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WO2019168222A1 - 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 항암 활성화 림프구 배양방법 - Google Patents

말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 항암 활성화 림프구 배양방법 Download PDF

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Publication number
WO2019168222A1
WO2019168222A1 PCT/KR2018/002504 KR2018002504W WO2019168222A1 WO 2019168222 A1 WO2019168222 A1 WO 2019168222A1 KR 2018002504 W KR2018002504 W KR 2018002504W WO 2019168222 A1 WO2019168222 A1 WO 2019168222A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
culture
peripheral blood
monoclonal antibody
culture medium
Prior art date
Application number
PCT/KR2018/002504
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
강세찬
장선필
Original Assignee
주식회사 제넨셀
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 제넨셀 filed Critical 주식회사 제넨셀
Priority to PCT/KR2018/002504 priority Critical patent/WO2019168222A1/ko
Publication of WO2019168222A1 publication Critical patent/WO2019168222A1/ko

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/55—Lung
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
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    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
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    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0638—Cytotoxic T lymphocytes [CTL] or lymphokine activated killer cells [LAK]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2302—Interleukin-2 (IL-2)

Definitions

  • the present invention relates to a medium composition for culturing peripheral blood mononuclear cell-derived anti-cancer activated lymphocytes comprising a predetermined amount of interleukin-2 (IL-2), an anti-CD3 monoclonal antibody, an anti-CD16 monoclonal antibody, and a high blood normal hexane fraction, and an anticancer using the same. It relates to a method for culturing activated lymphocytes.
  • IL-2 interleukin-2
  • an anti-CD3 monoclonal antibody an anti-CD16 monoclonal antibody
  • a high blood normal hexane fraction a high blood normal hexane fraction
  • a surgical surgical treatment to remove a cancer-generating site As a means of treating cancer or a tumor, a surgical surgical treatment to remove a cancer-generating site, a chemotherapy to administer an anticancer agent, a radiation therapy to irradiate radiation to a cancer-generating site, and the like are common.
  • anti-cancer drugs are used to proliferate, select, or change the biological characteristics of cells in various ways by activating autologous, allogenic, or xenogenic cells in vitro and then activating anticancer activity to patients.
  • a fourth cancer treatment has been developed called immune cell therapy.
  • Representative anti-cancer immune cell therapies include self-activated lymphocyte therapy, such as lymphokine-activated killer (LAK) therapy or cytotoxic T lymphocyte (CTL) therapy.
  • LAK lymphokine-activated killer
  • CTL cytotoxic T lymphocyte
  • LAK therapy is a method of treating cancer of a patient by using the immunity of the patient's own lymphocytes proliferated and activated in vitro. Specifically, after (1) blood is collected from cancer patients, peripheral blood monocytes including lymphocytes are isolated, and (2) the isolated peripheral blood monocytes are separated from IL-2 (Interleukin-2) and anti-CD3 monoclonal antibodies. cultured in a medium containing (anti-CD3 monoclonal antibody) for 2 weeks to proliferate and activate lymphocytes, and (3) wash the cell suspension containing cultured lymphocytes to treat IL-2 and anti-CD3 antibodies. The medium is removed, the lymphocytes are suspended in an appropriate solution such as saline solution containing albumin, and prepared in the form of an injection.
  • IL-2 Interleukin-2
  • IL-2 Interleukin-2
  • anti-CD3 monoclonal antibody interleukin-2
  • the medium is removed, the lymphocytes are suspended in an appropriate solution such as saline solution containing albumin, and prepared
  • CTL therapy is a method of proliferating and activating cytotoxic T lymphocytes, and the treatment process is similar to that of LAK cell therapy.
  • various studies have been conducted to increase the specificity and effect of anticancer immune cell therapy.
  • Cinnabar bark is the bark or root bark of the mulberry tree ( Meliaazedarach L. var. Japonica Makino ), and is native to Korea, China, and Japan. It is known to have antiparasitic, insecticidal, antimalarial, contraceptive, and antibacterial effects, and is used for the treatment of formal medicine, worms, and malaria fever. It has been reported that ethanol extract of Rhizobarium inhibits iNOS and that beta-carboline alkaloids exhibit anti-inflammatory activity by inhibiting iNOS in Raw264.7 cell line. In addition, the present inventors have reported the anti-cancer activity effect of the extract of Gyunpi in Korean Patent No. 10-1609935 through animal experiments, Gyunpi normal hexane fraction shows little cytotoxicity, when co-administration with anticancer agent It has been reported to show the characteristic efficacy of anticancer synergistic effect and anticancer drug side effects.
  • the use of the bark normal hexane fraction itself as an anticancer agent is disclosed, but for the culture method in which the bark normal hexane fraction promotes the differentiation into NK cells, NKT cells, and T cells, which are immune cells that have anticancer activity, and proliferates them. It has not been disclosed at all.
  • Korean Patent No. 10-1039843 relates to a medium composition for culturing self-activated lymphocytes and a method for culturing self-activated lymphocytes using the same, which promotes differentiation of immune cells into NK cells, NKT cells, and T cells and lacks mass proliferation.
  • the anticancer effect of killing tumor cells to inhibit proliferation is not high.
  • Patent Document 1 Korean Registered Patent No. 10-1609935
  • Patent Document 2 Korean Registered Patent No. 10-1039843
  • the present inventors conducted a study to find a culture composition that is superior to a known medium for activating lymphocyte culture medium, as a result of the study, the high blood normal hexane fraction with little cytotoxicity and interleukin-2 (IL-2), anti
  • IL-2 interleukin-2
  • -CD3 monoclonal antibody and anti-CD16 monoclonal antibody are used as an additive for a predetermined amount of cell culture medium, it was found that the differentiation into NK cells, NKT cells and T cells, which are immune cells, can be greatly promoted and proliferated.
  • the present invention has been completed. Furthermore, it was confirmed that the immune cells proliferated by the method of the present invention significantly inhibited the cell proliferation of cancer cells, and the anticancer power was greatly enhanced in comparison with the existing LAK cells in animal tests (see Experimental Example).
  • an object of the present invention is to provide a medium composition for culturing natural killer cells (NK Cell), natural killer T cells (NKT Cell), and peripheral blood mononuclear cell-derived anti-cancer activated lymphocytes capable of effectively proliferating T cells.
  • Another object of the present invention is to provide a method for culturing peripheral blood monocyte-derived anti-cancer activated lymphocytes using the medium composition.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating cancer comprising peripheral blood mononuclear cell-derived anti-cancer activated lymphocytes cultured by the culture method.
  • the present invention is a medium composition for mass culturing anti-cancer activated lymphocytes comprising a cell culture medium and an additive added to the cell culture medium, wherein the additive is interleukin-2 (IL- 2), anti-CD3 monoclonal antibody, anti-CD16 monoclonal antibody, and provides a medium composition for culturing peripheral blood mononuclear cell derived anti-cancer activated lymphocytes, characterized in that it comprises a normal blood hexane fraction.
  • IL-2 interleukin-2
  • IL-2 interleukin-2
  • anti-CD3 monoclonal antibody anti-CD16 monoclonal antibody
  • the present invention comprises the steps of separating peripheral blood monocytes into peripheral blood; Putting the isolated peripheral blood mononuclear cells into the cell culture medium and culturing in the presence of interleukin-2 (IL-2), anti-CD16 monoclonal antibody, and the bark normal hexane fraction; A second culture step of obtaining cells from the culture medium in which the culture was completed in the first culture step, and culturing the obtained cells in the presence of interleukin-2 (IL-2), anti-CD3 monoclonal antibody, and pulmonary normal hexane fraction; And obtaining cells from the culture medium in the second culture step, and culturing the obtained cells in the presence of interleukin-2 (IL-2), anti-CD3 monoclonal antibody, anti-CD16 monoclonal antibody, and the bark normal hexane fraction. It provides a peripheral blood mononuclear cell-derived anti-cancer activated lymphocyte culture method comprising a third culture step.
