CN100510092C

CN100510092C - 生产l-谷氨酸的方法

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Publication number: CN100510092C
Application number: CNB2004800162176A
Authority: CN
Inventors: 高桥裕典; 立山康博; 佐藤雅一
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2003-06-10
Filing date: 2004-06-10
Publication date: 2009-07-08
Anticipated expiration: 2024-06-10
Also published as: CN1806048A; BRPI0411086B1; KR20060023550A; WO2004111258A1; BRPI0411086A; US7354744B2; US20060110813A1; JPWO2004111258A1; US20100003726A1; EP1655374A1; EP1655374B1; AU2004248005A1; US7879583B2; RU2005138514A; EP1655374A4

Abstract

通过培养一种微生物生产L-谷氨酸，该微生物能在含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中在特定的pH值下代谢碳源，并具备在具有所述pH的液体培养基中积累L-谷氨酸的能力，其中L-谷氨酸的量超过了pH被控制以使L-谷氨酸沉淀的培养基中L-谷氨酸的所述饱和浓度所对应的量，所述液体培养基还含有泛酸，以使得在沉淀L-谷氨酸的同时引起L-谷氨酸的积累。

Description

生产L-谷氨酸的方法

技术领域

[0001]

本发明涉及一种通过发酵生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸被广泛用作调味品等的原材料。

背景技术

[0002]

L-谷氨酸主要使用所谓的棒状杆菌的L-谷氨酸-生产细菌通过发酵来生产，这些棒状杆菌是属于短杆菌属、棒状杆菌属或微杆菌属或它们的突变株。此外，使用属于芽孢杆菌属、链霉菌属、青霉属、假单胞菌属、节杆菌属、沙雷氏菌属、念珠菌属的微生物或产气杆菌(通常是产气肠杆菌)、大肠杆菌的突变株等的方法是公知的。进而，本发明的发明人曾建议了一种使用属于克雷伯氏菌属、欧文氏菌属或泛菌属的微生物制造L-谷氨酸的方法(美国专利No.6,197,559)和一种使用肠杆菌属细菌制造L-谷氨酸的方法(美国专利No.6,331,419)。

[0003]

此外，各种使用重组DNA技术增强L-谷氨酸生物合成酶活性以提高L-谷氨酸生产能力的技术已被揭示了。例如，有报道由大肠埃希氏菌或谷氨酸棒杆菌获得的柠檬酸合酶的编码基因的引入对于增强棒状杆菌属或短杆菌属的细菌中L-谷氨酸生产能力是有效的(日本专利公告JP7-121228B)。另外，JP61-268185A揭示了一种含有由棒杆菌属细菌获得的谷氨酸脱氢酶基因的重组DNA的细胞。而且，JP63-214189A揭示了一种通过扩增编码谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶和柠檬酸合酶的基因来提高L-谷氨酸生产能力的技术。

[0004]

L-谷氨酸的生产能力已经通过上述微生物的育种或生产方法的改进做了相当大的提高。然而，为了与未来进一步提高的需要相适应，用更低的成本提供更有效的L-谷氨酸的生产的方法的开发仍然是必要的，而且仍旧是本领域的需求。

[0005]

本发明的发明人开发了一种在沉淀在培养液中积累的L-谷氨酸的同时，进行L-谷氨酸发酵的方法(EP1078989A)。由于通常的L-谷氨酸-生产细菌在酸性条件下不会生长，传统的L-谷氨酸发酵是在中性条件下进行的。与这种传统技术相反，本发明的发明人成功地得到在酸性条件下具有生产L-谷氨酸能力的微生物。进一步，通过在控制pH值以便L-谷氨酸沉淀的液体培养基中培养获得的微生物(成团泛菌(Enterobacter agglomerans))，L-谷氨酸可以在沉淀L-谷氨酸的同时在培养基中被生产出来并积累。

[0006]

此外，本发明的发明人也揭示了一种生产L-谷氨酸的方法，包括在培养基中培养这种L-谷氨酸-生产细菌，其能够在如上所述的酸性条件下生长，所述培养基中抑制该细菌生长的有机酸的含量是一个不会抑制该细菌生长的量(EP1233070A)，以及一种生产L-谷氨酸的方法，包括在对于微生物生长最佳的第一pH值下培养这种如上所述的细菌，然后在对于用微生物生产L-谷氨酸最佳的比第一pH值低的第二pH值下培养这种细菌(EP1233068A)。进而，他们也揭示了一种当在培养基中沉淀L-谷氨酸时，在培养基中生产和积累L-谷氨酸的方法，这里要执行操作使L-谷氨酸的晶体在一段期间内存在于培养基中，该期间内L-谷氨酸在培养基中浓度比L-谷氨酸发生天然结晶时浓度要低(EP1233069A)。

发明内容

[0007]

本发明的目的是提供一种通过使用具有生产L-谷氨酸能力的细菌如属于泛菌属(Pantoea)的细菌与本领域现有技术相比更有效的生产L-谷氨酸的方法。

[0008]

本发明的发明人发现了如果L-谷氨酸的高生产能力被赋予属于泛菌属的细菌，3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇也会同L-谷氨酸一起被生产出来。进而，他们认为如果可能抑制这些副产物的生产，L-谷氨酸相对于单位量的主要原材料(糖)的产量将会提高。因此，本发明的发明人进行了各种研究，结果发现了如果在培养基中加入泛酸，3-羟基-2-丁酮(acetoin)和2，3-丁二醇副产品会减低，因此L-谷氨酸的发酵量被提高。从而，他们完成了本发明。

[0009]

也就是说，本发明如下所述

(1)一种发酵生产L-谷氨酸的方法，它包括培养一种微生物，该微生物能在含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中在特定的pH值下代谢碳源，并具有在该pH的液体培养基中积累L-谷氨酸的能力，其中L-谷氨酸的量超过了pH被控制以使L-谷氨酸沉淀的培养基中L-谷氨酸的饱和浓度所对应的量，此液体培养基还含有泛酸，以使得当沉淀L-谷氨酸时引起L-谷氨酸的积累。

(2)如上所述的方法，此处微生物属于泛菌属。

(3)如上所述的方法，此处微生物是Pantoea ananatis。

(4)如上所述的方法，此处培养基中的泛酸是一种泛酸盐，且该盐的浓度是1mg/L或更高。

附图说明

[0010]

[图1]源自Pantoea ananatis的pTWVEK101的DNA片断的限制性酶切图(restriction map)。

[图2]显示包含基因gltA、ppc和gdhA的质粒pMWCPG的构建的图。

[图3]显示包含宽寄主范围质粒RSF1010的复制起点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet的构建的图。

[图4]显示包含宽寄主范围质粒RSF1010的复制起点、四环素抗性基因、gltA、ppc和gdhA基因的质粒RSFCPG的构建的图。

[图5]显示包含gltA基因的质粒pSTVCB的构建的图。

[图6]显示通过加入泛酸提高L-谷氨酸产量机理的解释图。

[图7]显示加入到培养基中的泛酸钙的浓度与L-谷氨酸发酵量间关系的图。

优选实施方式的详细说明

[0011]

以下将详细解释本发明。本发明提供了一种通过发酵生产L-谷氨酸的方法，其特征在于培养一种微生物，该微生物能在含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中在特定的pH值下代谢碳源，并具有在该pH的液体培养基中积累L-谷氨酸的能力，其中L-谷氨酸的量超过了pH被控制以使L-谷氨酸沉淀的培养基中L-谷氨酸的饱和浓度所对应的量，(此后称为“L-谷氨酸积累微生物”)此液体培养基还含有泛酸，以使得当沉淀L-谷氨酸时引起L-谷氨酸的积累。

[0012]

上述L-谷氨酸-积累微生物可以被制得，例如，按以下方法。一种含有微生物的样品在特定pH值下被接种到含有饱和浓度L-谷氨酸和碳源的液体培养基中，一个可代谢碳源的菌株被选定。尽管该特定的pH值没有特殊限制，但通常约为5.0或更小，优选约4.5或更小，进一步优选约4.3或更小。L-谷氨酸-积累微生物被用于通过伴随着L-谷氨酸沉淀的发酵生产L-谷氨酸。如果pH值太高，那允许微生物以足够沉淀的量生产L-谷氨酸变得困难。因此，pH值优选前述范围。

