CN110585427B

CN110585427B - 提高机体免疫力的组合物及在抗成人t细胞白血病或鼻咽癌中的应用

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Publication number: CN110585427B
Application number: CN201910842053.0A
Authority: CN
Inventors: 刘慧宁
Original assignee: Individual
Current assignee: Shanghai Hengsai Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-09-06
Filing date: 2019-09-06
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2039-09-06
Also published as: CN110585427A

Abstract

本发明提供了一种提高机体免疫力的组合物及在抗成人T细胞白血病或鼻咽癌中的应用，该组合物包含树突细胞疫苗和新型免疫检查点抑制剂NKG2A拮抗剂，并以此用来治疗成人T细胞白血病和鼻咽癌。组合物中树突细胞的来源首先从患者或动物提取树突状细胞，在体外培养诱导成熟时，将特异性癌抗原负载到从患者或动物提取的树突状细胞，让树突状细胞表面带有相应的抗原，与NKG2A拮抗剂一同回输至患者体内以刺激天然免疫和诱导NK细胞、T淋巴细胞产生获得性免疫反应，降低体内病毒数量，并激活细胞毒性T细胞杀伤癌细胞来治疗由成人T细胞白血病和鼻咽癌。

Description

提高机体免疫力的组合物及在抗成人T细胞白血病或鼻咽癌中的应用

技术领域

本发明涉及有生物免疫技术领域，具体涉及一种提高机体免疫力的组合物及在抗成人T细胞白血病中或鼻咽癌的应用。

背景技术

树突细胞(Dendritic cells,DC)由2011年诺贝尔医学及生理学奖获得者加拿大科学家RalphM.Steinman于1973年发现，因其成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。DC是目前所知的机体功能最强的专职抗原递呈细胞(Antigenpresenting cells,APC)，能高效地摄取、加工处理和呈递抗原，是目前发现的唯一能激活未致敏的初始型T细胞的APC；且未成熟的DC具有较强的迁移能力，能提呈抗原，成熟DC能有效激活初始T细胞，处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。其数量不足外周血单核细胞的1％，但其表面具有丰富的抗原递呈分子(如MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ)、共刺激因子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等)和粘附因子(ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、LFA-1、LFA-3)等。树突状细胞是一类重要的天然免疫细胞和专职性抗原提呈细胞，在激活机体免疫应答及维持自身免疫耐受过程中发挥着关键性的调控作用。

树突细胞可由骨髓多潜能造血干细胞(HSC)在不同情况下通过相应途径分化为得到，如髓样/常规样DC(myeloid/conventional dendritic cells，mDC/cDC)，高表达CD13、CD33、CD1c、CD2、IgE高亲和力受体(FcεR1)、SIRPα等，能分泌IL-12等多种细胞因子；浆细胞样DC(plasmacytoid dendritic cells，pDC)，表面表达CD123、BDCA-2(CD303)、BDCA-4(CD304)和HLA-DR等分子,但是不表达CD11c、CD14、CD3、CD20或CD56，可分泌大量I型干扰素等；同时pDC也可由淋巴祖细胞CLP(common lymphoidprogenitor)分化而来。

树突状细胞(DC)是最强的抗原呈递细胞，能有效地把抗原信息呈递给T细胞，诱导T细胞活化而导致一系列免疫应答。DC表面的MHC分子能与抗原结合，形成肽-MHC分子复合物，将抗原信号呈递给T细胞，部分树突细胞高表达的共刺激分子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等)提供T细胞活化所必须的第二信号，同时DC也能直接向CD8⁺T细胞呈递抗原肽，在CD4⁺T细胞辅助下使CD8⁺T细胞活化，活化的DC可以大量分泌IL-12、IL-18、趋化因子(ChemotacticCytokines，CCK)等激活T细胞增殖，以及启动MHC-I类限制性CTL反应和MHC-Ⅱ类限制性的CD4⁺Th1免疫应答；此外，还可激活穿孔素P颗粒酶B和FasL/Fas介导的途径增强NK细胞毒作用来增强机体抗肿瘤免疫应答，利于肿瘤清除。DC本身能作为一种天然的免疫佐剂通过分泌各种细胞因子来提高机体免疫能力，也可增强各种疫苗和疫苗佐剂(如寡核苷酸等)的免疫反应，通常我们将带有相关抗原信息的具有疫苗功能的树突细胞，称为树突细胞疫苗(DC疫苗)。

正常免疫系统会利用免疫检查点(Checkpoint)来调节免疫反应及保持系统平衡，免疫系统的免疫细胞如APC树突状细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK cell)、CD4以及CD8等T淋巴细胞，可以区分正常组织、癌组织、感染的细菌病毒以及外源组织。正常情况下体内细胞会表达相应的免疫检查点(Checkpoint)配体使其自身被免疫系统忽视，防止错误攻击自身细胞，而不健康的或者异常的细胞被免疫细胞识别和消灭。然而，很多癌细胞也衍生出了能够让它们逃避免疫系统的检查点分子。例如T淋巴细胞的表面存在CTLA-4、PD-1等蛋白分子，有些癌细胞会表达PD-L1，与T淋巴细胞的PD-1结合抑制T淋巴细胞的功能，阻止T细胞杀伤癌细胞。近年开发的以单克隆抗体制成的免疫检查点抑制剂(immune checkpointinhibitors)能有效解除癌细胞对T淋巴细胞的抑制，阻止癌细胞的免疫逃逸，杀伤癌细胞。

NKG2A属于C型凝集素超家族(C-type lectin super family,CL-SF)是一类表达于细胞表面的受体，在胞外具有识别碳水化合物的结构域CRD(Carbohydrate-recognitiondomain,通常由115-130个氨基酸组成，含2-3个二硫键，有2-3个N连接的糖基化位点，其配体识别的过程往往是Ca²⁺依赖性的)，表达在CD56hi NK细胞和CD8⁺αβT细胞亚群中；相对分子质量为43000，由233个氨基酸组成，其胞外区有135个氨基酸。CD94又称Kp43，属于C型凝集素超家族，表达于绝大多数的NK细胞、γδT细胞和αβT细胞亚群的表面，相对分子质量为30000，为II型跨膜分子，与NKG2A结构类似，均含有CRD，两者可形成二聚体。非经典MHC-I类分子HLA-E(表达于人体大多数组织中，HLA-E可结合来自经典MHC-I类分子HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-G的信号肽，可形成蛋白间稳定的构象)是CD94/NKG2A的主要配体，能抑制TCRγ/δ-CD3介导的溶细胞活性，在抑制性信号传导过程中起关键的作用。

