CN109053870B

CN109053870B - AtERF49基因在植物响应高温胁迫过程中的应用

Info

Publication number: CN109053870B
Application number: CN201810895814.4A
Authority: CN
Inventors: 朱生伟; 陈霞; 吴金霞; 隆浩; 路铁刚; 罗小敏; 张治国
Original assignee: Institute of Botany of CAS; Biotechnology Research Institute of CAAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS; Biotechnology Research Institute of CAAS
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2018-08-08
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2038-08-08
Also published as: CN109053870A

Abstract

本发明公开了AtERF49基因在植物响应高温胁迫过程中的应用。本发明提供了如下1)‑3)中任一种物质在调控植物耐逆性中的应用：1)蛋白AtERF49；2)编码蛋白AtERF49的DNA分子；3)含有编码蛋白AtERF49的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；本发明实验证明了本发明发现显性抑制AtERF49基因表达可增强拟南芥对高温胁迫的耐受性；研究结果表明AtERF49在植物的生长发育及响应高温胁迫的过程中具有非常重要的作用。显性抑制AtERF49可以作为一种潜在的分子育种工具，增强植物对高温的耐受性，以稳定或提高极端高温天气情况下，作物的产量和品质。

Description

AtERF49基因在植物响应高温胁迫过程中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及AtERF49基因在植物响应高温胁迫过程中的应用。

背景技术

植物在生长发育过程中往往会受到各种非生物因子的胁迫，温度是制约植物产量和品质的主要环境因子之一。局部地区的高温干旱现象严重影响了农作物的生长发育，导致作物减产，品质降低(Mba et al.2012)。

为了抵御高温胁迫带来的伤害，植物进化出了一系列的防御机制(Wahid etal.2007)。植物响应高温胁迫的核心是通过热激转录因子(Heat Stress TranscriptionFactors,HSFs)来诱导热激蛋白(Heat Shock Proteins,HSPs)的表达(Guan et al.2014)。热激蛋白(HSPs)是生物体在遭受短时间高于其正常生长温度8-12℃的高温(一般称为亚致死温度)时，体内新合成的或含量增加的一系列蛋白质，又被称为热休克蛋白。许多研究表明，HSPs蛋白的丰度与生物耐热性呈正相关，其功能是与多肽结合并使其正确折叠，阻止变性蛋白的聚集，有利于蛋白质在高温变性后的复性(Parsell et al.1993；Waters etal.1996；Nover et al.1997)。热激转录因子(HSFs)可以识别并结合到HSPs启动子区域的热激元件(5’-GAAnnTTC-3’)来调控HSPs的表达(Busch et al.2005)。

发明内容

本发明的一个目的提供如下1)-3)中任一种物质的用途。

本发明提供的如下1)-3)中任一种物质在调控植物耐逆性中的应用：

1)蛋白AtERF49；

2)编码蛋白AtERF49的DNA分子；

3)含有编码蛋白AtERF49的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述蛋白AtERF49为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。

上述应用中，所述AtERF49蛋白编码基因是如下1)-3)中任一种的DNA分子：

1)编码区为序列表中序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)或2)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子；

3)与1)或2)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能蛋白质的DNA分子。

上述应用中，所述调控植物耐逆性为降低植物耐逆性；

和/或，所述耐逆性为耐高温性。

上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

或所述植物为双子叶植物，所述双子叶植物具体为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。

本发明另一个目的提供抑制AtERF49蛋白编码基因表达的物质的用途。

本发明提供的抑制AtERF49蛋白编码基因表达的物质在如下a)-c)中任一中的应用；

或，抑制AtERF49蛋白编码基因表达在如下a)-c)中任一中的应用；

a)提高植物耐逆性；

b)培育耐逆性植物；

c)培育高耐逆性植物；

所述蛋白AtERF49为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

上述抑制AtERF49蛋白编码基因表达或抑制AtERF49蛋白编码基因表达为抑制植物内源性AtERF49蛋白编码基因表达或抑制植物内源性AtERF49蛋白编码基因表达。

