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WO2023120524A1 - 結核感染試料のスクリーニング方法及びこれに用いるプローブセット - Google Patents

結核感染試料のスクリーニング方法及びこれに用いるプローブセット Download PDF

Info

Publication number
WO2023120524A1
WO2023120524A1 PCT/JP2022/046903 JP2022046903W WO2023120524A1 WO 2023120524 A1 WO2023120524 A1 WO 2023120524A1 JP 2022046903 W JP2022046903 W JP 2022046903W WO 2023120524 A1 WO2023120524 A1 WO 2023120524A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tuberculosis
sample
hsa
mir
urine
Prior art date
Application number
PCT/JP2022/046903
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
靖士 神田
利正 西山
敬紀 下埜
Original Assignee
学校法人関西医科大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 学校法人関西医科大学 filed Critical 学校法人関西医科大学
Priority to CN202280084658.8A priority Critical patent/CN118414437A/zh
Priority to JP2023569461A priority patent/JPWO2023120524A1/ja
Publication of WO2023120524A1 publication Critical patent/WO2023120524A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes

Definitions

  • the present invention relates to a screening method for separating a large number of test samples into samples that may be positive for tuberculosis infection and samples that may be negative for tuberculosis infection. screening methods and test probe sets.
  • test method for diagnosing tuberculosis infection
  • a test method Quantiferon ( (registered trademark) TB and T-spot (registered trademark) TB
  • blood is collected from a subject, lymphocytes are separated, a certain amount is dispensed into a culture plate coated with an anti-human interferon ⁇ antibody, and tubercle bacillus-specific antigens ESAT-6 and CFP-10 are added. , culturing for about 20 hours, and then counting the number of INF- ⁇ -producing cells bound to the anti-human INF- ⁇ antibody.
  • INF- ⁇ is not only produced by Mycobacterium tuberculosis, but also in patients infected with HIV (human immunodeficiency virus) (co-infected patients with HIV infection and tuberculosis infection).
  • HIV human immunodeficiency virus
  • MPB64 antibody is known as an antibody specific to active tuberculosis patients. It is also known to determine whether the It has been reported that MPB64 antibody is also present in urine and correlates with the results of using serum as a measurement sample (Non-Patent Document 1: Yasuko Tamada et.al., Microbiol immunol 2012;56:740 -747).
  • urine which is easy to collect, can be used as a measurement sample, so it is suitable as a method that can quickly determine the presence or absence of tuberculosis infection in developing countries where tuberculosis infection is likely to spread. is.
  • cross-reacting antibodies are also known to exist, which may result in false positive test results in BCG vaccinated individuals.
  • miRNA As a biomarker in addition to antibodies, cells, cytokines, and the like. Abnormal expression of miRNAs has been found to be involved in the onset and malignancy of many diseases, and since miRNAs can also be detected in body fluids such as blood, attention is being focused on their use as liquid biopsies. . In recent years, the use of miRNA as a diagnostic marker has been variously reported mainly for cancer (Patent 5156829 (various cancers: Patent Document 1), Patent 6489583 (Pancreatic cancer: Patent Document 2), WO2019/244575 (Stomach cancer: Patent document 3)).
  • two types of miRNA are identified as biomarkers, and the abundance of the miRNA that serves as the biomarker in blood samples is compared with the abundance of the same miRNA in healthy subjects to determine the possibility of developing pancreatic cancer. are doing.
  • the two types of miRNAs are a combination of miRNAs whose abundance increases and miRNAs whose abundance decreases when the possibility of developing pancreatic cancer is high compared to healthy subjects.
  • the ⁇ Ct value after correction using cel-miR39 as an external control from the Ct value of the measurement sample, subtract the Ct value of cel-miR39 contained in the sample other) are used. Positive and negative discrimination is performed based on the cutoff value calculated based on the ⁇ Ct value for the biomarker miRNA.
  • Patent Document 3 proposes a method for determining the presence of gastric cancer using the expression level of miRNA identified as a gastric cancer biomarker as an indicator.
  • specific miRNAs hsa-miR3610, hsa-miR4669
  • ⁇ Ct value the value obtained by subtracting the Ct value of the normalization factor from the biomarker Ct value
  • Patent Document 4 using a minimally invasive sample (serum here), as a biomarker that can be used for population screening for separating positive and negative samples of colorectal cancer, It has been proposed to identify specific piRNAs (non-coding RNA molecules that are longer (26-31 nucleotides) than miRNAs) and compare the expression levels of marker RNAs with reference expression levels.
  • the expression level used for comparison is the expression level normalized with miR93-5p as a normalization marker (endogenous control), and the determination of the cut-off value for discrimination judgment is performed in the healthy subject group and the colon patient group. , can be determined by statistical analysis of normalized expression levels.
  • Non-Patent Document 2 Naveed Sabir et.al., Frontiers in Microbiology vol.9, March 2018
  • Table 1 of Non-Patent Document 2 human peripheral blood , whole blood, serum, or macrophages as specimens, miRNAs that can be candidates for biomarkers have been introduced.
  • the miRNAs shown in Table 1 even if we focus on human peripheral blood and serum, they vary depending on the reference literature, and what degree of specificity each miRNA has as a diagnostic marker It has not been clarified whether the miRNAs shown in Table 1, even if we focus on human peripheral blood and serum, they vary depending on the reference literature, and what degree of specificity each miRNA has as a diagnostic marker It has not been clarified whether the miRNAs shown in Table 1, even if we focus on human peripheral blood and serum, they vary depending on the reference literature, and what degree of specificity each miRNA has as a diagnostic marker It has not been clarified whether the miRNAs shown in Table 1, even if we focus on human peripheral blood and serum, they vary depending on the
  • blood as a test sample is excellent as a liquid biopsy, it is necessary to collect blood for examination, and the examination method in developing countries is limited to patients who are strongly suspected of being infected with tuberculosis. It is of limited application as a testing method for broadly screening tuberculosis-infected patients.
  • the present invention is a tuberculosis infection using a biomarker that can provide useful information on the presence or absence of infection in a short time and at a low cost using a liquid biopsy that is less invasive, especially urine that is easy to collect specimen samples. It is to provide a screening method for the presence or absence of and a screening probe set.
  • the present inventors comprehensively detected and analyzed miRNA contained in urine collected from patients with active tuberculosis and healthy subjects, and found that miRNAs were specifically increased/decreased in tuberculosis-infected patients compared to healthy subjects.
  • a patent application was filed after identifying miRNAs that can be used as indicators for determining tuberculosis infection as biomarker candidates (PCT/JP2021/023027).
  • miRNA concentration the amount of miRNA contained in the collected urine sample. Therefore, the determination based on the result of comparing the expression level of the miRNA selected as a biomarker (content in the urine sample) and the expression level of the same miRNA in healthy subjects by simple relative content lacks reliability. become.
  • focusing on the expression frequency of miRNA by comparing the expression frequency of the biomarker miRNA of the subject and the average expression frequency of healthy subjects, it is possible to determine whether the expression of the biomarker miRNA is enhanced / decreased. If so, the problem of concentration differences between individuals can be resolved.
  • miRNAs used as biomarkers generally do not have a very high expression frequency (approximately 0 to 2.5%). It is required to accurately grasp the total amount that will be the number. In addition, from the viewpoint of increasing the accuracy of the total amount, it is necessary to detect many types of miRNA. In this sense as well, RNA arrays equipped with many types of primer probes, expensive PCR equipment, and a large number of measurement engineers and analysts are required.
  • the present inventors have found that the expression of miRNAs used as biomarkers is enhanced/decreased compared to healthy subjects without measuring the total amount of most miRNAs expressed in each individual (total read number). Further examination was carried out on the method of determining which is the case. Then, various studies were conducted on miRNAs that serve as a standard (internal control for standardization) for determining whether the expression of miRNAs that serve as biomarkers for tuberculosis infection is increasing or decreasing in individual individuals.
  • miRNA that is constantly expressed in all individuals in all individuals, a certain level of expression can be expected at all times
  • miRNA with small individual variation small individual variation in expression frequency
  • the present inventors identified miRNA (internal control for standardization) that can satisfy the above requirements, and found that the presence or absence of tuberculosis infection can be determined by using the relative content of this internal control for standardization with respect to miRNA as an index, We have completed the present invention.
  • the screening method for tuberculosis-infected samples of the present invention is selected from miRNAs (sequence ID: 2 to sequence ID: 33 and/or sequence ID: 34 to sequence ID: 73) contained in urine-derived samples of subjects.
  • a method for screening a tuberculosis-infected sample by detecting one or more biomarker miRNAs comprising: obtaining the ratio [B/S] of the biomarker miRNA content B to the hsa-miR-423-5p (sequence ID: 1) content S in the urine-derived sample; and The ratio [B / S] of the subjects who were tested is the ratio N (B / S) of the content B of the biomarker miRNA to the content S of hsa-miR-423-5p in the urine-derived sample of healthy subjects and tuberculosis
  • the sorting step is a step of sorting into tuberculosis-infected samples when the [B/S] of the subject is smaller than the cutoff value.
  • the fractionation step includes a fractionation step (first fractionation step) using miRNAs selected from SEQ ID: 2 to SEQ ID: 33 as biomarkers, and miRNAs selected from SEQ ID: 34 to 73.
  • first fractionation step using miRNAs selected from SEQ ID: 2 to SEQ ID: 33 as biomarkers
  • miRNAs selected from SEQ ID: 34 to 73 are selected from SEQ ID: 34 to 73.
  • a method for screening tuberculosis-infected samples comprises: hsa-miR-423-5p (sequence ID: 1) in the urine-derived sample of the subject, and hsa-miR-532-3p (sequence ID: 49), hsa-miR-423-3p (sequence measuring the content of at least two of ID: 56) and hsa-miR-451a (sequence ID: 37);
  • the step of fractionating the tuberculosis-infected sample consists only of the second fractionation step of the type I screening method, and a plurality of markers are used as biomarkers used in the comparison step. This makes it possible to ensure the accuracy of determination.
  • the test probe set used for tuberculosis-infected sample screening of the present invention includes a nucleotide probe for standardization that can hybridize with hsa-miR-423-5p under stringent conditions and has a detectable label; A probe set for testing active tuberculosis containing at least one selected from the group consisting of nucleotide probe 1 and nucleotide probe 2.
  • Probe 1 A nucleotide probe that can hybridize under stringent conditions with one or more selected from sequence ID2 to sequence ID33 and has a detectable label
  • Probe 2 from sequence ID34 to sequence ID73 A nucleotide probe capable of hybridizing under stringent conditions to one or more selected species and having a detectable label.
  • Probe 1 and Probe 2 are included in the implementation of Type I tuberculosis infection sample screening.
  • a test probe set containing a combination of the above standardization nucleotide probe and probe 3 below is used.
  • Probe 3 A set of marker nucleotide probes that can hybridize with each of the probes of SEQ ID: 49 and SEQ ID: 56 under stringent conditions and have a detectable label.
  • tuberculosis refers to an infectious disease caused by Mycobacterium tuberculosis. It refers to the state of active tuberculosis in which symptoms such as coughing and weight loss have already appeared, and tuberculosis bacteria are detected in sputum. On the other hand, the presence or absence of latent tuberculosis infected with Mycobacterium tuberculosis, although there are no abnormalities in clinical findings such as symptoms, chest X-ray findings, and bacteriological examination findings, is not included.
  • the term "healthy subject” refers to a specimen derived from a person who is tuberculosis-negative with no tuberculosis bacteria detected in sputum, and who can be certified as AIDS-negative based on the ratio of CD4-positive T cells.
  • miRNA refers to miRNA identified by a sequence ID (sequence No) when identified by the sequence.
  • sequence ID sequence No
  • miRNA genes correspond to initial transcripts transcribed by RNA polymerase II and have a hairpin loop structure.
  • the concept also includes pre-miRNA corresponding to the precursor of miRNA in a state in which the pri-mRNA is partially cleaved by RNaseIII-like Drosha.
  • the term "miRNA content” refers to the amount of miRNA contained in a measurement sample, and can be usually quantified by real-time PCR.
  • Relative quantification standardized using an endogenous control (miRNA that is constantly present in patient and healthy subject specimens and has no difference in expression in both) so that absolute amounts obtained by absolute quantification and comparison between samples can be performed. includes both relative amounts obtained by
  • the ratio [B/S] of the content B of the biomarker miRNA and the content S of the standardization miRNA contained in the same measurement sample is used as a discriminant index for tuberculosis infection positive or negative, as a parameter Since it is used as an absolute amount, it does not matter whether it is an absolute amount or a relative amount.
  • the method using a calibration curve or the ⁇ Ct method may be used for quantification of the relative amount by real-time PCR.
  • the parameter used herein that is, the content ratio [B / S], is expressed as P (B / S) when the ratio of tuberculosis infected patients [B / S] is generally referred to, healthy
  • P B / S
  • N the ratio of tuberculosis infected patients
  • B/S the ratio of tuberculosis infected patients
  • the ratio B/S of persons it is written as N(B/S).
  • the content B of each biomarker in the sample is indicated using B (abbreviation of miRNA), such as B 532-3p when hsa-miR-532-3p is used as the biomarker.
  • the content ratio of the relevant biomarker to the standardization internal miRNA (endogenous control) (for example, in the case of hsa-miR-532-3p [B 532-3p / S], in the case of tuberculosis infected is abbreviated as P (532-3p) for healthy subjects, and N (532-3p) for healthy subjects.
