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CN105602962A - 一种柳枝稷SBP-box类转录因子在增加植物生物量和可发酵糖产量方面的应用 - Google Patents

一种柳枝稷SBP-box类转录因子在增加植物生物量和可发酵糖产量方面的应用 Download PDF

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CN105602962A
CN105602962A CN201610035833.0A CN201610035833A CN105602962A CN 105602962 A CN105602962 A CN 105602962A CN 201610035833 A CN201610035833 A CN 201610035833A CN 105602962 A CN105602962 A CN 105602962A
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Abstract

本发明公开了一类柳枝稷SBP-box类转录因子在增加植物生物量和可发酵糖产量方面的应用，属于植物基因工程技术领域。其主要内容包括柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPL1和2的基因克隆和序列测定，然后在此基础上利用嵌合抑制子沉默技术（CRES-T），抑制整个PvSPL1和2转录因子亚家族的转录活性，从而产生分蘖数目增加的转基因柳枝稷植物。所获得的转基因植物的干物质生物量增加到2.0-2.3倍，总的可发酵糖产量增加到2.0-2.2倍。本发明所产生的转基因能源植物能够整合到常规育种项目中，为创制高产且可高效降解的能源植物新品种提供宝贵的种质资源。同时，所鉴定的柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPL1和2能够为今后分子育种提供新的靶标，用于商业化能源植物产品的定向分子设计。

Description

一种柳枝稷SBP-box类转录因子在增加植物生物量和可发酵糖产量方面的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及柳枝稷SBP-box类转录调控因子PvSPL1和2及其编码基因的改造，提高柳枝稷生物量及其可发酵糖产量。
背景技术
化石能源的过度消耗使得新能源开发成为必要。其中，生物质能具有资源丰富、环保清洁且可再生等特点。目前的研究多集中于生物柴油和生物乙醇两大类，其中，生物乙醇的开发利用已逐步实现商业化。柳枝稷（PanicumvirgatumL.）属多年生C4高大草本植物，主要用作能源草和牧草，是重要的纤维生物质资源。增加柳枝稷生物量和可发酵糖产量是提高其生物质能开发利用的重要手段。柳枝稷全基因组测序的完成和表达芯片数据库的公布，为功能基因的挖掘和验证提供了资源保证。
SQUMOSAPROMOTERBINDINGPROTEIN-like（SPL）转录因子含有一个保守的SBP-box核心结构域，是一类植物特异的转录调控因子家族。另外，超过1/2的SBP-box家族基因含有miR156的靶位点，在转录后水平上受到miR156的严格调控。因此超表达miR156之后，含miR156靶位点的SPL基因表达量会显著降低。目前的研究表明，SPL基因功能广泛，参与植物生长发育的各个阶段以及生理生化反应的多个途径，主要涉及植物花期调控、分蘖发生、株型建成和生物/非生物胁迫响应等过程。植物中最早鉴定出的SPL基因是从金鱼草中分离出的SBP1和SBP2基因（Kleinetal,AnewfamilyofDNA-bindingproteinsincludesputativetranscriptionalregulatorsoftheAntirrhinummajusfloralmeristemidentitygeneSQUAMOSA.1996,MolecularandGeneralGenetics,259:7-16）。