上述应用中，所述抑制AtERF49蛋白编码基因表达的物质为如下：

1)由AtERF49编码基因和SRDX编码核苷酸融合的DNA分子；

2)1)所示DNA分子编码的蛋白或RNA；

3)含有1)所示DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

和/或，所述由AtERF49编码基因和SRDX编码核苷酸融合的DNA分子的核苷酸序列为序列3。

上述应用中，所述耐逆性为耐高温性。

上述应用中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

本发明第3个目的提供如下方法：

本发明提供了一种培育高耐逆性转基因植物的方法，包括如下步骤：降低目的植物中编码蛋白AtERF49的DNA分子的表达量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物；

或本发明提供了一种培育低耐逆性转基因植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中编码蛋白AtERF49的DNA分子的表达量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的耐逆性低于所述目的植物；

或本发明提供了一种培育低耐逆性转基因植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中蛋白AtERF49的活性，得到转基因植物，所述转基因植物的耐逆性低于所述目的植物；

所述蛋白AtERF49为如下(1)或(2)：

(1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

上述方法中，所述植物为双子叶植物或单子叶植物；

和/或，所述植物为双子叶植物，所述双子叶植物具体为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥；

和/或，所述耐逆性为耐高温性。

上述培育高耐逆性转基因植物的方法中，所述转基因植物的耐逆性高于所述目的植物耐高温性体现在如下：

42℃高温胁迫后，转基因植物的存活率高于目的植物，

或，42℃高温胁迫后，转基因植物的HSPs或HSFs的转录水平高于目的植物；

上述HSPs为HSP26.5、HSP70和HSP90.1。

本发明将目的基因沉默后可以通过增加高温对HSFs和HSPs的诱导从而增强植物对高温的耐受性，对进一步改良作物的耐高温性、提高作物产量具有重要的理论价值和实践意义。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、荧光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

利用任何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体，将本发明所提供的AtERF49基因显性抑制表达后导入植物细胞，可获得对高温耐受性提高的植株。携带有AtERF49基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织,并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主可为双子叶植物。

本发明发现显性抑制AtERF49基因表达可增强拟南芥对高温胁迫的耐受性；研究结果表明AtERF49在植物的生长发育及响应高温胁迫的过程中具有非常重要的作用。显性抑制AtERF49可以作为一种潜在的分子育种工具，增强植物对高温的耐受性，以稳定或提高极端高温天气情况下，作物的产量和品质。

附图说明

图1为AtERF49基因和蛋白的结构及其表达模式分析；

A.AtERF49基因和蛋白的结构；B.AtERF49基因在植物不同组织中的表达模式；C.AtERF49基因的表达受高温抑制。

图2为抑制AtERF49在拟南芥中的表达可以增强拟南芥的耐热性；

A.三个AtERF49过表达转基因株系(OX-3、OX-11、OX-39)中AtERF49 mRNA表达水平鉴定；B.三个AtERF49显性抑制转基因株系(SRDX-14/Col、SRDX-17/Col、SRDX-19/Col)中AtERF49 mRNA表达水平鉴定；C.AtERF49过表达和显性抑制转基因株系以及拟南芥野生型Col-0于42℃高温处理3h并恢复生长5天后的存活率统计。相同的小写字母代表着非显著性差异(P>0.05)。

图3为显性抑制AtERF49的表达提高植物耐高温性的作用机理研究。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

农杆菌GV3101:中国科学院植物研究所；郑银英,崔百明,常明进,彭明.转拟南芥ICE1基因增强烟草抗寒性的研究.《西北植物学报》.2009年29巻1期.75-79。

pENTR/SD/D-TOPO载体购自Invitrogen公司。

过表达载体pMDC32记载在如下文献中：Curtis MD,Grossniklaus U(2003)AGateway Cloning Vector Set for High-Throughput Functional Analysis of Genesin Planta.Plant Physiol.133(2):462–469.

显性抑制表达载体p35SSRDX记载在如下文献中：Zhao J,Liu JS,Meng FN,ZhangZ,Long H,Lin WH,Luo XM,Wang ZY,Zhu SW(2016)ANAC005is a membrane-associatedtranscription factor and regulates vascular development inArabidopsis.Journal of Integrative Plant Biology,58(5)：442-451.