  • miRNA expression frequency refers to the ratio of the number of target miRNA (eg, biomarker) reads to the total number of reads when read by a next-generation sequencer. It corresponds to the ratio (%) of the target miRNA content to the total miRNA content (usually 200 to 500 types) contained in a detectable amount in the sample.
  • cycle number means the number of repetitions of PCR performed until the target miRNA can be detected, and the cycle number (herein represented by “Ct”) is large. It means that the content of the target miRNA is small.
  • capable of hybridizing under stringent conditions means a nucleotide having a sequence complementary to each sequence of the target miRNA, or 85% or more, preferably 90% or more of the complementary sequence, More preferably, they have a sequence match of 95% or more.
  • the screening method for a tuberculosis-infected sample of the present invention uses a specific number of miRNAs as biomarkers, and uses the content ratio [B/S] of the biomarker to the content of the endogenous control as an index for determination. , there is no need to obtain the total amount of miRNA for calculating the expression frequency, and variation between individuals can be small. Therefore, with the screening method of the present invention, it is possible to separate a large number of samples into a potentially positive group and a possibly negative group in a short period of time without using expensive equipment such as a next-generation sequencer. becomes. Furthermore, since urine, which does not need to be collected by a specialist, is used as a specimen sample for measurement, it is possible to quickly and inexpensively screen a large number of specimens for possible positive samples.
  • FIG. 2 is a scatter diagram showing the expression levels of hsa-miR23-5p in all individuals measured in Examples.
  • FIG. 2 is a scatter diagram showing the content ratio [B/S] after normalization of hsa-miR532-3p.
  • Fig. 2 is a scatter diagram showing the content ratio [B/S] after normalization of hsa-miR423-3p.
  • Fig. 2 is a scatter diagram showing the content ratio [B/S] after normalization of hsa-miR451a.
  • FIG. 10 is a scatter diagram showing the normalized content ratio [B/S] of hsa-miR532-3p obtained in Verification 3;
  • FIG. 10 is a scatter diagram showing the normalized content ratio [B/S] of hsa-miR423-3p obtained in Verification 3;
  • the standardizing miRNA used in the screening method for tuberculosis-infected samples of the present invention is hsa-miR423-5p contained in individual specimens. Specifically, it has the nucleotide sequence "UGAGGGGCAGAGGAGCGAGACUUU" (sequence ID: 1).
  • miRNAs that can be used as biomarkers in the screening method for tuberculosis-infected samples of the present invention are miRNAs that are expressed up/down in the state of active tuberculosis compared to healthy subjects. Specifically, miRNAs (first group) that are overexpressed compared to healthy subjects and have the sequences shown in Table 1 (SEQ ID: 2-ID: 33); miRNAs that are decreased compared to healthy subjects (Group 2), miRNAs having the sequences shown in Table 2 (sequence ID: 34-ID: 73).
  • miRNAs comprehensively detect miRNAs contained in urine samples of tuberculosis-infected persons, and compared with the average profile of miRNAs contained in urine samples of healthy subjects, the expression frequency is significantly higher. Differences are recognized.
  • the miRNAs in the first group were found to be significantly overexpressed compared to the expression frequency in healthy subjects, and the miRNAs in the second group were found to be significantly decreased in expression.
  • p ⁇ 0.05 (preferably p ⁇ 0.01) as a significance level in the Mann Whitney U test with respect to the average content of the target miRNA in healthy subjects, containing Refers to cases where the amount increased (Table 1) or decreased (Table 2).
  • hsa-miR-532-3p SEQ ID: 49
  • hsa-miR-423-3p SEQ ID: 56
  • hsa-miR-451a sequence ID: 37
  • These miRNAs have a relatively high expression frequency, and there are few amplification errors that can occur when a urine specimen containing a low miRNA concentration is amplified and detected.
  • biomarkers may be used alone, but it is preferable to use two or more in combination. By using two or more types in combination, it is possible to increase the accuracy of determination based on markers. In particular, it is preferable to use miRNAs classified into the first group and miRNAs classified into the second group in combination. By combining two groups in which the increase and decrease in expression frequency are reversed due to tuberculosis infection, more reliable determination results (tuberculosis-positive or tuberculosis-negative) can be obtained. In addition, even in the case of HIV infection, the risk of misjudgment such as false positive or false negative can be reduced.
  • markers classified into the second group include a combination of hsa-miR-532-3p (sequence ID: 49) and hsa-miR-423-3p (sequence ID: 56), and hsa-miR-451a.
  • sequence ID: 49 hsa-miR-532-3p
  • hsa-miR-423-3p hsa-miR-451a.
  • the test probe set of the present invention is a probe set for determining the possibility of positive active tuberculosis in a sample derived from urine of a subject, and is a set combining probes for detecting the above biomarkers. .
  • an internal standard probe that detects the normalization miRNA (hsa-miR-423-5p), probe 1 that detects the biomarkers of the first group and / or probes that detect the biomarkers of the second group 2 (preferably probe 3).
  • the base sequence of hsa-miR-423-5p represented by SEQ ID: 1 ( UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU) has a sequence that matches 85% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and is labeled for detection.
  • the 5' end and 3' end of the sequence may be ligated with a primer sequence, a nucleotide chain for ligation for immobilization on a carrier, an adapter, etc. may be modified as appropriate.
  • Probe 1 Hybridizable under stringent conditions with one or more miRNAs contained in the first group (SEQ ID: 2 to SEQ ID: 33) shown in Table 1, and labeled for detection nucleotide probe or probe set
  • Probe 2 can hybridize under stringent conditions with a nucleotide represented by at least one selected from the group consisting of sequences ID: 37, ID: 49, and ID: 56, and is labeled for detection. It preferably contains a nucleotide probe that is
  • Probe 3 is a preferred embodiment of Probe 2, and is a marker nucleotide that can hybridize under stringent conditions with each of the probes of SEQ ID: 49 and SEQ ID: 56 and has a detectable label. A set of probes.
  • Probe 3 may further include a marker nucleotide probe that can hybridize with SEQ ID: 37 under stringent conditions and has a detectable label.
  • Probe 1, probe 2, and probe 3 only need to have a sequence that can hybridize under stringent conditions with the target miRNA.
  • a ligating nucleotide chain, an adapter, or the like for immobilization on a carrier may be ligated, and the phosphate moiety and sugar moiety may be appropriately modified.
  • a nucleotide that can hybridize under stringent conditions is a nucleotide having a complementary sequence to each sequence of the target miRNA, or a sequence that matches the complementary sequence by 85% or more, preferably 90% or more. more preferably 95% or more, particularly preferably 99% or more.
  • the probe set of the present invention is a probe set containing an internal standard probe and a biomarker probe, and includes the following combinations. ⁇ Internal standard probe and probe 1 ⁇ Internal standard probe and probe 2 ⁇ Internal standard probe, probe 1 and probe 2 ⁇ Internal standard probe and probe 3 ⁇ Internal standard probe, probe 1 and probe 3
  • the type of biomarker probes included is selected according to the type of screening method to be applied, ie the fractionation process to be employed. Note that the probe set may be provided as a microarray, probe panel, or the like.
  • the label may be either a known direct label or an indirect label that are suitably used for nucleotide probes.
  • Examples of direct labeling substances include isotopes such as 32 P;
  • examples of indirect labeling substances include antibodies, labeling enzymes such as the avidin-biotin system, chemiluminescence systems such as luminescence and quenching, fluorescent dyes, gold colloids, and the like.
  • a sample to be tested is urine collected from a subject.
  • urine collected from a subject.
  • saliva is also a sample that can be collected without relying on specific skilled workers, but it may not be easy to collect from dry mouth subjects such as the elderly.
  • urine is excellent as a test sample that can be easily collected from all subjects. Therefore, the screening method of the present invention is suitable as a simple screening method for comprehensively examining a large number of samples.
  • Urine tends to have less exosomes containing miRNA than blood, but compared to other body fluids, a large amount can be collected, and blood collection equipment such as a syringe is unnecessary. Since there is no risk of infection with blood-borne viral infections due to needle stick accidents or the like, it is preferable to use urine as a sample as a testing method to be carried out in developing countries.
  • Urine like other body fluids such as blood, contains exosomes containing mature miRNAs that serve as biomarkers.
  • Exosomes are one of the membrane vesicles secreted from cells, and generally have a diameter of 30 to 150 nm by electron microscopic observation. - Includes mRNA, DNA, enzymes, cytoskeletal proteins, signal molecules, etc.
  • Examples of urine-derived samples include exosome-enriched or crudely purified fractions (hereinafter referred to as "exosome-rich fractions”), and RNA-extracted samples. Among these, it is preferable to use a sample obtained by directly extracting RNA as the measurement sample from the viewpoint of determination accuracy.
  • RNA isolate RNA isolate
  • exosomes may be separated from urine specimens by size exclusion chromatography, centrifugation, etc.
  • RNA may be extracted from the resulting exosome-rich fraction, or exosomes may be separated using a commercially available kit.
  • direct RNA isolation may be performed.
  • isolation kits include ExoQuick TM Exosome precipitation solution series (e.g., ExoQuick-TC, ExoQuick-CG, etc., both manufactured by System Biosciences) as exosome isolation kits, and nucleic acid extraction samples from urine
  • the miRNeasy mini kit manufactured by Qiagen
  • MagMax mirVana Total RNA kit manufactured by Thermo Fisher
  • Magtration registered trademark
  • a method for recovering exosomes simply by sending an exosome-containing sample (urine) to a nanowire structure may be used.
  • it is a total RNA extraction sample prepared according to the protocol of the operation manual (urine sample) of MagMax TM mirVana Total RNA-Seq kit (Thermo Fisher).
  • RNA-containing sample RNA-containing sample
  • the probe set of the present invention is used. Then, luminescence intensity, radioactivity, fluorescence intensity, enzymatic activity, etc. may be measured based on the type of label used for the probe.
  • miRNA quantification examples include real-time PCR, microarray, northern blotting, liquid-phase nucleic acid hybridization, colorimetry, and the like.
  • a method of detecting a marker by coloration by combining the PCR method and the immunochromatography method may be used. These methods are appropriately selected according to the type of probe label used. For example, when a fluorescent label is used, it can be detected by visually observing the presence or absence of fluorescence emitted by hybridization. Also, by scaling the intensity according to the type of labeling substance, such as fluorescence intensity, it is possible to calculate the content and the content ratio.
  • the quantification performed by the screening method of the present invention is not limited to measurement of the absolute amount of the target miRNA contained in the measurement sample, and may be quantification of the relative amount.
  • the quantification of miRNA is a quantification for obtaining the ratio [B / S] of the content B of the biomarker miRNA to the content S of hsa-miR-423-5p. , without calculating the content of hsa-miR-423-5p as an endogenous control contained in the sample and the target biomarker miRNA, even if it is a method that can directly obtain [B / S] good.
  • the [B/S] of the measurement sample can be obtained by either the calibration curve method or the ⁇ Ct method.
  • the screening method of the present invention is a method for screening samples that may be positive for active tuberculosis from samples to be tested. It can be adopted as a screening method and as a simple test method for the first visit of a patient suspected of having tuberculosis.
  • the screening method of the present invention uses the ratio [B/S] of biomarker miRNA content B to hsa-miR-423-5p content S contained in the specimen sample as a positive/negative determination index. is characterized by
  • the hsa-miR-423-5p and the selected biomarker miRNA contained in the prepared measurement sample are detected and quantified, and the content of the biomarker miRNA with respect to the content S of hsa-miR-423-5p a step of obtaining the ratio of B [B/S]; and the obtained [B/S] is based on the same ratio N (B/S) of RNA-containing samples prepared from urine of healthy subjects by the same treatment method.
  • [B / S] of the subject is obtained by detecting hsa-miR-423-5p (content S) contained in the measurement sample and the selected biomarker miRNA (content B) by the above-described detection and quantification method. , After obtaining each, the [B / S] of the measurement sample may be calculated, or, like the ⁇ Ct method, based on the cycle number (Ct) of the measured value obtained by the real-time PCR method, directly [B /S] may be calculated.
  • [B/S] can be obtained directly from, for example, the specific intensity of the label.
  • the cut-off value is a threshold for [B/S] that can statistically distinguish between a group of healthy subjects and a group of tuberculosis-infected subjects, and can be appropriately set by ROC analysis or the like. For example, for a data group of tuberculosis patients [B/S] normalized by the average value of N (B/S) derived from a large number of healthy subject groups, a ROC curve is created and a large number of tuberculosis patients are included. A threshold that will be exceeded can be set as a cut-off value. In this case, the cut-off value corresponds to how many times the expression frequency of the same biomarker in healthy subjects.
  • the average value of N (B/S) for normalization is obtained by detecting and quantifying the marker miRNA of interest in the same manner as the method for obtaining [B/S] of the measurement sample for a population of healthy subjects. It is an average value obtained by going to The cut-off value used for comparison is appropriately determined depending on the type of miRNA, the preparation method of the sample for measurement, the type of label, the quantification method, and the like.
  • the subject's [B/S] acquisition process and comparison process are performed according to each biomarker.
  • the [B/S] obtained for each biomarker is compared with the corresponding cutoff value, and the sample measured based on the magnitude relationship with respect to the cutoff value Samples are sorted into tuberculosis-positive or negative samples.
  • the samples in Table 1 are selected as biomarkers, if the obtained [B/S] is higher than the cutoff value, the samples are sorted into tuberculosis-infected samples (first determination).
  • the miRNAs shown in Table 2 are selected as biomarkers, if the obtained [B/S] is lower than the cutoff value, the samples are separated into tuberculosis-infected samples (second judgment). .
  • each biomarker is compared to a predetermined cutoff value.