拟南芥和水稻中分别含有17和19个SPL基因，其中含miR156靶位点的均有11个基因。目前研究较为深入的是SPL基因调控开花时间，影响植物由营养生长时期向生殖生长时期的过渡。而对于株型建成和分蘖发生方面的研究还尚未有系统研究，AtSPL9和AtSPL15被报道与拟南芥的莲座叶增多相关（Schwarzetal,ThemicroRNAregulatedSBP-boxgenesSPL9andSPL15controlshootmaturationinArabidopsis.2008,PlantMolecularBiology,67:183-195），OsSPL14参与水稻分蘖发生（Luoetal,ControloftillergrowthofricebyOsSPL14andstrigolactones,whichworkintwoindependentpathways.PlantandCellPhysiology,2012,53:1793-1801）。而柳枝稷中过量表达miR156之后，分蘖数目增多、生物量和可发酵糖产量增加（Fuetal,OverexpressionofmiR156inswitchgrass(PanicumvirgatumL.)resultsinvariousmorphologicalalterationsandleadstoimprovedbiomassproduction.2012,PlantBiotechnologyJournal,10:443-452）。
通过植物基因工程改良植物生物量的研究相对较少，过量表达miR156增加植物分枝或分蘖数目是当前研究的一个热点。SPL基因作为miRNA156的直接靶基因，其调控植物分枝或分蘖的机制尚不清楚。本发明主要针对柳枝稷的PvSPL1和2基因，通过嵌合抑制子沉默技术将PvSPL1和2转变成高效的负调控子，最终实现对柳枝稷分蘖发生的调控，获得生物量和可发酵糖产量增加的转基因柳枝稷植株，这对于柳枝稷和其他禾本科植物的遗传育种和定向分子设计具有重要的指导意义。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPL1和2的编码基因；其核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、2和SEQIDNO.3、4所示。考虑到密码子的简并性，在不改变氨基酸序列的前提下，对上述核苷酸序列进行同义突变，也属于本发明的保护范围内。
本发明的第二个目的是提供一种针对柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPL1和2的SRDX融合片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.5和6所示。利用此融合片段能够显著增加柳枝稷分蘖数目，以增加其生物量。
本发明的第三个目的是提供一种柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPL1和2的嵌合抑制子沉默表达载体，该表达载体克隆上述如SEQIDNO.5和6的融合片段。
本发明的第四个目的是提供柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPL1和2在调控柳枝稷分蘖发生方面的应用。
本发明的第五个目的是提供所述的针对柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPL1和2的SRDX融合片段在增加柳枝稷生物量及可发酵糖产量方面的应用。
所述柳枝稷PvSPL1和2的SRDX融合片段，基于Gateway技术重组整合入超表达载体pANIC6B中；采用农杆菌AGL1介导的遗传转化方法，将超表达载体导入柳枝稷胚性愈伤细胞中，通过潮霉素抗性筛选，获得抗性再生植株，并通过PCR分析最终确定阳性转基因植株；分蘖数目统计、生物量及可发酵糖产量测定结果表明，PvSPL1和2能够显著增加柳枝稷分蘖数目、生物量和可发酵糖产量。
本发明的核心特点和发明理念包括：
