JP2022535239A - 生体適合性メンブレン複合体 - Google Patents

Abstract

異物反応を緩和又は調整し得る環境を提供できる生体適合性メンブレン複合体が提供される。メンブレン複合体は緩和層と血管新生層とを含有する。ｉｎ ｖｉｖｏの生体適合性メンブレン複合体に支持を提供し、そしてメンブレン複合体の歪みを防止するために、補強構成部分を任意に含むことができる。緩和層は植え込み型デバイス及び／又は細胞システムに結合（例えば点結合又は溶着）されるか又は付着（密接又は不連続に）されてよい。生体適合性メンブレン複合体は、機能のために血管新生を必要とするものの宿主の免疫反応、例えば異物巨細胞の形成からの保護を必要とする植え込み型デバイス又は細胞システムのための表面層として使用することができる。生体適合性メンブレン複合体は植え込み型デバイス又は細胞システムの外側を部分的又は完全に覆うことができる。緩和層は植え込み型デバイス又は生物活性スキャフォールドと血管新生層との間に位置決めされる。

Description

本発明は大まかに言えば、植え込み型デバイス、及び具体的には生体適合性メンブレン複合体及びその使用に関する。

生物学的治療は、末梢動脈疾患、動脈瘤、心臓疾患、アルツハイマー病及びパーキンソン病、自閉症、失明、糖尿病、及び他の病理を治療するますます実行可能になりつつある方法である。

一般の生物学的治療に関しては、細胞、ウイルス、ウイルスベクター、細菌、タンパク質、抗体、及び他の生物活性部分を、患者の組織床内に生物活性部分を入れる外科的方法又は介入的方法によって、患者内に導入することができる。多くの場合、生物活性部分を先ずデバイス内に入れ、次いでこれを患者内へ挿入する。あるいは、デバイスを先ず患者内へ挿入し、後から生物活性部分を添加することもある。

外部デバイス（例えば細胞カプセル化デバイス、センサ、及び／又は体内の物理的パラメータ及び／又は被分析物を測定するためのモニター）を植え込むと、免疫反応が引き起こされる。免疫反応では異物巨細胞が形成され、植え込まれたデバイスを少なくとも部分的にカプセル化する。デバイスは、栄養素又は他の治療的に有用な物質が通過するのを許すがしかし細胞の通過を阻止する１つ又は２つ以上の生体適合性メンブレン又は他の生体適合性材料から形成することができる。細胞不透過性界面又はその近くに異物巨細胞が存在すると、この表面に近接して血管が形成されることは、不可能ではないにしても難しくなり、これにより、酸素、栄養素、被分析物、又は十分なデバイス機能のために必要となるデバイス界面にわたる他の信号化へのアクセスが制約される。

したがって、細胞不透過性界面の表面又は表面近くに十分な血管新生が発生し、これにより、植え込まれたカプセル化済み細胞が生き残り、治療的に有用な物質を分泌するのを可能するように、異物反応を緩和又は調整し得る環境において利用することができ、あるいはこのような環境を提供することができる材料であって、植え込まれたデバイスが、測定のために被分析物及び物理的パラメータへアクセスするのを許す材料が技術分野において依然として必要である。

１つの態様（「態様１」）によれば、生体適合性メンブレン複合体が、当該第１層が第１固形フィーチャ間隔を備えた第１固形フィーチャを有しており、前記第１固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン未満である、第１層と、当該第２層が第２固形フィーチャ間隔を備えた第２固形フィーチャを有しており、前記第２固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン超である、第２層と、を含む。

態様１に加えられる別の態様（「態様２」）によれば、前記第１層が、大部分が約３ミクロン～約２０ミクロンの代表短軸を含む。

態様１又は態様２に加えられる別の態様（「態様３」）によれば、前記第２層が有効直径約９ミクロン超の第１孔サイズを有している。

態様１から３までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様４」）によれば、前記第１層の第１厚が約２００ミクロン未満である。

態様１から４までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様５」）によれば、前記第１層が有効直径約１ミクロン～約９ミクロンの第２孔サイズを有している。

態様５に加えられる別の態様（「態様６」）によれば、前記第１層及び第２層のうちの少なくとも一方の層の固形フィーチャがフィブリルによって接続されており、前記フィブリルが変形可能である。

態様１から５までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様７」）によれば、前記第２層の第２厚が約３０ミクロン～約２００ミクロンである。

態様１から６までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様８」）によれば、前記第１層及び第２層のうちの少なくとも一方が、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）メンブレン、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）メンブレン、及び改質延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）メンブレンから選択されたポリマーを含む。

態様１から８までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様９」）によれば、前記生体適合性メンブレン複合体が表面被膜を上に含み、前記表面被膜が、抗菌剤、抗体、医薬品、及び生物活性分子から選択された１種又は２種以上の員を含む。

態様１から９までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様１０」）によれば、前記第１層及び第２層のうちの少なくとも一方が、延伸ポリテトラフルオロエチレンメンブレンである。

態様１から１０までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様１１」）によれば、前記第２層がスパンボンド不織布ポリエステル材料である。

態様１から１０までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様１２」）によれば、補強構成部分を含む。

態様１２に加えられる別の態様（「態様１３」）によれば、前記補強構成部分が織布又は不織布である。

態様１から１３までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様１４」）によれば、前記第１層の固形フィーチャがさらに代表短軸、代表長軸、及び固形フィーチャ深さを含み、そして前記代表短軸、代表長軸、及び固形フィーチャ深さのうちの少なくとも２つの大部分が約５ミクロン超である。

態様１から１４までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様１５」）では、当該第１層が、有効直径約１ミクロン～約９ミクロンの第１孔サイズと、約２００ミクロン未満の第１厚と、第１固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン未満である第１固形フィーチャとを有し、前記第１固形フィーチャの大部分が約３ミクロン～約２０ミクロンの第１代表短軸を有する、第１層と、第２層と、を含む。

態様１から１５までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様１６」）によれば、前記第２層が、有効直径約９ミクロン超である孔サイズを有している。

態様１から１６までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様１７」）によれば、前記第２層が、第２固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン超である第２固形フィーチャを含む。

態様１５から１７までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様１８」）によれば、前記第２層の第２厚が約３０ミクロン～約２００ミクロンである。

態様１５から１８までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様１９」）によれば、前記第１層の第１固形フィーチャが第１代表長軸と第１固形フィーチャ深さとを含み、そして前記第１代表短軸、前記第１代表長軸、及び前記第１固形フィーチャ深さのうちの少なくとも２つが約５ミクロン超である。

態様１５から１９までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様２０」）によれば、前記固形フィーチャがフィブリルによって接続されており、前記フィブリルが変形可能である。

態様１５から２０までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様２１」）によれば、前記第２層が第２固形フィーチャを含み、そして前記第２固形フィーチャの大部分が、約４０ミクロン未満の第２代表短軸を有している。

態様１５から２１までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様２２」）によれば、前記第２層が第２代表長軸と第２固形フィーチャ深さとを含み、そして前記第２代表短軸、前記第２代表長軸、及び前記第２固形フィーチャ深さのうちの少なくとも２つの大部分が約５ミクロン超である。

態様１５から２２までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様２３」）によれば、前記第１層及び第２層のうちの少なくとも一方が、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）メンブレン、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）メンブレン、及び改質延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）メンブレンから選択されたポリマーである。

態様１５から２３までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様２４」）によれば、前記第２層がスパンボンド不織布ポリエステル材料である。

態様１５から２４までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様２５」）によれば、前記第１層及び第２層のうちの少なくとも一方が、ポリマー、フルオロポリマーメンブレン、非フルオロポリマーメンブレン、織布、不織布、繊維又は糸の製織又は不織収集体、繊維性マトリックス、及びこれらの組み合わせを含む。

態様１５から２５までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様２６」）によれば、前記第１層の第１固形フィーチャが、熱可塑性ポリマー、ポリウレタン、シリコーン、ゴム、エポキシ、及びこれらの組み合わせから選択された員を含む。

態様１５から２６までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様２７」）によれば、補強構成部分を含む。

態様２７に加えられる別の態様（「態様２８」）によれば、前記補強構成部分が織布又は不織布である。

態様１５から２８までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様２９」）によれば、前記生体適合性メンブレン複合体が表面被膜を上に含み、そして前記表面被膜が、抗菌剤、抗体、医薬品、及び生物活性分子から選択された１種又は２種以上の員を含む。

態様１５から２９までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様３０」）によれば、前記生体適合性メンブレン複合体が親水性被膜を上に含む。

態様１５から３０までのいずれか１つに加えられる別の態様（「態様３１」）によれば、前記第１層が結合可能な固形フィーチャを含み、前記結合可能な固形フィーチャが植え込み型デバイス又は植え込み型細胞システムに結合されている。

態様３１に加えられる別の態様（「態様３２」）によれば、前記植え込み型デバイスがスキャフォルドである。

態様３２に加えられる別の態様（「態様３３」）によれば、前記スキャフォールドが細胞培養マトリックスである。

態様３２に加えられる別の態様（「態様３４」）によれば、前記スキャフォールドが外植片である。

態様３１に加えられる別の態様（「態様３５」）によれば、前記第１固形フィーチャが前記細胞システムに少なくとも部分的に結合されている。

態様３５に加えられる別の態様（「態様３６」）によれば、前記細胞システムが細胞容器である。

態様３１に加えられる別の態様（「態様３７」）によれば、前記植え込み型デバイスがセンサである。

態様３１に加えられる別の態様（「態様３８」）によれば、前記細胞システムが生物活性スキャフォールドである

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様３９」）によれば、哺乳類の血糖値を低下させる方法が、前の請求項のいずれかに記載の生体適合性メンブレン複合体を含む細胞カプセル化デバイスを移植することを含み、前記細胞カプセル化デバイス内にカプセル化された細胞がＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞の集団を含み、そして前記膵臓内胚葉細胞が成長してインスリン分泌細胞になり、これにより血糖値を低下させる。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様４０」）によれば、前記ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が、内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞をさらに含む細胞の混合物を含み、前記内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞がクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を発現させる。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様４１」）によれば、請求項１に記載の細胞カプセル化デバイスを移植することを含み、前記細胞カプセル化デバイス内にカプセル化された細胞がＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞の集団を含み、そして前記膵臓内胚葉細胞が成長してインスリン分泌細胞になり、これにより血糖値を低下させる。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様４２」）によれば、前記ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が、内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞をさらに含む細胞の混合物を含み、前記内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞がクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を発現させる。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様４３」）によれば、哺乳類の血糖値を低下させる方法が細胞カプセル化デバイスを移植することを含み、前記細胞カプセル化デバイスが、少なくとも１つのセンサと生体適合性メンブレン複合体とを含み、前記生体適合性メンブレン複合体が前記センサを少なくとも部分的に覆い、前記生体適合性メンブレン複合体が、当該第１層が第１固形フィーチャ間隔を備えた第１固形フィーチャを有しており、前記第１固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン未満である、第１層と、当該第２層が第２固形フィーチャ間隔を備えた第２固形フィーチャを有しており、前記第２固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン超である、第２層と、を含み、前記第１層が前記センサと前記第２層との間に位置決めされており、前記結合型フィーチャの少なくとも一部が前記第１層に密接に結合されており、さらに前記細胞カプセル化デバイスが、ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を含み、そして前記膵臓内胚葉細胞が成長してインスリン分泌細胞になり、これにより血糖値を低下させる。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様４４」）によれば、前記ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が、内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞をさらに含む細胞の混合物を含み、前記内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞がクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を発現させる。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様４５」）によれば、哺乳類の血糖値を低下させる方法が、少なくとも１つのセンサ及び生体適合性メンブレン複合体を移植することを含み、前記生体適合性メンブレン複合体が前記センサを少なくとも部分的に覆い、前記生体適合性メンブレン複合体が、当該第１層が第１固形フィーチャ間隔を備えた第１固形フィーチャを有しており、前記第１固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン未満である、第１層と、当該第２層が第２固形フィーチャ間隔を備えた第２固形フィーチャを有しており、前記第２固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン超である、第２層と、を含み、前記第１層が前記センサと前記第２層との間に位置決めされており、前記結合型フィーチャの少なくとも一部が前記第１層に密接に結合されており、さらに前記生体適合性メンブレン複合体が、ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を含み、そして前記膵臓内胚葉細胞が成長してインスリン分泌細胞になり、これにより血糖値を低下させる。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様４６」）によれば、前記ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が、内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞をさらに含む細胞の混合物を含み、前記内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞がクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を発現させる。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様４７」）によれば、カプセル化されたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１を同時発現させる膵臓プロジェニター集団を少なくとも含む細胞亜集団の混合物を含む。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様４８」）によれば、カプセル化されたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１を同時発現させる膵臓プロジェニター集団と、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１及びＣＨＧＡを発現させる膵臓内分泌及び／又は内分泌プリカーサー集団とを少なくとも含む細胞亜集団の混合物を含む。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様４９」）によれば、前記集団の少なくとも３０％が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１を同時発現させる膵臓プロジェニター集団を含む。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様５０」）によれば、前記集団の少なくとも４０％が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１を同時発現させる膵臓プロジェニター集団を含む。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様５１」）によれば、前記集団の少なくとも５０％が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１を同時発現させる膵臓プロジェニター集団を含む。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様５２」）によれば、前記集団の少なくとも２０％が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１／ＣＨＧＡを発現させる内分泌及び／又は内分泌プリカーサー集団である。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様５３」）によれば、前記集団の少なくとも３０％が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１／ＣＨＧＡを発現させる内分泌及び／又は内分泌プリカーサー集団である。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様５４」）によれば、前記集団の少なくとも４０％が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１／ＣＨＧＡを発現させる内分泌及び／又は内分泌プリカーサー集団である。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様５５」）によれば、前記膵臓プロジェニター細胞及び／又は内分泌又は内分泌プリカーサー細胞が、成長してｉｎ ｖｉｖｏのインスリン分泌細胞になることができる。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様５６」）によれば、インスリンをｉｎ ｖｉｖｏで生成する方法が、細胞カプセル化デバイスを移植することを含み、前記細胞カプセル化デバイスが、前の請求項のいずれかに記載の生体適合性メンブレン複合体と、成長してインスリン分泌細胞になるＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞集団とを含み、前記インスリン分泌細胞がグルコース刺激に反応してインスリンを分泌する。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様５７」）によれば、前記ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が、内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞をさらに含む細胞の混合物を含み、前記内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞がクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を発現させる。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様５８」）によれば、前記集団の少なくとも約３０％が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１／ＣＨＧＡを発現させる内分泌及び／又は内分泌プリカーサー集団である。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様５９」）によれば、ｉｎ ｖｉｔｒｏヒトＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞培養物が、ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞と、少なくとも形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－ベータ）受容体キナーゼ阻害物質との混合物を含む。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様６０」）によれば、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害物質をさらに含む。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様６１」）によれば、前記ＴＧＦ－ベータ受容体キナーゼ阻害物質が、ＴＧＦ－ベータ受容体１型キナーゼ阻害物質である。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様６２」）によれば、前記ＴＧＦ－ベータ受容体キナーゼ阻害物質がＡＬＫ５ｉである。

先行の態様のいずれかに加えられる別の態様（「態様６３」）によれば、前記ＢＭＰ阻害物質がノギンである。

添付の図面は、開示内容をさらに理解するために含まれ、本明細書の一部に組み込まれ、そして本明細書の一部を構成し、実施態様を例示し、そして記述と一緒に開示内容の原理を説明するのに役立つ。

図１Ａは、本明細書中に記載された実施態様に基づく固形フィーチャ間隔の判断を示す概略図であり、３つの隣接固形フィーチャが三角形の角を表し、三角形の外接円が、付加的な固形フィーチャのない内部を有しており、固形フィーチャ間隔が、三角形を形成する固形フィーチャのうちの２つの固形フィーチャの間の直線距離である。