  • the screening method of the present invention may include either the first determination step or the second determination step, but from the viewpoint of increasing the determination accuracy, biomarkers are selected from both the first group and the second group. Then, it is preferable to perform the first determination and the second determination (type I screening method).
  • biomarkers used are only the first group or the second group, only one of the above first determination or second determination will be performed.
  • using a combination of multiple biomarkers belonging to the first group or the second group when the comparison results of the B / S value and the cutoff value of each biomarker all match, positive or negative It is possible to ensure the accuracy of determination by adopting the determination criteria for determination.
  • the order of these determinations is not particularly limited. A judgment may be made. Moreover, you may perform a 1st determination and a 2nd determination simultaneously. Multiple determinations can be made simultaneously by using the probe set of the present invention.
  • Screening methods that use biomarkers belonging to either the first group or the second group include, for example, screening methods that use a probe set in which an internal standard probe and probe 3 are combined (type II).
  • Urine specimens from 19 healthy Laotian subjects, 19 Laotian patients with active tuberculosis infection (two of whom were co-infected with HIV), and 12 Japanese COVID19 severely ill patients (without tuberculosis infection) were used. board. After collection, the urine samples were cryopreserved, and in the case of urine samples from patients with active tuberculosis, RNA samples for measurement were prepared after a storage period of one year or longer. For urine specimens from healthy subjects and COVID19 critically ill patients, the cryopreservation period was within 60 days.
  • RNA sample for measurement A total RNA extraction sample was obtained from 3 ml of a urine specimen according to the protocol of the operation manual (urine sample) of the MagMax TM mirVana Total RNA-Seq kit (Thermo Fisher). Specific procedures are as follows. 2.4 ml of Lysis Buffer was added to 3 ml of urine and shaken for 7 minutes (500 rpm). 350 ⁇ l of a separately prepared Binding Beads Mix (mixture of 234 ⁇ l of RNA Binding Beads and 116 ⁇ l of Lysis/Binding Enhancer) was added to the resulting mixed solution and shaken for 5 minutes (500 rpm).
  • Binding Beads Mix mixture of 234 ⁇ l of RNA Binding Beads and 116 ⁇ l of Lysis/Binding Enhancer
  • RNA extraction sample containing miRNA was obtained from 15 ml of urine sample.
  • 15 ml of urine sample was pretreated (centrifuged at room temperature (2000 x g) for 20 minutes, filtered by PVDF membrane filter (Millex-GV Syringe Filter Unit, 0.22 ⁇ m, (MERCK)) and concentrated (obtained in pretreatment).
  • 1.05 ⁇ m Urine Conditioning Buffer was added to the obtained filtrate, and after centrifugation (3000 x g) at room temperature for 20 minutes, a total RNA extraction sample was obtained according to the RNeasy Mini Kit protocol.
  • RNA extraction sample obtained in preparation method 1 or 2 an adapter was added and reverse transcription reaction was performed according to the operation manual of Ion Total RNA-Seq kit v2 for small RNA Libraries (Thermo Fisher).
  • a cDNA library for the next-generation sequencer was constructed. The sequence of the prepared cDNA library was analyzed using a next-generation sequencer Ion Torrent S5 (Thermo Fisher).
  • miRNAs registered on the data bank site: miRBase miRNAs registered on the data bank site: miRBase
  • the obtained sequences are comprehensively collated, and the number of reads for each miRNA is calculated to quantify the miRNAs in the sample, The percentage of total miRNA reads was calculated.
  • miRNA corresponding to the reference sequence was identified when 10 consecutive bases or more matched.
  • the content of the target miRNA was quantified by the qRT-real-time PCR method for the measurement sample prepared from the urine specimen by the preparation method 2.
  • the quantification method by the real-time PCR method is as follows.
  • RNA extraction samples were reverse transcribed using the miRCURY LNA miRNA PCR Starter Kit (Qiagen).
  • a reaction solution (10 ⁇ l) having the following composition (volume ⁇ l per sample) was used in a 0.2 ml tube.
  • 5 x miRCURY RT Reaction Buffer (buffer) 2.0 ⁇ l
  • 10 x miRCURY RT Enzyme Mix 1.0 ⁇ l Template RNA 6.5 ⁇ l 0.5 ⁇ l of nuclease-free water
  • Reverse transcription reaction was carried out under the following conditions using a thermal cycler, GeneAtlas G02 (ASTEC). Step 1: 60 minutes at 42°C Step 2: 5 minutes at 95°C Step 3: Store at 4°C
  • Real-time PCR 2-1 Real-time PCR reaction (SYBR Green method)
  • the cDNA synthesized by the reverse transcription was quantified by the real-time PCR method.
  • a 15-fold dilution of the synthesized cDNA (dilution with nuclease-free water) was used with the miRCURY LNA miRNA PCR Starter Kit (Qiagen) to prepare a reaction solution (the following composition, the amount added is ⁇ l per sample) of 10 ⁇ l. was prepared in a Strip Tube (0.1 ml) and performed using a real-time thermal cycler, Roter Gene Q (Qiagen).
  • the vertical axis represents the Ct of hsa-miR-423-5p in each sample (cycle number when hsa-miR-423-5p was detected in each sample). A larger Ct value indicates a smaller content.
  • "Heslthy” indicates healthy subjects
  • "TB” indicates tuberculosis patients
  • "TB+HIV” indicates co-infected tuberculosis and HIV patients
  • "Covid19” indicates Japanese severely ill patients with Covid19.
  • the Ct value was 20 to 24 in all tuberculosis infection-negative group (healthy subjects, Covid19), and it can be seen that there is little variation within the group. This indicates that hsa-miR-423-5p does not differ in urinary expression frequency between races. In addition, it can be seen that individual differences in the tuberculosis-negative group are small.
  • hsa-miR-423-5p is a microRNA with small individual differences even in the tuberculosis-positive group.
  • hsa-miR-423-5p is constantly present in urine specimens, has little variation due to individual differences, and is less affected by HIV infection, tuberculosis infection, and Covid19, another respiratory disease. It was confirmed that the miRNA was small and suitable as a normalizing miRNA for relative comparison.
  • Table 3 also shows the values normalized by the average value (B/S after normalization) for each test sample. Normalization is to convert when the average value is 1, and the content ratio of each sample [B 532-3p / S] is the average value of N (532-3p) 28.02, [B 423 -3p /S] by the average value of N(423-3p), 0.82.
  • the average value of P (B 532-3p /S) is 5.92
  • the average value of P (B 423-3p /S) is 0.44
  • both N (532-3p) is significantly lower than the average value.
  • ROC analysis was performed using statistical analysis software EZR (reference: Bone Marrow Transplantation (2013) 48, 452-458) to determine the cutoff value.
  • the obtained cut-off values are as follows. When setting the cut-off value using the marker miR532-3p, no. 23 were rejected by the test. Cutoff value for marker miR532-3p: 0.46 Cutoff value for marker miR423-3p: 0.73
  • FIGS. 2 and 3 Verification of Screening Method [B/S] after normalization of Tables 3 and 4 are shown in FIGS.
  • the data rejected by the test are not plotted.
  • the vertical axis indicates the content ratio [B/S] after normalization for each biomarker. That is, the average value of N(B/S) is 1.0.
  • the sample is a positive sample for tuberculosis infection, or negative It can be confirmed that it is possible to separate into samples. That is, according to the screening method of the present invention, simply by detecting and quantifying a specific number of miRNAs, it is possible to easily screen samples that are highly likely to be positive for tuberculosis infection.
  • the first group and the second group when only one of the first group and the second group is used as a biomarker, it is possible to reduce false negatives and false positives by using a plurality of types of biomarkers belonging to the group. For example, false positives can be avoided by classifying samples as positive for tuberculosis infection only when the results of comparison with cutoff values for all markers match.
  • hsa-miR-451a (ID: 37) was prepared by preparation method 2 in the same manner as in 1, samples from healthy subjects (No. 1 to 19) and tuberculosis patient group samples Real-time PCR was performed on RNA samples for measurement prepared from (Nos. 21 to 39). From the obtained Ct value, the content was calculated in the same manner as in Part 1, and the content (B) of each biomarker relative to the content (S) of the standardization miRNA (hsa-miR-423-5p) The ratio [B/S] of was calculated.
  • the average value of B/S of the sample group of healthy subjects was obtained, and each B/S value was normalized by dividing it by the average value. That is, the average value (N(B/S)) of healthy subjects after normalization is 1.00.
  • a scatter diagram of the B/S results after normalization is shown in FIG.
  • the average B/S value N (451a) of the healthy subjects was 0.066, and the average B/S value P (451a) of the tuberculosis patient group was 0.0000089.
  • the normalized B/S value for healthy subjects is 0 to 3.56
  • the normalized B/S value for hsa-miR-451a for tuberculosis patients is 0 to 0.00072
  • the average The value was 0.00014.
  • the standardized B/S value of tuberculosis patients is lower than the cutoff value, so the sample group is classified into a sample group with a high possibility of being positive for tuberculosis infection. can do.
  • the normalized B/S value is small, so even if the sample can be determined as positive, the normalized B/S values of the other two markers is not equal to or lower than the cutoff value, it is possible to judge that there is a high possibility of false positive.
  • the normalized B 451a /S value of a healthy subject sample was 0, it can be judged positive, but the normalized B 532-3P /S of the same sample was 0.46 (cutoff value 0.46), and B 423-3p /S after normalization was 2.44 (cutoff value 0.73), so it is possible to judge that the possibility of false positive is high.
  • RNA samples for measurement were prepared by preparation method 2 from urine specimens (24 healthy subjects, 39 patients with active tuberculosis infection) obtained separately from the specimens used in Verification 1 and 2 above.
  • real-time PCR method is performed according to biomarker verification 1, internal microRNA for normalization (hsa-miR-423-5p) and biomarkers belonging to the second group (hsa- The content of miR-532-3p, hsa-miR-423-3p) was calculated.
  • the ratio [B/S] of the content of each biomarker (B) to the content of hsa-miR-423-5p (S) is calculated, and the average value of healthy subjects for each specimen sample standardized by
  • a scatter diagram of [B 532-3p /S] after normalization is shown in FIG. 5, and a scatter diagram of [B 423-3p /S] after normalization is shown in FIG. Mean of [B 532-3p /S] after normalization of tuberculosis-infected persons, excluding samples whose expression level was too low to be amplified for a given cycle in real-time PCR or samples far from the group
  • Sensitivity and specificity were calculated based on the following table based on the results classified into positive and negative based on the above cut-off values.
  • the sensitivity was 0.939 and the specificity was 0.696. Also, when miR423-3p was used as a biomarker, the sensitivity was 0.818 and the specificity was 0.571.
  • the method for screening a tuberculosis-infected sample of the present invention allows the use of a urine sample that is minimally invasive and easy to collect for a subject as a test sample, and does not require culturing or the like for determination of tuberculosis infection, and is rapid. Since the determination result can be obtained, it is useful as a testing method for examining the presence or absence of active tuberculosis infection in areas where facilities are not well-equipped, such as developing countries.

