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CN108531506B - 一种调控作物株型结构的方法及获得株型紧凑作物的方法 - Google Patents

一种调控作物株型结构的方法及获得株型紧凑作物的方法 Download PDF

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CN108531506B CN201810365360.XA CN201810365360A CN108531506B CN 108531506 B CN108531506 B CN 108531506B CN 201810365360 A CN201810365360 A CN 201810365360A CN 108531506 B CN108531506 B CN 108531506B
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Abstract

本发明提供了一种调控作物株型结构的方法，属于植物基因工程领域。本发明通过一种调控作物多种农艺性状的方法，该方法通过调控SBP‑Box基因的表达，实现对作物株型的调控；进而获得株型紧凑、适宜密植、方便采收、抗倒伏的作物；通过将基因转化到农作物中，优化农作物的株型结构，提高农作物的抗倒伏性能，提高农作物的种植密度，方便人工和机械采收；具有较好的实际应用价值。

Description

一种调控作物株型结构的方法及获得株型紧凑作物的方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程领域，具体而言，涉及一种调控作物株型结构的方法及获得株型紧凑作物的方法。
背景技术
在农业生产中，农作物的农艺性状对作物的产量具有较大影响，在农业研究中，理想株型的研究不断的进行，科研工作者通过不断的调整作物植株的株型，来改善作物的产量、栽培、管理、采收性能。
传统的遗传育种是一条比较成熟的路径，但是遗传育种的时间较长，耗时费力，还不一定能获得理想的株型；但是随着分子生物学的发展，通过分子生物学的手段能极大的缩短育种时间，且还能提高获得目标植株的概率，是一个较好的手段。
株形结构是农作物的一个主要性状，目前在蔷薇科和茄科中，关于株形结构的研究还不够；尤其是苹果和番茄中的研究还有待进一步的加强。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种调控作物株型结构的方法，通过调控农作物的株型性状，进一步的调控农作物的相关(衍生)农艺性状和改善栽培方式；这些相关(衍生)农艺性状包括：抗倒伏性；可改善的栽培方式包括：适宜密植、方便人工和机械采收。
本发明的第二目的在于提供一种获得株型紧凑作物的方法，通过优化株型结构，可以提高作物抗倒伏、适宜密植、方便采收的能力；获得株型紧凑型转基因植物，具有抗倒伏、宜密植、易采收特性，为增加农作物的产量、改进植物外观品质和减少劳动力支出提供重要的保证。
为了实现本发明的上述目的，采用以下技术方案：
一种调控作物株型结构的方法，通过调控作物SBP-Box基因表达，以调控作物的农艺性状。
一种获得株型紧凑作物的方法，包括以下步骤：
将SBP-Box基因连接到表达载体，得到转化载体；
将转化载体转化到农作物中，获得株型紧凑型、抗倒伏、宜密植、易采收的转基因作物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明通过一种调控作物株型结构的方法，该方法通过调控SBP-Box基因的表达，实现对作物农艺性状的调控；进而对农作物的外观品质和栽培方式产生影响；获得株型紧凑型、抗倒伏、宜密植、易采收作物的方法，通过将基因转化到农作物中，提高农作物的株型结构、抗倒伏性、空间利用率、人工和机械采收性能；具有较好的实际应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例1提供的转基因株系PCR检测结果图；
图2为本发明实施例1提供的转基因株系株型比较图；
图3为本发明实施例1提供的转基因株系株高比较图；
图4为本发明实施例1提供的转基因株系节长比较图；
图5为本发明实验例1提供的转基因株系节数比较图；
图6为本发明实验例1提供的转基因株系叶片长比较图；
图7为本发明实验例1提供的转基因株系坐果节位比较图；
图8为本发明实验例1提供的转基因株系L22株高比较图；
图9为本发明实施例2提供的CK1与CK2具有表达相关性拟合图；
图10为本发明实施例2提供的CK1与CK3具有表达相关性拟合图；
图11为本发明实施例2提供的CK2与CK3具有表达相关性拟合图；
图12为本发明实施例2提供的L16与L22具有表达相关性拟合图；
图13为本发明实施例2提供的L4与L16具有表达相关性拟合图；
图14为本发明实施例2提供的L4与L22具有表达相关性拟合图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种调控作物株型结构的方法及获得转基因作物的方法进行具体说明。
一种调控作物株型结构的方法，通过调控作物SBP-Box基因表达，以调控作物的农艺性状。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，SBP-Box基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，农艺性状包括株型。
一种获得转基因作物的方法，包括以下步骤：
将SBP-Box基因连接到表达载体，得到转化载体；
将转化载体转化到农作物中，获得株型紧凑型、抗倒伏、宜密植、易采收的转基因作物。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，还包括将转化载体转化到宿主菌，得到转化宿主菌，用转化宿主菌转化作物获得转基因作物。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，宿主菌为农杆菌。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，农作物为蔷薇科作物或茄科作物。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，蔷薇科作物为苹果，茄科作物为番茄。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种调控作物株型结构的方法，即通过调控作物SBP-Box基因的表达，以达到调控作物株型结构的目的；SBP-Box基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
本实施例提供一种调控作物株型结构的方法，包括以下步骤：
1.1选择两个合适的酶切位点，通过引物设计，将酶切位点设计到引物上，通过PCR扩增或者人工合成的方法将酶切位点引入到SBP-Box基因的两端；
1.2双酶切带有酶切位点SBP-Box基因片段和pBI121载体质粒，并凝胶电泳回收；
1.3电泳回收，得到SBP-Box片段和pBI121载体片段；
1.4用连接酶将SBP-Box片段和pBI121载体片段连接，得到pBI121-SBP-Box重组质粒。
1.5将pBI121-SBP-Box重组质粒转化到大肠杆菌，鉴定阳性克隆，挑选阳性克隆测序，验证SBP-Box序列是否正确。
还包括农杆菌的转化和阳性克隆的鉴定，包括以下步骤：
2.1取100μL农杆菌感受态，加入1-2μL质粒DNA，1800V电转，加入400μL YEP培养基；
2.2在28℃，100rpm的条件下，恢复培养1h；涂布于含相应抗生素的LB平板上，28℃，培养36-48h；
2.3挑取单菌落于1mL的LB培养基(含相应抗生素)中，28℃，200rpm培养48h后，进行PCR验证；验证正确的单克隆进行保菌，用于后续的实验。
本实施例还提供获得的含有pBI121-SBP-Box重组质粒的阳性农杆菌转化番茄，获得转基因番茄的实验。实验过程的步骤如下：