CD94/NKG2A是一类特异性表达于NK细胞和部分T细胞亚群表面的抑制性受体，NKG2A/CD94受体具有广泛的配体识别特异性，能够与HLA-E结合，进而更广泛的间接介导特异地识别HLA-Bw6、HLA-C及HLA-A的等位基因的产物，NKG2A/CD94与HLA-E结合会导致细胞质免疫受体酪氨酸磷酸化，转导抑制性信号进入胞内，对NK细胞和T细胞的杀伤作用起到负性调节作用，抑制T细胞和NK细胞的功能。与其它免疫检查点受体-配体(如PD-1/PD-L1)类似，CD94-NKG2A/HLA-E这对免疫检查点也被癌细胞利用来逃避免疫系统的攻击。有研究人员发现新型NKG2A抗体可促进机体抗肿瘤能力：通过阻断或抑制NKG2A(如使用NKG2A抗体)可以促进小鼠NK细胞和T细胞的效应，从而增强肿瘤免疫力。

当细胞HLA-E表达缺失时，NKG2A/CD94受体的抑制作用不能有效发挥，NK细胞表现杀伤能力，NK细胞不攻击自身正常的细胞，但可杀伤同种异体或者HLA-E表达缺陷的某些肿瘤细胞或受病毒、细菌感染的其他细胞。有研究显示，高浓度的NKG2A/CD94阳性肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)与卵巢癌或结直肠癌患者的预后有关，肿瘤细胞会异常表达HLA-E，因此，导致了NKG2A介导的癌症疫苗耐药性。

自然杀伤(natural killer cell，NK)细胞是一类细胞毒性淋巴细胞，作用于靶细胞后杀伤作用见效快(体内4小时)，由于NK细胞的杀伤活性无MHC限制，不依赖抗体，因此称为自然杀伤活性。NK细胞的靶细胞主要有肿瘤细胞、病毒感染细胞、某些自身组织细胞、寄生虫等，与机体抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节、超敏反应和自身免疫性疾病的发生发展有关，能够识别靶细胞、分泌杀伤介质(如穿孔素、NK细胞毒因子和TNF等)，是免疫系统重要成员。

成人T细胞白血病(adult T-cell leukemia，ATL)是一种与人T细胞白血病病毒Ⅰ(HTLV-Ⅰ)感染直接相关、发生于成人的特殊类型淋巴系统恶性克隆增殖性疾病，临床潜伏期较长，可以长达数十年以上，一般是童年时期感染，成人发病。其病变主要发生在外周血淋巴细胞，亦可侵及骨髓。其临床特征为肝、脾、淋巴结肿大、皮肤浸润、间质性肺浸润及高钙血症。我国东南沿海地区发病率高于北方，且国内目前尚无较好的治疗手段，急性ATL患者的平均存活期较短。

成人T细胞白血病病毒I型(Human Tcell leukemia virus type 1，HTLV-1)，是人类发现的第一个逆转录病毒，属于δ逆转录病毒属。在HTLV-1携带者中，约5％以上的感染人群由于病毒的长期持续作用而发展成为严重致命性的CD4⁺T淋巴细胞增殖性疾病、成人T细胞白血病(Adult T-cell leukemia，ATL)、神经性疾病、炎症性疾病、与HTLV-1相关的脊髄病(HAM)或热带痉挛性下肢轻瘫(TSP)等疾病中的一种或多种。HTLV-1病毒能侵染T淋巴细胞，其Tax蛋白在诱发成人T淋巴细胞白血病(ATL)过程中起着关键作用。

鼻咽癌是一种起源于鼻咽部黏膜上皮的恶性肿瘤。中国鼻咽癌的发病率却居世界之冠，据世界卫生组织的调查数据，世界上80％的鼻咽癌发生在中国，且南方发病率高于北方，广东及东南沿海是鼻咽癌发病率最高地区，占全国的百分之六十。目前临床上普遍认为鼻咽癌的发病与EB病毒相关。而EB病毒(Epstein-Barr virus,简称EBV)，是疱疹病毒家族(herpesvirusfamily)的一员，又被称为人类疱疹病毒第四型Human herpesvirus 4(HHV-4)，是一种嗜B淋巴细胞的双链DNA病毒。EBV是感染人类最普遍的病毒之一，90％以上的成人都可能携带，是最常见的引起人类疾病的病毒之一。EBV感染可引起鼻咽癌、传染性单核细胞增多症(IM)、非洲高发的伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤等多种肿瘤。

现有技术的缺陷与不足：

1、目前树突细胞疫苗多采用肿瘤细胞裂解物负载树突状细胞，或肿瘤细胞与树突状细胞融合的技术来制备。由于受到病毒感染并癌化的细胞表面会在病毒的基因组影响下表达能使其不被免疫系统识别的免疫检查点分子，大多数树突细胞疫苗引起的免疫反应无法成功识别接触病毒感染的癌细胞，无法有效地对肿瘤造成杀伤，治疗效果有限。

2、目前大部分树突细胞疫苗的靶向抗原除了在癌细胞上有表达，在少数正常细胞上也有表达，免疫系统有一定几率攻击正常细胞，引起其他不良副反应。

3、现有的树突细胞疫苗，由于需要树突细胞提呈肿瘤表面抗原或外源性病毒抗原给免疫系统，逐步启动免疫，见效慢，治疗过程相较于CAR-T等其他免疫治疗更为漫长。

4、在体内由于很多肿瘤细胞可以分泌多种抑制树突状细胞成熟的细胞因子，使存在于肿瘤部位的树突状细胞数量相对较少，以及下调树突细胞表面MHC分子的表达影响其功能，导致树突状细胞诱导的抗病毒感染性肿瘤的免疫反应无法在宿主体内起到非常显著的治疗效果，大部分只能达到部分缓解。