  • IL-2 interleukin-2
  • IL-2 inter
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for treating cancer comprising peripheral blood mononuclear cell-derived anticancer activated lymphocytes cultured by the above method.
  • the culture composition provided by the present invention comprises a fraction of high-fidelity normal hexane, thereby significantly differentiating and proliferating into NK cells, NKT cells, and T cells, which are immune cells that have anticancer activity, compared to conventional lymphokine-activated killer (LAK) cells.
  • LAK lymphokine-activated killer
  • the media composition of the present invention can be used as an anticancer treatment by itself, it can greatly enhance the anticancer power while alleviating side effects by lowering the dose of the existing anticancer agent when used in combination in the clinic as a chemical anticancer agent.
  • Example 1 is a graph comparing the number of immune cells proliferated using a conventional culture method (Comparative Example 1) and a culture method using the activated lymphocyte culture medium composition according to the present invention (Example 1).
  • 2A-2C are diagrams illustrating the differentiation and phenotypic changes of lymphocytes using flow cytometry.
  • Figures 3a-3c is a result of measuring the viability of the cells using the 51 Cr release assay.
  • Figure 4 is a result confirming the cancer cell proliferation inhibitory effect using a lung cancer model animal.
  • the present invention relates to a medium composition for mass culturing anti-cancer activated lymphocytes comprising a cell culture medium and an additive added to the cell culture medium.
  • the additive is interleukin-2 (IL-2), anti -CD3 monoclonal antibody, anti-CD16 monoclonal antibody, and cinnabar normal hexane fraction.
  • the anti-cancer activated lymphocytes in the present invention mean natural killer cells (NK Cell), natural killer T cells (NKT Cell), and T cells.
  • the NK cells are large granular lymphocytes (LGL), a characteristic type of lymphocytes, and their antitumor activity occurs in necrosis, apoptosis, or both mechanisms. It is done by NK cells respond to cytokines such as IL-2, IL-12, Interferon, and the like, thereby raising cytotoxicity, secretory, and proliferative functions. Phenotypes of NK cells are CD16 (Fc ⁇ RIII) and CD56 in humans, and CD16 and CD56 do not have a T-cell receptor complex (TRC) on the cell surface and thus are used as markers for NK cells.
  • TRC T-cell receptor complex
  • T cells refer to cells having an T cell receptor (TCR) on the cell surface.
  • TCR forms a heterodimer with the CD3 antigen of the di- and ⁇ -chain dimers. Some of the T cells (around 5% of peripheral blood T cells) are dimers of ⁇ and ⁇ chains, not ⁇ .
  • TCR forms a complex with the CD3 antigen ( ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ , ⁇ or ⁇ ), which plays a role in delivering the signal into the cell when TCR recognizes the antigen.
  • NKT cells are a type of T cell whose function is being revealed relatively recently as an attendant of endogenous immunity. As the name suggests, it expresses T-cell receptors and NK cell-specific surface markers.
  • One surprising feature of NKT cells is the rapid release of several cytokines such as IL-4, IL-10, IL-13, IFN- ⁇ , TNF- ⁇ after activation. This feature suggests that NKT cells can have a significant effect on the adaptive immune response.
  • interleukin-2 is a glycoprotein (glycoprotein) having a molecular weight of 14 to 17 kDa that is produced when T cells recognize and activate an antigen, is secreted out of T cells, and then IL-2. It reacts with the T cells themselves, which promotes the growth of the corresponding T cells. IL-2 also acts on NK cells to promote growth, enhances NK cell killing capacity, and acts on B cells to promote their growth.
  • IL-2 is a glycoprotein (glycoprotein) having a molecular weight of 14 to 17 kDa that is produced when T cells recognize and activate an antigen, is secreted out of T cells, and then IL-2. It reacts with the T cells themselves, which promotes the growth of the corresponding T cells. IL-2 also acts on NK cells to promote growth, enhances NK cell killing capacity, and acts on B cells to promote their growth.
  • CD16 antigen When lymphocytes are cultured in the presence of anti-CD3 monoclonal antibody, anti-CD16 monoclonal antibody or antigen antibody complex, CD16 antigen is added to NK cells and signaling occurs. Transferrin receptors such as ⁇ chains, or tumor necrosis factor (TNF) or IFN- ⁇ can be produced.
  • TNF tumor necrosis factor
  • IL-2 anti-CD3 monoclonal antibody and anti-CD16 monoclonal antibody were used as a medium additive in culture.
  • IL-2 was used for proliferation of T cells and NK cells, and each monoantibody was used.
  • CD16 in immune cells in the present invention further comprises a high blood normal hexane fraction, NK cells, T cells and NKT cells to proliferate and activate significantly.
  • the bark normal hexane fraction greatly promotes differentiation and proliferation into NK cells, T cells and NKT cells.
  • the medium composition of the present invention is a cell culture medium that can be used in conventional cell culture, and interleukin-2 (IL-2) 100 ⁇ 200000 IU / ml as an additive; Anti-CD3 monoclonal antibody 10-100000 ng / ml; Anti-CD16 monoclonal antibody 10-100000 ng / ml; And 25-250 ⁇ g / ml of the bark normal hexane fraction.
  • IL-2 interleukin-2
  • the present invention provides a peripheral blood mononuclear cell-derived anti-cancer activated lymphocyte culture method using the culture composition.
  • separating peripheral blood monocytes with peripheral blood Putting the isolated peripheral blood mononuclear cells into the cell culture medium and culturing in the presence of interleukin-2 (IL-2), anti-CD16 monoclonal antibody, and the bark normal hexane fraction; A second culture step of obtaining cells from the culture medium in which the culture was completed in the first culture step, and culturing the obtained cells in the presence of interleukin-2 (IL-2), anti-CD3 monoclonal antibody, and pulmonary normal hexane fraction; And obtaining cells from the culture medium in the second culture step, and culturing the obtained cells in the presence of interleukin-2 (IL-2), anti-CD3 monoclonal antibody, anti-CD16 monoclonal antibody, and the bark normal hexane fraction.
  • IL-2 interleukin-2
  • IL-2 interleukin-2
  • peripheral blood mononuclear cells refer to monocytes (Mononuclear Cell) isolated from peripheral blood (Peripheral Blood) commonly used for anticancer immunotherapy.
  • Peripheral blood monocytes can be separated from blood by centrifugation using specific gravity, and the degree and composition of immune cells is confirmed by flow cytometry.
  • the peripheral blood monocytes may be obtained from a patient or cancer patient having a normal risk of cancer.
  • the peripheral blood mononuclear cells used in the present invention are not necessarily self-derived, and if the peripheral blood mononuclear cells derived from the same species can be used for the induction and proliferation of natural killer cells for anticancer immune treatment according to the present invention.
  • the peripheral blood mononuclear cells isolated in the cell culture medium are put and cultured in the presence of Interleukin-2 (IL-2), anti-CD16 monoclonal antibody, and the pulmonary blood normal hexane fraction.
  • IL-2 Interleukin-2
  • anti-CD16 monoclonal antibody anti-CD16 monoclonal antibody
  • the cell culture medium may further include a nutrient component or a pH adjuster for culturing peripheral blood mononuclear cells.
  • a medium containing such a component RPMI-1640, DMEM, serum-free medium, and the like may be used, and reagents commonly used in cell culture may be included. Examples of such reagents include serum (human or fetal), albumin, antibiotics and antifungal agents, L-glutamine, sodium pyruvate, transferrin, insulin and the like.
