MX2010011184A

MX2010011184A - Molecula de union de antigeno capaz de unir repetidamente a dos o mas moleculas de antigeno.

Info

Publication number: MX2010011184A
Application number: MX2010011184A
Authority: MX
Inventors: Takashi Nakai; Tomoyuki Igawa; Shinya Ishii; Atsuhiko Maeda
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2009-04-10
Publication date: 2011-01-20
Also published as: TWI563134B; HK1246311A1; JP4961501B2; US20200048627A1; HUE028718T2; EP2275443A1; JP2021141897A; EP2708559A2; CN102056946A; EP3521311A1; CA2721052A1; PL2708558T3; US20240002836A1; CN107551270A; HRP20180708T1; JPWO2009125825A1; TWI787643B; TWI700293B; TW202241961A; JP6417431B2

Abstract

Se describe el hallazgo de una molécula de un anticuerpo que exhibe una actividad de unión de antígeno más debíl a un valor de pH en un endosoma temprano en comparación con una molécula a un valor de pH en un plasma que puede unir dos o más moléculas de antígeno, y también el hallazgo del anticuerpo que tiene un período de vida largo en un plasma y se mejora en el período durante el cual el anticuerpo puede unir a un antígeno.

Description

MOLECULA DE UNION DE ANTIGENO CAPAZ DE U EPETIDAMENTE A DOS O MAS MOLECULAS DE ANT mpo de la Invención La presente invención se refiere a métodos para m macocinética de las moléculas de unión al antígeno y a incrementar la cantidad de veces que las moléculas antígeno se unen a un antígeno, y también con molé ón al antígeno que tienen una farmacocinética m léculas de unión al antígeno que se unen a un antíg yor cantidad de veces, y métodos para produci léculas. racterísticas de la Invención Los anticuerpos están ganando atención como fárm son muy estables en plasma y tienen pocos efectos a la actualidad, hay una cantidad de fármacos bas icuerpos del tipo de IgG disponibles en el mercado, y is necesaria de un fármaco a base de anticuerpos es consiguiente, esto ha resultado en problemas, tales to de producción elevado, y también en la dific ducir formulaciones subcutáneas. En teoría, la dosi maco a base de anticuerpos puede reducirse mejo macocinética del anticuerpo o mejorando la afinidad icuerpos y los antígenos.

En la literatura se han descrito métodos para m macocinética de un anticuerpo usando una sustitución aminoácidos en las regiones constantes (Documento entes 4 y 5). De manera similar, se ha mencio duración por afinidad como una tecnología para m acidad de unión al antígeno o la actividad de neutraliz ígenos (Documento de No patentes 6). Esta tecnología jorar la actividad de unión al antígeno mediante la intr mutaciones de aminoácidos en la región CDR de un iable o una porción similar. La mejora de la capa ementarse hasta el infinito mediante la unión coval icuerpo al antígeno, una sola molécula de anticuerp tralizar una molécula de antígeno (un anticuerpo ría neutralizar dos moléculas de antígeno). Sin emb tralización estequiometria de un anticuerpo contra un anticuerpo divalente contra dos antígenos) es el límit todos preexistentes, por lo que es imposible ne pletamente un antígeno con una menor cantidad de an la cantidad de antígeno. En otras palabras, el e jora de la afinidad tiene un límite (Documento de No Para prolongar el efecto de neutralización de un an tralizador durante un período determinado, es n inistrar el anticuerpo en una dosis mayor que la can ígeno producida en el cuerpo durante el mismo períod tof con la mejora de la farmacocinética del anticue nología de maduración por afinidad por sí solas, cribe en la presente documentación, hay un límite icuerpos que poseen una función catalítica. Cu ígeno es una proteína, es posible inactivarlo hidroliz aces peptídicos. Un anticuerpo puede ne etidamente antígenos al catalizar tal hidrólisis (Docu patentes 8). Los anticuerpos catalíticos y las tecnolog ducirlos han sido descritos en diversas publicació bargo, no se han descrito anticuerpos catalíticos qu actividad catalítica suficiente para usarlos como macéuticos. Específicamente, en un estudio con ant tra un antígeno determinado in vivo, no se han icuerpos catalíticos que puedan producir un efecto co iás fuerte, aún en dosis bajas, o que puedan producir u s prolongado, aún en la misma dosis que un an tralizador no catalítico convencional.

Como se describió anteriormente, no se han icuerpos que puedan producir un efecto in vivo superi los anticuerpos neutralizadores convencionales med A continuación se detallan los documentos que co antecedentes técnicos de la presente invención.

[Documentos técnicos anteriores] [Documentos de No patentes] Documento de No patentes 1: Monoclonal cesses in the clinic. Janice M Reichert, Clark J Ros ra B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechno 3-1078 (2005). ' Documento de No patentes 2: Pavlou AK, Belsey rapeutic antibodies market to 2008. Eur J Pharm B ril de 2005¡59(3):389-96.

Documento de No patentes 3: Kim SJ, Park Y, H ibody engineering for the development of th ibodies. Mol Cells. 31 de Agosto de 2005;20(1 visión.

Documento de No patentes 4: Hinton PR, Xiong J , Tang MT, Keller S, Tsurushita N. An engineered hu eral method for greatly improving the affinity of antib ng combinatorial librarles. Proc Nati Acad Sci U S io de 2005; 102(24):8466-71. Epub 6 de Junio de 2005.

Documento de No patentes 7: Wu H, Pfarr DS, Jo wah YA, Woods RM , Patel NK, White Wl, Young JF, Ki velopment of Motavizumab, an Ultra-potent Antibody vention of Respiratory Syncytial Virus Infection in th Lower Respiratory Tract. J Mol Biol. 2007, 368, 652-6 Documento de No patentes 8: Hanson CV, Nishiyam Catalytic antibodies and their applications. Cu technoi. Diciembre de 2005; 16(6):631 -6.

Documento de No patentes 9: Rathanaswami P, Ro skos L, Su QJ, Lackie S, Babcook J. Demonstration o generated sub-picomolar affinity fu 11 y human mo ibody to interleukin-8. Biochem Biophys Res Comm tiembre de 2005;334(4): 1004-13. ve Descripción de la Invención igenos varias veces, moléculas de unión al antíg en una farmacocinética mejorada, compo macéuticas que contienen tales moléculas de u ígeno, y métodos para producir tales molé posiciones. dios para Resolver los Problemas! En la presente documentación, se describen icados a métodos para unir polipéptidos que p acidad de unión al antígeno, tales como moléculas de ígeno, varias veces a los antígenos, y métodos para vidas medias de tales moléculas en plasma diante la mejora de su farmacocinética). Como resul cubrió que, si la actividad de unión al antígeno lécula de unión al antígeno al pH endosomico con ant inferior a su actividad de unión al antígeno al pH de ngre), debería ser capaz de unirse varias vece igenos y tendría una vida media en plasma más proion s específicamente, en la presente invención se proporc [1] una molécula de unión al antígeno que tiene un (pH 5.8)/KD(pH 7.4), definido como la relación entre l ígeno pH 5.8 y la KD del antígeno pH 7.4, de 2 ó más; [2] la molécula de unión ai antígeno de [1], en or de KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4) es de 10 ó más; [3] la molécula de unión al antígeno de [1], en or de KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4) es de 40 ó más; [4] la molécula de unión al antígeno de cualquiera t en donde al menos un aminoácido de la molécula de ígeno ha sido sustituido por histidina, o se ha inse os una histidina en la molécula de unión al antígeno; [5] la molécula de unión al antígeno de cualquiera , en donde la molécula de unión al antígeno tiene agónica; [6]. la molécula de unión al antígeno de cualquiera , en donde la molécula de unión al antígeno se u ígeno pH 5.8, en comparación con la actividad pH 7.4; [10] un método para incrementar la cantidad de v une a los antígenos una molécula de unión al antíg prende reducir ta actividad de unión al antígen lécula de unión al antígeno pH 5.8, en comparació ividad pH 7.4; [11] un método para incrementar la cantidad de ant que puede unirse una molécula de unión al antíg prende reducir la actividad de unión al antígen écula de unión al antígeno pH 5.8, en comparació ividad pH 7.4; [12] un método para disociar, dentro de una cé ígeno de una molécula de unión al antígeno. que se un exterior de la célula, que comprende reducir la acti ón ai antígeno de la molécula de unión al antígeno p paración con la actividad pH 7.4; [13] un método para liberar de la célula una mol lécula de unión al antígeno pH 5.8, en comparació ividad pH 7.4; [15] el método de cualquiera de [9] a [14], en donde KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4), definido como la relación ent antígeno pH 5.8 y la KD del antígeno pH 7.4, es de 2 [16] el método de cualquiera de [9] a [14], en donde KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4) es de 10 o más; [17] el método de cualquiera de [9] a [14], en donde KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4) es de 40 o más; [18] un método para mejorar la farmacocinética lécula de unión al antígeno, que comprende sustituir aminoácido de la molécula de unión al antígeno por nsertar al menos una histidina en la molécula de ígeno; [19] un método para incrementar la cantidad de ve une a los antígenos una molécula de unión al antíg prende sustituir al menos un aminoácido de la mol ígeno de una molécula de unión al antígeno que se un exterior de la célula, que comprende sustituir al m inoácido de la molécula de unión al antígeno por his ertar al menos una histidina en la molécula de ígeno; [22] un método para liberar de la célula una mol ón al antígeno que ha estado unida a un antígeno y rnalizada en una célula, en una forma libre de antíg prende sustituir al menos un aminoácido de la mol ón al antígeno por histidina, o insertar al menos una la molécula de unión al antígeno; [23] un método para incrementar la capacidad lécula de unión al antígeno de eliminar un antígeno en comprende sustituir al menos un aminoácido de la unión al antígeno por histidina, o insertar al me tidina en la molécula de unión al antígeno; [24] el método de cualquiera de [18] a [23], en [26] el método de cualquiera de [9] a [25], en lécula de unión al antígeno se une a un antígeno de m n antígeno soluble; [27] el método de cualquiera de [9] a [26], en lécula de unión al antígeno es un anticuerpo; [28] un método para, buscar una molécula de ígeno que comprende las siguientes etapas: (a) determinar la actividad de unión al antígeno lécula de unión ai antígeno a un pH de entre 6.7 y 10.0 (b) determinar la actividad de unión al antígen lécula de unión al antígeno a un pH de entre 4.0 y 6.5; (c) seleccionar una molécula de unión al antíge ividad de unión al antígeno a un pH de entre 6.7 y yor que su actividad de unión al antígeno a un pH de -5; [29] el método de búsqueda de [28], que comprende seleccionar un anticuerpo cuya actividad de unión al (c) obtener una molécula de unión al antígeno d o una condición con un pH de entre 4.0 y 6.5; [31] un método para buscar una molécula de ígeno cuya actividad de unión a un primer pH es may segundo pH, que comprende las siguientes etapas: (a) unir una molécula de unión al antígeno a una un antígeno inmovilizado bajo una condición con e ; (b) eluir la molécula de unión al antígeno unida a la primer pH de la columna, bajo una condición con el ; y (c) recolectar la molécula de unión al antígeno extra [32] un método para buscar una molécula de ígeno cuya actividad de unión a un primer pH es may segundo pH, que comprende las siguientes etapas: (a) unir una biblioteca de moléculas de unión al an er pH es de entre 6.7 y 10.0, y el segundo pH es de .5; [34] el método de búsqueda de cualquiera de [28] a de al menos uno o más aminoácidos de la molécula ntígeno han sido sustituidos por histidina, o se ha ins os una histidina en la molécula de unión al antígeno; [35] el método de búsqueda de cualquiera de [28 a obtener una molécula de unión al antígeno que es retención en el plasma; [36] el método de búsqueda de cualquiera de [28 a obtener una molécula de unión al antígeno que es se a un antígeno dos o más veces; [37] el método de búsqueda de cualquiera de [28 a obtener una molécula de unión al antígeno que es se a más antígenos, en comparación con la cantidad unión al antígeno que posee; [38] el método de búsqueda de cualquiera de [28 a obtener una molécula de unión al antígeno que pres acidad mejorada de eliminar el antígeno en plasma; [41] el método de búsqueda de cualquiera de [28] a de la molécula de unión al antígeno es utilizada c posición farmacéutica; [42] el método de búsqueda de cualquiera de [28] a de la molécula de unión al antígeno es un anticuerpo; [43] un método para producir una molécula de ígeno que comprende las siguientes etapas: (a) determinar la actividad de unión al antígeno lécula de unión al antígeno a un pH de entre 6.7 y 10.0 (b) determinar la actividad de unión al antígen lécula de unión al antígeno a un pH de entre 4.0 y 6.5; (c) seleccionar la molécula de unión al antíge ividad de unión al antígeno a un pH de entre 6.7 y yor que a un pH de entre 4.0 y 6.5; (d) obtener el gen que codifica la molécula de ígeno de (a) repose bajo una condición con un pH de .5; (c) recolectar la molécula de unión al antígeno d o una condición con un pH de entre 4.0 y 6.5; (d) obtener el gen que codifica la molécula de ígeno obtenida en (c); y (e) producir la molécula de unión al antígeno usand enido en (d); [45] un método para producir una molécula de ígeno cuya actividad de unión a un primer pH es may segundo pH, que comprende las siguientes etapas: (a) unir una molécula de unión al antígeno a una un antígeno inmovilizado bajo una condición con u ; (b) eluir de la columna la molécula de unión al antíg había unido a la columna al primer pH, bajo una cond segundo pH; (a) unir una biblioteca de moléculas de unión al an columna con un antígeno inmovilizado bajo una condi primer pH; (b) eluir la molécula de unión al antígeno de la colur condición con un segundo pH; (c) amplificar el gen que codifica la molécula de ígeno extraído; (d) recolectar la molécula de unión al antígeno extra (e) obtener el gen que codifica la molécula de ígeno recolectada en (d); y (f) producir la molécula de unión al antígeno usand enido en (e); [47] el método de producción de [45] o [46], en mer pH es de entre 6.7 y 10.0, y el segundo pH es de .5. [48] el método de producción de cualquiera de [43 comprende además la etapa de sustituir al m ectos de la Invención] La presente invención proporciona métodos para h moléculas que se unen al antígeno simple s etidamente a múltiples moléculas de antígeno. Cua lécula que se une al antígeno se une a múltiples molé ígeno, la farmacocinética de la molécula que se ígeno puede ser mejorada y tal molécula puede ejerce vivo más superiores que aquellos de las moléculas o se unen al antígeno. ve Descripción de los Dibujos Figura 1 es un diagrama donde se ilustra la radación de los anticuerpos unidos a antígenos uni mbrana.

Figura 2 es un diagrama donde se ilustra un me diante el cual las moléculas de IgG son capturadas por Figura 3 es un diagrama esquemático donde se i on de las moléculas de IgG con nuevos antígenos, de ultados de un ELISA de fagos para clones adquiri io de una búsqueda en columna. En el gráfico sup tra un espécimen tipo salvaje (WT)F y en el gráfico in tra CL5.

Figura 7 es un gráfico donde se ilustra la acti tralización biológica de anticuerpos anti-receptor de I ón depende del pH.

Figura 8 se presentan gráficos donde se ilus ultados de un sensograma Biacore para la u icuerpos anti-receptor de IL-6, cuya unión depende del receptor de IL-6 soluble a pH 7.4. En el gráfico su tra un espécimen WT; en el segundo gráfico desde tra H3pl/L73; en el tercer gráfico desde arriba s 0/L82; y en el gráfico inferior se ilustra CLH5/L73.

Figura 9 se presentan gráficos donde se ilus ultados de un sensograma Biacore para la u icuerpos anti-receptor de IL-6, cuya unión depende del imbrana. En el gráfico superior se ilustra un espécime segundo gráfico desde arriba se ilustra H3pl/L73; en fico desde arriba se ilustra H170/L82; y en el gráfic ilustra CLH5/L73.

Figura 11 es un sensograma Biacore donde se i ón repetida de anticuerpos anti-receptor de IL-6, cu ende del pH, a SR344.

Figura 12 es un gráfico donde se ilustra la cantidad ígeno unido en un experimento de unión repet icuerpos anti-receptor de IL-6, cuya unión depende d 344.

Figura 13 es un gráfico donde se ilustra la progresi po de la concentración de anticuerpos anti-receptor a unión depende del pH, en plasma de ratones tran a el receptor de IL-6 humano.

Figura 14 es un gráfico donde se ilustra la progresi po de la concentración de anticuerpos anti-receptor eptor de IL-6 cuya unión depende del pH.

Figura 17 se presentan gráficos donde se ilus ultados de un sensograma Biacore de asociación (p ociación (pH 5.8) de anticuerpos anti-receptor de IL ón depende del pH, con un receptor de IL-6 uni mbrana. Desde arriba hacia abajo, se ilustran los re a un espécimen WT, H3pl/L73-lgG1 , Fv2-lgG1 y Fv4-lg Figura 18 es un gráfico donde se ilustra ia progresi po de la concentración de anticuerpos anti-receptor a unión depende del pH en plasma (WT, H3pl/L73-lg 1 y Fv4-lgG1) en ratones transgénicos para el recepto ano.

Figura 19 se presentan gráficos donde se ilus ultados de un sensograma Biacore para la asociación a disociación (pH 5.8) de anticuerpos anti-receptor a unión depende del pH, a un receptor de IL-6 un mbrana. Desde arriba hacia abajo, se ilustran los re ociación (pH 5.8) de anticuerpos anti-receptor de IL ón depende del pH, a un receptor de IL-6 uni mbrana. Desde arriba hacia abajo, se ilustran los re a un espécimen Fv1 -M71 , Fv1 -M73, Fv3-M71 y Fv3-M7 Figura 22 es un gráfico donde se ilustra la progres po de concentraciones de anticuerpos anti-receptor a unión depende del pH, en plasma de monos ante la administración de H3pl/L73-lgG1 , Fv1-M71, -lgG1, Fv3-M73 y Fv4-M73 a razón de 0.5 mg/kg, y d inistración de un anticuerpo de alta afinidad a razó /kg.

Figura 23 es un gráfico donde se ilustra la progres po de la concentración de CRP en monos maca ción a anticuerpos anti-receptor de IL-6 cuya unión pH (Se administró H3pl/L73-lgG1 , Fv1-M71, Fv1-M 1, Fv3-M73f Fv4-M73 y un anticuerpo de alta afinidad) Figura 24 es un gráfico donde se ilustra la progresi eriscos se señalan las localizaciones donde hay mutac inoácidos en las secuencias alineadas.

Figura 26 se presenta un sensograma Biacore d tra la unión dependiente del pH de un anticuerpo i-IL6 clon 2, con IL-6, a pH 7.4 y pH 5.5. Las curv sograma a pH 7.4 corresponden a 100, 50, 25, 12. mi de IL-6, desde la parte superior.

Figura 27 se presenta un sensograma Biacore d tra la unión dependiente del pH de un anticuerpo anti- IL-31, Anti-IL31R clon 1, con el receptor de IL-31 a 5.5. Las curvas en el sensograma a pH 5.5 corresp , 50, 25 y 12.5 ng/ml del receptor de IL-31, desde erior.

Figura 28 se ilustra la progresión en el tiemp centración de un anticuerpo en plasma despué inistración intravenosa en ratones de una solución m tiene SR344 y un anticuerpo anti-receptor de IL-6 hum sente invención se proporcionan métodos para incre tidad de veces que se unen a los antígenos las molé on al antígeno, que comprenden reducir la capacidad antígeno de las moléculas de unión al antígeno pH á paración con la actividad pH neutro. Además, en la ención se proporcionan métodos para incrementar la veces que se unen a los antígenos las moléculas de ígeno, que comprenden sustituir al menos un amino moléculas de unión al antígeno por histidina, o in nos una histidina en las moléculas de unión al emás, en la presente invención se proporcionan méto rementar la cantidad de veces que se unen a los antíg léculas de unión al antígeno, que comprenden rimir, agregar y/o insertar aminoácidos en la región c anticuerpo de las moléculas de unión al antígeno.

En la presente invención también se proporcionan a incrementar la cantidad de antígenos a los que pued aminoácido por histidina en las moléculas de unión al nsertar al menos una histidina en las moléculas de ígeno. Además, en la presente invención se prop todos para incrementar la cantidad de antígenos a de unirse una molécula de unión al antígeno, que co tituir, suprimir, agregar y/o insertar aminoácidos en l stante de anticuerpo de las moléculas de unión al antí En la presente invención también se proporcionan a disociar, dentro de una célula, un antígeno de una unión al antígeno que se unió desde el exterior de l S específicamente, en la presente invención se prop todos para disociar, dentro de una célula, un antígen lécula de unión al antígeno que se unió desde el exter ula, que comprenden reducir la capacidad de unión al ácido, en comparación con la actividad pH neutro. Ad presente invención se proporcionan métodos para tro de una célula, un antígeno de una molécula de anticuerpo de la molécula de unión al antígeno.

En la presente invención también se proporcionan a liberar de la célula una molécula de unión al antígen ado unida a un antígeno y ha sido internalizada en un una forma libre de antígeno. Más específicament sente invención se proporcionan métodos para liber ula una molécula de unión al antígeno que ha estado antígeno y ha sido internalizada en una célula, en u e de antígeno, que comprenden reducir la capacidad ntígeno pH ácido, en comparación con la actividad p más, en la presente invención se proporcionan méto rar de la célula una molécula de unión al antígeno ado unida a un antígeno y ha sido internalizada en un una forma libre de antígeno, que comprenden su os un aminoácido por histidina en la molécula de ígeno o insertar al menos una histidina en la mol ón al antígeno. Además, en la presente inven ígeno de eliminar antígenos en plasma. Más específi la presente invención se proporcionan métod rementar la capacidad de una molécula de unión al ant inar antígenos en plasma, que comprenden re acidad de unión al antígeno pH ácido, en comparació i viciad pH neutro. Además, en la presente inve porcionan métodos para incrementar la capacidad lécula de unión al antígeno de eliminar antígenos en comprenden sustituir al menos un aminoácido por his moléculas de unión al antígeno o insertar al me tidina en las moléculas de unión al antígeno. Ademá sente invención se proporcionan métodos para incre acidad de una molécula de unión al antígeno de ígenos en plasma, que comprenden sustituir, suprimir, insertar aminoácidos en la región constante de antic olécula de unión al antígeno.

En la presente invención también se proporcionan comprenden sustituir al menos un aminoácido por his moléculas de unión al antígeno o insertar al me tidina en las moléculas de unión al antígeno. Adema sente invención se proporcionan métodos para m macocinética de las moléculas de unión al antíge prenden sustituir, suprimir, agregar y/o insertar ami la región constante de anticuerpo de las moléculas de ígeno.

Además, en la presente invención se proporcionan a incrementar la capacidad de las moléculas de ígeno de eliminar antígenos en plasma. Más específi la presente invención se proporcionan métod ementar la capacidad de las moléculas de unión al eliminar antígenos en plasma, que comprenden re acidad de unión al antígeno de las moléculas de ígeno pH ácido, en comparación con la actividad pH emás, en la presente invención se proporcionan méto inoácidos en la región constante de anticuerpo léculas de unión al antígeno.

En la presente documentación, la "perfección macocinética", "mejora de la farmacocinét rmacocinética superior" son frases que pueden istintamente con la "perfección de la retención en ngre)", la "mejora de la retención en plasma (sang tención en plasma (sangre) superior", respectivamen ta de sinónimos.

En la presente documentación, la reducción de la unión al antígeno pH ácido, en comparación con la neutro, hace referencia a la reducción de la capa ón al antígeno de una molécula de unión al antígeno entre 4.0 y 6.5, en comparación con la actividad a u re 6.7 y 10.0, preferiblemente la reducción de la acti ón al antígeno de una molécula de unión al antígeno entre 5.5 y 6.5, en comparación con la actividad a u , y más preferiblemente, es un pH de 7.4.

En la presente documentación, la frase "reducir la c unión al antígeno de una molécula de unión al antí o, en comparación con la actividad pH neutro" pued istintamente con la frase "incrementar la capacidad de igeno de una molécula de unión al antígeno pH ne paración con la actividad pH ácido". En otras pal rencia en la capacidad de unión al antígeno de una unión al antígeno debería aumentar entre pH áci tro. Por ejemplo, el valor de KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4) entar, como se describirá más adelante. La diferen acidad de unión al antígeno de una molécula de igeno entre pH ácido y pH neutro puede aumen mplo, mediante la reducción de la capacidad de igeno pH ácido y/o el incremento de la capacidad de igeno pH neutro.

Las condiciones distintas del pH para deter ertos en la técnica, por ejemplo, usando Biac althcare), o semejantes, como se describe en los ejer presente documentación. Cuando el antígeno es un uble, la actividad de unión al antígeno soluble puede e ectando el antígeno como analito en un chip donde ovilizada la molécula de unión al antígeno. Como alt ndo el antígeno es un antígeno de membrana, la acti on al antígeno de membrana puede evaluarse inyec lécula de unión al antígeno como analito en un ígenos inmovilizados.

En la presente invención, la diferencia en la acti ón al antígeno entre pH ácido y pH neutro no ticularmente limitada, siempre y cuando la actividad antígeno pH ácido sea menor que la actividad pH ne bargo, el valor de KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4), que es una re la constante de disociación (KD) contra un antígen pH 7.4, preferiblemente es de 2 ó más, más preferi ígeno de membrana, ta actividad de unión al antígen sentarse en términos de la constante de disociación a constante de disociación (KD) y la constante de dis rente (KD aparente) pueden determinarse con ocidos por aquellos expertos en la técnica, por ndo Biacore (GE healthcare), Scatchard plot o FACS.

