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MXPA02007614A - Uso de proteasas subtilisinas estables en acido para alimento de animales. - Google Patents

Uso de proteasas subtilisinas estables en acido para alimento de animales.

Info

Publication number
MXPA02007614A
MXPA02007614A MXPA02007614A MXPA02007614A MXPA02007614A MX PA02007614 A MXPA02007614 A MX PA02007614A MX PA02007614 A MXPA02007614 A MX PA02007614A MX PA02007614 A MXPA02007614 A MX PA02007614A MX PA02007614 A MXPA02007614 A MX PA02007614A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
protease
residual activity
proteases
activity
incubation
Prior art date
Application number
MXPA02007614A
Other languages
English (en)
Inventor
Peter Rahbek Oestergaard
Original Assignee
Hoffmann La Roche
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoffmann La Roche filed Critical Hoffmann La Roche
Publication of MXPA02007614A publication Critical patent/MXPA02007614A/es

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Abstract

Se describen proteasas estables en acido de la familia de las subtilisinas, su uso en el alimento para animales, aditivos para alimentos y composiciones de alimentos que contienen tales proteasas, y metodos para el tratamiento de proteinas vegetales utilizando tales proteasas.

Description

USO DE PROTEASAS SUBTILISINAS ESTABLES EN ACIDO PARA ALIMENTO DE ANIMALES Campo de la Invención La presente invención se refiere al uso de serina proteasas estables en ácido de la familia de las subtilisinas en alimento para animales (in vivo) , y al uso de tales proteasas para tratar proteínas vegetales ( in vi tro) . Las proteínas son factores nutricionales los cuales son esenciales para los animales y humanos. La mayor parte de la ganadería y muchos seres humanos obtienen las proteínas necesarias de las fuentes de proteínas vegetales. Las fuentes de proteínas vegetales importantes son por ejemplo los cultivos de semillas oleaginosas, legumbres y cereales. Cuando, por ejemplo, la harina de soya es incluida en el alimento de animales mono-gástricos tales como cerdos y aves de corral, no se digiere una proporción significante de los sólidos de la harina de soya. Por ejemplo, la digestibilidad ileal aparente de proteínas en los lechones y cerdos en crecimiento es solo alrededor de 80%. El estómago de los animales mono-gástricos y muchos peces exhibe un pH fuertemente ácido. Sin embargo, la mayor parte de la digestión de proteínas ocurre en el intestino delgado. Por lo tanto, existe la necesidad de una proteasa REF : 140169 estable en ácido que pueda sobrevivir al paso a través del estómago.
Antecedentes de la Invención El uso de proteasas en el alimento para animales, o para tratar proteínas vegetales, es conocido a partir de los siguientes documentos: La patente WO 95/28850 describe i. a. un aditivo de alimento para animales que comprende una fitasa y una enzima proteolítica. Varias enzimas proteolíticas son especificadas en la página 7. La patente WO 96/05739 describe un aditivo enzimático para alimentos que comprende xilanasa y una proteasa. Las proteasas adecuadas se listan en la página 25. La patente WO 95/02044 describe i. a. proteasas derivadas de Aspergillus aculeatus, así como también el uso de las mismas en el alimento para animales. La patente norteamericana No. 3966971 describe un procedimiento para obtener una proteína a partir de una fuente de proteínas vegetales mediante el tratamiento con una fitasa acida y opcionalmente una enzima proteolítica. Las proteasas adecuadas son especificadas en la columna 2. Las patentes norteamericanas Nos. 4073884, 5047240, 3868448, 3823072 y 3683069 describen preparaciones de proteasas derivadas de diversas cepas de Streptomyces y su uso en el alimento para animales. Sin embargo, estas proteasas no son estables en ácido y/o no son proteasas de la familia de las subtilisinas . 5 Breve Descripción de la Invención Ahora se han identificado diversas proteasas, las cuales se encuentra que son muy estables en ácido, y expectativamente de un desempeño mejorado en el alimento para animales. Estas proteasas pertenecen al grupo de las proteasas conocidas como subtilisinas.
Breve Descripción de los Dibujos La presente invención se ilustra adicionalmente por referencia a los dibujos que la acompañan, en los cuales: la figura 1 muestra curvas de estabilidad en diferentes valores de pH, es decir la actividad de proteasa residual de cuatro proteasas (una proteasa estable en ácido de la familia de las subtilisinas derivadas de Bacillus sp.
NCIMB 40484 (PD 498), y tres proteasas de referencia (Sub. Novo, y Sub. Novo (Y217L) , ambas derivadas de Bacillus amyloliquefaciens, y SAVINASEMR) después de la incubación durante 2 horas, a una temperatura de 37 °C; y a valores de pH en la gama de pH 2 a pH 11; la actividad es relativa a la actividad residual después de 2 horas de incubación a pH 9.0, y 5°C; la figura 2 muestra curvas de actividad en diferentes valores de pH, es decir la actividad de proteasa entre pH 3 y pH 11, con relación a la actividad de proteasa en el pH óptimo, de las mismas cuatro proteasas; la figura 3 muestra curvas de actividad en diferentes valores de temperatura a pH 9.0, es decir la actividad de proteasa a pH 9.0 entre 15°C y 80°C, con relación a la actividad de proteasa a la temperatura óptima, de las misas cuatro proteasas; la figura 4 muestra curvas de estabilidad en diferentes valores de pH similares a la figura 1 pero para otras seis proteasas estables en ácido de la familia de las subtilisinas derivadas de Bacillus alcalophilus NCIMB 10438, Fusarium oxysporum IFO 4471, Paecilomyces lilacinus CBS 102449, Aspergillus sp. CBS 102448, Acremonium chrysogenu ATCC 48272, Acremonium kiliense ATCC 20338; la figura 5 muestra curvas de actividad en diferentes valores de pH similares a la figura 2 pero para las mismas proteasas como en la figura 4; y la figura 6 muestra curvas de actividad en diferentes valores de temperatura a pH 9.0 similares a la figura 3 pero para las misma proteasas como en la figura 4.
¡L«j^^^^^ gjA^?Ajdwg*«^^^á¡j^ Descripción Detallada de la Invención El término proteasa utilizado en este documento es una enzima que hidroliza los enlaces peptídicos (tiene actividad de proteasa) . Las proteasas también son llamadas por ejemplo peptidasas, proteinasas, péptido hidrolasas o enzimas proteolíticas . Las proteasas preferidas para el uso de acuerdo con la invención son del tipo endo que actúan internamente en las cadenas de polipéptidos (endopeptidasas) . Las endopeptidasas muestran actividad en los substratos de péptidos bloqueados termmalmente en N y C que son relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. En la definición anterior de proteasa está incluida cualquier enzima que pertenezca al grupo de enzimas EC 3.4 (que incluye cada una de las trece subclases de las mismas) de la lista EC (Enzyme Nomenclature 1992 from NC-IUBMB, 1992) , complementada y actualizada regularmente, ver por ejemplo la red mundial (WWW) en http: //www. chem. qmw. ac. uk/iubmb/enzyme/índex . html . Las proteasas son clasificadas en base a su mecanismo catalítico en las siguientes agrupaciones: serina proteasas (S) , cisteína proteasas (C) , proteasas aspárticas (A) , metaloproteasas (M) , y proteasas desconocidas o aun no clasificadas (U) , ver Handbook of Proteolytic Enzymes, A.J.Barrett, N . D: Rawlings, J.F.Woessner (eds), Academic Press (1998), en particular la parte de la introducción general. El término serina proteasa se refiere a las serina peptidasas y sus clanes como se define en el manual anterior. En la versión de 1998 de este manual, las serina peptidasas y sus clanes son tratadas en los capítulos 1-175. En una modalidad particular, las serina proteasas son peptidasas en las cuales el mecanismo catalítico depende del grupo hidroxilo de un residuo de serina que actúa como el nucleófilo que ataca el enlace peptídico. Los términos subtilisinas o familia de las subtilisinas utilizados en este documento se proponen para incluir todas las serina proteasas del clan SB, en particular la familia S8 de las mismas (el clan SB es tratado en el capítulo 93 del manual anterior) . En las subtilisinas, el orden de la triada catalítica es Asp-His-Ser. La estructura terciaria incluye tanto alfa-hélices y capas beta. El clan SB incluye tanto endopeptidasas como exopeptidasas . Estas peptidasas son conocidas de las bacterias, archea y eukariotes; existe una individual representativa del virus de ADN. Para determinar si una proteasa dada es una subtilisina o no, se hace referencia al manual anterior y los principios indicados en el mismo. Esta determinación se puede llevar a cabo para todos los tipos de proteasas, que sean "—•-'-*-—»-- *********** proteasas de origen natural o de tipo no cultivado; o proteasas diseñadas genéticamente o sintéticas. En la alternativa, los estudios de inhibición se pueden realizar con ISS (el Inhibidor de Subtilisina derivada de Streptomyces), y una subtilisina es definida como una proteasa con hasta 10% de actividad residual cuando se inhibe con un exceso molar de ISS. Esta prueba se puede llevar a cabo como se describe en el ejemplo 8. En las modalidades particulares de esta definición, la subtilisina tiene hasta 8%, hasta 6% o hasta 5% de actividad residual. La expresión ?hasta' se considera igual a la expresión 'menos que o igual que' . La actividad de proteasa se puede medir utilizando cualquier ensayo, en el cual se emplea un substrato, que incluye enlaces peptídicos relevantes para la especificidad de la proteasa en cuestión. De igual manera, el pH del ensayo y la temperatura del ensayo deben ser adaptados a la proteasa en cuestión. Los ejemplos de valores de pH del ensayo son pH 5, 6, 7, 8, 9, 10 u 11. Los ejemplos de temperaturas del ensayo son 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o 70°C. Ejemplos de substratos de proteasa son caseína y substratos pNA, tales como Suc-AAPF-pNA (disponible de por ejemplo Sigma S-7388) . Las letras mayúsculas en este substrato pNA se refieren al código de aminoácidos de una letra. Otro ejemplo es Protazyme AK (caseína reticulada '» •* •* ** teñida con azurina preparada como tabletas por Megazyme T-PRAK) . Para los estudios de actividad en diferentes valores de pH y estabilidad en diferentes valores de pH, se prefiere el substrato pNA, mientras que para los estudios de actividad en diferentes valores de temperatura, se prefiere el sustrato Protazyme AK. Los ejemplos de ensayos de proteasas se describen en la parte experimental. No existen limitaciones sobre el origen de la proteasa para el uso de acuerdo con la invención. De esta manera, el término proteasa incluye no únicamente las proteasas naturales o de tipo no cultivado, sino también cualquier mutante, variación, fragmento, etcétera de las mismas que exhiban actividad de proteasa, así como también proteasas sintéticas, tales como proteasas entremezcladas y proteasas consensúales. Estas proteasas diseñadas genéticamente se pueden preparar como se conoce generalmente en la técnica, por ejemplo mediante la Mutagénesis dirigida al Sitio, mediante la PCR (utilizando un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada como uno de los cebadores en las reacciones PCR), o mediante la Mutagénesis Aleatoria. La preparación de proteínas consensúales se describe en por ejemplo en la patente EP 897985.
