CN105143446A - 人胚胎干细胞分化成单一激素胰岛素阳性细胞 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了促进多能干细胞分化的方法。具体地，本发明提供了生成细胞群的方法，其中群体中大于10%的细胞表达单一激素胰腺β细胞特征性标志物。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年12月22日提交的美国临时专利申请序列号61/579,351的权益，所述美国临时专利申请全文以引用方式并入本文用于任何目的。
技术领域
本发明在细胞分化领域中。更具体地，本发明提供了在逐步分化的每个步骤使用限定条件，由多能干细胞分化的单一激素胰岛素生成细胞。群体中大于10％的分化的胰岛素生成细胞表达单一激素胰腺β细胞特征性标志物。
背景技术
用于I型糖尿病的细胞替代疗法的进展以及可移植胰岛的缺乏已使得注意力集中在开发适于移植物移入的胰岛素生成细胞或β细胞的来源上。一种方法是从多能干细胞，例如胚胎干细胞产生功能性β细胞。
在脊椎动物的胚胎发育中，多能干细胞可在称为原肠胚形成的过程中产生包括三个胚层(外胚层、中胚层和内胚层)的一组细胞。组织例如甲状腺、胸腺、胰腺、肠和肝将从内胚层经由中间阶段发育而来。该过程的中间阶段是定形内胚层的形成。定形内胚层细胞表达多种标志物，例如HNF3β、GATA4、MIXL1、CXCR4和SOX17。
到原肠胚形成为止，内胚层划分成可通过一组因子的表达来识别的前-后域，所述因子独特标志内胚层的前、中和后区。例如，Hhex和Sox2鉴定内胚层的前区，而Cdx1、2和4鉴定内胚层的后半部分。
内胚层组织的迁移使内胚层与不同的中胚层组织紧密接近，这帮助肠管的区域化。这通过多种分泌因子例如FGF、Wnt、TGF-B、视黄酸(RA)和BMP配体及其拮抗剂来完成。例如，FGF4和BMP促进预定的后肠内胚层中的Cdx2表达并阻遏前基因Hhex和SOX2的表达(Development2000，127：1563-1567)。WNT信号传导也已显示与FGF信号传导平行工作，以促进后肠发育并抑制前肠命运(Development2007，134：2207-2217)。最后，由间充质分泌的视黄酸调节前肠-后肠边界(CurrBiol2002，12：1215-1220)。
特异性转录因子的表达水平可用于指定组织的身份。在定形内胚层转化成原肠管的过程中，肠管变得区域化成广泛域，所述广泛域可通过限制性基因表达模式在分子水平上进行观察。例如，肠管中区域化的胰腺域显示PDX-1的极高表达以及CDX2和SOX2的极低表达。相似地，高水平的Foxel的存在指示食道组织；在肺组织中高度表达的是NKX2.1；SOX2/Oddl(OSR1)在胃组织中高度表达；PROX1/Hhex/AFP的表达在肝组织中比较高；SOX17在胆道结构组织中高度表达；PDX1、NKX6.1/PTfla和NKX2.2在胰腺组织中高度表达；并且CDX2的表达在肠组织中高。上文概括摘自DevDyn2009，238：29-42和AnnuRevCellDevBiol2009，25：221-251。
胰腺的形成起于定形内胚层分化成胰腺内胚层(AnnuRevCellDevBiol2009，25：221-251；DevDyn2009，238：29-42)。背侧和腹侧胰腺域起于前肠上皮。前肠也产生食道、气管、肺、甲状腺、胃、肝、胰腺和胆管系统。
胰腺内胚层的细胞表达胰-十二指肠同源盒基因PDX1。在不存在Pdx1时，胰腺形成腹胰芽和背胰芽后不再发育。因而，Pdx1表达标志着胰腺器官发生中的一个关键步骤。除了其他细胞类型，成熟的胰腺还包括外分泌组织和内分泌组织。外分泌和内分泌组织来自胰腺内胚层的分化。
D'Amour等人描述了在高浓度激活素和低血清的存在下，产生人胚胎干细胞衍生的定形内胚层的富集培养物(Nature2005，23：1534-1541；美国专利号7,704,738)。将这些细胞移植在小鼠的肾囊下导致分化成具有内胚层组织特征的更成熟的细胞(美国专利号7,704,738)。在添加FGF-10和视黄酸后，人胚胎干细胞衍生的定形内胚层细胞还可分化成PDX1阳性细胞(美国专利公开号2005/0266554A1)。这些胰腺前体细胞在免疫缺陷小鼠的肾囊下的后续移植导致在3-4个月成熟期后形成功能胰腺内分泌细胞(美国专利号7,993,920和美国专利号7,534,608)。
Fisk等人报道用于由人胚胎干细胞产生胰岛细胞的系统(美国专利号7,033,831)。在这种情况下，分化途径分成三个阶段。人胚胎干细胞首先使用丁酸钠和激活素A的组合而分化成内胚层(美国专利号7,326,572)。然后将细胞和与EGF或β细胞素(betacellulin)结合的BMP拮抗剂例如头蛋白一起培养，以生成PDX1阳性细胞。通过烟酰胺诱导终末分化。
小分子抑制剂也已用于诱导胰腺内分泌前体细胞。例如，TGF-B受体和BMP受体的小分子抑制剂(Development2011，138：861-871；Diabetes2011，60：239-247)已用于显著提高胰腺内分泌细胞的数目。另外，小分子活化剂也已用于生成定形内胚层细胞或胰腺前体细胞(CurrOpinCellBiol2009，21：727-732；NatureChemBiol2009，5：258-265)。
由人胚胎干细胞诱导胰腺前体细胞的先前尝试已突出PDX-1和NKX6.1共表达在正确鉴定胰腺内胚层中的重要性。然而，虽然本领域已鉴定在PDX-1和NKX6.1表达中阳性的细胞群是低CDX2表达或不存在CDX2表达的，但先前报道未能测试正好在发育中的胰腺前的标志物的存在。标志前内胚层的SOX2在成人胰岛中不表达，并且在发育中的胰腺中以极低水平表达(Diabetes2005，54：3402-4309)。相比之下，本专利申请的一些实例公开了这样的细胞群，其中由人胚胎干细胞生成的至少30％的胰腺内胚层细胞对于PDX-1和NKX6.1的表达是阳性的，并且对于CDX2和SOX2的表达是阴性的。
所有生成功能胰腺β细胞的先前尝试未能获得具有成熟β细胞特征的细胞。成熟β细胞的标志包括单一激素胰岛素的表达，胰岛素原正确加工成胰岛素和C肽，PDX-1和NKX6.1的强表达，响应葡萄糖的适当胰岛素释放，葡萄糖转运蛋白的表达，和葡糖激酶的高表达。所有先前报道均已导致产生两种或更多种胰腺激素的内分泌细胞。例如，D'Amour等人(NatureBiotech2006，24：1392-1401)报道如通过突触小泡蛋白测量的，包含～10％胰岛素阳性细胞和～20％内分泌细胞的细胞群的生成。由其他人的类似报道(CellRes2009，19：429-438；StemCells2007，25：1940-1953；DiabetesObesMetab2008，10：186-194)也已显示多能细胞分化为无功能的胰岛素阳性细胞。事实上，近期研究已明确确定多激素细胞在重症联合免疫缺陷(SCID)小鼠中的移植不导致功能β细胞的生成(Diabetes2011，60：239-247；NatureBiotech2011，29：750-756)。虽然在人胎儿胰腺中，一部分(～10-20％)内分泌细胞是多激素细胞；但多激素细胞在成人胰腺中消失(HistochemCellBiol1999，112：147-153；JHistochemCytochem2009，57：811-824)。
随着再生医学的新兴领域不断成熟，终末分化的、适当调节的胰腺内分泌细胞的形成方法是高度希望的。我们在此处证实使用培养条件的适当和限定操纵，以及添加多种途径的活化剂/抑制剂的精确定时，人胚胎干细胞可在体外分化成功能胰腺β细胞。具体地，BMP抑制的精确定时、使用连同维生素C的使用一起的视黄酸梯度证明在单一激素胰腺内分泌细胞的生成中是有效的。
发明内容
本发明提供了通过多能细胞的逐步分化在体外获得的胰腺内胚层谱系的细胞群。在每个分化步骤使用的培养基均补充有葡萄糖。在一些实施例中，在每个分化步骤，细胞在包含5mM至20mM葡萄糖的培养基中进行培养。
在一些实施例中，多能干细胞的分化生成胰腺内胚层细胞群，其中分化群体中大于10％的细胞表达单一激素胰腺β细胞特征性标志物。
在一些实施例中，多能干细胞的分化生成胰腺内胚层细胞群，其中大于30％的分化群体对于PDX-1和NKX6.1的表达是阳性的，而对于CDX2和SOX2的表达是阴性的。
在一些实施例中，逐步分化包括在还补充有TGF-B配体的培养基中培养未分化的人胚胎干细胞。在一些实施例中，逐步分化包括在还补充有WNT活化剂的培养基中培养未分化的人胚胎干细胞。在一些实施例中，逐步分化包括在还补充有FGF配体的培养基中培养定形内胚层细胞。在一些实施例中，逐步分化包括在还补充有shh抑制剂、FGF配体、PKC活化剂、TGF-B配体、类视色素和BMP抑制剂梯度的培养基中培养肠管细胞。在一些实施例中，逐步分化包括在还补充有PKC活化剂、shh抑制剂、类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养后前肠细胞。在一些实施例中，逐步分化包括在还补充有抗坏血酸的培养基中培养细胞。
在一个实施例中，本发明提供了用于使多能细胞逐步分化成胰腺内胚层谱系的细胞群的体外方法，所述体外方法包括在包含5mM至20mM葡萄糖的培养基中培养每个分化阶段中的细胞。在一些实施例中，用于多能细胞逐步分化的体外方法还包括通过在补充有TGF-B配体和WNT活化剂的培养基中培养多能细胞，使多能细胞分化成定形内胚层(DE)细胞。在一些实施例中，用于多能细胞逐步分化的体外方法还包括通过在补充有FGF配体的培养基中培养DE细胞，使DE细胞分化成肠管细胞。在一些实施例中，用于多能细胞逐步分化的体外方法还包括通过在补充有shh抑制剂、FGF配体、PKC活化剂、TGF-B配体、类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养肠管细胞，使肠管细胞分化成后前肠内胚层细胞。在一些实施例中，用于多能细胞逐步分化的体外方法还包括通过在补充有shh抑制剂、FGF配体、PKC活化剂、TGF-B配体、类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养肠管细胞，使肠管细胞分化成后前肠内胚层细胞。在一些实施例中，用于多能细胞逐步分化的体外方法还包括通过在补充有PKC活化剂、shh抑制剂、类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养后前肠内胚层细胞，使后前肠内胚层细胞分化成胰腺前肠细胞。在一些实施例中，用于多能细胞逐步分化的体外方法还包括通过在补充有shh抑制剂、TGF-B配体和类视色素的培养基中培养胰腺前肠细胞，使胰腺前肠细胞分化成胰腺内胚层细胞。在一些实施例中，用于多能细胞逐步分化的体外方法还包括使胰腺内胚层细胞分化成胰腺β细胞群。
在一个实施例中，在用于多能细胞逐步分化的体外方法的至少一个步骤中，培养基还补充有抗坏血酸。在一些实施例中，分化群体中大于10％的细胞是单一激素胰岛素阳性细胞。在一些实施例中，在通过本发明的方法生成的培养物中大于30％的胰腺内胚层细胞是PDX-1+、NKX6.1+、SOX2-和CDX2-。
在一个实施例中，本发明涉及用于使人胚胎干细胞分化成胰腺β细胞的体外方法，所述体外方法包括：a)在补充有葡萄糖、TGF-B配体和WNT活化剂的培养基中培养未分化的人胚胎干细胞，以生成定形内胚层(DE)细胞群；b)在补充有葡萄糖和FGF配体的培养基中培养DE细胞，以生成肠管细胞群；c)在补充有葡萄糖、shh抑制剂、FGF配体、PKC活化剂、TGF-B配体、类视色素和BMP抑制剂梯度的培养基中培养肠管细胞，以生成表达PDX-1和SOX2的后前肠内胚层细胞群；d)在补充有葡萄糖、PKC活化剂、shh抑制剂、类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养后前肠细胞，以生成相比于后前肠细胞，表达PDX-1和NKX6.1并表达更低水平的SOX2的胰腺前肠细胞群；e)在补充有葡萄糖、shh抑制剂、TGF-B抑制剂和类视色素的培养基中培养胰腺前肠细胞，以获得相比于胰腺前肠细胞，表达PDX-1、更高水平的NKX6.1和更低水平的SOX2的胰腺内胚层细胞群；和f)使胰腺内胚层细胞分化成胰腺β细胞群。在一些实施例中，通过本发明的方法生成的胰腺β细胞群是PDX-1+、NKX6.1+、SOX2-和CDX2-。在一些实施例中，在逐步分化方法的至少一个步骤中的培养基还补充有抗坏血酸。在一些实施例中，通过本发明的方法获得的胰腺β细胞是单一激素胰岛素生成细胞，其也是NKX6.1+和PDX-1+。
附图说明
