CN108913629B - 一种产纤维素酶的细菌及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高效产纤维素酶细菌及其制备方法和应用，细菌（Luteibacter sp.）L43，已于2018年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.16107。本发明菌株生长速度快，纤维素酶活高，产酶能力强，不会对自然界的碳循环产生负面影响，不会对环境造成危害，是应用于烟草醇化、烟草秸秆腐熟生产有机肥料、秸秆还田、促进生态恢复和保护生态环境、饲料加工等行业的好材料。在农林废弃物回收利用过程中可发挥重要作用。

Description

一种产纤维素酶的细菌及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地说是一种产纤维素酶细菌及其制备方法与应用。

背景技术

纤维素是自然界中分布最为广泛、产量最为丰富的可再生资源，广泛存在于植物的根茎叶中。我国是农业大国，每年秸秆产量约为7亿吨左右，秸秆中的主要成分为纤维素。纤维素降解后可转化为生物燃料、优质饲料等物质。然而在自然界中，纤维素降解困难，主要源于其特殊的结构。纤维素是由葡萄糖通过β-(1，4) 糖苷键连接而成的线状大分子聚合物。纤维素酶是能够将纤维素降解为葡萄糖的一类酶的总称，根据其催化功能分为三大类：1)葡聚糖内切酶(1，4-β-D-glucan glucanohydrolase)：该酶能够随机切割纤维素多糖链内的无定型区，产生不同长度的寡糖和新链末端；2）葡聚糖外切酶(1，4-β-D-glucancellobilhydrolase)：作用于纤维素还原性和非还原性的纤维素多糖链的末端，产生葡萄糖或纤维二糖；3）β-葡聚糖苷酶(β-1，4-glucosidase)：该酶功能为水解纤维二糖产生葡萄糖。由于纤维素酶的三个组分经过协同作用，将大分子的纤维素降解为低分子量的寡糖、双糖或多糖，而被广泛应用于食品加工、酿造、造纸、饲料添加剂、纺织、医药等工农业领域。使得纤维素酶成为酶制剂工业中的一个新的增长点。纤维素酶主要由微生物产生，受制于纤维素酶制剂工业化生产的因素主要有菌种和酶活及产量，因而高酶活微生物的筛选和产酶条件的优化尤为重要。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效产纤维素酶细菌及其制备方法与应用。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种高效产纤维素酶细菌，细菌（Luteibacter sp.）L43，分类命名为藤黄色杆菌，已于2018年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号），其保藏编号为CGMCC No. 16107。

所述产纤维素酶细菌分离自烟草醇化样品中，通过纤维素酶活的测定及菌种鉴定表明，该菌是一株产酶能力强、纤维素酶活高的细菌（Luteibacter sp.）。对该菌进行16SrRNA基因序列分析，并通过在GenBank中比对发现，本发明的细菌扩增的16S rRNA序列与Luteibacter yeojuensis R2A16-10T（登录号：NR043618）相似性最高，为98%。从而将分离出来的细菌命名为（Luteibacter sp.）L43。

所述的细菌菌株（Luteibacter sp.）L43的制备方法：

从烟草醇化样品中选取约1 g样品加入灭菌去离子水中进行震荡，然后进行梯度稀释，从10-1～10-8，分别吸取100 μL悬浊液进行涂布至羧甲基纤维素钠固体培养基，28℃倒置培养3-5天，分别挑取单菌落至PDA培养基平板，反复划线直至纯化后转接至PDA培养基斜面，将纯化后的菌株分别转接至羧甲基纤维素钠固体培养基，培养3天，测定菌落直径后，用1 mg/ml的刚果红溶液染色1 h，弃去染料，加入1 mol/L的NaCl溶液脱色1 h，然后用去离子水冲洗3-5遍后测定透明圈直径，水解圈和菌株直径的比值越大，菌株降解纤维素的能力越强，因此比值大小的定性试验，直接反映了菌降解纤维素的的能力。