[0013]

如果含有L-谷氨酸的水溶液的pH值降低，L-谷氨酸的溶解度在γ-羧基的pKa(4.25，25℃)附近显著降低。溶解度在等电点(pH3.2)变得最低，而超出了对应于饱和浓度的量的L-谷氨酸被沉淀。在约30℃，虽然取决于培养基组成，L-谷氨酸溶解以下述量溶解，在pH值3.2时10-20g/L，在pH值4.0时30-40g/L，而在pH值4.7时50-60g/L。通常pH值不必被控到3。0或更低，因为L-谷氨酸沉淀效果在pH值低于一定值时达到其上限。然而，pH值可以是3.0或更低。

[0014]

另外，微生物“可以代谢碳源”这种表述意味着微生物可以繁殖或尽管它不能繁殖但可消耗碳源，即，这表明微生物使碳源如糖或有机酸发生分解代谢。特别的，例如，如果一种微生物在pH值为5.0-4.0，优选pH值4.5-4.0，更优选pH值4.3-4.0，最优选pH值约为4.0的含有饱和浓度L-谷氨酸的液体培养基中培养下，在合适的温度下，例如，28℃，37℃或50℃，在2-4天中繁殖，这种微生物就可代谢培养基中的碳源。进而，例如，如果一种微生物消耗碳源，尽管这种微生物不繁殖，当它在pH值为5.0-4.0，优选pH值4.5-4.0，更优选pH值4.3-4.0，最优选pH值约为4.0的含有饱和浓度L-谷氨酸的合成液体培养基中培养2-4天，在合适的温度下，例如，28℃，37℃或50℃，能够消耗碳源这种微生物就是一种能够代谢培养基中碳源的微生物。

[0015]

能够代谢碳源的微生物包括能够在上述液体培养基中生长的微生物。一种微生物“能够生长”的表述意思是它可以繁殖或尽管不能繁殖但可以生产出L-谷氨酸。特别的，例如，如果一种微生物在pH值为5.0-4.0，优选pH值4.5-4.0，更优选pH值4.3-4.0，最优选pH值约为4.0的含有饱和浓度L-谷氨酸的液体培养基中培养下，在合适的温度下，例如，28℃，37℃或50℃，在2-4天中繁殖，这种微生物就可以在这培养基中生长。进而，例如，如果一种微生物尽管不能繁殖，但当这种微生物在pH值为5.0-4.0，优选pH值4.5-4.0，更优选pH值4.3-4.0，最优选pH值约为4.0的含有饱和浓度L-谷氨酸的合成液体培养基中培养下，在合适的温度下，例如，28℃，37℃或50℃，2-4天中，提高了在合成液体培养基中L-谷氨酸的量，那么这种微生物就是一种能够在这种培养基中生长的微生物。

[0016]

如上所述的微生物的选择在同样条件下或改变pH值或L-谷氨酸的浓度下，可以重复两次或多次。较早阶段的选择可以在含有低于饱和浓度的浓度下的L-谷氨酸的培养基中进行，而接着后来的选择可在含有饱和浓度的L-谷氨酸的培养基中进行。进一步，具有优良特性如较高的繁殖率的菌株可被选出。

[0017]

L-谷氨酸-积累微生物除了上述性质外，还具有在超过相对于L-谷氨酸在液体培养基中的饱和浓度的值下积累L-谷氨酸的能力。前面提到的液体培养基的pH值优选与用于筛选具有前述性质的微生物的培养基的pH值相同或接近。通常，微生物随着pH值变得更低，而变得对于高浓度的L-谷氨酸敏感。因此，考虑到对L-谷氨酸的抗性，优选pH不低；但考虑到伴随其沉淀的L-谷氨酸生产，优选低pH。为满足这些条件，pH值可以在3-5范围内，优选4-5，更优选4-4.7，进一步优选4-4.5，特别优选4.0-4.3。

[0018]

L-谷氨酸-积累微生物或繁殖原料的例子因此包括，但并不限于，属于泛菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、大肠埃希氏菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、肠环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、芽孢杆菌属、酵母属等的微生物。这些当中，泛菌属的微生物是优选的。此后，本发明的微生物将主要针对属于泛菌属的微生物进行解释。然而，该微生物并不限于属于泛菌属，那些属于其它属的也可类似的使用。

[0019]

属于泛菌属的微生物包括，但并不限于，Pantoea ananatis，优选Pantoea ananatis AJ13355菌株。这种菌株从日本Shizuoka的Iwata-shi的土壤分离，作为可以在低pH值下在含有L-谷氨酸和碳源的培养基中繁殖的菌株。

[0020]

Pantoea ananatis AJ13355于1998年2月19日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(目前，National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology，国际专利生物保藏机构)并收到入藏登记号FERM P-16644。然后它于1999年1月11日转为布达佩斯条约规定的国际保藏并收到入藏登记号FERM BP-6614。

上述菌株被分离后确定为成团泛菌(Enterobacteragglomerans)，并作为成团泛菌AJ13355菌株来保藏。然而，目前在16s rRNA核苷酸测序等的基础上重新分类作为Pantoea ananatis(参见实施例部分)。

尽管源于菌株AJ13355的菌株AJ13356和AJ13601都在上述保藏机构作为成团泛菌保藏，在本说明书中它们都描述为Pantoeaananatis。

[0021]

L-谷氨酸-积累微生物可以是一种原本具有L-谷氨酸-生产能力的微生物或是一种通过诱变、重组DNA技术等通过育种而被赋予或提高L-谷氨酸-生产能力的微生物。

[0022]

L-谷氨酸-生产能力可被赋予或提高，通过，例如，提高催化L-谷氨酸生物合成反应酶的活性。L-谷氨酸-生产能力也可以通过减低或消除催化从L-谷氨酸生物合成路径分支出去并产生不同于L-谷氨酸的化合物的反应的酶的活性来提高。

[0023]

催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的例子包括，但并不限于，谷氨酸脱氢酶(此后，也作“GDH”)、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶(此后，亦作“CS”)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(此后，亦作“PEPC”)、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、烯醇化酶、磷酸甘油变位酶、磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、果糖二磷酸酶醛缩酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡糖异构酶等。这些酶中，优选CS、PEPC和GDH中的一种、两种或三种。进一步，优选所有三种酶CS、PEPC和GDH的活性在L-谷氨酸-积累微生物中增强。特别是，优选来自谷氨酸棒杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的CS，因为它不受α-酮戊二酸、L-谷氨酸及NADH抑制的影响。

[0024]

为了增强CS、PEPC或GDH的活性，例如，编码CS、PEPC或GDH的基因可克隆在合适的质粒中，可以用得到的质粒转化寄主微生物。转化体细胞中编码CS、PEPC或GDH的基因的拷贝数(此后，分别缩写为“gltA基因”、“ppc基因”和“gdhA基因”)提高了，带来CS、PEPC或GDH活性的提高。

[0025]

克隆的gltA、ppc和gdhA基因被单独或它们中任意两个或三个组合引入前述起始母株。当两或三种基因被引入时，两或三种基因可以在一种质粒中克隆并被引入寄主，或分别在两或三种能够共存的质粒中克隆并被引入寄主。

[0026]

两或三种编码相同种类但源自不同生物体的酶的基因，可以被引入同一寄主。

上述质粒并不特别限制，只要它们在属于，例如，泛菌属等的微生物细胞中自主复制即可。质粒的例子包括pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pACYC177、pACYC184等。噬菌体DNA的载体也可用于引入前述基因。

[0027]

转化可以通过，例如，D.A.Morrison的方法(酶学方法，68，326(1979))进行，该方法中，受体细菌细胞对DNA的透过性通过用氯化钙处理细胞(Mandel M.和Higa A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))、电穿孔(Miller J.H.，“细菌遗传学的短期课程”，ColdSpring Harbor Laboratory Press，美国，1992)或类似方法来提高。

[0028]

