CN105296389B - 一株青霉素钠降解菌pc-2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物降解处理领域，提供一株青霉素钠降解菌及其分离鉴定，以及该降解菌在青霉素钠上的降解应用。该青霉素钠降解菌属螯合球菌属，分类命名螯合球菌Chelatococcus sp.，保藏编号为CGMCC No.1.15283，于2015年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。降解特性研究表明，在37℃、150r/min的条件下振荡培养12d，PC‑2对初始浓度为200ppm的青霉素钠的降解率为53.5％。当葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源、降解菌接种量为14％、青霉素钠初始浓度为100ppm、pH值范围6.0～7.0时降解率最高。该青霉素钠降解菌对青霉素钠有良好的降解特性，为生物法降解青霉素残留提供了一定的参考依据。

Description

一株青霉素钠降解菌PC-2及其应用

技术领域

本发明属于生物降解处理领域，涉及一株青霉素钠降解菌及其分离鉴定，以及该降解菌在青霉素钠上的降解应用。

背景技术

青霉素菌渣是我国抗生素发酵工业生产中的主要废料，据初步估算，2009年中国产生的各类抗生素菌渣约130万吨。2002年农业部、卫生部、国家药品监督管理局等部门把抗生素菌渣列为禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录中；2008年，国家环保部又将抗生素菌渣列入《国家危险废物名录》中。针对抗生素菌渣产量大、处理难度大等现实问题，以及《制药工业污染防治技术政策》(征求意见稿)中提出的“鼓励开发发酵菌渣在生产工艺中的再利用技术、无害化处理技术、综合利用技术”政策建议，如何实现抗生素菌渣的合理有效利用与安全处理成为了我国环境保护和制药产业可持续发展的难题。

抗生素菌渣堆肥技术不仅能有效利用菌渣中大量蛋白质、有机质、有机酸，还能降解菌渣中残留的抗生素，因此是抗生素菌渣处理处置技术的研究热点。鉴于堆肥处理若不能将抗生素残留完全去除，堆肥产品施用后会导致一定的生态环境风险，有些学者开始在堆肥过程中接种微生物菌剂，从而提高堆肥物料的降解速率。

抗生素降解菌的筛选、分离是生物法处理抗生素污染物的关键。迄今为止，国内外一些研究学者已筛选到多株抗生素降解菌，但青霉素降解菌较少，本研究涉及的降解菌是首次发现的能够降解青霉素钠的螯合球菌属(Chelatococcus sp.)细菌。

发明内容

为了克服目前抗生素菌渣中抗生素难以有效分解，导致青霉素菌渣不能高效利用，产生大量污染等问题，提供一株能高效分解青霉素钠的降解菌以及该降解菌在降解青霉素钠方面的应用。

本发明的目的通过以下技术方案实现

1.本发明提供一株青霉素钠降解菌PC-2，该青霉素钠降解菌属螯合球菌属，分类命名螯合球菌Chelatococcus sp.，保藏编号为CGMCC No.1.15283，于2015年6月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。

所述青霉素钠降解菌PC-2生物学特征如下：在LB固体培养基上PC-2呈圆形，中间凸起，乳白色，表面光滑，不透明，边缘整齐，菌落直径约为1～2mm。在透射电子显微镜下观察，PC-2为短杆状，1.96μm×0.92μm，端生鞭毛。

2.本发明还提供鉴定青霉素钠降解菌PC-2的方法，该方法以引物F-primer 27F和R-primer 1492R对待检测细菌基因组进行PCR扩增，得到1475bp的扩增产物，说明该待检测细菌为青霉素钠降解菌PC-2；

其中，引物F-primer 27F的序列为：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R-primer1492R的序列为：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

1475bp的扩增产物为16S rDNA序列PCR分析结果。

3.本发明还提供分离青霉素钠降解菌PC-2的方法，包括：(1)取青霉素菌渣与猪粪的混合堆肥样品，添加到含蒸馏水三角瓶中，36℃-38℃，130r/min-160r/min在摇床上震荡使样品与水充分混合；其中，青霉素菌渣与猪粪的混合堆肥样品中菌渣和堆肥的质量比例为1:2；混合堆肥与蒸馏水的比例为1:8-1:10g/mL

(2)采用梯度稀释法将混合液稀释至浓度约为0.1～1.0ppm时，用移液枪分别移取200μL的样品涂布到青霉素钠添加浓度为1000ppm的LB固体培养基上于36-37℃恒温培养2d-3d，待培养基长出菌落后，挑取单菌落划线分离培养多次后获得单菌株。

