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DE2546166A1 - Gegerbte thrombozyten - Google Patents

Gegerbte thrombozyten

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Publication number
DE2546166A1
DE2546166A1 DE19752546166 DE2546166A DE2546166A1 DE 2546166 A1 DE2546166 A1 DE 2546166A1 DE 19752546166 DE19752546166 DE 19752546166 DE 2546166 A DE2546166 A DE 2546166A DE 2546166 A1 DE2546166 A1 DE 2546166A1
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DE
Germany
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platelets
tanned
platelet
final concentration
treatment
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Withdrawn
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DE19752546166
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Roloff Dr Johannsen
Hermann Dr Karges
Hans-Harald Dr Sedlacek
Fritz Dipl Chem Dr Seiler
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Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Original Assignee
Behringwerke AG
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Publication date
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    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/554—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being a biological cell or cell fragment, e.g. bacteria, yeast cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
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Description

BEHRINGWERKE AKTIENGESELLSCHAFT, Marburg(Lahn)
-3
Aktenzeichens 75/B 008
Datum: 14. Oktober 1975
Gegerbte Thrombozyten
Die Erfindung betrifft gegerbte Thrcmbozyten. ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ein diese enthaltendes diagnostisches Mittel zum Nachweis von Thrombozyten-AntikÖrpern.
Thrombozyten sind 1-3 Aim grosse ovale Blutzellen mit einem eigenen Stoffwechsel und schwach basophilem Pi'otoplasma, Synonyma für Thrombozyten sind Blutplättchen und Gerinnselzellen. Zu ihren physiologischen Bedexitungen gehört ihre Wirksamkeit bei der Einleitung der Blutgerinnung.
Auf der Oberfläche der Thrombozyten befinden sich Antigene, die zur Ausbildung von gegen diese Antigene gerichteten Antikörpern führen können. Die Thrombozytenantigene haben demnach diagnostische Bedeutung. Zum Nachweis von Antikörpern gegen Thrombozytenantigene bediente man sich bisher eines aus Blut frisch gewonnenen Thrombozytenpräparates.
Ziel, der Erfindung ist es, Thrornbo/yteri über einen längeren Zeitraum zu stabilisieren, ohne dass die auf der Thrombozyten-Oberflache befindlichen Antigene in ihren immunologischen Eigenschaften wesentlich verändert werden.
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- if- Ma 23O
Dies wird gemäss der Erfindung dadurch erreicht, dass Thrombozyten mit einem Gerbstoff behandelt -werden.
Gebenstand der Erfindung sind zunächst- die "■ererbten Thrcnbo·· zyten, ferner ein Verfahren zu deren Herstellung. Gegenstand der Erfindung sind ferner Mittel zum Nachweis von Thrornbozyten-Antikörpern oder Thrombozyten-Antigenen, die die er— findungsgemässen Thrombozyten enthalten.
Gerbstoffe im Sinne der vorliegenden Erfindung sind Stoffe, die geeignet sind und in der Praxis dafür verwendet werden die Überführung von tierischen Häuten in Leder zu bewirken. Man unterscheidet organische Gerbstoffe, die pflanzlichen oder synthetischen Ursprungs sein können und mineralische Gerbstoffe. Die bekanntesten organischen Gerbstoffe pflanzlichen Ursprungs leiten sich von der Gallussäure ab. Als solche sind beispielsweise das türkische und das chinesische Tannin zu nennen. Die synthetischen organischen Gerbstoffe sind meist Derivate von ein- oder mehrwertigen Phenolen. Andere organische Gerbstoffe sind Aldehyde und ungesättigte . Fettsäuren. Von den anorganischen Gerbstoffen sind die wasserlöslichen 2- und 3-wertigen Chromsalze, insbesondere das Chrom(III)-Chlorid zu nennen.
Bei dem Verfahren zur Herstellung der gegerbten Thrombozyten ist mit besonders gutem Erfolg die 5-Sulfosalizylsäure oder der Glutardialdehyd einzusetzen.
Die Konzentration der zu verwendenden Gerbstofflösung liegt zweckmässig zwischen 0,002 und 5°i (g/v).