CS、PEPC或GDH的活性也可以通过允许gltA基因、ppc基因或gdhA基因的多个拷贝存在于前述启动母株的染色体DNA中来提高。gltA基因、ppc基因或gdhA基因的多个拷贝可以通过同源重组而引入染色体DNA。为了以多个拷贝将gltA基因、ppc基因或gdhA基因引入属于泛菌属的细菌的染色体DNA，可以使用以多个拷贝存在于染色体DNA中的序列，例如存在于可转座元件末端的重复DNA和反转重复(inverted repeats)。可选择的，gltA基因、ppc基因或gdhA基因的多个拷贝可以通过将它们合并入一个转座子并转移它从而将其引入染色体DNA。结果是，gltA基因、ppc基因或gdhA基因在转化体菌株中的拷贝数提高了，因此CS、PEPC或GDH的活性也提高了。

[0029]

作为用作拷贝数将被提高的gltA基因、ppc基因或gdhA基因源的生物体，任何生物体只要具有CS、PEPC或GDH的活性就可使用。生物体的例子优选包括，但不限于，属于泛菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、埃希氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属或芽孢杆菌属的细菌。特别的，大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等是本发明所包含的。gltA基因、ppc基因和gdhA基因可以从上述微生物的染色体DNA中获得。

[0030]

gltA基因、ppc基因和gdhA基因可以使用CS、PEPC或GDH活性缺乏的突变体菌株，以从上述微生物的染色体DNA中分离出补充其辅源营养的DNA片断来获得。进而，由于属于埃希氏菌属和棒杆菌属的细菌的这些基因的核苷酸序列是已知的(生物化学，22，第5243-5249页，(1983)；J.Biochem.，95，第909-916页，(1984)；基因，27，第193-199页，(1984)；微生物学，140，第1817-1828页，(1994)；Mol.Gen。Genet.，218，第330-339页，(1989)；分子微生物学，6，第317-326页，(1992))，它们也可以通过PCR使用基于每个核苷酸序列和染色体DNA作为模板合成的引物来获得。众所周知，在肠细菌如属于肠杆菌属或克雷伯氏菌属的细菌中，与由同种类细菌引入的gltA基因相比由棒状细菌引入的gltA基因对于增强L-谷氨酸生产能力是更有效的(EP0999282A)。在这一专利文件中，本说明书中描述的Pantoea ananatis的菌株被描述为成团泛菌。

[0031]

CS、PEPC或GDH活性也可以通过增强gltA基因、ppc基因或gdhA基因的表达来提高，除前述这些基因的扩增外。例如，可以通过用另一更强的启动子来替代gltA基因、ppc基因或gdhA基因的启动子使表达增强。例如lamda噬菌体的lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、P_R启动子和P_L启动子等都是已知的强启动子。替代了启动子的gltA基因、ppc基因或gdhA基因被克隆在质粒中并被引入宿主微生物，或使用重复DNA、颠倒重复、转位子等引入到宿主微生物的染色体DNA。

[0032]

CS、PEPC或GDH活性也可以通过用另一强启动子在染色体中替代gltA基因、ppc基因或gdhA基因的启动子来提高(参见WO87/03006和JP61-268183A)，或者通过在每个基因编码序列上游插入强启动子(参见基因，29，第231-241页(1984))。特别的，可以在gltA基因、ppc基因或gdhA基因和染色体的相应基因之间进行同源重组，前述三种基因的启动子被更强的启动子或者含有它的部分的DNA来代替。

[0033]

催化L-谷氨酸生物合成路径分支出去并产生不同于L-谷氨酸化合物的反应的酶的实例包括α-酮戊二酸脱氢酶(以后也用“αKGDH”来指代)、异柠檬酸裂合酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶等。这些酶当中，优选α KGDH。

[0034]

为了降低或消除在属于泛菌属或类似属的微生物中的上述酶的活性，降低或消除这些酶细胞内活性的突变可以被引入上述酶的基因中，通过通常的突变发生处理方法或遗传工程方法。

[0035]

突变发生处理方法的例子包括，例如，应用X射线或紫外线辐射的方法、应用突变发生剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等处理的方法。突变被引入基因的位置可以是酶蛋白编码区或调节表达的区域如启动子中。

[0036]

遗传工程方法的例子包括，例如，应用基因重组、转导、细胞融合等的方法。例如，一种抗药基因被插入克隆的目标基因中以制备遗?失了其功能的基因(缺陷基因)。随后，这种缺陷基因被引入一宿主微生物细胞内，染色体上的目标基因通过应用同源重组被上述缺陷基因代替(基因破坏)。

[0037]

目标酶细胞内活性的减少或缺乏及活性减少的程度能通过衡量细胞抽提物或由候选菌株获得的纯化部分的酶活性并与野生型菌株的酶活性对比来确定。例如，α KGDH的活性可以用Reed等的方法来测量(Reed L.J.和Mukher jee B.B.，酶学方法，13，第55-61页(1969))。

[0038]

依赖于目标酶，目标突变菌株可以基于突变菌株的表型来选择。例如，其αKGDH的活性消除或降低的突变菌株在含葡萄糖的基本培养基或在含乙酸或L-谷氨酸作为唯一的碳源的基本培养基中在需氧培养条件下不能繁殖或显示出明显降低的繁殖率。然而，通过在含有葡萄糖的基本培养基中加入琥珀酸或赖氨酸、蛋氨酸和二氨基庚二酸，正常的繁殖甚至在同样条件下是能够的。通过利用这些现象作为指示物，带有减低的α KGDH的活性或活性缺乏的突变菌株被选择出来。

[0039]

通过利用同源重组制备α KGDH基因-缺乏谷氨酸棒杆菌菌株的方法在WO95/34672中详细描述了。类似的方法可以应用在其它微生物上。

[0040]

进一步，诸如基因克隆和DNA的消化和连接、转化等在分子克隆，第二版，Cold Spring Harbor Press(1989)等里面详细描述了。

[0041]

如上所述αKGDH活性缺乏或具有减低的αKGDH活性的突变菌株的特殊例子包括Pantoea ananatis AJ13356。Pantoea ananatisAJ13356于1998年2月19日存放于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(目前，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology，国际专利生物保藏机构)并收到入藏登记号FERM P-16645。然后它于1999年1月11日转为布达佩斯条约规定的国际保藏并收到入藏登记号FERM BP-6615。Pantoea ananatisAJ13356由于αKGDH-E1亚基基因(sucA)破坏，其缺乏α KGDH活性。

[0042]

当Pantoea ananatis，作为本发明使用的微生物的例子，在含有糖类的培养基中培养时，粘液在细胞外分泌，有时造成低操作效率。因此，当具有这种分泌粘液性质的Pantoea ananatis被使用时，优选使用与野生型菌株相比分泌较少粘液的突变菌株。突变发生处理的例子包括，例如，利用X射线或紫外线辐射的方法、利用突变发生剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等的方法。有降低分泌粘液性质的菌株可以通过在含有糖类的培养基，例如，含有5g/L葡萄糖的LB培养基盘中，接种突变发生的细菌细胞，将它们在45度倾斜的盘内培养，选择未显示出粘液流下的菌落，来进行选择。

[0043]

本发明中，L-谷氨酸生产能力的赋予或增强以及其它良好性能如上述对于较少粘液分泌的突变的赋子可以按任意顺序完成。

作为用于繁育上述L-谷氨酸生产细菌的基因的Pantoea ananatis的sucA基因的核苷酸序列和被基因编码的α KGDH-E1亚基的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3。

[0044]

进一步，含有源于大肠埃希氏菌的gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒RSFCPG(参见参考实施例1)的核苷酸序列显示于SEQ IDNO：8。在SEQ ID NO：8中，gltA基因、gdhA基因和ppc基因的编码区域分别对应于核苷酸号码1170-487(由互补链编码)、2598-3941和7869-5218(由互补链编码)。这些基因编码的CS、GDH和PEPC氨基酸序列显示于SEQ ID NOS：9，10和11。进一步，含有源于谷氨酸棒杆菌的gltA基因的质粒pSTVCB(参见参考实施例1)和用该基因编码的CS的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。

[0045]