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Abstract

尿検体を用いた結核感染の有無のスクリーニング方法、及びスクリーニング用プローブセットを提供する。尿由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの含有量Ｓに対する、バイオマーカー用ｍｉＲＮＡ（配列ＩＤ２～ＩＤ３３及び／又はＩＤ:３４～ＩＤ:７３）の含有量Ｂの比率〔Ｂ／Ｓ〕を指標として、健常者の比率Ｎ（Ｂ／Ｓ）と結核感染者の同比率Ｐ〔Ｂ／Ｓ〕に基づくカットオフ値と比較し、比較結果に基づいて、被験者の尿由来試料を結核感染陽性試料又は陰性試料に分別する。

Description

結核感染試料のスクリーニング方法及びこれに用いるプローブセット
　本発明は、多数の検体試料を、結核感染の陽性可能性試料と陰性可能性試料とに分別するスクリーニング方法に関し、特に、尿を検体試料として、一検体あたりのコストを抑制しつつ簡易にスクリーニングできるスクリーニング方法、及び検査用プローブセットに関する。
　世界総人口の１/４が結核に感染しているといわれ、特に発展途上国で感染が広がっている。このため、発展途上国でも実施可能な、迅速で簡易に結核感染の有無を検査できる方法の開発が望まれている。
　結核感染診断のための検査方法としては、我が国においては、ＥＳＡＴ－６、ＣＦＰ－１０等による抗原刺激によってリンパ球から産生されるインターフェロンγ（ＩＮＦ－γ）を測定する検査方法（クォンティフェロン（登録商標）ＴＢ、Ｔスポット（登録商標）ＴＢ）が一般に用いられている。かかる検査方法は、対象者から採血してリンパ球を分離し、抗ヒトインターフェロンγ抗体をコーティングした培養プレートに一定量を分注後、結核菌特異抗原ESAT-6およびCFP-10を添加して、20時間程度培養し、その後、抗ヒトＩＮＦ－γ抗体と結合したＩＮＦ―γ産生細胞数を計測するという方法である。ＢＣＧ接種や非結核性抗酸菌の影響を受けないため、ツベルクリン反応と比較して特異度が高いという特徴があるが、培養が必要であることから、判定までに約２日間要する。また、細胞分離及び細胞培養のための装置が必要であることから、１検体当たりのコストが高く、発展途上国での普及には困難を伴う。
　また、ＩＮＦ－γは、結核菌だけでなく、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウィルス）の感染者でもある患者（ＨＩＶ感染と結核感染の重複感染者）では、免疫不全のために結核感染患者であってもＩＮＦ－γ産生細胞量が少ないため、判定結果が偽陰性となる場合があるという問題がある。
　また、活動性結核患者に特異的な抗体としてＭＰＢ６４抗体が知られており、かかる抗体をマーカーとして、血漿中のＭＰＢ６４抗体量を、例えばドット・ブロット法で検出することで、活動性結核の状態にあるか否かを判定する方法も知られている。ＭＰＢ６４抗体は、尿中にも存在し、血清を測定試料として用いた結果と相関性があることが報告されている（非特許文献１：Yasuko Tamada et.al.,Microbiol immunol 2012;56:740-747)。ＭＰＢ６４抗体をマーカーとして用いる検査方法では、測定試料として、採取が容易な尿を使用することができるので、結核感染が広がりやすい発展途上国で、迅速に感染の有無を知ることができる方法として好適である。しかしながら、交差反応を示す抗体の存在も知られており、ＢＣＧワクチン接種者の場合には偽陽性といった検査結果が表れることもある。
　被験者から採取した喀痰培養による検査では、結核菌の有無を判断することから、正確度は高いが、培養のための設備、さらに培養期間も１～４週間要するため、迅速を要する検査・診断方法として利用することは困難である。
　このような状況下、発展途上国での結核感染有無の検査には、細胞培養等を行う必要がなく、侵襲性の少ない検体を用いて、迅速に且つ偽陽性、偽陰性といった誤った検査結果を引き起こすおそれが少ない検査・診断方法の開発が望まれている。
　ところで、近年、抗体、細胞、サイトカインなどとは別に、ｍｉＲＮＡを、バイオマーカーとして用いることが提案されている。ｍｉＲＮＡの発現異常は、多くの疾患の発症、悪性化に関与することが明らかになり、またｍｉＲＮＡは血液などの体液からも検出可能であることから、リキッドバイオプシーとしての利用に注目が集まっている。
　ｍｉＲＮＡの診断マーカーとしての利用は、近年、癌を中心に種々報告されている（特許５１５６８２９（各種癌：特許文献１）、特許６４８９５８３（膵がん：特許文献２）、ＷＯ２０１９／２４４５７５（胃がん：特許文献３））。
　特許文献２では、バイオマーカーとして２種類のｍｉＲＮＡを特定し、血液試料中の当該バイオマーカーとなるｍｉＲＮＡの存在量と健常者の同ｍｉＲＮＡの存在量とを比較して膵癌発症の可能性を判定している。２種類のｍｉＲＮＡは、健常者と比べて、膵癌発症の可能性が高い場合に存在量が多くなるｍｉＲＮＡ及び存在量が少なくなるｍｉＲＮＡの組み合わせであり、このような組み合わせを使用することで、膵癌発症可能性の判定精度を高めている。ｍｉＲＮＡ存在量の健常者との比較については、外部コントロールとしてのｃｅｌ－ｍｉＲ３９を用いて補正した後のΔＣｔ値（測定サンプルのＣｔ値から、そのサンプル中に含まれるｃｅｌ－ｍｉＲ３９のＣｔ値を引いたもの）を用いている。陽性、陰性の分別は、バイオマーカーｍｉＲＮＡについて、ΔＣｔ値に基づき算出したカットオフ値を基準に行っている。
　特許文献３では、胃癌バイオマーカーとして同定したｍｉＲＮＡの発現レベルを指標にして胃癌の罹患を判定する方法を提案している。発現レベルの決定には、標準化因子として特定のｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ３６１０、ｈｓａ－ｍｉＲ４６６９）を使用し、バイオマーカーのＣｔ値から標準化因子のＣｔ値を減じた値（ΔＣｔ値）を使用している。
　また、特開２０２１－９０４５１（特許文献４）では、低侵襲性のサンプル（ここでは血清）を使用し、大腸癌の陽性試料と陰性試料を分別するための集団スクリーニングに利用できるバイオマーカーとして、特定のｐｉＲＮＡ（ｍｉＲＮＡよりも長い（２６～３１ヌクレオチド）の非コードＲＮＡ分子）を同定し、マーカーＲＮＡの発現レベルを基準発現レベルと比較することが提案されている。
　比較に用いる発現レベルは、正規化用マーカー（内因性コントロール）としてのｍｉＲ９３－５ｐで正規化した発現レベルであり、分別判定のためのカットオフ値の決定は、健常者群と大腸患者群における、正規化された発現レベルの統計解析によって決定できるとしている。
　結核患者においても、特有のｍｉＲＮＡがいくつか報告され（非特許文献２：Naveed Sabir et.al.,Frontiers in Microbiology　vol.9，March 2018)、非特許文献２のTable1には、ヒトの末梢血、全血、血清、又はマクロファージを検体として、バイオマーカーの候補となり得るｍｉＲＮＡが紹介されている。しかしながら、当該Table１に示されているｍｉＲＮＡについて、ヒトの末梢血、血清に注目してみても、参照文献により区々であり、診断マーカーとして、いずれのｍｉＲＮＡが、どの程度の特異性を有しているのか、どのように判定するのかということまでは明らかにされていない。
　また、検体試料としての血液は、リキッドバイオプシーとして優れているものの、検査のためには採血が必要になり、発展途上国における検査方法としては、結核感染の疑いが強い患者に限定したものとなり、結核感染患者を広くスクリーニングする検査方法としての適用には限定的である。
特許５１５６８２９号公報 特許６４８９５８３号公報 ＷＯ２０１９／２４４５７５号公報 特開２０２１－９０４５１号公報
Yasuko Tamada et.al.,"Diagnosis of active tuberculosis using MBP64, a specific antigen of Mycobacterium bovis",Microbiol immunol 2012;56:740-747 Naveed Sabir et.al.,"miRNAs in Tuberculosis: New Avenues for Diagnosis and Host-Directed Therapy",Frontiers in Microbiology vol.9，March 2018
　本発明は、侵襲性が低いリキッドバイオプシー、特に検体試料の採取が容易である尿を用いて、短時間で且つ低コストで、感染の有無について有用な情報を提供できるバイオマーカーを用いた結核感染の有無のスクリーニング方法、及びスクリーニング用プローブセットを提供することにある。
　本発明者らは、活動性結核の患者と健常者から採取した尿に含まれるｍｉＲＮＡを網羅的に検出、解析し、健常者と比べて、結核感染患者では、特異的に亢進／低下発現しているｍｉＲＮＡを同定し、結核感染の判定の指標として用いることができるｍｉＲＮＡをバイオマーカー候補として特定し、特許出願をした（ＰＣＴ／ＪＰ２０２１／０２３０２７）。
　ところで、採取された尿検体に含まれるｍｉＲＮＡ量（ｍｉＲＮＡ濃度）には個体差がある。このため、バイオマーカーとして選択したｍｉＲＮＡの発現量（尿検体中の含有量）と健常者の同ｍｉＲＮＡの発現量とを、単なる相対含有量で比較した結果に基づく判定は、信頼性に欠けることになる。
　この点において、ｍｉＲＮＡの発現頻度に着目し、被験者のバイオマーカーｍｉＲＮＡの発現頻度と健常者の平均的発現頻度とを比較することで、バイオマーカーｍｉＲＮＡの発現が亢進／低下しているかを判断すれば個体間の濃度差の問題は解決可能である。しかしながら、特定のｍｉＲＮＡの発現頻度の大小を正確に知るためには、母数となるｍｉＲＮＡ量、すなわち、各個体で発現されている多数のｍｉＲＮＡを同定、定量して、発現しているｍｉＲＮＡの総量を求める必要がある。かかる測定には、数百種類以上のｍｉＲＮＡの同定及び定量を同時に行うことができる次世代シークエンサーのような高価な装置を用いる必要があり、個々のサンプル解析にかかる時間も長くなるため、健康診断のように多数のサンプルから結核感染のおそれのあるサンプルをピックアップする大規模なスクリーニング方法には適用困難である。
　さらに、バイオマーカーとして用いられるｍｉＲＮＡは、一般に発現頻度がそれ程高くはなく（約０～２．５％程度）、特に結核感染により、健常者より発現頻度が低下することになるｍｉＲＮＡについては、母数となる総量を正確に把握することが求められる。また、総量の精度を上げる観点から、多種類のｍｉＲＮＡを検出しておく必要がある。かかる意味においても、多種類のプライマープローブを備えたＲＮＡアレイ、高価なＰＣＲ装置、大量の測定技術者、解析者が必要となる。
　本発明者らは、各個体で発現されている大多数のｍｉＲＮＡの総量（トータルリード数）を測定しなくても、健常者と比べて、バイオマーカーとして用いたｍｉＲＮＡの発現が亢進／低下のいずれとなっているかを判定する方法について、さらなる検討を進めた。そして、個々の個体において、結核感染のバイオマーカーとなるｍｉＲＮＡの発現が増加しているのか、減少傾向にあるのかを判定するための基準（標準化用内部コントロール）となるｍｉＲＮＡについて種々検討した。
　標準化用内部コトンロールとして利用するためには、以下のような要件を充足する必要がある。
ａ）全個体において、定常的に発現しているｍｉＲＮＡであること（全個体で、常時ある程度の発現量が期待できること）
ｂ）個体差のばらつきが小さいｍｉＲＮＡであること（発現頻度について個体差が小さい）
ｃ）結核感染に対する影響が極めて小さいｍｉＲＮＡであること
　本発明者らは、上記要件を充足できるｍｉＲＮＡ（標準化用内部コントロール）を特定し、この標準化用内部コントロールのｍｉＲＮＡに対する相対含有量を指標とすることで、結核感染の有無を判定できることを見出し、本発明を完成した。
　本発明の結核感染試料のスクリーニング方法（タイプＩ）は、被験者の尿由来試料に含まれるｍｉＲＮＡ（配列ＩＤ:２～配列ＩＤ:３３及び／又は配列ＩＤ:３４～配列ＩＤ:７３）から選択される1種又は２種以上のバイオマーカー用ｍｉＲＮＡを検出することにより、結核感染試料をスクリーニングする方法であって、
　前記尿由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ（配列ＩＤ：１）の含有量Ｓに対する、前記バイオマーカー用ｍｉＲＮＡの含有量Ｂの比率〔Ｂ／Ｓ〕を取得する工程；及び
　得られた被験者の比率〔Ｂ／Ｓ〕を、健常者の尿由来試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの含有量Ｓに対する前記バイオマーカー用ｍｉＲＮＡの含有量Ｂの比率Ｎ（Ｂ／Ｓ）と結核感染者の同比率Ｐ〔Ｂ／Ｓ〕に基づくカットオフ値と比較する工程；
　前記比較工程結果に基づいて、前記被験者の尿由来試料を結核感染陽性試料又は陰性試料に分別する工程を含む。
　前記カットオフ値としては、健常者群から導出されるＢ／Ｓの平均値（Ｎ（Ｂ／Ｓ））に対する結核感染者群のＢ／Ｓ（Ｐ（Ｂ／Ｓ））について、健常者群と結核感染者群とを統計的に区別できるカットオフ値が挙げられる。
　前記バイオマーカーとして、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ（配列ＩＤ：４９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－３ｐ（配列ＩＤ：５６）、及びｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ（配列ＩＤ：３７）から選択される少なくとも１種を選択した場合、前記分別工程は、前記被験者の〔Ｂ／Ｓ〕が、前記カットオフ値より小さい場合に結核感染試料に分別する工程となる。
　前記分別工程は、バイオマーカーとして、配列ＩＤ:２～配列ＩＤ:３３から選択されるｍｉＲＮＡを用いた分別工程（第１分別工程）と、配列ＩＤ:３４～配列ＩＤ:７３から選択されるｍｉＲＮＡを用いた分別工程（第２分別工程）とを行い、第１分別工程で結核感染試料に分別され、且つ第２分別工程で結核感染試料に分別された場合に、結核感染陽性試料に分別してもよい。
　本発明の別の見地による、結核感染試料のスクリーニング方法（タイプＩＩ）は、
　被験者の尿由来試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ（配列ＩＤ：１）、及びマーカー用ｍｉＲＮＡとしてのｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ（配列ＩＤ：４９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－３ｐ（配列ＩＤ：５６）及びｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ（配列ＩＤ：３７）の少なくとも２種の含有量を測定する工程；
