CH646524A5 - Procede pour preparer un reactif qui s'agglutine lorsqu'on le met en contact avec des liquides de l'organisme contenant des antigenes. - Google Patents

Description

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REVENDICATIONS d'agglutination pour la détection d'antigènes dans les liquides

1. Procédé pour préparer un réactif qui s'agglutine lors- de l'organisme choisis parmi le groupe constitué par le sérum qu'on le met en contact avec des liquides de l'organisme con- et le plasma susceptible de contenir de tels antigènes, compre-tenant des antigènes, caractérisé en ce qu'il comprend les éta- nant le chauffage de ce liquide de l'organisme et la combinai-pes selon lesquelles: 5 son de ce liquide de l'organisme traité par la chaleur avec un on injecte une cartaine quantité d'antigènes à une espèce agent réducteur capable de réduire les anticorps de type antianimale et on laisse l'espèce animale produire un antisérum globulines de ce liquide, en particulier le mercapto-2 éthanol, dirigé contre l'antigène; le dithiothréitol, le glutathion, la cystéine et similaires, et à un on recueille l'antisérum ainsi produit; réactif liquide, l'incubation de ce milieu puis la détermination on dilue cet antisérum dans un système tampon physiolo- i0 visuellement du degré d'agglutination.

gique compatible; 15. Utilisation selon la revendication 11 comme test direct on mélange la solution d'antisérum ainsi obtenue à une d'agglutination, la période d'incubation étant de 45 minutes suspension de particules; ou plus.

on incube la suspension; 16. Utilisation selon la revendication 11 comme test direct on centrifuge cette suspension et on décante l'antisérum 15 d'agglutination pour la détection d'antigènes dans un liquide non absorbé; céphalorachidien susceptible de contenir ces antigènes, com-

on remet le culot ainsi obtenu en suspension dans un prenant la combinaison de ce liquide céphalorachidien avec le système tampon physiologique compatible; et réactif liquide, l'incubation du mélange puis la détermination on centrifuge à nouveau et on remet le culot en suspension visuellement du degré d'agglutination.

dans ledit système tampon contenant un sérum animal non 20

immun de la même espèce que celle ayant servi à la prépara-

tion de l'antisérum.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que La présente invention a pour objet un procédé pour pré-l'espèce animale utilisée est un équidé. parer un réactif qui s'agglutine lorsqu'on le met en contact

3. Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce 25 avec des liquides de l'organisme contenant des antigènes. De que l'équidé utilisé est un âne. tels tests directs d'agglutination de particules visent à détermi-

4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ner la présence ou l'absence d'antigènes dans des liquides de l'on choisit l'antigène parmi le groupe constitué par les poly- l'organisme tels que le sérum, l'urine, le liquide céphalorachi-saccharides. dien et similaires pour contribuer au diagnostic de certains

5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé 30 états physiologiques ou pathologiques chez l'homme et en ce qu'on sélectionne des fractions à titre élevé en macroglo- l'animal.

bulines de l'antisérum recueilli avant de les diluer dans le La détection d'antigènes microbiens dans les liquides de système tampon. l'organisme peut être utile pour le diagnostic rapide d'un

6. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le nombre croissant d'infections. Cependant un problème im-polysaccharide est le polyribophosphate constituant le poly- 35 portant est que les techniques actuelles ne sont pas suffisam-saccharide capsulaire d'Haemophilus influenzae type b. ment sensibles (immunodiffusion, immunoélectrophorèse à

7. Réactif liquide obtenu par le procédé selon l'une des re- contre-courant), si bien que l'on ne peut pas mettre en éviden-vendications 1 à 5 s'agglutinant lorsqu'on le met en contact ce la présence d'antigènes chez une proportion importante de avec des liquides contenant des antigènes, caractérisé en ce patients infectés, ou sont trop lentes pour permettre le dia-qu'il comprend un support revêtu d'un antisérum animal, di- 40 gnostic rapide (détermination radio-immunologique, essai rigé contre lesdits antigènes en suspension dans un système avec immunoabsorbant) lié à une enzyme. Dans certains cas, tampon physiologique compatible et d'un sérum animal non le complexe antigène-anticorps se forme lentement et/ou les immun de la même espèce animale que celle utilisée pour pro- particules formées sont trop petites pour être observées de fa-duire l'antisérum. çon certaine. Pour améliorer les possibilités de détection, on a

8. Réactif liquide selon la revendication 7, caractérisé en « utilisé des tests d'agglutination employant des particules ser-ce que l'antigène est un Polysaccharide. vant de supports sur la surface desquelles la molécule d'anti-

9. Réactif liquide selon la revendication 7, caractérisé en gène ou d'anticorps est adsorbée ou fixée.

ce que l'antisérum animal revêtant le support est un antisérum On peut effectuer ces tests d'agglutination selon une tech-

entier d'équidé. nique indirecte dans laquelle on mélange l'échantillon clini-

10. Réactif liquide selon la revendication 7, caractérisé en so que à l'anticorps avec une dilution déterminée et, après une ce que l'antisérum animal revêtant le support est la fraction de période d'incubation appropriée, on ajoute au mélange un macroglobulines d'un antisérum d'équidé. système indicateur constitué d'un complexe fait de l'antigène