Como alternativa, es posible usar, por ejemplo stante de la velocidad de disociación, como indicad rencia en la actividad de unión al antígeno entre pH neutro. Cuando la constante de la velocidad de dis ) se usa como indicador de la diferencia en la acti ón en lugar de la constante de disociación (KD), el pH 5.8)/kd(pH 7.4), que es una relación entre la consta ocidad de disociación (kd) contra un antígeno pH 5.8 , preferiblemente es de 2 ó más, más preferiblemente más preferiblemente 10 ó más, y aún más preferible ás. El límite superior del valor de Kd(pH 5.8)/Kd(pH 7. igeno puede presentarse en términos de la constan ocidad de disociación aparente. La constante de la v disociación (kd) y la constante de la velocidad de dis rente (kd aparente) pueden determinarse con ocidos por aquellos expertos en la técnica, por ndo Biacore (GE healthcare) o FACS.

En la presente invención, cuando la actividad de igeno de una molécula de unión al antígeno se dét tintos pH, es preferible que, excepte por el pH, las con medición sean constantes.

Los métodos para reducir la actividad de unión al una molécula de unión al antígeno pH 5.8, en compara actividad pH 7.4 (métodos para conferir una capa ón dependiente del pH) no se hallan particularmente li ueden ser cualquier método. Estos métodos pueden in mplo, métodos para reducir la actividad de unión al 5.8, en comparación con la actividad pH 7.4, que co ón al antígeno pH 5.8 sea menor que pH 7.4 (el (pH 5.8)/KD(pH 7.4) aumenta), en comparación con la via a la mutación o la inserción. Cuando la molécula antígeno es un anticuerpo, estos sitios incluyen, por os dentro de la región variable del anticuerpo. La opiada de sitios para realizar la mutación por histid erción de histidina podrá ser determinada apropiadar ellos expertos en la técnica. La mutación por histid erción de histidina pueden realizarse en un solo sitio, más sitios. También es posible introducir mutacio inoácidos distintos de histidina (sustituciones por ami tintos de histidina) de manera simultánea. Además, la histidina puede introducirse de manera simultáne erción de histidina. Es posible realizar la sustitu ti d i n a o la inserción de histidina al azar, usando un m o la búsqueda de histidina, donde, en un análisis de ocido por aquellos expertos en la técnica, se usa his aminoácidos de la molécula, es preferible, pero no n la actividad de unión al antígeno de la molécula de ígeno pH 7.4 después de la sustitución por histidi erción de histidina sea comparable a la actividad pH 7. la sustitución por histidina o la inserción de histi tividad de unión al antígeno de la molécula de ígeno pH 7.4 después de la sustitución por histidi erción de histidina es comparable a la actividad pH 7 la sustitución por histidina o la inserción de histidina , aún después de la sustitución por histidina o la inse t id i na , la molécula de unión al antígeno retiene 10% feriblemente 50% o más, más preferiblemente 80% más preferiblemente 90% o más de la actividad de ígeno que presentaba antes de la sustitución por histi erción de histidina. Cuando la actividad de unión al la molécula de unión al antígeno ha sido reducida de titución por histidina o la inserción de histidina, la acti inoácidos, después de la sustitución por histidin erción de histidina.

Métodos alternativos para reducir la actividad de ígeno de una molécula de unión al antígeno pH paración con la actividad pH 7.4, incluyen métod tituir aminoácidos por aminoácidos no naturales lécula de unión al antígeno, o para insertar aminoá urales entre los aminoácidos de una molécula de ígeno. Se sabe que el pKa puede ser controlado de ificial usando aminoácidos no naturales (Angew. Chem. 5, 44, 34; Chem Soc Rev. 10 de Septie 4;33(7):422-30; Amino Acids. 1999; 16(3-4):345-7 siguiente, en la presente invención, es posib inoácidos no naturales en lugar de la histidina des erioridad. La sustitución por aminoácidos no natural erción de aminoácidos no naturales pueden realiz nera simultánea con la sustitución por histidina y/o la i paración con la actividad pH 7.4, incluyen métod dificar la región constante de anticuerpo contenid lécula de unión al antígeno. Estos métodos para mo ión constante de anticuerpo incluyen, por ejemplo, mé titución por una región constante como la que se des ejemplos en la presente documentación.

Métodos alternativos para modificar la región cons icuerpo incluyen, por ejemplo, métodos para eva tipos de diversas regiones constantes (lgG1, lgG2, 4) y seleccionar un isotipo que reduzca la actividad antígeno pH 5.8 (que incremente la velocidad de diso 5.8). Como alternativa, los métodos incluyen méto ucir la actividad de unión al antígeno pH 5.8 (incre ocidad de disociación a pH 5.8) que comprenden inoácidos en la secuencia de aminoácidos de un iso vaje (la secuencia de lgG1, lgG2, lgG3 o lgG4 tipo sal uencia de la región bisagra de una región const i ó n bisagra tiene una influencia significativa sobre la unión al antígeno, se asume que los sitios preferi lizar las sustituciones de aminoácidos en la secu inoácidos de un isotipo tipo salvaje se hallarán en \ agra.

Cuando la actividad de unión al antígeno de la sust ón al antígeno pH 5.8 se halla debilitada en compara actividad pH 7.4 (cuando aumenta el valor de )/KD(pH 7.4)), debido a la aplicación de los métodos anterioridad y métodos semejantes, generalm ferible que el valor de KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4) sea el s, más preferiblemente el quíntuple o más, y a feriblemente diez veces o más el valor del anticuerpo que la invención no se halla particularmente limitada ecto.

En la presente documentación, la "mejora macocinética" hace referencia a la prolongación del mplo, una forma libre de antígenos), durante el períod u eliminación del plasma, después de la administració molécula de unión al antígeno circule en plasma, rse a un antígeno cuando ya esté unida a otro antig siguiente, el período en el que la molécula de ígeno puede unirse nuevamente a otro antígeno se incrementa la probabilidad de que se una a otro a longando el período en el que la molécula de unión al halla en una forma libre de antígenos. Esto permite a íodo en el que el antígeno está libre de moléculas de ígeno in vivo (en otras palabras, permite prolongar el el que el antígeno está unido por una molécula de ígeno). Por ejemplo, la relación entre los antígenos moléculas de unión al antígeno y los antígenos en e poral (total de moléculas de antígeno unidas y libre éculas de unión al antígeno) generalmente se reduc íodo de tiempo determinado, después de la administr Específicamente, en la presente invención, la "mej macocinética" no hace referencia necesariament longación (extensión) del período requerido inación de la molécula de unión al antígeno despu inistración. Aún si el período requerido para la elimin molécula de unión al antígeno después de la admin manece inalterado, en la presente invención puede la farmacocinética ha sido "mejorada" si se prolonga el período de retención en plasm lécula de unión al antígeno, en una forma capaz de uni ígeno (por ejemplo, la molécula de unión al antígen ma libre de antígenos); se acorta el período en el que el antígeno está libr lécula de unión al antígeno en el cuerpo (en otras pal longa el período en el que la molécula de unión al á unida al antígeno); y se incrementa la relación entre los antígenos unid igeno, después de la administración de la molécula de igeno; (3) el acortamiento del período en el que el antíg e de una molécula de unión al antígeno en el cuerpo, la administración de la molécula de unión al olongación del período en el que la molécula de igeno está unida a un antígeno en el cuerpo); y (4) el incremento de la relación entre los antígenos moléculas de unión al antígeno al antígeno en el cuer Cuando el antígeno es un antígeno soluble presen sma, aún si la farmacocinética de la molécula de igeno (velocidad de eliminación del plasma) es equ casos donde se acelera la eliminación del antígeno u lécula de unión al antígeno. La reducción de la fármac antígeno (aceleración de la eliminación del plasma) r mejora relativa de la farmacocinética de la molécula antígeno, lo que resulta en la prolongación del pe En la presente invención, cuando el antígeno es un membrana, es posible determinar si una sola mol ón al antígeno se une a múltiples antígenos eval jora la farmacocinética de la molécula de unión al antí erminación de la "mejora de la farmacocinética lizarse con el siguiente método. Por ejemplo, puede e se prolonga el período requerido para la eliminación lécula de unión al antígeno después de la admin erminando cualquiera de los parámetros relacionado lécula de unión al antígeno, tales como la vida sma, el período promedio de retención en plas inación del plasma ("Pharmacokinetics: Enshu-niyo derstanding through practice)" Nanzando). Por ndo se prolonga la vida media en plasma o el medio de retención en plasma de una molécula de ígeno administrada a ratones, ratas, monos, conejos anos u otros animales, se establece que la fármac íodo de retención en plasma de una molécula de ígeno, en una forma capaz de unirse a los antígenos, la administración de la molécula de unión al a iendo la concentración en plasma de la molécula de ígeno libre de antígenos, y determinando cualquier ámetros propios de la molécula de unión al antígeno ígenos, tales como la vida media en plasma, el medio de retención en plasma y la eliminación del pí centración de la molécula de unión al antígeno ígenos en plasma puede medirse con métodos conoc ellos expertos en la técnica. Por ejemplo, estas medic criben en Clin Farmacol. Abril de 2008;48(4):406-17.

Además, es posible determinar si se ha acortado el el que un antígeno está libre de las moléculas de ígeno en el cuerpo (si se ha prolongado el período en lécula de unión al antígeno está unida a un antíge rpo), después de la administración de las moléculas mplo, estas mediciones se describen en Pharm Res. 6;23(1 ):95-103. Como alternativa, cuando el antígen cierta función in vivo, puede determinarse si el antig do con una molécula de unión al antígeno que neut ción del antígeno (molécula antagónica) evaluand traliza la función del antígeno. Es posible evalú traliza la función del antígeno analizando un marcado refleje la función del antígeno. Puede determinar ígeno se ha unido a una molécula de unión al antíg iva la función del antígeno (molécula agónica) analiz rcador in vivo que refleje la función del antígeno.

No hay limitaciones particulares para la determinac centración en plasma del antígeno libre y la relación tidades de antígeno libre y antígeno total, o para el marcadores in vivo, pero la determinación preferibler Ctúa después de un período determinado, despué inistración de una sustancia de unión al antígen unión al antígeno, siete días después de la administr sustancia de unión al antígeno, 14 días despué inistración de una sustancia de unión al antígeno y pués de la administración de una sustancia de ígeno.

En la presente invención, es preferible mej macocinética en el humano. Aún cuando la retención e el humano sea difícil de determinar, es posible p re la base de la retención en plasma en ratones (por ones normales, ratones transgénicos donde se igenos humanos, y ratones transgénicos donde se n humanos) o monos (por ejemplo, monos macacos).

Los métodos para determinar la retención en plas ian particularmente limitados. La determinación lizarse, por ejemplo, de acuerdo con los métodos criben en los ejemplos en la presente documentación.

Es posible determinar si una molécula de unión al tra, exponiendo el complejo a una condición ácida íodo predeterminado, y luego determinando si la mol ón al antígeno puede unirse nuevamente a un antígen dición neutra, usando un dispositivo para eva cciones de las moléculas de unión al antígeno y los a como Biacore. Cuando la capacidad de unión al antíg lécula de unión al antígeno que presenta una depend ha sido mejorada hasta alcanzar el doble de la capac sentaba la molécula de unión al antígeno ante dificación, es posible establecer que la cantidad de v une la molécula de unión al antígeno que pre acidad de unión dependiente del pH es el doble de la respondiente a la molécula de unión al antígeno ant dificación. Como alternativa, cuando el antígeno ígeno de membrana, y por lo tanto, la molécula de ígeno es eliminada del plasma por medio de la C diada por el antígeno y la degradación en un lisosom lécula de unión al antígeno que presenta una capa ón dependiente del pH se prolonga hasta el dobl ación correspondiente a la molécula de unión al es de la modificación puede establecerse que la can es que se une la molécula de unión al antígeno que capacidad de unión dependiente del pH ha aumenta doble, en comparación con la molécula de unión al es de la modificación. Como alternativa, cuando se d concentración en plasma de un antígeno no unido, e de la molécula de unión al antígeno, y cuando el pe que la concentración en plasma del antígeno libre o la re las cantidades de antígeno libre y el antíge manecen bajas se prolonga hasta el doble, puede esta la cantidad de veces que se une la molécula de ígeno que presenta una capacidad de unión dependi ha aumentado hasta el doble, en comparación con la unión al antígeno antes de la modificación. ías veces a los antígenos. En comparación con la situ ue el antígeno unido a una molécula de unión al antí disocia en un endosoma (el antígeno permanece un lécula de unión al antígeno cuando regresa al plasma) ntígeno unido a una molécula de unión al antígeno s endosomas, el antígeno es transportado a un lisosom radado, por lo que aumenta la velocidad de elimina ígeno del plasma. Vale decir, también es posible dete molécula de unión al antígeno es capaz de unirse vari os antígenos usando la velocidad de eliminación del plasma como indicador. La velocidad de elimina ígeno del plasma puede determinarse, por inistrando los antígenos (por ejemplo, antígeno de m s moléculas de unión al antígeno in vivo, y luego mi centración de antígenos en plasma. Cuando el antíg mplo, antígeno de membrana) se produce o se secreta concentración en plasma del antígeno se reduce si au unión al antígeno administrada a un humano, ratón, mal similar, se une a un antígeno y es internalizada ula. Específicamente, en la presente documentac lécula de unión al antígeno se une dos veces a un a ota que la molécula de unión al antígeno unida a un sido internalizada en una célula y liberada en una fo antígeno, y que luego, la molécula de unión al rada se ha unido nuevamente con otro antígeno y rnalizada en una célula nuevamente.

Cuando la molécula de unión al antígeno rnalizada en una célula, puede hallarse en una forma solo antígeno, o dos o más antígenos.

En la presente documentación, "el incremento de la veces que se une a los antígenos una molécula de ígeno" no denota necesariamente que la cantidad de v ne lugar la unión con antígeno aumente en todas las m unión al antígeno. Por ejemplo, entre las moléculas de ígeno aumente cuando la molécula le sea administra ano. Sin embargo, cuando es difícil determinar la can es que tiene lugar la unión al antígeno en un hu ible predecir esta cantidad en un humano sobre la ba ultados obtenidos en ensayos in vitro o mediciones ones (por ejemplo, ratones transgénicos donde se ígenos humanos y ratones transgénicos donde se n humanos) o monos (por ejemplo, monos macacos).

En la presente invención, es preferible que una mol ón al antígeno se una a los antígenos dos o más ve mplo, es preferible que, de las moléculas de unión al una composición de moléculas de unión al antígeno, o más, preferiblemente 30% o más, más preferiblem iás, y aún más preferiblemente 80% o más (por ejempl s, 95% o más, y así sucesivamente) se unan a los a o más veces.

En la presente documentación, el "incremento de la inios de unión, por lo que un solo anticuerpo se u ximo de dos antígenos. Un anticuerpo unido a un ígenos es internalizado en una célula, y el anticuerp antígenos son degradados en un lisosoma. En gen icuerpos, tales como las IgG, pueden unirse a un m antígenos. Cuando se reduce la actividad de ígeno de una molécula de unión al antígeno, tal icuerpo, al pH endosómico, en comparación con la act del plasma, de acuerdo con los métodos de la ención, la molécula de unión al antígeno, tal c icuerpo que ha sido internalizado en una célula, se di ígeno y es liberada de la célula, por lo que puede un más a otro antígeno. En otras palabras, los métod sente invención permiten que una molécula de ígeno se una a más antígenos que ia cantidad de ón al antígeno que posee. Específicamente, al todos de la presente invención, por ejemplo, una IgG lécula de unión al antígeno". Por consiguiente, la de reemplazarse por la "neutralización" cuando el a un anticuerpo neutralizador.

En la presente invención, el "incremento de la can ígenos a los que puede unirse una molécula de ígeno" no denota necesariamente el incremento de la antígenos a los que puede unirse cada molécula de ígeno. Por ejemplo, puede aumentar la cantidad pro ígenos a los que puede unirse una molécula de ígeno en una composición de moléculas de unión al puede aumentar la proporción de moléculas de ígeno que pueden unirse a más antígenos en lug tidad de sitios de unión al antígeno que poseen.

En la presente invención, es preferible que la can ígenos a los que puede unirse una molécula de ígeno aumente cuando se le administre la molécu ano. Sin embargo, cuando resulte difícil deterr antígenos que pueden ser neutralizados por una mol ón al antígeno. Por consiguiente, la cantidad de antíg dén ser neutralizados por una molécula de unión al de determinarse con los mismos métodos descri erioridad para determinar la cantidad de veces que se lécula de unión al antígeno.

Además, en la presente invención se proporcionan a unir una molécula de unión al antígeno dos o más ígerio en el cuerpo, que comprenden administrar una unión al antígeno cuya actividad de unión al antígeno menor que pH neutro.

La presente invención también se refiere a méto tralizar antígenos que se hayan en mayor cantida tidad de sitios de unión al antígeno de la molécula de ígeno que presenta la actividad de neutralizaci prenden administrar la molécula de unión al antíge ividad de unión al antígeno pH ácido es menor que p lécula de unión al antígeno pH ácido, en comparació ividad pH neutro. En la presente invención, el antíge ociarse de la molécula de unión al antígeno en cualq tro de una célula. Sin embargo, es preferible que el disocie dentro de un endosoma con anticipación sente invención, "un antígeno dentro de una célula s una molécula de unión al antígeno que se unió erior de la célula" no denota necesariamente q ígeno que haya sido internalizado en la célula al uni lécula de unión al antígeno se disocie de la molécula ntígeno dentro de la célula. Es aceptable que la prop ígenos que se disocian de la molécula de unión al ant célula aumente en comparación con la situación pr ucción de la capacidad de unión al antígeno de la mol ón al antígeno pH ácido, en comparación con la acti tro.

Además, la presente invención se refiere a méto antígeno unido a membrana, en la presente inve luyen métodos para mejorar la disociación endosó ígenos de moléculas de unión al antígeno, lo que jorar la unión entre FcRn y las moléculas de unión al comprenden reducir la capacidad de unión al antígen lécula de unión al antígeno al pH endosómico (pH á paración con la actividad al pH del plasma (pH ando el antígeno es un antígeno soluble, la molécula antígeno puede unirse a FcRn en presencia o ause ígeno. Si es posible promover la disociación del antíg lécula de unión al antígeno en los endosomas me ucción de la capacidad de unión al antígeno de la mol ón al antígeno al pH intraendosómico (ácido), en com la actividad al pH del plasma (neutro), es posible m ón a FcRn de la molécula de unión al antígeno que e antígenos" con los métodos de la presente invención.

Independientemente de que el antígeno esté n. Es aceptable que la proporción de moléculas de ígeno libres de antígenos que se unen a FcRn en u ente en comparación con la situación previa a la redu capacidad de unión al antígeno de la molécula de ígeno al pH endosómico, en comparación con la act del plasma. Las moléculas de unión al antígeno pref métodos de la presente invención para mejorar racelular entre la molécula de unión al antígeno luyen, por ejemplo, moléculas de unión al antígeno n a antígenos unidos a membrana (antígenos de me s como proteínas de membrana. Otras moléculas de ígeno preferidas incluyen moléculas de unión al antí unen a antígenos solubles, tales como proteínas solub Como alternativa, los métodos para mejorar la uni molécula de unión al antígeno y FcRn en una c criben como métodos para promover la unión a FcR lécula de unión al antígeno en una célula, por eje écula de unión al antígeno que ha estado unida a un a sido internalizada en una célula, en una forma igeno" no denota necesariamente que cada molécula antígeno que haya estado unida a un antígeno y h rnalizada en una célula sea liberada de la célula en u e de antígeno. Es aceptable que la proporción de molé ón al antígeno que son liberadas de la célula au paración con la situación previa a la reducció acidad de unión al antígeno de la molécula de igeno pH ácido, en comparación con la actividad pH n ferible que la molécula de unión al antígeno libera ula retenga su capacidad de unión al antígeno. Ad todo para liberar de la célula una molécula de igeno que ha estado unida a un antígeno y rnalizada en una célula, en una forma libre de a bién puede describirse como un método para confer lécula de unión al antígeno una propiedad que le pe presente invención "la capacidad de eliminar antíg sma" hace referencia a la capacidad de eliminar antíg én presentes en plasma, cuando las moléculas de ígeno se administren in vivo o se secreten in v siguiente, en la presente invención, el "increr acidad de la molécula de unión al antígeno de ígenos en plasma" denota que la velocidad de elimin antígenos del plasma se acelera cuando se admini léculas de unión al antígeno in vivo, en comparació ocidad previa a la reducción de la capacidad de ígeno de las moléculas de unión al antígeno pH á paración con la actividad pH neutro. Es posible dete capacidad de la molécula de unión al antígeno de ígenos en plasma aumenta, por ejemplo, admi ígenos solubles y moléculas de unión al antígeno i go midiendo la concentración de antígenos solubles en ando la concentración de antígenos solubles en comprenden sustituir al menos un aminoácido en la unión al antígeno por histidina o un aminoácido no n ertar histidina o un aminoácido no natural en la molécu Además, en la presente invención se proporcionan a incrementar la cantidad de veces que se une a los a molécula de unión al antígeno, que comprenden su nos un aminoácido en la molécula de unión al antí tidina o un aminoácido no natural, o insertar histidi inoácido no natural en la molécula.

Además, la presente invención se refiere a méto ementar la cantidad de antígenos a los que puede un lécula de unión al antígeno, que comprenden sustituir aminoácido en la molécula de unión al antígeno por hi aminoácido no natural, o insertar histidina o un amino ural en la molécula.

En la presente invención también se proporcionan a disociar un antígeno en una célula de una molécula nos un aminoácido en la molécula de unión al antí tidina o un aminoácido no natural, o insertar his inoácido no natural en la molécula.

En la presente invención también se proporcionan a incrementar la capacidad de la molécula de ígeno de eliminar antígenos en plasma, que co tituir al menos un aminoácido en la molécula de ígeno por histidina o un aminoácido no natural, o tidina o aminoácido no natural en la molécula.

El sitio donde tiene lugar la mutación por histidi inoácido no natural (sustitución, inserción, etcétera ia particularmente limitado. Es posible realizar una su una inserción de histidina o un aminoácido no na lquier sitio. Los sitios preferidos para realizar la sust inserción de histidina o un aminoácido no natural inclu mplo, sitios dentro de una región que afecta la capa ón al antígeno de la molécula de unión al antíg manera simultánea con la sustitución o inserció tidina o un aminoácido no natural En la presente invención, cuando la molécula de ígeno es un anticuerpo, los sitios posibles para re titución por histidina o un aminoácido no natural incl mplo, sitios dentro de la secuencia CDR o la s ponsable de la estructura de la CDR de un anticuerp os incluyen, por ejemplo, los sitios que se detalla lante. Las posiciones de aminoácidos están numer erdo con la numeración de Kabat (Kabat EA y colab 91) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Cadena pesada: H27, H31, H32, H33, H35, H50, H 1, H62, H63, H64, H65, H99, H100b y H102 Cadena ligera: L24, L27, L28, L32, L53, L54, L56, 94 Entre los sitios anteriores, H32, H61, L53, L90 y L94 sitios de modificación universales.

Cuando se realiza una sustitución por histtdin inoácido no natural en varios sitios, las combi feridas de sitios de sustitución incluyen, por eje binación de H27, H31 y H35; la combinación de H , H35, H58, H62 y H102; la combinación de L32 y binación de L28, L32 y L53. Además, las combi feridas de sitios de sustitución de las cadenas pesada !uyen las combinaciones de H27, H31, L32, y L53.

Cuando el antígeno es IL-6 (por ejemplo, IL-6 hum os preferibles para la modificación incluyen los icarán más adelante. Sin embargo, los sitios dificación no se hallan particularmente limitados icados.

Cadena pesada: H32, H59, H61 y H99 Cadena ligera: L53, L54, L90 y L94 Cuando el antígeno es el receptor de IL-31 (por ej eptor de IL-31 humano), los sitios preferibles Los métodos de la presente invención pueden apl lquier molécula de unión al antígeno, independíentem de antígeno objetivo Las moléculas de unión al antígeno de la presente i se hallan particularmente limitadas, siempre que p actividad de unión específica por el antígeno de int léculas de unión al antígeno preferidas de la ención incluyen, por ejemplo, sustancias que tienen un unión al antígeno de un anticuerpo. El dominio de ígeno de un anticuerpo incluye, por ejemplo, la C ión variable. Cuando el dominio de unión al antígen icuerpo es la CDR, la molécula de unión al antíge luir las seis CDR de un anticuerpo completo, o una s de ellas. Como alternativa, cuando una molécula de ígeno incluye la CDR como dominio de unión de un an CDR puede incluir una supresión, una sustitución, un una inserción de un aminoácido, o puede ser una CDR región constante de anticuerpo, en la presente inve porcionan métodos para incrementar la cantidad de v une a los antígenos una molécula de unión al antíg prenden modificar (por ejemplo, mediante la su resión, adición y/o inserción de aminoácidos) l stante de anticuerpo en la molécula de unión al antíge Además, cuando la molécula de unión al antígen región constante de anticuerpo, la presente inve iere a métodos para incrementar la cantidad de antíge puede unirse una molécula de unión al antíge prenden modificar (por ejemplo, mediante la su resión, adición y/o inserción de aminoácidos) l stante de anticuerpo en la molécula de unión al antíge Además, cuando la molécula de unión al antígen región constante de anticuerpo, la presente inve iere a métodos para disociar, dentro de una célula, un una molécula de unión al antígeno que se unió rnalizada en una célula, en una forma libre de antíg prenden modificar (por ejemplo, mediante la su resión, adición y/o inserción de aminoácidos) l stante de anticuerpo en la molécula de unión al antíge Además, cuando la molécula de unión al antígen región constante de anticuerpo, la presente inve iere a métodos para incrementar la capacidad de una unión al antígeno de eliminar antígenos en plas prenden modificar (por ejemplo, mediante la su resión, adición y/o inserción de aminoácidos) l stante de anticuerpo en la molécula de unión al antíge En una modalidad preferida, la sustancia de igeno de la presente invención incluye sustancias de igeno que incluyen una región capaz de unirse a Fc internalizadas en las células, las sustancias de igeno que incluyen una región capaz de unirse a FcR resar al plasma a través de la vía de captura de rse indirectamente a FcRn a través de la albúmina, étera.