1、通过嵌合抑制子沉默技术实现对柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPL1和2的改造，使其成为高效的负调控子，能够克服由于柳枝稷中功能冗余基因的存在而造成的抑制效果不显著问题；
2、本发明针对柳枝稷分蘖数目这一影响生物量高低的主要性状，通过先进的基因工程技术对其进行调控，能够在短期内获得显著效果。
本发明的有益效果如下：
1、本发明中获得的柳枝稷SBP-box类基因PvSPL1和2，是调控柳枝稷分蘖的关键基因，这对于通过分子定向设计获得理想能源植物株型具有重要贡献；
2、本发明中对PvSPL1和2进行分子调控，能够显著增加柳枝稷的生物量和可发酵糖产量，对于能源植物和禾本科牧草的生物量和可发酵糖产量的遗传改良具有重要的参考意义；
3、本发明中所产生的遗传改良植物能够整合到常规育种项目，从而为能源植物和禾本科牧草作物的品种培育提供新的种质资源。
附图说明
图1柳枝稷pANIC6B-PvSPL2-SRDX融合片段的过表达载体简图；
图2转PvSPL2-SRDX基因植株的PCR鉴定。M表示DNAMarker，1-16表示转pANIC6B-PvSPL2-SRDX的柳枝稷植株，WT-表示未转基因的野生型柳枝稷植株。hph为PvSPL2-SRDX载体上携带的植物抗性筛选标记基因。
图3转PvSPL2-SRDX基因植株的qRT-PCR分析。CtrlP表示转pANIC6B空载体植株，TSPL2-1/-2/-3分别表示三个独立的阳性转基因株系。
图4转基因阳性植株的表型（A）和分蘖数目（B）。CtrlP表示转pANIC6B空载体植株，TSPL2-1/-2/-3分别表示三个独立的阳性转基因株系。
图5转基因植株的干物质生物量测定。CtrlP表示转pANIC6B空载体植株，TSPL2-1/-2/-3分别表示三个独立的阳性转基因株系。
图6转基因植株的可发酵糖产量测定。CtrlP表示转pANIC6B空载体植株，TSPL2-1/-2/-3分别表示三个独立的阳性转基因株系。
具体实施方式
下面以针对PvSPL2的嵌合抑制子沉默增加柳枝稷分蘖数目、生物量和可发酵糖产量为实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定发明的范围。下述实施例中所用的材料、试剂、双元载体和农杆菌等，如无特殊说明，均可从公司通过商业途径购到，所述的MS基本培养基购自PhytoTechnologyLaboratories（货号M519）。
实施例1：PvSPL2基因的克隆与序列测定
取低地型柳枝稷Alamo的嫩茎部位，用TriZolReagent（Invitrogen公司，货号15596026）提取嫩茎总RNA，使用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测总RNA的含量和纯度，取2.0μg总RNA做逆转录反应，所采用的逆转录酶为M-MLV（Promega公司，货号M1701），逆转录反应的步骤参考该逆转录酶的使用说明。以逆转录反应合成的第一链cDNA为模板，使用引物：
5’-ATGGGTTCATTTGGGATGGAC-3’
5’-AAGCGTCAGTGCATCAGGTCATAG-3’
进行常规PCR扩增；PCR反应体系为：2μLcDNA，5μL10×Buffer，4μLdNTP（2.5mM），正/反向引物（10μM）各1μL，0.5μLTaq酶（5U/μL）和36.5μLddH2O。在冰上加样后混匀。PCR反应条件为：94oC5min；94oC30sec，56oC30sec；72oC90sec，32个循环；72oC10min。PCR扩增获得约1.4kb的片段。采用琼脂糖凝胶电泳回收该片段后，连接pMD-18T载体（TaKaRa公司，货号6011）上，连接反应：4.5μLPCR产物，0.5μLpMD-18T载体和5μLSolutionI，16oC连接过夜。取5μL连接产物，用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，加800μL液体LB培养基，复苏1hr，涂于氨苄抗生素的LB平板上（已涂布X-gal/IPTG），37oC培养14hr。挑选白色单克隆菌落，在含氨苄抗生素的液体LB培养基中扩增培养，测序。经测序分析表明，该序列含有一个完整的开放阅读框，全长1413个碱基，序列如SEQIDNO.2所示，其编码蛋白含有470个氨基酸残基，序列如SEQIDNO.4所示。
