CN103172717B - 植物耐低钾胁迫相关蛋白GmWRKY50及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物耐钾胁迫相关蛋白GmWRKY50及其编码基因与应用。该蛋白质GmWRKY50来源于大豆（Glycine max(L.)Merr.），为如下a）或b）的蛋白质：a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b）将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物的耐低钾胁迫和/或器官体积及器官数量相关的由（a）衍生的蛋白质。实验证明，将含有编码所述蛋白的序列表序列2所示DNA分子的重组表达载体pCXSN-GmWRKY50转化拟南芥得到的T₃代纯合转基因植株，其耐低钾胁迫能力明显高于相同条件下的野生型拟南芥植株。本发明在提高植物耐低钾胁迫能力的育种和研究中具有重要意义。

Description

植物耐低钾胁迫相关蛋白GmWRKY50及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种植物耐低钾胁迫相关蛋白GmWRKY50及其编码基因与应用。

背景技术

钾素是植物体中含有的最丰富的无极阳离子，其总量占植株总干重的2%—6%，对植物的生长发育起关键作用。钾离子参与植物的许多重要生理生化过程，如维持细胞电荷平衡，调节各种酶的活性，调节细胞膨压以及参与蛋白质合成，影响植物气孔运动、光合作用、促进细胞伸长等。严重缺钾的植物表现出缺素症状如根系萎缩，茎部脆弱，叶片生活力差，老叶边缘焦灼，种子果实小而皱缩，植株矮小，生长缓慢，易感染病虫害及冻害。尽管钾素是地壳中含量最多的可供植物吸收利用的矿质元素，但植物只能以离子形式吸收钾素，因此能被植物利用的钾素只占很少一部分。农作物尤其是大豆对钾素的消耗量较大，而根际可利用的土壤中的钾离子浓度一般在0.1—6.0mmol/L，经常低于植株需要的浓度，造成植株遭遇低钾环境，严重影响植株的正常生长发育。当土壤溶液中钾离子含量低，钾肥供应不足时，会严重制约作物产量。因此，筛选钾高效的作物新品种或利用基因工程改良作物品种，提高作物自身的钾吸收利用能力，对于提高作物产量和改进品质具有重要作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物耐低钾胁迫相关蛋白GmWRKY50及其编码基因与应用。

本发明所提供的与植物耐低钾胁迫相关的蛋白质，来源于大豆（Glycine max(L.)Merr.），名称为GmWRKY50，该蛋白质为如下a）或b）的蛋白质：

a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

b）将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物的耐低钾胁迫能力和/或器官体积及器官数量的由（a）衍生的蛋白质。

序列表序列1所示的氨基酸序酸残基组成。

为了使上述（a）中的蛋白便于纯化，可在由序列表序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6（通常为5个）	RRRRR
Poly-His	2-10（通常为6个）	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述（b）中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述（b）中的蛋白的编码基因可通过将序列表序列2所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述蛋白质的编码基因也是本发明保护的范围。

所述蛋白质的编码基因具体可为如下1）或2）或3）或4）的基因：

1）其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

2）其核苷酸序列是序列表中序列2的第140位至第979位所示的DNA分子；

3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码所述蛋白质的DNA分子；

4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白质的DNA分子。

序列表序列2由1011个脱氧核苷酸组成，其中的第140位至第979位是大豆蛋白GmWRKY50的编码序列。

所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1%SDS和1×SSC，0.1%SDS各洗膜一次。

本发明保护含有所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

可用现有的植物表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pROKII、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb（CAMBIA公司）等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因（如大豆贮存蛋白基因）3’端转录的非翻译区均具有类似功能。使用所述基因构建重组植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子（如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、玉米的泛素启动子（Ubiquitin））、组成型启动子或组织特异表达启动子（如种子特异表达的启动子），它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因（GUS基因、萤光素酶基因等）、抗生素的标记基因（如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因）或是抗化学试剂标记基因等（如抗除莠剂基因）、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。

所述重组载体具体可为在载体pCXSN的两个Xcm I位点间插入了所述基因得到的重组载体（命名为重组载体A）。

本发明所提供的所述蛋白质及所述基因可用于调控目的植物的耐低钾胁迫能力和/或器官体积及器官数量。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：在所述目的植物中导入所述基因，得到耐低钾胁迫能力和/或器官体积及器官数量高于所述目的植物的转基因植物。