图1A至图1G显示了在根据实例1分化的细胞的S3第2天时，下述标志物的FACS直方图表达谱。图1A：同种型对照；图1B：嗜铬粒蛋白；图1C：KI-67；图1D：NKX6.1；图1E：SOX2；图1F：CDX2；图1G：PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
图2A至图2G显示了在根据实例1分化且在S4第2天时收获的细胞中，下述标志物的FACS直方图表达谱。图2A：同种型对照；图2B：嗜铬粒蛋白；图2C：KI-67；图2D：NKX6.1；图2E：SOX2；图2F：CDX2；图2G：PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
图3A至图3G显示了在根据实例1分化且在S5第2天时收获的细胞中，下述标志物的FACS直方图表达谱。图3A：同种型对照；图3B：嗜铬粒蛋白；图3C：KI-67；图3D：NKX6.1；图3E：SOX2；图3F：CDX2；图3G：PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
图4A至图4G显示了根据实例1分化且在S5第7天时收获的细胞的下述标志物的FACS直方图表达谱。图4A：同种型对照；图4B：嗜铬粒蛋白；图4C：KI-67；图4D：NKX6.1；图4E：SOX2；图4F：CDX2；图4G：PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
图5A至图5C描述了在根据实例1分化且在S5第2天时收获的细胞中，下述标志物的FACS直方图表达谱。图5A：嗜铬粒蛋白(y轴)和CDX2(x轴)；图5B：嗜铬粒蛋白(y轴)和SOX2(x轴)；图5C：嗜铬粒蛋白(y轴)和NKX6.1(x轴)。每个图的共表达百分比显示于每个直方图上。
图6A至图6T显示了在根据实例1分化且在S2、S3、S4和S5时收获的人胚胎干细胞系H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图6A：CDX2；图6B：CD142；图6C：FOXE1；图6D：HNF4-α；图6E：NKX2.1；图6F：NKX2.2；图6G：NKX6.1；图6H：OSR1；图6I：PDX-1；图6J：PROX1；图6K：PTF1a；图6L：SOX17；图6M：SOX2；图6N：胰岛素；图6O：ZIC1；图6P：嗜铬粒蛋白；图6Q：胰高血糖素；图6R：Ngn3；图6S：NeuroD；图6T：生长抑素。
图7A至图7G描述了在根据实例2分化且在S2、S3或S4的第3天时收获的H1细胞系的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图7A：NKX6.1；图7B：PDX-1；图7C：嗜铬粒蛋白；图7D：NGN3；图7E：CDX2；图7F：白蛋白；图7G：SOX2。
图8A至图8G描述了在根据实例3分化且在S2、S3、S4或S5时收获的H1细胞中，来自下述标志物表达的实时PCR分析的数据。图8A：NKX6.1；图8B：PDX-1；图8C：NGN3；图8D：NeuroD；图8E：嗜铬粒蛋白；图8F：CDX2；图8G：SOX2。
图9A至图9H描述了在根据实例4分化且在S3和S4的第4天时收获的H1细胞中，来自下述标志物表达的实时PCR分析的数据。图9A：NKX6.1；图9B：PDX-1；图9C：嗜铬粒蛋白；图9D：NGN3；图9E：NeuroD；图9F：CDX2；图9G：白蛋白；图9H：SOX2。
图10A至图10H描述了在根据实例5分化且在第4阶段时收获的人胚胎干细胞系H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图10A：NKX6.1；图10B：PDX-1；图10C：嗜铬粒蛋白；图10D：NGN3；图10E：NeuroD；图10F：CDX2；图10G：白蛋白；图10H：SOX2。
图11A至图11H显示了在根据实例6分化且在S3或S6的第3天时收获的人胚胎干细胞系H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图11A：NKX6.1；图11B：PDX-1；图11C：嗜铬粒蛋白；图11D：NGN3；图11E：NeuroD；图11F：CDX2；图11G：白蛋白；图11H：SOX2。
图12A至图12G描述了在根据实例7分化且在S3、S4或S5的第3天时收获的人胚胎干细胞系H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图12A：NKX6.1；图12B：PDX-1；图12C：嗜铬粒蛋白；图12D：NGN3；图12E：NeuroD；图12F：CDX2；图12G：SOX2。
图13A至图13G描述了在根据实例8分化且在S3、S4、S5或S6时收获的人胚胎干细胞系H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图13A：NKX6.1；图13B：PDX-1；图13C：嗜铬粒蛋白；图13D：NGN3；图13E：NeuroD；图13F：CDX2；图13G：SOX2。
图14A至图14H显示了在根据实例9分化的细胞的S3第4天时，下述标志物的FACS直方图表达谱。图14A：同种型对照；图14B：嗜铬粒蛋白；图14C：KI-67；图14D：NKX6.1；图14E：SOX2；图14F：HNF3B；图14G：CDX2；图14H：PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
图15A至图15G显示了在根据实例9分化的细胞的S4第2天时，下述标志物的FACS直方图表达谱。图15A：同种型对照；图15B：NKX6.1；图15C：KI-67；图15D：嗜铬粒蛋白；图15E：SOX2；图15FCDX2；图15G：PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
图16A至图16F显示了在根据实例9分化的细胞的S4第4天时，下述标志物的FACS直方图表达谱。图16A：同种型对照；图16B：NKX6.1；图16C：嗜铬粒蛋白；图16D：SOX2；图16E：CDX2；图16F：PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
图17A至图17J显示了在根据实例9分化且在S1D3、S2D3、S3D4、S4D2和S4D4时收获的人胚胎干细胞系H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图17A：CDX2；图17B：HHex；图17C：FOXE1；图17D：IPF1(PDX-1)；图17E：NKX2.1；图17F：NKX2.2；图17G：NKX6.1；图17H：PROX1；图17I：SOX2；图17J：SOX9。
图18A至图18G显示了在根据实例10分化的细胞的S3第3天时，下述标志物的FACS直方图表达谱。图18A：同种型对照；图18B：NKX6.1；图18C：嗜铬粒蛋白；图18D：SOX2；图18E：CDX2；图18F：KI-67；图18G：PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
图19A至图19G显示了在根据实例10分化的细胞的S4第5天时，下述标志物的FACS直方图表达谱。图19A：同种型对照；图19B：NKX6.1；图19C：嗜铬粒蛋白；图19D：SOX2；图19E：CDX2；图19F：KI-67；图19G：PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
图20A至图20J显示了在根据实例11分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中，下述基因表达的实时PCR分析。图20A：生长抑素；图20B：PDX1；图20C：Pax6；图20D：Pax4；图20E：NKX6.1；图20F：NGN3；图20G：胰高血糖素；图20H：NeuroD；图20I：胰岛素；图20J：嗜铬粒蛋白。
图21A至图21J显示了在根据实例12分化且在S4第2天、S5第2天和S5第9天时收获的人胚胎干细胞系H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图21A：生长抑素；图21B：PDX1；图21C：Pax6；图21D：Pax4；图21E：NKX6.1；图21F：NGN3；图21G：NeuroD；图21H：胰岛素；图21I：胰高血糖素；图21J：嗜铬粒蛋白。
图22A至图22L显示了在根据实例13分化且在S5第3天时收获的胚胎干细胞系H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图22A：Pax4；图22B：Pax6；图22C：PDX1；图22D：PTF1a；图22E：胰高血糖素；图22F：胰岛素；图22G：NeuroD；图22H：ngn3；图22I：Zic1；图22J：CDX2；图22K：白蛋白；图22L：NKX6.1。
具体实施方式
将本发明的具体实施方式部分分成以下几个分部分，来描述或说明本发明的某些特征、实施例或应用，这是为了使公开内容清楚起见，并非限制本发明。
定义
干细胞是通过其在单细胞水平上既自我更新又分化的能力来定义的未分化细胞。干细胞可产生子代细胞，包括自我更新祖细胞、非更新祖细胞和终末分化细胞。干细胞的特征还在于其在体外分化成来自多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的多种细胞谱系的功能细胞的能力。干细胞还在移植后产生多种胚层的组织，并且在注射到胚泡内之后，促成基本上至大部分(如果不是所有的话)组织。
干细胞通过其发育潜能分类为：(1)全能的，意指能够产生所有胚胎和胚胎外细胞类型；(2)多能的，意指能够产生所有胚胎细胞类型；(3)多潜能的，意指能够产生细胞谱系子系，但全部在特定组织、器官或生理系统内(例如造血干细胞(HSC)可产生的后代包括HSC(自我更新)、局限于血细胞的寡能祖细胞、以及其为正常血液组分的所有细胞类型和成分(例如血小板))；(4)寡能的，意指能够产生比多潜能干细胞更受限制的细胞谱系子系；以及(5)单能的，意指能够产生单细胞谱系(例如生精干细胞)。
分化是未特化的(“未定向的”)或特化不足的细胞获得特化细胞(如神经细胞或肌肉细胞)的特征的过程。分化的细胞或诱导分化的细胞是已在细胞谱系中占据更特化的(“定型的”)位置的细胞。当应用于分化的过程时，术语“定型的”指在分化途径中已进行到这样的点的细胞：其中在正常环境下，它继续分化成特定的细胞类型或细胞类型子集，并且在正常环境下，不能分化成不同细胞类型或回复到分化程度较低的细胞类型。“去分化”指细胞通过其回复到在细胞谱系内特化(或定型)程度较低的位置的过程。本文所用的“细胞的谱系”限定细胞的遗传关系，即它来自哪些细胞和它能产生什么细胞。细胞谱系将细胞定位于发育和分化的遗传计划内。谱系特征性标志物指与目的谱系的细胞的表型明确相关的特征，可用来评估未定向细胞向目的谱系的分化。
如本文所用，“标志物”是在所关注细胞中差异表达的核酸或多肽分子。在这个情形中，差异表达意思是阳性标志物的水平增加，而阴性标志物的水平降低。标志物核酸或多肽的可检测水平，在目的细胞中充分地高于或低于在其他细胞中，使得可使用多种本领域公知的方法中的任何一种将目的细胞与其他细胞鉴别和区分开来。
如本文所用，当在细胞中检测到特定标志物时，细胞对于“特定标志物”是“阳性的”或是“阳性的”。相似地，当在细胞中未检测到特定标志物时，细胞对于“特定标志物”是“阴性的”或是“阴性的”。
如本文所用，“第1阶段”和“S1”在本文中可互换使用，以鉴定表达定形内胚层(DE)特征性标志物的细胞。
如本文所用，“定形内胚层”指这样的细胞，其具有在原肠胚形成过程中起于上胚层的细胞的特征，并形成胃肠道及其衍生物。定形内胚层细胞表达下述标志物中的至少一种：HNF3β、GATA4、SOX17、CXCR4、Cerberus、OTX2、goosecoid、C-Kit、CD99和MIXL1。
如本文所用，“肠管”指源自定形内胚层的细胞，所述细胞表达下述标志物中的至少一种：HNF3-β、HNF1-β或HNF4-α。肠管细胞可产生所有内胚层器官，例如肺、肝、胰腺、胃和肠。
在本文中可互换使用的是“第2阶段”和“S2”，其鉴定表达原肠管特征性标志物的细胞。
“前肠内胚层”指产生食道、肺、胃、肝、胰腺、胆囊和一部分十二指肠的内胚层细胞。
“后前肠”指可产生后胃、胰腺、肝和一部分十二指肠的内胚层细胞。
