CN105779339B - 一种氨基糖苷类抗生素复合降解菌的配制及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种氨基糖苷类抗生素复合降解菌的配制及应用。方案如下：分别将Aquamicrobium sp.FN‑A3菌株和Paracoccus kondratievae FN‑A2菌株接到LB培养液中培养，分别得到降解菌种子液。将降解菌种子液按照体积比3：1～5的比例进行混合，混匀后再将种子液与玉米淀粉按照重量比1：1～3的比例混合，风干制成氨基糖苷类抗生素复合降解菌。本发明采用现代微生物技术对抗生素菌渣进行无害化发酵处理，或抗生素污染水体或土壤的生物修复，消除其潜在环境和健康危害，也为相关企业提供一种安全高效的处理生产过程伴生的菌渣和污水的新途径，利于菌渣的资源化应用。

Description

一种氨基糖苷类抗生素复合降解菌的配制及其应用

技术领域

本发明涉及抗生素发酵和环保领域，具体为一种氨基糖苷类抗生素复合降解菌的配制及其应用。

背景技术

氨基糖苷类抗生素是一类由氨基糖和氨基环醇通过氧桥连接而成的抗生素，主要由放线菌产生。1943 年，首先从灰色链霉菌中发现了链霉素( streptomycin) ，成为第一种能够有效治疗结核病的临床抗生素。随后，众多这类抗生素被发现并用于临床治疗，如新霉素( neomycin，1949) 、卡那霉素（kanamycin，1957）、大观霉素（spectinomycin，1961）、庆大霉素( gentamicin ，1963) 、妥布霉素( tobramycin，1967)；以及第二代氨基糖苷类抗生素挖掘和半合成衍生物的研究也随后进入高潮，如西索米星（sisomicin，1970）、地贝卡星( dibekacin，1971 ) 、依替米星（etimicin，1971）、阿米卡星( amikacin，1972) 、巴龙霉素（paromycin，1972）、核糖霉素(ribostamycin，1973)、阿贝卡星( arbekacin，1973)、异帕米星( isepamicin，1975) 、小诺米星（micronomicin，1975）、奈替米星（netimicin，1976）和plazomicin（2012）。其作用机制为抑制细胞蛋白质的合成，作用靶点在核糖体30S小亚基16SrRNA解码区的A部位，阻碍初始复合物的合成，诱导细胞合成错误蛋白以及抑制已合成蛋白的释放，从而导致细菌死亡。临床主要用于敏感的革兰氏阴性需氧杆菌所致的全身感染，如脑膜炎、呼吸道、泌尿道、胃肠道、皮肤软组织、烧伤、创伤及骨关节感染等。

我国是全球氨基糖苷类抗生素的最大生产国和出口国，每年出口大量原料药。链霉素产能超过2800吨，58%出口；庆大霉素产能突破2500吨。近来发现氨基糖苷类抗生素的新药理作用，以及新型氨基糖苷类抗生素衍生物陆续开发，这类抗生素老产品有望重新焕发生机，产量和需求还可能进一步提升。抗生素生产过程的含抗废水、废渣可能导致潜在的环境问题，引起抗生素抗性基因传播，加剧多药耐药菌形成。且氨基糖苷类抗生素具有较强的耳毒性和肾毒性，会损害前庭和听觉上皮细胞，危害人体健康，环境危害性更为重大。据估算，每生产1吨抗生素伴生8～10吨菌渣，夹带一定量的氨基糖苷类抗生素，需要安全处理。2008 年修订的《国家危险废物名录》已将抗生素菌渣列入其中，需要有危废处理资质的公司进行焚烧处理。由于抗生素菌渣含水率高、有机质含量高，处置成本高且带来二恶英和烟尘等二次污染问题，该法处置与当前循环经济和科学发展的时代要求背离。