In dem Verfahren ist jede Throrabozyten-Präparation verwendbar. in- der Thrombozyten im Vergleich zu anderen partikulären Blutbestandteilen angereichert sind. Hierzu gehört beispielsweise der bei der Zentrifugation von Blut in bekannter ¥eise
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Ma
zu gewinnende thrombozytenreiche Plasma-Überstand. Zweckmassig wird dieser vor Umsetzung mit dem Gerbstoff durch wiederholte Zentrifugation und Resuspension in einer isotonischen, ggf. einen Metall-Chelatbildner wie beispielsweise Äthylendianiintetraessigsäure enthaltenden Lösung , gewaschen.
Die Umsetzung der Thrombozyten mit Gerbstoff erfolgt in einem isotonischen wässrigen Milieu, das ein Schutzkolloid enthält.
Geeignete Schutzkolloide sind die für wässrige Systeme als besonders wirksam bekannten lyophilen Kolloide, beispielsweise diejenigen, die bei der Emulsionspolymerisation verwendet werden wie Polyvinylalkohol und Polyacrylderivate) sowie Polyvinylpyrrolidon, das sich im Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders bewährt hat.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die mit einem Gerbstoff modifizierten Thrombozyten wie folgt hergestellt:
Zunächst wird Blut auf bekannte ¥eise durch einen geeigneten
mittels
Zusatz, z.B./einer · mit Calcium einen Komplex bildenden Substanz oder eines Chelatbildners wie Äthylendianiintetraessigsäure oder einer anderen gerinnungshemmenden Substanz wie Heparin, ungerinnbar gemacht. Aus diesem Blut wird sodann durch Sedimentation oder durch Zentrifugation bis-zu etwa 3OO x S der thrombozytenreiche Plasma-Überstand gewonnen. Die Thrombozyten werden durch Zentrifugation bei 100 χ g bis 3OO χ g im Zentrifugensediment angereichert, wonach
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Ma 230
- if - '
die Thrombozyten in einer isotonischen physiologisch verträglichen wässrigen Salzlösung, beispielsweise einer Q,9/£igen Koch.sa.lzlQstm°" die crnrfv. Q. OQOI M bis O.OOO5M eines Metall— chelatbildners wie Athylendiamintetraessigsäure enthalten kann, resuspendiert und zentrifugiert. Für die Umsetzung werden
5 Q die Thrombozyten in einer Konzentration von 10 bis 10', vorzugsweise 3 x 10 pro ml eingesetzt. Die Zählung der Thrombozyten erfolgt mit Hilfe einer Zählkammer, z.B. der nach Thoma. Als Suspensionsmittel dient eine wässrige Pufferlösung vom pH-¥ert 6-8, die 0,01 bis 55° eines lyophilen Kolloids, vorzugsweise Polyvinylpyrrolidon und ggf. einen Chelatbildner im oben bezeichneten Konzentrationsbereich enthält.
Die Suspension wird mit SuIfosalizylsäure bis zu einer Endkonzentration von 0,002 bis h°/o, vorzugsweise 1$, bei 0-37 > vorzugsweise 18-22 , versetzt und mindestens 15 Minuten vorzugsweise .etwa 1 Stunde unter diesen Bedingungen belassen. Danach werden die Thrombozyten durch Zentrifugation bei 100 χ g bis 300 χ g gewonnen, mit einer neutralen Pufferlösung resuspendiert» abermals zentrifugiert und schliesslich in einer wässrigen vorzugsweise Polyvinylpyrrolidon enthaltenden Lösung resuspendiert. In dieser Lösung können die gegerbten Thrombozyten gefriergetrocknet werden. Das gefriergetrocknete Produkt ist homogen in Wasser resuspendierbar.
Gemääs einem weiteren bevorzugt durchzuführenden Verfahren werden die Thrombozyten mit Glutardialdehyd in einer Endkonzentration von 0,001 bis hfo, vorzugsweise 0,5 $>t unter sonst gleichen Bedingungen wie für die SuIf ο salizylsäure beschrieben behandelt. Auch diese Präparation lässt sich mit einer ein Schutzkolloid wie Polyvinylpyrrolidon enthaltenden Lösung resuspendieren und, falls dies gewünscht wird, gefriertrocknen.
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Ma
Die gegerbten Thrombozyten sind kugelrund, lichtmikroskopisch von homogener Struktur und formstabil. Sie zeigen keine mit blossom Auge oder lichtTnikroskopiech erkennbare, soontane oder durch unspezifische Antikörper ausgelöste Aggregation.
Die in Schutzkolloid enthaltenden Lösungen suspendierten gegerbten Thrombozyten sind bei Kühlschranktemperatur (ca. h ) über mehrere Monate ohne Veränderung ihrer Eigenschaft .haltbar. Die noch wesentlich langer lagerfähigen gefriergetrockneten Präparationen zeigen nach Resuspension die gleichen Eigenschaften, die sie vor der Trocknung hatten.
