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WO2018110892A2 - 대식세포와 염증성물질을 이용한 자연살해세포의 대량증식방법 - Google Patents

대식세포와 염증성물질을 이용한 자연살해세포의 대량증식방법 Download PDF

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WO2018110892A2
WO2018110892A2 PCT/KR2017/014215 KR2017014215W WO2018110892A2 WO 2018110892 A2 WO2018110892 A2 WO 2018110892A2 KR 2017014215 W KR2017014215 W KR 2017014215W WO 2018110892 A2 WO2018110892 A2 WO 2018110892A2
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WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
lps
natural killer
macrophages
cell
Prior art date
Application number
PCT/KR2017/014215
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English (en)
French (fr)
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WO2018110892A3 (ko
Inventor
문귀영
이의수
임고은
최은영
Original Assignee
주식회사 이뮤니스바이오
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Application filed by 주식회사 이뮤니스바이오 filed Critical 주식회사 이뮤니스바이오
Publication of WO2018110892A2 publication Critical patent/WO2018110892A2/ko
Publication of WO2018110892A3 publication Critical patent/WO2018110892A3/ko

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    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/599—Cell markers; Cell surface determinants with CD designations not provided for elsewhere

Definitions

  • the present invention relates to the proliferation technology of natural killer cells (NK cells), and more particularly natural killer cells having an excellent cytotoxic effect on tumor cells by promoting the activation of NK cells secreting IFN- ⁇ . It relates to a method of proliferating.
  • NK cells natural killer cells
  • Immune cell therapies that selectively destroy tumors without affecting normal cells use their own cells to treat the body's immune system, resulting in less toxicity and increased efficacy. It has significant advantages when compared to medication or radiation therapy.
  • NK cells natural killer cells
  • NK cells natural killer cells
  • T-cells and B-cells with antigen-specific receptors various innate immune receptors are expressed on the cell surface and can be distinguished from them. It is known that.
  • the present invention by incubating the polygamma glutamic acid and LPS in the initial culture step at a time difference to promote the activation of natural killer cells through costimulation using macrophages, NK extracellular monocytes, induce mitosis and proliferation It is an object of the present invention to provide a method for proliferating a large amount of natural killer cells having an excellent cytotoxic effect on tumors by differentiating into cytotoxic effector cells that secrete - ⁇ .
  • Mass production method of natural killer cells the first step of collecting and separating lymphocytes, including macrophages from human blood; To the cell suspension in which the isolated lymphocytes were suspended in the culture medium, a mixture containing at least two selected from the group consisting of IL-2, IL-12, CD16 antibody, CD56 antibody and plasma was added thereto, and at the same time, 1,000 kDa.
  • the first dose of the LPS introduced at ⁇ 125 ( ⁇ g / ml), and the first dose in the third stage is greater than the second dose of the LPS introduced in the fourth stage, and the first dose And the total amount of the second dose is added so as to have a concentration of 0.5 ⁇ g / ml to 10 ⁇ g / ml with respect to the cell suspension.
  • the IL-12 or IL-15 is preferably added at a concentration of 10ng / ml ⁇ 100ng / ml with respect to the cell suspension.
  • the IL-2 is preferably added at a concentration of 80ng / ml ⁇ 2,000ng / ml relative to the cell suspension.
  • the CD16 antibody or CD56 antibody is preferably added at a concentration of 0.1ng / ml ⁇ 100ng / ml with respect to the cell suspension.
  • the plasma is preferably added in 5% to 20% by weight relative to the total weight of the cell suspension.
  • polygammaglutamic acid particularly derived from Bacillus bacteria
  • LPS induce mitosis and proliferation of natural killer cells through co-stimulation with macrophages, monocytes, in the early culturing stage.
  • Activated natural killer cells promote the release of gamma interferon.
  • Monocytes and lymphocytes primed with gamma interferon are sensitive to LPS stimuli and increase expression of genes including TNF- ⁇ .
  • Monocytes and lymphocytes primed with gamma interferon are stimulated by LPS to induce nitric oxide systhase 2 (NOS2) genes, which are important for antibacterial responses, and inflammatory cytokines (IL-1 ⁇ , IL-12, CXCL8, By secreting IL-6), natural killer cells have a cytotoxic effect.
  • NOS2 nitric oxide systhase 2
  • 4 to 6 show the distribution and phenotype of lymphocytes (Sample 1 to 3) cultured according to the present invention, respectively.
  • Figure 7 shows that in the case of Examples (Sample 1 and 2) according to the present invention, compared to the case of PBMC (lymphocytes before activation), the amount of IFN- ⁇ production of activated lymphocytes increased significantly with the day of culture. It is a graph.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of comparing cytotoxicity with PBMC (lymphocytes before activation) while treating natural killer cells activated in cancer cells K562 (target cells) by concentration.
  • Example 9 is a graph showing that the cell growth rate of lymphocytes is significantly increased in Examples (Sample 1 to 3) according to the present invention.
  • Example 10 is a graph showing that in Examples (Sample 1 to 3) according to the present invention, the cell viability of lymphocytes remains constant even when the culture day is increased.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of measuring the number of cells 5 days after the treatment of the cell suspension treated with the polygamma glutamic acid by concentration.
  • Mass production method of natural killer cells the first step of collecting and separating lymphocytes, including macrophages from human blood; To the cell suspension in which the isolated lymphocytes were suspended in the culture medium, a mixture containing at least two selected from the group consisting of IL-2, IL-12, CD16 antibody, CD56 antibody and plasma was added thereto, and at the same time, 1,000 kDa.
  • the first dose of the LPS introduced at ⁇ 125 ( ⁇ g / ml), and the first dose in the third stage is greater than the second dose of the LPS introduced in the fourth stage, and the first dose And the total amount of the second dose is added so as to have a concentration of 0.5 ⁇ g / ml to 10 ⁇ g / ml with respect to the cell suspension.
  • the IL-12 or IL-15 is preferably added at a concentration of 10ng / ml ⁇ 100ng / ml with respect to the cell suspension.
  • the IL-2 is preferably added at a concentration of 80ng / ml ⁇ 2,000ng / ml relative to the cell suspension.
  • the CD16 antibody or CD56 antibody is preferably added at a concentration of 0.1ng / ml ⁇ 100ng / ml with respect to the cell suspension.
  • the plasma is preferably added in 5% to 20% by weight relative to the total weight of the cell suspension.
  • the inventors of the present invention Prior to explaining the specific process of the method for propagating natural killer cells according to the present invention, the inventors of the present invention describe the experimental basis leading to the present invention as follows.
  • the inventors of the present invention through various attempts, using co-stimulation of macrophages and natural killer cells in the initial culture stage, activates natural killer cells and secretes gamma interferon (hereinafter referred to as IFN- ⁇ ) in large quantities. It has been found that they can proliferate and differentiate, and in particular, cytokines made by macrophages are of great importance for the activation, proliferation and survival of natural killer cells.
  • IFN- ⁇ gamma interferon
  • IL-12 directly collects and activates NK cells.
  • NK cells have surface receptors for IL-12 (Interleukin-12) and stimulation by IL-12 helps to differentiate into effective NK cells.
  • Effect NK cells produce cytokines that act on macrophages and other cells present in infected tissues, enhancing the inflammatory response.
  • the most important cytokine secreted by NK cells is gamma interferon, a potent inflammatory cytokine.
  • Gamma interferon (hereinafter referred to as IFN- ⁇ ), also known as type 2 interferon, is the primary target for macrophages in endogenous immune responses.
  • monocytes or macrophages activate NK cells, and these activated NK cells increase IFN- ⁇ secretion.
  • cytokine IL-15 Interleukin-15
  • IFN transcription factor interferon
  • NK cells express cytokine receptors different from ⁇ chains and signaling common ⁇ chains of the Interleukin-2 (IL-2) receptor.