  • the culture medium containing the additive IL-2, anti-CD3 monoclonal antibody, anti-CD16 monoclonal antibody and the hexane fraction can be prepared by the following method.
  • the culture medium is prepared by adding IL-2, anti-CD3 monoclonal antibody, anti-CD16 monoclonal antibody, and bark hexane fraction to the cell culture medium, or a medium containing anti-CD3 monoclonal antibody, anti-CD16 monoclonal antibody. It can also be prepared by coating each antibody in a flask in advance, and adding the remaining culture component to the flask.
  • the cell culture medium during the first to the third culture step the concentration of IL-2 100 ⁇ 200000 IU / ml, anti-CD3 Concentrations of monoclonal antibodies of 10 to 100000 ng / ml and concentrations of anti-CD16 monoclonal antibodies of 10 to 100000 ng / ml, and bark normal hexane fractions can be used within the range of 25 to 250 ⁇ g / ml. The amount of these may be adjusted and used within the above range through each culture step, but is not necessarily limited.
  • interleukin-2 200-1000 IU / ml
  • anti-CD16 monoclonal antibody 1000-30000 ng / ml
  • the bark normal hexane fraction 30-75 ⁇ g / ml
  • the culture conditions of the first culture step are not particularly limited, and conditions used in normal cell culture can be used. In one embodiment, it is preferable to incubate at a temperature of 30 ⁇ 38 °C and a condition of CO 2 concentration of 5 to 10%. The culture period is 3 to 5 days in order to activate and proliferate peripheral blood monocytes, and to fully differentiate and proliferate into NK cells, NKT cells and the like, and may be longer. In addition, culture medium exchange can be appropriately carried out during the culture.
  • the culture is performed under conditions that selectively differentiate peripheral blood monocytes into cytotoxic T cells, and the peripheral blood monocytes, which have not been stimulated in the first culture step, are selectively differentiated and expanded into T cells.
  • NK cells and NKT cells differentiated, activated and proliferated in the first culture stage can be stimulated, directly or indirectly, by T cells activated in the second culture stage to significantly activate and proliferate NK cells and NKT cells. .
  • the second culture step in order to selectively differentiate peripheral blood monocytes into cytotoxic T cells, cells are obtained from the culture medium cultured in the first culture step, and the obtained cells are interleukin-2 (IL-2), Incubated in the presence of anti-CD3 monoclonal antibody, and a barley normal hexane fraction.
  • IL-2 interleukin-2
  • the cell culture medium during the first to third culture stages has a concentration of 100-20000 IU / ml of IL-2, a concentration of 10-100000 ng / ml of anti-CD3 monoclonal antibody, and an anti-CD16 monoclonal antibody.
  • concentration of 10 to 100000 ng / ml, the concentration of the bark normal hexane fraction can be used within the range of 25 ⁇ 250 ⁇ g / ml.
  • the second culture step uses 200-1000 IU / ml of interleukin-2 (IL-2), 1000-30000 ng / ml of anti-CD3 monoclonal antibody, and 30-75 [mu] g / ml of the bark normal hexane fraction.
  • IL-2 interleukin-2
  • IL-2 interleukin-2
  • anti-CD3 monoclonal antibody 10-75 [mu] g / ml of the bark normal hexane fraction.
  • the culture solution is exchanged at the start of the second culture step to perform the culture.
  • the culture conditions of the second culture step is not particularly limited, and may be cultured under the same conditions as specified in the first culture step, and the culture period is sufficient for the differentiation and proliferation of peripheral blood monocytes into cytotoxic T cells. It can be 3 to 5 days or more.
  • culture medium exchange can be appropriately carried out during the culture.
  • the third culture step is a step of additionally culturing the cells obtained in the culture medium of the second culture step in a culture medium containing IL-2, anti-CD16 monoclonal antibody, anti-CD3 monoclonal antibody and the bark hexane fraction.
  • the third culture step may further activate and proliferate the immune cells differentiated and expanded in the first and second culture steps.
  • cells are obtained from the culture medium in the second culture step, and the obtained cells are interleukin-2 (IL-2), anti-CD3 monoclonal antibody, anti-CD16 monoclonal antibody, and cinnabar rind. Incubate in the presence of normal hexane fractions.
  • IL-2 interleukin-2
  • anti-CD3 monoclonal antibody anti-CD3 monoclonal antibody
  • anti-CD16 monoclonal antibody anti-CD16 monoclonal antibody
  • cinnabar rind cinnabar rind
  • the cell culture medium undergoes a concentration of 100-20000 IU / ml of IL-2, a concentration of 10-100000 ng / ml of anti-CD3 monoclonal antibody, and an anti-CD16 monoclonal antibody during the first to third culture steps.
  • concentration of 10 to 100000 ng / ml, the concentration of the bark normal hexane fraction can be used within the range of 25 ⁇ 250 ⁇ g / ml.
  • interleukin-2 200 to 1000 IU / ml
  • anti-CD3 monoclonal antibody 1000 to 30000 ng / ml anti-CD16 monoclonal antibody 1000 to 30000 ng / ml
  • high blood normal Hexane fractions 30-75 ⁇ g / ml are used.
  • the culture medium is exchanged at the start of the third culture step to perform the culture.
  • the culture conditions of the third culture step is not particularly limited, can be cultured under the same conditions as specified in the first and second culture step, the culture period is 3 to 5 in order for the immune cells to fully differentiate and proliferate I can do it more than a day.
  • culture medium exchange can be appropriately carried out during the culture.
  • peripheral blood of 30 ml was collected, and peripheral blood mononuclear cells were separated from blood by centrifugation and selected as experimental groups (peripheral blood mononuclear cells).
  • the peripheral blood mononuclear cells thus separated were added to 50 ml of a medium containing IL-2 (Interleukin-2) 200 IU / ml and anti-CD3 monoclonal antibody 10000 ng / ml, and cultured for 2 weeks, thereby proliferating and activating lymphocyte cells.
  • IL-2 Interleukin-2
  • peripheral blood of 30 ml was collected, and peripheral blood mononuclear cells were separated from blood by centrifugation and selected as experimental groups (peripheral blood mononuclear cells).
  • peripheral blood monocytes were suspended in 50 ml of medium to which 200 IU / ml of IL-2 and 50 ⁇ g / ml of the bark normal hexane fraction obtained in Preparation Example 1 were added, and 10000 ng / ml of anti-CD16 monoclonal antibody.
  • a 75 cm 2 flask coated with a 37 ° C 5% CO 2 conditions were incubated for 5 days using a cell incubator (first culture step).
  • the cells were recovered from the flask at the end of the first culture step (Day 5), and the recovered cells were again added with 200 IU / mL of IL-2 and 50 ⁇ g / mL of the bark normal hexane fraction. Suspended in ml medium (primary culture medium), and then placed in a sterile gas permeable cell culture medium coated with anti-CD3 monoclonal antibody 10000 ng / ml for 4 days at 37 °C, 5% CO 2 conditions using a cell incubator The culture was carried out (second culture step).
  • the cells were recovered from the flask at the end of the second culture step (Day 9), and the recovered cells were again subjected to 200 IU / ml of IL-2, 10000 ng / ml anti-CD3 monoclonal antibody, 10000 ng / ml.
  • IL-2 10000 ng / ml anti-CD3 monoclonal antibody
  • 10000 ng / ml anti-CD3 monoclonal antibody
  • the cells were incubated at 37 ° C. and 5% CO 2 for 4 days using a cell culture medium. 3 culture steps).