本发明还提供一种提高目的植物耐低钾胁迫能力和/或器官体积及器官数量的方法，包括在所述目的植物中导入所述基因的步骤。

在上述两种方法中，所述导入是通过所述重组载体A实现的。

在上述方法或应用中，所述目的植物可为单子叶植物或双子叶植物。

在上述方法或应用中，所述双子叶植物具体可为拟南芥（Arabidopsis thaliana）。

所述低钾为所述目的植物可利用的钾的量或浓度低于其正常生长发育的需要量或浓度；在本发明的实施例中，所述低钾具体是可利用的钾浓度为0.3mmol/L。

所述耐低钾胁迫能力与经所述低钾胁迫的植物的器官体积和/或器官数量正相关；

所述器官为叶、茎和/或根。

实验证明，将含序列表中序列2所示DNA分子的重组表达载体pCXSN-GmWRKY50转化拟南芥得到的T₃代纯合转基因植株，正常培养基和低钾培养基培养20天后，与相同培养条件下的WT幼苗相比，莲座叶片的体积更大，根系更发达，新生真叶数更多；且新生叶片叶色更绿，生长状况更好。本发明在提高植物耐低钾胁迫能力的育种和研究中具有重要意义。

附图说明

图1为T₃代纯合转基因GmWRKY50的拟南芥株系（TL）植株的PCR检测结果。其中，M为分子量标准，从上至下的片段大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道3—5分别为不同的TL株系TL1、TL2和TL3的植株；泳道1为重组载体pCXSN-GmWRKY50阳性对照；泳道2为野生型拟南芥阴性对照。

图2为T₃代纯合转空载体的拟南芥株系（CK）植株的PCR检测结果。其中，M为分子量标准，从上至下的片段大小依次为2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；泳道3—6分别为不同的CK株系CK1、CK2和CK3的植株；泳道1为载体pCXSN阳性对照；泳道2为野生型拟南芥阴性对照。

图3为T₃代纯合转基因GmWRKY50的拟南芥株系（TL）中目的基因GmWRKY50的相对表达量测定结果。其中，WT为野生型拟南芥阴性对照，TL1—TL3为不同的TL株系。

图4为将T₃代纯合转基因GmWRKY50的拟南芥株系（TL）和野生型拟南芥（WT）的种子发芽后于正常培养基中培养20天后的表型。其中，左侧3株分别为TL株系TL1、TL2和TL3的植株，右侧3株为WT植株。

图5为将T₃代纯合转基因GmWRKY50的拟南芥株系（TL）和野生型拟南芥（WT）的种子发芽后于低钾培养基中培养20天后的表型。其中，左侧3株分别为TL株系TL1、TL2和TL3的植株，右侧3株为WT植株。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、大豆蛋白GmWRKY50及其编码基因与重组表达载体的获得

取大豆品系油06-71（Glycine max(L.)Merr.）正常条件下培养的苗期叶片，提取总RNA，并反转录获得cDNA，以该cDNA为模板，在引物PF和引物PR的引导下，用常规PCR法进行扩增，反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化约1kb的DNA片段；将载体pCXSN（在载体pCXSN的T-DNA片段上含有致死基因ccdB，其两侧含XcmⅠ酶切识别序列。该载体购自拟南芥生物资源中心（TheArabidopsis Biological Resource Center，ABRC；网址：http://abrc.osu.edu/)，产品目录编号为Vector:5019471951）用XcmⅠ酶切，回收载体骨架片段；将该载体骨架片段与所述约1kb的DNA片段用T4连接酶连接，获得重组载体pCXSN-GmWRKY50，经测序证实，该重组载体pCXSN-GmWRKY50为在载体pCXSN的两个XcmⅠ位点间插入了序列表序列2所示1011bp的DNA片段。序列表序列2的第140—979位序列编码具有序列表序列1所示的由279个氨基酸组成的蛋白GmWRKY50，将其编码基因命名为GmWRKY50。

上述引物的序列如下：

引物PF：5’-CATGGCATTCTGACTCATACCCA-3’；

引物PR：5’-CCCCAACAGTTCCCCTTTCTTTA-3’。

实施例2、重组根癌农杆菌的获得

将实施例1获得的重组载体pCXSN-GmWRKY50冻融法转化根癌农杆菌GV3101（文献：Amanda M Davis，Anthony Hall，Andrew J Millar，Chiarina Darrah and SethJ Davis，Protocol:Streamlined sub-protocols for floral-dip transformationand selection of transformants in Arabidopsis thaliana，2009，5:310.1186/1746-4811-5-3；公众可从中国农业科学院油料作物研究所获得），获得含有重组载体pCXSN-GmWRKY50的根癌农杆菌GV3101，将该重组农杆菌命名为GV3101/pCXSN-GmWRKY50；