　前記尿由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの含有量Ｓに対する、前記各マーカー用ｍｉＲＮＡの各含有量Ｂの比率〔Ｂ／Ｓ〕を取得する工程；及び
　得られた被験者の比率〔Ｂ／Ｓ〕を、健常者の尿由来試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの含有量Ｓに対する前記バイオマーカー用ｍｉＲＮＡの含有量Ｂの比率Ｎ（Ｂ／Ｓ）と結核感染者の同比率Ｐ〔Ｂ／Ｓ〕に基づいて、それぞれのバイオマーカーについて設定されたカットオフ値と比較する工程；
　前記比較工程の結果、前記バイオマーカーの少なくとも１種又は全てについて、カットオフ値よりも低い場合に、前記被験者の尿由来試料を結核感染陽性試料に分別する工程を含む。
　上記タイプＩＩのスクリーニング方法では、結核感染試料を分別する工程が、タイプＩのスクリーニング方法の第２分別工程のみから構成されることになるが、比較工程で使用するバイオマーカーとして複数のマーカーを用いることで、判定の精度を担保することが可能となる。
　本発明の結核感染試料スクリーニングに用いる検査用プローブセットは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐとストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出可能な標識を有している標準化用ヌクレオチドプローブ；及び下記ヌクレオチドプローブ１及びヌクレオチドプローブ２からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む活動性結核の検査用プローブセットである。
　プローブ１：配列ＩＤ２～配列ＩＤ３３から選択される1種又は２種以上とストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出可能な標識を有しているヌクレオチドプローブ
　プローブ２：配列ＩＤ３４～配列ＩＤ７３から選択される1種又は２種以上とストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出可能な標識を有しているヌクレオチドプローブ。
　タイプＩの結核感染試料スクリーニングの実施には、プローブ１及びプローブ２の双方が含まれる。
　タイプＩＩの結核感染試料のスクリーニングの実施には、上記標準化用ヌクレオチドプローブと、下記プローブ３との組合せを含む検査用プローブセットを用いる。
　プローブ３：配列ＩＤ：４９及び配列ＩＤ：５６の各プローブとそれぞれストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出可能な標識を有しているマーカー用ヌクレオチドプローブのセット。
　本明細書において「結核」とは、結核菌の感染症をいう。すでに咳や体重減少などの症状が表れていて、喀痰中から結核菌が検出される活動性結核の状態をいう。一方、症状や胸部Ｘ線所見や菌検査所見などの臨床所見の異常がないが、結核菌に感染している潜在性結核の有無の判定は対象としない。
　本明細書にいう「健常者」とは、喀痰中に結核菌が検出されない結核感染陰性であり、且つＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合からエイズ陰性であると認定できる者に由来する検体をいう。
　本明細書において「ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）」とは、配列ＩＤ（配列Ｎｏ）で特定している場合、当該配列により特定されるｍｉＲＮＡをいう。
　特段の限定がない限り、１６～２５塩基程度の非コード（non-coding）ＲＮＡである成熟ｍｉＲＮＡのほか、ｍｉＲＮＡ遺伝子がＲＮＡポリメラーゼＩＩによって転写された初期転写産物に該当し、ヘアピンループ構造を有しているｐｒｉ―ｍｉＲＮＡ、このｐｒｉ―ｍＲＮＡがRNaseIII様のDroshaにより一部切断された状態で、ｍｉＲＮＡの前駆体に該当するｐｒｅ―ｍｉＲＮＡも含む概念である。
　本明細書において、「ｍｉＲＮＡの含有量」とは、測定試料に含まれるｍｉＲＮＡの量をいい、通常、リアルタイムＰＣＲにより定量できる。絶対定量により得られる絶対量、サンプル間の比較が行えるように、内在性コントロール（患者、健常者検体で恒常的に存在し、両者で発現に際を認めないｍｉＲＮＡ）を用いて標準化する相対定量により得られる相対量の双方が含まれる。本発明においては、結核感染陽性、陰性の判別指標として、同一の測定試料に含まれているバイオマーカーｍｉＲＮＡの含有量Ｂと標準化用ｍｉＲＮＡの含有量Ｓとの比率〔Ｂ／Ｓ〕を、パラメータとして用いることから、絶対量、相対量のいずれでもかまわない。
　なお、リアルタイムＰＣＲによる相対量の定量については、検量線を用いる方法、ΔΔＣｔ法のいずれであってもよい。
　本明細書で使用しているパラメータ、すなわち、含有量比率〔Ｂ／Ｓ〕について、結核感染患者の比率〔Ｂ／Ｓ〕について一般的に称する場合にＰ（Ｂ／Ｓ）と表記し、健常者の比率Ｂ／Ｓについて一般的に称する場合にＮ（Ｂ／Ｓ）と表記する。また、サンプルにおける各バイオマーカーの含有量Ｂについては、例えばバイオマーカーとしてｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐを用いた場合、Ｂ532-3pのように、Ｂ（ｍｉＲＮＡの略称）を用いて表記する。そして、該当するバイオマーカーの標準化用内部ｍｉＲＮＡ（内在性コントロール）に対する含有量比（例えば、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐの場合であれば〔Ｂ532-3p／Ｓ〕について、結核感染者の場合にＰ（５３２－３ｐ）、健常者の場合にＮ（５３２－３ｐ）と略記する。
　本明細書において、「ｍｉＲＮＡの発現頻度」とは、次世代シークエンサーでリードした場合の総リード数に対する、ターゲットとするｍｉＲＮＡ（例えば、バイオマーカー）のリード数の割合をいう。試料中に検出可能な程度の量が含有されているｍｉＲＮＡ（通常、２００～５００種類）の含有量総量に対する、ターゲットｍｉＲＮＡの含有量の割合（％）に対応する。
　本明細書において、「サイクル数」とは、ターゲットとするｍｉＲＮＡを検出することができるまでに行うＰＣＲの繰り返し数を意味し、サイクル数（本明細書では「Ｃｔ」で表す）の値が大きいほど、ターゲットｍｉＲＮＡの含有量は少ないことを意味する。
　本明細書において、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる」とは、標的となるｍｉＲＮＡの各配列に対する相補的配列を有するヌクレオチド、又は当該相補的配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の一致する配列を有する。
　本発明の結核感染試料のスクリーニング方法は、特定数のｍｉＲＮＡをバイオマーカーとして使用し、内在性コントロールの含有量に対するバイオマーカーの含有量比率〔Ｂ／Ｓ〕を判定の指標として利用しているので、発現頻度を算出するためのｍｉＲＮＡの総量を求める必要がなく、個体間のばらつきも小さくて済む。
　よって、本発明のスクリーニング方法であれば、次世代シークエンサーなどの高価な機器を用いなくても、多数の試料を、短時間で、陽性可能性群と陰性可能性群とに分別することが可能となる。
　さらに、測定の検体試料として、専門家による採取が不要な尿を用いているので、迅速に且つ安価で、大量の検体から、陽性可能性試料をスクリーニングすることができる。
実施例で測定した全個体のｈｓａ－ｍｉＲ２３－５ｐの発現量を示した散布図である。 ｈｓａ－ｍｉＲ５３２－３ｐの規格化後の含有量比率〔Ｂ／Ｓ〕を示す散布図である。 ｈｓａ－ｍｉＲ４２３－３ｐの規格化後の含有量比率〔Ｂ／Ｓ〕を示す散布図である。 ｈｓａ－ｍｉＲ４５１ａの規格化後の含有量比率〔Ｂ／Ｓ〕を示す散布図である。 検証その３で得られたｈｓａ－ｍｉＲ５３２－３ｐの規格化後の含有量比率〔Ｂ／Ｓ〕を示す散布図である。 検証その３で得られたｈｓａ－ｍｉＲ４２３－３ｐの規格化後の含有量比率〔Ｂ／Ｓ〕を示す散布図である。
＜標準化用内部ｍｉＲＮＡ＞
　本発明の結核感染試料のスクリーニング方法で使用する標準化用ｍｉＲＮＡは、個々の検体中に含まれるｈｓａ－ｍｉＲ４２３－５ｐである。具体的には、塩基配列「UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU」（配列ＩＤ：１）を有する。
　ｈｓａ－ｍｉＲ４２３－５ｐは、様々な正常又は病理組織で定常的な発現が報告されている（Eliana Bignotti et.al.,“Identification of stably expressed reference small non-cording RNAs for microRNA quantification in high-grade serous ovarian carcinoma tissues”, Journal of Cellular and Molecular Medicine 2016 vol.20, No 12, pp.2341-2348、コスモバイオ：RNAi ハンドブック第2版https://www.cosmobio.co.jp/upfiles/catalog/pdf/catalog_11711.pdf）。尿検体においても、健常者及び結核感染者の双方の検体において、比較的ばらつきが少なく、安定的、定常的に発現していることを、本発明者らは、尿検体に含まれているｍｉＲＮＡの解析（次世代シークエンサ―による解析）、さらにはリアルタイムＰＣＲによる定量によっても確認した（発現頻度０．００８６～０．２９％）。ここで、「安定的に発現」しているとは、常時、尿中に含まれていて、検出可能であることをいう。
＜結核感染判定用バイオマーカー＞
　本発明の結核感染試料のスクリーニング方法でバイオマーカーとして用いることができるｍｉＲＮＡは、活動性結核の状態では、健常者と比べて、増加発現／減少発現するｍｉＲＮＡである。
　具体的には、健常者と比べて過剰発現するｍｉＲＮＡ（第１グループ）で、表１に示す配列を有するｍｉＲＮＡ（配列ＩＤ：２－ＩＤ：３３）；健常者と比べて減少発現するｍｉＲＮＡ（第２グループ）で、表２に示す配列を有するｍｉＲＮＡ（配列ＩＤ：３４－ＩＤ：７３）である。
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　これらのｍｉＲＮＡは、結核感染者の尿試料に含まれているｍｉＲＮＡを網羅的に検出し、さらに健常者の尿試料に含まれているｍｉＲＮＡの平均的プロファイルと比べて、発現頻度について、有意に差異が認められたものである。第１グループのｍｉＲＮＡでは、健常者の発現頻度と比べて有意に亢進発現していると認められ、第２グループのｍｉＲＮＡでは有意に減少発現していると認められたものである。
　ここで、「有意」とは、健常者に対して発現頻度が増加（表１）又は減少（表２）したことを示す有意水準が、次世代シーケンサーを用いたＲＮＡ配列の解析結果について、Welchのｔ検定でｐ＜０．１（好ましくはｐ＜０．０５）、あるいは、フィシャーの正確確立検定による統計的処理において、ｐ＜０．０５（好ましくはｐ＜０．０１）、あるいは尤度比検定または疑似尤度F検定による統計的処理に基づき有意水準ｐ＜０．０５（好ましくはｐ＜０．０１）で発現頻度が２倍以上（表１）又は１／２以下（表２）をいう。
　また、リアルタイムＰＣＲの結果について、対象とするｍｉＲＮＡの健常者の平均的含有量に対して、Mann Whitney U testでの有意水準としてｐ＜０．０５（好ましくはｐ＜０．０１）で、含有量が増加（表１）又は減少（表２）した場合をいう。
　これらのうち、特に、第２グループのバイオマーカーについては、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ（配列ＩＤ：４９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－３ｐ（配列ＩＤ：５６）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ（配列ＩＤ：３７）が好ましく用いられる。これらのｍｉＲＮＡは、比較的、発現頻度が高く、ｍｉＲＮＡの含有濃度が薄い尿検体を増幅検出した場合に発生し得る増幅ミスが少なくて済む。
　以上のようなバイオマーカーは、１種類だけで使用してもよいが、２種類以上を組み合わせて用いることが好ましい。２種以上組み合わせて用いることで、マーカーに基づく判定精度を上げることができる。
　特に第１グループに分類されるｍｉＲＮＡと第２グループに分類されるｍｉＲＮＡとを組み合わせて使用することが好ましい。結核感染により発現頻度の増減が逆になる２つのグループを組み合わせて用いることで、より信頼性の高い判定結果（結核陽性又は結核陰性）を得ることができる。また、ＨＩＶ感染の場合であっても、偽陽性、偽陰性といった誤判定のリスクを低減することができる。
　また、たとえ第１グループ又は第２グループに分類されるｍｉＲＮＡのみをマーカーとして使用し、判定する場合であっても、複数のマーカーについて、すべての比較結果による判定が同じ場合には、判定結果の信頼性は高いといえる。例えば、第２グループに分類されるマーカーとして、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ（配列ＩＤ：４９）とｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－３ｐ（配列ＩＤ：５６）との組合せ、さらにはｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ（配列ＩＤ：３７）を組み合わせた３種類を使用することで、例えば、偽陽性と判定される検体試料を減らすことができる。
＜検査用プローブセット＞
　本発明の検査用プローブセットは、被験者の尿由来の試料について、活動性結核の陽性可能性を判定するためのプローブセットであって、上記バイオマーカーを検出するためのプローブを組み合わせたセットである。具体的には、標準化用ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ）を検出する内部標準用プローブと、第１グループのバイオマーカーを検出するプローブ１及び／又は第２グループのバイオマーカーを検出するプローブ２（好ましくはプローブ３）を含む。
（１）内部標準用プローブ
　ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるプローブ
　具体的には、配列ＩＤ：１で表されるｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの塩基配列（UGAGGGGCAGAGAGCGAGACUUU）の相補的配列と８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上一致する配列を有し、検出のために標識化がされている。また、必要に応じて、配列の５’端、３’端に、プライマー配列、担体への固定化のための連結用ヌクレオチド鎖、アダプターなどが連結されていてもよく、リン酸部、糖部分は適宜修飾されていてもよい。
