KR20170136525A

KR20170136525A - 전립선암을 예측하기 위한 전혈 기반 mRNA 마커 및 그의 검출 방법

Info

Publication number: KR20170136525A
Application number: KR1020177028155A
Authority: KR
Inventors: 데보라 리치; 마이클 곰리; 시부 토마스; 야스호다 라즈푸로히트; 마이클 샤퍼
Original assignee: 얀센 파마슈티카 엔.브이.
Priority date: 2015-03-12
Filing date: 2016-03-11
Publication date: 2017-12-11
Also published as: WO2016145308A2; HRP20220128T1; EP3268493A2; JP2018507702A; PL3268493T3; CN107567502A; RS62972B1; DK3268493T3; EP3268493B1; PT3268493T; CY1125020T1; WO2016145308A3; CA2979226A1; ES2905163T3; HUE058025T2; IL254119A0; LT3268493T; MA45480A; US20160304962A1; SI3268493T1

Abstract

전립선암을 예측하기 위한 전혈 기반 mRNA 바이오마커 및 그의 검출 방법이 제공된다. 개시된 mRNA 마커 및 방법은 전립선암을 갖는 환자의 확인/진단, 고위험 전립선암을 갖는 환자의 확인/고위험 전립선암의 예측, 및 전립선암을 갖는 환자의 치료를 가능하게 한다. 또한, 개시된 전혈 기반 mRNA 바이오마커를 포함하는 유전자 칩이 제공된다.

Description

전립선암을 예측하기 위한 전혈 기반 mRNA 마커 및 그의 검출 방법

전립선암을 예측하기 위한 전혈 기반 mRNA 바이오마커 및 그의 검출 방법이 본 명세서에 제공된다. 상세하게는, 개시된 mRNA 마커 및 방법은 환자로부터의 전혈 샘플에서의 전립선암-특이적 mRNA 바이오마커의 검출, 전립선암을 갖는 환자의 확인, 고위험 전립선암을 갖는 환자의 확인, 및 전립선암을 갖는 환자의 치료를 가능하게 한다.

전립선암은 미국 내의 남성들 사이에서 두 번째로 가장 일반적인 암이다. 이것은 또한 모든 인종들 및 히스패닉 태생 인구의 남성들 사이에서 암 사망의 주요 원인들 중 하나이다. 2010년에, 미국 내의 19만6천38명의 남성이 전립선암을 갖는 것으로 진단되었으며, 한편 미국 내의 2만8천560명의 남성은 전립선암으로 인해 사망하였다. (문헌[U.S. Cancer Statistics Working Group. United States Cancer Statistics: 1999―2010 Incidence and Mortality Web-based Report. Atlanta (GA): Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention, and National Cancer Institute; 2013].)

전립선암의 관리에 있어서의 주요 난제들 중 하나는 이 질병의 공격적인 형태를 중지하기 위해 적절하게 치료되어야 할 환자와 무통성 형태의 과잉치료를 피해야 할 환자 사이를 구별하는 시험이 결여되어 있다는 것이다. 전립선암의 분자 이종성(molecular heterogeneity) 및 환자로부터 종양 조직을 획득하는 데 있어서의 어려움은 전립선암의 개별화된 관리를 어렵게 한다.

환자로부터의 전혈 샘플에서 전립선암-특이적 mRNA 바이오마커를 검출하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 본 방법은 상기 전혈 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계; 상기 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; 및 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나, 이로 본질적으로 이루어지며, 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커는 KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARv7(ARV3.7), ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3.1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3, 및/또는 이들의 임의의 조합이거나, 또는 이들로 본질적으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

환자로부터의 전혈 샘플에서 ARv7(ARV3.7)을 검출하는 방법이 또한 개시된다. 본 방법은 상기 전혈 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계, 상기 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계, 및 ARV3.7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나, 이로 본질적으로 이루어진다.

전립선암을 갖는 환자를 확인하는 방법이 또한 개시되며, 본 방법은 상기 환자의 전혈 샘플로부터 cDNA를 획득하는 단계; 상기 cDNA를 유전자 칩(gene chip)과 접촉시키는 단계로서, 상기 유전자 칩은 COL1A1에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는, 상기 접촉 단계; COL1A1의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 COL1A1의 발현 수준을 COL1A1의 기준 수준과 대비하는 단계로서, 상기 기준 수준과 대비하여 상기 전혈 샘플에서의 상기 COL1A1의 발현 수준의 증가가 전립선암을 나타내는, 상기 대비 단계를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나, 이로 본질적으로 이루어진다.

고위험 전립선암을 갖는 환자를 확인하는 방법이 또한 제공된다. 본 방법은 상기 환자의 전혈 샘플로부터 cDNA를 획득하는 단계; 상기 cDNA를 유전자 칩과 접촉시키는 단계로서, 상기 유전자 칩은 고위험 전립선암을 나타내는 적어도 하나의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하며, 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커는 KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 및/또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 구성원을 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나, 이로 본질적으로 이루어지는, 상기 접촉 단계; 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 기준 수준과 대비하는 단계로서, 상기 기준 수준과 대비하여 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준의 증가가 고위험 전립선암을 나타내는, 상기 대비 단계를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나, 이로 본질적으로 이루어진다. 게다가, mRNA 바이오마커는 다수의 mRNA 바이오마커를 포함하는 바이오마커 패널 내로 조합될 수 있다. 대상체는 미리 결정된 값, 예를 들어 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 9개 이상이 검출되었다면 바이오마커 양성으로 칭해질 것이다. 바이오마커 양성 상태는 고위험 전립선암을 나타낸다.

전립선암을 갖는 환자를 치료하는 방법이 추가로 개시되며, 본 방법은 상기 환자의 전혈 샘플로부터 cDNA를 획득하는 단계; 상기 cDNA를 유전자 칩과 접촉시키는 단계로서, 상기 유전자 칩은 COL1A1에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는, 상기 접촉 단계; COL1A1의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 COL1A1의 발현 수준을 COL1A1의 기준 수준과 대비하는 단계; 및 상기 COL1A1의 발현 수준이 상기 COL1A1의 기준 수준과 대비하여 증가되는 경우, 전립선암에 대하여 상기 환자를 치료하는 단계를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나, 이로 본질적으로 이루어진다. 이 예는, 예를 들어 mRNA 바이오마커의 발현을 제한하는 것으로 의미되지 않거나, 본 명세서에 기재된 바이오마커 양성 상태가 또한 치료를 위한 환자를 선택하는 데 사용될 수 있다.

환자로부터의 전혈 샘플에서 전립선암 특이적 mRNA 전사체를 검출하기 위한 유전자 칩이 또한 제공되며, 본 유전자 칩은 구성원을 증폭 및 검출하도록 구성된 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하고/하거나, 이로 이루어지고/지거나, 이로 본질적으로 이루어지며, 상기 구성원은 KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3.1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3, 및/또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.

발명의 내용뿐만 아니라, 이에 뒤따르는 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 첨부된 도면과 함께 읽을 때 더 이해된다. 개시된 방법 및 유전자 칩을 예시할 목적으로, 본 방법 및 유전자 칩의 예시적인 실시 형태가 도면에 나타나 있지만; 이러한 방법 및 유전자 칩은 개시된 구체적인 실시 형태로 제한되지 않는다. 도면에서:
도 1은 COL1A1에 대한 예시적인 ROC 곡선을 나타내는데, 이 곡선은 모든 마커 발현 수준에서 감도(sensitivity)와 특이도(specificity) 사이의 트레이드-오프(trade-off)를 보여준다. 포인트는 감도 및 특이도를 최대화하는 최적의 컷포인트(cutpoint)를 나타낸다.
도 2는 바이오마커 또는 바이오마커 패널에 대한 예시적인 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 곡선을 나타내는데, 이 곡선은 x-축 상에 나타낸 특정 시간까지 질병 재발 또는 질병으로 인한 사망과 같은 사건을 겪지 않은 대상체들의 비율을 나타낸다. 바이오마커 양성 및 바이오마커 음성 대상체는 각각 적색선 및 흑색선으로 표시되어 있다. 바이오마커 양성 대상체는 바이오마커 음성 대상체보다 더 일찍이 사건을 겪을 가능성이 유의하게 더 높으며, 즉 바이오마커 양성 대상체는 더 불량한 예후를 갖는다.