  • Comparative Example 1 and Example 1 obtained through the above culture process were compared with the total lymphocyte cell numbers including NK cells, NKT cells, and T cells, and are shown in FIG. 1.
  • the number of cells before the culture was 2.0x10 6 ⁇ 1.3x10 7, but by the conventional LAK cell culture method (Comparative Example 1) was 2.3x10 9 ⁇ 3.70x10 9 or more, according to the present invention By culture method (Example 1), it was confirmed that the growth was 3.1x10 9 ⁇ 4.8x10 9 or more.
  • the lymphocytes prepared by the culturing method according to the present invention had an increase in cell number of about 35% or more compared with the lymphocytes prepared by the conventional LAK cell culture method.
  • the activated lymphocytes cultured in Comparative Example 1 and Example 1 were analyzed for surface antigen of each immune cell using flow cytometry, and the results are shown in FIG.
  • the H1 region shows T cells
  • the H2 region shows NKT cells
  • the H4 region shows NK cells
  • the H3 region shows the distribution of other immune cells.
  • the surface antigen distribution is most distributed in the H4 region before the cultivation, whereas the distribution of the H1 and H2 regions is obtained after the culturing by the culturing method (Example 1) according to the present invention. Was found to be increased.
  • the lymphocytes produced by the culture method according to the present invention is increased in differentiation and activity compared to the lymphocytes produced by the conventional LAK cell culture method.
  • the activated lymphocytes cultured in Comparative Examples 1 and 1 were confirmed the secretion level of IFN- ⁇ by ELISPOT assay, and CD69 expression, which is an active surface antigen of lymphocytes, was measured by flow cytometry. b) and (c).
  • the lymphocytes prepared by the culture method according to the present invention is IFN- ⁇ compared to lymphocytes prepared by the conventional LAK cell culture method (Comparative Example 1) Increased secretion and expression of CD69 was found to increase the activity was confirmed.
  • the immune cell-containing compositions prepared in Comparative Example 1 and Example 1 were placed in a 15 ml centrifuge tube, centrifuged (1400 rpm, 5 minutes), and the supernatant was removed to separate cells.
  • apoptosis effects on the human lung cancer cell line A549, the human liver cancer cell line HepG2, and the human cervical cancer cell line SiHa were confirmed using a 51 Cr release assay, and the results are shown in FIG. 3.
  • the cell death effect was calculated based on Equation 1 below.
  • % Apoptosis ((experimental release-spontaneous release) / (maximal release-spontaneous release)) ⁇ 100
  • Example 1 As shown in Figure 3, it was confirmed that the lymphocytes prepared by the culture method according to the present invention (Example 1) has a higher killing effect on cancer cells than lymphocytes prepared by the conventional LAK cell culture method (Comparative Example 1). .
  • the immune cell-containing compositions prepared in Comparative Example 1 and Example 1 were placed in a 15 ml centrifuge tube, centrifuged (1400 rpm, 5 minutes), and the supernatant was removed to separate cells.
  • the isolated immune cells were administered intravenously to BALB / c nude mice in which tumors were formed by administering A549, a non-small cell lung cancer line, to confirm the effect of inhibiting tumor growth.
  • Example 1 As shown in Figure 4, it was confirmed that the lymphocytes prepared by the culture method according to the present invention (Example 1) showed a higher tumor growth inhibitory effect than lymphocytes prepared by the conventional LAK cell culture method (Comparative Example 1).

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Abstract

본 발명은 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 항암 활성화 림프구 배양방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 고련피 노르말헥산 분획물과 인터루킨-2(IL-2), 항-CD3 단클론항체, 항-CD16 단클론항체를 배지 조성물에 포함하는 경우 말초혈액단핵구로부터 NK 세포, NKT 세포 및 T 세포(항암 활성화 림프구 해당)의 분화 촉진 및 대량 증식 효과를 확인하였다. 이에 본 발명은 고련피 노르말헥산 분획물 기반의 배지 조성물 및 이를 이용한 말초혈액단핵구의 배양방법에 관한 것이다. 또한 본 발명에 따른 방법으로 배양한 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구들은 암치료에 매우 유효한 약학 조성물로 사용할 수 있다. 나아가 본 발명의 배지 조성물은 그 자체로 항암치료에 이용될 수 있으며, 이를 화학적 항암제를 임상에서 병용 투여시 기존 항암제의 투여량을 낮추어 부작용을 완화시키면서 항암력을 크게 증진시킬 수 있다.

Description

말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 항암 활성화 림프구 배양방법
본 발명은 인터루킨-2(IL-2), 항-CD3 단클론항체, 항-CD16 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물을 소정량 포함하는 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 항암 활성화 림프구 배양방법에 관한 것이다.
암이나 종양의 치료 수단으로는, 암 발생부위를 절제하는 외과적 수술 치료법, 항암제를 투여하는 화학요법, 암 발생부위에 방사선을 조사하는 방사선 요법 등이 일반적이다.
하지만, 이러한 치료법에는 환자에게 있어서 다양한 부작용을 나타내는 단점이 있다. 이에 따라, 살아있는 자가(autologous), 동종(allogenic), 혹은 이종(xenogenic)의 세포를 체외에서 증식, 선별하거나 여러 가지 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시켜 항암력을 활성화한 후 환자에게 투여하는 항암면역세포치료법이라는 제4의 암치료법이 개발되었다.
대표적인 항암 면역세포치료법에는 LAK (lymphokine-activated killer) 요법이나 CTL (cytotoxic T lymphocyte) 요법 등의 자가 활성화 림프구 요법이 있다.
LAK 요법은 체외에서 증식 및 활성화된 환자 자신의 림프구가 갖는 면역력을 이용하여 환자의 암을 치료하는 방법이다. 구체적으로는, (1) 암환자로부터 혈액을 채취한 후, 림프구를 포함하는 말초혈액 단핵구를 분리하고, (2) 분리된 말초혈액 단핵구를 IL-2(Interleukin-2) 및 항-CD3 단클론 항체(anti-CD3 monoclonal antibody)를 포함하는 배지에서 2주간 배양하여, 림프구 세포를 증식하여 활성화시키고, (3) 배양된 림프구를 포함하는 세포 현탁액을 세정하여 IL-2와 항-CD3 항체가 처리된 배지를 제거하고, 림프구를 알부민 함유 수액용 생리 식염수 등의 적절한 용액에 현탁시켜 주사제 형태로 조제하고, (4) 이 활성화된 림프구가 포함된 주사제를 환자의 몸에 주입하여 환자를 치료하는 방법이다. 또한, CTL 요법이란, 세포 독성 T 림프구를 증식 활성화시켜 사용하는 방법이며, 치료과정은 LAK 세포 요법과 유사하다. 현재, 항암 면역세포치료제는 항암 작용의 특이성과 효과를 높이기 위해 다양한 연구가 이루어지고 있다.
고련피는 멀구슬나무 (MeliaazedarachL .var. japonicaMakino)의 수피 또는 근피로서 한국, 중국 및 일본이 원산지이다. 고련피는 구충 및 살충작용, 항말라리아작용, 피임작용, 항균작용이 있는 것으로 알려져 있으며, 정장약, 조충구제약 및 말라리아열 치료에 이용되고 있다. 또한 고련피 에탄올 추출물은 iNOS를 억제하며, beta-carboline alkaloid류는 Raw264.7 세포주에서 iNOS를 억제하여 항염증작용을 나타낸다고 보고되어 있다. 또한, 본 발명자는 한국 등록특허 제10-1609935호에서 고련피 추출물의 항암 활성 효과를 동물실험을 통해 보고한 바 있으며, 고련피 노르말헥산 분획물이 세포독성이 거의 나타나지 않으며, 항암제와의 병용투여 시 항암 상승효과 및 항암제 부작용 감소의 특징적인 효능을 나타내는 것을 보고한 바 있다.