“中肠内胚层”指可产生肠、一部分十二指肠、盲肠和升结肠的内胚层细胞。
“后肠内胚层”指可产生横结肠远端三分之一、降结肠、乙状结肠和直肠的内胚层细胞。
“第3阶段”和“S3”可互换使用，以鉴定表达前肠内胚层特征性标志物的细胞。如本文所用，“表达前肠谱系特征性标志物的细胞”指表达下述标志物中的至少一种的细胞：PDX-1、FOXA2、CDX2、SOX2和HNF4α。
本文可互换使用的是“第4阶段”和“S4”，以鉴定表达胰腺前肠前体特征性标志物的细胞。如本文所用，“表达胰腺前肠前体谱系特征性标志物的细胞”指表达下述标志物中的至少一种的细胞：PDX-1、NKX6.1、HNF6、FOXA2、PTF1a、Prox1和HNF4α。
如本文所用，“第5阶段”和“S5”可互换使用，以鉴定表达胰腺内胚层和胰腺内分泌前体细胞特征性标志物的细胞。如本文所用的，“表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞”指表达下述标志物中的至少一种的细胞：PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、HB9或PROX1。表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞基本上不表达CDX2或SOX2。
如本文所用，“第6阶段”和“S6”可互换使用，以鉴定富含胰腺内分泌细胞的细胞。
如本文所用，“胰腺内分泌细胞”或“胰腺激素表达细胞”或“表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞”指能够表达下述激素中的至少一种的细胞：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素、生长素释放肽和胰多肽。
“胰腺内分泌前体细胞”或“胰腺内分泌祖细胞”指能够变成胰腺激素表达细胞的胰腺内胚层细胞。此类细胞可表达下述标志物中的至少一种：NGN3、NKX2.2、NeuroD、ISL-1、Pax4、Pax6或ARX。
如本文所用，“功能胰腺β细胞”指能够是葡萄糖响应的并且对于PDX-1和NKX6.1是阳性的单一激素胰岛素阳性细胞。
本文可互换使用的是“d1”、“d1”和“第1天”；“d2”、“d2”和“第2天”；“d3”、“d3”和“第3天”等等。这些数字字母组合指定在本专利申请的逐步分化方案过程中的不同阶段中的温育天数。
“抗坏血酸”和“维生素C”在本文中可互换使用，并且指人及其他动物物种的必需营养物质。
“葡萄糖”和“D-葡萄糖”在本文中可互换使用，并且指右旋糖，在自然界中通常发现的糖。
对于特异性标志物“阳性”或其为标志物“+”(即PDX-1+)的细胞是在其中可检测到特定标志物的细胞。对于特异性标志物“阴性”或其为标志物“-”(即NKX6.1-)的细胞是在其中通过本说明书中教导的方法无法检测到该标志物的细胞。
在本专利申请中，“嗜铬粒蛋白”和“CHGN”可互换使用，以鉴定编码酸性分泌性糖蛋白嗜铬粒蛋白的基因。
在本文中可互换使用的是“NeuroD”和“NeuroDl”，其鉴定在胰腺内分泌祖细胞中表达的蛋白质及其编码基因。
在本文中可互换使用的是“LDN”和“LDN-193189”，以指示可得自Stemgent(CA，USA)的BMP受体抑制剂。
多能干细胞的分离、扩增和培养
多能干细胞可表达阶段特异性胚胎抗原(SSEA)3和4以及可用称为Tra-1-60和Tra-1-81的抗体检测的标志物中的一种或多种(Thomson等人，Science282：1145，1998)。多能干细胞在体外的分化导致SSEA-4、Tra-1-60和Tra-1-81表达的丧失。未分化的多能干细胞通常具有碱性磷酸酶活性，所述碱性磷酸酶活性可通过用4％多聚甲醛固定细胞，然后用矢量红(VectorRed)作为底物显色来检测，如由制造商(VectorLaboratories，CA，USA)描述的。如通过RT-PCR检测的，未分化的多能干细胞通常也表达OCT4和TERT。
增殖多能干细胞的另一种希望表型是分化成所有三种胚层的细胞的潜能：内胚层、中胚层和外胚层。多能干细胞的多能性可例如通过下述加以证实：将细胞注射到SCID小鼠内，使用4％多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然后就来自三个胚层的细胞类型的证据对它们进行组织学检查。作为另一种选择，多能性可通过这样来确定：产生胚状体并评价该胚状体是否存在与三个胚层相关的标志物。
增殖的多能干细胞系可以用标准G-显带技术进行核型分析并与所公开的相应灵长类物种的核型相比较。希望获得具有“正常核型”的细胞，“正常核型”的细胞意指该细胞是整倍体，其中所有人染色体都存在并且没有显著改变。多能细胞在培养物中可使用多种饲养层或通过使用基质蛋白质涂布的容器容易地扩增。作为另外一种选择，与限定培养基例如mTesrTM1培养基(StemCellTechnologies，Vancouver，Canada))结合的化学成分限定的表面可用于常规细胞扩增。多能细胞可使用酶促、机械或使用多种钙螯合剂例如EDTA(乙二胺四乙酸)容易地从培养皿中取出。作为另外一种选择，多能细胞可在不存在任何基质蛋白质或饲养层的情况下悬浮扩增。
多能干细胞的来源
可使用的多能干细胞的类型包括源自妊娠后形成的组织的建立的多能细胞系，包括在妊娠期间的任何时间取得的胚胎前组织(例如胚泡)、胚胎组织或胎儿组织，所述时间通常但不一定是在大约10至12周妊娠前。非限制性例子是建立的人胚胎干细胞(hESC)或人胚胎生殖细胞系，例如人胚胎干细胞系H1、H7和H9(WiCellResearchInstitute，Madison，WI，USA)。另外合适的是取自已在不存在饲养细胞的情况下培养的多能干细胞群体的细胞。还合适的是诱导多能细胞(IPS)或重编程的多能细胞，其可使用多种多能相关转录因子的被迫表达而源自成人体细胞，所述转录因子例如OCT4、Nanog、Sox2、KLF4和ZFP42(AnnuRevGenomicsHumGenet，2011，12：165-185)。在本发明的方法中使用的人胚胎干细胞也可如由Thomson等人描述的进行制备(美国专利号5,843,780；Science，1998，282：1145；Curr.Top.Dev.Biol.，1998，38：133；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1995：92：7844)。
由多能干细胞形成表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞
多能干细胞的特征是本领域技术人员众所周知的，并且多能干细胞的附加特征不断被鉴定。多能干细胞标志物包括例如下述中的一种或多种的表达：ABCG2、cripto、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60、Tra1-81。
适用于本发明的多能干细胞包括例如人胚胎干细胞系H9(NIH代码：WA09)、人胚胎干细胞系H1(NIH代码：WA01)、人胚胎干细胞系H7(NIH代码：WA07)和人胚胎干细胞系SA002(Cellartis，Sweden)。还适用于本发明的是表达下述多能细胞特征性标志物中的至少一种的细胞：ABCG2、cripto、CD9、FOXD3、CONNEXIN43、CONNEXIN45、OCT4、SOX2、NANOG、hTERT、UTF1、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra1-60和Tra1-81。
定形内胚层谱系特征性标志物选自SOX17、GATA4、HNF3β、GSC、CER1、Nodal、FGF8、Brachyury、Mix样同源盒蛋白、FGF4、CD48、脱中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C-Kit、CD99和OTX2。适用于本发明的是表达至少一种定形内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是原条前体细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是中内胚层细胞。在另一方面，表达定形内胚层谱系特征性标志物的细胞是定形内胚层细胞。
胰腺内胚层谱系特征性标志物选自PDX1、NKX6.1、HNF1β、PTF1α、HNF6、HNF4α、SOX9、HB9和PROX1。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内胚层谱系特征性标志物的细胞是胰腺内胚层细胞，其中PDX-1和NKX6.1的表达基本上高于CDX2和SOX2的表达。
胰腺内分泌谱系特征性标志物选自NGN3、NEUROD、ISL1、PDX1、NKX6.1、PAX4、ARX、NKX2.2和PAX6。在一个实施例中，胰腺内分泌细胞能够表达下述激素中的至少一种：胰岛素、胰高血糖素、生长抑素和胰多肽。适用于本发明的是表达至少一种胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞。在本发明的一个方面，表达胰腺内分泌谱系特征性标志物的细胞是胰腺内分泌细胞。胰腺内分泌细胞可以是表达胰激素的细胞。作为另外一种选择，胰腺内分泌细胞可以是分泌胰腺激素的细胞。
在本发明的一个方面，胰腺内分泌细胞是表达β细胞谱系特征性标志物的细胞。表达β细胞谱系特征性标志物的细胞表达PDX1和下述转录因子中的至少一种：NKX2.2、NKX6.1、NEUROD、ISL1、HNF3β、MAFA、PAX4和PAX6。在本发明的一个方面，表达β细胞谱系特征性标志物的细胞是β细胞。
本发明描述了可生成单一激素胰岛素阳性细胞的体外方法和细胞群，所述单一激素胰岛素阳性细胞也是PDX-1和NKX6.1阳性的。在本发明中使用的方法包括一系列阶段，其以逐步方式指导人多能细胞通过下述中间阶段分化为单一激素细胞：
a)由未分化的人胚胎干细胞生成定形内胚层(DE)细胞，其包括在包含葡萄糖、TGF-B配体和WNT活化剂的培养基中培养多能细胞；
b)使DE细胞分化成肠管细胞，其包括在包含葡萄糖、维生素C和FGF配体的培养基中培养DE细胞；
c)使肠管细胞分化成表达PDX-1和SOX2的后前肠内胚层细胞。该分化通过在shh抑制剂、BMP抑制剂、TGF-B配体、FGF配体、视黄酸、维生素C和PKC活化剂的存在下培养肠管细胞来完成；
d)使后前肠内胚层细胞分化成胰腺前肠细胞，相比于后前肠细胞，所述胰腺前肠细胞表达PDX-1和NKX6.1，并表达更低水平的SOX2。该分化通过在shh抑制剂、BMP抑制剂、低剂量视黄酸、维生素C和PKC活化剂的存在下培养后前肠细胞来完成。
e)使胰腺前肠细胞分化成胰腺内胚层细胞，相比于胰腺前肠细胞，所述胰腺内胚层细胞表达PDX-1、更高水平的NKX6.1和更低水平的SOX2。该分化通过在补充有shh抑制剂、TGF-B抑制剂、低剂量视黄酸和维生素C的培养基中培养胰腺前肠细胞来完成；和
f)使胰腺内胚层细胞分化成胰腺内分泌前体细胞，随后为单一激素胰腺内分泌细胞。该分化通过在补充有shh抑制剂、低剂量视黄酸和维生素C的培养基中培养胰腺内胚层细胞来完成。
在一个实施例中，在逐步分化的所有阶段中的细胞在含有少于25mM葡萄糖的培养基配方中进行培养。在一些实施例中，葡萄糖浓度在约8mM至约20mM葡萄糖的范围中。
在一些实施例中，用于生成肠管阶段细胞和所有后续步骤的培养基配方均含有抗坏血酸(也称为维生素C)。在一个实施例中，抗坏血酸浓度为约0.01mM至约1mM。在一个实施例中，抗坏血酸浓度为约0.1mM至约0.5mM。
本发明通过下述实例进一步举例说明，但并不受其限制。
实例1
在不存在胎牛血清-BMP/TGF-B途径调节的情况下，细胞系H1的人胚
胎干细胞分化为胰腺内分泌前体细胞导致改善的胰腺内胚层群体生产和减
少百分比的SOX2+群体
执行该实例，以显示可生成具有极高表达水平的PDX-1和NKX6.1，同时具有低水平表达的CDX2和SOX2的胰腺内胚层培养物。
人胚胎干细胞系H1(hESCH1)的细胞在不同传代(第40代至第52代)时进行收获，并且以100,000细胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGELTM(1：30稀释；BDBiosciences，NJ，USA)涂布的皿上的1培养基(StemCellTechnologies，Vancouver，Canada)中，所述1培养基补充有10μMY27632(Rock抑制剂，目录#Y0503，SigmaAldrich，MO，USA)。接种后四十八小时，将培养物洗涤并在不完全PBS(不含Mg或Ca的磷酸盐缓冲盐水)中温育大约30秒。如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系：