3.1取番茄种子，用蒸馏水冲洗一遍，70％乙醇洗45秒，1％次氯酸钠消毒5-8分钟，无菌水冲洗5次，播种于1/2MS培养基中萌发；
3.2将已萌发的无菌苗子叶切下，叶片近轴面向下，接种在预培养培养基上，预培养1-3天；
3.3挑取一个单菌落根癌农杆菌，接种到20mL附加相应抗生素的YEB或LB培养液中，在28℃恒温摇床上培养到OD值为0.2-0.5时，用50mL无菌离心管于3000rpm离心5分钟收集菌体，弃上清后用液体MS培养基重悬即可用于转化；
3.4在超净工作台上，将菌液倒入无菌培养皿，从培养皿中取出预培养的外植体，放入菌液中泡1－5分钟，取出外植体在无菌滤纸上吸去附着的菌液，然后接种在分化培养基上，28℃暗培养2－4天；
3.5将经过共培养的外植体转移到加有选择压的分化培养基上。在光照的条件下，25℃进行选择培养；
3.6选择培养2-4周后，外植体的转化细胞将分化出抗性不定芽，或者产生抗性愈伤组织；将这些抗性材料转移到相应继代选择培养基上，或者转入附加选择压的生长和分化培养基中，令其生长和诱导分化；
3.7待不定芽长到1cm以上时，切下并插入含有选择压的生根培养基上进行根培养，两周左右长出不定根。
通过农杆菌介导的遗传转化，共获得31个抗性植株，通过PCR检查和T1代株系的卡拉霉素筛选，获得15个转基因株系。
PCR检查结果如图1所示，可以看出，从31个抗性植株中获得了15个转基因株系，15个株系分别是L1、L3、L4、L6、L7、L10、L12、L15、L16、L22、L23、L25、L27、L28和L30。
转基因植株的株型如图2所示，获得的15个转基因株系的植株与对照组(CK)的比较，转基因植株的T1代植株从幼苗期开始显示出株型矮小化，节间缩短的表型性状，尤其是转基因株系L22表现较为明显。
转基因植株的株高如图3所示、节长如图4所示、节数如图5所示、叶片长如图6所示、坐果节位如图7所示；可以看出，在转基因植株成熟期，转基因植株的株高，节间长与对照相比显著降低，而叶片长度，植株节数与对照无明显差异，第一胎果坐果节位有所升高。
可以看出，SBP-Box基因的转基因植株能够调控株高、株型、节高等农艺性状。
如图8所示，将转基因植株L22株系与对照组记性比较，发现转基因株系L22的株型明显变小。
综上，SBP-Box基因是一个株型结构调控基因，适量超表达该基因能够产生株型紧凑的植物。
因此，通过上述的方法构建SBP-Box基因的表达载体，并转化到植物中，能够获得转基因植株并调控作物的农艺性状。当然也能将SBP-Box基因转化到苹果等蔷薇科或者以番茄为代表的茄科的其他作物中，通过调控SBP-Box基因的表达，调控番茄、苹果等作物的农艺性状。
由于株型紧凑的作物具有较好的抗倒伏、宜密植、易采收性能，因此通过调控SBP-Box基因，可以优化作物株型、提高抗倒伏、宜密植、易采收性能。
实施例2
本实施例对获得转基因番茄的3个转基因株系(L4、L6和L22)以及另外3和非转基因株系(CK1、CK2和CK3)进行转录组分析。
分别对获得转基因番茄的3个转基因株系(L4、L6和L22)以及另外3和非转基因株系(CK1、CK2和CK3)进行illumina转录组测序，测序读长是100bp，每个样品获得超过4Gclean data数据。获得的数据如表1所示。
表1测序获得Clean data数据统计表
Figure BDA0001635910440000091
reads在基因组上的分布与基因在染色体上的分布是一致的，表明该测序结果是无偏的。
通过使用短reads比对软件SOAPaligner/SOAP2将每个样品的clean data分别与参考基因和参考基因组做比对，最多允许5个碱基错配，87.30％-88.95％的reads比对到参考基因上，可以看出，绝大多数基因都能比对上，说明测序结果还是较为可靠和准确的；比对的如表2所示。
表2样品与参考基因比对的统计结果
Figure BDA0001635910440000101
对转基因和对照各自3个株系之间的相关性进行了评价，样品之间的相关性和拟合系数如图9到图14所示，相关系数超过0.97，表明这些株系之间具有很好的生物学重复性。
表达量分析显示，3个转基因株系与对照相比，分别有1091、655、1187个基因上调表达，1196、584、842个基因下调表达，表达量分析结果如表3所示。
表3样品差异表达基因个数
Figure BDA0001635910440000111
将3个株系作为生物学重复对待，使用DESeq(http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq.html)软件对生物学重复的组间样品做差异分析，筛选条件为FDR≤0.001AND|log2Ratio|≥1，发现333个基因在转基因和对照组间具有显著表达差异，其中248个基因上调表达，85个基因下调表达。结果如表4所示。
表4组间差异表达基因数
群组 总基因数 上调 下调
转基因组VS非转组 333 248 85
对这些差异基因的表达模式聚类分析，转基因株系与非转基因株系分别聚类到2个分支中，表明这些差异主要由所转基因引起。对差异表达基因的GO功能注释进行分类，发现biological process分类中的cellular process和metabolic process条目，cellularcomponent分类中的cell和cell part条目，molecular function分类中的catalyticactivity和binding条目是含有最多差异表达基因的条目。
使用blast软件将基因比对到KEGG数据库中，得到基因的pathway注释信息。然后根据已得的差异表达基因列表，应用超几何检验做差异表达基因的pathway富集分析。metabolic pathways，biosynthesis of secondary metabolites和plant hormonesignal transduction是显著受影响的代谢途径。表明所转的SBP-box基因是通过影响植物激素信号传导，进而影响植物代谢和次生代谢，从而调控植物株型结构以及其他发育过程。
综上所述，本发明提供的调控作物株型结构的方法，在分子水平获得解释和证实，通过本发明的操作过程，可以获得表现良好的转基因作物。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院蔬菜花卉研究所
<120> 一种调控作物株型结构的方法及获得株型紧凑作物的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 489
<212> DNA
<213> Apple
<400> 1
atggagggga tgagtaaatt ggacttggac aagcagatga aggagaagcc gcatgtggtg 60
gtggtggtga agaaggagga ggaggaattt gatgatgagc tgcaagtgga caggatgaag 120
aaaggtaaga gatcgttgtc gtcatcatca ggaggaggag gaggtgcaat gagacggtgt 180
caggcagaca ggtgcacagc tgatctgagc gatgaaaaga aatatcacag aaagcataag 240
gtttgtgacc ttcattccaa gtctcaggtt gtgcttgtct ctggcctcca ccaaaggttt 300
tgccagcaat gcagcagatt tcatgagcta tcagaatttg acgacaccaa acggagctgt 360
cgtagccgtt tgtcaggaca caatgaacga cgaaggaaga atccagccga gtctcatgct 420
gtggaaggct caagccgcaa tgttggtaca aggactcagt ccactcacaa gcacttccaa 480
atcaaataa 489