将空载体pCXSN冻融法转化根癌农杆菌GV3101，获得含有空载体pCXSN的根癌农杆菌GV3101，将该重组农杆菌命名为GV3101/pCXSN。

实施例3、转基因拟南芥的获得及鉴定

一、转基因拟南芥的获得

利用实施例2获得的两种重组农杆菌，分别花芽浸泡法转化180株哥伦比亚生态型拟南芥Columbia-0（以下简称为野生型拟南芥WT）（文献：Xia T,Xiao D,Liu D,Chai W,Gong Q,Wang NN.Heterologous expression of ATG8c from soybean conferstolerance to nitrogen deficiency and increases yield in Arabidopsis.PLoS One.2012;7(5):e37217；公众可从中国农业科学院油料作物研究所获得），获得T₃代纯合转基因GmWRKY50的拟南芥株系3个，T₃代纯合转空载体的拟南芥株系3个，具体方法如下：

1、取重组农杆菌GV3101/pCXSN-GmWRKY50或GV3101/pCXSN，用含卡那霉素50μg/ml和利福平50μg/ml的YEP培养液培养至OD₆₀₀为0.8；室温离心后将菌体沉淀重悬于5%蔗糖溶液中，获得菌悬液；将待转基因的拟南芥植株倒置，使莲座叶以上的花序在菌悬液中浸泡15s后，将植株水平放置于22℃环境中，用不透光的塑料袋封住盆钵；24小时后将植株取出，竖直培养直至收获种子（即T₀代种子），种子经室温干燥后备用。

2、将步骤1获得的T₀代种子，4℃低温处理2天，播种于含100mg/l潮霉素的MS培养基中，置于22℃光照培养箱中持续培养，15天后挑选可正常生长的潮霉素抗性植株（潮霉素抗性植株表现为植株生长正常；非潮霉素抗性植株表现为植株矮小黄化，无法正常生长），移入正常MS培养基中缓苗后，播种于营养土中直至收获T₁代种子。按照同样的方法种植筛选T₁代种子，移栽潮霉素抗性分离比为3:1的T₁代株系，并单株收获T₁代株系内各单株上所结T₂代种子，取T₂代株系种子按照同样的方法进行潮霉素抗性筛选，得到T₂代不再产生潮霉素抗性分离的纯合转基因GmWRKY50的拟南芥株系8个和T₂代不再产生潮霉素抗性分离的纯合转空载体株系8个；随取3个T₂代纯合转基因GmWRKY50的拟南芥株系繁殖，收获T₃代纯合转基因GmWRKY50的拟南芥株系种子；随取3个T₂代纯合转空载体的拟南芥株系繁殖，收获T₃代纯合转空载体的拟南芥株系种子。

T₀代表示转化当代所结的种子及由它所长成的植株；T₁代表示T₀代自交产生的种子及由它所长成的植株；T₂代表示T₁代自交产生的种子及由它所长成的植株；T₃代表示T₂代自交产生的种子及由它所长成的植株。

二、转基因拟南芥的分子检测

1、PCR鉴定

取步骤一获得的T₃代纯合转基因GmWRKY50的拟南芥株系（TL1、TL2、TL3）和野生型拟南芥（WT）的植株，分别提取基因组DNA，用实施例1的引物PF和引物PR对目的基因GmWRKY50进行PCR扩增，目的产物大小为1011bp，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，将获得1011bp条带的植株记为阳性。结果：TL1、TL2、TL3株系植株全部为阳性，WT植株全部为阴性，部分结果如图1所示。

取步骤一获得的T₃代纯合转空载体的拟南芥株系（CK1、CK2、CK3）和野生型拟南芥（WT）的植株，分别提取基因组DNA，用引物5’-AGACCGGCAACAGGATTCAATC-3’和引物5’-CTCAAGCAATCAAGCATTCT-3’PCR扩增靶基因ccdB基因，目的产物大小为896bp，将扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，将获得896bp条带的植株记为阳性。结果：CK1、CK2、CK3株系植株全部为阳性，WT植株全部为阴性，部分结果如图2所示。