Los antígenos reconocidos por las moléculas de ígeno, tales como los anticuerpos de interés en los mé presente invención, no se hallan particularmente M os anticuerpos de interés pueden reconocer ígeno. Los anticuerpos cuya farmacocinética ha jorada con los métodos de la presente invención inclu mplo, anticuerpos que reconocen antígenos de m s como proteínas receptoras (receptores unidos a mer eptores solubles) y marcadores de la superficie c icuerpos que reconocen antígenos solubles, tale quinas. Los ejemplos preferidos de los antíg mbrana de la presente invención incluyen prote mbrana. Los ejemplos de antígenos solubles de la ención incluyen proteínas solubles. Los antígenos rec los anticuerpos cuya farmacocinética ha de ser mejo feridos incluyen el receptor de IL-6.

Además, la molécula de unión al antígeno de interé todos de la presente invención incluye moléculas de ígeno que presentan actividad antagónica (moléculas antígeno antagónicas) y moléculas de unión al antíg sentan actividad agónica (moléculas de unión al nicas). En una modalidad preferida, la molécula de ígeno incluye moléculas de unión al antígeno antagó ticular, moléculas de unión al antígeno antagóni onocen antígenos de membrana, tales como recep ígenos solubles, tales como citoquinas. Por ejem lécula de unión al antígeno antagónica que reco eptor inhibe la unión ligando-receptor al unirse al rece ue inhibe la señalización mediada por el receptor.

En la presente invención, la molécula de unión al interés no se halla particularmente limitada, y pu lquier molécula de unión al antígeno. La molécula de sente invención incluyen, por ejemplo, anticuerp ando el anticuerpo a usar es un anticuerpo IgG, el tip se halla limitado, y puede usarse una IgG que pert lquier isotipo (subclase), tal como lgG1, lgG2, lgG3 emás, pueden introducirse mutaciones de aminoáci mplo, M73) en la región constante de cualquier tipos de IgG. Las mutaciones de aminoácidos que roducirse incluyen, por ejemplo y sin limitaciones, aqu encian o reducen la unión al receptor Fcy (Proc Nati S A. 14 de Marzo de 2006; 103( 11 ):4005-10), y aque encian o reducen la unión a FcRn (J Biol Chem. 2 de I 1 ;276(9):6591 -604). Como alternativa, también es rar la unión dependiente del pH seleccionando un stante apropiada, tal como una de lgG2.

Cuando la molécula de unión al antígeno de inter sente invención es un anticuerpo, puede tratarse icuerpo derivado de cualquier animal, tal como un a luyen fragmentos de anticuerpos.

Los "anticuerpos quiméricos" son anticuerpos paran combinando secuencias derivadas de distintos a pecíficamente, el anticuerpo quimérico incluye, por icuerpos que tienen regiones variables (V) de la ada y la cadena ligera de un anticuerpo de ratón, y stantes (C) de la cadena pesada y la cadena liger icuerpo humano.

Los "anticuerpos humanizados", también conocid icuerpos humanos reformados, son anticuerpos dond splantado las regiones de determinación plementariedad (CDR) de un anticuerpo derivado mífero no humano, por ejemplo, un ratón, dentro de un anticuerpo humano. Se conocen métodos para i CDR (Kabat y colaboradores, Sequence of Pro unological Interest (1987), National Institute of thesda, Md.¡ Chotia y colaboradores, Nature (1989) 3 mo antígeno.

Además, los polipéptidos que incluyen fragme icuerpos incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, fra b')2, scFv (Nat Biotechnol. Septiembre de 2005;23( , dominios de anticuerpos (dAb) (WO 2004/0588 3/002609), scFv-Fc (WO 2005/037989), dAb-Fc, y prot ión con Fe. De éstos, las moléculas que incluyen un son capaces de unirse a FcRn, por lo que son apropia r en los métodos que se describen en la presente inve Además, las moléculas de unión al antígeno que earse a ta presente invención pueden ser moléculas anticuerpos. Una molécula similar a un anticuerpo lécula que puede presentar funciones de unión a una etivo (Current Opinión in Biotechnology 2006, 17: rrent Opinión in Biotechnology 2007, 18:1-10; Current Structural Biology 1997, 7:463-469; Protein Scien 14-27), e incluye, por ejemplo, DARPinas (WO 2002/ teína de fusión TNFR-Fc, una proteína de fusión IL1R teína de fusión VEGFR-Fc y una proteína de fusión C t Med. Enero de 2003;9(1 ):47-52;: BioDrugs. 2006;2 . Si estas proteínas receptoras y estas proteínas de f receptor y Fe pueden unirse a las moléculas objetiv ñera dependiente del pH, es posible que una única mol a varias moléculas objetivo.

Más aún, la molécula de unión al antígeno puede teína que es un ligando artificial o una proteína de fu un ligando artificial, que se une a un objetivo y pre eto neutralizador, incluyendo, por ejemplo, IL-6 BO J. 15 de Diciembre de 1994;13(24):5863-70). teína que es un ligando artificial o esta proteína de fu un ligando artificial puede unirse a las moléculas obj manera dependiente del pH, es posible que un lécula se una a varias moléculas objetivo.

Además, los anticuerpos de la presente invención teoría específica, la relación entre el debilitamien acidad de unión al antígeno pH ácido, en comparació ividad pH neutro, la mejora de la farmacocinética y la ígenos en múltiples ocasiones puede explicarse, por o se detalla a continuación.

Por ejemplo, cuando anticuerpo es un anticuerpo qu n antígeno de membrana, el anticuerpo administra rpo se une al antígeno, y luego es tomado por intern los endosomas en las células, junto con el antígeno, d l el anticuerpo se mantiene unido al antígeno. Des icuerpo es translocados hasta los lisosomas, durante l icuerpo se mantiene unido al antígeno, y el antic radado por lisosoma junto con el antígeno. La elimin sma mediado por internalización se denomina eli endiente del antígeno, y esta eliminación ha sido a numerosas moléculas de anticuerpos (Drug Disco ro de 2006; 11 ( 1 -2) :81 -8). Cuando una sola molé La retención relativamente prolongada (eliminación l moléculas de IgG en el plasma se debe a la función es conocido como un receptor de captura de molé . Cuando son captadas en endosomas por pinocit léculas de IgG se unen a los FcRn expresados osomas, bajo la condición ácida de los endosomas. las moléculas de IgG que no se unieron a los F nsferidas a los lisosomas, donde serán degrada léculas de IgG que se han unido a los FcRn son transi superficie de la célula, y regresan nuevamente al pl ociarse de los FcRn bajo la condición neutra del plasm Como alternativa, cuando el antígeno es un antígen a un antígeno soluble, el anticuerpo administrad rpo se une al antígeno y es tomado por las células á unido al antígeno. Muchos anticuerpos tomados ulas son liberados de ellas a través de los FcRn. Sin o los anticuerpos son liberados de las células mien ntras aún están unidos a los antígenos, son transloca somas y son degradados, mientras que los anticue pudieran disociarse de los antígenos en los en rían unirse a los FcRn expresados en los end ecíficamente, los presentes inventores descubrieron icuerpo que se uniera fuertemente a un antígeno en el o que se uniera débilmente al antígeno en el endosom rse a un antígeno en plasma y ser tomado en los en las células, en forma de un complejo con el antíg rnalización; podría disociarse del antígeno en el en go podría unirse al FcRn y sería translocados erficie de la célula; y regresaría nuevamente al plas ado no unido a los antígenos, para neutralizar ígenos unidos a membrana. Además, los presentes in cubrieron que un anticuerpo que tuviera la propi rse fuertemente a los antígenos en el plasma, pero era débilmente a los antígenos en los endosomas ígenos bajo las condiciones de pH del plasma, pero n débilmente a los antígenos bajo las condiciones d endosomas, eran superiores en retención en plasma, una molécula de anticuerpo podía unirse a ígenos.

Los endosomas, que son vesículas de membrana es en el citoplasma de las células eucariotas, ponsables del metabolismo de las macromolécu la ceso desde la membrana hasta los lisosomas. Se ha i el pH en los endosomas generalmente es un pH á re 5.5 y 6.0 (Nat Rev Mol Cell Biol. Febrero de 2004; . Por otro lado, se sabe que el pH en el pí cticamente neutro (normalmente, pH 7.4).

Por lo tanto, una molécula de unión al antíge ividad de unión al antígeno pH ácido es más débil ividad de unión al antígeno pH neutro se une al antíge sma, que tiene un pH neutro, es tomada por las c Además, en ia presente invención se prop léculas de unión ai antigeno cuya actividad de igeno a un pH de entre 4.0 y 6.5 es menor que a u re 6.7 y 10.0, preferiblemente moléculas de unión al a actividad de unión al antígeno a un pH de entre 5.0 nor que a un pH de entre 7.0 y 8.0. Especifícam éculas de unión al antígeno cuya actividad de igeno a un pH de entre 4.0 y 6.5 es menor que a u re 6.7 y 10.0 incluyen, por ejemplo, moléculas de igeno cuya actividad de unión al antígeno pH 5.8 es m 7.4. Las moléculas de unión al antígeno cuya acti ón al antígeno pH 5.8 es menor que pH 7.4 también cribirse como moléculas de unión al antígeno cuya unión ai antígeno pH 7.4 es mayor que pH 5.8.

Con relación a las moléculas de unión al antíge sente invención cuya actividad de unión al antígeno p nor que pH 7.4, siempre que ia actividad de unión al ás de su actividad pH 5.8. Una modalidad más preferi lécula de unión al antígeno incluye moléculas de ígeno cuya actividad de unión al antígeno pH 7.4 es di ás su actividad pH 5.8. Una modalidad aún más pref molécula de unión al antígeno incluye moléculas de ígeno cuya actividad de unión al antígeno pH 7.4 es ás su actividad pH 5.8.

Específicamente, en una modalidad preferida, la unión al antígeno de la presente invención tiene una unión al antígeno pH 5.8 que es menor que pH 7.4, valor de KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4), que es la relación ent antígeno pH 5.8 y la KD a pH 7.4, es preferiblemente s preferiblemente 10 o más, y aún más preferibleme s. El límite superior del valor de KD(pH 5.8)/KD(pH 7 ia particularmente limitado, y puede ser cualquier v mplo, 400, 1000 ó 10000, siempre que sea posible re ducción usando tecnologías conocidas por aquellos pH 5.8)/Kd(pH 7.4) no se halla particularmente lim de ser cualquier valor, por ejemplo, 50, 100 ó 200, sea posible realizar la producción usando tec ocidas por aquellos expertos en la técnica.

Las condiciones distintas del pH para medir la acti ón al antígeno pueden ser seleccionadas apropiadam ellos expertos en la técnica, y las condiciones no s ticularmente limitadas. Sin embargo, las mediciones ctuarse, por ejemplo, bajo condiciones de amortiguad C, como se describe en los ejemplos. Además, la acti ón al antígeno de una molécula de unión al antíge erminarse con métodos conocidos por aquellos expert nica, por ejemplo, usando Biacore T100 (GE Healt ejantes, como se describe en los ejemplos.

Se presume que tal molécula de unión al antígeno débilmente a un antígeno pH ácido, se disocia fácil ígeno bajo la condición ácida del endosoma, y que, ígenos varias veces. Como resultado, las moléculas antígeno cuya actividad de unión al antígeno a un pH y 6.5 es menor que a un pH de entre 6.7 y 1 eriores en retención en plasma.

En una modalidad preferida, la molécula de ígeno cuya actividad de unión al antígeno pH 5.8 es m 7.4 incluye moléculas de unión al antígeno en don tituido al menos un aminoácido en la molécula de ígeno por histidina o un aminoácido no natural, o en insertado al menos una histidina o un aminoácido no sitio en donde se introduce la mutación por histidi inoácido no natural no se halla particularmente lir de ser cualquier sitio, siempre y cuando la actividad antígeno pH 5.8 sea más débil que pH 7.4 (el valor d )/KD(pH 7.4) es mayor, o el valor de Kd(pH 5.8)/Kd(p yor), en comparación con la situación previa a la su ejemplos incluirán las regiones variables y las CD eriarse dos o más aminoácidos. Más aún, aparte tituciones por histidina o aminoácidos no natural erción de histidina o aminoácidos no naturales, tambi ctuarse de manera simultánea la supresión, adición, i sustitución de otros aminoácidos, y proced ejantes. Las sustituciones por histidina o un amino ural, o la inserción de histidina o un aminoácido n dén efectuarse al azar, usando un método como la b histidina, en donde, en un análisis de alanina cono ellos expertos en la técnica, se usa histidina en niña. Las moléculas de unión al antígeno cuyo valor d )/KD(pH 7.4) ó Kd(pH 5.8)/Kd(pH 7.4) es a paración con la situación previa a la mutación, eccionarse entre moléculas de unión al antígeno en introducido mutaciones por histidina o aminoácidos n zar.

Las moléculas de unión al antígeno preferi tidina o un aminoácido no natural, tiene una actividad antígeno que es equivalente a la de la molécula de ígeno antes de la mutación por histidina o un amino ural" denota que, cuando la actividad de unión al ant molécula de unión al antígeno antes de la muta tidina o un aminoácido no natural se toma como 1 ividad de unión al antígeno de la molécula de ígeno después de la mutación por histidina o un amino ural es al menos 10% o más, preferiblemente 50% o feriblemente 80% o más, y aún más preferiblement s. La actividad de unión al antígeno pH 7.4 despu tación por histidina o un aminoácido no natural p yor que la actividad de unión al antígeno pH 7.4, ant tación por histidina o un aminoácido no natural. C ividad de unión al antígeno de la molécula de ígeno se reduce debido a la sustitución o la inse tidina o aminoácido no natural, la actividad de resión, adición y/o inserción de uno o más amin pués de la sustitución por histidina o la inserción de hi Además, cuando la molécula de unión al antígeno tancia que incluye una región constante de anticuerpo dalidad preferida de la molécula de unión al antíge ividad de unión al antígeno pH 5.8 es menor que pH 7 sente invención se incluyen métodos para modif iones constantes de anticuerpos contenidas en las m unión al antígeno. Los ejemplos específicos de stantes de anticuerpos después de la modificación regiones constantes que se describen en los ejemplos Cuando la actividad de unión al antígeno de la sust ón al antígeno pH 5.8 es más débil que la activida ando el valor de KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4) es mayor) d de los métodos descritos con anterioridad, y ejantes, generalmente es preferible que el valor d )/KD(pH 7.4) sea el doble o más, más preferible ígeno agónica o antagónica. Las moléculas de ígeno preferidas de la presente invención inclu mplo, moléculas de unión al antígeno antagónicas. En molécula de unión al antígeno antagónica i alización intracelular mediada por receptores al i ón entre un ligando (agonista) y el receptor.

Además, en la presente invención se prop icuerpos en donde un aminoácido en al menos un siti allará más adelante ha sido sustituido por histidi inoácido no natural. Las posiciones de aminoácidos s re la base de la numeración de Kabat (Kaba aboradores, (1991) Sequences of Proteins of Immu erest, NIH).

Cadena pesada: H27, H31, H32, H33, H35, H50, H 1, H62, H63, H64, H65, H99, H100b y H102 Cadena ligera: L24, L27, L28, L32, L53, L54, L56, 94 , H64, H65, H100b y H102 Cadena ligera: L24, L27, L28, L32, L53, L56, L90, L Cuando se realiza una sustitución por histidin inoácido no natural en varios sitios, las combi feridas de sitios de sustitución incluyen, por eje binación de H27, H31 y H35; la combinación de H , H35, H58, H62 y H102; la combinación de L32 y binación de L28, L32 y L53. Además, las combi feridas de sitios de sustitución de las cadenas pesada luyen las combinaciones de H27, H31, L32, y L53.

Cadena pesada: H32, H59, H61 y H99 Cadena ligera: L53, L54, L90 y L94 luyen las proteínas receptoras mencionadas con ant ceptoras unidos a membrana o receptores solubles), a membrana, tales como marcadores de la superficie c ígenos solubles, tales como citoquinas, por ejemplo, I 3, IL-4, IL-5( IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, I IL-23, el receptor de IL-2, el receptor de IL-6, el rec M, gp130, el receptor de IL-5, CD40, CD4, eopontina, CRTH2, CD26, PDGF-D, CD20, el miotáctico de los monocitos, CD23, TNF-a, HM grina a4, ICAM-1, CCR2, CD11a, CD3, IFN5, BLyS, F-ß, CD52 y receptor de IL-31.

Los antígenos particularmente preferidos incl eptor de IL-6.

Las moléculas de unión al antígeno de la presente i sido descritas con anterioridad.

En una modalidad preferida de la presente inven léculas de unión al antígeno incluyen anticuerp icuerpos humanos, anticuerpos de rata, anticuerpos d icuerpos de cabra, anticuerpos de camello, y otros. anticuerpos pueden ser, por ejemplo, los ant méricos descritos con anterioridad, y en particular, ant dificados con sustituciones en su secuencia, tal icuerpos humanizados. Los anticuerpos también pu anticuerpos biespecíficos descritos con ante ductos de la modificación de anticuerpos a los que s do diversas moléculas, polipéptidos, incluyendo fragm icuerpos, y anticuerpos con cadenas de azúcares modi Es conocida la generación de anticuerpos quiméric o de un anticuerpo quimérico de humano-ratón, por de unirse un ADN que codifica una región V de un a n ADN que codifica una región C de un anticuerpo h conjunto puede insertarse en un vector de exp roducirse en un huésped para producir el anticuerpo qu Los "anticuerpos humanizados" también se conoc mbién se conocen tecnologías generales de recom ética apropiadas para este propósito (ver la Soli tente Europea EP 125023 y WO 96/02576). Los ant anizados pueden producirse con métodos conoci mplo, puede determinarse la CDR de un anticuerpo de de unirse un ADN que codifica un anticuerpo, de m ener la CDR unida en la región de marco (FR) icuerpo humano. Después, los anticuerpos hum dén producirse usando un sistema en donde se usen expresión convencionales. Estos ADN pueden sintetiz R, usando como cebadores diversos oligonu parados de manera que presenten porciones erpongan con los extremos de las CDR y las FR todo que se describe en WO 98/13388). Se seleccion icuerpos humanos unidos a través de CDR, de maner R formen un sitio de unión al antígeno apropiado, esario, pueden sustituirse aminoácidos en las FR de I olaboradores, J. Mol. Biol. (1987) 196: 901-17) y porci ticipan en las interacciones VH-VL (EP 239400).

Cuando los anticuerpos de la presente invenc icuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados, las de estos anticuerpos preferiblemente derivan de ant anos. Por ejemplo, puede usarse Cy1, Cy2, Cy3 y Cy ena H, y puede usarse CK y CX para la cadena L. Más necesario, pueden introducirse mutaciones de aminoá región C del anticuerpo humano para incrementar o dis ón al receptor de Fcy o FcRn, o para mejorar la esta productividad del anticuerpo. Un anticuerpo quiméri sente invención preferiblemente incluye una región va anticuerpo derivado de un mamífero no humano y un stante derivada de un anticuerpo humano. Por otro icuerpo humanizado preferiblemente incluye CDR icuerpo derivado de un mamífero no humano y FR y re ivadas de un anticuerpo humano. Las regiones co anizados tampoco se hallan particularmente limit dén derivar de un anticuerpo de cualquier isotipo.

Las regiones variables y constantes de los ant méricos y humanizados de la presente invención dificarse mediante la supresión, sustitución, inser ción de aminoácidos, y por medio de otros proced ejantes, siempre que los productos presenten la espe unión de los anticuerpos originales.

Como se reduce la inmunogenicidad en el cuerpo cree que los anticuerpos quiméricos y humanizados usan secuencias derivadas de seres humanos son úti inistrarlos a seres humanos con fines terapé pósitos semejantes.

Los anticuerpos de la presente invención pueden pr cualquier método. Por ejemplo, los anticuerpos cuya unión al antígeno pH 5.8 es originalmente mayor o cor u actividad pH 7.4 pueden modificarse por medios art Cuando se sustituyen aminoácidos por histidina icuerpo, pueden usarse secuencias conocidas uencia de aminoácidos de cadena H o cadena icuerpo, antes de la introducción de las mutacio tidina, o también pueden usarse secuencias de aminoá icuerpos obtenidos recientemente de acuerdo con ocidos por aquellos expertos en la técnica. Por eje icuerpos pueden obtenerse a partir de una biblio icuerpos, o pueden obtenerse clonando genes que icuerpos a partir de hibridomas productores de ant ocionales.

Con relación a las bibliotecas de anticuerpos, ya se ias bibliotecas de anticuerpos, y también se conocen a producir bibliotecas de anticuerpos. Por cons el!os expertos en la técnica pueden obtener apropia liotecas de anticuerpos. Por ejemplo, con rela liotecas de anticuerpos en fagos, puede consul más, es posible usar métodos conocidos, tales como donde se usan células eucariotas como bibliotec 15393) y métodos de presentación en ribosomas. bién se conocen tecnologías para obtener ant anos por medio de análisis con bibliotecas de ant anos. Por ejemplo, las regiones variables de los ant anos pueden expresarse en la superficie de fag icuerpos de cadena simple (scFv) usando mét sentación en fagos, y pueden seleccionarse los fago n a los antígenos. Con el análisis genético de l eccionados, es posible determinar las secuencias de ifican las regiones variables de los anticuerpos hum de unirse a los antígenos. Una vez que se han dét secuencias de ADN de los scFv que se unen a los a dén producirse vectores de expresión apropiados e de estas secuencias, para obtener anticuerpos h os métodos son bien conocidos, y pueden consultars vencionales, a lo que sigue la fusión de las células ultantes con células progenitoras conocidas, de acu todos de función convencionales, la búsqueda de ductoras de anticuerpos monoclonales (hibrido erdo con métodos de búsqueda convencionales, la si Nc de regiones variables de anticuerpos (regiones V) ARNm de los hibridomas obtenidos usando tran ersa, y la unión de tal ADNc con ADN que codifica las stantes deseadas de los anticuerpos (regiones C).

Más específicamente, los antígenos sensibilizado ener los genes de anticuerpos descritos con anteriori ifican las cadenas M y las cadenas L, incluyen a pletos con inmunogenicidad y antígenos inco luyendo haptenos y semejantes, sin antigenicid bargo, los antígenos sensibilizadores no se limitan mpíos. Por ejemplo, es posible usar proteínas com tidos parciales de interés. Además, se sabe stein y colaboradores (G. Kohler y C. Milstein, ymol. 1981, 73: 3-46), y semejantes. Cua unogen icidad de un antígeno sea baja, la inmunizaci lizarse después de unir el antígeno con una macro presente inmunogenicidad, tal como la albúmin rnativa, de ser necesario, los antígenos pue vertidos en antígenos solubles al unirlos con otras m ando como antígenos se usan moléculas transmembra o antígenos de membrana (por ejemplo, receptores), rse porciones de las regiones extracelulares de los a membrana como fragmentos, o pueden usarse células erficie se expresan las moléculas transmembran unógenos.

Las células productoras de anticuerpos pueden o unizando los animales con antígenos sensibil opiados, como se describió con anterioridad. Como alt células productoras de anticuerpos pueden pr ertorios de anticuerpos humanos, y pueden o icuerpos humanos usando estos animales (ver WO 9 ndez y colaboradores, Nat. Genet, 1997, 15: 146-56). uso de estos animales transgénicos, por ejem icuerpos humanos que presentan actividad de uni ígenos deseados pueden obtenerse mediante la sensib vitro de linfocitos humanos con los antígenos deseado ulas que expresan los antígenos deseados, a lo que ión de los linfocitos sensibilizados con células de s como U266 (ver la Publicación de Solicitud de onesa Kokoku N° (JP-B) H01-59878 (solicitud de onesa aprobada, publicada para oposición)). Ade icuerpos humanos deseados pueden obtenerse inm los antígenos deseados animales transgénicos que c repertorio completo de genes de anticuerpos humanos 12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 96/3409 3373S).

Freund, en varias ocasiones durante un período tro y 21 días. La producción de anticuerpos puede con iendo la titulación del anticuerpo de interés en s mal, usando métodos convencionales.

Las células productoras de anticuerpos obtenidas a ocitos o animales inmunizados con un antígeno dén fusionarse con células de mieloma para ridomas, mediante el uso de agentes de fusión conven r ejemplo, polietilenglicol) (Goding, Monoclonal An nciples and Practice, Academic Press, 1986, 59-103). necesario, las células de hibridomas podrán ser cult arroliadas, y será posible medir la especificidad de u icuerpo producido por estos hibridomas usando mét lisis conocidos, tales como la inmunoprecipita ioinmunoensayo (RIA) y el ensayo inmunosorbente imas (ELISA). Después, los hibridomas product icuerpos de interés cuya especificidad, afinidad o icuerpos). También es posible clonar los genes a Nm usando RT-PCR. Las inmunoglobulinas se clasi co clases diferentes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. A su v ses son divididas en diversas subclases (isotip mplo, lgG-1, lgG-2, lgG-3 e lgG-4, lgA-1 e l ejantes). Las cadenas H y las cadenas L usada sente invención para producir anticuerpos no s ticularmente limitadas, y pueden originarse en anticue tenecen a cualquiera de estas clases o súbela bargo, en particular se prefiere la IgG.