所述的羧甲基纤维素钠固体培养基：羧甲基纤维素钠5 g、KH2PO4 1 g、NaNO3 3g、KCl 0.5 g、MgSO4 0.5 g、蒸馏水l000 ml、FeSO4﹒7H2O 0.01 g，琼脂粉15 g。（调pH在5.5—6.0，于121℃，0.11 Mpa下灭菌30 min备用）。

所述的PDA培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1000 ml、1.5%琼脂，自然pH值，于121℃，0.11 Mpa下灭菌30 min备用。

所述细菌（Luteibacter sp.）L43在生产纤维素酶中的应用：将所述细菌（Luteibacter sp.）L43于羧甲基纤维素钠产酶培养基中培养获得纤维素酶，产酶培养基中酶活最强，滤纸酶活达16.9±1.61IU/mL，外切酶酶活达39.62±1.65 IU/mL。

进一步地，所述细菌（Luteibacter sp.）L43在pH=6、羧甲基纤维素钠浓度为12.5g/L、NaNO3浓度为5 g/L的羧甲基纤维素钠产酶培养基中培养获得纤维素酶。

所述细菌（Luteibacter sp.）L43 在烟草秸秆堆肥、烟草秸秆还田、烟草醇化及生产纤维素酶中有着很好的应用前景。具体方法如下：

1）活化该菌株，从超低温冰箱取出冻存管，接种于PDA培养基或羧甲基纤维素固体培养基，28℃培养2天；

2）接种于PDA液体或羧甲基纤维素钠液体培养基，28℃震荡培养两天左右至OD600为0.8；

3）离心菌体并用灭菌去离子水悬浮离心后用去离子水重新悬浮，调节至浓度为108个/毫升；

4）用常规喷雾器均匀喷洒至烟草秸秆堆肥、秸秆还田的秸秆表面、醇化烟草表面，并进行翻动均匀后常温存放发酵即可。

本发明所具有优点：

1.本发明的细菌L43具有产纤维素酶活高的特性，该菌在纤维素筛选平板上降解圈/菌落直径达到3.9，在发酵培养基中酶活较高，滤纸酶活为8.53±0.6 IU/mL，内切酶酶活为2.02±0.22 IU/mL，外切酶酶活为20.17±0.25 IU/mL。

2.本发明菌株分离自秸秆腐熟发酵的秸秆中，属于Luteibacter菌株，因而无毒无害，未经遗传改造，可放心应用到秸秆堆肥腐熟、秸秆还田、饲料加工、纤维素酶工程领域中。是促进生态恢复和保护生态环境、饲料加工等行业的好材料。在农林废弃物回收利用过程中可发挥重要作用。

附图说明

图1为本发明实施例提供的菌株L43的菌落照片。

图2为本发明实施例提供的菌株L43产纤维素酶的刚果红染色照片。

图3为本发明实施例提供的菌株L43的纤维素酶酶活。

细菌（Luteibacter sp.）L43，已于2018年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1 号院3 号）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例旨在对本发明进行举例描述，而非以任何形式对本发明进行限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1：

菌株L43的制备方法：

从烟草醇化样品中选取约1 g样品加入灭菌去离子水中进行震荡，然后进行梯度稀释，从10-1～10-8，分别吸取100 μL悬浊液进行涂布至羧甲基纤维素钠固体培养基，28℃倒置培养3-5天，分别挑取单菌落至PDA培养基平板，反复划线直至纯化后转接至PDA培养基斜面（参见图1）。将纯化后的菌株分别转接至羧甲基纤维素钠固体培养基，培养3天，测定菌落直径后，用1 mg/ml的刚果红溶液染色1 h，弃去染料，加入1 mol/L的NaCl溶液脱色1 h，然后用去离子水冲洗3-5遍后测定透明圈直径。一般说来，比值的大小与菌株降解纤维素能力大小有关。水解圈和菌株直径的比值越大，菌株降解纤维素的能力越强，因此比值大小的定性试验，直接反映了菌降解纤维素的的能力。因此，本研究选取了水解圈和菌株直径的比值最大的菌株L43作为研究对象。