以下实施例中的基因表达量检测结果,均是以野生型植株的目的基因表达量为1,其它植株的目的基因表达量与野生型植株的目的基因表达量进行比较。

实施例1、拟南芥AtERF49基因的克隆

一、拟南芥基因组DNA(gDNA)的获得

利用CTAB法分离提取拟南芥col-0(以下称为野生型拟南芥)叶片中总DNA(gDNA)，具体方法：

1)取100mg材料剪碎放于研钵中液氮速冻研磨；

2)用药匙将研磨好的材料转移至1.5mL的离心管中，然后加入400μL的CTABDNA提取液；

CTAB DNA提取液：

2％(w/v)CTAB

100mM/L Tris·HCl pH 8.0

20mM/L EDTA pH 8.0

1.4M/L NaCl

3)65℃水浴30min至3h；

4)自然冷却至室温，加入400μL氯仿混匀。混匀过程要轻缓，以保证得到完整的DNA；

5)室温，12000rpm，5min，离心分相；

6)转移上清于新的离心管中，加入等体积预冷的异丙醇(4℃放置)充分混匀，-20℃放置1h；

7)室温，12000rpm，离心10min，沉淀DNA；

8)小心移去上清，加入1mL 70％的乙醇洗涤沉淀；

9)室温，12000rpm，离心5min；

10)重复9)，10)步骤2次；

11)小心移去乙醇，放于超净工作台吹干沉淀；

12)加50μL灭菌的去离子水，溶解，得到gDNA。

二、拟南芥AtERF49的克隆

以gDNA为模板，用如下引物进行PCR扩增。

AtERF49:

Forward Primer：5'-CACCATGTCATCCATAGAGCCA

Reverse Primer：5'-AAGTGGGGAATGAAAGGAATC

上述PCR扩增反应体系为：模板gDNA，2u1；Phusion酶，1μL；Forward Primer(10μM)，2.5μL；Reverse Primer(10μM)，2.5μL；5XPhusion Buffer 10μL；dNTP mixture(each10mM)，1μL；ddH₂0，31μL。

上述PCR扩增反应条件为：98℃，2min；98℃，20sec；60℃，20sec；72℃，25sec(35循环)；72℃，5min；16℃，5min。PCR产物4℃保存。

PCR产物送去测序，结果，该PCR产物具有序列1所示的AtERF49基因，该基因编码的蛋白为AtERF49(图1A)，该蛋白的氨基酸序列为序列2。

实施例2、AtERF49基因的表达模式及其对高温的响应情况

一、AtERF49在拟南芥不同组织部位的表达水平

分别收集野生型拟南芥生长14天的根、生长7天的幼苗、3周的莲座叶、茎、茎生叶、花以及角果，提取RNA之后进行反转录，然后进行荧光定量PCR(RT-PCR)。

利用Trizo1法分离提取野生型拟南芥叶片中总RNA，其具体方法是：

所配试剂全部用DEPC处理的双蒸水配制，然后高压灭菌。整个实验过程全部在低温下进行操作。

1)取50-100mg材料在液氮中充分研磨，研碎后转移到1.5mL离心管中，加入1mLTrizol RNA提取试剂，充分混匀后室温裂解5min；

2)每管中加入200μL新鲜氯仿，充分颠倒混匀5min，室温静止15min；

3)12000rpm，4℃离心10min；

4)将上层无色的水相转移到一个新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇沉淀RNA，-20℃放置3hr或-80℃放置30min；

5)12000rpm，4℃，离心10min；

6)弃掉上清，将RNA沉淀用1mL 75％的乙醇洗涤1-2次，用移液器将残余的酒精尽量吸取干净，室温放置5-10min使管中残余乙醇挥发干净(注意不要完全干)；

7)将沉淀溶于30μL DEPC处理过的去离子水中，如果沉淀不溶解可在55℃-60℃水浴锅中温育10min；

8)用紫外分光光度计(NanoDrop2000,Thermo Scientific)测定RNA样品的OD260/OD280值(OD260/280在1.8-2.0间为宜)和浓度，-80℃保存。

9)将提取好的RNA样品(0.5mg到1mg)，用0.5×TBE buffer配置的琼脂糖胶，在200V电压下电泳5min后，紫外灯下观察照相。测OD₂₆₀/OD₂₈₀值，以OD₂₆₀/OD₂₈₀大于1.9为宜，并确定RNA浓度。

反转录反应：

参照反转录酶M-MLV(购于Promega公司)说明书进行。取1μg植物总RNA，与OligodT引物以0.5μg primer/μg total RNA的比例混合，70℃水浴5min，冰上冷却。