（２）プローブ１
　表１に示す第１グループ（配列ＩＤ：２～配列ＩＤ：３３）に含まれるｍｉＲＮＡの１種又は２種以上とストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出のための標識化されているヌクレオチドプローブ又はプローブセット
（３）プローブ２
　表２に示す第２グループ（配列ＩＤ：３４～配列ＩＤ：７３）に含まれるｍｉＲＮＡの１種又は２種以上とストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出のための標識化されているヌクレオチドプローブ又はプローブセット
　プローブ２は、配列ＩＤ：３７、ＩＤ：４９、及びＩＤ：５６からなる群より選ばれる少なくとも１種で表されるヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出のための標識化されているヌクレオチドプローブを含んでいることが好ましい。
（４）プローブ３
　プローブ３は、プローブ２の好ましい一態様であり、配列ＩＤ：４９及び配列ＩＤ：５６の各プローブとそれぞれストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出可能な標識を有しているマーカー用ヌクレオチドプローブのセットである。
　プローブ３には、さらに配列ＩＤ：３７とストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出可能な標識を有しているマーカー用ヌクレオチドプローブを含んでもよい。
　プローブ１、プローブ２、プローブ３は、ターゲットとするｍｉＲＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる配列を有すればよく、必要に応じて、配列の５’端、３’端に、プライマー配列、担体への固定化のための連結用ヌクレオチド鎖、アダプターなどが連結されていてもよく、リン酸部、糖部分は適宜修飾されていてもよい。
　ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズできるヌクレオチドとは、標的となるｍｉＲＮＡの各配列に対する相補的配列を有するヌクレオチド、又は当該相補的配列と８５％以上、好ましくは９０％以上の一致する配列を有するヌクレオチドであり、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上一致する配列を有するヌクレオチドである。
　本発明のプローブセットは、内部標準用プローブと、バイオマーカー用プローブとを含むプローブセットであり、以下のような組合せが挙げられる。
・内部標準用プローブとプローブ１
・内部標準用プローブとプローブ２
・内部標準用プローブとブローブ１とプローブ２
・内部標準用プローブとプローブ３
・内部標準用プローブとプローブ１とプローブ３
　含まれるバイオマーカー用プローブの種類は、適用するスクリーニング方法のタイプ、すなわち採用する分別工程に応じて選択される。
　なお、プローブセットは、マイクロアレイ、プローブパネルなどとして供されてもよい。
　これらのヌクレオチドプローブは、標識に基づき、標的とするｍｉＲＮＡとハイブリダイズした場合に検出、定量できる。標識は、ヌクレオチドプローブに好適に用いられている公知の直接標識、間接標識のいずれであってもよい。直接標識物質としては、例えば、32Ｐなどのアイソトープ；間接標識物質としては、抗体、アビジン－ビオチン系などの標識酵素、発光・消光などの化学発光系、蛍光色素、金コロイドなどが挙げられる。
＜検体及び測定用試料の調製＞
　検査対象となる検体は、被験者から採取された尿である。ヒトの体液のうち、尿を検査試料として用いることにより、採血といった検体試料の採取が特定技能者に依存しなくて済む。唾液も特定技能者に依存することなく検体を採取できる試料であるが、高齢者のようなドライマウスの被験者では、採取が容易でない場合がある。この点、尿は全ての被験者から容易に採取できる検体試料として優れている。
　したがって、本発明のスクリーニング方法は、多数の試料を網羅的に検査するための簡易スクリーニング方法として好適である。
　尿は、ｍｉＲＮＡを含有するエクソソームが血液に比べて少ない傾向にあるが、他の体液と比べて、多量の採取が可能であること、さらに注射器のような採血用器具が不要であることから、針刺し事故等による血液媒介性のウィルス感染症の感染リスクもないので、発展途上国で実施する検査方法として、尿を検体として用いることは好適である。
　尿中には、血液等の他の体液と同様に、バイオマーカーとなる成熟ｍｉＲＮＡを含むエクソソームが含まれている。エクソソーム(exosome)とは、細胞から分泌される膜小胞の１つであって、一般に、電子顕微鏡観察により直径が３０～１５０ｎｍであり、成熟ｍｉＲＮＡ以外に、pri-ｍｉＲＮＡ、pre-ｍｉＲＮＡ、coding-ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、酵素、細胞骨格タンパク質、シグナル分子などが含まれている。
　被験者から採取した尿をそのまま使用することも可能であるが、通常、ターゲットとするｍｉＲＮＡを、ハイブリダイズにより検出することとの関係で、ヌクレオチドを含む尿由来試料を、測定用試料として用いることが好ましい。
　尿由来試料としては、エクソソームが濃縮若しくは粗精製されたフラクション（以下、「エクソソームリッチフラクション」と言う。）、さらにはＲＮＡを抽出した試料などが挙げられる。これらのうち、判定精度の点から、直接ＲＮＡを抽出した試料を測定用試料として用いることが好ましい。
　被験者の尿から測定用試料（ＲＮＡ単離物）を調製する方法としては、従来より公知の方法を利用することができる。
　例えば、尿検体から、サイズ排除クロマトグラフィー、遠心分離方法などによりエクソソームを分離し、得られたエクソソームリッチフラクションからＲＮＡを抽出してもよいし、商業的入手可能なキットを用いてエクソソームの分離、あるいは直接ＲＮＡ単離を行ってもよい。
　商業的に入手可能な分離キットとしては、エクソソームの分離キットとして、ExoQuickTM Exosome precipitation溶液シリーズ（例えば、ExoQuick-TC、ExoQuick-CG等、いずれもSystem Biosciences社製）、尿から核酸抽出試料を得るための分離キットとして、miRNeasy mini kit（Qiagen社製）、MagMax mirVana Total RNAkit（Thermo Fisher社）、磁性粒子を利用するMagtration（登録商標）（プレジッションシステムサイエンス社）などを利用することができる。
　また、エクソソーム含有試料（尿）をナノワイヤ構造体に送液するだけでエクソソームを回収する方法（ナノバイオデバイス法）を利用してもよい。
　好ましくは、例えば、MagMaxTM mirVana Total RNA－Seq kit（Thermo Fisher社）の操作マニュアル（尿サンプル）のプロトコルにしたがって調製される全ＲＮＡ抽出試料である。
＜ｍｉＲＮＡの検出・定量＞
　上記により調製した測定用試料（ＲＮＡ含有試料）からターゲットとするｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ、及びバイオマーカーとして用いたｍｉＲＮＡ）を検出、定量する方法としては、本発明のプローブセットを用いてハイブリダイズさせ、プローブに使用した標識の種類の基づき、発光強度、放射能、蛍光強度、酵素活性などを測定すればよい。
　ｍｉＲＮＡの定量には、例えばリアルタイムＰＣＲ法、マイクロアレイ法、ノーザンブロット法、液相核酸ハイブリダイゼーション、比色法等が挙げられる。ＰＣＲ法とイムノクロマトグラフ法を組み合わせて、呈色によりマーカーを検出する方法であってもよい。
　これらの方法は、使用したプローブの標識の種類に応じて適宜選択される。例えば、蛍光標識を用いた場合には、ハイブリッド形成により発される蛍光の有無を視覚により観察することで、検出することが可能である。また、蛍光強度など、標識物質の種類に応じた強度をスケーリングすることにより、含有量、含有比率を算出することが可能である。
　本発明のスクリーニング方法で行う定量は、測定用試料に含まれる目的とするｍｉＲＮＡの絶対量の測定に限定せず、相対量の定量であってもよい。
　後述するように、ｍｉＲＮＡの定量は、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの含有量Ｓに対する、バイオマーカーｍｉＲＮＡの含有量Ｂの比率〔Ｂ／Ｓ〕を取得するための定量であることから、サイクル数、試料中に含まれる内在性コントロールとしてのｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ及び目的とするバイオマーカーｍｉＲＮＡそれぞれの含有量を算出しなくても、直接〔Ｂ／Ｓ〕を取得できる方法であってもよい。
　例えば、リアルタイムＰＣＲ法により定量する場合、検量線法、ΔΔＣｔ法にいずれによっても、測定用試料の〔Ｂ／Ｓ〕を取得することができる。
＜活動性結核試料のスクリーング方法＞
　本発明のスクリーニング方法は、検体となる試料から活動性結核の陽性可能性試料をスクリーニングする方法であり、健康診断のように、多数の検体を陽性試料群と陰性試料群とに分別するためのスクリーニング方法、結核の疑いがある患者の初診としての簡易的検査方法として採用することができる。
　本発明のスクリーニング方法は、陽性、陰性の判定指標として、検体試料に含まれるｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの含有量Ｓに対する、バイオマーカーｍｉＲＮＡの含有量Ｂの比率〔Ｂ／Ｓ〕を用いるところに特徴がある。
　すなわち、調製した測定用試料に含まれる、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ及び選択したバイオマーカーｍｉＲＮＡを検出・定量して、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの含有量Ｓに対する、バイオマーカーｍｉＲＮＡの含有量Ｂの比率〔Ｂ／Ｓ〕を取得する工程；及び
　得られた〔Ｂ／Ｓ〕を、健常者の尿から同様の処理方法で調製したＲＮＡ含有試料の同比率Ｎ（Ｂ／Ｓ）に基づくカットオフ値と比較し、比較の結果、バイオマーカーの種類（第１グループ又は第２グループ）に応じて、前記被験者の尿由来試料を、結核感染陽性試料は陰性試料に分別する工程を含む。
　被験者の〔Ｂ／Ｓ〕の取得は、測定用試料に含まれるｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ（含有量Ｓ）、及び選択したバイオマーカーｍｉＲＮＡ（含有量Ｂ）を、前述の検出、定量方法により、それぞれ得た後、当該測定用試料の〔Ｂ／Ｓ〕を算出してもよいし、ΔΔＣｔ法のように、リアルタイムＰＣＲ法で得られる測定値のサイクル数（Ｃｔ）に基づき、直接〔Ｂ／Ｓ〕を算出してもよい。
　本発明のプローブセットを用いることで、例えば、標識の比強度などにより、直接〔Ｂ／Ｓ〕を取得することができる。
　前記カットオフ値とは、〔Ｂ／Ｓ〕について、健常者群と結核感染者群とを統計的に区別できる閾値であり、ＲＯＣ解析などにより適宜設定することができる。
　例えば、多数の健常者集団から導出されるＮ（Ｂ／Ｓ）の平均値で規格化した結核患者の〔Ｂ／Ｓ〕のデータ集団について、ＲＯＣ曲線を作成して、結核患者の多数が含まれることになる閾値を、カットオフ値として設定することができる。この場合、カットオフ値は、健常者の同バイオマーカーの発現頻度の何倍であるかということに対応する。
　規格化のためのＮ（Ｂ／Ｓ）の平均値は、健常者の集団について、測定試料の〔Ｂ／Ｓ〕を取得する方法と同一の方法で、目的とするマーカーｍｉＲＮＡの検出、定量を行って求められる平均値である。
　比較に使用するカットオフ値は、ｍｉＲＮＡの種類、測定用試料の調製方法、標識の種類、定量方法などに依存して、適宜定められる。
　被験者の〔Ｂ／Ｓ〕の取得工程、比較工程は、各バイオマーカーに応じて行われる。２種類以上のバイオマーカーを使用する場合、個々のバイオマーカーに対して取得した〔Ｂ／Ｓ〕を基に、対応するカットオフ値と比較し、カットオフ値に対する大小関係に基づき、測定した検体試料を結核感染陽性試料又は陰性試料に分別する。
　バイオマーカーとして、表１（第１グループ）のｍｉＲＮＡを選択した場合、取得した〔Ｂ／Ｓ〕が、上記カットオフ値より高い場合に、結核感染試料に分別する（第１判定）。
　バイオマーカーとして、表２（第２グループ）に示されているｍｉＲＮＡを選択した場合、取得した〔Ｂ／Ｓ〕が上記カットオフ値より低い場合に、結核感染試料に分別する（第２判定）。
　２種類以上のバイオマーカーを使用する場合、各バイオマーカーについて、所定のカットオフ値との比較が行われる。
　本発明のスクリーニング方法は、第１判定工程又は第２判定工程のいずれか一方を含むだけでもよいが、判定精度を上げる観点からは、第１グループと第２グループの双方からそれぞれバイオマーカーを選択し、第１判定及び第２判定を行うことが好ましい（タイプＩのスクリーニング方法）。
　使用するバイオマーカーが、第１グループ又は第２グループのみの場合、上記第１判定又は第２判定のいずれか一方しか実施されないことになる。しかしながら、第１グループ又は第２グループの属する複数のバイオマーカーを組み合わせて使用し、各バイオマーカーのＢ／Ｓの値とカットオフ値との比較結果が、全て一致した場合に、陽性又は陰性と判定するといった判定基準を採用することで、判定精度を担保することが可能となる。
　第１判定と第２判定の双方を行う場合、これらの判定順序は特に限定せず、第１判定を行った後、第２判定を行ってもよいし、第２判定を行った後に第１判定を行ってもよい。また、第１判定と第２判定を同時に行ってもよい。
　本発明のプローブセットを用いることで、複数の判定を同時に行うことが可能である。
　第１グループ又は第２グループのいずれか一方のみに属するバイオマーカーを用いるスクリーニング方法として、例えば、内部標準用プローブとプローブ３を組合せたプローブセットを用いるスクリーニング方法（タイプＩＩ）が挙げられる。
　この場合、プローブ３として用いたバイオマーカーのＢ／Ｓの値とカットオフ値との比較結果について、全てのマーカーについて、カットオフ値よりも低い場合に、結核感染陽性試料であると判定することで、高い判定精度を担保することが可能となる。
　あるいは偽陰性を減らした場合、マーカーのいずれか１種のＢ／Ｓがカットオフ値よりも低い場合に、結核感染陽性の可能性がある試料であると判定することもできる。
　本明細書には、ＰＣＴ／ＪＰ２０２１／０２３０２７に記載の内容全体が、参照として、本明細書に組み込まれる。