  • IL-2 stimulates cell cycle progression by synthesizing cyclin and breaks down cell cycle progression by breaking down p27, a cell cycle inhibitor.
  • direct stimulation by IL-2 activates NK cells and induces the anti-apoptotic protein Bcl-2 to enhance cell survival.
  • cytokines such as IL-2 and IL-15, the activation of NK cells can be facilitated to induce activation through a single activation receptor.
  • IL-12, IL-6, IL-1 ⁇ , TNF- ⁇ inflammatory cytokines
  • Macrophages activate NK cells through IL-12 and IL-18 and this stimulation occurs through direct contact of NK cells and macrophages.
  • IL-12 secreted by macrophages activates NK cells and IFN- ⁇ secreted by NK cells activates macrophages. This mutual secretion increases the likelihood of ending the virus without the need to mobilize an adaptive immune response by forming a positive feedback tail.
  • TLRs Toll-like receptors
  • LPS Lipopolysaccharide
  • the toll-like receptor that initiated this activation binds to the adapter protein MyD88 domain and binds to the next member protein kinase IRAK4. This interaction causes the protein kinase to phosphorylate itself, resulting in its release from the complex, which phosphorylates another linker protein called TRAF6. After a few more steps in this pathway, a kinase complex called the inhibitor of ⁇ B kinase (IKK) is finally activated.
  • IKK inhibitor of ⁇ B kinase
  • IKK nuclear factor ⁇ B
  • NF ⁇ B nuclear factor ⁇ B
  • NF ⁇ B nuclear factor ⁇ B
  • NF ⁇ B plays an important role in endogenous immune responses. NF ⁇ B enters the nucleus and activates genes encoding inflammatory cytokines. Cytokines are synthesized from cytokine mRNAs in the cytoplasm and secreted via an endogenous network. This MyD88 domain-NF ⁇ B pathway is also stimulated by receptors for the cytokine IL-18. In addition, NF- ⁇ B transcription factor is required for anticancer activity through NK cell apoptosis activity. IKK ⁇ (activating nuclear factor called NF ⁇ B) or NF ⁇ B essential regulator is called NEMO (NF-kB essential modulator).
  • NEMO NF-kB essential modulator
  • NF- ⁇ B is a transcription factor essential for the expression of cell killer and inflammatory factors required for immune cell activation. It was confirmed that the activation of NF- ⁇ B is essential for the expression of cell killer (Granzyme B) and inflammatory factor (IFN- ⁇ ) in natural killer cells.
  • Granzyme B is a cell killer that is present in granulocytes of natural killer cells and cytotoxic T cells and is secreted like Perforin, which punctures the cell membrane to induce the death of target cancer cells.
  • IFN- [gamma] is a representative protective immune activator expressed in natural killer cells and is essential for protective immunity against cancer cells and virus infected cells.
  • the first cytokines exposed to inactive NK cells residing in virus infected tissues are IFN- ⁇ and IFN- ⁇ . They first induce mitosis and proliferation of NK cells, which in turn cause them to differentiate into cytotoxic effector cells that kill cells infected with the virus. NK cells are further activated by receiving signals from TLR4, TLR7 and TLR8, and the participation and signaling of these toll-like receptors has the effect of triggering the synthesis and secretion of type 1 interferon at the site of infection, thereby activating NK cells. And promotes cytotoxic effects.
  • polygamma glutamic acid derived from Bacillus bacteria increases the expression of CD86, CD40, IL-12 through the signal of nuclear transcription factors NF-kB and MAPK as a microorganism-associated molecular pattern.
  • the effect of polygammaglutamic acid is dependent on toll-like receptors (TLR-4) and these toll-like receptors bind pathogens and activate innate immunity.
  • Stimulating congenital immunity causes monocytes, macrophages, and dendritic cells to secrete various cytokines (IL-2, IL-12, IL-15 and IL-18). Reacts with TLR agonis.
  • NK cells secrete IFN- ⁇ , granulocyte macrophage colony-stimulating factor, and cytokines with toll-like receptors (TLRs) active to fight infected cells It becomes possible.
  • Natural killer cell proliferation method the first step of collecting and separating lymphocytes from human blood; Culturing the isolated lymphocytes; And harvesting by centrifuging and harvesting cells from the culture.
  • mononuclear cells such as human lymphocytes and monocytes, whose specific gravity is lighter than 1.077
  • the blood is superimposed on 1.077 specific gravity Ficoll-Paque Plus solution and centrifuged at a constant centrifugal force, depending on the difference in specific gravity.
  • Erythrocytes and granulocyte layers with a specific gravity greater than 1.077 are divided into mononuclear cell layers and platelets, each of which is below 1.077, which is used to obtain a mononuclear cell layer containing lymphocytes.
  • the specific process is as follows.
  • Human peripheral blood is collected from 30ml to 60ml using a heparinized 10ml vacuum vessel (BD Vacutainer TM).
  • the collected blood is transferred to a tube and centrifuged at 2,500 rpm so that the erythrocytes and granulocyte layers are divided downward, the monocyte layer and platelets are separated, and the blood components are separated.
  • lymphocyte layer divided after centrifugation is collected in a 15 ml tube using a sterile pipette.
  • PBS phosphate buffer
  • the suspension is counted using a hemocytometer and centrifuged again to collect only lymphocytes.
  • polygammaglutamic acid and LPS are treated at different time intervals to induce differentiation of natural killer cells and to stimulate the secretion of immunostimulatory cytokines such as IFN- ⁇ . Let's do it.
  • time-induced early IFN- ⁇ expression in lymphocytes, and further, stimulation of macrophages following LPS treatment led to TNF- ⁇ , IFN inducing differentiation of NK cells. to produce - ⁇ and IFN- ⁇ . This may increase the proliferation rate of cells and increase the cytotoxic ability to cancer cells through rapid induction differentiation of NK cells.
  • polygammaglutamic acid is first treated with lymphocyte cell cultures than LPS.
  • LPS is treated (60% of the total amount added)
  • the amount of TNF- ⁇ produced can be higher than that of LPS alone.
  • LPS is further treated (40% of the total amount added) to maintain TNF- ⁇ production. Treated in this way, it is possible to induce NK cell differentiation and mass production through synaptic activity of macrophages and NK cells.
  • the specific process is as follows.
  • the harvested lymphocytes are suspended in 10 ml to 20 ml of culture.
  • the molecular weight of the polygamma glutamic acid used in step (2) is preferably 1,000kDa ⁇ 5,000kDa.
  • the molecular weight of polygamma glutamic acid is preferably 2,000 kDa to 5,000 kDa, and more preferably 2,000 kDa to 4,000 kDa.
  • ⁇ -PGA poly gamma glutamic acid
  • the concentration of polygamma glutamic acid is 25 ( ⁇ g / ml) or more and 125 ( ⁇ g / ml) or less with respect to the cell culture solution.
  • Figure 11 shows the results of confirming the effects of cytotoxicity and the number of cells by the concentration of poly-gamma glutamic acid, when the lymphocytes were cultured for 5 days after the poly-gamma glutamic acid by concentration, 5 days after treatment
  • the cell number in the group treated with polygamma glutamic acid rapidly decreased when it exceeded 125 ( ⁇ g / ml). Based on the experimental results of FIG.
  • the concentration of polygamma glutamic acid should be 25 ( ⁇ g / ml) or higher for co-stimulatory effects with NK cells, and also to maintain the bulk growth effect of NK cells. In order not to exceed 125 ⁇ g / ml.
  • LPS (16) which is known to increase the secretion of IL-1 ⁇ , IFN- ⁇ , and TNF- ⁇ in human peripheral blood mononuclear cells, was treated with low and high concentrations of ⁇ -PGA at concentrations of 0.1, 1 and 10 ⁇ g / ml.
