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WO2016171235A1 - 組織細胞の選別方法 - Google Patents

組織細胞の選別方法 Download PDF

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WO2016171235A1
WO2016171235A1 PCT/JP2016/062710 JP2016062710W WO2016171235A1 WO 2016171235 A1 WO2016171235 A1 WO 2016171235A1 JP 2016062710 W JP2016062710 W JP 2016062710W WO 2016171235 A1 WO2016171235 A1 WO 2016171235A1
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WO
WIPO (PCT)
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cells
cell
mirna
gene
nucleic acid
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/062710
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English (en)
French (fr)
Inventor
善紀 吉田
博英 齊藤
健嗣 三木
慧 遠藤
誠弥 高橋
Original Assignee
国立大学法人京都大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Priority to EP16783256.7A priority patent/EP3318630B1/en
Publication of WO2016171235A1 publication Critical patent/WO2016171235A1/ja
Priority to US16/660,333 priority patent/US20200056248A1/en

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    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/178—Oligonucleotides characterized by their use miRNA, siRNA or ncRNA

Definitions

  • the present invention relates to a method for sorting tissue cells, and particularly to a method for sorting endothelial cells, hepatocytes and insulin-producing cells.
  • Non-patent document 1 Non-patent document 2 and Non-patent document 3
  • all cells are not induced into the desired cell and usually contain other cell types simultaneously.
  • it is necessary to increase the purity of desired cells by sorting or the like.
  • an object of the present invention is to provide an index for sorting each tissue cell.
  • tissue cells such as endothelial cells, hepatocytes or insulin-producing cells can be purified with high purity by using miRNA-responsive mRNA.
  • miRNA specifically expressed in each tissue cell group was found by microarray analysis.
  • mRNA (miRNA switch) having these miRNA target sequence and marker gene was prepared, and when the mRNA was introduced into the cells to be selected, there were cells with different reactions in the cell group.
  • mRNA switch miRNA switch
  • these cells were extracted, it was confirmed that they were target tissue cells with high purity, and a method for selecting desired tissue cells was found.
  • the present invention has been completed based on such findings.
  • a method for selecting endothelial cells comprising the step of introducing miRNA-responsive mRNA into a cell group, wherein the miRNA-responsive mRNA is: (i) a nucleic acid sequence specifically recognized by miR-126-3P or miR-126-5P, and (ii) a nucleic acid sequence corresponding to the coding region of the first marker gene.
  • a method for selecting hepatocytes including a step of introducing miRNA-responsive mRNA into a cell group, wherein the miRNA-responsive mRNA is: (i) a nucleic acid sequence specifically recognized by miR-122-5P, and (ii) a nucleic acid sequence corresponding to the coding region of the first marker gene.
  • a method for selecting insulin-producing cells comprising the step of introducing miRNA-responsive mRNA into a cell group, wherein the miRNA-responsive mRNA is: (i) a nucleic acid sequence specifically recognized by miR-375, and (ii) a nucleic acid sequence corresponding to the coding region of the first marker gene.
  • the miRNA-responsive mRNA according to any one of [1] to [3], wherein the miRNA-responsive mRNA includes a nucleic acid sequence in which (i) and (ii) are linked in a 5 ′ to 3 ′ direction.
  • the first marker gene of (ii) is one or more genes selected from the group consisting of a gene encoding a fluorescent protein, an apoptosis-inducing gene, and a suicide gene, [1] to [4 ] The method of any one of these.
  • BFP blue fluorescent protein
  • the apoptosis-inducing gene is a gene encoding a Bim protein.
  • the method further includes the step of introducing mRNA comprising a nucleic acid corresponding to the coding region of the second marker gene into the cell group, wherein the cell into which the second marker gene is translated is defined as the target cell.
  • the second marker gene is a fluorescent protein or a drug resistance gene different from the first marker gene.
  • a method for producing endothelial cells comprising: (a) producing a cell group containing endothelial cells from pluripotent stem cells; (b) (i) miRNA responsiveness comprising a sequence comprising a nucleic acid specifically recognized by miR-126-3P or miR-126-5P, and (ii) a nucleic acid corresponding to the coding region of the first marker gene introducing mRNA into the cell population of step (a), and (c) selecting a cell with a small amount of translation of the first marker gene in the step (b), Including a method.
  • a method for producing hepatocytes comprising: (a) producing a cell group containing hepatocytes from pluripotent stem cells, (b) (i) a nucleic acid specifically recognized by miR-122-5P, and (ii) a miRNA-responsive mRNA comprising a sequence containing a nucleic acid corresponding to the coding region of the first marker gene (a) ) In the cell group, and (c) selecting a cell with a small amount of translation of the first marker gene in the step (b), Including a method.
  • a method for producing insulin-producing cells comprising: (a) producing a cell group containing insulin-producing cells from pluripotent stem cells; (b) (i) a nucleic acid specifically recognized by miR-375, and (ii) a miRNA-responsive mRNA comprising a sequence containing a nucleic acid corresponding to the coding region of the first marker gene. Introducing into the cell population; and (c) selecting a cell with a small amount of translation of the first marker gene in the step (b), Including a method.
  • the miRNA-responsive mRNA according to any one of [11] to [13], wherein the miRNA-responsive mRNA comprises a nucleic acid sequence in which (i) and (ii) are linked in a 5 ′ to 3 ′ direction.
