ES2243826T3 - Procedimiento para la produccion de l-aminoacidos. - Google Patents
Procedimiento para la produccion de l-aminoacidos.Info
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Abstract
Procedimiento para la producción de un L-aminoácido que comprende el cultivo de un microorganismo que posee la capacidad de producir un L-aminoácido en un medio para producir y acumular el L-aminoácido en el medio y la recogida del L-aminoácido a partir del medio, en el que el microorganismo es una bacteria gramnegativa que sigue la ruta Entner-Doudoroff y que se ha modificado de forma que la actividad de la 6-fosfogluconato deshidratasa o la actividad de la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa, o las actividades de ambas se incrementan, y el L-aminoácido se selecciona de entre los L-aminoácidos producidos por una ruta biosintética utilizando ácido pirúvico como intermediario.
Description
Procedimiento para la producción de
L-aminoácidos.
La presente invención se refiere a procedimientos
para la producción de L-aminoácidos y a bacterias
utilizadas para el mismo. Más precisamente, la presente invención se
refiere a bacterias que poseen una capacidad mejorada de producción
de L-aminoácido y a procedimientos para la
producción de L-aminoácidos utilizando las
mismas.
Convencionalmente, los
L-aminoácidos tales como el ácido
L-glutámico se producen principalmente mediante
fermentación utilizando las bacterias denominadas corineformes
pertenecientes al género Brevibacterium,
Corynebacterium o Microbacterium ("Amino Acid
Fermentation", Gakkai Shuppan Center,
págs.195-215, 1986). Además, los microorganismos del
género Bacillus, Streptomyces, Penicillium
(patente US nº 3.220.929),
Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia,
Aerobacter, Candida (patente US nº 3.563.857),
Escherichia (publicación de patente japonesa abierta al
público nº 5-244970 (Kokai)) o similares se pueden
utilizar asimismo en la producción de L-aminoácidos.
Además, los microorganismos que pertenecen al género
Enterobacter (documento EP 1 078 989 A2), Klebsiella,
Erwinia o Pantoea (publicación de patente japonesa
abierta al público nº 2000-106869) se pueden
utilizar asimismo en la producción de L-aminoácidos
tales como ácido L-glutámico.
Además, se han descrito diversas técnicas para
aumentar la capacidad de producción de L-aminoácidos
mediante el incremento de enzimas implicadas en la biosíntesis de
L-aminoácidos mediante técnicas de ADN recombinante.
Por ejemplo, se ha descrito un procedimiento para la producción de
ácido L-glutámico mediante la utilización de una
bacteria que pertenece al género Enterobacter o
Klebsiella en el que se introduce un gen de citrato sintasa
(documento EP 0 999 282 A2), y un procedimiento para la producción
de ácido L-glutámico utilizando una bacteria que
pertenece al género Enterobacter en el que se introducen los
genes que codifican la citrato sintasa, la fosfoenolpiruvato
carboxilasa y la glutamato deshidrogenasa (documento EP 1 078 989
A2).
Además, existen asimismo técnicas para
incrementar la capacidad de producción de
L-aminoácido mediante la introducción de genes que
codifican las enzimas glucolíticas tales como la
glucosa-6-fosfato isomerasa
(documento WO 01/02542 A1), fructosa fosfotransferasa (documento WO
01/48146 A1) y enolasa (documento WO 01/02543 A1).
Mientras, muchas bacterias gramnegativas que
incluyen enterobacterias siguen la ruta
Entner-Doudoroff como una de las rutas metabólicas
de la glucosa. Esta ruta implica la 6-fosfogluconato
deshidratasa (abreviada como "EDD" en lo sucesivo), que
cataliza una reacción para producir
2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato
a partir de ácido 6-fosfoglucónico, y
2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato
aldolasa (abreviada como "EDA" en lo sucesivo), que escinde
2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato
para producir
gliceraldehído-3-fosfato y ácido
pirúvico. Los genes que codifican EDD y a EDA se han clonado a
partir de Escherichia coli, Zymomonas mobilis y así
sucesivamente y se han publicado sus secuencias nucleótidas. Las
secuencias nucleótidas del gen que codifica EDD (edd) y del
gen que codifica EDA (eda) de la Escherichia coli se
registran como número de entrada L20897 en el GenBank. Además, la
secuencia de nucleótidos del gen eda de para Zymomonas
mobilis se registra como número de entrada X58364 en el GenBank,
y la secuencia nucleótida del gen edd de la misma se registra
como número de entrada M60615 M37982 en la base de datos del
Genbank.
Sin embargo, se desconoce la relación entre la
ruta Entner-Doudoroff y la productividad de los
L-aminoácidos.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar una técnica para mejorar la productividad de
L-aminoácidos en las bacterias desde un punto de
vista diferente de las técnicas conocidas.
Los inventores de la presente invención centraron
su atención en la ruta Entner-Doudoroff seguida por
las bacterias gramnegativas. Entre las rutas metabólicas desde
sacáridos a L-aminoácidos tales como el ácido
L-glutámico, se produce dióxido de carbono mediante
una reacción para producir
ribulosa-5-fosfato a partir de
ácidos 6-fosfoglucónicos mediante
6-fosfogluconato deshidrogenasa. En las cepas de
bacterias que poseen una gran entrada de carbono en la ruta de la
pentosa fosfato, en particular, se debería asimismo liberar una gran
cantidad de dióxido de carbono mediante la reacción mencionada
anteriormente. Por lo tanto, consideraron que una capacidad de
producción de un L-aminoácido tal como el ácido
L-glutámico se podría mejorar evitando la entrada en
la ruta de la pentosa fosfato.
Se concibieron dos de los procedimientos para
reducir la entrada de carbono en la ruta de la pentosa fosfato: (1)
eliminar o reducir una actividad de
glucosa-6-fosfato deshidrogenasa o
de 6-fosfogluconato deshidrogenasa; y (2) aumentar
la ruta Entner-Doudoroff. Se puede esperar que ambos
procedimientos posean un efecto de desviación de la ruta de la
pentosa fosfato. Sin embargo, en el caso de (2), se considera que,
ya que la distribución de carbono con respecto a la ruta de la
pentosa fosfato se puede cambiar mediante la regulación de las
actividades de EDD y de EDA, se puede asimismo suministrar un
derivado de una sustancia intermedia en la ruta de la pentosa
fosfato tal como ácido nucleico. Además, como resultado de diversas
investigaciones, se encontró que se puede mejorar la capacidad de
las bacterias para la producción de L-aminoácidos
mediante el incremento de la ruta Entner-Doudoroff,
y de este modo llevar a cabo la presente invención.