发明内容

为了解决现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提供一种提高机体免疫力的组合物及在抗成人T细胞白血病或鼻咽癌中的应用。

为实现上述目的，本发明一方面提供了一种提高机体免疫力的组合物，即是针对成人T细胞白血病和鼻咽癌治疗的一种树突细胞疫苗、NKG2A拮抗剂和细胞因子IL-2、IL-12、Poly(I:C)和TNF-α的组合物，即是树突细胞疫苗与新型免疫检查点抑制剂NKG2A拮抗剂及细胞因子按照特定比例形成的组合物来治疗病毒感染性肿瘤。提取患者或动物体内树突状细胞，在体外培养诱导成熟后，将特异性病毒抗原负载到提取的树突状细胞，让树突状细胞表面带有相应的病毒抗原，同时与NKG2A拮抗剂、细胞因子IL-2、IL-12、Poly(I:C)和TNF-α等形成组合物，回输至患者体内以刺激天然免疫和诱导NK细胞、T淋巴细胞产生获得性免疫反应，产生细胞毒性T细胞杀伤癌细胞，降低机体内的病毒数量；从而达到治疗病毒感染性肿瘤的目的。

大多数癌症患者的树突细胞功能发挥是受到障碍的，且时常会出现机体内树突细胞数量减少的现象。在大多数肿瘤的进程中，如果能产生大量树突细胞，且可以正常发挥抗原提呈和免疫佐剂的作用，可以充分启动机体的免疫反应，诱导产生大量NK细胞，活化CTL细胞、发挥补体依赖性细胞毒性(CDC)以及调节T细胞功能作用来杀伤肿瘤细胞。本发明提供了一种用于增强机体免疫应答的方法，能有效治疗肿瘤癌症，具有良好疗效，且副作用小，能长期高效抑制肿瘤细胞的增殖生长或缓解感染性疾病的进程，甚至达到完全缓解状态。

本发明包括提供NKG2A拮抗剂，与负载有肿瘤特异抗原的树突细胞疫苗以及细胞因子联合形成一种增强机体抗成人T细胞白血病的免疫能力的组合物。

在一些方面，根据实施方案的治疗受试者是哺乳动物受试者。受试者是灵长类，如人、猴；或非人哺乳动物，如小鼠、兔狗、猫、马、牛、山羊、猪或其他动物。

在一些实施方案的抗原致敏的树突细胞群属免疫原性组合物，所述树突细胞群已被相应抗原负载。具体的抗原包含多肽抗原，或编码抗原的核酸(DNA或RNA)以及蛋白质，肿瘤细胞表面特异性抗原。

本发明的另一方面提供了一种上述提高机体免疫力的组合物在抗成人T细胞白血病或鼻咽癌中的应用。载有肿瘤特异抗原的树突细胞疫苗，在一些特定实施例中是只负载相关第一抗原的树突细胞疫苗，在另一些特定实施例中是同时负载相关第二抗原，甚至多抗原的树突细胞疫苗，在有些特定实施例中将负载第一特异性抗原的树突细胞疫苗，与负载有第二抗原的树突细胞、负载有第三抗原或更多抗原的树突细胞同时应用。

在某些方面，树突细胞疫苗可以包含第一佐剂(Ploy(I:C)等)或其他辅助治疗的细胞因子如IL-2、TNF-α、IL-12等。

其中所述的NKG2A拮抗剂包括NKG2A抗体以及其他小分子拮抗剂。NKG2A抗体在一些特定实施例中是重组单克隆抗体(人抗体、人源化抗体或去免疫化抗体)，在一些特定实施例中是多克隆抗体；拮抗剂包含是抑制性核酸RNA(如小干扰性RNA(siRNA)，短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)、以及其他化学合成小分子抑制剂(如寡核苷酸等)。

其中NKG2A抗体是单克隆抗体或多克隆抗体，NKG2A结合抗体在一些特定实施例中是IgA、IgG(例如：IgG1，IgG2，IgG3或IgG4)、遗传修饰的IgG同型或其抗原结合片段；在一些特定实施例中是Fab'、F(ab')2、F(ab')3、一价scFv、二价scFv、双特异性、纳米抗体或单结构域抗体；在另一些特定实施例中是人、人源化或去免疫化抗体。

在实施方案中，组合物被给予三次，每次间隔一周或两周；树突细胞细胞每次回输细胞量在5*10⁶-5*10⁸个间，NKG2A拮抗剂(优选NKG2A抗体monalizumab)每次注射量在10ug/kg—10mg/kg(优选10ug/kg-1mg/kg)。

在一些方面涉及对受试者施用树突细胞疫苗和NKG2A拮抗剂组合物的的回输方式包含经静脉内、皮内、肿瘤内、肌肉内、腹膜内、皮下或局部注射。

本发明具有如下优点和有益效果：

抗原负载树突细胞疫苗、NKG2A拮抗剂与细胞因子的组合物联合应用治疗病毒感染性肿瘤与传统的树突细胞疫苗相比较，有以下优点：

1、特异性靶向癌细胞。选取的病毒或肿瘤细胞表面抗原经过文献数据对比、高效液相色谱、基因测序等综合分析，是特异性表达于病毒侵染的癌细胞表面，其被树突状细胞识别后，体内免疫系统只针对病毒侵染的癌细胞，安全性及有效性得到了明显提高。

2、将抗原负载树突细胞疫苗与新型免疫抑制检查点NKG2A拮抗剂及辅助细胞因子形成组合物联合应用，与单独用抗原负载树突细胞疫苗或新型免疫抑制检查点NKG2A拮抗剂相比，能有效增强机体免疫效应能力，提高免疫反应持续作用时间。

3、相较于目前常用的树突细胞疫苗，首先本发明中树突细胞疫苗有特定靶向病毒的抗原，能呈递表面表达有病毒抗原的癌细胞给T淋巴细胞，可以更为精确的治疗病毒感染性肿瘤，特别是成人T细胞白血病和EBV感染性鼻咽癌，降低对正常细胞的杀伤副作用；本发明组合物中含有新型免疫检查点抑制剂NKG2A拮抗剂，使表面存在CD94/NKG2A-HLA-E受体-配体的肿瘤细胞或受感染的细胞能被NK细胞、T细胞识别杀伤，增强淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，且有助于树突细胞的抗原提呈功能，使部分未被树突细胞疫苗提呈抗原的细胞重新被免疫系统捕获，增加了体内免疫细胞间以及免疫细胞与肿瘤细胞间的接触几率与范围，增强了对疾病的治疗效果，见效比现有的树突细胞疫苗更快，持续时间更长，提高了机体免疫能力。