En la presente documentación, es posible modi es que codifican la cadena H y los genes que cod ena L usando tecnologías de ingeniería genéti icuerpos modificados genéticamente, tales co icuerpos quiméricos y los anticuerpos humanizados, o modificados por medios artificiales con el fin de re unogenicidad heteróloga y efectos semejantes co icuerpos quiméricos pueden obtenerse uniendo un ifica la región variable de un anticuerpo de ratón con ifica la región constante de un anticuerpo humano, in conjunto en un vector de expresión, e introduciendo un huésped para producir el anticuerpo. Un a anizado, también denominado un anticuerpo ormado, puede sintetizarse por PCR utilizando onucleótidos producidos de manera que presenten p se superpongan con los extremos de las secuencias eñadas para unir las regiones de determinación plementariedad (CDR) de un anticuerpo de un ma ano, tal como el ratón. El ADN resultante puede uni N que codifica la región constante de un anticuerpo hu N puede insertarse en un vector de expresión, y de introducirse en un huésped para producir el anticu 239400 y WO 96/02576). Las FR de anticuerpos hum án unidas a través de las CDR se seleccionan cuand lógicas, por ejemplo, la unión al antígeno. En la ención, estas modificaciones pueden efectuarse de métodos como la mutagénesis dirigida a sitios es r, por ejemplo, Kunkel (1910.0) Proc. Nati. Acad. Sci. ), la mutagénesis por PCR y la mutagénesis con cas eral, los anticuerpos mutantes cuyas propiedades b sido mejoradas presentan una homología y/o una si el de su secuencia de aminoácidos de 70% o m feriblemente 80% o más, y aún más preferiblement s (por ejemplo, 95% o más, 97%, 98% o 99%), cuand para con la secuencia de aminoácidos de la región anticuerpo original. En la presente documenta ología y/o la similitud de secuencia se define como la re los residuos de aminoácidos que son homólogos ( ales) o similares (residuos de aminoácidos clasificad mo grupo, sobre la base de las propiedades genérale enas laterales de los aminoácidos) a los resid (2) hidrof ílícos neutros: asparagina, glutamina, onina y serina; (3) ácidos: ácido aspártico y ácido glutámico; (4) básicos: arginina, histidina y Usina; (5) residuos que afectan la orientación de la caden rolina; y (6) aromáticos: tirosina, triptófano y fenilalanina.

En general, en total hay seis regiones de determin complementariedad (CDR, regiones hipervariables) p las regiones variables de la cadena H y la cadena L, la ractúan unas con otras para formar el sitio de ígeno de un anticuerpo. También se sabe que un iable sola puede reconocer y unirse a un antígeno, a idad es menor que la afinidad del sitio de unión comp siguiente, los genes de anticuerpos que codifican la C la cadena L de la presente invención pueden gmentos, cada uno de los cuales podrá incluir la cade CDR o una FR. En general, las modificaciones iduos de aminoácidos en las CDR pueden reducir la c unión al antígeno. Por lo tanto, los residuos de ami opiados para la "modificación" de acuerdo con la ención preferiblemente se seleccionan, sin limitacion iduos de aminoácidos en el FR. Es posible sel inoácidos en una CDR siempre y cuando se haya co la modificación no reducirá la capacidad de unió rnativa, mediante el uso de bases de datos pú mentos semejantes, aquellos expertos en la técnica ener secuencias que pueden usarse como la FR de I iable de un anticuerpo de un organismo, tal como un h ratón.

Además, en la presente invención se proporciona codifican los anticuerpos de la presente invención. L codifican los anticuerpos de la presente invención pu lquier gen, y pueden ser ADN, ARN, análogos d ducción in vitro e in vivo disponibles para la produ ipéptidos. Los sistemas de producción in vitro inclu mplo, sistemas de producción donde se usan ariotas o células procariotas.

Las células eucariotas que pueden usarse como sped incluyen, por ejemplo, células animales, etales y células fúngicas. Las células animales ulas de mamíferos, por ejemplo, CHO (J. Exp. Med : 94.0), COS, HEK293, 3T3, mieloma, BHK (riñon de é), HeLa y Vero; células de anfibios, tales como o nopus laevis (Valle y colaboradores, Nature (1981) 2 ); y células de insectos, tales como Sf9, Sf21 feriblemente, se usan las células CHO-DG44, CHO S7, HEK293 y BHK para expresar los anticuerpo sente invención. Entre las células animales, las célu particularmente preferibles para la expresión a gra vectores pueden introducirse en las células hués anticuerpos de la presente invención. Con relaci ulas fúngicas, los sistemas de expresión de ocidos son aquellos en donde se usan células de leva mplo, células del género Saccharomyces (tale ccharomyces cerevisiae y Saccharomyces pombe) y c gos filamentosos, por ejemplo, del género Aspergill o Aspergillus niger). Estas células pueden usar spedes para producir los anticuerpos de la ención.

En los sistemas de producción procariotas puede ulas bacterianas. Con relación a las células bacteri ocen los sistemas de producción en donde se usa tilis, además de los sistemas de producción en dond coli que se describieron con anterioridad. Estos dén usarse para producir los anticuerpos de la ención. étodos de filtrado> ención también se proporcionan métodos para fil écula de unión al antígeno que se disocia de una célu ígeno unido desde el exterior de la célula. En la ención también se proporcionan métodos para fil lécula de unión al antígeno que está unida a un antig o internalizada en una célula, y que luego ha sido lib célula en una forma libre de antígeno. En la presente i ibién se proporcionan métodos para filtrar una mol ón al antígeno que presenta una capacidad mejo inar antígenos en plasma. Además, en la presente i bién se proporcionan métodos para filtrar moléculas antígeno que son particularmente útiles cuando se o composiciones farmacéuticas.

Específicamente, en la presente invención se prop todos para filtrar moléculas de unión al antíge prenden las siguientes etapas: (a) determinar la actividad de unión al antígeno ividad de unión al antígeno de la molécula de igeno a un pH de entre 6.7 y 10.0 no se halla particu tada, siempre y cuando se trate de una actividad de igeno a un pH de entre 6.7 y 10.0. Sin embargo, por actividad de unión al antígeno preferida es una acti ón al antígeno a un pH de entre 7.0 y 8.0, y una acti ón al antígeno más preferida es una actividad de igeno pH 7.4. Además, la actividad de unión al antíge lécula de unión al antígeno a un pH de entre 4.0 y 6 ia particularmente limitada, siempre y cuando ividad de unión al antígeno a un pH de entre 4.0 y bargo, por ejemplo, una actividad de unión ai ferida es una actividad de unión al antígeno a un pH y 6.5, y una actividad de unión al antígeno más pre actividad de unión al antígeno pH 5.8 o pH 5.5.

La actividad de unión al antígeno de una molécula antígeno puede determinarse con métodos conoci aquellos expertos en la técnica, por ejemplo, usando healthcare), Scatchard plot o FACS.

En la presente documentación, "la etapa de sele molécula de unión al antígeno cuya actividad de ígeno a un pH de entre 6.7 y 10.0 es mayor que a u re 4.0 y 6.5" tiene el mismo significado que "la ección de una molécula de unión al antígeno cuya acti ón al antígeno a un pH de entre 4.0 y 6.5 es menor de entre 6.7 y 10.0" La diferencia entre la actividad de unión al antígeno entre 6.7 y 10.0 y la actividad a un pH de entre 4.0 y ia particularmente limitada, siempre y cuando la acti ón al antígeno a un pH de entre 6.7 y 10.0 sea mayor de entre 4.0 y 6.5. Sin embargo, la actividad de ígeno a un pH de entre 6.7 y 10.0 preferiblemente es más, más preferiblemente diez veces o más, y feriblemente 40 veces o más que la actividad de (c) obtener la molécula de unión al antígeno disoci condición con un pH de entre 4.0 y 6.5.

Además, en la presente invención también se prop todos para filtrar moléculas de unión al antíge prenden las siguientes etapas: (a) seleccionar una molécula de unión al antígeno q a un antígeno bajo una condición con un pH de en ; (b) unir la molécula de unión al antígeno selecciona n antígeno bajo una condición con un pH de entre 6.7 (c) obtener la molécula de unión al antígeno que se ntígeno bajo la condición con un pH de entre 6.7 y 10.

Además, en ia presente invención también se prop todos para filtrar moléculas de unión al antíge prenden las siguientes etapas: (a) unir una molécula de unión al antígeno a un Las etapas (a) a (d) pueden repetirse dos o más ve siguiente, en la presente invención se proporcio todos que se describieron con anterioridad, los cuales luyen la etapa de repetir las etapas (a) a (d) dos o má cantidad de repeticiones de las etapas (a) a (d) no ticularmente limitada. Sin embargo, la cantidad gene diez o menos.

Además, en la presente invención también se prop todos para filtrar moléculas de unión al antíge prenden las siguientes etapas: (a) seleccionar una molécula de unión al antígeno q a un antígeno bajo una condición con un pH de en ; (b) unir la molécula de unión al antígeno selecciona n antígeno bajo una condición con un pH de entre 6.7 (c) obtener la molécula de unión al antígeno que se ntígeno bajo la condición con un pH de entre 6.7 y 10. ticularmente limitada. Sin embargo, la cantidad gene diez o menos.

Cuando se usa una biblioteca de fagos o el ejantes en los métodos de filtrado de la presente inve pa de amplificación del gen que codifica la molécula antígeno también puede ser un etapa de amplific os.

En los métodos de la presente invención, la uni lécula de unión al antígeno y el antígeno puede efect lquier estado, sin limitaciones particulares. Por eje ón de la molécula de unión al antígeno y el antígen ctuarse poniendo en contacto un antígeno con una mol ón al antígeno inmovilizada, o poniendo en conta lécula de unión al antígeno con un antígeno inmo mo alternativa, la unión de la molécula de unión al an antígeno puede efectuarse poniendo en contacto el an molécula de unión al antígeno en una solución. primer pH de la columna, bajo una condición con el ; y (c) obtener la molécula de unión al antígeno extraíd Además, en la presente invención también se prop todos para filtrar moléculas de unión al antíge ividad de unión a un primer pH es menor que a un seg comprenden las siguientes etapas: (a) hacer pasar una molécula de unión al antígeno una columna de antígenos inmovilizados bajo una c el primer pH; (b) recolectar ia molécula de unión al antígeno extr se unió a la columna en la etapa (a); (c) unir la molécula de unión al antígeno recolecta na columna bajo la condición del segundo pH; y (d) obtener la molécula de unión al antígeno un umna en la etapa (c).

Además, en la presente invención también se prop no (c) amplificar el gen que codifica la molécula de ígeno extraído; y (d) obtener la molécula de unión al antígeno extraíd Las etapas (a) a (c) pueden repetirse dos o más ve siguiente, en la presente invención se proporcio todos que se describieron con anterioridad, los cuales luyen la etapa de repetir las etapas (a) a (c) dos o má cantidad de repeticiones de las etapas (a) a (c) no ticularmente limitada. Sin embargo, la cantidad gene diez o menos.

En la presente invención, cada uno del primer y el puede ser cualquier pH, siempre que no sean idént combinación preferida del primer y el segundo mplo, el primer pH es de entre 6.7 y 10.0, y el segun entre 4.0 y 6.5; en una combinación más preferida, es de entre 7.0 y 8.0, y el segundo pH es de entre 5.5 una combinación aún más preferida, el primer pH es todos de la presente invención pueden ser cualquier unión al antígeno. Por ejemplo, es posible usar las m unión al antígeno descritas con anterioridad en la bús presente invención. Por ejemplo, es posible filtrar molé ón al antígeno que incluyen secuencias naturales o IT unión al antígeno que incluyen secuencias de aminoác tituciones. Las moléculas de unión al antígeno prefer buscan en la presente invención incluyen, por léculas de unión al antígeno en donde se ha sust nos un aminoácido por histidina o se ha insertado histidina. El sitio para introducir la sustitución por hi inserción de histidina no se halla particularmente li de tratarse de cualquiera. Además, la sustitución por la inserción de histidina pueden introducirse en un dén introducirse en dos o más sitios. Además, las m unión al antígeno preferidas que se buscan en la ención incluyen, por ejemplo, moléculas de unión al inoácido en la molécula de unión al antígeno por his ertar al menos una histidina en la molécula de ígeno.

En los métodos de filtrado de la presente invención rse aminoácidos no naturales en lugar de histidina. E presente invención también puede ponerse en mplazando la histidina mencionada con anteriori inoácidos no naturales.

Más aún, los métodos de filtrado de la presente i ibién pueden comprender la etapa de modifi inoácidos de las regiones constantes de los anticuerpo Las sustancias de unión al antígeno que pueden filtr métodos de filtrado de la presente invención pararse de acuerdo con cualquier método. Por eje ible usar anticuerpos preexistentes, bibliotecas pree bliotecas con modificaciones en función del pH, y sem icuerpos y bibliotecas preparados a partir de hi Con los métodos de filtrado de la presente invenció enerse moléculas de unión al antígeno que se une es a los antígenos, por lo que son superiores en rete sma. Por consiguiente, los métodos de filtrado de la ención pueden usarse como métodos de filtrado para léculas de unión al antígeno que son superiores en r plasma.

Además, con los métodos de filtrado de la ención pueden obtenerse moléculas de unión al antíg unen dos o más veces a los antígenos cua inistradas en animales, tales como humanos, ra nos. Por consiguiente, los métodos de filtrado de la ención pueden usarse como métodos de filtrado para léculas de unión al antígeno que se unen dos o más antígenos.

Adicionalmente, con los métodos de filtrado de la ención pueden obtenerse moléculas de unión al antíg icuerpo neutralizados los métodos de filtrado de la ención pueden usarse como métodos de filtrado para léculas de unión af antígeno que pueden neutrali ígenos, en comparación con la cantidad de sitios de ígeno de las moléculas de unión al antígeno.

Además, con los métodos de filtrado de la ención pueden obtenerse moléculas de unión al antíg capaces de disociarse en una célula de un antíge de el exterior de la célula cuando son administr males, tales como humanos, ratones o mon siguiente, los métodos de filtrado de la presente i dén usarse como métodos de filtrado para obtener m unión al antígeno que son capaces de disociarse en u un antígeno unido desde el exterior de la célula.

Adicionalmente, con los métodos de filtrado de la ención pueden obtenerse moléculas de unión al antíg unen a un antígeno y son internalizadas en una célul ención pueden obtenerse moléculas de unión al antíg miten eliminar rápidamente los antígenos en plasma administradas en animales, tales como humanos, r nos. Por lo tanto, los métodos de filtrado de la ención pueden usarse como métodos de filtrado para léculas de unión al antígeno con una capacidad incre ta) de eliminar antígenos en plasma.

Adicionalmente, se espera que estas moléculas de ígeno sean especialmente superiores como fármacos, permiten reducir la dosis y la frecuencia de administr pacientes, lo que permite reducir la dosis to siguiente, los métodos de filtrado de la presente rse como métodos para filtrar moléculas de unión al han de usarse como composiciones farmacéuticas.

Además, en la presente invención se prop liotecas cuyo contenido de histidina se halla incremen paración con las bibliotecas originales. Las bibliote orporarse 20 tipos de códigos triples (trinucleótid ifican 20 tipos de aminoácidos, en una frecuenci ndo se sintetizan los ácidos nucleicos (J Mol Biol rero de 2008; 376(4): 1182-200). Como resultado, la tada para la biblioteca puede prepararse de man tenga 20 tipos de aminoácidos con una probabilidad i cuencia de la histidina en la posición mutada para la b de incrementarse aumentando la proporción de trinu codifican histidina, en comparación con los 20 inoácidos restantes en la síntesis. étodos para producir moléculas de unión al antí en La presente invención proporciona métodos para léculas de unión al antígeno cuya actividad de ígeno al pH endosómico es menos que al pH del pí sente invención también proporciona métodos para léculas de unión al antígeno que son superiores en plasma. La presente invención también proporciona lécula de unión al antígeno a un valor de pH 4.0 a pH (c) seleccionar una molécula de unión al antíge ividad de unión al antígeno a un valor de pH 6.7 a pH yor que a un valor de pH 4.0 a pH 6.5; (d) obtener el gen que codifica la molécula de ígeno seleccionado en (c); y (e) producir la molécula de unión al anttgeno usand enido en (d).

La presente invención también proporciona méto ducir moléculas de unión al antígeno, que compre pas de: (a) unir una molécula de unión al antígeno a un an valor de pH 6.7 a pH 10.0; (b) dejar asentar la molécula de unión al antígeno ígeno de (a) bajo la condición de pH 4.0 a pH 6.5; (c) recolectar la molécula de unión al antígeno ocia bajo la condición de pH 4.0 a pH 6.5; al antígeno bajo la condición de pH 4.0 a pH 6.5; (b) unir el antígeno bajo la condición de pH 6.7 a p olécula de unión al antígeno seleccionado en (a); (c) recolectar la molécula de unión al antígeno que ígeno bajo la condición de pH 6.7 a pH 10.0; (d) obtener el gen que codifica la molécula de ígeno recolectada en (c); y (e) producir la molécula de unión al antígeno usand enido en (d).

Además, la presente invención proporciona méto ducir moléculas de unión al antígeno, que compre pas de: (a) unir una molécula de unión al antígeno a un o la condición de pH 6.7 a 10.0; (b) dejar asentar la molécula de unión al antígen ó al antígeno de (a) bajo la condición de pH 4.0 a pH 6 (c) recolectar la molécula de unión al antígeno Las etapas (a) a (d) se pueden repetir dos o más ve tanto, la presente invención proporciona los métodos eriormente, que además comprenden la etapa de re pas (a) a (d) dos o más veces. En número de vece iten las etapas (a) a (d) no está particularmente limi bargo, en general es de diez veces o menos.

Adicionalmente, la presente invención proporciona a filtrar y seleccionar moléculas de unión al antíg prenden las etapas de: (a) seleccionar una molécula de unión al antígeno q al antígeno bajo la condición de pH 4.0 a pH 6.5; (b) unir el antígeno bajo la condición de pH 6.7 a p molécula de unión al antígeno seleccionado en (a); (c) recolectar la molécula de unión al antígeno que ígeno bajo la condición de pH 6.7 a pH 10.0; (d) amplificar el gen que codifica la molécula de ígeno disociada; pas (a) a (d) dos o más veces. En número de vece iten las etapas (a) a (d) no está particularmente limi bargo, en general es de diez veces o menos.

Adicionalmente, la presente invención proporciona a producir moléculas de unión al antígeno cuya acti ón a un primer pH es mayor que a un segundo prenden las etapas de: (a) unir la molécula de unión al antígeno a una ovilizada con antígeno bajo la primera condición de p (b) eluir la molécula de unión al antígeno, que está columna bajo la primera condición de pH de la colu segunda condición de pH; (c) recolectar la molécula de unión al antígeno extra (d) obtener el gen que codifica la molécula de ígeno recolectada en (c); y (e) producir la molécula de unión al antígeno usand enido en (d). segunda condición de pH; (c) amplificar el gen que codifica la molécula de ígeno extraído; (d) recolectar la molécula de unión al antígeno extra (e) obtener el gen que codifica la molécula de ígeno recolectada en (d); y (f) producir la molécula de unión al antígeno usand enido en (e).

Las etapas (a) a (c) se pueden repetir dos o más ve tanto, la presente invención proporciona los métodos eriormente, que además comprenden la etapa de re pas (a) a (c) dos o más veces. En número de vece iten las etapas (a) a (c) no está particularmente limi bargo, en general es de diez veces o menos.

Cuando se usa una biblioteca de fagos o semejant todos de producción de la presente invención, la plificar el gen que codifica la molécula de unión al liotecas (bibliotecas con un alto contenido de his inoácidos no naturales, bibliotecas con introduc tidina o aminoácidos no naturales en sitios espe ejantes) preparadas por introducción de mutaci tidina o mutaciones de aminoácidos no naturales icuerpos y las bibliotecas que se describieron anterio ejantes.

En los métodos de producción descritos anterior ividad de unión al antígeno de la molécula de ígeno a un valor de pH 6.7 a pH 10.0 no está particu itada, en tanto la actividad de unión al antígeno ervada a un pH entre pH 6.7 y pH 10.0. Una actividad antígeno preferida es la observada a un pH de entre 8.0, y una actividad de unión al antígeno más preferí ervada a un valor de pH de 7.4. Como alternativa, la unión al antígeno de la molécula de unión al antíge or de pH 4.0 a pH 6.5 no está particularmente dén determinarse apropiadamente por los experto nica.

La etapa de seleccionar moléculas de unión al a actividad de unión al antígeno a un valor de pH 0 es mayor que a un valor de pH 4.0 a pH 6.5 es sin etapa de seleccionar moléculas de unión al antíge ividad de unión al antígeno a un valor de pH 4.0 a p nor que la observada a un valor de pH 6.7 a pH 10.0.

La diferencia en la actividad de unión al antígeno a pH 6.7 a pH 10.0 y a un valor de pH 4.0 a pH 6.5 ticularmente limitada siempre y cuando la actividad de ígeno a un valor de pH 6.7 a pH 10.0 sea mayor que a pH 4.0 a pH 6.5. La actividad de unión al antígeno a pH 6.7 a pH 10.0 es preferentemente dos veces o ma ferentemente diez veces o mayor, y aún más prefere veces o mayor que a un valor de pH 4.0 a pH 6.5.

En los métodos de producción que se des ígeno en una solución.

En los métodos de producción que se des eriormente, cada uno del primer y el segundo valo de ser cualquier pH, siempre y cuando no sean idén combinación preferida del primer y el segundo valo ejemplo, el primer pH comprende entre pH 6.7 y pH undo pH comprende entre pH 4.0 y pH 6.5; binación más preferida, el primer pH es de entre pH y el segundo pH es de entre pH 5.5 y pH 6.5; y binación aún más preferida, el primer pH es pH undo pH es pH 5.8 o pH 5.5.

En otra combinación preferida del primer y segundo , por ejemplo, el primer pH comprende entre pH 4.0 y segundo pH es de entre pH 6.7 y pH 10.0; en una com s preferida, el primer pH es de entre pH 5.5 y pH undo pH es de entre pH 7.0 y pH 8.0; y en una com más preferida, el primer pH es pH 5.8 o pH 5.5 y el ticularmente limitado y se puede introducir en cualqu icionalmente, la mutación de histidina se puede intro sitio o en dos o más sitios.

Por lo tanto, los métodos de producción de la ención pueden comprender además la etapa de su os un aminoácido en una molécula de unión al antí t id i n a o insertar al menos una histidina en moléculas ntígeno.

En los métodos de producción de la presente inve dén usar aminoácidos no naturales en lugar de histi , la presente invención también puede comprender re histidina mencionada previamente por aminoác urales.

Adicionalmente, en otra modalidad, las moléculas antígeno producidas mediante los métodos de produc describieron antes incluyen, por ejemplo, moléculas antígeno incluyendo regiones constantes de ant eriores en la retención en plasma.

Adicionalmente, se espera que las moléculas de ígeno producidas mediante los métodos de producció rse al antígeno dos o más veces cuando son adminis males tales como humanos, ratones o monos. Por lo t todos de producción de la presente invención se pue o métodos para producir moléculas de unión al aces de unirse al antígeno dos o más veces.

Adicionalmente, se espera que las moléculas de ígeno producidas mediante los métodos de producci sente invención puedan unirse a más antíge paración con la cantidad de sus sitios de unión al ndo son administradas a animales tales como h ones o monos. Por lo tanto, los métodos de producci sente invención se pueden usar como métodos para léculas de unión al antígeno capaces de unirse igenos en comparación con la cantidad de sus sitios aces de disociarse dentro de una célula de un antíge racelularmente.

Adicionalmente, se espera que las moléculas de ígeno producidas mediante los métodos de producci sente invención se puedan unir a un antígeno e intern célula así como liberarse hacia el exterior de la célul ma libre de antígeno, cuando sean administradas a s como humanos, ratones o monos. Por lo tanto, los producción de la presente invención se pueden us todos para producir moléculas de unión al antíg dan unirse a un antígeno e internalizar en una rarse hacia el exterior de la célula en una forma ígeno.

Adicionalmente, se espera que las moléculas de ígeno producidas mediante los métodos de producci sente invención puedan eliminar rápidamente los antíg sma cuando sean administradas a animales tale r como métodos para producir moléculas de unión al a su uso como composiciones farmacéuticas.

Los genes obtenidos mediante los métodos de produ presente invención con típicamente llevados sertados) en vectores apropiados y luego son introdu ulas huésped. Los vectores no están particularmente l mpre y cuando puedan retener de manera estable lo leicos insertados. Por ejemplo, cuando se usa Escheri coli) como huésped, los vectores de clonación p luyen el vector pBluescript (Stratagene); sin emb dén usar distintos vectores disponibles comerci ando se usan vectores para producir las moléculas de ígeno de la presente invención, los vectores de expré particular utilidad. Los vectores de expresión n ticularmente limitados siempre y cuando los vectores moléculas de unión al antígeno in vitro, en E. coli, e cultivo o en el cuerpo de un organismo. Por ejemplo, t. Ausubel y colaboradores, (1987) Publish. John Wiley cción 11.4-11.11).

Las células huésped anteriores no están l ticularmente, y se pueden usar distintas células endiendo de la finalidad. Los ejemplos de célul resar las moléculas de unión al antígeno incluyen terianas (tales como células de Strept phylococcus, E. coli, Streptomyces y Bacillus subtilis) ariotas (tales como células de levadura y Aspergillus) insecto (tales como células S2 de Drosophila y odoptera), células de animales (tal como células CH La, C127, 3T3, BHK, HEK293 y células de mela wes) y células vegetales. Los vectores se pueden intr célula huésped mediante métodos conocidos, por todos de precipitación por fosfato de calcio, mét ctroporación (Current protocols in Molecular BÍOIO subel y colaboradores (1987) Publish. John Wiley re 6 y 8 aproximadamente durante el transcurso del c ubación se conduce típicamente a una temperatura e C por aproximadamente 15 a 200 horas. El medio se ear o agita, según necesidad.