所述羧甲基纤维素钠固体培养基：羧甲基纤维素钠5 g、KH2PO4 1 g、NaNO3 3 g、KCl 0.5 g、MgSO4 0.5 g、蒸馏水l000 ml、FeSO4﹒7H2O 0.01 g，琼脂粉15 g。（调pH在5.5—6.0，于121℃，0.11 Mpa下灭菌30 min备用）。

所述PDA培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1000 ml、1.5%琼脂。（自然pH值，于121℃，0.11 Mpa下灭菌30 min备用）。

菌株鉴定：

将上述纯化获得的产纤维素酶活高的菌株进行菌落观察，在PDA固体培养基上，菌落表面湿润，黄绿色，为典型细菌的表型特征。

分子鉴定：为了确定本实施细菌菌株L43的系统进化地位，对其16S rRNA基因序列测定与系统发育分析。

首先提取该菌株的基因组DNA，并扩增其16S rRNA的基因序列，PCR引物为27F：（AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG），1492R：（AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG），将PCR产物进行测序并进行序列分析，表明，与Luteibacter yeojuensis R2A16-10T（登录号：NR043618）相似性最高为98%。

Luteibacter sp.L43的16S rRNA基因序列：

TTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACAGCAGAGCTTGCTCTGTGGGTGGCGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGCATCGGGACCTACCTAGACGTGGGGGATAACGTAGGGAAACTTACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCGGGGGATCGCAAGACCTCGCGCGGTTAGATGGACCGATGTGCGATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCGACGATCGCTAGCTGGTCTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGCAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCCTCGGGTTGTAAAGCACTTTTATCAGGAGCGAAATCTGCATGGCTAATACCCATGTAGTCTGACGGTACCTGAGGAATAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGTTCGTTAAGTCTGCTGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGAATGGCAGTGGATACTGGCGAGCTAGAGTGTGATAGAGGATGGTGGAATTCCCGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCGGGAGGAACATCAGTGGCGAAGGCGGCCATCTGGATCAACACTGACGCTGAGGCACGAAA

综合以上鉴定结果，将菌株L43定名为Luteibacter sp.；已于2018年7月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号为CGMCC No. 16107。（Luteibacter sp.）L43，简称菌株L43。

上述细菌菌菌株L43降解纤维素能力强，酶活高，未进行遗传改造。当菌体被释放入自然环境后，对人、动植物无害，不污染环境，不能够促进秸秆还田，农林废弃物的降解，在农业上有潜在的应用价值。

所得Luteibacter sp. L43细菌菌株的实验室保藏方式：

短期保藏方式为，接种至PDA固体斜面，待菌落长好后保藏于4℃冰箱内，此保藏方式用于不超过3个月短期保藏；

长期保藏方式为：将细菌菌体加入终浓度为20%甘油中混匀并保藏至-80℃冰箱中，此保藏方式大约可保藏10年。

应用实施例：

所述细菌（Luteibacter sp.）L43在生产纤维素酶中的应用：将所述细菌（Luteibacter sp.）L43于羧甲基纤维素钠产酶培养基中培养获得纤维素酶，产酶培养基中酶活最强，滤纸酶活达16.9±1.61IU/mL，外切酶酶活达39.62±1.65 IU/mL。

进一步地，所述细菌（Luteibacter sp.）L43在pH=6、羧甲基纤维素钠浓度为12.5g/L、NaNO3浓度为5 g/L的羧甲基纤维素钠产酶培养基中培养获得纤维素酶。

产酶能力及其他特性分析

1、菌株L43的产纤维素能力初筛分析

所述细菌菌株L43点接至羧甲基纤维素钠培养基固体平板上，28℃培养5天，测定菌落直径后，用1 mg/ml的刚果红溶液染色1 h后，弃去染料，加入1 mol/L氯化钠溶液脱色1h，测定透明圈直径。透明圈直径/菌落直径为3.9（参见图片1，2），因此，该菌株有着很强的降解纤维素能力。

