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CN107072251A - 具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸以及它们在动物饲料方面的应用 - Google Patents

具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸以及它们在动物饲料方面的应用 Download PDF

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CN107072251A
CN107072251A CN201580059472.7A CN201580059472A CN107072251A CN 107072251 A CN107072251 A CN 107072251A CN 201580059472 A CN201580059472 A CN 201580059472A CN 107072251 A CN107072251 A CN 107072251A
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CN
China
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seq
polypeptide
animal feed
activity
protease
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Application number
CN201580059472.7A
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T·霍夫
P·R·厄斯特高
K·F·蓬托皮丹
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Novo Nordisk AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
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Publication date
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Abstract

本发明涉及包含具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂及其用途。确切地，该蛋白酶是来自两面神菌属、土壤球菌属(Terracoccus)和诺尔氏菌属(Knoellia)的丝氨酸S1蛋白酶，这些属都属于微球菌亚目(Micrococineae)的间孢囊菌科。这些蛋白酶在广pH范围(pH 3‑7)下具有高活性，并且因此在完整穿过消化道期间是高度活性的。它还涉及用于生产这些蛋白酶以及使用蛋白酶来改进动物性能和动物饲料营养价值的方法。

Description

具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸以及它 们在动物饲料方面的应用
对序列表的引用
本申请包含计算机可读形式的序列表，将其通过引用结合在此。
发明背景
发明领域
本发明涉及包含具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂及其用途。它还涉及用于生产这些蛋白酶以及使用蛋白酶来改进动物性能和动物饲料营养价值的方法。
发明背景
在动物饲料中使用蛋白酶(体内)，和/或这类的蛋白酶用于处理植物性蛋白(体外)的用途中，注意的是蛋白对于动物和人类是必需营养因子。大部分家畜和许多人从植物性蛋白来源获得这些必需蛋白。重要的植物性蛋白来源是例如油籽作物、豆类和谷类。
当例如大豆粉包含在单胃动物如猪和家禽的饲料中时，相当比例的大豆粉未被有效地消化(在小猪、生长猪和家禽如肉仔鸡、蛋鸡和公鸡中的表观回肠蛋白消化率仅是80％左右)。
动物的胃肠道是由一系列各自呈现不同pH环境的段组成。在单胃动物如猪和家禽以及许多类型的鱼中，胃是具有潜在地低至1-2的pH的强酸性的，而肠具有一个6-7.5左右的更中性的pH。除胃和肠之外，家禽在胃之前还具有一个嗉囊。嗉囊中的pH主要由消化的饲料决定并且因此典型地位于pH 4-6的范围内。通过一种蛋白酶消化蛋白可发生在整个消化道中，其条件是该蛋白酶是有活性的并存活于该消化道的条件下。因此，以下这样的蛋白酶是特别令人希望的：它们是高度地酸稳定的并且所以可以在胃环境中存活，并且同时在靶动物的消化道的宽范围的生理pH下是有效地有活性的。
由于动物饲料通常以粒状形式配制，其中在造粒过程中应用蒸汽，因此在暴露于所述蒸汽处理之后用于动物饲料中的蛋白酶仍能够保持是有活性的也是令人希望的。
为了生产用于工业使用的蛋白酶，重要的是生产高产量的蛋白酶，使得可获得足够量的该产品以能够以有利的价格提供该蛋白酶。
相关技术说明
来自S1家族的蛋白酶在本领域是已知的并且用于在动物饲料中使用。例如，WO01/58275披露了枯草杆菌蛋白酶家族的酸稳定性蛋白酶在动物饲料中的用途。WO 01/58276披露了衍生自拟诺卡氏菌属NRRL 18262的酸稳定性蛋白酶(10R蛋白酶)以及衍生自白拟诺卡氏菌DSM 14010的蛋白酶在动物饲料中的用途。WO 04/072221、WO 04/111220、WO04/111223、WO 05/035747以及WO 05/123911披露了与10R蛋白酶相关的蛋白酶及其在动物饲料中的用途。WO 04/072279披露了其他蛋白酶在动物饲料中的用途。WO 04/034776披露了枯草杆菌蛋白酶/角蛋白酶，来自地衣芽孢杆菌的PWD-1，在家禽饲料中的用途。
大豆和玉米是在农业中两种高度使用的蛋白质来源，并且因此重要的是，蛋白酶对这类底物具有良好的活性。有许多披露示出来自以下不同细菌来源的蛋白酶对大豆-玉米粉的活性，如韩国生工菌属(Kribbella)物种(WO 2013/026796)、糖多孢红霉菌(WO2013/110766和WO 2014/122161)、绿色糖单孢菌(WO 2013/189972)、澳大利亚糖丝菌(WO2013/041689)和指孢囊菌属物种(WO 2014/096259)。
此外，从其他细菌物种(例如两面神菌属(Janibacter sp.))分离的蛋白酶是本领域已知的。思拉什(Thrash)等人进行了如在“海上的两面神菌属菌株HTCC2649的基因组序列(Genome sequence of the Marine Janibacter Sp.Strain HTCC2649)”，2011，细菌学杂志(J.Bacteriol.)193:584-585中所描述的细菌两面神菌属HTCC2649的全基因组鸟枪法，该菌株已经在登录号AAMN01000001下被提交至EMBL/GenBank。由此基因组测序，将具有Uniprot编号A3TJ83(本文的SEQ ID NO:2)的多肽注释为丝氨酸蛋白酶。
吉田(Yoshida)等人进行了细菌Austwickia chelonae NBRC 105200的全基因组鸟枪法，该细菌被提交至EMBL/GenBank/DDBJ数据库，来自这些数据库的肽酶(Uniprot:K6VM97，SEQ ID NO:9)被注释与SEQ ID NO:5(对应于本文的SEQ ID NO:2和4的成熟多肽)具有62.1％序列一致性。
包含一种蛋白酶的并且销售以用于在动物饲料中使用的商业产品包括ProAct(DSM NP/诺维信公司)、(杜邦公司(DuPont))、(杜邦公司)、(杜邦公司)、AllzymeTM(奥特奇公司(Alltech))、(生物资源有限公司(BioResources,Int.)、PoultrygrowTM(杰夫公司(Jefo))和(诺伟思公司(Novus))。
然而，仍然需要找到在动物饲料领域内表现出改进的性质的蛋白酶。
发明概述
本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(c)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(d)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；
(ii)SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列；
(iii)SEQ ID NO:16的成熟多肽编码序列；或者
(iv)(i)、(ii)或(iii)的全长互补体；
(e)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(f)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(g)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:16的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(h)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:20的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50位置中包括一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；以及
(i)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多肽的片段，其中该片段包括至少170个氨基酸，例如至少175个氨基酸，至少177个氨基酸，至少180个氨基酸，至少185个氨基酸，至少190个氨基酸，至少195个氨基酸或至少200个氨基酸。
本发明进一步涉及本发明的蛋白酶在动物饲料中的用途，用于制备动物饲料的方法；改进动物饲料的营养价值的方法；用于处理蛋白的方法；用于提高蛋白质的消化率和/或溶解度的方法；用于改进动物中的一个或多个性能参数的方法以及生产本发明的多肽的方法。
序列表综述
SEQ ID NO:1是来自两面神菌属HTCC2649的S1蛋白酶1的DNA序列。
SEQ ID NO:2是如从SEQ ID NO:1推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:3是来自SEQ ID NO:1的重组体表达DNA序列的DNA序列。
SEQ ID NO:4是如从SEQ ID NO:3推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:5是来自两面神菌属HTCC2649的成熟S1蛋白酶1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:6是克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)分泌信号。
SEQ ID NO:7是蛋白酶10R(WO 05/035747，SEQ ID NO:1)的DNA序列。
SEQ ID NO:8是蛋白酶10R(WO 05/035747，SEQ ID NO:2)的氨基酸序列。
SEQ ID NO:9是来自Austwickia chelonae NBRC 105200(Uniprot:K6VM97)的肽酶的氨基酸序列。
SEQ ID NO:10是来自土壤球菌属(Terracoccus sp.)的S1蛋白酶1的DNA序列。
SEQ ID NO:11是如从SEQ ID NO:10推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:12是来自SEQ ID NO:10的重组体表达DNA序列的DNA序列。
SEQ ID NO:13是如从SEQ ID NO:12推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:14是来自土壤球菌属(Terracoccus sp.)的成熟S1蛋白酶1的氨基酸序列。
SEQ ID NO:15是保守基序VCG[E/Q]KVGQP。
SEQ ID NO:16是来自黄色诺尔氏菌(Knoellia flava)的S1蛋白酶1的DNA序列。
SEQ ID NO:17是如从SEQ ID NO:16(Uniprot:A0A0A0JF07)推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:18是SEQ ID NO:16的密码子优化的合成基因的DNA序列。
SEQ ID NO:19是如从SEQ ID NO:18推导的氨基酸序列。
SEQ ID NO:20是来自黄色诺尔氏菌的成熟S1蛋白酶1的氨基酸序列。
附图简述
图1示出了在25℃下，与蛋白酶10R相比，来自两面神菌属HTCC2649的S1蛋白酶1对Suc-AAPF-pNA底物的pH-活性曲线。
图2示出了与蛋白酶10R相比，来自两面神菌属HTCC2649的S1蛋白酶1的pH-稳定性曲线(在37℃下2小时后的残余活性)。
图3示出了与蛋白酶10R在pH 6.5下相比，来自两面神菌属HTCC2649的S1蛋白酶1在pH 7.0下对普罗塔酶AK(Protazyme AK)的温度活性曲线。
图4示出了与10R蛋白酶相比，来自两面神菌属HTCC2649的S1蛋白酶1对大豆-玉米粉的活性(OD340x稀释因子)。误差条显示2倍标准差。
图5示出了与10R蛋白酶相比，来自两面神菌属HTCC2649的S1蛋白酶1、两面神菌变体S68N和T71N、以及来自土壤球菌属(Terracoccus sp.)的S1蛋白酶1对大豆-玉米粉的活性(OD340x稀释因子)。
定义
多肽对大豆-玉米粉的活性：术语“多肽对大豆-玉米粉的活性”是指使用如本文所述的邻苯二甲醛(OPA)测定，确定酶对以30:70的比率混合的大豆粉-玉米粉的蛋白酶活性。PH值测定的实例是pH 3.0、4.0、5.0、6.0和7.0。温度测定的实例是30℃、35℃、40℃、45℃和50℃。时间测定的实例是2、3和4小时。酶浓度的实例是50、100、150、200、250和300mg酶蛋白/kg干物质的底物。
在一个优选的实施例中，通过以下来确定多肽对大豆-玉米粉的活性：将以30:70的比率混合的大豆粉-玉米粉(1g)添加到包含100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CAPS、1mM CaCl2、150mM KCl、0.01％Triton X-100(10mL)的缓冲液中，这些缓冲液已被制备并且使用HCl或NaOH调节至这样的pH值，使得大豆-玉米粉底物已经与测定缓冲液混合后，浆液的最终pH为pH 3.0、4.0、5.0、6.0或7.0；然后将一个等分试样的底物浆液(2mL)混合30min；添加溶解于100μl 100mM乙酸钠缓冲液(9.565g/L NaOAc、1.75g/L乙酸、5mM CaCl2、0.01％BSA、0.01％吐温20，pH6.0)中的蛋白酶(200mg酶蛋白/kg干物质)；在40℃(500rpm)下孵育样品3小时；离心样品(10min，4000rpm，0℃)；并使用邻苯二甲醛(OPA)测定(本文称为“大豆-玉米粉测定法”)收集上清液进行分析。在另一个优选的实施例中，如本文实例4所描述的，确定多肽对大豆-玉米粉的活性。
在一个实施例中，如SEQ ID NO:5的多肽，在pH 4下，本发明的多肽对大豆-玉米粉具有至少30％，例如至少40％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的活性。在一个实施例中，如SEQ ID NO:5的多肽，在pH 5下，本发明的多肽对大豆-玉米粉具有至少40％，例如至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的活性。
等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占用同一染色体基因座的一种基因的两个或更多个替代形式中的任一者。等位基因变异由突变天然产生，并且可以导致群体内多态性。基因突变可以是沉默的(在所编码的多肽中没有改变)或可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。
动物：术语“动物饲料”是指除人类以外的所有动物。动物的实例为非反刍动物和反刍动物。反刍动物包括例如，动物，如绵羊、山羊、牛(例如，肉牛、奶牛和牛犊)、鹿、yank、骆驼、美洲驼和袋鼠。非反刍动物包括单胃动物，例如，猪(包括但不限于小猪、成长猪、和母猪)；家禽，如火鸡、鸭和鸡(包括但不限于肉仔鸡和蛋鸡)；马(包括但不限于热血马、冷血马和温血马)、小牛；鱼(包括但不限于琥珀鱼、巨滑舌鱼、魮鱼、鲈鱼、蓝鱼、bocachico、鲤科鱼、鲶鱼、cachama、鲤鱼、鲶鱼、卡特拉鱼、遮目鱼、嘉鱼、丽鱼科鱼、军曹鱼、鳕鱼、小翻车鱼、金头鲷、石首鱼、鳗鱼、虾虎鱼、金鱼、丝足鱼、石斑鱼、guapote、大比目鱼、爪哇鱼(java)、野鲮属鱼、莱鱼(lai)、泥鳅、鲭鱼、牛奶鱼、银鲈、泥鱼、鲻鱼、帕高鱼(paco)、pearlspot、pejerrey、河鲈鱼、狗鱼、鲳参鱼、斜齿鳊、鲑鱼、虾米鱼(sampa)、加拿大鰤鲈、黑鲈、海鲤、发光鱼(shiner)、睡鲨(sleeper)、黑鱼、鲷鱼、锯盖鱼、比目鱼、刺足鱼、鲟鱼、翻车鱼、香鱼(sweetfish)、丁鲷、特罗尔鱼(terror)、罗非鱼、鳟鱼、鲔鱼、多宝鱼、白鳟鱼、白斑鱼和白鱼)；和甲壳动物(包括但不限于虾和对虾)。
动物饲料：术语“动物饲料”是指适合于、或打算用于由动物摄入的任何化合物、制剂、或混合物。单胃动物的动物饲料通常包括浓缩物连同维生素、矿物质、酶、直接饲养的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(例如在预混物中)，而反刍动物的动物饲料通常包括草料(包括粗粮和青贮)，并且可以进一步包括浓缩物连同维生素、矿物质、酶、直接饲养的微生物、氨基酸和/或其他饲料成分(例如在预混物中)。
体重增加：术语“体重增加”是指在给定时间段期间动物的活重增加，例如，从第1天到第21天的体重增加。
cDNA：术语“cDNA”是指可以通过从得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺少可以存在于相应基因组DNA中的内含子序列。早先的初始RNA转录本是mRNA的前体，其在呈现为成熟的剪接的mRNA之前要经一系列的步骤进行加工，包括剪接。
编码序列：术语“编码序列”意指直接指定一个多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界一般由开放阅读框架决定，该开放阅读框架从起始密码子(如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
组合物：术语“组合物”是指包括载体和本发明的至少一种酶的组合物。可以将在此所描述的组合物与动物饲料混合，并且可以将其称为“粉状饲料”。
浓缩物：术语“浓缩物”意指具有高蛋白和能量浓度的饲料，例如鱼粉、糖蜜、低聚糖、高粱、种子和谷物(例如来自玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦的整体或由破碎、碾磨等制备的)、油籽滤饼(例如从棉籽、红花、向日葵、大豆、油菜籽/卡诺拉、花生或落花生)、棕榈仁饼、酵母衍生材料和酒糟(例如湿酒糟(WDS)和具有可溶物的干酒糟(DDGS))。
控制序列：术语“控制序列”意指对于表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是天然的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导子、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。至少，控制序列包括启动子，以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将这些控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制酶切位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。
欧洲生产效能因子(EPEF)：术语“欧洲生产效能因子”是决定生产效率并考虑到饲料转化率、死亡率和日增重的一个术语。EEF计算为[(存活率(％)×体重增加(kg))/(以天计的研究持续时间)×FCR)]×100。
表达：术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于，转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。
表达载体：术语“表达载体”意直链性或环状DNA分子，该分子包含编码多肽的多核苷酸并且该多核苷酸可操作地与提供用于其表达的控制序列连接。
饲料转化率：术语“饲料转化率”是指用来增加动物的体重一个指定量的喂给动物的饲料量。改进的饲料转化率是指更低的饲料转化率。通过“更低的饲料转化率”或“改进的饲料转化率”，是指与当饲料不包含所述饲料添加剂组合物时，将动物体重增加相同量所需饲料量相比，饲料中饲料添加剂组合物的使用导致需要喂给动物的更低量的饲料，来增加动物体重一个指定量。
饲料效率：术语“饲料效率”是指当动物在一段时间内被任意喂养或喂养指定量的食物时每单位饲料的体重增加量。通过“增加的饲料效率”是指根据本发明的饲料添加剂组合物在饲料中的使用导致与不用所存在的所述饲料添加剂组合物喂养的动物相比，每单位饲料摄入的增加的增重。
草料：如本文定义的术语“草料”还包括粗粮。草料是新鲜的植物物料，例如来自草料植物(禾草)和其他草料植物(海草、发芽谷物和豆类植物)或其任何组合的干草和青贮。草料植物的实例是紫花苜蓿(Alfalfa、lucerne)、百脉根、芸苔属植物(例如，羽衣甘蓝、油菜籽(卡诺拉(canola))、芜菁甘蓝(瑞典芜菁)、萝卜)、三叶草(例如，杂三叶、红三叶、地三叶、白三叶)、禾草(例如，百慕大草、雀麦、伪燕麦草、羊茅、石南草(heath grass)、草地早熟禾、鸭茅(orchard grass)、黑麦草、梯牧草(Timothy-grass))、玉米(玉蜀黍)、小米、大麦、燕麦、黑麦、高粱、大豆和小麦和蔬菜(如甜菜)。草料进一步包括来自谷物产物的作物残余物(例如玉米秸秆，来自小麦、大麦、燕麦、黑麦和其他谷物的秸秆)，来自蔬菜像甜菜缨(beet top)的残余，来自油籽产物像来自大豆、油菜籽和其他豆类植物的茎和叶子的残余，以及来自用于动物或人类消耗的谷物精致过程或来自燃料生产或其他行业的部分。
片段：术语“片段”意指在成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺失一个或多个(例如，若干个)氨基酸的多肽；其中该片段具有蛋白酶活性。在一方面中，片段包括至少173个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸16至188)、至少177个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸12至188)、至少181个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸10至190)、至少185个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸9至193)、至少190个氨基酸残基(例如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸7至196)、或至少195个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5的氨基酸5至199)。
在另一方面中，片段包括至少174个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸16至189)、至少178个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸12至189)、至少182个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:11、SEQID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸10至191)、至少186个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸9至194)、至少191个氨基酸残基(例如SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸7至197)、或至少196个氨基酸残基(例如，SEQID NO:11、SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14的氨基酸5至200)。
在另一方面中，片段包括至少174个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸16至189)、至少178个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸12至189)、至少182个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:17、SEQID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸10至191)、至少186个氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸9至194)、至少191个氨基酸残基(例如SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸7至197)、或至少196个氨基酸残基(例如，SEQID NO:17、SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:20的氨基酸5至200)。
宿主细胞：术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体转化、转染、转导等的任何细胞类型。该术语“宿主细胞”涵盖亲本细胞的任何后代，由于复制期间发生的突变，该后代与其亲本细胞不完全相同。
分离的：术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其本质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于天然发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分，增加物质的量而修饰的任何物质(例如宿主细胞中的重组产生；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关的启动子更强的启动子)。
成熟多肽：术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。在一方面中，基于SignalP程序(尼耳森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)，该成熟多肽是SEQ ID NO:2的氨基酸1至203，并且SEQ ID NO:2的氨基酸-200至-171是信号肽。在另一方面中，该成熟多肽是基于EDMAN N-末端测序数据和完整MS数据的SEQ ID NO:4的氨基酸1至203(本文定义为SEQ ID NO:5)，并且SEQ ID NO:4的氨基酸-197至-171是信号肽。
在另一方面中，基于SignalP程序(尼耳森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)，该成熟多肽是SEQ ID NO:11的氨基酸1至204，并且SEQID NO:11的氨基酸-196至-171是信号肽。在另一方面中，该成熟多肽是基于EDMAN N-末端测序数据和完整MS数据的SEQ ID NO:13的氨基酸1至204(本文定义为SEQ ID NO:14)，并且SEQ ID NO:13的氨基酸-197至-171是信号肽。
在另一方面中，基于SignalP程序(尼耳森(Nielsen)等人，1997，蛋白质工程(Protein Engineering)10:1-6)，该成熟多肽是SEQ ID NO:17的氨基酸1至204，并且SEQID NO:17的氨基酸-198至-170是信号肽。在另一方面中，该成熟多肽是基于EDMAN N-末端测序数据和完整MS数据的SEQ ID NO:19的氨基酸1至204(本文定义为SEQ ID NO:20)，并且SEQ ID NO:19的氨基酸-198至-170是信号肽。
本领域已知，宿主细胞可以产生由同一多核苷酸表达的两种或更多种不同成熟多肽(即，具有不同C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。本领域还已知，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。
成熟多肽编码序列：术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有蛋白酶活性的成熟多肽的一种多核苷酸。在一方面中，基于SignalP程序(尼耳森(Nielsen)等人，1997，见上文)，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸601至1209，并且SEQ ID NO:1的核苷酸1至90编码信号肽。在另一方面中，基于SEQ ID NO:4的多肽的EDMAN N-末端测序数据和完整MS数据，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:3的核苷酸592至1200，并且SEQ ID NO:3的核苷酸1至81编码信号肽。
在另一方面中，基于SignalP程序(尼耳森(Nielsen)等人，1997，见上文)，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:10的核苷酸589至1200，并且SEQ ID NO:10的核苷酸1至78编码信号肽。在另一方面中，基于SEQ ID NO:13的多肽的EDMAN N-末端测序数据和完整MS数据，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:12的核苷酸592至1203，并且SEQ ID NO:12的核苷酸1至81编码信号肽。
在另一方面中，基于SignalP程序(尼耳森(Nielsen)等人，1997，见上文)，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:16的核苷酸595至1206，并且SEQ ID NO:16的核苷酸1至87编码信号肽。在另一方面中，基于多肽的EDMAN N-末端测序数据和完整MS数据，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:18的核苷酸589至1200，并且SEQ ID NO:18的核苷酸1至81编码信号肽。
核酸构建体：术语“核酸构建体”意指单-链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以本来不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或是合成的，该核酸分子包括一个或多个控制序列。
获得自或可获得自：术语“获得自或可获得自”是指多肽可以在来自特定分类等级的生物中发现。在一个实施例中，该多肽获得自或可获得自微球菌(Micrococcales)(以前称为微球菌Micrococcineae)目，其中术语目是分类等级。在另一个优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自间孢囊菌科(Intrasporangiaceae)，其中术语科是分类等级。
如果多肽的分类等级未知，则它可以容易地由本领域普通技术人员通过进行多肽的BLASTP检索(使用例如国家生物技术信息中心(NCIB)网站http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)并将其与最接近的同系物进行比较来确定。作为已知多肽的片段的未知多肽被认为是属于相同的分类物种。包括在多达10个位置中的取代、缺失和/或插入的未知天然多肽或人工变体被认为来自与已知多肽相同的分类物种。
可操作地连接：术语“可操作地连接”意指如下的构造，其中，控制序列相对于多核苷酸的编码序列安置在适当位置，使得该控制序列指导该编码序列的表达。
小粒：术语“小粒”和/或“粒化”是指固体圆形、球形和/或圆柱形片或小粒，以及用于形成此类固体形状的过程，特别是饲料小粒和固体挤出的动物饲料。如在此使用的，术语“挤出(extrusion或extruding)”是本领域众所周知的术语，并且是指如此处所描述的，在压力下使组合物通过一个孔口的过程。
性能参数：术语“性能参数”是指选自以下列表的许多项中的一项，该列表由以下各项组成：体重增加、欧洲生产效率因子(EPEF)、欧洲生产效能因子(EFF)以及FCR。术语“改进一个或多个性能参数”意指在一种或多种动物中体重增加的增加、欧洲生产效率因子(EPEF)的增加、欧洲生产效能因子(EFF)的增加和/或FCR的降低。
蛋白酶：术语“蛋白酶”在此被定义为水解肽键的酶。蛋白酶的定义也适用于如在此使用的术语“亲本蛋白酶”和“蛋白酶变体”的蛋白酶部分。术语“蛋白酶”包括属于EC3.4.21酶组(丝氨酸蛋白酶)的酶。EC编号参考加利福尼亚州(California)的圣迭戈(SanDiego)的NC-IUBMB学术出版社(Academic Press)的1992年酶命名法，分别包括出版于1994，欧洲生物化学杂志(Eur.J.Biochem.)223:1-5；1995，欧洲生物化学杂志232:1-6；1996，欧洲生物化学杂志237:1-5；1997，欧洲生物化学杂志250:1-6；以及1999，欧洲生物化学杂志264:610-650的增刊1-5。命名会定期得以增补和更新；参见例如万维网(WWW)于http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html。
本发明的蛋白酶和用于根据本发明的用途的蛋白酶选自肽酶家族S1的丝氨酸蛋白酶，如在1993，生物化学杂志(Biochem.J.)290:205-218中和在MEROPS蛋白酶数据库，发行9.9(2013年8月23日)(www.merops.ac.uk)中所描述的。该数据库描述于罗林斯(Rawlings)，N.D.，巴雷特(Barrett)，A.J.和贝特曼(Bateman)，A.，2010，“MEROPS：肽酶数据库(MEROPS:the peptidase database)”，核酸研究(Nucl.Acids Res.)38:D227-D233中。
为了测定给定蛋白酶是否为丝氨酸蛋白酶和S1家族的蛋白酶，可参考上述手册和其中述及的原理。可以对所有类型的蛋白酶进行这样的测定，而不论其是天然存在的或野生型蛋白酶；还是基因工程化的或合成的蛋白酶。
蛋白酶活性：术语“蛋白酶活性”意指蛋白水解活性(EC 3.4)。具有蛋白酶活性的多肽或蛋白酶有时还被指定为肽酶、朊酶、肽水解酶或蛋白水解酶。蛋白酶可以是始于任一端的水解肽的外切型蛋白酶或在多肽链内部发挥作用的内切型蛋白酶(内肽酶)。内肽酶对N-和C-末端被封闭的肽底物显示出活性，这些底物与所讨论的蛋白酶的特异性有关。
存在若干种蛋白酶活性类型，例如在Arg和Lys残基的羧基末端侧切割的胰蛋白酶样蛋白酶以及在疏水性氨基酸残基的羧基末端侧切割的糜蛋白酶样蛋白酶。本发明的蛋白酶是具有轻微碱性最适pH(最适pH 8-9.5)的丝氨酸内肽酶(EC 3.4.21)。
可以使用任何测定来测量蛋白酶活性，其中采用一种底物，该底物包括与所讨论的蛋白酶的特异性相关的肽键。pH测定和温度测定同样适用于所讨论的蛋白酶。pH值测定的实例是pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、或12。温度测定的实例是15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、80℃、90℃、或95℃。普通蛋白酶底物的实例是酪蛋白、牛血清白蛋白以及血红蛋白。在经典的安森(Anson)和米尔斯基(Mirsky)方法中，将变性的血红蛋白用作底物并且在用所讨论的蛋白酶孵育测定后，确定三氯乙酸可溶的血红蛋白的量用作蛋白酶活性的量度(安森(Anson)，M.L.和米尔斯基(Mirsky)，A.E.，1932，普通生理学杂志(J.Gen.Physiol.)16:59以及安森，M.L.，1938，普通生理学杂志22:79)。
出于本发明的目的，使用描述于“材料与方法”中的测定来确定蛋白酶活性，如Suc-AAPF-pNA测定和普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定。对于普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定，当用该蛋白酶孵育时，不可溶普罗塔酶AK(Protazyme AK)(天青精-交联的酪蛋白)底物释放蓝色并且确定该颜色作为蛋白酶活性的量度。对于Suc-AAPF-pNA测定，当用该蛋白酶孵育时，无色的Suc-AAPF-pNA底物释放黄色的对硝基苯胺并且确定该黄色作为蛋白酶活性的量度。
本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:5的多肽的至少20％，例如至少40％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。在另一个实施例中，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:14的多肽的至少20％，例如至少40％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。在另一个实施例中，本发明的这些多肽具有SEQ ID NO:20的多肽的至少20％，例如至少40％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、以及至少100％的蛋白酶活性。
粗粮：术语“粗粮”意指具有高水平纤维的干植物物料，例如来自种子和谷物以及作物残余物(例如秸秆、干椰肉(copra)、稻草、谷壳、甜菜废料)的纤维、麸、苞叶。
序列一致性：两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性通过参数“序列一致性”来描述。
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，遗传学趋势(Trends Genet.)16:276-277)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列一致性程度。使用版本6.1.0。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版)替代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(相同残基x 100)/(比对的长度-在比对中的空位总数)
出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件，赖斯(Rice)等人，2000，同上)(优选3.0.0版或更新版本)的尼德尔程序中所实施的尼德尔曼-翁施算法(尼德尔曼(Needleman)和翁施(Wunsch)，1970，同上)来确定两个脱氧核糖核苷酸序列之间的序列一致性程度。使用版本6.1.0。所用的任选参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5，和EDNAFULL(NCBI NUC4.4的EMBOSS版)替代矩阵。尼德尔标注的“最长的一致性”的输出(使用-非简化选项获得)被用作百分比一致性，并且如下计算：
(一致的脱氧核糖核苷酸x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)
青贮：术语“青贮”是指可以饲喂反刍动物(反刍-咀嚼(cud-chewing)动物，如牛和绵羊)或用作厌氧消化器的生物燃料原料的发酵的、高水分储存饲料。它被发酵并储存在称为青贮(ensilage、ensiling或silaging)的过程中，并且通常由草或谷类作物(例如玉米、高粱、燕麦、黑麦、梯牧草等饲草植物)或豆类作物(如三叶草(clovers/trefoils)、苜蓿、野豌豆)使用整个绿色植物(不仅是谷物)制成。青贮可以由许多大田作物制成，并且取决于类型可以使用特殊术语(针对燕麦的燕麦青贮(oatlage)、针对苜蓿的半干青贮(haylage))。通过将切割的绿色植被放在青贮窖中，通过将其堆积在用塑料片覆盖的大堆中，抑或通过将大包包裹在塑料膜中来制造青贮。
严格条件：不同的严格条件定义如下。
术语“非常低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用1.2X SSC、0.2％SDS，在65℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“低严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和25％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用1.2X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“中严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.6X SSC、0.2％SDS，在70℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“中-高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和35％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.6X SSC、0.2％SDS，在75℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.3X SSC、0.2％SDS，在75℃下洗涤三次，每次15分钟。