实施例2：PvSPL2基因的嵌合抑制子沉默表达载体构建和遗传转化
本发明所用的嵌合抑制子沉默表达载体所使用的负调控因子是一类类EAR型基序的转录抑制子SRDX（LDLDLELRLGFA）。通过PCR反应将该基序的编码序列融合入PvSPL2的终止密码子（TGA）之前，使用引物：
5’-CACCATGGGTTCATTTGGGATGGAC-3’；
5’-TCATTAAGCGAAACCCAAACGGAGTTCTAGATCCAGATCCAGGTGCATCAGGTCATAGTG-3’
进行PCR扩增，扩增模板为上述PvSPL2-pMD18T重组质粒。PCR反应体系为：2μL模板，5μL10×Buffer，4μLdNTP（2.5mM），1μL正/反向引物（10μM）各，0.5μLTaq酶（5U/μL）和36.5μLddH2O。PCR反应条件为：94oC5min；94oC30sec，56oC30sec；72oC90sec，32个循环；72oC10min。PCR扩增获得约1.4kb的片段，片段序列如SEQIDNO.6所示。采用琼脂糖凝胶电泳回收该片段后，连接pENTR载体（Invitrogen，货号450228）。连接反应参考该载体使用说明。取5μL连接产物，用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，加800μL液体LB培养基，复苏1hr，涂于卡那霉素抗性的LB平板上（已涂布X-gal/IPTG），37oC培养14hr。挑选白色单克隆菌落，在卡那霉素抗性的LB培养基中扩增培养，测序。碱裂解法提取测序正确的重组菌株质粒，EcoRV核酸内切酶37oC酶切1hr，使用Gateway技术，将重组质粒酶切回收片段转入超表达载体pANIC6B（图1）。重组反应为：100ng酶切回收片段，50ngpANIC6B载体质粒，1μLLR酶（Invitrogen，货号11791020），然后用ddH2O补足至10μL。16oC连接过夜。取5μL连接产物，用热激法转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，加800μL液体LB培养基，复苏1hr，涂于卡那霉素抗性的LB平板上（已涂布X-gal/IPTG），37oC培养14hr。挑选白色单克隆菌落，在卡那霉素抗性的LB培养基中扩增培养，测序。碱裂解法提取测序正确的重组菌株质粒，电击法转化农杆菌AGL1感受态细胞，涂布于含卡那霉素和利福平的LB平板上，28oC，暗培养2天，使用上述引物检测阳性单克隆，在卡那霉素和利福平抗性的液体LB培养基中扩增培养，用于柳枝稷胚性愈伤的遗传转化。
采用农杆菌介导的柳枝稷胚性愈伤的遗传转化方法（Xietal,Agrobacterium-mediatedtransformationofswitchgrassandinheritanceofthetransgenes.2009,BioenergyResearch,2:275-283）将pANIC6B-PvSPL2-SRDX导入低地型野生型柳枝稷Alamo，获得抗性苗，经PCR鉴定扩增hph基因，最终确定阳性转基因株系（图2）。
实施例3：转基因植株分子鉴定
取上述鉴定转基因阳性植株嫩茎组织，使用TriZol（Invitrogen公司，货号15596026）法提取总RNA，逆转录酶（Promega公司，货号M1701）合成第一链cDNA，以柳枝稷Ubiquitin基因作为内参基因，分别采用引物PvSPL2-qF1/qR1和PvSPL2-qF2/qR2检测阳性转基因植株内源和总PvSPL2基因的表达情况（图3），引物序列如下：
PvUbiquitin-qF:5’-TTCGTGGTGGCCAGTAAG-3’
PvUbiquitin-qR:5’-AGAGACCAGAAGACCCAGGTACAG-3’
PvSPL2-qF1:5’-GCGCGGTTTCAGGCTCTCG-3’
PvSPL2-qR1:5-CCTCGCAACCGGACAATGGA-3’