図１Ｂは、本明細書中に記載された実施態様に基づく、非隣接固形フィーチャの判断を示す概略図であり、固形フィーチャが三角形の角を表し、三角形の外接円が、少なくとも１つの付加的な固形フィーチャを含有している。

図２は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、ｅＰＴＦＥメンブレン内の固形フィーチャ（白い形状）間の間隔（白い線）を示す走査電子顕微鏡写真である。

図３Ａは、本明細書中に記載された実施態様に基づく、固形フィーチャの長軸と短軸とを判断する方法を示す概略図である。

図３Ｂは、本明細書中に記載された実施態様に基づく、固形フィーチャの深さを示す概略図である。

図４は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、孔の有効直径を示す概略図である。

図５は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、孔サイズを示す走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。

図６Ａは、本明細書中に記載された実施態様に基づく、生体適合性メンブレン複合体によって少なくとも部分的に覆うことができる植え込み型デバイスを概略的に示す断面図である。

図６Ｂは、本明細書中に記載された実施態様に基づく、生体適合性メンブレン複合体によって少なくとも部分的に覆うことができる生物活性スキャフォールドを示す概略図である。

図７は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、生体適合性メンブレン複合体を示す概略図である。

図８は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、別の生体適合性メンブレン複合体を示す概略図である。

図９は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、さらに別の生体適合性メンブレン複合体を示す概略図である。

図１０は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、実施例１のｅＰＴＦＥ緩和層の上面を示す走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。

図１１は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、実施例１で利用される不織布ポリエステルから形成された血管新生層の上面を示す走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）である。

図１２は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、実施例１で利用される材料及び固定具の形態を示す分解図である。

図１３は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、ＦＥＰを有する実施例２の構造Ａ，Ｂ及びＣの第２ｅＰＴＦＥ層を示す代表的なＳＥＭ画像である。

図１４は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、実施例２の構造Ａにおける第２ｅＰＴＦＥメンブレンのノード・フィブリル構造を示す代表的なＳＥＭ画像である。

図１５は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、実施例２の構造Ｂにおける第２ｅＰＴＦＥメンブレンのノード・フィブリル構造を示す代表的なＳＥＭ画像である。

図１６は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、実施例２の構造Ｃにおける第２ｅＰＴＦＥメンブレンのノード・フィブリル構造を示す代表的なＳＥＭ画像である。

図１７は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、実施例２の構造Ａの生体適合性メンブレン複合体の断面を示すＳＥＭ画像である。

図１８は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、実施例２の構造Ｂの生体適合性メンブレン複合体の断面を示すＳＥＭ画像である。

図１９は、本明細書中に記載された実施態様に基づく、実施例２の構造Ｃの生体適合性メンブレン複合体の断面を示すＳＥＭ画像である。

所期機能を発揮するように構成されたあらゆる数の方法及び装置によって、本開示の種々の態様を実現し得ることは当業者には容易に明らかになる。また念のために述べるならば、本明細書中で言及される添付の図面は必ずしも原寸に比例してはおらず、本開示の種々の態様を例示するために誇張されることがあり、またこれに関して図面は限定的なものとして解釈されるべきではない。方向的な言及、例えばとりわけ「上（up）」、「下（down）」、「上（top）」、「左（left）」、「右（right）」、「前（front）」、及び「後ろ（back）」は、当該構成部分及び方向が言及されている図面において示され記された配向を意味するものとする。言うまでもなく、「生体適合性メンブレン複合体」及び「メンブレン複合体」という用語は本明細書中では互いに置き換え可能に使用される。なお、本明細書中に記載されたすべての範囲は本質的に例示的なものであり、その間のありとあらゆる値を含む。加えて、本明細書中に挙げられたすべての参考文献はこれらの全体を参照することにより援用される。

本開示は、異物反応を緩和又は調節し得る環境を提供することができる生体適合性メンブレン複合体に関する。生体適合性メンブレン複合体は第１層と第２層とを含有している。各層は互いに区別可能であり、植え込み型デバイス又は生物活性存在物（例えば生物活性スキャフォールド）の細胞不透過性層上の異物巨細胞の形成を緩和するのを助ける独自の機能のために役立つ。ある特定の実施態様では、第１層は緩和層として機能し、第２層は血管新生層として機能する。本明細書中では便宜上、「第１層」という用語は「緩和層」と互いに置き換え可能に使用され、「第２層」という用語は「血管新生層」と互いに置き換え可能に使用される。緩和層は植え込み型デバイス又は生物活性存在物と血管新生層との間に位置決めされている。少なくとも１つの実施態様では、緩和層は、緩和層を形成するメンブレン内に固有に存在する固形フィーチャ（例えばノード）を含む。生体適合性メンブレン複合体のいずれかの側（すなわち外側）、又は生体適合性メンブレン複合体内部（すなわち内側）に補強構成部分を任意に位置決めすることにより、生体適合性メンブレン複合体に支持を提供し、そして生体適合性メンブレン複合体の歪みを防止することができる。緩和層は植え込み型デバイス及び／又は生物活性存在物に結合（例えば点結合又は溶着）されるようになっていてよい。いくつかの実施態様では、緩和層と血管新生層とを互いに密接に結合又は接続することにより、開放／開放構造を有する複合層を形成することができる。本明細書に使用される「密接な結合」及び「密接に結合された」という用語は、表面上の任意の点で容易には分離又は取り外しできない生体適合性複合体の層、又は生体適合性複合体内部の固形フィーチャを意味する。言うまでもなく、本明細書中に使用される「約」という用語は、指定された測定単位の±１０％を意味する。

少なくとも１つの実施態様では、緩和層と血管新生層とを、１種又は２種以上の生体適合性接着剤によって互いに結合することにより、生体適合性メンブレン複合体を形成する。接着剤は、緩和層、及び血管新生層のうちの一方又は両方の層の表面に、層間の不連続又は密接な結合を形成するように被着することができる。本明細書中に使用される「不連続な結合」又は「不連続に結合された」という表現は、定義された領域の連続的な周辺を巡る点及び／又は線の意図的なパターンを成す結合又は結合部を含むものとする。好適な生体適合性接着剤の一例としては、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、ポリカーボネートウレタン、ＴＦＥ及びＰＡＶＥから成る熱可塑性フルオロポリマー、ＥＦＥＰ（エチレンフッ素化エチレンプロピレン）、ＰＥＢＡＸ（ポリエーテルアミド）、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、Carbosil（登録商標）（abシリコーンポリカーボネートウレタン）、Elasthane（登録商標）（ポリエーテルウレタン）、PurSil（登録商標）（シリコーンポリエーテルウレタン）、ポリエチレン、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、エチレンクロロテトラフルオロエチレン（ＥＣＴＦＥ）、ペルフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

いくつかの実施態様では、本明細書中に記載された生体適合性メンブレン複合体は、体内で生成される分子（例えばグルコース又は他の生物活性分子）又は体外で生成される分子（例えば摂取食物からの分子）を検出するために使用される植え込み型センサのための生体界面として利用することができる。別の実施態様では、生体適合性メンブレン複合体は、体内の分子、信号、又は活動を提供又は要求する植え込み型デバイス、例えばペースメーカーのための生体適合性カバーとして使用することにより、これらの機能を導き出すことができる。植え込み型デバイスを使用することにより、身体の物理的パラメータ、例えば血圧を測定することができる。本明細書中では、「植え込み型デバイス」という用語はあらゆる植え込み型センサ又は植え込み型デバイスを包含するように使用される。他の実施態様では、生体適合性メンブレン複合体は、機能のために血管新生を必要とするものの宿主の免疫反応、例えば異物巨細胞の形成からの保護を必要とする植え込み型デバイスのための表面層として、又は包囲カバーとして使用することができる。植え込み型デバイスはその上に第３層（すなわち細胞不透過性層）を含有してよい。細胞不透過性層は微細孔質の免疫隔離バリアとして役立ち、血管内方成長を受け付けず、宿主からの細胞接触を防止する。別の実施態様では、生体適合性メンブレン複合体は組織、細胞スキャフォールド、又は細胞カプセル化デバイスとの関連において使用されてよい。いくつかの例としては、外植片、二次元（２Ｄ）及び三次元（３Ｄ）細胞培養システム又は細胞容器が挙げられる。「細胞システム」という総称は本明細書中では、生体適合性メンブレン複合体との関連において使用し得る任意の生物学的存在物を記述するために利用される。

生体適合性メンブレン複合体の機能から恩恵を受けることができる植え込み型デバイスのエレメントの一例としては、スイッチ、センサ、ボロメータ、バイオセンサ、化学センサ、慣性センサ、音響センサ、マイクロフォン、マイクロスピーカ、圧力センサ、共振器、超音波共振器、温度センサ、振動センサ、マイクロエンジン、アクチュエータ、熱アクチュエータ、バイモルフ及びユニモルフアクチュエータ（例えば圧電及び熱）、電気回転マイクロマシン、マイクロギア、マイクロポンプ、マイクロトランスミッタ、マイクロエンジン、光学マイクロ電気機械システム（ＭＥＭＳ）、マイクロミラー、光学スイッチ、及び生体マイクロ電気機械システム（ＭＥＭＳ）が挙げられる。

生体適合性メンブレン複合体と植え込み型デバイスとの界面は緩和層である。緩和層は、緩和層内への血管組織の成長を許すのに十分に多孔質である。このようにいくつかの事例では、緩和層は初期血管新生層として作用する。緩和層は、植え込み型デバイスの表面上又は表面近くに、隣接する異物巨細胞層が形成されるのを最小化又は防止するのに好適な環境を形成する一方、血管が植え込み型デバイスの表面にアクセスするのを可能にする。本明細書では、血管内方成長を許すのに十分に大きい開口を有する層を「開放」層と呼ぶことがある。植え込み型デバイスのための酸素及び栄養素の源である血管は、信号が容易に検出され伝達されるように、植え込み型デバイスから距離をおいて形成されることが必要である。信号の非制限的な例は、グルコース、酸素、増殖因子、又は検知又は監視を必要とする任意の被分析物を含む。

緩和層は少なくとも部分的に、固形フィーチャ間隔を有する複数の固形フィーチャを含むことにより特徴付けられる。本明細書中に使用される「固形フィーチャ（solid features）」は、緩和層内部の三次元成分であって、環境力、例えば細胞運動（例えば細胞移動及び内方成長、宿主血管新生／内皮血管形成）に晒されたときに概ね運動不能且つ耐変形性である三次元成分であると定義することができる。緩和層内の固形フィーチャは、熱可塑性ポリマー、ポリウレタン、シリコーン、ゴム、エポキシ、及びこれらの組み合わせから形成されていてよい。

緩和層がノード・フィブリルマイクロ構造（例えばフィブリル化ポリマーから形成される）を有する実施態様では、ノードは固形フィーチャであり、フィブリルは固形フィーチャではない。実際に、いくつかの実施態様では、フィブリルは、緩和層内にノードだけを残して取り除くことができる。緩和層内部のノードが固形フィーチャである実施態様では、これらのノードは、デバイス又はセンサ界面に密接に結合されており、本明細書中ではこれを「結合型固形フィーチャ」と呼ぶ。「非結合型固形フィーチャ」は、デバイス又はセンサ界面に結合（密接に結合又はその他の形で結合）されていない、緩和層内部の固形フィーチャである。１実施態様では、緩和層はノード・フィブリルマイクロ構造を有する延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）メンブレンから形成されている。

植え込み型デバイス又は細胞システムに隣接する固形フィーチャの固形フィーチャ間隔の大部分は、約５０ミクロン未満、約４０ミクロン未満、約３０ミクロン未満、約２０ミクロン未満、又は約１０ミクロン未満である。本明細書中に使用される「大部分」という用語は、測定されるパラメータの測定値の半分を上回る量（すなわち５０％超）を表すものとする。いくつかの実施態様では、固形フィーチャ間隔の大部分は、約５ミクロン～約４５ミクロン、約１０ミクロン～約４０ミクロン、約１０ミクロン～約３５ミクロン、又は約１５ミクロン～約３５ミクロンであってよい。「固形フィーチャ間隔」という表現は、本明細書中では、２つの隣接する固形フィーチャ間の直線距離と定義される。本開示において、固形フィーチャは、これらのセントロイドが三角形の角を表し、この三角形の外接円が空の内部を有する場合に隣接すると考えられる。図１Ａに絵によって示されているように、指定の固形フィーチャ（Ｐ）を隣接固形フィーチャ（Ｎ）に接続することにより、三角形１００が形成されている。三角形において外接円１１０は固形フィーチャを内部に含有しない。固形フィーチャ（Ｘ）は、隣接固形フィーチャではない固形フィーチャを指定している。このように、図１Ａに示された事例では、固形フィーチャ間隔１３０は、指定された固形フィーチャ（Ｐ），（Ｎ）間の直線距離である。対照的に、三角形１６０から描かれた図１Ｂに示された外接円１５０は、固形フィーチャ（Ｎ）を含有しており、そしてこのようなものとして、緩和層（又は血管新生層）内の固形フィーチャ間隔を判断するために利用することはできない。図２は、延伸ポリテトラフルオロエチレンメンブレンから形成された緩和層内の固形フィーチャ２１０（白い形状）間の測定距離、例えば白い線２００を示す走査電子顕微鏡写真である。

固形フィーチャはまた代表短軸、代表長軸、及び固形フィーチャ深さを含む。固形フィーチャの代表短軸は本明細書中では、固形フィーチャにフィットされた楕円形の短軸の長さと定義される。この楕円形は固形フィーチャと同じ面積、配向、及びセントロイドを有する。固形フィーチャの代表長軸は本明細書中では、固形フィーチャにフィットされた楕円の長軸の長さと定義される。この楕円は固形フィーチャと同じ面積、配向、及びセントロイドを有する。長軸は、長さが短軸よりも大きいか又はこれと等しい。固形フィーチャ３１０をフィットさせるための楕円３２０の短軸及び長軸は図３Ａに絵によって示されている。固形フィーチャ３１０の代表短軸は矢印３００によって示され、固形フィーチャ３１０の代表長軸は矢印３３０によって示されている。固形フィーチャの大部分は、約３ミクロン～約２０ミクロン、約３ミクロン～約１５ミクロン、又は約３ミクロン～約１０ミクロンのサイズの短軸を有している。固形フィーチャ深さは、層（例えば緩和層又は血管新生層）の表面に対して垂直な軸における固形フィーチャの投影長さである。固形フィーチャ３１０の固形フィーチャ深さは図３Ｂに絵によって示されている。固形フィーチャ３１０の深さは線３４０によって示されている。少なくとも１つの実施態様では、固形フィーチャ深さは緩和層の厚さと等しいか又はこれよりも小さい。少なくとも１つの実施態様では、層内の代表短軸、代表長軸、及び固形フィーチャ深さのうちの少なくとも２つの大部分が５ミクロン超である。

固形フィーチャがフィブリル又は繊維によって相互接続されている実施態様では、固形フィーチャを相互接続する境界は孔を形成する。これらの孔は、細胞内方成長及び血管新生を許し、且つ酸素及び栄養素の質量輸送に対する抵抗を形成しないほどに十分に開いている。孔有効直径は定量的画像解析（ＱＩＡ）によって測定され、走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）画像上で実施される。孔の「有効直径」という用語は、表面孔の測定面積と等しい面積を有する円の直径と定義される。この関係は以下の等式によって定義される。

図４を参照すると、有効直径は円４００の直径であり、表面孔は符号４２０によって示されている。表面の総孔面積は、その表面のすべての孔の面積の和である。層の孔サイズは、総孔面積のおよそ半分が孔サイズよりも小さな直径を有する孔から成り、且つ総孔面積の半分が孔サイズよりも大きいか又はこれに等しい直径を有する孔から成る、そのポイントを定義する孔の有効直径である。図５は孔サイズ５００（白色）、より小さなサイズの孔５１０（薄灰色）、及びより大きなサイズの孔５２０（濃灰色）を示している。画像のエッジと交差する孔５３０は解析から除外され、黒色で示されている。