Die erfindungsgemäss hergestellten P-rodukte sind wertvolle Mittel zum Nachweis von ThromTxeyten-Antikörpern in Serum oder Serumpräparationen. Es können dabei beispielsweise folgende Testprinzipien eingesetzt werden:
Thrombozyten mit darauf befindlichen bekannten Antigenen werden mit Flüssigkeiten, die Antikörper gegen diese bekannten Antigene enthalten, in Kontakt gebracht. Die sich bildenden Immunkomplexe werden mit der dem Fachmann geläufigen Coombs-Reaktion nachgewiesen, d.h. mit einem Antikörper, der gegen die zu prüfenden Antikörper gericht ist und in irgendeiner bekannten Weise -markiert ist, urngesetzt und durch die verwendete Markierung sichtbar gemacht.
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Ma
-Alternativ zum Coombs-Test kann ein Nachweis der Thrombozyten-Antigen-Antikörper-Immunkomplexen durch die ebenfalls geläufige, Komplementbindungsreaktion erfolgen. Das Testprinzip ist auch anwendbar, wenn die Antigene auf den Thrombozyten unbekannt sind und mit bekannten gegen Thrombozyten gerichtete*Antikörper^ reagieren. Es kann hierbei folgendes Testsystem zur Anwendung gelangen:
Das Sediment von ca. 1 χ 1O erfindungsgemäß stabilisierten Thrombozyten wird mit 0,1 ml der auf das Vorhandensein von Thrombozyten-Antikörpern zu prüfenden Flüssigkeit, z.B. Serum, ggf. in mehreren Stufen verdünnt, überschichtet und resuspendiert. Nach einer Inkubation von etwa 30 Min. Dauer bei ca. 20 C werden die Thrombozyten mit einer physiologischen Salzlösung, die ggf. 0,0001 M bis 0,0005 M eines Metallchelatbildners wie Äthylendiamintetraessigsäure entheilt, dreimal gewaschen . Nachfolgend wird das Thrombozytensediment mit 0,1 mV eines Antiserums, welches Antikörper' gegen die zu prüfenden Thrombozyten-Antikörper enthält, die mit einem Markierungsmittel (z.B. einem fluoreszierenden Stoff wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) oder Tetrarne thyI-rhodarninisothiocyanat (TRITC) oder einem Enzym wie Peroxydase gekoppelt sind, überschichtet und resuspendiert und zwar in einer Verdünnung, die selbst nicht mehr (unspezifisch) mit den stabilisierten Thrombozyten reagiert. Nach einer Inkubation von 30 Min. Dauer bei ca. 20 C und nach erneuter dreimaliger Waschung wird das'Thrombozytensediment in 0,02 ml einer proteinhaltigen Lösung (z.B. Albumin oder fetales Kälberserum) resuspendiert. Die Suspension wird auf einem Objektträger ausgestrichen. Nach Lufttrocknung wird je nach Markierungsart das Präparat direkt im Fluoreszenzmikroskop beurteilt oder es wird nachfolgend einer der bekannten cytochemischen Reaktionen auf das Markerenzyrn unterzogen und dann lichtmikroskopisch ausgewertet. Sind in
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Ma
-jr -
zu prüfenden Flüssigkeit Antikörper gegen Thrombozyten, sind diese Partikel je nach der gewählten Methode markiert und erkennbar.
Die Erfindung soll mit Hilfe des nachstehenden Ausführungs beispiels näher erläutert werden.
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• - J?- Ma 230
Beispiel
100 ml menschliches Blut, das während der Gewinnung mit 0.005 g EDTA pro ml gemischt wurde, wird in einer Zentrifuge bei 1500 UpM (Rotordurchmesser 21 cm) zentrifugiert. Der sogenannte Thrombozytenreiche Überstand wird abgehebert, der Rest verworfen. Der Überstand wird bei 1200 UpM zentrifugiert und in 0,9%iger Kochsalzlösung enthaltend 0,01 g EDTA pro 100 ml resuspendiert. Die Zentrifugation und Resuspension wird insgesamt 5 Mal wiederholt, wobei jeweils der Überstand verworfen und das Thrombozyten-^ sediment gewonnen wird.