PvSPL2-qF2:5’-GTGTGGAGCGGCGGTTTT-3’
PvSPL2-qR2:5’-TCCGTCTGCGGGCATTGT-3’
如图3所示，转基因植株（标记为TSPL2-1/-2/-3）中内源PvSPL2的表达量相对于对照（转pANIC6B空载体，标记为CtrlP）没有明显差异，而总的PvSPL2的表达量明显升高，说明外源转入的PvSPL2起到了过量表达效果。
实施例4：转基因植株分蘖数目、生物量和可发酵糖产量分析
取生长六个月植株进行分蘖数目和生物量测定，与对照植物相比，转基因植物的分蘖数目增加到1.6-2.0倍（图4）。进而分别收集CtrlP和TSPL2-1/-2/-3生长六个月大小的植株地上部材料，置于40oC烘箱1个周，测定其干物质重量，结果表明，转基因植株的生物量增加至对照的2.0-2.3倍（图5）。可发酵糖产量测定使用苯酚硫酸酯法，具体测定如下：使用纤维素酶和纤维二糖酶混合物直接酶解细胞壁残留物72hr，作为对照；使用1.5%H2SO4在121oC条件下预处理60min，再使用相同量的纤维素酶和纤维素二糖酶混合物酶解细胞壁残留物72hr，作为处理组。酶解产物使用苯酚硫酸酯法测定可发酵糖含量（Duboisetal，Colorimetricmethodfordeterminationofsugarsandrelatedsubstances.1956,AnalyticalChemistry,28:350-356）。糖化效率是酶解前后可发酵糖含量的差值与酶解前可发酵糖含量的比值。因此，依据公式：可发酵糖产量（g/plant）=地上部细胞壁碳水化合物产量（g/plant）×糖化效率，计算出转基因植株的可发酵糖产量增加到对照植株的2.0-2.2倍（图6）。
SEQIDNO.1
ATGGAGTGGACGGCCCCGAAGCCCGCCGCTTCGCCCTCCTCGCCTCCCCTGCTCTGGGACTGGGGCAACCACGCCGCCGCGGGCTCGGGCTGCTCCGGCGACGCGCCAGCGCGGCGCGGCGGGAAGGAGCGGGAGGCGAAGCGTACCAAGGGCGAGGAAGGCGGGGGAGCGGAAGTTAGGTGCCAGGTCGAGGGGTGCGGGCTGGAGCTCGGCACGGCCAAGGACTACCACCGGAAGCACCGCGTCTGCGAGGCCCACACCAAGTGCCCCCGCGTCGTCGTCGCCGGCCAGGAGCGCCGCTTCTGCCAGCAGTGCAGCAGGTTCCATGCTCTGTCCGAGTTTGATCAGAAGAAGAGGAGCTGCAGGAGGCGTCTGTCTGATCACAATGCCCGCCGGCGGAAGCCTCAGCCAGATGCATACGCCTTTGCCTCTGCGAGGCTGCCTTCATCATTGTTTGATGATAGGCGGCAAATAAGTTTTGTCTGGAATAGAGCTCCTCTTAGCCATGTAAGACCTTTCACTTCTCCATGTGACAGCTCATCTGACTTCAAGCTCTCACATGCCAAAGAAATAAGTGAGCTATCAACAAAAGTTGGGACGATAACTGGACAAGTTCATTTTGATAAATCTCACCTGTCCAATGCCATTCCAACACTTAGCCATGGCAAAGATGAGCTGTTGCCAATGAAAGGTCCGGACACATCAATAACTGCTTCAAAATTCGATGGAGCACCGGATCTTCAGCGTGCTCTCTCTCTTCTGTCAGCTGGCTCTTGTGGATTCCCCGATCCTGTACCGCAAGCATCTTGCCTTATCCAGTTCACTGGTGCCAGTGAGAACAGCGGTGACCTTCACTTATCGCATGGAGGGAACTCTGGTCCAGCTTCATGTGCCGATGAACAGCATGTAGCACCTCAGCCTCAGCTGGTTCGTTTTACCATGGATACCAGTAGCAATGTCTATGAGCCCACTTTCTTCGGTGTAAACCAGATAAATTAA
SEQIDNO.2