  • the three cytokine secretion induction was found to be significantly increased synergistic effect (Synergic Effect) than when only LPS alone.
  • the LPS is added with a time difference of at least 4 hours and less than 6 hours after the treatment of polygamma glutamic acid in step (2).
  • the reason why LPS is added at a time difference of 4 hours to 6 hours after polygamma glutamic acid is introduced is to stimulate macrophages early through LPS treatment to effectively induce mitosis and proliferation of NK cells by macrophages. .
  • the injection time of LPS exceeds 6 hours after the addition of polygamma glutamic acid, the co-stimulatory effect of macrophages and NK cells is reduced.
  • the input of LPS is preferably divided into the first input and the second input.
  • the first input amount of the LPS input in the first step (3) is larger than the second input amount of the LPS input in the step (4), in particular the total amount of the first input and the second input amount
  • the silver suspension is preferably added at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml to 10 ⁇ g / ml.
  • co-stimulation between macrophages and NK cells is induced by two substances, polygammaglutamic acid and LPS.
  • cell culture must be made in the presence of macrophages, and the synapses between macrophages and NK cells further stimulate NK cells to induce rapid differentiation.
  • Inflammatory cytokines secreted by macrophages by the injection of polygammaglutamic acid induce mitosis and proliferation of NK cells, and primed by IFN- ⁇ secreted during mitosis and proliferation of NK cells Is stimulated by LPS to induce NOS2 genes important for bacterial responses.
  • Synaptic activity of these macrophages and NK cells can induce differentiation and mass proliferation of NK cells.
  • IL-1 ⁇ , IFN- ⁇ and TNF- ⁇ are proinflammatory cytokines that play an important role in the host's defense mechanism against various pathological conditions such as infection, inflammation and malignancy.
  • IL-1 ⁇ is secreted from macrophages, monocytes, dendritic cells, etc. and plays an important role in the inflammatory response associated with infection.
  • IFN- ⁇ is secreted from CD4 + T helper cell type 1 lymphocytes, CD8 + cytotoxic T cells, NK cells, and professional antigen presenting cells. It plays an important role in the process of removing infected cells and cancer cells and is also involved in immunomodulatory and autoimmune diseases.
  • TNF- ⁇ is mainly produced in macrophages and secreted in lymphocytes, mast cells, vascular endothelial cells, adipocytes, fibroblasts, and the like.
  • the mixture used in the above step (2) it is preferable to include at least two or more of IL-12, CD16 antibody, CD56 antibody, IL-2, IL-15 and plasma.
  • the IL-12 or IL-15 is preferably added so as to have a concentration of 10 to 100ng / ml with respect to the total suspension, and more preferably about 50ng / ml.
  • the concentration of IL-2 is preferably added at a concentration of 80 to 2,000 ng / ml relative to the total suspension, and more preferably about 500 ng / ml.
  • the concentration of LPS is preferably added at a concentration of 0.5 ⁇ g / ml to 10 ⁇ g / ml relative to the total suspension, and more preferably about 5 ⁇ g / ml.
  • 60% of the total amount is added, and after incubating for 24 hours in the step (4) of the LPS It is preferable to process 40% of the total amount added during the second addition.
  • the antibody CD16 or the antibody CD56 is preferably added at a concentration of 0.1 to 100 ng / ml, and more preferably 10 ng / ml.
  • antibody CD16 or antibody CD56 is injected in order to induce differentiation of lymphocytes into activated NK cells.
  • the plasma is preferably 5 to 20% by weight, more preferably 10% by weight based on the total suspension.
  • Plasma contains growth factors, signaling peptides, and nutrients, which are essential for cell growth, and have factors that affect the differentiation of natural killer cells into effect cells.
  • Plasma nutrients act as nutrients in cell culture, while CD16 and CD56 antibodies enhance cell-to-cell interaction through adhesion to cells, maximizing cell activation.
  • each component that can be added to the suspension in the steps (2) and (3) above, when the concentration or weight range for each component is lower than the above, it is possible to achieve an optimal culture condition for cell activation during cell culture. On the contrary, if it is higher than the concentration or weight range, the toxicity of each component may damage the cells.
  • the cell suspension of the 75T flask was transferred to the T-175 flask, and 25 ml of the culture solution, 10 wt% to 20 wt% of the plasma, except for polygammaglutamic acid and LPS, was added thereto. Then, incubate for 2 days at 37 °C, 5% CO 2 incubator. After 2 days, add 20 ml to 50 ml of the culture. Again incubate for 1 to 2 days at 37 °C, 5% CO 2 incubator (incubator).
  • the cell suspension incubated in the T-175 flask was treated with IL-2, transferred to a culture solution containing a 1000 ml gas-permeable culture bag, and then cultured for another 6 to 7 days to multiply the cells. .
  • FIG. 4 to 6 it shows the distribution and phenotype of Examples 1 to 3 (Sample 1 to 3) for lymphocytes cultured according to the present invention.

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Abstract

본 발명에 따른 자연살해세포의 대량증식방법은, 사람의 혈액으로부터 림프구를 채취 및 분리하는 제1 단계; 상기 분리된 상기 림프구를 배양액에 현탁시킨 세포현탁액에 폴리감마글루탐산을 첨가하여 배양하는 제2 단계; 및 상기 배양액으로부터 세포를 원심 분리하여 수확하는 제3 단계;를 포함하고, 상기 폴리감마글루탐산은 1,000kDa ~ 5,000kDa의 분자량을 갖는 것을 특징으로 한다.

Description

대식세포와 염증성물질을 이용한 자연살해세포의 대량증식방법
본 발명은 자연살해세포(natural killer cell; NK 세포)의 증식 기술에 관한 것으로서, 더 자세하게는 IFN-γ를 분비하는 NK 세포의 활성화를 촉진시켜 종양세포에 대한 우수한 세포독성 효과를 갖는 자연살해세포를 증식하는 방법에 관한 것이다.
3대 항암치료인 수술, 방사선치료, 항암치료 이외에, 최근에는 면역세포치료제가 새롭게 부상하고 있다. 기존의 항암치료제는 많은 부작용과 환자의 고통을 수반한다. 이러한 항암치료방법의 단점과 한계를 보완하는 치료법으로 면역세포치료제가 주목받고 있다.
정상 세포에 영향을 주지 않고 종양만을 선택적으로 파괴하는 면역세포치료제는, 인체의 면역체계를 이용한 치료법으로 자신의 세포를 이용하기 때문에, 독성이 적고 동시에 효능은 증가되는 효과를 유도할 수 있어서, 기존의 약물치료나 방사선 치료와 비교할 때 상당한 장점을 갖고 있다.
그 중, 자연살해세포(natural killer cell, NK cell)는 선천면역세포 중의 하나로 암세포를 즉각적으로 감지하여 바로 제거 할 수 있는 장점이 있어서, 직접적으로 암의 발생과 증식, 전이, 재발 방지에 효과적이라는 사실이 밝혀지고 있다. 비특이적으로 암세포 및 바이러스 감염세포를 살상할 수 있는 세포살해활성을 특징으로 하는 선천림프구로 항원특이적인 수용체를 가진 T세포, B세포와 달리 다양한 선천면역 수용체를 세포 표면에 발현하며 이들을 통해 암세포를 구분할 수 있다고 알려져 있다.
현재 자연살해세포를 이용해 암을 치료하려는 다양한 임상연구들이 시도되고 있으며 특정 암들에 대해 유망한 결과들이 보고되고 있다.