附图说明

图1.BMDC表面CD80/CD86/MHC-I/MHC-II表达百分比；

图2.各组大鼠血清中IL-12p70的表达量；

图3.抗原特异性CD8⁺T细胞体外增殖能力检测图；

图4.体外各组大鼠脾淋巴细胞IFN-γ表达量；

图5.腺T细胞中HTLV-I病毒载量(PVL)；

图6.成熟树突细胞表面标志分子百分比；

图7.体外刺激诱导的CTL特异性淋巴细胞杀伤活性百分比；

图8.小鼠鼻咽癌皮下肿瘤大小数据图；

图9.各组小鼠外周血淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性图；

图10.干扰素γ的分泌量。

具体实施方式

通过以下详细说明可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实施例一：树突细胞疫苗与NKG2A拮抗剂的组合物联合治疗HTLV-I型大鼠T细胞淋巴瘤

一.大鼠骨髓来源树突细胞细胞的分离制备

1.4周龄F344/N JCL-Rnu/+雌性大鼠处死后立即浸泡在体积分数为75％的酒精中，5min后，在无菌环境下取出大鼠股骨和胫骨，放置于RPMI-1640培养基中，在无菌纱布垫上去除肌肉组织，将干净的骨头置于新的含70％乙醇平皿浸泡2min，最后用RPMI-1640培养基洗涤2遍。

2.用剪刀剪去骨两端(骺)然后将其转移到另外的培养皿中，用注射器吸取2mLRPMI-1640培养基冲洗骨髓腔以获得骨髓，用1640冲洗至骨髓腔成白色。在另一培养皿里剪碎骨骺。将剁碎的骨骺以及骨髓混合在一起，用吸管打碎团块，将悬液通过200目筛网过滤，去除颗粒后收于50mL的离心管里。

3.加入5mL的氯化铵溶液裂解红细胞。室温静置3min后，300g离心10min，弃上清。

4.用RPMI-1640洗涤骨髓细胞2次，室温，300g离心10min。Trypan blue计数活细胞。用RPMI-1640完全培养基调整细胞数量至1×10⁷个细胞于100mm细胞培养皿。

5.加入重组大鼠(Rr)GM-CSF(10ng/ml)和RrIL-4(5ng/ml)进行培养，含10％FBS和1％的青链霉素的RPMI-1640培养基。将细胞悬液约按2mL/孔接种六孔板。第6天，轻轻去除非贴壁细胞，在10ng/ml GM-CSF和5ng/ml IL-4存在下再培养5天,用LPS(1mg/ml)刺激BMDCs 24小时,使其成熟。

6.用Tax-Ag抗原致敏的部分BMDC：Tax-Ag与BMDC共培养，室温下孵育1h，2mlPBS洗涤两次，PBS重悬，细胞计数，调整密度为1x10⁶个细胞每毫升，形成负载抗原的树突细胞疫苗(Ag-DC疫苗)备用。并收集未致敏的成熟BMDC，调整细胞密度为1x10⁶个细胞每毫升。流式检测BMDC表面标志物CD80/CD86/MHC-I/MHC-II表达量，得图1.

流式细胞术实施方案：

1.使用离心管分别收集树突状细胞悬液，室温离心1000rpm，5分钟；

2.弃去上清液，加入10mL的PBS液使细胞重悬，随后离心1000rpm离心5分钟；

3.弃去上清液，重复上一步的操作过程；

4.向离心管内加入少量PBS液将细胞悬浮，进行细胞计数，调整密度为3x l0⁵个细胞每200μL,移入1.5mL EP管中；

5.选第1管细胞设为空白对照(不加入任何抗体)，之后的每管依次加入适量的抗大鼠APC-CD86抗体，FITC-CD80抗体，APC-MHC I抗体，FITC-MHC II抗体，其他管细胞中分别加入由APC、PE和FITC染料标记的同型对照抗体；

6.将以上各管细胞，4度避光孵育40分钟；

7.向各管内分别加入l mL含有2％FBS的PBS液，2000rpm离心3分钟，弃上清，尽量避光操作；

8.重复步骤(7)一次；

9.向各管内分别加入500μL浓度为1％的多聚甲醛溶液固定细胞；

10.使用流式细胞分析仪对以上各管细胞进行分析，共进行3次独立重复实验。

二.抗NKG2A抗体的选择及剂量

选用抗NKG2A抗体，NKG2A–blocking antibody(20D5)(Innate Pharma鼠源)，使用剂量在优选量10ug/kg，商品化购买的NKG2A拮抗剂包括NKG2A抗体、其抗原结合片段免疫黏合素、融合蛋白、寡肽和其他降低、阻断、抑制、或干扰NKG2A/CD94与HLA-E结合相互作用的分子，NKG2A抗体可以是NKG2A抗体20D5或者其他可阻止NKG2A–CD94与HLA-E结合的高效特异的相应蛋白。

三.HTLV-I型淋巴瘤大鼠模型建立

细胞系

1)HTLV-1感染的人类T细胞系MT-2，用含10％FBS(热灭活)、100IU/ml青霉素和100mg/ml链霉素的RPMI1640培养。

2)HTLV-1永生化的大鼠T细胞系FPM1:将产生HTLV-1的人T细胞系MT-2与F344/NJCL-R nu/+大鼠的胸腺细胞在10U/ml的IL-2存在下共培养，其中MT-2用丝裂霉素C(50mg/ml)在37℃下处理30min，构建出HTLV-1永生化细胞系FPM1。细胞用含有10％FBS(热灭活)和2-ME(1X10^-5mol/L)的RPMI1640培养。2-3周后用于大鼠HTLV-1感染。