　以下、実施例をあげて本発明を更に具体的に説明するが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に限定されるものではない。
〔検体〕
　ラオス人の健常者１９人、ラオス人の活動性結核感染患者１９名（うち２名は、ＨＩＶ感染の重複感染者）、日本人のＣＯＶＩＤ１９重症患者（結核感染なし）１２名の尿検体を用いた。
　尿検体は、採取後、凍結保存され、活動性結核患者の尿検体の場合、１年以上の保存期間を経た後に測定用ＲＮＡ試料の調製に供した。健常者及びＣＯＶＩＤ１９重症患者の尿検体の場合、凍結保存期間は６０日以内であった。
〔測定用ＲＮＡ試料の調製〕
（１）調製方法その１
　尿検体３ｍｌから、MagMaxTM mirVana Total RNA－Seq kit（Thermo Fisher社）の操作マニュアル（尿サンプル）のプロトコルにしたがって、全ＲＮＡ抽出試料を得た。具体的手順は以下のとおりである。
　尿３ｍｌに、Lysis　Buffer　２．４ｍｌを添加し、７分間振盪した（500rpm）。得られた混合液に、別途調製したBinding　Beads　Mix（RNA　Binding　Beads　234μlとLysis/Binding　Enhancer　116μlの混合液）３５０μｌを添加し、５分間振盪した（500rpm）。
　得られた溶液に、イソプロパノール５．７６ｍｌを添加して、ピペッティングした後、２０分間インキュベートした（200rpm）。マグネットスタンドに静置して、分離させた後、上澄み液をすて、洗浄液の添加、振盪による洗浄、次いでTurbo　DNaseTM溶液の添加によりRNA　Binding　Beadsに再結合させ、再結合したＲＮＡを再度マグネットにより分離操作した。分離と洗浄を繰り返した後、乾燥したRNA　Binding　Beadsに、溶出用バッファーを添加し、６５℃で５分間インキュベートした。マグネットスタンドに静置し、得られた上澄液を、測定用サンプルとして用いた。
（２）調製方法その２
　Urine Conditioning Buffer（ZYMO RESEARCH）とRNeasy Mini KitとRNeasy MiniElute Cleanup Kit（Qiagen）を用いて尿検体１５ｍｌからｍｉＲＮＡを含むＲＮＡ抽出試料を得た。尿検体１５ｍｌを、前処理（20分間室温で遠心（2000 x g）した後、上清をPVDFメンブレンフィルター（Millex-GV Syringe Filter Unit,0.22μm、（MERCK）でろ過）及び濃縮（前処理で得られたろ液に、1.05μｍのUrine Conditioning Bufferを添加して、２０分間室温で遠心（3000 x g））を行った後、RNeasy Mini Kit のプロトコルに従って、全ＲＮＡ抽出試料を得た。具体的手順は、以下のとおりである。
　上記で得られた沈殿物にQiazol 2.25ml及びイソプロパノール450μlを添加混合し、2分間室温で静置した。その後、30分間4℃で遠心（最大スピード、21100 x g）し、水相をRNeasy Mini Kit付属のカラムに添加し、遠心による分離洗浄を繰り返した（室温で8000 x g以上で１５秒間遠心→フロースルーをRNeasy MiniElute Cleanup Kitへ添加→室温で8000 x g以上で１５秒間遠心（フロースルーは廃棄）→RNeasy MiniElute Cleanup Kit付属のウォッシュ用バッファーをカラムへ添加→室温で8000 x g以上で１５秒間遠心（フロースルーは廃棄）→80％エタノールをカラムへ添加→室温で8000 x g以上で２分間遠心→室温で、最大スピード21100 x gで５分間遠心）。最後に70℃に加温した滅菌水23μｌをカラムに添加し、5分間室温で静置後、室温で１分間遠心（8000 x g以上）し、得られたフロースルー液を測定用サンプルとして用いた。
〔シークエンス解析方法〕
　調製方法その１又はその２で得られたＲＮＡ抽出サンプルを用いて、Ion Total RNA-Seq kit v2 for small RNA Libraries（Thermo Fisher社）の操作マニュアルにしたがって、アダプターを付加し、逆転写反応を行って、次世代シークエンサー用ｃＤＮＡライブラリーを作製した。
　作製したｃＤＮＡライブラリーについて、次世代シークエンサーIon Torrent Ｓ５（Thermo Fisher社）によりシークエンスを解析した。
　公知のｍｉＲＮＡ（データバンクサイト：miRBaseに登録されているｍｉＲＮＡ）をリファレンス配列として、得られた配列を網羅的に照合し、各ｍｉＲＮＡのリード数を算出することで試料中のｍｉＲＮＡを定量し、トータルｍｉＲＮＡのリード数に対する割合を算出した。
　リファレンス配列との照合・同定は、連続する１０塩基以上が一致する場合に、リファンレンス配列に対応するｍｉＲＮＡであると同定した。
　検出されたｍｉＲＮＡを発現頻度順に並べたところ、調製した試料からは、いずれも２００種類以上のｍｉＲＮＡについて定量可能であった。
〔ｍｉＲＮＡの定量：リアルタイムＰＣＲ法〕
　尿検体から調製方法その２により調製した測定用サンプルについて、ターゲットとするｍｉＲＮＡの含有量を、ｑＲＴ－リアルタイムＰＣＲ法により定量した。リアルタイムＰＣＲ法による定量方法は以下のとおりである。
１．ｍｉＲＮＡの逆転写
　miRCURY LNA miRNA PCR Starter Kit（Qiagen社）を用いて、ＲＮＡ抽出試料の逆転写を行った。逆転写反応には、0.2mlチューブに下記組成（添加量については検体当たりの体積μｌ）を有する反応液（１０μｌ）を用いた。
　5×miRCURY RT Reaction Buffer（緩衝液）　　２．０μｌ
　10×miRCURY RT Enzyme Mix（逆転写酵素液）　１．０μｌ
　Template RNA　　　　　　　　　　　　　　　　６．５μｌ
　ヌクレアーゼ非含有水　　　　　　　　　　　　０．５μｌ
　逆転写反応は、サーマルサイクラーであるGeneAtlas G02（ASTEC社）を用いて、以下の条件で行った。
　ステップ１：４２℃で６０分
　ステップ２：９５℃で５分
　ステップ３：４℃で保存
２．リアルタイムPCR
２－１　リアルタイムPCR反応（ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ法）
　上記逆転写で合成されたｃＤＮＡについて、リアルタイムＰＣＲ法にて定量した。
　リアルタイム反応は、合成したｃＤＮＡの１５倍希釈物（ヌクレアーゼ非含有水による希釈）について、miRCURY LNA miRNA PCR Starter Kit（Qiagen社）で反応液（下記組成、添加量については検体当たりの体積μｌ）１０μｌを、Strip Tube（0.1ml）調製し、リアルタイムサーマルサイクラーであるRoter Gene Q（Qiagen社）を用いて行った。
　2×miRCURY SYBR Green Master Mix（緩衝液）　　　　　　５．０μｌ
　PCRプライマー（miRCURY LNA miRNA PCR assay）　　　　　１．０μｌ
　cDNA template（１５倍希釈）　　　　　　　　　　　　　　３．０μｌ
　ヌクレアーゼ非含有水　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０μｌ
　ＰＣＲ反応は、初期変性（９５℃、２分）を行った後、９５℃で１０秒間、５６℃で６０秒間を４５サイクル行った。融解曲線分析は、６０―９５℃の範囲について、１．０秒／０．５℃で行った。
２－２　Ｃｔ値の算出
　Ct値は蛍光の増幅曲線が指数関数的に増幅する領域に、補助線となる閾値線（Thereshold line）を引き、この閾値線と増幅曲線との交点をCt値として算出した。
２－３　相対定量法によるmiRNA含有量の算出
　解析した全ての健常者と患者のcDNA１μｌずつを混合した混合物を、基準サンプルとして用いた。
　この基準サンプルを、８倍、３２倍、１２８倍、５１２倍、２０４８倍に段階希釈した５種類のスタンダードサンプルを用いてリアルタイムPCR反応を行い、検量線を作成した。なお、スタンダードサンプルの濃度（相対値）はそれぞれ２５６、６４、１６、４、１となる。
〔検体の結核感染及びＨＩＶ感染の確認〕
　上記シークエンス解析に供した検体の結核感染の有無は、各被験者の喀痰に含まれる結核菌の培養検査、及びGeneXpert（登録商標）システムによる解析により確認した。GeneXpert（登録商標）システムによる結核菌の存否の確認は、喀痰中に含まれるＲＮＡをＰＣＲで増幅した後、結核菌のｒｐｏＢ遺伝子の薬剤耐性領域をターゲットとするプローブを用いて調べた。
　ＨＩＶ感染の有無については、BD　bioscience社のFACS　Presto（登録商標）を用いてＣＤ４陽性Ｔ細胞の割合を計測することにより、ＨＩＶ感染の有無を調べた。
〔標準化用ｍｉＲＮＡの検証〕
　健常者、活動性結核感染患者、ＣＯＶＩＤ１９患者の尿検体から、調製方法その２にて調製した測定用ＲＮＡ試料について、リアルタイムＰＣＲ法により、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの同定・定量を行った。定量結果を図１に示す。
　図１中、縦軸は、各サンプルにおけるｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐのＣｔ（各サンプルにおいて、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐが検出されたときのサイクル数）である。Ｃｔの値が大きいほど、含有量が少ないことを示している。
　図1中、「Ｈｅｓｌｔｈｙ」は健常者、「ＴＢ」は結核患者、「ＴＢ＋ＨＩＶ」は結核とＨＩＶの重複感染者、「Ｃｏｖｉｄ１９」は日本人のＣｏｖｉｄ１９重症患者を示す。
　結核感染陰性者群（健常者、Covid19）のいずれもＣｔ値は２０～２４で、群内のばらつきが小さいことがわかる。このことは、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐが人種間で尿における発現頻度として差異がないことを示している。また、結核陰性者群での個体差が小さいことがわかる。
　ＴＢ群のＣｔ値は、２５～３０であり、群内のばらつきは小さかった。したがって、結核陽性者群においても、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐは個体差が小さいマイクロＲＮＡであることがわかる。
　結核感染陰性者群（Healthy、Covid19）と結核感染陽性者群（ＴＢ、ＴＢ＋ＨＩＶ）では、Ｃｔ値レンジに差異が認められた。これは、尿検体について、尿採取後、測定用試料の調製及び測定に供するまでの凍結保存期間が異なったためと考えられる。健常者の凍結保存期間は６０日以内であったが、陽性者群の試料は、試料の種類にもよるが、１年以上であったため、ターゲットとなるｍｉＲＮＡの分解が進んだと考えられる。
　以上から、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐは、尿検体中で定常的に存在し、個体差によるばらつきが小さく、ＨＩＶ感染、結核感染、他の呼吸器系疾患であるＣｏｖｉｄ１９による発現量の影響が小さく、相対比較のための標準化用ｍｉＲＮＡとして好適であることが確認できた。
〔本発明のスクリーニング方法によるバイオマーカーの検証その１〕
（１）Ｎ（Ｂ／Ｓ）の設定
　調製方法その２により、健常者の検体（Ｎｏ．１～１９）から調製した測定用ＲＮＡ試料について、標準化用内部マイクロＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ）及び第２グループに属するバイオマーカー（ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－３ｐ）について、リアルタイムＰＣＲ法で測定されたＣｔ値から検量線法により含有量を算出した。次いで、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの含有量（Ｓ）に対する各バイオマーカーの含有量（Ｂ）の含有量の比率〔Ｂ／Ｓ〕を算出した。健常者の測定、算出結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表３のうち、Ｎ（５３２－３ｐ）では、サンプルＮｏ．１６を除いて、各バイオマーカーについての含有量比Ｎ（５３２－３ｐ）、Ｎ（４２３－３ｐ）の平均値を算出した。算出結果は以下のとおり。
・ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ
　　Ｎ（５３２－３ｐ）＝｛健常者１８人の〔Ｂ532-3p／Ｓ〕の総和｝／１８＝２８．０２
・ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－３ｐ
　　Ｎ（４２３－３ｐ）＝｛健常者１９人〔Ｂ423-3p／Ｓ〕の総和｝／１９＝０．８２
　各検体試料について、平均値で規格化した値（規格化後Ｂ／Ｓ）も併せて表３に示す。規格化は、平均値を１とした場合に換算することであり、各検体の含有量比率〔Ｂ532-3p／Ｓ〕をＮ（５３２－３ｐ）の平均値２８．０２で、〔Ｂ423-3p／Ｓ〕をＮ（４２３－３ｐ）の平均値０．８２で除することにより求められる。
（２）Ｐ（Ｂ／Ｓ）の算出及びカットオフ値の設定
　調製方法その２により、結核患者群の検体（Ｎｏ．２１～３９）から調製した測定用ＲＮＡ試料について、標準化用内部マイクロＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ）及び第２グループに属するバイオマーカー（ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－３ｐ）について、リアルタイムＰＣＲにより測定されるＣｔ値から含有量を算出した。次いで、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの含有量（Ｓ）に対する各バイオマーカーの含有量（Ｂ）の含有量比〔Ｂ／Ｓ〕を算出した。さらに、算出された各検体の〔Ｂ／Ｓ〕を、健常者のＮ（Ｂ／Ｓ）の平均値で除することにより規格化した値（規格化後Ｂ／Ｓ）を算出した結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表３及び表４からわかるように、マーカーｍｉＲ５３２－３ｐを用いた場合、健常者では規格化後の〔Ｂ／Ｓ〕の値は０．３２～１．９７の範囲に含まれるのに対して、結核感染者では、０～０．８４であった（Ｎｏ．２３については検定により棄却されたため考慮せず）。またマーカーｍｉＲ４２３－３ｐを用いた場合、健常者では規格化後の〔Ｂ／Ｓ〕の値は０．００～１．９６の範囲に含まれるのに対して、結核感染者では、０～１．４２であった。