CS、GDH和PEPC除了它们的野生型，可以包括一个或几个氨基酸残基的替换、删除、插入、增加或倒置，并且不会显著降低酶活性。尽管这里所指的“几个”氨基酸残基的数量基于蛋白质的三维结构位置或氨基酸残基的类型而不同，它可以具体地在2-30之间，优选2-20之间，更优选2-10之间。因此，CS、GDH或PEPC的所述改变例如上述的那些是典型的保守的改变，以便保持CS、GDH或PEPC的活性。替换改变包括氨基酸序列中至少一个残基被移除以及一个不同的残基在这位置上插入。CS、GDH或PEPC蛋白质中原始氨基酸可能被替换并被认为是保守替换的氨基酸的例子包括：Ala被ser或thr替换；arg被gln、his或lys替换；asn被glu、gln、lys、his或asp替换；asp被asn、glu或gln替换；cys被ser或ala替换；gln被asn、glu、lys、his、asp或arg替换；glu被asn、gln、lys或asp替换；gly被pro替换；his被asn、lys、gln、arg或tyr替换；ile被leu、met、val或phe替换；leu被ile、met、val或phe替换；lys被asn、glu、gln、his或arg替换；met被ile、leu、val或phe替换；phe被trp、tyr、met、ile或leu替换；ser被thr或ala替换；thr被ser或ala替换；trp被phe或tyr替换；tyr被his、phe或trp替换；以及val被met、ile或leu替换。

[0046]

与CS、GDH或PEPC基本相同的蛋白质或肽的编码DNA的例子包括可与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：8的核苷酸序列的开放阅读框(ORF)杂交的DNA，或者可在严格条件下由核苷酸序列制得的并能为具有CS、GDH或PEPC活性的蛋白质编码的探针。这里所述的“严格条件”包括形成所谓特异的杂交体，而不特异的杂交体不会形成的条件。很难用任何数量化的值明白表达出这种条件。然而，例如，严格条件包括高度同源的DNA，例如，同源不少于50％的DNA，优选不少于70％，更优选不少于90％，最优选不少于95％，互相杂交，但比上述同源性低的DNA不互相杂交的条件。可选择的，严格条件包括由此DNA在对应于DNA杂交洗涤的常规条件的盐浓度下相互杂交，即1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS，在60℃的条件。

[0047]

SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：8的核苷酸序列的ORF或它的部分序列也可被用作探针。这样的探针可以通过使用在SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：12核苷酸序列基础上生产的低聚核苷酸作为引物的PCR来制备，其中将含有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：12的核苷酸序列或它的部分核苷酸序列的DNA片段作为模板。当使用长度约为300bp的DNA片段作为探针时，杂交的洗涤条件可以是，例如，在50℃下2×SSC和0.1％SDS。

[0048]

用作基因破坏的删除型sucA基因具有足够程度的同源性以便引起同目标微生物的染色体DNA中的sucA基因同源重组。这种同源性优选不少于85％，更优选不少于90％，特别优选不少于95％。而且，在严格条件下可杂交的DNA可引起同源重组。

[0049]

如上所述得到的这种菌株的特殊例子包括源于前述Pantoeaananatis AJ13355菌株的AJ13601菌株。此菌株通过从AJ13355菌株选择低粘膜产生菌株、α KGDH基因的破坏、源于大肠埃希氏菌的gltA、ppc和gdhA基因和源于谷氨酸棒杆菌的gltA基因的引入、对低pH值下高浓度L-谷氨酸显示抵抗的菌株的选择、显示出超级生长能力和L-谷氨酸生产能力的菌株的选择而获得。

[0050]

通过在调整pH值条件以允许L-谷氨酸沉淀的液体培养基中培养L-谷氨酸-积累微生物，L-谷氨酸可以生产出来，并伴随在培养基中沉淀而积累。这里所指的“允许该微生物产生的L-谷氨酸沉淀的条件”意思是当L-谷氨酸-积累微生物生产并积累L-谷氨酸时，允许L-谷氨酸沉淀的条件。尽管这种条件下的pH值可以基于微生物的L-谷氨酸生产能力而不同，但当微生物是属于泛菌属的细菌时它通常是3-5，优选4.5或更低，更优选4或更低。

进而，对于上述允许L-谷氨酸沉淀的pH值条件，pH值在这种条件下被决定：L-谷氨酸-积累微生物可以在含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中代谢其中的碳源并显示出以超过对应于L-谷氨酸在那个pH值下的培养基中饱和浓度的量在培养基中积累L-谷氨酸的能力。

[0051]

当L-谷氨酸-积累微生物在前述条件的培养基中培养时，L-谷氨酸的积累量可以通过在培养基中加入泛酸来提高。这大概是因为3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇的次级(secondary)产生被在培养基中加入泛酸而减低，结果是L-谷氨酸的发酵量提高了。

[0052]

将包含在培养基中的泛酸优选以泛酸盐加入。泛酸盐的含量优选为1mg/L或更多，更优选4mg/L或更多，特别优选8mg/L或更多。泛酸盐的类型没有特别限制，实例包括钙盐、钠盐等。泛酸可以在整个培养过程中存在于培养基中，或者在含有泛酸的培养基中培养的阶段可以是这个过程的一部分。例如，当本发明的方法包括繁殖L-谷氨酸积累微生物的步骤和允许L-谷氨酸生产的步骤时，泛酸可以在至少允许L-谷氨酸生产的步骤期间存在于培养基中，而且泛酸在繁殖L-谷氨酸-积累微生物的步骤中可以存在或不存在于培养基中。进而，对于允许L-谷氨酸生产的步骤，泛酸的含量可以不必在整个步骤期间在前述的范围内。即，泛酸可以被含有，以便在步骤的早期其含量在前述范围内，且随着培养时间含量可以减低。泛酸也可以间歇地额外加入。

[0053]

对于本发明的方法，使用L-谷氨酸-积累微生物在沉淀L-谷氨酸的同时生产L-谷氨酸的公知方法都可以应用，除了使用含有泛酸的培养基以外(例如，JP2001-333769A(EP1078989A)、JP2002-238591A(EP1233070A)、JP2002-238592A(EP1233068A)、JP2002-238593A(EP1233069A))。

[0054]

例如，本发明方法的优选实施例之一是生产L-谷氨酸的方法，包括在含有泛酸盐且pH值为5.0或更低的培养基中培养L-谷氨酸-积累微生物，其中抑制微生物生长的有机酸的总含量是不抑制该微生物生长的量(参见JP2002-238591A(EP1233070))。在这一实施例中，在培养基pH值下抑制该微生物生长的有机酸意思是当其以一定浓度(通常为0.5g/L或更多)存在于此pH值的培养基中时具有抑制该微生物生长效果的有机酸，而且它通常是具有碳原子数为1-3的有机酸，即甲酸、乙酸或丙酸。

[0055]

有机酸的总含量优选0.4g/L或更少，更优选0.3g/L或更少，进而优选0.2g/L或更少。

本发明方法的另一优选实施例是生产L-谷氨酸的方法，包括在对于微生物生长最佳的第一pH值下培养L-谷氨酸-积累微生物，然后在对于通过微生物生产L-谷氨酸最佳的且低于第一pH值的第二pH值下培养微生物，其中L-谷氨酸-积累微生物在至少第二pH值培养期内在含有泛酸的培养基中培养。

[0056]

本发明方法的另一优选实施例是生产L-谷氨酸的方法，包括在微生物生长不会被存在于培养基中的有机酸抑制的第一pH值下培养L-谷氨酸-积累微生物，然后在对于通过微生物生产L-谷氨酸最佳的且低于第一pH值的第二pH值下培养微生物，其中L-谷氨酸-积累细菌在至少第二pH值培养期内在含有泛酸的培养基中培养(参见JP2002-238591A(EP1233070A))。

[0057]

已发现L-谷氨酸-生产细菌一般在酸性条件下被有机酸抑制生长，然而它可在中性条件下消耗有机酸(参见JP2002-238591A(EP1233070A))。基于这一性质，通过在中性pH值下进行细胞生长然后改变pH值至生产L-谷氨酸的酸性pH值，使获得较高的生产力变为可能，同时使用各种材料作为糖源也成为可能。

[0058]

在这个实施例中，有机酸意味着当它在第二pH值的培养基中以一定浓度(通常0.5g/L或更多)存在时对于微生物生长具有抑制效果的有机酸，而且通常是具有碳原子数为1-3的有机酸，即甲酸、乙酸或丙酸。

[0059]