2、菌株L43的纤维素酶活测定

对产纤维素酶菌株进行酶活的测定，酶活力的测定参考Miller G.L的DNS 法，这种方法可以对菌株产纤维素酶活强度进行有效定量。酶活力定义在50℃条件下1 mL粗酶液在1 min内水解生成1.0 μg的葡萄糖，称为1个纤维素酶酶活力单位（μg/min，IU）。将菌株接种到50 ml（100 ml三角瓶）羧甲基纤维钠液体发酵产酶培养基中，于28℃、180 r/min摇床培养，3 d后取菌液，6000 r/min离心10 min，上清即为粗酶液。对粗酶液进行三种酶活的测定：

①滤纸酶活的测定。将新华1号滤纸(1cm×3cm)卷成小卷,放进15ml EP管内,加入1.75 mL HAc-NaAc缓冲液(pH=4.8),再加入0.25 mL粗酶液,轻轻摇匀,使滤纸完全浸泡在液体中，50℃保温1 h后,加入3 ml DNS溶液，放于沸水浴中煮沸10 min，用冷水立即终止反应。在波长为540 nm下测定光吸收值(OD值)。

②内切酶活测定。移取含有0.5% CMC-Na的醋酸缓冲液1.75 mL于试管中,加入粗酶液0.25 mL，50℃保温30 min，加入3 ml DNS溶液，放于沸水浴中煮沸10 min，置冷水中终止反应。在波长为540 nm下测定光吸收值(OD值)。

③外切酶活测定。移取含有0.5%微晶纤维素的醋酸缓冲液1.75 mL于试管中，加入酶液0.25 mL，于50℃保温2 h后，加入3 ml DNS溶液，置沸水浴中煮沸10 min，置冷水中终止反应。在波长为540 nm下测定光吸收值(OD值)。对照组选用沸水煮10 min后冷水冷却的菌液。每个样品做三个平行实验。测定结果显示菌株L43有着较高的酶活，滤纸酶活为8.53±0.6 IU/mL，内切酶酶活为2.02±0.22 IU/mL，外切酶酶活为20.17±0.25 IU/mL（参见图片3）。

3、菌株L43产纤维素酶培养条件的优化

纤维素酶的产生及分泌能力与菌的生长状态和培养环境（如碳、氮源配比、pH等）密切相关，本发明对发酵产酶过程中碳、氮源配比、pH进行了优化，最终使产酶能力显著提高。

优化的基础培养基为羧甲基纤维素钠培养基，由于羧甲基纤维素钠培养基配制完成要求pH5.5-6.5，这可能不是L43 产纤维素酶的最优pH，且碳源、氮源的配比都影响着产酶菌株的产酶能力，因此，本发明分别设置了pH =3，4，5，6，7，8一系列的pH培养条件、羧甲基纤维素钠浓度为0.25%，0.5%，0.75%，1%，1.25%一系列碳源浓度和NaNO3浓度为0.25%，0.5%，1%，1.5%，2%一系列的氮源浓度，并进行了正交试验，结果表明pH=7、羧甲基纤维素钠浓度为3 g/L、NaNO3浓度为3 g/L时纤维素内切酶酶活最高，为2.45±0.05 IU/mL。pH=6、羧甲基纤维素钠浓度为12.5 g/L、NaNO3浓度为3 g/L时滤纸酶活，产酶能力最强，酶活达16.9± 1.61 IU/mL。pH=6、羧甲基纤维素钠浓度为12.5 g/L、NaNO3浓度为5 g/L时外切酶产酶能力最强，酶活达39.62±1.65 IU/mL。培养条件优化后，滤纸酶活、外切酶酶活分别比原始酶活增加了98.12%和96.33%（参见图片3）。