緩和層の孔サイズは、走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）画像上で実施される定量的画像解析（ＱＩＡ）によって測定して、有効直径で約１ミクロン～約９ミクロン、有効直径約３ミクロン～有効直径約９ミクロン、又は有効直径約４ミクロン～約９ミクロンであってよい。緩和層の厚さは約２００ミクロン未満、約２９０ミクロン未満、約２８０ミクロン未満、約２７０ミクロン未満、約２６０ミクロン未満、約２００ミクロン未満、約１９０ミクロン未満、約１８０ミクロン未満、約１７０ミクロン未満、約１６０ミクロン未満、約１５０ミクロン未満、約１４０ミクロン未満、約１３０ミクロン未満、約１２０ミクロン未満、約１１０ミクロン未満、約１００ミクロン未満、約９０ミクロン未満、約８０ミクロン未満、約７０ミクロン未満、又は約６０ミクロン未満、約５０ミクロン未満、約４０ミクロン未満、約３０ミクロン未満、約２０ミクロン未満、又は約１０ミクロン未満である。緩和層の厚さは、約６０ミクロン～約２００ミクロン、約６０ミクロン～約１７０ミクロン、約６０～約１５０ミクロン、約６０ミクロン～約１２５ミクロン、約６０ミクロン～約１００ミクロン、約３ミクロン～約６０ミクロン、約１０ミクロン～約５０ミクロン、約１０ミクロン～約４０ミクロン、又は約１５ミクロン～約３５ミクロンであってよい。いくつかの実施態様では、緩和層のポロシティは約６０％超である。他の実施態様では、緩和層のポロシティは約７０％超、約８０％超、約９０％超、又は約９５％超である。いくつかの実施態様では、ポロシティは約９８％、又は約９９％であってよい。緩和層のポロシティは、約６０％～約９８％、約７０％～約９８％、又は約８０％～約９８％であってよい。

植え込み型デバイスを固着し、そして生体適合性メンブレン複合体を通してデバイスの表面まで血管組織を内方成長させることは、第２層（すなわち血管新生層）によってさらに促進される。血管新生層は「開放」層である。この開放層は宿主からの付加的な血管貫通を許し、そしてまた宿主の組織内部に生体適合性メンブレン複合体を迅速に固着させ取り付けるのを許す。加えて、血管新生層は、例えば植え込み型デバイス又は細胞システムへの十分な量の付加的な新血管の成長物を受容するための多孔質マトリックスを提供する。血管新生層が緩和層と同じ基準を満たさない実施態様では、緩和層と血管新生層とは別個の、互いに区別可能な層として考えられる。血管新生層は、宿主への一体化及び取り付けを可能にするための固形フィーチャがあるように構成されている。これらの固形フィーチャは、緩和層の固形フィーチャと比較して、固形フィーチャ間の間隔及び孔サイズが増大しており、これにより、層内への組織のより迅速な内方成長を促進する。

いくつかの実施態様では、血管新生層内の固形フィーチャの固形フィーチャ間隔の大部分は、約５０ミクロン超、約６０ミクロン超、約７０ミクロン超、又は約８０ミクロン超である。血管新生層内の固形フィーチャの大部分の固形フィーチャ間隔は、約５０ミクロン～約９０ミクロン、約６０ミクロン～約９０ミクロン、又は約７０ミクロン～約９０ミクロンである。血管新生層の孔サイズ及び全厚は、栄養素及び酸素を細胞に提供するのに必要な付加的な血管量を有するための空間を提供するのに十分なものである。血管新生層の孔サイズは、ＳＥＭ画像上で実施される定量的画像解析（ＱＩＡ）によって測定して、有効直径で約９ミクロン超、有効直径で約２５ミクロン超、有効直径で約５０ミクロン超、有効直径で約７５ミクロン超、有効直径で約１００ミクロン超、有効直径で約１２５ミクロン超、有効直径で約１５０ミクロン超、有効直径で約１７５ミクロン超、又は有効直径で約２００ミクロン超であってよい。いくつかの実施態様では、血管新生層の孔サイズは、ＳＥＭ画像上で実施される定量的画像解析（ＱＩＡ）によって測定して、有効直径約９ミクロン～有効直径約２００ミクロン、有効直径約９ミクロン～有効直径約５０ミクロン、有効直径約１５ミクロン～有効直径約５０ミクロン、有効直径約２５ミクロン～有効直径約５０ミクロン、有効直径約５０ミクロン～有効直径約２００ミクロン、有効直径約７５ミクロン～有効直径約１７５ミクロンであってよい。

加えて、血管新生層の厚さは、約３０ミクロン超、約５０ミクロン超、約７５ミクロン超、約１００ミクロン超、約１２５ミクロン超、約１５０ミクロン超、又は約２００ミクロン超であってよい。加えて、血管新生層の厚さは、約３０ミクロン～約３００ミクロン、約３０ミクロン～約２００ミクロン、約３０ミクロン～約１００ミクロン、約１００ミクロン～約２００ミクロン、又は約１００ミクロン～約１５０ミクロンであってよい。加えて、血管新生層内の固形フィーチャの大部分の代表短軸は、約４０ミクロン未満、約３０ミクロン未満、約２０ミクロン未満、約１０ミクロン未満、約５ミクロン未満、又は約３ミクロン未満である。いくつかの実施態様では、代表短軸は、約３ミクロン～約４０ミクロン、約３ミクロン～約３０ミクロン、約３ミクロン～約２０ミクロン、約３ミクロン～約１０ミクロン、又は約２０ミクロン～約４０ミクロンであってよい。血管新生層内の固形フィーチャ、例えば不織布の連続繊維はまた、短軸よりも長さが大きい長軸を有しており、長さにおいて事実上制限されなくてよい。血管新生層内の固形フィーチャは、血管新生層の全厚よりも小さいか又は全厚に等しい深さを有している。

ｉｎ ｖｉｖｏの歪みを最小化するために、生体適合性メンブレン複合体に機械的な支持を提供するように、任意の補強構成部分を含むことができる。このような付加的な任意の補強構成部分は生体適合性メンブレン複合体に、生体適合性メンブレン複合体自体よりも大きな剛性を提供する。このような任意の補強構成部分は事実上連続していてもよく、あるいは生体適合性メンブレン複合体上の不連続領域内に存在してもよく、例えば生体適合性メンブレン複合体の表面全体にわたってパターン化されてよく、あるいは特定の位置、例えば生体適合性メンブレン複合体の周辺を巡って配置されてもよい。メンブレン複合体の表面に適した非限定的なパターンはドット、直線、角度付き線、曲線、点線、格子などを含む。補強構成部分を形成するパターンは単独又は組み合わせで使用することができる。加えて、補強構成部分は事実上一時的なもの（例えば生体吸収性材料から形成される）であってよく、又は事実上永久的なもの（例えばポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）メッシュ又はニチノール）であってもよい。構成部分の剛性の最終的な判断は、単一の補強構成部分の剛性にだけ依存するのではなく、最終デバイス形態における補強構成部分の位置及び拘束状態にも依存する。

少なくとも１つの実施態様では、補強構成部分を血管新生層の外面上に設けることにより、生体適合性メンブレン複合体を環境力に対して強化することができる。このような配向において、補強構成部分は、血管内方成長を許すのに十分な孔サイズを有しており、したがって「開放」層と考えられる。補強構成部分として有用な材料は、生体適合性メンブレン複合体よりも著しく高い剛性を有する材料を含む。このような材料の一例としては、開放メッシュ生体材料布地、織布、不織布（例えば繊維又は糸の収集体）、及び繊維性マトリックスが単独又は組み合わせで挙げられる。

いくつかの実施態様では、緩和層と血管新生層とを１種又は２種以上の生体適合性接着剤によって互いに結合することにより、生体適合性メンブレン複合体を形成する。接着剤は、緩和層及び血管新生層のうちの一方又は両方の層の表面に、不連続又は密接な結合を形成するように被着することができる。好適な生体適合性接着剤の非限定的な一例としては、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、ポリカーボネートウレタン、ＴＦＥ及びＰＡＶＥから成る熱可塑性フルオロポリマー、ＥＦＥＰ（エチレンフッ素化エチレンプロピレン）、ＰＥＢＡＸ（ポリエーテルアミド）、ＰＶＤＦ（ポリフッ化ビニリデン）、CarbOsil（登録商標）（abシリコーンポリカーボネートウレタン）、Elasthane（登録商標）（ポリエーテルウレタン）、PurSil（登録商標）（シリコーンポリエーテルウレタン）、ポリエチレン、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）、エチレンクロロテトラフルオロエチレン（ＥＣＴＦＥ）、ペルフルオロアルコキシ（ＰＦＡ）、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。

いくつかの実施態様では、緩和層及び血管新生層のうちの少なくとも一方は、ポリマーメンブレン、又は繊維又は糸の製織又は不織収集体、又は繊維性マトリックスから単独又は組み合わせで形成されてよい。使用し得るポリマーの非限定的な一例としては、アルギネート、セルロースアセテート、ポリアルキレングリコール、例えばポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコール、パンビニル（panvinyl）ポリマー、例えばポリビニルアルコール、キトサン、ポリアクリレート、例えばポリヒドロキシエチルメタクリレート、アガロース、加水分解ポリアクリロニトリル、ポリアクリロニトリルコポリマー、ポリビニルアクリレート、例えばポリエチレン－コ－アクリル酸、ポリアルキレン、例えばポリプロピレン、ポリエチレン、ポリフッ化ビニリデン、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、ペルフルオロアルコキシアルカン（ＰＦＡ）、ポリエステルスルホン（ＰＥＳ）、ポリウレタン、ポリエステル、及びこれらのコポリマー及び組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様では、血管新生層はスパンボンド不織布ポリエステル、又は延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）メンブレンであってよい。

いくつかの実施態様では、緩和層、血管新生層、又は補強構成部分のうちの少なくとも１つが、不織布から形成されている。多くのタイプの不織布があり、そのそれぞれは織りの緻密さ及びシートの厚さを変化させることができる。フィラメント断面は三葉状であってよい。不織布は、製織又は編成以外のプロセスによって製造される接着布地、成形布地、又はエンジニアード布地であってよい。いくつかの実施態様では、不織布は、主として又は全体的に繊維、例えばウェブ、シート、又はバットに集成されたステープルファイバーから成る、通常はフラットシート形態を成す多孔質のテキスタイル様材料である。不織布の構造は、典型的にはランダムに配列された、例えばステープルファイバーの配列に基づいている。加えて、テキスタイル業界において知られている種々の技術によって、不織布を形成することができる。種々の方法は、カーデッド、ウェットレイド、メルトブローン、スパンボンデッド、又はエアレイド不織布材料を形成することができる。方法及び基材が例えばColter他の米国特許出願公開第２０１０／０１５１５７５号明細書に記載されている。１つの実施態様では、不織布はポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）である。別の実施態様では、不織布はスパンボンドポリエステルである。不織布の密度は処理条件に応じて変化してよい。１つの実施態様では、不織布は、坪量が約１０～約２０ｇ／ｍ^２、公称厚が約７５～約１５０ミクロン、そして繊維直径が約２０ミクロン～約４０ミクロンのスパンボンドポリエステルである。フィラメント断面は三葉状である。いくつかの実施態様では、不織布は生体吸収性である。

いくつかの実施態様では、緩和層、及び／又は血管新生層のポリマーメンブレンを形成するポリマーはフィブリル化可能ポリマーである。本明細書中で定義されるフィブリル化可能とは、ポリマーメンブレンにフィブリルを導入する能力、一例としては固形フィーチャ部分をフィブリルへ変換させる能力を意味する。例えば、フィルビルは固形フィーチャ間のギャップを跨ぐ固形エレメントである。フィブリルは概ね、環境力への暴露時の耐変形性を有しておらず、したがって変形可能である。緩和層及び／又は血管新生層内の変形可能なフィルビルの大部分の直径は、約２ミクロン未満、約１ミクロン未満、約０．７５ミクロン未満、約０．５０ミクロン未満、又は約０．２５ミクロン未満であってよい。いくつかの実施態様では、フィブリルの直径は、約０．２５ミクロン～約２ミクロン、約０．５ミクロン～約２ミクロン、又は約０．７５ミクロン～約２ミクロンであってよい。

いくつかの実施態様では、緩和層及び血管新生層のうちの一方又は両方の層の固形フィーチャは、マイクロリソグラフィ、マイクロモールディング、機械加工、選択的堆積、又はポリマー（例えば熱可塑性物質）を緩和層又は血管新生層上に印刷（又はレイダウン）することによって固形フィーチャの少なくとも一部を形成することにより、形成することができる。任意のコンベンショナルな印刷技術、例えば転写被覆、スクリーン印刷、グラビア印刷、インクジェット印刷、パターン化吸収（patterned imbibing）、及びナイフ塗布を利用して、熱可塑性ポリマーを緩和層及び／又は血管新生層上に置くことができる。任意には、パターンをライナー上に印刷し、そして緩和層、血管新生層、又は植え込み型デバイスに被着することができる。

固形フィーチャを形成するために使用される材料の一例としては、熱可塑性物質、ポリウレタン、ポリプロピレン、シリコーン、ゴム、エポキシ、ポリエチレン、ポリエーテルアミド、ポリエーテルエーテルケトン、ポリフェニルスルホン、ポリスルホン、シリコーンポリカーボネートウレタン、ポリエーテルウレタン、ポリカーボネートウレタン、シリコーンポリエーテルウレタン、ポリエステル、ポリエステルテレフタレート、溶融処理可能なフルオロポリマー、例えばフッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）、テトラフルオロエチレン－（ペルフルオロアルキル）ビニルエーテル（ＰＦＡ）、エチレンとテトラフルオロエチレン（ＥＴＦＥ）との交互コポリマー、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）とヘキサフルオロプロピレン（ＨＦＰ）とフッ化ビニリデン（ＴＨＶ）とのターポリマー、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、及びこれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの実施態様では、パターンフィーチャを形成するためにポリテトラフルオロエチレンを使用することができる。さらなる実施態様では、固形フィーチャを別々に形成し、血管新生層又は植え込み型デバイス（図示せず）の表面に付着させることができる。

緩和層、及び血管新生層、及び任意の細胞不透過性層のうちの１つ又は２つ以上の層を形成するために使用することができるフィブリル化可能ポリマーの一例としては、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）ポリマー、例えばポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、延伸ＰＴＦＥ（ｅＰＴＦＥ）、改質ＰＴＦＥ、ＴＦＥコポリマー、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、Sbrigliaの米国特許出願公開第２０１６／００３２０６９号明細書に教示されたポリ（ｐ－キシリレン）（ｅＰＰＸ）、Sbrigliaの米国特許第９，９２６，４１６号明細書に教示された多孔質超高分子量ポリエチレン（ｅＵＨＭＷＰＥ）、Sbrigliaの米国特許第９，９３２，４２９号明細書に教示された多孔質エチレンテトラフルオロエチレン（ｅＥＴＦＥ）、及びSbrigliaの米国特許第９，４４１，０８８号明細書に教示された多孔質フッ化ビニリデン－コ－テトラフルオロエチレン又はトリフルオロエチレン［ＶＤＦ－コ－（ＴＦＥ又はＴｒＦＥ）］ポリマーが挙げられる。

いくつかの実施態様では、フィブリル化可能ポリマーは、フルオロポリマーメンブレン、例えば延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）メンブレンである。延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）（及び他のフィブリル化ポリマー）はノード・フィブリルマイクロ構造を有している。ノード・フィブリルマイクロ構造では、ノードはフィブリルによって相互接続され、孔はメンブレン全体にわたってノード及びフィブリルの間に位置する空間である。本明細書中に使用される「ノード」という用語は、ほとんどがポリマー材料から成る固形フィーチャを意味するものとする。変形可能なフィブリルが存在する場合には、これらのノードは複数のフィブリルの接合部に位置する。いくつかの実施態様では、フィルビルはメンブレンから、例えばプラズマエッチングによって除去することができる。少なくとも１つの実施態様では、延伸ポリテトラフルオロエチレンメンブレンが緩和層、及び血管新生層、及び任意の細胞不透過性層のうちの１つ又は２つ以上の層に使用される。延伸ポリテトラフルオロエチレンメンブレン、例えばGoreの米国特許第３，９５３，５６６号明細書、Bacino他の米国特許第７，３０６，７２９号明細書、Bacinoの米国特許第５，４７６，５８９号明細書、Bacino の国際公開第９４／１３４６９号パンフレット、Branca他の米国特許第５，８１４，４０５号明細書、又はBranca他の米国特許第５，１８３，５４５号明細書に記載された方法に基づき調製された延伸ポリテトラフルオロエチレンメンブレンがここでは使用されてよい。