본 발명은, 종양세포에 대한 우수한 세포독성 효과를 갖는 자연살해세포를 증식하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
특히, 본 발명은 초기 배양단계에서 폴리감마글루탐산과 LPS를 시간차를 두고 처리함으로써 NK세포외 단핵세포인 대식세포를 이용한 공동자극을 통해 자연살해세포의 활성화를 촉진시켜 유사분열 및 증식을 유도하고 IFN-γ를 분비하는 세포독성 효과세포로 분화시켜 종양에 대한 우수한 세포독성 효과를 갖는 자연살해세포를 대량으로 증식하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적들은 이상에서 언급한 목적들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 이하의 기재로부터 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 자연살해세포의 대량증식방법은, 사람의 혈액으로부터 대식세포를 포함한 림프구를 채취 및 분리하는 제1 단계; 상기 분리된 상기 림프구를 배양액에 현탁시킨 세포현탁액에 대하여, IL-2, IL-12, CD16 항체, CD56 항체 및 혈장을 포함하는 그룹에서 선택된 적어도 2종을 포함하는 혼합물을 투입하고, 동시에 1,000kDa ~ 5,000kDa의 분자량을 갖는 폴리감마글루탐산을 투입하여 4시간 이상 및 6시간 이하로 배양하는 제2 단계; 제2 단계 이후에 1차로 LPS를 투입한 후 24시간 이상 배양하는 제3 단계; 제3 단계 이후에 2차로 LPS를 투입한 후 2~3일간 배양하는 제4 단계; 제4 단계 이후에, 상기 폴리감마글루탐산 및 상기 LPS가 포함되지 않은 배양액 및 혈장을 투입하여 2~4일간 배양하는 제5 단계; 및 상기 제5 단계를 마친 상기 배양액으로부터 세포를 원심 분리하여 수확하는 제6 단계;를 포함하고, 상기 제2 단계에서 투입되는 상기 폴리감마글루탐산의 농도는 상기 세포현탁액에 대하여 25(㎍/㎖) ~ 125(㎍/㎖)로 투입되고, 상기 제3 단계에서 1차로 투입되는 상기 LPS의 제1차 투입량은 상기 제4 단계에서 투입되는 상기 LPS의 제2차 투입량보다 크고, 상기 제1차 투입량 및 상기 제2차 투입량의 합계는 상기 세포현탁액에 대하여 0.5㎍/㎖ ~ 10㎍/㎖의 농도가 되도록 투입되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 IL-12 또는 IL-15는 상기 세포현탁액에 대하여 10ng/㎖ ~ 100ng/㎖의 농도로 투입되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 IL-2는 상기 세포현탁액에 대하여 80ng/㎖ ~ 2,000ng/㎖의 농도로 투입되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 CD16 항체 또는 CD56 항체는 상기 세포현탁액에 대하여 0.1ng/㎖ ~ 100ng/㎖의 농도로 투입되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 혈장은 상기 세포현탁액 총 중량에 대하여 5중량% ~ 20중량%로 투입되는 것이 바람직하다.
본 발명에 따르면, 폴리감마글루탐산(특히, 바실러스 박테리아로부터 유래된) 및 LPS를 이용하여 초기 배양단계에서 단핵구인 대식세포를 이용한 공동자극법을 통해 자연살해세포의 유사분열 및 증식을 유도하고, 이러한 과정을 통해 활성화된 자연살해세포는 감마 인터페론의 분비를 촉진시킨다. 감마 인터페론에 의해 프라이밍(priming)된 단핵구 및 림프구는 LPS 자극에 민감하게 하여 TNF-α를 포함한 유전자의 발현을 증가시킨다. 감마 인터페론에 의해 프라이밍(priming)된 단핵구 및 림프구는 LPS에 의해 자극되어진 후 항 박테리아 반응에 중요한 NOS2(nitric oxide systhase 2) 유전자 유도를 하게 되고, 염증 싸이토카인(IL-1β, IL-12, CXCL8, IL-6)을 분비하게 됨으로써 자연살해세포가 세포 독성 효과를 갖도록 한다.
도 1 내지 도 3은, 본 발명에 따른 자연살해세포의 대량증식방법에서, 폴리감마글루탐산(Poly Gamma Glutamic Acid; γ-PGA)을 첨가하여 배양하였을 때, 폴리감마글루탐산을 첨가하지 않은 경우보다, IFN-γ, IL-1β, TNF-α의 분비를 증가시킴을 보여주는 그래프들이다.
도 4 내지 도 6에는 본 발명에 따라 배양된 림프구(Sample 1 내지 3)의 분포도 및 표현형을 각각 나타내었다.
도 7는, 본 발명에 따른 실시예(Sample 1 및 2)의 경우, PBMC(활성화되기 전의 림프구)의 경우와 비교할 때, 활성화 림프구의 IFN-γ의 생성량이 배양일에 따라 월등히 증가함을 보여주는 그래프이다.
도 8은, 암세포 K562(타겟 세포)에 활성화된 자연살해세포를 농도별로 처리하면서 세포독성(Cytotoxicity) 정도를 PBMC(활성화되기 전의 림프구)와 비교한 결과를 도시한 그래프이다.
도 9은, 본 발명에 따른 실시예(Sample 1 내지 3)의 경우, 림프구의 세포증식률이 현저히 증가함을 보여주는 그래프이다.
도 10은, 본 발명에 따른 실시예(Sample 1 내지 3)의 경우, 림프구의 세포생존율(Viability)이 배양일이 증가하더라도 일정하게 유지됨을 보여주는 그래프이다.
도 11은, 폴리감마글루탐산을 농도별로 처리한 세포현탁액에 대하여 처리 5일 후에 세포수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
본 발명에 따른 자연살해세포의 대량증식방법은, 사람의 혈액으로부터 대식세포를 포함한 림프구를 채취 및 분리하는 제1 단계; 상기 분리된 상기 림프구를 배양액에 현탁시킨 세포현탁액에 대하여, IL-2, IL-12, CD16 항체, CD56 항체 및 혈장을 포함하는 그룹에서 선택된 적어도 2종을 포함하는 혼합물을 투입하고, 동시에 1,000kDa ~ 5,000kDa의 분자량을 갖는 폴리감마글루탐산을 투입하여 4시간 이상 및 6시간 이하로 배양하는 제2 단계; 제2 단계 이후에 1차로 LPS를 투입한 후 24시간 이상 배양하는 제3 단계; 제3 단계 이후에 2차로 LPS를 투입한 후 2~3일간 배양하는 제4 단계; 제4 단계 이후에, 상기 폴리감마글루탐산 및 상기 LPS가 포함되지 않은 배양액 및 혈장을 투입하여 2~4일간 배양하는 제5 단계; 및 상기 제5 단계를 마친 상기 배양액으로부터 세포를 원심 분리하여 수확하는 제6 단계;를 포함하고, 상기 제2 단계에서 투입되는 상기 폴리감마글루탐산의 농도는 상기 세포현탁액에 대하여 25(㎍/㎖) ~ 125(㎍/㎖)로 투입되고, 상기 제3 단계에서 1차로 투입되는 상기 LPS의 제1차 투입량은 상기 제4 단계에서 투입되는 상기 LPS의 제2차 투입량보다 크고, 상기 제1차 투입량 및 상기 제2차 투입량의 합계는 상기 세포현탁액에 대하여 0.5㎍/㎖ ~ 10㎍/㎖의 농도가 되도록 투입되는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 IL-12 또는 IL-15는 상기 세포현탁액에 대하여 10ng/㎖ ~ 100ng/㎖의 농도로 투입되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 IL-2는 상기 세포현탁액에 대하여 80ng/㎖ ~ 2,000ng/㎖의 농도로 투입되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 CD16 항체 또는 CD56 항체는 상기 세포현탁액에 대하여 0.1ng/㎖ ~ 100ng/㎖의 농도로 투입되는 것이 바람직하다.