术语“非常高严格条件”意指对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃下在5X SSPE、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑鱼精子DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。载体材料最终使用0.15X SSC、0.2％SDS，在75℃下洗涤三次，每次15分钟。
子序列：术语“子序列”意指使一个或多个(例如，若干个)核苷酸从成熟多肽编码序列的5'端和/或3'端缺失的多核苷酸；其中该子序列编码具有蛋白酶活性的片段。在一方面中，子序列包含至少519个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸646至1164)、至少531个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸634至1164)、至少543个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸628至1170)、至少555个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸625至1179)、至少570个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸619至1188)、或至少585个核苷酸(例如，SEQ ID NO:1的核苷酸613至1197)。
在另一方面中，子序列包含至少522个核苷酸(例如，SEQ ID NO:10的核苷酸634至1155)、至少534个核苷酸(例如，SEQ ID NO:10的核苷酸622至1155)、至少546个核苷酸(例如，SEQ ID NO:10的核苷酸614至1161)、至少558个核苷酸(例如，SEQ ID NO:10的核苷酸611至1170)、至少573个核苷酸(例如，SEQ ID NO:10的核苷酸605至1179)、或至少588个核苷酸(例如，SEQ ID NO:10的核苷酸599至1188)。
在另一方面中，子序列包含至少522个核苷酸(例如，SEQ ID NO:16的核苷酸640至1161)、至少534个核苷酸(例如，SEQ ID NO:16的核苷酸628至1161)、至少546个核苷酸(例如，SEQ ID NO:16的核苷酸620至1167)、至少558个核苷酸(例如，SEQ ID NO:16的核苷酸617至1176)、至少573个核苷酸(例如，SEQ ID NO:16的核苷酸611至1185)、或至少588个核苷酸(例如，SEQ ID NO:16的核苷酸605至1194)。
基本上纯的多肽：术语“基本上纯的多肽”意指这样一种制剂，该制剂包含与其天然关联或重组关联的按重量计至多10％、至多8％、至多6％、至多5％、至多4％、至多3％、至多2％、至多1％、以及至多0.5％的其他多肽材料。优选地，该多肽按存在于制剂中的总多肽材料的重量计是至少92％纯的，例如至少94％纯的、至少95％纯的、至少96％纯的、至少97％纯的、至少98％纯的、至少99％纯的、至少99.5％纯的、以及100％纯的。本发明的多肽优选处于基本上纯的形式。例如，这可以通过采用熟知的重组方法或采用经典的纯化方法制备多肽来完成。
变体：术语“变体”意指在一个或多个(若干个)位置包含改变(即，一个或多个(若干个)氨基酸残基的取代、插入和/或缺失)的具有蛋白酶活性的多肽。取代意指用不同的氨基酸置换占据一个位置的氨基酸；缺失意指去除占据一个位置的氨基酸；并且插入意指邻近占据一个位置的氨基酸添加1-3个氨基酸。本发明的这些变体具有SEQ ID NO:5、和/或SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:20的至少20％，例如至少40％、至少65％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的蛋白酶活性。
命名法
出于本发明的目的，命名法[E/Q]是指在该位置的氨基酸可以是谷氨酸(Glu，E)或谷氨酰胺(Gln，Q)。同样，命名法[V/G/A/I]是指在该位置的氨基酸可以是缬氨酸(Val，V)、甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)或异亮氨酸(Ile，I)，依次类推如本文所述的其他组合。除非进一步另有限制，氨基酸X被这样定义，使得它可以是20种天然氨基酸中的任一种。
发明详述
包含具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂
大豆和玉米是在农业中两种高度使用的蛋白质来源，并且因此重要的是，蛋白酶对这类底物具有良好的活性。此外，在整个胃肠pH范围内(即在约pH 3和pH 7.5之间)表现出高活性的蛋白酶将具有重大意义，因为可以预期它们更好地在摄入后不久降解底物，并且贯穿大部分胃肠道。
已经发现，一些蛋白酶对商业相关的底物(大豆-玉米)具有令人惊讶的良好的pH-活性图，并且在比蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)更低的pH范围(4-5)中是显著更有活性的，同时在中性pH下也保持可比较的活性。
因此，在第一方面中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中：
(a)该多肽是肽酶家族S1的丝氨酸蛋白酶；
(b)该多肽在pH 4下与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性相比，具有对大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍或至少4倍更高的活性；
(c)该多肽在pH 5下与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性相比，具有对大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍或至少3倍更高的活性；并且
(d)与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，该多肽在pH 7下对大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。
在一个优选的实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
在一个优选的实施例中，使用如本文定义部分中所述的大豆-玉米粉测定法来确定该多肽对大豆-玉米粉的活性。
在一个实施例中，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有少于20倍，例如少于15倍、少于10倍、少于9倍、少于8倍的蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性，并且在pH 5下对大豆-玉米粉具有少于20倍，例如少于15倍、少于10倍、少于9倍、少于8倍的蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性。在一个实施例中，与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，该多肽在pH 7下对大豆-玉米粉具有小于200％的活性，例如小于180％、小于170％、小于160％、小于150％、小于140％、小于130％或小于125％的活性。
在一个实施例中，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少2倍更高的活性，在pH5下对大豆-玉米粉具有至少2倍更高的活性并且在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少75％的活性。在一个实施例中，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少2倍更高的活性，在pH 5下对大豆-玉米粉具有至少2倍更高的活性并且在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ IDNO:8)的至少90％的活性。在一个实施例中，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少2.5倍更高的活性，在pH 5下对大豆-玉米粉具有至少2.25倍更高的活性并且在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少75％的活性。在一个实施例中，该多肽在pH4下对大豆-玉米粉具有至少2.5倍更高的活性，在pH 5下对大豆-玉米粉具有至少2.25倍更高的活性并且在pH7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少90％的活性。
在一个实施例中，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少3倍更高的活性，在pH5下对大豆-玉米粉具有至少2.5倍更高的活性并且在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少75％的活性。在一个实施例中，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少3倍更高的活性，在pH 5下对大豆-玉米粉具有至少2.5倍更高的活性并且在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少90％的活性。在一个实施例中，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少3.5倍更高的活性，在pH 5下对大豆-玉米粉具有至少2.75倍更高的活性并且在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少75％的活性。在一个实施例中，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少3.5倍更高的活性，在pH 5下对大豆-玉米粉具有至少2.75倍更高的活性并且在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少90％的活性。
在一个实施例中，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少4倍更高的活性，在pH5下对大豆-玉米粉具有至少3倍更高的活性并且在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少75％的活性。在一个实施例中，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少4倍更高的活性，在pH 5下对大豆-玉米粉具有至少3倍更高的活性并且在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ IDNO:8)的至少90％的活性。在一个实施例中，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少4.5倍更高的活性，在pH 5下对大豆-玉米粉具有至少3倍更高的活性并且在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少75％的活性。在一个实施例中，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少4.5倍更高的活性，在pH 5下对大豆-玉米粉具有至少3倍更高的活性并且在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少90％的活性。
在一个优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自微球菌目。在一个甚至更优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自间孢囊菌科。
在第二方面中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中：
(a)该多肽是肽酶家族S1的丝氨酸蛋白酶；
(b)与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少25％的活性，例如至少30％、至少35％或至少40％的活性；
(c)与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 5下对大豆-玉米粉具有至少45％的活性，例如至少50％、至少55％、至少60％、或至少65％的活性；并且
(d)与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，该多肽在pH 7下对大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。
在一个优选的实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
在一个优选的实施例中，使用如本文定义部分中所述的大豆-玉米粉测定法来确定该多肽对大豆-玉米粉的活性。
在一个实施例中，与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有小于100％的活性，例如小于90％、小于80％、小于75％或小于70％的活性，并且与在pH 7下的活性相比，在pH 5下对大豆-玉米粉具有小于95％，例如小于90％、小于85％或小于80％的活性。在一个实施例中，与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，该多肽在pH 7下对大豆-玉米粉具有小于200％的活性，例如小于180％、小于170％、小于160％、小于150％、小于140％、小于130％或小于125％的活性。
在一个实施例中，与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 4下具有至少25％的活性；与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 5下具有至少45％的活性；并且该多肽在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少75％的活性。在一个实施例中，与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 4下具有至少25％的活性；与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 5下具有至少45％的活性；并且该多肽在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少90％的活性。
在一个实施例中，与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 4下具有至少30％的活性；与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 5下具有至少55％的活性；并且该多肽在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少75％的活性。在一个实施例中，与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 4下具有至少30％的活性；与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 5下具有至少55％的活性；并且该多肽在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少90％的活性。
在一个实施例中，与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 4下具有至少35％的活性；与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 5下具有至少60％的活性；并且该多肽在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少75％的活性。在一个实施例中，与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 4下具有至少35％的活性；与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 5下具有至少60％的活性；并且该多肽在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少90％的活性。
在一个实施例中，与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 4下具有至少40％的活性；与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 5下具有至少65％的活性；并且该多肽在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少75％的活性。在一个实施例中，与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 4下具有至少40％的活性；与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 5下具有至少65％的活性；并且该多肽在pH 7下具有蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的至少90％的活性。
在一个优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自微球菌目。在一个甚至更优选的实施例中，该多肽获得自或可获得自间孢囊菌科。
在第三方面中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中：
(a)该多肽是肽酶家族S1的丝氨酸蛋白酶；并且
(b)该多肽获得自或可获得自间孢囊菌科。
在一个实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
在一个实施例中，该多肽在pH 4下与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性相比，具有对大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍或至少4倍更高的活性。
在一个实施例中，该多肽在pH 5下与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性相比，具有对大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍或至少3倍更高的活性。
在一个实施例中，与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，该多肽在pH 7下对大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。
在一个优选的实施例中，该多肽：
(a)在pH 4下与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性相比，具有对大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍或至少4倍更高的活性；
(b)在pH 5下与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性相比，具有对大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍或至少3倍更高的活性；并且
(c)与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，在pH 7下对大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。
在一个优选的实施例中，该多肽：
(a)该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)；
(b)在pH 4下与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性相比，具有对大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍或至少4倍更高的活性；
(c)在pH 5下与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性相比，具有对大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍或至少3倍更高的活性；并且
(d)与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，在pH 7下对大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。
在第四方面中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1和50个氨基酸之间，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一个实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
在一个实施例中，该多肽已经被分离。动物饲料或动物饲料添加剂优选地包括SEQID NO:2的氨基酸序列或其等位基因变体或由它们组成；是一个从N-末端或C-末端缺失例如30、26、22、18、13、11、8或5个氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段，或者是一个具有蛋白酶活性的片段，其中该片段包括至少173个氨基酸，例如至少177个氨基酸、至少181个氨基酸、至少185个氨基酸、至少190个氨基酸、至少195个氨基酸或至少200个氨基酸。在另一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:2的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:2的氨基酸1至203或由其组成。
在第四方面的延续中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽与SEQ ID NO:5具有至少65％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少70％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ IDNO:5具有至少75％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少80％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少81％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少82％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ IDNO:5具有至少83％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少84％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少85％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少86％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ IDNO:5具有至少87％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少88％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少89％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少90％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ IDNO:5具有至少91％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少92％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少93％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少94％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ IDNO:5具有至少95％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少96％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少97％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少98％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ IDNO:5具有至少99％序列一致性。在一个实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
在第四方面的延续中，这些多肽与SEQ ID NO:5相差多达50个氨基酸，例如1和50个氨基酸之间，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一个实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
在一个实施例中，该多肽已经被分离。动物饲料或动物饲料添加剂优选地包括SEQID NO:5的氨基酸序列或其等位基因变体或由它们组成；是一个从N-末端或C-末端缺失例如30、26、22、18、13、11、8或5个氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段，或者是一个具有蛋白酶活性的片段，其中该片段包括至少173个氨基酸，例如至少177个氨基酸、至少181个氨基酸、至少185个氨基酸、至少190个氨基酸、至少195个氨基酸或至少200个氨基酸。在另一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:5的氨基酸1至203或由其组成。
在第四方面的延续中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，这些多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列，或者(iii)(i)或(ii)的全长互补体(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，分子克隆实验指南(Molecular Cloning,ALaboratory Manual)，第2版，冷泉港，纽约)。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第四方面的延续中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，这些多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第四方面的延续中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，这些多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第四方面的延续中，本发明涉及包含SEQ ID NO:5的一个或多个变体的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包括一个或多个取代、和/或缺失、和/或插入或其任何组合。在一个实施例中，包括在SEQ ID NO:5中的取代和/或缺失和/或插入或其任何组合的位置的数目在1和50之间，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个位置。在一个实施例中，包括在SEQ ID NO:5中的取代和/或缺失和/或插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:5中的取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:5中的取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在一个实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
氨基酸改变可以具有次要性质，即不显著影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基-或羧基末端延伸，如氨基末端蛋氨酸残基；至多20-25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或另一功能来促进纯化的小延伸，如多组氨酸序列、抗原性表位或结合结构域。
保守取代的实例是在下组的范围内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。一般不会改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的并且例如由H.诺伊拉特(Neurath)和R.L.希尔(Hill)，1979，在蛋白质(The Proteins)，学术出版社(Academic Press)，纽约中描述。常见的取代为Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、和Asp/Gly。
可替代地，氨基酸改变具有这样一种性质：改变多肽的物理化学特性。例如，氨基酸改变可以改进多肽的热稳定性、改变底物特异性、改变最适pH等。
可以根据本领域已知的方法，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变鉴定多肽中的必需氨基酸(康宁汉(Cunningham)和韦尔斯(Wells)，1989，科学(Science)244:1081-1085)。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且对所得突变体分子的蛋白酶活性进行测试以鉴定对于该分子的活性至关重要的氨基酸残基。还参见希尔顿(Hilton)等人，1996，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271:4699-4708。也可结合假定接触位点氨基酸的突变，如通过以下技术例如核磁共振、结晶学、电子衍射、或光亲和标记进行确定的对结构进行物理学分析，从而确定酶的活性位点或其他生物学相互作用。参见，例如德沃斯(de Vos)等人，1992，科学(Science)255:306-312；史密斯(Smith)等人，1992，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224:899-904；乌乐达维尔(Wlodaver)等人，1992，欧洲生物化学学会联盟通讯(FEBS Lett.)309:59-64。也可以从与相关多肽的比对推断必需氨基酸的身份。
S1家族的肽酶包含按His、Asp、Ser顺序的催化三联体。该催化三联体的任意氨基酸的突变将导致酶活性或底物特异性的变化或损失。如从两面神菌属HTCC2649(SEQ IDNO:5)分离的S1蛋白酶1的催化三联体的氨基酸是位置His-35、Asp-62和Ser-148。如从土壤球菌属(Terracoccus sp.)(SEQ ID NO:14)分离的S1蛋白酶1的催化三联体的氨基酸是位置His-35、Asp-62和Ser-149。如从黄色诺尔氏菌(SEQ ID NO:20)分离的S1蛋白酶1的催化三联体的氨基酸是位置His-35、Asp-62和Ser-149。
可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用已知的诱变、重组和/或改组方法进行测试，随后进行有关筛选程序，如由里德哈尔-奥尔森(Reidhaar-Olson)和萨奥尔(Sauer)，1988，科学(Science)241:53-57；博维(Bowie)和萨奥尔，1989，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86:2152-2156；WO 95/17413；或WO 95/22625所披露的那些。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示(例如，罗曼(Lowman)等人，1991，生物化学(Biochemistry)30:10832-10837；美国专利号5,223,409；WO 92/06204)和区域定向诱变(德比舍尔(Derbyshire)等人，1986，基因(Gene)46:145；Ner等人，1988，DNA 7:127)。
诱变/改组方法可以与高通量自动化筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的诱变多肽的活性(奈斯(Ness)等人，1999，自然生物技术(Nature Biotechnology)17:893-896)。可以从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并且使用本领域内标准方法快速测序。这些方法允许迅速确定多肽中单个氨基酸残基的重要性。
该多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的区域在另一种多肽的区域的N-末端或C-末端处融合。
该多肽可以是融合多肽或可裂解的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸与本发明多核苷酸融合而产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，并且包括连接编码多肽的编码序列，使得它们在框内，并且融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。也可以使用内含肽技术构建融合多肽，其中以翻译后方式产生融合多肽(库珀(Cooper)等人，1993，欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)12:2575-2583；道森(Dawson)等人，1994，科学(Science)266:776-779)。
融合多肽可以进一步包括两种多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，该位点被切割，从而释放出这两种多肽。切割位点的实例包括但不局限于在以下文献中披露的位点：马丁(Martin)等人，2003，工程微生物和生物技术杂志(J.Ind.Microbiol.Biotechnol.)3:568-576；斯瓦蒂娜(Svetina)等人，2000，生物技术杂志(J.Biotechnol.)76:245-251；拉斯马森-威尔逊(Rasmussen-Wilson)等人，1997，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)，63:3488-3493；沃德(Ward)等人，1995，生物技术(Biotechnology)13:498-503；以及孔特雷拉斯(Contreras)等人，1991，生物技术(Biotechnology)9:378-381；伊顿(Eaton)等人，1986，生物化学(Biochemistry)25:505-512；柯林斯-瑞思(Collins-Racie)等人，1995，生物技术13:982-987；卡特(Carter)等人，1989，蛋白质：结构、功能以及遗传学(Proteins:Structure,Function,and Genetics)6:240-248；以及史蒂文斯(Stevens)，2003，世界药物发现(Drug Discovery World)4:35-48。
碳水化合物分子通常在翻译后修饰过程中附接至来自真菌来源的多肽。为了辅助质谱分析，该多肽可以用内切糖苷酶孵育以使各N-连接的位置去糖基化。对于每个去糖基化的N-连接位点，一个N-乙酰己糖胺仍然在该蛋白质主链上。
在第五方面中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:11的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1和50个氨基酸之间，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一个实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
在一个实施例中，该多肽已经被分离。动物饲料或动物饲料添加剂优选地包括SEQID NO:11的氨基酸序列或其等位基因变体或由它们组成；是一个从N-末端或C-末端缺失例如30、26、22、18、13、11、8或5个氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段，或者是一个具有蛋白酶活性的片段，其中该片段包括至少174个氨基酸，例如至少178个氨基酸、至少182个氨基酸、至少186个氨基酸、至少191个氨基酸、至少196个氨基酸或至少201个氨基酸。在另一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:11的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:11的氨基酸1至204或由其组成。
在第五方面的延续中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽与SEQ ID NO:14具有至少65％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少70％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQID NO:14具有至少75％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少80％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少81％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少82％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少83％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少84％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少85％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少86％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少87％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少88％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少89％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少90％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少91％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少92％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少93％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少94％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少95％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少96％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少97％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少98％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少99％序列一致性。在一个实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
在第五方面的延续中，这些多肽与SEQ ID NO:14相差多达50个氨基酸，例如1和50个氨基酸之间，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一个实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