近几年来，福建师范大学王明兹课题组致力于可强力降解氨基糖苷类抗生素性能的微生物菌株的筛选和纯化工作，先后从抗生素污染土壤和水体中分离、纯化得到具有较强降解氨基糖苷类抗生素能力的Paracoccus kondratievae FN-A2菌株和Aquamicrobium sp. FN-A3，并与本发明同日申请了发明专利。利用氨基糖苷类抗生素降解菌Aquamicrobium sp.FN-A3菌株和Paracoccus kondratievae FN-A2菌株分别对含有氨基糖苷类抗生素的污水、土壤和新鲜的菌渣中的氨基糖苷类抗生素进行降解。前者（Paracoccus kondratievae FN-A2菌株）对氨基糖苷类抗生素的污水进行降解，24小时后基本降解2000mg/L的抗生素。对新鲜的卡那霉素、链霉素、庆大霉素等氨基糖苷类抗生素菌渣进行48～72小时降解，也能将基本将菌渣中残余的抗生素降解；后者（Aquamicrobium sp. FN-A3）对氨基糖苷类抗生素的污水进行降解，40小时后可基本降解2000 mg/L的抗生素。48～72小时可基本降解新鲜的卡那霉素、链霉素、庆大霉素等菌渣中残余的抗生素，降解能力相当显著，且不需其他原料，成本低廉，操作简单。

发明内容

本发明的目地就是基于筛选到的具有较强降解氨基糖苷类抗生素性能的Aquamicrobium sp. FN-A3菌株和Paracoccus kondratievae FN-A2菌株进行复合配制，制成降解污水、土壤或菌渣中的氨基糖苷类抗生素的复合降解菌，采用现代微生物技术对抗生素菌渣进行无害化发酵处理，或对抗生素污染水体或土壤的生物修复，消除其潜在环境和健康危害，也为相关企业提供一种安全高效的处理生产过程伴生的菌渣和污水的新途径，利于菌渣的资源化应用。

为实现本发明目标所采用的技术方案如下：

1、降解菌种子液的培养

分别将氨基糖苷类抗生素降解菌Aquamicrobium sp. FN-A3菌株和Paracoccus kondratievae FN-A2菌株接到LB培养液中，37℃，恒温培养24h，再按10倍重量比扩大培养转接到LB培养液中，37℃、180r/min恒温振荡扩大培养16h，分别制成氨基糖苷类抗生素降解菌Aquamicrobium sp. FN-A3菌株种子液和Paracoccus kondratievae FN-A2菌株种子液。

2、复合降解菌种子液的配制

将Aquamicrobium sp.FN-A3降解菌种子液和Paracoccus kondratievae FN-A2降解菌种子液按照体积比3：1～5的比例进行混合，混匀后再将种子液与玉米淀粉按照重量比1：1～3的比例混合，风干制成氨基糖苷类抗生素复合降解菌。

本发明所述的氨基糖苷类抗生素降解菌Paracoccus kondratievae FN-A2菌株是通过以下步骤得到的：

①氨基糖苷类抗生素降解菌株浓度梯度递增筛选

采集土样，用适量无菌水稀释，混匀，静置后取悬液接种到含300mg/L氨基糖苷类抗生素的LB培养液中，37℃、180r/min恒温振荡培养3-5天，培养物变混浊后转接到含600mg/L氨基糖苷类抗生素的LB培养液中，同上培养后转入含900mg/L氨基糖苷类抗生素的LB培养液中，直至LB培养液中氨基糖苷类抗生素浓度达1200mg/L后结束筛选，得到混浊的培养物；

所述的LB培养液中氨基糖苷类抗生素含量以300mg/L为起点，以浓度逐级增加300mg/L为递增值，至浓度达1200mg/L为止。

本发明所述的土样采自中国福建福州台江闽江公园。

②氨基糖苷类抗生素降解菌株复筛纯化

将上述混浊培养物转接入含2000mg/L氨基糖苷类抗生素的水溶液中，同上培养至混浊。将此混浊培养物用10000倍无菌水稀释，然后涂布于含2000mg/L氨基糖苷类抗生素的LB平板上进行培养，培养后采用划线法分离菌落，获得不同菌落形态的菌株；将不同菌落形态的各菌株分别接种到含2000mg/L氨基糖苷类抗生素的水溶液中，于 37℃、180r/min恒温振荡发酵培养72小时，即获得本发明所述的氨基糖苷类抗生素Paracoccus kondratievaeFN-A2降解菌的菌株。