11. Utilisation du réactif selon l'une des revendications 7 fixé à un support particulaire. Si l'antigène est présent dans ou 8 comme test direct d'agglutination pour la détection d'an- l'échantillon clinique, l'anticorps n'est pas disponible pour tigènes dans des liquides de l'organisme susceptibles de conte-55 réagir avec le complexe antigène-support et il ne se produit nir de tels antigènes, comprenant en combinaison un échantil- pas d'agglutination, cette absence d'agglutination constituant Ion de liquide de l'organisme choisi parmi le sérum ou le plas- un test positif de l'antigène. Inversement, si l'antigène est ab-ma, avec le réactif liquide et un système tampon contenant un sent de l'échantillon clinique, l'anticorps réagit avec le com-polyanion capable de réduire l'effet des constituants thermo- plexe antigène-support ce qui provoque une agglutination de labiles de l'échantillon. 60 l'échantillon indicateur. La théorie sur laquelle repose ces

12. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce tests d'agglutination est bien connue dans l'art comme illustré que le polyanion est choisi parmi le polyéthanol-sulfonate de par les brevets US n° 3 171 783, n° 3 775 536, n° 3 873 683, n° sodium, le sulfate de dextrane, la carlagénine, l'héparine et si- 3 879 262, n° 4 003 988 et n° 4 045 384.

milaires. On considère depuis longtemps que la seule voie vraiment

13. Utilisation selon la revendication 11, caractérisée en ce 65 significative pour le diagnostic des maladies infectieuses est la que l'agent réducteur est choisi parmi le mercapto-2 éthanol, détection précoce et rapide des antigènes associés à l'agent in-le dithiothréitol, le glutathion, la cystéine et similaires. fectieux pour permettre l'application immédiate d'un traite-

14. Utilisation selon la revendication 11 comme test direct ment efficace.

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Le procédé selon l'invention pour préparer un réactif pour Polysaccharide capsulaire à'Haemophilus influenzae type b, la détection des antigènes est caractérisé en ce qu'il comprend (H.i.b).

les étapes selon lesquelles: La sensibilité limitée est le problème principal des procé-

on injecte une certaine quantité d'antigènes à une espèce dés précédemment décrits de détection des antigènes microanimale et on laisse l'espèce animale produire un antisérum 5 biens. Par conséquent, on ne peut pas détecter un antigène mi-dirigé contre l'antigène; crobien chez tous les patients atteints d'infections confirmées,

on recueille l'antisérum ainsi produit; Par exemple des tests ont montré que chez 7 à 22% de patients on dilue cet antisérum dans un système tampon physiolo- atteints de méningite à H.i.b., 38 % de patients atteints d'épi-gique compatible; glottite à H.i.b., 20 à 39% de patients atteints de pneumonie on mélange la solution d'antisérum ainsi obtenue à une 10 pneumococcique avec bactériémie et 50 à 90% de patients at-suspension de particules; teints de pneumonie pneumococcique sans bactériémie, on ne on incube la suspension; pouvait pas détecter d'antigène dans le sérum ou le liquide cé-

on centrifuge cette suspension et on décante l'antisérum phalorachidien selon les tests connus par immuno-électro-non absorbé; phorèse à contre-courant ou par agglutination de particules.

on remet le culot ainsi obtenu en suspension dans un i5 Cependant une détermination radio-immunologique qui est système tampon physiologique compatible; et capable de détecter 0,5 ng/ml ou moins permet de diagnosti-

on centrifuge à nouveau et on remet le culot en suspension quer pratiquement tous les cas de méningites à H.i.b. dès le dans ledit système tampon contenant un sérum animal non premier examen par un médecin. Les résultats des tests indi-immun de la même espèce que celle ayant servi à la prépara- quent également que la concentration de l'antigène chez 37% tion de l'antisérum. 20 des patients est inférieure à 10 ng/ml et que par conséquent el-

II permet d'effectuer un test d'agglutination très sensible le est inférieure à la sensibilité de la plupart des techniques pour la détection des antigènes, tels que les protéines et les po- d'immuno-électrophorèse à contre-courant dont on dispose, lysaccharides de divers microorganismes y compris les bacté- On obtient ainsi un test d'agglutination des particules ries, les protozoaires et les champignons à de faibles concen- ayant un degré de sensibilité comparable à celui des détermi-trations dans les liquides de l'organisme. Il permet la détec- 25 nations radio-immunologiques. Le degré élevé de sensibilité tion selon une technique simple d'une concentration aussi fai- du test résulte de modifications des tests connus d'agglutina-ble que 0,2 ng/ml des Polysaccharides capsulaires associés aux tion des particules à savoir le choix d'un antisérum anti-H.i.b. bactéries pathogènes. Ceci correspond à une sensibilité 25 à spécifique, l'emploi d'une fraction de globulines de cet antisé-250 fois supérieure à celle des méthodes d'immuno-électro- rum, le lavage des particules sensibilisées et la prolongation de phorèse à contre-courant très utilisées et à une sensibilité au 30 la période d'incubation des tests d'agglutination des particu-moins égale à celle des déterminations radio-immunologi- les de la valeur habituelle de 5 minutes à environ 45 minutes ques. De plus bien que l'immuno-électrophorèse à contre- ou plus.