이처럼, 고련피 노르말헥산 분획물 자체로 항암제로 이용하는 것은 개시되어 있으나, 고련피 노르말헥산 분획물이 항암 작용을 하는 면역세포인 NK 세포, NKT 세포 및 T 세포로의 분화를 촉진하고 대량 증식시키는 배양법에 대해서는 전혀 개시된 바가 없다.
한국 등록특허 제10-1039843호는 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물 및 이를 이용한 자기 활성화 림프구 배양방법에 관한 것으로, 면역세포인 NK 세포, NKT 세포 및 T 세포로의 분화를 촉진하고 대량 증식도 미흡할 뿐만 아니라, 실제 종양 세포를 사멸하여 증식을 억제하는 항암 효과가 높지 않다는 한계가 있다.
이에 보다 효율적으로 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양할 수 있는 배지 조성물과 이를 이용한 배양방법이 필요한 실정이다.
선행기술문헌
(특허문헌 1) 한국 등록특허 제10-1609935호
(특허문헌 2) 한국 등록특허 제10-1039843호
이에, 본 발명자들은 종래 알려진 자기활성화 림프구 배양용 배지 조성물 보다 효과가 우수한 배양 조성물을 찾고자 연구를 거듭한 결과, 세포독성이 거의 나타나지 않은 고련피 노르말헥산 분획물과 인터루킨-2(IL-2), 항-CD3 단클론항체, 항-CD16 단클론항체를 소정량 세포 배양용 배지의 첨가제로 사용하는 경우, 면역세포인 NK 세포, NKT 세포 및 T 세포로의 분화를 월등히 촉진하고 대량 증식시킬 수 있다는 것을 알게 되어 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 나아가, 본 발명의 방법으로 증식된 면역세포는 암세포의 세포증식을 유의하게 억제하며, 동물시험에서 기존의 LAK세포에 비하여 크게 항암력이 증진됨을 확인하였다(실험예 참조).
따라서, 본 발명은 자연살해세포(NK Cell), 자연살해 T세포(NKT Cell), 및 T세포를 효과적으로 증식시킬 수 있는 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양용 배지 조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 배지 조성물을 이용한 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 상기 배양방법으로 배양한 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구를 포함하는 암치료용 약학조성물을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 과제 해결을 위하여, 본 발명은 세포 배양용 배지와, 상기 세포 배양용 배지에 첨가되는 첨가제를 포함하는 항암 활성화 림프구를 대량 배양하기 위한 배지 조성물에 있어서, 상기 첨가제는 인터루킨-2(IL-2), 항-CD3 단클론항체, 항-CD16 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물을 포함하는 것을 특징으로 하는 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양용 배지 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 말초혈액으로 말초혈액단핵구를 분리하는 단계; 세포 배양용 배지에 분리된 말초혈액단핵구세포를 넣고 인터루킨-2(IL-2), 항-CD16 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물의 존재 하에 배양하는 제1배양단계; 상기 제1배양단계에서 배양완료된 배양액으로부터 세포를 획득하고, 획득한 세포를 인터루킨-2(IL-2), 항-CD3 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물 존재 하에 배양하는 제2배양단계; 및 상기 제2배양단계에서 배양완료된 배양액으로부터 세포를 획득하고, 획득한 세포를 인터루킨-2(IL-2), 항-CD3 단클론항체, 항-CD16 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물 존재 하에서 배양하는 제3배양단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 배양한 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구를 포함하는 암치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명이 제공하는 배양 조성물은 고련피 노르말헥산 분획물을 포함함으로써, 기존 LAK(lymphokine-activated killer) 세포에 비해 항암 작용을 하는 면역세포인 NK 세포, NKT 세포 및 T 세포로의 분화 및 증식이 월등히 촉진시킬 수 있다.이에 따라 암세포의 증식을 유의하게 억제 가능한 자연살해세포(NK Cell), 자연살해 T세포(NKT Cell), 및 T세포를 대량으로 획득할 수 있다.
나아가 본 발명의 배지 조성물은 그 자체로 항암치료에 이용될 수 있으며, 이를 화학적 항암제로서 임상에서 병용 투여 시 기존 항암제의 투여량을 낮추어 부작용을 완화시키면서 항암력을 크게 증진시킬 수 있다.
도 1은 종래의 배양방법(비교예 1)과 본 발명에 따른 활성화 림프구 배양용 배지 조성물을 이용한 배양방법(실시예 1)을 이용하여 증식한 면역세포수를 비교한 그래프이다.
도 2a-2c는 유세포 분석법(flow cytometry)를 이용하여 림프구의 분화 및 표현형 변화를 나타내는 그림이다.
도 3a-3c은 51Cr release assay법을 이용하여 세포의 생존 능력을 측정한 결과이다.
도 4는 폐암 모델 동물을 이용한 암세포 증식 억제 효과 확인한 결과이다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 세포 배양용 배지와, 상기 세포 배양용 배지에 첨가되는 첨가제를 포함하는 항암 활성화 림프구를 대량 배양하기 위한 배지 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 상기 첨가제는 인터루킨-2(IL-2), 항-CD3 단클론항체, 항-CD16 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물을 포함한다. 여기서, 본 발명에서의 항암 활성화 림프구라 함은 대표적으로 자연살해세포(NK Cell), 자연살해 T세포(NKT Cell), 및 T세포를 의미한다.
본 발명에 대한 구체적인 설명에 앞서, 먼저 각 면역세포의 특징과 함께 면액세포 증폭 및 활성화에 이용되는 각 첨가물들에 대해 설명한다.
상기 NK 세포는 림프구의 일종으로 특징적인 형태인 거대과립형 림프구(LGL, Large granular lymphocytes)로서, 그항종양 작용은 괴사(necrosis)나 세포예정사(apoptosis), 또는 이들 두 가지 작용기전이 동시에 발생하여 이루어진다. NK 세포는 IL-2, IL-12, 인터페론(Interferon) 등의 사이토카인(cytokine)에 반응하며 이에 의해 역가(cytotoxicity), 분비성(secretory), 증식성(proliferative) 기능이 상승한다. NK 세포의 표현형(phenotype)은 사람에 있어서 CD16(FcγRIII), CD56이며, CD16과 CD56은 세포표면에 TRC(T-cell receptor complex)가 없어 NK세포에 대한 마커(marker)로 활용된다.
T 세포는 세포 표면에 항원 수용체(T cell receptor; TCR)를 가지는 세포를 말한다. TCR은 α사슬과 β사슬의 이합체 CD3 항원과 이형 이합체를 형성하고 있다. T세포의 일부(말초혈 T세포의 5% 전후)는 αβ가 아닌, γ사슬과 δ사슬의 이합체로 되어있다. TCR은 CD3 항원 (γ, δ, ε, ζ, ζ또는η)과 복합체를 형성하고 있는데, CD3 항원은 TCR이 항원을 인식하면 그 신호를 세포 내에 전달하는 역할을 맡는다.
NKT 세포는 내재면역의 한 수행원으로서 비교적 근래에 그 기능들이 밝혀지고 있는 T 세포의 한 종류이다. 이름에서도 알 수 있듯이 T 세포의 수용체와 NK 세포 특이적인 세포표면마커(surface marker)를 발현하고 있다. NKT세포의 한가지 놀라운 특징은 활성 후 IL-4, IL-10, IL-13, IFN-γ, TNF-α등과 같은 여러 사이토카인을 매우 빠른 시간 안에 분비한다는 점이다. 이러한 특징은 NKT 세포가 적응면역반응에 커다란 영향을 끼칠 수 있음을 암시한다.