Los ejemplos de proteasas estables en ácido de la familia de las subtilisinas para el uso de acuerdo con la invención son (i) las proteasas derivadas de Bacillus sp. NCIMB 40484; Bacillus alcalophilus NCIMB 10438; Fusarium oxysporum IFO 4471; Paecilomyces lilacinus CBS 102449, Aspergillus sp. CBS 102448, Acremonium chrysogenum ATCC 48272, y Acremonium kiliense ATCC 20338; (ii) proteasas de al menos 70, 75, 80, 85, 90 o al menos 95% de identidad de aminoácidos a cualquiera de las proteasas de (i) ; (iii) proteasas de al menos 70, 75, 80, 85, 90 o al menos 95% de identidad con cualquiera de la SEC ID NO: 1, SEC ID NO: 2, SEC ID NO: 3, o SEC ID NO: 4; (iv) proteasas de al menos 70, 75, 80, 85, 90 o al menos 95% de identidad de aminoácidos con cualquiera de la SEC ID NO: 5 (la secuencia completa 1-397, o los fragmentos 28-397 o 118-397 de la misma), SEC ID NO: 6 (la secuencia completa 1-367, o los fragmentos 70-367 o 84-367 de la misma), o SEC ID NO: 7. Para calcular el porcentaje de identidad, se puede utilizar cualquier programa de computadora conocido en la técnica, tal como GAP proporcionada en el paquete de programas GCG versión 8 (Program Manual for the Wisconsin Package, Versión 8, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, EUA 53711) (Needleman, S.B. y Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453. Utilizando el programa GAP con los siguientes ajustes para la comparación de secuencias de polipéptidos: penalidad de creación de GAP de 5.0 y penalidad de extensión de GAP de 0.3. En una modalidad particular, la proteasa para el uso de acuerdo con la invención es una proteasa microbiana, el término microbiano indica que la proteasa se deriva de, o se origina de, un microorganismo, o es un análogo, un fragmento, una variante, un mutante o una proteasa sintética derivada de un microorganismo. Esta se puede producir o expresar en la cepa microbiana original de tipo no cultivado, en otra cepa microbiana o en una planta; es decir el término cubre la expresión de las proteasas de origen natural, de tipo no cultivado, así como también la expresión de cualquier hospedante de proteasas recombinantes, genéticamente diseñadas o sintéticas. El término microorganismo utilizado en este documento incluye Archaea, bacterias, hongos, virus, etcétera. Ejemplos de microorganismos son las bacterias, tales como bacterias del género Bacillus, por ejemplo Bacillus sp. NCIMB No. 40484; Bacillus alcalophilus NCIMB ¡^^ ************ . ****** , 10438; o mutantes o variantes de las mismas que exhiben actividad de proteasa. Los ejemplos adicionales de microorganismos son los hongos, tales como levadura u hongos filamentosos, por ejemplo seleccionados de los géneros Paecilomyces, por ejemplo Paecilomyces lilacinus CBS 102449, Aspergillus, por ejemplo Aspergillus sp. CBS 102448, Acremonium, e.g. Acremonium chrysogenum ATCC 48272, Acremonium kiliense ATCC 20338 o Fusarium, por ejemplo Fusarium oxysporum IFO 4471; o mutantes o variantes de los mismos que exhiben actividad de proteasa. En otra modalidad, la proteasa es una proteasa vegetal. Un ejemplo de una proteasa de origen vegetal es la proteasa derivada del sarcocarpio del melón (Kaneda y colaboradores, J. Biochem. 78, 1287-1296 (1975). El término animal incluye a todos los animales, inclusive a los seres humanos. Ejemplos de animales son no rumiantes y rumiantes tales como vacas, ovejas y caballos. En una modalidad particular, el animal es un animal no rumiante. Los animales no rumiantes incluyen animales mono-gástricos, por ejemplo los cerdos o puercos (que incluyen, pero no están limitados a, lechones, cerdos en crecimiento y cerdas adultas); aves de corral tales como pavos, y pollos (que incluyen, pero no están limitados a, pollos jóvenes, gallinas ponedoras) ; terneros y peces (que incluyen pero no están limitados al salmón) . El término alimento o composición de alimento significa cualquier compuesto, preparación, mezcla o composición adecuada para, o propuesta para la captación por un animal. En el uso de acuerdo con la invención, la proteasa puede ser dada como alimento al animal antes, después o simultáneamente con la dieta. Se prefiere después. En el presente contexto, el término estable en ácido significa que la actividad de proteasa de la enzima proteasa pura, en una dilución que corresponde a A28o = 1.0, y después de la incubación durante 2 horas a 37 °C en el siguiente amortiguador: ácido succínico 100 mM, HEPES 100 mM, CHES 100 mM, CABS 100 M, CaCl2 1 mM, KCl 150 mM, Tritón® X-100 0.01%, pH 3.5, es al menos 40% de la actividad de referencia, medida utilizando el ensayo descrito en el ejemplo 2C en este documento (sustrato: Suc-AAPF-pNA, pH 9.0, 25°C) . En las modalidades particulares de la definición anterior de estabilidad en ácido, la actividad de proteasa es de al menos 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 o al menos 90% de la actividad de referencia.
El término actividad de referencia se refiere a la actividad de proteasa de la misma proteasa, después de la incubación en forma pura, en una dilución que corresponde a A2ßo = 1.0, durante 2 horas a 5°C en el siguiente amortiguador: ácido succínico lOOmM, HEPES lOOmM, CHES lOOmM, CABS lOOmM, CaCl2 lmM, KCl 150mM, Tritón® X-100 0.01%, pH 9.0, en donde la actividad es determinada como se describe anteriormente . En otras palabras, el método para determinar la estabilidad en ácido comprende los siguientes pasos: a) La muestra de proteasa a ser sometida a prueba (en forma pura, A2ßo = 1.0) se divide en dos alícuotas (I y II); b) La alícuota I se incuba durante 2 horas a 37 °C y pH 3.5; c) Se mide la actividad residual de la alícuota I (pH 9.0 y 25°C) ; d) La alícuota II se incuba durante 2 horas a 5°C y pH 9.0; e) Se mide la actividad residual de la alícuota II (pH 9.0 y 25°C) ; f) Se calcula el porcentaje de la actividad residual de la alícuota I con relación a la actividad residual de la alícuota II.
Alternativamente, en la definición anterior de estabilidad en ácido, el valor de pH del amortiguador del paso b) puede ser 2.0, 2.5, 3.0, 3.1, 3.2, 3.3. o 3.4. En otras modalidades alternativas de la definición anterior de estabilidad en ácido con relación a los valores de pH alternativos del amortiguador del paso b) anterior, la actividad de proteasa residual comparada con la referencia es al menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o al menos 50%. En las modalidades alternativas, los valores de pH de 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, o 8.5 se pueden aplicar para el amortiguador del paso d) . En la definición anterior de estabilidad en ácido, el término 2eo = 1.0 significa esta concentración (dilución) de la proteasa pura que da origen a una absorción de 1.0 a 280 nm en una cubeta de longitud de trayectoria de 1 cm con relación a un control del amortiguador. Y en la definición anterior de estabilidad en ácido, el término proteasa pura se refiere a una muestra con una relación de A2ßo/ 26o arriba o igual a 1.70 (ver el ejemplo 2E) , y la cual se mide mediante una exploración de un gel de SDS-PAGE teñido con Coomassie para tener al menos 95% de su intensidad de exploración en la banda que corresponde a la proteasa (ver el ejemplo 2A) . Alternativamente, la relación de A28o/A26o está arriba de o es igual a 1.50, 1.60, 1.65, 1.70, 1.75, 1.80, 1.85, o arriba de o igual a 1.90.
Sin embargo, para los usos de acuerdo con la invención, la proteasa no necesita ser tan pura; ésta puede incluir por ejemplo otras enzimas, aun otras proteasas, caso en el cual podrían ser denominadas una preparación de proteasas. No obstante, una preparación de proteasas bien definida es ventajosa. Por ejemplo, es mucho más fácil de dosificar correctamente a la alimentación una proteasa que es esencialmente libre de la interferencia o contaminación de otras proteasas. El término dosificar correctamente se refiere en particular al objetivo de obtener resultados consistentes y constantes, y la capacidad para optimizar una dosificación en base al efecto deseado. En una modalidad particular, la proteasa, en la forma en la cual se adiciona al alimento, o cuando es incluida en un aditivo para alimentos, está bien definida. Bien definida significa que la preparación de proteasas es al menos 50% pura lo cual se determinada por la cromatografía de exclusión de tamaño (ver el ejemplo 12). En otras modalidades particulares, la preparación de proteasas es al menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 o al menos 95% pura lo cual se determina por este método. Alternativamente, el término bien definido significa que una fraccionación de la preparación de proteasas en una columna de exclusión de tamaño apropiada revela únicamente un componente de proteasa principal.
El trabajador experto sabrá como seleccionar una columna de cromatografía de exclusión de tamaño apropiada. El podría comenzar por la fraccionación de la preparación en por ejemplo una columna HiLoad26/60 Superdex75pg de Amersham Pharmacia Biotech (ver el ejemplo 12). Si los picos no estuvieran separados claramente, él podría tratar diferentes columnas (por ejemplo con un tamaño de partícula de la columna y/o una longitud de la columna corregidos) , y/o corregiría el volumen de la muestra. Por los métodos de tanteo simples y comunes, él llegaría con lo cual a una columna con una resolución suficiente (separación clara de los picos) , en base a que el cálculo de pureza se realiza como se describe en el ejemplo 12. La preparación de proteasas puede ser (a) adicionada directamente al alimento (o utilizada directamente en el proceso de tratamiento de las proteínas vegetales) , o (b) se puede utilizar en la producción de una o más composiciones intermediarias tales como aditivos para alimento o mezclas previas que se adicionan subsecuentemente al alimento (o que se utilizan en el proceso de tratamiento) . El grado de pureza descrito anteriormente se refiere a la pureza de la preparación de proteasas original, si se utiliza de acuerdo con (a) o (b) anteriores. Las preparaciones de proteasas con purezas de este orden de magnitud se pueden obtener en particular utilizando métodos recombinantes de producción, mientras que estas no se obtienen fácilmente y también se sujetan a una variación muy alta de lote a lote cuando la proteasa es producida por métodos de fermentación tradicionales. Esta preparación de proteasas puede ser mezclada naturalmente con otras enzimas. En una modalidad particular, la proteasa para el uso de acuerdo con la invención, además de ser estable en ácido, también tiene una actividad en pH óptimo casi neutral. El término actividad en pH óptimo casi neutral significa uno o más de lo siguiente: Que el pH óptimo está en el intervalo de pH 6.0-11.0 o pH 7.0-11.0 o pH 6.0-10.0 o pH 7.0-10.0 o pH 8.0-11.0 o pH 8.0-10.0 (ver los ejemplos 2B y 7, y las figuras 2 y 5 en este documento) . En otra modalidad particular, la proteasa para el uso de acuerdo con la invención, además de ser estable en ácido, también es termoestable. El término termoestable significa uno o más de lo siguiente: Que la temperatura óptima es al menos 50°C, 52°C, 54°C, 56°C, 58°C, 60°C, 62°C, 64°C, 66°C, 68°C o al menos 70°C, haciendo referencia a los ejemplos 2D y 7 y las figuras 3 y 6 en este documento. En una modalidad particular adicional, la proteasa para el uso de acuerdo con la invención es capaz de solubilizar las proteínas vegetales de acuerdo con el modelo in vi tro del ejemplo 4 en este documento. El término proteínas vegetales utilizado en este documento se refiere a cualquier compuesto, composición, preparación o mezcla que incluye al menos una proteína derivada de o que se origina de un vegetal, que incluye proteínas modificadas y derivados de proteínas. En las modalidades particulares, el contenido de proteínas de las proteínas vegetales es al menos 10, 20, 30, 40, 50, o 60% (p/p). Las proteínas vegetales se pueden derivar de fuentes de proteínas vegetales, tales como legumbres y cereales, por ejemplo materiales de plantas de las familias Fabacea (Leguminosas), Cruciferas, Quenopodea y Poácea, tal como harina de soya, harina de lupino y harina de colza. En una modalidad particular, la fuente de proteína vegetal es un material de una o más plantas de la familia Fabacea, por ejemplo soya, lupino, alverja o fríjol. En otra modalidad particular, la fuente de proteína vegetal es un material de una o más plantas de la familia Quenopodea, por ejemplo remolacha, betabel, espinaca o quinua . Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son colza y col.
La soya es una fuente de proteína vegetal preferida . Otros ejemplos de fuentes de proteína vegetal son cereales tales como cebada, trigo, centeno, avena, maíz, arroz y sorgo. El tratamiento de acuerdo con la invención de las proteínas vegetales con al menos una proteasa estable en ácido de la familia de las subtilisinas da por resultado una solubilización incrementada de las proteínas vegetales. Los siguientes son ejemplos de % de proteínas solubilizadas que se pueden obtener utilizando las proteasas de la invención: Al menos 76.8%, 77.0%, 77.2%, 77.4%, 77.6%, 77.8%, 78.0%, 78.2%, 78.4%, 78.6% o al menos 78.8%, haciendo referencia al modelo in vi tro del ejemplo 4 en este documento. El término solubilización de proteínas significa básicamente poner la(s) proteínas (s) en solución. Esta solubilización puede ser debido a la liberación mediada por proteasas de la proteína a partir de otros componentes de las composiciones naturales usualmente complejas tales como el alimento. La solubilización puede ser medida como un incremento en la cantidad de proteínas solubles, por referencia a una muestra sin tratamiento con proteasas (ver el ejemplo 4 en este documento) .