加入各种反转录试剂混合：

混匀后，42℃温育1hr；冰上放置5min，得到cDNA。

取第一链产物cDNA 0.2μL为模板，进行荧光定量PCR(qPCR)扩增，UBC30作为内参基因。

荧光定量RT-PCR的操作方法参照TOYOBO

Green Realtime PCR Master Mix试剂盒说明书进行。

PCR反应液按照以下比例配制：

PCR反应使用QIAGEN公司的Rotor-Gene Q荧光定量PCR仪，按照以下参数进行：

第一步95℃ 2min

第二步95℃ 10sec

第三步60℃ 15sec

第四步72℃ 20sec

从第二步至第四步进行40个循环

反应完毕后进行溶解曲线分析。

其中，检测基因和内参基因所用引物如下：

AtERF49引物Forward：5’-AGACTACACCAAGCAGCAACACC

引物Reverse：5’-TTGGATGAACACGGCGACTCAG

UBC30引物Forward：5’-TCACTTCCCACCAGATTACCC

引物Reverse：5’-TCGACAGAAGAACCTTGGATACG

结果如图1B所示，AtERF49在不同的组织部位都有表达，但是在各个部位的表达水平不一，在根、茎以及莲座叶表达水平偏低，在茎生叶和花中稍高，角果中最高。

二、AtERF49的表达受高温抑制

对在1/2MS培养基上22℃正常生长7天后的野生型拟南芥，进行42℃高温处理，分别于处理0min、30min、60min、90min、120min后收集材料，提取RNA，进行荧光定量PCR检测AtERF49在转录水平上的表达情况。

实验方法及引物同上。实验结果如图1C所示，高温处理后AtERF49在转录水平上的表达量下降，说明高温抑制AtERF49的表达。

实施例3、AtERF49在调控植物耐高温过程中的应用

一、过表达AtERF49的转基因拟南芥的获得

1、过表达载体的构建

过表达载体35S::AtERF49为将序列1所示的AtERF49基因重组到pMDC32载体中，得到表达AtERF49蛋白的载体。

具体构建方法如下：用高保真酶phusion酶从野生型拟南芥的基因组DNA中扩增出AtERF49基因(序列1)连接入入门载体TOPO中，通过重组将目的序列连入pMDC32载体中完成35S::AtERF49载体构建。

2、转基因拟南芥AtERF49-OX的获得

1)、转化

将步骤1构建的重组载体35S::AtERF49入农杆菌GV3101，得到含有表达载体的农杆菌，用于转化野生型拟南芥Col-0，获得转基因植物,具体步骤如下：

(1)在YEB平板上挑取含有表达载体的农杆菌单克隆，接种于10mL含抗生素(50mg/L卡纳霉素)的YEB液体培养基中，28℃，200rpm,振荡培养至对数生长晩期。

(2)按1:50的比例转接到50mL YEB培养基中,28℃,200rpm,振荡培养至0D_6oo为0.6左右。

(3)5,000rpm，离心5分钟，收集菌体，重悬于渗透缓冲液(5％蔗糖，0.02％silwetL-77)，调OD_6oo至0.6左右。

(4)取正在开花的拟南芥，剪去转化前形成的果荚，然后将整个花序浸泡在步骤3)的菌悬液中2分钟，使得农杆菌很好的粘附在花序中进行转化。

(5)农杆菌侵染后的拟南芥放于暗处保湿培养24小时，然后将拟南芥移到培养室中继续正常培养。

(6)收获成熟的拟南芥种子，充分晾干后用10％次氯酸钠消毒后，在含有相应抗生素的1/2MS培养基上，筛选得到的抗性苗(T₁代)移入土中继续培养，得到T₁代转AtERF49拟南芥。