한편, 첨가제 중 하나인 인터루킨-2(IL-2)는 T 세포가 항원을 인식하여 활성화될 때 만들어지는 분자량 14 ~ 17 kDa의 당단백질(glycoprotein)로서, T 세포 밖으로 분비된 다음, IL-2를 생산한 T 세포 자신과 반응하여 해당 T 세포의 성장을 촉진하게 된다. IL-2는 또한 NK 세포에 작용하여 성장을 촉진하고 NK 세포의 살해능력을 강화하며, B 세포에 작용하여 그 성장을 촉진하기도 한다.
항-CD3 단일클론항체, 항-CD16 단일클론항체 또는 항원항체복합체의 존재하에 림프구를 배양하게 되면 NK 세포에 CD16 항원이 첨가되어 신호전달이 일어나는데, 이들의 자극에 의해서 NK 세포에 IL-2 수용체의 α 사슬 등 트랜스페린(transferrin) 수용체가 발현하거나, 또는 종양괴사인자(tumor necrosis factor; TNF)나 IFN-γ가 생산될 수 있게 된다.
따라서, 본 발명에서는 배양 시 IL-2, 항-CD3 단일클론항체 및 항-CD16 단일클론항체를 배지 첨가물로 사용하였으며, 첨가물 중에서 IL-2은 T 세포와 NK 세포의 증식에, 각 단일항체는 면역세포에 CD3, CD16을 발현시키는 항원의 역할을 수행하게 되는데, 본 발명에서는 고련피 노르말 헥산 분획물을 더 포함함으로써, NK 세포, T 세포 및 NKT 세포를 월등하게 증식 및 활성화시킨다.
구체적으로, 본 발명에서의 고련피 노르말헥산 분획물은 고련피를 C1~ 4알콜로 추출한 추출물을 노르말헥산으로 분획하여 얻은 분획물인 것을 사용하며, 이는 세포독성이 거의 나타나지 않기에 세포 생장에 영향을 미치지 않으며, 본 발명에서의 고련피 노르말헥산 분획물은 NK 세포, T 세포 및 NKT 세포로의 분화 및 증식을 월등히 촉진시킨다.
구체적으로, 본 발명의 배지 조성물은 통상적으로 세포 배양에 사용될 수 있는 세포 배양용 배지와, 첨가제로서 인터루킨-2(IL-2) 100 ~ 200000 IU/㎖; 항-CD3 단클론항체 10 ~ 100000 ng/㎖; 항-CD16 단클론항체 10 ~ 100000 ng/㎖; 및 고련피 노르말헥산 분획물 25 ~ 250 ㎍/ml을 포함하는 것이 바람직하다.
한편, 본 발명에서는 상기 배양 조성물을 이용한 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양방법을 제공한다.
구체적으로, 말초혈액으로 말초혈액단핵구를 분리하는 단계; 세포 배양용 배지에 분리된 말초혈액단핵구세포를 넣고 인터루킨-2(IL-2), 항-CD16 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물의 존재 하에 배양하는 제1배양단계; 상기 제1배양단계에서 배양완료된 배양액으로부터 세포를 획득하고, 획득한 세포를 인터루킨-2(IL-2), 항-CD3 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물 존재 하에 배양하는 제2배양단계; 및 상기 제2배양단계에서 배양완료된 배양액으로부터 세포를 획득하고, 획득한 세포를 인터루킨-2(IL-2), 항-CD3 단클론항체, 항-CD16 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물 존재 하에서 배양하는 제3배양단계를 제공한다. 이를 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.
(말초혈액단핵구의 분리)
본 발명에서, 말초혈액단핵구는 항암면역치료를 위하여 통상적으로 사용되는 말초혈액(Peripheral Blood)으로부터 분리된 단핵구(Mononuclear Cell)를 의미한다. 말초혈액단핵구는 비중을 이용한 원심분리를 통해 혈액에서 분리할 수 있으며, 유세포 분석법(flow cytometry)에 의해 면역세포의 분화도 및 구성을 확인한다. 또한 본 발명의 일 구현예로서, 상기 말초혈액단핵구는 정상인, 암의 위험성을 갖는 환자 또는 암 환자로부터 얻은 것일 수 있다. 또한 본 발명에서 사용되는 말초혈액단핵구는 반드시 자가 유래일 필요는 없으며, 동종 유래의 말초혈액단핵구라면 본 발명에 따른 항암면역치료를 위한 자연 살해세포의 유도 및 증식을 위해 사용할 수 있다.
(제1배양단계)
제1배양단계에서는 세포 배양용 배지(배양액)에 분리된 말초혈액단핵구세포를 넣고 인터루킨-2(IL-2), 항-CD16 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물의 존재 하에 배양한다.
이때 세포 배양용 배지에는 말초혈액단핵구를 배양 가능하게 하기 위한 영양성분이나, pH 조정제 등이 더 포함될 수도 있다. 이러한 성분을 포함하는 배지로서는 RPMI-1640, DMEM 및 무혈청 배지 등이 사용될 수 있으며, 세포 배양에 있어서 통상 사용되는 시약이 포함될 수도 있다. 이러한 시약으로서, 혈청(인간 또는 소 태아), 알부민, 항생제 및 항진균제, L-글루타민, 피루브산 나트륨, 트랜스페린 및 인슐린 등을 들 수 있다.
아울러, 첨가제인 IL-2, 항-CD3 단클론항체, 항-CD16 단클론항체 및 고련피 헥산 분획물을 포함하는 배양액은 아래와 같은 방법에 의해서 제조할 수 있다. 예를 들면, 배양액은 세포 배양용 배지에 IL-2, 항 CD3 단클론항체, 항 CD16 단클론항체 및 고련피 헥산 분획물을 첨가하여 제조하거나, 항-CD3 단클론항체, 항- CD16 단클론항체를 포함하는 배지는 플라스크에 각각의 항체를 미리 코팅해 두고, 그 플라스크에 나머지 배양액 성분을 첨가하는 것에 의해서 제조할 수도 있다.
아울러, 말초혈액단핵구로부터 NK 세포, NKT 세포 및 T 세포로의 분화 및 증식을 위해, 제1 내지 제3 배양단계를 거치는 동안 세포 배양액에는 IL-2의 농도 100 ~ 200000 IU/㎖, 항-CD3 단클론항체의 농도 10 ~ 100000 ng/㎖ 및 항-CD16 단클론 항체의 농도 10 ~ 100000 ng/㎖, 고련피 노르말헥산 분획물의 농도는 25 ~ 250 ㎍/㎖ 범위 내에서 사용할 수 있다. 이들의 사용량은 각 배양단계를 거치면서 상기 범위 내에서 조절하여 사용하면 되는 것으로, 반드시 제한되지 않는다.
바림직하게 제1배양단계에서는 인터루킨-2(IL-2) 200 ~ 1000 IU/㎖, 항-CD16 단클론항체　1000 ~ 30000 ng/㎖, 및 고련피 노르말헥산 분획물 30 ~ 75 ㎍/㎖를 사용한다.
아울러, 제1배양단계의 배양 조건은 특별하게 한정되지 않고, 통상의 세포배양에 있어서 사용하는 조건을 사용할 수 있다. 일 구현예로서, 30 ~ 38℃의 온도와 5 ~ 10%의 CO2농도의 조건에서 배양하는 것이 바람직하다. 배양기간은 말초혈액단핵구가 활성화 및 증식하고, NK 세포 및 NKT 세포 등으로 충분히 분화 및 증식하기 위해서 3 ~ 5일간 배양하며 경우에 따라서는 그 이상도 할 수 있다. 또한 배양 중 적절히 배양액 교환을 실시할 수도 있다.