いくつかの実施態様では、緩和層、及び血管新生層のうちの１つ又は２つ以上の層が、フルオロポリマーメンブレン、一例としては延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）メンブレン、改質ｅＰＴＦＥメンブレン、テトラフルオロエチレン（ＴＦＥ）コポリマーメンブレン、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、又はフッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）メンブレンから形成されてよい。さらなる実施態様では、血管新生層は、織布及び不織布（例えばスパンボンド不織布、メルトブローン繊維材料、電気スパンナノ繊維など）、非フルオロポリマーメンブレン、例えばポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ナノ繊維、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリエチレン、ポリプロピレン、及びポリイミドを含む生体適合性布地を含んでよい。いくつかの実施態様では、血管新生層はスパンボンド不織布ポリエステル、又は延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）メンブレンである。

いくつかの実施態様では、血管新生層及び補強構成部分のうちの１つ又は２つ以上が不浸透性（例えば生分解性）であることが望ましい場合がある。このような事例では、血管新生層及び／又は補強構成部分を形成するために、生分解材料が使用されてよい。生分解性材料の好適な一例としては、ポリグリコリド：トリメチレンカーボネート（ＰＧＡ：ＴＭＣ）、ポリアルファヒドロキシ酸、例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ（グリコリド）、及びポリ（ラクチド－コ－カプロラクトン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリ（カーボネート）、ポリ（ジオキサノン）、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（ヒドロキシバレレート）、ポリ（ヒドロキシブチレート－コ－バレレート）、Sbrigliaの米国特許出願公開第２０１６／００３２０６９号明細書で教示されている延伸ポリパラキシリレン（ｅＰＬＬＡ）、及びこれらのコポリマー及びブレンドが挙げられる。あるいは、血管新生層を生体吸収性材料で被覆してもよく、又は生体吸収性材料を血管新生層中又は血管新生層上に粉末の形態で取り込むこともできる。被膜付き材料は感染部位低減、血管新生化、及び好ましい１型コラーゲン堆積を促進することができる。

生体適合性メンブレン複合体は少なくとも部分的に表面被膜、例えば両性イオン非ファウリング被膜、親水性被膜、又はＣＢＡＳ（登録商標）／ヘパリン被膜（W.L. Gore & Associates, Inc.から商業的に入手可能）を有してよい。表面被膜はこれに加えて又はこの代わりに、抗菌薬、抗体（例えば抗ＣＤ４７抗体（抗線維化））、医薬品、及び生物活性分子（例えば血管新生の刺激因子、例えばＦＧＦ、ＶＥＧＦ、エンドグリン、ＰＤＧＦ、アンジオポエチン、及びインテグリン、抗線維化物質、例えばＴＧＦｂ阻害物質、シロリムス、ＣＳＦ１Ｒ阻害物質、抗炎症／免疫調節薬、例えばＣＸＣＬ１２、及びコルチコステロイド）、及びこれらの組み合わせを含有してもよい。

図６Ａを参照すると、少なくとも１つの実施態様では、生体適合性メンブレン複合体は植え込み型デバイス６００との組み合わせで使用することができる。具体的には、生体適合性メンブレン複合体（図示せず）はエンクロージャ６０５を部分的又は完全に覆うことができる。エンクロージャ６０５は、センサ、ペースメーカー、又は電気的な導線の構成部分６１０を担持するためのパウチ又は容器であってよく、あるいは植え込み型デバイス自体であってもよい。図６Ｂに示された別の実施態様では、生体適合性メンブレン複合体（図示せず）は、細胞システム６２０の外側及び／又は構造エレメント６５０の一部又はすべてを部分的又は完全に覆うことができる。細胞システムの個々の構造エレメント６５０と、細胞システム６２０と一緒に成長する細胞６４０とを示すために、区分６３０が拡大されている。

生体適合性メンブレン複合体７００が図７に示されている。図７に示されているように、生体適合性メンブレン複合体７００は緩和層（すなわち第１層）７２０と、血管新生層（すなわち第２層）７３０とを含む。生体適合性メンブレン複合体７００は、植え込み型デバイス７１０を少なくとも部分的に覆い、包囲し、又は取り囲むために利用することができる。図示の実施態様では、固形フィーチャ７５０を植え込み型デバイス７１０の表面に付着させることにより、緩和層７２０を形成している。本明細書中に使用される「付着させる」は、密接に付着させる又は不連続に付着させることを含むものとする。いくつかの実施態様では、固形フィーチャ７５０は血管新生層７３０内には貫通していない。固形フィーチャ７５０は、本質的に同じ高さ及び幅であり且つ植え込み型デバイス７１０と血管新生層７３０との間に延びるものとして図７に示されてはいるものの、言うまでもなく、これは一例であり、固形フィーチャ７５０は高さ及び／又は幅が様々であってよい。固形フィーチャ７５０間の距離は固形フィーチャ間隔７６０である。

図８は生体適合性複合体８００である。図８に示されているように、生体適合性メンブレン複合体８００は緩和層８２０と、血管新生層８３０とを含む。図示の実施態様の場合、固形フィーチャ８５０は、高さ及び幅が異なるノードであり、そして植え込み型デバイス８１０と血管新生層８３０との間の距離を延びても延びなくてもよい。固形フィーチャ８５０はフィブリル８７０によって接続されている。図８において、固形フィーチャ深さの大部分は、緩和層８２０の総厚よりも小さい。結合可能な固形フィーチャ８８０は植え込み型デバイス８１０の表面に付着させることができる。

図９を参照すると、生体適合性メンブレン複合体９００が示されている。生体適合性メンブレン複合体９００は細胞不透過性層９２０と、血管新生層９３０とを含む。生体適合性メンブレン複合体９００は植え込み型デバイス９１０を少なくとも部分的に覆うか又は包囲することができる。この実施態様では、緩和層９２０内部の固形フィーチャは、延伸ポリテトラフルオロエチレンメンブレンから形成されたノードである。ノード９５０はフィブリル９７０によって相互接続されている。ノード９５０，９８０は緩和層９２０内部に位置決めされている。しかしながら、結合可能な固形フィーチャ又はノード９８０は緩和層９２０内部にあるだけではなく、植え込み型デバイス９１０とも接触しており、植え込み型デバイス９１０に密接に結合することができる。

言うまでもなく、図７～９で説明された実施態様のそれぞれにおいて、細胞システムの代わりに植え込み型デバイスを使用することができ、このような実施態様は本発明の範囲に含まれると考えられる。

試験法
ポロシティ
層のポロシティはここでは層の総体積と比較した、孔空間から成る層体積比率と定義される。ポロシティは下記等式を用いて、固体画分の密度に対する、固体画分とボイド画分とから成る多孔質構造の嵩密度を比較することにより計算される。

質量／面積
試料を（手、レーザー、又はダイによって）既知のジオメトリにカットした。試料の寸法を測定又は検証し、面積をｍ^２で計算した。次いで較正されたスケール上で試料をグラムで秤量した。質量（グラム）を面積（ｍ^２）で割り算することにより、単位面積当たり質量をｇ／ｍ^２で計算した。

厚さ
生体適合性メンブレン複合体内の層の厚さを、断面ＳＥＭ画像の定量的画像解析（ＱＩＡ）によって測定した。メンブレンを接着剤に固定し、液体窒素冷却されたカミソリ刃を使用して手でフィルムをカットし、次いで接着剤を背面に有するフィルムを直立させて、断面が鉛直方向になるようにすることによって、断面ＳＥＭ画像を生成した。次いで試料をEmitech K550Xスパッタコータ（Quorum Technologies Ltd, UKから商業的に入手可能）及び白金ターゲットを使用してスパッタ塗布した。次いでThermo ScientificのFEI Quanta 400走査電子顕微鏡写真を用いて、試料を画像形成した。

次いで、国立衛生研究所（ＮＩＨ）のImageJ 1.51hを使用して、断面ＳＥＭ画像内部の層の厚さを測定した。ＳＥＭによって提供されたスケールに関して画像スケールを設定した。フリーハンドツールを使用して、当該層を単離してクリッピングした。次いで少なくとも１０本の等しい間隔を置いた線を、層厚の方向に描いた。すべての線の長さを測定して平均することにより層厚を定義した。

剛性
未補強及び補強済みのプラスチック及び電気絶縁材料の曲げ特性のためのＡＳＴＭ Ｄ７９０－１７規格試験法に基づいて剛性試験を実施した。この方法を用いて、生体適合性メンブレン複合層及び／又は最終デバイスの剛性を割り出した。

ＡＳＴＭ法の手順Ｂに従い、これは５％超の歪みと、撓みのための１型クロスヘッド位置とを含む。１６ｍｍのスパンと１．６ｍｍの支持体及びノーズビースの半径とを有するように、フィクスチャの寸法を調節した。用いられる試験パラメータは撓みが３．１４ｍｍであり、試験速度が９６．８ｍｍ／ｍｉｎであった。試験幅が標準の１ｃｍとは異なる場合には、線形比によって１ｃｍの試料幅に対して力を正規化した。

荷重を最大撓み時にＮ／ｃｍで報告した。

ＳＥＭ試料の調製
先ず、メンブレン複合体又はメンブレン複合体層を接着剤にハンドリングのために、画像形成しようとする側とは反対の側が接着剤に面する状態で固定することにより、ＳＥＭ試料を調製した。次いでフィルムをカットすることにより、画像形成のためのほぼ３ｍｍ ｘ ３ｍｍの面積を提供した。次いでEmitech K550Xスパッタコータ及び白金ターゲットを使用して試料をスパッタ塗布した。Thermo ScientificのFEI Quanta 400走査電子顕微鏡を使用して、ロバスト解析のための十分な数のフィーチャの可視化を可能にする一方で、それぞれのフィーチャの最小寸法が少なくとも５画素の長さであることを保証する倍率及び解像度で画像を撮影した。

固形フィーチャ間隔
国立衛生研究所（ＮＩＨ）のImageJ 1.51hにおいてＳＥＭ画像を解析することにより、固形フィーチャ間隔を割り出した。ＳＥＭ画像によって提供されたスケールに基づいて画像スケールを設定した。サイズに基づく閾値化／シェーディング及び／又は手動識別の組み合わせによって、フィーチャを識別し単離した。構造が、不連続な固形フィーチャを有する構造とは異なり、連続構造、例えば不織布又はエッチングされた表面から成る事例では、固形フィーチャは、ボイドを取り囲む構造の部分として定義され、固形フィーチャの対応する間隔は、ボイドの一方の側から反対の側へ延びる。フィーチャを単離した後、ドローネ三角形分割法を実施して隣接フィーチャを識別した。画像のエッジを超えて延びる外接円を有する三角形分割は解析から度外視した。隣接フィーチャの最も近いエッジ間に線を引き、その長さを測定することにより、隣接フィーチャ間の間隔を定義した（例えば図１Ａ参照）。

測定されたすべての固形フィーチャ間隔の中央値は、測定された固形フィーチャ間隔の半分以下であり、且つ測定された固形フィーチャ間隔の半分以上である値をマークする。したがって、測定された中央値が何らかの値を上回るか又は下回る場合、測定値の大部分も同様にその値を上回るか又は下回る。このようなものとして、中央値は、固形フィーチャ間隔の大部分を表すための要約統計量として用いられる。

代表短軸及び代表長軸の測定
ＮＩＨのImageJ 1.51hにおいてメンブレン表面ＳＥＭ画像を解析することにより、代表短軸を測定した。ＳＥＭ画像によって提供されたスケールに基づいて画像スケールを設定した。サイズに基づく閾値化／シェーディング及び／又は手動識別の組み合わせによって、フィーチャを識別し単離した。フィーチャを単離した後、組み込まれた粒子分析能力を利用して、代表楕円の長軸及び短軸を割り出した。この楕円の短軸は測定されたフィーチャの代表短軸である。この楕円の長軸は測定されたフィーチャの代表長軸である。測定されたすべての短軸の中央値は、測定された短軸の半分以下であり、且つ測定された短軸の半分以上である値をマークする。同様に、測定されたすべての長軸の中央値は、測定された長軸の半分以下であり、且つ測定された長軸の半分以上である値をマークする。両方の事例において、測定された中央値が何らかの値を上回るか又は下回る場合、測定値の大部分も同様にその値を上回るか又は下回る。このようなものとして、中央値は、代表短軸及び代表長軸の大部分を表すための要約統計量として用いられる。

固形フィーチャ深さ
メンブレン断面のＳＥＭ画像の定量的画像解析（ＱＩＡ）を用いることによって、固形フィーチャ深さを割り出した。フィルムを接着剤に固定し、液体窒素冷却されたカミソリ刃を使用して手でフィルムをカットし、次いで接着剤を背面に有するフィルムを直立させて、断面が鉛直方向になるようにすることによって、断面ＳＥＭ画像を生成した。次いで試料をEmitech K550Xスパッタコータ（Quorum Technologies Ltd, UKから商業的に入手可能）及び白金ターゲットを使用してスパッタ塗布した。次いでThermo ScientificのFEI Quanta 400走査電子顕微鏡写真を用いて、試料を画像形成した。

次いで、国立衛生研究所（ＮＩＨ）のImageJ 1.51hを使用して、断面ＳＥＭ画像内部のフィーチャの深さを測定した。ＳＥＭによって提供されたスケールに関して画像スケールを設定した。サイズに基づく閾値化／シェーディング及び／又は手動識別の組み合わせによって、フィーチャを識別し単離した。フィーチャを単離した後、組み込まれた粒子分析能力を利用して、フェレット直径と、それぞれの固形フィーチャのフェレット直径軸及び水平平面によって定義された軸によって形成された角度とを計算する。フェレット直径は、ＳＥＭ画像の平面内のフィーチャの境界上の任意の２点間の最長距離である。フェレット直径軸は、これら２点によって定義された線である。層厚の方向における各固形フィーチャのフェレット直径の投影を、下記等式によって計算した。

層厚の方向における最長軸の投影は、測定されたフィーチャの固形フィーチャ深さである。測定されたすべての固形フィーチャ深さの中央値は、測定された固形フィーチャ深さの半分以下であり、且つ測定された固形フィーチャ深さの半分以上である値をマークする。したがって、測定された中央値が何らかの値を上回るか又は下回る場合、測定値の大部分も同様にその値を上回るか又は下回る。このようなものとして、中央値は、固形フィーチャ間隔の大部分を表すための要約統計量として用いられる。

孔サイズ
ＮＩＨのImageJ 1.51hにおいてＳＥＭ画像を解析することにより、孔サイズを割り出した。ＳＥＭ画像によって提供されたスケールに基づいて画像スケールを設定した。サイズに基づく閾値化／シェーディング及び／又は手動識別の組み合わせによって、孔を識別し単離した。孔を単離した後、組み込まれた粒子分析能力を利用して、各孔の面積を割り出した。測定された孔面積を下記等式によって、「有効直径」に変換した。

孔面積を合計することにより、孔によって定義された表面の総面積を定義する。これは表面の総孔面積である。層の孔サイズは、総孔面積のおよそ半分が孔サイズよりも小さな直径を有する孔から成り、且つ総孔面積の半分が孔サイズよりも大きいか又はこれに等しい直径を有する孔から成る、そのポイントを定義する孔の有効直径である。

ヒトＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞及び内分泌細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ生成
多能性幹細胞、例えばｈＥＳ及びｉＰＳ細胞に向けられた本明細書中の分化方法は、所望の最終ステージ細胞培養物又は細胞集団（例えばＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞集団（又はＰＥＣ）、又は内分泌プリカーサー細胞集団、内分泌細胞集団、又は未熟ベータ細胞集団、又は成熟内分泌細胞集団）に応じて、少なくとも４又は５又は６又は７ステージに分けて表すことができる。

ステージ１は、多能性幹細胞からの胚体内胚葉の生成であり、これには約２～５日、好ましくは２又は３日かかる。ＲＰＭＩ、ＴＧＦβスーパーファミリーメンバー増殖因子、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８又はＧＤＦ－１１（１００ｎｇ／ｍＬ）、Ｗｎｔファミリーメンバー又はＷｎｔ経路アクチベータ、例えばＷｎｔ３ａ（２５ｎｇ／ｍＬ）、あるいはｒｈｏ－キナーゼ、又はＲＯＣＫ阻害物質、例えばＹ－２７６３２（１０μＭ）を含む培地中に多能性幹細胞を懸濁させることにより、成長、及び／又は生存、及び／又は増殖、及び／又は細胞間接着を促進する。約２４時間後、この培地を、血清、例えば０．２％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ、及びＴＧＦβスーパーファミリーメンバー増殖因子、例えばアクチビンＡ、アクチビンＢ、ＧＤＦ－８又はＧＤＦ－１１（１００ｎｇ／ｍＬ）、あるいはｒｈｏ－キナーゼ、又はＲＯＣＫ阻害物質を含む培地と、さらに２４時間（第１日）～４８時間（第２日）にわたって交換する。あるいは、アクチビン／Ｗｎｔ３ａを含む培地中に約２４時間にわたって培養した後、これらの細胞を次の２４時間中アクチビンだけを含む培地（すなわち培地はＷｎｔ３ａを含まない）中に培養する。重要なのは、胚体内胚葉の生成が、血清含量が低く、ひいてはインスリン又はインスリン様増殖因子の含量も低い細胞培養条件を必要とすることである。McLean et al. (2007) Stem Cells 25: 29-38を参照されたい。McLean他はまた、ステージ１において０．２μｇ／ｍＬという低い濃度でｈＥＳ細胞とインスリンとを接触させると、胚体内胚葉の生成にとって有害であり得ることを示している。さらに他の当業者が、実質的に本明細書及びD’Amour他（２００５）において、そして例えば少なくとも、Agarwal et al., Efficient Differentiation of Functional Hepatocytes from Human Embryonic Stem Cells（ヒト胚幹細胞からの機能的肝細胞の効率的な分化）, Stem Cells (2008) 26:1117-1127; Borowiak et al., Small Molecules Efficiently Direct Endodermal Differentiation of Mouse and Human Embryonic Stem Cells（小分子がマウス及びヒトの胚幹細胞の内胚葉分化を効率的に指向する）, (2009) Cell Stem Cell 4:348-358; Brunner et al., Distinct DNA methylation patterns characterize differentiated human embryonic stem cells and developing human fetal liver（明確なDNAメチル化パターンが、分化されたヒト胚幹細胞及び発生中のヒト胎児肝臓を特徴付ける。）, (2009) Genome Res. 19:1044-1056, Rezania et al. Reversal of Diabetes with Insulin-producing Cells Derived In Vitro from Human Pluripotent Stem Cells（ヒト多能性幹細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導されたインスリン生成細胞による糖尿病の逆転） (2014) Nat Biotech 32(11): 1121-1133 (GDF8 & GSK3beta inhibitor, e.g. CHIR99021);そしてPagliuca et al. (2014) Generation of Function Human Pancreatic B-cell In Vitro（機能ヒト膵臓Ｂ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの発生）, Cell 159: 428-439 (Activin A & CHIR)に記載されているように、ステージ１という多能性幹細胞から胚体内胚葉への分化を改変している。他の内胚葉系列細胞を誘導するためには、胚体内胚葉の適切な分化、仕様、特徴付け、及び識別が必要である。このステージにおける胚体内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７及びＨＮＦ３β（ＦＯＸＡ２）を同時発現させ、そして少なくともＨＮＦ４アルファ、ＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＳＯＸ６、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ３、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＳＣ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、又はＰＰを感知可能なほどには発現させない。胚体内胚葉におけるＨＮＦ４アルファ発現の不在は、詳細には少なくともDuncan et al. (1994), Expression of transcription factor HNF-4 in the extraembryonic endoderm, gut, and nephrogenic tissue of the developing mouse embryo: HNF-4 is a marker for primary endoderm in the implanting blastocyst（発生中のマウス胚の胚体外内胚葉、消化管、及び腎性組織における転写因子ＨＮＦ－４の発現：ＨＮＦ－４は、着床した胚盤胞における初期内胚葉のためのマーカーである）, Proc. Natl. Acad. Sci, 91:7598-7602、及びSi-Tayeb et al. (2010), Highly Efficient Generation of Human Hepatocyte-Like cells from Induced Pluripotent Stem Cells（誘発胚体内胚葉細胞からのヒト肝細胞様細胞の高効率の発生）, Hepatology 51:297-305において支持され詳述されている。

ステージ２はステージ１から胚体内胚葉細胞培養物を取り、そして１：１０００希釈のＩＴＳ中の低血清レベルのＲＰＭＩ、例えば０．２％のＦＢＳ、２５ｎｇのＫＧＦ（又はＦＧＦ７）、あるいはＲＯＣＫ阻害物質を含む懸濁液培養物を２４時間にわたって（第２日～第３日）インキュベートすることによって、前腸内胚葉又はＰＤＸ１－陰性前腸内胚葉を生成した。２４時間後（第３日～第４日）、培地を、同じ培地からＴＧＦβ阻害物質を、あるいはさらにＲＯＣＫ阻害物質を差し引いたものと交換することにより、さらに２４日間（第４日～第５日）～４８時間（第６日）にわたって、細胞の成長、生存、及び増殖を促進する。前腸内胚葉の適切な仕様のための重要なステップが、ＴＧＦβファミリー増殖因子の除去である。したがってＴＧＦβ阻害物質、例えば２．５μＭのＴＧＦβ阻害物質ＮＯ．４、又は５μＭのＳＢ４３１５４２、ＴＧＦβＩ型受容体であるアクチビン受容体様キナーゼ（ＡＬＫ）の特定の阻害物質をステージ２の細胞培養物に添加することができる。ステージ２から生成された前腸内胚葉又はＰＤＸ１－陰性前腸内胚葉細胞は、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ１β及びＨＮＦ４ａｌｐｈａを発現させ、そして少なくともＨＮＦ３β（ＦＯＸＡ２）を感知可能なほどには同時発現させることはなく、またＨＮＦ６、ＰＤＸ１、ＳＯＸ６、ＰＲＯＸ１、ＰＴＦ１Ａ、ＣＰＡ、ｃＭＹＣ、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、ＰＡＸ３、ＡＲＸ、ＮＫＸ２．２、ＩＮＳ、ＧＳＣ、ＧＨＲＬ、ＳＳＴ、又はＰＰを感知可能なほどには同時発現させることもなかった。これらは、胚体内胚葉、ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞、又は膵臓プロジェニター細胞、又は内分泌プロジェニター／プリカーサー、並びに典型的にはポリホルモン型細胞の特質である。

ＰＥＣ生成のためのステージ３（第５日～第８日）は前腸胚体内胚葉細胞培養物を取り、そして１％のＢ２７中のＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ、０．２５μＭのＫＡＡＤシクロパミン、レチノイド、例えば０．２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）又はレチノイン酸類似体、例えば３ｎＭのＴＴＮＰＢ（又はＣＴＴ３、これはＫＡＡＤシクロパミンとＴＴＮＰＢとの組み合わせである）、及び５０ｎｇ／ｍＬのノギン（Noggin）によって、ＰＤＸ１－陽性前腸内胚葉細胞を約２４時間（第７日）～４８時間（第８日）にわたって生成する。具体的には、出願人はおよそ２００３年以来、ＤＭＥＭ高グルコースを使用しており、その時点でのすべての特許及び非特許の開示は、たとえ「ＤＭＥＭ高グルコース」などと述べなくても、ＤＭＥＭ高グルコースを採用した。これは一部は、Gibcoのような製造業者がこれらのＤＭＥＭ、例えばＤＭＥＭ(Cat.No 11960)及びノックアウトＤＭＥＭ(Cat. No 10829)をそのようなものとして命名しなかったからである。注目に値するのは、本出願の出願日時点で、Gibcoはより多くのＤＭＥＭ製品を提供してはいるものの、高グルコースを含有するこれらのＤＭＥＭ製品のうちのある程度の数の製品、例えばノックアウトＤＭＥＭ(Cat. No 10829-018)には未だに「高グルコース」を付けていないことである。したがって、ＤＭＥＭが記載されているそれぞれの事例では、これは高グルコースを有するＤＭＥＭを意味するものとする。このことは、この分野の研究開発を行う他者には明らかであった。ここでもやはりＲＯＣＫ阻害剤又はｒｈｏ－キナーゼ阻害剤、例えばＹ－２７６３２を使用して、成長、生存、増殖を促進し、及び／又は細胞間接着を促進することができる。付加的な物質及び因子の一例としては、アスコルビン酸（例えばビタミンＣ）、ＢＭＰ阻害物質（例えばノギン、ＬＤＮ、コーディン）、ＳＨＨ阻害物質（例えばＳＡＮＴ、シクロパミン、ＨＩＰ１）、及び／又はＰＫＣアクチベータ（例えばＰｄＢｕ、ＴＢＰ、ＩＬＶ）、又はこれらの任意の組み合わせが挙げられる。あるいはステージ３は、ＳＨＨ阻害物質、例えばステージ３のシクロパミンなしで実施される。ステージ３から生成されたＰＤＸ１－陽性前腸内胚葉細胞は、ＰＤＸ１及びＨＮＦ６並びにＳＯＸ及びＰＲＯＸを同時発現させ、そしてステージ１及び２において上述した胚体内胚葉又は前腸内胚葉（ＰＤＸ１－陰性前腸内胚葉）細胞、又はＰＤＸ１－陽性前腸内胚葉細胞を示すマーカーを感知可能なほどには発現させない。

上記ステージ３方法は、ＰＥＣ集団の生成のための４つのステージのうちの１つである。下で詳述する内分泌プロジェニター／プリカーサー及び内分泌細胞を生成するために、ノギンに加えて、ＫＡＡＤ－シクロパミン及びレチノイド、アクチビン、Ｗｎｔ及びヘレグリン、甲状腺ホルモン、ＴＧＦｂ受容体阻害物質、タンパク質キナーゼＣアクチベータ、ビタミンＣ、及びＲＯＣＫ阻害物質を単独且つ／又は組み合わせて使用することにより、ＮＧＮ３の早期発現及びＣＨＧＡ陰性型細胞の増大を抑制する。

ステージ４（およそ第８日～第１４日）のＰＥＣ培地生産はステージ３の培地を取り、そしてこれを、１％ｖｏｌ／ｖｏｌのＢ２７補充物中のＤＭＥＭに加えて５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦ及び５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含有し、そしてあるときには５０ｎｇ／ｍＬのＮｏｇｇｉｎ及びＲＯＣＫ阻害物質をも含有する培地と交換し、この培地はさらにアクチビンを単独で、又はヘレグリントと組み合わせて含む。あるいは、ＫＧＦ、ＲＡ、ＳＡＮＴ、ＰＫＣアクチベータ及び／又はビタミンＣ又はこれらの任意の組み合わせを使用して、ステージ３の細胞をさらに分化することもできる。これらの方法は少なくともＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１、並びにＰＴＦ１Ａを同時発現させる膵臓プロジェニター細胞を生じさせる。これらの細胞は、ステージ１、２及び３において上述した胚体内胚葉又は前腸内胚葉（ＰＤＸ１－陰性前腸内胚葉）細胞を示すマーカーを感知可能なほどには発現させない。

ステージ５の生産は、上記ステージ４のＰＥＣ細胞集団を取り、そしてこれらをさらに分化することによって、内分泌プロジェニター／プリカーサー又はプロジェニター型細胞及び／又は単一ホルモン型又はポリホルモン型の膵臓内分泌型細胞を、１％ ｖｏｌ／ｖｏｌのＢ２７補充物を含むＤＭＥＭ、ノギンＫＧＦ、ＥＧＦ、ＲＯ（ガンマセクレターゼ阻害物質）、ニコチンアミド及び／又はＡＬＫ５阻害物質、又はこれらの任意の組み合わせ、例えばノギンとＡＬＫ５阻害物質との組み合わせを含有する培地中で約１～６日間にわたって（好ましくは約２日間、すなわち第１３～１５日）生成する。あるいは、レチノイン酸（例えばＲＡ又はその類似体）、甲状腺ホルモン（例えばＴ３，Ｔ４又はその類似体）、ＴＧＦｂ受容体阻害物質（ＡＬＫ５阻害物質）、ＢＭＰ阻害物質（例えばノギン、コーディン、ＬＤＮ）、又はガンマセクレターゼ阻害物質（例えばＸＸＩ、ＸＸ、ＤＡＰＴ、ＸＶＩ、Ｌ６８５４５８）、及び／又はベータセルリン、又はこれらの任意の組み合わせを使用して、ステージ４細胞をさらに分化することもできる。ステージ５から生成された内分泌プロジェニター／プリカーサーは、少なくともＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１を同時発現させ、またＣＨＧＡ、ＮＧＮ３及びＮｋｘ２．２をも発現させ、そしてＰＥＣ生産のためのステージ１、２、３及び４において上述した胚体内胚葉又は前腸内胚葉（ＰＤＸ１－陰性前腸内胚葉）を示すマーカーを感知可能なほどには発現させない。

内分泌細胞、内分泌プリカーサー、又は未熟ベータ細胞の細胞培養集団又は適切な比を達成するために、一例としてはＰＤＧＦ＋ＳＳＨ阻害物質（例えばＳＡＮＴ、シクロパミン、ＨＩＰ１）、ＢＭＰ阻害物質（例えばＮｏｇｇｉｎ、Ｃｈｏｒｄｉｎ、ＬＤＮ）、ニコチンアミド、インスリン様増殖因子（例えばＩＧＦ１、ＩＧＦ２）、ＴＴＮＢＰ、ＲＯＣＫ阻害物質（例えばＹ２７６３２）、ＴＧＦｂ受容体阻害物質（例えばＡＬＫ５ｉ）、甲状腺ホルモン（例えばＴ３、Ｔ４及びその類似体）、及び／又はガンマセクレターゼ阻害物質（ＸＸＩ、ＸＸ、ＤＡＰＴ、ＸＶＩ、Ｌ６８５４５８）又はこれらの組み合わせを含む物質又は因子の組み合わせのうちのいずれかを添加することによって、ステージ６及び７をステージ５細胞集団からさらに分化することができる。

ステージ７又は未熟ベータ細胞は内分泌細胞と考えられるが、しかし生理学的にグルコースに反応するのに十分に成熟していてもいなくてもよい。ステージ７未熟ベータ細胞はＭＡＦＢを発現させ得るのに対して、ＭＡＦＡ及びＭＡＦＢを発現させる細胞は、グルコースに生理学的に反応し得る完全に成熟した細胞である。

ステージ１～７の細胞集団はヒト多能性幹細胞（例えばヒト胚幹細胞、誘発多能性幹細胞、例えば現在利用可能な、又は後で開発される遺伝子編集ツール及びアプリケーションのうちのいずれかを使用した、遺伝子操作された幹細胞）に由来し、これらの正確な自然発生の対応細胞型を有していないことがある。それというのも、これらはｉｎ ｖｉｔｒｏで（すなわち人工組織培養で）発生した不死ヒト多能性幹細胞に由来し、ｉｎ ｖｉｖｏの内細胞塊ではない（すなわちｉｎ ｖｉｖｏヒト発生はヒトＥＳ細胞等価物を有しない）からである。