选择第一pH值和第二pH值以便它们满足所使用L-谷氨酸-生产细菌的性质。这些pH数值可以由本领域技术人员容易地测量。例如，不会被培养基中的有机酸引起抑制微生物生长的pH值可以这样确定，在含有调整至各种pH值的有机酸的培养基中培养L-谷氨酸-生产细菌，基于吸光率等测量细胞数量，与在同一条件下培养但培养基不含有机酸的L-谷氨酸-生产细菌的细胞数量对比。对于L-谷氨酸生产合适的pH值是指在此pH值下L-谷氨酸在培养基中积累，并且通过在各pH值下的培养基中培养L-谷氨酸-生产细菌可确定此pH值。特别的，它可以通过测量L-谷氨酸在各pH值的培养基中积累的量并对比它们来确定。

[0060]

第一pH值并不特别限制，只要微生物的生长不被培养基中的有机酸抑制，但通常是5.0-8.0。

第二pH值优选在此pH值下生产的L-谷氨酸沉淀，且这样的pH值通常为3.0-5.0。L-谷氨酸在高浓度下积累导致的生产力的减低可以通过在被生产的L-谷氨酸沉淀的pH值下进行培养来避免。

[0061]

第一pH值和第二pH值在培养期间可以不是严格恒定的，只要本发明的优势可以获得，它们可以波动。

L-谷氨酸-生产细菌甚至在第一pH值下也生产L-谷氨酸，因此pH值被生产的L-谷氨酸降低了。所以，在第一pH值下培养优选通过加入碱性物质到培养基中保持培养基的pH值为第一pH值而执行。

[0062]

尽管碱性物质并不特别限定，只要它不会造成对于L-谷氨酸-生产细菌生长或L-谷氨酸生产不利的影响，但优选氨气。

[0063]

培养基的pH值通过加入酸性物质可以从第一pH值降到第二pH值。然而，pH值在上述培养期间被由L-谷氨酸-生产细菌生产的L-谷氨酸降低了。因此，优选通过控制碱性物质的加入量将培养基的pH值由第一pH值降到第二pH值，因为酸性物质的加入量可以被忽略。

[0064]

在第一pH值下培养可以延续到培养基中的有机酸耗尽为止。耗尽意味着有机酸的量降低到一定水平，在此量下L-谷氨酸-生产细菌的生长在第二pH值下的培养期间不会被抑制。这样的有机酸水平可以容易的通过本领城技术人员来测量。例如，通过在第二pH值下在含有各种浓度的有机酸的培养基中培养L-谷氨酸-生产细菌，测量L-谷氨酸-生产细菌的细胞数量，对比此细胞数量与在同一条件下但培养基不含有机酸下培养的L-谷氨酸-生产细菌的细胞数量。一般，随着第二pH值降低，有机酸的水平也变得降低了。

[0065]

本发明方法的进一步优选的实施例，是通过发酵生产L-谷氨酸的方法，包括在控制pH值以便通过微生物生产的L-谷氨酸沉淀以引起在L-谷氨酸沉淀的同时L-谷氨酸在培养基中积累的培养基中，培养L-谷氨酸-积累细菌，其中执行一操作使得L-谷氨酸结晶在一段期间存在于培养基中，其中L-谷氨酸在培养基中的浓度比L-谷氨酸天然结晶发生时的浓度低，且培养基含有泛酸(参见JP2002-238593A(EP1233069A))。“天然结晶”意思是，当具有生产L-谷氨酸能力的微生物积累L-谷氨酸时，L-谷氨酸在培养基中的浓度超过了L-谷氨酸的饱和浓度，因此L-谷氨酸天然的在培养基中沉淀。

[0066]

使L-谷氨酸结晶存在于培养基中的操作意思是，人工提供L-谷氨酸结晶在培养基中的存在的操作。这种操作的例子包括加入结晶，在培养开始时在培养基中溶解一定量的L-谷氨酸，以及在培养期间降低pH位以强制沉淀结晶等的操作。存在于培养基中结晶的量通常为0.01-10g/L。进而，使得结晶存在的期间优选培养基中积累的L-谷氨酸的量提高到接近饱和浓度的浓度(例如，当pH值为4.5或更高，为25g/L或更多)。存在于培养基中L-谷氨酸结晶的量和L-谷氨酸的浓度可以用本领域技术人员熟知的方法测量。L-谷氨酸的结晶在培养基静置之后测量，且通过倾析收集结晶。L-谷氨酸在培养基中的浓度是溶解的L-谷氨酸的浓度。当结晶在培养基中沉淀时，L-谷氨酸的浓度是指通过离心分离或过滤将固体物质从培养基中分离后获得的清溶液测量出的L-谷氨酸浓度值。

[0067]

使L-谷氨酸结晶存在于培养基中的操作优选加入L-谷氨酸晶体。

L-谷氨酸的晶体包括α-型和β-型晶体(H.Takahashi，T.Takenishi，N.Nagashima，Bull.Chem.Soc.Japan，35，923(1962)；J.D.Bernal，Z.Krist.，78，363(1931)；S.Hirokawa，Acta Cryst.，8，637(1955))。当想要得到α-型晶体时，加入的晶体优选为α-型晶体。

[0068]

尽管要加入的晶体的优选用量依据包括晶体结晶形式等条件而不同，通常对于α-型晶体为0.2g/L或更多。如果以上述量或更大量加入晶体，可以获得有良好再生性的α-型晶体。从形态学的观点看α-型晶体与β-型晶体相比更容易操作。

[0069]

作为本发明使用的培养基，可以使用既含有碳源、氮源和无机盐也含有，如果需要的话，有机痕量营养如氨基酸和维生素的一般营养培养基，除了它含有泛酸，且pH值被调整以满足预先设定的条件。合成培养基或天然培养基都可以使用。想要培养的菌株可以使用的任何碳源和氮源都可以在培养基中使用。

[0070]

糖类如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解产物和糖蜜，可以作为碳源使用。另外，有机酸如乙酸和柠檬酸可以每个单独使用或同另外的碳源联合使用。

[0071]

氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和醋酸铵、硝酸铵等可用作氮源。

[0072]

氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸，含有这些物质的物质，如蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母抽提物和大豆蛋白分解产物被用作有机痕量营养。当需要氨基酸等用来新陈代谢或生长的营养缺陷型菌株被使用时，所需要的营养必须补充。

[0073]

磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等被用作矿物盐。

关于培养方法，通常实行在20-42℃下通风培养，前提是pH值被控制在预先设定的值。

[0074]

培养完成后，培养基中沉淀的L-谷氨酸可通过离心分离、过滤或类似方法收集。溶解在培养基中的L-谷氨酸也可以用公知方法收集。例如，用浓缩培养液使其结晶的方法离析L-谷氨酸或用离子交换色谱法或类似方法离析L-谷氨酸。也可以结晶溶解在培养基中的L-谷氨酸，然后收集在培养中沉淀的L-谷氨酸以及结晶的L-谷氨酸。

[0075]

在L-谷氨酸超过饱和浓度而沉淀的实施例中，溶解在培养基中的L-谷氨酸的浓度保持在一个不变的水平。因此，L-谷氨酸在高浓度时对微生物的影响可以减低。从而，繁殖具有进一步提高的L-谷氨酸-生产能力的微生物也变为可能。进而，由于L-谷氨酸作为晶体沉淀，L-谷氨酸积累带来的培养液酸化被抑制，因此用于保持培养的pH值的碱用量可以明显减少。

实施例

[0076]

此后，本发明将被详细描述。

参考实施例1

<1>筛选具有在酸性环境下抵抗L-谷氨酸能力的微生物

筛选具有在酸性环境下抵抗L-谷氨酸能力的微生物按以下步骤执行。一(1)克来自于天然的大约500种样品的每一种，包括土壤、水果、植物体、河流水等，悬浮在5mL无菌水中，将200μL的这种液体加入到20mL用盐酸调pH值至4.0的固体培养基上。培养基组分如下：3g/L葡萄糖，1g/L硫酸铵，0.2g/L硫酸镁七水合物，0.5g/L磷酸二氢钾，0.2g/L氯化钠，0.1g/L氯化钙二水合物，0.01g/L硫酸铁七水合物，0.01g/L硫酸锰四水合物，0.72mg/L硫酸锌二水合物，0.64mg/L硫酸铜五水合物，0.72mg/L氯化钴六水合物，0.4mg/L硼酸，1.2mg/L钼酸钠二水合物，50μg/L维生素h，50μg/L泛酸钙，50μg/L叶酸，50μg/L肌醇，50μg/L烟酸，50μg/L对氨基苯甲酸，50μg/L维生素B6，50μg/L核黄素，50μg/L盐酸硫胺素，50μg/L放线菌酮和20g/L琼脂。