该菌株已于2015年6月17日由中国典型培养物保藏中心（中国武汉）保藏并登记入册，保藏编号为：M2015383，且该中心已于2015年6月24日进行存活性检测，其结论为存活。

本发明所述的氨基糖苷类抗生素Aquamicrobium sp.FN-A3降解菌，是通过如下方式得到的：

①氨基糖苷类抗生素降解菌株富集筛选

采集水样，混匀静置后悬液接入含300mg/L氨基糖苷类抗生素的LB培养液中，37℃、180r/min恒温振荡培养3-5天，培养物变混浊后转接到含600mg/L氨基糖苷类抗生素的LB培养液中，同上培养后转入含900mg/L氨基糖苷类抗生素的LB培养液中，直至LB培养液中氨基糖苷类抗生素浓度达1200mg/L后结束筛选，得到混浊的培养物；

所述的LB培养液中氨基糖苷类抗生素含量以300mg/L为起点，以浓度逐级增加300mg/L为递增值，至浓度达1200mg/L为止。

本发明所述的水样采自中国福建福州台江闽江公园。

②氨基糖苷类抗生素降解菌株复筛纯化

将上述混浊培养物转接入含2000mg/L氨基糖苷类抗生素的水溶液中，同上培养至混浊。将此混浊培养物用10000倍无菌水稀释，然后涂布于含2000mg/L氨基糖苷类抗生素的LB平板上进行培养，培养后采用划线法分离菌落，获得不同菌落形态的菌株；将不同菌落形态的各菌株分别接种到含 2000mg/L氨基糖苷类抗生素的水溶液中，于 37℃、180r/min恒温振荡发酵培养72小时，即获得本发明所述的氨基糖苷类抗生素Aquamicrobium sp.FN-A3降解菌。

该菌株已于2015年6月17日由中国典型培养物保藏中心（中国武汉）保藏并登记入册，保藏编号为：M2015384，且该中心已于2015年6月24日进行存活性检测，其结论为存活。

3、应用

1）复合降解菌对抗生素污水中氨基糖苷类抗生素的降解

取复合降解菌种接种到含有300～2000 mg/L氨基糖苷类抗生素的并用水稀释10的LB培养液中，37℃，恒温培养24h，活化和扩大复合降解菌种。投入含300～2000 mg/L氨基糖苷类抗生素的污水中，室温曝气处理。处理7.5小时后复合降解菌可降解含有2000 mg/L的氨基糖苷类抗生素42.5%，培养10小时后复合降解菌可降解含有2000 mg/L的氨基糖苷类抗生素68.5%，培养15小时后复合降解菌可完全降解含有2000 mg/L的氨基糖苷类抗生素。复合降解菌种子液接种量为氨基糖苷类抗生素的污水体积的8～15%。

2）复合降解菌对发酵菌渣或土壤残留氨基糖苷类抗生素的降解

取含抗生素菌渣或土壤按照接种量7～10%接入上述活化培养24小时的复合降解菌种子液，加水混匀，加水后固液比控制在0.55～0.85之间，发酵50～90h，发酵过程中每天翻动两次自然通气，空气湿度75%，温度控制28℃～40℃，就能将菌渣或土壤中残余的抗生素基本降解，且不需其他原料，成本低廉，操作简单。