本明細書中に意図された膵臓細胞治療代替物は、ステージ４，５，６又は７の細胞集団のいずれかを使用して、本明細書中に記載されたメンブレンから成る本明細書中に記載されたデバイス内にカプセル化することができ、マクロカプセル化デバイス内にローディングされ、完全に包含され、そして患者内に移植され、そして膵臓内胚葉系列細胞は成熟して膵臓ホルモン分泌細胞、又は膵島、例えばｉｎ ｖｉｖｏ（「ｉｎ ｖｉｖｏ機能」とも呼ばれる）インスリン分泌ベータ細胞になり、血糖に正常に反応することができる。

膵臓内胚葉系列細胞のカプセル化、及びｉｎ ｖｉｖｏのインスリンの生成は、２００９年１１月１３日付けで出願された、ENCAPSULATION OF PANCREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLSと題する米国出願第１２／６１８，６５９号明細書（‘６５９出願）に詳述されている。‘６５９出願は、２００８年１１月１４日に出願されたENCAPSULATION OF PANCREATIC PROGENITORS DERIVED FROM HES CELLSと題する仮特許出願第６１／１１４，８５７号明細書、及び２００８年１２月９日付けで出願されたENCAPSULATION OF PANCREATIC ENDODERM CELLSと題する米国仮特許出願第６１／１２１，０８４号明細書、そして今や米国特許第８，２７８，１０６号明細書及び米国特許第８，４２４，９２８号明細書の優先権を主張する。本明細書に記載された方法、組成物、及びデバイスは現在のところ、好ましい実施態様の代表であり、模範的なものであり、また本発明の範囲を制限するものとしては意図されていない。当業者には本発明の範囲に含まれ、開示の範囲によって定義される変更形及び他の使用が容易に想到される。したがって、本発明の範囲及び思想を逸脱することなしに、本明細書中に開示された本発明に様々な置換及び変更を加え得ることは、当業者には明らかである。

加えて、本明細書中に記載された実施態様は、多能性幹細胞、又はヒト多能性幹細胞のうちのいずれか１つのタイプに限定されることはなく、一例としてはヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞及びヒト誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、又は後で開発される他の多能性幹細胞を含む。本出願の出願時点では、ヒト多能性幹を形成する方法をヒト胚の破壊なしに実施することができ、そしてこのような方法が任意のヒト多能性幹細胞の生成のために予測されることも、当業者によく知られている。

ヒト多能性幹細胞から膵臓細胞系列を生成する方法は実質的に、一例として少なくとも下記に挙げられたもの、つまり、ＰＣＴ／ＵＳ２００７／６２７５５（ＷＯ２００７１０１１３０），ＰＣＴ／ＵＳ２００８／８０５１６（ＷＯ２００９０５２５０５），ＰＣＴ／ＵＳ２００８／８２３５６（ＷＯ２０１００５３４７２），ＰＣＴ／ＵＳ２００５／２８８２９（ＷＯ２００６０２０９１９），ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／３４４２５（ＷＯ２０１５１６０３４８），ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６０３０６（ＷＯ２０１６０８０９４３），ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／６１４４２（ＷＯ２０１８０８９０１１），ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／１５１５６（ＷＯ２０１４１２４１７２），ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／２２１０９（ＷＯ２０１４１３８６９１），ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／２２０６５（ＷＯ２０１４１３８６７１），ＰＣＴ／ＵＳ２００５／１４２３９（ＷＯ２００５１１６０７３），ＰＣＴ／ＵＳ２００４／４３６９６（ＷＯ２００５０６３９７１），ＰＣＴ／ＵＳ２００５／２４１６１（ＷＯ２００６０１７１３４），ＰＣＴ／ＵＳ２００６／４２４１３（ＷＯ２００７０５１０３８），ＰＣＴ／ＵＳ２００７／１５５３６（ＷＯ２００８０１３６６４），ＰＣＴ／ＵＳ２００７／０５５４１（ＷＯ２００７１０３２８２），ＰＣＴ／ＵＳ２００８／６１０５３（ＷＯ２００９１３１５６８），ＰＣＴ／ＵＳ２００８／６５６８６（ＷＯ２００９１５４６０６），ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／１５１５６（ＷＯ２０１４１２４１７２），ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／４１６４８（ＷＯ２０１９０１４３５１），ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／２６５２９（ＷＯ２０１４１６０４１３），ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６４４５９（ＷＯ２０１００５７０３９）を含む、ViaCyte, Inc.に権利譲渡された刊行物、及びd’Amour et al. 2005 Nature Biotechnology 23:1534-41; D'Amour et al. 2006 Nature Biotechnology 24(11):1392-401; McLean et al., 2007 Stem Cells 25:29-38, Kroon et al. 2008 Nature Biotechnology 26(4): 443-452, Kelly et al. 2011 Nature Biotechnology 29(8): 750-756, Schulz et al., 2012 PLos One 7(5):e37004;, and/or Agulnick et al. 2015 Stem Cells Transl. Med. 4(10):1214-22に記載されているように実施された。

ヒト多能性幹細胞から膵臓細胞系列を生成する方法は実質的に、一例として少なくとも下記に挙げられたもの、つまり、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／６８７８２（ＷＯ２００９０６３９９），ＰＣＴ／ＵＳ２００８／７１７７５（ＷＯ２００９４８６７５），ＰＣＴ／ＵＳ２００８／７１７８２（ＷＯ２００９１８４５３），ＰＣＴ／ＵＳ２００８／８４７０５（ＷＯ２００９７０５９２），ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４１３４８（ＷＯ２００９１３２０６３），ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４１３５６（ＷＯ２００９１３２０６８），ＰＣＴ／ＵＳ２００９／４９１８３（ＷＯ２０１０００２８４６），ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６１６３５（ＷＯ２０１００５１２１３），ＰＣＴ／ＵＳ２００９／６１７７４（ＷＯ２０１００５１２２３），ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／４２３９０（ＷＯ２０１１０１１３００），ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／４２５０４（ＷＯ２０１１０１１３４９），ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／４２３９３（ＷＯ２０１１０１１３０２），ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／６０７５６（ＷＯ２０１１０７９０１７），ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／２６４４３（ＷＯ２０１１１０９２７９），ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／３６０４３（ＷＯ２０１１１４３２９９），ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／４８１２７（ＷＯ２０１２０３０５３８），ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／４８１２９（ＷＯ２０１２０３０５３９），ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／４８１３１（ＷＯ２０１２０３０５４０），ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／４７４１０（ＷＯ２０１２０２１６９８），ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／６８４３９（ＷＯ２０１３０９５９５３），ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／２９３６０（ＷＯ２０１３１３４３７８），ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／３９９４０（ＷＯ２０１３１６９７６９），ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／４４４７２（ＷＯ２０１３１８４８８８），ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／７８１９１（ＷＯ２０１４１０６１４１），ＰＣＴＵ／Ｓ２０１４／３８９９３（ＷＯ２０１５０６５５２４），ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／７５９３９（ＷＯ２０１４１０５５４３），ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／７５９５９（ＷＯ２０１４１０５５４６），ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／２９６３６（ＷＯ２０１５１７５３０７），ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／６４７１３（ＷＯ２０１６１０００３５），ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／４１９８８（ＷＯ２０１５００２７２４），ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／２５８４７（ＷＯ２０１７１８０３６１），ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／３７３７３（ＷＯ２０１７２２２８７９），ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／３７３７３（ＷＯ２０１７２２２８７９）；ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０４９０４９（ＷＯ２０１０／００２７８５），ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０６０７７０（ＷＯ２０１１／０７９０１８），ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４２７９６，（ＷＯ２０１５／０６５５３７），ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０７０４１８（ＷＯ２００９／０１２４２８）を含む、Janssenに権利譲渡された刊行物、及びBruin et al. 2013 Diabetologia. 56(9): 1987-98, Fryer et al. 2013 Curr. Opin. Endocrinol. Diabetes Obes. 20(2): 112-7, Chetty et al. 2013 Nature Methods. 10(6):553-6, Rezania et al. 2014 Nature Biotechnologyy 32(11):1121-33, Bruin et al. 2014 Stem Cell Res.12(1): 194-208, Hrvatin 2014 Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 111(8): 3038-43, Bruin et al. 2015 Stem Cell Reports. 5, 1081-1096, Bruin et al.2015 Science Transl. Med., 2015, 7, 316ps23, and/or Bruin et al. 2015 Stem Cell Reports. 14;4(4):605-20に記載されているように実施された。

１実施態様では、好ましい下記条件Ａ及び／又はＢのうちの一方にしたがって、ヒト多能性幹細胞を、膵臓プロジェニター及び内分泌プリカーサーを含むＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞に分化した。

表１凡例:ｒ０．２ＦＢＳ：ＲＰＭＩ １６４０ (Mediatech)；０．２％のＦＢＳ (HyClone)、１ｘ ＧｌｕｔａＭＡＸ－１ (Life Technologies)、１％ｖ／ｖのペニシリン／ストレプトマイシン；ｄｂ：０．５ｘ Ｂ－２７補充物(Life Technologies)で補充されたＤＭＥＭ Ｈｉ グルコース (HyClone)；Ａ１００，Ａ５０，Ａ５：１００ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトアクチビンＡ(R&D Systems)；Ａ５ｉ：１μＭ、５μＭ、１０μＭのＡＬＫ５阻害物質；ＴＴ３：３ｎＭのＴＴＮＰＢ (Sigma-Aldrich）；Ｅ５０：５０ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＥＧＦ (R&D Systems)；ＩＴＳ：１：５０００又は１：１０００で希釈されたインスリン－トランスフェリン－セレニウム(Life Technologies);ＩＶ：２．５ｍＭのＴＧＦ－ｂ ＲＩキナーゼ阻害物質ＩＶ(EMD Bioscience）；Ｋ５０，Ｋ２５：５０ｎｇ／ｍＬ，２５ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトＫＧＦ(R&D Systems、又はPeprotech）；Ｎ５０，Ｎ１００：５０ｎｇ／ｍＬ又は１００ｎｇ／ｍＬの組み換えヒトノギン(R&D Systems)；Ｗ５０：５０ｎｇ／ｍＬの組み換えマウスＷｎｔ３Ａ (R&D Systems)。

当業者に明らかなように、膵臓プロジェニター又は内分泌細胞及び内分泌プリカーサー細胞を含むＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞又はＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉系列細胞を生成するための他の方法、及び少なくともKroon et al. 2008, Rezania et al. 2014（上記参照）及び Pagliuca et al. 2014 Cell159(2):428-439（上記参照）に記載されたＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞も存在し得る。

当業者には明らかなように、ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞の生成のために本明細書中に記載された実施態様は、混合集団又は亜集団の混合から成っている。そして前後軸に沿って発生し、細胞及び組織がそれに従って命名される哺乳類のｉｎ ｖｉｖｏ発生とは異なり、任意の培養容器内の細胞培養物は、このような指向性パターン化を欠いており、したがって具体的には、これらのマーカー発現に基づき特徴付けられている。ゆえに、任意の分化ステージにおける混合型の細胞亜集団はｉｎ ｖｉｖｏでは発生しない。したがってＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞培養物の一例としては、ｉ） 内分泌プリカーサー（例えば早期内分泌マーカー、クロモグラニンＡ又はＣＨＧＡによって示される）、ｉｉ） 典型的な膵臓ホルモン、例えばインスリン（ＩＮＳ）、ソマトスタチン（ＳＳＴ）、膵臓ポリペプチド（ＰＰ）、グルカゴン（ＧＣＧ）、又はガストリン、インクレチン、又はコレシストキニン、のいずれかを発現させる単一ホルモン型、ポリホルモン型の細胞、ｉｉｉ） 前膵臓細胞、例えばＰＤＸ－１を発現させるが、しかしＮＫＸ６．１又はＣＨＧＡを発現させない細胞、
ｉｖ） ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１及びＣＨＧＡ（ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１／ＣＨＧＡ）、又は非内分泌細胞、例えばＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１を同時発現させるが、しかしＣＨＧＡ（ＰＤＸ－１＋／ＮＫＸ６．１＋／ＣＨＡ－）を発現させない内分泌細胞、及びｖ） さらに、ＰＤＸ－１、ＮＫＸ６．１又はＣＨＧＡを発現させない細胞（例えばトリプルネガティブ細胞）が挙げられる。

混合型の細胞亜集団を有するこのＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞集団は大抵の場合、少なくともＰＤＸ－１を発現させ、具体的にはＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１を発現させる亜集団を有する。ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１亜集団は「膵臓プロジェニター」、「膵臓上皮」、又は「ＰＥＣ」又はＰＥＣのバージョン、例えばＰＥＣ－０１とも呼ばれている。表１にはステージ４細胞集団が記載されているが、これらの種々の亜集団はステージ４に限定されるものではない。これらの亜集団のうちのあるものは、例えばステージ３という早期に、そしてステージ５，６及び７を含む後期に見出すことができる（未熟ベータ細胞）。それぞれの亜集団の比は、採用される細胞培養の培地条件に応じて変化する。例えば、Agulnick et al. 2015（上記参照）において、７３～８０％のＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１細胞を使用して、概ね７４～８９％の内分泌細胞を含有する膵島様細胞（ＩＣ）にさらに分化し、そしてこれらの４０～５０％は、インスリン（ＩＮＳ）を発現させた。したがって、異なる細胞培養条件が、異なる比の細胞亜集団を発生させることができ、ｉｎ ｖｉｖｏ機能、ひいては血清ｃ－ペプチドレベルに影響を与えることができる。そしてＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉系列細胞培養集団を形成するための修正方法がｉｎ ｖｉｖｏ機能に影響を与えるか否かは、下で詳述するｉｎ ｖｉｖｏ研究を用いてのみ判断することができる。さらに、ある特定の細胞型が形成されておりそして十分に特徴付けられているという理由だけで、このような方法が同じ細胞中間体を生成することを、これも良好に特徴付けられない限り想定することはできず、また想定するべきでもない。

１つの態様では、成熟ベータ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで生成する方法が提供される。少なくともＴＧＦβスーパーファミリーメンバー及び／又は少なくともＴＧＦβスーパーファミリーメンバー及びＷｎｔファミリーメンバー、好ましくはＴＧＦβスーパーファミリーメンバー及びＷｎｔファミリーメンバー、好ましくはアクチビンＡ，Ｂ又はＧＤＦ－８、ＧＤＦ－１１又はＧＤＦ－１５及びＷｎｔ３ａ、好ましくはアクチビンＡ及びＷｎｔ３ａ、好ましくはＧＤＦ－８及びＷｎｔ３ａを用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト多能性幹細胞から誘導されたヒト胚体内胚葉系列細胞を形成することから成る方法。少なくともＫＧＦ、ＢＭＰ阻害物質及びレチノイン酸（ＲＡ）又はＲＡ類似体を用いて、そして好ましくはＫＧＦ、ノギン及びＲＡを用いてＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞を形成する方法。この方法はさらに、甲状腺ホルモン及び／又はＴＧＦｂ－ＲＩ阻害物質、ＢＭＰ阻害物質、ＫＧＦ、ＥＧＦ、甲状腺ホルモン及び／又はタンパク質キナーゼＣアクチベータを用いて、好ましくはノギン、ＫＧＦ及びＥＧＦを用いて、好ましくはこれに加えてＴ３又はＴ４及びＡＬＫ５阻害物質又はＴ３を用いて、又はＴ４単独で、又はＡＬＫ５阻害物質単独で、又はＴ３又はＴ４、ＡＬＫ５阻害物質及びＰＫＣアクチベータ、例えばＩＬＶ、ＴＰＢ及びＰｄＢｕを用いて、ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞を未熟ベータ細胞又はMAFA発現細胞に分化することができる。あるいは好ましくはノギン及びＡＬＫ５ｉを用いて、そしてＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞又はＭＡＦＡ未熟ベータ細胞集団をｉｎ ｖｉｖｏで哺乳類宿主内へ植え込み成熟させることにより、血糖に反応し得るインスリン分泌細胞を含む細胞集団を生成する。