[0077]

用以上样品覆盖的培养基在28℃、37℃或50℃下培养2-4天，得到形成菌落的378个菌株。

随后如上所述获得的每个菌株在16.5cm长14mm直径的含有3mL含有饱和浓度L-谷氨酸的液体培养基(用HCL调整pH值至4.0)的试管中接种，并在震荡下在28℃、37℃或50℃下培养24小时。然后，选出生长的菌株。前述培养基组成如下：40g/L葡萄糖，20g/L硫酸铵，0.5g/L硫酸镁七水合物，2g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，0.25g/L氯化钙二水合物，0.02g/L硫酸铁七水合物，0.02g/L硫酸锰四水合物，0.72mg/L硫酸锌二水合物，0.64mg/L硫酸铜五水合物，0.72mg/L氯化钴六水合物，0.4mg/L硼酸，1.2mg/L钼酸钠二水合物和2g/L酵母抽提物。

[0078]

这样，78个在酸性环境下显示出对L-谷氨酸抵抗的微生物的菌株就成功的获得了。

[0079]

<2>从在酸性环境下具有L-谷氨酸抗性的微生物中选择显示出较好生长速率的菌株

上述获得的各种在酸性环境下具有L-谷氨酸抗性的微生物的每一个在16.5cm长14mm直径的含有3mL通过在M9培养基中加入20g/L谷氨酸和2g/L葡萄糖而获得的培养基(用HCL调整pH值至4.0)的试管中接种(Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.，“分子克隆”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，U.S.A.，1989)，并在一时间段内测量培养基的混浊度以选择显示好的生长速率的菌株。结果，作为显示好的生长的菌株，AJ13355菌株从日本Shizuoka，Iwata-shi的土壤中得到。该菌株在它的前述细菌学性质基础上被确定为成团泛菌。成团泛菌(Enterobacter agglomerans)包括那些根据16S rRNA的核苷酸序列分析等而重新分类到成团泛菌(Pantoeaagglomerans)、Pantoea anaatis、斯氏泛菌(Pantoea Stewartii)等的细菌，而AJ13355菌株被分类到这些中的Pantoea ananatis。

[0080]

<3>从Pantoea ananatis AJ13355菌株获得较少粘液分泌的菌株

由于Pantoea ananatis AJ13355菌株在含有糖类的培养基中培养时在细胞外分泌粘液，操作效率不好。因此通过紫外线辐射方法获得较少粘液分泌的菌株(Miller，J.H.et al.，“细菌遗传学的短期课程；实验室手册”，第150页，1992，Cold Spring HarborLaboratory Press，美国)。

[0081]

Pantoea ananatis AJ13355菌株在距离60-W紫外灯60cm处用紫外线辐射2分钟，在LB培养基中培养过夜以固定突变。发生突变的菌株被稀释并接种在含有5g/L葡萄糖和20g/L琼脂的LB培养基中以便在每板上有大约100个菌落形成，然后将板倾斜约45度在30℃下培养过夜，选择没有流下粘液的20个菌落。

[0082]

作为满足即使在含有5g/L葡萄糖和20g/L琼脂的LB培养基中传代培养5次也没有回复突变发生的条件的菌株，SC17菌株显示了与LB培养基，在含有5g/L葡萄糖的LB培养基和增补了20g/L L-谷氨酸和2g/L葡萄糖并用HCL调整pH值至4.5的M9培养基中(Sambrook，J.et al.，“分子克隆”，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，U.S.A.，1989)的母株同等的生长，从上述选择的菌株中选择SC17菌株。

[0083]

<4>由Pantoea ananatis SC17菌株得来的谷氨酸-生产细菌的构建

(1)由Pantoea ananatis SC17菌株制备αKGDH缺乏菌株

由Pantoea ananatis SC17菌株制备缺乏αKGDH并具有增强的L-谷氨酸生物合成系统的菌株。

[0084]

(i)Pantoea ananatis AJ13355菌株αKGDH基因的克隆(此后，用“sucAB”指代)

Pantoea ananatis AJ13355菌株的sucAB基因通过由Pantoeaananatis AJ13355菌株的染色体DNA中选择互补于αKGDH-E1亚基基因(此后秒为“sucA”)缺乏的大肠杆菌菌株的乙酸不吸收性质的DNA片段来克隆。

[0085]

Pantoea ananatis AJ13355菌株的染色体DNA用通常应用的从大肠埃希氏菌提取染色体DNA的方法离析(生物工程学实验课本，生物科学和生物工程学协会编辑，日本，第97-98页，Baifukan，1992)。PTWV228(氨苄青霉素抗性)用作载体，是Takara Shuzo公司的商业产品。

[0086]

被EcoT221消化的AJ13355菌株的染色体DNA和被PstI消化的pTWV228被用T4连接酶连接，使用连接混合物转化sucA缺乏大肠埃希氏菌JRG465菌株(Herbert，J.etal.，Mol.Gen.Genetics，105，182(1969))。在醋酸盐基本培养基中生长的菌株从上述得到的转化株中选择出，从上述得到的菌株中提取质粒，称为pTWVEK101。含有pTWVEK101的大肠埃希氏菌JRG465菌株恢复(recover)了对于琥珀酸或L-赖氨酸和L-蛋氨酸的营养缺陷型，包括乙酸-不可同化性的特性。这表明pTWVEK101含有Pantoea anana tis的sucA基因。

[0087]

图1表示了源于Pantoea ananatis的pTWVEK101中的DNA片断的限制酶图谱。在图1阴影线部分的核苷酸序列中，发现被认为是两个全长的可读框的核苷酸序列和被认为是可读框的部分序列的两个核苷酸序列。预测这些可读框或部分序列编码的氨基酸序列以开始于5’侧的顺序表示为SEQ ID NOS：2-5。这些序列同源性检索的结果，表明其核苷酸序列被测定的部分包含了琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白基因(sdhB)、全长sucA和αKGDH-E2亚基基因(sucB)的3’端的部分序列和琥珀酰CoA合成酶β亚基基因(sucC)的5’端部分序列。由这些核苷酸序列推出的氨基酸序列与源自大肠埃希氏菌的序列的对比结果(Bur.J.Biochem.，141，第351-359页(1984)；Eur.J.Biochem.，141，第361-374页(1984)；生物化学，24，第6245-6252页(1985))表明这些氨基酸序列显示出非常高的相互同源。另外，发现sdhB-sucA-sucB-sucC聚簇在Pantoea ananatis的染色体上，和大肠埃希氏菌一样(Eur.J.Biochem.，141，第351-359页(1984)；Eur.J.Biochem.，141，第361-374页(1984)；生物化学，24，第6245-6252页(1985))。

[0088]

(ii)源自Pantoea ananatisSC17菌株的αKGDH-缺乏菌株的获得

使用上述得到的Pantoea ananatis的sucAB基因进行同源重组来得到Pantoea ananatis的αKGDH-缺乏菌株。

[0089]

在pTWVEK101被SphI消化以切除含有sucA的片断后，用klenow片断将该片断平端(Takara Shuzo有限公司)，并用T4DNA连接酶(Takara Shuzo有限公司)与由EcoRI消化得来且用klenow片断将其平端的pBR322连接。所得的质粒通过使用酶在大约位于sucA中心的限制酶BglII识别位点消化，用klenow片断平端，然后再使用T4 DNA连接酶连接。认为sucA基因成为非功能性的，因为移码突变被引入通过上述步骤新构造的质粒的sucA中。

[0090]

如上构造的质粒用限制酶ApaLI消化，进行琼脂糖凝胶电泳以回收含有其中引入了移码突变的sucA和源自pBR322的四环素抗性基因的DNA片断。回收的DNA片断再次用T4 DNA连接醇连接以构造用于破坏α KGDH基因的质粒。