*** En una modalidad particular de un proceso de tratamiento, la(s) proteasa (s) en cuestión está(n) afectando (o actuando sobre, o ejerciendo su influencia de solubilización sobre las proteínas o fuentes de proteínas vegetales. Para lograr esto, la proteína o fuente de proteína vegetal se suspende típicamente en un solvente, por ejemplo, un solvente acuoso tal como agua y los valores de pH y temperatura se ajustan con respecto a las características de la enzima en cuestión. Por ejemplo, el tratamiento puede tomar lugar en un valor de pH en el cual la actividad relativa de la proteasa real es al menos 50 o 60, o 70, u 80 o 90%. De igual manera, por ejemplo, el tratamiento puede tomar lugar a una temperatura en la cual la actividad relativa de la proteasa real es al menos 50, o 60, o 70, u 80 o 90% (estas actividades relativas son definidas en el ejemplo 2 en este documento) . La reacción enzimática continúa hasta que se obtiene el resultado deseado, después de lo cual puede ser detenida o no mediante la activación de la enzima, por ejemplo mediante un paso de tratamiento térmico. En otra modalidad particular de un proceso de tratamiento de la invención, la acción de la proteasa es sostenida, lo que significa por ejemplo que la proteasa se adiciona a las proteínas o fuentes de proteínas vegetales, pero su influencia de solubilización es como quien dice no conmutada hasta el final cuando se desee, una vez que se establezcan las condiciones de solubilización adecuadas, o una vez que sea desactivado cualquier inhibidor de enzimas, o pudiera haber sido aplicado cualquier otro medio para posponer la acción de la enzima. En una modalidad, el tratamiento es un tratamiento previo del alimento para animales o proteínas vegetales para el uso en el alimento para animales, es decir las proteínas son solubilizadas antes de la captación. El término mejorar el valor nutricional de un alimento para animales significa mejorar la disponibilidad de las proteínas, conduciendo con esto a una extracción incrementada de proteínas, rendimientos más altos de las proteínas y/o utilización mejorada de las proteínas. Por lo tanto, el valor nutricional del alimento es incrementado, y la velocidad del crecimiento y/o ganancia de peso y/o conversión del alimento (es decir, el peso del alimento ingerido con relación a la ganancia de peso) del animal son mejorados . En las modalidades particulares, la ganancia de peso es al menos 101%, 102%, 103%, 104%, 105%, 106%, o al menos 106.6% del control, haciendo referencia al ejemplo 10 en este documento. En las modalidades particulares adicionales, la conversión del alimento es al menos (o no más de) 99%, 98%, 97.5%, 97%, o más de 96.6%. Esto es equivalente a una conversión del alimento de hasta 99%, 98%, 97.5%, 97%, o hasta 96.6%. Nuevamente, se hace referencia al ejemplo 10 en este documento, comparando con el control. La proteasa puede ser adicionada al alimento en 5 cualquier forma, puede ser como una proteasa relativamente pura o puede estar en una mezcla con otros componentes propuestos para la adición al alimento para animales, es decir en la forma de aditivos de alimento para animales, tales como las comúnmente llamadas mezclas previas para 10 alimento para animales.
Aditivos de alimento para animales Además de la proteasa estable en ácido de la familia de las subtilisinas, los aditivos de alimento para animales de la invención contienen al menos una vitamina soluble en grasa, y/o al menos una vitamina soluble en agua y/o al menos un mineral traza y/o al menos un macro-mineral . Además, los ingredientes de los aditivos para alimentos opcionales son agentes colorantes, compuestos de aroma, estabilizadores y/o al menos otra enzima seleccionada entre fitasas EC 3.1.3.8 o 3.1.3.26; xilanasas EC 3.2.1.8; galactanasas EC 3.2.1.89; y/o beta-glucanasas EC 3.2.1.4 (EC se refiere a las Clases de Enzima de acuerdo con la Enzime Nomenclature 1992 de NC-IUBMB, 1992) ver también la red ^^g^¡ gggj^g mundial (www) en http: //www. chem. qmw. ac. u /iubmb/enzyme/index . html . En una modalidad particular, estas otras enzimas son bien definidas (como se define y se ejemplifica 5 anteriormente para las preparaciones de proteasas, i. a. por referencia al ejemplo 12) . Usualmente las vitaminas solubles en grasa y solubles en agua, así como también los minerales traza forman parte de una comúnmente llamada mezcla previa propuesta para la adición al alimento, mientras que los macro-minerales son adicionados usualmente por separado al alimento. Cualquiera de estos tipos de composición, cuando son enriquecidos con una subtilisina estable en ácido de acuerdo con la invención, es un aditivo de alimentos para animales de la invención. 15 En una modalidad particular, el aditivo de alimento para animales de la invención se propone que sea incluido (o prescrito como que debe ser incluido) en las dietas o el alimento de los animales en niveles de 0.01-10.0%; más particularmente 0.05-5.0%; o 0.2-1.0% (% significa g de aditivo por 100 g de alimento) . Esto es en particular para las mezclas previas. Por consiguiente, las concentraciones de los componentes individuales del aditivo de alimento para animales, por ejemplo la 'mezcla previa, se pueden encontrar al multiplicar la concentración en el alimento final del --•* ™^->* *J* *?***l* >-*¡* ~* «>. ** * *. - mismo componente por, respectivamente, 10-10000; 20-2000; o 100-500 (con referencia a los tres intervalos de inclusión en porcentaje anteriores). Las guías para las concentraciones finales deseadas, es decir, concentraciones en los alimentos, de estos componentes individuales del alimento y del aditivo para alimento están indicadas en la Tabla A posteriormente. Las siguientes son listas no exclusivas de ejemplos de estos componentes: Los ejemplos de vitaminas solubles en grasa son vitamina A, vitamina D3, vitamina E, y vitamina K, por ejemplo vitamina K3. Los ejemplos de vitaminas solubles en agua son vitamina B12, biotina y colina, vitamina Bl, vitamina B2, vitamina B6, niacina, ácido fólico y pantotenato, por ejemplo, Ca-D-pantotenato. Los ejemplos de minerales traza son manganeso, zinc, hierro, cobre, yodo, selenio y cobalto. Ejemplos de macro-minerales son calcio, fósforo y sodio. Los requerimientos nutricionales de estos componentes - ejemplificados con las aves de corral y lechones /cerdos - se listan en la Tabla A posteriormente. Requerimiento nutricional significa que estos componentes deben ser proporcionados en la dieta en las concentraciones indicadas. Estos datos se compilan de: NRC, Nutrient requirements in swine, ninth revised edition 1988, subcommittee on swine nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C. 1988; y NRC, Nutrient requirements of poultry, ninth revised edition 1994, subcommittee on poultry nutrition, committee on animal nutrition, board of agriculture, national research council. National Academy Press, Washington, D.C. 1994. Alternativamente, el aditivo de alimento para animales de la invención comprende al menos uno de los componentes individuales especificados en la Tabla A. Al menos uno significa cualquiera de, uno o más de, uno o dos o tres o cuatro y así sucesivamente hasta todos los trece, o hasta todos los quince componentes individuales. Más específicamente, al menos este componente individual es incluido en el aditivo de la invención en tal cantidad para proporcionar una concentración en el alimento dentro de la gama indicada en la cuarta columna, o quinta columna, o sexta columna de la Tabla A. Como se explica anteriormente, las concentraciones correspondientes del aditivo para alimentos se pueden encontrar al multiplicar los límites del intervalo de estas gamas con 10-10000; 20-2000; o 100-500. Como un ejemplo, considerando que el contenido de la mezcla previa de vitamina A correspondería al contenido del alimento de 10-10000 IU/kg, este ejercicio conduciría a los siguientes intervalos: 100-108 IU; o 200-2xl07 IU; o 1000-5xl06 IU por kg de aditivo.
Tabla A Composiciones de alimento para animales Las composiciones de alimento para animales o dietas tienen un contenido relativamente alto de proteínas. De acuerdo con las publicaciones de National Research Council (NRC) referidas anteriormente, las dietas para aves de corral y cerdos pueden ser caracterizadas como se indica en la Tabla B posteriormente, columnas 2-3. Las dietas para peces pueden estar caracterizadas como se ilustra en la columna 4 de la Tabla B. Además, estas dietas para peces usualmente tienen un contenido de grasa cruda de 200-310 g/kg. Estas dietas para peces se ejemplifican con dietas para Salmónidos y están diseñadas en base a Aquaculture, principies and practices, ed. T.V.R. Pillay, Blackwell Scientific Publications Ltd. 1990; Fish nutrition, segunda edición, ed. John E. Halver, Academic Press Inc. 1989. Una composición de alimento para animales de acuerdo con la invención tiene un contenido de proteína cruda de 50-800 g/kg, y además comprende al menos una proteasa como se reclama en este documento. Además, o alternativamente (al contenido de proteína cruda indicado anteriormente) , la composición de alimento para animales de la invención tiene un contenido de energía metabolizable de 10-30 MJ/kg; y/o un contenido de calcio de 0.1-200 g/kg; y/o un contenido de fósforo disponible de 0.1-200 g/kg; y/o un contenido de metionina de 0.1-100 g/kg; y/o un contenido de metionina más cisteína de 0.1-150 g/kg; y/o un contenido de lisina de 0.5-50 g/kg. En las modalidades particulares, el contenido de energía metabolizable, proteína cruda, calcio, fósforo, metionina, metionina más cisteína, y/o lisina está dentro de cualquiera de las gamas de 2, 3, 4 o 5 en la Tabla B posteriormente (R. 2-5) .
La proteína cruda se calcula como el nitrógeno (N) p -iplicado por un factor de 6.25, es decir proteína cruda ' g) = N (g/kg) x 6.25 como se establece en Animal M-~r?tion, 4a edición, Capítulo 13 (Eds. P. McDonald, R. A. ?.~v=rds and J. F. D. Greenhalgh, Longman Scientific and e — nical, 1988, ISBN 0-582-40903-9). El contenido de r. -rógeno se determina por el método de Kjeldahl (A.O.A.C, 11: -* -. , Official Methods of Analysis 14th ed., Association of Cíficial Analytical Chemists, Washington DC) . La energía metabolizable puede ser calculada en ase a NRC publication Nutrient Requirements of Swine (1988) p; . 2-6 y the European Table of Energy Valúes for Poultry Fe -stuffs, Spelderholt centre for poultry research and ex.ension, 7361 DA Beekbergen, Los Países Bajos. Grafisch ? crijf Ponsen & looijen bv, Wageningen. ISBN 90-71463-12-5. El contenido dietético de calcio, fósforo disponible y aminoácidos en las dietas para animales :r.pletas se calcula en base a las tablas de alimentación =les como Veevoedertabel 1997, gegevens over chemische s= enstelling, verteerbaarheid en voederwaarde van vce?ermiddelen, Central Veevoederbureau, Runderweg 6, 8219 pk Islystad. ISBN 90-72839-13-7. En una modalidad particular, la composición de al-mento para animales de la invención contiene al menos una proteína o fuente de proteína vegetal como se definiera anteriormente . En las modalidades particulares aun adicionales, la composición de alimento para animales de la invención contiene 0-80% de maíz; y/o 0-80% de sorgo; y/o 0-70% de trigo; y/o 0-70% de cebada; y/o 0-30% de avena; y/o 0-40% de harina de soya; y/o 0-10% de harina de pescado; y/o 0-20% de suero. Las dietas para animales pueden ser fabricadas por ejemplo como un alimento en amasijo (no granulado) o un alimento granulado. Típicamente, los alimentos molidos son mezclados y se adicionan cantidades suficientes de vitaminas y minerales esenciales de acuerdo con las especificaciones para las especies en cuestión. Las enzimas pueden ser adicionadas como formulaciones de enzimas sólidas o líquidas. Por ejemplo, una formulación de enzima sólida se adiciona típicamente antes o durante el paso del mezclado; y una preparación de enzima líquida se adiciona típicamente después del paso de granulación. La enzima también puede ser incorporada en un aditivo o mezcla previa del alimento. La concentración de enzima final en la dieta está dentro de la gama de 0.01-200 mg de proteína enzimática por kg de dieta, por ejemplo en la gama de 5-30 mg de proteína enzimática por kg de dieta del animal.
» Los ejemplos de composiciones de alimento para animales se muestran en el ejemplo 11.