Schließlich wird das Thrombozytensediment in 25 ml einer pjhosphac-
. gepufferten Lösung folgenden Rezeptes, de'ren pH 7,2' ¥ert beträgtu. die mit \% Polyvinylpyrrolidon versetzt ist, resuspendiert:
NaCl 8g
KCl 0,2 g
MgCl2 '. 6H2O 0,1 g
CaCl2 . 2H^O 0,132 g
Na2HPO4 . 12H2O 2,9g
KH2PO4 0,2 g
Aquai· TaId. ad 1000 ml
Zu der Thrombozytensuspension werden 25 ml einer 2/oigen 5-Sulfosalizylsäurelösung gelöst in dsr oben genanten Phosphatpufferlösung mit einem Gehalt von 1 Gew.% Polyvinylpyrrolidon gegeben. Danach rührt man eine Stunde bei Raumtemperatur, zentrifugiert die chemisch modifizierten Thrombozyten bei 180 χ g ab, wäscht wie anfänglich beschrieben mit Phosphatpufferlösung, die pro 100 rnl 0,01 g EDTA enthält, insgesamt 5 Mal, wofür insgesamt 40 ml d*zr Vv.'aschflüssigkeit verwendet· werden. Schließlich werden die Thrombozyten durch Zentrifugation gewonnen und in 30 rnl der beschriebenen Phosphatpuffer lösung, die 1 g Polyvinylpyrrolidon pro 100 rrsl enthält, resuspendiert.
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_ / _ Ma 23O
Die Suspension stellt in dieser Form ein diagnostisch anwendbares Mittel zum Nachweis von Thrombozyten-Antikörpern dar. Zur Haltbarmachung kann der Suspension ein antimikrobiell wirksames Agens wie z.B. Natrium timer fonat in einer Konzentration von 0,001 g pro 100 ml zugesetzt werden. Die erhaltene Suspension kann in bekannter
Weise gefriergetrocknet werden. Zweckmäßig werden hierbei Porf
tionen von 10 ml abgefüllt und gefriergetrocknet.
In gleicher Weise wie in dem vor beschriebenen Beispiel lassen sieh gegerbte Thrombozyten mit Gluta'rdialdehyd herstellen, wobei statt 2%iger Sulfosalizylsäure 1%ige Glutardialdehyd-Lösung verwendet wird.
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Claims (8)

  1. Ma 23O
    Patentansprüche
    Gegerbte Thrombozyten.
  2. 2. Verfahren zur Herstellung modifizierter Thrombozyten, da.durch gekennzeichnet, dass man Thrombozyten mit einem Gerbstoff behandelt.
  3. 3. Verfahren zur Herstellung modifizierter Thrombozyten, dadurch gekennzeichnet, dass frisch gewonnene Thrombozyten in einer isotonischen, ein Schutzkolloid enthaltejiden, annähernd neutralen, ggf. einen Chelatbildner enthaltenden wässrigen Lösung suspendiert, mit einem Gerbstoff behandelt, die gegerbten Thrombozyten gewonnen und ggf. gefriergetrocknet werden.
  4. h. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass eine aus frischem Blut gewonnene thrombozytenreiche Fraktion in einem wässrigen, ein Schutzkolloid enthaltenden Medium bei pH 6—8 mit einem Gerbstoff in einer Endkonzentration von 0,002 - 5/£ wenige Minuten bis zu mehreren Stunden bei .0-37 behandelt, wonach die gegerbten Thrombozyten gewonnen werden.
  5. 5· Verfahren nach Ansprüchen 2-3» dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung in Gegenwart eines lyophilen Kolloids durchgeführt wird.
  6. 6. Verfahren nach Ansprüchen 2-4, dadurch gekennzeichnet, dass di-e Behandlung in Gegenwart des lyophilen Kolloids Polyvinylpyrrolidon in einer Endkonzentration von 0,01 - yp durchgeführt wird.
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  7. 7· Verfahren nach Ansprüchen 2—5» dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung mit 5-Sulfosalizylsäure als Gerbstoff in einer Endkonzentration von ö5üü2 - 4yo durchgeführt wird.
  8. 8. Verfahren nach Ansprüchen 2-5» dadurch gekennzeichnet, dass die Behandlung mit Glutardialdehyd als Gerbstoff in einer Endkonzentration von 0,002 - k°/o durchgeführt wird.
    9- Mittel zum Nachweis von Thrombozyten—Antikörpern oder Thrombozyten-Antigenen enthaltend Thrombozyten nach Anspruch
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