(제2배양단계)
제2배양단계는 말초혈액단핵구를 선택적으로 세포독성 T 세포로 분화시키는 조건 하에서 배양이 이루어지는 것으로, 상기 제1배양단계에서 자극되지 않았던 말초혈액단핵구를 선택적으로 T 세포로 분화 및 증식시킨다. 제1배양단계에서 분화, 활성화 및 증식한 NK 세포 및 NKT 세포가 제2배양단계에서 활성화된 T 세포에 의해, 직접 또는 간접적으로 자극되어 NK 세포 및 NKT 세포를 유의적으로 활성 및 증식될 수 있다.
구체적으로, 제2배양단계에서는 말초혈액단핵구를 선택적으로 세포독성 T 세포로 분화시키기 위해, 제1배양단계에서 배양완료된 배양액으로부터 세포를 획득하고, 획득한 세포를 인터루킨-2(IL-2), 항-CD3 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물 존재 하에 배양한다.
아울러, 전술한 바와 같이 제1 내지 제3 배양단계를 거치는 동안 세포 배양액에는 IL-2의 농도 100 ~ 200000 IU/㎖, 항-CD3 단클론항체의 농도 10 ~ 100000 ng/㎖ 및 항-CD16 단클론 항체의 농도 10 ~ 100000 ng/㎖, 고련피 노르말헥산 분획물의 농도는 25 ~ 250 ㎍/㎖ 범위 내에서 사용될 수 있다.
바람직하게 제2배양단계에서는 인터루킨-2(IL-2) 200 ~ 1000 IU/㎖, 항-CD3 단클론항체 1000 ~ 30000 ng/㎖, 및 고련피 노르말헥산 분획물 30 ~ 75 ㎍/㎖를 사용한다.
아울러, 배양액은 제2배양단계의 시작 시 교환하여 배양을 실시하게 된다. 또한, 제2배양단계의 배양 조건은 특별하게 한정되지 않으며, 제1배양단계에서 명시한 조건과 동일한 조건에서 배양할 수 있으며, 배양기간은 말초혈액단핵구가 세포독성 T세포로 충분히 분화 및 증식하기 위해서 3 ~ 5일 이상으로 할 수 있다. 또한 배양 중 적절히 배양액 교환을 실시할 수도 있다.
(제3배양단계)
제3배양단계는 IL-2, 항-CD16 단클론항체, 항-CD3 단클론항체 및 고련피 헥산 분획물을 포함하는 배양액에서 제2배양단계의 배양액에서 획득한 세포를 추가적으로 배양하는 단계이다. 제3배양단계는 제1 및 제2 배양단계에서 분화 및 증식된 면역세포를 추가로 활성 및 증식시킬 수 있다.
구체적으로, 제3배양단계에서는 제2배양단계에서 배양완료된 배양액으로부터 세포를 획득하고, 획득한 세포를 인터루킨-2(IL-2), 항-CD3 단클론항체, 항-CD16 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물 존재 하에서 배양한다.
아울러, 전술한 바와 같이 제1 내지 제3 배양단계를 거치는 동안 세포 배양액에는 IL-2의 농도 100∼200000 IU/㎖, 항-CD3 단클론항체의 농도 10 ~ 100000 ng/㎖ 및 항-CD16 단클론 항체의 농도 10 ~ 100000 ng/㎖, 고련피 노르말헥산 분획물의 농도는 25 ~ 250 ㎍/㎖ 범위 내에서 사용될 수 있다.
바람직하게 제3배양단계에서는 인터루킨-2(IL-2) 200 ~ 1000 IU/㎖, 항-CD3 단클론항체 1000 ~ 30000 ng/㎖, 항-CD16 단클론항체 1000 ~ 30000 ng/㎖, 및 고련피 노르말헥산 분획물 30 ~ 75 ㎍/㎖를 사용한다.
아울러, 배양액은 제3배양단계의 시작 시 교환하여 배양을 실시하게 된다. 또한, 제3배양단계의 배양 조건은 특별하게 한정되지 않으며, 제1 및 제2배양단계에서 명시한 조건과 동일한 조건에서 배양할 수 있으며, 배양기간은 면역세포가 충분히 분화 및 증식하기 위해서 3 ~ 5일 이상으로 할 수 있다. 또한 배양 중 적절히 배양액 교환을 실시할 수도 있다.
이상에서 설명한 바와 같은 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 고련피 노르말헥산 분획물 제조
음건 세절된 고련피 1kg에 80% 에탄올 용액 10L를 넣고 70 ~ 80℃ 사이에서 8시간 동안 추출 및 여과한 후 감압농축기로 농축하여 500㎖이 될 때 까지 농축하고, 여기에 500㎖의 노르말헥산 용액을 넣고 분획로드에 옮겨서 분획 후 상등액을 취하여 감압농축기로 다시 농축하고 용매를 제거하였다. 용매를 제거하여 얻은 고련피 노르말헥산 분획물은 오일상으로 약 8g이 얻어졌다.
비교예 1. LAK 세포 배양법에 의한 면역세포의 증식(대조군)
먼저, 정상인의 말초 혈액 30㎖을 채취하고, 원심분리를 통해 혈액에서 말초혈액단핵구 분리하고 이를 실험군으로 선정하였다(말초혈액단핵구 분리). 이렇게 분리된 말초혈액 단핵구를 IL-2(Interleukin-2) 200 IU/㎖ 및 항-CD3 단클론 항체 10000 ng/㎖를 포함하는 배지 50㎖에 넣어 2주간 배양하여, 림프구 세포를 증식하여 활성화시켰다.
실시예 1. 본 발명의 배양법에 따른 면역세포의 증식 및 확인
먼저, 정상인의 말초 혈액 30㎖을 채취하고, 원심분리를 통해 혈액에서 말초혈액단핵구 분리하고 이를 실험군으로 선정하였다(말초혈액단핵구 분리).
상기 말초혈액단핵구를 200 IU/㎖의 IL-2와, 제조예 1에서 얻은 50 ㎍/㎖의 고련피 노르말헥산 분획물이 첨가된 50㎖의 배지에 현탁하고, 항-CD16 단클론 항체 10000 ng/㎖로 코팅된 75㎠ 플라스크 중에서 37℃, 5% CO2조건에서 세포배양기를 이용해 5일간 배양했다(제1배양단계).
다음으로, 제1배양단계가 끝나는 시점(Day 5)에서 세포를 플라스크로부터 회수하여, 회수한 세포를 다시 200 IU/㎖의 IL-2와 50 ㎍/㎖의 고련피 노르말헥산 분획물이 첨가된 50㎖의 배지(1차 배양 배지)에 현탁한 후, 항-CD3 단클론항체 10000 ng/㎖로 코팅된 멸균된 가스투과성 세포배양백에 넣어 37℃, 5% CO2조건에서 세포배양기를 이용해 4일간 배양했다(제2배양단계).
다음으로, 제2배양단계가 끝나는 시점(Day 9)에서 세포를 플라스크로부터 회수하여, 회수한 세포를 다시 200 IU/㎖의 IL-2, 10000 ng/㎖ 항-CD3 단클론항체, 10000 ng/㎖의 항-CD16 단클론항체 및 50 ㎍/㎖의 고련피 노르말헥산 분획물을 포함하는 배지가 들어있는 가스투과성 세포배양백에 넣어 37℃, 5% CO2조건에서 세포배양기를 이용해 4일간 배양했다(제3배양단계).