在一个实施例中，该多肽已经被分离。动物饲料或动物饲料添加剂优选地包括SEQID NO:14的氨基酸序列或其等位基因变体或由它们组成；是一个从N-末端或C-末端缺失例如30、26、22、18、13、11、8或5个氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段，或者是一个具有蛋白酶活性的片段，其中该片段包括至少174个氨基酸，例如至少178个氨基酸、至少182个氨基酸、至少186个氨基酸、至少191个氨基酸、至少196个氨基酸或至少201个氨基酸。在另一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:14或由其组成。在另一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:14的氨基酸1至204或由其组成。
在第五方面的延续中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，这些多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列，(ii)SEQ ID NO:12的成熟多肽编码序列，或者(iii)(i)或(ii)的全长互补体(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第五方面的延续中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，这些多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第五方面的延续中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，这些多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:12的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第五方面的延续中，本发明涉及包含SEQ ID NO:14的一个或多个变体的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或缺失、和/或插入或其任何组合。在一个实施例中，包括在SEQ ID NO:14中的取代和/或缺失和/或插入或其任何组合的位置的数目在1和50之间，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个位置。在一个实施例中，包括在SEQ ID NO:14中的取代和/或缺失和/或插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:14中的取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:14中的取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在一个实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ IDNO:15)。在本发明的第四方面中描述了氨基酸变化、保守取代和融合肽的实例。
在第六方面中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽与SEQ ID NO:17的成熟多肽具有至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99、％或100％序列一致性。在一个实施例中，这些多肽与SEQ ID NO:17的成熟多肽相差多达50个氨基酸，例如1和50个氨基酸之间，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一个实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
在一个实施例中，该多肽已经被分离。动物饲料或动物饲料添加剂优选地包括SEQID NO:17的氨基酸序列或其等位基因变体或由它们组成；是一个从N-末端或C-末端缺失例如30、26、22、18、13、11、8或5个氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段，或者是一个具有蛋白酶活性的片段，其中该片段包括至少174个氨基酸，例如至少178个氨基酸、至少182个氨基酸、至少186个氨基酸、至少191个氨基酸、至少196个氨基酸或至少201个氨基酸。在另一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:17的成熟多肽或由其组成。在另一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:17的氨基酸1至204或由其组成。
在第六方面的延续中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽与SEQ ID NO:20具有至少65％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少70％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQID NO:20具有至少75％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少80％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少81％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少82％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少83％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少84％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少85％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少86％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少87％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少88％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少89％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少90％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少91％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少92％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少93％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少94％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少95％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少96％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少97％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少98％序列一致性。在一个实施例中，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少99％序列一致性。在一个实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
在第六方面的延续中，这些多肽与SEQ ID NO:20相差多达50个氨基酸，例如1和50个氨基酸之间，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个氨基酸，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个氨基酸。在一个实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
在一个实施例中，该多肽已经被分离。动物饲料或动物饲料添加剂优选地包括SEQID NO:20的氨基酸序列或其等位基因变体或由它们组成；是一个从N-末端或C-末端缺失例如30、26、22、18、13、11、8或5个氨基酸并且具有蛋白酶活性的片段，或者是一个具有蛋白酶活性的片段，其中该片段包括至少174个氨基酸，例如至少178个氨基酸、至少182个氨基酸、至少186个氨基酸、至少191个氨基酸、至少196个氨基酸或至少201个氨基酸。在另一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:20或由其组成。在另一个实施例中，该动物饲料或动物饲料添加剂包含SEQ ID NO:20的氨基酸1至204或由其组成。
在第六方面的延续中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，这些多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交：(i)SEQ ID NO:16的成熟多肽编码序列，或(ii)(i)的全长互补体(萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。在一个实施例中，该多肽已经被分离。
在第六方面的延续中，本发明涉及包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，这些多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:16的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列一致性。在另外的实施例中，该多肽已经被分离。
在第六方面的延续中，本发明涉及包含SEQ ID NO:20的一个或多个变体的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或缺失、和/或插入或其任何组合。在一个实施例中，包括在SEQ ID NO:20中的取代和/或缺失和/或插入或其任何组合的位置的数目在1和50之间，例如1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10或1-5个位置。在一个实施例中，包括在SEQ ID NO:20中的取代和/或缺失和/或插入或其任何组合的位置的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:20中的取代和/或缺失和/或插入的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在另一个实施例中，在SEQ ID NO:20中的取代的数目不超过10，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。在一个实施例中，该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ IDNO:15)。在本发明的第四方面中描述了氨基酸变化、保守取代和融合肽的实例。
在一个优选的实施例中，本发明的第四、第五和第六方面的多肽还包括本发明的第一方面的特性。
在一个优选的实施例中，本发明的第四、第五和第六方面的多肽还包括本发明的第二方面的特性。
在一个优选的实施例中，本发明的第四、第五和第六方面的多肽还包括本发明的第三方面的特性。
在一个优选的实施例中，本发明的第四、第五和第六方面的多肽还包括本发明的第一和第二方面的特性。
在一个优选的实施例中，本发明的第四、第五和第六方面的多肽还包括本发明的第一和第三方面的特性。
在一个优选的实施例中，本发明的第四、第五和第六方面的多肽还包括本发明的第二和第三方面的特性。
在一个优选的实施例中，本发明的第四、第五和第六方面的多肽还包括本发明的第一、第二和第三方面的特性。
特性
酸度/碱度特性
在本发明的某些实施例中，就pH而言，本发明的蛋白酶展现了有益的特性，例如酸稳定性和最适pH。广泛的生理pH(例如，从4-7)上的活性覆盖上胃肠道(嗉囊pH 4-6；猪体内的胃pH有时高达pH 5-6)连同小肠(pH 6-7)两者。本发明的一个实施例是与蛋白酶10R相比，在40℃下在pH 3与7之间，例如在pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0和/或pH 7.0下具有改进的蛋白酶活性的分离的多肽。
温度-活性
可如在实例3中所述的确定该蛋白酶的温度-活性曲线。在低温度(37℃-50℃)下的活性对于在动物中蛋白的消化可以是有利的。
在一个实施例中，本发明包含一种蛋白酶，当与在60℃下的蛋白酶的活性(比较实例3)相比时，该蛋白酶具有在37℃下0.10或更高的相对活性、在50℃下0.40或更高的相对活性、或在60℃下0.80或更高的相对活性的pH 7.0下的温度活性曲线。
本发明的一个另外的实施例是与pH 6.5下的蛋白酶10R相比，在pH 7.0，例如60℃或以下，如50℃或以下、37℃或以下、或37℃与60℃之间、或50℃与60℃之间或在37℃下、或在50℃下或在60℃下具有改进的蛋白酶活性的分离的多肽。
热稳定性
可如在实例5中所述的确定热稳定性，即使用DSC测量来确定经纯化的蛋白酶蛋白的变性温度(Td)。Td指示了该蛋白的热稳定性：Td越高，热稳定性越高。因此，在一个优选的实施例中，本发明的蛋白酶具有一个Td，该Td高于参照蛋白酶的Td，其中Td是对经纯化的蛋白酶样品(优选地具有至少90％或95％的纯度，如通过SDS-PAGE确定的)确定的。
在优选的实施例中，如通过残余活性、变性温度Td所提供的这些热特性(例如加热稳定性、温度稳定性、热稳定性、蒸汽稳定性、和/或造粒稳定性)或本发明的蛋白酶的其他参数高于相应的值(如SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:14的蛋白酶的残余活性或Td)，更优选地是它的至少101％，或者它的至少102％、103％、104％、105％、106％、107％、108％、109％、或者至少110％。甚至更优选地，本发明的蛋白酶的参数(如残余活性或Td)的值是SEQ ID NO:5和/或SEQ ID NO:14和/或SEQ ID NO:20的蛋白酶的值的至少120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、或至少190％。
在仍另外的具体实施例中，本发明的热稳定的蛋白酶具有至少50℃的熔化温度Tm(或变性温度Td)，如通过在实例5(即在20mM乙酸钠，pH值4.0)中所述的差示扫描量热法(DSC)所确定的。在仍另外的具体实施例中，该Tm是至少51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、92℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃或至少100℃。
蒸汽稳定性
蒸汽稳定性可以如在实例6中所述的，通过确定在85℃或90℃下蒸汽处理一个短的时间之后蛋白酶分子的残余活性来确定。
造粒稳定性
造粒稳定性可如在实例7中所述的，通过使用与饲料预混合的酶颗粒来确定。由该混合器用蒸汽将该饲料调节至95℃。在调节之后，将该饲料加压成丸并确定残余活性。
具有蛋白酶活性的多肽的来源
可以从任何属的微生物获得根据本发明的具有蛋白酶活性的多肽。出于本发明的目的，如在此与给出的来源结合使用，术语“从…获得”应当意指由多核苷酸编码的多肽是由该来源或由其中已经插入来自该来源的多核苷酸的菌株产生的。在一方面中，从给定来源获得的多肽分泌至细胞外。
该多肽可以是细菌多肽。例如，该多肽可以是具有蛋白酶活性的、来自如放线菌门内的一种革兰氏阳性细菌或来自如变形菌门内的一种革兰氏阴性细菌的多肽。
在一方面中，该多肽是来自放线菌纲的细菌的蛋白酶，例如来自微球菌目，或来自间孢囊菌科，或来自两面神菌、土壤球菌属(Terracoccus)或诺尔氏菌属(Knoellia)。
这些分类单位的菌株在许多培养物保藏中心对于公众来说是容易获得的，这些保藏中心如美国典型培养物保藏中心(ATCC)、德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSM)、真菌菌种保藏中心(CBS)、以及农业研究机构专利培养物保藏中心北区研究中心(NRRL)。
可以使用上述探针，从其他来源包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水，等等)分离的微生物鉴定并获得该多肽。用于从天然生境(habitat)分离微生物的技术是本领域内公知的。随后可以通过类似地筛选另一种微生物的基因组或cDNA文库或混合DNA样品获得编码该多肽的多核苷酸。一旦用这种或这些探针检测到编码一种多肽的多核苷酸，就可以通过使用本领域普通技术人员众所周知的的技术分离或克隆该多核苷酸(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，见上文)。
多核苷酸
本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸，如在此所述。在一个实施例中，编码本发明的多肽的多核苷酸已经被分离。
用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域中已知的并且包括从基因组DNA或cDNA、或其组合进行分离。可以例如通过使用熟知的聚合酶链式反应(PCR)或表达文库的抗体筛选来检测具有共有结构特征的克隆DNA片段，实现从基因组DNA克隆多核苷酸。参见例如，伊尼斯(Innis)等人，1990，PCR：方法和应用指南(PCR:A Guide to Methods andApplication)，学术出版社(Academic Press)，纽约。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。可以从两面神菌、土壤球菌属(Terracoccus)或诺尔氏菌属(Knoellia)的菌株或来自微球菌属的相关生物中克隆多核苷酸，并且因此，例如可以是多核苷酸的多肽编码区的等位基因变体或物种变体。
核酸构建体
本发明还涉及包含与一个或多个控制序列可操作地连接的本发明多核苷酸的核酸构建体，其中所述控制序列指导编码序列在适合的宿主细胞中在与所述控制序列相容的条件下的表达。
可以用许多方式操作所述多核苷酸以便于多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操纵可以是令人希望的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。
该控制序列可以是启动子，即，被宿主细胞识别以对编码本发明的多肽的多核苷酸进行表达的多核苷酸。启动子包含介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变、截短和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因中获得。
用于在细菌宿主细胞中指导本发明的核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(阿盖塞(Agaisse)和勒尔克吕(Lereclus)，1994，分子微生物学(Molecular Microbiology)13:97-107)、大肠杆菌lac操纵子、大肠杆菌trc启动子(埃贡(Egon)等人，1988，基因(Gene)69:301-315)、天蓝链霉菌琼脂水解酶基因(dagA)、以及原核β-内酰胺酶基因(维拉-卡马洛夫(Villa-Kamaroff)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:3727-3731)以及tac启动子(德波尔(DeBoer)等人，1983，美国国家科学院院刊80:21-25)。其他启动子描述在吉尔伯特(Gilbert)等人，1980，科学美国人(Scientific American)242:74-94的“来自重组细菌的有用蛋白质(Useful proteinsfrom recombinant bacteria)”；以及在萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上。串联启动子的实例披露在WO 99/43835中。
在丝状真菌宿主细胞中，用于指导本发明的核酸构建体的转录的合适启动子的实例是获得自以下各项的基因的启动子：构巢曲霉乙酰胺酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡萄糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖镰孢胰蛋白酶–样蛋白酶(WO 96/00787)、镶片镰孢菌淀粉葡糖苷酶(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Daria(达莉亚)(WO 00/56900)、镶片镰孢菌Quinn(奎恩)(WO 00/56900)、米黑根毛霉脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，以及里氏木霉翻译延伸因子，连同NA2-tpi启动子(来自编码中性α-淀粉酶的曲霉属基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的曲霉属基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子；非限制性实例包括来自编码中性α-淀粉酶的黑曲霉基因的修饰的启动子，其中已经用来自编码丙糖磷酸异构酶的构巢曲霉或米曲霉基因的未翻译的前导子替换未翻译的前导子)；及其突变型、截短型及杂合型启动子。其他启动子在美国专利号6,011,147中描述。
在酵母宿主中，从针对以下各项的基因获得有用的启动子：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母乙醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1，ADH2/GAP)、酿酒酵母磷酸丙糖异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、和酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。在罗马诺斯(Romanos)等人，1992，酵母(Yeast)8:423-488中描述了酵母宿主细胞的其他有用启动子。
控制序列也可以是由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。终止子与编码该多肽的多核苷酸的3’-末端可操作地连接。在宿主细胞中有功能的任何终止子可以用于本发明中。
细菌宿主细胞的优选终止子从针对以下各项的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。
用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子是从以下各项的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延长因子。
用于酵母宿主细胞的优选终止子从以下各项的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)、以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。在罗马诺斯(Romanos)等人，1992，上文中描述了酵母宿主细胞的其他有用终止子。
该控制序列还可以是在启动子下游并且在基因编码序列上游的mRNA稳定子区域，它增加该基因的表达。
适合的mRNA稳定子区的实例是从以下获得的：苏云金杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(化(Hue)等人，1995，细菌学杂志(Journal ofBacteriology)177:3465-3471)。
该控制序列也可以是前导子，该前导子是对宿主细胞翻译重要的mRNA的非翻译区。该前导子与编码该多肽的多核苷酸的5’-末端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导子。
用于丝状真菌宿主细胞的优选前导子是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。
从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母醹-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得用于酵母宿主细胞的合适的前导子。
控制序列也可以是多聚腺苷化序列，一种与多核苷酸3’-末端可操作地连接并在转录时由宿主细胞识别为向转录的mRNA添加聚腺苷酸残基的信号序列。可以使用在宿主细胞中起作用的任何聚腺苷酸化序列。
用于丝状真菌宿主细胞的优选聚腺苷酸化序列是从以下各项的基因中获得的：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。
对于酵母宿主细胞有用的聚腺苷酸化序列在郭(Guo)和谢尔曼(Sherman)，1995，分子细胞生物学(Mol.Cellular Biol.)15:5983-5990中得以描述。
控制序列也可以是编码与多肽的N-末端连接并指导多肽进入细胞的分泌通路的信号肽的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’-端可以固有地包含在翻译阅读框中与编码多肽的编码序列的区段天然地连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5’-末端可以包含相对于编码序列为外来的信号肽编码序列。在编码序列不天然地包含信号肽编码序列的情况下，可能需要外来信号肽编码序列。可替代地，外来信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。
用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837生麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌鈣-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌醹-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。其他信号序列由西莫宁(Simonen)和帕尔瓦(Palva)，1993，微生物评论(Microbiological Reviews)57:109-137描述。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶的基因获得的信号肽编码序列。
从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得用于酵母宿主细胞的有用信号肽。其他的有用的信号肽编码序列由罗曼诺斯(Romanos)等人(1992，上文)描述。
控制序列也可以是编码位于多肽N-末端处的前肽的前肽编码序列。生成的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可以通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下各项的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶(WO 95/33836)、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、以及酿酒酵母α-因子。
在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列定位成紧邻多肽的N-末端并且该信号肽序列定位成紧邻该前肽序列的N-末端。
也可能令人希望的是添加调节序列，所述调节序列调节相对于宿主细胞的生长的多肽的表达。调节序列的实例是使得基因的表达响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac以及trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是那些允许基因扩增的序列。在真核系统中，这些调控序列包括在甲氨蝶呤存在下被扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸将与调控序列可操作地连接。
表达载体
本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。不同的核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可以包括一个或多个便利的限制酶切位点以允许在这些位点处插入或取代编码该多肽的多核苷酸。可替代地，该多核苷酸可以通过将该多核苷酸或包括该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中来表达。在产生该表达载体时，该编码序列位于该载体中，这样使得该编码序列与该供表达的适当控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是可便利地经受重组DNA程序并且可引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于该载体与有待引入该载体的宿主细胞的相容性。该载体可以是线性的或闭合的环状质粒。
该载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。该载体可包含任何用以保证自我复制的要素。可替代地，该载体可以是这样载体，当它被引入该宿主细胞中时，被整合到基因组中并且与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单一载体或质粒或两个或更多个载体或质粒(这些载体或质粒共同包包含待引入到宿主细胞的基因组中的总DNA)或转座子。
该载体优选包含一个或多个允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的选择性标记。选择性标记是这样一种基因，该基因的产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、重金属抗性、营养缺陷型的原养型等。
细菌性选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因，或赋予抗生素抗性(如氨比西林、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素或四环素抗性)的标记。用于酵母宿主细胞的适合的标记包括但不局限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、以及URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于，adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)、以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)、连同其等效物。优选地用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌bar基因。在木霉属细胞中优选使用的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。
选择性标记可以是如在WO 2010/039889中描述的双选择性标记系统。在一方面中，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。
载体优选包含允许载体整合到宿主细胞的基因组中或载体在细胞中独立于基因组自主复制的一个或多个元件。
对于整合到该宿主细胞基因组中，该载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或者用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，该载体可以包含用于指导通过同源重组而整合到宿主细胞基因组中的一个或多个染色体中的一个或多个精确位置的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置整合的可能性，这些整合元件应包含足够数量的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、以及800至10,000个碱基对，这些碱基对与对应的靶序列具有高度的序列一致性以提高同源重组的可能性。这些整合元件可以是与宿主细胞的基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，这些整合元件可以是非编码多核苷酸或编码多核苷酸。在另一方面，该载体可以通过非同源重组整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，该载体可以进一步包括使该载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是在细胞中起作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、以及pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、以及pAMβ1的复制起点。
用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANS1(格姆斯(Gems)等人，1991，基因(Gene)98:61-67；卡伦(Cullen)等人，1987，核酸研究(Nucleic Acids Res.)15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中披露的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将本发明多核苷酸的一个以上的拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包含与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝的细胞、以及由此该多核苷酸的另外的拷贝。
用于连接以上所描述的元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域的普通技术人员熟知的(参见，例如，萨姆布鲁克(Sambrook)等人，1989，同上)。
宿主细胞
本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接到一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，这些控制序列指导本发明的多肽的产生。将包括多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体被维持作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体，如早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制过程中发生的突变与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。
该宿主细胞可以是有用于重组产生本发明的多肽的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。
原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、海洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。
细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、坚硬芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌以及苏云金芽孢杆菌细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于：似马链球菌、酿脓链球菌、乳房链球菌以及马链球菌兽瘟亚种细胞。
细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌、除虫链霉菌、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌细胞。
将DNA引入芽孢杆菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见例如，张(Chang)和科恩(Cohen)，1979，分子遗传学与基因组学(Mol.Gen.Genet.)168:111-115)、感受态细胞转化(参见例如，杨格(Young)和斯皮宰曾(Spizizen)，1961，细菌学杂志(J.Bacteriol.)81:823-829；或杜拜努(Dubnau)以及大卫杜夫-阿贝尔森(Davidoff-Abelson)，1971，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)56:209-221)、电穿孔(参见例如，茂川(Shigekawa)和道尔(Dower)，1988，生物技术(Biotechniques)6:742-751)、或者接合(参见例如，克勒(Koehler)和索恩(Thorne)，1987，细菌学杂志169:5271-5278)。将DNA引入大肠杆菌细胞中可通过以下来实现：原生质体转化(参见，例如，哈纳汗(Hanahan)，1983，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)166:557-580)或电穿孔(参见，例如，道尔(Dower)等人，1988，核酸研究(Nucleic Acids Res.)16:6127-6145)。将DNA引入链霉菌属细胞中可通过以下来实现：原生质体转化、电穿孔(参见例如，贡(Gong)等人，2004，叶线形微生物学(FoliaMicrobiol.)(Praha(布拉格))49:399-405)、接合(参见例如，马佐迪耶(Mazodier)等人，1989，细菌学杂志(J.Bacteriol.)171:3583-3585)、或转导(参见例如，伯克(Burke)等人，2001，美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)98:6289-6294)。将DNA引入假单孢菌属细胞中可通过以下来实现：电穿孔(参见，例如，蔡(Choi)等人，2006，微生物学方法杂志(J.Microbiol.Methods)64:391-397)或接合(参见，例如，皮内多(Pinedo)和斯梅茨(Smets)，2005，应用与环境微生物学(Appl.Environ.Microbiol.)71:51-57)。将DNA引入链球菌属细胞中可通过以下来实现：天然感受态(参见，例如，佩里(Perry)和藏满(Kuramitsu)，1981，感染与免疫(Infect.Immun.)32:1295-1297)、原生质体转化(参见，例如，卡特(Catt)和卓林克(Jollick)，1991，微生物(Microbios)68:189-207)、电穿孔(参见，例如，巴克利(Buckley)等人，1999，应用与环境微生物学65:3800-3804)或者共轭(参见，例如，克利威尔(Clewell)，1981，微生物学评论(Microbiol.Rev.)45:409-436)。然而，可以使用本领域已知的用于将DNA引入宿主细胞中的任何方法。
宿主细胞也可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如在此使用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌(如霍克斯沃思(Hawksworth)等人定义，引自：安斯沃斯(Ainsworth)和比斯比(Bisby)的真菌大词典(Dictionary of The Fungi)，第8版，1995，国际CAB，大学出版社(University Press)，剑桥(Cambridge)，英国)。
真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如在此所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。由于酵母的分类可能在将来变化，为了本发明的目的，酵母应当如酵母的生物学与活性(Biology and Activities of Yeast)(斯金纳(Skinner)，帕斯莫尔(Passmore)和达文波特(Davenport)编著，应用细菌学学会专题论文集系列9(Soc.App.Bacteriol.Symposium Series No.9)，1980)所描述那样定义。
酵母宿主细胞可以是假丝酵母属、汉逊酵母属、克鲁弗酵母属、毕赤酵母属、酵母属、裂殖酵母属、或耶氏酵母属细胞，如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母、酿酒酵母、糖化酵母、道格拉氏酵母、克鲁弗酵母、诺地酵母、卵形酵母或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
该真菌宿主细胞可以是丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门(Oomycota)亚类的所有丝状形式(如霍克斯沃思等人，1995，上文定义)。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖、以及其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)，而碳分解代谢可以是发酵的。
丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属、金孢子菌属、鬼伞属、革盖菌属(Coriolus)、隐球菌属、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属、毛霉属、毁丝霉属、新美鞭菌属、链孢菌属、拟青霉属、青霉属、平革菌属、射脉菌属(Phlebia)、瘤胃壶菌属、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属、篮状菌属、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、弯颈霉属、栓菌属(Trametes)或木霉属细胞。
例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉、烟曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsisaneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsisgilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsisrivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsissubvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌、昆士兰金孢子菌(Chrysosporium queenslandicum)、热带金孢子菌、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢、谷类镰孢、库威镰孢、大刀镰孢、禾谷镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、拟分枝孢镰孢、硫色镰孢、圆镰孢、拟丝孢镰孢、镶片镰孢、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌、产紫青霉、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉、康宁木霉、长枝木霉、里氏木霉、或绿色木霉细胞。
真菌细胞可以通过下述过程转化，所述过程涉及原生质体形成、原生质体的转化、以及以本身已知的方式的细胞壁的再生。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的适合程序在EP 238023和约尔顿(Yelton)等人，1984，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81:1470-1474以及科里蒂森(Christensen)等人，1988，生物/技术(Bio/Technology)6:1419-1422中描述。用于转化镰刀菌属物种的适合方法在马拉迪耶(Malardier)等人，1989，基因(Gene)78:147-156和WO 96/00787中描述。可以使用由如以下文献描述的程序转化酵母：贝克尔(Becker)和瓜伦特(Guarente)，在阿贝尔森(Abelson)，J.N.和西蒙(Simon)，M.I.编，酵母遗传学与分子生物学指南(Guide to Yeast Genetics and MolecularBiology)，酶学方法(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology,Methods inEnzymology)，第194卷，第182-187页，学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)，纽约；伊藤(Ito)等人，1983，细菌学杂志(J.Bacteriol.)153:163；以及亨内恩(Hinnen)等人，1978，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)75:1920。
产生的方法
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，包括(a)在有益于产生该多肽的条件下培养细胞，该细胞以其野生型形式产生该多肽；(b)任选地分离该多肽；以及(c)回收该多肽。在一方面中，该细胞是两面神菌细胞。在另一方面中，该细胞是两面神菌HTCC2649细胞。在另一方面中，该细胞是土壤球菌属(Terracoccus)细胞。在另一方面中，该细胞是土壤球菌属(Terracoccus sp.)273MFTsu3.1细胞。在另一方面中，该细胞是诺尔氏菌属(Knoellia)细胞。在另一方面中，该细胞是黄色诺尔氏菌细胞。
本发明还涉及产生本发明的多肽的方法，该方法包括(a)培养重组芽孢杆菌属表达宿主细胞，其包含编码本发明的多肽的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接一个或多个控制序列，这些控制序列在有益于产生该多肽的条件下指导该多肽的产生；(b)任选地分离该多肽；以及(c)回收该多肽。
在一个实施例中，该芽孢杆菌属表达宿主细胞选自以下列表，该列表由以下各项组成：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、以及苏云金杆菌(Bacillusthuringiensis)。在一个优选的实施例中，该芽孢杆菌属表达宿主细胞选自以下列表，该列表由以下各项组成：地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌、和枯草芽孢杆菌。
这些宿主细胞是在适合于使用本领域中已知的方法产生该多肽的一种营养培养基中培养的。例如，可以通过摇瓶培养、或在实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞，所述培养在适合的培养基中并且在允许表达和/或分离多肽的条件下进行。该培养是使用本领域中已知的程序，在一种适合营养培养基中发生，该培养基包括碳和氮来源及无机盐。适合的培养基可从商业供应商获得或可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。如果多肽分泌到该营养培养基中，那么可直接从培养基中回收多肽。如果多肽不被分泌，那么其可从细胞裂解液中进行回收。
可以使用特异性针对这些多肽的本领域已知的方法来检测该多肽。这些检测方法包括但不限于，特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定来确定该多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法来回收多肽。例如，该多肽可以通过常规程序，包括但不限于，收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀，从该营养培养基回收。在一方面中，回收包含该多肽的发酵液。
可以通过本领域已知的多种方法纯化多肽，所述方法包括但不限于色谱(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水色谱法、聚焦色谱法和大小排阻色谱法)、电泳方法(例如，制备性等电聚焦)、差异性溶解(例如，硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE或提取(参见，例如，蛋白质纯化(Protein Purification)，编者詹森(Janson)和赖登(Ryden)，VCH出版公司，纽约，1989)，以便获得基本上纯的多肽。
在替代性方面，不回收多肽，而是使用表达该多肽的本发明宿主细胞作为多肽的来源。
植物
本发明还涉及分离的植物，例如转基因植物、植物部分或植物细胞，这些植物包括本发明的多肽，从而表达并且产生可回收的量的多肽或结构域。可从植物或植物部分回收多肽或结构域。作为替代方案，包括该多肽或结构域的植物或植物部分可以按原样用于改进食品或饲料的质量，例如改进营养价值、可口性及流变学特性，或破坏抗营养因素。
转基因植物可以是双子叶的(双子叶植物)或单子叶的(单子叶植物)。单子叶植物的实例是草，如草甸草(蓝草，早熟禾属)；饲草，如羊茅属(Festuca)、黑麦草属(Lolium)；温带草，如翦股颖属(Agrostis)；以及谷类，例如小麦、燕麦、黑麦、大麦、稻、高粱、以及玉蜀黍(玉米)。
双子叶植物的实例是烟草、豆类(如羽扇豆(lupins)、马铃薯、糖甜菜(sugarbeet)、豌豆、豆(bean)和大豆(soybean))、以及十字花科植物(十字花科(familyBrassicaceae))(如花椰菜、油菜籽、以及紧密相关的模式生物拟南芥)。
植物部分的实例是茎、愈伤组织、叶、根、果实、种子、以及块茎、以及包括这些部分的独立组织，例如，表皮、叶肉、薄壁组织(parenchyme)、维管组织、分生组织。
植物细胞和具体的植物细胞区室(如叶绿体、质外体、线粒体、液泡、过氧化物酶体和细胞质)也被认为是植物部分。
同样包含于本发明范围内的是这类植物、植物部分以及植物细胞的子代。
可以根据本领域已知方法构建表达该多肽或结构域的转基因植物或植物细胞。
本发明还涉及产生本发明的多肽或结构域的方法，该方法包括：(a)在有益于产生该多肽或结构域的条件下，培养包括编码该多肽或结构域的多核苷酸的转基因植物或植物细胞，以及(b)回收该多肽或结构域。
发酵液配制品或细胞组合物
本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。发酵液产物进一步包括在发酵过程中使用的另外的成分，例如像，细胞(包括包含编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞被用于产生感兴趣的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵介质和/或发酵产物。在一些实施例中，该组合物是包含一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。
如在此使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生、不经历或经历最低限的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养株在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞的酶表达)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳受限的条件下孵育生长到饱和时，产生发酵液。发酵液可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，发酵液是未分级的并且包括用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液包含用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。
在一个实施例中，该发酵液配制品和细胞组合物包括第一有机酸组分(包括至少一种1-5碳的有机酸和/或其盐)以及第二有机酸组分(包括至少一种6碳或更多碳的有机酸和/或其盐)。在具体实施例中，该第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐，或前述两种或更多种的混合物。
在一方面中，该组合物包括一种或多种有机酸，并且任选地进一步包含杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。
这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包括防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域中已知的其他试剂。
该细胞杀灭的全培养液或组合物可以包含在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包括用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下孵育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，该细胞杀灭的全培养液或组合物包括用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。
如在此描述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以包含不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。
本发明的全液配制品和细胞组合物可以通过WO 90/15861或WO 2010/096673中所描述的方法来产生。
组合物
本发明还涉及包含本发明的蛋白酶的组合物。优选地，这些组合物富集了这样一种蛋白酶。术语“富集”表示组合物的蛋白酶活性已增加，例如富集因子为至少1.1，例如至少1.2、至少1.3、至少1.4、至少1.5、至少2.0、至少3.0、至少4.0、至少5.0、至少10。
这些组合物可以包含本发明的多肽作为主要酶组分，例如单组分组合物。此类组合物可以进一步包括如下所述的调配剂。可替代地，这些组合物可以包括多于一种本发明的多肽(例如单一活性型组合物)和/或多种酶活性，例如一种或多种(例如，若干种)选自下组的酶，该组由以下各项组成：植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶，另外的蛋白酶，磷脂酶A1、磷脂酶A2、溶血磷脂酶、磷脂酶C、磷脂酶D、淀粉酶、溶菌酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、支链淀粉酶、和β-葡聚糖酶或其任何组合。
在一个实施例中，该组合物包括本发明第三方面的多肽和任选地一种调配剂。在一个实施例中，该组合物包括本发明第四方面的多肽和任选地一种调配剂。在一个实施例中，该组合物包括本发明第五方面的多肽和任选地一种调配剂。在一个实施例中，该组合物包括本发明第六方面的多肽和任选地一种调配剂。
调配剂
本发明的酶可以配制为液体或固体。针对液体配制品，该配制剂可以包括多元醇(如，例如，甘油、乙二醇或丙二醇)、盐(如，例如，氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾)或糖或糖衍生物(如，例如，糊精、葡萄糖、蔗糖、和山梨醇)。因此，在一个实施例中，该组合物是一种液体组合物，该液体组合物包括本发明的多肽和一种或多种选自以下列表的调配剂，该列表由以下各项组成：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、糊精、葡萄糖、蔗糖、和山梨醇。
针对固体配制品，该配制品可以是例如作为颗粒、喷雾干粉或聚结物。调配剂可以包括盐(有机的或无机的锌、钠、钾或钙盐，例如，如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)。
在一个实施例中，该固体组合物是处于颗粒形式。该颗粒可以具有基体结构(matrix structure)，其中组分是均匀混合的。然而，该颗粒典型地包括核心颗粒和一种或多种包衣，该包衣典型地是盐的和/或蜡质的包衣。该核心颗粒可以是任选地与一种或多种另外的酶组合的本发明的蛋白酶并且任选地连同一种或多种盐的均匀共混物，抑或是惰性颗粒(具有本发明的蛋白酶，该蛋白酶任选地与施加到其上的一种或多种另外的酶组合)。
在一个实施例中，核心颗粒的材料选自下组，该组由以下各项组成：无机盐(如乙酸钙、苯甲酸钙、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、山梨酸钙、硫酸钙、乙酸钾、苯甲酸钾、碳酸钾、氯化钾、柠檬酸钾、山梨酸钾、硫酸钾、乙酸钠、苯甲酸钠、碳酸钠、氯化钠、柠檬酸钠、硫酸钠、乙酸锌、苯甲酸锌、碳酸锌、氯化锌、柠檬酸锌、山梨酸锌、硫酸锌)、淀粉或糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、糖或糖衍生物(像例如，蔗糖、糊精、葡萄糖、乳糖、山梨醇)、有机小分子、淀粉、面粉、纤维素和矿物质。
盐包衣典型地至少是1μm厚并且可以是一种具体的盐或多种盐的混合物，例如Na2SO4、K2SO4、MgSO4和/或柠檬酸钠。其他实例是在例如WO 2008/017659、WO 2006/034710、WO 1997/05245、WO 1998/54980、WO 1998/55599、WO 2000/70034中描述的那些，或是例如在WO 2001/00042中描述的聚合物包衣。
在另一个实施例中，该组合物是一种固体组合物，该固体组合物包括本发明的蛋白酶和一种或多种选自以下列表的一种或多种调配剂，该列表由以下各项组成：氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纤维素。在一个优选的实施例中，该调配剂选自以下化合物中的一种或多种：硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠和碳酸钙。在一个优选的实施例中，该固体组合物是处于颗粒形式。在一个实施例中，该固体组合物是处于颗粒形式，并且包括核心颗粒、包含本发明的蛋白酶的酶层以及盐包衣。
在另外的实施例中，该调配剂选自以下化合物中的一种或多种：甘油、乙二醇、1,2-丙二醇或1,3-丙二醇、氯化钠、苯甲酸钠、山梨酸钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫代硫酸钠、碳酸钙、柠檬酸钠、糊精、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、乳糖、淀粉和纤维素。在一个优选的实施例中，该调配剂选自以下化合物中的一种或多种：1,2-丙二醇、1,3-丙二醇、硫酸钠、糊精、纤维素、硫代硫酸钠和碳酸钙。
动物饲料和动物饲料添加剂
本发明还涉及动物饲料组合物和动物饲料添加剂。动物饲料组合物或饮食具有相对高的蛋白含量。家禽和猪饮食的特征如WO 01/58275，表B第2-3栏所示。鱼饮食可被表征为该表B第4栏中所示的。此外，这类鱼食通常具有200-310g/kg的粗脂肪含量。
根据本发明的动物饲料组合物具有的粗蛋白含量为50-800g/kg，并且此外还包含至少一种如本文所述的蛋白酶或多于一种如本文所述的蛋白酶。
此外，或可替代地(对于以上指出的粗蛋白含量)，本发明的动物饲料组合物具有10-30MJ/kg的可代谢能量的含量；和/或0.1-200g/kg的钙含量；和/或0.1-200g/kg的有效磷含量；和/或0.1-100g/kg的甲硫氨酸含量；和/或0.1-150g/kg的甲硫氨酸加半胱氨酸含量；和/或0.5-50g/kg的赖氨酸含量。
在具体实施例中，可代谢能量、粗蛋白、钙、磷、甲硫氨酸、甲硫氨酸加半胱氨酸、和/或赖氨酸的含量落入WO 01/58275，表B，范围2、3、4或5(R.2-5)中的任何一个中。
粗蛋白以氮(N)乘以系数6.25计算，即粗蛋白(g/kg)＝N(g/kg)x6.25。通过凯氏定氮法(Kjeldahl method)测定氮含量(A.O.A.C.,1984，官方分析方法(Official Methodsof Analysis)第14版，官方分析化学家集(Association of Official AnalyticalChemists)，华盛顿特区)。
可代谢能量可根据NRC出版物猪的营养需求(Nutrient requirements inswine)，第九次再版1988，国家研究委员会农业部动物营养协会猪营养分会。美国国家科学院出版社，华盛顿特区，第2-6页和欧洲家禽饲养材料能量值表(European Table ofEnergy Values for Poultry Feed-stuffs)，斯克得霍特(Spelderholt)家禽研究与推广中心，7361DA贝克贝亨，荷兰，Grafisch bedrijf Ponsen&looijen公司，瓦赫宁恩.ISBN90-71463-12-5计算。
完整的动物饮食中钙、有效磷和氨基酸的饮食含量是在饲料表(如饲料表(Veevoedertabel)1997，化学成分数据(gegevens over chemische samenstelling)，饲料的消化率和营养价值(verteerbaarheid en voederwaarde van voedermiddelen)，中央饲料局(Central Veevoederbureau)，Runderweg 6,8219pk莱利斯塔德，ISBN 90-72839-13-7)的基础上计算。
在具体实施例中，本发明的动物饲料组合物包含如上定义的至少一种植物性蛋白。
本发明的动物饲料组合物还可以包含动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉，通常量为0-25％。本发明的动物饲料组合物还可以包含具有可溶物的干酒糟(DriedDistillers Grains)，通常量为0-30％。
在再进一步具体的实施例中，本发明的动物饲料组合物包含0-80％玉蜀黍；和/或0-80％高粱；和/或0-70％小麦；和/或0-70％大麦；和/或0-30％燕麦；和/或0-40％大豆粉；和/或0-25％鱼粉；和/或0-25％肉和骨粉；和/或0-20％乳清。
该动物饲料可以包括植物性蛋白。在具体实施例中，这些植物性蛋白的蛋白含量至少为10、20、30、40、50、60、70、80、或90％(w/w)。植物性蛋白可以衍生自植物性蛋白来源，如豆类和谷类，例如得自蝶形花科(豆科)、十字花科、藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉饼、羽扇豆粉饼、油菜籽粉饼、及其组合。
在一个具体实施例中，植物性蛋白来源是来自豆科(Fabaceae)的一种或多种植物的材料，如大豆、羽扇豆、豌豆、豆。在另一个具体实施例中，植物性蛋白来源是得自藜科的一种或多种植物，如甜菜，糖甜菜，菠菜或奎奴亚藜的材料。植物性蛋白来源的其他实例是油菜和卷心菜。在另一个具体实施例中，大豆是一种优选的植物性蛋白来源。植物性蛋白来源的其他实例是谷物，例如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、水稻、和高粱。
可将动物饮食制成例如糊状饲料(非丸状)或丸状饲料。通常，混合碾磨的饲料并根据所讨论的这些种类的说明添加充足量的必需维生素和矿物质。以固体或液体酶配制品的形式添加酶。例如，对于糊状饲料，在成分混合步骤前或期间可添加固体或液体酶配制品。对于丸状饲料，在饲料成分步骤前或期间还可加入该(固体或液体)蛋白酶/酶制剂。典型地，液体蛋白酶/酶制剂包括本发明的蛋白酶，任选地伴随着多元醇(例如甘油、乙二醇或丙二醇)，并且是在压丸步骤后添加，例如通过将该液体配制品喷涂至丸粒上。也可以将酶掺入饲料添加剂或预混物。
可替代地，可以通过冷冻液体酶溶液与膨胀剂(例如研磨的大豆粉)的混合物，并且然后冻干该混合物，来制备蛋白酶。
在一个实施例中，该组合物包括一种或多种另外的酶。在一个实施例中，该组合物包括一种或多种微生物。在一个实施例中，该组合物包括一种或多种维生素。在一个实施例中，该组合物包括一种或多种矿物质。在一个实施例中，该组合物包括一种或多种氨基酸。在一个实施例中，该组合物包括一种或多种其他饲料成分。
在另一个实施例中，该组合物包括一种或多种本发明的多肽、一种或多种调配剂和一种或多种另外的酶。在一个实施例中，该组合物包括一种或多种本发明的多肽、一种或多种调配剂和一种或多种微生物。在一个实施例中，该组合物包括一种或多种本发明的多肽、一种或多种调配剂和一种或多种维生素。在一个实施例中，该组合物包括一种或多种本发明的多肽和一种或多种矿物质。在一个实施例中，该组合物包括本发明的多肽、一种或多种调配剂和一种或多种氨基酸。在一个实施例中，该组合物包括一种或多种本发明的多肽、一种或多种调配剂和一种或多种其他饲料成分。
在另一个实施例中，该组合物包括一种或多种本发明的多肽、一种或多种调配剂和一种或多种选自以下列表的组分，该列表由以下各项组成：一种或多种另外的酶；一种或多种微生物；一种或多种维生素；一种或多种矿物质；一种或多种氨基酸；和一种或多种其他饲料成分。
饮食中的最终蛋白酶浓度在0.01-200mg蛋白酶蛋白/kg饮食的范围内，优选地在0.5-100mg/kg饮食之间，更优选地2-50mg，甚至更优选地5-25mg蛋白酶蛋白/kg动物饮食。
目前考虑，按以下量(剂量范围)中的一个或多个给予蛋白酶：0.01-200；0.01-100；0.5-100；1-50；5-100；5-50；10-100；0.05-50；5-25；或0.10-10-所有这些范围都是每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数(ppm)。
为了确定每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数，从饲料组合物中纯化蛋白酶，并且使用相关试验(参见蛋白酶活性)确定经纯化的蛋白酶的比活性。使用相同试验测定该饲料组合物的蛋白酶活性，并且在这两次测定的基础上计算出以每kg饲料中蛋白酶蛋白的mg数计的剂量。
在一个具体实施例中，本发明的动物饲料添加剂意欲以0.01％至10.0％，更具体0.05％至5.0％或0.2％至1.0％(％指g添加剂/100g饲料)的水平包含(或规定为必须包含)在动物饮食或饲料中。具体地说，对预混物也是如此。
使用相同的原理测定饲料添加剂中的蛋白酶蛋白mg数。当然，如果可获得制备饲料添加剂或饲料所用蛋白酶的样品，可由该样品测定比活性(无需从饲料组合物或添加剂中纯化蛋白酶)。
另外的酶
在另一个实施例中，本文所描述的这些组合物任选地包括一种或多种酶。酶可在来自NC-IUBMB，1992的手册酶命名法(Enzyme Nomenclature)的基础上分类，还可以在以下网址参见ENZYME网站：http://www.expasy.ch/enzyme/。ENZYME是相对于酶命名法的信息仓库。它主要基于国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会(IUB-MB)，学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，1992的推荐并且描述了所表征的酶的每种类型，为所述酶提供EC(酶委员会)编号(Bairoch A.The ENZYME database，2000，Nucleic Acids Res 28:304-305)。该IUB-MB酶命名法是基于它们的底物特异性并且偶尔也会基于他们的分子机制；此种分类并不反映这些酶的结构特征。
亨利萨特(Henrissat)等人在“2013年的碳水化合物活性酶数据库(Thecarbohydrate-active enzymes database)(CAZy)”，核酸研究(Nucl.Acids Res.)(2014年1月1日)42(D1):D490-D495中描述了某些糖苷水解酶(例如内切葡聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶、溶菌酶和半乳糖苷酶)的另一种分类；还参见www.cazy.org。
因此，本发明的组合物还可以包括选自下组的至少一种其他的酶，该组由以下各项组成：植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)；木聚糖酶(EC 3.2.1.8)；半乳聚糖酶(EC3.2.1.89)；α-半乳糖苷酶(EC 3.2.1.22)；蛋白酶(EC 3.4)，磷脂酶A1(EC 3.1.1.32)；磷脂酶A2(EC 3.1.1.4)；溶血磷脂酶(EC 3.1.1.5)；磷脂酶C(3.1.4.3)；磷脂酶D(EC 3.1.4.4)；淀粉酶，如，例如α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；溶菌酶(EC 3.2.1.17)；阿拉伯呋喃糖苷酶(EC3.2.1.55)；β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)；乙酰木聚糖酯酶(EC 3.1.1.72)；阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)；纤维素酶(E.C.3.2.1.4)；纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)；β-葡糖苷酶(EC3.2.1.21)；支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)和β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.4或EC 3.2.1.6)，或其任何组合。
在一个具体实施例中，本发明的组合物包括植酸酶(EC 3.1.3.8或3.1.3.26)。可商购的植酸酶的实例包括Bio-FeedTM植酸酶(诺维信(Novozymes))、P、NP和HiPhos(帝斯曼营养产品公司(DSM NutritionalProducts))、NatuphosTM(巴斯夫(BASF))、和Blue(AB酶公司(ABEnzymes))、(Huvepharma)、XP(范恩尼姆/杜邦公司(Verenium/DuPont))和PHY(杜邦公司(DuPont))。其他优选的植酸酶包括描述于，例如，WO 98/28408、WO 00/43503、和WO 03/066847中的那些。
在一个具体实施例中，本发明的组合物包括木聚糖酶(EC 3.2.1.8)。可商购的木聚糖酶的实例包括WX和G2(帝斯曼营养产品公司(DSMNutritional Products))、XT和Barley(AB维斯塔公司(AB Vista))、(范恩尼姆公司(Verenium))、X(Huvepharma)和XB(木聚糖酶/β-葡聚糖酶，杜邦公司(DuPont))。
在一个具体实施例中，本发明的组合物包括蛋白酶(EC 3.4)。可商购的蛋白酶的实例包括ProAct(帝斯曼营养产品公司(DSM Nutritional Products))。
微生物
在一个实施例中，该动物饲料组合物进一步包含一种或多种另外的微生物。在一个具体实施例中，该动物饲料组合物进一步包括来自以下属中的一个或多个属的细菌：乳杆菌属、乳球菌属、链球菌属、芽孢杆菌属、片球菌属、肠球菌属、明串珠菌属、Carnobacterium、杆菌属、丙酸杆菌属、双歧杆菌属、梭菌属和巨型球菌属(Megasphaera)或其任何组合。
在一个优选的实施例中，该动物饲料组合物进一步包括来自以下菌株中的一个或多个菌株的细菌：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘菌芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、屎肠球菌、肠球菌属和片球菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属、嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、乳酸乳球菌、两歧双歧杆菌、特氏丙酸杆菌(Propionibacteriumthoenii)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、鼠李糖乳杆菌、丁酸梭菌、动物双歧杆菌动物专化型(Bifidobacterium animalis ssp.animalis)、罗伊氏乳杆菌、唾液乳酸杆菌唾液专化型(Lactobacillus salivarius ssp.salivarius)、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、丙酸杆菌属。
在一个更优选的实施例中，该动物饲料组合物进一步包括来自枯草芽孢杆菌的以下菌株中的一个或多个菌株的细菌：3A-P4(PTA-6506)；15A-P4(PTA-6507)；22C-P1(PTA-6508)；2084(NRRL B-500130)；LSSA01(NRRL-B-50104)；BS27(NRRL B-501 05)；BS 18(NRRLB-50633)；和BS 278(NRRL B-50634)。
该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数为1x 104和1x 1014CFU/kg的干物质之间，优选地1x 106和1x 1012CFU/kg的干物质之间，并且更优选地1x 107至1x1011CFU/kg的干物质之间。在一个更优选的实施例中，该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数为1x 108和1x 1010CFU/kg的干物质之间。
该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数为1x 105和1x 1015CFU/动物/天之间，优选地1x 107和1x 1013CFU/动物/天之间，并且更优选地1x108和1x 1012CFU/动物/天之间。在一个更优选的实施例中，该动物饲料组合物中的每种细菌菌株的细菌计数为1x109和1x 1011CFU/动物/天之间。
在另一个实施例中，该一种或多种细菌菌株以稳定的孢子形式存在。
预混物
在一个实施例中，该动物饲料可以包括预混物，该预混物例如包括混合到动物饲料中的维生素、矿物质、酶、氨基酸、防腐剂、抗生素、其他饲料成分或其任何组合。
维生素和矿物质
在另一个实施例中，该动物饲料可以包括一种或多种维生素，例如一种或多种脂溶性维生素和/或一种或多种水溶性维生素。在另一个实施例中，该动物饲料可任选地包括一种或多种矿物质，例如一种或多种痕量矿物质和/或一种或多种巨量矿物质。
通常，脂溶性维生素-和水溶-性维生素、以及痕量矿物质形成了一种所谓的旨在添加到饲料中的预混料的部分，而大量矿物质通常被分开地添加到饲料中。
脂-溶性维生素的非限制性实例包括维生素A、维生素D3、维生素E、以及维生素K，例如维生素K3。
水-溶性维生素的非限制性实例包括维生素B12、生物素和胆碱、维生素B1、维生素B2、维生素B6、烟酸、叶酸和泛酸盐，例如Ca-D-泛酸盐。
痕量矿物质的非限制性实例包括硼、钴、氯化物、铬、铜、氟化物、碘、铁、锰、钼、硒和锌。
巨量矿物质的非限制性实例包括钙、镁、钾和钠。
在WO 01/58275的表A中，列出了这些组分的营养需求(以家禽和仔猪/猪为例)。营养需求指的是应在饮食中提供指定浓度的这些组分。
在可替代的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含WO 01/58275的表A中指定的单独组分中的至少一种。至少一种指的是一种或两种或三种或四种等直至所有十三种、或直至所有15种单独组分中的任一种，一种或多种。更具体地，该至少一种单独组分以提供在表A的第四栏或第五栏或第六栏说明的范围内的饲料中浓度(in-feed-concentration)的量包括在本发明的添加剂内。
在仍另外的实施例中，本发明的动物饲料添加剂包含以下维生素中的至少一种，优选使得其饲料内浓度落入下表1中所限定的范围之内(分别对于小猪饮食和肉仔鸡饮食)。
表1：一般性维生素建议
维生素 小猪饮食 肉仔鸡饮食
维生素A 10,000-15,000IU/kg饲料 8-12,500IU/kg饲料
维生素D3 1800-2000IU/kg饲料 3000-5000IU/kg饲料
维生素E 60-100mg/kg饲料 150-240mg/kg饲料
维生素K3 2-4mg/kg饲料 2-4mg/kg饲料
维生素B1 2-4mg/kg饲料 2-3mg/kg饲料
维生素B2 6-10mg/kg饲料 7-9mg/kg饲料
维生素B6 4-8mg/kg饲料 3-6mg/kg饲料
维生素B12 0.03-0.05mg/kg饲料 0.015-0.04mg/kg饲料
烟酸(维生素B3) 30-50mg/kg饲料 50-80mg/kg饲料
泛酸 20-40mg/kg饲料 10-18mg/kg饲料
叶酸 1-2mg/kg饲料 1-2mg/kg饲料
生物素 0.15-0.4mg/kg饲料 0.15-0.3mg/kg饲料
氯化胆碱 200-400mg/kg饲料 300-600mg/kg饲料
氨基酸
本发明的组合物还可包括一种或多种氨基酸。用于动物饲料的氨基酸的实例是赖氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。
其他饲料成分
本发明的组合物可以进一步包括着色剂、稳定剂、生长改进添加剂和香料化合物/调味品、多不饱和脂肪酸(PUFA)；活性氧产生物质、抗微生物肽和抗真菌多肽。
着色剂的实例是类葫萝卜素，例如β-胡萝卜素、虾青素、和叶黄素。
香料化合物/调味料的实例是甲氧甲酚，茴香醚，十、十一和/或十二内酯、紫罗酮、鸢尾酮、姜辣素、哌啶、亚丙基苯酞(propylidene phatalide)、亚丁基苯酞(butylidenephatalide)、辣椒素和鞣质。
抗微生物肽(AMP)的实例是CAP18、林可霉素(Leucocin)A、三色肽(Tritrpticin)、Protegrin-1、死亡素(Thanatin)、防卫素(Defensin)、乳铁蛋白、乳铁蛋白肽、和奥维司匹林(Ovispirin)如诺维司匹林(Novispirin)(罗伯特莱勒(Robert Lehrer)，2000)、菌丝霉素(Plectasins)以及他汀类，包含在WO 03/044049和WO 03/048148中所披露的化合物和多肽，以及以上的保留了抗微生物活性的变体或片段。
抗真菌多肽(AFP)的实例是巨大曲霉(Aspergillus giganteus)和黑曲霉的肽，连同其保留了抗真菌活性的变体和片段，如在WO 94/01459和WO 02/090384中披露的。
多不饱和脂肪酸的实例为C18、C20和C22多不饱和脂肪酸，如花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸和γ-亚油酸。
产生活性氧的种类的实例为化学品，如过硼酸盐、过硫酸盐或过碳酸盐；和酶，如氧化酶、加氧酶或合成酶。
本发明的组合物可以进一步包括至少一种氨基酸。用于动物饲料的氨基酸的实例是赖氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和色氨酸。
用途
本发明还针对用于使用具有蛋白酶活性的多肽或其组合物(用于例如动物饲料)的方法。
在动物饲料中的用途
本发明的蛋白酶还可以在动物饲料中使用。在一个实施例中，本发明提供了一种用于制备动物饲料组合物的方法，该方法包括将本发明的一种或多种蛋白酶添加至一种或多种动物饲料成分中。
根据WO 00/21381和WO 04/026334，还可以将本发明的一种或多种蛋白酶在动物饲料中用作改进饲料可消化性以增加其利用效率的饲料增强酶。
在一个另外的实施例中，可以将本发明的蛋白酶用于动物饲料中或用作饲料添加剂，其中它对动物消化道可以提供积极作用并且以此方式根据体重增加、饲料转化率(FCR)、欧洲生产效率因子(EPEF)、欧洲生产效能因子(EFF)改进动物生产性能，或改进动物健康，例如降低的死亡率。将FCR计算为相对于以g/动物计的的体重增加的以g/动物计的饲料摄入。
在根据本发明的用途中，可在饮食之前、之后或同时给动物饲喂蛋白酶。优选后者。
在一个具体实施例中，明确限定了将蛋白酶添加至饲料中时或将其包括在饲料添加剂中时蛋白酶的形式。明确限定指的是如经大小排阻色谱法(参见WO 01/58275的实例12)测定的，蛋白酶制剂至少为50％纯。在其他具体实施例中，如经此方法测定的，蛋白酶制剂至少为60％、70％、80％、85％、88％、90％、92％、94％、或至少为95％纯。
明确限定的蛋白酶制剂是有利的。例如，对于实质上不受其他蛋白酶干扰或污染的蛋白酶而言，更容易确定它在饲料中的正确剂量。术语正确配量具体指得到一致和恒定的结果的目标，和基于所希望的效果优化剂量的能力。
然而，为了在动物饲料中使用，蛋白酶不必是纯的；可以例如包括其他酶，此时可将其称为蛋白酶制品。
该蛋白酶制剂可以(a)直接加入饲料，或者(b)它可以用于随后加入饲料(或者用于处理过程中)的一种或多种中间组合物，如饲料添加剂或者预混物的生产。不论是否根据上述(a)或(b)来使用，上文所述的纯度指的都是原始蛋白酶制剂的纯度。
具体地说，使用重组生产方法即可获得纯度为上述数量级的蛋白酶制剂，然而，当通过传统的发酵方法生产蛋白酶时，要想获得这些蛋白酶制剂却并非易事，而且，批次与批次之间会有较高的差异。
这类蛋白酶制品当然可以与其他酶混合。
该蛋白可以是一种动物性蛋白，如肉和骨粉、羽毛粉、和/或鱼粉；或者其可以是一种植物性蛋白。
如本文所使用的术语植物性蛋白指包括至少一种得自或来源自植物的蛋白的任何化合物、组合物、制剂或混合物，其中所述蛋白包括经修饰蛋白或蛋白衍生物。在具体实施例中，这些植物性蛋白的蛋白含量至少为10％、20％、30％、40％、50％或60％(w/w)。
植物性蛋白可以衍生自植物性蛋白来源，如豆类和谷类，例如得自蝶形花科(豆科)、十字花科、藜科和早熟禾科植物的材料，如大豆粉、羽扇豆粉和油菜籽粉。
在一个具体实施例中，植物性蛋白来源是来自蝶形花科的一种或多种植物(例如大豆、羽扇豆、豌豆或蚕豆)的材料。
在另一个具体实施例中，植物性蛋白来源是得自藜科的一种或多种植物，如甜菜，糖甜菜，菠菜或奎奴亚藜的材料。
植物性蛋白来源的其他实例为油菜籽、向日蔡籽、棉籽和卷心菜。
大豆为优选的植物性蛋白来源。
植物性蛋白来源的其他实例为谷类，如大麦、小麦、黑麦、燕麦、玉蜀黍(玉米)、稻、黑小麦和高粱。
在处理过程的具体实施例中，所讨论的这种或这些种蛋白酶影响这些蛋白如植物性蛋白或蛋白来源(或对其发挥作用或施加水解或降解影响)。为了达到此目的，一般将蛋白或蛋白来源悬浮于溶剂，例如含水溶剂，如水中，并适当关注所讨论的酶的特征，以调节pH和温度值。例如，可在能使实际蛋白酶的活性至少为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少为90％的pH值下进行处理。类似地，例如，可在能使实际蛋白酶的活性至少为5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、或至少为90％的温度下进行处理。上述活性百分比指示是相对于最大活性而言的。持续进行酶解反应直至获得所需结果，然后可以通过例如热-处理步骤灭活酶来终止反应，或者也可以不终止反应。
在本发明处理过程的另一个具体实施例中，蛋白酶作用被维持，这意味着例如将蛋白酶加入这些蛋白，但其水解影响可以说尚未开启，直到后来当有此需求时，一旦建立了适当的水解条件，或一旦灭活了任何酶抑制剂，或不论使用何种其他方式延迟了酶的作用，才会开启其水解影响。