courant soit rapide, elle nécessite un personnel de laboratoire expérimenté ainsi que des réactifs et un appareillage assez a. Sensibilité.

coûteux et sa sensibilité vis-à-vis de la plupart des polysaccha- 35 Le choix de l'antisérum a un effet important sur la sensibi-rides bactériens est limitée entre 10 et 50 ng/ml. Comme des lité du test. Six antisérums préparés chez trois espèces anima-concentrations plus faibles en antigènes sont fréquentes dans les permettent d'obtenir des particules ayant des sensibilités les liquides de l'organisme, l'immuno-électrophorèse à con- comprises entre 0,2 ng et plus de 1000 ng de PRP/ml. La qua-tre-courant donne souvent des résultats faussement négatifs lité fonctionnelle de l'anticorps spécifique ainsi que sa concen-chez des patients atteints d'une infection bactérienne confïr- 40 tration sont importantes. L'antisérum produisant les particu-mée par culture. D'autre part, la détermination radio-immu- les les plus sensibles n'a pas la concentration maximale en an-nologique est 10 à 100 fois plus sensible que l'immuno-élec- ticorps mesurée par radio-détermination de la fixation d'an-trophorèse à contre-courant mais elle est bien plus lente et tigène.

coûteuse. On prépare six antisérums dirigés contre Haemophilus in-

45 fluenzae type b total chez quatre lapins, un âne et un cheval Jusqu'à présent, la généralisation de l'emploi des tests selon les programmes d'immunisation décrits par H.E. Aie-d'agglutination des particules, bien qu'ils soient extrêmement xander et coll. dans Journal of Immunology 54:207-211, simples et peu coûteux, était limitée par le faible degré de sen- 1946.

sibilité à de faibles concentrations de l'antigène et à la mau- On entend par «particules» des particules inertes et neu-

vaise spécificité se traduisant par des agglutinations non spé- 50 très vis-à-vis des autres composants et capables d'adsorber les cifiques en particulier avec les échantillons de sérum. Lors- antisérums de façon irréversible, Ces particules peuvent être qu'on opère selon la technologie de l'invention décrite ci- des perles de verre ou des particules de polybutadiène, de après, on atteint une sensibilité de l'ordre de 0,2 ng/ml et la polystyrène, de polybutadiènestyrène, etc. ayant une taille fréquence des agglutinations non spécifiques avec les sérums moyenne d'environ 0,15 à environ 0,9 |xm. De préférence on humains est réduite à 2% ou moins. De plus, le choix judi- 55 sensibilise des particules de latex de polystyrène ayant un dia-cieux et la préparation de l'antisérum permettent d'effectuer mètre uniforme d'environ 0,81 ^im sous forme d'une suspen-un test caractérisé par une sensibilité uniforme, une bonne sion à 10% p/v dans de l'eau distillée avec les antisérums préstabilité et une bonne spécificité. cités de la façon suivante:

Le procédé selon l'invention permet de réaliser un test On dilue les antisérums entiers d'âne et de lapins à 1/500 et d'agglutination sensible des particules pour la détection d'an- 60 on dilue l'antisérum entier de cheval au 1/200 dans du tampon tigènes microbiens dans les liquides de l'organisme à des con- salé standard à la glycine (0,1 M en glycine, 0,9% de chlorure centrations aussi faibles que 0,2 ng/ml de liquide de l'or- de sodium, pH 8,2). Pour adsorber les anticorps sur les parti-

ganisme. cules de latex, on ajoute 1 partie de suspension de latex à 10%

Il a pour but de fournir un test d'agglutination des parti- à 80 parties d'antisérum dilué et on incube à la température cules présentant une fréquence d'agglutination on spécifique 65 ordinaire pendant une heure. On décante les antisérums libres avec les sérums humains de 2% ou moins; elle vise en particu- après centrifugation pendant 10 minutes à 12 000 x g. On lier une détermination améliorée par agglutination de particu- met le culot de latex en suspension dans du tampon salé à la les pour la détection rapide du polyribophosphate (PRP) du glycine avec une petite quantité de protéine, telle que 0,1% de

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sérum-albumine humaine ou 0,1 % de sérum d'âne, de lapin ou de cheval selon le cas, pour obtenir une suspension à 0,125% de latex, on centrifuge à nouveau et on remet en suspension dans du tampon salé à la glycine. On utilise du sérum foetal de veau, ne contenant pas d'anticorps anti-PRP, par détermination radio-immunologique, comme diluant pour les solutions standards d'antigène PRP.

Pour effectuer l'agglutination, on ajoute des portions de 0,05 ml de liquide contenant l'antigène à des fractions de 0,01 ml de solution de latex sensibilisé pour une lame pour examen sérologique comportant des anneaux en céramique. On fait tourner la lame (180 tr/min) dans une chambre humidifiée à la température ordinaire et on examine l'agglutination après 45 minutes. On note l'agglutination 4+ lorsque le mélange d'agglutination est limpide et qu'on observe des amas grossiers de particules de latex, 3 + lorsque le mélange demeure trouble mais qu'on observe des amas grossiers, 2+ lorsque le mélange demeure trouble et granuleux et 1+ lorsque le mélange demeure trouble mais n'est que très peu granuleux. On sonsidère qu'une agglutination égale ou supérieure à 2+ est positive. Les sensibilités comparées figurent dans le tableau 1.