HTLV-I型淋巴瘤大鼠模型

取对数生长期FPM1细胞，除去培养液，用PBS清洗细胞两遍，于培养皿中加入0.25％蛋白酶消化1分钟，去除蛋白酶，加入无血清培养基3mL，吹打细胞，制成悬液，以1000rpm离心5分钟，除去上清液，另加入适量生理盐水，制备为肿瘤细胞悬浮液。

F344/N JCL-Rnu/+大鼠按照动物护理和使用委员会(Institutional AnimalCare and UseCommittee)的实验室动物护理和使用指南规程，用正常饮食饲养动物并且将动物养在SPF动物设施。对肿瘤细胞培养液经台盼兰染色计数，当活细胞比率大于90％、细胞浓度为2×10⁷个细胞/mL时，可按每只大鼠1mL通过喂养管直接注入6周龄或7周龄F344/NJCL-Rnu/+大鼠的食道。一到两周后，即可见大鼠精神不济，食欲下降，体重有下降趋势。

四.治疗与检测

1将HTLV-I型淋巴瘤大鼠，随机分为对照组(生理盐水)、正常成熟DC组(1×10⁶个细胞)，负载抗原的Ag-DC疫苗组(1×10⁶个细胞)，抗NKG2A抗体组(10μg/kg)，正常成熟DC组+抗NKG2A抗体组，负载抗原的Ag-DC疫苗组+抗NKG2A抗体组，共六组，每组10只。

2.各组都加入等量的细胞因子：IL-2含量为1000U/ml、IL-12含量为1500U/ml、Poly(I:C)含量为15mg/ml和TNF-α含量为1000U/ml，形成组合物采取液腹壁皮下注射的方式，在肿瘤接种后第3天、与第10天与第17天后分别进行免疫组合治疗。

3.ELISA检测大鼠IL-12p70的表达

治疗后第二周，取各组大鼠眼内眦血，用大鼠的IL-12p70ELISA检测试剂盒测定血淸中IL-12p70的含量。基本过程为：用50mM的碳酸盐包被缓冲液(pH 9.6)溶解抗原，使抗原浓度为15ug/ml，加100μl/孔到96孔板，4℃放置过夜。第二天弃去包被液后，用PBST洗涤3次，每孔加入150μL的1％BSA，37℃封闭1小时。PBST洗涤3次后，每孔加入100μL不同倍比稀释度的血清，并加入对照样品，37℃孵育2小时。PBST洗涤5次后，加入100μL稀释后的HRP标记的二抗，37℃孵育1小时。PBST洗涤5次后，显色剂显色20min后，酶标仪上读取A₄₀₅吸收值，得图2。

4.检测抗原特异性大鼠CD8⁺T细胞体外增殖能力

第四周处死大鼠，取大鼠脾脏，用尼龙毛柱富集大鼠脾脏T细胞作为应答细胞，将FPM1细胞(5x 10⁵个/ml，用丝裂霉素C(MMC；50mg/ml)在37℃下处理30min)作为刺激细胞，脾T细胞(1x 10⁶个/ml)与MMC处理的FPM1(5x 10⁵个/ml)在10U/ml Rh IL-2存在下共培养7d。然后用Tax-tetramer-PE、大鼠CD3-FITC和大鼠CD8-PerCP对细胞进行染色,检测第0天和第7天细胞表面分子表达，得图3。

5.检测脾淋巴细胞分泌IFN-γ的量

将上述得到的大鼠脾淋巴细胞的一部分作为效应细胞，FPM1细胞作为靶细胞，按照效靶比20：1混合于U型底96孔板中，在10U/ml rhIL-2存在下共培养72h后，使用干扰素γ酶联免疫试剂盒，按照说明书流程检测培养上清中IFNγ的含量，得图4。

6.胸腺T细胞中HTLV-I病毒载量(PVL)

使用实时荧光定量PCR检测HTLV-1感染大鼠脾脏T细胞中的HTLV-1PVL，得图5。按照SYBR Green PCR kit说明书严格操作；具体引物如下：HTLV-1PF，5-CGGATACCCAGTCTACGT GTT TGGAGA CTG T-3(正义)；HTLV-1PR，5-GAG CCGATAACG CGT CCATCGATG GGGTCC-3(反义)；内参正向引物，5-CCT GTATGC CTC TGG TCG TA-3；和内参反向引物，5-CCATCT CTT GCT CGAAGT CT-3。

结果：

如图1所示：将提取诱导而来的大鼠骨髓来源的细胞经过流式细胞术，检测其表面相关共刺激因子等表达量发现，分离诱导得到的细胞表面高表达成熟BMDC的表面标志物CD80，CD86，MHC-I，MHC-II，说明诱导得到的细胞为成熟的树突细胞。

如图2所示：治疗后第二周，取各组大鼠眼内眦血，用大鼠的IL-12p70ELISA检测试剂盒测定血淸中IL-12p70的含量，用抗原负载的树突细胞疫苗治疗的大鼠血清中IL-12p70的分泌量，显著高于对照组和未负载抗原的树突细胞组的大鼠，经抗NKG2A抗体治疗的大鼠，其IL-12p70的表达量也有所升高，最为显著的是，抗原负载的树突细胞疫苗与抗NKG2A抗体组合物实验组的大鼠具有极强的IL-12p70分泌能力，说明其体内免疫反应最为强烈，间接反应出联合治疗方案的强大抗肿瘤能力。

如图3所示：取大鼠脾脏T细胞与FPM1细胞共培养7d，用Tax-tetramer-PE、大鼠CD3-FITC和大鼠CD8-PerCP对细胞进行染色，检测第0天和第7天细胞表面分子表达。第0天，各组大鼠提取出的抗原特异性TaxCD8⁺T细胞数量较少，在体外，待与提供刺激信号的FPM1细胞共培养7天后，发现Ag-DC组与Ag-DC+NKG2A抗体组，抗原特异性TaxCD8⁺T细胞表现出明显的增殖能力，能形成大量特异性CTL细胞，分别占总CD3⁺CD8⁺T细胞的25.7％，46.1％；且Ag-DC+NKG2A抗体组的抗原特异性Tax CD8⁺T细胞增殖能力显著高于Ag-DC组，说明抗原负载的树突细胞疫苗与抗NKG2A抗体组合物能有效刺激HTLV-I型淋巴瘤大鼠产生T细胞杀伤肿瘤，且抗NKG2A抗体能通过某种方式促进树突细胞疫苗作用。