Esto es, la presente invención proporciona los
siguientes.
- (1)
- Procedimiento para la producción de un L-aminoácido que comprende cultivar un microorganismo que posee la capacidad de producción de un L-aminoácido en un medio para producir y acumular el L-aminoácido en el medio y recoger el L-aminoácido a partir del medio, en el que el microorganismo es una bacteria gramnegativa que sigue la ruta Entner-Doudoroff y que se ha modificado de forma que la actividad 6-fosfogluconato deshidratasa o la actividad 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa, o las actividades de ambas se incrementan, y que el L-aminoácido se selecciona de entre los L-aminoácidos producidos mediante una ruta biosintética utilizando ácido pirúvico como un intermedio.
- (2)
- Procedimiento según (1), en el que la bacteria es una enterobacteria.
- (3)
- Procedimiento según (2), en el que la bacteria pertenece al género Enterobacter.
- (4)
- Procedimiento según cualquiera de (1) a (3), en el que la actividad de la 6-fosfogluconato deshidratasa o la actividad de la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldosa aumenta mediante el incremento del número de copias de un gen que codifica la 6-fosfogluconato deshidratasa o la 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato aldolasa o modifica una secuencia reguladora de la expresión del gen de forma que la expresión del gen se incremente en una célula de la bacteria.
- (5)
- Procedimiento según (1), en el que el L-aminoácido es ácido L-glutámico o un L-aminoácido producido por una ruta biosintética que utiliza un ácido L-glutámico como intermediario o un grupo amino donador.
- (6)
- Procedimiento según cualquiera de (1) a (5), en el que el L-aminoácido se selecciona de entre el grupo que comprende ácido L-glutámico, L-arginina, L-glutamina, L-prolina, L-leucina, L-isoleucina, L-valina y L-alanina.
- (7)
- Procedimiento según (6), en el que el L-aminoácido es ácido L-glutámico.
Según la presente invención, aumentando la
actividad de la ruta Entner-Doudoroff, se puede
mejorar la capacidad de un microorganismo que sigue la ruta de
producción de un L-aminoácido.
La fig. 1 muestra el crecimiento de una cepa en
la que el gen edd y el gen eda se incrementan (A) y la
cantidad producida del ácido L-glutámico (B).
La fig. 2 muestra las cantidades de acetoína y
2,3-butanodiol producidas por una cepa en la que el
gen edd y el gen eda se incrementan: (A) cantidad de
acetoína en un medio, (B) cantidad de 2,3-butanodiol
en un medio, y (C) cantidad total de acetoína y
2,3-butanodiol producida por unidad de células
bacterianas (peso por unidad de peso de célula seca).
A continuación, la presente invención se
explicará en detalle.
La bacteria gramnegativa utilizada en la presente
invención es una bacteria gramnegativa que posee una capacidad de
producción de un L-aminoácido y sigue la ruta
Entner-Doudoroff.
El término "una capacidad de producción de un
L-aminoácido" utilizado en la presente invención
significa una capacidad para acumular el
L-aminoácido en un medio cuando la bacteria de la
presente invención se cultiva en el medio. Esta capacidad de
producción de un L-aminoácido puede ser una
propiedad de una cepa natural de la bacteria gramnegativa o una
propiedad impartida o aumentada por el cultivo. Los
L-aminoácidos a los que se les puede aplicar la
presente invención se producen por una ruta biosintética que utiliza
ácido pirúvico como intermediario. Ejemplos específicos de los
mismos incluyen ácido L-glutámico,
L-arginina, L-glutamina,
L-prolina, L-leucina,
L-isoleucina, L-valina,
L-alanina y así sucesivamente.
Según se muestra en los ejemplos que se describen
posteriormente, una bacteria que sigue la ruta
Entner-Doudoroff incrementada mediante el aumento de
las actividades de EDD y de EDA mostró una producción incrementada
de acetoína y 2,3-butanodiol. Ya que se produce
2,3-butanodiol a partir de acetoína, y la acetoína
se produce a partir de ácido pirúvico, el aumento en la producción
de la acetoína y 2,3-butanodiol indica un aumento en
la cantidad de ácido pirúvico suministrada. Por lo tanto, se espera
que la bacteria que sigue la ruta Entner-Doudoroff
incrementada posea una capacidad incrementada de producción de un
L-aminoácido producido por una ruta biosintética que
utiliza ácido pirúvico como intermediario.
Ejemplos específicos de las bacterias
gramnegativas que siguen la ruta Entner-Doudoroff
incluyen bacterias que pertenecen a los géneros Enterobacter,
Klebsiella, Serratia, Erwinia o Pantoea,
Escherichia, Pseudomonas, Arthrobacter, y
Aerobacter y así sucesivamente. Se puede determinar si una
bacteria toma o no la ruta Entner-Doudoroff
mediante, por ejemplo, la mezcla de una suspensión de célula
desorganizada con
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, ácido 6-fosfoglucónico y
dinucleótido de acetilpiridina adenina y de la detección del
gliceraldehído-3-fosfato producido a
partir de ácido-6-fosfoglucónico
como sustrato mediante la medición del incremento de absorbancia a
365 nm. Una bacteria que se confirme que produce
gliceraldehído-3-fosfato sigue la
ruta Entner-
Doudoroff.
Doudoroff.
Las bacterias utilizadas en la presente invención
se pueden seleccionar adecuadamente dependiendo del tipo de
L-aminoácido objetivo. Las bacterias adecuadas para
la producción de ácido L-glutámico se ejemplifican a
continuación. Sin embargo, el alcance de la presente invención no se
limita a estos ejemplos.
Los ejemplos específicos de las bacterias
Enterobacter incluyen las bacterias siguientes.
- Enterobacter agglomerans
- Enterobacter aerogenes
- Enterobacter amnigenus
- Enterobacter asburiae
- Enterobacter cloacae
- Enterobacter dissolvens
- Enterobacter gergoviae
- Enterobacter hormaechei
- Enterobacter intermedius
- Enterobacter nimipressuralis
- Enterobacter sakazakii
- Enterobacter taylorae
Las cepas más preferidas son las cepas
bacterianas siguientes.