예시적인 실시 형태의 상세한 설명

개시된 방법 및 유전자 칩은 본 개시 내용의 일부를 형성하는 첨부 도면과 관련하여 취해지는 하기 상세한 설명을 참조하여 더 용이하게 이해될 수 있다. 개시된 방법 및 유전자 칩은 본 명세서에 기재되고/되거나 제시된 구체적인 방법 및 유전자 칩으로 제한되지 않으며, 본 명세서에 사용된 용어는 특정 실시 형태를 단지 예로서 기재하기 위한 것으로, 청구된 방법 및 유전자 칩을 제한하려는 의도가 아님이 이해되어야 한다.

달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 가능한 작용 기전 또는 방식 또는 개선 이유에 대한 임의의 설명은 단지 예시적인 것으로 의미되며, 개시된 방법은 임의의 그러한 제시된 작용 기전 또는 방식 또는 개선 이유의 정확함 또는 부정확함에 의해 구속되어서는 안 된다.

문맥이 명확하게 달리 지시하지 않는 한, 특정 수치 값에 대한 언급은 적어도 그러한 특정 값을 포함한다. 값들의 범위가 표현되는 경우, 다른 실시 형태는 하나의 특정 값으로부터 그리고/또는 다른 하나의 특정 값까지를 포함한다. 또한, 범위로 기술된 값들에 대한 언급은 그 범위 내의 각각의 모든 값을 포함한다. 모든 범위는 포괄적이며 조합가능하다.

값이 선행사 "약"의 사용에 의해 근사치로서 표현될 때, 특정 값은 다른 실시 형태를 형성한다는 것이 이해될 것이다.

명료함을 위해서, 본 명세서에서 개별적인 실시 형태와 관련하여 기재된, 개시된 방법 및 유전자 칩의 소정 특징부가 단일 실시 형태에서 조합되어 제공될 수도 있음이 인식되어야 한다. 역으로, 간결함을 위해서, 단일 실시 형태와 관련하여 기재된, 개시된 방법 및 유전자 칩의 다양한 특징부가 개별적으로 또는 임의의 하위조합으로 제공될 수도 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 단수형("a," "an," 및 "the")은 복수를 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "환자"는 개시된 방법을 사용하여 전혈 샘플이 분석될 수 있는 임의의 포유동물을 지칭한다. 따라서, 개시된 방법은 인간 및 비인간 대상체에 적용가능하지만, 그것은 가장 바람직하게는 인간에 사용된다. 일부 실시 형태에서, 환자 샘플은 인간 샘플이다. 다른 실시 형태에서, 환자 샘플은 비인간 샘플이다. "환자" 및 "대상체"는 본 명세서에서 상호교환 가능하게 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "cDNA를 유전자 칩과 접촉하는"은 유전자 발현을 평가하기 위하여 환자의 전혈 샘플로부터 획득된 cDNA를 유전자 칩과 함께 인큐베이션하거나 그에 첨가하는 절차를 지칭한다.

어구 "발현 수준의 증가"는 기준 샘플과 대비하여 mRNA 바이오마커의 상승된 수준 및 mRNA 바이오마커의 존재 둘 모두를 포함한다. 예를 들어, 개시된 mRNA 바이오마커들 중 하나 이상이 기준 샘플로부터 부재할 수 있다. 그러한 mRNA 바이오마커의 경우, 용어 "발현 수준의 증가"는 환자의 전혈 샘플에서의 mRNA 바이오마커의 존재를 지칭한다. 역으로, 개시된 mRNA 바이오마커들 중 하나 이상이 기준 샘플에 약간의 수준으로 존재할 수 있다. 그러한 mRNA 바이오마커의 경우, 용어 "발현 수준의 증가"는 기준 샘플과 대비하여 환자의 전혈 샘플에서의 mRNA 바이오마커의 상승된 수준을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "기준 샘플"은 전립선암을 갖지 않고, 과거에 갖지 않았던 개체 또는 개체들의 집단으로부터의 전혈 샘플을 지칭한다. 따라서, "~의 기준 수준"은 전립선암을 갖지 않고, 과거에 갖지 않았던 개체 또는 개체들의 집단으로부터의 전혈 샘플에서의 하나 이상의 개시된 바이오마커의 발현 수준을 지칭한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, "프라이머 쌍"은 관심 mRNA 바이오마커의 cDNA를 증폭시키기 위한 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 지칭한다.

전립선암 특이적 mRNA 바이오마커의 검출

환자로부터의 전혈 샘플에서 전립선암 특이적 mRNA 바이오마커를 검출하는 방법이 본 명세서에 개시된다. 본 방법은 상기 전혈 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계; 상기 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; 선택적으로, 상기 cDNA를 예비증폭시키는(preamplifying) 단계, 및 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하며, 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커는 KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV7(ARV3.7)(ARV7로도 알려짐), ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3.1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3, 또는 이들의 임의의 조합이다.

개시된 방법은 전혈 샘플에서의 전립선암 특이적 mRNA 바이오마커의 검출을 가능하게 한다. 이들 마커의 검출은 전립선암을 갖는 환자를 확인/진단하는 데, 고위험 전립선암을 갖는 환자를 확인/고위험 전립선암을 예측하는 데, 그리고 전립선암을 갖는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 어구 "전립선암 특이적 mRNA 바이오마커"는 전혈 샘플로부터 전립선암을 검출하는 데 사용될 수 있는 단일 mRNA 바이오마커 또는 mRNA 바이오마커 그룹(즉, 둘 이상의 관련 바이오마커)을 지칭한다. 예시적인 mRNA 바이오마커는 표 1에 열거되어 있으며, KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3.1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3 및 CYP3A5를 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

[표 1]

적합한 mRNA 바이오마커는 안드로겐 제어 그룹, 아비라테론 저항성 그룹, 뉴로엔도크린 바이패스 그룹, 또는 다른 바이패스 경로로 기능적으로 분류될 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 적어도 하나의 mRNA 바이오마커는 안드로겐 제어 그룹, 아비라테론 저항성 그룹, 뉴로엔도크린 바이패스 그룹, 다른 바이패스 경로, 또는 이들의 임의의 조합의 구성원일 수 있다.

전혈의 발현 프로파일링은 종양 조직의 발현 프로파일링에 비하여 몇몇 실용적인 이점을 제공하는데, 이에는 샘플 획득의 최소한의 침습적인 성질, 샘플링 프로토콜들의 표준화의 상대적인 용이성, 및 종양 조직은 표준 치료의 일부로서 받아들여지지 않기 때문에 시간 경과에 따라 반복된 샘플을 획득하는 능력이 포함된다. 정맥천자(venipuncture)를 포함하지만 이로 한정되지 않는 당업계에 알려진 다수의 기법에 의해 환자로부터 전혈 샘플이 획득될 수 있다. 전혈 샘플은 혈액 수집 튜브 내에 수집될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 혈액 수집 튜브는 PAXgene® 브랜드 혈액 RNA 튜브일 수 있다.

전혈 샘플로부터 RNA를 단리하는 기법은 당업계에 알려져 있다. 적합한 구매가능한 키트에는, 예를 들어 QIAGEN PAXgene 혈액 RNA 키트가 포함되며, 이의 절차는 실시예 섹션에 기재되어 있다.

단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하기 위한 기법은 당업계에 알려져 있으며, 이에는 RNA의 역전사가 포함되지만 이로 한정되지 않는다.

일부 실시 형태에서, cDNA는 합성 단계 후에 예비증폭될 수 있다. 예비증폭 단계는 임의의 적합한 횟수의 사이클 동안 수행될 수 있다. 사이클의 횟수는, 부분적으로, 출발 cDNA의 양 및/또는 증폭 단계를 수행하는 데 필요한 cDNA의 양에 좌우된다. 적합한 예비증폭 사이클 횟수에는 1 내지 20회 사이클이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 따라서, 예비증폭 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회 사이클 중 임의의 사이클 동안 수행될 수 있다. 일부 태양에서, 예비증폭 단계는 2회 사이클 동안 수행될 수 있다. 다른 태양에서, 예비증폭 단계는 14회 사이클 동안 수행될 수 있다. 또 다른 태양에서, 예비증폭 단계는 20회 초과의 사이클 동안 수행될 수 있다.