또한, 상기 혈장은 상기 세포현탁액 총 중량에 대하여 5중량% ~ 20중량%로 투입되는 것이 바람직하다.
이하에서는 본 발명에 따른 자연살해세포의 증식방법에 대한 바람직한 실시예를 자세히 설명한다. 다만, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
본 발명에 따른 자연살해세포 증식 방법의 구체적인 공정을 설명하기에 앞서서 본 발명의 발명자들이 본 발명에 이르게 된 실험적 근거를 설명하면 다음과 같다. 본 발명의 발명자들은, 다양한 시도를 통해, 초기 배양단계에서 대식세포와 자연살해세포의 공동자극을 이용하면, 자연살해세포를 활성화시켜 감마 인터페론(이하, IFN-γ)을 분비하는 효과세포로 대량 증식 및 분화시킬 수 있음을 발견하였고, 특히 대식세포에 의해 만들어지는 사이토카인들이 자연살해세포의 활성화, 증식 및 생존에 매우 중요함을 발견하였다.
여기서, 감염조직에 활성화된 대식세포(macrophages)가 분비하는 사이토카인(cytokines)들 중 IL-12는 NK 세포(NK cell)를 직접 소집하여 활성화시킨다. NK 세포는 IL-12(Interleukin-12)에 대한 표면수용체를 가지며 IL-12에 의한 자극은 효과 NK 세포로 분화되는데 도움을 준다. 효과 NK 세포는 감염조직에 존재하는 대식세포와 다른 세포들에게 작용하는 사이토카인을 생성하여 염증반응을 고조시킨다. NK 세포에 의해 분비되는 가장 중요한 사이토카인은 강력한 염증 사이토카인인 감마 인터페론이다. 제2형 인터페론이라고도 알려진 감마 인터페론(이하, IFN-γ)은 내재면역반응에서 대식세포를 주된 표적으로 한다. 인간 및 쥐(mouse) 모델에서 단핵구(monocytes) 또는 대식세포(macrophages)는 NK 세포를 활성화시키며, 이러한 활성화된 NK 세포는 IFN-γ 분비를 높인다.
또한, 대식세포(macrophages)에 의해 만들어지는 사이토카인 IL-15(Interleukin-15)는 NK 세포의 활성화, 증식 및 생존에 매우 중요하다. IL-15의 효과는 특별히 NK 세포와 대식세포의 접촉에 의존한다. IL-15는 NK 세포 분화에 관여하고, 이것은 IL-15 생성에 요구되는 전사인자 인터페론(transcription factor interferon, IFN)-조절 인자 1이 결핍된 쥐에서는 NK 세포가 결핍되면, IL-15 또는 IL-15Rα가 결핍된 쥐에서는 NK 세포가 발견되지 않는다는 것에 의해 알게 되었다.
한편, 휴지기의 NK 세포는 인터루킨-2(Interleukin-2; IL-2) 수용체의 β사슬 및 신호전달 공통 γ사슬과 다른 사이토카인(cytokine) 수용체를 발현한다. IL-2는 사이클린(cyclin)을 합성하여 세포주기 진행을 자극하고, 세포주기 억제자인 p27을 분해시켜 세포주기 진행의 차단을 풀어준다. 따라서, IL-2에 의한 직접적인 자극은 NK세포를 활성화시키며 항세포자멸사단백질 Bcl-2를 유도하여 세포의 생존을 증진시킨다. 이러한 IL-2, IL-15같은 사이토카인(cytokine)이 존재할 경우, NK 세포의 활성화를 용이하게 하여 단일 활성화 수용체를 통해서도 활성화를 유도할 수 있다.
IFN-γ와 대식세포의 표면에 있는 IFN-γ 수용체의 상호작용으로 생성되는 신호에 의해, 대식세포가 더욱 활성화되어 염증 사이토카인(IL-12,IL-6,IL-1β,TNF-α)을 더욱 효과적으로 분비한다. 대식세포는 IL-12와 IL-18을 통해 NK 세포를 활성화시키며 이러한 자극은 NK 세포와 대식세포의 직접적인 접촉을 통해 일어난다. 대식세포가 분비하는 IL-12는 NK 세포를 활성화시키고 NK 세포가 분비하는 IFN-γ은 대식세포를 활성화시킨다. 이러한 상호 분비는 양성되먹임꼬리를 형성함으로써 내재면역반응의 힘을 강화시켜 적응면역반응을 동원할 필요없이 바이러스를 종식시킬 가능성을 증가시킨다.
또한, 대식세포는 포식수용체 뿐만 아니라 이를 보완하는 신호전달수용체를 가지고 있다. 이 수용체는 병원체를 인지하여 대식세포로 하여금 감염조직으로 내재면역 세포들을 추가로 동원하도록 지시한다. 병원체를 인지하는 가변성 세포 외 도메인과 세포의 내부로 정보를 전달하는 보존성 세포질 선호전달 도메인을 갖는 톨-유사 수용체(Toll-like receptor, TLRs)는 다른 종류의 내재면역세포에 의해 발현되며 다양한 미생물 리간드(ligand)를 인지한다. 톨-유사 수용체 중에서 TLR4는 대식세포에 의해 발현되며, CD14와 연관되어 LPS(Lipopolysaccharide)를 인지하며, TLR4 이합체는 MD2라 불리는 단백질과 결합하여 LPS를 탐지한다. 이렇게 활성화를 시작한 톨-유사 수용체는 연결단백(adaptor protein) MyD88 도메인에 결합하고, 다음 구성원인 단백 키나아제 IRAK4에 결합한다. 이러한 상호작용으로 단백 키나아제는 그 자신이 인산화되며, 그 결과 복합체에서 유리되어 TRAF6라 불리는 다른 연결단백을 인산화시킨다. 이 경로에서 몇 단계를 더 거치면 마침내 κB키나아제 억제제(inhibitor of κB kinase, IKK)라 불리는 키나아제복합체가 활성화된다.
IKK의 기능은 핵 인자 κB(nuclear factor κB, NFκB)라 불리는 전사인자를 활성화시키는 것이다. NFκB는 내재면역반응에서 중요한 역할을 한다. NFκB는 핵 속으로 들어가 염증 사이토카인을 부호화하는 유전자를 활성화시킨다. 사이토카인은 세포질에 있는 사이토카인 mRNA로부터 합성되어 내형질망을 거쳐 분비된다. 또한, 이 MyD88 도메인-NFκB 경로는 싸이토카인 IL-18에 대한 수용체에 의해서도 자극된다. 또한 NK 세포의 세포살해활성을 통한 항암작용에는 NF-κB 전사인자가 필요한데, IKKγ(NFκB라 불리는 핵 인자를 활성화시킴)나 NFκB 필수 조절자를 NEMO(NF-kB essential modulator)라고 한다. 이러한 MEMO와 같은 성분이 부족한 환자에서는 NK 세포는 IFN-γ 발현이 감소한다. 이러한 NF-κB는 면역세포 활성화에 필요한 세포살해인자, 염증인자 발현에 핵심적인 전사인자이다. NF-κB의 활성화는 자연살해세포에서 세포살해인자(Granzyme B)와 염증인자(IFN-γ)의 발현에 필수적임을 확인하였다. 세포살해인자(Granzyme B)는 자연살해세포, 세포독성 T세포의 과립구에 존재하는 세포살해인자로 세포막에 구멍을 뚫는 퍼포린(Perforin)과 같이 분비되어 표적암세포의 사멸을 유도하며, 염증인자인 IFN-γ는 자연살해세포에서 발현되는 대표적인 방어면역 활성인자로 암세포, 바이러스 감염세포에 대한 방어면역에 필수적이다.