Tabla B Valores de las gamas para la energía, proteína y minerales en En las modalidades particulares del método de la invención para tratar proteínas vegetales, también está incluido un paso adicional de agregar fitasa. Y en las modalidades particulares adicionales, además del tratamiento combinado con fitasa y proteasa, también se pueden adicionar enzimas adicionales, en donde estas enzimas se seleccionan del grupo que comprende otras proteasas, fitasas, enzimas lipolíticas, y enzimas de glucosidasa/carbohidrasa. Los ejemplos de tales enzimas se indican en la patente WO95/28850. Naturalmente, la proteasa debe ser aplicada en una cantidad efectiva, es decir en una cantidad adecuada para mejorar la solubilización y/o para mejorar el valor nutricional del alimento. En la actualidad, se contempla que la enzima se administra en una o más de las siguientes cantidades (gamas de dosificación): 0.01-200; o 0.01-100; o 0.05-100; o 0.05-50; o 0.10-10 - todas estas gamas son en mg de proteína de proteasa por kg de alimento (ppm) . Para determinar los miligramos de proteína de proteasa por kg de alimento, la proteasa se purifica a partir de la composición del alimento, y la actividad específica de la proteasa purificada se determina utilizando un ensayo relevante (ver bajo la actividad de proteasa, substratos, ensayos) . La actividad de proteasa de la composición del alimento también se determina utilizando el mismo ensayo y en base a estas dos determinaciones, se calcula la dosificación en miligramos de proteína de proteasa por kg de alimento. Los mismos principios se aplican para determinar los miligramos de proteína de proteasa en los aditivos para alimentos. Naturalmente, si está disponible una muestra de la proteasa utilizada para preparar el aditivo para alimento o el alimento, la actividad específica se determina a partir de esta muestra (no es necesario purificar la proteasa de la composición para alimento o el aditivo) . Muchos vegetales contienen factores anti-nutricionales tales como lectinas e inhibidores de tripsina. Los factores anti-nutricionales más importantes de la soya son la lecitina, aglutinina de soya (SBA, por sus siglas en inglés), y el inhibidor de tripsina de soya (STI, por sus siglas en inglés) . Las lectinas son proteínas que se unen a las moléculas específicas que contienen carbohidratos con 5 especificidad considerable, y cuando se ingieren éstas llegan a unirse al epitelio intestinal. Esto puede conducir a una viabilidad reducida de las células epiteliales y una absorción reducida de los nutrientes. La SBA es una lectina tetramérica, glicosilada con un peso molecular de subunidades de aproximadamente 30 kDa y una afinidad alta por la N-acetilgalactosamina. Los inhibidores de tripsina afectan la proteólisis intestinal reduciendo la digestibilidad de proteínas, y también incrementan la secreción de enzimas digestivas del páncreas conduciendo a una pérdida de aminoácidos en la forma de enzimas digestivas. Un ejemplo de un inhibidor de tripsina es el inhibidor Bowman-Birk, que tiene un peso molecular de aproximadamente 8 kDa, contiene 7 puentes de disulfuro y tiene dos circuitos inhibidores específicos para las proteasas similares a la tripsina y similares a la quimiotripsina . Otros ejemplos son los comúnmente llamados inhibidores Kunitz de los factores (por ejemplo el Inhibidor de Tripsina Kunitz de la Soya que contiene un sitio de unión para las proteasas similares a la tripsina y tiene un peso 25 molecular de aproximadamente 20 kDa) .
***^*^ * **** **!*.*.- ********. -. Se ha mostrado que las proteasas para el uso de acuerdo con la invención hidrolizan los factores anti- nutricionales similares a la lectina SBA y los inhibidores de tripsina del Inhibidor Bowman Birk y el Factor Kunitz de Semilla de Soya. Ver la parte experimental, ejemplo 5. De esta manera, la invención también se refiere al uso de serina proteasas estables en ácido para hidrolizar o reducir la cantidad de, factores anti-nutricionales, por ejemplo, la lectina SBA y los inhibidores de tripsina, tales 10 como el Inhibidor Bowman Birk, y los Factores Kunitz tal como un Factor Kunitz de Semilla de Soya.
Ejemplo 1 Selección de proteasas estables en ácido 15 Se analizó un gran número de proteasas para la estabilidad en pH 3, con el objetivo de identificar las proteasas que tengan la estabilidad necesaria para pasar a través del estómago ácido de los animales mono-gástricos. Las proteasas han sido purificadas mediante métodos cromatográficos convencionales tales como la cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrófoba y cromatografía de exclusión de tamaño (ver por ejemplo Protein Purification, Principies, High Resolution Methods, and Applications. Editors: Jan-Christer Janson, Lars Rydén, VCH * 25 Publishers, 1989) .
La actividad de proteasa se determinó como sigue: La proteasa se incubó con caseína Hammarsten 1.67% a 25°C, pH 9.5 durante 30 minutos, luego se adicionó TCA (ácido triclsroacético) para una concentración final de 2% (p/p) , la mezcla se filtró para eliminar el sedimento, y el producto filtrado se analizó por los grupos amino primarios, libres (determinados en un ensayo colométrico en base a OPA (o-ftal- dialdehído) al medir la absorbancia a 340 nm, utilizando una norma de serina (Biochemische Taschenbuch teil II, Springer-Verlag (1964), página 93 y página 102). Una Unidad de Caseína Proteasa (CPU, por sus siglas en inglés) es definida como la cantidad de enzima que libera 1 mmol de grupos amino primarios solubles en TCA por minuto bajo condiciones normales, es decir 25°C y pH 9.5. Las proteasas se diluyeron a una actividad de 0.6 CPU/1 en agua, dividido en dos alícuotas y cada alícuota luego se diluyó además a 0.3 CPU/1 con amortiguador de citrato 100 mM, pH 3 y amortiguador de fosfato 100 mM, pH 7 respectivamente. Las muestras diluidas se incubaron a 37 °C durante 1 hora, y luego se aplicaron 20 µl de las muestras a los orificios en placas de agarosa 1% que contenían leche descremada 1%. Las placas (pH 7.0) se incubaron a 37 °C durante toda la noche y se midieron las zonas limpias. 42 proteasas se desempeñaron bien en esta prueba. Una variedad de éstas han sido caracterizadas, ver los ejemplos 2, 6, 7 y 8. Todas estas proteasas pertenecen a la familia de las subtilisinas de las serina proteasas.
Ejemplo 2 Caracterización y estudio comparativo de la proteasa subtilisina derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 La proteasa derivada de Bacillus sp NCIMB 40484 se preparó como se describe en el Ejemplo 1 de W093/24623. El propósito de esta caracterización fue estudiar su estabilidad en diferentes valores de pH, actividad en diferentes valores de pH y perfiles de actividad en diferentes valores de temperatura, en comparación con Sub. Novo, Sub. Novo (Y217L) , y SAVINASEMR. Sub. Novo es una subtilisina derivada de Bacillus amyloliquefaciens, y Sub. Novo (Y217L) es el mutante de la misma que se describe en la patente WO96/05739. Sub. Novo se preparó y se purificó de un cultivo de la cepa de tipo no cultivado utilizando métodos convencionales, mientras que el mutante se preparó como se describe en los ejemplos 1-2, y 15-16 de EP 130756. SANIVASEMR es una subtilisina derivada de Bacillus clausii (previamente Bacillus lentus NCIB 10309) , comercialmente disponible de Novozymes A/S, Krogshoej vej , DK- 2880 Bagsvaerd, Dinamarca. Su preparación se describe en la patente norteamericana No. 3,723,250.
Ejemplo 2A Determinación de la pureza analizada con gel de SDS-PAGE de las muestras de proteasa La pureza analizada con gel de SDS-PAGE de las muestras de proteasa se determinó por el siguiente procedimiento : Una solución de proteasa de 40 µl (concentración A280 = 0.025) se mezcló con 10 µl de TCA 50% (p/v) (ácido tricloroacético) en un tubo Eppendorf sobre hielo. Después de media hora sobre el hielo, el tubo se centrifugó (5 minutos, 0°C, 14,000 x g) y el sobrenadante se removió cuidadosamente. Se adicionaron 20 µl de amortiguador de la muestra de SDS- PAGE (200 µl de Amortiguador de la Muestra de la Tris-Glicina SDS (2x) (Tris 125 M/HCl, pH 6.8, SDS 4% (p/v), azul de bromofenol 50 ppm, Glicerol 20% (v/v), LC2676 de NOVEXMR) + 160 µl de agua destilada + 20 µl de ß-mercaptoetanol + 20 µl de Base Tris no amortiguada 3M (Sigma T-1503) al producto precipitado y el tubo se hirvió durante 3 minutos. El tubo se centrifugó en corto y se aplicaron 10 µl de la muestra a un gradiente de 4-20% de gel previamente fundido de Tris-Glicina de NOVEXMR (gel de gradiente de poliacrilamida en base a la química Laemmli pero sin SDS en el gel, (Laemmli, U.K., (1970) Nature, vol. 227, páginas 680-685), EC60255). La electroforesis se realizó con amortiguador de servicio de Tris-Glicina (2.9 g de Base Tris, 14.4 g de Glicina, 1.0 g de ** * * * *. * * *.***&*** * SDS, agua destilada para un litro) en ambos recipientes del amortiguador con un voltaje constante de 150V hasta que el tinte de sondeo azul de bromofenol había alcanzado el fondo del gel. Después de la electroforesis, el gel se enjuagó 3 veces, 5 minutos cada vez, con 100 mi de agua destilada mediante la agitación suave. El gel luego se sacudió suavemente con Reactivo de Tinción Azul Gelcode (colloidal Comassie G-250/producto de PIERCE, PIERCE No. de cat. 24592) durante una hora y se lavó por agitación suave durante 8 a 16 horas con agua destilada con varios cambios del agua destilada. Finalmente, el gel se secó entre 2 piezas de celofán. Los geles secos se exploraron con un explorador Arcus II de AGFA equipado con el programa Fotolook 95 v2.08 y se importaron al programa de evaluación de imágenes CREAMMR para Windows (nos. de catálogo 990001 y 990005, Kem-En-Tec, Dinamarca) por el comando Archivo/Adquirir con los siguientes ajustes (de Fotolook 95 v2.08): Original=Reflectivo, Modo=Color RGB, resolución de exploración=240 ppi, resolución de salida=1201pi, el factor de escala=100%, Gama=Histograma con selección Global y Min=0 y Max=215, Curva de Tono=Ninguna, Agudeza=Ninguna, Remoción del patrón jaspeado (Descreen) =Ninguna y Sabor=Ninguno, produciendo con lo cual un archivo de imagen * . img del gel de SDS-PAGE, el cual se utilizó para la evaluación en CREAMMR. El archivo de imagen * . img se evalúo con el comando de menú Anál isis/1 -D. Se colocaron dos líneas de exploración en el archivo de imagen * . img con la Herramien ta de Colocación de Carril : Una línea de exploración de la Muestra y una línea de exploración del Fondo. La línea de exploración de la Muestra se colocó en la parte intermedia de un carril de la muestra (con la proteasa en cuestión) desde precisamente abajo de la abertura de aplicación a precisamente arriba de la posición del tinte de sondeo azul de Bromofenol. La línea de exploración de Fondo se colocó paralela a la línea de exploración de la muestra, pero en una posición en el gel de SDS-PAGE de la imagen no se aplicó la muestra, los puntos de inicio y finales para la línea de exploración del Fondo fueron perpendiculares a los puntos de inicio y finales de la línea de exploración de la Muestra. La línea de exploración del Fondo representa el fondo verdadero del gel. La anchura y la forma de las líneas de exploración no se ajustaron. La intensidad a lo largo de las líneas de exploración ahora se registró con el comando del menú 1 -D/Exploración con una sensibilidad In termedia . Utilizando el comando del menú 1 -D/Edi tor, la exploración del Fondo se sustrajo de la exploración de la Muestra. Luego se seleccionó el comando del menú 1 -D/Resul tados y el % de área del pico de la proteasa, calculado por el programa CREAMMR, se utilizó como la pureza de las proteasas analizada con gel de SDS-PAGE. i.* i* -* ,* ***. .
Se obtuvieron los siguientes resultados Ejemplo 2B ensayo de actividad en diferentes valores de pH El substrato Suc-AAPF-pNA (Sigma® S-7388) se utilizó para obtener los perfiles de actividad en diferentes valores de pH. Amortiguador de ensayo: ácido succínico 100 mM (Merck 1.00682), HEPES 100 mM (Sigma H-3375) , CHES 100 mM (Sigma C-2885) , CABS 100 M (Sigma C-5580) , CaCl2 1 mM, KCl 150 mM, Tritón® X-100 0.01%, ajustado a los valores de pH 3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0 o 11.0 con HCl o NaOH. Temperatura del ensayo: 25°C Una muestra de proteasa de 300 µl (diluida en Tritón® X-100 0.01%) se mezcló con 1.5 mi del amortiguador del ensayo en el valor de pH respectivo, para llevar el pH de la mezcla al pH del amortiguador del ensayo. La reacción se inició al adicionar 1.5 mi del substrato pNA (50 mg disueltos en 1.0 mi de DMSO y además diluidos 45x con Tritón® X-100 0.01%) y, después del mezclado, el incremento en A40s se monitoreó por un espectrofotómetro como una medida de la actividad de proteasa al pH en cuestión. El ensayo se repitió con el amortiguador del ensayo en los otros valores de pH, y las medidas de actividad se colocaron en un diagrama como la actividad relativa contra el pH. Las actividades relativas se normalizaron con la actividad más alta (pH-óptimo) , es decir ajustando la actividad al pH óptimo a 1, o a 100%. Las muestras de proteasa se diluyeron para asegurar que todas las medidas de actividad se incluyen dentro de la parte lineal de la curva de respuesta a la dosis para el ensayo.