Tableau 1

Sensibilité de la détermination par agglutination de particules de latex avec six antisérums anti-Haemophilus influenza type b.

Sérum -Anticorps anti- Anticorps anti- Sensibilité des

15

25

PRP du sérum total1

(|xg de protéines d'anticorps/ml)

PRP fixés aux particules de latex1 (|ig de protéines d'anticorps/ml de particules de latex)

particules de latex anti-PRP2 so (ng de PRP/ml)

Ane

11200

3,40

0,2

Lapin 1

96 000

7,84

1,0

Lapin 2

68 000

7,20

1,0

Lapin 3

45 000

6,56

5,0

Lapin 4

10 300

1,95

10,0

Cheval

3 100

1,84

1000

35

40

1 mesurés par détermination radio-immunologique par fi- 45 xation d'antigène.

2 concentration minimale en PRP-5 dans le sérum foetal de veau provoquant une agglutination égale ou supérieure à 2+.

Le tableau 1 montre nettement l'importance de la qualité de l'antisérum utilisé pour sensibiliser les particules de latex sur la sensibilité du test d'agglutination des particules de latex pour la détection de l'antigène PRP. Les résultats du tableau 1-montrent nettement que l'on ne peut pas prévoir la sensibili50

té uniquement à partir de la concentration en PRP de l'antisérum mesurée par radio-détermination par fixation d'antigène. Un antisérum d'âne, ne contenant que 12% des anticorps du meilleur antisérum de lapin, permet d'obtenir des particules de latex cinq fois plus sensibles. Cette différence de sensibilité ne peut s'expliquer par un revêtement plus efficace des particules de latex par les anticorps d'âne car il y a 2,3 fois plus d'anticorps absorbés sur les particules de latex revêtues d'antisérum de lapin. Les activités d'agglutination des antisérums d'âne et de lapin vis-â-vis des hématies de mouton revêtues de PRP sont égales bien que l'antisérum de lapin ait une activité bien supérieure de fixation du PRP.

La mesure des vitesses d'association montre que les anticorps d'âne se combinent bien plus rapidement avec l'antigène PRP que ne le font les anticorps de lapin. La période de demi-association est de 20 minutes pour les anticorps d'âne et de plus de 60 minutes pour les anticorps de lapin. La raison de cette différence des vitesses d'association est inconnue.

La vitesse de dissociation des complexes antigène-anti-corps en présence d'un excès d'antigène, mesure la robustesse de la fixation ou l'affinité de l'anticorps. L'anticorps de lapin se dissocie plus lentement du polyribosephosphate que ne le fait l'anticorps d'âne et par conséquent a une plus grande affinité pour l'antigène. Ce résultat vient à l'appui de l'hypothèse selon laquelle la vitesse de combinaison de l'antigène et de l'anticorps est plus importante dans les processus d'agglutination que la robustesse de l'interaction antigène-anticorps.

b. Emploi d'une fraction de macroglobulines pour revêtir des particules de latex.

La Chromatographie sur tamis moléculaire de différents antisérums dirigés contre des Polysaccharides bactériens montre que la majorité des anticorps anti-polysaccharide des équi-dés (âne, cheval) est présente dans la classe des macroglobulines qui est éluée dans le volume vide de cette colonne. Au contraire, la majorité des anticorps de lapin est présente dans la classe des IgG qui est éluée ultérieurement. Comme indiqué dans le tableau 2, l'emploi de la fraction de macroglobulines de l'antisérum d'âne ou de cheval, à une concentration de 50 \ig de protéine/ml pour sensibiliser les particules de latex, améliore considérablement la sensibilité des antisérums d'é-quidés relativement faibles. Cette modification n'apporte pas d'amélioration complémentaire des meilleurs antisérums bien que la netteté de la réaction d'agglutination soit généralement meilleure avec la fraction correspondant au volume vide. L'emploi de la fraction d'IgG des sérums de lapin ne provoque pas d'améliorations comparables de la sensibilité ou de la netteté de l'agglutination.

Tableau 2

Comparaison des sensibilités des particules de latex revêtues de sérum entier ou de la fraction de macroglobulines d'antisérums d'équidés vis-à-vis de Polysaccharides bactériens.

55

Animal

Antisérum dirigé

contre:

Sensibilité * des particules de latex revêtues de sérum entier (dilution au 1/500)

Sensibilité des particules de latex revêtues de la fraction de macroglobulines (50 jig de protéines/ml)

Ane-F Ane-132

H. influenzae typeb

H. influenzae typeb

1 ng/ml 0,2 ng/ml

0,2 ng/ml 0,2 ng/ml

5

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Animal

Antisérum

Sensibilité * des

Sensibilité des

dirigé

particules de particules de

contre:

latex revêtues de latex revêtues

sérum entier de la fraction de

(dilution au 1/500)

macroglobulines

(50 ng de

protéines/ml)

Ane-W.J.