在一个实施例中，处理是预-处理动物饲料或用于动物饲料的蛋白，即这些蛋白是在摄入之前被水解的。
术语改进动物饲料的营养价值指的是提高饲料中的营养的可利用性。在本发明中，改进营养价值具体指的是改进饲料的蛋白部分的可利用性，从而导致蛋白提取的增加，较高的蛋白产量，和/或蛋白利用的改进。当饲料的营养价值增加时，蛋白和/或氨基酸消化率增加，并且该动物的生长速率和/或体重增加量和/或饲料转化(即相对于体重增加的饲料摄取量)可被改进。
能以任何形式将蛋白酶添加至饲料中，如它是相对纯的蛋白酶，或与欲添加至动物饲料的其他组分的混合物，即以动物饲料添加剂的形式，例如所谓的动物饲料预混物。
制备方法
在一个实施例中，本发明还涉及用于制备动物饲料或饲料添加剂的方法，该方法包括制备包含动物饲料和本发明第一方面的蛋白酶的动物饲料或饲料添加剂。
在一个实施例中，本发明还涉及用于制备动物饲料或饲料添加剂的方法，该方法包括制备包含动物饲料和本发明第二方面的蛋白酶的动物饲料或饲料添加剂。
在一个实施例中，本发明还涉及用于制备动物饲料或饲料添加剂的方法，该方法包括制备包含动物饲料和本发明第三方面的蛋白酶的动物饲料或饲料添加剂。
在一个实施例中，本发明还涉及用于制备动物饲料或饲料添加剂的方法，该方法包括制备包含动物饲料和本发明第四方面的蛋白酶的动物饲料或饲料添加剂。
在一个实施例中，本发明还涉及用于制备动物饲料或饲料添加剂的方法，该方法包括制备包含动物饲料和本发明第五方面的蛋白酶的动物饲料或饲料添加剂。
在一个实施例中，本发明还涉及用于制备动物饲料或饲料添加剂的方法，该方法包括制备包含动物饲料和本发明第六方面的蛋白酶的动物饲料或饲料添加剂。
核酸构建体、表达载体、重组宿主细胞和用于生产蛋白酶的方法
本发明还涉及包含编码本发明的蛋白酶的这类多核苷酸的核酸构建体、表达载体及重组宿主细胞。
本发明还涉及生产蛋白酶的方法，包括(a)对包含这种多核苷酸的重组宿主细胞进行培养；以及(b)回收该蛋白。
该蛋白对于宿主细胞而言可以是天然的或异源的。术语“蛋白”在此并不是指特定长度的编码产物并且，因此，涵盖肽、寡肽和蛋白。术语“蛋白质”还涵盖了组合形成编码的产物的两个或更多个多肽。这些蛋白还包括杂合多肽和融合多肽。
优选地，该蛋白是一种蛋白酶。该基因可以从任何原核、真核或其他来源获得。
本发明的优选实施例
在下面的一组项目中描述了本发明的优选实施例。
1.包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:2的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(c)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:11的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(d)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(e)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:17的成熟多肽具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(f)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(g)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；
(ii)SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列；
(iii)SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列；
(iv)SEQ ID NO:12的成熟多肽编码序列；
(v)SEQ ID NO:16的成熟多肽编码序列；或者
(vi)(i)、(ii)、(iii)、(iv)、或(v)的全长互补体；
(h)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(i)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:3的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(j)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(k)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:12的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(l)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:16的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(m)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:20的变体或SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:11或SEQ ID NO:17的成熟多肽，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个位置中包含一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；以及
(n)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)、(h)、(i)、(j)、(k)、(l)或(m)多肽的片段，其中该片段包括至少170个氨基酸，例如至少175个氨基酸、至少177个氨基酸、至少180个氨基酸、至少185个氨基酸、至少190个氨基酸、至少195个氨基酸或至少200个氨基酸。
2.如项目1所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽获得自或可获得自微球菌目。
3.如项目1至2中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽获得自或可获得自间孢囊菌科。
4.如项目1至3中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中：
(a)该多肽在pH 4下与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性相比，具有对大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍或至少4倍更高的活性；
(b)该多肽在pH 5下与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性相比，具有对大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍或至少3倍更高的活性；并且
(c)与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，该多肽在pH 7下对大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。
5.如项目1至4中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中：
(a)与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少25％的活性，例如至少30％、至少35％或至少40％的活性；
(b)与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 5下对大豆-玉米粉具有至少45％的活性，例如至少50％、至少55％、至少60％、或至少65％的活性；并且
(c)与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，该多肽在pH 7下对大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。
6.如项目1至5中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽包括SEQID NO:5、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19的成熟多肽，或SEQ ID NO:2的氨基酸1至203、SEQID NO:4的氨基酸1至203、SEQ ID NO:5的氨基酸1至203、SEQ ID NO:11的氨基酸1至204、SEQ ID NO:13的氨基酸1至204、SEQ ID NO:14的氨基酸1至204、SEQ ID NO:17的氨基酸1至204、SEQ ID NO:19的氨基酸1至204或SEQ ID NO:20的氨基酸1至204，或由它们组成。
7.包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中：
(a)该多肽是肽酶家族S1的丝氨酸蛋白酶；
(b)该多肽在pH 4下与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性相比，具有对大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍或至少4倍更高的活性；
(c)该多肽在pH 5下与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性相比，具有对大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍或至少3倍更高的活性；并且
(d)与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，该多肽在pH 7下对大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。
8.如项目7所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有少于20倍，例如少于15倍、少于10倍、少于9倍、少于8倍的蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性，并且在pH 5下对大豆-玉米粉具有少于20倍，例如少于15倍、少于10倍、少于9倍、少于8倍的蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性。
9.如项目7或8中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，该多肽在pH 7下对大豆-玉米粉具有小于200％的活性，例如小于180％、小于170％、小于160％、小于150％、小于140％、小于130％或小于125％的活性。
10.包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中：
(a)该多肽是肽酶家族S1的丝氨酸蛋白酶；
(b)与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少25％的活性，例如至少30％、至少35％或至少40％的活性；
(c)与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 5下对大豆-玉米粉具有至少45％的活性，例如至少50％、至少55％、至少60％、或至少65％的活性；并且
(d)与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，该多肽在pH 7下对大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。
11.如项目10所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有小于100％的活性，例如小于90％、小于80％、小于75％或小于70％的活性，并且与在pH 7下的活性相比，在pH 5下对大豆-玉米粉具有小于95％，例如小于90％、小于85％或小于80％的活性。
12.如项目10或11中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，该多肽在pH 7下对大豆-玉米粉具有小于200％的活性，例如小于180％、小于170％、小于160％、小于150％、小于140％、小于130％或小于125％的活性。
13.如项目7至12中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽获得自或可获得自微球菌目。
14.如项目7至12中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽获得自或可获得自间孢囊菌科。
15.包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中：
(a)该多肽是肽酶家族S1的丝氨酸蛋白酶；并且
(b)该多肽获得自或可获得自间孢囊菌科。
16.如项目1至15中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
17.如项目1至16中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，具有50至800g/kg的粗蛋白质含量。
18.如项目1至17中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，进一步包含选自以下列表的一种或多种组分，该列表由以下各项组成：
一种或多种另外的酶；
一种或多种微生物；
一种或多种维生素；
一种或多种矿物质；
一种或多种氨基酸；以及
一种或多种其他饲料成分。
19.如项目18所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中这些另外的酶选自下组，该组由以下各项组成：植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶，另外的蛋白酶，磷脂酶A1、磷脂酶A2、溶血磷脂酶、磷脂酶C、磷脂酶D、淀粉酶、溶菌酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、支链淀粉酶、和β-葡聚糖酶或其任何组合。
20.如项目18所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该一种或多种微生物选自下组，该组由以下各项组成：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘菌芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、肉食杆菌属(Carnobacterium sp.)、丁酸梭菌、梭菌属、屎肠球菌、肠球菌属、乳酸杆菌属、嗜酸乳杆菌、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳酸杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属、明串珠菌属、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、巨型球菌属(Megasphaera sp.)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、片球菌属、特氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)、丙酸杆菌属、以及链球菌属或其任何组合。
21.如项目1至20中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂的用途：
在用于在动物饲料中使用的组合物的制备中；
用于改进动物饲料的营养价值；
用于增加动物饲料中的可消化和/或可溶性蛋白；
用于增加动物饮食中的蛋白的水解程度；
用于改进动物中的一个或多个性能参数；和/或
用于处理蛋白。
22.一种用于制备动物饲料的方法，包括将如项目1至20中任一项所述的动物饲料添加剂与至少一种蛋白质或蛋白质源进行混合。
23.一种用于改进动物饲料的营养价值的方法，其中将如项目1至20中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂添加至饲料中。
24.一种用于处理蛋白的方法，包括以下步骤：将如项目1至20中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂添加到至少一种蛋白质或蛋白质源中。
25.一种用于增加蛋白质的消化率和/或溶解度的方法，包括将如权利要求1至20中任一项所述的动物饲料添加剂与至少一种蛋白质或蛋白质源进行混合。
26.一种用于改进动物中的一种或多种性能参数的方法，包括将如项目1至20中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂给予一种或多种动物。
27.如项目21所述的用途或如项目26所述的方法，其中性能参数选自以下列表，该列表由以下各项组成：体重增加(BWG)、欧洲生产效率因子(EPEF)以及饲料转化率(FCR)。
28.一种产生多肽的方法，该方法包括：
(a)培养重组芽孢杆菌表达宿主细胞，其包含编码项目1中所示的多肽的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接一个或多个控制序列，这些控制序列在有益于产生该多肽的条件下指导该多肽的产生；以及
(b)回收该多肽。
实例
菌株
在两面神菌属菌株HTCC2649的公开基因组序列中鉴定了来自两面神菌属的S1蛋白酶1，如在思拉什(Thrash)，J.C.、卓(Cho)，J.C.、Bertagnolli,A.D.、Ferriera,S.、约翰逊(Johnson)，J.、韦尔然(Vergin)，K.L.以及焦万诺尼(Giovannoni)，S.J.，“海上的两面神菌属菌株HTCC2649的基因组序列(Genome sequence of the Marine JanibacterSp.Strain HTCC2649)”，2011，细菌学杂志(J.Bacteriol.)193:584-585中所描述的。本文使用的DNA如实例1所述合成获得。根据该文章，该菌株从在百慕大(Bermuda)的东南部12英里的水电站S处、从10米深处收集的水中分离出来。
在土壤球菌属(Terracoccus sp.)273MFTsu3.1的基因组序列中鉴定了来自土壤球菌属(Terracoccus sp.)的S1蛋白酶1(来自JGI http://genome.jgi.doe.gov/(分类单元id 2522125155，JGI工程id 1000316))。本文使用的DNA如实例10所述合成获得。
在黄色诺尔氏菌的基因组序列(由朱(W.Zhu)和王(G.Wang)于2013年8月提交给EMBL/GenBank/DDBJ数据库)中鉴定了来自黄色诺尔氏菌TL1的S1蛋白酶1。根据向宇(XiangYu)、闫笃(Yan Du)和王歌娇(Gejiao Wang)，国际系统与进化微生物学杂志(International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology)(2012),62,384-389，从中华人民共和国中心的武汉的华中农业大学的养猪场的猪粪中分离出了黄色诺尔氏菌TL1。本文使用的DNA如实例14所述合成获得。
蛋白质测定
1)Suc-AAPF-pNA测定：
pNA底物：Suc-AAPF-pNA(巴亨(Bachem)L-1400)。
温度：室温(25℃)
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、及11.0。
将20μl蛋白酶(稀释于0.01％Triton X-100中)与100μl测定缓冲液混合。通过添加100μl pNA底物(50mg，溶解在1.0ml DMSO中，并进一步地用0.01％Triton X-100稀释45倍)开始进行测定。监测OD405的增加作为蛋白酶活性的量度。
2)普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定：
底物：普罗塔酶AK(Protazyme AK)片剂(交联和染色的酪蛋白；来自麦格酶公司(Megazyme))
温度：受控的(测定温度)。
测定缓冲液：100mM琥珀酸，100mM HEPES，100mM CHES，100mM CABS，1mM CaCl2，150mM KCl，0.01％Triton X-100，用HCl或NaOH调节至pH值2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、8.0、9.0、10.0、及11.0。
通过温和搅拌，将普罗塔酶AK(Protazyme AK)片剂悬浮于2.0ml0.01％Triton X-100中。将500μl的这种悬浮液和500μl的测定缓冲液分散在艾本德管中并置于冰上。添加20μl蛋白酶样品(稀释在0.01％Triton X-100中)。通过将艾本德(Eppendorf)管转移至设定为测定温度的艾本德恒温混匀仪来启动测定。将管在艾本德恒温混匀仪上在最高振摇速率(1400rpm.)下孵育15分钟。通过转移该管返回至冰浴停止孵育。随后将管在冰冷的离心机中离心数分钟并将200μl上清液转移至微量滴定板。读取OD650作为蛋白酶活性的量度。在测定法中包含空白缓冲液(buffer blind)(代替酶)。
3)邻苯二甲醛(OPA)测定：
这一测定检测伯胺并且因此可以将肽键由一种蛋白酶的切割测量为蛋白酶处理的样品与对照样品之间的吸光度的差异。基本上根据尼尔森(Nielsen)等人(尼尔森(Nielsen)，P.M.、彼得森(Petersen)，D、达姆麦妮(Dampmann)，C.，用于确定食物蛋白水解程度的改进方法(Improved method for determining food protein degree ofhydrolysis)，食品科学杂志(J Food Sci)，2001,66:642-646)进行该测定。
将0.5ml样品通过100kDa微量浓缩(Microcon)离心过滤器(60min，11,000rpm，5℃)过滤。将这些样品在去离子水中稀释大约(例如10倍、50倍或100倍)，并将25μL的每份样品装载到96孔微量滴定板中(5个重复)。将200μl OPA试剂(100mM四硼酸二钠十水合物、3.5mM十二烷基硫酸钠(SDS)、5.7mM二硫苏糖醇(DDT)、6mM邻苯二甲醛)分配在所有孔中，振荡该板(10sec，750rpm)并且在340nm下测量吸光度。
实例1：来自两面神菌属菌株HTCC2649的S1蛋白酶1的表达
基于被鉴定为SEQ ID NO:1的公开的核苷酸序列，由基因技术(Gene Art)(基因技术生物公司(GENEART AG BioPark)，约瑟夫-恩格特大街(Josef-Engert-Str.)11号，93053，雷根斯堡，德国)合成具有SEQ ID NO:3的经密码子优化的合成基因。如在WO 2012/025577中所述，使用ClaI和MluI限制酶切位点将该合成基因亚克隆进芽孢杆菌属表达载体中。用克劳氏芽孢杆菌分泌信号(具有以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA，SEQ ID NO:6)代替天然的分泌信号来表达该S1蛋白酶1。将表达质粒转化到枯草芽孢杆菌中。将表达盒通过同源重组进果胶裂解酶基因座中来整合。在每ml补充有6μg氯霉素的LB板上选择转化体。选择包含整合的表达构建体的重组体枯草芽孢杆菌克隆并且将其指定为来自两面神菌属HTCC2649的S1蛋白酶1。将其在500mL带挡板的锥形瓶(Erlenmeyer flask)中的旋转摇床上培养，每个锥形瓶包含100ml基于酵母提取物的培养基。将该克隆在30℃下培养3天。收获包含上清液的酶并如实施例2中所述的将该酶进行纯化。
实例2：来自两面神菌属HTCC2649的S1蛋白酶1的纯化
将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。将上清液通过Nalgene 0.2μm过滤单元进行过滤，以便去除其余的芽孢杆菌宿主细胞。将0.2μm滤液转移至在G25葡聚糖凝胶柱(来自GE医疗集团)上的10mM MES/NaOH、100mM H3BO3、2mMCaCl2(pH 5.5)。将G25葡聚糖凝胶转移的酶施加至在20mM MES/NaOH(pH 5.5)中平衡的SP-琼脂糖凝胶FF柱(来自GE医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在平衡缓冲液与20mM MES/NaOH、0.5mM CaCl2、0.5M NaCl(pH 5.5)之间的线性梯度洗脱超过五个柱体积。合并来自SP-琼脂糖凝胶FF柱(该柱包含来自两面神菌的S1蛋白酶1)的主峰，并添加固体硫酸铵至最终硫酸铵浓度为1.6M(NH4)2SO4。将经硫酸铵调节的合并物施加到苯基-琼脂糖凝胶FF高取代柱(来自GE医疗集团)上，该柱在10mM MES/NaOH、100mM H3BO3、2mM CaCl2、1.6M(NH4)2SO4(pH 6.0)中平衡。在用平衡缓冲液充分地洗涤柱之后，将蛋白酶用在平衡缓冲液与10mM MES/NaOH、100mM H3BO3、10mM MES、2mM CaCl2(pH 6.0)+25％2-丙醇之间的线性梯度洗脱超过五个柱体积。合并来自苯基-琼脂糖凝胶FF柱(该柱包含来自两面神菌的S1蛋白酶1)的的主峰，并转移到G25葡聚糖凝胶柱(来自GE医疗集团)上的20mMCH3COOH/NaOH，1mM CaCl2(pH 4.5)。将G25葡聚糖凝胶转移的酶施加至在20mM MES/NaOH、1mM CaCl2(pH 4.5)中平衡的SP-琼脂糖凝胶FF柱(来自GE医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)洗脱超过四个柱体积。分析来自柱的部分的蛋白酶活性(在pH 7下使用普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定)并且通过SDS-PAGE进一步分析活性部分。将在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上仅见到一条带的部分合并，并且用3％NaOH将pH调节至pH 5.8。来自SP-琼脂糖凝胶FF柱的调节的合并物是纯化制剂并且用于进一步表征。
实例3：来自两面神菌属HTCC2649的S1蛋白酶1(SEQ ID NO:5)的表征
将普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定法用于获得pH-活性曲线和pH-稳定性曲线(在指示的pH值下2小时之后的残余活性)。对于pH-稳定性曲线，将蛋白酶在不同测定缓冲液中稀释8x以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37℃下孵育2小时。在孵育之后，通过稀释于pH8.0测定缓冲液中，使该蛋白酶孵育的pH转至与残余活性测定之前相同的pH值。使用普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定法以获得在pH 7.0下的温度-活性曲线。
结果示于下表2-4中。蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的数据包括在这些表中。对于表2，活性是相对于酶的最适pH而言。对于表3，活性是相对于样品的残余活性而言，将这些样品在稳定条件下(5℃，pH 8.0或pH 9.0)保持。对于表4，活性相对于酶在pH 7.0或pH 6.5下的最佳温度。使用Suc-AAPF-pNA测定来获得蛋白酶10R的pH-活性曲线和pH-稳定性曲线，并且使用pH 6.5下的普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定来获得温度-活性曲线。
表2：如使用动力学Suc-AAPF-pNA测定确定的在25℃下的pH-活性曲线
表3：如使用动力学Suc-AAPF-pNA测定确定的pH-稳定性曲线(在37℃下2小时之后 的残余活性)
表4：如使用普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定确定的pH7.0或pH6.5下的温度活性 曲线
与蛋白酶10R的数据相比，来自两面神菌属HTCC2649的S1蛋白酶1的对普罗塔酶AK(Protazyme AK)底物的pH-活性、pH-稳定性曲线(在37℃下2小时后的残留活性)以及在pH7.0下的对普罗塔酶AK(Protazyme AK)的温度活性曲线也示出如下图1-3。
来自两面神菌属HTCC2649的S1蛋白酶1(SEQ ID NO:5)的其他特征
抑制剂：PMSF。
确定N-末端序列为：ANVYGGQ。
如通过SDS-PAGE确定的相对分子量是大约Mr＝24kDa。
通过完整分子量分析确定的分子量是20406.3Da。
成熟序列(来自埃德曼N-末端测序数据和完整MS数据)：
ANVYGGQQIEFSGYVCSLGFNATKAGAPVFITAGHCGEGYQTFSKNGTTLGKTQAFSFPGNDYAYSTLASSWTGIGAVDLWTGSARAVTGSSNAAVGTAICKSGRTTYWTCGSVQAKNVTVNYDNGDGTTSSVSGLTKSNTCTEGGDSGGSWMAGNLAQGVTSGGAGYGSSGVCGEKVGQPNIAYFQPVGEILSAYGLTLKTA(SEQ ID NO:5)
来自这一成熟序列的计算的分子量是20406.2Da。
实例4：大豆-玉米粉活性测定法
使用大豆-玉米粉作为底物的终点测定以获得在pH 3-7时该蛋白酶的活性曲线。
底物：从丹麦技术研究所(Danish Technological Institute)，Gl.1,6092Stenderup获得以30:70的比率混合的大豆粉-玉米粉。将商业原料研磨(2mm筛)，混合10分钟，然后研磨(1mm筛)并再混合10分钟。使用JEL 200旋转筛(J.恩格斯曼(Engelsmann)AG公司，路德维希港(Ludwigshafen)，德国)的筛分分析显示1％的颗粒为>500微米，并且约82％为<212微米。
测定缓冲液：制备包含100mM琥珀酸、100mM HEPES、100mM CHES、100mM CAPS、12mMCaCl2、150mM KCl、0.01％Triton X-100的5种缓冲液，并使用HCl或NaOH调节至一pH值，使得在将大豆-玉米粉底物(1g)已经与测定缓冲液(10mL)混合之后给出一种浆液，该浆液的终pH是以下pH之一：3.0、4.0、5.0、6.0以及7.0。
在添加蛋白酶之前将底物浆液(2mL)混合30min并在40℃下孵育(500rpm)3小时。将蛋白酶(200mg酶蛋白/kg干物质)溶解于100μl 100mM乙酸钠缓冲液(9.565g/L NaOAc、1.75g/L乙酸、5mM CaCl2、0.01％BSA、0.01％吐温20，pH 6.0)中并且添加。将样品离心(10min，4000rpm，0℃)并且将收集的上清液使用邻苯二甲醛(OPA)测定进行分析。
结果示于表5和图4中。来自两面神菌属HTCC2649的S1蛋白酶1对大豆-玉米粉的蛋白水解活性随着pH从pH 3增加到pH 7而增加，并且在pH 3-7的整个范围内，特别是在pH 4-6的范围内的活性显著高于蛋白酶10R。这些数据表明，来自两面神菌属HTCC2649的S1蛋白酶1具有在蛋白质水解中更有效的潜力，例如在反刍动物连同单胃动物中；例如在pH通常在4和6之间的肉鸡的嗉囊中，以及在pH从大约2至6变化(这取决于例如饲料、胃区和喂养后的时间)的猪的胃中。
表5：在pH3.0、4.0、5.0、6.0及7.0下对大豆-玉米粉的蛋白酶活性(OD340x稀释因 子)
实例5：热稳定性
将蛋白酶的蛋白样品的等分部分(如在例如实例2、9或11中所述的经过纯化的)脱盐或使用预装PD-10柱改变缓冲液为20mM乙酸钠，pH 4.0或在4℃下以2-3h步骤针对2x500ml 20mM乙酸钠，pH 4.0进行透析，随后是一个过夜步骤。将该样品进行0.45μm过滤并用缓冲液稀释至大约2A280单位。在差示扫描量热法(DSC)中使用该透析缓冲液作为参照。使用真空吸引器对这些样品进行脱气并搅拌大约10分钟。
以1.5℃/min的恒定扫描速率从20℃-90℃在MicroCal VP-DSC上进行DSC扫描。使用MicroCal原点软件(Origin software)(4.10版本)进行数据处理，并将变性温度Td(也称为熔解温度Tm)定义为温度自记曲线的峰尖端的温度。
实例6：蒸汽稳定性
可以使用以下测定法评价蒸汽处理后该蛋白酶的残余活性。
在这些试验中，使用修改设置从而该蒸汽是从蒸汽发生器中提供的并被导入到箱中。当温度达到约93℃-94℃时，通过抽屉将放置在板上的这些样品插入到该箱中。插入这些样品后，温度即降低4℃。当温度停留在大约恒定的90℃时，孵育30秒。此后，将盘快速地从盒中移除，将样品放置在冰上，重悬浮，并且使用例如Suc-AAPF-pNA或邻苯二醛(OPA)测定来针对蛋白酶活性进行评估。将各个酶样品与未经蒸汽处理的相似样品比较以计算残余活性。
实例7：造粒稳定性测试
如美国专利号4,106,991，实例1中所述的方式进行酶粒化。将获得的颗粒在流化床中干燥至含水量低于1％并过筛以获得具有250μm至850μm粒子范围的产物。最终，将该产物用棕榈油和碳酸钙以如在美国专利号4,106,991，实例22中所述的方式进行包衣。
在小型卧式搅拌器中，大致地将50g酶颗粒与10kg饲料预混合10分钟。在大型卧式搅拌器中将该预混合物与90kg饲料混合10分钟。将该饲料从该搅拌器中以大约300kg/小时的速率导至调节器(带有蒸汽注入的串联搅拌器)。该调节器通过注入蒸汽将该饲料加热至95℃(在排气口进行测量)。在该调节器中的停留时间是30秒。将该饲料从该调节器中导至配备有3.0x 35mm水平冲模的西蒙黑森(Simon Heesen)压力机中并将其压缩成具有15mm左右的长度的丸。在压缩后，将这些丸放置在冷气机中并冷却15分钟。
使用Suc-AAPF-pNA测定法，在造粒之前测量蛋白酶活性，并在造粒之后测量该饲料粒中的蛋白酶活性。通过将粒状饲料中的蛋白酶活性相对于非粒状饲料中的活性相对比以确定造粒稳定性。
实例8：来自两面神菌属的S1蛋白酶1的4种变体的表达
制备来自两面神菌属的S1蛋白酶1的四种变体，每种包含单个氨基酸变化。氨基酸变化如下：S68N、T71N、T87Q和S90T(编号基于SEQ ID NO:5)。通过使用来自实例1的原始构建体DNA作为模板和包含DNA变化的引物的PCR，通过将变化掺入WT DNA序列(SEQ ID NO:1)中来构建4种变体。为每个构建体制备两个DNA片段，并且每个片段覆盖基因的一部分和实例1中所述的上游抑或下游侧翼区。通过SOE PCR反应将两个片段融合在一起，以将2个片段组装成一个线性载体构建体。将等分部分的该SOE PCR产物转化到枯草芽孢杆菌中。在每ml补充有6μg氯霉素的LB板上选择转化体。对于每种变体，选择具有包含单个氨基酸变化的确认的正确序列的重组克隆用于在液体培养物中发酵。收获包含酶的上清液并如实例9中所述的将该4种变体酶进行纯化。
实例9：来自两面神菌属变体的S1蛋白酶1的纯化
将每种变体通过以下程序进行纯化：
将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。将上清液通过Nalgene 0.2μm过滤单元进行过滤，以便去除其余的芽孢杆菌宿主细胞。将滤液与3.0M(NH4)2SO4进行1:1混合，以给出最终硫酸铵浓度为1.5M(NH4)2SO4。将经硫酸铵调节的滤液施加到在5mM MES/NaOH、50mM H3BO3、1mM CaCl2、1.5M(NH4)2SO4(pH 6.0)中平衡的癸基-琼脂糖柱(来自Upfront层析公司(UpFront Chromatography))上。在用平衡缓冲液充分地洗涤该柱之后，将蛋白酶用具有30％2-丙醇的10mM MES/NaOH、100mM H3BO3、2mM CaCl2(pH6.0)进行逐步洗脱。收集包含来自两面神菌属变体的S1蛋白酶1的洗脱峰并转移到G25葡聚糖凝胶柱(来自GE医疗集团)上的20mM CH3COOH/NaOH，1mM CaCl2(pH 4.5)。将G25葡聚糖凝胶转移的变体施加至在20mM CH3COOH/NaOH、1mM CaCl2(pH 4.5)中平衡的SP-琼脂糖凝胶FF柱(来自GE医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在相同的缓冲液中的线性NaCl梯度(0-->0.5M)洗脱超过四个柱体积。分析来自柱的部分的蛋白酶活性(在pH 7下使用普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定)并且通过SDS-PAGE进一步分析主要活性峰部分。将其中仅在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶上见到一个条带的部分汇集作为纯化的制剂并且用于进一步表征。
实例10：来自土壤球菌属(Terracoccus sp.)的S1蛋白酶1的表达
基于被鉴定为SEQ ID NO:10的核苷酸序列，由基因技术(Gene Art)(基因技术生物公司(GENEART AG BioPark)，约瑟夫-恩格特大街(Josef-Engert-Str.)11号，93053，雷根斯堡，德国)合成具有SEQ ID NO:12的经密码子优化的合成基因。如在WO 2012/025577中所述，使用ClaI和MluI限制酶切位点将该合成基因亚克隆进芽孢杆菌属表达载体中。用克劳氏芽孢杆菌分泌信号(具有以下氨基酸序列：MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA，SEQ IDNO:6)代替天然的分泌信号来表达该S1蛋白酶1。将表达质粒转化到枯草芽孢杆菌中。将表达盒通过同源重组进果胶裂解酶基因座中来整合。在每ml补充有6μg氯霉素的LB板上选择转化体。选择包含整合的表达构建体的重组体枯草芽孢杆菌克隆并且将其指定为来自土壤球菌属(Terracoccus sp.)的S1蛋白酶1。将其在500mL带挡板的锥形瓶(Erlenmeyerflask)中的旋转摇床上培养，每个锥形瓶包含100ml基于酵母提取物的培养基。将该克隆在30℃下培养3天。收获包含上清液的酶并如实施例9中所述的将该酶进行纯化。
实例11：来自土壤球菌属(Terracoccus sp.)的S1蛋白酶1的纯化
将培养液离心(20000x g，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。将上清液通过Nalgene 0.2μm过滤单元进行过滤，以便去除其余的芽孢杆菌宿主细胞。用3％NaOH将0.2μm滤液的pH调节至pH 8.0，并将该溶液施加至在20mM Tris/HCl、1mM CaCl2(pH 8.0)中平衡的MEP Hypercel柱(来自颇尔公司(Pall Corporation))上。在将柱用平衡缓冲液充分洗涤后，将蛋白酶用20mM CH3COOH/NaOH、1mM CaCl2(pH 4.5)进行逐步洗脱。收集包含来自土壤球菌属(Terracoccus sp.)的S1蛋白酶1的洗脱峰并用脱矿质水稀释3x以降低导电性。将溶液的pH调节至pH 4.5并施加到在20mM CH3COOH/NaOH，1mM CaCl2(pH 4.5)中平衡的SOURCE 30S柱(来自GE医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在平衡缓冲液与20mM CH3COOH/NaOH、1mM CaCl2、0.5M NaCl(pH 4.5)之间的线性梯度洗脱超过五个柱体积。分析来自柱的部分的蛋白酶活性(使用在pH8下的Suc-AAPF-pNA测定)，并汇集主要活性峰，并且最后用3％NaOH将pH调节至pH 5.0。经pH调节的合并物是纯化的制剂并且用于进一步表征。
实例12：来自土壤球菌属(Terracoccus sp.)的S1蛋白酶1(SEQ ID NO:14)
和来自两面神菌属变体的S1蛋白酶1的表征
使用Suc-AAPF-pNA测定来获得来自土壤球菌属(Terracoccus sp.)的S1蛋白酶1的pH-活性曲线和pH-稳定性曲线。使用普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定来获得来自两面神菌属变体的S1蛋白酶1的pH-活性曲线和pH-稳定性曲线。对于pH-稳定性曲线，将蛋白酶在不同测定缓冲液中稀释8-10x以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37℃下孵育2小时。在孵育之后，通过稀释于pH 8.0测定缓冲液中，使该蛋白酶孵育的pH转至与残余活性测定之前相同的pH值。使用普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定法以获得在pH 7.0下的温度-活性曲线。
结果示于下表6-8中。蛋白酶10R的数据包括在这些表中。对于表6，活性是相对于酶的最适pH而言。对于表7，活性是相对于样品的残余活性而言，将这些样品在稳定条件下(5℃，pH 8.0或pH 9.0)保持。对于表8，活性相对于酶在pH 7.0或pH 6.5下的最佳温度。使用Suc-AAPF-pNA测定来获得蛋白酶10R的pH-活性曲线和pH-稳定性曲线，并且使用pH 6.5下的普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定来获得温度-活性曲线。
表6：pH-活性曲线
表7：pH-稳定性曲线(在37℃下2小时之后的残余活性)
表8：在pH 7.0或pH 6.5下的温度活性曲线
来自土壤球菌属(Terracoccus sp.)的S1蛋白酶1的其他特征
抑制剂：PMSF。
确定N-末端序列为：ANVYGGQ。
如通过SDS-PAGE确定的相对分子量是大约Mr＝24kDa。
通过完整分子量分析所确定的分子量是20603.4Da((M+H)+)。
成熟序列(来自埃德曼N-末端测序数据和完整MS数据)：