- Enterobacter agglomerans ATCC 12287
- Enterobacter agglomerans AJ13355
- Enterobacter agglomerans AJ13356
- Enterobacter agglomerans AJ13601
Se declararon el Enterobacter agglomerans
AJ13355 y AJ13556 en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology (actualmente, la corporación administrativa
independiente, International Patent Organism Depositary, National
Institute of Advanced Industrial Science and Technology, dirección:
Chuo Dai-6, 1-1 Higashi
1-Chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, Japón, código postal:
305-5466) el 19 de febrero de 1998 y se obtuvieron
números de entrada de FERM P-16644 y FERM
P-16645, respectivamente. A continuación, las
declaraciones se convirtieron en declaraciones internacionales bajo
las disposiciones del Budapest Treaty el 11 de enero de 1999, y se
obtuvieron los números de entrada de FERM BP-6614 y
FERM BP-6615. Se declaró el Enterobacter
Agglomerans AJ13601 en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Bioscience and Human
Technology el 18 de agosto de 1999, y se obtuvieron los números de
entrada de FERM P-17516. A continuación, la
declaración se convirtió en una declaración internacional bajo las
disposiciones del Budapest Treaty el 6 de julio de 2000, y se
obtuvieron los números de entrada de FERM BP-7207.
El Enterobacter agglomerans ATCC 12287 se puede obtener a
partir de ATCC (American Type Culture Collection, 10801 University
Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, U.S.A.).
\newpage
Ejemplos de bacterias que pertenecen al género
Klebsiella incluyen las bacterias siguientes:
- Klebsiella planticola
- Klebsiella terrigena
La más preferida es Klebsiella planticola
AJ13399. La Klebsiella planticola AJ13399 se declaró en el
National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology (actualmente, la corporación administrativa
independiente, International Patent Organism Depositary, National
Institute of Advanced Industrial Science and Technology) el 19 de
febrero de 1998 y se obtuvo el número de entrada de FERM
P-16646. A continuación, la declaración se convirtió
en una declaración internacional bajo las disposiciones del Budapest
Treaty el 11 de enero de 1999 y se obtuvo el número de entrada de
FERM BP-6616.
La cepa de Klebsiella Planticola AJ13399
es una cepa aislada del suelo en Sapporo-shi,
Hokkaido.
Ejemplos de los microorganismos que pertenecen al
género Serratia utilizados en la presente invención incluyen
los siguientes.
- Serratia liquefacience
- Serratia entomophila
- Serratia ficaria
- Serratia fonticola
- Serratia grimesii
- Serratia proteamaculans
- Serratia odorifera
- Serratia plymuthica
- Serratia rubidaea
Las cepas de las bacterias siguientes son las más
preferidas.
- Serratia liquefacience ATCC 14460
- Serratia liquefacience ATCC 14460 se puede distribuir a partir de ATCC.
Los ejemplos de los microorganismos que
pertenecen al género Erwinia utilizados en la presente
invención incluyen los siguientes.
- Erwinia herbicola (clasificada actualmente como Pantoea agglomerans)
- Erwinia ananas
- Erwinia cacticida
- Erwinia chrysanthemi
- Erwinia mallotivora
- Erwinia persicinus
- Erwinia psidii
- Erwinia quercina
- Erwinia rhapontici
- Erwinia rubrifaciens
- Erwinia salicis
- Erwinia uredovora
La más preferida es Erwinia herbicola
IAM1595 (Pantoea agglomerans AJ2666). La Erwinia
herbicola IAM1595 se puede obtener a partir del Institute of
Molecular and Cellular Biosciences, Universidad de Tokio.
La Erwinia herbicola no se menciona en el
Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 9ª ed., y el
microorganismo que se ha clasificado como Erwinia herbicola
se clasifica como Pantoea agglomerans. De este modo, los
microorganismos que pertenecen al género Erwinia y los
microorganismos que pertenecen al género Pantoea están muy
relacionados. Por lo tanto, los microorganismos que pertenecen al
género Pantoea se pueden utilizar de forma similar como
microorganismos que pertenecen al género Erwinia. Como tales
microorganismos que pertenecen al género Pantoea, se pueden
mencionar Pantoea agglomerans, Pantoea dispersa y
Pantoea ananas. La Erwinia herbicola IAM1595 se
designó como Pantoea agglomerans AJ2666, declarada en el
National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of
Bioscience and Human Technology (actualmente, International Patent
Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial
Science and Technology) como un número de declaración internacional
bajo las disposiciones del Budapest Treaty el 25 de febrero de 1999,
y se obtuvo un número de entrada de FERM
BP-6660.
Los ejemplos de los microorganismos que
pertenecen al género Escherichia utilizados en la presente
invención incluyen Escherichia coli.
La más preferida es la Escherichia coli
que posee resistencia de valina, y los ejemplos específicos son las
cepas siguientes.
- Escherichia coli K-12 (ATCC 10798)
- Escherichia coli W (ATCC 9637)
- Escherichia coli K-12 (ATCC 10798) y Escherichia coli W (ATCC 9637) se pueden obtener a partir de ATCC.
La bacteria gramnegativa de la presente invención
es una bacteria gramnegativa que posee una capacidad de producción
de un L-aminoácido y la ruta
Entner-Doudoroff mencionada anteriormente que se ha
modificado de forma que se incremente la actividad de EDD o la de
EDA o ambas actividades. La bacteria de la presente invención es
preferentemente una bacteria gramnegativa que se ha modificado de
forma que se incrementen las actividades de EDD y de EDA.
La expresión "modificada de forma que se
incremente la actividad de EDD o la de EDA" significa que la
actividad de EDD o la de EDA por célula es mayor que la de la
bacteria de tipo natural. Por ejemplo, en las que el número de
moléculas de EDD o de EDA por célula se incrementa, en las que se
incrementa la actividad específica de EDD o EDA por molécula de EDD
o de EDA y se pueden mencionar así sucesivamente. Además, la
bacteria de tipo natural que se va a comparar es una bacteria que no
se ha sometido a ninguna manipulación para aumentar la actividad de
EDD o de EDA.
El aumento de la actividad de EDA y/o de EDA en
una bacteria se consigue mediante el incremento del número de copias
de un gen que codifica el EDD y/o el EDA. Por ejemplo, el ADN
recombinante se puede preparar ligando un fragmento de gen que
codifica al EDD y/o al EDA con un vector que funcione en una
bacteria objetivo, preferentemente un tipo de vector multicopia, y
se pueda introducir en la bacteria para transformarlo. Cuando se
incrementan las actividades tanto de EDD como de EDA, el fragmento
de gen codificador de EDD y el fragmento de gen que codifica EDA se
pueden incorporar separadamente en vectores diferentes, pero se
incorporan preferentemente en el mismo vector. El ADN recombinante
se puede introducir en una bacteria que posee una capacidad de
producción de un de L-aminoácido, alternativamente
el ADN recombinante se puede introducir en una bacteria de tipo
natural para obtener una cepa transformante, y a continuación a la
cepa transformante se le puede conferir la capacidad de producción
del L-aminoácido.