H. influenzae

2 ng/ml

0,5ng/ml

typeb

Ane-Y

Neisseria menin-

1 ng/ml

0,2 ng/ml

gitidis-groupe Y

Cheval-49

N. meningitidis

0,5 ng/ml

0,2 ng/ml

groupe A

Cheval-46

N. meningitidis

> 10 000 ng/ml

2 ng/ml groupe B

* la concentration la plus faible d'antigène provoquant une agglutination égale ou supérieure à 2+ est indiquée.

c. Lavage des particules de latex revêtues tampon salé à la glycine contenant 1/1000 parties de sérum

Pour améliorer encore la sensibilité des antisérums d'âne, foetal de veau; les résultats figurent dans le tableau 3. on compare des particules de latex revêtues d'anticorps avec diverses dilutions d'antisérum d'âne dans du tampon salé à la 25 Tableau 3

glycine, non lavées ou après un, deux et trois lavages avec du Effet de la dilution de l'antisérum et du lavage des particu les de latex sur la sensibilité du test d'agglutination des particules de latex par le polyribosephosphate.

Dilution de l'antisérum d'âne utilisé pour sensibiliser les particules de latex

Concentration minimale de PRP détectée * (ng/ml)

non lavées lavées 1 fois lavées 2 fois lavées 3 fois

1/10 200 >

1/100 50

1/500 2

1/1000 0,5

1/2000 0,2

1/5000 >1000 >

1000 > 1000 > 1000

0,5 0,5 0,5

0,2 0,2 0,2

0,2 0,2 0,2

0,2 0,2 0,5

1000 > 1000 > 1000

*un résultat positif correspond à une agglutination égale ou supérieure à

2+.

Comme le montrent les résultats du tableau 3, les faibles dilutions d'antisérum sont insensibles. Avec des dilutions de 1/500 et plus, on obtient la sensibilité maximale lorsque les particules de latex sont lavées. On obtient la sensibilité maximale avec les particules de latex non lavées uniquement dans une gamme étroite de dilutions. Deux lavages permettent d'obtenir la sensibilité maximale tandis que trois lavages peuvent réduire la sensibilité.

On conserve à 4 °C les particules de latex sensibilisées de l'expérience de lavage et on les soumet à de nouveaux essais après 12 et 24 mois. Les particules de latex sensibilisées avec une dilution au 1/500 et au 1/1000 d'antisérum d'âne et lavées deux fois conservent leur sensibilité d'origine tandis que les particules de latex non lavées sont deux à quatre fois moins sensibles après 24 mois.

d. Durée de la période d'incubation

La figure unique annexée illustre la relation entre la sensibilité de la détermination (mg de PRP/ml) en ordonnées et la durée d'incubation (minutes) en abscisses. Les courbes indiquent la concentration minimale de PRP-5 détectée par agglutination des particules de latex après diverses périodes d'incubation. On considère qu'un résultat positif correspond 50 à une agglutination égale ou supérieure à 2+. La courbe A-A correspond aux particules de latex revêtues de l'antisérum de lapin n° 144 et la courbe 0-0 correspond aux particules de latex revêtues d'antisérum d'âne n° 132. Des concentrations importantes en antigène agglutinent les particules de latex en 5 55 minutes. La sensibilité s'accroît rapidement pendant les 45 à 60 premières minutes puis lentement pour atteindre un maximum de 0,05 ng/ml avec les préparations les plus sensibles après 10 heures. Le sérum d'équidé de l'invention est plus sensible que le sérum de lapin pour toutes les périodes d'incuba-60 tion. Pour effectuer l'étude comparative, on mélange sur une lame pour sérologie, 50 |il de solution d'échantillon et 10 ni de particules de latex revêtues, comme décrit ci-après et on fait tourner à 180 tr/min à la température ordinaire. On recouvre les lames et on maintient l'humidité avec des éponges saturées 65 d'eau chaude. On observe les lames aux temps indiqués.

Lorsqu'on accroît la période d'incubation de 5 minutes à 45 minutes ou plus, la sensibilité s'accroît de 10 à 20 fois. Pour l'emploi clinique, on choisit une période d'incubation de 45

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6

minutes avec normalement des lectures à des intervalles de 5 à un agent réducteur directement au mélange d'incubation et/

15 minutes lorsqu'on utilise des particules de latex revêtues ou (3) on inactive les sérums par la chaleur.

d'un antisérum d'équidé. Ces particules de latex ont une sensi- On détermine la fréquence de l'agglutination non spécifi-

bilité de 0,2 ng d'antigène/ml de liquide. que avec des sérums d'enfants et d'adultes hospitalisés qui, ne

On prévoyait que l'accroissement de la sensibilité des dé- s sont pas atteints de maladie à H.i.b.. On teste tous ces sérums terminations par agglutination de particules augmenterait la avec des particules de latex sensibilisées avec de l'anti-sérum fréquence des agglutinations non spécifiques, et en fait dans le d'âne (particules de latex anti-PRP) et avec des particules de cas des échantillons de sérum, 69% des sérums d'enfants hos- latex sensibilisées avec du sérum d'âne non immun (particules pitalisés agglutinaient les particules de latex. Cet inconvénient de latex témoins).