  • the first marker gene of (ii) is one or more genes selected from the group consisting of a gene encoding a fluorescent protein, an apoptosis-inducing gene, and a suicide gene, [11] to [14 ] The method of any one of these.
  • the method further includes the step of introducing mRNA comprising a nucleic acid corresponding to the coding region of the second marker gene into the cell group, wherein the cell into which the second marker gene is translated is defined as the target cell.
  • the method according to any one of [11] to [15], wherein the second marker gene is a fluorescent protein or a drug resistance gene different from the first marker gene.
  • the tissue cells such as endothelial cells, hepatocytes or insulin-producing cells can be easily selected and purified to high purity by the method shown in the present invention. Since the mRNA introduced into the cell group by the method of the present invention is present in the cell only transiently, it is possible to select the target cell safely without being integrated into the genome. Moreover, it is possible to select a living cell based on the expression level of miRNA in an activated state in the cell without immobilizing the cell by the method shown in the present invention. Furthermore, the cells purified by the method of the present invention can be used for the purpose of transplantation therapy.
  • FIG. 1A shows the results of microarray comparison of miRNA expression levels in HUVEC and smooth muscle cells (AoSMC) (left) or cardiomyocytes (MYH6-EIP4 d20 CMs) (right). The figure below shows the Venn diagram of the analysis results.
  • FIG. 1B shows each miRNA switch (miR-208, miR-10b-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-196b-5 and miR-216a5p) or BFP after introduction into HUVECs along with EGFP. The result of a flow cytometry analysis is shown.
  • FIG. 1A shows the results of microarray comparison of miRNA expression levels in HUVEC and smooth muscle cells (AoSMC) (left) or cardiomyocytes (MYH6-EIP4 d20 CMs) (right). The figure below shows the Venn diagram of the analysis results.
  • FIG. 1B shows each miRNA switch (miR-208, miR-10b-5p, miR-12
  • each miRNA switch (miR-208, miR-10b-5p, miR-126-3p, miR-126-5p, miR-196b-5 and miR-216a5p) is induced to differentiate from iPS cells together with EGFP.
  • FIG. 2B shows a group of cardiomyocytes containing endothelial cells derived from iPS cells (201B7, 409B2 and 606A1) and ES cells (KhES1) for each miRNA switch (miR-208, miR-126-3p, and miR-126-5p). ) Is a graph showing the content of CD31-positive cells in the cells separated using.
  • FIG. 2C shows the results of tube formation studies of cells isolated using HUVEC or miR-126-5p miRNA switch.
  • FIG. 3A shows a schematic diagram of an miRNA switch having two target sequences.
  • 3B shows the miRNA switch (miR-126-3p + miR-208, miR-126-5p + miR-208, miR-208 + miR-126-3p, miR) for cardiomyocytes and endothelial cells derived from iPS cells.
  • miRNA switch miR-126-3p + miR-208, miR-126-5p + miR-208, miR-208 + miR-126-3p, miR
  • FIG. 3B shows the miRNA switch (miR-126-3p + miR-208, miR-126-5p + miR-208, miR-208 + miR-126-3p, miR) for cardiomyocytes and endothelial cells derived from iPS cells.
  • the results of flow cytometric analysis of the content of positive cells of CD31 or cTnT in cells separated using -208 + miR-126-5p and miR-208)) are shown.
  • FIG. 3C shows cardiomyocytes and endothelial cells derived from iPS cells (201B7 and 409B2) and ES cells (KhES1) by miRNA switch (miR-126-3p + miR-208, miR-126-5p + miR-208, It is the graph which showed the content rate of the CD31 or cTnT positive cell in the cell isolate
  • FIG. 4A shows the results of comparison of miRNA expression levels in primary hepatocytes (Hepatocytes) and fibroblasts (NHDF) using a microarray.
  • Hepatocytes primary hepatocytes
  • fibroblasts fibroblasts
  • FIG. 4B shows a group of hepatocytes in which each miRNA switch (control, miR-122-3p, miR-122-5p, miR-192-5p, miR-194-5p and miR-215) is induced to differentiate from iPS cells together with EGFP.
  • each miRNA switch control, miR-122-3p, miR-122-5p, miR-192-5p, miR-194-5p and miR-215.
  • FIG. 5A shows the results of flow cytometry analysis after introduction of miR-122-5p miRNA switch into EPS-differentiated hepatocyte groups together with EGFP, and the cells indicated by the gate in the left figure.
  • the results of staining with an antibody against HNF4A and flow cytometric analysis are shown.
  • 5B shows cells isolated from iPS cells using miR-122-5p miRNA switch, cells other than those isolated using miR-122-5p miRNA switch (negative fraction), and iPS cells.
  • 5 is a graph showing the content of ALUBUMIN or HNF4A positive cells in a hepatocyte group (w / o sort) induced to differentiate from.
  • FIG. 5C shows cells isolated from iPS cells using miR-122-5p miRNA switch, cells other than those separated using miR-122-5p ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ miRNA switch (negative fraction), and iPS cells. The result of having carried out the immuno-staining using the antibody with respect to ALUBUMIN for the hepatocyte group (w / o
  • FIG. 6A shows the results of flow cytometry analysis after introducing miR-375 miRNA switch into an insulin-producing cell group induced to differentiate from iPS cells together with EGFP.