a.第1阶段(定形内胚层(DE)-3天)：细胞在下述第1阶段培养基中培养一天：MCDB-131培养基(目录#10372-019，Invitrogen，CA，USA)，其补充有0.1％无脂肪酸BSA(目录#68700，Proliant，IA，USA)、0.0012g/mL碳酸氢钠(目录#S3187，SigmaAldrich，MO，USA)、1XGlutaMaxTM(目录#35050-079，Invitrogen)、5mMD-葡萄糖(目录#G8769，SigmaAldrich，MO，USA)，含有100ng/mLGDF8(R&DSystems，MN，USA)和1μMMCX化合物(GSK3B抑制剂，14-丙-2-烯-1-基-3，5，7，14，17，23，27-七氮杂四环[19.3.1.1～2，6～.1～8，12～]二十七-1(25)，2(27)，3，5，8(26)，9，11，21，23-壬烯-16-酮，美国专利申请序列号12/494,789；该专利申请全文以引用的方式并入本文)。细胞随后在MCDB-131培养基中培养一天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、5mMD-葡萄糖、100ng/mLGDF8和100nMMCX化合物。细胞随后在MCDB-131培养基中培养一天，所述MCDB-131培养基中已添加0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、5mMD-葡萄糖和100ng/mLGDF8。
b.第2阶段(原肠管-2天)：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、5mMD葡萄糖和25ng/mLFGF7。
c.第3阶段(前肠-2天)：第2阶段细胞在下述第3阶段培养基中培养一天：MCDB-13l培养基，其补充有1∶200稀释的ITS-X(Invitrogen)、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、25ng/mLFGF7、10ng/mL激活素-A(R&Dsystems)、0.25μMSANT-1(shh抑制剂，SigmaAldrich)、1μM视黄酸(RA)(SigmaAldrich)和200nMTPB(PKC活化剂；目录#565740；EMD，NJ，USA)，含有100nMLDN-193189(BMP受体抑制剂；目录#04-0019；Stemgent，CA，USA)。细胞随后在补充有10nMLDN-193189的第3阶段培养基中培养另外一天。
d.第4阶段(胰腺前肠前体-2天)：第3阶段细胞在MCDB-131培养基中培养两天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、50nMRA、200nMTPB和50nMLDN-193189。
e.第5阶段(胰腺内胚层，2-7天)：第4阶段细胞在MCDB-131培养基中培养2-7天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1和50nMRA。
在指定阶段时，收集样品并通过实时PCR、免疫组织化学或荧光激活细胞分选(FACS)进行分析。
对于FACS分析，通过在TrypLEExpress(目录号12604，Invitrogen)中在37℃下温育3-5分钟，使hESC衍生的细胞释放成单细胞悬浮液。随后将细胞在染色缓冲液(含有0.2％无脂肪酸BSA的PBS)(目录号554657，BDBiosciences，NJ，USA)中洗涤两次。对于细胞内抗体染色，首先使细胞在4℃下与绿色荧光活/死细胞染料(Invitrogen目录号L23101)一起温育20分钟，以允许在分析过程中的活/死细胞区分，随后为在冷PBS中的单次洗涤。将细胞在250μlCytofix/Cytopern缓冲液(BDBiosciences目录号554722)中在4℃下固定20分钟，随后为在BDPerm/洗涤缓冲溶液(BDBiosciences目录号554723)中的两次洗涤。将细胞重悬浮于100μl染色/封闭溶液中，所述染色/封闭溶液由补充有2％正常血清(具有二抗的适当种类)的Perm/洗涤缓冲液组成。细胞随后在4℃下与以凭经验预定的稀释度的一抗一起温育30分钟，随后为在Perm/洗涤缓冲液中的两次洗涤。最后，使细胞在4℃下与适当的二抗一起温育30分钟，随后为在BDFACSCantoII上分析之前，用Perm/洗涤缓冲液的两次洗涤。
使用下述一抗稀释度：兔抗胰岛素(1∶100；目录号C27C9；CellSignaling，MA，USA)、小鼠抗胰岛素(1∶100；目录号ab6999，Abcam，MA，USA)、小鼠抗胰高血糖素(1∶1250；目录号G2654；Sigma-Aldrich)、兔抗突触小泡蛋白(1∶100；目录号A0010，Dako，CA，USA)、兔抗嗜铬粒蛋白A(1∶800；Dako)、小鼠抗NKX6.1(1∶50；DSHB，UniversityofIowa，IA，USA)、小鼠抗CDX2(1∶250；Invitrogen)、山羊抗NeuroD(1∶500；R&DSystems)、小鼠抗SOX2(BD，CA，USA)、小鼠抗NKX2.2(DSHB)、小鼠抗Pax6(BD，CA，USA)、小鼠抗PDX-1(BD，CA，USA)。二抗以下述稀释度使用：山羊抗小鼠Alexa647(1∶500；Invitrogen)、山羊抗兔PE(1∶200；Invitrogen)、驴抗山羊(1∶800；Invitrogen)。在加入二抗后使样品在4℃下温育30分钟，随后为在Perm/洗涤缓冲液中的最后一次洗涤。使用BDFACSDiva软件与获得的至少30,000次事件，在BDFACSCantoII上分析细胞。
图1A至图1G描述了根据实例1分化并在S3第2天时分析的细胞的同种型对照(图1A)、嗜铬粒蛋白(图1B)、KI-67(图1C)、NKX6.1(图1D)、SOX2(图1E)、CDX2(图1F)、PDX-1(图1G)的FACS直方图表达谱。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。在第3阶段的第2天时，超过95％的细胞对于PDX-1(图1G)的表达是阳性的，并且群体中约60％的细胞对于SOX2(图1E)的表达是阳性的，而少于10％的细胞对于CDX2(图1F)或NKX6.1(图1D)、或嗜铬粒蛋白(图1B)的表达是阳性的。如由高百分比的KI-67阳性细胞所示，在第3阶段时显著百分比的细胞处于活跃细胞周期中(图1C)。
图2A至图2G描述了如通过根据实例1分化且在S4的第2天时收获的细胞的FACS染色测定的，同种型对照(图2A)、嗜铬粒蛋白(图2B)、KI-67(图2C)、NKX6.1(图2D)、SOX2(图2E)、CDX2(图2F)、PDX-1(图2G)的表达谱。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。类似于第3阶段，超过95％的细胞对于PDX-1表达是阳性的(图2G)，而约10％的细胞对于CDX2表达是阳性的(图2F)，并且约40％的细胞对于NKX6.1表达是阳性的(图2D)。约45％的细胞对于SOX2表达是阳性的(图2E)，由在S3时的60％下降。嗜铬粒蛋白表达为大约3％(图2B)。如由高百分比的KI-67阳性细胞所示，在第4阶段时显著百分比的细胞处于活跃细胞周期中(图2C)。
图3A至3G描述了如通过遵循该实例中概述的分化方案在第5阶段的第2天收获的细胞的FACS分析测定的相对表达谱。图3A：同种型对照；图3B：嗜铬粒蛋白；图3C：KI-67；图3D：NKX6.1；图3E：SOX2；图3F：CDX2；图3G：PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。类似于第3和4阶段，超过95％的细胞对于PDX-1表达是阳性的，而大约10％的细胞对于CDX2表达是阳性的，并且超过67％的细胞对于NKX6.1表达是阳性的。当与第3阶段相比较时，以大约50％的SOX2表达更低，但类似于其在S4时的表达。
图4A至图4G描述了如通过遵循该实例中概述的方案在第5阶段的第7天时收获并分析的细胞的FACS染色测量的，PDX-1(图4G)、NKX6.1(图4D)、CDX2(图4F)、SOX2(图4E)、Ki-67(增殖标志物；图4C)和嗜铬粒蛋白(泛内分泌标志物；图4B)的表达。类似于第3和4阶段，＞90％的细胞对于PDX-1表达是阳性的，而CDX2表达少于10％，并且NKX6.1表达显著增至＞70％，并且SOX2表达急剧降至约2％。
此外，大多数表达SOX2、CDX2和NKX6.1的细胞对于嗜铬粒蛋白的表达是阴性的(参见图5A至图5C)。因此，遵循该实例中概述的方案制备的S5培养物导致这样的细胞群，其中至少50％的细胞表达PDX-1和NKX6.1，同时对于CDX-2、SOX2和嗜铬粒蛋白是阴性的。表I概括了在S3-S5时的多种内胚层标志物的表达百分比。
表I
在S3直到S5时的平均内胚层标志物表达
*自从分化开始以后的总天数。
图6A至图6T描述了通过遵循该实例中概述的分化方案分化的S2、S3、S4和S5细胞的实时PCR测量，并报道为超过未分化H1细胞中的表达的倍数变化的mRNA表达谱。在第3阶段时，存在前前肠标志物例如FOXe1(图6C)和NKX2.1(图6E)的极低表达。然而，在第3阶段时，标志肠管的胃区的SOX2(图6M)和OSR1(图6H)是显著上调的并且其表达在S4-S5时下降。胰腺内胚层标志物例如PTF1a(图6K)、NKX6.1(图6G)和PDX-1(图6I)在培养的S5第2天时达到最大表达水平。PCR数据指示在第3阶段时，细胞在变成在S4-S5时的PDX-1+NKX6.1+SOX2-CDX2-之前通过PDX-1+SOX2+群体过渡。(参见图6I、图6G、图6M和图6A。)内分泌标志物(嗜铬粒蛋白、胰岛素、胰高血糖素和生长抑素)的表达在S5结束时达到最大表达水平。胰腺内分泌前体标志物NKX2.2、NeuroD和NGN3的表达在S4-S5时达到最大表达水平。其他谱系标志物例如ZIC1和SOX17的表达在S4-S5时保持很低。
总之，遵循该实例中概述的方案分化的在第5阶段第2天时的细胞表达低水平的CDX2和SOX2，同时维持高表达水平的NKX6.1和PDX-1。认为适时BMP抑制、在S4-S5时使用低剂量的RA、在S1-S2时使用高葡萄糖的独特组合导致实例1中所述的细胞群。
实例2
BMP抑制和PKC活化对在S3-S4时的SOX2表达的作用
执行该实例中概述的方案，以阐明BMP抑制、FGF7的添加连同PKC活化一起对在S3-S4时的SOX2表达的作用。
人胚胎干细胞系H1的细胞在不同传代(第40代至第52代)时进行收获，并且以100,000细胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿上的补充有10μMY27632的mTesrTM1培养基中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系的细胞：
a.第1阶段(定形内胚层(DE)-3天)：在DE开始前，将培养物洗涤并与不完全PBS(无Mg或Ca)一起温育30秒，随后添加第1阶段培养基。作为单细胞在MATRIGELTM涂布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM和2.5mMD-葡萄糖、100ng/mLGDF8和1.5μMMCX化合物(GSK3B抑制剂)。对于第2-3天，细胞随后用MCDB-131培养基进行处理，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mM葡萄糖和100ng/mLGDF8。
b.第2阶段(原肠管-3天)：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mMD-葡萄糖和50ng/mLFGF7。
c.第3阶段(前肠-3天)：在存在或不存在50ng/mLFGF7、50nM或200nMLDN-193189和/或200nMTPB的情况下，第2阶段细胞用MCDB131培养基进行处理，所述MCDB131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、20ng/mL激活素-A、2μMRA。使用下表II中列出的组合，使细胞在培养基中温育三天：