ANVYGGQQIEFSGYVCSLGFNATRGGAPVFVTAGHCGEGYQTFSKGGTTLGSTQAYSFPGNDYAYSTLTSSWTGVGAVDLYDGVNARRVSGYSNAPVGTAICKSGRTTGWTCGSVQAKNVTVNYSNADGSTSTVSGLTKSNTCTEGGDSGGSWMASTSAQGVTSGGAGYGANSVCGQKVGQPNIAYFQPVDEIVSAYGLTLKTS(SEQ ID NO:14)
来自这一成熟序列的计算分子量为20601.2Da((M+H)+峰的计算分子量为20602.2Da)。
实例13：大豆-玉米粉活性测定法
将如在实例4中使用大豆-玉米粉作为底物的终点测定用于获得在pH 3-7下蛋白酶的活性曲线。
结果示于表9和图5中。来自两面神菌变体的S1蛋白酶1连同来自土壤球菌属(Terracoccus)的S1蛋白酶1对大豆-玉米粉的蛋白水解活性随着pH从pH 3增加到pH 7而增加，并且在pH 3-7的整个范围内，特别是在pH 4-6的范围内的活性显著高于蛋白酶10R。这些数据表明，来自两面神菌变体的S1蛋白酶1连同来自土壤球菌属(Terracoccus)的S1蛋白酶1具有在蛋白质水解中更有效的潜力，例如在反刍动物以及单胃动物中；例如在pH通常在4和6之间的肉鸡的嗉囊中，以及在pH从约2至6变化(这取决于例如饲料、胃区和喂养后的时间)的猪的胃中。
此外，来自两面神菌变体S68N和T71N的S1蛋白酶1与来自土壤球菌属(Terracoccus)的S1蛋白酶1在40℃下对大豆-玉米粉共享非常相似的pH-活性曲线，并且与本领域已知的其他蛋白酶显著不同。
表9：在pH3.0、4.0、5.0、6.0及7.0下对大豆-玉米粉的蛋白酶活性(OD340x稀释因 子)
实例14：来自黄色诺尔氏菌TL1的S1蛋白酶1的表达
来自黄色诺尔氏菌的具有序列SEQ ID NO:17(SWISSPROT：A0A0A0JF07)的S1蛋白酶1被表达为密码子优化的合成基因(SEQ ID NO:18)，其中克劳氏芽孢杆菌分泌信号替换了如实例10中所述的天然分泌信号，给出氨基酸序列SEQ ID NO:19。该基因由基因技术(Gene Art)(基因技术生物公司(GENEART AG BioPark)，约瑟夫-恩格特大街(Josef-Engert-Str.)11号，93053，雷根斯堡，德国)合成。如针对实例10所述的来自土壤球菌属(Terracoccus sp.)的S1蛋白酶1进行克隆和表达。
实例15：来自黄色诺尔氏菌TL1的S1蛋白酶1的纯化
将培养液离心(20000xg，20min)并且将上清液小心地与沉淀物滗析分开。将上清液通过Nalgene 0.2μm过滤单元进行过滤，以便去除其余的芽孢杆菌宿主细胞。用3M Tris碱将0.2μm滤液中的pH调节至pH 8.0，并将经pH调节的滤液施加至在20mM Tris/HCl、1mMCaCl2(pH 8.0)中平衡的MEP Hypercel柱(来自颇尔公司(Pall corporatio))上。在将柱用平衡缓冲液充分洗涤后，将蛋白酶用20mM CH3COOH/NaOH、1mM CaCl2(pH 4.5)进行逐步洗脱。收集包含来自黄色诺尔氏菌TL1的S1蛋白酶1的洗脱峰并用脱矿质水稀释3x以降低导电性。将溶液的pH调节至pH 4.5并施加到在20mM CH3COOH/NaOH，1mM CaCl2(pH 4.5)中平衡的SOURCE 30S柱(来自GE医疗集团)上。在将柱用平衡缓冲液充分地洗涤之后，将蛋白酶用在平衡缓冲液与20mM CH3COOH/NaOH、1mM CaCl2、0.5M NaCl(pH 4.5)之间的线性梯度洗脱超过五个柱体积。分析来自柱的部分的蛋白酶活性(使用在pH8下的Suc-AAPM-pNA测定)，并汇集主要活性峰，并且最后用3％NaOH将pH调节至pH 5.5。经pH调节的合并物是纯化的制剂并且用于进一步表征。
实例16：来自黄色诺尔氏菌TL1(SEQ ID NO:20)的S1蛋白酶1的表征
使用Suc-AAPM-pNA测定来获得来自黄色诺尔氏菌TL1的S1蛋白酶1的pH-活性曲线和pH-稳定性曲线。对于pH-稳定性曲线，将蛋白酶在不同测定缓冲液中稀释10x以达到这些缓冲液的pH值并且然后在37℃下孵育2小时。在孵育之后，通过稀释于pH 9.0测定缓冲液中，使该蛋白酶孵育的pH转至与残余活性测定之前相同的pH值。使用普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定法以获得在pH 7.0下的温度-活性曲线。
结果示于下表10-12中。蛋白酶10R的数据包括在这些表中。对于表10，活性是相对于酶的最适pH而言。对于表11，活性是相对于样品的残余活性，将这些样品保持在稳定条件(5℃，pH 9.0)下。对于表12，活性相对于酶在pH 7.0或pH 6.5下的最佳温度。使用Suc-AAPF-pNA测定来获得蛋白酶10R的pH-活性曲线和pH-稳定性曲线，并且使用pH 6.5下的普罗塔酶AK(Protazyme AK)测定来获得温度-活性曲线。
表10：pH-活性曲线
表11：pH-稳定性曲线(在37℃下2小时之后的残余活性)
表12：在pH7.0或pH6.5下的温度活性曲线
来自黄色诺尔氏菌TL1的S1蛋白酶1的其他特征
抑制剂：PMSF。
确定N-末端序列为：ANVYGGQ。
如通过SDS-PAGE确定的相对分子量是大约Mr＝24kDa。
通过完整分子量分析确定的分子量是20697.8Da。
成熟序列(来自埃德曼N-末端测序数据和完整MS数据)：
ANVYGGQQIEFSGYVCSLGFNATKSGTPVFITAGHCAEGNQTFTRNGTTLGTTRGWSFPGNDYAYSSLTSSWTGIGAVDLWNGTSARSVTGSSNAAVGTAICKSGRTTGWTCGSVQTKNVTVNYNNGDGTYSTVSGLTKSNTCTEGGDSGGSWMAGNLAQGVTSGGAGYGSNGVCGQKVGQPNIAYFQPIGEILSVYGLTLKTA(SEQ ID NO:20)
来自这一成熟序列的计算的分子量是20698.4Da。
实例17：大豆-玉米粉活性测定法
将如在实例4中使用大豆-玉米粉作为底物的终点测定用于获得在pH 3-7下蛋白酶的活性曲线。
结果示于表13中。来自黄色诺尔氏菌的S1蛋白酶1对大豆-玉米粉的蛋白水解活性随着pH从pH 3增加到pH 7而增加，并且在pH 3-7的整个范围内，特别是在pH 4-6的范围内的活性显著高于蛋白酶10R。这些数据表明，来自黄色诺尔氏菌的S1蛋白酶1具有在蛋白质水解中更有效的潜力，例如在反刍动物以及单胃动物中；例如在pH通常在4和6之间的肉鸡的嗉囊中，以及在pH从约2至6变化(这取决于例如饲料、胃区和喂养后的时间)的猪的胃中。
表13：在pH 3.0、4.0、5.0、6.0及7.0下对大豆-玉米粉的蛋白酶活性(OD340x稀释因子)
在此描述并且要求保护的本发明不局限于在此披露的特定方面的范围，因为这些方面旨在作为本发明若干方面的说明。预期任何等效方面都处于本发明的范围内。实际上，除在此所示和描述的那些之外，本发明的不同修改对于本领域普通技术人员而言从前述描述将变得清楚。这样的修改也旨在落入所附权利要求的范围内。在有冲突的情况下，以包括定义的本披露为准。
序列表
<110> 诺维信公司(Novozymes A/S)
<120> 具有丝氨酸蛋白酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸以及它们在动物饲料方面的应用
<130> 13078-WO-PCT
<150> EP14191691.6
<151> 2014-11-04
<160> 20
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 1212
<212> DNA
<213> 两面神菌属（Janibacter sp.） HTCC2649
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1209)
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(90)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (601)..(1209)
<400> 1
atg tct cgc aga agt ctc acc gtc ctg gcc gga acc ctc tcg gcc 45
Met Ser Arg Arg Ser Leu Thr Val Leu Ala Gly Thr Leu Ser Ala
-200 -195 -190
gct gca gca gca acc gcc ctc tgc gtc gcg ccc gcc gcg aac gct 90
Ala Ala Ala Ala Thr Ala Leu Cys Val Ala Pro Ala Ala Asn Ala
-185 -180 -175
gcg aac cct ggc ccg agc ggc ccg agc agc ccg agc acc gga ccc 135
Ala Asn Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ser Ser Pro Ser Thr Gly Pro
-170 -165 -160
ctg gct gtc gac tcc ggt gac tcc gtc gcc gag atg tcg gcg cag 180
Leu Ala Val Asp Ser Gly Asp Ser Val Ala Glu Met Ser Ala Gln
-155 -150 -145
tgg ctc gcg acg gag gag ggc ctg agc ctc gag acc gcc cgt gac 225
Trp Leu Ala Thr Glu Glu Gly Leu Ser Leu Glu Thr Ala Arg Asp
-140 -135 -130
cga gtg gcc gct cag gag ggg ttg tcg cgc acg gcg acg tcg ctg 270
Arg Val Ala Ala Gln Glu Gly Leu Ser Arg Thr Ala Thr Ser Leu
-125 -120 -115
gag acg tcg ctc ggc gcc aag gcc gtc ggc acg tgg atc gac cag 315
Glu Thr Ser Leu Gly Ala Lys Ala Val Gly Thr Trp Ile Asp Gln
-110 -105 -100
gcg acg ggc gtg ctc cac gtc aac gtc acc gac gcc gcc gcc gcg tcc 363
Ala Thr Gly Val Leu His Val Asn Val Thr Asp Ala Ala Ala Ala Ser
-95 -90 -85 -80
acg gtg cgt tcc gcc ggg gcg agc gcc cgt gtc gtc agc gcc gac aag 411
Thr Val Arg Ser Ala Gly Ala Ser Ala Arg Val Val Ser Ala Asp Lys
-75 -70 -65
tcc cgg ctc gcc gcc tcc gag aag gcc gcc acc acc gtc gcc ggc aag 459
Ser Arg Leu Ala Ala Ser Glu Lys Ala Ala Thr Thr Val Ala Gly Lys
-60 -55 -50
gac acc atc gcg tcc tac gtc gac ccg gtc acc aac aag gtc atc ctc 507
Asp Thr Ile Ala Ser Tyr Val Asp Pro Val Thr Asn Lys Val Ile Leu
-45 -40 -35
acg gtg ccc gcg gat cgc gtc gag gcg acc cgc gcc aag atc gcc gac 555
Thr Val Pro Ala Asp Arg Val Glu Ala Thr Arg Ala Lys Ile Ala Asp
-30 -25 -20
ccg tcc gtc acg gtc gag ggc acg cag gcc aag gtc tcc acc cag gcc 603
Pro Ser Val Thr Val Glu Gly Thr Gln Ala Lys Val Ser Thr Gln Ala
-15 -10 -5 -1 1
aac gtc tac ggc ggc cag cag atc gag ttc agc ggc tac gtc tgc tcg 651
Asn Val Tyr Gly Gly Gln Gln Ile Glu Phe Ser Gly Tyr Val Cys Ser
5 10 15
ctc ggc ttc aac gcc acc aag gcc ggc gcc ccg gtc ttc atc acg gcc 699
Leu Gly Phe Asn Ala Thr Lys Ala Gly Ala Pro Val Phe Ile Thr Ala
20 25 30
ggc cac tgc ggc gag ggc tac cag acc ttc tcc aag aac ggc acg acc 747
Gly His Cys Gly Glu Gly Tyr Gln Thr Phe Ser Lys Asn Gly Thr Thr
35 40 45
ctg ggc aag aca cag gcc ttc tcg ttc ccc ggc aac gac tac gcc tac 795
Leu Gly Lys Thr Gln Ala Phe Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Tyr
50 55 60 65
tcg acc ctc gcg tcg agc tgg acc ggc atc ggc gcg gtc gac ctg tgg 843
Ser Thr Leu Ala Ser Ser Trp Thr Gly Ile Gly Ala Val Asp Leu Trp
70 75 80
acc ggc tcc gca cgg gcg gtg acg ggg tcg agc aac gcc gcc gtc ggc 891
Thr Gly Ser Ala Arg Ala Val Thr Gly Ser Ser Asn Ala Ala Val Gly
85 90 95
acc gcg atc tgc aag tcc ggc cgc acc acc tac tgg acc tgc ggc tcg 939
Thr Ala Ile Cys Lys Ser Gly Arg Thr Thr Tyr Trp Thr Cys Gly Ser
100 105 110
gtc cag gcc aag aac gtc acc gtg aac tac gac aac ggt gac ggc acg 987
Val Gln Ala Lys Asn Val Thr Val Asn Tyr Asp Asn Gly Asp Gly Thr
115 120 125
acg agc tcg gtc tcg ggc ctc acg aag tcc aac acc tgc acc gag ggc 1035
Thr Ser Ser Val Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr Glu Gly
130 135 140 145
ggc gac tcc ggc ggc tcc tgg atg gcg ggc aac ctt gcc cag ggc gtg 1083
Gly Asp Ser Gly Gly Ser Trp Met Ala Gly Asn Leu Ala Gln Gly Val
150 155 160
acg agc ggc ggc gcg ggc tac ggc tcc agc gga gtg tgc ggc gag aag 1131
Thr Ser Gly Gly Ala Gly Tyr Gly Ser Ser Gly Val Cys Gly Glu Lys
165 170 175
gtc ggc cag ccc aac atc gcc tac ttc cag ccg gtc ggc gag atc ctc 1179
Val Gly Gln Pro Asn Ile Ala Tyr Phe Gln Pro Val Gly Glu Ile Leu
180 185 190
tcc gcc tac ggc ctc acc ctc aag acg gcc tga 1212
Ser Ala Tyr Gly Leu Thr Leu Lys Thr Ala
195 200
<210> 2
<211> 403
<212> PRT
<213> 两面神菌属 HTCC2649
<400> 2
Met Ser Arg Arg Ser Leu Thr Val Leu Ala Gly Thr Leu Ser Ala
-200 -195 -190
Ala Ala Ala Ala Thr Ala Leu Cys Val Ala Pro Ala Ala Asn Ala
-185 -180 -175
Ala Asn Pro Gly Pro Ser Gly Pro Ser Ser Pro Ser Thr Gly Pro
-170 -165 -160
Leu Ala Val Asp Ser Gly Asp Ser Val Ala Glu Met Ser Ala Gln
-155 -150 -145
Trp Leu Ala Thr Glu Glu Gly Leu Ser Leu Glu Thr Ala Arg Asp
-140 -135 -130
Arg Val Ala Ala Gln Glu Gly Leu Ser Arg Thr Ala Thr Ser Leu
-125 -120 -115
Glu Thr Ser Leu Gly Ala Lys Ala Val Gly Thr Trp Ile Asp Gln
-110 -105 -100
Ala Thr Gly Val Leu His Val Asn Val Thr Asp Ala Ala Ala Ala Ser
-95 -90 -85 -80
Thr Val Arg Ser Ala Gly Ala Ser Ala Arg Val Val Ser Ala Asp Lys
-75 -70 -65
Ser Arg Leu Ala Ala Ser Glu Lys Ala Ala Thr Thr Val Ala Gly Lys
-60 -55 -50
Asp Thr Ile Ala Ser Tyr Val Asp Pro Val Thr Asn Lys Val Ile Leu
-45 -40 -35
Thr Val Pro Ala Asp Arg Val Glu Ala Thr Arg Ala Lys Ile Ala Asp
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Pro Ser Val Thr Val Glu Gly Thr Gln Ala Lys Val Ser Thr Gln Ala
-15 -10 -5 -1 1
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20 25 30
Gly His Cys Gly Glu Gly Tyr Gln Thr Phe Ser Lys Asn Gly Thr Thr
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Ser Thr Leu Ala Ser Ser Trp Thr Gly Ile Gly Ala Val Asp Leu Trp
70 75 80
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85 90 95
Thr Ala Ile Cys Lys Ser Gly Arg Thr Thr Tyr Trp Thr Cys Gly Ser
100 105 110
Val Gln Ala Lys Asn Val Thr Val Asn Tyr Asp Asn Gly Asp Gly Thr
115 120 125
Thr Ser Ser Val Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr Glu Gly
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Gly Asp Ser Gly Gly Ser Trp Met Ala Gly Asn Leu Ala Gln Gly Val
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Thr Ser Gly Gly Ala Gly Tyr Gly Ser Ser Gly Val Cys Gly Glu Lys
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195 200
<210> 3
<211> 1203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1200)
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(81)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (592)..(1200)
<400> 3
atg aag aaa ccg ttg ggg aaa att gtc gca agc acc gca cta ctc 45
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu
-195 -190 -185
att tct gtt gct ttt agt tca tcg ata gca tcg gct gca aat ccg 90
Ile Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Asn Pro
-180 -175 -170
gga ccg agc gga ccg tca tca ccg tca aca gga ccg ctg gca gtt 135
Gly Pro Ser Gly Pro Ser Ser Pro Ser Thr Gly Pro Leu Ala Val
-165 -160 -155
gat tca ggc gat tca gtt gca gaa atg tca gca caa tgg ctg gca 180
Asp Ser Gly Asp Ser Val Ala Glu Met Ser Ala Gln Trp Leu Ala
-150 -145 -140
aca gaa gaa ggc ctg tca ctg gaa aca gca aga gat aga gtt gca 225
Thr Glu Glu Gly Leu Ser Leu Glu Thr Ala Arg Asp Arg Val Ala
-135 -130 -125
gca caa gaa gga ctt tca aga aca gca aca tca ctt gaa aca agc 270
Ala Gln Glu Gly Leu Ser Arg Thr Ala Thr Ser Leu Glu Thr Ser
-120 -115 -110
ctt ggc gca aaa gca gtt ggc aca tgg att gat caa gca aca ggc gtt 318
Leu Gly Ala Lys Ala Val Gly Thr Trp Ile Asp Gln Ala Thr Gly Val
-105 -100 -95
ctg cat gtt aat gtt aca gat gca gca gca gca tca aca gtt aga tca 366
Leu His Val Asn Val Thr Asp Ala Ala Ala Ala Ser Thr Val Arg Ser
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gca ggc gca tca gca aga gtt gtt tca gca gat aaa tca aga ctg gca 414
Ala Gly Ala Ser Ala Arg Val Val Ser Ala Asp Lys Ser Arg Leu Ala
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gca tca gaa aaa gca gcg aca aca gtt gca ggc aaa gat aca att gca 462
Ala Ser Glu Lys Ala Ala Thr Thr Val Ala Gly Lys Asp Thr Ile Ala
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tca tat gtt gat ccg gtc acg aac aaa gtt att ctg aca gtt ccg gca 510
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gat aga gtc gaa gca aca cgc gca aaa att gca gat ccg tca gtt aca 558
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gtt gaa ggc aca caa gca aaa gtt tca aca caa gcg aat gtt tat ggc 606
Val Glu Gly Thr Gln Ala Lys Val Ser Thr Gln Ala Asn Val Tyr Gly
-10 -5 -1 1 5
gga cag caa att gaa ttt agc ggc tat gtt tgc tca ctg ggc ttt aat 654
Gly Gln Gln Ile Glu Phe Ser Gly Tyr Val Cys Ser Leu Gly Phe Asn
10 15 20
gca aca aaa gca ggc gct ccg gtc ttt att aca gca ggc cat tgc gga 702
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gaa ggc tat caa aca ttt tca aaa aat ggc aca aca ctg ggc aaa aca 750
Glu Gly Tyr Gln Thr Phe Ser Lys Asn Gly Thr Thr Leu Gly Lys Thr
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aga gca gtt aca ggc tca tca aat gca gca gtt gga aca gca att tgc 894
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tca ggc ctt aca aaa agc aac aca tgc aca gaa ggc gga gat agc gga 1038
Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr Glu Gly Gly Asp Ser Gly
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gca gga tat ggc tca tca ggc gtc tgc gga gaa aaa gtt gga caa ccg 1134
Ala Gly Tyr Gly Ser Ser Gly Val Cys Gly Glu Lys Val Gly Gln Pro
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 4
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-195 -190 -185
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-180 -175 -170
Gly Pro Ser Gly Pro Ser Ser Pro Ser Thr Gly Pro Leu Ala Val
-165 -160 -155
Asp Ser Gly Asp Ser Val Ala Glu Met Ser Ala Gln Trp Leu Ala
-150 -145 -140
Thr Glu Glu Gly Leu Ser Leu Glu Thr Ala Arg Asp Arg Val Ala
-135 -130 -125
Ala Gln Glu Gly Leu Ser Arg Thr Ala Thr Ser Leu Glu Thr Ser
-120 -115 -110
Leu Gly Ala Lys Ala Val Gly Thr Trp Ile Asp Gln Ala Thr Gly Val
-105 -100 -95
Leu His Val Asn Val Thr Asp Ala Ala Ala Ala Ser Thr Val Arg Ser
-90 -85 -80
Ala Gly Ala Ser Ala Arg Val Val Ser Ala Asp Lys Ser Arg Leu Ala
-75 -70 -65 -60
Ala Ser Glu Lys Ala Ala Thr Thr Val Ala Gly Lys Asp Thr Ile Ala
-55 -50 -45
Ser Tyr Val Asp Pro Val Thr Asn Lys Val Ile Leu Thr Val Pro Ala
-40 -35 -30
Asp Arg Val Glu Ala Thr Arg Ala Lys Ile Ala Asp Pro Ser Val Thr
-25 -20 -15
Val Glu Gly Thr Gln Ala Lys Val Ser Thr Gln Ala Asn Val Tyr Gly
-10 -5 -1 1 5
Gly Gln Gln Ile Glu Phe Ser Gly Tyr Val Cys Ser Leu Gly Phe Asn
10 15 20
Ala Thr Lys Ala Gly Ala Pro Val Phe Ile Thr Ala Gly His Cys Gly
25 30 35
Glu Gly Tyr Gln Thr Phe Ser Lys Asn Gly Thr Thr Leu Gly Lys Thr
40 45 50
Gln Ala Phe Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Tyr Ser Thr Leu Ala
55 60 65
Ser Ser Trp Thr Gly Ile Gly Ala Val Asp Leu Trp Thr Gly Ser Ala
70 75 80 85
Arg Ala Val Thr Gly Ser Ser Asn Ala Ala Val Gly Thr Ala Ile Cys
90 95 100
Lys Ser Gly Arg Thr Thr Tyr Trp Thr Cys Gly Ser Val Gln Ala Lys
105 110 115
Asn Val Thr Val Asn Tyr Asp Asn Gly Asp Gly Thr Thr Ser Ser Val
120 125 130
Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr Glu Gly Gly Asp Ser Gly
135 140 145
Gly Ser Trp Met Ala Gly Asn Leu Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly
150 155 160 165
Ala Gly Tyr Gly Ser Ser Gly Val Cys Gly Glu Lys Val Gly Gln Pro
170 175 180
Asn Ile Ala Tyr Phe Gln Pro Val Gly Glu Ile Leu Ser Ala Tyr Gly
185 190 195
Leu Thr Leu Lys Thr Ala
200
<210> 5
<211> 203
<212> PRT
<213> 两面神菌属HTCC2649
<220>
<221> 成熟多肽
<222> (1)..(203)
<400> 5
Ala Asn Val Tyr Gly Gly Gln Gln Ile Glu Phe Ser Gly Tyr Val Cys
1 5 10 15
Ser Leu Gly Phe Asn Ala Thr Lys Ala Gly Ala Pro Val Phe Ile Thr
20 25 30
Ala Gly His Cys Gly Glu Gly Tyr Gln Thr Phe Ser Lys Asn Gly Thr
35 40 45
Thr Leu Gly Lys Thr Gln Ala Phe Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Tyr Ser Thr Leu Ala Ser Ser Trp Thr Gly Ile Gly Ala Val Asp Leu
65 70 75 80
Trp Thr Gly Ser Ala Arg Ala Val Thr Gly Ser Ser Asn Ala Ala Val
85 90 95
Gly Thr Ala Ile Cys Lys Ser Gly Arg Thr Thr Tyr Trp Thr Cys Gly
100 105 110
Ser Val Gln Ala Lys Asn Val Thr Val Asn Tyr Asp Asn Gly Asp Gly
115 120 125
Thr Thr Ser Ser Val Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr Glu
130 135 140
Gly Gly Asp Ser Gly Gly Ser Trp Met Ala Gly Asn Leu Ala Gln Gly
145 150 155 160
Val Thr Ser Gly Gly Ala Gly Tyr Gly Ser Ser Gly Val Cys Gly Glu
165 170 175
Lys Val Gly Gln Pro Asn Ile Ala Tyr Phe Gln Pro Val Gly Glu Ile
180 185 190
Leu Ser Ala Tyr Gly Leu Thr Leu Lys Thr Ala
195 200
<210> 6
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克劳氏芽孢杆菌分泌信号
<400> 6
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile
1 5 10 15
Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala
20 25
<210> 7
<211> 1596
<212> DNA
<213> 拟诺卡氏菌（Nocardiopsis sp.）
<220>
<221> CDS
<222> (318)..(1463)
<220>
<221> 信号肽
<222> (318)..(404)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (900)..(1463)
<400> 7
acgtttggta cgggtaccgg tgtccgcatg tggccagaat gcccccttgc gacagggaac 60
ggattcggtc ggtagcgcat cgactccgac aaccgcgagg tggccgttcg cgtcgccacg 120
ttctgcgacc gtcatgcgac ccatcatcgg gtgaccccac cgagctctga atggtccacc 180
gttctgacgg tctttccctc accaaaacgt gcacctatgg ttaggacgtt gtttaccgaa 240
tgtctcggtg aacgacaggg gccggacggt attcggcccc gatcccccgt tgatcccccc 300
aggagagtag ggacccc atg cga ccc tcc ccc gtt gtc tcc gcc atc ggt 350
Met Arg Pro Ser Pro Val Val Ser Ala Ile Gly
-190 -185
acg gga gcg ctg gcc ttc ggt ctg gcg ctg tcc ggt acc ccg ggt 395
Thr Gly Ala Leu Ala Phe Gly Leu Ala Leu Ser Gly Thr Pro Gly
-180 -175 -170
gcc ctc gcg gcc acc gga gcg ctc ccc cag tca ccc acc ccg gag 440
Ala Leu Ala Ala Thr Gly Ala Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Glu
-165 -160 -155
gcc gac gcg gtc tcc atg cag gag gcg ctc cag cgc gac ctc gac 485
Ala Asp Ala Val Ser Met Gln Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Asp
-150 -145 -140
ctg acc tcc gcc gag gcc gag gag ctg ctg gcc gcc cag gac acc 530
Leu Thr Ser Ala Glu Ala Glu Glu Leu Leu Ala Ala Gln Asp Thr
-135 -130 -125
gcc ttc gag gtc gac gag gcc gcg gcc gag gcc gcc ggg gac gcc 575
Ala Phe Glu Val Asp Glu Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gly Asp Ala
-120 -115 -110
tac ggc ggc tcc gtc ttc gac acc gag agc ctg gaa ctg acc gtc ctg 623
Tyr Gly Gly Ser Val Phe Asp Thr Glu Ser Leu Glu Leu Thr Val Leu
-105 -100 -95
gtc acc gat gcc gcc gcg gtc gag gcc gtg gag gcc acc ggc gcc ggg 671
Val Thr Asp Ala Ala Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly
-90 -85 -80
acc gag ctg gtc tcc tac ggc atc gac ggt ctc gac gag atc gtc cag 719
Thr Glu Leu Val Ser Tyr Gly Ile Asp Gly Leu Asp Glu Ile Val Gln
-75 -70 -65
gag ctc aac gcc gcc gac gcc gtt ccc ggt gtg gtc ggc tgg tac ccg 767
Glu Leu Asn Ala Ala Asp Ala Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro
-60 -55 -50 -45
gac gtg gcg ggt gac acc gtc gtc ctg gag gtc ctg gag ggt tcc gga 815
Asp Val Ala Gly Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly
-40 -35 -30
gcc gac gtc agc ggc ctg ctc gcg gac gcc ggc gtg gac gcc tcg gcc 863
Ala Asp Val Ser Gly Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala
-25 -20 -15
gtc gag gtg acc acg agc gac cag ccc gag ctc tac gcc gac atc atc 911
Val Glu Val Thr Thr Ser Asp Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile
-10 -5 -1 1
ggt ggt ctg gcc tac acc atg ggc ggc cgc tgt tcg gtc ggc ttc gcg 959
Gly Gly Leu Ala Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala
5 10 15 20
gcc acc aac gcc gcc ggt cag ccc ggg ttc gtc acc gcc ggt cac tgc 1007
Ala Thr Asn Ala Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys
25 30 35
ggc cgc gtg ggc acc cag gtg acc atc ggc aac ggc agg ggc gtc ttc 1055
Gly Arg Val Gly Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe
40 45 50
gag cag tcc gtc ttc ccc ggc aac gac gcg gcc ttc gtc cgc ggt acg 1103
Glu Gln Ser Val Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr
55 60 65
tcc aac ttc acg ctg acc aac ctg gtc agc cgc tac aac acc ggc ggg 1151