如图4所示：将大鼠脾淋巴细胞的一部分作为效应细胞，FPM1细胞作为靶细胞，在10U/mlrhIL-2存在下共培养72h后，使用干扰素γ酶联免疫试剂盒，检测发现，来源于未负载抗原的树突细胞疫苗的大鼠脾淋巴细胞能在靶细胞的刺激下，分泌一定量的IFN-γ用于杀伤肿瘤细胞，经过抗NKG2A抗体治疗的大鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的能力也显著增强，相比于单独治疗组和其他实验组，抗原负载的树突细胞疫苗与抗NKG2A抗体组合物实验组的大鼠其产生IFN-γ的能力最强，能在体外有效抑制杀伤肿瘤细胞，比单独治疗的效果要好一倍以上，说明抗原负载的树突细胞疫苗与抗NKG2A抗体联合治疗在大鼠体内有效提高了其免疫能力。

如图5所示：通过实时荧光定量PCR检测HTLV-1感染大鼠脾脏T细胞中的HTLV-1病毒载量PVL，发现F344/NJCL-Rnu/+大鼠在移植HTLV-I大鼠永生化细胞FPM1后，脾脏T淋巴细胞被HTLV-I病毒大量侵染，导致大鼠免疫力下降，经过各组方案治疗后，NKG2A抗体组和Ag-DC疫苗组合物实验组的大鼠其脾脏淋巴细胞中PVL有明显下降，且负载抗原的树突细胞疫苗治疗要比抗NKG2A抗体的清除病毒效果显著；另外抗原负载的树突细胞疫苗与抗NKG2A抗体组合物实验组的大鼠脾脏淋巴细胞中只能检测到很少的HTLV-I病毒表达，其清除病毒抗肿瘤的效果远远高于Ag-DC疫苗和NKG2A抗体的单独使用，说明本专利提供的组合物能有效治疗HTLV-I病毒引起的淋巴瘤。

实施例二：树突细胞疫苗与抗NKG2A抗体组合物联合治疗NOG小鼠鼻咽癌皮下移植瘤

本实施例中选用的人鼻咽癌细胞株CNE-2为低分化鼻咽癌细胞系，表达EBV-LMP蛋白，普遍认为其分化程度与EB病毒相关。

一.从人体静脉血中分离外周血单核细胞

本实施方式基于外周血中各细胞成分密度的差异性(外周血主要含有血小板、单个核细胞、粒细胞、红细胞等细胞：血小板密度为1.030～1.035kg/m³，单个核细胞密度为1.075～1.090kg/m³，粒细胞密度为1.092kg/m³，红细胞密度为1.093kg/m³)，在外周血样品中加入

Paque Plus(GE Healthcare)溶液(密度为1.075～1.089kg/m³)，进行密度梯度离心，使不同细胞成分分层，能快速从人体外周血中分离得到单核细胞。

1.从EBV阳性的正常人体静脉采集外周血20mL，用相应规格的离心管，使用移液管在两个新的离心管中分别加入4.5mL血液体积的

Paque Plus溶液。

2.使用移液管吸取混匀的样品并沿着离心管管壁缓慢地注入Ficoll溶液上层。室温，800g离心20min。

3.取出离心管，样品分为四层，从上到下依次为血浆、单核细胞、Ficoll溶液、红细胞与粒细胞。

4.小心吸取单核细胞转移至一个15离心管中，加入PBS/1％FBS溶液补齐至14mL，吸打混匀。室温，800g离心5min。

5.去上清，轻弹管底部使细胞松散，加入14mLPBS/1％FBS溶液重悬细胞吸打混，室温，700g离心5min。

6.去上清，轻弹管底部使细胞松散。加入14mL RPMI/10％FBS溶液重悬细胞吸打混，室温，400g离心5min。

7.去除上清，轻弹管底部使细胞松散。加入10mLRPMI/10％FBS溶液重悬细胞，吹打混匀。

8.吸取10μL细胞液至一个新的1.5mL离心管，加入40μL RPMI/10％FBS溶液稀释5倍；吸取20μL稀释细胞液，加入2μL Trypan Blue染色后加至血球计数板，在倒置显微镜下计数。

9.室温，700g离心5min，去除上清，加入适量PBS/％1FBS用于后续试验。

二.分离获取DC及T淋巴细胞

2.1基于抗原抗体的特异性结合特点，CD14⁺磁珠分选试剂盒可以特异性识别结合PBMC中的CD14⁺细胞，并通过生物素或葡聚糖间接与磁珠偶联，在高强度磁场作用下达到CD14⁺细胞分离目的。本实施例选用EasySep^TMCD14阳选试剂盒。

1.将PBMC细胞悬液转移至5mL流式管。

2.在流式管中加入适量selection cocktail溶液至终浓度为100μL/mL。充分吸打混匀，室温孵育10min。

3.准备磁珠，将RapidSphere^TM溶液涡旋30s使磁珠颗粒均匀分散。

4.在流式管中加入适量RapidSphere^TM溶液至终浓度为100μL/mL，充分吸打混匀，室温孵育3min。

5.在流式管中加入适量PBS/2％FBS with 1mM EDTA溶液至总体积为2.5mL，充分吸打混匀。

6.将流式管垂直插入EasySep^TM magnet，室温孵育3min。

7.倒置磁铁，收集流式管流出的细胞液至15mL离心管，保持磁铁倒置状态3s，不要摇晃或吸干管壁上的液体。

8.将磁铁正置，取出流式管。

9.重复步骤7-10两次。

10.在流式管中加入2mLRPMI/10％FBS重悬细胞，Trypan Blue细胞计数。

2.2CD14⁺单核细胞诱导产生成熟树突细胞实验方案

在体外，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granμLocyte-macrophage colony stimμLating factor,GM-CSF)能促进iDC的存活，诱导iDC大量增殖。白细胞介素4(Interleukin-4,IL-4)能抑制巨噬细胞的过度生长，降低细胞表面表达CD14分子的能力，诱导CD14+单核细胞向iDC分化。