将T₁代转AtERF49拟南芥经过培育获得T₃代转AtERF49拟南芥纯合株系。

2)、鉴定

将上述T₃代转AtERF49拟南芥纯合株系进行RT-PCR检测RT-PCR实验方法及引物同上。

结果如图2A所示，可以看出，T₃代转基因拟南芥AtERF49-OX纯合株系为阳性T₃代转AtERF49拟南芥纯合株系(OX)。

二、显性抑制转基因拟南芥AtERF49-SRDX的获得

显性抑制转基因拟南芥AtERF49-SRDX的原理是“在植株中转入一段含有12个氨基酸的抑制域(SRDX)AtERF49-SRDX载体之后，这个载体会在植物体内与目标基因竞争从而抑制目标基因的表达，最终使转基因植株出现显性的功能缺失的表型。因此在进行RT-PCR鉴定AtERF49-SRDX转基因植株是否起作用的时候，需要检测两个基因AtERF49-SRDX(转入植物中的AtERF49-SRDX基因)和AtERF49-endo(内源AtERF49基因)的表达量，当AtERF49-SRDX的表达量相对AtERF49-endo的表达量越高时，说明AtERF49-SRDX在体内表达很多，相应的AtERF49-endo被严重的抑制表达，从而说明起作用。因此，显性抑制转基因拟南芥AtERF49-SRDX的制备方法与前面过表达植物的制备基本一致，只是在进行RT-PCR鉴定时所用的鉴定引物有所不同。

具体制备方法如下：

1、显性抑制表达载体的构建

显性抑制表达载体35S::AtERF49-SRDX为将序列1第1-618位所示的AtERF49基因去除密码子的序列替换p35SSRDX载体的BamHI和SpeI酶切位点间的DNA分子得到的载体，AtERF49基因与载体上的12个氨基酸的抑制域SRDX融合表达AtERF49-SRDX(AtERF49-SRDX的核苷酸序列为序列3，其中序列3第1-618位为去掉终止密码子后的AtERF49，第619-624为酶切位点SpeI，第625-663为SRDX核苷酸序列)。

2、转基因拟南芥AtERF49-SRDX的获得

1)、转化

将步骤1构建的重组载体35S::AtERF49-SRDX转入农杆菌GV3101，得到含有表达载体的农杆菌，用于转化野生型拟南芥Col-0，获得转AtERF49-SRDX拟南芥，转化方法同上，得到T₁代转AtERF49-SRDX拟南芥。

将T₁代转AtERF49-SRDX拟南芥经过培育获得T₃代转AtERF49-SRDX拟南芥纯合株系。

2)、鉴定

将上述T₃代转AtERF49-SRDX拟南芥纯合株系进行RT-PCR检测,RT-PCR实验方法同上。所用引物为：

AtERF49-SRDX引物Forward：5’-TGTCATCATGTGGAAGAGTGACA

引物Reverse：5’-CGAAACCCAAACGGAGTTCTAG

AtERF49-endo引物Forward：5’-TCGCGGATGACCTTATCCATA

引物Reverse：5’-GCTTCCTCCTCTCGACACG

UBC30引物Forward：5’-TCACTTCCCACCAGATTACCC

引物Reverse：5’-TCGACAGAAGAACCTTGGATACG

结果如图2B所示，可以看出，AtERF49-SRDX在体内表达很多，相对植物体内AtERF49-endo的表达倍数高出几十倍，AtERF49-SRDX在植物体内会与内源AtERF49(AtERF49-endo)竞争作用位点，从而导致体内AtERF49的功能被严重抑制。说明T₃代转AtERF49-SRDX纯合株系为阳性T₃代转AtERF49-SRDX纯合株系(SRDX/col-0)。

三、转AtERF49拟南芥和转AtERF49-SRDX拟南芥的功能研究

1)转基因拟南芥对高温耐受性的检测

将阳性T₃代转AtERF49拟南芥纯合株系OX-3、OX-11、OX-39、阳性T₃代转AtERF49-SRDX拟南芥SRDX-14/col-0、SRDX-17/col-0、SRDX-19/col-0进行种子表面消毒，铺于1/2MS培养基上，4℃春化2天，放于拟南芥培养间正常培养(22℃，白天/黑夜：16h/8h)7天，42℃黑暗处理2.5h后，放于拟南芥培养间恢复培养7天，进行表型观察并统计存活率。以野生型拟南芥为对照。