  • FIG. 6B shows the differentiation of insulin-producing cells differentiated from iPS cells using miR-375 miRNA switch, cells other than miR-375 miRNA switch separated (negative fraction), and iPS cells. It is the graph which showed the content rate of the INSULIN positive cell in the obtained insulin production cell group (w / o
  • FIG. 6C shows the differentiation of insulin-producing cells differentiated from iPS cells using miR-375 miRNA switch, cells other than miR-375 miRNA switch separated (negative fraction), and iPS cells. The result of having carried out the immuno-staining using the antibody with respect to the insulin-producing cell group (w / o
  • miRNA-responsive mRNA which is also simply referred to as miRNA switch, means mRNA comprising the following nucleic acid sequences (i) and (ii): (i) a nucleic acid sequence specifically recognized by miRNA, and (ii) a nucleic acid sequence corresponding to the coding region of the first marker gene.
  • the nucleic acid sequence specifically recognized by (i) the miRNA and (ii) the nucleic acid sequence corresponding to the coding region of the first marker gene are operably linked.
  • the “miRNA” in the present invention is a short non-coding RNA (20-25 bases) existing in cells involved in regulation of gene expression through inhibition of translation from mRNA to protein and degradation of mRNA. .
  • This miRNA is transcribed as a single-difference pri-miRNA that can take a hairpin loop structure containing miRNA and its complementary strand, and a part of it is cut into a pre-miRNA by an enzyme called Drosha in the nucleus. After being transported outside the nucleus, it is further cleaved by Dicer and functions.
  • the miRNA that is specifically expressed in the desired cells to be selected can be appropriately selected.
  • the desired cells include endothelial cells, hepatocytes, and insulin-producing cells described later.
  • Specifically expressed miRNAs are 10% or more, 20% or more, 30% or more, 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more in a desired cell compared to other cells
  • Such miRNAs are listed in database information (for example, http://www.mirbase.org/ or http://www.microrna.org/) and / or described in the database. It can select suitably from miRNA described in literature information. Examples include, but are not limited to, miRNAs listed in Table 1.
  • the nucleic acid sequence specifically recognized by miRNA is preferably, for example, a sequence that is completely complementary to the miRNA.
  • it may have a mismatch (mismatch) with a completely complementary sequence.
  • the mismatch from the sequence that is completely complementary to the miRNA may be any mismatch that can be normally recognized by the miRNA in the desired cell, and the mismatch of about 40 to 50% in the original function in the cell in vivo. There may be.
  • mismatch is not particularly limited, but 1 base, 2 bases, 3 bases, 4 bases, 5 bases, 6 bases, 7 bases, 8 bases, 9 bases, or 10 bases or 1% of the total recognition sequence, 5% %, 10%, 20%, 30%, or 40% discrepancy.
  • the miRNA target sequence on the mRNA ⁇ ⁇ ⁇ included in the cell in particular, on the part other than the seed region, that is, on the ⁇ ⁇ 5 ' A region may contain a number of mismatches, and portions of the seed region may contain no mismatches, or may contain 1 base, 2 bases, or 3 bases mismatches.
  • Such a sequence may be any base length including the number of bases to which RISC specifically binds, and the length is not particularly limited, but is preferably a sequence of 18 bases or more and less than 24 bases, more preferably 20 It is a sequence of not less than 22 bases.
  • the nucleic acid sequence specifically recognized by miRNA introduces miRNA-responsive mRNA having the sequence into the desired cell and other cells, and the expression of the corresponding marker gene is suppressed only in the desired cell. By confirming this, it can be appropriately determined and used.
  • nucleic acid sequences specifically recognized by miR-126-3P, miR-126-5P, miR-122-5P, and miR-375 include the target sequences listed in Table 2, which include It is not limited.
  • the “marker gene” of (ii) used in the present invention is a gene that is translated in a cell, functions as a marker, and encodes an arbitrary protein that enables cell selection.
  • proteins that can be translated into cells and function as markers include, for example, visualization, quantification by assisting fluorescence, luminescence, coloration, or fluorescence, luminescence, or coloration of fluorescence, fluorescent proteins, etc.
  • an apoptosis-inhibiting gene can also be used as a marker gene.
  • a protein translated from mRNA containing a nucleic acid corresponding to the coding region of the marker gene is referred to as a marker protein.
  • the “first” is a term for distinguishing when two types of marker genes are used, and the marker genes are not particularly limited.
  • fluorescent proteins include blue fluorescent proteins such as Sirius, BFP, and EBFP; cyan fluorescent proteins such as mTurquoise, TagCFP, AmCyan, mTFP1, MidoriishiCyan, and CFP; TurboGFP, AcGFP, TagGFP, Azami-Green (for example, hmAG1 ), Green fluorescent proteins such as ZsGreen, EmGFP, EGFP, GFP2, HyPer; yellow fluorescent proteins such as TagYFP, EYFP, Venus, YFP, PhiYFP, PhiYFP-m, TurboYFP, ZsYellow, mBanana; KusabiraOrange (for example, hmKO2), mOrange Orange fluorescent proteins such as: TurboRFP, DsRed-Express, DsRed2, TagRFP, DsRed-Monomer, AsRed2, mStrawberry and other red fluorescent proteins; TurboFP602, mRFP1, JRed, KillerRed, mCh
  • the photoprotein can be exemplified by aequorin, but is not limited thereto.