적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계는 cDNA를 증폭시키는 단계 및 증폭된 cDNA를 유전자 칩을 사용하여 검출하는 단계를 포함하며, 유전자 칩은 KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3.1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3 또는 이들의 임의의 조합에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함한다. 일부 태양에서, 유전자 칩은 분석하고자 하는 각각의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 쌍 및 하나의 프로브를 포함할 수 있다. 다른 태양에서, 유전자 칩은 분석하고자 하는 각각의 mRNA 바이오마커에 대한 하나 초과의 프라이머 쌍 및 하나 초과의 프로브를 포함할 수 있다.

이론에 의해 구애되고자 함이 없이, 유전자 칩에 첨가되는 예비증폭된 cDNA는 관심 mRNA 바이오마커 내의 영역에 대해 특이적인 프라이머 쌍에 의해 결합 및 증폭될 것이다. cDNA가 증폭됨에 따라, 증폭된 cDNA는 관심 mRNA 바이오마커 내의 영역에 대해 특이적인 프로브에 의해 결합될 것이다. 증폭된 cDNA에 대한 프로브의 결합은 증폭 과정이 일어남에 따라 증폭된 cDNA의 검출을 가능하게 할 것이다. 따라서, 개시된 방법은 증폭 과정에서 초기 단계에 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준의 검출을 가능하게 하여, 향상된 감도 및 정확성을 가능하게 한다.

측정 단계는 예비증폭된 또는 예비증폭되지 않은 cDNA에 대해 수행될 수 있다. cDNA의 증폭은, 예를 들어 qRT-PCR에 의해 수행될 수 있다. 적합한 시약 및 조건은 당업자에게 알려져 있다. qRT-PCR은 다수의 적합한 플랫폼 상에서 수행될 수 있다. 일부 태양에서, 예를 들어, qRT-PCR은 Fluidigm™을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 측정 단계는 Fluidigm™ 플랫폼 상에서 Fluidigm™ 유전자 발현 칩을 사용하여 qRT-PCR에 의해 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있는데, 유전자 발현 칩은 상기에 논의된 바와 같은 적어도 하나의 mRNA 바이오마커를 포함한다.

환자로부터의 전혈 샘플에서 ARV7(ARV3.7)을 검출하는 방법이 또한 개시된다. 개시된 방법은 상기 전혈 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계, 상기 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계, 및 ARV3.7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, cDNA는 합성 단계 후에 예비증폭될 수 있다. 적합한 예비증폭 사이클 횟수에는 1 내지 20회 사이클이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 따라서, 예비증폭 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회 사이클 동안 수행될 수 있다. 일부 태양에서, 예비증폭 단계는 2회 사이클 동안 수행될 수 있다.

전혈 샘플은 혈액 수집 튜브, 예컨대 PAXgene® 혈액 RNA 튜브 내에 수집될 수 있다.

측정 단계는 ARV3.7에 대한 프라이머 및 프로브를 포함하는 개시된 유전자 칩들 중 어느 하나를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 측정 단계는 서열 번호 2의 정방향 프라이머 및 서열 번호 3의 역방향 프라이머를 포함하는 유전자 칩을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 태양에서, 유전자 칩은 서열 번호 1의 프로브를 추가로 포함할 수 있다.

ARV7(ARV3.7) 발현을 검출하는 방법은 환자의 전혈 샘플로부터의 ARV7(ARV3.7)의 발현 수준을 ARV7(ARV3.7) 발현의 기준 수준과 대비하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. ARV7(ARV3.7) 발현의 적합한 기준 수준은, 예를 들어 전립선암을 갖지 않는 개체로부터의 전혈 샘플에서의 ARV7(ARV3.7)의 기준 수준을 포함한다. 대비 단계는 환자의 전혈 샘플로부터의 ARV7(ARV3.7)의 발현 수준이 ARV7(ARV3.7) 발현의 기준 수준과 대비하여 증가되는지 또는 감소되는지를 결정하는 데 사용될 수 있다.

전립선암을 갖는 환자의 확인 방법

전립선암을 갖는 환자를 확인하는 방법이 본 명세서에 또한 개시된다. 개시된 방법은 상기 환자의 전혈 샘플로부터 cDNA를 획득하는 단계; 상기 cDNA를 유전자 칩과 접촉시키는 단계로서, 상기 유전자 칩은 COL1A1에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는, 상기 접촉 단계; COL1A1의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 COL1A1의 발현 수준을 COL1A1의 기준 수준과 대비하는 단계로서, 상기 기준 수준과 대비하여 상기 전혈 샘플에서의 상기 COL1A1의 발현 수준의 증가가 전립선암을 나타내는, 상기 대비 단계를 포함한다.

cDNA는, 전혈 샘플로부터 RNA를 단리하고, 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성함으로써, 전혈 샘플로부터 획득될 수 있다. RNA를 단리하고 cDNA를 합성하기 위한 적합한 기법은, 상기에 개시되고 실시예 섹션에 추가로 개시된 것들을 포함한다. 일부 실시 형태에서, cDNA는 합성 단계 후에 예비증폭될 수 있다. 예비증폭 단계는 임의의 적합한 사이클 횟수 동안 수행될 수 있으며, 이에는 1 내지 20회 사이클이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 따라서, 예비증폭 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회 사이클 동안 수행될 수 있다. 일부 태양에서, 예비증폭 단계는 14회 사이클 동안 수행될 수 있다.

일부 실시 형태에서, 유전자 칩은 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 추가로 포함하며, 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커는 KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3.1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3, 또는 이들의 임의의 조합이다. 유전자 칩이 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 실시 형태에서, 본 방법은 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 기준 수준과 대비하는 단계로서, 상기 기준 수준과 대비하여 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준의 증가가 전립선암을 나타내는, 상기 대비 단계를 추가로 포함한다.

일부 태양에서, 유전자 칩은 분석하고자 하는 각각의 mRNA 바이오마커에 대한 하나의 프라이머 쌍 및 하나의 프로브를 포함할 수 있다. 다른 태양에서, 유전자 칩은 분석하고자 하는 각각의 mRNA 바이오마커에 대한 하나 초과의 프라이머 쌍 및 하나 초과의 프로브를 포함할 수 있다.

유전자 칩이 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 추가로 포함하는 실시 형태에서, 본 방법은 COL1A1 및 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계, 및 COL1A1 및 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 COL1A1 및 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 기준 수준과 대비하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 그리고 제한하고자 함이 없이, 일부 실시 형태에서, 본 방법은 상기 cDNA를 유전자 칩과 접촉시키는 단계로서, 상기 유전자 칩은 COL1A1에 대한 프라이머 쌍 및 프로브 및 MYBPC1에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는, 상기 접촉 단계,COL1A1 및 MYBPC1의 발현 수준을 측정하는 단계, 및 상기 COL1A1 및 MYBPC1의 발현 수준을 COL1A1 및 MYBPC1의 기준 수준과 대비하는 단계로서, 상기 기준 수준과 대비하여 상기 전혈 샘플에서의 상기 COL1A1 및 MYBPC1의 발현 수준의 증가가 전립선암을 나타내는, 상기 대비 단계를 포함한다.

COL1A1의 발현 수준을 단독으로 또는 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커와 조합하여 측정하는 단계는 COL1A1에 대한 프라이머 쌍을 단독으로 또는 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머와 조합하여 사용하여 cDNA를 증폭시키는 단계 및 COL1A1에 대한 프로브를 단독으로 또는 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커에 대한 프로브와 조합하여 사용하여, 증폭된 cDNA를 검출하는 단계를 포함한다. 측정 단계는 예비증폭된 또는 예비증폭되지 않은 cDNA에 대해 수행될 수 있다. cDNA의 증폭은, 예를 들어 qRT-PCR에 의해 수행될 수 있다. 적합한 시약 및 조건은 당업자에게 알려져 있다. qRT-PCR은 다수의 적합한 플랫폼 상에서 수행될 수 있다. 일부 태양에서, 예를 들어, qRT-PCR은 Fluidigm™을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 측정 단계는 Fluidigm™ 플랫폼 상에서 Fluidigm™ 유전자 발현 칩을 사용하여 qRT-PCR에 의해 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있는데, 유전자 발현 칩은 COL1A1에 대한 프라이머를 단독으로 또는 상기에 논의된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머와 조합하여 포함한다.