바이러스에 감염된 조직에서 상주하는 비활성 상태의 NK 세포가 처음 노출되는 싸이토카인은 IFN-α와 IFN-β이다. 이들은 먼저 NK 세포의 유사분열과 증식을 유도하며, 이어서 이들 세포가 바이러스에 감염된 세포를 죽이는 세포독성 효과세포로 분화되게 한다. NK 세포는 TLR4, TLR7 및 TLR8을 통해 나오는 신호를 받아 더욱 활성화되며, 이러한 톨-유사 수용체의 참여와 신호전달은 감염부위에서 제1형 인터페론의 합성과 분비를 촉발하는 효과를 가져 NK 세포의 활성화와 세포 독성 효과를 촉진시킨다.
한편, 바실러스 박테리아로부터 유래된 폴리감마글루탐산은 미생물연관 분자패턴으로서 핵 전사인자인 NF-kB와 MAPK의 신호를 통해 CD86, CD40, IL-12의 발현을 증가시킨다. 폴리감마글루탐산의 효과는 톨-유사 수용체(TLR-4)에 의존적이며 이러한 톨-유사 수용체는 병원체와 결합하며 선천면역을 작동시킨다. 선천면역을 자극하면 단핵구(monocytes), 대식세포(macrophages), 수지상세포(dendritic cells)가 각종 사이토카인들(IL-2, IL-12, IL-15 and IL-18)을 분비하게 되고, 이것이 TLR 아고니스(agonis)로 반응하게 된다. 톨-유사 수용체(TLRs)가 활성화되어 있는 상태에서 NK 세포가 IFN-γ, 과립세포-대식세포 집락자극인자(granulocyte macrophage colony-stimulating factor), 사이토카인(cytokines)을 분비하게 되어 감염된 세포와 싸울 수 있게 된다.
이하, 본 발명에 따른 자연살해세포의 증식방법의 그 구체적인 공정에 대해 상세히 설명한다. 본 발명에 따른 자연살해세포 증식방법은, 사람의 혈액으로부터 림프구를 채취 및 분리하는 제1 단계; 분리된 상기 림프구를 배양하는 제2 단계; 및 배양액으로부터 세포를 원심 분리하여 수확하는 제3 단계;를 포함하여 달성된다.
[림프구의 분리]
사람의 림프구, 단구 등 단핵세포의 비중이 1.077 보다 가벼운 성질을 이용하여, 혈액을 1.077 비중의 피콜-파크 플러스(Ficoll-Paque Plus) 용액에 중첩시켜 일정한 원심력으로 원심 침전시키면, 비중의 차이에 따라 비중이 1.077 보다 큰 적혈구와 과립구층은 아래로 1.077 이하인 단핵구층과 혈소판 등은 위로 나뉘어지는데, 이를 이용하여 림프구가 포함된 단핵구층을 얻는다. 구체적인 공정은 다음과 같다.
(1) 사람의 말초혈액을 헤파린 처리된 10㎖의 진공채혈관(BD Vacutainer TM)을 이용하여 30㎖ ~ 60㎖ 채혈한다.
(2) 50㎖ 림프구 분리튜브(Leuco sep, Greiner Bio-One, Swiss)에 피콜-파크 플러스(Ficoll-Paque Plus; endotoxin tested, 밀도 1.077g/㎖, GE Healthcare, USA)를 15㎖ 넣고 2,000rpm에서 원심분리하여 용액을 튜브 내의 글래스 멤브레인(glass membrane)의 아래로 침강되게 한다.
(3) 채혈한 혈액을 튜브에 옮기고 2,500rpm에서 원심 분리함으로써, 적혈구와 과립구층은 아래로, 단핵구층과 혈소판 등은 위로 나뉘게 하여, 혈액성분을 분리한다.
(4) 원심분리 후 나뉘어진 상층의 혈장은 56℃ 수조에서 30분간 불활성시킨다.
(5) 원심분리 후 나뉘어진 림프구층은 멸균된 피펫을 이용하여 15㎖ 튜브(tube)에 모은다.
(6) 채취한 림프구가 있는 15㎖ 튜브를 원심분리후 상층액을 제거한다.
(7) 상층액이 제거된 림프구에 인산염 완충용액(PBS) 10㎖를 넣어 현탁시켜, 세포를 세정(washing)한다.
(8) 현탁액을 혈구계산판(hemocytometer)을 사용하여 세포수를 측정하고 다시 원심분리하여 림프구만을 모은다.
(9) 최종적으로 분리한 림프구에 대식세포가 포함되어 있는지 여부를 확인한다. 확인 결과, 대식세포가 포함되어 있는 경우에 후술하는 제 1 공정을 진행한다.
[제 1 공정]
대식세포가 포함된 림프구에 대하여, 폴리감마글루탐산과 LPS를 시간차를 두고 처리하여 자연살해세포의 분화증식을 유도하고 IFN-γ와 같은 면역촉진성(immunostimulatory)의 사이토카인(cytokines)의 분비를 촉진시킨다. 고분자량의 폴리감마글루탐산 및 LPS의 시간차 첨가에 의해, 림프구에서의 초기 IFN-γ 발현을 유도하고, 추가로 LPS를 처리함에 따른 대식세포의 자극은 NK 세포의 분화를 유도하는 TNF-α, IFN-α 및 IFN-β를 생산하게 한다. 이는, NK 세포의 빠른 유도 분화를 통해 세포의 증식률을 높이고 암세포에 대한 세포독성능력을 증가시킬 수 있다. 림프구 세포배양액에 LPS 보다 폴리감마글루탐산을 먼저 처리하는 이유는, 림프구에 폴리감마글루탐산을 먼저 처리하여 림프구에서의 초기 IFN-γ 발현을 유도하고, 이렇게 세포배양액에 IFN-γ 발현이 되어 있는 상태에서 LPS를 처리(첨가하는 총량의 60%)하므로 생성되는 TNF-α 양을 LPS 단독 처리군보다 높일 수 있다. 또한, 림프구의 TNF-α 생성이 감소하는 24시간 뒤에 LPS를 추가로 처리(첨가하는 총량의 40%)하여 TNF-α 생성을 유지한다. 이러한 방법으로 처리하여야 대식세포 및 NK 세포의 시냅스 활동을 통해 NK 세포 분화 및 대량 생산을 유도할 수 있다. 구체적인 공정은 다음과 같다.
(1) 수확한 림프구를 10㎖ ~ 20㎖의 배양액에 현탁시킨다.
(2) 위 (1)에서 준비된 세포현탁액에, IL-12, CD16 항체, CD56 항체, IL-2, IL-15 및 혈장을 포함하는 혼합물을 넣는다. 이와 동시에 고분자량의 폴리감마글루탐산을 배양액의 25(㎍/㎖) ~ 125(㎍/㎖)가 되도록 75T 플라스크(Flask)에 처리하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 4시간 이상 및 6시간 이하의 시간동안 배양한다.
(3) 위 (2) 이후에 폴리감마글루탐산이 첨가되어 있는 75T 플라스크에 1차로 LPS(첨가하는 총량의 51wt%~60wt%)를 처리하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 24시간 배양한다.
(4) 24시간 배양 후에 다시 2차로 LPS(첨가하는 총량의 40wt%~49wt%)를 처리한다.
(5) 그 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 2일간 배양한다.