Se pueden incorporar señales de secreción apropia ipéptidos de interés de modo que las moléculas de ígeno expresadas en la célula huésped serán secretad lumen del retículo endoplasmático, hacia el iplasmático o hacia el entorno extracelular. Estas dén ser endógenas para las moléculas de unión al ant rés o pueden ser señales heterólogas.

Por otro lado, por ejemplo, los sistemas de produc lizan animales o plantas se pueden usar como siste ducir polipéptidos in vivo. El polinucleótido de in roduce en un animal o una planta y el polipéptido es p el cuerpo del animal o la planta, y luego se recolé éspedes" de la presente invención incluyen tales an de fusión con un gen que codifica un polipéptido p ecíficamente en leche, tal como ia ß-caseína de tinuación, los fragmentos de polinucleótidos que con de fusión se inyectan en los embriones de cabra y splantan a cabras hembra. Las moléculas de unión al eadas se pueden obtener de la leche producida por la sgénicas, que nacieron de las cabras que recibier briones o de su descendencia. Se pueden ad monas, según sea apropiado, para incrementar el vol he que contiene a la molécula de unión al antígeno p las cabras transgénicas (Ebert y colab /Technology (1994) 12: 699-702).

Se pueden usar insectos tales como gusanos de s ducir las moléculas de unión al antígeno de la ención. Cuando se usan gusanos de seda, se puede ulovirus que contienen un polinucleótido que codi lécula de unión al antígeno de interés para infect robacterium tumefaciens. Luego se deja que las cten el tabaco, tal como Nicotiana tabacum, y las m unión al antígeno deseadas se pueden recolectar de s y colaboradores, Eur. J. Immunol. (1994) 24: 131-13 rnativa, es posible infectar lentejas de agua (Lemn bacterias similares. Después de la clonación, se ener las moléculas de unión al antígeno deseada ulas de lenteja de agua (Cox KM y colaborador technol., diciembre de 2006; 24(12):1591-1597).

Las moléculas de unión al antígeno así obtenidas s lar del interior de las células huésped o fuera de o del medio y de la leche), y purificar como molé ón al antígeno sustancialmente puras y homogén todos para aislar y purificar moléculas de unión al ant án particularmente limitados, y habitualmente se todos de aislamiento y purificación para la purificació ipéptidos. Las moléculas de unión al antígeno se pued rofóbica, filtración sobre gel, cromatografía de fase r matografía de adsorción (Strategies for Protein Pu Characterization: A Laboratory Course Manual, Ed rshak y colaboradores, (1996) Cold Spring Harbor La ss). Tales métodos cromatográficos se pueden ndo cromatografía en fase líquida, tales como HPLC columnas usadas para una cromatografía por luyen columnas de proteína A y columnas de proteín umnas que utilizan proteína A incluyen, por ejemplo, ROS y Sepharose F. F. (Pharmacia).

Si fuera necesario, es posible modificar una mol ón al antígeno arbitrariamente, y se pueden cialmente péptidos para obtener una enzima dificación proteica apropiada que actúe antes o despu ificación de la molécula de unión al antígeno. Tales modificaciones proteicas incluyen, por ejemplo, miotripsina, lisil endopeptidasas, proteína quin posición 51, Asn en la posición 59, Ser en la posición la posición 106 y Tyr en la posición 108 en la secu inoácidos de SEC ID N°1 (región variable H53) tituido por His; (b) un anticuerpo que incluye una región variab ena pesada (H3pl) que tiene una secuencia de ami donde Tyr en la posición 27, Asp en la posición 31 y ición 35 en la secuencia de aminoácidos de SEC gión variable H53) ha sido sustituido por His; (c) un anticuerpo que incluye una región variab ena pesada que tiene una secuencia de aminoác de Tyr en la posición 27, Asp en la posición 31, A ición 32, Trp en la posición 35, Asn en la posición 5 posición 63 y Tyr en la posición 108 en la secu inoácidos de SEC ID N° 1 (región variable H53) tituido por His; (d) un anticuerpo que incluye una región variab ena pesada que tiene una secuencia de aminoác de Asp en la posición 31, Tyr en la posición 51, S ición 63, Met en ta posición 106 y Tyr en la posición 1 uencia de aminoácidos de SEC ID N° 1 (región varia sido sustituido por His; (f) un anticuerpo que incluye una región variab ena pesada (CLH5) que tiene una secuencia de amin donde Asp en la posición 31, Tyr en la posición 51, ición 63, Met en la posición 106 y Tyr en la posició o sustituido por His, y en donde Ser en la posición 99 tituido por Phe y Thr en la posición 103 ha sido susti en la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° 1 iable H53); (g) un anticuerpo que incluye una región variab ena ligera que tiene una secuencia de aminoácidos, menos uno entre Asp en la posición 28, Tyr en la pos en la posición 53, Ser en la posición 56 y Asn en la ena ligera (L82) que tiene una secuencia de aminoá de Tyr en la posición 32 y Glu en la posición 5 uencia de aminoácidos de SEC ID N° 1 (región varia sido sustituido por His; (j) un anticuerpo que incluye una región variabl ena ligera (CLL5) que tiene una secuencia de aminoá de Tyr en la posición 32, Glu en la posición 53, S ición 56 y Asn en la posición 92 en la secue inoácidos de SEC ID N° 2 (región variable PF1L) tituido por His; (k) un anticuerpo que incluye la región variable de l ada de (b) y la región variable de la cadena ligera de (I) un anticuerpo que incluye la región variable de l ada de (d) y la región variable de la cadena ligera de (m) un anticuerpo que incluye la región variabl ena pesada de (f) y la región variable de la cadena l ¦ ena pesada. una región variable de la cadena pesada que uencia de aminoácidos de SEC ID N° 3 (H3pl) una región variable de la cadena pesada que uencia de aminoácidos de SEC ID N° 4 (H170) una región variable de la cadena pesada que uencia de aminoácidos de SEC ID N° 5 (CLH5) Los ejemplos específicos de la región variable de l ra que tienen una secuencia de aminoácidos, en nos uno entre Asp en la posición 28, Tyr en la posició la posición 53, Ser en la posición 56 y Asn en la po la secuencia de aminoácidos de SEC ID N° 2 (región L) ha sido sustituido por His que incluye, por eje uientes regiones variables de la cadena pesada. una región variable de la cadena ligera que uencia de aminoácidos de SEC ID N° 6 (L73) una región variable de la cadena ligera que [Tabla 1] * En WT, la cadena H tiene histidina en la posició to la cadena L tiene histidina en la posición 55.

La presente invención proporciona anticuerp inoácidos distintas de las descritas anteriormente en luyen, por ejemplo, una sustitución, supresión, adi erción en la secuencia de aminoácidos de las CDR y la Además, la presente invención proporciona los ant i-receptor de IL-6 indicados a continuación de (1) a (2 (1) un anticuerpo que incluye la región variable de l ada (región variable VH1-lgG1) que tiene la secu inoácidos de las posiciones 1 a 119 en la SEC ID N° 1); (2) un anticuerpo que incluye la región variable de l ada (región variable VH2-lgG1) que tiene la secu inoácidos de las posiciones 1 a 119 en la SEC ID N° 1); (3) un anticuerpo que incluye la región variable de l ada (región variable VH3-lgG1) que tiene la secu inoácidos de las posiciones 1 a 119 en la SEC ID N° 1); (6) un anticuerpo que incluye la región variable de l ra (región variable VL2-CK) que tiene la secue inoácidos de las posiciones 1 a 107 en la SEC ID N° (7) un anticuerpo que incluye la región variable de l ra (región variable VL3-CK) que tiene la secue inoácidos de las posiciones 1 a 107 en la SEC ID N° (8) un anticuerpo (Fv1-lgG1) que incluye la región la cadena pesada de (2) y la región variable de la ra de (6); (9) un anticuerpo (Fv2-lgG1) que incluye la región la cadena pesada de (1) y una región variable de l ra que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC 2); (10) un anticuerpo (Fv3-lgG1) que incluye la región la cadena pesada de (4) y la región variable de la (14) un anticuerpo (VH3-M73) que incluye una ada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC ID (15) un anticuerpo (Fv4-lgG2AGK) que incluye la ada de (12) y una cadena ligera que tiene la secu inoácidos de SEC ID N° 27 (VL3-CK); (16) un anticuerpo (Fv4-M58) que incluye la caden (13) y una cadena ligera que tiene la secue inoácidos de SEC ID N° 27 (VL3-CK); (17) un anticuerpo (Fv4-M73) que incluye la caden (14) y una cadena ligera que tiene la secue inoácidos de SEC ID N° 27 (VL3-CK); (18) un anticuerpo (VH2-M71) que incluye una ada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC I 2-M71); (19) un anticuerpo (VH2-M73) que incluye una ada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEC I 2-M73); inoácidos de SEC ID N° 26 (VL2-CK) ; (23) un anticuerpo (Fv1-M73) que incluye la caden (19) y una cadena ligera que tiene la secue inoácidos de SEC ID N° 26 (VL2-CK); (24) un anticuerpo (Fv3-M71 ) que incluye la caden (20) y una cadena ligera que tiene la secue inoácidos de SEC ID N° 25 (VL1-CK); (25) un anticuerpo (Fv3- 73) que incluye la caden (21) y una cadena ligera que tiene la secue inoácidos de SEC ID N° 25 (VL1-CK); (26) un anticuerpo que incluye una cadena ligera q ecuencia de aminoácidos de SEC ID N° 25 (VL1-CK); (27) un anticuerpo que incluye una cadena ligera q ecuencia de aminoácidos de SEC ID N° 26 (VL2-CK); (28) un anticuerpo que incluye una cadena ligera q ecuencia de aminoácidos de SEC ID N° 27 (VL3-CK).

Adicionalmente, la presente invención proporciona (h) la cadena pesada FR1 de SEC ID N° 47 (VH3, 4): (i) la cadena pesada FR2 de SEC ID N° 48 (VH 1 , 2, (j) la cadena pesada FR3 de SEC ID N° 49 (VH1); (k) la cadena pesada FR3 de SEC ID N° 50 (VH2); (I) la cadena pesada FR3 de SEC ID N° 51 (VH3, 4); (m) la cadena pesada FR4 de SEC ID N° 52 (VH 1 , 2, (n) la cadena ligera CDR1 de SEC ID N° 53 (VL1, 2); (o) la cadena ligera CDR1 de SEC ID N° 54 (VL3); (p) la cadena ligera CDR2 de SEC ID N° 55 (VL1, V (q) la cadena ligera CDR2 de SEC ID N° 56 (VL2) ; (r) la cadena ligera CDR3 de SEC ID N° 57 (VL1 , 2, (s) la cadena ligera FR1 de SEC ID N° 58 (VL1 , 2, 3) (t) la cadena ligera FR2 de SEC ID N° 59 (VL1, 2, 3) (u) la cadena ligera FR3 de SEC ID N° 60 (VL1 , 2, 3 (v) la cadena ligera FR4 de SEC ID N° 61 (VL1 , 2, 3 Las respectivas secuencias de (a) a (v) anter estran en la Fig. 25. Adicionalmente, la presente i enas H y L están ligadas entre sí por medio de u opiado, dominio único de la cadena H y dominio úni ena L (por ejemplo, Nat. Biotechnol., septiembre 9):1126-36), Unibody (WO 2007059782 A1) y SM 7014278 A2). El origen de los anticuerpos ticularmente limitado. Los anticuerpos incluyen ant anos, de ratón, rata y de conejo. Los anticuerpo sente invención también pueden ser anticuerpos qui anizados, completamente humanizados o semejantes.

Específicamente, tales fragmentos de anticu ienen mediante tratamiento de los anticuerpos con ejemplo, papaína o pepsina, o por construcción de g ifican tales fragmentos de anticuerpo, inserción de lo vectores de expresión y expresión de ellos en células opiadas (ver, por ejemplo, Co, M. S. y colaborad unol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz thods in Enzymology (1999) 178, 476-496; Plueckth célula huésped que comprende un vector en el roduce un pol in ucleótido que codifica al polipéptid sente invención.

Más específicamente, la presente invención pro todos para producir un polipéptido de la presente in comprenden las etapas de (a) cultivar una célula huésped que comprende un cual se introduce un gen que codifica al polipépti sente invención; y (b) obtener el polipéptido codificado por el gen.

El scFv se obtiene ligando las regiones V de las ca icuerpo H y L. En tal scFv, la región V de la caden da a la región V de la cadena L por medio de un ferentemente un ligador peptídicos (Huston, J aborado-res, Proc. Nati. Acad. Sci. EE.UU. (1988) 10. 3). Las regiones V de la cadena H y de la cadena v pueden derivar de cualquiera de los anticuerpos stante puede ser una forma modificada incluye titución, supresión, adición y/o inserción en la secu inoácidos de las regiones constantes de lgG1 humana, ana o la lgG4 humana.

El receptor de IL-6 preferido al cual se une un a i-receptor de IL-6 de la presente invención es el rec humano.

Los anticuerpos anti-receptor de IL-6 de la ención son superiores en la retención en plasma, y exi período prolongado en el plasma en una forma capaz d antígeno, es decir, receptores de IL-6 solubles o aso tnbrana. Por lo tanto, los anticuerpos anti-receptor d n in vivo a receptores de IL-6 solubles o asociados m un período prolongado. Adicionalmente, los anticuer eptor de IL-6 tienen la capacidad de unirse a los recep 6 dos o más veces, y por lo tanto se supone que tralizar tres o más receptores de IL-6. léculas de unión al antígeno producidas mediante los producción de la presente invención son superior ención en plasma, y por lo tanto, se espera que red cuencia de administración de las moléculas de ígeno y por lo tanto, son de utilidad como comp macéuticas. La composición farmacéutica de la ención puede incluir portadores farmacéuticamente ace En la presente invención, las composiciones farma refieren comúnmente a agentes para tratar o pr luar y diagnosticar enfermedades.

Las composiciones farmacéuticas de la presente i pueden formular mediante métodos conocidos por los la técnica. Por ejemplo, se pueden usar por vía paren forma de inyecciones de soluciones o suspensiones luyendo agua u otro líquido farmacéuticamente acept mplo, tales composiciones se pueden formular por mez forma de las dosis unitaria requerida en la prá determinado.

Las composiciones estériles inyectables se pueden ndo vehículos tales como agua destilada para inyecci erdo con la práctica de formulación estándar.

Las soluciones acuosas inyectables incluyen, por ina fisiológica y soluciones isotonicas que contienen tros adyuvantes (por ejemplo, D-sorbitol, D-manosa, loruro de sodio). También es posible usar en una com ubilizadores apropiados, por ejemplo, alcoholes ( ej antes), polialcoholes (propilenglicol, polietilen ejantes), agentes tensoactivos no iónicos (po TM), HCO-50 y semejantes).

Los aceites incluyen aceite de sésamo y aceites de de usar benzoato de bencilo y/o alcohol bencílic binación como solubilizadores. También es posible uciones amortiguadoras (por ejemplo, solución amort fosfato y solución amortiguadora de acetato de sodio), nsdérmica. Por ejemplo, se pueden administrar témica o local mediante inyección intravenosa, i amuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcu ejantes.

Los métodos de administración se pueden sel opiadamente teniendo en consideración la edad y los paciente. La dosis de una composición farmacéu tiene una molécula de unión al antígeno puede com ejemplo, entre 0.0001 y 1000 mg/kg para cada admini mo alternativa, la dosis puede comprender, por eje 01 a 100.000 mg por paciente. Sin embargo, la ención no está limitada por los valores numéricos cribieron anteriormente. Las dosis y los mét inistración varían dependiendo del peso, la e tomas del paciente y semejantes. Los expertos en l dén definir las dosis y los métodos de admin opiados teniendo en consideración los factores uencias de aminoácidos en la presente invención.

Todos los documentos de la técnica anterior citad ecificación se incorporan en la presente a modo de ref mplos Más adelante en la presente documentación, la ención se describirá específicamente con referenci mpíos, pero no se debe interpretar como limitad mos. emplo 1]: Producción de Anticuerpo PM1 Hum dif icado paración de receptor de IL-6 humano soluble reco 344) Se preparó un receptor de IL-6 humano recombina ió como antígeno, tal como se describe más adel dujo una línea celular CHO que expresa constante eptor de IL-6 humano soluble (a partir de aquí den o SR344) (Yamasaki, y colaboradores, Science 19 la cual se encuentra inmovilizado un anticuerpo e tra SR344, y cromatografía en columna de filtración e cción que eluyó como el pico principal se usó como el ificado final. paración de receptor de IL-6 soluble recombin no macaco (clL-6R) Se produjeron cebadores de oligo ADN Rhe6Rf1 (S y Rhe6Rr2 (SEC ID N° 17) en base a la s licamente disponible del gen del receptor de IL-6 esus (Birney y colaboradores, Ensemble 2006, Nucle S. , 2006, Jan. 1; 34 (publicación de base de datos): D ando ADNc preparado de páncreas de cinomolgus com preparó por PCR un fragmento de ADN que codifica gitud total del gen del receptor de IL-6 de mono ndo cebadores Rhe6Rf1 y Rhe6Rr2. Usando el frag N resultante como molde, se amplificó por PCR un f ADN de 1131 pb (SEC ID N° 20) que codifica para una Se purificó un medio de cultivo de células CHO pro cyno.slL-6R con una columna HisTrap (GE H sciences), se concentró usando Amicon Ultra-15 Ultr illipore), y además se purificó con una columna de filtr Superdex 200 pg 16/60 (GE Healthcare Bioscienc ener el producto purificado final de receptor de IL-6 caco soluble (a partir de aquí denominado como clL-6R paración de IL-6 de mono macaco recombinante ícI Se preparó IL-6 de mono macaco tal como sigue. S secuencia de nucleótidos que codifican para inoácidos registrada bajo el número de acceso a SWI 9341, se clonó en un vector de expresión en míferas, y se introdujo en células CHO para producir ular de expresión estable (células CHO product o. IL-6). Se purificó un medio de cultivo de célu ductoras de cyno.lL-6 con una columna SP-Sepharos althcare Biosciences) , se concentró usando Amicon ano tal como se indica más adelante con el obj ener una línea celular que muestre un crecimiento dep IL-6.

Se amplificó por PCR el ADNc de gp130 humano de pleta (Hibi y colaboradores, Cell 1990; 63: 11 nBank #NM__002184)) y se clonó en el vector de e OS2Zeo, el cual se preparó por eliminación del resión del gen DHFR de pCHOl (Hirata, y colab BS Letter 1994; 356: 244-248) e inserción del resión del gen de resistencia a Zeocina, para OS2Zeo/gp130. Se amplificó por PCR el IL-6R hui gitud completa y se clonó en pcDNA3.1(+) (Invitrog struir hlL-6R/pcDNA3.1 ( + ). Se mezclaron 10 OS2Zeo/gp130 en células BaF3 (0.8 x 107 células) sus PBS, y se pulsaron usando un Gene Pulser (Bio-Rad taje de 0.33 kV y una capacitancia de 950 FD. Se C ulas BaF3 después de someterse a introducción de g 30 humano (a partir de aquí denominada como BaF3 o que este BaF3/gp130 prolifera en prese rleuquina-6 humana (R&D Systems) y SR344, se pu a evaluar la actividad inhibitoria del crecimiento ( ividad neutralizante del receptor de IL-6) del anticuerp eceptor de IL-6. ducción del anticuerpo anti-receptor de IL-6 human En el contexto del ejemplo inmediato y en cualq o en la presente documentación, el término "tipo salv eviado como WT, el término "cadena H de tipo salv eviado como H(WT) (secuencia de aminoácidos de S y el término "cadena L de tipo salvaje está abrevia J) (secuencia de aminoácidos: SEC ID NO. 10). texto, se introdujeron mutaciones en la secuenci ructura y secuencia CDR del anticuerpo PM1 d anizado tal como se describe en Cáncer Res. 1993, 4): 851-6, para producir cadenas H modificad míferas para producir los vectores de expresión de ca vectores de expresión de cadena L deseados. Las se nucleótidos de los vectores de expresión obten erminaron usando metodologías convencionales cono sonas expertos en la técnica. presión y purificación de anticuerpo anti-receptor manizado Los anticuerpos se expresaron por el método desc lante. Se suspendió la línea celular HEK293H deriv cer de riñon embrionario humano (Invitrogen) e vitrogen) suplementado con 10% de suero fetal vitrogen). Se plaquearon 10 mi de células por disco e a células adherentes (10 cm de diámetro; CORNIN sidad celular de entre 5 y 6 x 105 células/ml y se cu tt i incubador de C02 (37°C, 5% de C02) durante todo he. Luego, el medio se quitó por aspiración, y se a mi de medio CHO-S-SFM-II (Invitrogen). El pharose Fast Flow (Amersham Biosciences). Para d concentración del anticuerpo purificado, se orbancia a 280 nm usando un espectrofotómet centraciones de anticuerpo se calcularon a partir ores determinados usando un coeficiente de abs culado por el método de PACE (Protein Science 1995; 3). enripio 2]: Producción de anticuerpo H3pl/L73 d endiente de pH todo para la creación de anticuerpo con capac utralizar antíqenos múltiples veces Dado que las moléculas de IgG son divalentes, u lécula de IgG puede neutralizar hasta dos molé ígeno cuando los dos sitios se unen a los antíge bargo, no puede neutralizar tres o más moléculas de r lo tanto, para mantener el efecto neutralizante icuerpo neutralizador durante cierto período de tie is de anticuerpo requerida para alcanzar la misma dur Para anticuerpos neutralizadores, hay dos ti ígenos objetivo: antígenos del tipo solubles, qu sentes en plasma, y antígenos unidos a membrana, resan en la superficie de las células.

Cuando el antígeno es un antígeno unido a memb icuerpo administrado se une al antígeno de membra erficie celular, y el anticuerpo posteriormente es inc ndosomas en la célula por internalización junto con el membrana unido al anticuerpo. Luego, el anticuerpo ntiene unido al antígeno se mueve a un lisosoma cu radado por el lisosoma junto con el antígeno. La eli anticuerpo del plasma mediado por internaliza ígenos de membrana se refiere c¾mq eliminación dep antígeno, y esto ha sido informado para numerosas m anticuerpo (Drug Discov. Today, 2006 Jan; 11(1-2 bido a que una única molécula de anticuerpo IgG se u o internalizadas dentro de endosomas por pinocitosis FcRn expresado en endosomas bajo condiciones osomales. Las moléculas de IgG unidas a FcRn se ía la superficie celular en donde se disocian de FcRn diciones neutras del plasma y regresan al plasma, las moléculas de IgG sin capacidad de unirse tinúan hacia los lisosomas donde son degradadas (Fig Las moléculas de IgG unidas al antígeno de memb orporadas dentro de endosomas intracelular rnalización, se mueven a lisosomas mientras están ígeno, y sufren la degradación. Cuando un anticuerp en forma divalente a antígenos, éste neutraliza dos m antígeno y sufre degradación junto con los antígen icuerpo IgG, cuando es incorporado dentro de los en racelulares por internalización, se puede disociar del o las condiciones ácidas intraendosomales, el a ociado puede tener la capacidad de unirse a FcRn e tralización de múltiples antígenos con una única mol (Fig. 3).

En el caso de un antígeno soluble, un a inistrado se une al antígeno en el plasma, y perman sma en la forma de un complejo antígeno-an rmalmente, mientras la retención del anticuerpo en pl y larga (la tasa de eliminación es muy lenta) deb ción de FcRn tal como se describió anteriormente, la r antígeno en plasma es corta (la tasa de eliminación es r lo tanto, los antígenos unidos a anticuerpo mues ención en plasma comparable a la del anticuerpo (la inación es muy lenta). Los antígenos se produce rpo a una velocidad constante y, en la ausencia de an án presentes en plasma en una concentración a la cua producción de antígeno y la tasa de eliminación de án en equilibrio. En presencia de un anticuerpo, la na antígenos están unidos a ios anticuerpos, resultand eto neutralizante del anticuerpo termina luego de alan las concentraciones de anticuerpo y antígeno. los anticuerpos con una constante de disociación fu dén neutralizar antígenos solubles con una concentr icuerpo baja, los anticuerpos a una concentración de enos que la concentración de antígeno presente son neutralizar antígenos sin importar cuán fuerte es la anticuerpo (Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005 (4): 1004-13). Como en el caso de las moléculas d das a antígenos, las moléculas de IgG unidas a antí plasma también son incorporadas a endosomas por pin e unen al FcRn expresado en endosomas bajo las con das intraendosomales. Las moléculas de IgG unidas a even hacia la superficie celular mientras que el antic ntiene unido al antígeno y luego se disocia del FcRn diciones neutras del plasma. Dado que las molécula resan al plasma mientras están unidas al antígeno, n rse a un nuevo antígeno nuevamente en el pía etición de este proceso permite que una única molécul una a antígenos solubles en forma repetida. Esto per única molécula de IgG neutralice múltiples antígenos De este modo, sin importar si el antígeno es un ant mbrana o un antígeno soluble, si la disociación del a del antígeno es posible bajo condiciones raendosomales, una única molécula de IgG podría acidad de neutralizar antígenos repetidamente. Para icuerpos IgG se disocien de los antígenos bajo co das intraendosomales, es necesario que la unión a icuerpo sea considerablemente más débil en co das que en condiciones neutras. Debido a que los antí mbrana en la superficie celular necesitan ser neutraliz icuerpos tienen que unirse fuertemente a los antígen la superficie celular, es decir pH 7.4. Debido a qu raendosomal ha sido informado generalmente entre macocinética.