  • proteins that assist fluorescence, luminescence, or coloration include, but are not limited to, enzymes that degrade fluorescence, luminescence, or color precursors such as luciferase, phosphatase, peroxidase, and ⁇ -lactamase.
  • the corresponding precursor is contacted with a cell group in the selection of a target cell, or the cell group is supported. This can be done by introducing a precursor that
  • the apoptosis-inducing gene means a gene encoding a protein having apoptosis-inducing activity for cells.
  • Bim is preferably used as an apoptosis-inducing gene.
  • the suicide gene means a gene whose expression in a cell is lethal to the cell.
  • the suicide gene may be one that causes cell death by itself (eg, diphtheria A toxin) or the expression of this gene sensitizes the cell to a specific drug (eg, Or sensitize cells to antiviral compounds by expression of the herpes simplex thymidine kinase gene.
  • suicide genes include diphtheria A toxin, herpes simplex thymidine kinase gene (HSV-TK), carboxypeptidase G2 (CPG2), carboxylesterase (CA), cytosine deaminase (CD), cytochrome P450 (cyt-450), deoxycytidine Genes encoding kinase (dCK), nitroreductase (NR), purine nucleoside phosphorylase (PNP), thymidine phosphorylase (TP), varicella-zoster virus thymidine kinase (VZV-TK), xanthine-guanine phosphoribosyltransferase (XGPRT), etc.
  • HSV-TK is preferably used as a suicide gene.
  • the marker gene may include a gene encoding a localization signal.
  • the localization signal include a nuclear localization signal, a cell membrane localization signal, a mitochondrial localization signal, a protein secretion signal, and the like.
  • a classical nuclear translocation sequence (NLS), M9 Examples include, but are not limited to, sequences, mitochondrial target sequences (MTS), and endoplasmic reticulum translocation sequences.
  • Such a localization signal is particularly advantageous when a step of selecting a target cell is performed on an image by imaging cytometry described later.
  • the nucleic acid sequence specifically recognized by the miRNA and the nucleic acid sequence corresponding to the coding region of the first marker gene are functionally linked to the open reading frame (however, starting from the marker gene).
  • the miRNA-responsive mRNA preferably comprises a Cap structure (7-methylguanosine 5′-phosphate), an open reading frame encoding a marker gene, and a poly A tail in the direction 5 ′ to 3 ′ from the 5 ′ end. It comprises at least one miRNA target sequence in the 5′UTR, in the 3′UTR, and / or in the open reading frame.
  • the position of the target sequence of miRNA in mRNA may be 5′UTR or 3′UTR, may be within the open reading frame (3 ′ side of the start codon), and all of these include miRNA
  • the target sequence may be provided.
  • the number of miRNA target sequences may be one, two, three, four, five, six, seven, eight or more.
  • the nucleic acid sequences (i) and (ii) are linked in this order in the 5 ′ to 3 ′ direction.
  • the number of bases and the kind of base between the cap structure and the target sequence of miRNA may be arbitrary as long as they do not constitute a stem structure or a three-dimensional structure.
  • the number of bases between the cap structure and the miRNA target sequence can be designed to be 0 to 50 bases, preferably 10 to 30 bases.
  • the number of bases and the type of base between the miRNA target sequence and the start codon may be arbitrary as long as they do not constitute a stem structure or a three-dimensional structure, and the number of bases between the miRNA target sequence and the start codon is 0. It can be designed with an arrangement of -50 bases, preferably 10-30 bases.
  • an AUG serving as a start codon does not exist in the miRNA target sequence in the miRNA-responsive mRNA.
  • the target sequence of miRNA is present in the 5′UTR and AUG is included in the target sequence, it is designed to be in-frame in relation to the marker gene linked to the 3 ′ side. It is preferable.
  • AUG in the target sequence can be converted to GUG and used. Further, in order to minimize the influence of AUG in the target sequence, the location of the target sequence in the 5'UTR can be changed as appropriate.
  • the number of bases between the cap structure and the AUG sequence in the target sequence is 0 to 60 bases, for example, 0 to 15 bases, 10 to 20 bases, 20 to 30 bases, 30 to 40 bases, 40 to 50 bases , Can be designed in an arrangement of 50 to 60 bases.
  • the miRNA target sequence when the miRNA target sequence is present in the 5 ′ UTR, for example, the following sequences can be employed. Table 3. Sequence of 5′UTR in miRNA and corresponding miRNA-responsive mRNA
  • the target sequence of miRNA when the target sequence of miRNA is present in the 5'UTR, the following sequence can be adopted, for example, downstream of the marker gene that follows (ie, the 3'UTR). At this time, any gene as described above can be used as the marker gene sandwiched between the 5'UTR and the 3'UTR.
  • the following sequence can be adopted as the full length of the miRNA-responsive mRNA in the present invention.
  • Table 5 The full length of miRNA and its corresponding miRNA-responsive mRNA
  • miRNA-responsive mRNA as a method for introducing miRNA-responsive mRNA into cells, it can be introduced in the form of DNA or mRNA.
  • miRNA-responsive mRNA When miRNA-responsive mRNA is introduced in the form of DNA, it can be introduced into somatic cells by techniques such as vectors such as viruses, plasmids, artificial chromosomes, lipofection, liposomes, and microinjection.
  • Virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors (cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007 ), Adenovirus vectors (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors (WO 2010/008054), and the like.