Ser Asn Phe Thr Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly
70 75 80
tac gcc acg gtc gcc ggt cac aac cag gcc ccc atc ggc tcc tcc gtc 1199
Tyr Ala Thr Val Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ser Val
85 90 95 100
tgc cgc tcc ggc tcc acc acc ggt tgg cac tgc ggc acc atc cag gcc 1247
Cys Arg Ser Gly Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala
105 110 115
cgc ggc cag tcg gtg agc tac ccc gag ggc acc gtc acc aac atg acc 1295
Arg Gly Gln Ser Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asn Met Thr
120 125 130
cgg acc acc gtg tgc gcc gag ccc ggc gac tcc ggc ggc tcc tac atc 1343
Arg Thr Thr Val Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile
135 140 145
tcc ggc acc cag gcc cag ggc gtg acc tcc ggc ggc tcc ggc aac tgc 1391
Ser Gly Thr Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys
150 155 160
cgc acc ggc ggg acc acc ttc tac cag gag gtc acc ccc atg gtg aac 1439
Arg Thr Gly Gly Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Val Asn
165 170 175 180
tcc tgg ggc gtc cgt ctc cgg acc tgatccccgc ggttccaggc ggaccgacgg 1493
Ser Trp Gly Val Arg Leu Arg Thr
185
tcgtgacctg agtaccaggc gtccccgccg cttccagcgg cgtccgcacc ggggtgggac 1553
cgggcgtggc cacggcccca cccgtgaccg gaccgcccgg cta 1596
<210> 8
<211> 382
<212> PRT
<213> 拟诺卡氏菌
<400> 8
Met Arg Pro Ser Pro Val Val Ser Ala Ile Gly Thr Gly Ala Leu
-190 -185 -180
Ala Phe Gly Leu Ala Leu Ser Gly Thr Pro Gly Ala Leu Ala Ala
-175 -170 -165
Thr Gly Ala Leu Pro Gln Ser Pro Thr Pro Glu Ala Asp Ala Val
-160 -155 -150
Ser Met Gln Glu Ala Leu Gln Arg Asp Leu Asp Leu Thr Ser Ala
-145 -140 -135
Glu Ala Glu Glu Leu Leu Ala Ala Gln Asp Thr Ala Phe Glu Val
-130 -125 -120
Asp Glu Ala Ala Ala Glu Ala Ala Gly Asp Ala Tyr Gly Gly Ser
-115 -110 -105
Val Phe Asp Thr Glu Ser Leu Glu Leu Thr Val Leu Val Thr Asp Ala
-100 -95 -90
Ala Ala Val Glu Ala Val Glu Ala Thr Gly Ala Gly Thr Glu Leu Val
-85 -80 -75
Ser Tyr Gly Ile Asp Gly Leu Asp Glu Ile Val Gln Glu Leu Asn Ala
-70 -65 -60
Ala Asp Ala Val Pro Gly Val Val Gly Trp Tyr Pro Asp Val Ala Gly
-55 -50 -45
Asp Thr Val Val Leu Glu Val Leu Glu Gly Ser Gly Ala Asp Val Ser
-40 -35 -30 -25
Gly Leu Leu Ala Asp Ala Gly Val Asp Ala Ser Ala Val Glu Val Thr
-20 -15 -10
Thr Ser Asp Gln Pro Glu Leu Tyr Ala Asp Ile Ile Gly Gly Leu Ala
-5 -1 1 5
Tyr Thr Met Gly Gly Arg Cys Ser Val Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ala
10 15 20
Ala Gly Gln Pro Gly Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Arg Val Gly
25 30 35 40
Thr Gln Val Thr Ile Gly Asn Gly Arg Gly Val Phe Glu Gln Ser Val
45 50 55
Phe Pro Gly Asn Asp Ala Ala Phe Val Arg Gly Thr Ser Asn Phe Thr
60 65 70
Leu Thr Asn Leu Val Ser Arg Tyr Asn Thr Gly Gly Tyr Ala Thr Val
75 80 85
Ala Gly His Asn Gln Ala Pro Ile Gly Ser Ser Val Cys Arg Ser Gly
90 95 100
Ser Thr Thr Gly Trp His Cys Gly Thr Ile Gln Ala Arg Gly Gln Ser
105 110 115 120
Val Ser Tyr Pro Glu Gly Thr Val Thr Asn Met Thr Arg Thr Thr Val
125 130 135
Cys Ala Glu Pro Gly Asp Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Ser Gly Thr Gln
140 145 150
Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly Ser Gly Asn Cys Arg Thr Gly Gly
155 160 165
Thr Thr Phe Tyr Gln Glu Val Thr Pro Met Val Asn Ser Trp Gly Val
170 175 180
Arg Leu Arg Thr
185
<210> 9
<211> 415
<212> PRT
<213> Austwickia chelonae NBRC 105200
<400> 9
Met Asn Lys Arg Ile Gly Ala Thr Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ala Ala
1 5 10 15
Leu Leu Pro Ala Ala Ala Pro Leu Thr Ala Gln Ala Ala Asp Glu Lys
20 25 30
Lys Ser Glu Glu Leu Ser Thr Ile Gln Glu Met Ser Ala Glu Trp Leu
35 40 45
Ser Lys Ser Tyr Gly Leu Asp Gly Glu Glu Ala Lys Arg Arg Val Lys
50 55 60
Asp Gln Asp Gly His Ala Gln Lys Ala Lys Asp Ile Glu Gly Asp Leu
65 70 75 80
Gly Asp Lys Thr Ala Gly Ser Phe Ile Asp Gln Lys Arg Gly Lys Leu
85 90 95
Val Val Thr Val Thr Asp Glu Lys Ala Val Asp Lys Val Lys Glu Lys
100 105 110
Asp Lys Asn Ala Asp Val Arg Val Val Lys Asn Ser Ala Ser Lys Leu
115 120 125
Asn Asp Ser Lys Lys Asn Ala Glu Asp Lys Val Gly Asp Lys Met Ala
130 135 140
Ala Ser Tyr Val Asp Val Glu Arg Asn Val Val Val Leu Thr Val Pro
145 150 155 160
Lys Asp Lys Ala Glu Glu Ala Lys Lys Gln Val Lys Asp Val Gln Gly
165 170 175
Val Glu Val Gln Glu Val Glu Ala Thr Ile Glu Ala Gln Ala Asn Leu
180 185 190
Tyr Gly Gly Gln Glu Ile Gln Phe Gly Arg Ser Val Cys Ser Val Gly
195 200 205
Phe Pro Ala Thr Lys Asp Gly Lys Asn Val Phe Ile Thr Ala Gly His
210 215 220
Cys Ala Ala Gly Gly Gln Ala Phe Arg Arg Asn Gly Gln Asn Leu Gly
225 230 235 240
Lys Pro Val Lys Tyr Asn Phe Pro Gly Pro Asp Met Ala Tyr Ser Thr
245 250 255
Met Glu Asn Gly Trp Asn Gly Val Gly Ala Val Asp His Trp Asn Gly
260 265 270
Lys Ala Val Ala Val Ala Gly Ser Gln Glu Ala Pro Val Gly Ala Thr
275 280 285
Val Cys Lys Ser Gly Arg Thr Thr Arg Trp Thr Cys Gly Val Ile Gln
290 295 300
Ala Lys Asn Val Thr Val Arg Tyr Gly Lys Pro Gly Gly Gly Gln Asp
305 310 315 320
Ile Val Arg Gly Met Thr Gln Ala Asn Val Cys Ser Glu Gly Gly Asp
325 330 335
Ser Gly Gly Ser Trp Ile Ala Gly Asn Gln Ala Gln Gly Val Thr Ser
340 345 350
Gly Gly Ala Gly Tyr Gly Pro Asn Lys Ser Cys Gly Glu Lys Val Gly
355 360 365
Arg Pro Asn Val Ala Tyr Phe Gln Pro Leu Asn Pro Ile Leu Lys Asp
370 375 380
Tyr Gly Leu Lys Leu Thr Thr His Asn Gly Gly Lys Gly Gly Gly Asp
385 390 395 400
Asn Gly Gly Asp Arg Asn Arg Asp Asn Arg Lys Gly Gly Arg Tyr
405 410 415
<210> 10
<211> 1203
<212> DNA
<213> 土壤球菌属（Terracoccus sp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1200)
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(78)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (589)..(1200)
<400> 10
atg atc cgc acc agt ctc acc acc ctg gcc gcc acg gcc gcg atc 45
Met Ile Arg Thr Ser Leu Thr Thr Leu Ala Ala Thr Ala Ala Ile
-195 -190 -185
gcc acc gcg atc acc gtg atg ccg gcc cag gca tcg acc ctc gcg 90
Ala Thr Ala Ile Thr Val Met Pro Ala Gln Ala Ser Thr Leu Ala
-180 -175 -170
tcc gac ccg acc ccc gcg ccg acg cca gcg gcg tcc acc gac tca 135
Ser Asp Pro Thr Pro Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ser Thr Asp Ser
-165 -160 -155
ggc cag tcc gtc gcc gag atg tcg gcg cgc tgg ctc gcg aag gac 180
Gly Gln Ser Val Ala Glu Met Ser Ala Arg Trp Leu Ala Lys Asp
-150 -145 -140
cgt gcc atc agc ctc gcc acg gct cgc cag cgc gtc gcg gcc cag 225
Arg Ala Ile Ser Leu Ala Thr Ala Arg Gln Arg Val Ala Ala Gln
-135 -130 -125
gac gga cag acc cgc acg gcg gcc tcg ctc gag cgc gcg ctc ggc 270
Asp Gly Gln Thr Arg Thr Ala Ala Ser Leu Glu Arg Ala Leu Gly
-120 -115 -110
gcc cgg gcc gca ggg tcc tac atc gac gcc acc tcc ggc gcg ctc gtc 318
Ala Arg Ala Ala Gly Ser Tyr Ile Asp Ala Thr Ser Gly Ala Leu Val
-105 -100 -95
gtc aac gtc gtc gac acc gcg tcc gtc gcc agg gtg ctg tct gcc ggt 366
Val Asn Val Val Asp Thr Ala Ser Val Ala Arg Val Leu Ser Ala Gly
-90 -85 -80 -75
gcc gtc gcc aag gtc gtc gac cgc tcg acg agc gag ctg tcc gcg acc 414
Ala Val Ala Lys Val Val Asp Arg Ser Thr Ser Glu Leu Ser Ala Thr
-70 -65 -60
gag cgc gcg gca cgc gca cgt gcc ggg tcg gcc gtc gtg tcc tcc tac 462
Glu Arg Ala Ala Arg Ala Arg Ala Gly Ser Ala Val Val Ser Ser Tyr
-55 -50 -45
acc gac ccc gtc acc aac ggc gtc gtc ctg acc gtc ccc agc gcg cgg 510
Thr Asp Pro Val Thr Asn Gly Val Val Leu Thr Val Pro Ser Ala Arg
-40 -35 -30
gtc tcg gag gtc cgc agc gag gtc gtt ggt ctc gac ggg gtg acc gtc 558
Val Ser Glu Val Arg Ser Glu Val Val Gly Leu Asp Gly Val Thr Val
-25 -20 -15
gca ggc acc gac gca cgg acg acg acg cag gcc aac gtc tac ggc ggc 606
Ala Gly Thr Asp Ala Arg Thr Thr Thr Gln Ala Asn Val Tyr Gly Gly
-10 -5 -1 1 5
cag cag atc gag ttc agc ggc tac gtc tgc tcg ctc ggc ttc aac gcc 654
Gln Gln Ile Glu Phe Ser Gly Tyr Val Cys Ser Leu Gly Phe Asn Ala
10 15 20
acc cgc ggc ggt gct ccg gtg ttc gtc acc gcc ggc cac tgt ggt gag 702
Thr Arg Gly Gly Ala Pro Val Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Glu
25 30 35
ggt tac cag acc ttc agc aag gga ggc acg acg ctg ggg tcg acg cag 750
Gly Tyr Gln Thr Phe Ser Lys Gly Gly Thr Thr Leu Gly Ser Thr Gln
40 45 50
gcg tac tcc ttc ccg ggc aac gac tac gcc tac tcg acc ctg acg tcg 798
Ala Tyr Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Tyr Ser Thr Leu Thr Ser
55 60 65 70
agc tgg acc ggg gtc ggt gcc gtc gac ctc tac gac ggc gtc aac gcc 846
Ser Trp Thr Gly Val Gly Ala Val Asp Leu Tyr Asp Gly Val Asn Ala
75 80 85
cgc cgg gtc tcg ggc tac tcg aac gcc ccg gtc ggg acc gcg atc tgc 894
Arg Arg Val Ser Gly Tyr Ser Asn Ala Pro Val Gly Thr Ala Ile Cys
90 95 100
aag tcg ggc cgc acg acc ggc tgg acc tgc ggc tcg gtg cag gcc aag 942
Lys Ser Gly Arg Thr Thr Gly Trp Thr Cys Gly Ser Val Gln Ala Lys
105 110 115
aac gtc acc gtc aac tac agc aac gcc gac ggc tcg acg agc acc gtg 990
Asn Val Thr Val Asn Tyr Ser Asn Ala Asp Gly Ser Thr Ser Thr Val
120 125 130
agc ggc ctg acg aag agc aac acc tgc acc gag ggt ggc gac tcg ggc 1038
Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr Glu Gly Gly Asp Ser Gly
135 140 145 150
ggc tcg tgg atg gcg agc acg tcg gca cag ggc gtg acg agc ggt ggt 1086
Gly Ser Trp Met Ala Ser Thr Ser Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly
155 160 165
gcc ggc tac ggc gcc aac agc gtc tgc ggc cag aag gtc ggc cag ccc 1134
Ala Gly Tyr Gly Ala Asn Ser Val Cys Gly Gln Lys Val Gly Gln Pro
170 175 180
aac atc gcc tac ttc cag ccc gtc gac gag atc gtg tcg gcc tac ggc 1182
Asn Ile Ala Tyr Phe Gln Pro Val Asp Glu Ile Val Ser Ala Tyr Gly
185 190 195
ctg acg ctc aag acc tcc tga 1203
Leu Thr Leu Lys Thr Ser
200
<210> 11
<211> 400
<212> PRT
<213> 土壤球菌属（Terracoccus sp.）
<400> 11
Met Ile Arg Thr Ser Leu Thr Thr Leu Ala Ala Thr Ala Ala Ile
-195 -190 -185
Ala Thr Ala Ile Thr Val Met Pro Ala Gln Ala Ser Thr Leu Ala
-180 -175 -170
Ser Asp Pro Thr Pro Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ser Thr Asp Ser
-165 -160 -155
Gly Gln Ser Val Ala Glu Met Ser Ala Arg Trp Leu Ala Lys Asp
-150 -145 -140
Arg Ala Ile Ser Leu Ala Thr Ala Arg Gln Arg Val Ala Ala Gln
-135 -130 -125
Asp Gly Gln Thr Arg Thr Ala Ala Ser Leu Glu Arg Ala Leu Gly
-120 -115 -110
Ala Arg Ala Ala Gly Ser Tyr Ile Asp Ala Thr Ser Gly Ala Leu Val
-105 -100 -95
Val Asn Val Val Asp Thr Ala Ser Val Ala Arg Val Leu Ser Ala Gly
-90 -85 -80 -75
Ala Val Ala Lys Val Val Asp Arg Ser Thr Ser Glu Leu Ser Ala Thr
-70 -65 -60
Glu Arg Ala Ala Arg Ala Arg Ala Gly Ser Ala Val Val Ser Ser Tyr
-55 -50 -45
Thr Asp Pro Val Thr Asn Gly Val Val Leu Thr Val Pro Ser Ala Arg
-40 -35 -30
Val Ser Glu Val Arg Ser Glu Val Val Gly Leu Asp Gly Val Thr Val
-25 -20 -15
Ala Gly Thr Asp Ala Arg Thr Thr Thr Gln Ala Asn Val Tyr Gly Gly
-10 -5 -1 1 5
Gln Gln Ile Glu Phe Ser Gly Tyr Val Cys Ser Leu Gly Phe Asn Ala
10 15 20
Thr Arg Gly Gly Ala Pro Val Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly Glu
25 30 35
Gly Tyr Gln Thr Phe Ser Lys Gly Gly Thr Thr Leu Gly Ser Thr Gln
40 45 50
Ala Tyr Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Tyr Ser Thr Leu Thr Ser
55 60 65 70
Ser Trp Thr Gly Val Gly Ala Val Asp Leu Tyr Asp Gly Val Asn Ala
75 80 85
Arg Arg Val Ser Gly Tyr Ser Asn Ala Pro Val Gly Thr Ala Ile Cys
90 95 100
Lys Ser Gly Arg Thr Thr Gly Trp Thr Cys Gly Ser Val Gln Ala Lys
105 110 115
Asn Val Thr Val Asn Tyr Ser Asn Ala Asp Gly Ser Thr Ser Thr Val
120 125 130
Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr Glu Gly Gly Asp Ser Gly
135 140 145 150
Gly Ser Trp Met Ala Ser Thr Ser Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly
155 160 165
Ala Gly Tyr Gly Ala Asn Ser Val Cys Gly Gln Lys Val Gly Gln Pro
170 175 180
Asn Ile Ala Tyr Phe Gln Pro Val Asp Glu Ile Val Ser Ala Tyr Gly
185 190 195
Leu Thr Leu Lys Thr Ser
200
<210> 12
<211> 1206
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 表达构建体
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1203)
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(81)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (592)..(1203)
<400> 12
atg aag aaa ccg ttg ggg aaa att gtc gca agc acc gca cta ctc 45
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu
-195 -190 -185
att tct gtt gct ttt agt tca tcg atc gca tcg gct tca aca ctg 90
Ile Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ser Thr Leu
-180 -175 -170
gca tca gat ccg aca ccg gca cct aca ccg gca gca agc aca gat 135
Ala Ser Asp Pro Thr Pro Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ser Thr Asp
-165 -160 -155
tca ggc caa tca gtt gca gaa atg tca gca aga tgg ctg gca aaa 180
Ser Gly Gln Ser Val Ala Glu Met Ser Ala Arg Trp Leu Ala Lys
-150 -145 -140
gat aga gca att tca ctg gca aca gca aga cag cgc gtt gca gca 225
Asp Arg Ala Ile Ser Leu Ala Thr Ala Arg Gln Arg Val Ala Ala
-135 -130 -125
caa gat ggc caa aca aga aca gca gca tca ctg gaa aga gca ctt 270
Gln Asp Gly Gln Thr Arg Thr Ala Ala Ser Leu Glu Arg Ala Leu
-120 -115 -110
ggc gca aga gca gca ggc tca tat att gat gca aca tca ggc gca ctg 318
Gly Ala Arg Ala Ala Gly Ser Tyr Ile Asp Ala Thr Ser Gly Ala Leu
-105 -100 -95
gtt gtt aat gtt gtt gat aca gca agc gtt gca aga gtt ctg tca gca 366
Val Val Asn Val Val Asp Thr Ala Ser Val Ala Arg Val Leu Ser Ala
-90 -85 -80 -75
ggc gca gtt gca aaa gtt gtc gat aga tca aca tca gaa ctg agc gca 414
Gly Ala Val Ala Lys Val Val Asp Arg Ser Thr Ser Glu Leu Ser Ala
-70 -65 -60
aca gaa aga gcg gca aga gcg aga gca ggc agc gca gtt gtt tca tca 462
Thr Glu Arg Ala Ala Arg Ala Arg Ala Gly Ser Ala Val Val Ser Ser
-55 -50 -45
tat aca gat ccg gtt aca aat ggc gtt gtt ctg aca gtt ccg agc gca 510
Tyr Thr Asp Pro Val Thr Asn Gly Val Val Leu Thr Val Pro Ser Ala
-40 -35 -30
aga gtt tca gaa gtt aga agc gaa gtt gtt ggc ctg gat ggc gtt aca 558
Arg Val Ser Glu Val Arg Ser Glu Val Val Gly Leu Asp Gly Val Thr
-25 -20 -15
gtt gca ggc aca gat gca aga aca aca aca caa gca aat gtt tat ggc 606
Val Ala Gly Thr Asp Ala Arg Thr Thr Thr Gln Ala Asn Val Tyr Gly
-10 -5 -1 1 5
gga cag cag att gaa ttt tca ggc tat gtt tgc tca ctg ggc ttt aat 654
Gly Gln Gln Ile Glu Phe Ser Gly Tyr Val Cys Ser Leu Gly Phe Asn
10 15 20
gca aca aga ggc gga gca ccg gtt ttt gtt aca gca ggc cat tgc gga 702
Ala Thr Arg Gly Gly Ala Pro Val Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly
25 30 35
gaa ggc tat caa aca ttt tca aaa ggc gga aca aca ctg ggc agc aca 750
Glu Gly Tyr Gln Thr Phe Ser Lys Gly Gly Thr Thr Leu Gly Ser Thr
40 45 50
caa gca tat tca ttt ccg gga aac gat tat gca tat agc aca ctg aca 798
Gln Ala Tyr Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Tyr Ser Thr Leu Thr
55 60 65
tca tca tgg aca ggc gtt gga gca gtt gat ctg tat gat ggc gtc aat 846
Ser Ser Trp Thr Gly Val Gly Ala Val Asp Leu Tyr Asp Gly Val Asn
70 75 80 85
gca aga aga gtt agc ggc tat tca aat gca ccg gtt ggc aca gca att 894
Ala Arg Arg Val Ser Gly Tyr Ser Asn Ala Pro Val Gly Thr Ala Ile
90 95 100
tgc aaa agc ggc aga aca aca ggc tgg aca tgc ggc tca gtt caa gca 942
Cys Lys Ser Gly Arg Thr Thr Gly Trp Thr Cys Gly Ser Val Gln Ala
105 110 115
aaa aat gtc aca gtc aat tat agc aat gca gat ggc tca aca tca aca 990
Lys Asn Val Thr Val Asn Tyr Ser Asn Ala Asp Gly Ser Thr Ser Thr
120 125 130
gtt tca ggc ctt aca aaa agc aac aca tgc aca gaa ggc gga gat agc 1038
Val Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr Glu Gly Gly Asp Ser
135 140 145
gga ggc tca tgg atg gca tca aca agc gca caa ggc gtt aca agc gga 1086
Gly Gly Ser Trp Met Ala Ser Thr Ser Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly
150 155 160 165
ggc gca ggc tat ggc gca aat tca gtt tgc gga caa aaa gtt gga caa 1134
Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Asn Ser Val Cys Gly Gln Lys Val Gly Gln
170 175 180
ccg aac att gca tat ttt caa ccg gtc gat gaa att gtt agc gca tat 1182
Pro Asn Ile Ala Tyr Phe Gln Pro Val Asp Glu Ile Val Ser Ala Tyr
185 190 195
ggc ctg aca ctg aaa aca tca taa 1206
Gly Leu Thr Leu Lys Thr Ser
200
<210> 13
<211> 401
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 13
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu
-195 -190 -185
Ile Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ser Thr Leu
-180 -175 -170
Ala Ser Asp Pro Thr Pro Ala Pro Thr Pro Ala Ala Ser Thr Asp
-165 -160 -155
Ser Gly Gln Ser Val Ala Glu Met Ser Ala Arg Trp Leu Ala Lys
-150 -145 -140
Asp Arg Ala Ile Ser Leu Ala Thr Ala Arg Gln Arg Val Ala Ala
-135 -130 -125
Gln Asp Gly Gln Thr Arg Thr Ala Ala Ser Leu Glu Arg Ala Leu
-120 -115 -110
Gly Ala Arg Ala Ala Gly Ser Tyr Ile Asp Ala Thr Ser Gly Ala Leu
-105 -100 -95
Val Val Asn Val Val Asp Thr Ala Ser Val Ala Arg Val Leu Ser Ala
-90 -85 -80
Gly Ala Val Ala Lys Val Val Asp Arg Ser Thr Ser Glu Leu Ser Ala
-75 -70 -65 -60
Thr Glu Arg Ala Ala Arg Ala Arg Ala Gly Ser Ala Val Val Ser Ser
-55 -50 -45
Tyr Thr Asp Pro Val Thr Asn Gly Val Val Leu Thr Val Pro Ser Ala
-40 -35 -30
Arg Val Ser Glu Val Arg Ser Glu Val Val Gly Leu Asp Gly Val Thr
-25 -20 -15
Val Ala Gly Thr Asp Ala Arg Thr Thr Thr Gln Ala Asn Val Tyr Gly
-10 -5 -1 1 5
Gly Gln Gln Ile Glu Phe Ser Gly Tyr Val Cys Ser Leu Gly Phe Asn
10 15 20
Ala Thr Arg Gly Gly Ala Pro Val Phe Val Thr Ala Gly His Cys Gly
25 30 35
Glu Gly Tyr Gln Thr Phe Ser Lys Gly Gly Thr Thr Leu Gly Ser Thr
40 45 50
Gln Ala Tyr Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Tyr Ser Thr Leu Thr
55 60 65
Ser Ser Trp Thr Gly Val Gly Ala Val Asp Leu Tyr Asp Gly Val Asn
70 75 80 85
Ala Arg Arg Val Ser Gly Tyr Ser Asn Ala Pro Val Gly Thr Ala Ile
90 95 100
Cys Lys Ser Gly Arg Thr Thr Gly Trp Thr Cys Gly Ser Val Gln Ala
105 110 115
Lys Asn Val Thr Val Asn Tyr Ser Asn Ala Asp Gly Ser Thr Ser Thr
120 125 130
Val Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr Glu Gly Gly Asp Ser
135 140 145
Gly Gly Ser Trp Met Ala Ser Thr Ser Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly
150 155 160 165
Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Asn Ser Val Cys Gly Gln Lys Val Gly Gln
170 175 180
Pro Asn Ile Ala Tyr Phe Gln Pro Val Asp Glu Ile Val Ser Ala Tyr
185 190 195
Gly Leu Thr Leu Lys Thr Ser
200
<210> 14
<211> 204
<212> PRT
<213> 土壤球菌属（Terracoccus sp.）
<220>
<221> 成熟肽
<222> (1)..(204)
<400> 14
Ala Asn Val Tyr Gly Gly Gln Gln Ile Glu Phe Ser Gly Tyr Val Cys
1 5 10 15
Ser Leu Gly Phe Asn Ala Thr Arg Gly Gly Ala Pro Val Phe Val Thr
20 25 30
Ala Gly His Cys Gly Glu Gly Tyr Gln Thr Phe Ser Lys Gly Gly Thr
35 40 45
Thr Leu Gly Ser Thr Gln Ala Tyr Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Tyr Ser Thr Leu Thr Ser Ser Trp Thr Gly Val Gly Ala Val Asp Leu
65 70 75 80
Tyr Asp Gly Val Asn Ala Arg Arg Val Ser Gly Tyr Ser Asn Ala Pro
85 90 95
Val Gly Thr Ala Ile Cys Lys Ser Gly Arg Thr Thr Gly Trp Thr Cys
100 105 110
Gly Ser Val Gln Ala Lys Asn Val Thr Val Asn Tyr Ser Asn Ala Asp
115 120 125
Gly Ser Thr Ser Thr Val Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr
130 135 140
Glu Gly Gly Asp Ser Gly Gly Ser Trp Met Ala Ser Thr Ser Ala Gln
145 150 155 160
Gly Val Thr Ser Gly Gly Ala Gly Tyr Gly Ala Asn Ser Val Cys Gly
165 170 175
Gln Lys Val Gly Gln Pro Asn Ile Ala Tyr Phe Gln Pro Val Asp Glu
180 185 190
Ile Val Ser Ala Tyr Gly Leu Thr Leu Lys Thr Ser
195 200
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基序VCG[E/Q]KVGQP.