4.本发明还提供上述1所述的青霉素钠降解菌在青霉素残留降解中的应用，该应用通过将青霉素降解菌PC-2按接种量2％-18％接种于青霉素钠初始浓度为100-1200ppm的青霉素残留物中，向其中加入碳源、氮源，调整pH值为6-10；其中，碳源包括葡萄糖、麦芽糖和蔗糖的一种或多种混合物，浓度为0.3％-0.5％；氮源包括蛋白胨、酵母膏和尿素的一种或多种混合物，浓度为0.3％-0.5％。

5.上述4提供的青霉素钠降解菌在青霉素残留降解中的应用，其中，所述接种量为14％，青霉素钠初始浓度为100ppm，向青霉素残留物中加入的碳源为浓度为0.4％的葡萄糖，氮源为浓度为0.4％的蛋白胨，调整pH范围在6.0～7.0。

6.上述4或5所述的应用，其中，青霉素降解菌PC-2取自对数生长期，在接种前先经过离心，然后以磷酸盐缓冲溶液淋洗，所述磷酸盐缓冲溶液为0.2mol/L NaH2PO4 39.0mL，0.2mol/L Na2HPO461.0mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。

7.本发明还提供一种青霉素钠降解剂，该降解剂包括青霉素钠降解菌PC-2。

8.上述7提供的青霉素钠降解剂在青霉素钠降解上的应用，使用时，按照青霉素降解菌PC-2接种量2％-18％接种于青霉素钠初始浓度为100-1200ppm的青霉素残留物中，向其中加入碳源、氮源，调整pH值为6-10；其中，碳源包括葡萄糖、麦芽糖和蔗糖的一种或多种混合物，浓度为0.3％-0.5％；氮源包括蛋白胨、酵母膏和尿素的一种或多种混合物，浓度为0.3％-0.5％。

9.上述8所述的应用，其中，所述接种量为14％，青霉素钠初始浓度为100ppm，向青霉素残留物中加入的碳源为浓度为0.4％的葡萄糖，氮源为浓度为0.4％的蛋白胨，调整pH范围在6.0～7.0。

有益效果：

1.本研究涉及的降解菌是首次发现的能够降解青霉素钠的螯合球菌属(Chelatococcus sp.)细菌，填补了目前研究的空白。

2.通过优化降解菌降解青霉素钠过程中反应参数，青霉素钠降解菌PC-2降解青霉素钠的降解率最高可达到99.32％，相较于一般10％的降解率有了明显提高，说明本发明提供的青霉素降解菌PC-2是一种高效率降解菌。利用此菌制成的青霉素钠降解剂可以大范围应用于抗生素发酵工业生产中，可以大大降低环境污染，提高经济效率。

附图说明

图1为PC-2在LB平板上的菌落形态

图2为PC-2透射电镜图片

图3为PC-2扫描电镜图片

图4为PC-2系统发育树图片

图5为青霉素钠溶液标准曲线图

图6为PC-2生长曲线图片

图7为PC-2降解曲线图片

图8为PC-2降解动力学线性回归方程

图9为碳源对PC-2降解青霉素钠的降解效果影响图

图10为氮源对PC-2降解青霉素钠的降解效果影响图

图11为接种量对PC-2降解青霉素钠的降解效果影响图

图12为底物浓度对PC-2降解青霉素钠的降解效果影响图

图13为pH值对PC-2降解青霉素钠的降解效果影响图

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。

LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。LB固体培养基加15g琼脂粉。

基础培养基：(NH₄)₂SO₄2g，NaH₂PO₄0.5g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄0.2g，蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min。

上述两种培养基分别用于降解菌PC-2生长曲线和降解曲线的绘制。

磷酸盐缓冲溶液：0.2mol/L NaH2PO439.0mL，0.2mol/L Na2HPO461.0mL，pH7.0，121℃灭菌20min。

主要实验仪器及试剂：生物培养箱(Thermo)；离心机(eppendrof,Centrifuge5415R)；恒温摇床(Thermo,MAXQ 4000)；高效液相色谱仪Waters 2695(美国Waters公司)。

乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；青霉素钠标准品(>98％，美国Sigma公司)；甲酸(分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司)；实验用水为Milli Q水(电导率18.2MΩ·cm)。PCR试剂均购自TaKaRa公司。

实施例1

青霉素钠降解菌PC-2的筛选与鉴定

(一)青霉素钠降解菌PC-2的分离筛选

取10g青霉素菌渣(河北石家庄河北制药)与猪粪(江苏省南京市横溪镇)的混合堆肥样品(堆肥地点为江苏省南京市南京农业大学牌楼)，菌渣与猪粪的质量比例为1:2)，添加到含蒸馏水90mL的250mL的三角瓶中，37℃，150r/min在摇床上震荡使样品与水充分混合。采用梯度稀释法将混合液稀释至浓度约为0.1～1.0ppm时，用移液枪分别移取200μL的样品涂布到1000ppm青霉素钠添加量的LB固体培养基上，于37℃恒温培养2d，待培养基长出菌落后，挑取单菌落划线分离培养约4次后获得单菌株。将得到的纯种转入LB试管斜面上，37℃恒温培养48h，放入4℃冰箱内保存。