여기서, 위 (2) 단계에서 사용된 폴리감마글루탐산의 분자량은 1,000kDa ~ 5,000kDa인 것이 바람직하다. 특히, 폴리감마글루탐산의 분자량은 2,000kDa ~ 5,000kDa인 것이 바람직하고, 2,000kDa ~ 4,000kDa인 것이 더욱 바람직하다. 참고로, 도 1 내지 도 3에서 보듯이, 1,000kDa ~ 5,000kDa 범위의 고분자량을 가진 폴리감마글루탐산(Poly Gamma Glutamic Acid; γ-PGA)의 경우, 폴리감마글루탐산을 첨가하지 않은 경우(도 1 내지 도 3에서 'control'로 표시한 경우) 보다, IFN-γ, IL-1β, TNF-α의 분비를 더욱 증가시킴을 알 수 있다. 다만, 폴리감마글루탐산의 분자량이 1,000kDa 미만인 경우, 물질의 나노화로 면역활성 반응이 낮아지는 문제가 발생(효능감소)되고, 폴리감마글루탐산의 분자량이 5,000kDA 초과인 경우 효능에는 차이가 없으나 점도가 증가되어 세포배양에는 적합하지 않은 문제가 발생된다.
또한, 폴리감마글루탐산의 농도는 세포배양액에 대하여 25(㎍/㎖) 이상 및 125(㎍/㎖) 이하가 되도록 하는 것이 바람직하다. 참고로, 도 11은 폴리감마글루탐산의 투입 농도에 의한 세포독성 및 세포수의 영향을 확인한 결과를 나타낸 결과로서, 폴리감마글루탐산을 농도별로 투입한 후 림프구를 5일간 배양하였을 때, 처리 후 5일째에 세포수를 측정한 결과, 125(㎍/㎖)를 초과하는 경우 폴리감마글루탐산을 처리한 군에서 세포수가 급격히 감소함을 알 수 있었다. LPS를 투입하지 않은 도 11의 실험결과에 기초할 때, NK 세포와의 공동자극 효과를 위해서는 폴리감마글루탐산의 농도가 25(㎍/㎖) 이상이어야 하고, 또한 NK 세포의 대량증식 효과를 유지하기 위해서는 125(㎍/㎖)를 초과하지 않아야 한다.
다음으로, 인간 말초혈액 단핵세포에서 IL-1β, IFN-γ, TNF-α의 분비를 증가시키는 것으로 알려진 LPS(16)를 0.1, 1, 10 ㎍/㎖의 농도에서 저농도와 고농도 γ-PGA와 함께 처리한 실험에서, 고분자량의 γ-PGA를 LPS와 함께 처리하였을 때, 위 세가지 사이토카인 분비유도가 LPS만 단독으로 처리하였을 때보다 월등히 증가하는 시너지 효과(Synergic Effect)를 확인할 수 있었다.
여기서, LPS는 위 (2)단계에서 폴리감마글루탐산을 처리한 이후 최소 4시간 이상 및 6시간 이하의 시간차를 두고 투입한다. LPS를 폴리감마글루탐산 투입 이후 4시간 ~ 6시간의 시차를 두고 투입하는 이유는, LPS의 처리를 통해 초기의 대식세포를 자극하여 대식세포에 의한 NK 세포의 유사분열 및 증식이 효과적으로 유도하기 위함이다. 또한, LPS의 투입시기가 폴리감마글루탐산 투입 이후 6시간을 초과하면, 대식세포 및 NK 세포의 공동자극 효과가 저하된다. 또한, LPS의 투입은 1차 투입 및 2차 투입으로 나누어서 진행하는 것이 바람직하다. 이와 같이 LPS의 투입을 24시간 이상의 시차를 두고 나누어 진행하는 이유는, TNK-α의 농도를 배양 기간 동안 충분히 유지하기 위해서이고, 또한 초기에 너무 많은 양의 LPS를 투입하면 세포 손상의 위험이 있기 때문이다. 이를 위하여, 위 (3)단계에서 1차로 투입되는 LPS의 제1차 투입량은, 위 (4)단계에서 투입되는 LPS의 제2차 투입량보다 크고, 특히 제1차 투입량 및 제2차 투입량의 총량은 세포현탁액에 대하여 0.5㎍/㎖ ~ 10㎍/㎖의 농도가 되도록 투입되는 것이 바람직하다.
이와 같이, 폴리감마글루탐산 및 LPS의 두 물질에 의하여 대식세포 및 NK 세포간 공동자극이 유도된다. 이를 위해, 대식세포의 존재 하에 세포 배양이 이루어져야 하고, 대식세포 및 NK 세포 사이의 시냅스가 NK 세포를 더욱 자극시켜 빠르게 분화되도록 유도한다. 폴리감마글루탐산의 투입에 의해 대식세포에 의해 분비되는 염증 싸이토카인들이 NK 세포의 유사분열 및 증식을 유도하고, NK 세포의 유사분열 및 증식과정 중에 분비되는 IFN-γ에 의해 프라이밍(priming)된 대식세포는 LPS에 의해 자극되어 박테리아 반응에 중요한 NOS2 유전자를 유도하게 된다. 이러한 대식세포 및 NK세포의 시냅스 활동을 통해 NK 세포의 분화 및 대량증식을 유도할 수 있다.
참고로, IL-1β, IFN-γ, TNF-α는 감염, 염증, 악성종양과 같은 다양한 병적인 상황에 대항하는 숙주의 방어기전에 있어 중요한 역할을 하는 전구 염증성 사이토카인이다. IL-1β는 대식세포, 단핵세포, 수지상세포 등에서 분비되며 감염과 관련된 염증반응에 중요한 역할을 한다. IFN-γ는 CD4+ 보조 T세포(T helper cell type 1 lymphocytes), CD8+ 세포독성세포(cytotoxic T cell), 자연살해세포 (NK cells), 항원제시세포 (professional antigen presenting cell) 등에서 분비되고, 병원체에 감염된 세포와 암세포를 제거하는 과정에 있어 중요한 역할을 하며 면역조절 및 자가면역 질환에도 관련이 있다. TNF-α는 주로 대식세포에서 생산되며 림프구세포, 비만세포, 혈관내피세포, 지방세포, 섬유아세포 등에서도 분비된다.
주로 급성염증 반응에서 면역세포들을 조절하는 중요한 역할을 하며, 종양발생 및 바이러스 복제 등을 억제하고 세포고사를 촉진한다. 이러한 IL-1β, IFN-γ, TNF-α의 생산증가는 면역작용세포 (immune effector cells)의 세포독성과 살균효능 증가와 관련이 있는데, 특히 이러한 사이토카인들 모두 종양세포를 파괴할 수 있는 능력을 갖는 자연살해세포 (natural killer cells)와 세포독성 T세포 (cytotoxic T cells)의 활성에 큰 영향을 미친다.
폐암 환자에서는 혈청 IL-1, IL-2, TNF-α가 감소된 소견이 관찰되며, IFN-γ의 감소는 짧은 생존기간과 관련이 있다. 그 외에 건선, 아토피 피부염, 천식, 말라리아, 에이즈, 악성종양 등의 질환에서 이 사이토카인들의 농도가 변화된 사실이 증명되었다.
아울러, 위 (2) 단계에서 사용된 혼합물은, IL-12, CD16 항체, CD56 항체, IL-2, IL-15 및 혈장 중 적어도 2개 이상을 포함하는 것이 바람직하다.
이때, IL-12 또는 IL-15는 각각 전체 현탁액에 대하여 10 ~ 100ng/㎖의 농도가 되도록 투입되는 것이 바람직하고, 약 50ng/㎖인 것이 더욱 바람직하다.
IL-2의 농도는 전체 현탁액에 대하여 80 ~ 2,000ng/㎖의 농도로 투입되는 것이 바람직하고, 약 500ng/㎖인 것이 더욱 바람직하다.
LPS의 농도는 전체 현탁액에 대하여 0.5㎍/㎖ ~ 10㎍/㎖의 농도로 투입 것이 바람직하고, 약 5㎍/㎖인 것이 더욱 바람직하다. 이때, 위 (3) 단계에서 LPS의 1차 투입시(폴리감마글루탐산의 투입 이후 4시간 경과 후)에는 전체 첨가하는 총량의 60%를 첨가하고, 위 (4) 단계에서 24시간 배양 후에 LPS의 2차 투입시 전체 첨가하는 총량의 40%를 처리하는 것이 바람직하다.