本发明所述的抗生素菌渣是指卡那霉素、链霉素、妥布霉素、庆大霉素发酵过程产生的废弃菌渣。

附图说明

图1是本发明所述的复合降解菌对污水残抗的降解曲线。

图2是本发明所述的复合降解菌对菌渣残抗的降解曲线。

具体实施方式

实施例1

1、降解菌种子液的培养

将氨基糖苷类抗生素降解菌Aquamicrobium sp.FN-A3菌株和Paracoccus kondratievae FN-A2菌株、分别接到新鲜LB斜面培养液中，37℃、180r/min恒温振荡培养16h，制成氨基糖苷类抗生素Aquamicrobium sp.FN-A3降解菌种子液和Paracoccus kondratievae FN-A2降解菌种子液。

2、复合降解菌种制备

将氨基糖苷类抗生素Aquamicrobium sp.FN-A3和Paracoccus kondratievae FN-A2降解菌种子液按照体积比3：5的比例进行混合，混匀后与玉米淀粉按照1：1的重量比例混合，配制成复合降解菌，风干备用。

3、应用

1）复合降解菌对卡那霉素污水残留氨基糖苷类抗生素的降解

取复合降解菌种接种到含有300～2000 mg/L氨基糖苷类抗生素并用水稀释10的LB培养液中，37℃，恒温培养24h，活化和扩大复合降解菌种。然后每100ml含有3000ug/L的卡那霉素的污水中接入10mL复合降解菌种子液，室温曝气处理处理，12h后，经检测，污水中卡那霉素已完全降解，降解率达98%。培养过程间隔检测，处理7.5小时后复合降解菌可降解率达78.5%，培养10小时后复合降解菌抗生素降解率88.5%，12小时后抗生素可完全降解。降解率随着培养时间的变化如图1所示。

2）复合降解菌对卡那霉素菌渣中残留氨基糖苷类抗生素的降解

取新鲜卡那霉素菌渣1000g，接入100mL复合降解菌种子液，混匀，混匀后总含水量控制在60%，室温发酵55h，获得无抗生素残留的菌渣。经检测，处理菌渣中残余的卡那霉素已基本降解，降解率达90.8%。发酵过程经间隔检测显示，培养10h时，菌渣中卡那霉素已降解了21.8%； 20h时，菌渣中卡那霉素已降解了46.7%；培养42h时，菌渣中卡那霉素已降解了78.3%。降解率随着发酵时间的变化如图2所示。

发酵过程中每天翻动两次自然通气，温度控制30-40℃，空气湿度75%。

本实施例所述的氨基糖苷类抗生素Aquamicrobium sp.FN-A3降解菌是按照发明内容中的技术方案获得的。

本实施例所述的氨基糖苷类抗生素Paracoccus kondratievae FN-A2降解菌是按照发明内容中的技术方案获得的。

上述新鲜卡那霉素菌渣和污水由丽珠集团福兴医药公司古田抗生素厂提供。

实施例2

降解菌种子液培养、复合降解菌制备和活化同实施例1。

1、复合降解菌对污水残留链霉素的降解

在50ml含有1000 mg/L的链霉素的污水中接入500uL复合降解菌种子液， 37℃、180r/min恒温振荡培养20h，经检测，链霉素基本降解，降解率达92.8%。

2、复合降解菌对菌渣中残余链霉素的降解

取新鲜链霉素菌渣1000g，接入100mL复合降解菌种子液菌种子液，混匀，混匀后总含水量控制在65%，发酵60h，获得无抗生素残留的菌渣。经检测，菌渣发酵产物中残余的链霉素已完全降解，降解率达100%。发酵过程中每天翻动两次自然通气，温度控制30-40℃，空气湿度75%。

上述新鲜链霉素菌渣和污水由河北圣雪大成制药有限公司提供。

实施例3

降解菌种子液培养、复合降解菌制备和活化同实施例1。

1、复合降解菌对污水残留庆大霉素的降解

在50ml含有3000 mg/L的庆大霉素的污水中接入500uL复合降解菌种子液， 37℃、180r/min恒温振荡培养24h，经检测，庆大霉素降解率达97%。

2、复合降解菌对土壤中庆大霉素的降解

取含庆大霉素800 mg/L的土壤1000g，接入600mL复合降解菌种子液菌种子液，混匀，混匀后总含水量控制在55%，发酵90h。经检测，菌渣发酵产物中残余的庆大霉素已基本降解，降解率达88.6%。发酵过程中每天翻动两次自然通气，温度控制30-40℃，空气湿度75%。