(二)青霉素钠降解菌PC-2的形态学和分子学鉴定

用透射电子显微镜(TEM)观察细胞形态特征，菌株鉴定采用形态观察和16S rDNA序列PCR分析方法。

菌株PC-2在LB固体培养基上呈圆形，中间凸起，乳白色，表面光滑，不透明，边缘整齐，菌落直径约为1～2mm(如图1所示)。在透射及扫描电子显微镜下观察，PC-2为短杆状，1.96μm×0.92μm，端生鞭毛(如图2、3所示)。

16S rDNA扩增的引物为F-primer 27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R-primer1492R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。扩增产物由生工生物工程(上海)有限公司测序，利用BLAST程序与NCBI中的已知序列进行比对分析。

PC-2与Chelatococcus daeguensis(T)K106及Chelatococcus sambhunathii(T)HT4聚类在一个系统发育分支，序列同源性在99％以上，根据形态学观察并结合文献报道，初步鉴定PC-2属螯合球菌属(Chelatococcus sp.)。

实施例2

青霉素钠降解菌PC-2降解特性

(一)青霉素钠溶液标准曲线的绘制

青霉素钠浓度采用超高效液相色谱仪(Waters 2695，美国)定量测定。色谱条件：流动相：0.1％的甲酸水溶液-乙腈(V:V＝50:50)；流速：1mL/min；检测器为PDA紫外检测器；波长范围190nm～400nm；柱温：30℃；进样量20μL；出峰时间设置为6min。

配制浓度分别为0.5ppm、1ppm、2ppm、4ppm、8ppm的青霉素钠工作液，然后分别精密吸取该标准工作液1mL在设定的色谱条件下进样测定，以青霉素钠溶液的质量浓度为横坐标，以其峰面积为纵坐标绘制标准曲线(如图5所示)。

(二)降解菌PC-2生长曲线测定

将保存在4℃冰箱内的降解菌PC-2放置在室温下恢复几分钟，然后挑取菌丝体转接在新的斜面培养基上进行培养。再从新的的斜面菌种上挑取菌体接入到装有100mL液体LB培养基的三角瓶(250mL)中，在37℃，150r/min条件下振荡培养36h，制成种子液。将种子液按照10％的接种量接种到装有100mL液体LB培养基的三角瓶(500mL)中，在37℃、150r/min条件下振荡培养72h，每隔3h取一次样，并用酶标仪测定OD₆₀₀值来确定菌体的生长量。设不接种的培养基为空白对照。

从PC-2的生长曲线上可以看出，0-6h是生长适应期，6-36h是对数期，36h后进入稳定期(如图6所示)。

(三)降解菌PC-2降解效率及残留青霉素钠的降解动力学实验

将对数生长期菌液离心(转速不宜过大，约3000r/min)10min，磷酸盐缓冲溶液淋洗约3次后，按10％接种于青霉素钠初始浓度为200ppm的基础培养基中。37℃，150r/min振荡培养，每隔3h取样，测定青霉素钠浓度。实验设三个重复，以不加青霉素钠的培养基作对照。

结果表明青霉素钠的降解率随着培养时间的延长而增大，到第12d时，青霉素钠浓度由初始的200ppm降低至93ppm，降解率为53.5％(如图7所示)。根据青霉素钠浓度随时间的变化，获得青霉素钠的降解动力学线性回归方程：y＝-9.008x+203.6，R²＝0.993，见图8。

(四)培养基成分对青霉素钠降解效率的影响

(1)碳源对青霉素钠降解效率的影响

在基础培养基中分别加入0.4％的葡萄糖、麦芽糖和蔗糖。接入10％种子液后，37℃，150r/min振荡培养48h，测定青霉素钠含量，计算青霉素钠降解率，确定最佳的碳源。实验设3个重复，结果取其平均值。

当PC-2以青霉素钠为唯一碳源进行培养时(对照组)，青霉素钠降解率仅为11.56％。添加碳源，可以提高青霉素钠的降解率。在基础培养基中加入葡萄糖，青霉素钠的降解率最高，其次是加入蔗糖和麦芽糖。因此，最佳碳源为葡萄糖。(如图9所示)

(2)氮源对青霉素钠降解效率的影响

在基础培养基中分别加入0.4％的蛋白胨、酵母膏和尿素。接入10％种子液后，37℃，150r/min振荡培养48h，测定青霉素钠含量，计算青霉素钠降解率，确定最佳的氮源。实验设3个重复，结果取其平均值。

从降解效果来看，蛋白胨>酵母提取物>尿素>对照。因此，选择蛋白胨为最佳的氮源。(如图10所示)