<220>
<221> 尚未归类的特征
<222> (4)..(4)
<223> 该保守基序的位置4处的氨基酸是谷氨酸（Glu， E）抑或谷氨酰胺（Gln， Q）。
<400> 15
Val Cys Gly Xaa Lys Val Gly Gln Pro
1 5
<210> 16
<211> 1209
<212> DNA
<213> 黄色诺尔氏菌（Knoellia flava）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1206)
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(87)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (595)..(1206)
<400> 16
atg tct cgc aga cgt ctc acc gtc ctc gcc ggg ggc ctc tcg gcc 45
Met Ser Arg Arg Arg Leu Thr Val Leu Ala Gly Gly Leu Ser Ala
-195 -190 -185
gcg gcg gca gcc acc gcc ctc tgc gtc gcg ccc gcg tcc gcc gcc 90
Ala Ala Ala Ala Thr Ala Leu Cys Val Ala Pro Ala Ser Ala Ala
-180 -175 -170
acc tcc gcg gcg ggc ggt ccg gag ccg agc acc ggc cct ctc gcc 135
Thr Ser Ala Ala Gly Gly Pro Glu Pro Ser Thr Gly Pro Leu Ala
-165 -160 -155
acc gac tcg ggc gcg tcc gtc gcc gag atg tcg gcc cgg tgg ctc 180
Thr Asp Ser Gly Ala Ser Val Ala Glu Met Ser Ala Arg Trp Leu
-150 -145 -140
gcc aag gag cac gac ctg agc atc gag acc gct cgt gag cgg atc 225
Ala Lys Glu His Asp Leu Ser Ile Glu Thr Ala Arg Glu Arg Ile
-135 -130 -125
gcg tcc cag gag gac aag agt cgc aag gcc gag gct ctc gaa cgg 270
Ala Ser Gln Glu Asp Lys Ser Arg Lys Ala Glu Ala Leu Glu Arg
-120 -115 -110
tcg ctc ggc gcg cga gcc gtg ggc tcg ttc atc gac cag acc ggc ggc 318
Ser Leu Gly Ala Arg Ala Val Gly Ser Phe Ile Asp Gln Thr Gly Gly
-105 -100 -95
gtg ctc gtc gtc aac gtc acc gac gcc gac gcc gct gcc cgc gtg cag 366
Val Leu Val Val Asn Val Thr Asp Ala Asp Ala Ala Ala Arg Val Gln
-90 -85 -80
aag gcg ggc gcg acc gcc cgc gtc gtc acc gag gac aag gcg gag ctc 414
Lys Ala Gly Ala Thr Ala Arg Val Val Thr Glu Asp Lys Ala Glu Leu
-75 -70 -65
ggc gcg tcg cag gcg agg gcg gtc aag gcg ctc ggc gcc acg gtc atc 462
Gly Ala Ser Gln Ala Arg Ala Val Lys Ala Leu Gly Ala Thr Val Ile
-60 -55 -50 -45
gac agc tcc gtc gac ccg gtg acc aac aag gtc gtc gtc acc gtg ccc 510
Asp Ser Ser Val Asp Pro Val Thr Asn Lys Val Val Val Thr Val Pro
-40 -35 -30
acc gcc gac gtc gcc gcc gcg cgg gcg cgc acg agc gac ccg tcg gtg 558
Thr Ala Asp Val Ala Ala Ala Arg Ala Arg Thr Ser Asp Pro Ser Val
-25 -20 -15
acg atc cag ggc acc gac gcg acg gtg tcg acg cag gcc aac gtc tat 606
Thr Ile Gln Gly Thr Asp Ala Thr Val Ser Thr Gln Ala Asn Val Tyr
-10 -5 -1 1
ggc ggg cag cag atc gag ttc agc ggc tac gtc tgc tcg ctg ggc ttc 654
Gly Gly Gln Gln Ile Glu Phe Ser Gly Tyr Val Cys Ser Leu Gly Phe
5 10 15 20
aac gcg acg aag tcc ggc acc ccg gtc ttc atc acc gcc ggc cac tgc 702
Asn Ala Thr Lys Ser Gly Thr Pro Val Phe Ile Thr Ala Gly His Cys
25 30 35
gcc gag ggg aac cag acc ttc acg cgc aac ggc acg acc ctc ggc acg 750
Ala Glu Gly Asn Gln Thr Phe Thr Arg Asn Gly Thr Thr Leu Gly Thr
40 45 50
acc cgc ggc tgg tcc ttc ccg ggc aac gac tac gcc tac tcg agc ctc 798
Thr Arg Gly Trp Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Tyr Ser Ser Leu
55 60 65
acc tcg agc tgg acc ggc atc ggc gcc gtc gac ctg tgg aac ggc acg 846
Thr Ser Ser Trp Thr Gly Ile Gly Ala Val Asp Leu Trp Asn Gly Thr
70 75 80
agc gcg cgc tcc gtc acg ggc tcg agc aac gcc gcc gtc ggc acc gcg 894
Ser Ala Arg Ser Val Thr Gly Ser Ser Asn Ala Ala Val Gly Thr Ala
85 90 95 100
atc tgc aag tcg ggc cgc acg acc ggc tgg acc tgt ggc tcg gtc cag 942
Ile Cys Lys Ser Gly Arg Thr Thr Gly Trp Thr Cys Gly Ser Val Gln
105 110 115
acc aag aac gtc acc gtc aac tac aac aac ggc gac ggc acc tac tcg 990
Thr Lys Asn Val Thr Val Asn Tyr Asn Asn Gly Asp Gly Thr Tyr Ser
120 125 130
acc gtg agc ggc ctg acg aag tcc aac acc tgc acc gag ggt ggc gac 1038
Thr Val Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr Glu Gly Gly Asp
135 140 145
tcc ggc ggc tcg tgg atg gcg ggc aac ctc gcc cag ggc gtg acg agc 1086
Ser Gly Gly Ser Trp Met Ala Gly Asn Leu Ala Gln Gly Val Thr Ser
150 155 160
ggc ggc gcc ggc tac ggc tcc aac ggc gtc tgc ggc cag aag gtc ggc 1134
Gly Gly Ala Gly Tyr Gly Ser Asn Gly Val Cys Gly Gln Lys Val Gly
165 170 175 180
cag ccc aac atc gcc tac ttc cag ccg atc ggc gag atc ctc tcc gtc 1182
Gln Pro Asn Ile Ala Tyr Phe Gln Pro Ile Gly Glu Ile Leu Ser Val
185 190 195
tac ggc ctc acc ctc aag acc gcc tga 1209
Tyr Gly Leu Thr Leu Lys Thr Ala
200
<210> 17
<211> 402
<212> PRT
<213> 黄色诺尔氏菌
<400> 17
Met Ser Arg Arg Arg Leu Thr Val Leu Ala Gly Gly Leu Ser Ala
-195 -190 -185
Ala Ala Ala Ala Thr Ala Leu Cys Val Ala Pro Ala Ser Ala Ala
-180 -175 -170
Thr Ser Ala Ala Gly Gly Pro Glu Pro Ser Thr Gly Pro Leu Ala
-165 -160 -155
Thr Asp Ser Gly Ala Ser Val Ala Glu Met Ser Ala Arg Trp Leu
-150 -145 -140
Ala Lys Glu His Asp Leu Ser Ile Glu Thr Ala Arg Glu Arg Ile
-135 -130 -125
Ala Ser Gln Glu Asp Lys Ser Arg Lys Ala Glu Ala Leu Glu Arg
-120 -115 -110
Ser Leu Gly Ala Arg Ala Val Gly Ser Phe Ile Asp Gln Thr Gly Gly
-105 -100 -95
Val Leu Val Val Asn Val Thr Asp Ala Asp Ala Ala Ala Arg Val Gln
-90 -85 -80
Lys Ala Gly Ala Thr Ala Arg Val Val Thr Glu Asp Lys Ala Glu Leu
-75 -70 -65
Gly Ala Ser Gln Ala Arg Ala Val Lys Ala Leu Gly Ala Thr Val Ile
-60 -55 -50 -45
Asp Ser Ser Val Asp Pro Val Thr Asn Lys Val Val Val Thr Val Pro
-40 -35 -30
Thr Ala Asp Val Ala Ala Ala Arg Ala Arg Thr Ser Asp Pro Ser Val
-25 -20 -15
Thr Ile Gln Gly Thr Asp Ala Thr Val Ser Thr Gln Ala Asn Val Tyr
-10 -5 -1 1
Gly Gly Gln Gln Ile Glu Phe Ser Gly Tyr Val Cys Ser Leu Gly Phe
5 10 15 20
Asn Ala Thr Lys Ser Gly Thr Pro Val Phe Ile Thr Ala Gly His Cys
25 30 35
Ala Glu Gly Asn Gln Thr Phe Thr Arg Asn Gly Thr Thr Leu Gly Thr
40 45 50
Thr Arg Gly Trp Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Tyr Ser Ser Leu
55 60 65
Thr Ser Ser Trp Thr Gly Ile Gly Ala Val Asp Leu Trp Asn Gly Thr
70 75 80
Ser Ala Arg Ser Val Thr Gly Ser Ser Asn Ala Ala Val Gly Thr Ala
85 90 95 100
Ile Cys Lys Ser Gly Arg Thr Thr Gly Trp Thr Cys Gly Ser Val Gln
105 110 115
Thr Lys Asn Val Thr Val Asn Tyr Asn Asn Gly Asp Gly Thr Tyr Ser
120 125 130
Thr Val Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr Glu Gly Gly Asp
135 140 145
Ser Gly Gly Ser Trp Met Ala Gly Asn Leu Ala Gln Gly Val Thr Ser
150 155 160
Gly Gly Ala Gly Tyr Gly Ser Asn Gly Val Cys Gly Gln Lys Val Gly
165 170 175 180
Gln Pro Asn Ile Ala Tyr Phe Gln Pro Ile Gly Glu Ile Leu Ser Val
185 190 195
Tyr Gly Leu Thr Leu Lys Thr Ala
200
<210> 18
<211> 1200
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 密码子优化的合成基因
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1200)
<220>
<221> 信号肽
<222> (1)..(81)
<220>
<221> 成熟肽
<222> (589)..(1200)
<400> 18
atg aag aaa ccg ttg ggg aaa att gtc gca agc acc gca cta ctc 45
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu
-195 -190 -185
att tct gtt gct ttt agt tca tcg atc gca tcg gct gct aca tct 90
Ile Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Thr Ser
-180 -175 -170
gca gct ggt ggc cca gaa cca tca act ggc cca ctt gct aca gat 135
Ala Ala Gly Gly Pro Glu Pro Ser Thr Gly Pro Leu Ala Thr Asp
-165 -160 -155
tct ggc gct tca gtt gcc gag atg tca gca cgc tgg ctt gcg aaa 180
Ser Gly Ala Ser Val Ala Glu Met Ser Ala Arg Trp Leu Ala Lys
-150 -145 -140
gaa cac gat ctt tca att gag act gca cgt gag cgc atc gct agc 225
Glu His Asp Leu Ser Ile Glu Thr Ala Arg Glu Arg Ile Ala Ser
-135 -130 -125
cag gaa gac aaa tct cgc aag gct gaa gct ctt gaa cgc tca ctt 270
Gln Glu Asp Lys Ser Arg Lys Ala Glu Ala Leu Glu Arg Ser Leu
-120 -115 -110
ggc gct cgt gct gtt ggc agc ttt atc gac caa act ggc ggt gta ttg 318
Gly Ala Arg Ala Val Gly Ser Phe Ile Asp Gln Thr Gly Gly Val Leu
-105 -100 -95
gta gta aac gtt act gat gcg gat gca gca gct cgc gtt caa aag gca 366
Val Val Asn Val Thr Asp Ala Asp Ala Ala Ala Arg Val Gln Lys Ala
-90 -85 -80 -75
gga gct aca gct cgt gtt gtt act gag gat aag gct gaa ctt ggc gct 414
Gly Ala Thr Ala Arg Val Val Thr Glu Asp Lys Ala Glu Leu Gly Ala
-70 -65 -60
tct caa gct cgt gct gtt aag gct ctt ggt gcc act gta att gat agc 462
Ser Gln Ala Arg Ala Val Lys Ala Leu Gly Ala Thr Val Ile Asp Ser
-55 -50 -45
tca gtt gac cct gta acg aac aaa gtt gta gtt aca gta cct act gct 510
Ser Val Asp Pro Val Thr Asn Lys Val Val Val Thr Val Pro Thr Ala
-40 -35 -30
gat gtt gcg gca gca cgt gca cgt aca agc gac cca tct gta act att 558
Asp Val Ala Ala Ala Arg Ala Arg Thr Ser Asp Pro Ser Val Thr Ile
-25 -20 -15
caa gga aca gac gca acg gtt tct aca cag gct aac gtt tat ggt ggc 606
Gln Gly Thr Asp Ala Thr Val Ser Thr Gln Ala Asn Val Tyr Gly Gly
-10 -5 -1 1 5
cag cag atc gag ttc tct gga tac gta tgt tca tta ggt ttc aac gca 654
Gln Gln Ile Glu Phe Ser Gly Tyr Val Cys Ser Leu Gly Phe Asn Ala
10 15 20
act aaa tct gga act cct gtt ttc atc aca gct ggc cat tgt gcg gaa 702
Thr Lys Ser Gly Thr Pro Val Phe Ile Thr Ala Gly His Cys Ala Glu
25 30 35
ggt aac cag act ttc act cgt aat ggt aca aca ttg ggt aca aca cgc 750
Gly Asn Gln Thr Phe Thr Arg Asn Gly Thr Thr Leu Gly Thr Thr Arg
40 45 50
ggt tgg tct ttt cca ggt aac gat tat gcg tac tca tct ctt act tct 798
Gly Trp Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Tyr Ser Ser Leu Thr Ser
55 60 65 70
tct tgg act ggt att gga gct gtt gac tta tgg aat gga aca tca gct 846
Ser Trp Thr Gly Ile Gly Ala Val Asp Leu Trp Asn Gly Thr Ser Ala
75 80 85
cgc tct gta act ggc tca tca aac gct gct gtt gga act gca att tgc 894
Arg Ser Val Thr Gly Ser Ser Asn Ala Ala Val Gly Thr Ala Ile Cys
90 95 100
aaa tct ggt cgt aca acg gga tgg aca tgt ggt tct gta caa acg aaa 942
Lys Ser Gly Arg Thr Thr Gly Trp Thr Cys Gly Ser Val Gln Thr Lys
105 110 115
aac gta act gta aac tat aac aac gga gat ggt aca tat tct act gta 990
Asn Val Thr Val Asn Tyr Asn Asn Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Thr Val
120 125 130
tct ggt ctt aca aaa agc aat act tgc act gaa ggt gga gat tca ggc 1038
Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr Glu Gly Gly Asp Ser Gly
135 140 145 150
ggt tct tgg atg gct ggc aac tta gca caa ggt gta act agc ggt ggt 1086
Gly Ser Trp Met Ala Gly Asn Leu Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly
155 160 165
gct ggc tat ggt agc aat gga gta tgt ggc cag aaa gta ggt caa ccg 1134
Ala Gly Tyr Gly Ser Asn Gly Val Cys Gly Gln Lys Val Gly Gln Pro
170 175 180
aac att gct tac ttt cag cct atc ggt gaa atc ttg tct gtt tat ggt 1182
Asn Ile Ala Tyr Phe Gln Pro Ile Gly Glu Ile Leu Ser Val Tyr Gly
185 190 195
ctt aca ttg aaa aca gct 1200
Leu Thr Leu Lys Thr Ala
200
<210> 19
<211> 400
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成构建体
<400> 19
Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu
-195 -190 -185
Ile Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala Ala Thr Ser
-180 -175 -170
Ala Ala Gly Gly Pro Glu Pro Ser Thr Gly Pro Leu Ala Thr Asp
-165 -160 -155
Ser Gly Ala Ser Val Ala Glu Met Ser Ala Arg Trp Leu Ala Lys
-150 -145 -140
Glu His Asp Leu Ser Ile Glu Thr Ala Arg Glu Arg Ile Ala Ser
-135 -130 -125
Gln Glu Asp Lys Ser Arg Lys Ala Glu Ala Leu Glu Arg Ser Leu
-120 -115 -110
Gly Ala Arg Ala Val Gly Ser Phe Ile Asp Gln Thr Gly Gly Val Leu
-105 -100 -95
Val Val Asn Val Thr Asp Ala Asp Ala Ala Ala Arg Val Gln Lys Ala
-90 -85 -80 -75
Gly Ala Thr Ala Arg Val Val Thr Glu Asp Lys Ala Glu Leu Gly Ala
-70 -65 -60
Ser Gln Ala Arg Ala Val Lys Ala Leu Gly Ala Thr Val Ile Asp Ser
-55 -50 -45
Ser Val Asp Pro Val Thr Asn Lys Val Val Val Thr Val Pro Thr Ala
-40 -35 -30
Asp Val Ala Ala Ala Arg Ala Arg Thr Ser Asp Pro Ser Val Thr Ile
-25 -20 -15
Gln Gly Thr Asp Ala Thr Val Ser Thr Gln Ala Asn Val Tyr Gly Gly
-10 -5 -1 1 5
Gln Gln Ile Glu Phe Ser Gly Tyr Val Cys Ser Leu Gly Phe Asn Ala
10 15 20
Thr Lys Ser Gly Thr Pro Val Phe Ile Thr Ala Gly His Cys Ala Glu
25 30 35
Gly Asn Gln Thr Phe Thr Arg Asn Gly Thr Thr Leu Gly Thr Thr Arg
40 45 50
Gly Trp Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala Tyr Ser Ser Leu Thr Ser
55 60 65 70
Ser Trp Thr Gly Ile Gly Ala Val Asp Leu Trp Asn Gly Thr Ser Ala
75 80 85
Arg Ser Val Thr Gly Ser Ser Asn Ala Ala Val Gly Thr Ala Ile Cys
90 95 100
Lys Ser Gly Arg Thr Thr Gly Trp Thr Cys Gly Ser Val Gln Thr Lys
105 110 115
Asn Val Thr Val Asn Tyr Asn Asn Gly Asp Gly Thr Tyr Ser Thr Val
120 125 130
Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr Glu Gly Gly Asp Ser Gly
135 140 145 150
Gly Ser Trp Met Ala Gly Asn Leu Ala Gln Gly Val Thr Ser Gly Gly
155 160 165
Ala Gly Tyr Gly Ser Asn Gly Val Cys Gly Gln Lys Val Gly Gln Pro
170 175 180
Asn Ile Ala Tyr Phe Gln Pro Ile Gly Glu Ile Leu Ser Val Tyr Gly
185 190 195
Leu Thr Leu Lys Thr Ala
200
<210> 20
<211> 204
<212> PRT
<213> 黄色诺尔氏菌
<220>
<221> 成熟肽
<222> (1)..(204)
<400> 20
Ala Asn Val Tyr Gly Gly Gln Gln Ile Glu Phe Ser Gly Tyr Val Cys
1 5 10 15
Ser Leu Gly Phe Asn Ala Thr Lys Ser Gly Thr Pro Val Phe Ile Thr
20 25 30
Ala Gly His Cys Ala Glu Gly Asn Gln Thr Phe Thr Arg Asn Gly Thr
35 40 45
Thr Leu Gly Thr Thr Arg Gly Trp Ser Phe Pro Gly Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Tyr Ser Ser Leu Thr Ser Ser Trp Thr Gly Ile Gly Ala Val Asp Leu
65 70 75 80
Trp Asn Gly Thr Ser Ala Arg Ser Val Thr Gly Ser Ser Asn Ala Ala
85 90 95
Val Gly Thr Ala Ile Cys Lys Ser Gly Arg Thr Thr Gly Trp Thr Cys
100 105 110
Gly Ser Val Gln Thr Lys Asn Val Thr Val Asn Tyr Asn Asn Gly Asp
115 120 125
Gly Thr Tyr Ser Thr Val Ser Gly Leu Thr Lys Ser Asn Thr Cys Thr
130 135 140
Glu Gly Gly Asp Ser Gly Gly Ser Trp Met Ala Gly Asn Leu Ala Gln
145 150 155 160
Gly Val Thr Ser Gly Gly Ala Gly Tyr Gly Ser Asn Gly Val Cys Gly
165 170 175
Gln Lys Val Gly Gln Pro Asn Ile Ala Tyr Phe Gln Pro Ile Gly Glu
180 185 190
Ile Leu Ser Val Tyr Gly Leu Thr Leu Lys Thr Ala
195 200

Claims (19)

1.包含一种或多种具有蛋白酶活性的多肽的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽选自下组，该组由以下各项组成：
(a)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:5具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(b)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:14具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(c)一种多肽，该多肽与SEQ ID NO:20具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(d)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸在低严格条件、中严格条件、中-高严格条件、高严格条件、或非常高严格条件下与以下各项杂交：
(i)SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；
(ii)SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列；
(iii)SEQ ID NO:16的成熟多肽编码序列；或者
(iv)(i)、(ii)或(iii)的全长互补体；
(e)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(f)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:10的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(g)一种多肽，该多肽由以下多核苷酸编码，该多核苷酸与SEQ ID NO:16的成熟多肽编码序列具有至少65％，例如至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列一致性；
(h)SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:20的变体，其中该变体具有蛋白酶活性并且在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50位置中包括一个或多个取代、和/或一个或多个缺失、和/或一个或多个插入或其任何组合；以及
(i)具有蛋白酶活性的(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)、(g)或(h)的多肽的片段，其中该片段包括至少170个氨基酸，例如至少175个氨基酸，至少177个氨基酸，至少180个氨基酸，至少185个氨基酸，至少190个氨基酸，至少195个氨基酸或至少200个氨基酸。
2.如权利要求1所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽获得自或可获得自微球菌目。
3.如权利要求1至2中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽获得自或可获得自间孢囊菌科。
4.如权利要求1至3中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中：
(a)该多肽在pH 4下与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性相比，具有对大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍、至少3倍、至少3.25倍、至少3.5倍、至少3.75倍或至少4倍更高的活性；
(b)该多肽在pH 5下与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)的活性相比，具有对大豆-玉米粉至少2倍更高的活性，例如至少2.25倍、至少2.5倍、至少2.75倍或至少3倍更高的活性；并且
(c)与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，该多肽在pH 7下对大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。
5.如权利要求1至4中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中：
(a)与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 4下对大豆-玉米粉具有至少25％的活性，例如至少30％、至少35％或至少40％的活性；
(b)与在pH 7下的活性相比，该多肽在pH 5下对大豆-玉米粉具有至少45％的活性，例如至少50％、至少55％、至少60％、或至少65％的活性；并且
(c)与同一pH下蛋白酶10R(SEQ ID NO:8)相比，该多肽在pH 7下对大豆-玉米粉具有至少50％的活性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％(即，至少相同)、或至少105％的活性。
6.如权利要求1至5中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽包括SEQID NO:5、SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:20，SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11、SEQID NO:13、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19的成熟多肽，或SEQ ID NO:2的氨基酸1至203、SEQID NO:4的氨基酸1至203、SEQ ID NO:5的氨基酸1至203、SEQ ID NO:11的氨基酸1至204、SEQ ID NO:13的氨基酸1至204、SEQ ID NO:14的氨基酸1至204、SEQ ID NO:17的氨基酸1至204、SEQ ID NO:19的氨基酸1至204或SEQ ID NO:20的氨基酸1至204，或由它们组成。
7.如权利要求1至6中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该多肽包括一个或多个基序VCG[E/Q]KVGQP(SEQ ID NO:15)。
8.如权利要求1至7中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，具有50至800g/kg的粗蛋白质含量。
9.如权利要求1至8中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂，进一步包含选自以下列表的一种或多种组分，该列表由以下各项组成：
一种或多种另外的酶；
一种或多种微生物；
一种或多种维生素；
一种或多种矿物质；
一种或多种氨基酸；以及
一种或多种其他饲料成分。
10.如权利要求9所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中这些另外的酶选自下组，该组由以下各项组成：植酸酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶、α-半乳糖苷酶，另外的蛋白酶，磷脂酶A1、磷脂酶A2、溶血磷脂酶、磷脂酶C、磷脂酶D、淀粉酶、溶菌酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、β-木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶、阿魏酸酯酶、纤维素酶、纤维二糖水解酶、β-葡糖苷酶、支链淀粉酶、和β-葡聚糖酶或其任何组合。
11.如权利要求9所述的动物饲料或动物饲料添加剂，其中该一种或多种微生物选自下组，该组由以下各项组成：枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、多粘菌芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、肉食杆菌属(Carnobacterium sp.)、丁酸梭菌、梭菌属、屎肠球菌、肠球菌属、乳酸杆菌属、嗜酸乳杆菌、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminus)、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、唾液乳酸杆菌、乳酸乳球菌、乳球菌属、明串珠菌属、埃氏巨型球菌(Megasphaera elsdenii)、巨型球菌属(Megasphaera sp.)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、片球菌属、特氏丙酸杆菌(Propionibacterium thoenii)、丙酸杆菌属、以及链球菌属或其任何组合。
12.如权利要求1至11中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂的用途：
在用于在动物饲料中使用的组合物的制备中；
用于改进动物饲料的营养价值；
用于增加动物饲料中的可消化和/或可溶性蛋白；
用于增加动物饮食中的蛋白的水解程度；
用于改进动物中的一个或多个性能参数；和/或
用于处理蛋白。
13.一种用于制备动物饲料的方法，包括将如权利要求1至11中任一项所述的动物饲料添加剂与至少一种蛋白质或蛋白质源进行混合。
14.一种用于改进动物饲料的营养价值的方法，其中将如权利要求1至11中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂添加至饲料中。
15.一种用于处理蛋白的方法，包括以下步骤：将如权利要求1至11中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂添加到至少一种蛋白质或蛋白质源中。
16.一种用于增加蛋白质的消化率和/或溶解度的方法，包括将如权利要求1至11中任一项所述的动物饲料添加剂与至少一种蛋白质或蛋白质源进行混合。
17.一种用于改进动物中的一种或多种性能参数的方法，包括将如权利要求1至11中任一项所述的动物饲料或动物饲料添加剂给予一种或多种动物。
18.如权利要求12所述的用途或如权利要求17所述的方法，其中性能参数选自以下列表，该列表由以下各项组成：体重增加(BWG)、欧洲生产效率因子(EPEF)以及饲料转化率(FCR)。
19.一种产生多肽的方法，该方法包括：
(a)培养重组芽孢杆菌表达宿主细胞，其包含编码权利要求1-11中任一项所示的多肽的多核苷酸，该多核苷酸可操作地连接一个或多个控制序列，这些控制序列在有益于产生该多肽的条件下指导该多肽的产生；以及
(b)回收该多肽。
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