Como gen que codifica EDD y gen que codifica EDA,
se pueden utilizar cualquiera de los genes derivados de bacterias
gramnegativas que siguen la ruta Entner-Doudoroff.
Específicamente, se pueden mencionar los genes derivados de las
bacterias de Escherichia. Se ha publicado que el gen que
codifica EDD (edd) y el gen que codifica EdzA (eda)
derivado de Escherichia coli forman un operón (J. Bacteriol.,
174 (14); 4638-46, julio 1992). En lo sucesivo, se
designará el gen que codifica EDD como edd, y el gen que
codifica EDA como eda. Además, se han publicado asimismo los
genes de bacterias del género Zymomonas, y se pueden obtener
el gen edd y el gen eda mediante PCR (Polymerasa Chain
Reaction, referido a White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185
(1989)) utilizando cebadores preparados basados en las secuencias de
estos genes o la hibridización utilizando una sonda preparada basada
en las secuencias de genes mencionadas anteriormente. Por ejemplo,
un fragmento de operón que contiene el gen edd y el gen
eda de Escherichia coli se puede obtener mediante PCR
utilizando cebadores edd-F (SEC. ID. nº: 1) y
eda-R (ID. SEC. nº: 2) descrito posteriormente. Se
pueden obtener de forma similar el gen edd y el gen
eda de otros microorganismos. La condición de hibridización
se ejemplifica mediante una condición bajo la que se realiza el
lavado a una concentración salina que corresponde a 1 x SSC, 0,1% de
SDS, preferentemente 0,1 x SSC, 0,1% de SDS, a 60ºC.
Además, el gen edd y el gen eda
utilizados en la presente invención no se limitan a los genes de
tipo natural, y pueden ser genes mutantes o modificados
artificialmente que codifican productos de gen que incluyen
sustitución, deleción, inserción, adición o similares de uno o
varios aminoácidos en uno o más sitios siempre que las funciones de
los EDD y EDA codificados no se degraden. Aunque difiera el número
de varios aminoácidos "distintos" referidos en la presente
memoria, dependiendo de la posición o el tipo de residuos de
aminoácidos en una estructura de tres dimensiones de una proteína,
pueden ser específicamente de 2 a 60, preferentemente de 2 a 40, más
preferentemente de 2 a 20. Además, como ADN que codifica una
proteína sustancialmente idéntica a la EDD y/o EDA mencionada
anteriormente, se puede mencionar ADN hibridizable con secuencias de
nucleótidos de un gen edd o eda conocido (por ejemplo,
número de entrada al GenBank L20897, X58364, M60615, M37982) o una
sonda que se puede producir a partir de estas secuencias de
nucleótidos bajo una condición severa y que codifique a una proteína
que posee una actividad similar a la de EDD o de EDA. La
"condición severa" referida en la presente memoria es una
condición bajo la que se forma un híbrido específico denominado así,
y no se forma un híbrido no específico. Es difícil expresar
claramente esta condición mediante valores numéricos. Sin embargo,
por ejemplo, la condición severa incluye una condición bajo la que
los ADN que poseen homología elevada, por ejemplo, ADN que poseen
homología del 50% o más, se hibridizan uno con otro, pero los ADN
que poseen homología inferior a la anterior no se hibridizan uno con
otro. Alternativamente, la condición severa se ejemplifica mediante
una condición bajo la que los ADN se hibridizan uno con otro a una
concentración salina correspondiente a una condición de lavado
normal de la hibridización Southern, es decir, 1 x SSC, 0,1% de SDS,
preferentemente 0,1 x SSC, 0,1% de SDS a 60ºC.
El ADN cromosómico se puede preparar a partir de
una bacteria como un donador de ADN mediante, por ejemplo, el
procedimiento de Saito y Miura (véase H. Saito y K. Miura, Biochem.
Biophys. Acta, 72, 619 (1963), Text for Bioengineering Experiments,
editado por la Society for Bioscience and Bioengineering, Japón,
págs. 97-98, Baifukan, 1992) o similares.
Si el ADN recombinante se prepara ligando el gen
edd y/o del gen eda amplificado por PCR con el vector
de ADN autónomamente replicable en una célula de Escherichia
coli o similar y se introduce en la Escherichia coli, las
operaciones siguientes son más fáciles. Ejemplos del vector
autónomamente replicable en la célula de Escherichia coli
incluyen pMW219, pSTV28, pUC19, pUC18, pHSG299, pHSG399, pHSG398,
RSF1010, pBR322, pACYC184 y así sucesivamente.
Para introducir el ADN recombinante preparado
como se ha descrito anteriormente en una bacteria gramnegativa, se
han utilizado los procedimientos de transformación que se han
publicado hasta ahora. Por ejemplo, se puede mencionar el
procedimiento de D.A. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326,
(1979)), un procedimiento de tratamiento de células receptoras con
cloruro de calcio de forma que aumente la permeabilidad de ADN
(Mandel, M. y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), un
procedimiento de electroporación (Miller J. H., "A Short Course in
Bacterial Genetics; Handbook", Cold Spring Harbor Laboratory
Press, U.S.A., pág. 279, 1992) y así sucesivamente.
El número de copias del gen edd y/o gen
eda se puede incrementar asimismo permitiendo copias
múltiples de estos genes que existen en el ADN cromosómico de una
bacteria. Para introducir múltiples copias del gen edd y/o
del gen eda en el ADN cromosómico de una bacteria, se lleva a
cabo la recombinación homóloga utilizando una secuencia cuyas copias
múltiples existen en el ADN cromosómico como un objetivo. Como
secuencias cuyas copias múltiples existen en el ADN cromosómico, ADN
repetitivo o de repetición invertida, se pueden utilizar las que
existen en el extremo de un elemento transponible. Además, según se
describe en la publicación abierta al público de patente japonesa nº
2-109985, es posible incorporar asimismo el gen
edd y/o el gen eda en un transposón, y permitir que se
transfiera para introducir copias múltiples de los genes en el ADN
cromosómico.
El incremento de las actividades de EDD y/o de
EDA se puede conseguir asimismo, además de estar basadas en la
amplificación de gen mencionada anteriormente, mediante la
sustitución de una secuencia reguladora de la expresión tal como un
promotor del gen edd y/o del gen eda en el ADN
cromosómico o plásmido con uno más fuerte. Por ejemplo, se conocen
como promotores fuertes el promotor lac; promotor trp, promotor trc
y así sucesivamente. Además, según se describe en la publicación de
patente internacional WO00/18935, mediante la introducción de una
sustitución de varios nucleótidos en la región del promotor del gen
edd y/o gen eda, el promotor se puede modificar de
forma que llegue a ser un promotor más fuerte. La sustitución o
modificación de estos promotores aumenta la expresión del gen
edd y/o gen eda, y de este modo se incrementan las
actividades de EDD y/o EDA. La modificación de estas secuencias
reguladoras de expresión se puede combinar con el aumento del número
de copias del gen edd y/o del gen eda.