结果如图2C所示，可以看出，与野生型拟南芥相比，显性抑制AtERF49表达提高植物对高温的耐受性。

2)显性抑制AtERF49的表达提高植物耐高温性的作用机理研究

将阳性T₃代转AtERF49拟南芥纯合株系OX-11、OX-39、阳性T₃代转AtERF49-SRDX拟南芥SRDX-14/col-0、SRDX-17/col-0进行种子表面消毒铺于1/2MS培养基上，春化两天后在模式植物生长室中22℃正常生长7天，然后置于42℃分别处理30min和60min，取样并提取RNA，反转录成cDNA后进行RT-PCR检测HSFs和HSPs的表达量。

RT-PCR实验方法同上。所用引物为：

UBC30引物Forward：5’-TCACTTCCCACCAGATTACCC

引物Reverse：5’-TCGACAGAAGAACCTTGGATACG

HSFA2F:5’-TGGGATTCTCATAAGTTCTCAACA

R:5’-TGGATCAATCTTTCTGAATCCAT

DREB2A F:5’-CAGTGTTGCCAACGGTTCAT

R:5’-AAACGGAGGTATTCCGTAGTTGAG

HSP70F:5’-tgtcaatcctgatgaggctgtt

R:5’-tcaccgcggaggatacca

HSP90.1F:5’-cattgcgaggtctggaacaa

R:5’-Catgcttacatcagctccagctt

HSP26.5F:5’-ACTGTCTCCTAGTTTGATGGGTCAATCTTGTG

R:5’-TGAAGTAGCCATGATCGTCGGTGTTACG

结果如图3A、B、C所示，在正常生长温度下，热激蛋白HSP26.5、HSP70和HSP90.1在转基因植株中的转录水平和野生型Col-0中相差不大；而高温处理60min之后，转基因植株和野生型中这些HSPs的转录水平均上升，但是过表达转基因植株中HSPs转录水平的上升程度低于Col-0，而显性抑制转基因植株中的转录水平上升程度明显高于Col-0。同样，与HSPs的表达情况类似，高温处理后过表达植株中HSFs转录水平的上升程度低于野生型，而显性抑制转基因植株中HSFs的转录水平上升程度明显高于野生型(图3-6D、E)。这些变化特征表明过表达AtERF49会降低高温对这些HSFs和HSPs的诱导，而显性抑制AtERF49的表达则会增强高温对这些HSFs和HSPs的诱导,从而使植物增强其对高温的耐受性。

序列表

<110>中国科学院植物研究所中国农业科学院生物技术研究所

<120>AtERF49基因在植物响应高温胁迫过程中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 621

<212> DNA

<213>拟南芥 (Arabidopsis thaliana)

<400> 1

atgtcatcca tagagccaaa agtaatgatg gttggtgcta ataagaaaca acgaaccgtc 60

caagctagtt cgaggaaagg ttgtatgaga ggaaaaggtg gacccgataa cgcgtcttgc 120

acttacaaag gtgttagaca acgcacttgg ggcaaatggg tcgctgagat ccgcgagcct 180

aaccgaggag ctcgtctttg gctcggtacc ttcgacacct cccgtgaagc tgccttggct 240

tatgactccg cagctcgtaa gctctatggg cctgaggctc atctcaacct ccctgagtcc 300

ttaagaagtt accctaaaac ggcgtcgtct ccggcgtccc agactacacc aagcagcaac 360

accggtggaa aaagcagcag cgactctgag tcgccgtgtt catccaacga gatgtcatca 420

tgtggaagag tgacagagga gatatcatgg gagcatataa acgtggattt gccggtaatg 480

gatgattctt caatatggga agaagctaca atgtcgttag gatttccatg ggttcatgaa 540

ggagataatg atatttctcg gtttgatact tgtatttccg gtggctattc taattgggat 600

tcctttcatt ccccactttg a 621

<210> 2

<211> 206

<212> PRT

<213> 拟南芥 (Arabidopsis thaliana)