表II
第3阶段处理
d.第4阶段(胰腺前肠前体-3天)：第3阶段细胞用MCDB131培养基处理三天，所述MCDB131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、200nMTPB、400nMLDN-193189、2μMALk5抑制剂(SD-208，公开于MolecularPharmacology2007，72：152-161中)和100nMCYP26A抑制剂(N-{4-[2-乙基-1-(1H-1，2，4-三唑-1-基)丁基]苯基}-1，3-苯并噻唑-2-胺，Janssen，Belgium)。
mRNA对于上文列出的所有条件在S2-S4时进行收集，并使用实时PCR进行分析。在S3时的对照条件指其中FGF7、AA、SANT、RA和200nMLDN-193189以上文步骤c时列出的浓度使用的培养物。如图7A至图7G中所示的PCR数据所证实的那样，在S3时去除LDN-193189导致内分泌标志物例如NGN3(图7D)、和泛内分泌标志物例如嗜铬粒蛋白(参见图7C)的显著降低。在S3时添加PKC活化剂和去除LDN-193189还降低内分泌标志物，同时增强NKX6.1的表达(参见图7A至图7G)。此外，添加50nMLDN-193189在诱导内分泌标志物(嗜铬粒蛋白和NGN3)方面与200nMLDN-193189一样有效。在S3时去除LDN-193189并且添加TPB增强CDX2(图7E)和白蛋白(图7F)的表达，同时抑制SOX2(图7G)的表达。此外，相比于其中去除了LDN-193189并保留FGF7的培养物，去除FGF7和LDN-193189两者显著增强SOX2的表达(图7G)，并减少白蛋白的表达(图7F)。这些数据证实BMP抑制、FGF活化和PKC活化的精确调节可导致富含PDX-1和NKX6.1，同时对于CDX2、SOX2和白蛋白很低的内胚层域。最后，在S3-S4时的持续BMP抑制增强了促内分泌基因的表达加上SOX2表达的上调。这突出BMP抑制必须被精确调谐，以增加胰腺内分泌基因，同时不上调SOX2表达，所述SOX2表达在胰腺发育中是不存在或很低的，但存在于前前肠内胚层器官例如胃中。
实例3
在前肠阶段时的早期BMP抑制是内分泌标志物的后续诱导所需的
该实例显示在S3时的早期BMP信号传导抑制是内分泌标志物的后续诱导所需的。然而，在第3阶段时的持续BMP抑制还导致SOX2的强表达。为了获得内分泌标志物的高表达连同SOX2表达的低表达两者，需要BMP抑制梯度，以诱导促胰腺内分泌标志物，同时具有SXO2和CDX2的低表达。
在不同传代(第40代至第52代)时的人胚胎干细胞系H1的细胞以100,000细胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿上的补充有10μMY27632的mTesrTM1培养基中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系的细胞：
a.第1阶段(定形内胚层(DE)-4天)：在DE开始前，将细胞洗涤并与不完全PBS(无Mg或Ca)一起温育30秒，随后为在S1培养基中的温育。作为单细胞在MATRIGELTM涂布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mMD-葡萄糖、100ng/mLGDF8、1.5μMMCX化合物(GSK3B抑制剂)。细胞随后用MCDB-131培养基处理两天(第2-4天)，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mM葡萄糖和100ng/mLGDF8。
b.第2阶段(原肠管-3天)：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mMD葡萄糖和50ng/mLFGF7。
c.第3阶段(前肠-3天)：第2阶段细胞用MCDB-131培养基进行处理，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、20ng/mL激活素-A、2μMRA、50ng/mLFGF7、100nMLDN-193189(仅在第1天时或对于第3阶段的持续时间)和200nMTPB。在一些培养物中，从第3阶段中去除LDN-193189。
d.第4阶段(胰腺前肠前体-3天)：第3阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、100nMTPB、200nMLDN-193189、2μMALk5抑制剂和100nMCYP26A抑制剂。
e.第5阶段(胰腺内胚层/内分泌-4天)：第4阶段细胞用MCDB-131培养基处理四天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、200nMLDN-193189和2μMALk5。
如图8A至图8G所示的PCR结果所证实的那样，从第3阶段中去除LDN-193189(BMP抑制剂)取消了在第4阶段和第5阶段时的促内分泌基因NGN3(图8C)；NeuroD(图8D)；嗜铬粒蛋白(图8E)的表达。然而，相比于在第4-5阶段时的NGN3和NeuroD，PDX-1(图8B)和NKX6.1(图8A)的表达并未显著下调。此外，在第3阶段时LDN-193189的完全去除导致CDX2表达的显著增加(图7F)。对于第3阶段的第一天添加LDN-193189随后在第3阶段的第2-3天时将其去除显著加强了NGN3和NeuroD的表达，同时降低了在第4阶段时的CDX2和SOX2表达。其中LDN-193189对于第3阶段的持续时间被保留的培养物显示在S3-S4时SOX2的极高表达(图8G)。该数据显示在第3阶段的第1天时的BMP抑制足以触发胰腺内分泌标志物，同时抑制SOX2和CDX2表达。
概括地说，需要在第3阶段的第1天时的BMP抑制，以诱导在第4-5阶段时的内分泌前体细胞的形成，并维持PDX-1和NKX6.1的表达，同时抑制SOX2表达。此外，在第3阶段时添加PKC活化剂还增强PDX-1和NKX6.1的表达。
实例4
在第3阶段的第1天时的BMP信号传导抑制足以在第4阶段时生成胰
腺前体细胞，而在第3阶段的最后一天时的BMP信号传导抑制导致显著更
低的内分泌标志物表达
该实例显示在第3阶段时的早期BMP信号传导抑制允许诱导胰腺内分泌前体标志物，而在第3阶段时的晚期BMP信号传导抑制显著降低在第4阶段时内分泌前体标志物的表达水平。
在不同传代(第40代至第52代)时的人胚胎干细胞系H1的细胞以100,000细胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿上的补充有10μMY27632的mTesrTM1培养基中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系的细胞：
a.第1阶段(定形内胚层(DE)-4天)：在DE开始前，将培养物洗涤并与不完全PBS(无Mg或Ca)一起温育30秒，随后添加第1阶段培养基。作为单细胞在MATRIGELTM涂布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mMD-葡萄糖、100ng/mLGDF8和1.5μMMCX化合物(GSK3B抑制剂)。细胞随后用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mM葡萄糖和100ng/mLGDF8。
b.第2阶段(原肠管-3天)：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mMD-葡萄糖和50ng/mLFGF7。
c.第3阶段(前肠-3天)：第2阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、50ng/mLFGF7、2μMRA和下表III中列出的组合。
表III
第3阶段处理
d.第4阶段(胰腺前肠前体-3天)：第3阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、100nMTPB、200nMLDN-193189、2μMALk5抑制剂和100nMCYP26A抑制剂。
图9A至图9H描述了对于上文列出的培养条件组合，胰腺内胚层、内分泌前体和前肠内胚层标志物的基因表达谱。符合先前实例，如通过泛内分泌标志物嗜铬粒蛋白的表达测量的，在第3阶段的第一天时阻断BMP途径对于内分泌程序的后续诱导是关键的。(参见图9C。)然而，在第3阶段的第一天时添加BMP抑制剂触发在后续阶段时的内分泌标志物的表达。此外，在第3阶段的第一天时添加BMP抑制剂还降低在第3-4阶段时前肠标志物SOX2的表达(图9H)。然而，相比于仅在第3阶段的第一天时用BMP抑制剂处理的细胞，仅在第3阶段的最后一天时添加BMP抑制剂显示在第3阶段结束时显著更高的SOX2表达。图9A至图9H中所示的表达水平与在未分化的H1细胞中的表达水平有关，所述未分化的H1细胞具有极高表达水平的SOX2。除了是前前肠的标志物之外，SOX2还是众所周知的在ES细胞的多能性维持中重要的转录因子。该实例还支持先前结果，所述先前结果突出了第3阶段培养物对BMP信号传导的持续时间和动力学的敏感性，以及对胰腺内分泌诱导和SOX2表达的后续影响。
实例5
在胰腺前肠阶段(第4阶段)时BMP抑制的最佳剂量
先前实例描述了在第3阶段时BMP抑制的最佳持续时间。该实例鉴定了在S4培养基时BMP抑制剂的最佳剂量。
在不同传代(第40代至第52代)时的人胚胎干细胞系H1的细胞以100,000细胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿上的mTesrTM1培养基和10μMY27632中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系：
a.第1阶段(定形内胚层(DE)-4天)：在DE开始前，将培养物洗涤并与不完全PBS(无Mg或Ca)一起温育30秒，随后添加第1阶段培养基。作为单细胞在MATRIGELTM涂布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mMD-葡萄糖、100ng/mLGDF8和1μMMCX化合物(GSK3B抑制剂)。对于第2-4天，细胞随后用MCDB-131培养基进行处理，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mM葡萄糖和100ng/mLGDF8。
b.第2阶段(原肠管-3天)：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mMD-葡萄糖和50ng/mLFGF7。
c.第3阶段(前肠-4天)：第2阶段细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、50ng/mLFGF7、2μMRA、20ng/mL激活素-A、100nMLDN-193189和100nMTPB。细胞随后在MCDB-131培养基中培养三天，所述MCDB-培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、50ng/mLFGF7、2μMRA、20ng/mL激活素-A和100nMTPB。
d.第4阶段(胰腺前肠前体-4天)：对于第4阶段的第1-4天，第3阶段细胞用MCDB-131培养基进行处理，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、200nMLDN-193189-193189、2μMALk5抑制剂、100nMCYP26A抑制剂和表IV(下文)上列出的LDN-193189浓度：
表IV
在S4时使用的LDN-193189浓度
| 条件A | 条件B | 条件C | 条件D | 条件E | |
| S4D1 | 100nM | 50nM | 10nM | 10nM | 10nM |
| S4D2 | 50nM | 10nM | 50nM | 10nM | 10nM |
| S4D3 | 10nM | 10nM | 100nM | 50nM | 10nM |
| S4D4 | 10nM | 10nM | 100nM | 50nM | 10nM |
d.第5阶段(胰腺内胚层/内分泌前体-3天)：第4阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、50nMLDN-193189和1μMALk5抑制剂。