위와 같은 배양 과정을 거쳐서 얻은 비교예 1과 실시예 1에서의 세포에 대해서, NK 세포, NKT 세포 및 T 세포를 포함한 전체 림프구 세포수를 비교하여 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타난 바와 같이, 배양 전에는 세포수가 2.0x106 ~ 1.3x107개였으나, 종래의 LAK 세포 배양법에 의한 경우(비교예 1) 2.3x109개 ~ 3.70x109개 이상이 였으며, 본 발명에 따른 배양법(실시예 1)에 의해 3.1x109개 ~ 4.8x109개 이상으로 증식되었음을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 따른 배양법에 의해 제조된 림프구가 기존 LAK 세포 배양법에 의해 제조된 림프구에 비해 세포수가 약 35% 이상 증가되었음을 확인하였다.
실험예 1. 면역세포의 분화 및 활성 확인
비교예 1 및 실시예 1에서 배양된 활성화 림프구를 유세포 분석법(flow cytometry)를 이용하여 각 면역세포의 표면 항원을 분석하여, 그 결과를 도 2의 (a)에 나타냈다. 도 2의 (a)에서 H1 영역은 T 세포, H2 영역은 NKT 세포, H4 영역은 NK 세포, H3 영역은 기타 면역 세포의 분포를 나타내고 있다.
구체적으로, 도 2의 (a) 결과를 살펴보면, 배양 전에는 표면 항원 분포가 H4 영역에 가장 많이 분포되어 있는 반면, 본 발명에 따른 배양법(실시예 1)에 의한 배양 후에는 H1, H2 영역의 분포가 증가되는 것을 알 수 있었다.
실제 NK 세포, NKT 세포 및 T 세포의 비율을 계산한 결과, 기존 LAK 세포 배양법에 의한 경우 40.3%:4.6%:27.5%인데 반해, 본 발명에 따른 배양법에 의한 경우51.6%:7.7%:38.2%로 나타났으며, 이는 본 발명에 따른 배양법에 의해 제조된 림프구가 기존 LAK 세포 배양법에 의해 제조된 림프구에 비해 분화 및 활성이 증가된 것임을 알 수 있다.
또한, 비교예 1 및 실시예 1에서 배양된 활성화 림프구를 ELISPOT assay를 이용해 IFN-γ의 분비 정도를 확인하였고, 림프구 활성 표면 항원인 CD69발현을 유세포 분석법으로 측정하여, 그 결과를 도 2의 (b)와 (c)에 나타냈다.
도 2의 (b)와 (c)의 결과를 살펴보면, 본 발명에 따른 배양법에 의해 제조된 림프구(실시예 1)가 기존 LAK 세포 배양법에 의해 제조된 림프구(비교예 1)에 비해 IFN-γ의 분비 및 CD69의 발현이 증가된 것으로 나타나 활성이 증가된 것으로 확인할 수 있었다.
상기 결과로부터 본 발명에 따른 배양법에 의해 제조된 림프구 세포 내에서 NK 세포, NKT 세포 및 T 세포 비율이 대폭 상승됨을 확인하였으며, 이러한 최종 배양물의 조성 변화가 각종 암세포에 대한 사멸 능력 향상에 미치는 영향을 평가하기 위하여 아래의 분석을 수행하였다.
실험예 2 : 암세포에 대한 세포 사멸 효과 확인
비교예 1 및 실시예 1에서 제조된 면역세포 함유 조성물을, 15㎖ 원심관에 넣고, 원심분리(1400rpm, 5분)를 실시하고, 상층액을 제거하여 세포를 분리하였다. 분리된 세포를 이용하여, 인간 폐암 세포주인 A549, 인간 간암세포주인 HepG2 및 인간 자궁경암 세포주인 SiHa에 대한 세포사멸효과를 51Cr release assay법을 이용하여 확인하였고, 그 결과를 도 3에 나타냈다. 참고로, 세포사멸효과는 아래의 수학식 1에 의거해서 산출했다.
[수학식 1]
세포사멸율(%)=((experimental release - spontaneous release)/(maximal release- spontaneous release))×100
도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 배양법에 의해 제조된 림프구(실시예 1)가 기존 LAK 세포 배양법에 의해 제조된 림프구(비교예 1)에 비해 암세포에 대한 사멸효과가 높게 나타나는 것을 확인하였다.
실험예 3 : 폐암 모델 동물에서 암세포 증식 억제 효과 확인
비교예 1 및 실시예 1에서 제조된 면역세포 함유 조성물을 15㎖ 원심관에 넣고, 원심분리(1400rpm, 5분)를 실시하고, 상층액을 제거하여 세포를 분리하였다. 분리된 면역세포를 비소세포성 폐암주인 A549를 투여하여 종양을 형성시킨 BALB/c 누드 마우스에 정맥 투여하여 종양 증식 억제 효과를 확인하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 배양법에 의해 제조된 림프구(실시예 1)가 기존 LAK 세포 배양법에 의해 제조된 림프구(비교예 1)에 비해 종양 증식 억제 효과가 높게 나타나는 것을 확인하였다.

Claims (5)

  1. 세포 배양용 배지와, 상기 세포 배양용 배지에 첨가되는 첨가제를 포함하는 항암 활성화 림프구를 대량 배양하기 위한 배지 조성물에 있어서,
    상기 첨가제는 인터루킨-2(IL-2), 항-CD3 단클론항체, 항-CD16 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물을 포함하며,
    상기 세포 배양용 배지는
    인터루킨-2(IL-2) 100 ~ 200000 IU/㎖;
    항-CD3 단클론항체 10 ~　100000 ng/㎖;
    항-CD16 단클론항체 10 ~ 100000 ng/㎖; 및
    고련피 노르말헥산 분획물 25 ~ 250 ㎍/㎖;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양용 배지 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 고련피 노르말헥산 분획물은 고련피를 C1~ 4알콜로 추출한 추출물을 노르말헥산으로 분획하여 얻은 분획물인 것을 특징으로 하는 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양용 배지 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 항암 활성화 림프구는 자연살해세포(NK Cell), 자연살해 T세포(NKT Cell), 및 T세포인 것을 특징으로 하는 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양용 배지 조성물.
  4. 말초혈액으로 말초혈액단핵구를 분리하는 단계;
    세포 배양용 배지에 분리된 말초혈액단핵구세포를 넣고 인터루킨-2(IL-2), 항-CD16 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물의 존재 하에 배양하는 제1배양단계;
    상기 제1배양단계에서 배양완료된 배양액으로부터 세포를 획득하고, 획득한 세포를 인터루킨-2(IL-2), 항-CD3 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물 존재 하에 배양하는 제2배양단계; 및
    상기 제2배양단계에서 배양완료된 배양액으로부터 세포를 획득하고, 획득한 세포를 인터루킨-2(IL-2), 항-CD3 단클론항체, 항-CD16 단클론항체, 및 고련피 노르말헥산 분획물 존재 하에서 배양하는 제3배양단계;
    를 포함하며, 상기 제1 내지 제3 배양단계를 거쳐 사용한 배양액에는 인터루킨-2(IL-2)의 농도 100 ~ 200000 IU/㎖, 항-CD3 단클론항체의 농도 10 ~　100000　ng/㎖, 항-CD16 단클론항체의 농도 10 ~ 100000 ng/㎖, 및 고련피 노르말헥산 분획물의 농도 25 ~ 250 ㎍/㎖로 포함하는 것을 특징으로 하는 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 제1 내지 제3 배양단계는 30 ~ 80℃ 온도 및 5 ~ 10% CO2 조건 하에서 3 ~ 5일 동안 배양되는 것을 특징으로 하는 말초혈액단핵구 유래 항암 활성화 림프구 배양방법.
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