１つの態様では、ＩＮＳ及びＮＫＸ６．１を発現させ、そしてＮＧＮ３をほとんど発現させない単能性ヒト未熟ベータ細胞又はＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が提供される。１実施態様では、単能性ヒト未熟ベータ細胞は成熟ベータ細胞に成熟することができる。１実施態様では、単能性ヒト未熟ベータ細胞はさらに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでＭＡＦＢを発現させる。１実施態様では、未熟ベータ細胞はＩＮＳ、ＮＫＸ６．１及びＭＡＦＡを発現させ、そしてＮＧＮ３をほとんど発現させない。

１つの態様では、少なくともＣＨＧＡ（又はＣＨＧＡ＋）を発現させる膵臓内胚葉系列細胞は内分泌細胞を意味し、そしてＣＨＧＡ（又はＣＨＧＡ－）を発現させない膵臓内胚葉細胞は非内分泌細胞を意味する。別の態様では、これらの内分泌亜集団及び非内分泌亜集団は多能性プロジェニター／プリカーサー亜集団、例えば非内分泌多能性膵臓プロジェニター亜集団又は内分泌多能性膵臓プロジェニター亜集団であってよく、あるいはこれらは単能性亜集団、例えば未熟内分泌細胞、好ましくは未熟ベータ細胞、未熟グルカゴン細胞、及びこれに類するものであってよい。

１つの態様では、膵臓内胚葉細胞集団又はＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞集団（ステージ４）の１０％超、好ましくは２０％、３０％、４０％超、そしてより好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％超、又は１００％が非内分泌（ＣＨＧＡ－）多能性プロジェニター亜集団であり、この亜集団は成熟インスリン分泌細胞を生じさせ、哺乳類宿主内へ植え込まれるとｉｎ ｖｉｖｏでグルコースに反応する。

１実施態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの多能性幹細胞を実質的に膵臓内胚葉培養物に分化し、そしてさらに膵臓内胚葉培養物をｉｎ ｖｉｔｒｏの内分泌細胞又は内分泌プリカーサー細胞に分化するための組成物及び方法を提供する。１つの態様では、内分泌細胞又は内分泌プリカーサー細胞はＣＨＧＡを発現させる。１つの態様では、内分泌細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでインスリンを生成することができる。１つの態様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏ内分泌インスリン分泌細胞は、グルコース刺激に反応してインスリンを生成することができる。１つの態様では、細胞集団中の細胞の１０％超、好ましくは２０％、３０％、４０％超、そしてより好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％超、又は１００％が内分泌細胞である。

本明細書中に記載された実施態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの多能性ヒト幹細胞を内分泌細胞に分化する組成物及び方法を提供する。１つの態様では、内分泌細胞はＣＨＧＡを発現させる。１つの態様では、内分泌細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏでインスリンを生成することができる。１つの態様では、内分泌細胞は未熟内分泌細胞、例えば未熟ベータ細胞である。１つの態様では、ｉｎ ｖｉｔｒｏインスリン生成細胞は、グルコース刺激に反応してインスリンを生成することができる。

１実施態様は哺乳類においてｉｎ ｖｉｖｏでインスリンを生成する方法であって、この方法が（ａ） 膵臓内胚葉細胞又は内分泌細胞又は内分泌プリカーサー細胞集団を植込み型半透過性デバイス内へローディングし、（ｂ） 細胞集団を有するデバイスを哺乳類宿主内へ植え込み、そして（ｃ）ｉｎ ｖｉｖｏのデバイス内で細胞集団を成熟させ、内分泌細胞のうちの少なくともいくつかは、ｉｎ ｖｉｖｏでグルコース刺激に反応してインスリンを生成するインスリン分泌細胞であり、これにより哺乳類のｉｎ ｖｉｖｏでインスリンを生成することを含む、方法を提供する。１つの態様では、内分泌細胞は、より高レベルの非内分泌多能性膵臓プロジェニター亜集団（ＣＨＧＡ－）を用いて、ＰＥＣを含む細胞組成物から誘導される。別の態様では、内分泌細胞は、低減された内分泌亜集団（ＣＨＧＡ＋）を用いて、ＰＥＣを含む細胞組成物から誘導される。別の態様では、内分泌細胞は未熟内分泌細胞、好ましくは未熟ベータ細胞である。

１つの態様では、多能性幹細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された内分泌細胞は、ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉集団、又はＰＤＸ１／ＮＫＸ６．１陽性である非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団と比較してより多くのＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現させる。１つの態様では、多能性幹細胞からｉｎ ｖｉｔｒｏで形成された内分泌細胞は、ＰＥＣ非内分泌多能膵臓プロジェニター亜集団（ＣＨＧＡ－）よりも比較的多くＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現させる。１つの態様では、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）及びレチノイン酸（ＲＡ）類似体を単独又は組み合わせで細胞培養物に添加することによって、内分泌細胞を得た。内分泌細胞は、ＰＥＣ非内分泌多能性膵臓プロジェニター亜集団（ＣＨＧＡ－）と比較してＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現を増大させる。１つの態様では、ＢＭＰは、ＢＭＰ２、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８及びＢＭＰ４を含む群から選択され、より好ましくはＢＭＰ４から選択される。１つの態様では、レチノイン酸は、オールトランスレチノイン酸、及びＴＴＮＰＢ（４－［（Ｅ）－２－（５，６，７，８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル－２－ナフタレニル）－ｌ－プロペニル］安息香酸アロチノイド酸）、又は０．１～１０μＭのＡＭ－５８０（４－［（５，６，７，８－テトラヒドロ－５，５，８，８－テトラメチル－２－ナフタレニル）カルボキサミド］安息香酸）を含む群から選択され、より好ましくはＴＴＮＰＢである。

１実施態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの多能性幹細胞を内分泌細胞及び未熟内分泌細胞、好ましくは未熟ベータ細胞に分化するための方法であって、凝集体を解離及び再結合することを含む方法を提供する。１つの態様では、解離及び再結合はステージ１、ステージ２、ステージ３、ステージ４、ステージ５、ステージ６、又はステージ７、又はこれらの組み合わせで発生する。１つの態様では、胚体内胚葉、ＰＤＸ１－陰性前腸内胚葉、ＰＤＸ１－陽性前腸内胚葉、ＰＥＣ、及び／又は内分泌及び内分泌プロジェニター／プリカーサー細胞は解離されそして再結合される。１つの態様では、ステージ７の解離・再結合された細胞凝集体は、内分泌（ＣＨＧＡ＋）亜集団と比較して少ない非内分泌（ＣＨＧＡ－）亜集団から成る。１つの態様では、細胞集団中の細胞の１０％超、好ましくは２０％、３０％、４０％超、そしてより好ましくは５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％超、又は１００％が内分泌（ＣＨＧＡ＋）細胞である。

１実施態様は、ステージ４のＰＥＣ生成中に形成された内分泌細胞を除去し、これによりＰＤＸ１＋及びＮＫＸ６．１＋である非内分泌多能性膵臓プロジェニター（ＣＨＧＡ－）亜集団を富化することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏの多能性幹細胞を内分泌細胞に分化するための方法を提供する。

１実施態様では、ステージ３及び／又はステージ４でノギンファミリーメンバーを添加しないことによって、非内分泌多能性プロジェニター亜集団(CHGA-)を富化されたＰＥＣ培養物を形成する。１実施態様では、ステージ３及び／又はステージ４でノギンファミリーメンバーを添加しないことによって、内分泌系列（ＣＨＧＡ＋）に関わる細胞が比較的豊富なＰＥＣ培養物を形成する。１つの態様では、ノギンファミリーメンバーは、ノギン、コーディン、ホリスタチン、ホリスタチン様タンパク質、サーベラス、ココ（Coco）、ダン（Dan）、グレムリン、スクレロスチン、ＰＲＤＣ（ダン及びサーベラスに関連するタンパク質）を含む群から選択された化合物である。

１実施態様は、外因性高レベルグルコースを含む培地内で内分泌細胞を培養することにより、培養物中に内分泌細胞を維持するための方法であって、添加される外因性グルコースが約１ｍＭ～２５ｍＭ、約１ｍＭ～２０ｍＭ、約５ｍＭ～１５ｍＭ、約５ｍＭ～１０ｍＭ、約５ｍＭ～８ｍＭである、方法を提供する。１つの態様では、培地はＤＭＥＭ、ＣＭＲＬ又はＲＰＭＩを基剤とする培地である。

１実施態様は、細胞凝集体の解離及び再結合を伴って、そして伴わずにｉｎ ｖｉｔｒｏの多能性幹細胞を分化するための方法を提供する。１つの態様では、非解離の、又は解離・再結合済みの細胞凝集体をステージ６及び／又はステージ７において、内分泌細胞のｉｎ ｖｉｖｏ機能に影響を及ぼすことなしに冷凍保存又は凍結する。１つの態様では冷凍保存された内分泌細胞培養物を解凍し、培養し、そして移植時にｉｎ ｖｉｖｏで機能する。

別の実施態様は、多能性幹細胞を分化するための培養システムであって、培養システムが、早期の分化ステージ中に内分泌遺伝子発現を抑制又は阻害することができる物質と、後期分化ステージ中に内分泌遺伝子発現を誘発することができる物質とを少なくとも含む、培養システムを提供する。１つの態様では、内分泌遺伝子発現を抑制又は阻害することができる物質を、膵臓ＰＤＸ１陰性前腸細胞から成る培養システムに添加する。１つの態様では、ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉プロジェニター又はＰＥＣから成る培養システムに、内分泌遺伝子発現を誘発することができる物質を添加する。１つの態様では、内分泌遺伝子発現を抑制又は阻害することができる物質が、ＴＧＦベータ受容体ファミリーを活性化する物質であり、好ましくはこれはアクチビンであり、好ましくはこれは高レベルのアクチビン、及びこれに続く低レベルのアクチビンである。１つの態様では、内分泌遺伝子発現を誘発することができる物質は、Ｎ－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェナセチル－Ｌ－アラニル）］－Ｓ－フェニルグリシンｔ－ブチルエステル（ＤＡＰＴ）、ＲＯ４４９２９０９７、ＤＡＰＴ（Ｎ－［Ｎ－（３，５－ジフルオロフェナセチル－Ｌ－アラニル）］－Ｓ－フェニルグリシンｔ－ブチルエステル）、１－（Ｓ）－エンド－Ｎ－（１，３，３）－トリメチルビシクロ［２．２．１］ヘプト－２－イル）－４－フルオロフェニルスルホンアミド、ＷＰＥ－ＩＩＩ３１Ｃ、Ｓ－３－［Ｎ′－（３，５－ジフルオロフェニル－アルファ－ヒドロキシアセチル）－Ｌ－アラニリル］アミノ－２，３－ジヒドロ－１－メチル－５－フェニル－１Ｈ－１，４－ベンゾジアゼピン－２－オン、（Ｎ）－［（Ｓ）－２－ヒドロキシ－３－メチル－ブチリル］－１－（Ｌ－アラニニル）－（Ｓ）－１－アミノ－３－メチル－４，５，６，７－テトラヒドロ－２Ｈ－３－ベンズアゼピン－２－オン、ＢＭＳ－７０８１６３（アバガセスタット）、ＢＭＳ－７０８１６３、セマガセスタット（ＬＹ４５０１３９）、セマガセスタット（ＬＹ４５０１３９）、ＭＫ－０７５２、ＭＫ－０７５２、ＹＯ－０１０２７、ＹＯ－０１０２７（ジベンズアゼピン、ＤＢＺ）、ＬＹ－４１１５７５、ＬＹ－４１１５７５、又はＬＹ２８１１３７６から成る群から選択されたガンマセクレターゼ阻害物質である。１つの態様では、高レベルのアクチビンとは、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、及び７５ｎｇ／ｍＬを上回るレベルを意味する。１つの態様では、ステージ３中、又は膵臓前腸内胚葉細胞の生成前に高レベルのアクチビンを使用する。１つの態様では、低レベルのアクチビンとは、３０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、及び５ｎｇ／ｍＬを下回ることを意味する。１つの態様では、ステージ４中、又はＰＥＣ生成のために、低レベルのアクチビンが使用される。１つの態様では、阻害又は誘発される内分泌遺伝子はＮＧＮ３である。別の態様では、アクチビンＡ及びＷｎｔ３Ａを単独又は組み合わせで使用して内分泌発現を阻害し、好ましくは、膵臓前腸内胚葉細胞の生成前に、又は好ましくはステージ３中にＮＧＮ３発現を阻害する。１つの態様では、ガンマセクレターゼ阻害剤、好ましくはＲＯ４４９２９０９７又はＤＡＰＴを培養システム中に使用して、ＰＥＣ生成後に、又は好ましくはステージ５，６，及び／又は７中に内分泌遺伝子発現を誘発する。

内分泌細胞を含むｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物であって、ヒト細胞の少なくとも５％が、インスリン（ＩＮＳ）、ＮＫ６ホメオボックス１（ＮＫＸ６．１）、膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）、転写因子関連遺伝子座２（ＮＫＸ２．２）、ペアードボックス４（ＰＡＸ４）、神経原性分化１（ＮＥＵＲＯＤ）、フォークヘッドボックスＡ１（ＦＯＸＡ１）、フォークヘッドボックスＡ２（ＦＯＸＡ２）、スネイルファミリー亜鉛フィンガー２（ＳＮＡＩＬ２）、及び筋腱膜繊維肉腫癌遺伝子ファミリーＡ及びＢ（ＭＡＦＡ及びＭＡＦＢ）から成る群から選択された内分泌マーカーを発現させ、そしてニューロジェニン（neurogenin）３（ＮＧＮ３）、アイレット（ｉｓｌｅｔ）１（ＩＳＬ１）、肝細胞核因子６（ＨＮＦ６）、ＧＡＴＡ結合タンパク質４（ＧＡＴＡ４）、ＧＡＴＡ結合タンパク質６（ＧＡＴＡ６）、膵臓特異的転写因子１ａ（ＰＴＦ１Ａ）及びＳＲＹ（性決定領域Ｙ）－９（ＳＯＸ９）から成る群から選択されたマーカーを実質的に発現させることがなく、内分泌細胞が単能性であり、膵臓ベータ細胞に成熟することができる、ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞培養物。

実施例１
２つの不連続層を互いに熱的に結合することにより、二層結合型複合体を形成した。

二層型生体適合性メンブレン複合体の第１層は、Branca他の米国特許第５，８１４，４０５号明細書の教示内容にしたがって調製された延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）（緩和層）であった。図１０に示された走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）画像は、第１層（すなわち緩和層）のｅＰＴＦＥメンブレンの表面の代表的な画像である。このｅＰＴＦＥ層の特性は表１に示されている。第２層は商業的に入手されたスパンボンドポリエステル不織布材料（血管新生層）であった。第３層の代表的な表面構造が図１１のＳＥＭ画像に示されている。この層の特性は表２に示されている。

緩和層と血管新生層とを、これらを互いに隣接した状態で積み重ね、そしてアルミニウムバッキングブロックを備えたアルミニウム緊定リング内部で拘束することにより互いに結合した。血管新生層（不織布層）を、これがアルミニウムバッキングブロックと接触するように配向した。ｅＰＴＦＥメンブレンは緊定フープ内で外方へ向いた。次いで、バッキングブロックを備えた緊定リング内の材料を、２つの鋼板間にサンドイッチし、カーバープレス（carver press）内に入れた。図１２は、使用された材料の形態を示す分解図である。具体的には、材料は、カーバープレス上側プラテン１２２０と、上側鋼板１２４０と、バッキングブロックを備えた緊定リング１２６０と、下側鋼板１２８０と、カーバープレス下側プラテン１２２５とを含んだ。二層型生体適合性メンブレン複合体１２１０は、第１層（緩和層）１２３０と第２層（緩和層）１２５０とを含んだ。

カーバープレスを２３５℃の温度に設定し、そしてカーバープレスプラテンが鋼板と接触するがしかし圧力計に圧力が記録されないように最小限の圧力を加えた。４５秒の滞留時間後に、カーバープレスプラテンからの接触を除去した。緩和層と血管新生層とを緊定リングから取り出すと、これらは生体適合性メンブレン複合体として互いに結合された。