전혈 샘플은, PAXgene RNA 튜브를 포함하지만 이로 한정되지 않는 혈액 수집 튜브 내에 수집될 수 있다.

전립선암을 갖는 환자를 확인하는 방법은 실시간 PCR에 의해 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 방법은 전립선암에 위험 인자를 배정하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, 또는 이들의 임의의 조합의 증가된 발현 수준이 고위험 전립선암을 나타낸다.

고위험 전립선암을 갖는 환자를 확인하는 방법

고위험 전립선암을 갖는 환자를 확인하는 방법이 또한 개시된다. 본 방법은 상기 환자의 전혈 샘플로부터 cDNA를 획득하는 단계; 상기 cDNA를 유전자 칩과 접촉시키는 단계로서, 상기 유전자 칩은 프라이머 쌍 및 고위험 전립선암을 나타내는 mRNA 바이오마커 패널을 포함하며, 상기 패널은 KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 상기 접촉 단계; 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 기준 수준과 대비하는 단계로서, 상기 기준 수준과 대비하여 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준의 증가가 고위험 전립선암을 나타내는, 상기 대비 단계를 포함한다.

개시된 방법은 전혈 샘플로부터의 KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 또는 이들의 임의의 조합의 검출에 기초하여 고위험 전립선암의 예측을 가능하게 한다.

cDNA는, 전혈 샘플로부터 RNA를 단리하고, 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성함으로써, 전혈 샘플로부터 획득될 수 있다. RNA를 단리하고 cDNA를 합성하기 위한 적합한 기법은, 상기에 개시되고 실시예 섹션에 추가로 개시된 것들을 포함한다. 일부 실시 형태에서, cDNA는 합성 단계 후에 예비증폭될 수 있다. 예비증폭 단계는 임의의 적합한 횟수의 사이클 동안 수행될 수 있다. 사이클의 횟수는, 부분적으로, 출발 cDNA의 양 및/또는 증폭 단계를 수행하는 데 필요한 cDNA의 양에 좌우된다. 적합한 예비증폭 사이클 횟수에는 1 내지 20회 사이클이 포함되지만 이로 한정되지 않는다. 따라서, 예비증폭 단계는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20회 사이클 동안 수행될 수 있다. 일부 태양에서, 예비증폭 단계는 2회 사이클 동안 수행될 수 있다. 다른 태양에서, 예비증폭 단계는 14회 사이클 동안 수행될 수 있다. 또 다른 태양에서, 예비증폭 단계는 20회 초과의 사이클 동안 수행될 수 있다.

KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 또는 이들의 임의의 조합의 발현 수준을 측정하는 단계는 KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 또는 이들의 임의의 조합에 대한 프라이머 쌍을 사용하여 cDNA를 증폭시키는 단계, 및 KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 또는 이들의 임의의 조합에 대한 프로브를 사용하여, 증폭된 cDNA를 검출하는 단계를 포함한다. 측정 단계는 예비증폭된 또는 예비증폭되지 않은 cDNA에 대해 수행될 수 있다. cDNA의 증폭은, 예를 들어 qRT-PCR에 의해 수행될 수 있다. 적합한 시약 및 조건은 당업자에게 알려져 있다. qRT-PCR은 다수의 적합한 플랫폼 상에서 수행될 수 있다. 일부 태양에서, 예를 들어, qRT-PCR은 Fluidigm™을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 측정 단계는 Fluidigm™ 플랫폼 상에서 Fluidigm™ 유전자 발현 칩을 사용하여 qRT-PCR에 의해 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있으며, 유전자 발현 칩은 상기에 논의된 바와 같이 KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 또는 이들의 임의의 조합에 대한 프라이머를 포함한다.

고위험 전립선암을 갖는 환자를 확인하는 방법은 실시간 PCR에 의해 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 본 방법은 실시간 PCR에 의해 하나 초과의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계 및 양성 발현을 갖는 역치 초과의 마커를 검출하는 단계를 수반할 수 있다. 이들 실시 형태에서, 양성 발현을 갖는 역치 초과의 마커를 갖는 환자는 바이오마커 양성인 것으로 여겨진다. 바이오마커 양성 상태는 고위험 질병의 증가된 가능성과 관련된다.

전립선암을 갖는 환자를 치료하는 방법

전립선암을 갖는 환자를 치료하는 방법이 본 명세서에 개시되며, 본 방법은 상기 환자의 전혈 샘플로부터 cDNA를 획득하는 단계; 상기 cDNA를 유전자 칩과 접촉시키는 단계로서, 상기 유전자 칩은 COL1A1에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는, 상기 접촉 단계; COL1A1의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 COL1A1의 발현 수준을 COL1A1의 기준 수준과 대비하는 단계; 및 상기 COL1A1의 발현 수준이 상기 COL1A1의 기준 수준과 대비하여 증가되는 경우, 상기 환자를 치료하는 단계를 포함한다.

일부 실시 형태에서, 유전자 칩은 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 추가로 포함하며, 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커는 KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3.1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3, 또는 이들의 임의의 조합이다. 유전자 칩이 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는 실시 형태에서, 본 방법은 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 기준 수준과 대비하는 단계; 및 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준이 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 기준과 대비하여 증가되는 경우, 상기 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함한다.

다른 실시 형태에서, 유전자 칩은 다수의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 추가로 포함한다.

유전자 칩이 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 추가로 포함하는 실시 형태에서, 전립선암을 갖는 환자를 치료하는 방법은 COL1A1 및 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계, COL1A1 및 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 COL1A1 및 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 기준 수준과 대비하는 단계, 및 COL1A1 및 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준이 COL1A1 및 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 기준 수준과 대비하여 증가되는 경우, 상기 환자를 치료하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 그리고 제한하고자 함이 없이, 일부 실시 형태에서, 본 방법은 상기 cDNA를 유전자 칩과 접촉시키는 단계로서, 상기 유전자 칩은 COL1A1에 대한 프라이머 쌍 및 프로브 및 MYBPC1에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는, 상기 접촉 단계, COL1A1 및 MYBPC1의 발현 수준을 측정하는 단계, 상기 COL1A1 및 MYBPC1의 발현 수준을 COL1A1 및 MYBPC1의 기준 수준과 대비하는 단계, 및 상기 COL1A1 및 MYBPC1의 발현 수준이 상기 COL1A1 및 MYBPC1의 기준 수준과 대비하여 증가되는 경우, 상기 환자를 치료하는 단계를 포함할 수 있다.

유전자 칩이 다수의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 및 프로브를 추가로 포함하는 실시 형태에서, 전립선암을 갖는 환자를 치료하는 방법은 다수의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계, 상기 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 각각의 mRNA 바이오마커의 발현의 기준 수준과 비교하는 단계, 및 역치 초과의 mRNA 바이오마커가 상기 기준 수준보다 높은 발현 수준으로 검출되는 경우, 상기 환자를 치료하는 단계를 포함한다.

COL1A1의 발현 수준을 단독으로 또는 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커와 조합하여 측정하는 단계는 COL1A1에 대한 프라이머 쌍을 단독으로 또는 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 쌍과 조합하여 사용하여 cDNA를 증폭시키는 단계, 및 COL1A1에 대한 프로브를 단독으로 또는 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커에 대한 프로브와 조합하여 사용하여, 증폭된 cDNA를 검출하는 단계를 포함한다. 측정 단계는 예비증폭된 또는 예비증폭되지 않은 cDNA에 대해 수행될 수 있다. cDNA의 증폭은, 예를 들어 qRT-PCR에 의해 수행될 수 있다. 적합한 시약 및 조건은 당업자에게 알려져 있다. qRT-PCR은 다수의 적합한 플랫폼 상에서 수행될 수 있다. 일부 태양에서, 예를 들어, qRT-PCR은 Fluidigm™을 사용하여 수행될 수 있다. 따라서, 일부 실시 형태에서, 측정 단계는 Fluidigm™ 플랫폼 상에서 Fluidigm™ 유전자 발현 칩을 사용하여 qRT-PCR에 의해 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함할 수 있는데, 유전자 발현 칩은 COL1A1에 대한 프라이머를 단독으로 또는 상기에 논의된 바와 같은 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머와 조합하여 포함한다.