  • artificial chromosome vectors examples include human artificial chromosomes (HAC), yeast artificial chromosomes (YAC), and bacterial artificial chromosomes (BAC, PAC).
  • HAC human artificial chromosomes
  • YAC yeast artificial chromosomes
  • BAC bacterial artificial chromosomes
  • a plasmid a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • the vector can contain regulatory sequences such as a promoter, an enhancer, a ribosome binding sequence, a terminator, a polyadenylation site, etc., so that miRNA-responsive mRNA can be expressed.
  • Selective marker sequences such as kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene, reporter gene sequences such as green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG, etc. Can be included.
  • GFP green fluorescent protein
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • miRNA-responsive mRNA When miRNA-responsive mRNA is in the form of RNA, it may be introduced into somatic cells by, for example, lipofection or microinjection, and 5-methylcytidine and pseudouridine (TriLink Biotechnologies) were incorporated to suppress degradation RNA may also be used (Warren L, L (2010) Cell Stem Cell 7: 618-630).
  • the positions of the modified bases can be all or part of the uridine and cytidine independently, and if they are part of the base, they can be random positions at an arbitrary ratio.
  • a plurality of mRNAs are added to a cell group. Co-introduction is preferred. This is because the ratio of two or more co-introduced mRNAs in cells is maintained in individual cells, and the activity ratio of proteins expressed from these mRNAs is constant in the cell population.
  • the introduction amount at this time varies depending on the cell group to be introduced, the mRNA to be introduced, the introduction method and the kind of the introduction reagent, and those skilled in the art can appropriately select these in order to obtain a desired translation amount.
  • control mRNA is mRNA consisting of a sequence containing a nucleic acid corresponding to the coding region of a marker gene or a sequence containing a nucleic acid corresponding to the coding region of a drug resistance gene, and does not have a miRNA target site.
  • An example is mRNA.
  • the control mRNA is introduced into a cell group together with the miRNA-responsive mRNA, and can function as a control for confirming and identifying the cell into which the miRNA-responsive mRNA has been introduced. Moreover, it can function as a control in quantifying signal intensity such as fluorescence and luminescence from miRNA-responsive mRNA.
  • the amount of control mRNA introduced can also be appropriately selected by those skilled in the art to obtain a desired translation amount.
  • the “drug resistance gene” used in the present invention may be any gene as long as it expresses a protein having resistance to the corresponding drug.
  • examples include, but are not limited to, antibiotic resistance genes.
  • antibiotic resistance genes include kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, blasticidin resistance gene, gentamicin resistance gene, kanamycin resistance gene, tetracycline resistance gene, chloramphenicol resistance gene, etc.
  • a puromycin resistance gene or a blasticidin resistance gene is used as the antibiotic resistance gene.
  • the selection method preferably includes a step of simultaneously introducing miRNA-responsive mRNA and control mRNA into a cell group including target cells. Such a step can be preferably carried out by co-introduction of miRNA-responsive mRNA and control mRNA.
  • control mRNA By using control mRNA, it is possible to select cells with low or non-translated marker protein translated from miRNA-responsive mRNA as target cells even when the efficiency of miRNA-responsive mRNA introduction into cells is low. Become.
  • the marker gene contained in the control mRNA is preferably different from the marker gene contained in the miRNA-responsive mRNA.
  • the marker gene contained in miRNA-responsive mRNA is an apoptosis-inducing gene or a suicide gene
  • the marker gene contained in the control mRNA can be a gene encoding a fluorescent protein.
  • a control mRNA comprising a sequence containing a nucleic acid corresponding to the coding region of a drug resistance gene can be used together with an miRNA-responsive mRNA comprising a sequence containing a nucleic acid corresponding to the coding region of any marker gene.
  • miRNA-responsive mRNA comprising a sequence containing a nucleic acid corresponding to the coding region of any marker gene.
  • the same gene may be used for both the marker gene contained in the miRNA-responsive mRNA and the marker gene contained in the control mRNA.
  • a gene encoding a fluorescent protein may be used for both the marker gene contained in the miRNA-responsive mRNA and the marker gene contained in the control mRNA. In this case, the fluorescence wavelengths of the two fluorescent proteins are different. It is desirable.
  • control mRNA in the present invention is not particularly limited.
  • the following mRNAs can be used.
  • a target is detected from a cell group that can contain a target cell by performing a step of introducing miRNA-responsive mRNA and optionally control mRNA into the cell group.
  • Cells can be sorted. That is, it can be set as the state which presented the detectable signal information different from other cell types about a desired cell from the cell group containing two or more types of cells which can contain a target cell.
  • the target cell can be selectively separated by further carrying out the sorting step by the production method described later.
  • an endothelial cell is a flat and thin cell constituting the inner surface of a blood vessel, but is not distinguished from an endothelial progenitor cell in the present invention.
  • the endothelial cells in the present invention may be cells that can form a tube structure by continuing culture, and more preferably cells that have the ability to take up acetylated low density lipoprotein (ac-LDL).
  • ac-LDL acetylated low density lipoprotein
  • the nucleic acid sequence specifically recognized by miRNA contained in the miRNA-responsive mRNA used for selecting endothelial cells is a nucleic acid specifically recognized by miR-126-3P or miR-126-5P. A sequence is preferred.
  • the cell group to be selected may be any cell that can contain endothelial cells.