majeur limitait la généralisation de ces déterminations. Les io Dans des expériences préliminaires, on teste des sérums facteurs que l'on a impliqués dans l'agglutination des particu- contenant des agglutinines thermostables par addition de 10

les de latex revêtues de y-globulines sont des composants ther- |xl d'un agent réducteur, tel que le dithio-1,4 thréitol (DTT)

molabiles du sérum (vraisemblablement le complément) et ou le mercapto-2 éthanol (ME), ajouté au mélange d'incuba-

des antiglobulines thermostables, dont de faibles teneurs sont tion au début de l'incubation. Les concentrations optimales souvent présentes dans les sérums humains en particulier chez ts sont de 0,018 M pour le DTT et de 0,25 M pour le ME (les les patients atteints d'affections inflammatoires chroniques. concentrations finales dans le mélange d'incubation sont de

L'agglutination non spécifique était établie par l'aggluti- 0,0026 M pour le DTT et de 0,05 M pour le ME).

nation de particules de latex témoins sensibilisées par un sé- Le tableau 4 suivant regroupe les résultats obtenus avec rum animal non immun. Lorsqu'on utilisait des particules de 104 sérums d'enfants conservés au moins 24 heures à 4 °C

latex revêtues de macroglobulines, on revêtait les particules de 20 avant l'essai.

latex témoins de la fraction de macroglobulines du sérum non immun.

Pour réduire la fréquence de l'agglutination non spécifi- Tableau 4 que avec les sérums humains à 2% ou plus, (1) on ajoute le sé- Fréquence de l'agglutination non spécifique avec des sérum animal non immun aux particules de latex sensibilisées, 25 rums conservés1 d'enfants hospitalisés n'étant pas atteints de (2) on ajoute un tampon sérum contenant un polyanion et/ou maladie à Haemophilus influenzae type b.

Agglutination avec

les particules de

latex anti-PRP

négative positive négative positive

Agglutination avec

les particules de

latex témoin négative positive positive négative

Sérum non traité

(N = 104)

32(31%)

65 (63%)

3 (3%)

4(4%)

Sérum inactivé par

chauffage (n= 104)

49(47%)

47(45%)

1(1%)

7(7%)

Addition de sérum

normal d'âne (2,5%)

aux particules de

latex (n= 104)

72(69%)

23 (22%)

7(7%)

2(2%)

Inactivation du

sérum par chauffage

et addition de

sérum normal d'âne

(2,5%) aux parti

cules de latex (n=104)

75 (72%)

23 (22%)

• 5 (5%)

1 (1%)

Addition de sérum

normal d'âne (2,5%)

aux particules de

latex et addition

de DTT 2 au sérum

(n=53)3

52(98%)

1 ( 2%)

0

0

1 conservés au moins 24 heures à 4 °C avant l'essai.

2 dithiothréitol, concentration finale de 0,0026 M dans le mélange d'incubation

3 seuls 53 échantillons sur 104 contiennent suffisamment de sérum pour effectuer cet essai.

Avec les particules de latex anti-PRP, 69 % des sérums des réactions non spécifiques à 2%. Les résultats obtenus avec provoquent des agglutinations non spécifique mais toutes les 52 sérums conservés d'adultes sont semblables. Seul un sé-

(sauf 4%) sont identifiées avec les particules de latex témoin. rum produit une agglutination non spécifique (positive avec

L'inactivation par la chaleur (60 °C pendant 15 minutes) les particules de latex anti-PRP et les particules de latex té-ne réduit que faiblement à 53% l'agglutination non spécifique moins) lorsqu'on ajoute 2,5% de sérum normal d'âne aux et l'addition de sérum d'âne non immun aux particules de la- 65 particules de latex et du DTT au mélange d'incubation,

tex anti-PRP et aux particules de latex témoins réduit l'agglu- Pour déterminer si les sérums frais produisent des aggluti-

tination non spécifique à 31 % ; l'addition de 10 (j.1 d'un agent nations non spécifiques fréquentes, on recueille 100 sérums réducteur, par exemple le dithiothréitol réduit la fréquence d'adultes que l'on place immédiatement sur de la glace et

7

646 524

qu'on teste le jour même. On teste chaque sérum avec et sans moins contenant chacune 2,5% de sérum normal d'âne et agent réducteur (ME) et avec et sans inactivation par la cha- dans les deux cas on observe des résultats correspondants, leur (60 °C pendant 5 minutes). On teste l'agglutination avec Les schémas d'agglutinations figurent dans le tableau 5

des particules de latex anti-PRP et des particules de latex té-

5

Tableau 5

Agglutination non spécifique avec des sérums frais de 100 adultes sans affection par Haemophilus influenzae type b1.

Schéma

Pas d'inactiva-

Inactivation

Nombre

Interpré

tion par

par

de tation

chauffage

chauffage

sérums

sans ME

ME2

sans ME

ME2

1.

(-)

(-)

(-)

(-)

43

pas d'antiglobuline - pas de com

plément

2.

(+)

(-)

(+)

(-)

28

antiglobulines seulement

3.

( + )

(+)

(-)

(-)

4

complément seulement

4.

(-)

(+)

(-)

(-)

14

complément seulement «réactivé»

par le ME7

5.

(+)

(+)

(+)

(-)

10

antiglobulines et complément

6.