実施例２
それぞれ２つの区別可能な層を有する３つの生体適合性メンブレン複合体をそれぞれ同様に組み立てた。３つの構造は同様の第１層（緩和層）を共有したが、しかし相異なる第２層（血管新生層）を有した。以後３つの異なる生体適合性メンブレン複合体を構造Ａ、構造Ｂ、及び構造Ｃと呼ぶ。

第１延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）メンブレンをBranca他の米国特許第５，８１４，４０５号明細書の教示内容にしたがって調製した。第１ｅＰＴＦＥ層のｅＰＴＦＥテープ前駆体を、融点未満（below-the-melt）機械方向（ＭＤ）延伸工程によって、Branca他の米国特許第５，８１４，４０５号明細書の教示内容にしたがって処理した。第１ｅＰＴＦＥテープ前駆体の融点未満ＭＤ延伸工程中、ＦＥＰフィルムをBacinoの国際公開第９４／１３４６９号パンフレットの教示内容により被着した。第２ｅＰＴＦＥメンブレンのｅＰＴＦＥテープ前駆体を、非晶質ロック工程及び融点超ＭＤ延伸（above-the-melt MD expansion）によって、Branca他の米国特許第５，８１４，４０５号明細書の教示内容にしたがって処理した。テープ前駆体の特性、及び第２層上に施されたＭＤ延伸量は３つの構造間で変動した。第２ｅＰＴＦＥテープ前駆体の第１融点未満ＭＤ延伸工程中に、Bacinoの国際公開第９４／１３４６９号パンフレットの教示内容により、ＦＥＰフィルムを被着した。第２ｅＰＴＦＥメンブレンの延伸済のｅＰＴＦＥテープ前駆体を第１ｅＰＴＦＥメンブレンの延伸済のｅＰＴＦＥテープ前駆体に貼り合わせ、この場合第２ｅＰＴＦＥテープのＦＥＰ側が第１ｅＰＴＦＥメンブレンのｅＰＴＦＥテープ前駆体のＰＴＦＥ側と接触するようにした。

次いでＰＴＦＥの融点を上回る温度で二層型生体適合性メンブレン複合体を機械方向及び横方向に同時延伸した。上にＦＥＰ１３２０を有する第１ｅＰＴＦＥ層の代表的な表面マイクロ構造が、図１３の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）画像に示されている。図１４，図１５及び図１６に示されたＳＥＭ画像は、それぞれ第２ｅＰＴＦＥメンブレン１４００，１５００及び１６００（血管新生層）のノード・フィブリル構造の代表的な画像である。図１７，図１８及び図１９に示されたＳＥＭ画像は、それぞれ第１ｅＰＴＦＥメンブレン１７２０，１８２０及び１９２０（緩和層）と、それぞれ第２ｅＰＴＦＥメンブレン１７４０，１８４０及び１９４０（血管新生層）とを含む二層型生体適合性メンブレン複合体の断面構造の代表的な画像である。

生体適合性メンブレン複合体の特徴付け
生体適合性メンブレン複合体のそれぞれの個別の層を、各層毎の機能の関連パラメータに関して評価し特徴付けた。関連パラメータの特徴付けのために用いられる方法は、上記「試験法」の項に記載された試験法にしたがって実施した。結果を表３に要約する。

本出願の発明を全般的に、そして特定の実施態様に関して説明してきた。当業者に明らかなように、開示の範囲を逸脱することなしに、種々の改変及び変更を実施態様において加えることができる。したがって、実施態様は本発明の改変形及び変更形を、これらが添付の請求項及びこれと同等のものの範囲に含まれる限りカバーするものとする。

Claims (63)

1. 生体適合性メンブレン複合体であって、
   当該第１層が第１固形フィーチャ間隔を備えた第１固形フィーチャを有しており、前記第１固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン未満である、第１層と、
   当該第２層が第２固形フィーチャ間隔を備えた第２固形フィーチャを有しており、前記第２固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン超である、第２層と、
   を含む生体適合性メンブレン複合体。
2. 前記第１層が約３ミクロン～約２０ミクロンの代表短軸を含む、請求項１に記載の生体適合性メンブレン複合体。
3. 前記第２層が有効直径約９ミクロン超の第１孔サイズを有している、請求項１又は２に記載の生体適合性メンブレン複合体。
4. 前記第１層の第１厚が約２００ミクロン未満である、請求項１から３までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
5. 前記第１層が有効直径約１ミクロン～約９ミクロンの第２孔サイズを有している、請求項１から４までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
6. 前記第１層及び第２層のうちの少なくとも一方の層の固形フィーチャがフィブリルによって接続されており、前記フィブリルが変形可能である、請求項５に記載の生体適合性メンブレン複合体。
7. 前記第２層の第２厚が約３０ミクロン～約２００ミクロンである、請求項１から６までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
8. 前記第１層及び第２層のうちの少なくとも一方が、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）メンブレン、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）メンブレン、及び改質延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）メンブレンから選択されたポリマーを含む、請求項１から７までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
9. 前記生体適合性メンブレン複合体が表面被膜を上に含み、前記表面被膜が、抗菌剤、抗体、医薬品、及び生物活性分子から選択された１種又は２種以上の員を含む、請求項１から８までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
10. 前記第１層及び第２層のうちの少なくとも一方が、延伸ポリテトラフルオロエチレンメンブレンである、請求項１から９までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
11. 前記第２層がスパンボンド不織布ポリエステル材料である、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
12. 補強構成部分を含む、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
13. 前記補強構成部分が織布又は不織布である、請求項１２に記載の細胞カプセル化デバイス。
14. 前記第１層がさらに代表短軸、代表長軸、及び固形フィーチャ深さを含み、そして
    前記代表短軸、代表長軸、及び固形フィーチャ深さのうちの少なくとも２つの大部分が約５ミクロン超である、
    請求項１から１３までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
15. 当該第１層が、有効直径約１ミクロン～約９ミクロンの第１孔サイズと、約２００ミクロン未満の第１厚と、第１固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン未満である第１固形フィーチャとを有し、前記第１固形フィーチャの大部分が約３ミクロン～約２０ミクロンの第１代表短軸を有する、第１層と、
    第２層と、
    を含む、生体適合性メンブレン複合体。
16. 前記第２層が、有効直径約９ミクロン超である孔サイズを有している、請求項１５に記載の生体適合性メンブレン複合体。
17. 前記第２層が、第２固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン超である第２固形フィーチャを含む、請求項１５又は請求項１６に記載の生体適合性メンブレン複合体。
18. 前記第２層の第２厚が約３０ミクロン～約２００ミクロンである、請求項１５から１７までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
19. 前記第１層が第１代表長軸と第１固形フィーチャ深さとを含み、そして
    前記第１代表短軸、前記第１代表長軸、及び前記第１固形フィーチャ深さのうちの少なくとも２つが約５ミクロン超である、
    請求項１５から１８までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
20. 前記固形フィーチャがフィブリルによって接続されており、前記フィブリルが変形可能である、請求項１５から１９までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
21. 前記第２層が第２固形フィーチャを含み、そして前記第２固形フィーチャの大部分が、約４０ミクロン未満の第２代表短軸を有している、請求項１５から２０までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
22. 前記第２層が第２代表長軸と第２固形フィーチャ深さとを含み、そして
    前記第２代表短軸、前記第２代表長軸、及び前記第２固形フィーチャ深さのうちの少なくとも２つの大部分が約５ミクロン超である、
    請求項１５から２１までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
23. 前記第１層及び第２層のうちの少なくとも一方が、延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）メンブレン、フッ素化エチレンプロピレン（ＦＥＰ）メンブレン、及び改質延伸ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）メンブレンから選択されたポリマーである、請求項１５から２２までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
24. 前記第２層がスパンボンド不織布ポリエステル材料である、請求項１５から２３までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
25. 前記第１層及び第２層のうちの少なくとも一方が、ポリマー、フルオロポリマーメンブレン、非フルオロポリマーメンブレン、織布、不織布、繊維又は糸の製織又は不織収集体、繊維性マトリックス、及びこれらの組み合わせを含む、請求項１５から２４までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
26. 前記第１層の第１固形フィーチャが、熱可塑性ポリマー、ポリウレタン、シリコーン、ゴム、エポキシ、及びこれらの組み合わせから選択された員を含む、請求項１５から２５までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
27. さらに補強構成部分を含む、請求項１５から２６までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
28. 前記補強構成部分が織布又は不織布である、請求項２７に記載の細胞カプセル化デバイス。
29. 前記生体適合性メンブレン複合体が表面被膜を上に含み、そして前記表面被膜が、抗菌剤、抗体、医薬品、及び生物活性分子から選択された１種又は２種以上の員を含む、請求項１５から２８までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
30. 前記生体適合性メンブレン複合体が親水性被膜を上に含む、請求項１５から２９までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
31. 前記第１層が結合可能な固形フィーチャを含み、前記結合可能な固形フィーチャが植え込み型デバイス又は植え込み型細胞システムに結合されている、請求項１５から３０までのいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体。
32. 前記植え込み型デバイスがスキャフォールドである、請求項３１に記載の生体適合性メンブレン複合体。
33. 前記スキャフォールドが細胞培養マトリックスである、請求項３２に記載の生体適合性メンブレン複合体。
34. 前記スキャフォールドが外植片である、請求項３２に記載の生体適合性メンブレン複合体。
35. 前記第１固形フィーチャが前記細胞システムに少なくとも部分的に結合されている、請求項３１に記載の生体適合性メンブレン複合体。
36. 前記細胞システムが細胞容器である、請求項３５に記載の生体適合性メンブレン複合体。
37. 前記植え込み型デバイスがセンサである、請求項３１に記載の生体適合性メンブレン複合体。
38. 前記細胞システムが生物活性スキャフォールドである、請求項３１に記載の生体適合性メンブレン複合体。
39. 哺乳類の血糖値を低下させる方法であって、前の請求項のいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体を含む細胞カプセル化デバイスを移植することを含み、前記細胞カプセル化デバイス内にカプセル化された細胞がＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞の集団を含み、そして前記膵臓内胚葉細胞が成長してインスリン分泌細胞になり、これにより血糖値を低下させる、哺乳類の血糖値を低下させる方法。
40. 前記ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が、内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞をさらに含む細胞の混合物を含み、前記内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞がクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を発現させる、請求項３９に記載の方法。
41. 前記細胞カプセル化デバイス内にカプセル化された細胞がＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞の集団を含み、そして前記膵臓内胚葉細胞が成長してインスリン分泌細胞になり、これにより血糖値を低下させる、請求項１に記載の哺乳類の血糖値を低下させる方法。
42. 前記ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が、内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞をさらに含む細胞の混合物を含み、前記内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞がクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を発現させる、請求項４１に記載の方法。
43. 細胞カプセル化デバイスを移植することを含み、前記細胞カプセル化デバイスが、当該第１層が第１固形フィーチャ間隔を備えた第１固形フィーチャを有しており、前記第１固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン未満である、第１層と、当該第２層が第２固形フィーチャ間隔を備えた第２固形フィーチャを有しており、前記第２固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン超である、第２層と、を含み、前記結合型フィーチャの少なくとも一部が前記第１層に密接に結合されており、さらに前記細胞カプセル化デバイスが、ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団を含み、そして前記膵臓内胚葉細胞が成長してインスリン分泌細胞になり、これにより血糖値を低下させる、前の請求項のいずれか１項に記載の哺乳類の血糖値を低下させる方法。
44. 前記ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が、内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞をさらに含む細胞の混合物を含み、前記内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞がクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を発現させる、請求項４３に記載の方法。
45. 生体適合性メンブレン複合体を移植することを含み、当該第１層が第１固形フィーチャ間隔を備えた第１固形フィーチャを有しており、前記第１固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン未満である、第１層と、当該第２層が第２固形フィーチャ間隔を備えた第２固形フィーチャを有しており、前記第２固形フィーチャ間隔の大部分が約５０ミクロン超である、第２層と、ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞を含む細胞集団と、を含み、そして前記膵臓内胚葉細胞が成長してインスリン分泌細胞になり、これにより血糖値を低下させる、前の請求項のいずれか１項に記載の哺乳類の血糖値を低下させる方法。
46. 前記ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が、内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞をさらに含む細胞の混合物を含み、前記内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞がクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を発現させる、請求項４５に記載の方法。
47. カプセル化されたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１を同時発現させる膵臓プロジェニター集団を少なくとも含む細胞亜集団の混合物を含む、請求項４５又は４６に記載の方法。
48. カプセル化されたｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１を同時発現させる膵臓プロジェニター集団と、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１及びＣＨＧＡを発現させる膵臓内分泌及び／又は内分泌プリカーサー集団とを少なくとも含む細胞亜集団の混合物を含む、請求項４５から４７までのいずれか１項に記載の方法。
49. 前記集団の少なくとも３０％が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１を同時発現させる膵臓プロジェニター集団を含む、請求項４５から４８までのいずれか１項に記載の方法。
50. 前記集団の少なくとも４０％が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１を同時発現させる膵臓プロジェニター集団を含む、請求項４５から４９までのいずれか１項に記載の方法。
51. 前記集団の少なくとも５０％が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１を同時発現させる膵臓プロジェニター集団を含む、請求項４５から５０までのいずれか１項に記載の方法。
52. 前記集団の少なくとも２０％が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１／ＣＨＧＡを発現させる内分泌及び／又は内分泌プリカーサー集団である、請求項４５から５１までのいずれか１項に記載の方法。
53. 前記集団の少なくとも３０％が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１／ＣＨＧＡを発現させる内分泌及び／又は内分泌プリカーサー集団である、請求項４５から５２までのいずれか１項に記載の方法。
54. 前記集団の少なくとも４０％が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１／ＣＨＧＡを発現させる内分泌及び／又は内分泌プリカーサー集団である、請求項４５から５３までのいずれか１項に記載の方法。
55. 前記膵臓プロジェニター細胞及び／又は内分泌又は内分泌プリカーサー細胞が、成長してｉｎ ｖｉｖｏのインスリン分泌細胞になることができる、請求項４５から５４までのいずれか１項に記載の方法。
56. 前の請求項のいずれか１項に記載のインスリンをｉｎ ｖｉｖｏで生成する方法であって、細胞カプセル化デバイスを移植することを含み、前記細胞カプセル化デバイスが、前の請求項のいずれか１項に記載の生体適合性メンブレン複合体と、成長してインスリン分泌細胞になるＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞集団とを含み、前記インスリン分泌細胞がグルコース刺激に反応してインスリンを分泌する、インスリンをｉｎ ｖｉｖｏで生成する方法。
57. 前記ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞が、内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞をさらに含む細胞の混合物を含み、前記内分泌及び／又は内分泌プリカーサー細胞がクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）を発現させる、請求項５６に記載の方法。
58. 前記集団の少なくとも約３０％が、ＰＤＸ－１／ＮＫＸ６．１／ＣＨＧＡを発現させる内分泌及び／又は内分泌プリカーサー集団である、請求項５６又は５７に記載の方法。
59. ｉｎ ｖｉｔｒｏヒトＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞培養物が、ＰＤＸ１－陽性膵臓内胚葉細胞と、少なくとも形質転換増殖因子ベータ（ＴＧＦ－ベータ）受容体キナーゼ阻害物質との混合物を含む、請求項５６から５８までのいずれか１項に記載の方法。
60. 骨形成タンパク質（ＢＭＰ）阻害物質をさらに含む、請求項５６から５９までのいずれか１項に記載の方法。
61. 前記ＴＧＦ－ベータ受容体キナーゼ阻害物質が、ＴＧＦ－ベータ受容体１型キナーゼ阻害物質である、請求項５６から６０までのいずれか１項に記載の方法。
62. 前記ＴＧＦ－ベータ受容体キナーゼ阻害物質がＡＬＫ５ｉである、請求項５６から６１までのいずれか１項に記載の方法。
63. 前記ＢＭＰ阻害物質がノギンである、請求項５６から６２までのいずれか１項に記載の方法。

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