En general, las interacciones proteína-proteí racciones hidrofóbicas, interacciones electrostá ntes de hidrógeno, y la fuerza de unión generalr resa como una constante de unión (afinidad) o cons ón aparente (avidez). La unión dependiente de pH, cu unión varía entre condiciones neutras (pH 7.4) y con das (pH entre 5.5 y 6.0), se encuentra pres racciones proteína-proteína de origen natural. Por ej ón mencionada anteriormente entre moléculas de IgG ocido como un receptor salvaje para moléculas de rte bajo condiciones ácidas (pH entre 5.5 y 6. ablemente débil bajo condiciones neutras (pH 7.4). La esas interacciones proteína-proteína que endiendo del pH, se encuentran asociadas con resi tidina. Dado que el pKa del residuo de histidina se e la cercanía de pH entre 6.0 y 6.5, el estado de disoci n mencionada anteriormente también está asociada iduos de histidina presente en IgG (Mol. Cell. 2001 A -77).

Por lo tanto, la dependencia de pH se puede impa racciones proteína-proteína por sustitución de un inoácido involucrado en las interacciones proteína un residuo de histidina, o por introducción de una his sitio de interacción. Tales intentos también han sido h racciones proteína-proteína entre anticuerpos y antí ha adquirido exitosamente un anticuerpo mutante ilidad de unión a antígeno disminuida bajo condicione introducción de histidina en la secuencia CDR icuerpo anti-lisosima de clara de huevo (FEBS Letter ( 1, 85-88, 1992)). Adicionalmente, se ha infor icuerpo preparado por introducción de histidina uencia CDR y específicamente se une a un antígeno de tejidos cancerígenos pero que se une débilme reduzcan significativamente la unión bajo condicione a vez que mantengan la unión bajo condiciones neutra comparación con un anticuerpo no modificado, un a dificado se une múltiples veces in vivo a antígenos to muestra farmacocinética mejorada así como jorada del efecto neutralizante a la misma dosis.

El receptor de IL-6 está presente en el cuerpo en receptor soluble de IL-6 o receptor de membrana de I n. Pract. Rheumatol. 2006 Nov; 2(11): 619-26). Los ant i-receptor de IL-6 se unen al receptor soluble de I eptor de membrana de IL-6, y neutralizan su lógica. Se considera que, luego de la unión al rec mbrana de IL-6, los anticuerpos anti-receptor de orporan a endosomas intracelulares por intern ntras están unidos al receptor de IL-6 de membrana, even dentro de lisosomas mientras que los anticu ntienen unidos al receptor de membrana de IL-6, go se internaliza y se degrada en lisosomas. Por lo ta ible producir anticuerpos modificados que exhiben unión reducida en gran medida bajo condiciones áci ienen la misma habilidad de unión como el anticuerp vaje anti-receptor de IL-6 humanizado bajo con tras (anticuerpo anti-receptor de IL-6 con unión dep pH), se pueden neutralizar múltiples receptores de IL- co anticuerpo anti-receptor de IL-6 humanizado. Por comparación con los anticuerpos del tipo salvajes anti- IL-6 humanizado, los anticuerpos anti-receptor de ón dependiente de pH pueden mejorar la duración d tralizante in vivo a la misma dosis. ducción de anticuerpo humanizado anti-receptor n unión dependiente de pH H3pl/L73: La introducción de histidina en un CDR ha sido i o un método para la introducción de unión dependien eacciones antígeno-anticuerpo (FEBS Letter (vol. 30 bering, Kabat, E.A. y colaboradores, 1991, Sequ teins of Immunological Interest, NIH) como sitios de pueden introducir unión a antígeno dependiente d roducción de histidina. El producto en el cual los res 7 , H31 y H35 en H53 producido en el Ejemplo 1 se sus histidina se designó como H3pl (secuencia de amin C ID N° 3), y el producto en ei cual los residuos en L2 en PF1L producido en el Ejemplo 1 se sustituy t id i na se designó como L73 (secuencia de aminoácid N° 6). ducción, Expresión y Purificación del Vector de E pi/L73 La modificación de aminoácidos se llevó a ca ducir anticuerpos modificados en los sitios selecciona taciones se introdujeron en H53 (secuencia de nuc C ID N° 13) y PF1L (secuencia de nucleótidos: SEC I ducidos en el Ejemplo 1 para producir H3pl (secu resión resultantes se determinaron usando un ocido por personas expertos en la técnica. Se pl/L73 que usa H3pl para la cadena H y L73 para la ca purificó por el método descrito en el Ejemplo 1. emplo 3] Otorgamiento de la Habilidad de Unión a pendiente de pH por Modificación de His de CDR nología de Expresión en Fagos ducción de Molécula scfv de Anticuerpo PM1 Huma El anticuerpo PM1 humanizado, que es un a anizado anti-IL-6R (Cáncer Res. 1993 Feb 15; 53(4) convirtió en scFv. Las regiones VH y VL se amplific R, y se produjo el PM1 HL scFv humanizado que uencia conectora GGGGSGGGGSGGGGS (SEC ID re VH y VL. lección de Posiciones Capaces de Introducir Histi trado de Histidina Se realizó una PCR usando el ADN de PM1 irió con Sfil, se insertó en un vector fagémido pELBG bién se digirió con Sfil, y luego se usó para transferi e (Stratagene). Las colonias resultantes se usar luar la unión de antígeno por ELISA con fagos y se a uencia de HL scFv. El ELISA con fagos se llevó a cab placa recubierta con SR344 a 1 pg/ml de acuerdo co l. 1992; 227: 381-388. Los clones que se encontraro ieron a SR344 se sometieron al análisis de secuenci adores específicos.

Se determinó el título de fagos por ELISA con un a i-Etag (GE Healthcare) y anticuerpo anti-M13 (GE Hea te valor luego se usó para seleccionar las posiciones sustitución del residuo CDR con histidina n nificativamente la capacidad de unión en cpmparación scFv humanizado, en base a los resultados de E os para SR344. Las posiciones seleccionadas se mué Tabla 2. La numeración de cada residuo se hizo de a nstrucción de Biblioteca de CDR con Modifica tidina Se diseñó una biblioteca en la cual los aminoácido iduos de CDR que no alteraron significativamente la c unión cuando se sustituyeron por histidina como se m Tabla 2 (posiciones capaces de introducir histidina) uencia original (secuencia del tipo salvaje) o histi lioteca se construyó en base a las secuencias de la C 1H y la cadena L PF1L producidas en el Ejemplo 1 tal iciones mutadas para la biblioteca tienen las se ginales o histidina (tanto la secuencia original tidina).

Las porciones de la biblioteca se construyeron ndo cebadores que fueron diseñados tal que una eada para ser mutado para la biblioteca tiene el c inoácido original o codón de histidina, y se produjer ciones por PCR normal, o por PCR usando c al extremo 5\ y se ligó una secuencia parcia o conector para la expresión en ribosoma al ex ndo Sfil. tención de Scfv de Unión Dependiente de pH a lioteca por Cribado con Perlas Con el objetivo de concentrar sólo scFv que acidad de unirse a SR344, se llevó a cabo el crib es por el método de expresión en ribosoma de a ture Biotechnology 2000 Dec; 18: 1287-1292. El parado se biotiniló usando NHS-PE04-Biotina (Pier ener un antígeno. El cribado se llevó a cabo usando 4 ígeno biotinilado.

Usando la mezcla de ADN resultante como m uperó HL scFv por PCR usando cebadores específico la digestión con Sfil, el HL scFv digerido se insert tor fagémido pELBG lacl que también fue digerido co go se usó para transformar XL1-Blue (Stratagene). picilina, 25 Mg/ml de kanamicina, y 0.5 mM de IPTG, y ubó durante la noche a 30°C.

El cultivo incubado durante la noche se precipitó c NaCI y 10% de PEG, y luego se diluyó con PBS para solución biblioteca de fagos. Se agregó 10% de M-P teniendo 10% de leche descremada) y 1 M de Tris-ución de biblioteca de fagos a concentración final de S y pH 7.4. El cribado se llevó a cabo por un m ado típico usando un antígeno inmovilizado sobr gnéticas (J. ImmunoL Methods 2008 Mar 20; 332(1-2) unol. Methods 2001 Jan 1; 247(1-2): 191-203; Bi g. 2002 Mar-Apr; 18(2): 212-20). Más especifícam egaron 40 pmol de SR344 marcado con biotina a la b fagos y la biblioteca se puso en contacto con el ante 60 minutos a 37°C. Las perlas recubier reptavidina (Dynal M-280) lavadas con 5% de M-P teniendo 5% de leche descremada se a re aron se teniendo 2 YT, 100 Mg/ml de ampicilina y 2% de tas E. coii se usaron para comenzar el cultivo icional del mismo modo como se describió anterior etir el cribado 8 veces. aluación por ELISA con Fagos Las colonias únicas anteriores se inocularon en 1 , 100 pg/ml de ampicilina, 2% de glucosa y 12.5 raciclina y se cultivaron durante la noche a 30°C. Se in L de este cultivo en 300 \JL de 2YT, 100 g/ml de am de glucosa, y luego se cultivaron durante 4 horas a regó un fago auxiliar (M13K07) al cultivo a 9 x 108 pfu osar durante 30 minutos a 37°C y luego se agitó du utos a 37°C para la infección. Posteriormente, el mplazó con 300 pL de 2 YT, 100 Mg/ml de ampicilina, kanamicina, y 0.5 mM de IPTG. Luego del cultivo d he a 30°C, se recuperó el sobrenadante centrifug ado, se agregó 50 mM de PBS (pH 7.4) o 50 mM de ) y se incubó en reposo durante 30 minutos a 37°C. L ado, se llevó a cabo la detección con un anticuerpo jugado con HRP (Amersham Pharmacia Biotech) dil de BSA-PBS y solución simple de TMB (Zymed), seg agregado de ácido sulfúrico para detener la reacci dida de absorbancia a 450 nm.

Sin embargo, no se obtuvieron clones que exhibi ente capacidad de unión dependiente de pH con este ndo el antígeno inmovilizado sobre perlas magnéti nes que se encontraron mostraron débil capacidad endiente de pH se sometieron al análisis de secuenci adores específicos. Las posiciones en estos clones histidina estaba presente en alta tasa se muestran en bla 3] Posiciones de Sustituciones de Histidina De ando la Biblioteca de Fagos (Cribado con uientes razones. En el cribado usando el antígeno inm re perlas magnéticas o una placa, se colectan todos l ociados de las perlas magnéticas o placa bajo co das. Por lo tanto, los clones de fagos que tien endencia con el pH, recuperados juntos, red babilidad de que se incluyan los clones que rte dependencia con el pH en los clones fi centrados.

Por lo tanto, se examinó el cribado usando una ovilizada con un antígeno como un método de crib uroso (Fig. 5). No ha habido informes previos ención de clones que son capaces de unión dependi usando cribado con una columna con antígeno inmo el cribado, usando una columna con el antígeno, cu os que no han sido unidos bajo condiciones neutras s o condiciones ácidas, los clones que tienen baja dep el pH se vuelven a unir al antígeno en la columna acidad de unión con fuerte dependencia con el pH por fluya una solución amortiguadora ácida a travé umna para empezar la elusión y recuperar sólo las "fr opiadas".

Primero, se preparó una columna en la cual se inm ígeno SR344. Se lavaron 200 µ? de Streptavidin S Healthcare) con 1 mi de PBS, se suspendieron en 5 S, y se pusieron en contacto con 400 pmol de SR344 biotina durante 1 hora a temperatura a steriormente, una columna vacía (Amersham P tech) se rellenó con la anterior sefarosa y l oximadamente 3 mi de PBS. Los fagos de b cipitados con PEG mencionados anteriormente se dil 5 con 0.5% de BSA-PBS (pH 7.4), se hicieron pasar un filtro de 0.45 nm, y luego se agregaron a la column lavado con aproximadamente 6 mi de PBS (pH 7.4), ir 50 mM de MES-NaCI (pH5.5) a través de la colu os adiciona! del mismo modo que se describió anterio repitió el cribado 6 veces. aluación por ELISA con Fagos Los fagos resultantes se evaluaron por ELISA co clones que se encontraron tuvieron fuerte dependenc se sometieron al análisis de secuencia usando c ecíficos. Como resultado, se obtuvieron varios clo straron unión dependiente del pH en comparación con o se muestra en la Fig. 6, se encontró que el dena H: CLH5, cadena L: CLL5) (CLH5: secue inoácidos de SEC ID N° 5, CLL5: secuencia de aminoá C ID N° 8) exhibe una unión con una particularmen endencia del pH en comparación con WT. Así se conf anticuerpos que exhibieron unión con fuerte depende pH, mientras que no es posible obtenerlos por criba ndo el antígeno inmovilizado sobre perlas magnét dén obtener por cribado usando una columna inmovili bla 4] Posiciones de Sustitución de Histidina Ene r Biblioteca de Fagos (Cribado por Columna) H31, H50t H58, H62, H63, H65, H100b, H102 L24, L27, L28, L32, L53, L56, L90, L92, L94 emplo 4] Expresión y Purificación de An manizado Contra Receptor de IL-6 Histidina Modific ducción. Expresión v Purificación de Vector de E Anticuerpo Humanizado Contra Receptor de IL-6 d if icado Con el objetivo de convertir los clones que mostrar endencia con el pH en ELISA con fagos a IgG, VH plificaron respectivamente por PCR, se digirie ol/Nhel y EcoRI, se insertaron en un vector de expr ulas mamíferas. La secuencia de nucleótidos gmento de ADN se determinó por un método conocid sonas expertos en la técnica. Se expresó CLH5/L73, e H5 se usó para la cadena H y L73 obtenido en el Eje enido como una cadena H en el Ejemplo 2, y adicional tituyeron H95 y H99 por valina e isoleucina, respecti a producir H170 (SEC ID N° 4). La producción variante cabo usando el método descrito en el Eje icionalmente, se produjo L82 (SEC ID N° 7) por sustit do aspártico de la 28 a histidina de L73 que se prod cadena L en el Ejemplo 2. La producción variante s o usando el método descrito en el Ejemplo 1. Se 70/L82, en donde H170 se usó para la cadena H y L8 ra la cadena L, y se purificó como IgG usando el crito en el Ejemplo 1. emplo 5] Evaluación de la Actividad Neutralizante I Anticuerpo con Unión Dependiente de pH aluación de la Actividad Neutralizante del Receptor mano de Clones Convertidos a Iqg La actividad neutralizante del receptor de IL-6 s a cuatro anticuerpos: anticuerpo PM1 humanizado IL-6 humano soluble recombinante (SR344) y 10% de pensaron 50 µ?_ de la suspensión en cada pocilio de u 96 pocilios (Corning). Luego, el anticuerpo purificado RMPI1640 conteniendo 10% de FBS, y se mezclaron icuerpo en cada pocilio. Luego de cultivar durante C y 5% de C02, se diluyó dos veces el reactivo WS unting Kit-8, Dojindo Laboratories) con PBS y se agr pocilio, y luego se midió inmediatamente la absorban (longitud de onda de referencia: 620 nm) usando ssic (Tecan). Luego de cultivar durante 2 horas, vamente la absorbancia a 450 nm (longitud de erencia: 620 nm). La actividad neutralizante del recept e evaluó en base al cambio en absorbancia luego de mo resultado, tal como se muestra en Fig. 7, H H5/L73 y H170/L82 mostraron que tienen activ tralización biológica equivalente en comparación icuerpo PM1 humanizado (WT). los Ejemplos 2 y 4 (solución amortiguadora: 10 mM 7.4 o pH 5.8), 150 mM de NaCI, y 0,05% de Tween eron diferentes anticuerpos sobre un chip sensor inmo proteína A/G recombinante (Pierce) por acoplami ina. Se inyectó SR344 ajustado a concentraciones de 00 nM al chip como un analito. Se observe en tiemp ciación y disociación de los clones con unión depend a SR344 (figuras 8 y 9). Todas las medidas se llevaro 7°C. Las constantes de velocidad de asociación ka stantes de velocidad de disociación kd (1/s) se c ndo el programa de computación Biacore T100 Evalua althcare), y las constantes de disociación KD (M) se c base a aquellos valores (Tabla 5). Más aun, se c ación de las afinidades a pH 5.8 y pH 7.4 para cada e luar la unión dependiente de pH. Todas las me arón a cabo a 37°C.

Como resultado del cálcuto de la relación de afinid no han sido informados. En este estudio, se o icuerpos que conservaron una actividad de neutr lógica equivalente a la del anticuerpo WT humanizad receptor de IL-6 y la afinidad a pH 7.4, pero que nidad a pH 5.8 que ha sido específicamente disminuid veces. bla 5] Comparación de la Unión al Receptor Solubl los Clones con Unión Dependiente de pH Dirigido 344 pH7.4 pH5.8 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M) KD(pH5.8 WT 5.1E+06 1.0E-03 2.1E-09 7.6E+05 3.8E-03 5.0E-09 2 H3pl/L73 5.4E*05 7.4E-04 1.4E-09 1.7E+05 9.7E-03 5.7B-08 41 H170/L82 6.8E+05 1.1 E-oa 1.6B-09 2.6E+04 1.7E-02 ß.4?-07 39 CLH5/L73 7.1 ?+05 7.9E-04 1.1E-09' 3.8B05 2.8E-02 7.4E-08 6 álisis de la Unión de Clones con Unión Dependient Receptor de Membrana de IL-6 Se observaron las reacciones antígeno-anticu eptor de IL-6 de membrana a pH 5.8 y pH 7.4 de lo ución amortiguadora de fase móvil contuvo 10 mM de ), 150 mM de NaCI y 0.05% de Tween 20. Los clones c endiente de pH se inyectaron bajo la condición de e permitió que se unieran a SR344 (solución amortigu ección de muestra: 10 mM de MES (pH 7.4), 150 CI, 0.05% de Tween 20), y se observó la di endiente de pH de cada clon en la fase móvil con p g. 10).

La velocidad de disociación (kd(1/s)) a pH 5.8 s ndo el programa de computación Biacore T100 Evalua althcare) por ajuste sólo de la fase de disociación a p de 0.5 g/ml de la muestra se unió en 10 mM de I ), 150 mM de NaCI, y 0.05% de Tween 20, y se disoc de MES (pH 5.8), 150 mM de NaCI, y 0.05% de T ilarmente, la velocidad de disociación (kd(1/s)) a p euló usando el programa de computación Biaco aluation (GE Healthcare) por ajuste sólo de la ígido Contra SR344 del Receptor de Membrana de I kd(1/s) Relación kd pH7.4 pH5.B pH5.B/pH7.4 WT 4.84E-Q4 7.15E-04 1.5 H3pl/L73 3.44E-04 3.78E-03 11.0 H17D/L82 7.70E-04 1.44E-03 1.9 CLH5L73 1.04E-03 5.B7E-03 5.5 La mayor dependencia del pH de velocidad de disoci ervó en H3pl/L73 seguido por CLH5/L73 y H170/L82 cendiente, y cada clon demostró una mayor di endiente de pH del receptor de IL-6 de membrana que bargo, el grado de asociación/disociación dependient diferente entre el receptor de IL-6 soluble y el recept e membrana. Se reveló que H170/L82, que mostró l ón dependiente de pH en el análisis de unión al uble de IL-6, mostró la menor unión dependiente de lisis de unión al receptor de IL-6 de membrana. En ge Como se describe en el Ejemplo 2, los anticuer on dependiente de pH pueden ser capaces de ígenos múltiple veces. Específicamente, un anticu ón dependiente de pH que se ha unido a un antí orporado inespecíficamente a endosomas, pero se dis ígeno soluble bajo condiciones ácidas intraendoso icuerpo se une a FcRn y de este modo regresa al bido a que el anticuerpo que ha regresado al plasma do al antígeno, tiene la capacidad de unirse nuevame vo antígeno. La repetición de este proceso permite icuerpos con unión dependiente de pH se unan a a It i pies veces. Sin embargo, para anticuerpos IgG que acidad de unión dependiente de pH, no todos los antí ocian de los anticuerpos bajo las condiciones raendosomales. De este modo, tales anticuerpos resado al plasma por FcRn permanecen unidos al an lo tanto no se pueden unir a nuevos a Se usó Biacore (GE Healthcare) para evaluar que anticuerpos a pH 7.4 y disociación a pH 5.8 fue rse al antígeno múltiples veces. El anticuerpo a ser unió a un chip sensor con proteína A/G reco iovilizada (Pierce) por el método de acoplamiento por permitió fluir una fase móvil de pH 7.4 (etapa 1). ó fluir una solución de SR344 ajustada a pH 7.4 lito para unir SR344 al anticuerpo a pH 7.4 (etapa ión a pH 7.4 imita la unión de antígeno en steriormente, se agregó solución amortiguadora ajust sola (sin contener SR344) como un analito para ex ígeno unido al anticuerpo en condiciones ácidas (e ta disociación a pH 5.8 imita el estado de unión plejos antígeno-anticuerpo en endosomas. Posterior itió la etapa 2. Esto imita la nueva unión del anticuerp resado al plasma por FcRn a un nuevo steriormente, se repitió la etapa 2 para exponer el althcare) para su capacidad de unión al antígen ltiples veces a pH 5.8 y pH 7.4. Más especificar lisis se llevó a cabo como sigue. Todas las me arón a cabo a 37°C. Primero, los anticuerpos critos anteriormente se unieron sobre un chip se teína A/G recombinante (Pierce) inmovilizada por acop amina, en donde la solución amortiguadora de la fa 10 mM de MES (pH 5.8), 150 mM de NaCI, y 0.05% d (etapa 1). Se inyectó SR344 ajustado a una concentr oximadamente 40 nM como un analito durante 3 minu y se permitió que se una (la solución amortiguador 344 inyectado fue 10 mM de MES (pH 7.4), 150 mM d 5% de Tween 20) (etapa 2). Posteriormente, la inye 344 se discontinuó y se permitió que fluyera una fase 5.8 durante aproximadamente 70 segundos para ex plejo anticuerpo/SR344 bajo condiciones ácidas (eta itieron continuamente diez conjuntos de este proceso osición ácida en la etapa 3 que la mayoría del SR344 oció, y por lo tanto casi todos los anticuerpos fueron unirse a nuevos antígenos en la posterior etapa etición del 10-conjunto de unión (etapa 2) y exposici apa 3), casi todos los anticuerpos H170/L82 y CLH5/L aces de unirse a nuevos antígenos en cada conjunto.

Los sensogramas obtenidos se usaron para cal tidad de unión de SR344 en cada conjunto para cada ndo el programa de computación Biacore T100 Evalu althcare). Los valores integrados en el curso en el ti 10 conjuntos se muestran en la Fig. 12. Los val egrados obtenidos a 10mo conjunto son equivalent tidad total de antígenos unidos durante los diez ci nes con unión dependiente de pH, particularmente H1 H5/L73, mostraron la mayor cantidad total de antígeno comparación con WT, y se demostró que fueron ca ir repetidamente casi cuatro veces la cantidad de a ma de receptor de IL-6 soluble y en forma de recepto tipo de membrana (Nat. Clin. Pract. Rheumatol. 2 1): 619-26). Los anticuerpos anti-receptor de IL-6 s receptores solubles de IL-6 y a los receptores del mbrana de IL-6 y neutralizan su acción biológica. Se anticuerpo anti-receptor de IL-6 se une al receptor de mbrana de IL-6 receptor, es posteriormente incorpor osoma en la célula por internalización mientras icuerpo se mantiene unido al receptor del tipo de mem 6, y luego se mueve a un üsosoma mientras aun pe do al receptor del tipo de membrana de IL-6 en d radado por el lisosoma junto con el receptor del mbrana de IL-6. Si H3pl/L73, GLH5/L73, y H170/L82, anticuerpos contra el receptor de IL-6 con unión dep pH evaluados en el Ejemplo 6, tiene la capacidad de plasma por medio de FcRn como resultado de la di o condiciones ácidas en los endosomas, los anticue paración con la de los WT.

Por lo tanto, se evaluó la farmacocinética en sgénicos para el receptor de IL-6 humano nsgénicos h!L-6R, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 1995 11): 4862-6) para cuatro tipos de anticuerpos, e icuerpo PM1 humanizado (tipo salvaje: WT) y H5/L73, y H170/L82 construidos en los Ejemplos 2 ministró WT, H3pl/L73F CLH5/L73, o H170/L82 inistración de dosis única intravenosa a ratones tran -6R a 25 mg/kg, y se colectaron muestras de sangre, administración y durante el tiempo. La sangre cole trifugó inmediatamente durante 15 minutos a 15,000 r ra obtener plasma. El plasma separado se almacen ezer ajustado a -20°C o menos hasta que se llevaro medidas.

La medición de la concentración en plasma de ratón technology Associates) y conjugado estreptavidina- alina (Roche Diagnostics), y se llevó a cabo una mogénica usando el sistema BluePhos MicroweII Pho bstrates System (Kirkegaard & Perry Laboratorie trato. Se midió la absorbancia a 650 nm con un l roplacas. Se calcularon las concentraciones en pí ón con a partir de la absorbancia de la curva de ca ndo el programa de computación analítico SOFTm olecular Devices). Los cursos en el tiempo de la conc plasma de WT así como de H3pl/L73, CLH5/L73, y muestran en la Fig. 13.

La farmacocinética fue mejorada para todos H5/L73, y H170/L82 en comparación con WT. En part macocinética de H3pl/L73 y CLH5/L73 siderablemente. Un anticuerpo anti-receptor de I vaje (WT) unido a receptor del tipo de membrana de orpora en un endosoma en una célula por internaliz tipo de membrana de IL-6, bajo condiciones ácida osomas.