(-)

(-)

(-)

(+)

1

N° de sérum produisant 42

38

38

1

l'agglutination non-spé-cifique

1 On effectue toutes les déterminations avec des particules de latex anti-PRP et des particules de latex témoins contenant 2,5% de sérum normal d'âne. Il existe une correspondance complète des résultats pour les particules de latex anti-PRP et les particules de latex témoins.

2 mercapto-2 éthanol, à la concentration finale de 0,05 M dans le mélange d'incubation.

On observe une agglutination non spécifique avec 42% des sérums non traités (ni chauffage ni agent réducteur). Lors- 35 qu'on ajoute un agent réducteur (ME) 28 sérums deviennent négatifs (schéma 2) ce qui indique la présence d'antiglobuline. Quatorze sérums qui étaient au départ négatifs deviennent positifs (schéma 4) ce qui indique qu'une agglutinine thermo-labile a été réactivée par le mercaptoéthanol. L'effet global du io ME seul est de réduire l'agglutination non spécifique à 38%. On obtient une fréquence semblable d'agglutinations non spécifiques avec l'inactivitation par la chaleur seule. Cependant la combinaison de l'inactivation des sérums par la chaleur et de l'addition d'un agent réducteur au mélange d'incubation, 45 réduit la fréquence de l'agglutination non spécifique à une valeur de 2% ou moins.

Comme l'inactivation par la chaleur est longue, on a mis au point un autre procédé pour éliminer l'agglutination non spécifique provoquée par les facteurs thermolabiles du sérum. 50 Divers polyanions y compris le polyéthanolsulfonate de sodium (SPS), le sulfate de dextrane, la carraghénine et l'héparine empêchent l'agglutination non spécifique par les facteurs thermolabiles du sérum des particules de latex revêtues de globuline. 55

On teste 100 sérums frais d'adultes avec un tampon sérum contenant à la fois du ME (comme ci-dessus) et du SPS à la concentration de 0,05%. Seul un des 100 sérums produit une agglutination non spécifique avec les particules de latex anti-PRP et les particules de latex témoins. Le chauffage supprime 60 l'agglutination non spécifique par ce sérum.

Il est souhaitable d'ajouter un tampon sérum contenant un agent réducteur et un polyanion au mélange d'incubation constitué de particules de latex sensibilisées stabilisées et d'un échantillon de sérum. 65

On prépare ce tampon sérum de la façon suivante:

On dilue du mercapto-2 éthanol 14 M (solution standard concentrée) au 1 /40 dans du tampon salé à la glycine (GBS)

(0,1 M en glycine, 0,9% de chlorure de sodium, pH 8,2). Dans le même GBS, on dilue au 1 /00 une solution aqueuse à 5% de polyéthanolsulfonate de sodium.

Le tampon sérum peut contenir d'autres agents réducteurs tels que le dithiothréitol, le glutathion, la cystéine et similaires au lieu du mercapto-2 éthanol. De plus on peut utiliser d'autres polyanions tels que le sulfate de dextrane, l'héparine, la carragéénine et similaires sous réserve qu'ils ne gênent pas la réaction antigène-anticorps.

Le tableau 6 suivant montre les concentrations optimales des composants du tampon sérum. Des concentrations plus élevées en agents réducteurs ou en polyanions réduisent la sensibilité de la détermination et des concentrations plus faibles ne suppriment pas l'agglutination non spécifique de tous les sérums.

Tableau 6

Concentrations optimales des composants du tampon sérum.

DTT 2-ME SPS Concentration finale dans le mélange de détermination

Diminution de la sensibilité 12,8 mM 400 mM 0,07%

Bonne sensibilité et élimination de l'agglutination non spécifique 2,6 mM 50 mM 0,007%

L'agglutination non spécifique n'est pas

éliminée 0,65 mM 10 mM 0,0007%

On examine à nouveau la concentration efficace du sérum animal non immun dans la suspension de latex, dans le systè

646524

8

me de détermination utilisant le tampon sérum précédemment décrit.

Des concentrations en sérum animal non immun inférieures à 0,25% dans la suspension de particules (moins de 0,035% dans le mélange final de détermination) provoquent une agglutination non spécifique occasionnelle malgré l'emploi du tampon sérum.

Des concentrations en sérum animal non immun atteignant environ 25% dans la suspension de latex (3,5% dans le mélange final de détermination) sont efficaces pour réduire la fréquence de l'agglutination non spécifique, cependant la concentration maximale, c'est-à-dire 25%, réduit de 2 fois la sensibilité de la détermination dupolyribophosphate.

Agglutination non spécifique dans d'autres liquides de l'organisme.

La plupart des échantillons d'urine produisent une agglutination non spécifique avec les particules de latex anti-PRP et les particules de latex témoins. On peut éliminer cette agglutination soit par chauffage (100 °C pendant 5 minutes) soit par filtration de l'urine. Dans le mode de réalisation préféré on utilise un filtre de 0,45 (xm.

Il est très rare que les échantillons de liquide céphalorachidien produisent une agglutination non spécifique, et on l'élimine par chauffage (100 °C pendant 5 minutes). L'antigène PRP demeure stable dans ces opérations de chauffage et de filtration.