  • it may be a group of cells induced to differentiate from pluripotent stem cells or a group of cells taken out from the living body, but is not limited thereto. Therefore, miRNA-responsive mRNA may be introduced into a cell group that is unclear whether or not it contains endothelial cells.
  • the cell group may be a cell group derived from pluripotent stem cells.
  • Such differentiation induction is not limited to induction specific to endothelial cells, but also includes differentiation induction for the purpose of obtaining other cell types such as cardiomyocytes.
  • hepatocytes are defined as cells expressing albumin mRNA or HNF4A.
  • hepatocytes may accumulate hepatic cells such as glycogen accumulation, low density lipoprotein (LDL) uptake, albumin secretion, ammonia metabolism and urea synthesis, cytochrome P450 activity, lipid metabolism, drug metabolism, etc. It may be defined as a cell characterized by any one or a combination of known functions.
  • LDL low density lipoprotein
  • the nucleic acid sequence specifically recognized by miRNA contained in the miRNA-responsive mRNA used for selecting hepatocytes is preferably a nucleic acid sequence specifically recognized by miR-122-5P. .
  • the cell group to be selected may be any cell that can contain hepatocytes.
  • it may be a group of cells induced to differentiate from pluripotent stem cells or a group of cells taken out from the living body, but is not limited thereto. Therefore, miRNA-responsive mRNA may be introduced into a cell group in which it is unknown whether hepatocytes are contained.
  • the cell group may be a cell group derived from pluripotent stem cells. Such differentiation induction is not limited to induction specific to hepatocytes.
  • hepatocytes from pluripotent stem cells
  • WO2001 / 081549 Takayama K, et al, Stem Cell Reports. 1: 322-335, 2013, Kajiwara M, et al, Proc Natl Acad Sci U S A 109: 12538-12543, 2012, Hay DC, et al, Stem Cells. 26: 894-902, 2008 and the like may be used as appropriate.
  • an insulin producing cell is defined as a cell expressing insulin mRNA.
  • the nucleic acid sequence specifically recognized by miRNA contained in the miRNA-responsive mRNA used for selecting insulin-producing cell cells is preferably a nucleic acid sequence specifically recognized by miR-375.
  • the cell group to be selected may be any cell that can contain insulin-producing cells.
  • it may be a group of cells induced to differentiate from pluripotent stem cells or a group of cells taken out from the living body, but is not limited thereto. Therefore, miRNA-responsive mRNA may be introduced into a cell group in which it is unknown whether or not it contains insulin-producing cells.
  • the cell group may be a cell group derived from pluripotent stem cells. Such differentiation induction is not limited to induction specific to insulin-producing cells.
  • Examples of a method for inducing insulin production from pluripotent stem cells include a method for inducing differentiation using activin (Activin) or retinoic acid (RA) (JP 2009-225661 A, E. Kroon et, etc.). al., Nature Biotechnology (2008) Vol.26, No. 4: 443-452, KAD'Amour et al., Nature Biotechnology (2006) Vol.24, No.11: 1392-1401, W. Jiang, Cell Research (2007) 17: 333-344, JHShim et al., Diabetologia (2007) 50: 1228-1238, R.Maehra et al., PNAS (2009), vol.106, No.37: 15768-15773) .
  • Activin activin
  • RA retinoic acid
  • a pluripotent stem cell is a stem cell having pluripotency that can be differentiated into many cells existing in a living body and also having proliferative ability, and is used in the present invention. Any cell induced by a hepatocyte is included.
  • pluripotent stem cells include, but are not limited to, embryonic stem (ES) cells, cloned embryo-derived embryonic stem (ntES) cells obtained by nuclear transfer, sperm stem cells (“GS cells”), embryonic Examples include germ cells (“EG cells”), induced pluripotent stem (iPS) cells, cultured fibroblasts and bone marrow stem cell-derived pluripotent cells (Muse cells).
  • ES embryonic stem
  • ntES cloned embryo-derived embryonic stem
  • GS cells sperm stem cells
  • EG cells germ cells
  • iPS induced pluripotent stem
  • Muse cells bone marrow stem cell-derived pluripotent cells
  • Embryonic stem cells Embryonic stem cells (ES cells) are established from the inner cell mass of early embryos of mammals such as humans and mice (eg, blastocysts) and have the ability to proliferate by self-replication. It has stem cells.
  • ES cells are embryonic stem cells derived from the inner cell mass of the blastocyst, the embryo after the morula, in the 8-cell stage of a fertilized egg, and have the ability to differentiate into any cell that constitutes an adult, so-called differentiation. And ability to proliferate by self-replication.
  • ES cells were discovered in mice in 1981 (MJ Evans and MH Kaufman (1981), Nature 292: 154-156), and then ES cell lines were established in primates such as humans and monkeys (JA Thomson et al. (1998), Science 282: 1145-1147; JA Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 7844-7848; JA Thomson etal. (1996), Biol. Reprod. 55: 254-259; JA Thomson and VS Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38: 133-165).
  • ES cells can be established by taking an inner cell mass from a blastocyst of a fertilized egg of a target animal and culturing the inner cell mass on a fibroblast feeder. In addition, maintenance of cells by subculture is performed using a culture solution to which substances such as leukemia inhibitory factor (LIF) and basic fibroblast growth factor (basic fibroblast growth factor (bFGF)) are added. It can be carried out.
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • bFGF basic fibroblast growth factor
  • DMEM / F-12 culture medium supplemented with 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 0.1 mM non-essential amino acid, 2 mM L-glutamic acid, 20% KSR and 4 ng / ml bFGF is used as the culture medium for ES cell production.