1.在超净工作台内使用移液管吸取CD14⁺细胞液转移至六孔板中，每孔1x10⁵个细胞，在六孔板中继续加入1μL人重组GM-CSF(20ng/μL)和1μL人重组IL-4(10ng/μL)。

2.将六孔板置于超净工作台台面上，前后左右各轻轻晃动3次使细胞分散均匀。置于细胞培养箱中37℃，5％CO₂培养3天。

3.从培养箱取出六孔板，在超净工作台内向六孔板中继续加入2mLRPMI 1640/10％FBS、1μL人重组GM-CSF和1μL人重组IL-4。

4.将六孔板置于超净工作台台面上，前后左右各轻轻晃动3次使成分分散均匀。置于细胞培养箱中37℃，5％CO₂培养2天。

5.应用细胞因子GM-CSF和IL-4使血液中单核细胞分化成不成熟树突状细胞后，孵育至第9天时用TNF-α等细胞因子促进树突状细胞成熟；单核细胞分化为树突状细胞并不断趋向成熟，不再表达CD14抗原，HLA-DR抗原和CD80等表面分子表达水平增高，得图6：成熟树突细胞表面标志分子百分比。

2.3负载癌抗原或引起感染性疾病的第一抗原多肽

将成熟树突细胞与鼻咽癌抗原(如EBV-LMP2)多肽共培养2h，PBS洗涤两次，重悬，形成负载抗原的树突细胞疫苗(Ag-DC疫苗)。

2.4.T淋巴细胞制备

1.将分离得到的同一人PBMCs，置于37度5％CO₂培养箱2小时后，收集悬浮细胞，制备成1ml细胞悬液；

2.将细胞悬液加入37℃温育的尼龙毛柱，平放柱体，加入200μL预温的含10％FBS的RPMI 1640，用于封口，37℃静置孵育2h；

3.用10％FBS RPMI 1640清洗尼龙毛柱，流速大约为l ml/min，收集最初冼下的10ml细胞悬液，富含T细胞和NK细胞；

4.室温700g离心5min，收集底层细胞。计数并调整细胞浓度至1X l0⁷个/ml，置于含80IU/ml的IL-2的RPMI1640完全培养基中备用。

5.可采用MACS分离法，利用CD3⁺磁珠分离T淋巴细胞。细胞先与抗表面抗原的单抗孵育12min，10⁷个细胞用50μL抗CD3单抗，细胞经洗涤后与生物素标记的100μL羊抗鼠二抗孵育10min，洗涤后加入FITC标记的链霉亲和素25μL，反应8min，洗涤后加生物素标记的磁颗粒(加抗CD3单抗者加100μL磁颗粒)反应8min。上述每步反应后，均加入1ml的含1％牛血清白蛋白的PBS洗涤，2000r/min离心10min。使用磁化细胞分离器(MACS)作免疫磁性分离，得到T淋巴细胞。

3.抗NKG2A抗体的选择及剂量

选用抗NKG2A抗体---monalizumab，使用剂量在优选量20ug/kg，10ug/kg—10mg/kg(优选10ug/kg-1mg/kg)，商品化购买的NKG2A拮抗剂包括NKG2A抗体、其抗原结合片段免疫黏合素、融合蛋白、寡肽和其他降低、阻断、抑制、或干扰NKG2A/CD94与HLA-E结合相互作用的分子，NKG2A抗体可以是NKG2A抗体-monalizumab或者其他可阻止NKG2A–CD94与HLA-E结合的高效特异的相应蛋白。

4.体外刺激诱导CTL细胞的获得：

用RPMI完全培养基分别重悬负载有鼻咽癌抗原(EBV-LMP2)的Ag-DC细胞与正常成熟的DC细胞，分别调整密度到2x 10⁵个/ml；将分离得到的自体T淋巴细胞悬液，用RPMI完全培养基调整密度到1.6x 10⁶个/ml。设置以下实验组：

a.DC+T组：正常DC(2x 10⁵个)与T淋巴细胞(1.6x 10⁶个)共培养

b.Ag-DC+T组：负载抗原的Ag-DC(2x 10⁵个)与T淋巴细胞(1.6x 10⁶个)共培养

c.NKG2A+T组:抗NKG2A抗体(20ug，monalizumab)与T淋巴细胞(1.6x 10⁶个)共培养

d.DC+NKG2A+T组:正常成熟DC(2x 10⁵个)、抗NKG2A抗体(20ug，monalizumab)与T淋巴细胞(1.6x 10⁶个)共培养

e.Ag-DC+NKG2A+T组:负载抗原的Ag-DC(2x 10⁵个)与抗NKG2A抗体(20ug，monalizumab)组合物与T淋巴细胞(1.6x 10⁶个)共培养

以上实验组均加入同样的辅助细胞因子，IL-2含量为1000U/ml、IL-12含量为1500U/ml、Poly(I:C)含量为10mg/ml和TNF-α含量为1000U/ml等。在37℃、5％CO₂恒温恒湿培养箱中培养2周后，加入终浓度为30U/ml的IL-2，以及各组再加入2x 10⁵个的负载有鼻咽癌抗原(如EBV-LMP2)Ag-DC细胞、正常DC细胞或抗NKG2A抗体(20ug，monalizumab)进行二次刺激，继续培养一周，于第21天收集细胞，用于检测和后续小鼠移植瘤治疗。

5.检测收集的细胞对鼻咽癌细胞CNE2的杀伤活性：

将上述收集的部分细胞离心后用PRMI1640完全培养基悬浮，调细胞浓度，分三个不同效靶比实验组，三组分别每孔4x 10⁵、2x 10⁵、1x 10⁵加入96孔培养板作效应细胞；向每孔中加入2x 10⁴个鼻咽癌细胞CNE作为靶细胞，终体积为200ul。同时设置有无淋巴细胞对照组和无细胞的空白培养液对照组，均设5复孔。24h后吸去各孔中游离的效应细胞，PBS洗涤2次，每孔各加入含20μl CCK8试剂100μl，继续培养2h，酶标仪检测450nm处吸光度值(OD)，计算特异性淋巴细胞杀伤率(％)，得图7：体外刺激诱导的CTL特异性淋巴细胞杀伤率。