Ejemplo 2C Ensayo de estabilidad en diferentes valores de pH El substrato Suc-AAPF-pNA (Sigma® S-7388) se utilizó para obtener los perfiles de estabilidad en diferentes valores de pH. Amortiguador del ensayo: ácido succínico 100 mM, HEPES 100 M , CHES 100 mM, CABS 100 mM, CaCl2 1 mM, KCl 150 mM, Titron® X-100 0.01% ajustado a los valores de pH 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, u 11.0 con HCl o NaOH.
^^ ^^ ^ Cada muestra de proteasa (en ácido succínico 1 mM, CaCl2 2 mM, NaCl 100 mM, pH 6.0 y con una absorción A280 > 10) se diluyó en el amortiguador del ensayo en cada valor de pH sometido a prueba a A28o = 1.0. Las muestras de proteasa diluida se incubaron durante 2 horas a 37°C. Después de la incubación, las muestras de proteasa se diluyeron en ácido succínico 100 mM, HEPES 100 mM, CHES 100 mM, CABS 100 mM, CaCl2 1 mM, KCl 150 mM, Tritón® X-100 0.01%, pH 9.0, para llevar el pH de todas las muestras a pH 9.0. En la siguiente medición de actividad, la temperatura fue 25 °C. Una muestra de proteasa diluida de 300 µl se mezcló con 1.5 mi del amortiguador del ensayo a pH 9.0 y la reacción de la actividad se inició al adicionar 1.5 mi del substrato pNA (50 mg disuelto en 1.0 mi de DMSO y diluido además 45x con Tritón® X-100 0.01%) y, después del mezclado, el incremento en A40s se monitoreó por un espectrofotómetro como una medida de la actividad de proteasa (residual) . La incubación a 37 °C se realizó en los diferentes valores de pH y las medidas de actividad se colocaron en un diagrama como actividades residuales contra pH. Las actividades residuales se normalizaron con la actividad de una incubación paralela (control), donde la proteasa se diluyó a A28o = 1.0 en el amortiguador del ensayo a pH 9.0 y se incubaron durante 2 horas a 5°C antes de la medición de la actividad como las otras incubaciones. Las muestras de proteasa se diluyeron antes de la medición de la actividad a fin de asegurar que todas las mediciones de actividad se encontraran dentro de la parte lineal de la curva de respuesta a la dosis para el ensayo.
Ejemplo 2D Ensayo de actividad en diferentes valores de temperatura Las tabletas Protazyme AK se utilizaron para obtener los perfiles de temperatura. Las tabletas Protazyme AK son de caseína reticulada teñida con azurina preparada como tabletas por Megazyme. Amortiguador del ensayo: ácido succínico 100 mM, HEPES 100 Mm, CHES 100 mM, CABS 100 mM, CaCl2 1 mM, KCl 150 mM, Titron® X-100 0.01% ajustado a pH 9.0 con NaOH. Una tableta Protazyme AK se suspendió en 2.0 mi de Titron® X-100 0.01% mediante la agitación suave. 500 µl de esta suspensión y 500 µl del amortiguador del ensayo se mezclaron en un tubo Eppendorf y se colocaron en hielo. La muestra de proteasa de 20 µl (diluida en Titron® X-100 0.01%) se adicionó. El ensayo se inició mediante la transferencia del tubo Eppendorf a un termomezclador Eppendorf, el cual se ajustó a la temperatura del ensayo. El tubo se incubó durante 15 minutos en el termomezclador Eppendorf en su velocidad de agitación más alta. Al transferir el tubo nuevamente al baño de hielo, la incubación del ensayo se detuvo. El tubo se centrifugó en una centrífuga enfriada con hielo durante algunos minutos y la A650 del sobrenadante se diluyó por un espectrofotómetro. Una solución ciega o incompleta del amortiguador se incluyó en el ensayo (en lugar de la enzima) . La A65o (proteasa) - A6so (solución ciega) fue una medida de la actividad de proteasa. El ensayo se realizó a diferentes temperaturas y las medidas de actividad se colocaron en un diagrama como actividades relativas contra la temperatura de incubación. Las actividades relativas se normalizaron con la actividad más alta (temperatura óptima) . Las mezclas de proteasa se diluyeron para asegurar que todas las medidas de actividad se encontraran dentro de la parte lineal cercana de la curva de respuesta a la dosis para el ensayo. Una revisión de la actividad óptima (actividad en diferentes valores de pH y temperatura) se observa en la Tabla 1. Los perfiles de estabilidad en diferentes valores de pH, actividad en diferentes valores de pH y actividad en diferentes valores de temperatura se observan en las figuras 1-3, y en la Tabla 2 se observa una comparación detallada de los datos de estabilidad en diferentes valores de pH para las proteasas en valores de pH ácidos.
Tabla 1 pH y temperatura óptimos para diversas proteasas Tabla 2 Estabilidad en diferentes valores de pH de diversas proteasas, entre pH 2.0 y 5.0 **j.^ **.*. * ^aa Ejemplo 2E Pureza de absorción de las muestras de proteasa purificadas Determinación de la relación de A280/A26o La relación de A280/A26o de las muestras de proteasa purificadas se determina como sigue. A26o significa la absorción de una muestra de proteasa a 260 nm en una cubeta de longitud de trayectoria de 1 cm con relación al control del amortiguador. A28o significa la absorción de la misma muestra de proteasa a 280 nm en una cubeta de una longitud de trayectoria de 1 cm con relación al control del amortiguador. Las muestras de las proteasas purificadas de los ejemplos 2 y 6 se diluyeron en amortiguador hasta que la lectura de A28o del espectrofotómetro estuvo dentro de la parte lineal de su curva de respuesta. La relación de A28o/A26o se determinó a partir de las lecturas. Se obtuvieron los siguientes resultados: Ejemplo 3 Capacidad de la proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 para degradar las partes insolubles de la Harina de Soya (SBM, por sus siglas en inglés) La proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 se sometió a prueba por su capacidad para hacer las partes insolubles/indigeribles de la SBM accesible a las enzimas digestivas y/o enzimas exógenas adicionadas. Su desempeño se comparó a dos aspartato proteasas, Proteasa I y Proteasa II, preparadas como se describe en la patente WO95/02044. Este documento también describe su uso en el alimento. La Proteasa I es Aspergillopepsina tipo II de proteasa, y la Proteasa II es Aspergillopepsina tipo I de proteasa (ambas aspartato proteasas, es decir proteasas diferentes de la familia de las subtilisinas) de Aspergillus aculeatus (haciendo referencia al Manual de Enzimas Proteolíticas referido anteriormente) . El sustrato de prueba, el comúnmente llamado remanente de soya, se produjo en un proceso en el cual imita el tracto digestivo de animales mono-gástricos, que incluyen t^^fe^ tí^á^^^^^iM^^^^^^^tój^*^^^ t^^^^^^g^^^^^^^^«^tk?«^^*g^^^ un tratamiento con pepsina a pH 2, y un tratamiento con pancreatina a pH 7. En el paso del tratamiento con pancreatina, se adicionó una gama de enzimas comerciales en dosificaciones 5 altas a fin de degradar los componentes de la SBM que son accesibles para las enzimas comerciales existentes. Las siguientes enzimas, todas comercialmente disponibles de Novozymes A/Z, Dinamarca, se adicionaron: ALCALASEMR 2.4 L, NEUTRASEMR 0.5 L, FLAVOURZYMEMR 1000 L, 10 ENERGEXMR L, BIOFEEDMR Plus L, PHYTASE NOVOMR L. La SBM utilizada fue una SBM normal con 48% de proteína para alimento, la cual había sido granulada. Después del tratamiento, únicamente 5% de la proteína total se dejó en el remanente de soya resultante. 15 Protocolo de etiquetado con FITC El remanente se etiquetó subsecuentemente con FITC (Sondas Moleculares, F-143) como sigue: Remanente de soya (25 g húmedo, 5 g seco) se suspendió en 100 mi de amortiguador de carbonato 0.1 M, pH 9 y se agitó 1 hora a 40°C. La suspensión se enfrió a temperatura ambiente y se trató con 5- isotiocianato de fluoresceina (FITC) durante toda la noche en la oscuridad. La sonda no acoplada se removió mediante la ultrafiltración (corte de 10,000 Mw) . 25 ^^^^^gjg^á*ijgga&j¿^ ^^^^^¿g¡^^^¿«^j Ensayo con FITC El remanente de soya etiquetado con FITC se utilizó para someter a prueba la capacidad de las proteasas para degradar el remanente de soya utilizando el siguiente ensayo: una muestra de proteasa de 0.4 mi (con A280 = 0.1) se mezcló con 0.4 mi de remanente de soya etiquetado con FITC (suspensión de 10 mg/ml en amortiguador de fosfato de sodio 0.2 M, pH 6.5) a 37 °C, y las unidades de fluorescencia relativa (RFU 485/535 nm; excitación/monitoreo de longitud de onda) se midieron después de 0 horas, y después de 22 horas de incubación. Antes de la determinación de las RFU, las muestras se centrifugaron durante 1 minuto a 20.000 x G y 250 microlitros de sobrenadante se transfirieron a una charola negra de microtítulo. Las mediciones se realizaron utilizando un contador VÍCTOR 1420 Multilabel ( In vi tro, Dinamarca) . Las RFU se describen generalmente por Iain D. Johnson en: Introduction to Fluorescence Techniques, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, Molecular Probes, Richard P. Haugland, 6a edición, 1996 (ISBN 0-9652240-0-7) . Una muestra ciega se preparó al adicionar 0.4 mi de amortiguador en lugar de la muestra de enzima. RFUmuestra = ?RFUmUestra - ?RFUso?.C?ega, donde ?RFU = RFU (22 horas) - RFU (0 horas) . Los valores de FITC resultantes (valores de FRUmuestra) se muestran en la Tabla 3 posteriormente. Los valores de FITC son generalmente con un margen de error de +/- 20,000. Contrario a la Proteasa I y la Proteasa II, la proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 degradó el remanente de soya a un grado significante.
Tabla 3 Capacidad de las proteasas ara de radar el remanente de soya 0 Ejemplo 4 Prueba in vi tro de la proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 La proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 se sometió a prueba junto con otras proteasas subtilisinas tales como SubNovo, SubNovo (Y217L) , SAVINASEMR y ALCALASEMR por su capacidad para solubilizar las proteínas de maíz-SBM (maíz- harina de soya) en un sistema de digestión in vi tro automatizado (que simula la digestión en animales monogástricos) . Para los tratamientos con controles, el maíz- SBM se incubó en la ausencia de proteasas exógenas similares a la subtilisina. ¿ ¡^gja ittfc ri ** ^ A AL,^4*á? ^y^g El sistema in vi tro consistió de 30 matraces en los cuales se incubó inicialmente el sustrato de maíz-SBM con HCl/pepsina - que simula la digestión gástrica - y subsecuentemente con pancreatina - que simula la digestión intestinal. Al final del período de incubación gástrico, las muestras de la digesta in vitro se removieron y se analizaron para la proteína solubilizada.
Substratos 10 Se utilizaron 10 g de la dieta de maíz-SBM con una relación de maíz-SBM de 6:4 (p/p). El contenido de proteínas fue de 43% (p/p) en SBM y 8.2% (p/p) en harina de maíz. La cantidad total de proteína en 10 g de la dieta de maíz-SBM fue de 2.21 g.
Enzimas digestivas Pepsina (Sigma P-7000; 539 U/mg, sólida), pancreatina (Sigma P-7545; dxU.S.P. (Farmacopea de E.U.A.)).
Resultado del procedimiento de digestión in vi tro 20 *&&—- . fm&?fxm Determinaciones de la proteína enzimática La cantidad de la proteína enzimática de proteasa se calcula en base a los valores A28o y las secuencias de aminoácidos (composiciones de aminoácidos) utilizando los principios resumidos en S.C. Gill & P.H. von Hippel, .Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989) .