El incremento de las actividades de EDD y EDA se
puede confirmar mezclando una suspensión de célula desorganizada con
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa y ácido 6-fosfoglucónico y midiendo
el gliceraldehído-3-fosfato
producido a partir de ácido 6-fosfoglucónico como
sustrato. En esta reacción, la actividad de EDD se puede medir
mediante la cuantificación de ácido 6-fosfoglucónico
que queda después de la reacción mediante la utilización de
6-fosfogluconato deshidrogenasa, o cuantificar el
ácido pirúvico producido en presencia de la
2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato
aldolasa utilizando la lactato deshidrogenasa. El ácido
6-fosfoglucónico o ácido pirúvico se puede
cuantificar como un incremento de NADH en la reacción de
deshidrogenasa. Además, la actividad de EDA se puede medir asimismo
mediante la detección de ácido pirúvico producido a partir de
2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato
como sustrato mediante la utilización de la lactato
deshidrogenasa.
En la bacteria gramnegativa de la presente
invención, se puede aumentar la actividad de la enzima catalizadora
de una biosíntesis del L-aminoácido más que el EDD y
el EDA se puede aumentar mientras no se degrade el efecto de las
actividades incrementadas de EDD y EDA.
Por ejemplo, cuando un
L-aminoácido objetivo es ácido
L-glutámico, los ejemplos de dicha enzima incluyen
glutamato deshidrogenasa (designada asimismo como "GDH" en lo
sucesivo), glutamina sintetasa, glutamato sintasa, isocitrato
deshidrogenasa, aconitato hidratasa, citrato sintasa (designada
asimismo como "CS" en lo sucesivo), fosfoenolpiruvato
carboxilasa (designada asimismo como "PEPC" en lo sucesivo),
fosfoenolpiruvato sintasa, piruvato deshidrogenasa, piruvato cinasa,
piruvato carboxilasa, enolasa, fosfogliceromutasa, fosfoglicerato
cinasa, gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, triosafosfato isomerasa, fructosa bisfosfato
aldolasa, fosfofructocinasa, glucosafosfato isomerasa y así
sucesivamente. Cuando una bacteria utilizada en la producción de
ácido L-glutámico es una bacteria
Enterobacter, se prefiere cualquiera de las tres clases de
CS, PEPC y GDH entre las enzimas mencionadas anteriormente. Además,
se prefiere que se incrementen todas las actividades de las tres
clases de enzimas, CS, PEPC y GDH. En particular, se prefiere la CS
de Brevibacterium lactofermentum porque no sufre de la
inhibición por ácido \alpha-cetoglutárico, ácido
L-glutámico y NADH.
Como organismos que pueden ser fuentes
suministradoras del gen que codifica CS (gltA), el gen que codifica
PEPC (ppc) y el gen que codifica GDH (gdhA), se pueden utilizar
cualquier organismo siempre que posea la actividad de CS, PEPC y
GDH. En particular, se prefieren bacterias que sean procariotas, por
ejemplo, bacterias que pertenecen al género Enterobacter,
Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia,
Corynebacterium, Brevibacterium o Bacillus. Ejemplos específicos
de las mismas incluyen Escherichia coli, Brevibacterium
lactofermentum y así sucesivamente. El gen gltA, el gen ppc y el
gen gdhA se pueden obtener de ADN cromosómico de los microorganismos
mencionados anteriormente.
El gen gltA, el gen ppc y el gen gdhA se pueden
obtener utilizando un mutante deficiente en actividad de CS, PEPC o
GDH y aislando un fragmento de ADN que complemente su auxotrofía a
partir de ADN cromosómico de los microorganismos mencionados
anteriormente. Además, debido a que ya se han elucidado las
secuencias de nucleótidos de estos genes de bacterias de
Escherichia y de estos genes de bacterias
Corynebacterium (Biochemistry, 22; 5243-5249,
1983; J. Biochem., 95:909-916, 1984; Gene, 27:
193-199, 1984; Microbiology, 140;
1817-1828, 1994; Mol. Gen. Genet., 218,
330-339, 1989; Molecular Microbiology, 6;
317-326, 1992), éstos se pueden obtener mediante
síntesis de cebadores basada en las secuencias de nucleótidos
respectivas y realizando PCR utilizando ADN cromosómico como
plantilla. La introducción de estos genes en la bacteria
gramnegativa tal como la bacteria Enterobacter se describe en
el documento EP 0 670 370 A2, patente U.S. nº 6.197.559, documento
EP 0 999 282 A2 y documento EP 1 078 989 A2 en detalle.
Las actividades de CS, PEPC y GDH además de las
otras actividades enzimáticas mencionadas anteriormente se pueden
aumentar de la misma manera que el aumento de las actividades de EDD
y de EDA mencionadas anteriormente.
Además, en la bacteria de la presente invención,
una actividad enzimática para catalizar una reacción para producir
otro compuesto mediante ramificación de una ruta biosintética de un
L-aminoácido objetivo se puede reducir o eliminar
mientras que no se degrade el efecto del incremento de las
actividades de EDD y/o EDA. Por ejemplo, cuando el
L-aminoácido objetivo es ácido
L-glutámico, los ejemplos de dicha enzima incluyen
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa (designada
asimismo como "\alphaKGDH" en lo sucesivo), isocitrato liasa,
fosfatoacetil transferasa, acetato cinasa, acetohidroxiácido
sintasa, acetolactato sintasa, formiatoacetil transferasa, lactato
deshidrogenasa, L-glutamato descarboxilasa,
1-pirrolina deshidrogenasa y así sucesivamente.
Para reducir o eliminar las actividades de las
enzimas mencionadas anteriormente, un procedimiento para tratar un
microorganismo con irradiación de rayos ultravioletas o un agente de
mutagénesis en un tratamiento de mutación normal tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
(NTG) o ácido nitroso y seleccionar una cepa mutante en la que se
reduce la actividad enzimática objetivo, se puede utilizar un
procedimiento disruptivo del gen que utiliza la sustitución de gen
basada en la recombinación homóloga, o similar. La disrupción del
gen que codifica \alphaKGDH se describe en la patente U.S. nº
5.977.331.