在烟草秸秆堆肥、烟草秸秆还田、烟草醇化具体应用方法：

1）活化该菌株，从超低温冰箱取出冻存管，接种于PDA培养基或羧甲基纤维素钠固体培养基，28℃培养2天左右；

2）接种于PDA液体或羧甲基纤维素钠液体培养基（羧甲基纤维素钠固体培养基减去琼脂就是液体培养基），28℃震荡培养两天左右至OD600为0.8左右；

3）离心菌体并用灭菌去离子水悬浮离心后用去离子水重新悬浮，调节至浓度为108个/毫升；

4）用常规喷雾器均匀喷洒至烟草秸秆堆肥、秸秆还田的秸秆表面、醇化烟草表面，并进行翻动均匀后常温存放发酵即可达到应用目的。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110> 云南中烟工业有限责任公司

<120> 一种高效产纤维素酶细菌及其制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 720

<212> DNA/RNA

<213> Luteibacter sp.L43的16S rRNA基因序列：()

<400> 1

ttacacatgc aagtcgaacg gcagcacagc agagcttgct ctgtgggtgg cgagtggcgg 60

acgggtgagt aatgcatcgg gacctaccta gacgtggggg ataacgtagg gaaacttacg 120

ctaataccgc atacgtccta cgggagaaag cgggggatcg caagacctcg cgcggttaga 180

tggaccgatg tgcgattagc tagttggtaa ggtaacggct taccaaggcg acgatcgcta 240

gctggtctga gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300

aggcagcagt ggggaatatt ggacaatggg cgcaagcctg atccagcaat gccgcgtgtg 360

tgaagaaggc cctcgggttg taaagcactt ttatcaggag cgaaatctgc atggctaata 420

cccatgtagt ctgacggtac ctgaggaata agcaccggct aactccgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgg agggtgcaag cgttaatcgg aattactggg cgtaaagcgt gcgtaggcgg 540

ttcgttaagt ctgctgtgaa agccccgggc tcaacctggg aatggcagtg gatactggcg 600

agctagagtg tgatagagga tggtggaatt cccggtgtag cggtgaaatg cgtagagatc 660

gggaggaaca tcagtggcga aggcggccat ctggatcaac actgacgctg aggcacgaaa 720

<210> 2

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 引物()

<400> 2

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 1492R

<400> 3

agagtttgat cmtggctcag 20

Claims (4)

1.一种高效产纤维素酶细菌，其特征在于：纤维素酶细菌（Luteibacter sp.）L43，分类命名为藤黄色杆菌，于2018年7月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No. 16107。

2.权利要求1所述高效产纤维素酶细菌的应用，其特征在于：将所述纤维素酶细菌（Luteibacter sp.）L43于羧甲基纤维素钠产酶培养基中培养获得纤维素酶。

3.根据权利要求2所述高效产纤维素酶细菌的应用，其特征在于：将所述纤维素酶细菌（Luteibacter sp.）L43 在pH=6、羧甲基纤维素钠浓度为12.5 g/L、NaNO₃浓度为5 g/L的羧甲基纤维素钠产酶培养基中培养获得纤维素酶。

4.权利要求1所述高效产纤维素酶细菌的应用，其特征在于：应用于烟草秸秆堆肥、烟草秸秆还田、烟草醇化，具体方法如下：

1）活化纤维素酶菌株，从超低温冰箱取出冻存管，接种于PDA培养基或羧甲基纤维素固体培养基，28℃培养2天；

2）接种于PDA液体或羧甲基纤维素钠液体培养基，28℃震荡培养两天左右至OD600为0.8；

3）离心菌体并用灭菌去离子水悬浮离心后用去离子水重新悬浮，调节至浓度为10⁸个/毫升；用常规喷雾器均匀喷洒至烟草秸秆堆肥、秸秆还田的秸秆表面、醇化烟草表面，并进行翻动均匀后常温存放发酵即可。

Images