Procedimiento experimental para el modelo in vi tro 1. Se pesan 10 g del sustrato en un matraz de 100 mi. 2. En el tiempo 0 minutos, se adicionan 46 mi de HCl (0.1 M) que contiene pepsina (3000 U/g de dieta) y 1 mi de proteasa (0.1 mg de proteína enzimática/g de dieta) al matraz mientras que se mezcla. El matraz se incuba a 40°C. 3. En el tiempo 30 minutos, se mide el pH. ¿ jafr iAíattiL l é. á^A^ Í^* jr*.**^* *. i?. 4. En el tiempo 45 minutos, se adicionan 16 mi de H20. 5. En el tiempo 60 minutos, se adicionan 7 mi de NaOH (0.39 M) . 5 6. En el tiempo 90 minutos, se adicionan 5 mi de NaHC03 (1M) que contiene pancreatina (8.0 mg/g de dieta). 7. En el tiempo 120 minutos, se mide el pH. 8. En el tiempo de 300 minutos, se mide el pH. 9. En el tiempo 330 minutos, las muestras de 30 mi 10 se remueven y se colocan en hielo antes de la centrifugación (10000 x g, 10 minutos, 4°C) . Los sobrenadantes se remueven y se almacenan a -20°C.
Estimación de proteínas solubilizadas mediante la CLAR de filtración de gel 15 El contenido de proteínas solubilizadas en los sobrenadantes de las muestras digeridas in vi tro se estimó al cuantificar la proteína cruda (PC) utilizando la CLAR de filtración de gel. Los sobrenadantes se descongelaron, se filtraron a través de filtros de policarbonato de 0.45 µm (Sartorius) y se diluyeron (1:50, v/v) con H20. Las muestras diluidas se cromatografiaron mediante la CLAR utilizando una columna de filtración de gel Superdex Peptide PE (7.5 x 300 mm) (Global) . El eluyente utilizado para la elusión isocrática fue un amortiguador de fosfato de sodio 50 mM (pH 7.0) que contenía NaCl 150 mM. El volumen total del eluyente por ensayo fue de 26 mi y la velocidad de flujo fue de 0.4 ml/minutos. Los perfiles de elución se registraron a 214 nm y el área total bajo los perfiles se determinó mediante la integración. Para estimar el contenido de proteínas de las áreas integradas, se hizo una curva de calibración (R2=0.9993) de una serie de dilución de una muestra de maíz-SBM de referencia digerida in vi tro con un contenido de proteínas total conocido. La determinación de proteínas en esta muestra de referencia se llevó a cabo por el método Kjeldahl (determinación de % de nitrógeno; A.O.A.C (1984) Official Methods of Analysis 14a edición, Washington DC) .
Resultados Los resultados, es decir el efecto de las diversas proteasas sobre la solubilidad de proteínas in vi tro, se muestran en la Tabla 4 posteriormente. El cálculo de las cantidades relativas de la proteína solubilizada se basa en la cantidad total de proteínas en 10 g de la dieta de maíz-SBM (2.21 g de proteína) disuelta en el volumen total de 75 mi durante la reacción de digestión in vi tro . Asumiendo la solubilización completa de la proteína (100%), el contenido de proteína en los sobrenadantes sería 2.95% en peso por volumen.
^- * A.**.**»*-****»*** M*,,*-****,**** Los resultados se analizaron mediante el análisis de una vía de variación: P = 0.0001). SD = Derivación Estándar; n = el número de réplicas por tratamiento (n=5) . La proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 tiene un efecto significantemente mejor sobre la solubilización de proteínas comparado con las otras proteasas.
Tabla 4 Enzima PC Soluble (% SD del total) Proteasa derivada de Bacillus sp. 78.8A 0.48 NCIMB 40484 Sub.Novo 76.7B 0.37 ALCALASEMR 73.9C 1.04 Sub. Novo (Y217L) 75.8B 0.91 SAVINASEMR 75.8B 0.85 Control 76.6B 0.88 A, B, C: Valores que no comparten una letra del índice común difieren significantemente (P < 0.05) Ü^Aiia Ejemplo 5 Degradación de la SBA con lectina y los inhibidores Bowman- Birk y Kunitz de soya Se sometió a prueba la capacidad de la proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 para hidrolizar la aglutinina de soya (SBA, por sus siglas en inglés) y los inhibidores de tripsina Bow an-Birk y Kunitz de soya. La SBA pura (Fluka 61763) , inhibidor Bowman-Birk (Sigma T-9777) o el inhibidor Kunitz (Inhibidor de Tripsina de soya, Boehringer Mannheim 109886) se incubó con la proteasa durante dos horas. 37 °C, a pH 6.5 (proteasa: factor anti-nutricional = 1.10, en base a A280) . Amortiguador de la incubación: ácido dimetilglutárico 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 1 mM, Tritón X-100 0.01%, pH 6.5. La capacidad de la proteasa para degradar la SBA y los inhibidores de proteasa se determinó a partir de la desaparición de las bandas de SBA nativa o inhibidor de tripsina y la aparición de productos de la degradación de bajo peso molecular en los geles de SDS-PAGE. Los geles se tiñeron con azul Coomassie y la intensidad de las bandas se determinó mediante la exploración. Los resultados, como el % del factor anti-nutricional degradado, se muestran en la Tabla 5 posteriormente .
^^¿ Se contempla que la capacidad para degradar los factores anti-nutricionales en la soya también se puede estimar mediante la aplicación de la técnica Western con anticuerpos contra SBA, Inhibidor Bowman-Birk o Inhibidor Kunitz después de la incubación de la harina de soya con las proteasas candidatas (ver la patente WO98/56260) .
Tabla 5 Ejemplo 6 Preparación de subtilisinas estables en ácido adicionales Preparación de la proteasa derivada de Bacillus alcalophilus La cepa Bacillus alcalophilus NCIMB 10438 se incubó de un cultivo liofilizado en frascos de agitación cada uno que contenía 100 mi de medio BPX con la siguiente composición: almidón de papa 100 g/1, harina de cebada 50 g/1, BAN 800 MG (obtenible de Novozymes A/S) 0.05 g/1, caseinato de sodio 10 g/1, harina de soya 20 g/1, difosfato de sodio 9 g/1, Pluronic PE 6100 0.1 ml/1 en agua de la llave. El pH se ajustó a 9.7 con 10 mi de sesquicarbonato de sodio 1M en cada matraz de agitación antes de la inoculación. iü-l ** -i *i-* i.******.*-**- *-**.-*,,.
La cepa se fermentó durante 4 días a 30 grados C a 300 rpm. A partir de este cultivo se inocularon nuevos matraces de agitación que contenían 10 mi del medio BPX y se fermentaron durante 3 días.
Purificación El caldo de cultivo se centrifugó a 10000 x g durante 30 minutos en vasos de precipitados de 1 litro. Los sobrenadantes se combinaron y se clarificaron adicionalmente mediante la filtración a través de una placa de filtro profunda Seitz K-250. El producto filtrado claro se concentró mediante la ultrafiltración en un cásete o módulo de poli (éter sulfona) separado de 3kDa (Filtron). La enzima concentrada se transfirió a H3B03 50 mM, ácido 3,3'- dimetilglutárico 5 mM, CaCl2 1 mM, pH 7 (amortiguador A) en una columna G25 Sephadex (Amersham Pharmacia Biotech) , y se aplicó a una columna de agarosa de Bacitracina (Upfront Chromatography A/S) equilibrada en el amortiguador A. Después de lavar la columna de Bacitracina con el Amortiguador A para eliminar la proteína no unida, la proteasa se eluyó de la columna utilizando el Amortiguador A complementado con 2- propanol 25% y cloruro de sodio 1M. Las fracciones de la columna de Bacitracina con actividad de proteasa se acumularon y se transfirieron a CH3COOH 20 mM/NaOH, CaCl2 1 mM, pH 5 (Amortiguador B) mediante la cromatografía con G25 Sephadex. La acumulación de proteasa con el amortiguador intercambiado se aplicó a una columna SOURCE 30S (Amersham Pharmacia Biotech) equilibrada en el amortiguador B. Después de lavar la columna SOURCE 30S con el Amortiguador B, la proteasa se eluyó con un gradiente de NaCl lineal, creciente (0 a 0.5 M) en el Amortiguador B. Las fracciones de la columna se sometieron a prueba por la actividad de proteasa y las fracciones que contenían proteasas se analizaron con gel de SDS-PAGE. Las fracciones puras se acumularon y se utilizaron para la caracterización adicional.
Preparación de otras subtilisinas estables en ácido Las proteasas derivadas de Fusarium oxysporum IFO 4471, Bacillus alcalophilus NCIMB 10438, Paecilomyces 15 lilacinus CBS 102449, Aspergillus sp. CBS 102448, Acremonium chrysogenum ATCC 48272, y Acremonium kiliense ATCC 20388 se prepararon utilizando métodos convencionales, como se describe generalmente antes de la proteasa derivada de Bacillus alcalophilus, NCIMB 10438. 20 Secuencias Las siguientes secuencias de aminoácidos parciales se determinaron.
SEC ID NO: 1 N-terminal de la proteasa derivada de Acremonium chrysogenum ATCC 48272: ALVTQNGAPWGLGTISHRQPGSTSYIY; SEC ID NO: 2 N-terminal de la proteasa derivada de Bacillus alcalophilus NCIMB 10438: NQVTPWGITRVQAPTAW; SEC ID NO: 3 N-terminal de la proteasa derivada de Paecilomyces lilacinus CBS 102449: AYTQQPGAPWGLGRISH; SEC ID NO: 4 N-terminal de la proteasa derivada de Fusarium oxysporum IFO 4471: ALTTQSGATWGLGTVSHRSRGS . La secuencia de aminoácidos de la proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 SEC ID NO: 5 en este documento, ha sido determinada previamente (ver la patente norteamericana no. 5,650,326, SEC ID NOs : 4, 6 y 8). Una investigación en las bases de datos públicas de proteínas para las secuencias relacionadas reveló lo siguiente: SEC ID NO: 6 Geneseqp/r65936 (se refiere a la proteasa derivada de Paecilomyces lilacinus CBS 143.75 de EP 623672) relacionada a la SEC ID NO: 3; SEC ID NO: 7 Geneseqp/r74334 (se refiere a la proteasa derivada de Bacillus sp. THS-1001 de JP-07095882) - relacionada a la SEC ID NO: 2. Las cepas de Paecilomyces lilacinus y Aspergillus sp. han sido depositadas de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional de Deposito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimientos de Patente en la Centraalbureau voor Schimmelcutures (CBS), Apartado Postal 273, 3740 AG Baarn, Los Países Bajos, como sigue .
Fecha de depósito : 17 de Enero de 2000 CBS No. : Aspergillus sp. 102448 Fecha de depósito : 17 de Enero de 2000 CBS No. Paecilomyces lilacinus 102449 Los depósitos se hicieron por Novo Nordisk A/S y se asignaron posteriormente a Hoffmann-La Roche AG. Ejemplo 7 Caracterización y estudio comparativo de proteasas subtilisinas adicionales Las proteasas preparadas a partir de Bacillus alcalophilus NCIMB 10438, Fusarium oxysporum IFO 4471, Paecilomyces lilacinus CBS 102449, Aspergillus sp. CBS 102448, Acremonium chrysogenum ATCC 48272, Acremonium kiliense ATCC 20338 son todas subtilisinas. La pureza de las muestras de proteasa se determinó como se describe en el ejemplo 2. Se obtuvieron los siguientes resultados: n.d. = no determinada Ensayos Los ensayos de actividad en diferentes valores de pH, estabilidad en diferentes valores de pH y actividad en diferentes valores de temperatura se describen en el ejemplo 2 (el sustrato pNA Suc-AAPF-pNA (Sigma S-7388) se utilizó para todas las proteasas para los perfiles de actividad en diferentes valores de pH y estabilidad en diferentes valores de pH, mientras que las tabletas Protazyme AK se utilizaron para los perfiles de temperatura) . ^yy^ Una revisión de la actividad óptima (actividad en diferentes valores de pH y temperatura) se observa en la tabla 6. Los perfiles de estabilidad en diferentes valores de pH, actividad en diferentes valores de pH y actividad en diferentes valores de temperatura se observan en las figuras 4-6, y una comparación detallada de los datos de estabilidad en diferentes valores de pH para las proteasas en diferentes valores de pH ácidos se observa en la tabla 7.