[0091]

如上述获得的用于破坏α KGDH基因的质粒被用于电穿孔转化Pantoea ananatisSC17菌株(Miller，J.H.，“细菌遗传学的短期课程；手册”，第279页，Cold Spring Harbor Laboratory Press，美国，1992)，由抗四环素作为标记菌株中染色体上的sucA通过同源重组被质粒的突变sucA替代的菌株被获得。得到的菌株记为SC17sucA菌株。

[0092]

为了确定SC17sucA菌株缺乏αKGDH活性，使用Reed等人的方法测量酶的活性(Reed，L.J.和Mukherjee，B.B.，酶学方法，13，第55-61页，(1969))，使用在LB培养基中培养到对数生长期的菌株的细胞。结果是，从SC17菌株中检测到αKGDH活性为0.073(ΔABS/min/mg蛋白质)，但从SC17sucA菌株中未检测到任何αKGDH活性，因此确定sucA按设想被消除了。

[0093]

(2)Pantoea ananatisSC17sucA菌株的L-谷氨酸生物合成系统的增强

之后，源自大肠埃希氏菌的柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和谷氨酸脱氢酶基因被引入SC17sucA菌株。

[0094]

(i)制备具有源自大肠埃希氏菌的gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒

制备具有源自大肠埃希氏菌的gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒的过程参考图2和3来解释。

[0095]

具有源自大肠埃希氏菌的gdhA基因的质粒，pBRGDH(JP7-203980A)，被HindIII和SphI消化，两端用T4DNA聚合酶处理为平端，然后具有gdhA基因的DNA片断被纯化和回收。分别的，具有源自大肠埃希氏菌的gltA基因和Ppc基因的质粒，pMWCP(WO97/08294)，被XbaI消化，两端用T4DNA聚合酶处理为平端。将这与上述纯化的具有gdhA基因的DNA片断混合，并用T4连接酶连接得到质粒pMWCPG，它对应于还含有gdhA基因(图2)的pMWCP。

[0096]

同时，具有宽寄主范围质粒RSF1010的复制起点的质粒pVIC40(JP8-047397A)被NotI消化，用T4DNA聚合酶处理并用PstI消化。PBR322被EcoT14I消化，用T4DNA聚合酶处理并用PstI消化。两个产品混合，并用T4连接酶连接得到具有RSF1010的复制起点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet(图3)。

[0097]

之后，pMWCPG被EcoRI和PstI消化，具有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的DNA片断被纯化和回收。RSF-Tet类似地被EcoRI和PstI消化，具有RSF1010的复制起点的DNA片断被纯化和回收。将两个产品混合并用T4连接酶连接得到质粒RSFCPG，它对应于含有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的RSF-Tet(图4)。确定了得到的质粒RSFCPG表达gltA基因、ppc基因和gdhA基因，这基于源自大肠埃希氏菌的gltA基因-、ppc基因-或gdhA基因-缺乏菌株的营养缺陷型的补充以及每种酶活性的测定。

[0098]

(ii)制备具有源自谷氨酸棒杆菌的gltA基因的质粒

具有源自谷氨酸棒杆菌的gltA基因的质粒按以下构造。通过使用具有核苷酸序列SEQ ID NOS：6和7且在谷氨酸棒杆菌的gltA基因的核苷酸序列的基础上制备的引物DNA(微生物学，140，第1817-1828页(1994))执行PCR，用谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板得到大约3kb的gltA基因片断。将此片断插入被SmaI消化的质粒pHSG399(购买于Takara Shuzo有限公司)，得到质粒pHSGCB(图5)。此后，pHSGCB被HindIII消化，将切除的大约3kb的gltA基因片断插入被HindIII消化的质粒pSTV29(购买于Takara Shuzo有限公司)得到质粒pSTVCB。确认了得到的质粒pSTVCB表达了gltA基因，其中通过测量Pantoea ananatisAJ13355菌株的酶活性。

[0099]

(iii)RSFCPG和pSTVCB引入SC17sucA菌株

Pantoea ananatisSC17sucA菌株通过电穿孔用RSFCPG转化，得到显示四环素抗性的转化体SC17sucA/RSFCPG菌株。因而，SC17sucA/RSFCPG菌株通过电穿孔用pSTVCB转化，得到显示氯霉素抗性的转化体SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株。

[0100]

<4>带有提高的在低pH值环境下抵抗L-谷氨酸性质的菌株的获得

带有提高的在低pH值环境下抵抗高浓度L-谷氨酸性质的菌株(此后，也作为“在低pH值下抵抗高浓度Glu菌株”)从Pantoeaa刀anatisSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株中分离。

[0101]

SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株在LBG培养基(10g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母抽提物、10g/LNaCl、5g/L葡萄糖)中在30℃下培养一整夜，用盐水洗过的细胞被适当稀释，铺在M9-E培养基(4g/L葡萄糖、17g/LNa₂HPO₄·12H₂O、3g/LKH₂PO₄、0.5g/LNaCl、1g/LNH₄Cl、10mMMgSO₄、10μMCaCl₂、50mg/L L-赖氨酸、50mg/LL-蛋氨酸、50mg/LDL-二氨基庚二酸、25mg/L四环素、25mg/L氯霉素、30g/LL-谷氨酸，用氨水调pH值到4.5)板上。在32℃下培养2天后出现的菌落作为在低pH值下抵抗高浓度Glu菌株被得到。

[0102]

对于得到的菌株，测量在M9-E液体培养基中的生长水平，并在含有5mlL-谷氨酸生产测试培养基(40g/L葡萄糖、20g/L硫酸铵、0.5g/L硫酸镁七水合物、2g/L磷酸二氢钾、0.5g/L氯化钠、0.25g/L氯化钙二水合物、0.02g/L硫酸亚铁七水合物、0.02g/L硫酸锰四水合物、0.72mg/L硫酸锌二水合物、0.64mg/L硫酸铜五水合物、0.72mg/L氯化钴六水合物、0.4mg/L硼酸、1.2mg/L钼酸钠二水合物、2g/L酵母抽提物、200mg/LL-盐酸赖氨酸、200mg/LL-蛋氨酸、200mg/LDL-α，ε-二氨基庚二酸、25mg/L盐酸四环素和25mg/L氯霉素)的50-ml容积的大试管中测试L-谷氨酸-生产能力。表现出最好的生长水平并同其母株的L-谷氨酸-生产能力相同的菌株，SC17/RSFCPG+pSTVCB菌株，被称为Pantoea ananatisAJ13601。AJ13601菌株已于1999年8月18日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(目前，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，国际专利生物保藏机构，中央6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)并收到入藏登记号FERMP-17516。然后它于2000年7月6日转为布达佩斯条约规定的国际保藏并收到入藏登记号FERM BP-7207。

[0103]

实施例1

Pantoea ananatisAJ13601菌株在含有泛酸钙(12mg/L)的培养基和不含有泛酸钙的培养基中培养来研究L-谷氨酸的生产力。

[0104]

特别的，按以下步骤培养。在30℃下在含有25mg/L盐酸四环素和25mg/L氯霉素的LBG琼脂培养基(10g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母抽提物、10g/LNaCl、15g/L琼脂)中培养14小时的PantoeaananatisAJ13601菌株的细胞从一板中刮下并接种到300ml具有以下组成并容纳在1L容积的广口瓶发酵罐中的种子培养基中，在34℃和pH值6.0条件下进行种子培养。

[0105]

[种子培养基的组成]

蔗糖 50g/L

MgSO₄·7H₂O 0.4g/L

KH₂PO₄ 2.0g/L

酵母抽提物 4.0g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·5H₂O 0.01g/L

L-盐酸赖氨酸 0.4g/L

DL-蛋氨酸 0.4g/L

ε-二氨基庚二酸 0.4g/L

盐酸四环素 25mg/L

氯霉素 25mg/L

[0106]

在培养期间加入氨水调整pH值至6.0。通过观察培养基中糖类的耗尽作为指示来完成种子培养，相当于主培养基容积的20％的种子培养基被接种到300ml容纳在1L容积的广口瓶发酵罐中的主培养基中以便在34℃和pH值4.5条件下进行主要培养。主培养基的组成如下所示。

[0107]