  • Human ES cells can be maintained in a humid atmosphere at 37 ° C., 5% CO 2 (H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345: 926-932).
  • ES cells also need to be passaged every 3-4 days, where passage is eg 0.25% trypsin and 0.1 mg / ml collagenase IV in PBS containing 1 mM CaCl 2 and 20% KSR. Can be used.
  • ES cells can be generally selected by Real-Time PCR using the expression of gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, Nanog as an index.
  • gene markers such as alkaline phosphatase, Oct-3 / 4, Nanog
  • OCT-3 / 4, NANOG, and ECAD can be used as an index (E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 443). -452).
  • Human ES cell lines for example, WA01 (H1) and WA09 (H9) are obtained from the WiCell Research Institute, and KhES-1, KhES-2 and KhES-3 are obtained from the Institute of Regenerative Medicine (Kyoto, Japan), Kyoto University Is possible.
  • sperm stem cells are testis-derived pluripotent stem cells that are the origin of spermatogenesis. Like ES cells, these cells can be induced to differentiate into various types of cells, and have characteristics such as the ability to create chimeric mice when transplanted into mouse blastocysts (M. Kanatsu-Shinohara et al. ( 2003) Biol. Reprod., 69: 612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119: 1001-1012).
  • GDNF glial cell line-derived neurotrophic factor
  • Embryonic germ cells are cells that are established from embryonic primordial germ cells and have the same pluripotency as ES cells, such as LIF, bFGF, stem cell factor, etc. It can be established by culturing primordial germ cells in the presence of these substances (Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70: 841-847; JL Resnick et al. (1992), Nature, 359: 550 -551).
  • iPS Artificial pluripotent stem cell
  • iPS artificial pluripotent stem
  • the reprogramming factor is a gene specifically expressed in ES cells, its gene product or non-cording RNA, a gene that plays an important role in maintaining undifferentiation of ES cells, its gene product or non-coding RNA, or It may be constituted by a low molecular compound.
  • genes included in the reprogramming factor include Oct3 / 4, Sox2, Sox1, Sox3, Sox15, Sox17, Klf4, Klf2, c-Myc, N-Myc, L-Myc, Nanog, Lin28, Fbx15, ERas, ECAT15 -2, Tcl1, beta-catenin, Lin28b, Sall1, Sall4, Esrrb, Nr5a2, Tbx3 or Glis1 etc. are exemplified, and these reprogramming factors may be used alone or in combination.
  • the reprogramming factors include histone deacetylase (HDAC) inhibitors [eg small molecule inhibitors such as valproic acid (VPA), trichostatin A, sodium butyrate, MC ⁇ 1293, M344, siRNA and shRNA against HDAC (eg Nucleic acid expression inhibitors such as HDAC1DACsiRNA Smartpool (registered trademark) (Millipore), HuSH 29mershRNA Constructs against HDAC1 (OriGene), etc.], MEK inhibitors (eg, PD184352, PD98059, U0126, SL327 and PD0325901), Glycogen synthase kinase-3 inhibitors (eg, Bio and CHIR99021), DNA methyltransferase inhibitors (eg, 5-azacytidine), histone methyltransferase inhibitors (eg, small molecule inhibitors such as BIX-01294, Suv39hl, Suv39h2, SetDBl And nucleic acid
  • the reprogramming factor may be introduced into a somatic cell by a technique such as lipofection, fusion with a cell membrane-permeable peptide (for example, HIV-derived TAT and polyarginine), or microinjection.
  • a cell membrane-permeable peptide for example, HIV-derived TAT and polyarginine
  • Virus vectors include retrovirus vectors, lentivirus vectors (cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007 ), Adenovirus vectors (Science, 322, 945-949, 2008), adeno-associated virus vectors, Sendai virus vectors (WO 2010/008054), and the like.
  • artificial chromosome vectors examples include human artificial chromosomes (HAC), yeast artificial chromosomes (YAC), and bacterial artificial chromosomes (BAC, PAC).
  • HAC human artificial chromosomes
  • YAC yeast artificial chromosomes
  • BAC bacterial artificial chromosomes
  • a plasmid a plasmid for mammalian cells can be used (Science, 322: 949-953, 2008).
  • the vector can contain regulatory sequences such as a promoter, enhancer, ribosome binding sequence, terminator, polyadenylation site, etc. so that a nuclear reprogramming substance can be expressed.
  • Selective marker sequences such as kanamycin resistance gene, ampicillin resistance gene, puromycin resistance gene, thymidine kinase gene, diphtheria toxin gene, reporter gene sequences such as green fluorescent protein (GFP), ⁇ -glucuronidase (GUS), FLAG, etc.
  • GFP green fluorescent protein
  • GUS ⁇ -glucuronidase
  • FLAG FLAG
  • the above vector has a LoxP sequence before and after the introduction of the gene into a somatic cell in order to excise the gene or promoter encoding the reprogramming factor and the gene encoding the reprogramming factor that binds to it. May be.
  • RNA it may be introduced into somatic cells by techniques such as lipofection and microinjection, and in order to suppress degradation, RNA incorporating 5-methylcytidine and pseudouridine® (TriLink® Biotechnologies) is used. Yes (Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7: 618-630).