(五)理化因素对青霉素钠降解效率的影响

(1)降解菌PC-2的接种量对青霉素钠降解效率的影响

将对数生长期菌液离心，磷酸盐缓冲溶液淋洗后，分别按2％、6％、10％、14％和18％的接种量接入至青霉素钠初始浓度为200ppm的优化好的培养基中。37℃，150r/min振荡培养6h，测定青霉素钠含量，计算青霉素钠降解率，确定最佳的接种量。实验设3个重复，结果取其平均值。

结果表明当接种量较低时，菌株PC-2对青霉素钠的降解效果随接种量的增加在一定范围内增加，当接种量为14％时达到最高，为93.78％。当接种量超过14％后，菌株PC-2对青霉素钠的降解效果下降，因此，选择14％作为最佳接种量。(如图11所示)

(2)底物青霉素钠浓度对青霉素钠降解效率的影响

将对数生长期菌液离心，磷酸盐缓冲溶液淋洗后，按10％的接种量接入至青霉素钠初始浓度分别为100、200、400、800和1200ppm的优化好的培养基中。37℃，150r/min振荡培养6h，取菌液离心，测定青霉素钠含量，计算青霉素钠降解率，确定最佳的底物浓度。实验设3个重复，结果取其平均值。

结果表明随着底物浓度的增加，青霉素钠的降解率逐渐降低，从99.32％降低到52.52％，因此最佳底物浓度为100ppm。(如图12所示)

(3)降解pH值对青霉素钠降解效率的影响

用1mol/L盐酸和NaOH调节优化培养基的初始pH值为6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，分别接入10％种子液后，37℃，150r/min振荡培养6h，测定青霉素钠含量，计算青霉素钠降解率，确定最佳的pH值。实验设3个重复，结果取其平均值。

结果表明青霉素钠在pH为6.0和7.0时比较稳定，不接种降解菌，经过6h后的降解率分别为19.93％和26.72％。接种降解菌PC-2后，青霉素钠在pH 6.0和7.0时的降解率分别达到74.05％和75.9％，表明在pH 6.0～7.0范围内，PC-2对青霉素钠的降解起着重要作用。(如图13所示)

可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一株青霉素钠降解菌PC-2，其特征在于：该青霉素钠降解菌属螯合球菌属，分类命名PC-2，保藏编号为CGMCC1.15283，于2015年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种鉴定权利要求1所述青霉素钠降解菌PC-2的方法，其特征在于：以引物F-primer27F和R-primer 1492R对待检测细菌基因组进行PCR扩增，得到1475bp的扩增产物，说明该待检测细菌为青霉素钠降解菌PC-2；

其中，引物F-primer 27F的序列为：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R-primer 1492R的序列为：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。

3.权利要求1所述的青霉素钠降解菌PC-2在青霉素残留降解中的应用，其特征在于：将青霉素降解菌PC-2按接种量2％-18％接种于青霉素钠初始浓度为100-1200ppm的青霉素残留物中，向其中加入碳源、氮源，调整pH值为6-10；其中，碳源包括葡萄糖、麦芽糖和蔗糖的一种或多种混合物，浓度为0.3％-0.5％；氮源包括蛋白胨、酵母膏和尿素的一种或多种混合物，浓度为0.3％-0.5％。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述接种量为14％，青霉素钠初始浓度为100ppm，向青霉素残留物中加入的碳源为浓度为0.4％的葡萄糖，氮源为浓度为0.4％的蛋白胨，调整pH范围在6.0～7.0。

5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于：青霉素降解菌PC-2取自对数生长期，在接种前先经过离心，然后以磷酸盐缓冲溶液淋洗，所述磷酸盐缓冲溶液为0.2mol/L NaH₂PO₄39.0mL，0.2mol/L Na₂HPO₄ 61.0mL，pH 7.0，121℃灭菌20min。

6.一种青霉素钠降解剂，其特征在于：该降解剂包括权利要求1所述的青霉素钠降解菌PC-2。

7.权利要求6所述的青霉素钠降解剂在青霉素钠降解上的应用，其特征在于：使用时，按照青霉素降解菌PC-2接种量2％-18％接种于青霉素钠初始浓度为100-1200ppm的青霉素残留物中，向其中加入碳源、氮源，调整pH值为6-10；其中，碳源包括葡萄糖、麦芽糖和蔗糖的一种或多种混合物，浓度为0.3％-0.5％；氮源包括蛋白胨、酵母膏和尿素的一种或多种混合物，浓度为0.3％-0.5％。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述接种量为14％，青霉素钠初始浓度为100ppm，向青霉素残留物中加入的碳源为浓度为0.4％的葡萄糖，氮源为浓度为0.4％的蛋白胨，调整pH范围在6.0～7.0。