Cuando los genes diferentes del gen edd y
del gen eda se introducen tras la construcción de la bacteria
de la presente invención, se prefiere utilizar pocas clases de
vectores. Es decir, un vector por lo general posee un gen marcador,
y se necesita añadir un agente correspondiente al gen marcador o
similar a un medio. Por lo tanto, si se utilizan muchas clases de
vectores, se deben añadir al medio un gran número de agentes. Esto
puede resultar en un crecimiento pobre de bacterias. Por lo tanto,
es preferible por lo general utilizar pocas clases de vectores. Es
preferible utilizar dos o menos clases, más preferentemente una
clase de vectores o vector.
Además, cuando se utilizan dos o más clases de
vectores que cada una posee un número de copias diferente, es
preferible determinar la distribución de los genes entre un vector
de un número de copias elevado y un vector de un número de copias
bajo dependiendo de las clases de los genes que se van a
introducir.
Para las operaciones de aislamiento de un gen,
introducción de un gen en una bacteria huésped, disrupción del gen y
así sucesivamente, se pueden utilizar los procedimientos bien
conocidos por los expertos en la materia tal como procedimientos de
preparación de ADN cromosómico, construcción de un biblioteca de ADN
cromosómico, hibridización, PCR, preparación de ADN plásmido,
digestión y ligación de ADN, transformación, diseño de
oligonucleótidos utilizados como cebadores y así sucesivamente.
Estos procedimientos se describen en Sambrook J., Fritsch E.F., y
Maniatis T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second
Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) y así
sucesivamente.
Se puede producir un L-aminoácido
mediante el cultivo de la bacteria de la presente invención obtenida
según se ha descrito anteriormente en un medio para producir y
acumular el L-aminoácido en el medio y la recogida
del L-aminoácido a partir del medio.
Para producir un L-aminoácido
utilizando la bacteria de la presente invención, se pueden utilizar
medios normales que contienen una fuente de carbono, una fuente de
nitrógeno, sales inorgánicas y cantidades traza de nutrientes
orgánicos tales como aminoácidos y vitaminas según se requiere de
una forma convencional. Se puede utilizar un medio sintético o un
medio natural. Se puede utilizar cualquier clase de fuente de
carbono y de fuente de nitrógeno mientras se puedan utilizar por las
cepas de las bacterias que se van a cultivar.
Como fuente de carbono, se utilizan sacáridos,
tales como glucosa, glicerol, fructosa, sacarosa, maltosa, manosa,
galactosa, hidrolizado de almidón y melazas. Se utilizan asimismo
ácidos orgánicos como ácido acético y ácido cítrico y alcoholes
tales como etanol solos o en combinación con otras fuentes de
carbono. Entre éstas, se prefieren la glucosa y la sacarosa.
Como fuente de nitrógeno, se puede utilizar
amoniaco, sales de amonio tales como sulfato de amonio, carbonato de
amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio y acetato de amonio,
nitratos y así sucesivamente.
Como nutrientes orgánicos en cantidades traza, se
pueden utilizar aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos y ácidos
nucleicos, además de peptona, ácido casamino, extracto de levadura y
producto de descomposición de proteína de soja que contiene estos
últimos y así sucesivamente. Cuando se utiliza un mutante
auxotrófico que requiere un aminoácido o similar para el
crecimiento, se prefiere suministrar dicho nutriente requerido.
Como sales inorgánicas, se pueden utilizar
fosfatos, sales de magnesio, sales de calcio, sales de hierro, sales
de manganeso y así sucesivamente.
En cuanto al cultivo, aunque depende del tipo de
bacteria que se va a utilizar, se realiza por lo general el cultivo
de aireación mientras se controla la temperatura de fermentación de
20 a 45ºC y el pH de 5 a 9. Cuando el pH cae durante el cultivo, se
añade el carbonato de calcio, o el cultivo se neutraliza con un
álcali tal como un gas de amoniaco. En el cultivo de esta manera
durante aproximadamente 10 a 120 horas, se acumula una marcada
cantidad de L-glutamina en un caldo de cultivo.
Como procedimiento para la recogida de
L-aminoácidos a partir del caldo de cultivo después
de la completación del cultivo, se pueden utilizar procedimientos
conocidos de recogida, por ejemplo, procedimientos que utilizan
resinas de intercambio iónico, precipitación y así
sucesivamente.
En lo sucesivo, la presente invención se
explicará más específicamente con referencia a los ejemplos
siguientes.
El gen edd y el gen eda, que
codifican las enzimas EDD y EDA, respectivamente, involucradas en la
ruta Entner-Doudoroff, se han clonado a partir de
Escherichia coli, Zymomonas mobilis y así
sucesivamente. El Enterobacter agglomerans taxonómicamente
pertenece al grupo enterobacterias y se considera estrechamente
relacionado a la Escherichia coli. Además, se conoce que los
genes de la Escherichia coli se pueden expresar en
Enterobacter agglomerans. En consecuencia, se decidió clonar
el gen edd y el gen eda a partir de la Escherichia
coli.
Estos dos genes forman un operón en la
Escherichia coli (J. Bacteriol., 174 (14):
4638-46, julio 1992). En consecuencia,
edd-F (ID. SEC. nº: 1) y eda-R (ID.
SEC. nº: 2) se diseñaron como cebadores que podían simultáneamente
amplificar ambos genes para amplificar un fragmento de ADN
incluyendo ambos genes por PCR. Se realizó la PCR utilizando
polimerasa Pyrobest ADN (Takara Shuzo) y consistió en una reacción a
94ºC durante 1 minuto, seguida por reacciones a 94ºC durante 30
segundos, 60ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 3 minutos
repetidos durante 30 ciclos.
Posteriormente, el fragmento amplificado obtenido
se digirió completamente con enzimas de restricción SalI y
BamHI, ligadas con plásmido pMW219 digerido completamente con
enzimas de restricción SalI y BamHI y utilizado para
transformar la Escherichia coli JM109 (comprada a Takara
Shuzo). Se seleccionaron a partir de los transformantes obtenidos
cinco cepas de clones que contenían un fragmento que posee un tamaño
deseado, y se extrajeron los plásmidos a partir de estas cepas.
Cada plásmido se introdujo en la cepa de
Enterobacter agglomerans AJ13601 mediante el procedimiento de
electroporación (Miller J.H., "A Short Course in Bacterial
Genetics; Handbook", Cold Spring Harbor Laboratory Press, USA,
pág. 279, 1992), y las actividades de EDD y EDA se midieron para
seleccionar un clon en el que se expresaron el gen edd y el
gen eda.