전립선암을 갖는 환자를 치료하는 방법은 실시간 PCR에 의해 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

COL1A1, 또는 COL1A1 및 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 증가된 발현 수준을 갖는 환자를 치료하기에 적합한 화합물은 하기를 포함하지만 이로 한정되지 않는다:

유전자 칩

환자로부터의 전혈 샘플에서 전립선암 특이적 mRNA 전사체를 검출하기 위한 유전자 칩이 본 명세서에 개시된다. 일부 실시 형태에서, 유전자 칩은 KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3.1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3 또는 이들의 임의의 조합을 증폭 및 검출하도록 구성된 프라이머 쌍 및 프로브를 포함할 수 있다.

일부 실시 형태에서, 유전자 칩은 KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3.1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3 또는 이들의 임의의 조합을 증폭 및 검출하도록 구성된 복수의 프라이머 쌍 및 복수의 프로브를 포함할 수 있다. 예를 들어, 그리고 제한하고자 함이 없이, 일부 태양에서, 유전자 칩은 분석하고자 하는 각각의 mRNA 바이오마커에 대한 하나의 프라이머 쌍 및 하나의 프로브를 포함할 수 있다. 다른 태양에서, 유전자 칩은 분석하고자 하는 각각의 mRNA 바이오마커에 대한 하나 초과의 프라이머 쌍 및 하나 초과의 프로브를 포함할 수 있다.

적합한 프로브는 표 2에 열거된 것들을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

[표 2]

TMP:ERG 및 ARV7 (ARV3.7)에 대한 적합한 프라이머 및 프로브는표 3에 열거된 것들을 포함하지만 이로 한정되지 않는다.

[표 3]

실시예

방법

PAXgene ^® 혈액 RNA 수동 추출 절차

하기에 간략하게 기재된, 문헌[PAXgene Blood RNA Kit Handbook (PreAnalytiX GmbH; March 2009)]에 기재된 바와 같이 QIAGEN의 PAXgene® 혈액 RNA 키트를 사용하여 RNA를 추출하였다.

PAXgene® 혈액 RNA 튜브를 스윙-아웃 로터(swing-out rotor)를 사용하여 3000 내지 5000 × g로 10분 동안 원심분리하였다. 디캔팅(decanting) 또는 피펫팅(pipetting)함으로써 상층액을 제거하였다. 4 ml의 RNase-무함유 물을 펠릿에 첨가하고, 새로운 2차 BD Hemogard 클로저를 사용하여 튜브를 폐쇄하였다. 펠릿이 가시적으로 용해될 때까지 튜브를 와동시키고, 3000 내지 5000 × g로 10분 동안 원심분리하였다. 상층액 전체를 제거하고 폐기하였다.

350 μl의 Buffer BR1을 첨가하고, 펠릿이 가시적으로 용해될 때까지 와동시켰다. 샘플을 피펫팅하여 1.5 ml 미세원심분리 튜브 내로 넣었다. 300 μl의 Buffer BR2 및 40 μl의 프로테이나제 K를 첨가하였다. 샘플을 5초 동안 와동시킴으로써 혼합하고, 진탕기-인큐베이터를 400 내지 1400 rpm으로 사용하여 55℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다.

용해물을 피펫팅하여, 2 ml 프로세싱 튜브 내에 넣어진 PAXgene® 시레더 스핀 컬럼(Shredder spin column)(연보라색) 내로 직접 넣고, 최대 속도로(그러나 20,000 × g를 초과하지 않도록 하여) 3분 동안 원심분리하였다. 유통 분획(flow-through fraction)의 상층액 전체를 프로세싱 튜브 내의 펠릿을 교란시키지 않고서 새로운 1.5 ml 미세원심분리 튜브에 조심스럽게 옮겼다. 350 μl의 에탄올(96 내지 100%)을 첨가하고, 와동에 의해 혼합하고, 잠시 원심분리하여, 튜브 뚜껑의 내부로부터 액적을 제거하였다.

700 μl의 샘플을 피펫팅하여, 2 ml 프로세싱 튜브 내에 넣어진 PAXgene® RNA 스핀 컬럼(적색) 내로 넣고, 8000 내지 20,000 × g로 1분 동안 원심분리하였다. 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 프로세싱 튜브 내에 넣었다. 남아 있는 샘플을 피펫팅하여, PAXgene® RNA 스핀 컬럼 내로 넣고, 8000 내지 20,000 × g로 1분 동안 원심분리하였다. 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 프로세싱 튜브 내에 넣고, 유통물이 담긴 오래된 프로세싱 튜브는 폐기하였다.

350 μl의 Buffer BR3를 피펫팅하여, PAXgene® RNA 스핀 컬럼 내로 넣고, 8000 내지 20,000 × g로 1분 동안 원심분리하였다. 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 프로세싱 튜브 내에 넣고, 유통물이 담긴 오래된 프로세싱 튜브는 폐기하였다.

10 μl의 DNase I 스톡(stock) 용액을 1.5 ml 미세원심분리 튜브 내의 70 μl의 Buffer RDD에 첨가하고, 온화하게 혼합하였다. DNase I 인큐베이션 믹스(80 μl)를 PAXgene® RNA 스핀 컬럼 막 상에 직접 피펫팅하고, 15분 동안 벤치-톱(bench-top)(20 내지 30℃) 상에 놓았다. 350 μl의 Buffer BR3를 피펫팅하여, PAXgene® RNA 스핀 컬럼 내로 넣고, 8,000 내지 20,000 × g로 1분 동안 원심분리하였다. 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 프로세싱 튜브 내에 넣고, 유통물이 담긴 오래된 프로세싱 튜브는 폐기하였다.

추가 500 μl의 Buffer BR4를 PAXgene RNA 스핀 컬럼에 첨가하고, 8000 내지 20,000 × g로 3분 동안 원심분리하였다. 유통물이 담긴 튜브를 폐기하고, PAXgene® RNA 스핀 컬럼을 새로운 2 ml 프로세싱 튜브 내에 넣고, 8000 내지 20,000 × g로 1분 동안 원심분리하였다.

유통물이 담긴 튜브를 폐기하였다. PAXgene® RNA 스핀 컬럼을 1.5 ml 미세원심분리 튜브 내에 넣고, 40 μl의 Buffer BR5를 PAXgene® RNA 스핀 컬럼 막 상에 직접 피펫팅하였다. 컬럼을 8000 내지 20,000 × g로 1분 동안 원심분리하여 RNA를 용출하였다. 40 μl의 Buffer BR5 및 동일한 미세원심분리 튜브를 사용하여 이 단계를 반복하였다.

용출액을 진탕 없이 진탕기-인큐베이터 내에서 65℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후에, 튜브를 얼음 상에서 즉시 냉각시켰다. RNA 샘플을 즉시 사용하지 않는다면, 이것을 -20℃ 또는 -70℃에서 저장하였다.

cDNA 합성

2x 역전사 마스터 믹스의 제조: 적절한 반응 횟수를 위하여 표 4에 나타낸 바와 같이 얼음 상에서 마스터 믹스(2x)를 제조하였다(반응 횟수 + 10%, 20 μL의 반응 부피에 대함). 주: 10 μL의 샘플 RNA를 마스터 믹스에 첨가하여 최종 반응 부피가 20 μL가 되도록 하였다.

[표 4]

마스터 믹스를 수회(5 내지 10회) 와동시켜 혼합하고, 이어서 잠시 원심분리하였다 (1500 × g, 5 내지 10초). 10 μl의 반응 믹스를 96웰 플레이트의 각각의 적절한 웰에 첨가하였다.