上文处理后收获的细胞的实时PCR分析结果显示于图10A至图10H中。该图显示在S4的第1、2、3或4天时添加50nM或100nMLDN-193189可延长内分泌标志物的表达，同时维持在S4-S5时SOX2的低表达。(参见图10A至图10H。)
实例6
在前肠阶段(第3阶段)时BMP抑制的最佳剂量
该实例鉴定了在第3阶段时BMP抑制的最佳剂量和对在第6阶段时的内分泌标志物的后续作用。
在不同传代(第40代至第52代)时的人胚胎干细胞系H1的细胞以100,000细胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿上的补充有10μMY27632的mTesrTM 培养基中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系的细胞：
a.第1阶段(定形内胚层(DE)-4天)：在DE开始前，将培养物洗涤并与不完全PBS(无Mg或Ca)一起温育30秒，随后添加第1阶段培养基。作为单细胞在MATRIGELTM涂布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mMD-葡萄糖、100ng/mLGDF8和1.5μMMCX化合物(GSK3B抑制剂)。对于第2-4天，细胞随后用MCDB-131培养基进行处理，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mM葡萄糖和100ng/mLGDF8。
b.第2阶段(原肠管-3天)：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mMD-葡萄糖和50ng/mLFGF7。
c.第3阶段(前肠-3天)：第3阶段细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、50ng/mLFGF7、2μMRA、20ng/mL激活素-A、100nMTPB和10-50nMLDN-193189。细胞随后用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、50ng/mLFGF7、2μMRA、20ng/mL激活素-A和100nMTPB。
d.第4阶段(胰腺前肠前体-3天)：第3阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、20nMLDN-193189；2μMALk5抑制剂；100nMCYP26A抑制剂和100nMTPB。
e.第5阶段(胰腺内胚层/内分泌前体-3天)：第4阶段用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X；2.5mM葡萄糖；1XGlutaMaxTM；0.0015g/mL碳酸氢钠；2％无脂肪酸BSA；+/-25nMLDN-193189和/或2μMALk5抑制剂。
f.第6阶段(胰腺内分泌激素生产-3天)：第5阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X；2.5mM葡萄糖；1XGlutaMaxTM；0.0015g/mL碳酸氢钠；和2％无脂肪酸BSA。
图11A至图11H显示了需要在第3阶段的第一天时的低至中等BMP抑制，以触发内分泌标志物表达，同时维持SOX2的低表达。此外，在第5阶段时的BMP抑制在增强内分泌标志物的同时，还导致SOX2表达的上调。
该实例中的数据进一步证实了先前实例中呈现的结果。数据证实需要在第3-5阶段时BMP途径的精确调节，以触发胰腺内分泌标志物的诱导，同时抑制SOX2表达。
实例7
在S3(前肠阶段)时BMP抑制的最佳窗口
该实例鉴定了在第3阶段时用于抑制BMP信号传导的最佳窗口，同时保存在以后阶段时的内分泌诱导且降低SOX2的表达。
在不同传代(第40代至第52代)时的人胚胎干细胞系H1的细胞以100,000细胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿上的mTesrTM1培养基和10μMY27632中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系：
a.第1阶段(定形内胚层(DE)-4天)：在DE开始前，将培养物洗涤并与不完全PBS(无Mg或Ca)一起温育30秒，随后添加第1阶段培养基。作为单细胞在MATRIGELTM涂布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mMD-葡萄糖、100ng/mLGDF8和1.5μMMCX化合物。对于第2-4天，细胞随后用MCDB-131培养基进行处理，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mM葡萄糖和100ng/mLGDF8。
b.第2阶段(原肠管-3天)：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mMD-葡萄糖和50ng/mLFGF7。
c.第3阶段(前肠-3天)：第2阶段细胞用MCDB-131培养基进行处理，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、50ng/mLFGF7、2μMRA、20ng/mL激活素-A和100nMTPB，仅对于第3阶段的前2小时、6小时或24小时含有100nMLDN-193189。
d.第4阶段(胰腺前肠前体-3天)：第3阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、25nMLDN-193189、2μMALk5抑制剂、100nMCYP26A抑制剂和100nMTPB。
e.第5阶段(胰腺内胚层/内分泌前体-3天)：第4阶段细胞用MCDB-131培养基处理三天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、和2μMALk5抑制剂。
图12A至图12G示出了该实例中收集的数据的实时PCR分析。在第3阶段时用BMP抑制剂处理至少2小时可触发促内分泌转录因子例如Ngn3(图12D)和NeuroD(图12E)的表达，同时维持SOX2的极低表达(图12G)，并显著增加在S4-S5时的NKX6.1(图12A)和PDX-1(图12B)表达。然而，在第5阶段第3天时，CDX2表达在用BMP抑制剂处理2或6小时的细胞中高于用该抑制剂处理24小时的细胞中(图12F)。
来自该实例的数据提示BMP途径的24小时抑制对于维持低水平的CDX2表达和SOX2表达是最佳的，并且引发内分泌分化，同时维持胰腺内胚层标志物的高表达。
实例8
第3阶段(前肠阶段)和第4阶段(胰腺前肠前体阶段)的最佳持续
时间
执行该实例，以测定在多能细胞逐步分化为胰腺内分泌谱系的细胞群中S3和S4的最佳持续时间。
在不同传代(第40代至第52代)时的人胚胎干细胞系H1的细胞以100,000细胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿上的补充有10μMY27632的mTesrTM1培养基中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系：
a.第1阶段(定形内胚层(DE)-4天)：在DE开始前，将培养物洗涤并与不完全PBS(无Mg或Ca)一起温育30秒，随后添加第1阶段培养基。作为单细胞在MATRIGELTM涂布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM；2.5mMD-葡萄糖；100ng/mLGDF8和1.5μMMCX化合物(GSK3B抑制剂)。对于第2-4天，细胞随后用MCDB-131培养基进行处理，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA；0.0012g/mL碳酸氢钠；1XGlutaMaxTM；2.5mM葡萄糖和100ng/mLGDF8；随后
b.第2阶段(原肠管-2天)：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、2.5mMD-葡萄糖和50ng/mLFGF7。
c.第3阶段(前肠-2-3天)：第2阶段细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、50ng/mLFGF7、2μMRA、20ng/mL激活素-A和100nMTPB，含有100nMLDN-193189。细胞随后用MCDB-131培养基进行处理，所述MCDB-培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、50ng/mLFGF7、2μMRA、20ng/mL激活素-A和100nMTPB。
d.第4阶段(胰腺前肠前体-2-3天)：第3阶段细胞用MCDB-131培养基处理两或三天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、25nMLDN-193189、100nMCYP26A抑制剂和100nMTPB。
e.第5阶段(胰腺内胚层/内分泌前体-2天)：第4阶段细胞用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、和1μMALk5抑制剂。
f.第6阶段(胰腺内分泌前体/激素-2天)：第5阶段细胞用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠和2％无脂肪酸BSA。
来自在第3阶段、第4阶段、第5阶段或第6阶段时收获的样品的实时PCR分析的数据显示于图13A至图13G中。该数据显示当与具有两天S3和S4的培养物相比较时，使S3和S4延长至三天增强NKX6.1的表达(图13A)。当与其中S3和S4的持续时间仅两天的培养物相比较时，在第3阶段时处理三天的细胞显示促内分泌标志物的表达的下调(图13D和图13E)。此外，使第4阶段延长至三天的确显著增强SOX2的表达(图13G)。
该实例中获得的数据符合先前实例中生成的数据，显示延长的BMP抑制使前肠偏向高SOX2的群体。基于来自该实例和先前实例的数据，可得出结论第3阶段和第4阶段的最佳持续时间为两天。理想方案将导致具有促内分泌标志物的高表达水平、高NKX6.1、低CDX2和低SOX2表达的分化细胞。
实例9
在高葡萄糖和B27补充剂的存在下，对BMP抑制的延长暴露显著增
加在S3和S4时的SOX2表达
执行该方案，以测定在多能细胞逐步分化成激素生成细胞的过程中影响在S3和S4时SOX2表达的因子。
人胚胎干细胞系H1的细胞在MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿上进行培养，并且在mTesrTM1培养基中培养直至～70％汇合度时，并如下分化：
a.未分化的细胞在RPMI培养基(Invitrogen)中培养一天，所述RPMI培养基补充有0.2％FBS；100ng/mL激活素A；20ng/mLWNT-3a。细胞随后用RPMI培养基处理另外两天，所述RPMI培养基补充有0.5％FBS；100ng/mL激活素A(第1阶段)。
b.第1阶段细胞用DMEM/F12培养基处理三天，所述DMEM/F12培养基补充有2％FBS；50ng/mLFGF7(第2阶段)。
c.第2阶段细胞在DMEM-高葡萄糖培养基中培养四天，所述DMEM-高葡萄糖培养基补充有1％B27；0.25μMSANT-1；2μMRA；100ng/mL头蛋白(R&Dsystems，MN，USA)(第3阶段)。
d.第3阶段细胞用DMEM-高葡萄糖培养基处理四天，所述DMEM-高葡萄糖培养基补充有1％B27；100ng/mL头蛋白；1μMALK5抑制剂II(AxxoraCA，USA)；和50nMTPB(第4阶段)。
图14A至图14H描述了对于下述标志物获得的，对于在第3阶段第4天时收获的细胞的FACS直方图：同种型对照(图14A)、嗜铬粒蛋白(图14B)、KI-67(图14C)、NKX6.1(图14D)、SOX2(图14E)、HNF3B(图14F)、CDX2(图14G)、PDX-1(图14H)。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。在第3阶段时的大多数细胞对于PDX-1(图14H)和HNF3B(图14F)的表达是阳性的，对于NKX6.1(图14D)的表达是阴性的，并显示嗜铬粒蛋白(图14B)和CDX2(图14G)的低表达。然而，超过90％的细胞对于SOX2也是强阳性的(图14E)。这指示在第3阶段时，大多数细胞对于PDX-1和SOX2是阳性的，并且对于NKX6.1是阴性的，提示在胰腺的PDX-1域前的符合前肠群体的内胚层群体的建立。