　また、Ｐ（Ｂ532-3p／Ｓ）の平均値は５．９２、Ｐ（Ｂ423-3p／Ｓ）の平均値は０．４４であり、いずれもＮ（５３２－３ｐ）、Ｎ（４２３－３ｐ）の平均値と比べて顕著に低くなっている。規格化後Ｂ／Ｓで比較した場合、健常者の１．０に対して、それぞれ０．２２と０．５４で統計的に有意に低く（有意水準Ｐ＜０．０００１およびＰ＜０．００３１）、第２グループのバイオマーカーとして有効であることがわかる。
　統計解析ソフトＥＺＲ（参考文献：Bone　Marrow　Transplantation（2013）48,452-458）を用いてＲＯＣ解析を行い、カットオフ値を求めた。求められたカットオフ値は以下のとおり。なお、マーカーｍｉＲ５３２－３ｐを用いたカットオフ値の設定に際しては、群からはずれたＮｏ．２３は、検定により棄却した。
　マーカーｍｉＲ５３２－３ｐのカットオフ値：０．４６
　マーカーｍｉＲ４２３－３ｐのカットオフ値：０．７３
（３）スクリーニング方法の検証
　表３及び表４の規格化後の〔Ｂ／Ｓ〕を、図２及び図３に示す。図２，３において、検定で棄却したデータは、プロットしていない。
　図中、縦軸は各バイオマーカーについて、規格化後の含有量比率〔Ｂ／Ｓ〕を示している。すなわち、Ｎ（Ｂ／Ｓ）の平均値が１．０となっている。
　図２（ｍｉＲ５３２－３ｐ）に示すように、カットオフ値０．４６に設定すると、結核感染陽性に分別されるカットオフ値以下に、約９４％の検体が含まれた。
　また、図３（ｍｉＲ４２３－３ｐ）に示すように、カットオフ値０．７３に設定すると、結核感染陽性に分別されるカットオフ値以下に、約７４％の検体が含まれた。
　以上から、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐを標準化用内部マイクロＲＮＡとして、マーカーとの含有量比率〔Ｂ／Ｓ〕に基づいて設定したカットオフ値を基準に、検体を結核感染陽性試料、又は陰性試料に分別することが可能であることが確認できる。
　すなわち、本発明のスクリーニング方法によれば、特定数のｍｉＲＮＡを検出、定量するだけで、簡易に、結核感染陽性可能性が高い試料をスクリーニングできることがわかる。
　なお、バイオマーカーとして、第１グループ又は第２グループのいずれか一方のみの場合、当該グループに属する複数種類のバイオマーカーを用いることで、偽陰性、偽陽性を減らすことが可能である。
　例えば、全てのマーカーについて、カットオフ値との比較結果が一致する場合にのみ結核感染陽性試料であると分別することで、偽陽性を回避できる。
　一方、健康診断という目的上、偽陰性を減らすという観点から、使用する複数のマーカーのうち、１種でもカットオフ値との比較結果に基づき、結核感染陽性の可能性と判定することが好ましい場合もある。例えば、感染者Ｎｏ．２９は、マーカーｈｓａ―ｍｉＲ４２３－３Ｐを使用した場合、規格化後Ｂ／Ｓの値が１．４２であるために、判定結果は偽陰性であるが、マーカー５２３－３ｐの規格化後Ｂ／Ｓの値０．１７でカットオフ値０．４６よりも小さいので、結核感染陽性可能性の試料に分別され、偽陰性の判定を回避できる。
〔本発明のスクリーニング方法によるバイオマーカーの検証その２〕
　第２グループに属するバイオマーカーとして、ｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ（ＩＤ：３７）について、その１と同様に、調製方法その２により、健常者の検体（Ｎｏ．１～１９）及び結核患者群の検体（Ｎｏ．２１～３９）から調製した測定用ＲＮＡ試料について、リアルタイムＰＣＲ法を実施した。得られたＣｔ値から、その１と同様にして含有量を算出し、標準化用ｍｉＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ）の含有量（Ｓ）に対する各バイオマーカーの含有量（Ｂ）の含有量の比率〔Ｂ／Ｓ〕を算出した。
　健常者の検体群のＢ／Ｓの平均値を求め、各Ｂ／Ｓの値を当該平均値で除することにより、規格化した。すなわち規格化後の健常者の平均値（Ｎ（Ｂ／Ｓ））は１．００である。規格化後のＢ／Ｓの結果の散布図を図４に示す。尚、健常者のＢ／Ｓの平均値Ｎ（４５１ａ）は０．０６６であり、結核患者群のＢ／Ｓの平均値Ｐ（４５１ａ）は０．０００００８９であった。
　健常者の規格後Ｂ／Ｓの値が０～３．５６であるのに対して、結核患者のｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａの規格後Ｂ／Ｓの値は０～０．０００７２で、且つその平均値は０．０００１４あった。図４に示すように、仮にカットオフ値０．４を採用しても、結核患者の規格後Ｂ／Ｓの値はカットオフ値よりも低いので、結核感染陽性可能性が高い試料群に分別することができる。
　一方、マーカーｈｓａ―ｍｉＲ４５１ａを使用した場合に、規格化後Ｂ／Ｓの値が小さいために、陽性と判定され得る試料であっても、他の２つのマーカーの規格化後Ｂ／Ｓの値がカットオフ値以下でない場合には、偽陽性の可能性が高いといった判断が可能となる。例えば、ある健常者のサンプルの規格化後Ｂ451ａ／Ｓの値は０であったため、陽性と判断され得るが、同サンプルの規格化後Ｂ532-3P／Ｓ＝０．４６（カットオフ値０．４６）、規格化後Ｂ423-3p／Ｓ＝２．４４（カットオフ値０．７３）であったことから、偽陽性の可能性が高いといった判断が可能となる。
〔本発明のスクリーニング方法によるバイオマーカーの検証その３〕
　前記検証その１、その２で使用した検体とは別に取得した尿検体（健常者２４人、活動性結核感染患者３９人）について、調製方法その２により測定用ＲＮＡ試料を調製した。得られた測定用ＲＮＡ試料について、バイオマーカーの検証その１にしたがって、リアルタイムＰＣＲ法を実行し、標準化用内部マイクロＲＮＡ（ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ）及び第２グループに属するバイオマーカー（ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－３ｐ）の含有量を算出した。次いで、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの含有量（Ｓ）に対する各バイオマーカーの含有量（Ｂ）の含有量の比率〔Ｂ／Ｓ〕を算出し、さらに各検体試料について、健常者の平均値で規格化した。
　規格化後の〔Ｂ532-3p／Ｓ〕の散布図を図５、規格化後の〔Ｂ423-3p／Ｓ〕の散布図を図６に示す。
　発現量が低すぎて、リアルタイムＰＣＲにおいて所定サイクル増幅させることができなかった試料又は群からかけはなれた試料の値を除いた結核感染者の規格化後の〔Ｂ532-3p／Ｓ〕の平均値（ｎ＝３４）に基づき、〔Ｂ532-3p／Ｓ〕のカットオフ値として０．５２６、〔Ｂ423-3p／Ｓ〕のカットオフ値として０．７３に設定した。
　上記カットオフ値を基準に陽性、陰性に分別した結果を、下記表に基づき、感度及び特異度を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　「感度」とは、結核感染の検体（真陽性）を、正しく結核感染試料であると判定する割合で、下記式により算出される。
　　　感度＝ａ／（ａ＋ｃ）
　「特異度」とは、結核でない検体（真陰性）を正しく結核でない試料であると判定する割合で下記式により算出される。
　　　特異度＝ｄ／（ｂ＋ｄ）
　バイオマーカーとしてｍｉＲ５３２－３ｐを用いた場合、感度は０．９３９で特異度は０．６９６であった。また、バイオマーカーとしてｍｉＲ４２３－３ｐを用いた場合、感度は０．８１８で特異度は０．５７１であった。
　したがって、例えば、〔Ｂ532-3p／Ｓ〕についてカットオフ値との比較による判定で陽性と判別された検体について、さらに〔Ｂ423-3p／Ｓ〕についてカットオフ値との比較による判定で陽性と判別される検体について、結核感染陽性である可能性が高いと判断してもよい。これにより、偽陽性を減らすことができる。
　以上から、これらのバイオマーカー及び標準化を用いた場合の結核感染有無の分別には、再現性があり、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐを標準化用ｍｉＲＮＡとして用いて規格化する分別は、感度、特異度が高く、複数のバイオマーカーの判定結果を組み合わせることで、陽性試料と陰性試料との分別について、精度が高い分別が可能となることが確認できた。
　本発明の結核感染試料のスクリーニング方法は、検体試料として、被験者にとって低侵襲性で採取容易な尿検体を用いることができ、しかも結核感染の判定のために、培養等する必要がなく、迅速に判定結果を取得することができるので、発展途上国のように設備が整っていない地域において、活動性結核感染の有無を調べる検査方法として有用である。

Claims (8)

  1. 　被験者の尿由来試料に含まれる、表１に示されているｍｉＲＮＡ（配列ＩＤ:２～配列ＩＤｏ:３３）及び／又は表２に示されているｍｉＲＮＡ（配列ＩＤ:３４～配列ＩＤ:７３）から選択される1種又は２種以上のバイオマーカー用ｍｉＲＮＡを検出することにより、結核感染試料をスクリーニングする方法であって、
    　前記尿由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの含有量Ｓに対する、前記バイオマーカー用ｍｉＲＮＡの含有量Ｂの比率〔Ｂ／Ｓ〕を取得する工程；及び
    　得られた被験者の比率〔Ｂ／Ｓ〕を、健常者の尿由来試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの含有量Ｓに対する前記バイオマーカー用ｍｉＲＮＡの含有量Ｂの比率Ｎ（Ｂ／Ｓ）と結核感染者の同比率Ｐ〔Ｂ／Ｓ〕に基づくカットオフ値と比較する工程；
    　前記比較工程結果に基づいて、前記被験者の尿由来試料を結核感染陽性試料又は陰性試料に分別する工程
    を含む結核感染試料のスクリーニング方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
    Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  2. 　前記カットオフ値は、健常者群から導出されるＢ／Ｓの平均値（Ｎ（Ｂ／Ｓ））に対する結核感染者群のＢ／Ｓ（Ｐ（Ｂ／Ｓ））について、健常者群と結核感染者群とを統計的に区別できるカットオフ値である請求項１に記載のスクリーニング方法。
  3. 　前記バイオマーカーとして、ｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ（配列ＩＤ：４９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－３ｐ（配列ＩＤ：５６）及びｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ（配列ＩＤ：３７）から選択される少なくとも１種を選択し、
    　前記分別工程は、前記被験者の〔Ｂ／Ｓ〕が、前記カットオフ値より小さい場合に結核感染試料に分別する工程である、請求項２に記載の結核感染試料のスクリーニング方法。
  4. 　前記バイオマーカーが表１に示されているｍｉＲＮＡである分別工程（第１分別工程）と、前記バイオマーカーが表２に示されているｍｉＲＮＡである分別工程（第２分別工程）とを行い、
    　第１分別工程で結核感染試料に分別され、且つ第２分別工程で結核感染試料に分別された場合に、結核感染陽性試料に分別する、請求項１に記載のスクリーニング方法。
  5. 　被験者の尿由来試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐ、及びマーカー用ｍｉＲＮＡとしてのｈｓａ－ｍｉＲ－５３２－３ｐ（配列ＩＤ：４９）、ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－３ｐ（配列ＩＤ：５６）及びｈｓａ－ｍｉＲ－４５１ａ（配列ＩＤ：３７）の少なくとも２種の含有量を測定する工程；
    　前記尿由来の試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの含有量Ｓに対する、前記各マーカー用ｍｉＲＮＡの各含有量Ｂの比率〔Ｂ／Ｓ〕を取得する工程；及び
    　得られた被験者の比率〔Ｂ／Ｓ〕を、健常者の尿由来試料中のｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐの含有量Ｓに対する前記バイオマーカー用ｍｉＲＮＡの含有量Ｂの比率Ｎ（Ｂ／Ｓ）と結核感染者の同比率Ｐ〔Ｂ／Ｓ〕に基づく、それぞれのバイオマーカーについて設定したカットオフ値と比較する工程；
    　前記比較工程の結果、前記バイオマーカーの少なくとも１種又は全てについて、カットオフ値よりも低い場合に、前記被験者の尿由来試料を結核感染陽性試料に分別する工程
    を含む結核感染試料のスクリーニング方法。
  6. 　被験者の尿由来の試料について、活動性結核の陽性試料を分別するための検査用プローブセットであって、
    　ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐとストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出可能な標識を有している標準化用ヌクレオチドプローブ；及び
    　下記ヌクレオチドプローブ１及びヌクレオチドプローブ２からなる群より選ばれる少なくとも１種を含む活動性結核の検査用プローブセット。
    　プローブ１：配列ＩＤ２～配列ＩＤ３３から選択される1種又は２種以上とストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出可能な標識を有しているヌクレオチドプローブ
    　プローブ２：配列ＩＤ３４～配列ＩＤ７３から選択される1種又は２種以上とストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出可能な標識を有しているヌクレオチドプローブ。
  7. 　前記プローブ２は、配列ＩＤ３７、ＩＤ４９、及びＩＤ５６からなる群より選ばれる少なくとも１種で表されるヌクレオチドと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出可能な標識を有しているヌクレオチドプローブを含んでいる請求項６に記載の検査用プローブセット。
  8. 　被験者の尿由来の試料について、活動性結核の陽性試料を分別するための検査用プローブセットであって、
    　ｈｓａ－ｍｉＲ－４２３－５ｐとストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出可能な標識を有している標準化用ヌクレオチドプローブ；及び
    　プローブ３：配列ＩＤ４９及び配列ＩＤ５６の各ヌクレオチドとそれぞれストリンジェントな条件下でハイブリダイズでき、且つ検出可能な標識を有しているマーカー用ヌクレオチドプローブのセット
    を含む活動性結核の検査用プローブセット。
     
     
     
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