ATGGGTTCATTTGGGATGGACTGGAACCAGAAGGGTTCTGTGTTGTGGGACTGGGAGAATTTGCCGCTGATAGGCACAAGTGGAAGCGAGAGCGCTAAGGCGATCGCGACTCAGGCTGAGGCCAAGTTTTCAGCCACTGAGGTCACAAGGCATGGATCAGTGCATTCTTCCTGTGGTACTTTCTCTTCCAACTCGGAGATGGGGTATGGCTCATCTAAGAGCTCCATATCCGCGTCGATTGATTCTTCACCCAAGACGGGGAAGAACATGGAGCTCAATTTTGCACCTGCCAGAGTGTCTGACAAGAACACTGTTTTGGGAAAGGTTTATGATGCCAGAACCTCCCCATCATCAGTGATAGCCGTAAGTAGTGGAGAGCCAGTGCTTAGCCTGAAACTTGGCAAGAGAACCTATTTTGAAGACGTCTGTGGAGGGCAGAGTGTCAAGAGTTCTCCGTCGGATACAAGTGCAGTGACTCCTGCTTTGGTGAAGAAGGCAAAGGCAGCACAAAACGCACAGAACACCTACTGTCAGGTTGAAGGTTGCAAGATTGATCTCTCTTCTGCTAAAGATTACCATCGAAAGCACAAAGTCTGTGAAGCTCACTCTAAGGCTCCCAAGGTGGTTGTTGCTGGTGTGGAGCGGCGGTTTTGCCAACAGTGTAGCCGGTTCCATGGTTTAGATCTCTTCGACCAGAAAAAACGAAGCTGCCGCAGGCGTCTCAATGATCACAATGCCCGCAGACGGAAGCCACAGCCTGAAGCAATTTCTTTTGGTTCATCAAGGCTCTCTGCAATGTTCTATGATGCAAGGCAACAGACAACTCTTCATTTTGGTCAAGCCCCTTATGGTCAAATGAGAAGCTGTGCAAGTTCTTCATGGGATAACCCAGGAGGAGCCTTCAAATTTGCAGAAACTAAAGCCCCTTGGTTAAAGCCAGCAAGAGCTGCTGGTATTGATGCCTTGCATTTATCAAGTCAGCAGGTATGGAACAACATTATGCCACATGGTGGCCATCAAGATTTTGATGGGTTCATGGGTTTCAAAGGAACCAGTGCAAAGGTCCTCAATCAAGGCGTTGAAGCTTCTGCGGCCATCTCCGATTCAAATGGAAACCCGGATCTTCAGCGTGCTCTCTCTCTTCTGTCAAACAATTCAGCTGGTGCTGGCAACAACCACCCGACCACTCAGCCGCACCCTGGCCTGAGCACCCTCGCCAGCACCTCCAACGCAGTGATGCAAGCTTCATCACAAGGGCTCTGGCAAGACGGCACAGCGCTTGATCTTCATGCGCGGTTTCAGGCTCTCGATCCCCTGGGCAGTGGCAGCGCCATCCCAACAACTCATGAGGTCCAGCTCCCGAAACCGTCCTTGTTCGACGACTCCTCTTCCCACTATGACCTGATGCACTGA
SEQIDNO.3
MEWTAPKPAASPSSPPLLWDWGNHAAAGSGCSGDAPARRGGKEREAKRTKGEEGGGAEVRCQVEGCGLELGTAKDYHRKHRVCEAHTKCPRVVVAGQERRFCQQCSRFHALSEFDQKKRSCRRRLSDHNARRRKPQPDAYAFASARLPSSLFDDRRQISFVWNRAPLSHVRPFTSPCDSSSDFKLSHAKEISELSTKVGTITGQVHFDKSHLSNAIPTLSHGKDELLPMKGPDTSITASKFDGAPDLQRALSLLSAGSCGFPDPVPQASCLIQFTGASENSGDLHLSHGGNSGPASCADEQHVAPQPQLVRFTMDTSSNVYEPTFFGVNQIN
SEQIDNO.4