마스터 믹스에 대한 RNA 샘플의 첨가: 10 μL의 각각의 RNA 샘플을 물 음성 대조군을 포함한 96웰 플레이트의 적절한 웰에 첨가하여, 최종 반응 부피가 20 μL가 되도록 하였다. 용액을 3회 상하로 피펫팅함으로써 온화하게 혼합하였다. 96웰 반응 플레이트를 플레이트 시일(plate seal)로 밀봉하고, 잠시 원심분리하였다(60초 동안 1500 × g).

ABI 9700 셋업: ABI 9700을 하기와 같이 셋업하였다:

단계 1: 25℃에서 10분 동안

단계 2: 37℃에서 120분 동안

단계 3: 85℃에서 5초 동안

단계 4: 4℃로 무한 유지

반응 부피는 20 μL로 설정하였다.

cDNA 예비증폭

예비증폭 및 실시간 PCR을 위한 프라이머 프로브 어세이 믹스의 제조: 100 μl의 20X 프라이머-프로브 혼합물을 실시간 PCR을 위해 제조하였다.

0.2X 예비증폭 어세이 풀의 제조: 0.2X 예비증폭 어세이 풀을 표 5에 나타낸 바와 같이 제조하였다. 주: 하기의 부피는 400 μl의 0.2X 예비증폭 어세이 풀을 제조하기 위한 것이다. 부피는 시험되는 샘플/Taqman 어세이의 수에 따라 그에 맞추어 조정될 수 있다.

[표 5]

샘플 및 2x 마스터 믹스의 제조: 합성된 cDNA 반응 플레이트 및 0.2X 어세이 믹스 풀을 얼음 상에 놓았다. 2X 예비증폭 마스터 믹스를 표 6에 나타낸 바와 같이 제조하였다.

[표 6]

11.25 μL의 마스터 믹스를 96웰 반응 플레이트의 적절한 웰 내로 분취하였다. 3.75 μL의 각각의 cDNA 샘플 - 양성 및 음성 대조군을 포함함 - 을 마스터 믹스 반응 플레이트 내의 적절한 웰들 내로 옮기고, 3회 상하로 피펫팅함으로써 혼합하고, 잠시 원심분리하였다.

ABI 9700 셋업: ABI 9700을 하기와 같이 셋업하였다:

단계 1: 95℃에서 10분 동안

단계 2: 95℃에서 15초 동안

단계 3: 60℃에서 4분 동안

단계 4: 14회 사이클 동안 단계 2 및 단계 3을 설정

단계 5: 4℃로 무한 유지

반응 부피는 15 μL로 설정하였다.

예비증폭 생성물 희석: 예비증폭 반응 플레이트를, 예비증폭이 완료된 후 잠시 원심분리하였다(60초 동안 1500 × g). 135 μl의 IDTE를 각각의 반응 웰에 첨가하고(1:10 희석률), 3회 상하로 피펫팅함으로써 충분히 혼합하고, 잠시 원심분리하였다(5 내지 10초 동안 1500 × g). 예비증폭 생성물을 추가 사용 시까지 -20℃에서 저장하였다.

Fluidigm™ 96.96 실시간 PCR

10X 어세이의 제조: 표 7에서의 부피를 사용하여 10X 어세이의 분취물을 제조하였다. 이들 부피는 다회의 실시를 위해 적절하게 증대될 수 있다.

[표 7]

샘플 프리믹스 및 샘플의 제조: 표 8에서의 성분들을 배합하여 샘플 프리믹스 및 최종 샘플 혼합물을 제조하였다. 이들 부피는 다회의 실시를 위해 적절하게 증대될 수 있다.

[표 8]

칩의 로딩: 프라임(Prime)(136x) 스크립트의 완료 시에, 프라이밍된 칩을 IFC 컨트롤러 HX로부터 꺼냈다. 5 μL의 각각의 어세이 및 각각의 샘플을 칩 상의 그들의 각각의 입구 내로 피펫팅하였다. 칩을 IFC 컨트롤러 HX로 복귀시켰다. IFC 컨트롤러 HX 소프트웨어를 사용하여, 로드 믹스(Load Mix)(136x) 스크립트를 실시하여 칩 내로 샘플 및 어세이를 로딩하였다. 로드 믹스(136x) 스크립트를 완료하였을 때, 로딩된 칩을 IFC 컨트롤러로부터 꺼냈다.

데이터 수집 소프트웨어의 사용: 칩을 BioMark 상에 로딩하고, 후속으로 유전자 발현 어세이에 대한 설명서/실시 96.96 특정 프로토콜을 수행하였다.

분석: 데이터 분석을 위해 자동 검출기를 선택하였다. CT가 35 미만이고, 4개의 반복 시험물 중 하나에라도 존재하는 경우, 샘플은 증폭에 대해 양성인 것으로 간주되었다.

AR 축-액체 생검 어세이 개발-방법

프라이머 검증: 주문제작 설계 및 재검증된 Taqman 유전자 발현 어세이를 ABI로부터 주문하였다(마커 및 상응하는 유전자 ID의 상세한 목록은 표 2 및 표 3에 제공되어 있음). 이들 유전자의 대부분을 발현하는 것으로 밝혀진 4개의 전립선암 세포주(VCaP, LNCaP, 22RV1 및 PC-3)의 패널을 어세이 및 프라이머 검증에 사용하였다.

FFPET(포르말린 고정 파라핀 포매 조직) 유래 RNA에 대한 검증: 이들 마커가 진정으로 공격적인 종양을 나타내는지를 시험하기 위하여, 어세이를 일 세트의 40 FFPE 전립선암 및 인접 정상 조직 유래 RNA 샘플들에 대해 시험하였다. FFPET 블록으로부터의 RNA를 Qiagen의 All Prep DNA/RNA FFPET 키트를 사용하여 추출하였다. Agilent BioAnalyzer 상에서 RNA 농도를 확인하였다. 12 μl 부피의 350 내지 500 ng의 총 RNA를 Qiagen의 Quantitect™ 역전사 키트 및 프로토콜을 사용하여 역전사하였다. cDNA의 대략 1/3을 TaqMan 예비증폭 마스터 믹스/프로토콜을 사용하여 14회 사이클 동안 48개의 마커와 함께 25 μl의 반응 부피로 예비증폭시켰다. 예비증폭된 cDNA를 1x TE 완충액을 사용하여 1:20 비로 희석시켰다. 사용자 지침에 따라, 희석된 예비증폭 생성물을 96.96 유전자 발현 칩 상에 로딩하고, Biomark 상에서 진행시켰다. ACTB 및 GAPDH를 내인성 대조군으로서 사용하였다. 샘플들을 4회 반복하여 시험하였다(전술됨 - Qiagen DNA-RNA FFPET 키트를 사용한 RNA 추출).

세포주를 PAXgene® 혈액 중에 스파이킹함: 마커들이 전혈 세포(WBC)의 백그라운드에서 차별적으로 발현되는지를 시험하기 위하여, VCaP 세포주를 정상 공여체로부터의 PAXgene®(미국 캘리포니아주 발렌시아 소재의 Quiagen) 혈액 샘플 내로 연속 희석(10, 50, 100 및 500개 세포)으로 스파이킹하였다. Qiagen의 PAXgene® 혈액 RNA 프로토콜(전술됨)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. Agilent BioAnalyzer 시스템 상에서 RNA 농도를 측정하였다. 10 μl의 RNA를 Applied Biosystems 고성능 cDNA 역전사 키트/프로토콜을 사용하여 cDNA를 제조하는 데 사용하였다. cDNA의 대략 1/3을 TaqMan 예비증폭 마스터 믹스/프로토콜(Applied Biosystems)을 사용하여 14회 사이클 동안 48개의 유전자 마커와 함께 15 μl의 반응 부피로 예비증폭시켰다. 예비증폭된 cDNA를 1xTE 완충액을 사용하여 1:10 비로 추가로 희석시켰다. Fluidigm의 BioMark 사용자 지침에 따라, 희석된 예비증폭 생성물을 96.96 유전자 발현 칩 상에 로딩하고, Biomark 상에서 진행시켰다. 각각의 샘플 및 마커를 2회 반복하여 시험하였으며, 이에 따라 각각의 유전자/샘플에 대해 4개의 값이 생성되었다. ACTB, GAPDH 및 RPL19를 내인성 대조군으로서 사용하고, BST1 및 PTPRC를 WBC 대조군으로서 사용하였다.