Tabla 6 pH y temperatura óptimos de las diversas proteasas Proteasa PH Temperatura óptimo ópt:ima (°C) Bacillus alcalophilus NCIMB 10438 9 70 Fusarium oxysporum IFO 4471 11 60 Paecilomyces lilacinus CBS 102449 8 60 Aspergillus sp. CBS 102448 10 60 Acremonium chrysogenum ATCC 48272 9 70 Acremonium kiliense ATCC 20338 11 70 ^j^^ ^^¿ ^¡f™g^jafi^j^^.^^2^^^^KÍ^—«íßíií^^ -? Tabla 7 Estabilidad en diferentes valores de pH de diversas proteasas, pH 2.0 y 5.0 ^^^^j^^ÉÉggg^^^^^^^^^^^^^^ Ejemplo 8 Inhibición de proteasas con un Inhibidor de Subtilisina derivada de Streptomyces (ISS) El sustrato pNA: Suc-AAPF-pNA (Sigma® S-7388) se utilizó para medir la actividad residual después de la inhibición. Amortiguador del ensayo: ácido succínico 100 mM (Merck 1.00682), HEPES 100 mM (Sigma H-3375) , CHES 100 mM (Sigma C-2885) , CABS 100 mM (Sigma C-5580) , CaCl2 1 mM, KCl 150 mM, Titron® X -100 0.01%, pH 9.0. Temperatura del ensayo. 25°C El ISS se purificó de un sobrenadante de fermentación de Streptomyces albogriseol us FERM P-1205 (S-3253) mediante la cromatografía. La preparación del ISS utilizada tuvo una pureza arriba de 95% - la pureza se determinó mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 2A. Alternativamente, el ISS se puede obtener de Wako en Japón, catálogo no. 303-05201, fabricado por Daiwa Kasei K.K (ver por ejemplo: http://search.wako-chem.co.jp/lifedb e/lifedocs e/44834. asp) . Antes del ensayo de la inhibición posterior, el ISS se diluyó en Tritón X-100 0.01% a una concentración A280 = 0.010. Proteasa: La proteasa utilizada tuvo una pureza arriba de 95% - la pureza se determinó mediante el procedimiento descrito en el ejemplo 2A. Antes del ensayo de inhibición posterior, la proteasa se diluyó en Tritón X-100 0.01% a una concentración A280 = 0.010. La inhibición de las proteasas mediante el Inhibidor de Subtilisina derivada de Streptomyces (ISS) se determinó mediante el siguiente procedimiento: Una muestra de proteasa de 300 µl (concentración A280 = 0.010) se mezcló con 300 µl de ISS (concentración A280 = 0.010) y 1.5 mi del amortiguador del ensayo. Después de 15 minutos de incubación a temperatura ambiente, la actividad residual se midió por la adición de 1.5 mi del sustrato pNA (50 mg disuelto en 1.0 mi de DMSO y diluido adicionalmente 45x con Tritón® X-100 0.01%), y, después del mezclado, el incremento en la A405 se monitoreó por un espectrofotómetro. Como un control (sin ISS) , se utilizaron 300 µl de Tritón X- 15 100 0.01% en lugar del ISS. La actividad residual se normalizó con la actividad del control (sin ISS), es decir sin inhibición por el ISS dará 100% de actividad residual y la inhibición completa por el ISS dará 0% de actividad residual. 20 Se obtuvieron los siguientes resultados: *no determinada Ejemplo 9 Capacidad de las subtilisinas estables en ácido adicionales para degradar las partes insolubles de Harina de Soya (SBM) Las subtilisinas estables en ácido adicionales preparadas como se describe en el ejemplo 6 se sometieron a prueba como se describe en el ejemplo 3 por su capacidad para hacer las partes insolubles/indigeribles de la SBM accesibles para las enzimas digestivas y/o enzimas exógenas adicionadas. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 8 a continuación. Para comparación, los resultados obtenidos en el ejemplo 3 para las proteasas I y II se incluyen en la Tabla 8. ^ *^-*^^**^' ^^^^^«^^^^»^^¿^^s^tó^^^w^^g^^g^^^^^^^^«^^¿^^^^^^¿y Tabla 8 Capacidad de las proteasas adicionales para degradar el remanente de soya Proteasa, subtilisina de FITC / (+/-2000! Bacillus alcalophilus 81300 NCIMB 10438 Fusarium oxysporum 102200 IFO 4471 Paecilomyces lilacinus 98700 CBS 102449 Aspergillus sp. 123400 CBS 102448 Acremonium chrysogenum 89600 ATCC 48272 Acremonium kiliense 94600 ATCC 20338 Proteasa I -9200 Proteasa II -1200 Ejemplo 10 Efectos de la subtilisina estable en ácido derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 en el desempeño del crecimiento de pollos jóvenes. La prueba se llevó a cabo en el Centro de Investigación Roche para la Nutrición de .Animales (CRNA, F- i*?*?.**?t.?*****t* ***A-t 68305 Village-Neuf, Francia) de acuerdo con las instrucciones francesas oficiales para experimentos con animales vivos. Los pollos jóvenes de un día de edad ( ?Ross PM3' ) , separados por sexo, se suministraron por un criadero comercial. Los pollos son alojados en una serie de jaulas con piso de alambre, las cuales se mantuvieron en un cuarto con ambiente controlado. Se proporcionó alimento y agua de la llave ad libi tum . En el día 8, los pollos se dividieron por peso en grupos de 6 aves, las cuales se distribuyeron para ya sea el tratamiento de control, que recibieron la dieta experimental sin enzimas, o al tratamiento con enzimas, que recibieron la dieta experimental complementada con 100 mg de proteína enzimática de la proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 por kg de alimento. Cada tratamiento se duplicó con 12 grupos, 6 grupos de cada sexo. Los grupos se pesaron en los días 8 y 29. El consumo de alimento del período intermedio se determinó y se calcularon la ganancia de peso corporal y la relación de conversión del alimento. La dieta experimental en base a almidón de maíz y harina de soya (44% de proteína cruda) como ingredientes principales (Tabla 9) se produjo en el CRNA. El alimento se granuló (configuración del troquel: 3 x 20 mm) a aproximadamente 70 °C. Una cantidad apropiada de la proteasa ^^^^^^^^^¡¡^^yg^^^^^^fe Ü^^ derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 se diluyó en una cantidad fija de agua y se roció sobre el alimento granulado. Para el tratamiento de control, se utilizaron cantidades adecuadas de agua para manejar los tratamientos de la misma 5 manera. Para la evaluación estadística, se llevó a cabo un análisis de la variación de dos factores (factores: tratamiento y sexo) , utilizando el procedimiento GLM del paquete SAS (SAS Institute Inc., 1985). Donde se indicaron los efectos del tratamiento significante (p < 0.05), las diferencias entre el tratamiento significan que se analizaron con la prueba Duncan. Debido a las razones técnicas, una jaula del tratamiento con enzimas se excluyó de la evaluación estadística . 15 En la Tabla 2, se enlistan los resultados del rendimiento del crecimiento de los pollos jóvenes del día 8 al día 29. No hubieron interacciones entre el tratamiento y el sexo, por lo tanto, se presentan los resultados reunidos de ambos sexos. La complementación de la dieta experimental con la proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 mejoró la ganancia de peso numéricamente por 6.6%. La adición de la proteasa incrementó la captación de alimento ligeramente por 3.1%. La proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 mejoró la conversión de alimento de los pollos jóvenes significantemente por 3.4%. 'i'i?Milt— i<tt ittBMBi?tr -trii i?A-«rriHB ??^rtitf-ar*fc*-~^--'' — ^«— *— *^ — > - - * » ~*^ *.**.~*^***~ *-?** ? . * ** »* **. . * É Tomando en consideración que el almidón de maíz es un ingrediente altamente digerible, se puede asumir que los efectos observados fueron principalmente debido a la acción de las enzimas sobre la harina de soya. Por lo tanto, los resultados indicaron que el valor nutritivo de la harina de soya mejoró por la proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484. En conclusión, el estudio demostró que la complementación del alimento para pollos jóvenes que contiene cantidades altas de harina de soya con la proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 a 100 mg de proteína enzimática / kg de alimento dio por resultado un incremento numérico de la ganancia de peso y un mejoramiento significante de la conversión del alimento.
Referencias EEC (1986) : Directive de la Commission du 9 avril 1986 fixant la méthode de calcul de la valeur énérgetique des aliments composés destines á la volaille. Journal Officiel des Communautés Européennes, L130, 53 - 54 SAS Institute Inc. (1985): SAS® User's Guide, Versión 5 Edition. Cary NC Tabla 9 Composición de la dieta experimental Ingredientes (%) : Almidón de maíz 45.80 Harina de soya 44 1 44.40 Cebo 3.20 Aceite de soya 1.00 DL-Metionina 0.18 MCP 0.76 Sal 0.05 Aglutinador 1.00 Mezcla previa de vitaminas y 3.55 minerales Avatec® 15% CC 2 0.06 Contenido .Analizado: Proteína cruda (%) 19.3 ME, N-corregida (MJ/kg) 3 12.2 Grasa cruda (%) 5.3 1 contenido analizado: 90.6% de materia seca, 45.3% de proteína cruda, 2.0% de grasa cruda, 4.9% de fibra cruda. 2 correspondió a 90 mg de lasalocid-Na / kg de alimento anticoccidiano 3 calculado en base al contenido analizado de nutrientes (EC- equation; EEC, 1986) Proveedor de los ingredientes del alimento Almidón de Maíz: Roquettes Fréres, F-62136 Lestrem, Francia Harina de soya 44: Rekasan GmbH, D-07338 Kaulsdorf, Alemania Cebo: Fondoirs Gachot SA, F-67100 Strasbourg, Francia Aceite de soya: Ewoco Sari, F-68970 Guemar, Francia DL-Metionina: Produit Roche SA, F-92521 Neuilly-sur-Seine, Francia MPC: Brenntag Lorraine, F-54200 Toul, Francia Sal: Minoterie Moderne, F-68560 Hirsingue, Francia Aglutinador: Minoterie Moderne, F-68560 Hirsingue, Francia Mezcla previa (AM vol chair NS 4231) : Agrobase, F-01007 Bourg-en-Bresse, Francia Avatec: Produit Roche SA, F-92521 Neuilly-sur-Seine, Francia ^^^¿jj^¡¿^!^^j¡^^ Tabla 10 Rendimiento de los pollos jóvenes de los dias 8 a 29 Resultados acumulados de ambos sexos; promedio ± st. dev. Producto Control Proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 Dosis por kg de 0 100 mg de proteína alimento enzimática Jaulas x aves 12 x 6 11 x 61 Ganancia de peso 1155 A 1231 A (g/ave) ± 94 ± 98 (%) 1 00. 0 1 06. 6 Captación de 1941 A 2002 A alimento (g/ave) ± 108 ± 145 (%) 1 00. 0 1 03. 1 Conversión de 1.684 A 1.627 B alimento (g de ± 0.069 ± 0.031 alimento/g de 1 00. 0 96. 6 ganancia) (%) Los promedios dentro de una hilera, que no comparten un superíndice común son significantemente diferentes (p < 0.05) 1 Debido a razones técnicas, una jaula se excluyó de la evaluación estadística.
Hw J^irf-JSÉA'f-^-*"*'"-^' •—»—-- *-»"* *- *- ~— *- ' * **>,*-.-- •*.—*- .***... *-.*~*H *. ************ * ..,.**...*..* **,. -ii*....i .*. i Ejemplo 11 Mezcla previa y dietas para pavo y salmónidos complementada con proteasa derivada de subtilisina estable en ácido Una mezcla previa de la siguiente composición se prepara (contenido por kilo) : 5000000 IE Vitamina A 1000000 IE Vitamina D3 13333 mg Vitamina E 1000 mg Vitamina K3 7 75500 mmgg Vitamina Bl 2500 mg Vitamina B2 1500 mg Vitamina B6 7666 mg Vitamina B12 12333 mg Niacina 3 333333333 mmgg Biotina 300 mg Ácido Fólico 3000 mg Ca-D-pantotenato 1666 mg Cu 16666 mg Fe 1 166666666 mmgg Zn 23333 mg Mn 133 mg Co 66 mg I 66 mg Se 5.8 O Calcio A esta mezcla se adiciona la proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484 preparada como se describe en el ejemplo 2 en una cantidad que corresponde a 10 g de proteína enzimática de proteasa/kg. Las dietas de inicio y de crecimiento granuladas para pavo con una composición como se muestra en la tabla posterior (en base a Leeson y Summers, 1997 pero recalculada sin harina de carne al utilizar el programa de optimización AGROSOFT®) y con 100 mg de proteína enzimática de proteasa por kg se prepararon como sigue: Se mezcla maíz molido, harina de soya, harina de pescado y grasa vegetal en un mezclador en cascada o en serie. Se adicionan cal, fosfato de calcio y sal, junto con la mezcla previa en una cantidad de 10 g/kg de dieta, seguido por el mezclado. La mezcla resultante se granula (acondicionamiento con vapor seguido por el paso de granulación) .