<400> 2

Met Ser Ser Ile Glu Pro Lys Val Met Met Val Gly Ala Asn Lys Lys

1 5 10 15

Gln Arg Thr Val Gln Ala Ser Ser Arg Lys Gly Cys Met Arg Gly Lys

20 25 30

Gly Gly Pro Asp Asn Ala Ser Cys Thr Tyr Lys Gly Val Arg Gln Arg

35 40 45

Thr Trp Gly Lys Trp Val Ala Glu Ile Arg Glu Pro Asn Arg Gly Ala

50 55 60

Arg Leu Trp Leu Gly Thr Phe Asp Thr Ser Arg Glu Ala Ala Leu Ala

65 70 75 80

Tyr Asp Ser Ala Ala Arg Lys Leu Tyr Gly Pro Glu Ala His Leu Asn

85 90 95

Leu Pro Glu Ser Leu Arg Ser Tyr Pro Lys Thr Ala Ser Ser Pro Ala

100 105 110

Ser Gln Thr Thr Pro Ser Ser Asn Thr Gly Gly Lys Ser Ser Ser Asp

115 120 125

Ser Glu Ser Pro Cys Ser Ser Asn Glu Met Ser Ser Cys Gly Arg Val

130 135 140

Thr Glu Glu Ile Ser Trp Glu His Ile Asn Val Asp Leu Pro Val Met

145 150 155 160

Asp Asp Ser Ser Ile Trp Glu Glu Ala Thr Met Ser Leu Gly Phe Pro

165 170 175

Trp Val His Glu Gly Asp Asn Asp Ile Ser Arg Phe Asp Thr Cys Ile

180 185 190

Ser Gly Gly Tyr Ser Asn Trp Asp Ser Phe His Ser Pro Leu

195 200 205

<210> 3

<211> 663

<212> DNA

<213>人工序列

<400> 3

atgtcatcca tagagccaaa agtaatgatg gttggtgcta ataagaaaca acgaaccgtc 60

caagctagtt cgaggaaagg ttgtatgaga ggaaaaggtg gacccgataa cgcgtcttgc 120

acttacaaag gtgttagaca acgcacttgg ggcaaatggg tcgctgagat ccgcgagcct 180

aaccgaggag ctcgtctttg gctcggtacc ttcgacacct cccgtgaagc tgccttggct 240

tatgactccg cagctcgtaa gctctatggg cctgaggctc atctcaacct ccctgagtcc 300

ttaagaagtt accctaaaac ggcgtcgtct ccggcgtccc agactacacc aagcagcaac 360

accggtggaa aaagcagcag cgactctgag tcgccgtgtt catccaacga gatgtcatca 420

tgtggaagag tgacagagga gatatcatgg gagcatataa acgtggattt gccggtaatg 480

gatgattctt caatatggga agaagctaca atgtcgttag gatttccatg ggttcatgaa 540

ggagataatg atatttctcg gtttgatact tgtatttccg gtggctattc taattgggat 600

tcctttcatt ccccacttac tagtctggat ctggatctag aactccgttt gggtttcgct 660

tag 663

Claims

1.如下1) -3) 中任一种物质在降低植物耐高温性中的应用：

1) 蛋白ATERF49；

2) 编码蛋白ATERF49的DNA分子；

3) 含有编码蛋白ATERF49的DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

所述蛋白ATERF49为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：

所述ATERF49蛋白编码基因是编码区为序列表中序列1所示的DNA分子。

3.根据权利要求1-2中任一所述的应用，其特征在于：

所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：

所述双子叶植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。

5.抑制ATERF49蛋白编码基因表达的物质在如下a）-c）中任一中的应用；

或，抑制ATERF49蛋白编码基因表达在如下a）-c）中任一中的应用；

a）提高植物耐高温性；

b）培育耐高温性植物；

c）培育高耐高温性植物；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：

所述抑制ATERF49蛋白编码基因表达的物质为如下：

1) 由ATERF49编码基因和SRDX编码核苷酸融合的DNA分子；

2) 1）所示DNA分子编码的蛋白或RNA；

3) 含有1）所示DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：

所述由ATERF49编码基因和SRDX编码核苷酸融合的DNA分子的核苷酸序列为序列3。

8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：

10.一种培育高耐高温性转基因植物的方法，包括如下步骤：降低目的植物中编码蛋白ATERF49的DNA分子的表达量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的耐高温性高于所述目的植物；

或一种培育低耐高温性转基因植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中编码蛋白ATERF49的DNA分子的表达量和/或活性，得到转基因植物，所述转基因植物的耐高温性低于所述目的植物；

或一种培育低耐逆性转基因植物的方法，包括如下步骤：提高目的植物中蛋白ATERF49的活性，得到转基因植物，所述转基因植物的耐高温性低于所述目的植物；

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于：所述植物为双子叶植物或单子叶植物。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物；所述十字花科植物具体为拟南芥。