MGSFGMDWNQKGSVLWDWENLPLIGTSGSESAKAIATQAEAKFSATEVTRHGSVHSSCGTFSSNSEMGYGSSKSSISASIDSSPKTGKNMELNFAPARVSDKNTVLGKVYDARTSPSSVIAVSSGEPVLSLKLGKRTYFEDVCGGQSVKSSPSDTSAVTPALVKKAKAAQNAQNTYCQVEGCKIDLSSAKDYHRKHKVCEAHSKAPKVVVAGVERRFCQQCSRFHGLDLFDQKKRSCRRRLNDHNARRRKPQPEAISFGSSRLSAMFYDARQQTTLHFGQAPYGQMRSCASSSWDNPGGAFKFAETKAPWLKPARAAGIDALHLSSQQVWNNIMPHGGHQDFDGFMGFKGTSAKVLNQGVEASAAISDSNGNPDLQRALSLLSNNSAGAGNNHPTTQPHPGLSTLASTSNAVMQASSQGLWQDGTALDLHARFQALDPLGSGSAIPTTHEVQLPKPSLFDDSSSHYDLMH
SEQIDNO.5
ATGGAGTGGACGGCCCCGAAGCCCGCCGCTTCGCCCTCCTCGCCTCCCCTGCTCTGGGACTGGGGCAACCACGCCGCCGCGGGCTCGGGCTGCTCCGGCGACGCGCCAGCGCGGCGCGGCGGGAAGGAGCGGGAGGCGAAGCGTACCAAGGGCGAGGAAGGCGGGGGAGCGGAAGTTAGGTGCCAGGTCGAGGGGTGCGGGCTGGAGCTCGGCACGGCCAAGGACTACCACCGGAAGCACCGCGTCTGCGAGGCCCACACCAAGTGCCCCCGCGTCGTCGTCGCCGGCCAGGAGCGCCGCTTCTGCCAGCAGTGCAGCAGGTTCCATGCTCTGTCCGAGTTTGATCAGAAGAAGAGGAGCTGCAGGAGGCGTCTGTCTGATCACAATGCCCGCCGGCGGAAGCCTCAGCCAGATGCATACGCCTTTGCCTCTGCGAGGCTGCCTTCATCATTGTTTGATGATAGGCGGCAAATAAGTTTTGTCTGGAATAGAGCTCCTCTTAGCCATGTAAGACCTTTCACTTCTCCATGTGACAGCTCATCTGACTTCAAGCTCTCACATGCCAAAGAAATAAGTGAGCTATCAACAAAAGTTGGGACGATAACTGGACAAGTTCATTTTGATAAATCTCACCTGTCCAATGCCATTCCAACACTTAGCCATGGCAAAGATGAGCTGTTGCCAATGAAAGGTCCGGACACATCAATAACTGCTTCAAAATTCGATGGAGCACCGGATCTTCAGCGTGCTCTCTCTCTTCTGTCAGCTGGCTCTTGTGGATTCCCCGATCCTGTACCGCAAGCATCTTGCCTTATCCAGTTCACTGGTGCCAGTGAGAACAGCGGTGACCTTCACTTATCGCATGGAGGGAACTCTGGTCCAGCTTCATGTGCCGATGAACAGCATGTAGCACCTCAGCCTCAGCTGGTTCGTTTTACCATGGATACCAGTAGCAATGTCTATGAGCCCACTTTCTTCGGTGTAAACCAGATAAATCTGGATCTGGATCTAGAACTCCGTTTGGGTTTCGCTTAATAA
SEQIDNO.6
ATGGGTTCATTTGGGATGGACTGGAACCAGAAGGGTTCTGTGTTGTGGGACTGGGAGAATTTGCCGCTGATAGGCACAAGTGGAAGCGAGAGCGCTAAGGCGATCGCGACTCAGGCTGAGGCCAAGTTTTCAGCCACTGAGGTCACAAGGCATGGATCAGTGCATTCTTCCTGTGGTACTTTCTCTTCCAACTCGGAGATGGGGTATGGCTCATCTAAGAGCTCCATATCCGCGTCGATTGATTCTTCACCCAAGACGGGGAAGAACATGGAGCTCAATTTTGCACCTGCCAGAGTGTCTGACAAGAACACTGTTTTGGGAAAGGTTTATGATGCCAGAACCTCCCCATCATCAGTGATAGCCGTAAGTAGTGGAGAGCCAGTGCTTAGCCTGAAACTTGGCAAGAGAACCTATTTTGAAGACGTCTGTGGAGGGCAGAGTGTCAAGAGTTCTCCGTCGGATACAAGTGCAGTGACTCCTGCTTTGGTGAAGAAGGCAAAGGCAGCACAAAACGCACAGAACACCTACTGTCAGGTTGAAGGTTGCAAGATTGATCTCTCTTCTGCTAAAGATTACCATCGAAAGCACAAAGTCTGTGAAGCTCACTCTAAGGCTCCCAAGGTGGTTGTTGCTGGTGTGGAGCGGCGGTTTTGCCAACAGTGTAGCCGGTTCCATGGTTTAGATCTCTTCGACCAGAAAAAACGAAGCTGCCGCAGGCGTCTCAATGATCACAATGCCCGCAGACGGAAGCCACAGCCTGAAGCAATTTCTTTTGGTTCATCAAGGCTCTCTGCAATGTTCTATGATGCAAGGCAACAGACAACTCTTCATTTTGGTCAAGCCCCTTATGGTCAAATGAGAAGCTGTGCAAGTTCTTCATGGGATAACCCAGGAGGAGCCTTCAAATTTGCAGAAACTAAAGCCCCTTGGTTAAAGCCAGCAAGAGCTGCTGGTATTGATGCCTTGCATTTATCAAGTCAGCAGGTATGGAACAACATTATGCCACATGGTGGCCATCAAGATTTTGATGGGTTCATGGGTTTCAAAGGAACCAGTGCAAAGGTCCTCAATCAAGGCGTTGAAGCTTCTGCGGCCATCTCCGATTCAAATGGAAACCCGGATCTTCAGCGTGCTCTCTCTCTTCTGTCAAACAATTCAGCTGGTGCTGGCAACAACCACCCGACCACTCAGCCGCACCCTGGCCTGAGCACCCTCGCCAGCACCTCCAACGCAGTGATGCAAGCTTCATCACAAGGGCTCTGGCAAGACGGCACAGCGCTTGATCTTCATGCGCGGTTTCAGGCTCTCGATCCCCTGGGCAGTGGCAGCGCCATCCCAACAACTCATGAGGTCCAGCTCCCGAAACCGTCCTTGTTCGACGACTCCTCTTCCCACTATGACCTGATGCACCTGGATCTGGATCTAGAACTCCGTTTGGGTTTCGCTTAATGA

Claims (6)

1.柳枝稷SBP-box类转录因子PvSPL1和2的全长CDS，其特征在于：
（1）SEQIDNO.1和2所示的核苷酸序列；
（2）SEQIDNO.1和2所示的核苷酸序列，经取代、增加或缺失一个或多个核苷酸而形成的具有相同功能的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的PvSPL1和2的全长CDS编码的氨基酸序列，其特征在于：
（1）SEQIDNO.3和4所示的氨基酸序列；
（2）SEQIDNO.3和4所示的氨基酸序列，经取代、增加或缺失一个或多个氨基酸而形成的具有相同功能的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的PvSPL1和2的核苷酸序列经嵌合抑制子SRDX形成的融合片段PvSPL1-SRDX和PvSPL2-SRDX，其序列如SEQIDNO.5和6所示的核苷酸序列。
4.含有权利要求3所述的PvSPL1-SRDX和PvSPL2-SRDX融合片段的植物表达载体。
5.根据权利要求4所述的植物表达载体在调控分蘖发生、增加禾本科草类植物生物量和可发酵糖产量方面的应用。
6.根据权利要求4所述的植物表达载体在柳枝稷遗传改良和分子育种方面的应用。
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