전립선암 환자로부터의 PAXgene® 유래 RNA의 시험: 143명의 전립선암 환자 및 20명의 정상 남성 대상체로부터 유래된 PAXgene® RNA 샘플(Capital Biosciences, Cureline, 및 Conversant Bio로부터 조달된 암 샘플)에서 대략 170개의 마커를 시험하였다. 무통성 또는 정상 공여체 대비 공격적 공여체로부터 차별적으로 검출된 마커들을 최종 후보 목록에 넣었다.

BioMark 결과를 확인하기 위한 ViiA 7 ™ 기기 상에서의 RT-PCR 어세이: Biomark™(미국 캘리포니아주 샌프란시스코 소재의 Fluidigm) 플랫폼 상에서 검출된 것으로 밝혀진 마커들을 ViiA7™(미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 Life Technologies) 상에서 추가로 시험하여 결과를 검증/확인하였다. ViiA7 상에서 후속으로 검증된 모든 마커를 최종 후보 목록에 넣어서 액체 생검 패널을 제조할 것이다.

Fluidigm® BioMark™ HD 시스템: 이 고처리량 실시간 PCR 어세이를 Fluidigm® BioMark™ HD 시스템을 사용하여 수행하였는데, 이 시스템은 96개의 샘플에서 96개의 분석물을 동시 검출하여 단회 실시로부터 9,216개의 데이터 포인트를 생성할 수 있게 한다. BioMark™ HD 플랫폼은 단지 7 nL의 반응 부피를 필요로 하는 어세이 및 샘플의 미소유체(microfluidic) 분포를 사용하고, 완료하기까지 3시간 미만이 걸린다.

방법: FFPET, 및 PAXgene® RNA 샘플로부터의 RNA를 Applied Biosystems 고성능 cDNA 역전사 키트를 사용하여 역전사한 후, Applied Biosystems Taqman 예비증폭 마스터 믹스를 사용하여 10/14회 사이클 동안 cDNA를 예비증폭시켰다. 예비증폭된 cDNA를 희석시키고, 유전자 발현을 위하여 Applied Biosystems의 ViiA7™ 또는 Fluidigm® Biomark™플랫폼 상에서 시험하였다.

전립선암 환자로부터의 전혈로부터 특이적으로 검출된 mRNA 마커의 검출

전립선암 환자 및 건강한 대조군으로부터 수집된 전혈로부터의 mRNA 마커 발현 수준으로 이루어진 데이터를 사용하여 어세이 파라미터를 도출하였다. 어세이의 독립적인 검증을 가능하게 하기 위하여, 데이터를 70%:30% 비로 트레이닝 세트와 검증 세트로 분할하였다. 트레이닝 데이터에서 수신자 동작 특성(Receiver Operating Characteristic)(ROC) 분석에 기초하여 역치 Ct 값을 도출하였으며, 감도, 특이도 및 ROC 곡선 아래 면적(AUC)을 사용하여 어세이의 진단적 특성을 평가하였다. 트레이닝 데이터로부터 획득된 역치 값을 사용하여 어떤 환자가 전립선암을 갖는지를 예측하고, 감도 및 특이도로 어세이들을 평가하여, 검증 데이터에 대해 어세이들을 독립적으로 평가하였다. 각각의 마커에 대해 결정된 역치 Ct 값이 표 9에 열거되어 있다. 대표적인 마커에 대한 개별적인 ROC 곡선이 도 1에 예시되어 있다.

[표 9]

전혈로부터의 mRNA 마커의 검출에 기초한 고위험 전립선암의 예측

선택된 마커의 예후능(prognostic power)을 전립선암 환자 및 건강한 대조군으로부터 수집된 전혈에서의 mRNA 마커의 발현 수준으로 이루어진 데이터세트에서 평가하였다. 전술된 ROC 분석을 사용하여 역치 값을 도출하여, 트레이닝 데이터에서 전립선암과 정상적인 건강한 대조군 사이를 식별하였다. 피셔 정확 검정(Fisher Exact test)을 사용하여 임상 위험 인자와의 관련성을 평가하였다. 임상 위험 인자와 유의하게 관련된 것으로 선택된 마커가 표 10 내지 표 12에 열거되어 있다.

[표 10]

[표 11]

[표 12]

고위험 전립선암을 나타내는 다변수 바이오마커 패널의 확인

다수의 mRNA 바이오마커를 포함하는 바이오마커 패널을 전립선암 환자 및 건강한 대조군으로부터 수집된 전혈에서의 mRNA 마커의 발현 수준으로 이루어진 데이터세트에서 확인하였다. 건강한 지원자와 대비하여 전립선암 샘플에서 유의하게 더 높은 발현을 갖는 16개의 유전자(ACADL, AGR2, COL1A1, FAM13C, GPX8, GRHL2, HNF1A, HOXB13, KLK2, KLK3, MYBPC1, NR0B1, PITX2, SFRP4, SLCO1B3, TMEFF2)를 확인하였다. 이들 16개의 유전자를 하기에 기재된 바와 같이 다변수 바이오마커 패널로 조합하였다. 전술된 바와 같이 ROC 분석을 사용하여 역치 값을 도출하였다. 90% 특이도로 전립선암 환자를 확인하도록 역치를 선택하였는데, 즉 건강한 지원자의 90% 이상이 건강한 지원자로서 올바르게 확인될 것이다. 기계 학습 과정을 사용하여, 검출된 양성 바이오마커의 수를 규정하였는데, 이 수에서 환자는 고위험일 것으로 여겨질 것이다. 과다적합화(overfitting)를 감시하기 위하여, 데이터를 전술된 바와 같이 트레이닝 세트와 검증 세트로 분할하였다. 트레이닝 세트는 최적의 양성 마커 수를 포함하는 분류 규칙을 규정하기 위해 사용된다. 구체적으로는, 트레이닝 데이터로부터 100개의 샘플을 무작위로 선택함으로써 부트스트랩 샘플을 생성하였다. 예측된 바이오마커 상태와 생화학적 재발까지의 시간의 상관관계를 평가함으로써 분류 규칙을 생성하였다. 일치 지수(concordance index)를 사용하여 상관관계를 측정하였는데, 이때 일치 지수는 바이오마커 양성 상태를 갖는 대상체가 바이오마커 음성 상태를 갖는 대상체에 앞서 생화학적 재발을 겪을 확률을 측정한다. 8개의 마커는 분류 규칙을 위한 특징들의 최적의 수로서 확인되었는데, 즉 양성인 8개 초과의 마커를 갖는 대상체는 바이오마커 양성인 것으로 여겨질 것이고, 생화학적 재발까지 더 짧은 시간을 가질 것으로 예측될 것이다. 분류 규칙과 생화학적 재발까지의 시간 사이의 관련성을 콕스(Cox) 회귀 분석을 사용하여 샘플들의 독립적인 검증 세트를 사용하여 검증하였다. 다변수 바이오마커 패널은 바이오마커 음성 집단과 대비하여 생화학적 재발까지 유의하게 더 짧은 시간을 갖는 대상체들의 하위세트를 확인하였다(HR = 7.94, p 값 = 0.024).

당업자는 다수의 변화 및 변형이 본 발명의 바람직한 실시 형태에 대해 이루어질 수 있으며, 그러한 변화 및 변형은 본 발명의 사상을 벗어나지 않고서 이루어질 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 모든 그러한 동등한 변형을 본 발명의 사상 및 범주 내에 포함시키고자 한다.

이 문서에 인용되거나 기재된 각각의 특허, 특허 출원, 및 간행물의 개시내용은 전체적으로 본 명세서에 참고로 포함된다.