Claims (8)

1.一种调控作物株型结构的方法，其特征在于，通过调控作物SBP-Box基因表达，以调控作物的株型结构，所述SBP-Box基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的调控作物株型结构的方法，其特征在于，所述株型结构包括抗倒伏株型、宜密植株型或易采收株型。
3.一种获得株型紧凑作物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将SBP-Box基因连接到表达载体，得到转化载体；所述SBP-Box基因的碱基序列如SEQID NO.1所示；
将所述转化载体转化到农作物中，获得株型紧凑型、抗倒伏、宜密植、易采收的转基因作物。
4.根据权利要求3所述的获得株型紧凑作物的方法，其特征在于，还包括将所述转化载体转化到宿主菌，得到转化宿主菌，用所述转化宿主菌转化作物获得转基因作物。
5.根据权利要求4所述的获得株型紧凑作物的方法，其特征在于，所述宿主菌为农杆菌。
6.根据权利要求4所述的获得株型紧凑作物的方法，其特征在于，所述农作物为蔷薇科作物或茄科作物。
7.根据权利要求6所述的获得株型紧凑作物的方法，其特征在于，所述蔷薇科作物为苹果。
8.根据权利要求6所述的获得株型紧凑作物的方法，其特征在于，所述茄科作物为番茄。
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