La cepa AJ13601 es una cepa de bacterias obtenida
como sigue. La cepa Enterobacter agglomerans AJ13355 se aisló
a partir del suelo como una cepa que muestra resistencia al ácido
L-glutámico bajo un entorno ácido y una velocidad de
crecimiento superior. Posteriormente, una cepa mutante productora de
poca flema se derivó a partir de la cepa AJ13355, y el gen
\alphaKGDH se alteró para obtener la cepa AJ13356. La cepa AJ13356
fue deficiente en la actividad \alphaKGDH como resultado de la
alteración del gen subunidad \alphaKGDH-E1
(sucA). Posteriormente, la cepa AJ13356 se introdujo con el
plásmido RSFCPG que poseía el gen de citrato sintasa (gltA),
gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa (ppc) y el gen de la
glutamato deshidrogenasa (gdhA) de la Escherichia coli
y el plásmido pSTVCB que posee el gen gltA derivado de
Brevibacterium lactofermentum para obtener la cepa
SC17sucA/RSFCPG + pSTVCB. A partir de esta cepa, se seleccionó la
cepa AJ13601 como una cepa de bacterias que muestra una resistencia
mejorada al ácido L-glutámico bajo un entorno de pH
bajo y con la mejor velocidad de crecimiento (documento
\hbox{EP 1 078 989 A2).}
Se cultivaron las cepas seleccionadas al azar a
partir de los transformantes introducidos con un plásmido que
incluye los fragmentos del gen edd y el gen eda según
se ha descrito anteriormente durante 15 horas en un medio líquido
LBGM9 (un medio que contiene 10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto
de levadura, 5 g/l de NaCl y 5 g/l de glucosa, añadida con un
volumen 1/10 de 10 x M9 esterilizada separadamente (128 g/l de
Na_{2}HPO_{4}\cdot7H_{2}O, 30 g/l de KH_{2}PO_{4}, 5 g/l
de NaCl, 10 g/l de NH_{4}Cl)) conteniendo cada una tetraciclina,
cloranfenicol y kanamicina en una cantidad de 12,5 mg/l, 25 mg/l o
25 mg/l. Las células se recogieron a partir de estos caldos de
cultivo mediante centrifugación, se lavaron dos veces con regulador
Tris-HCl 50 mM (pH 7,6) y 10 mM de MgCl_{2} y a
continuación se suspendieron en el mismo regulador. Las células se
desorganizaron mediante ultrasonicación y se centrifugaron a 15000
rpm durante 30 minutos, y el sobrenadante se utilizó como una
solución de enzima cruda.
Las actividades de EDD y EDA se midieron
simultáneamente mediante la medición de los productos de reacción
obtenidos por las dos enzimas utilizando una técnica
fotoespectrométrica. Esto es, se mezclaron 50 mM de
Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM de MgCl_{2}, 1 mM de
EDTA, 1 mM de APAD (dinucleótido de adenina acetilpiridina), 5 mM de
K_{2}HPO_{4}, 20 unidades de
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, ácido 6-fosfoglucónico y la solución
de enzima cruda y se midió un incremento de la absorbancia a 365 nm
para medir el
gliceraldehído-3-fosfato producido a
partir del ácido 6-fosfoglucónico como sustrato. La
misma medición se realizó para una cepa introducida solo con un
vector. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
| Cepa bacteriana | Actividad (nmol/min/mg de proteína) |
| cepa introducida PMW219 | 1,9 |
| cepa 1 incrementada edd/eda | 13,4 |
| cepa 2 incrementada edd/eda | 11,5 |
| cepa 3 incrementada edd/eda | 13,2 |
| cepa 4 incrementada edd/eda | 5,0 |
| cepa 5 incrementada edd/eda | 10,9 |
Se confirmó que todas las cepas poseían las
actividades incrementadas. En la cepa con la actividad más elevada,
las actividades se incrementaron aproximadamente 7,2 veces. El
plásmido de esta cepa se diseñó como pMW-EDDA.
A continuación, se examinó la influencia del
incremento de la ruta Entner-Doudoroff en la
producción de ácido L-glutámico.
La cepa Enterobacter agglomerans AJ13601
utilizada en la sección anterior contenía dos clases de plásmidos, y
las cepas introducidas adicionalmente con el gen edd y el gen
eda contenían las tres clases de plásmidos. Por lo tanto, las
tres clases de agentes se deben añadir al cultivo, y por lo tanto el
crecimiento fue muy pobre, es decir, casi no se observó crecimiento
en el sistema de evaluación de cultivo productor de ácido
L-glutámico. Por lo tanto, sólo se utilizaron dos
clases de plásmidos mediante la introducción de un gen de la citrato
sintasa (referida asimismo como "CS", en lo sucesivo) de la
Brevibacterium lactofermentum, el gen edd y el gen
eda en un plásmido.
Del vector pSTV28 utilizado para la construcción
del plásmido pSTVCB que contiene el gen CS de la Brevibacterium
lactofermentum y del vector pMW219 utilizado para clonar el gen
edd y el gen eda, el primero muestra un número de
copias elevado. Se consideró que, mientras el gen CS de la
Brevibacterium lactofermentum se incrementa mediante el
vector pSTV28 en la cepa AJ13601, fue necesario incrementar la
cantidad de expresión para la introducción de este gen mediante la
utilización de pMW219. Por lo tanto, se construyó un gen cuya región
de promotor en el gen CS se sustituyó con la del gen CS de
Escherichia coli.
Específicamente, la región del promotor en el gen
CS se amplificó mediante la utilización de cebadores GLTSE1 (ID.
SEC. nº: 3) y GLTBE0 (ID. SEC. nº: 4) y el cromosoma de la cepa de
Escherichia coli W3110 como plantilla. Además, se amplificó
un fragmento que contiene la región ORF del gen CS mediante la
utilización de cebadores GLTBB0 (ID. SEC. nº: 5) y GLTBA1 (ID. SEC.
nº: 6) y el cromosoma de la cepa de Brevibacterium
lactofermentum 2256 como plantilla. El PCR cruzado se realizó
utilizando ambos fragmentos como plantillas y cebadores GLTES2 (ID.
SEC. nº: 7) y GLTBA2 (ID. SEC. nº: 8) para obtener un fragmento
objetivo. Este fragmento se digirió con las enzimas de restricción
SmaI y HindIII y se introdujeron en el mismo sitio de
pSTV28 para obtener pSTV-C^{B}(*). Este plásmido
se digirió con KpnI y HindIII, y se recogió un
fragmento del gen de fusión que contiene el promotor del gen CS de
Escherichia coli y la región codificadora del gen CS del
Brevibacterium lactofermentum y se debilitó en el extremo con
polimerasa ADN T4. Este fragmento del gen de fusión se introdujo en
el sitio SmaI de pMW219 para obtener
pMW-C^{B}(*). Además, el pMW-EDDA
se trató con BamHI y se ligó con el fragmento de gen de la
fusión anterior, y el producto de ligación se debilitó en el extremo
con polimerasa ADN T4 para obtener
pMW-C^{B}(*)\cdotED.