A pesar que la farmacocinética fue mejorada para t pl/L73, CLH5/L73, y H170/L82 en comparación con eto de prolongar el tiempo de persistencia en pí 70/L82 fue más débil que el de H3pl/L73 y CLH5/L73. las moléculas de IgG se piensa que normalmente se ma divalente al antígeno unido a membrana, se piens icuerpos anti-receptor de IL-6 también se unen e alenté (avidez) a los receptores del tipo de membran luego se internalizan. Como se indica en el Ejemp lisis usando Biacore reveló que H170/L82 se ilmente del receptor de IL-6 a pH 5.8 cuando la eptor de IL-6 soluble (FIG. 9), pero la velocidad de di mismo del receptor de IL-6 a pH 5.8 cuando estaba eptor del tipo de membrana de IL-6 fue extremadame g. 10). A partir de este resultado, la razón del efecto ociación de una unión divalente (avidez) es más i la dependencia con el pH de la unión monovalente (a emplo 9] Ensayo PK/PD de Anticuerpos con pendiente de pH Usando Monos Macacos Debido a que la farmacocinética de los anticuer eptor de IL-6 de unión dependiente de pH fue siderablemente en el Ejemplo 8, se piensa que los ant i-receptor de IL-6 de unión dependiente de pH reg sma por medio de FcRn como resultado de la disoci ígeno, receptor del tipo de membrana de IL- diciones ácidas en los endosomas. Si los anticuerpos resado al plasma se pueden unir a los receptores de mbrana de IL-6 nuevamente, neutralización de un eptor del tipo de membrana de IL-6, por anticuer eptor de IL-6 de unión dependiente de pH se cree que s que el anticuerpo del tipo salvaje anti-receptor de I ma dosificación. Adicionalmente, debido a que el rec ante el tiempo. La sangre colectada se c ediatamente durante 15 minutos a 15,000 rpm y a ener plasma. El plasma separado se almacenó rigerador ajustado a -20°C o menos hasta que se reali didas.

La medición de la concentración en plasma d cacos se llevó a cabo mediante ELISA. Primero, se gmento de anticuerpo anti-lgG humana (específi ena-?) F(ab')2 (Sigma) en una Nunc-lmmunoPlate I lge Nunc International) y se dejó reposar inmóvil dur he a 4°C para preparar placas con anti-lgG ovilizada. Se prepararon curvas de calibraci centraciones en plasma de 3.2; 1.6; 0.8; 0.4; 0.2; 0 mi y muestras para medida de plasma de monos uidas 100 veces o más; se agregó 200 L de 20 ng/ml mono macaco a 100 µ? de todas las muestras de la mponent HRP MicroweII Substrate (BioFX Laboratori trato, luego se detuvo la reacción con ácido sulfú owa Chemical) y se midió la absorbencia a 450 n tor de microplacas. Se calcularon las concentraci sma de monos macacos a partir de la absorbancia de calibración usando el programa analítico SOFTm olecular Devices). Los cursos temporales centraciones plasmáticas de WT y H3pl/L73 lueg ministración intravenosa se muestran en la FIG. 1 ultado, la farmacocinética de H3pl/L73 fue r siderablemente, en comparación con WT, en monos la misma manera que en los ratones transgénicos eptor de IL-6 humano. Debido a que la farmacocinéti icuerpo anti-receptor de IL-6 de unión dependiente pl/L73, fue mejorada en forma considerable, se pe pl/L73 retorna al plasma a través de FcRn como result ociación del antígeno, el receptor de IL-6 de eptores de IL-6 de tipo de membrana, CRP sirve icador de la neutralización de los receptores de IL-6 d mbrana. Se administró IL-6 de mono macaco ( parada como en el Ejemplo 1) con 1% de plasma inact nos macacos en forma subcutánea en el dorso inferi males diariamente a 5 pg/kg entre el día 3 y el día 10 administración de WT o H3pl/L73. Se colectaron mue gre desde la vena safena inmediatamente antes del la administración de IL-6 de mono macaco (día 3) y lú ministración a intervalos de 24 horas (entre el día 4 , y luego se les separó el plasma. Se midi centraciones de CRP de los animales individuales co P (Kanto Chemical) usando un analizador automáti FR, Toshiba Medical Systems). Los cursos tempora centración de CRP con la inducción con IL-6 de cy respecto a WT y H3pl/L73 se muestran en la FIG. 1 ultado, se prolongó la duración de la supresión ante un periodo de tiempo más largo que WT. abras, se demostró que H3pl/L73 es capaz de uni utralizar al receptor de IL-6 de tipo de membrana má , como una sola molécula de anticuerpo. Debido ración de la supresión de la producción de CRP pl/L73 es más prolongada en comparación con la de era que la duración de tiempo en la cual un antí eptor de IL-6 de tipo de membrana, está unid icuerpos, sea más prolongada para H3pl/L73 que para Con el objetivo de evaluar el grado en el cual se n receptor soluble de IL-6 de mono macaco med inistración intravenosa de WT y H3pl/L73, se centración de receptor soluble de IL-6 sin unir caco en plasma de monos macacos. Se adsorbieron t icuerpos de tipo IgG (IgG de mono macaco, anticue eptor de IL-6 humano, y un complejo de anticue eptor de IL-6 humano y receptor soluble de IL-6 eptor de IL-6 humano y receptor soluble de IL-6 caco el cual es unido a la proteína A, se puede centración de receptor soluble de IL-6 sin unir me dida de la concentración de receptor soluble de IL-6 caco en la solución de pasada. Se marcó con r ticuerpo Monoclonal Anti-IL-6R Humano (R&D) con S Ester (Meso Scale Discovery) y se mezcló A tinilado Anti-IL-6R Humano (R&D) con las muestras de calibración de receptor de IL-6 de mono macaco aju centraciones de 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, y 6 on las muestras de plasma tratadas con Proteína A cribió previamente. Se dejó que las mezclas reac rante una hora a temperatura ambiente. Subsiguiente egaron las mezclas a una placa SA-Coated Standard 96 pocilios (Meso Scale Discovery). Luego de pe cción durante otra hora y de lavar, se agregó Read ) (Meso Scale Discovery). Inmediatamente des 6 de mono macaco mediante H3pl/L73 fue considera s prolongada en comparación con la de WT. En bas llazgo, se espera que el anticuerpo anti-receptor p I/L73 de unión dependiente del pH se disocie de su receptor soluble de IL-6, bajo las condiciones ácida osomas; que retorne al plasma mediante FcRn; y utralice al receptor soluble de IL-6 nuevamente. Debi duración de la supresión de receptor soluble de IL-6 si no macaco mediante H3pl/L73 es prolongada en com la de WT, se espera que la duración de tiempo en l ígeno, un receptor soluble de IL-6, esté unido por ant más prolongada para H3pl/L73 que para WT.

A partir de estos hallazgos, se halló que el tiempo h anticuerpo desaparece del plasma así como también el cual los receptores de IL-6 solubles y de tipo de m án unidos por el anticuerpo en el cuerp siderablemente más largos para los anticuerpos anti e que es particularmente ventajoso como c macéutico para usar como antagonista de IL-6. emplo 10] Mejora de la Unión Dependiente de ceptor de IL-6 de Tipo de Membrana Medi timización de la Región Variable timización de I as Regiones Variables H3pl/L73 y CL Se demostró que los anticuerpos que tienen habili ión dependientes del pH tienen efectos superiore mplo 9. Por lo tanto, para mejorar más aun las habili ión dependientes del pH, se introdujeron mutacion uencia CDR de CLH5, que se obtuvo en el Ejemplo struir VH1-lgG1 (SEC ID N° 21) y VH2-lgG1 (SEC I emás, se introdujeron mutaciones en la secuencia de r bajo y secuencia CDR de H3pl para construir el C ID N° 23) y VH4-lgG1 (SEC ID N° 24) con ca dificadas. Se introdujeron mutaciones en las secuenc L73 y L82 para construir VL1-CK (SEC ID N° 25), VL2- leotídicas de los vectores de expresión resultantes métodos conocidos para los expertos en la técnica.

El anticuerpo que tiene VH2-lgG1 (SEC ID N° 2 ena H y VL2-CK (SEC ID N° 26) como cadena L se d o Fv1-lgG1, el anticuerpo que tiene VH1-lgG1 (SEC I o cadena H y L82 como cadena L se denominó co 1, el anticuerpo que tiene VH4-lgG1 (SEC ID N° 2 ena H y VL1-CK (SEC ID N° 25) como cadena L se d o Fv3-lgG1, y el anticuerpo que tiene VH3-lgG1 (S como cadena H y VL3-CK (SEC ID N° 27) como cad ominó como Fv4-lgG1. De estos, Fv2-lgG1 y Fv4- resaron y purificaron. La expresión y purificación se li o mediante el método que se describe en el Ejemplo 1 álisis de Unión de Clones de Unión Dependiente ceptor Soluble de lL-6 Se llevó a cabo un análisis de la cinética de las re ígeno-anticuerpo a pH 7.4 sobre los cuatro t centración de entre 9.8 y 40 nM. Se observó la asocia ociación de SR344 en base a tiempo real para los cí ón dependiente del pH. Todas las mediciones se H o a 37°C. Se calcularon las constantes de tasa de a (1/Ms) y las constantes de tasa de disociación kd (1/s core T100 Evaluation Software (GE Healthcare) stantes de disociación KD (M) se calcularon en bas ores (Tabla 7). bla 7] Comparación de Constantes de Tasa de Dis Clones de Unión Dependiente del pH de Receptor IL-6, SR344 Muestra Ka (1/MS) Kd (1/s) KD (M) WT 4.0E + D5 1.1E-03 2.7E-09 H3pl/L73 4.1E + 05 5.9E-04 1.4E-09 Fv2-lgG1 3.9E + 05 7.7E-04 2.0E-09 Fv4-lgG1 7.2E + 05 1.0E-03 1.4E-09 Se observaron reacciones antígeno-anticuerpo para IL-6 de tipo de membrana a pH 5.8 y pH 7.4 para I os de clones construidos, WT, H3pl/L73-lgG1 , Fv2-lgG 1 mediante el uso de Biacore T100 (GE Healthcare). S unión ai receptor de IL-6 de tipo de membrana me luación de la unión al receptor de IL-6 inmovilizado p sensor. Se biotiniló SR344 de acuerdo con un ocido por los expertos en la técnica, y se inmovilizó tinilado sobre el sensor chip mediante estreptavidina U nidad entre estreptavidina y biotina. Todas las me arón a cabo a 37°C. El amortiguador de fase móvil fue (pH 5.8), NaCI 150 mM y Tween 20 al 0.05%. Se n clones de unión dependiente del pH bajo condicion para permitir que se unan a SR344 (amortiguador de ra inyección: MES 10 mM (pH 7.4), NaCI 150 mM, Tw 5% , lue o, se observó la disociación de endiente d ilar, se ajustaron las concentraciones de muestra mi, se llevó a cabo la unión en MES 10 mM (pH 7.4), y Tween 20 al 0.05%, la disociación se llevó a cabo mM (pH 7.4), NaCI 150 mM, y Tween 20 al 0.05 stantes de tasa de disociación (kd(1/s)) a pH 7.4 se c stando solo la fase de disociación a pH 7.4 usando 0 Evaluation Software (GE Healthcare). Las const a de disociación dependiente del pH de cada clon se r la Tabla 8. bla 8] Comparación de Constantes de Tasa de Dis Clones de Unión Dependiente del pH de Receptor d o de Membrana, SR344 Dependencia Kd (1/s) a pH Kd (1/s) a pH uestra Kd(pH 5.8)/ 7.4 5.8 7.4) WT 2.5E-04 2.5E-04 1.00 3pl/L73 2.6E-04 6.7E-04 5.59 -lgG1, y Fv4-lgG1 con respecto a SR344, fueron 1.0 es, 7.18 veces, y 5.56 veces, respectivamente. Fv -lgG1 demostraron mayor dependencia del pH ociación del receptor de IL-6 de tipo de membr pl/L73-lgG1.

En base a lo anterior, se demostró que Fv2-lgG1 y nen una unión dependiente del pH más fuerte al recept de tipo de membrana que H3pl/L73-lgG1 mientas ntiene una afinidad hacia el receptor soluble de IL-yor a la de WT. emplo 11] Ensayo PK/PD de Anticuerpos de pendiente del pH con Regiones Variables Opti ando Ratones Transgénicos para Receptor de IL-6 H Se evaluó la farmacocinética de Fv2-lgG1 y Fv4-l o también de WT y H3pl/L73-lgG 1 preparados y eval Ejemplo 10 usando los ratones transgénicos para rece 6 humano que se usaron en el Ejemplo 8. Se administr ntras que la farmacocinética de Fv2-lgG1 y Fv4-l jorada más que H3pl/L73-lgG1. Las medidas, como l centraciones de receptor de IL-6 no unido medidas e cacos en el Ejemplo 9, se llevaron a cabo en los rat tg en este ensayo usando el mismo método. Como r confirmó la prolongación de la duración de la neutr I receptor soluble de IL-6 para Fv2-lgG1 y Fv4- paración con la de H3pl/L73-lgG1 (datos no mo mo se indica en el Ejemplo 10, se mejoró la unión dep I pH al receptor de IL-6 de tipo de membrana para Fv -lgG1 en comparación con H3pl/L73-lgG1. Por lo t cluyó que es posible una mejora adicional macocinética y en la duración de la neutralización del uble de IL-6 por sobre aquellos de H3pl/L73-lgG1 me jora de la unión dependiente del pH al receptor de IL- membrana. emplo 12] Mejora de la Unión Dependiente de to, se hizo un estudio para la optimización de l stante con el objetivo de mejorar la unión dependient receptor de IL-6 de tipo de membrana.

Se introdujo una mutación en una región constante ural, la región constante lgG2 (SEC ID N° 28), para región constante igG2AGK (SEC ID N° 29). Se intro tación en la región constante lgG2AGK para construir stante M58 (SEC ID N° 30). Se introdujeron otras m las regiones constantes lgG2 y M58 para construir las stantes M71 (SEC ID N° 31) y M73 (SEC ID N° 32).

Se construyó VH3-lgG2AGK (SEC ID N° 33) me titución de lá región constante de VH3-lgG1 que se pr Ejemplo 10 por lgG2AGK, se construyó VH3-M58 (S ) mediante la sustitución de la región constante por M struyó VH3-M73 (SEC ID N° 35) mediante la sustituc ión constante por M73. Más específicamente, se con ndo VH3-M58 (SEC ID N° 34) para la cadena H y VL3- N° 27) para la cadena L; y Fv4-M73 usando VH3-M73 35) para la cadena H y VL3-CK (SEC ID N° 27) para l La expresión y purificación se llevaron a cabo u todo que se describe en el Ejemplo 1. álisis de Unión de Fv4 con Región Constante Opti ceptor Soluble de IL-6 Se observó la asociación y la disociación de SR344 tiempo real usando el mismo método del Ejemplo parar de ese modo Fv4-lgG1, Fv4-lgG2, Fv4- 58, y como WT. Se calcularon las constantes de tasa de a (1/ s) y constantes de tasa de disociación kd (1/s) lue lisis del mismo modo, y luego, se calcularon las const ociación KD (M) en base a esos valores (Tabla 9). bla 9] Comparación de Constantes de Tasa de Dis Clones con Unión Dependiente del pH desde luble de IL-6, SR344 1, Fv4-lgG2, Fv4-M58, y Fv4-M73 hacia SR344 fuero nM, 1.4 nM, y 1.4 nM, respectivamente, y estas fu uivalentes. Esto indica que la habilidad de unión de lo unión dependiente del pH al receptor soluble de IL-6 cambia aun luego de la modificación de la región c base a este hallazgo, se ve que la habilidad de eptor soluble de IL-6 no cambia para Fv1, Fv2, y Fv3 i modifica en forma similar la región constante. álisis de Unión de Fv4 con Región Constante Optim ceptor de IL-6 de Tipo de Membrana Se observaron las reacciones antígeno-anticue eptor de IL-6 de tipo de membrana a pH 5.8 y pH paradas así Fv4-lgG1, Fv4-lgG2, Fv4-M58, y Fv4- o WT, de la misma manera que en el Ejemplo 10, core T100 (GE Healthcare). Los resultados obtenidos inyección de los clones de unión dependiente del diciones de pH 7.4 para permitir la unión con uestra Kd (1/s) a pH Kd (1/s) a pH Dependencia 7.4 5.8 Kd(pH 5.8)/ 7.4) Fv4- 4.7E-04 2.6E-03 5.56 lgG1 Fv4- 1.0E-03 1.8E-02 16.99 igG2 v4-M58 5.4E-04 9.5E-03 17.64 v4-M73 5.1 E-04 5.1 E-03 10.06 Como resultado del cálculo de la dependencia del a clon, las dependencias del pH de Fv4-lgG1, Fv4-lg 8, y Fv4-M73 hacia SR344 fueron 5.6 veces, 17.0 ve es, y 10.1 veces, respectivamente; por consiguien 2, Fv4-M58, y Fv4-M73 demostraron todos un ociación dependiente del pH desde el receptor de IL-membrana en comparación con Fv4-lgG1. emplo 13] Ensayo PK/PD de Anticuerpos de pendiente del pH con Región Constante Optimizada tones Transgénicos para Receptor de IL-6 humano Se evaluó la farmacocinética de Fv4-lgG1, Fv4-lgG 8 que se prepararon en el Ejemplo 13 usando los nsgénicos para receptores de IL-6 humano (ratones hl se usaron en el Ejemplo 8 para examinar los efect ión constante sobre la farmacocinética. Se administr -lgG1, Fv4-lgG2, o Fv4-M58 a los ratones hlL-6R tg ministración intravenosa en una sola dosis a 25 mg/kg, llevaron a cabo medidas de las concentraciones pía cada anticuerpo, de la misma manera que en el Ejemp sos temporales de las concentraciones en plasma de 1, Fv4-lgG2, y Fv4-M58 se muestran en la FIG. 20.

Similarmente al Ejemplo 11, la farmacocinética de mejorada en comparación con WT, y la farmacoci -lgG2 y Fv4-M58 fue mejorada además en compara mbrana se mejoró para Fv4-lgG2 y Fv4- 58 en com Fv4-lgG1. Por lo tanto, se demostró que la mejora en pendiente del pH al receptor de IL-6 de tipo de memb jora en la farmacocinética y duración de la neutraliz eptor soluble de IL-6 son posibles mediante la sustit región constante de lgG1 a lgG2 o M58. En bas llazgo, se espera que la farmacocinética y la duraci utralización del receptor soluble de IL-6, no solo en el , sino también en los casos de Fv1, Fv2, y Fv3, p jorada en comparación con lgG1 mediante la sustituci ión constante de lgG1 a lgG2 o M58. emplo 14] Construcción de Anticuerpos de pendiente del pH con Regiones Variables y Co timizadas Se construyeron VH2-M71 (SEC ID N° 36) y VH2-M N° 37), con M71 y M73 para la región constante de V H4-M71 (SEC ID N° 38) y VH4-M73 (SEC ID N° 39), c método que se describe en el Ejemplo 1. álisis de la Unión de Anticuerpos de Unión Dependi , con Regiones Variables v Constantes Optimiz ceptor Soluble de IL-6 Se observaron la asociación y la disociación de S se a tiempo real usando el mismo método del Ejemplo once tipos de anticuerpos, anticuerpo PM1 humani o salvaje: WT) y H3pl/L73-lgG1 , Fv1-M71, Fv1-M73, F 3-M71, Fv3-M73, Fv4-lgG1, Fv4-lgG2, Fv4-M58, y struidos como se describió previamente. Se calcul stantes de tasa de asociación ka (1/Ms) y constantes disociación kd (1/s) mediante un análisis de la misma as constantes de disociación KD (M) se calcularon e s valores (Tabla 11). bla 11] Comparación de Constantes de Tasa de Dis Clones con Unión Dependiente del pH de Receptor IL-6, SR344 Muestra Ka (1/Me) Kd (1/s) KD (M) Fv3-M73 8.5E + 05 8.7E-04 1.0E-09 Fv4-lgG1 7.2E + 05 1.OE-03 1.4E-09 Fv4-lgG2 9.6E + 05 1 2E-03 1.3E-09 Fv4-M58 8.3E + 05 1.1E-03 1.4E-09 Fv4-M73 7.5E + 05 1.OE-03 1.4E-09 Los diez tipos de clones de unión dependiente d ontraron con constantes de disociación (afinidad, va receptor soluble de IL-6 igual o mayor que para WT. álisis de la Unión de Anticuerpos de Unión Dependi , con Regiones Variables v Constantes Optimiz ceptor de IL-6 de Tipo de Membrana Se observaron reacciones antígeno-anticuerpo eptor de IL-6 del tipo de membrana a pH 5.8 y pH ma manera que en el Ejemplo 10, usando Biacore T althcare) para los once tipos de anticuerpos, anticue muestran en la FIG. 21, mientras que los resultados os clones se muestran en las FIGs. 17 y 19). Los an arón a cabo de la misma manera que en el Ejemplo pendencias del pH para las constantes de tasa de di todos los once tipos de clones se muestran en la Tabl bla 12] Dependencias del pH de las Constantes de ociación de Clones con Unión Dependiente del ceptor de IL-6 de Tipo de Membrana, SR344 Kd (1/s) a Kd (1/s) a Dependencia del pH uestra pH 7.4 pH 5.8 5.8)/kd (pH 7.

WT 2.5E-04 2.5E-04 1.00 3pl/L73 2.6E-04 6.7E-04 2.59 v1-M71 6.1E-04 6.9E-03 11.29 v1-M73 3.7E-04 3.2E-03 8.80 Fv2- 3.4E-04 2.4E-03 7.18 lgG1 v3-M71 9.1 E-04 9.7E-03 10.74 Los diez tipos de clones obtenidos con unión dep I pH demostraron una habilidad de unión dependient cía el receptor de IL-6 de tipo de membrana. Más contró que todos de Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-lgG1, -M73, Fv4-lgG1, Fv4-lgG2, Fv4-M58, y Fv4-M73 der mejor unión dependiente del pH hacia el receptor d o de membrana, en comparación con H3pl/L73-lgG 1 , se encontró que el tiempo hasta que el a saparece del plasma así como también el tiempo en eptor soluble de IL-6 y el receptor de IL-6 de mbrana están unidos por el anticuerpo en el cue siderablemente más prolongados en comparación o se muestra en monos macacos en el Ejemplo 9. emplo 15] Ensayo PK/PD de Anticuerpos de pendiente del pH con Regiones Variables y Co timizadas Usando Monos macacos nstrucción de Anticuerpo anti-receptor de IL-6 stante por PCR a partir del vector de expresión que s Ejemplo 1. Se ligaron la región variable de anticue ión constante de anticuerpo mediante PCR de ensamb ertaron en un vector para expresión en mamíf ertaron los fragmentos de ADN resultantes de cad ena L en el vector de expresión en células de mamíf struir el vector de expresión de cadena H y el v resión de cadena y L de interés. Se determinó la secu cleótidos de los vectores de expresión resultantes me todo conocido por los expertos en la técnica. Se llev expresión y purificación usando los vectores de e struidos. La expresión y purificación se llevaron ndo el método que se describe en el Ejemplo 1 para icuerpo de alta afinidad anti-receptor de IL-6 (Ab nidad). sayo PK/PD en Monos Macacos Se evaluaron la farmacocinética y la eficacia farm /kg. Se colectaron muestras de sangre antes ministración y a lo largo del tiempo. Se midió la conc plasma de cada anticuerpo de la misma manera q mplo 9. Los cursos temporales de las concentraci sma de H3pl/L73-lgG 1 , Fv1-M71, Fv1-M73, Fv2-lg 3, y Fv4-M73, así como también para el Ab de alta afi estran en la FIG. 21. Con el objetivo de evaluar la macológica en términos del grado en el cual se neu eptor de IL-6 de tipo de membrana de mono ma ministró IL-6 de mono macaco por vía subcutánea en erior de los animales diariamente a 5 pg/kg entre el d 10 (entre el día 6 y el día 10 con respecto al Ab nidad) luego de la administración del anticuerpo de ! ñera que en el Ejemplo 9. Se midió la concentración cada animal 24 horas luego de cada administrac sos temporales de las concentraciones de CRP ministración de cada anticuerpo se muestran en la FIG.

Como resultado, las concentraciones de anticu tuvieron altas en el plasma para cada uno de Fv1-M 3, Fv2-lgG1, Fv3-M73 y Fv4-M73 en compara pl/L73-lgG1 , mientras que las concentraciones de C eptor soluble de IL-6 de mono macaco no u ntuvieron a niveles bajos. O sea que, este resultado el tiempo en donde los receptores de IL-6 de mbrana y el soluble están unidos al anticuerpo (o labras, la duración de la neutralización) fue prolong anticuerpos en comparación con H3pl/L73-lgG1.

Además, para los anticuerpos anti-receptor de ión dependiente del pH, se confirmaron los efe utralización y la eficacia sostenida igual o mayor qu icuerpo de alta afinidad conocida anti-receptor de IL-a afinidad) administrado a 1.0 mg/kg, a solo la mita ificación, es decir 0.5 mg/kg. Por lo tanto, se descu anticuerpos de unión dependiente del pH tienen ef eptores de tipo de membrana y los receptores soluble én unidos al anticuerpo (o en otras palabras, la durac utralización y los efectos de neutralización sostenida) iongado para los anticuerpos en comparación con 1.