L'exemple non limitatif suivant illustre le mode de réalisation préféré de l'invention.

10

15

20

30

Exemple a. Revêtement des particules de latex.

Pour préparer les particules de latex anti-PRP, on dilue au 1/500 dans du GBS de l'antisérum entier d'âne dirigé contre 35 H. influenzae type b et on chauffe à 56 °C pendant 30 minutes. On ajoute 1 partie de suspension de latex (suspension à 10% de particules de 0,81 nm de diamètre dans l'eau distillée) à 80 parties d'antisérum dilué pour obtenir une concentration finale des particules de latex de 0,125%. On incube ce mélange pendant une heure à la température ordinaire, on centrifuge à 12 000 x g pendant 10 minutes puis on rejette le surnageant. On remet le culot en suspension dans un volume égal de GBS contenant 0,1 % de sérum non immun d'âne, on centrifuge comme ci-dessus puis on remet en suspension dans un volume égal de GBS contenant 2,5% de sérum non immun d'âne. On prépare les particules de latex témoins comme ci-dessus si ce n'est qu'on utilise du sérum non immun d'âne dilué au 1 /500 dans le GBS pour le revêtement initial des particules de latex. Le sérum non immun d'âne que l'on utilise doit être le sérum prélevé avant l'immunisation à l'animal que l'on immunise.

Lorsqu'on utilise la fraction de macroglobulines, on Chromatographie les sérums entiers d'âne prélevés avant l'immunisation et après l'immunisation sur une colonne filtrante garnie de gel Sephacryl G-200 et on regroupe les fractions éluées dans le volume vide de la colonne. On dilue l'ensemble à une concentration en protéines de 50 ng/ml dans du GBS et on utilise la dilution au lieu du sérum entier dilué dans le procédé précédemment décrit.

b. Préparation du tampon sérum.

On dilue au 1/40 dans du GBS, du mercapto-2 éthanol 14 M (solution concentrée standard). On ajoute du polyéthanolsulfonate de sodium à la concentration finale de 0,05%.

c. Mode de détermination.

On effectue la détermination selon l'invention de la façon suivante.

On introduit 50 ni de sérum témoin positif, de sérum témoin négatif et d'échantillon de sérum de liquide céphalorachidien et d'urine dans les deux rangées de cupules d'une lame propre et sèche pour sérologie selon le diagramme ci-après. Le sérum témoin positif contient 2 ng d'antigène PRP/ml. Le sérum témoin négatif contient des antiglobulines qui agglutinent à la fois les particules de latex anti-PRP et les particules de latex témoins en l'absence d'addition de tampon sérum, ce qui permet de contrôler l'activité du tampon sérum. On filtre au préalable les échantillons d'urine avec un filtre de 0,45 nm.

Rangée A : particules de latex anti-PRP

Rangée B : particules de latex témoins

Sérum témoin positif

Sérum témoin négatif

Sérum étudié

Liquide céphalo-rachidien étudié

Urine étudiée g)

©

©

o

O

g)

®

©

o o

55

TS : addition de tampon sérum

On ajoute 10 p.1 de tampon sérum aux godets contenant du sérum témoin positif, du sérum témoin négatif ou un échantillon de sérum.

On mélange doucement les suspensions de latex sans former de mousse et on ajoute 10 ni de particules de latex anti-PRP à une des rangées (rangée A) et on mélange intimement les réactifs.

On ajoute 10 ni de particules de latex témoin aux godets de la seconde rangée et on agite intimement les réactifs.

On place la lame sur un agitateur pour sérologie et on la fait tourner pendant environ 45 minutes. On doit humidifier la chambre avec des éponges trempées dans l'eau chaude pour

60

65

qu'une condensation soit visible pendant toute la détermination. On retire les lames de la chambre, on essuie la condensation et on lit l'agglutination en basculant lentement les lames en lumière oblique sur un fond sombre. On note les résultats de la façon suivante:

4+ gros amas-fond limpide 3+ gros amas-fond laiteux 2+ petits amas 1+ grains fins 0 laiteux

On doit facilement différencier les réactions 3 + et 4 + des témoins lorsqu'on observe la lame à bout de bras. Les réactions 2+ nécessitent un examen plus rapproché.

646524

Interprétation des résultats.

Particules de latex Particules de Interprétation anti-hoemophilus latex témoins

(+) (-) (+)

(-)

Positif pour l'antigène

H. influenzae type b.

(-)

Négatif pour l'antigène

H. influenzae type b.

(+)

Agglutination on spécifique

l'antigène H. influenzae type b,

peut être présent ou absent.

Une agglutination positive à 2+ doit être considérée comme «faiblement positive».

Bien que dans la présente description les durées et les températures utilisées pour le traitement par la chaleur et l'incubation soient optimales, on peut obtenir des résultats identiques avec des températures plus élevées pour des durées plus brèves ou inversement des températures plus basses pour des durées plus importantes. De plus dans la description précédente, on utilise des réactifs, des milieux et des techniques pour établir l'utilité de l'invention. Il est cependant évident pour l'homme de l'art que l'on peut effectuer des modifica-20 tions des techniques, des durées, des volumes et des natures des matières, des milieux et des appareils sans sortir du cadre de l'invention.

C