Posteriormente, se agitó durante toda la noche
AJ13601 en el medio líquido LBGM9 a 31,5ºC, diluida adecuadamente de
forma que se deberían obtener de 100 a 200 colonias por placa y
aplicada sobre la placa LBGM9 que contiene 12,5 mg/l de
tetraciclina. Las colonias que surgieron se replicaron sobre una
placa LBGM9 que contenía 12,5 mg/l de tetraciclina y 25 mg/l de
cloranfenicol, y se recogió una cepa que llegó a ser sensible al
cloranfenicol y se designó como G106S. La cepa G106S contenía sólo
RSFCPG y era deficiente en pSTVCB. Las cepas obtenidas mediante la
introducción de pMW-C^{B}(*) o
pMW-C^{B}(*)\cdotED dentro de esta cepa se
designaron como G106S pMW\cdotC^{B}(*) y G106S
pMW-C^{B}(*)\cdotED, respectivamente.
Para evaluar la capacidad de producción del ácido
L-glutámico de estas cepas, se llevó a cabo para
ellas la evaluación de cultivo utilizando un fermentador de jarra.
El medio utilizado fue 300 ml de un medio que contiene 50 g/l de
sacarosa, 0,4 g/l de MgSO_{4}, 0,1 ml/l de GD-113
(agente desespumante), 4 g/l de (NH_{4})_{2}SO_{4}, 2
g/l de KH_{2}PO_{4}, 4 g/l de extracto de levadura, 10 mg/l de
FeSO_{4}\cdot7H_{2}O, 10 mg/l de
MnSO_{4}\cdot4-5H_{2}O, 0,4 g/l de
L-lisina, 0,4 g/l de DL-metionina,
0,4 g/l de ácido diaminopimélico, 12,5 mg/l de tetraciclina y 25
mg/l de cloranfenicol. El cultivo se realizó con aireación de 1/1
VVM, agitando a 1300 r.p.m. y a pH 6,0 controlado con amoniaco hasta
que se consumió la sacarosa. Los cambios con el tiempo en la
absorbancia a 660 nm y las cantidades producidas del ácido
L-glutámico en el medio se muestran en la fig. 1.
Además, las cantidades de producción final del ácido
L-glutámico se muestran en la Tabla 2.
| OD 620 nm (x 1/101) | Tiempo de cultivo (h) | Ácido L-glutámico (g/l) | |
| G106S pMW\cdotC^{B}(*) | 0,334 | 12 | 30,4 |
| G106S pMW-C^{B}(*)\cdotED | 0,258 | 16 | 36,8 |
Se puso de manifiesto que la capacidad de
producción del ácido L-glutámico se podría mejorar
mediante el incremento de la ruta Entner-Doudoroff,
aunque el cultivo se retrasó.
Las cepas G106S pMW\cdotC^{B}(*) y G106S
pMW-C^{B}(*)\cdotED se cultivaron de la misma
manera que en la evaluación de la capacidad de producción del ácido
L-glutámico en <2>, y las cantidades de
acetoína y 2,3-butanodiol en el medio y las células
se midieron en el curso de tiempo. La medición se realizó mediante
cromatografía de gases (Shimadzu Corporation,
GC-1700A), bajo las condiciones siguientes.
Columna utilizada: VARIAN PORAPLOTQ PLOT FS25X32
(0,32 mm x 25M)
Temperatura: cámara de vaporización: 250ºC,
columna: 240ºC,
FID: 250ºC
Presión de entrada de columna: 180 kPa
Velocidad del flujo del gas portador: 1,6062
ml/min
Los resultados se muestran en la fig. 2A
(cantidad de acetoína en el medio), fig. 2B (cantidad de
2,3-butanodiol en el medio) y fig. 2C (cantidad
total de acetoína producida y de 2,3-butanodiol por
células unitarias). Se puso de manifiesto que la producción de
acetoína y de 2,3-butanodiol aumentó mediante el
incremento de la ruta de Entner-Doudoroff.
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\vskip0.400000\baselineskip
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento para la producción de
L-aminoácidos
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> documento
EPA-63152
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> documento JP
2002-88668
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2002-03-27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 35
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipcgctagtcga ccaattttta cactttcagg cctcg
\hfill35
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<210> 2
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<211> 35
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipgggggggatc cagtcagaat gtcacgtttg ataat
\hfill35
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<210> 3
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<211> 28
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 3
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\hskip-.1em\dddseqskipcccccgggtc tgttacctgc agacgtcg
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<212> ADN
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<220>
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 5
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: cebador
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<400> 6
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\hskip-.1em\dddseqskipaaaagcttat cgacgctccc ctcccca
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\hskip-.1em\dddseqskipcccccgggat ttccttcctc cggtctgctt
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artificial: cebador
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\hskip-.1em\dddseqskiptaaagcttgg tcagggcgtt ggcggtggcg
\hfill30
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Claims (7)
1. Procedimiento para la producción de un
L-aminoácido que comprende el cultivo de un
microorganismo que posee la capacidad de producir un
L-aminoácido en un medio para producir y acumular el
L-aminoácido en el medio y la recogida del
L-aminoácido a partir del medio, en el que el
microorganismo es una bacteria gramnegativa que sigue la ruta
Entner-Doudoroff y que se ha modificado de forma que
la actividad de la 6-fosfogluconato deshidratasa o
la actividad de la
2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato
aldolasa, o las actividades de ambas se incrementan, y el
L-aminoácido se selecciona de entre los
L-aminoácidos producidos por una ruta biosintética
utilizando ácido pirúvico como intermediario.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que la bacteria es una enterobacteria.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que la bacteria pertenece al género Enterobacter.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la actividad de la
6-fosfogluconato deshidratasa o la actividad de la
2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato
aldolasa se incrementa mediante el incremento del número de copias
de un gen que codifica la 6-fosfogluconato
deshidratasa o a la
2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato
aldolasa o mediante la modificación de una secuencia reguladora de
la expresión del gen de forma que la expresión del gen se incrementa
en una célula de la bacteria.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que el L-aminoácido es ácido
L-glutámico o un L-aminoácido
producido mediante una ruta biosintética utilizando ácido
L-glutámico como intermediario o un grupo amino
donador.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el L-aminoácido se
selecciona de entre el ácido L-glutámico,
L-arginina, L-glutamina,
L-prolina, L-leucina,
L-isoleucina, L-valina y
L-alanina.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el
que el L-aminoácido es ácido
L-glutámico.
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