SEQUENCE LISTING <110> JANSSEN PHARMACEUTICA NV <120> WHOLE BLOOD BASED MRNA MARKERS FOR PREDICTING PROSTATE CANCER AND METHODS OF DETECTING THE SAME <130> PRD3367USNP <140> PCT/US2016/022004 <141> 2016-03-11 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 1 ctgggagaaa aattccgggt 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 2 ggaaatgtta tgaagcaggg atg 23 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 3 tttgagatgc ttgcaattgc c 21 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 4 cttgcctgat tgcgagag 18 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 5 ctgggagaga gacagcttgt acac 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 6 caggtcaaaa gtgaactgat gca 23 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 7 cggcaggaag ccttat 16 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 8 gagctaagca ggaggcgga 19 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 9 taggcacact caaacaacga ctg 23 <210> 10 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe <400> 10 ccacaagctg aaggc 15 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer <400> 11 gcggattctc atggaacaca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer <400> 12 ggtcagccag gagcttcttg 20

Claims

환자로부터의 전혈 샘플에서 전립선암 특이적 mRNA 바이오마커를 검출하는 방법으로서,
상기 전혈 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계;
상기 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; 및
적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하며,
상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커는 KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3.1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
제1항에 있어서, 상기 cDNA는 상기 합성 단계 후에 예비증폭되는(preamplified), 방법.
제2항에 있어서, 예비증폭 단계는 14회 사이클 동안 수행되는, 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 증폭 단계는 qRT-PCR에 의해 수행되는, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전혈 샘플은 혈액 수집 튜브 내에 수집되는, 방법.
전립선암을 갖는 환자를 확인하는 방법으로서,
상기 환자의 전혈 샘플로부터 cDNA를 획득하는 단계;
상기 cDNA를 유전자 칩(gene chip)과 접촉시키는 단계로서, 상기 유전자 칩은 COL1A1에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는, 상기 접촉 단계;
COL1A1의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 COL1A1의 발현 수준을 COL1A1의 기준 수준과 대비하는 단계로서, 상기 기준 수준과 대비하여 상기 전혈 샘플에서의 상기 COL1A1의 발현 수준의 증가가 전립선암을 나타내는, 상기 대비 단계를 포함하는, 방법.
제6항에 있어서, 상기 유전자 칩은 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 추가로 포함하며, 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커는 KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3.1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 방법은
상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 기준 수준과 대비하는 단계로서, 상기 기준 수준과 대비하여 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준의 증가가 전립선암을 나타내는, 상기 대비 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 cDNA는 상기 합성 단계 후에 예비증폭되는, 방법.
제8항에 있어서, 예비증폭 단계는 14회 사이클 동안 수행되는, 방법.
제8항 또는 제9항에 있어서, 상기 증폭 단계는 qRT-PCR에 의해 수행되는, 방법.
제6항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전혈 샘플은 PAXgene RNA 튜브 내에 수집되는, 방법.
제6항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 실시간 PCR에 의해 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제6항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전립선암에 위험 인자를 배정하는 단계를 추가로 포함하며, KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, 또는 이들의 임의의 조합의 증가된 발현 수준이 고위험 전립선암을 나타내는, 방법.
고위험 전립선암을 갖는 환자를 확인하는 방법으로서,
상기 환자의 전혈 샘플로부터 cDNA를 획득하는 단계;
상기 cDNA를 유전자 칩과 접촉시키는 단계로서, 상기 유전자 칩은 고위험 전립선암을 나타내는 적어도 하나의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하며, 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커는 KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 상기 접촉 단계;
상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 기준 수준과 대비하는 단계로서, 상기 기준 수준과 대비하여 상기 적어도 하나의 mRNA 바이오마커의 발현 수준의 증가가 고위험 전립선암을 나타내는, 상기 대비 단계를 포함하는, 방법.
전립선암을 갖는 환자를 치료하는 방법으로서,
상기 환자의 전혈 샘플로부터 cDNA를 획득하는 단계;
상기 cDNA를 유전자 칩과 접촉시키는 단계로서, 상기 유전자 칩은 COL1A1에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하는, 상기 접촉 단계;
COL1A1의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 COL1A1의 발현 수준을 COL1A1의 기준 수준과 대비하는 단계; 및
상기 COL1A1의 발현 수준이 상기 COL1A1의 기준 수준과 대비하여 증가되는 경우, 상기 환자를 치료하는 단계를 포함하는, 방법.
제15항에 있어서, 상기 유전자 칩은 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 쌍 및 프로브를 추가로 포함하며, 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커는 KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1P1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3.1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되고;
상기 방법은
상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 기준 수준과 대비하는 단계; 및
상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 발현 수준이 상기 적어도 하나의 추가의 mRNA 바이오마커의 기준과 대비하여 증가되는 경우, 상기 환자를 치료하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
환자로부터의 전혈 샘플에서 ARV7(ARV3.7)을 검출하는 방법으로서,
상기 전혈 샘플로부터 RNA를 단리하는 단계;
상기 단리된 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; 및
ARV3.7의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
제17항에 있어서, 상기 cDNA는 상기 합성 단계 후에 예비증폭되는, 방법.
제18항에 있어서, 상기 예비증폭 단계는 2 내지 14회 사이클 동안 수행되는, 방법.
제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전혈 샘플은 혈액 수집 튜브 내에 수집되는, 방법.
제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정 단계는 서열 번호 2의 정방향 프라이머 및 서열 번호 3의 역방향 프라이머를 포함하는 유전자 칩을 사용하여 수행되는, 방법.
제21항에 있어서, 상기 유전자 칩은 서열 번호 1의 프로브를 추가로 포함하는, 방법.
제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 환자의 전혈 샘플로부터의 상기 ARV7(ARV3.7)의 발현 수준을 ARV7(ARV3.7) 발현의 기준 수준과 대비하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제23항에 있어서, 상기 ARV7(ARV3.7)의 기준 수준은 전립선암을 갖지 않는 개인으로부터의 전혈 샘플에서의 ARV7(ARV3.7)의 발현 수준인, 방법.
제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 환자의 전혈 샘플로부터의 상기 ARV7(ARV3.7)의 발현 수준이 상기 ARV7(ARV3.7) 발현의 기준 수준과 대비하여 증가되는지 또는 감소되는지를 결정하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
환자로부터의 전혈 샘플에서 전립선암 특이적 mRNA 전사체를 검출하기 위한 유전자 칩으로서,
mRNA 바이오마커를 증폭 및 검출하도록 구성된 프라이머 쌍 및 프로브를 포함하며, 상기 mRNA 바이오마커는 KLK3, ACADL, GRHL2, HOXB13, HSD3B1, TMP.ERG, ARV3.7, ARV567, FOLH1, KLK2, HSD3B2, AGR2, AZGP1, STEAP2, KCNN2, GPX8, SLCO1B3, TMEFF2, SPINK1, SFRP4, NROB1, FAM13C, HNF1A, CDH12, PGR, PITX2, MYBPC1, FOXA1, SRD5A2, COL1A1, NPY, UGT2B17, CLUL1, C9orf152, FLNC, GPR39, RELN, THBS2, CYP17A1, CYP3A5, BRS3, SNAI2, CDH12, NKX3.1, LGR5, TRPM8, SLCO1B3, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자 칩.
고위험 전립선암을 갖는 환자를 확인하는 방법으로서,
상기 환자의 전혈 샘플로부터 cDNA를 획득하는 단계;
상기 cDNA를 유전자 칩과 접촉시키는 단계로서, 상기 유전자 칩은 고위험 전립선암을 나타내는 8개의 mRNA 바이오마커에 대한 프라이머 쌍 및 프로브 세트를 포함하며, 상기 적어도 8개의 mRNA 바이오마커는 KLK3, PGR, KCNN2, MYBPC1, HOXB13, COL1A1, GPX8, FAM13C, SLCO1B3, KLK2, TMEFF2, NROB1, PITX2, ACADL, SFRP4, AGR2, HNF1A, GRHL2 또는 이들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 상기 접촉 단계;
모든 mRNA 바이오마커(들)의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
상기 적어도 8개의 mRNA 바이오마커의 발현 수준을 상기 적어도 8개의 mRNA 바이오마커의 기준 수준과 대비하는 단계로서, 상기 적어도 8개의 mRNA 바이오마커의 기준 수준과 대비하여 상기 적어도 8개의 mRNA 바이오마커의 발현 수준의 증가가 고위험 전립선암을 나타내는, 상기 대비 단계를 포함하는, 방법.