아울러, 항체 CD16 또는 항체 CD56는 각각 0.1~100ng/㎖의 농도로 투입되는 것이 바람직하고, 10ng/㎖인 것이 더욱 바람직하다. 여기서, 항체 CD16 또는 항체 CD56은, 미분화 림프구를 활성화 NK 세포로 분화 유도하기 위하여 투입한다.
그리고, 혈장은 전체 현탁액에 대하여 5 ~ 20 중량%인 것이 바람직하고, 10 중량%인 것이 더욱 바람직하다. 혈장 안에는 세포성장에 필수적인 성장인자 및 신호전달 펩티드와 영양성분 등이 포함되어 있으며, 자연살해세포가 효과세포로 분화하는데 영향을 미치는 인자를 갖고 있다. 혈장이 갖고 있는 영양분들은 세포배양에서 영양물질로서 작용하면서, CD16 항체 및 CD56 항체가 세포와의 접착작용으로 세포간 상호작용을 높여주어 세포활성화를 극대화시킨다.
위 (2) 및 (3) 단계에서 현탁액에 투입될 수 있는 각 성분의 함량과 관련하여, 상술한 각 성분에 대한 농도 또는 중량 범위보다 낮을 경우 세포배양시 세포활성화에 최적화된 배양조건을 이룰 수 없고, 반대로 해당 농도 또는 중량 범위보다 높을 경우 각 성분들이 갖고 있는 독성으로 인하여 세포에 손상을 줄 수 있다.
[제 2 공정]
제 1 공정을 마친 후, 75T 플라스크의 세포부유액을 T-175 플라스크로 옮기고, 폴리감마글루탐산 및 LPS를 제외하고 배양액 25㎖, 혈장 10중량% ~ 20 중량%를 넣어 준다. 그 후, 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 2일간 배양한다. 2일 후 배양액 20㎖ ~ 50㎖를 추가로 투입한다. 다시 37℃, 5% CO2 인큐베이터(incubator)에서 1 ~ 2일간 배양한다.
[제 3공정]
제 2 공정을 마친 후, T-175 플라스크에서 배양중인 세포현탁액에 IL-2를 처리하고, 1,000㎖ 용량의 가스투과성 배양백이 들어있는 배양액에 옮긴 후 6~7일간 더 배양하여 세포를 다량 증식시킨다.
[세포수확]
(1) 1,000㎖ 용량의 가스투과성 배양백이 들어있는 세포현탁액을 원심분리튜브에 나누어 옮긴다.
(2) 2,500rpm에서 원심분리하여 세포를 수확한다.
(3) 상층액을 세포가 떨어지지 않도록 조심히 버린 후, 멸균생리식염수 250㎖로 세포를 2회 세척하고, 원심분리하여 세포를 수확한다.
(4) 주사용 멸균 생리식염수 100㎖ 팩에 주사기(syringe)를 사용하여 세포를 주입한다.
본 발명에 따른 방법에 의해 자연살해세포를 증식한 경우, 다음과 같은 유리한 효과를 가진다.
먼저, 도 4 내지 도 6에서 보듯이, 본 발명에 따라 배양된 림프구에 대한 실시예 1 내지 3(Sample 1 내지 3)의 분포도 및 표현형을 나타내었다.
다음으로, 도 7에서 보듯이, 본 발명에 따른 실시예(Sample 1 및 2)의 경우, 활성화되기 전의 림프구의 경우(PBMC)와 비교할 때, 실시예 1 및 2의 활성화 림프구의 IFN-γ의 생성량이 배양일에 따라 월등히 증가함을 볼 수 있다. 여기서, "activated NK(1)"은 실시예 1(sample 1)을 가리키고, "activated NK(2)"는 실시예 2(sample 2)를 가리킨다.
또한, 도 8에서 보듯이, 암세포 K562(타겟 세포)에 활성화된 자연살해세포를 농도별로 처리하면서 세포독성(Cytotoxicity) 정도를 PBMC(활성화되기 전의 림프구)와 비교한 결과, 활성화된 자연살해세포(Activated NK cell)의 경우 농도 의존적으로 세포독성 결과가 나타났다. 여기서, "activated NK(1)"은 실시예 1(sample 1)을 가리키고, "activated NK(2)"는 실시예 2(sample 2)를 가리킨다. 도 6을 통해 알 수 있듯이, 본 발명에 따른 실시예 1 및 2의 경우에는 세포수가 증가함에 따라 세포독성 활성이 현저하게 증가함을 알 수 있었다. 반면에 PBMC의 경우에는 농도 증가에 따른 세포독성 활성의 증가가 크게 나타나지 않았다.
아울러, 도 9에서 보듯이, 본 발명에 따른 실시예(Sample 1 내지 3)의 경우, 림프구의 세포증식률이 현저히 증가함을 알 수 있다. 또한, 도 10에서 보듯이, 본 발명에 따른 실시예(Sample 1 내지 3)의 경우, 림프구의 세포생존율(Viability)이 배양일이 증가하더라도 일정하게 유지됨을 알 수 있다.
지금까지 본 발명의 바람직한 실시예에 대해 설명하였으나, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위 내에서 변형된 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그러므로 여기서 설명한 본 발명의 실시예는 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 하고, 본 발명의 범위는 상술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (5)

  1. 사람의 혈액으로부터 대식세포를 포함한 림프구를 채취 및 분리하는 제1 단계;
    상기 분리된 상기 림프구를 배양액에 현탁시킨 세포현탁액에 대하여, IL-2, IL-12, CD16 항체, CD56 항체 및 혈장을 포함하는 그룹에서 선택된 적어도 2종을 포함하는 혼합물을 투입하고, 동시에 1,000kDa ~ 5,000kDa의 분자량을 갖는 폴리감마글루탐산을 투입하여 4시간 이상 및 6시간 이하로 배양하는 제2 단계;
    제2 단계 이후에 1차로 LPS를 투입한 후 24시간 이상 배양하는 제3 단계;
    제3 단계 이후에 2차로 LPS를 투입한 후 2~3일간 배양하는 제4 단계;
    제4 단계 이후에, 상기 폴리감마글루탐산 및 상기 LPS가 포함되지 않은 배양액 및 혈장을 투입하여 2~4일간 배양하는 제5 단계; 및
    상기 제5 단계를 마친 상기 배양액으로부터 세포를 원심 분리하여 수확하는 제6 단계;를 포함하고,
    상기 제2 단계에서 투입되는 상기 폴리감마글루탐산의 농도는 상기 세포현탁액에 대하여 25㎍/㎖ ~ 125㎍/㎖로 투입되고,
    상기 제3 단계에서 1차로 투입되는 상기 LPS의 제1차 투입량은 상기 제4 단계에서 투입되는 상기 LPS의 제2차 투입량보다 크고, 상기 제1차 투입량 및 상기 제2차 투입량의 합계는 상기 세포현탁액에 대하여 0.5㎍/㎖ ~ 10㎍/㎖의 농도가 되도록 투입되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 대량증식방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL-12 또는 IL-15는 상기 세포현탁액에 대하여 10ng/㎖ ~ 100ng/㎖의 농도로 투입되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 대량증식방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL-2는 상기 세포현탁액에 대하여 80ng/㎖ ~ 2,000ng/㎖의 농도로 투입되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 대량증식방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 CD16 항체 또는 CD56 항체는 상기 세포현탁액에 대하여 0.1ng/㎖ ~ 100ng/㎖의 농도로 투입되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 대량증식방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 혈장은 상기 세포현탁액 총 중량에 대하여 5중량% ~ 20중량%로 투입되는 것을 특징으로 하는, 자연살해세포의 대량증식방법.
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