此外，在使用该实例概述的方案生成的细胞群中，其在第3阶段时是SOX2+的细胞百分比显著高于在使用实例1概述的方案生成的细胞群中其为SOX2+的细胞百分比。该差异可归于在该实例的第3阶段时，在培养基中对BMP拮抗剂头蛋白的延长暴露、FGF7和PKC活化剂的缺乏。
图15A直到图15G显示了在根据实例9分化的细胞的S4第2天时，下述标志物的FACS直方图表达谱：图15A：同种型对照，图15B：NKX6.1，图15C：KI-67，图15D：嗜铬粒蛋白，图15E：SOX2，图15F：CDX2，图15G：PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
图16A至图16F显示了在根据实例9分化的细胞的S4第4天时，下述标志物的FACS直方图表达谱。图16A：同种型对照，图16B：NKX6.1，图16C：嗜铬粒蛋白，图16D：SOX2，图16E：CDX2，图16F：PDX-1。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
下表V概括了对于根据该实例中概述的方案分化的细胞，对于在S3和S4时内胚层标志物的％表达获得的数据。
表V
在S3-S4时内胚层标志物的％表达
图17A至图17J描述了在根据实例9分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中，下述基因表达的实时PCR分析的结果。图17A：CDX2，图17B：HHex，图17C：FOXE1，图17D：IPF1(PDX-1)，图17E：NKX2.1，图17F：NKX2.2，图17G：NKX6.1，图17H：PROX1，图17T：SOX2，图17J：SOX9。
如图14至17和表V中可见，在第4阶段的第2-4天时，存在NKX6.1表达的显著增加，同时维持PDX-1的高表达。尽管SOX2的表达从第3阶段到第4阶段下降，但～75％的细胞仍为SOX2+。与图5中相同，CDX2+细胞、SOX2+细胞和NKX6.1+细胞与嗜铬粒蛋白群体相互排斥。这暗示使用实例9中概述的方案生成的第4阶段第4天细胞群具有～50％NKX6.1+SOX2+PDX-1+CDX2-嗜铬粒蛋白阴性馏分。这与实例1中生成的细胞群形成对比，所述细胞群具有40-70％PDX-1+NKX6.1+SOX2-、CDX2-、嗜铬粒蛋白阴性馏分，并且在S4-S5时具有2-25％PDX-1+NKX6.1+SOX2+。明确的是，相比于实例9中生成的细胞，使用实例1中的方案生成的细胞具有高得多的胰腺内胚层百分比，如定义为其为PDX-1+和NXK6.1+同时对于SOX2和CDX2很低或阴性的群体。
该实例中获得的数据提供了下述支持：在高葡萄糖和B27补充剂的存在下，对BMP抑制的延长暴露显著增加在分化的第3和4阶段时的SOX2表达。
实例10
先前公开的方案导致在阶段3-4时显著数目的SOX2+群体形成
Kroon等人已公开用于由人胚胎干细胞制备胰腺内胚层谱系的细胞的方案(NatureBiotech2008，26：443-452；下文“Kroon”)。在此处提供的实例中，人胚胎干细胞遵循Kroon方案进行分化，并测定不同分化阶段的特征性标志物的表达。
人胚胎干细胞系H1的细胞在MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿上铺平板，并且在mTesrTM1培养基中培养直至～70％汇合度时，并如下使用先前由Kroon公开的方案进行分化：
a)使未分化的细胞暴露于RPMI培养基一天，所述RPMI培养基补充有0.2％FBS、100ng/mL激活素A、20ng/mLWNT-3a，随后用补充有0.5％FBS、100ng/mL激活素A的RPMI培养基处理另外两天(第1阶段)。
b)使第1阶段细胞暴露于补充有2％FBS、50ng/mLFGF7的RPMI培养基三天(第2阶段)。
c)第2阶段细胞用DMEM-高葡萄糖培养基处理三天，所述DMEM-高葡萄糖培养基补充有1％B27、0.25μMSANT-1、2μMRA、50ng/mL头蛋白(R&Dsystems，MN)(第3阶段)。
d)第3阶段细胞在补充有1％B27的DMEM-高葡萄糖培养基中培养三天(第4阶段)。
e)第4阶段细胞从孔中刮取，并作为簇重悬浮于补充有1％B27的DMEM-高葡萄糖培养基中两天。
图18A至图18G显示了在根据实例10分化的细胞的S3第3天时，下述标志物的FACS直方图表达谱：同种型对照(图18A)、NKX6.1(图18B)、嗜铬粒蛋白(图18C)、SOX2(图18D)、CDX2(图18E)、KI-67(图18F)、PDX-1(图18G)。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
图19A至图19G显示了在根据实例10分化的细胞的S4第5天时，下述标志物的FACS直方图表达谱。同种型对照(图19A)、NKX6.1(图19B)、嗜铬粒蛋白(图19C)、SOX2(图19D)、CDX2(图19E)、KI-67(图19F)、PDX-1(图19G)。每种标志物的表达百分比显示于每个直方图上。
如图18和19中所示，到第4阶段结束时(第5天)，悬浮中的细胞簇为～20％NKX6.1+PDX-1+SOX2-和～20％PDX-1+NKX6.1+SOX2+。这些结果指示根据实例10生成的在第4阶段时其为NKX6.1+的细胞群的显著部分也是SOX2+。
下文显示的表VI概括了在该实例中生成的细胞的S3-S4时的内胚层标志物百分比。
表VT
在根据Kroon分化的细胞中，在S3-S4时的内胚层标志物表达
*最后两天在悬浮培养物中。
实例11
抗坏血酸的添加导致多激素数目中的显著降低和单一激素胰岛素阳性
细胞数目中的伴随增加
测试了抗坏血酸对多能细胞分化为激素生成细胞过程中的标志物表达的作用。如下在每一个分化步骤补充有葡萄糖并在第3、4和5阶段形成时补充有抗坏血酸的培养基中培养细胞：
在不同传代(第40代至第52代)时的人胚胎干细胞系H1的细胞以100,000细胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿上的mTesrTM1培养基和10μMY27632中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系：
a.第1阶段(定形内胚层(DE)-3天)：在DE开始前，将培养物洗涤并与不完全PBS(无Mg或Ca)一起温育30秒，随后添加第1阶段培养基。作为单细胞在MATRIGELTM涂布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、5mMD-葡萄糖、100ng/mLGDF8和1μMMCX化合物(GSK3B抑制剂)。对于第二天，细胞随后用MCDB-131培养基进行处理，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、5mM葡萄糖、100ng/mLGDF8和100nMMCX化合物，随后为在补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、5mM葡萄糖和100ng/mLGDF8的MCDB-131培养基中的另外一天。
b.第2阶段(原肠管-2天)：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、5mMD-葡萄糖和25ng/mLFGF7。
c.第3阶段(前肠-2天)：第2阶段细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、10ng/mE激活素A、25ng/mLFGF7、0.25μMSANT-1、1μMRA、200nMTPB(PKC活化剂)、100nMLDN-193189(BMP受体抑制剂)。细胞随后用MCDB-131培养基处理另外一天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、10ng/mL激活素A、25ng/mLFGF7、0.25μMSANT-1、1μMRA、200nMTPB(PKC活化剂)、10nMLDN-193189。对于第3阶段的持续时间，一些培养物用0.25mM抗坏血酸(目录#A4544，Sigma，MO，USA)进行处理。
d.第4阶段(胰腺前肠前体-2天)：第3阶段细胞用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、50nMRA、200nMTPB、50nMLDN-193189，连同或不连同0.25mM抗坏血酸。
e.第5阶段(胰腺内胚层，2-7天)：第4阶段细胞用MCDB-131培养基处理2-7天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、50nMRA，连同或不连同0.25mM抗坏血酸。
图20A至图20J描述了在根据实例11分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中，下述基因表达的实时PCR分析。图20A：生长抑素，图20B：PDX1，图20C：Pax6，图20D：Pax4，图20E：NKX6.1，图20F：NGN3，图20G：胰高血糖素，图20H：NeuroD，图20I：胰岛素，图20J：嗜铬粒蛋白。该图显示在第3阶段时或在第3和4阶段时添加抗坏血酸显著降低在第4-5阶段时生长抑素和胰高血糖素的表达，同时增加胰岛素的表达(参见图20A、图20G和图20I)。此外，在第4-5阶段时，胰腺内胚层标志物例如PDX-1和NKX6.1的表达通过添加0.25mM抗坏血酸并未显著改变(参见图20B和图20D)。在第4-5阶段时，Pax6表达下调，并且Pax4表达维持(参见图20C和图20D)。在第5阶段结束时，在S3-S5时用+/-抗坏血酸处理的培养物对于胰岛素、胰高血糖素和生长抑素激素进行免疫染色。表VII概括了胰岛素阳性细胞、胰高血糖素和生长抑素阳性细胞、以及多激素细胞(一个细胞中的两种或更多种激素表达)的平均百分比。
表VII
作为整体激素计数百分比的激素表达
实例12
在第3阶段时抗坏血酸的最佳剂量
执行该实例，以测定用于生成胰岛素阳性细胞的抗坏血酸的最佳剂量，所述胰岛素阳性细胞是单一激素、PDX-1阳性和NKX6.1阳性的。
在不同传代(第40代至第52代)时的人胚胎干细胞系H1的细胞以100,000细胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿上的mTesrTM1培养基和10μMY27632中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系：
a.第1阶段(定形内胚层(DE)-3天)：在DE开始前，将培养物洗涤并与不完全PBS(无Mg或Ca)一起温育30秒，随后添加第1阶段培养基。作为单细胞在MATRIGELTM涂布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、5mMD-葡萄糖和100ng/mLGDF8加上1μMMCX化合物(GSK3B抑制剂)。对于第二天，细胞随后用MCDB-131培养基进行处理，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、5mM葡萄糖和100ng/mLGDF8加上100nMMCX化合物，随后为在补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、5mM葡萄糖和100ng/mLGDF8的MCDB-131培养基中的另外一天。
b.第2阶段(原肠管-2天)：第1阶段细胞用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、5mMD-葡萄糖，连同或不连同0.25mM抗坏血酸和25ng/mLFGF7的添加。
c.第3阶段(前肠-2天)：对于第1天，第2阶段细胞用MCDB131培养基进行处理，所述MCDB131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、10ng/mL激活素A、25ng/mLFGF7、0.25μMSANT-1、+/-0.25mM抗坏血酸、1μMRA、200nMTPB、100nMLDN-193189，随后用MCDB131培养基处理另外一天，所述MCDB131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、10ng/mL激活素A、25ng/mLFGF7、0.25μMSANT-1、+/-0.25mM抗坏血酸、1μMRA、200nMTPB、10nMLDN-193189。