[主培养基的组成]

葡萄糖 50g/L

(NH₄)₂SO₄ 5.0g/L

MgSO₄·7H₂O 0.7g/L

KH₂PO₄ 6.0g/L

NaCl 1.5g/L

FeSO₄·7H₂O 0.01g/L

MnSO₄·5H₂O 0.01g/L

L-盐酸赖氨酸 0.8g/L

DL-蛋氨酸 0.6g/L

DL-α，ε-二氨基庚二酸 0.6g/L

盐酸四环素 25mg/L

氯霉素 25mg/L

氯化钙二水合物 0.75g/L

泛酸钙 12mg/L

(只在加入泛酸的培养中添加)

[0108]

在培养期间加入氨水调整pH值至4.5。当培养基中糖类被消耗并耗尽时，连续加入(5ml/hr)700g/L葡萄糖水溶液。当培养液中L-谷氨酸浓度达到45g/L时，在培养基中加入1.0g/LL-谷氨酸晶体作为促进L-谷氨酸在培养液中沉淀的种晶。

[0109]

进行主要培养50小时后，L-谷氨酸晶体以显著的量在广口瓶发酵罐中沉淀。然后加入氨气提高pH值到6.0，从而使所有L-谷氨酸晶体在广口瓶发酵罐中溶解。接着，测量所生产的L-谷氨酸的量。使用Asahi化学公司生产的自动酶电极分析器As210测量L-谷氨酸浓度。

[0110]

结果，发现通过加入泛酸使L-谷氨酸发酵产量明显提高，如表1所示。

[0111][表1]

表1

[0112]

研究了通过加入泛酸钙所提供的L-谷氨酸产量提高的起因。因而，确定3-羟基-2-丁酮、2，3-丁二醇和CO₂产生的减少(表2)。使用Shimadzu生产的气相色谱仪GC1700在以下条件测量3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇的浓度。

[0113]

[所使用的柱]

J&W Scientific生产的DB-210 123-0233，柱长：30m，柱直径：0.32mm，膜厚：5μm

[测量条件]

蒸汽室温度：250℃

载体气体：He

压力：85.6kPa

总流动速率：97.2ml/min

柱流动速率：0.93ml/min

线性粘度：25.0cm/sec

排空流动速率：3.0ml/min

分流比(split ratio)：100

柱温：70℃

补充(makeup)气体：He

补充流动速率：30.0ml/min

H₂流动速率：47ml/min

空气流动速率：400ml/min

[0114]

用ABLE生产的氧气二氧化碳消耗仪表(Exhaust oxygen carbondioxide meter)型号EX-1562测量释放的CO₂量。3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇的产量同由这些值计算出的CO₂产量示于表2(所有值用碳量表示)。由培养基中释放的CO₂测量值在不加泛酸时为26.5％，加入泛酸时为27.6％。

[0115]

当在培养基中加入泛酸钙时，3-羟基-2-丁酮、2，3-丁二醇和与前述物质的次级生产相关而产生的CO₂的量(3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇各一摩尔产生两摩尔CO₂)与不添加泛酸钙的情况作对比减少了约14.3％，这基于碳平衡。因为这个值与加入和不加入泛酸钙时L-谷氨酸发酵量的差值，即约13.1％，基本相当，可以认为由于加入泛酸钙带来产量提高的效果主要是由3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇次级生产(Secondary production)的减少引起的。

[0116][表2]

表2

[0117]

从以上结果看，通过加入泛酸改进L-谷氨酸发酵的机理如以下评估。即，可认为L-谷氨酸发酵量的提高是由于加入泛酸补偿了辅酶A(CoA)的缺乏。在泛酰巯基乙胺形态的CoA结构中含有泛酸，因此它是CoA的组分之一。CoA用作代谢途径中将丙酮酸转换为乙酰-CoA过程中的辅酶。另一方面，3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇由丙酮酸产生，CO₂与3-羟基-2-丁酮产生相关而被释放。当不在用于培养L-谷氨酸生产细菌的培养基中添加泛酸时，3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇在培养基中积累。因此，可以认为CoA最初在细菌中缺乏，且细菌中没有足够的乙酰-CoA产出，这带来的结果是3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇的次级生产。

[0118]

另一方面，当通过加入泛酸提供足够量的CoA时，就促进了由丙酮酸脱氢酶复合物(丙酮酸→乙酰-CoA)引起的反应，该反应由于CoA的缺乏起速度-限制因素的作用，因此促进了碳流入TCA循环。所以，可以认为L-谷氨酸的生产是通过α-酮戊二酸(αKG)作为结果而促进的。进而，当3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇产生减少时，同始自丙酮酸的这些物质的产生一起产生的CO₂也减少了(3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇各1摩尔产生2摩尔CO₂)。因此，认为这种减低也对于L-谷氨酸产量的提高有贡献(图6)。

[0119]

在上述机理的基础上，认为代替泛酸加入或在泛酸加入时加入的物质如D-泛解酸(D-panto acid)、β-丙氨酸或D-泛酰巯基乙胺会提供相当的或更好的产量提高效果。

[0120]

实施例2

加入到培养基中的泛酸钙的浓度变到0mg/L到196mg/L，以研究泛酸钙的浓度对于L-谷氨酸发酵量的影响。以同实施例1相同的方式除了将泛酸钙浓度变为0、1、2、4、8、12、24、48、96或192mg/L外进行培养。结果示于图7。由这些结果可以确认，L-谷氨酸发酵量可以依赖于泛酸钙浓度正向提高。即使当加入1mg/L泛酸钙时，与不加入(0mg/L)相比产量提高约5％。由于依赖于加入的泛酸钙浓度一直达到12mg/L的加入浓度都可以获得产量提高的效果，因此认为产量提高效果甚至在浓度低于1mg/L也可获得。

[0121]

实施例3

通过加入泛酸钠代替泛酸钙进行主要培养。培养条件与实施例1相同。泛酸钠以浓度12.15mg/L加入，以便泛酸的摩尔浓度会与加入12mg/L泛酸钙时得到的相当。结果示于表3。

[0122]

结果表示，相当的L-谷氨酸发酵量由泛酸钙和泛酸钠得到。因此，阐明了产量提高因素是泛酸本身，而不是泛酸的相反离子。

[0123][表3]

表3

实用性

[0124]

根据本发明，使用如属于泛菌属的细菌可以比传统技术更有效的生产L-谷氨酸。

序列表

<110>味之素株式会社

<120>生产L-谷氨酸的方法

<130>C210YMOPC4045

<150>2003-165545

<151>2003-06-10

<160>13

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>4556

<212>DNA

<213>Pantoea ananatis

<220>

<221>CDS

<222>(2)..(121)

<220>

<221>CDS

<222>(322)..(3129)

<220>

<221>CDS

<222>(3145)..(4368)

<220>

<221>CDS

<222>(4437)..(4556)

<400>1

<210>2

<211>39

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>2

<210>3

<211>935

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>3

<210>4

<211>407

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>4

<210>5

<211>40

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>5

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>6

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>7

<210>8

<211>16214

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：质粒RSFCPG

<400>8

<210>9

<211>427

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>9

<210>10

<211>447

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>10

<210>11

<211>883

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>11

<210>12

<211>6035

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：质粒pSTVCB

<220>

<221>CDS

<222>(2129)..(3439)

<400>12

<210>13

<211>437

<212>PRT

<213>Brevibacterium lactofermentum

<400>13

Claims

1.一种发酵生产L-谷氨酸的方法，它包括培养一种微生物，该微生物属于泛菌属，并且能在含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中在不超过5.0的pH值下代谢碳源，并具备在具有所述pH的液体培养基中积累L-谷氨酸的能力，其中L-谷氨酸的量超过了pH被控制以使L-谷氨酸沉淀的培养基中L-谷氨酸的所述饱和浓度所对应的量，所述液体培养基还含有泛酸，以使得在沉淀L-谷氨酸的同时引起L-谷氨酸的积累。

2.如权利要求1所述的方法，其中的微生物是Pantoeaananatis。

3.如权利要求1所述的方法，其中的微生物是Pantoea ananatisFERM BP-7207。

4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其中培养基中的泛酸是泛酸盐，且该盐的浓度是1mg/L或更高。