También se preparan dos dietas para Salmónidos, como se resume en general anteriormente. Las composiciones reales se indican en la Tabla posterior (compilada de Refstie y colaboradores (1998), Aquaculture, vol. 162, p.301-302). El contenido estimado de nutrientes se recalculó al utilizar el programa de optimización de alimento Agrosoft®. La proteasa derivada de Bacillus sp. NCIMB 40484, preparada como se describe en el ejemplo 2, se adiciona a las dietas de una cantidad que corresponde a 100 mg de proteína enzimática de proteasa por kg. ÍS^A****** bitftf|| IIIIIÉUÉHIG I-""*- '- ^.^j.,-**^**,*, ^*-*^****^.*-**»***** ... .********** *A***.**A*¡ Ejemplo 12 Determinación de pureza de los productos de enzimas que contienen proteasa La pureza de los productos de enzimas que contienen proteasa, por ejemplo, preparación de proteasa tales como productos de enzimas de múltiples componentes comerciales, se puede determinar por un método en base al fraccionamiento del producto de enzimas que contiene proteasa en una columna de exclusión de tamaño. La cromatografía de exclusión de tamaño, también conocida como cromatografía de filtración de gel, se basa en una matriz porosa de gel (empacada en una columna) con una distribución de tamaños de poro comparables en tamaño a las moléculas de proteína que son separadas. Las moléculas de proteína relativamente pequeñas pueden difundirse dentro del gel de la solución circundante, mientras que se impedirá por su tamaño que las moléculas más grandes se difundan dentro del gel al mismo grado. Como resultado, las moléculas de proteínas son separadas de acuerdo por su tamaño con las moléculas más grandes eluyendo de la columna antes que las más pequeñas.
I *** £****** Ensayo de concentración de proteínas. La concentración de proteínas en los productos de enzimas que contienen proteasas se determina con un equipo de ensayo de proteínas BCA de PIERCE (idéntico a PIERCE No. de cat. 23225). La sal sódica del ácido Bicinconínico (BCA, por sus siglas en inglés) es un compuesto soluble en agua, estable capaz de formar un complejo color púrpura intenso con iones de cobre (Cu1+) en un ambiente alcalino. El reactivo de BCA forma la base del equipo de ensayo de proteínas BCA capaz de monitorear los iones de cobre producidos en la reacción de la proteína con Cu2+ alcalino (reacción Biuret) . El color producido por esta reacción es estable y se incrementa en una forma proporcional con el incremento de las concentraciones de proteína (Smith, P.K., y colaboradores (1985), Analytical Biochemistry, vol. 150, pp. 76-85). La solución de trabajo de BCA se hace al mezclar 50 partes del reactivo A con 1 parte del reactivo B (el Reactivo A es PIERCE No. de cat. 23223, contiene BCA y tartrato en un amortiguador de carbonato alcalino; el reactivo B es PIERCE No. de cat. 23224, contiene CuS04*5H20 4%). La muestra de 300 µl se mezcla con 3.0 mi de la solución de trabajo de BCA. Después de 30 minutos a 37°C, la muestra se enfría a temperatura ambiente y la A490 se lee como una medida de la concentración de proteínas en la muestra. Las disoluciones de albúmina de suero Bovino (PIERCE No. de cat. 23209) se incluyen en el ensayo como una norma.
Tratamiento previo de una muestra Si el producto de enzimas que contiene proteasa es un sólido, el producto se disuelve/suspende primero en 20 volúmenes de H3B03 100 mM, ácido 3, 3' -dimetilglutárico 10 mM, CaCl2 2 mM, pH 6 (Amortiguador A) durante al menos 15 minutos a 5°C, y si la enzima en esta etapa es una suspensión, la suspensión se filtra a través de un filtro de 0.45µ para dar una solución clara. La solución de este punto es tratada como un producto líquido de enzimas que contiene proteasa. Si el producto de enzimas que contiene proteasa es un líquido, el producto es dialisado primero en un tubo de diálisis SpectraPor separado de 6-8000 Da (No. de cat. 132 670 de Spectrum Medical Industries) contra 100 volúmenes del Amortiguador A + NaCl 150 mM (Amortiguador B) durante al menos 5 horas a 5°C, para eliminar los químicos de la formulación que pudieran dar productos líquidos de enzimas que contienen proteasa a alta viscosidad, lo cual es dañino para la cromatografía de exclusión de tamaño. El producto dializado de enzimas que contiene proteasa se filtra a través de un filtro de 0.45µ si se formó un producto precipitado durante la diálisis. La concentración de proteínas en el producto de enzimas dializado se determina con el ensayo de concentración de proteínas descrito anteriormente y el producto de enzimas se diluye con el Amortiguador B, para dar una muestra lista para la cromatografía de exclusión de tamaño con una concentración de proteína de 5 mg/ml. Si el producto de enzimas tiene una concentración de proteína menor que 5 mg/ml después de la diálisis, este se utiliza como está.
Cromatografía de exclusión de tamaño Una columna HiLoad26/60 Superdex75pg de 300 mi (Amersham Pharmacia Biotech) se equilibra en el Amortiguador B (Flujo: 1 ml/minuto). Se aplica 1.0 mi de la muestra de enzimas que contiene proteasa a la columna y la columna se eluye con el Amortiguador B (Flujo: 1 ml/minuto) . Se -colectan fracciones de 2.0 mi de la salida de la columna, hasta que toda la muestra aplicada haya sido eluida de la columna. Las fracciones colectadas son analizadas por el contenido de proteínas (ver el ensayo de concentración de proteínas anterior) y por la actividad de proteasa mediante los ensayos apropiados. Un ejemplo de un ensayo apropiado es el ensayo con Suc-AAPF-pNA (ver el ejemplo 2B) . Otros ensayos apropiados son por ejemplo el ensayo de CPU (ver el ejemplo 1), y el ensayo con Protazyme AK (ver el ejemplo 2D) . Las condiciones, por ejemplo pH, para los ensayos de actividad de proteasa se ajustan para medir tantas proteasas como sea posible en la muestra fraccionada. Las condiciones de los ensayos referidos anteriormente son ejemplos de las condiciones adecuadas. Otras condiciones adecuadas se ÍBlrtAi-Éirr*t**i**^t¿fc"*it-' •'- •' •A»*****?*^^********-¿*MA^* m» .*.t*?*?f*» HKaaH*.». mencionan anteriormente en la sección que se refiere a la medición de la actividad de proteasa. Un pico de proteína con actividad en uno o más de los ensayos de proteasa es definido como un pico de proteasa. La pureza de un pico de proteasa se calcula como la cantidad de proteína en el pico dividida con la cantidad de proteína total en todos los picos de proteasa identificados . La pureza de un producto de enzimas que contiene proteasa se calcula como la cantidad de proteína en el pico de proteasa estable en ácido dividida con la cantidad de proteína de todos los picos de proteasa identificados utilizando el procedimiento anterior.
Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención. ±ÁÁ^j-m?k*******

Claims (12)

  1. Reivindicaciones Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. El uso de al menos una proteasa estable en ácido en alimento para animales, en donde la proteasa (i) es de la familia de las subtilisinas; y/o (ii) tiene menos de 10% de actividad residual cuando se inhibe con ISS, y en donde (iii) la actividad residual de la proteasa después de la incubación durante 2 horas a 37 °C y pH 3.5 es al menos 40% de la actividad residual después de la incubación durante 2 horas a 5°C y pH 9.0, la proteasa es incubada en forma pura, A280 = 1.0, y la actividad residual es medida en Succ-AAPF-pNA y pH 9.0 y 25 °C. 2. El uso de al menos una proteasa estable en ácido en la preparación de una composición para el uso en el alimento para animales, en donde la proteasa (i) es de la familia de las subtilisinas; y/o (ii) tiene menos de 10% de actividad residual cuando se inhibe con ISS, y en donde (iii) la actividad residual de la proteasa después de la incubación durante 2 horas a 37 °C y pH 3.5 es al menos 40% de la actividad residual después de la incubación durante 2 horas a 5°C y pH 9.0, la proteasa es incubada en forma
  2. | M3Ujáijaag^g^^^^^^gHg^^^^^^u^^2«dt««^^^^ pura, A280 = 1.0, y la actividad residual es medida en Suc-AAPF-pNA y pH 9.0 y 25 °C.
  3. 3. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde la dosificación de la proteasa es 0.01-200 mg de proteína enzimatica de proteasa por kg de alimento.
  4. 4. El uso de conformidad con la reivindicación 2, en donde la dosificación propuesta de la proteasa es 0.01-200 mg de proteína enzimática de proteasa por kg de alimento.
  5. 5. Un método para mejorar el valor nutricional de un alimento para animales, caracterizado porque al menos una proteasa estable en ácido se adiciona al alimento, y en donde la proteasa (i) es de la familia de las subtilisinas; y/o (ii) tiene menos de 10% de actividad residual cuando se inhibe con ISS, y en donde (iii) la actividad residual de la proteasa después de la incubación durante 2 horas a 37 °C y pH 3.5 es al menos 40% de la actividad residual después de la incubación durante 2 horas a 5°C y pH 9.0, la proteasa es incubada en forma pura, A280 = 1.0, y la actividad residual es medida en Suc-AAPF-pNA y pH 9.0 y 25°C.
  6. 6. Una aditivo de alimento para animales, caracterizado porque comprende (a) al menos una proteasa estable en ácido; y (b) al menos una vitamina soluble en grasa, y/o (c) al menos una vitamina soluble en agua, y/o (d) al menos un mineral traza, y/o (e) al menos un macro-mineral; en donde la proteasa (i) es de la familia de las subtilisinas; y/o (ii) tiene menos de 10% de actividad residual cuando se inhibe con ISS, y en donde (iii) la actividad residual de la proteasa después de la incubación durante 2 horas a 37 °C y pH 3.5 es al menos 40% de la actividad residual después de la incubación durante 2 horas a 5°C y pH 9.0, la proteasa es incubada en forma pura, A28o = 1.0, y la actividad residual es medida en Suc-AAPF-pNA a pH 9.0 y 25°C.
  7. 7. El aditivo de alimento para animales de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado la cantidad de la proteasa corresponde a una adición propuesta de 0.01-200 mg de proteína de proteasa por kg de alimento.
  8. 8. El aditivo de alimento para animales de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 6-7, caracterizado porque además comprende fitasa, xilanasa, galactanasa, y/o beta-glucanasa . 9. Una composición de alimento para animales, caracterizada porque tiene un contenido de proteína cruda de 50-800 g/kg y que comprend al menos de una proteasa estable en ácido, en donde la proteasa (i) es de la familia de las subtilisinas; y/o (ii) tiene menos de 10% de actividad residual cuando se inhibe con ISS, y en donde (iii) la actividad residual de la proteasa después de la incubación durante 2 horas a 37 °C y pH 3.5 es al menos 40% de la actividad residual después de la incubación durante 2 horas a 5°C y pH 9.0, la proteasa es incubada en forma pura, A80 = 1.0, y la actividad residual es medida en Suc-AAPF-pNA a pH
  9. 9.0 y 25 °C.
  10. 10. La composición de alimento para animales de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la cantidad de la proteasa es 0.01-200 mg de proteína de proteasa por kg de alimento.
  11. 11. Un método para el tratamiento de proteínas vegetales, caracterizado porque comprende el paso de adicionar al menos una proteasa estable en ácido a al menos una proteína vegetal o una fuente de proteínas, en donde la proteasa (i) es de la familia de las subtilisinas; y/o (ii) tiene menos de 10% de actividad residual cuando se inhibe con ISS, y en donde (iii) la actividad residual de la proteasa después de la incubación durante 2 horas a 37 °C y pH 3.5 es al menos 40% de la actividad residual después de la incubación durante 2 horas a 5°C y pH 9.0, la proteasa es incubada en forma pura, A280 = 1.0, y la actividad residual es medida en Suc-AAPF-pNA a pH 9.0 y 25 °C.
  12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la soya entre se incluye entre al menos una fuente de proteína vegetal. kAit,á,^.****Í*f^***ti*** **i?*i**iJ*.* **-* í',-*****--*** *.-** * * **,* .ai. i...* *** s ..****-j*.*******t******m**t
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