d.第4阶段(胰腺前肠前体-2天)：第3阶段细胞用MCDB131培养基处理两天，所述MCDB131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、50nMRA、200nMTPB、50nMLDN-193189，连同或不连同0.25mM至1mM抗坏血酸的添加。
e.第5阶段(胰腺内胚层，2-9天)：第4阶段细胞用MCDB131培养基处理2-9天，所述MCDB131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、50nMRA，连同或不连同0.25mM抗坏血酸的添加。
图21A至图21J描述了在根据实例12分化的人胚胎干细胞系H1的细胞中，来自下述基因表达的实时PCR分析的数据。图21A：生长抑素，图21B：PDX1，图21C：Pax6，图21D：Pax4，图21E：NKX6.1，图21F：NGN3，g图21G：NeuroD，图21H：胰岛素，图21I：胰高血糖素，图21J：嗜铬粒蛋白。符合得自实例10的数据，在第2-4阶段时添加抗坏血酸显著减少生长抑素、胰高血糖素和Pax6的表达，同时维持在第5阶段时的胰岛素和Pax4的表达。此外，相比于与0.25mM抗坏血酸，在S4时使用0.5-1mM抗坏血酸没有显著有益效果。最后，在第2阶段时添加抗坏血酸还证明在降低在第S3-5阶段时的胰高血糖素和生长抑素表达，同时维持胰岛素表达方面是有效的。因此，抗坏血酸以阶段特异性方式起作用，以调节单一激素细胞的表达。抗坏血酸的添加在分化方案的早期阶段中是重要的，而在晚期阶段时，其未证明在减少多激素细胞数目中是有效的。
实例13
视黄酸和抗坏血酸的组合是生成单一激素胰岛素阳性细胞所需的
执行该实例，以阐明在多能细胞的分化过程中生成单一激素胰岛素阳性细胞的需求。
在不同传代(第40代至第52代)时的人胚胎干细胞系H1的细胞以100,000细胞/cm2的密度作为单细胞接种到MATRIGELTM(1∶30稀释)涂布的皿上的mTesrTM1培养基和10μMY27632中。接种后四十八小时，如下使培养物分化成胰腺内分泌谱系：
a.第1阶段(定形内胚层(DE)-3天)：在DE开始前，将培养物洗涤并与不完全PBS(无Mg或Ca)一起温育30秒，随后添加第1阶段培养基。作为单细胞在MATRIGELTM涂布的皿上培养的人胚胎干细胞用MCDB-131培养基处理一天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、5mMD-葡萄糖、100ng/mLGDF8和1μMMCX化合物(GSK3B抑制剂)。对于第二天，细胞随后用MCDB-131培养基进行处理，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、碳酸氢钠、GlutaMaxTM、额外的5mM葡萄糖、100ng/mLGDF8和100nMMCX化合物，随后为在补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、5mM葡萄糖和100ng/mLGDF8的MCDB-131培养基中的另外一天。
b.第2阶段(原肠管-2天)：细胞用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有0.1％无脂肪酸BSA、0.0012g/mL碳酸氢钠、1XGlutaMaxTM、5mMD-葡萄糖、0.25mM抗坏血酸和25ng/mLFGF7，随后
c.第3阶段(前肠-2天)：对于第1天，细胞用MCDB131进行处理，所述MCDB131补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、10ng/mL激活素A、25ng/mLFGF7、0.25mM抗坏血酸、0.25μMSANT-1、1μMRA、200nMTPB、100nMLDN-193189，随后用tMCDB131处理另外一天，所述tMCDB131补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、10ng/mL激活素A、25ng/mLFGF7、0.25mM抗坏血酸、0.25μMSANT-1、1μMRA、200nMTPB、10nMLDN-193189。
d.第4阶段(胰腺前肠前体-2天)：细胞用MCDB-131培养基处理两天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA、0.25μMSANT-1、50nMRA、200nMTPB、50nMLDN-193189、0.1mM抗坏血酸，随后
e.第5阶段(胰腺内胚层，3天)：细胞用MCDB-131培养基处理3天，所述MCDB-131培养基补充有1∶200稀释的ITS-X、2.5mM葡萄糖、1XGlutaMaxTM、0.0015g/mL碳酸氢钠、2％无脂肪酸BSA和下述培养条件：
·+0.1mM抗坏血酸
·0.1mM抗坏血酸+50nMRA
·0.1mM抗坏血酸+50nMRA+0.25μMSANT-1
·0.1mM抗坏血酸+50nMRA+0.25μMSANT-1+50nMLDN-193189
·0.1mM抗坏血酸+50nMRA+0.25μMSANT-1+1μMAlk5抑制剂
·0.1mM抗坏血酸+50nMRA+0.25μMSANT-1+1μMAlk5抑制剂+50nMLDN-193189。
图22A直到图22L显示了在根据实例13分化且在S5第3天时收获的胚胎干细胞系H1的细胞中，来自下述表达的实时PCR分析的数据：Pax4(图22A)；Pax6(图22B)；PDX1(图22C)；PTF1a(图22D)；胰高血糖素(图22E)；胰岛素(图22F)；NeuroD(图22G)；ngn3(图22H)；Zic1(图22I)；CDX2(图22J)；白蛋白(图22K)；NKX6.1(图22L)。
在第5阶段结束时，用上文列出的组合处理的培养物对于胰岛素、胰高血糖素和生长抑素激素进行免疫染色。表VIII概括了胰岛素阳性细胞、胰高血糖素和生长抑素阳性细胞、以及多激素细胞(一个细胞中的两种或更多种激素表达)的平均百分比。
如图22和下表VIII中所示，相比于在S5时仅用维生素C处理的培养物，在第5阶段时添加低剂量的视黄酸加上抗坏血酸显著减少激素阳性细胞的总体数目，同时增加单一激素胰岛素阳性细胞的百分比。此外，相比于仅用抗坏血酸(维生素C)处理的培养物，视黄酸、抗坏血酸、音猬蛋白抑制剂和ALK5抑制剂的组合还增加单一激素胰岛素阳性细胞的数目。该数据指示因子的独特组合是生成单一激素胰岛素阳性细胞所需的。
表VIII
作为在S5第3天时的整体激素计数百分比的激素表达。
Claims (23)
1.由多能细胞的逐步分化获得的胰腺内胚层细胞的体外分化群体，其中每个分化步骤中的细胞在包含5mM至20mM葡萄糖的培养基中进行培养。
2.根据权利要求1所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中大于30%的所述分化的胰腺内胚层细胞是PDX-1+NKX6.1+、SOX2-和CDX2-。
3.根据权利要求1或2所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中所述分化群体中大于10%的细胞是单一激素胰岛素阳性细胞。
4.根据权利要求1-3所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中所述逐步分化包括在还补充有TGF-B配体的培养基中培养未分化的人胚胎干细胞。
5.根据权利要求1-4所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中所述逐步分化包括在还补充有WNT活化剂的培养基中培养未分化的人胚胎干细胞。
6.根据权利要求1所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中所述逐步分化包括在还补充有FGF配体的培养基中培养定形内胚层细胞。
7.根据权利要求1-4所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中所述逐步分化包括在还补充有shh抑制剂、FGF配体、PKC活化剂、TGF-B配体、类视色素和BMP抑制剂梯度的培养基中培养肠管细胞。
8.根据权利要求5所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中所述逐步分化包括在还补充有PKC活化剂、shh抑制剂、类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养后前肠细胞。
9.根据权利要求1-6所述的胰腺内胚层细胞的分化群体，其中所述逐步分化包括在还补充有抗坏血酸的培养基中培养细胞。
10.用于使多能细胞逐步分化成胰腺内胚层谱系的细胞群的体外方法，所述体外方法包括在包含5mM至20mM葡萄糖的培养基中培养每个分化阶段中的所述细胞。
11.根据权利要求10所述的体外方法，还包括通过在补充有TGF-B配体和WNT活化剂的培养基中培养所述多能细胞来使所述多能细胞分化成定形内胚层(DE)细胞。
12.根据权利要求11所述的体外方法，还包括通过在补充有FGF配体的培养基中培养所述DE细胞来使所述DE细胞分化成肠管细胞。
13.根据权利要求12所述的体外方法，还包括通过在补充有shh抑制剂、FGF配体、PKC活化剂、TGF-B配体、类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养所述肠管细胞来使所述肠管细胞分化成后前肠内胚层细胞。
14.根据权利要求13所述的体外方法，还包括通过在补充有PKC活化剂、shh抑制剂、类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养所述后前肠内胚层细胞来使所述后前肠内胚层细胞分化成胰腺前肠细胞。
15.根据权利要求14所述的体外方法，还包括通过在补充有shh抑制剂、TGF-B抑制剂和类视色素的培养基中培养所述胰腺前肠细胞来使所述胰腺前肠细胞分化成胰腺内胚层细胞。
16.根据权利要求15所述的体外方法，还包括使所述胰腺内胚层细胞分化成胰腺β细胞群。
17.根据权利要求10-16所述的体外方法，其中在至少一个步骤中，所述培养基还补充有抗坏血酸。
18.根据权利要求10-17所述的体外方法，其中所述分化群体中大于10%的细胞是单一激素胰岛素阳性细胞。
19.根据权利要求18所述的体外方法，其中培养物中大于30%的胰腺内胚层细胞是PDX-1+、NKX6.1+、SOX2-和CDX2-。
20.用于使人胚胎干细胞分化成胰腺β细胞的体外方法，包括：
a)在补充有葡萄糖、TGF-B配体和WNT活化剂的培养基中培养未分化的人胚胎干细胞，以生成定形内胚层(DE)细胞群；
b)在补充有葡萄糖和FGF配体的培养基中培养所述DE细胞以生成肠管细胞群；
c)在补充有葡萄糖、shh抑制剂、FGF配体、PKC活化剂、TGF-B配体、类视色素和BMP抑制剂梯度的培养基中培养所述肠管细胞以生成表达PDX-1和SOX2的后前肠内胚层细胞群；
d)在补充有葡萄糖、PKC活化剂、shh抑制剂、类视色素和BMP抑制剂的培养基中培养所述后前肠细胞以生成相比于所述后前肠细胞，表达PDX-1和NKX6.1并表达更低水平的SOX2的胰腺前肠细胞群；
e)在补充有葡萄糖、shh抑制剂、TGF-B抑制剂和类视色素的培养基中培养所述胰腺前肠细胞以获得相比于所述胰腺前肠细胞，表达PDX-1、更高水平的NKX6.1和更低水平的SOX2的胰腺内胚层细胞群；和
f)使所述胰腺内胚层细胞分化成胰腺β细胞群。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述胰腺β细胞群是PDX-1+、NKX6.1+、SOX2-和CDX2-。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中在至少一个步骤中，所述培养基还补充有抗坏血酸。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述胰腺β细胞群是单一激素胰岛素生成细胞，所述单一激素胰岛素生成细胞也是NKX6.1+和PDX-1+。
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