实施例4

降解菌种子液培养、复合降解菌制备和活化同实施例1。

1、复合降解菌对污水残留妥布的降解

在50ml含有1000 mg/L的妥布霉素的污水中接入500uL复合降解菌种子液， 37℃、180r/min恒温振荡培养28h，经检测，妥布霉素降解率达95%。

2、复合降解菌对土壤中妥布霉素的降解

取含妥布霉素1000 mg/L的土壤1000g，接入800mL复合降解菌种子液菌种子液，混匀，混匀后总含水量控制在70%，发酵85h。经检测，菌渣发酵产物中残余的妥布霉素降解率达88.6%。发酵过程中每天翻动两次自然通气，温度控制30-40℃，空气湿度75%。

Claims (5)

1.一种氨基糖苷类抗生素复合降解菌的配制方法，其特征是：

1）降解菌种子液的培养

分别将氨基糖苷类抗生素降解菌Aquamicrobium sp.FN-A3菌株和Paracoccus kondratievae FN-A2菌株接到LB培养液中，37℃，恒温培养24h，再按10倍重量比扩大培养转接到LB培养液中，37℃、180r/min恒温振荡扩大培养16h，分别制成氨基糖苷类抗生素降解菌Aquamicrobium sp. FN-A3菌株和Paracoccus kondratievae FN-A2菌株种子液。

2）复合降解菌的配制

将Aquamicrobium sp. FN-A3降解菌种子液和Paracoccus kondratievae FN-A2降解菌种子液按照体积比3：1～5的比例进行混合，混匀后再将种子液与玉米淀粉按照重量比1：1～3的比例混合，风干制成氨基糖苷类抗生素复合降解菌 ；

所述的氨基糖苷类抗生素降解菌Aquamicrobium sp.FN-A3菌株，保藏编号为为CCTCCNO： M2015384；

所述的氨基糖苷类抗生素降解菌Paracoccus kondratievae FN-A2菌株，保藏编号为：CCTCC NO：M2015383。

2.根据权利要求1所述的配置方法得到的氨基糖苷类抗生素复合降解菌的应用，其特征是所述的氨基糖苷类抗生素复合降解菌应用于抗生素菌渣或土壤中残留氨基糖苷类抗生素的降解和抗生素污水中氨基糖苷类抗生素的降解。

3.根据权利要求2所述的氨基糖苷类抗生素复合降解菌的应用，其特征是抗生素菌渣是指卡那霉素、链霉素、妥布霉素、庆大霉素发酵过程产生的废弃菌渣；污水是指生产过程中产生或被抗生素污染的水体；土壤是指被抗生素污染的土壤。

4.根据权利要求2所述的氨基糖苷类抗生素复合降解菌的应用，其特征是所述的抗生素污水中氨基糖苷类抗生素的降解是通过如下步骤进行的：取复合降解菌种接种到含有300～2000 mg/L氨基糖苷类抗生素的并用水稀释10的LB培养液中，37℃，恒温培养24h，活化和扩大复合降解菌；复合降解菌种子液投入含300～2000 mg/L氨基糖苷类抗生素的污水中，室温曝气处理，处理7.5～ 15小时；复合降解菌种子液接种量为氨基糖苷类抗生素的污水体积的8～15%。

5.根据权利要求2所述的氨基糖苷类抗生素复合降解菌的应用，其特征是所述的残留抗生素菌渣或土壤中氨基糖苷类抗生素的降解是通过如下步骤进行的：取抗生素菌渣或土壤按照接种量7～10%接入培养24小时的复合降解菌种子液，加水混匀，加水后固液比控制在0.55～0.85之间，发酵50～90h，发酵过程中每天翻动两次自然通气，空气湿度75%，温度控制28℃～40℃。