2、实时荧光定量PCR检测

取步骤一获得的T₃代纯合转基因GmWRKY50的拟南芥株系（TL1—TL3），T₃代纯合转空载体的拟南芥株系（CK）和野生型拟南芥（WT）植株，分别提取总RNA，反转录获得cDNA，以该cDNA为模板，用特异引物F1和R1对基因GmWRKY50的cDNA进行实时荧光定量PCR扩增，以Actin为内参，引物为FC和RC。实时荧光定量PCR在StepOnePlus^TM实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用Livak KJ和Schmittgen TD(2001)报道的方法，即2^-ΔΔCT计算相对表达量。

ΔΔC_T=（C_T.Target－C_T.Actin）_Timex－（C_T.Target－C_T.Actin）_Time0

Time x表示任意时间点，Time₀表示经Actin校正后1倍量的目标基因表达。

上述引物的序列如下：

F1：5’-GCGTCTCCTCCAACTCCTCCTT-3’；

R1：5’-TGGTCGTGGCACCTCTTCTTGA-3’；

FC：5’-TTTGCTGGTGATGATGCTC-3’；

RC：5’-ACCTCTTTTTGACTGGGCT-3’。

结果如图3所示，结果表明，WT植株中不表达目的基因GmWRKY50；而转基因GmWRKY50的拟南芥株系TL1—TL3中目的基因GmWRKY50的表达量都很高。CK株系植株的结果与WT相同。

三、转基因拟南芥的表型鉴定

取步骤一获得的T₃代纯合转基因GmWRKY50的拟南芥株系（TL1—TL3），T₃代纯合转空载体的拟南芥株系（CK）和野生型拟南芥（WT）种子，消毒后播种于1/2MS培养基中，于长日照（16h光照/8h黑暗）、22℃条件下培养7天，取生长状态一至的各株系植株幼苗移至正常培养基（即1/2的MS培养基）和低钾培养基（将1/2的MS培养基中钾离子的浓度由3mmol/L降低为0.3mmol/L）中长日照（16h光照/8h黑暗）、22℃条件下继续竖直培养20天，观察并记录不同处理各株系植株地上部（即茎和叶）和地下部（即根系）的表型。

结果：经正常培养基和低钾培养基培养20天后的T₃代纯合转基因GmWRKY50的拟南芥株系TL1—TL3幼苗，与相同培养条件下的WT幼苗相比，莲座叶片的体积更大，根系更发达，新生真叶数更多；且新生叶片叶色更绿，生长状况更好（部分结果如图4和图5所示）。T₃代纯合转空载体的拟南芥株系（CK）与野生型拟南芥（WT）的表型无显著差异。

实施例3的结果表明，蛋白GmWRKY50及其编码基因具有调控目的植物的耐低钾胁迫能力和器官体积及数量的功能。

Claims (15)

1.一种蛋白质，是由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：所述编码基因为如下1）或2）的基因：

1）其核苷酸序列是序列表中序列2所示的DNA分子；

2）其核苷酸序列是序列表中序列2的第140位至第979位所示的DNA分子。

4.含有权利要求2或3所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是在载体pCXSN的两个Xcm I位点间插入权利要求2所述基因。

6.权利要求1所述蛋白质或权利要求2或3所述基因在调控目的植物的耐低钾胁迫能力和/或器官体积及器官数量中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物可为拟南芥（Arabidopsisthaliana）。

9.根据权利要求6-8中任一所述的应用，其特征在于：所述低钾为所述目的植物可利用的钾量低于其正常生长发育的需要量；

所述耐低钾胁迫能力与经所述低钾胁迫的植物的器官体积和/或器官数量正相关；

所述器官为叶、茎和/或根。

10.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：在目的植物中导入权利要求2或3所述基因，得到耐低钾胁迫能力和/或器官体积及器官数量高于所述目的植物的转基因植物。

11.一种提高目的植物耐低钾胁迫能力的方法，包括在目的植物中导入权利要求2或3所述基因的步骤。

12.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于：所述导入是通过权利要求5所述重组载体实现的。

13.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物具体可为拟南芥（Arabidopsis thaliana）。

15.根据权利要求10或11所述的方法，其特征在于：所述低钾为所述目的植物可利用的钾量低于其正常生长发育的需要量；

所述耐低钾胁迫能力与经所述低钾胁迫的植物的器官体积和/或器官数量正相关；

所述器官为叶、茎和/或根。