三.小鼠鼻咽癌移植瘤模型：

4.1取6-8周龄，18-22g体重的NOG小鼠若干只，按照动物护理和使用委员会的实验室动物护理和使用指南规程，用正常饮食饲养动物并且将动物养在SPF动物设施。

4.2人鼻咽癌细胞CNE-2培养于含10％FBS的RPMI 1640中，37℃、5％CO₂恒温恒湿培养，细胞贴壁生长，每2天胰蛋白酶消化传代，取对数生长期的细胞，对肿瘤细胞培养液经台盼兰染色计数，当活细胞比率大于90％、细胞浓度为1×10⁷个细胞/mL时，可按每只小鼠0.2mL细胞悬液接种于右侧腹壁皮下，构建鼻咽癌小鼠皮下移植瘤模型，约一到两周形成肿瘤。

四.组合免疫治疗策略及检测

1.挑选已经成瘤，并且肿瘤体积相近的皮下移植瘤的小鼠，随机分为对照组(生理盐水)、正常DC组(静脉注射a组收获的细胞，1×10⁷个)、负载抗原的Ag-DC疫苗组(静脉注射b组收获的细胞，1×10⁷个)，抗NKG2A抗体组(静脉注射c组收获的细胞，1×10⁷个)，正常DC+抗NKG2A抗体组(静脉注射d组收获的细胞，1×10⁷个)、负载抗原的Ag-DC疫苗+抗NKG2A抗体组合物实验组(静脉注射e组收获的细胞，1×10⁷个)，共六组，每组10只。

2.采取静脉注射的方式，在成瘤后第3天、第10天与第17天后分别进行免疫组合治疗，每日观察肿瘤生长情况,在此期间，每三天测量肿瘤大小并记录到第30天，测定肿瘤最长径和最短径，计算肿瘤体积＝1/2肿瘤长径×短径²。将六组小鼠活体测量的肿瘤大小数据制成曲线图，得图8。

3.NOG小鼠淋巴细胞的杀伤活性检测：抽取小鼠外周血，用淋巴细胞分离液常规分离获得淋巴细胞，按效靶比5:1，10:1和20:1与CNE-2细胞共培养，检测各组小鼠外周血淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤活性。细胞于37℃、5％CO₂中培养48h后，用MTT法于570nm处，测定各孔吸光度A值，制成曲线图，得图9。

5.检测干扰素γ的分泌：将上述得到的小鼠外周血淋巴细胞的一部分作为效应细胞，CNE-2癌细胞作为靶细胞，按照效靶比20：1混合于U型底96孔板中培养72h后，使用干扰素γ酶联免疫试剂盒，按照说明书流程检测培养上清中IFNγ的含量，得图10。

结果：

如图6所示：经流式细胞术检测，所得细胞的表面分子CD80/CD83/CD86/HLA-DR都呈现阳性高表达，且CD14的表达量仅为8.6％，呈阴性，说明培养的细胞为成熟的树突细胞。

如图7所示：在体外，T淋巴细胞与负载有LMP2抗原的DC细胞或正常DC细胞、抗NKG2A抗体共培养后，检测收集的细胞对鼻咽癌细胞CNE-2的杀伤活性发现，经过EBV特异性抗原刺激后的T细胞能成为高效杀伤肿瘤细胞的CTL细胞，且与抗NKG2A抗体一起刺激T细胞时，其杀伤能力显著增强，而正常成熟的树突细胞没有提呈相应EBV抗原给T细胞，其体外淋巴细胞杀伤活性不高，单独的抗NKG2A抗体与T细胞共培养时，能通过阻断T细胞表面NKG2A受体来加强T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果。

如图8所示：每隔三天，测量每组小鼠的平均肿瘤大小，直至免疫重建后的第30天，从图中可以看出，相比于对照组小鼠，实验组的小鼠肿瘤大小均有所减小，肿瘤生长受到显著抑制，且负载鼻咽癌LMP多肽抗原的树突细胞疫苗与抗NKG2A抗体组合物实验组的效果最为显著，小鼠鼻咽癌皮下移植瘤的大小不足对照组的一半，证明Ag-DC疫苗与NKG2A拮抗剂的组合物可以有效抑制鼻咽癌的发展。

如图9所示：取淋巴细胞与CNE-2鼻咽癌细胞按5:1，10:1和20:1效靶比共培养结果显示，随着效靶比的增高，淋巴细胞对鼻咽癌细胞的杀伤率不断提高；且相比于对照组，实验组的杀伤率都明显增强，负载鼻咽癌LMP多肽抗原的树突细胞疫苗与抗NKG2A抗体组合物实验组在不同效靶比的基础上，其杀伤率都高于两者单一处理的效果(p<0.01)。说明抗原负载的树突细胞疫苗与抗NKG2A抗体组合物能有效杀伤癌细胞。

如图10所示：取淋巴细胞与CNE-2鼻咽癌细胞按20:1效靶比共培养，检测干扰素γ的表达，发现负载鼻咽癌多肽抗原的树突细胞疫苗与抗NKG2A抗体组合物实验组，其干扰素γ的分泌量显著多余其他组，显著高于两者单一处理的效果(p<0.01)。说明抗原负载的树突细胞疫苗与抗NKG2A抗体联合治疗能促进淋巴细胞大量分泌干扰素γ，促进机体的抗肿瘤能力。

Claims

1.一种提高机体免疫力且具有抗成人T细胞白血病作用的组合物，其特征在于：所述组合物包含有负载肿瘤特异抗原的树突细胞疫苗、NKG2A拮抗剂；所述树突细胞疫苗储存在无动物源性培养基中，所述树突细胞疫苗中含有树突状细胞的数量为5*10⁶-5*10⁸个；所述树突细胞疫苗还包含IL-2含量为1000U/ml、IL-12含量为1500U/ml、Poly(I:C)含量为15mg/ml和TNF-α含量为1000U/ml；所述NKG2A拮抗剂为抗NKG2A抗体；

所述抗NKG2A抗体为人源化抗NKG2A抗体monalizumab或鼠源抗NKG2A抗体20D5，含量为10ug/ml—10mg/ml；所述肿瘤特异性抗原为Tax蛋白。

2.一种如权利要求1所述的组合物在制备抗成人T细胞白血病药物中的应用。