En el Ejemplo 9, para H3pl/L73-lgG 1 , se halló que ta que desaparece el anticuerpo del plasma así como tiempo en el cual el receptor soluble de IL-6 y recepto tipo de membrana están unidos al anticuerpo en e ectos de neutralización sostenida) es considera longado en comparación con WT. Fv1-M71, Fv1-M 1, Fv3-M71, Fv3-M73, Fv4-lgG1, Fv4-lgG2, Fv4-M58 3, con efectos de neutralización sostenida supe pl/L73-lgG1 , se espera por lo tanto que tengan ef tralización sostenida remarcablemente mejores c para con WT.

En contraste con los anticuerpos anti-receptor de 6 de unión dependiente del pH sean extrema eriores como compuestos farmacéuticos para us agonista de IL-6. emplo 16] Construcción de Anticuerpo Anti-IL-6 d pendiente del pH presión v Purificación de Anticuerpo Anti-IL-6 En los Ejemplos 1 a 15, se crearon exitosam ralidad de anticuerpos anti-receptor de IL-6 humaniza unen en forma dependiente del pH al receptor artiendo la dependencia a través de la introdu tituciones de histidina y similares en la región vari rticular, en las secuencias CDR de los anticuerp eptor de IL-6 humanizados. Se halló que todo icuerpos se unen repetidamente al receptor de uestran una mejora considerable en PK/PD.

Por lo tanto, se confirmó que se puede conferir la endiente del pH de un anticuerpo para unir a un an uencias de aminoácidos de los anticuerpos de inter tor de expresión en células de mamíferos para co tor de expresión de cadena H y el vector de expr ena y L de interés. Se determinó la secuencia de nu los vectores de expresión resultantes usando un ocido por los expertos en la técnica. Se expresó y i-IL6 de tipo salvaje mediante el método que se descr mplo 1. nstrucción del Anticuerpo Anti-IL-6 Dependiente del Para conferir al anticuerpo la habilidad dependient ra unirse a IL-6, se introdujeron sustituciones de his aminoácidos de la CDR del anticuerpo anti-IL6 (An o salvaje) incluyendo la cadena H (WT) (secue inoácidos: SEC ID N° 62) y la cadena L (WT) (secu inoácidos: SEC ID N° 63). Mediante la sustitución de los aminoácidos de la CDR y mediante el subsiguiente obtuvieron varios clones que demostraron un 64) y la cadena L (c2) (secuencia de aminoácidos: S ). Los clones Anti-IL6 1 y Anti- 1 L6 2 se expresaron y p diante el método que se describe en el Ejemplo 1. bla 13] Posiciones de Sustitución de Histidina nes dependientes del pH H32, H59f H61, H99 L53, L54, L90, L94 álisis de Unión de Clones Dependientes del p mana Se llevó a cabo un análisis cinético de las re igeno-anticuerpo a pH 5.5 y pH 7.4 usando Biacore althcare) para los tres tipos de anticuerpo preparados ncionó previamente: Anti-IL6 de tipo salvaje, Clon Anti n Anti-IL6 2 (amortiguador: DPBS(-) (pH 7.4 o pH 5. 0 mM). Se unieron los anticuerpos a un chip sensor se inmovilizó proteína A/G recombinante (Pierce) plamiento con aminas, y luego se inyectó IL-6 human bla 14] Comparación de Unión de Clones Dependie a IL-6 La proporción de afinidad a pH 5.5 y pH 7.4 )/(KD)(pH 7.4)) calculada, la que indica la unión dep \ pH a IL-6 humana, fue de 0.8; 10.3; y 13.5 para An o salvaje, Clon Anti-IL6 1, y Clon Anti-IL6 2, respecti sea, la habilidad de unión dependiente del pH de cad ncipalmente en las secuencias de aminoácidos de mo se indica en los ejemplos 1 a 15, un anticue eptor de IL-6 que tiene una habilidad de unión depend se une repetidamente al receptor de IL-6 y se ablemente la proporción PK/PD. O sea, se espera qu ti-IL6 1 y el Clon Anti-IL6 2, que tienen una habilidad pendiente del pH, se unan repetidamente a más antíg significativamente mejor PK/PD, en comparación co de tipo salvaje. emplo 17] Construcción de Anticuerpo Anti-Recept con Unión Dependiente del pH presión y Purificación de Anticuerpo Anti-Receptor En los Ejemplos 1 a 15, se crearon con éxito una p anticuerpos anti-receptor de IL-6 humanizados que se ma dependiente del pH al receptor de IL-6 confir pendencia de pH a través de la introducción de sust histidina y similares en la región variable, en particula eptor de IL-31 de ratón, y se construyó un anticue eptor de IL-31 incluyendo la cadena H (WT) (secu inoácidos: SEC ID N° 67) y la cadena L (WT) (secu inoácidos: SEC ID N° 68), que se une al receptor de ón como se describe en WO 2007/142325, ("Anti-IL31 Ivaje"). Usando un método conocido por los expert nica, se insertaron fragmentos de genes que codifican uencias de aminoácidos de interés en un vector de e células de mamíferos para construir el vector de expr ena H y el vector de expresión de cadena L de i n t terminó la secuencia de nucleótidos de los expresión resultantes usando un método r los expertos en la técnica. Se expresó y purificó a tipo salvaje mediante el método que se describe en el nstrucción de Anticuerpo Anti-Receptor de pendiente del pH ostraron una unión dependiente del pH. La unión a p ujo significativamente en comparación con la unión a posición de las sustituciones de histidina en lo endientes del pH se muestra en la Tabla 15. Un Ejem on Anti-IL31R 1" incluyendo la cadena H (c1) (secu inoácidos: SEC ID N° 69) y la cadena L (WT). El e 1R 1 se expresó y purificó usando el método que se el Ejemplo . bla 15] Posición de Sustitución de Histidina en lo pendientes del pH H33 álisis de Unión de Clones Dependientes del pH a luble de IL-31 El análisis cinético de las reacciones antígeno-anti 5.5 y pH 7.4 se llevó a cabo usando Biacore T althcare) para los dos tipos de anticuerpos preparados ncionó previamente; Anti-IL31R de tipo salvaje y c tasa de asociación (1/Ms) y las constantes de ociación kd (1/s) usando Biacore T100 Evaluation E Healthcare), y se calcularon las constantes de disoci ) en base a esos valores (Tabla 16). Además se c porción de afinidad a pH 5.5 y pH 7.4 para cada e luar la unión dependiente del pH. bla 16] Comparación de Unión de Clones Dependie a Receptor de IL-31 de Ratón La proporción de afinidad a pH 5.5 y pH 7.4 anticuerpos anti-receptor de IL-6 y anticuerpos anti den construir anticuerpos anti-receptor de IL-31 pendiente del pH que se unen al antígeno fuertemente diciones neutras del plasma, pero débilmente diciones ácidas del endosoma, mediante la introdu tituciones de histidina y similares principalmente uencias de aminoácidos de la CDR. Como se índic implos 1 a 15, un anticuerpo anti-receptor de IL-6 que bilidad de unión dependiente del pH se une repetida eptor de IL-6 y mejora notablemente su PK/PD. O era que el clon Anti-IL31R 1, que tiene la habilidad pendiente del pH, se una repetidamente a más antíg a significativamente mejor PK/PD, en comparación co 1 R de tipo salvaje. emplo 18] Unión Repetitiva a Antígeno Mediante An Unión Dependiente del pH (secuencia de aminoácidos: SEC ID N° 12) usando e se indica en el Ejemplo 1. Como anticuerpos que se ma dependiente del pH al receptor de IL-6, se expr rificaron H 170/L82-lgG 1 del Ejemplo 3 incluyend cuencia de aminoácidos: SEC ID N° 4) y L82 (secu inoácidos: SEC ID N° 7), y Fv4-lgG1 del Ejemplo 10 in H3-lgG1 (SEC ID N° 23) y VL3-CK (SEC ID N° 27), U todo que se indicó en el Ejemplo 1. álisis de Unión de Cada Tipo de Anticuerpo al luble de IL-6 Se llevó a cabo un análisis cinético de las re ígeno-anticuerpo a pH 7.4 y pH 5.8 usando Biacore althcare) para los cuatro tipos de anticuerpos prepara 1, H54/L28-lgG1 , H 170/L82-lgG 1 , y Fv4-lgG1 (amor S 10 mM (pH 7.4 o pH 5.8), NaCI 150 mM, Surfacta 5%). Se unieron los anticuerpos a un chip sensor sob inmovilizó proteína A/G recombinante (Pierce) - bla 17] Comparación de Tasas de Asociación (ka), ociación (kd), y Constantes de Disociación de Cada ticuerpo Contra Receptor Soluble de IL-6 (SR344) Depe Muestra pH 7.4 pH 5.8 del ka Kd KD ka Kd KD kd (1/Ms) (1/s) (M) (1/Ms (1/s) (M) (pH ) 5.8)/ kd (PH 7.4) T-lgG1 4.9E + 9.4E 1.9E 8.9E + 2.7E 3 .1 E- 2.9 5 -4 -9 5 -3 9 54/L28- 8.3E + 1.4E 1.7E 2.4E + 2.7E 1 1E- 2.0 lgG1 5 -3 -9 6 -3 9 170/L8 6.7E + 1.1 E 1.6E 1.2E + 1.3E 1 .0E- 11.4 pectivamente. Además, se calculó la proporción de ociación (kd) a pH 5.8 y pH 7.4 para cada anticu porción kd, que indica la tasa de disociación depend para SR344, fue de 2.9; 2.0; 11.4 y 38.8 para \ 4/L28-lgG1, H170/L82-lgG1 , y Fv4-lgG1, respectivam nsiguiente, se confirmó que H170/L82-lgG1 y muestran una unión dependiente del pH, e los anticuerpos convencionales WT-lgG1 y H54/ hiben muy poca habilidad. Además, debido a que la ) de estos anticuerpos a pH 7.4 fue casi igual, s e su habilidad para unirse a SR344 en el pía uivalente. sayos de Farmacocinéttca In vivo Usando Ratones Se evaluaron la farmacocinética de SR344 y del a ti-receptor de IL-6 humano luego de una administr amente una dosis simple de SR344 (receptor de IL-6 se preparó en el Ejemplo 1), o bien la admin idal mediante administración en una dosis a 10 ml/kg. s el anticuerpo anti-receptor de IL-6 humano estaba una cantidad en exceso adecuada en relación a S jeraba que casi todas las moléculas de SR344 estén u anticuerpo. Se colectaron muestras de sangre a 15 m ras, 8 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 7 días, 14 is, y 28 días luego de la administración. Las mué ngre colectada se centrifugaron inmediatamente du utos a 15,000 rpm y 4°C para obtener el plasma. E arado se almacenó en un congelador a -20°C o menos mento de la medida. Se usaron los antes descritos 4/L28-lgG1, H 170/L82-lgG , y Fv4-lgG1 como anticuer eptor de IL-6 humano. dida de Concentración Plasmática de Anticuer ceptor de IL-6 Humano Mediante ELISA Se midió la concentración de anticuerpo anti-recept ibración y de las muestras de plasma, y luego se dej estras en reposo durante 1 horas a temperatura a bsiguientemente, se dispensaron las muestras en la anti-lgG humana inmovilizada, y se dejó en reposo d a a temperatura ambiente. Luego, se agregó a tinilado Anti-IL-6R Humano (R&D) para que reaccione hora a temperatura ambiente. Subsiguientemente, s eptavidin-PolyHRP80 (Stereospecific Detection Tech ra que reaccione durante 1 hora a temperatura ambie ó a cabo la reacción cromogénica usando T I mponent HRP MicroweII Substrate (BioFX Laboratori trato. Luego de detener la reacción con ácido sulfú owa Chemical), se midió la absorbancia a 450 nm tor de microplacas. Se calculó la concentración en pl ón a partir de la absorbancia de la curva de calibració programa analítico SOFTmax PRO (Molecular Devi so temporal de la concentración en plasma lueg muestras de plasma de ratón diluidas 50 veces o r estras se mezclaron con una solución de A nocional Anti-IL-6R Humano (R&D) marcado con rut lfo-Tag NHS Ester (Meso Scale Discovery), A tinilado Anti-IL-6R Humano (R&D), y WT-lgG1, y aron reaccionar durante una noche a 37°C. La conc al de WT-lgG1 fue de 333 pg/ml, lo que representa u respecto a la concentración de anticuerpo anti-recept umano contenido en las muestras, con el propósito de as las moléculas de SR344 en las muestras al \ bsiguientemente, se dispensaron las muestras en un Streptavidin Píate (Meso Scale Discovery), y se ccionar durante 1 hora a temperatura ambiente, y s o un lavado. Inmediatamente después de agregar Re (x4) (Meso Scale Discovery), se llevó a cabo la el Sector PR 400 Reader (Meso Scale Discov culó la concentración de SR344 en base en la r unión dependiente del pH, y H 170/L82-lgG 1 y Fv4-I demuestran una unión dependiente del pH, el curso la concentración fue casi idéntico para WT-lgG1, 1 y Fv4-lgG1, mientras que H 170/L82-lgG 1 se elim s rápidamente. Los datos de curso temporal centración en plasma se analizaron mediante el pro álisis de farmacocinética WinNonlin (Pharsight). L dias en el plasma para WT-lgG1, H54/L28-lgG 1 , Fv4 70/L28-lgG1 fueron 21.0; 28.8; 26.2 y 7. pectivamente.

Como se describió en el Ejemplo 2, cuando el ant antígeno soluble, el anticuerpo administrado se ígeno en el plasma, y queda retenido en el plasma en un complejo antígeno-anticuerpo. Por lo general, en un tiempo de retención en plasma extremadamente anticuerpo (la tasa de eliminación es extremadame bido a la función del FcRn, el tiempo de retención en p inistración conjunta de SR344 con un a vencional, WT-lgG1 o H54/L28-lgG1 , que no demues ión dependiente del pH, la tasa de eliminación de S ujo considerablemente, y se prolongó el tiempo de r plasma de SR344 (vida media en plasma: 5.3 días 1, 6.3 días para H54/L28-lgG1 ). Estos es debido a as las moléculas de SR344 estaban unidas a los ant se administraron juntos, y por consiguiente el SR3 r los anticuerpos tuvo un tiempo de retención prolon sma similar al del anticuerpo, debido a ia función d o se describió anteriormente.

En el caso de la administración concurrente de SR3 icuerpo H 170/L82-lgG 1 o con Fv4-lgG1, los que de a unión dependiente del pH, la eliminación de S nificativamente rápida (vida media en plasma: 1.3 d 70/L82-lgG1 , 0.6 días para Fv4-lgG1), en comparació o de la administración concurrente de WT-lgG1 o diante el concepto de la presente tecnología, el estra en la FIG. 4. En el caso de los an vencionales que no demuestran una unión dependient complejo anticuerpo- antígeno soluble es tomado dosomas mediante pinocitosis en el plasma, y se une resado en los endosomas bajo las condiciones acida los endosomas. Debido a que el complejo anticuerpo-luble unido al FcRn se transfiere desde la superfici mo tal, y retorna nuevamente al plasma, al antígeno icuerpo tiene un tiempo de retención en plasma pr iilar al del anticuerpo (la tasa de elimina remadamente lenta). Por otro lado, en el caso icuerpos que demuestran una unión dependiente d ígeno se disocia del anticuerpo bajo las condicione ntro del endosoma, y por lo tanto solo el anticuerpo s Rn y retorna nuevamente al plasma. Debido a que el ociado del anticuerpo se degrada en los lisosomas sin osomas. Por el contrario, en el caso de la admin currente de SR344 con el anticuerpo H 170/L82-lgG -lgG1, los que demuestran una unión dependiente d minación de SR344 es extremadamente rápida, debi 344 se disocia del anticuerpo en el entorno intraendo o pH. O sea que, debido a que los anticuerpos H170/ v4-lgG1, que demuestran una unión dependiente de ocian de SR344 en el entorno intraendosomal de baj era que la mayoría del H 170/L82-lgG 1 o del Fv4-l a retornado nuevamente a! plasma con FcRn no esté 344. Por consiguiente, como se muestra en la FIG. 4, , mediante la disociación del antígeno en el raendosomal de bajo pH y mediante el retorno al pla Rn sin una unión al antígeno, un anticuerpo que demu ión dependiente del pH puede unir nuevamente a un el plasma. También se demostró que, mediante la r este proceso, el anticuerpo que demuestra un Cuando el antígeno es un antígeno soluble, y el ant a un anticuerpo bajo las condiciones neutras del plas disocia del anticuerpo dentro de los endosomas ttcuerpo retornando al plasma junto al FcRn, el a de unirse nuevamente a un antígeno bajo las co utras del plasma. Por consiguiente, un anticuerpo que bilidad de disociarse de un antígeno bajo las co idas dentro del endosoma se puede unir a antígenos es. En comparación al caso en el cual un antígeno u ticuerpo no se disocia del anticuerpo dentro de los en sea, el antígeno unido al anticuerpo retorna al plasm ígeno unido a un anticuerpo se disocia del anticuerp los endosomas, se incrementa la tasa de e I i smática del antígeno, debido a que el antígeno se tra lisosomas y se degrada. Por consiguiente, la minación plasmática de un antígeno se puede usar ice para determinar si un anticuerpo puede unir a un el caso de un anticuerpo convencional que no demu ión dependiente del pH. Por consiguiente, se pued siderablemente la cantidad de anticuerpo que se adm pueden prolongar los intervalos de administración dida.

La unión repetitiva a múltiples antígenos de este m basa en una reacción antígeno- anticuerpo que es dep \ pH. Por consiguiente, sin importar el tipo de antíge ede construir un anticuerpo que demuestre un pendiente del pH para unir a un antígeno al pH 7.4 de ro para disociarse del antígeno al pH ácido dentr dosomas, entoaces tal anticuerpo se puede unir repeti últiples antígenos. Por consiguiente, la presente tecn l en que se la puede aplicar no solo a anticuerpos eptor de IL-6, a IL-6, o al receptor de IL-31, sino neral a cualquier anticuerpo contra cualquier antíg ortar el tipo de antígeno.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una molécula de unión al antígeno, tiene un (pH 5.8)/KD(pH 7.4), definido como la relación entre I ígeno pH 5.8 y ia KD del antígeno pH 7.4, de 2 o más. 2. La molécula de unión al antígeno de conform reivindicación 1, en donde el valor de KD(pH 5.8)/KD de 10 o más. 3. La molécula de unión al antígeno de conform reivindicación 1, en donde el valor de KD(pH 5.8)/KD de 40 o más. 4. La molécula de unión al antígeno de conform lquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde al inoácido de la' molécula de unión al antígeno ha sido s r histidina, o se ha insertado al menos una histidi lécula de unión al antígeno. 5. La molécula de unión al antígeno de conform ión al antígeno es un anticuerpo. 8. Una composición farmacéutica en donde com lécula de unión al antígeno de conformidad con cualq reivindicaciones 1 a 7. 9. Un método para mejorar la farmacocinética lécula de unión al antígeno, que comprende re ividad de unión al antígeno de la molécula de ígeno pH 5.8, en comparación con la actividad pH 7.4. 10. Un método para incrementar la cantidad de v une a los antígenos una molécula de unión al antíg prende reducir la actividad de unión al antígen lécula de unión al antígeno pH 5.8, en comparació ividad pH 7.4. 11. Un método para incrementar la cantidad de a os que puede unirse una molécula de unión al antíg prende reducir la actividad de unión al antígen lécula de unión al antígeno pH 5.8, en comparació ernalizada en una célula, en una forma libre de antíg prende reducir la actividad de unión al antígen lécuia de unión al antígeno pH 5.8, en comparació ividad pH 7.4. 14. Un método para incrementar la capacidad lécula de unión al antígeno de eliminar un antígeno en e comprende reducir la actividad de unión al antíge lécula de unión al antígeno pH 5.8, en comparació ividad pH 7.4. 15. El método de conformidad con cualquiera vindicaciones 9 a 14, en donde el valor de KD(pH 5. ), definido como la relación entre la KD del antígeno KD del antígeno pH 7.4, es de 2 o más. 16. El método de conformidad con cualquiera vindicaciones 9 a 14, en donde el valor de KD(pH 5. ) es de 10 o más. 17. El método de conformidad con cualquiera une a los antígenos una molécula de unión al antí de comprende sustituir al menos un aminoácido de la unión al antígeno por histidina, o insertar al me tidina en la molécula de unión al antígeno. 20. Un método para incrementar la cantidad de a os que puede unirse una molécula de unión al antí nde comprende sustituir al menos un aminoácido de la unión al antígeno por histidina, o insertar al me tidina en la molécula de unión al antígeno. 21. Un método para disociar, dentro de una c ígeno de una molécula de unión al antígeno que se un exterior de la célula, en donde comprende sustituir al inoácido de la molécula de unión al antígeno por his ertar al menos una histidina en la molécula de ígeno. 22. Un método para liberar de la célula una mo ión al antígeno que ha estado unida a un antígeno y histidina en la molécula de unión al antígeno. 24. El método de conformidad con cualquiera vindicaciones 18 a 23, en donde la sustitución por histi erción de histidina incrementan el valor de KD(pH 5. ), definido como la relación entre la actividad de ígeno pH 5.8 y la actividad de unión al antígeno pH paración con el valor de KD(pH 5.8)/KD(pH 7.4) ant titución por histidina o la inserción de histidina. 25. El método de conformidad con cualquiera vindicaciones 9 a 24, en donde la molécula de ígeno tiene actividad antagónica. 26. El método de conformidad con cualquiera vindicaciones 9 a 25, en donde la molécula de ígeno se une a un antígeno de membrana o un uble. 27. El método de conformidad con cualquiera vindicaciones 9 a 26, en donde la molécula de ividad de unión al antígeno a un pH de entre 6.7 y yor que su actividad de unión al antígeno a un pH de .5. 29. El método de filtrado de conformidad vindicación 28, en donde comprende la etapa de selec icuerpo cuya actividad de unión al antígeno a un pH y 10.0 es el doble o más de la actividad de unión al n pH de entre 4.0 y 6.5. 30. Un método para filtrar una molécula de ígeno, en donde comprende las siguientes etapas: (a) unir una molécula de unión al antígeno a un o una condición con un pH de entre 6.7 y 10.0; (b) colocar la molécula de unión al antígeno ígeno de (a) bajo una condición con un pH de entre 4 (c) obtener una molécula de unión al antígeno o una condición con un pH de entre 4.0 y 6.5. undo pH; y (c) recolectar la molécula de unión al antígeno ext 32. Un método para filtrar una molécula de ígeno cuya actividad de unión a un primer pH es may segundo pH, en donde comprende las siguientes etapa (a) unir una biblioteca de moléculas de unión al a columna con un antígeno inmovilizado bajo una cond primer pH; (b) eluir la molécula de unión al antígeno de la o una condición con el segundo pH; (c) amplificar el gen que codifica la molécula de ígeno extraído; y (d) obtener la molécula de unión al antígeno extra 33. El método de filtrado de conformidad vindicación 31 ó 32, en donde el primer pH es de en .O, y el segundo pH es de entre 4.0 y 6.5. 34. El método de filtrado de conformidad con cual 36. El método de filtrado de conformidad con cual reivindicaciones 28 a 33, en donde es para obt lécula de unión al antígeno que es capaz de unir tígeno dos o más veces. 37. El método de filtrado de conformidad con cual reivindicaciones 28 a 33, en donde es para obt lécula de unión al antígeno que es capaz de unirs tígenos, en comparación con la cantidad de sitios de tígeno que posee. 38. El método de filtrado de conformidad con cual reivindicaciones 28 a 33, en donde es para obt lécula de unión al antígeno que se disocia, dentro lula, de un antígeno unido desde el exterior de la célul 39. El método de filtrado de conformidad con cual reivindicaciones 28 a 33, en donde es para obt lécula de unión al antígeno que está unida a un antíg o internalizada en una célula, y que luego ha sido lib 42. El método de filtrado de conformidad con cual reivindicaciones 28 a 41, en donde la molécula de ígeno es un anticuerpo. 43. Un método para producir una molécula de ígeno en donde comprende las siguientes etapas: (a) determinar la actividad de unión al antígeno iécula de unión al antígeno a un pH de entre 6.7 y 10. (b) determinar la actividad de unión al antíge iécula de unión al antígeno a un pH de entre 4.0 y 6.5; (c) seleccionar la molécula de unión al antíge ividad de unión al antigeno a un pH de entre 6.7 y yor que a un pH de entre 4.0 y 6.5; (d) obtener el gen que codifica la molécula de tígeno seleccionada en (c); y (e) producir la molécula de unión al antígeno u n obtenido en (d). 44. Un método para producir una molécula de (d) obtener el gen que codifica la molécula de ígeno obtenida en (c); y (e) producir la molécula de unión al antígeno u n obtenido en (d). 45. Un método para producir una molécula de ígeno cuya actividad de unión a un primer pH es may segundo pH, en donde comprende las siguientes etapa (a) unir una molécula de unión al antígeno a una un antígeno inmovilizado bajo una condición con u (b) eluir de la columna la molécula de unión al e se había unido a la columna al primer pH, bajo una un segundo pH; (c) recolectar la molécula de unión al antígeno ext (d) obtener el gen que codifica la molécula de ígeno obtenida en (c); y (e) producir la molécula de unión al antígeno u o una condición con un segundo pH; (c) amplificar el gen que codifica la molécula de ígeno extraído; (d) recolectar la molécula de unión al antígeno ext (e) obtener el gen que codifica la molécula de ígeno recolectada en (d); y (f) producir la molécula de unión al antígeno u n obtenido en (e). 47. El método de producción de conformidad vindicación 45 ó 46, en donde el primer pH es de en .O, y el segundo pH es de entre 4.0 y 6.5. 48. El método de producción de conformid lquiera de las reivindicaciones 43 a 47, en donde co más la etapa de sustituir al menos un aminoácid lécula de unión al antígeno por histidina, o insertar histidina en la molécula de unión al antígeno. 49. El método de producción de conformid