  • a culture solution for inducing iPS cells for example, DMEM, DMEM / F12 or DME culture solution containing 10-15% FBS (in addition to these culture solutions, LIF, penicillin / streptomycin, puromycin, L- Glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc. may be included as appropriate.
  • a commercially available culture medium for example, a culture medium for mouse ES cell culture (TX-WES culture medium, Thrombo X), primate ES Medium for cell culture (primate ES / iPS cell culture medium, Reprocell), serum-free medium (mTeSR, Stemcell Technology, Essential 8, Life Technologies, StemFit, Ajinomoto).
  • a somatic cell is brought into contact with a reprogramming factor on a DMEM or DMEM / F12 medium containing 10% FBS at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for about 4 to 7 days.
  • a reprogramming factor on a DMEM or DMEM / F12 medium containing 10% FBS at 37 ° C. in the presence of 5% CO 2 for about 4 to 7 days.
  • feeder cells for example, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • bFGF-containing primate ES cell culture medium about 10 days after contact between the somatic cells and the reprogramming factor. Culturing and generating iPS-like colonies about 30 to about 45 days or more after the contact.
  • 10% FBS-containing DMEM medium including LIF, penicillin / streptomycin, etc.
  • feeder cells eg, mitomycin C-treated STO cells, SNL cells, etc.
  • 5% CO 2 at 37 ° C. can be suitably included with puromycin, L-glutamine, non-essential amino acids, ⁇ -mercaptoethanol, etc.
  • somatic cells to be reprogrammed themselves are used (Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4: e8067 or WO2010 / 137746), or extracellular matrix (eg, Laminin- 5 (WO2009 / 123349), Matrigel (BD) and iMatrix511 (Nippi)).
  • iPS cells may be established under hypoxic conditions (oxygen concentration of 0.1% or more and 15% or less) (Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5: 237 -241 or WO2010 / 013845).
  • the culture medium is exchanged with a fresh culture medium once a day from the second day onward.
  • the number of somatic cells used for nuclear reprogramming is not limited, but ranges from about 5 ⁇ 10 3 to about 5 ⁇ 10 6 cells per 100 cm 2 of culture dish.
  • IPS cells can be selected according to the shape of the formed colonies.
  • genes expressed when somatic cells are reprogrammed for example, SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, TRA-2-54, TRA-1-60 and TRA-1-80) Can be selected as an index.
  • the term “somatic cell” refers to any animal cell (preferably, a mammalian cell including a human) except a germ line cell such as an egg, oocyte, ES cell, or totipotent cell.
  • Somatic cells include, but are not limited to, fetal (pup) somatic cells, neonatal (pup) somatic cells, and mature healthy or diseased somatic cells. , Passage cells, and established cell lines.
  • somatic cells include, for example, (1) neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, tissue stem cells such as dental pulp stem cells (somatic stem cells), (2) tissue progenitor cells, (3) lymphocytes, epithelium Cells, endothelial cells, muscle cells, fibroblasts (skin cells, etc.), hair cells, hepatocytes, gastric mucosal cells, enterocytes, spleen cells, pancreatic cells (exocrine pancreas cells, etc.), brain cells, lung cells, kidney cells Examples thereof include differentiated cells such as fat cells.
  • somatic cells having the same or substantially the same HLA genotype as the transplant destination individual from the viewpoint that rejection does not occur.
  • substantially the same means that the HLA genotype matches the transplanted cells to such an extent that an immune response can be suppressed by an immunosuppressive agent.
  • HLA-A, HLA-B And somatic cells having an HLA type in which 3 loci of HLA-DR or 4 loci plus HLA-C are matched.
  • ES cell derived from a cloned embryo obtained by nuclear transfer An ES cell derived from a cloned embryo obtained by nuclear transfer (nt ES cell) is an ES cell derived from a cloned embryo produced by nuclear transfer technology, It has almost the same properties as ES cells derived from fertilized eggs (T. Wakayama et al. (2001), Science, 292: 740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72 : 932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450: 497-502).
  • nt ES nuclear transfer ES
  • nuclear transfer technology JB Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16: 642-646) and ES cell production technology (Kiyaka Wakayama et al. ( 2008), Experimental Medicine, 26, No. 5 (extra number), 47-52).
  • Nuclear transfer can be initialized by injecting a somatic cell nucleus into a mammal's enucleated unfertilized egg and culturing for several hours.
  • Multilineage-differentiating Stress Enduring cells are pluripotent stem cells produced by the method described in WO2011 / 007900. Specifically, fibroblasts or bone marrow stromal cells are treated with trypsin for a long time. Preferably, it is a pluripotent cell obtained by trypsin treatment for 8 hours or 16 hours and then suspension culture, and is positive for SSEA-3 and CD105.
  • the cells selected according to the present invention can be administered for medical purposes. Accordingly, a therapeutic agent comprising cells selected by the method of the present invention is provided.
  • the sorted cells are endothelial cells, they can be administered for the treatment of patients with severe ischemic diseases including coronary artery disease and lower limb ischemic disease (such as Buerger's disease and obstructive arteriosclerosis). Therefore, the present invention provides a revascularization agent containing endothelial cells selected by the above method.
  • the sorted cells are hepatocytes, they can be administered for the treatment of liver failure such as chronic liver failure such as cirrhosis and acute liver failure. Therefore, in this invention, the liver disease therapeutic agent containing the hepatocyte obtained by the method mentioned above is provided.
  • the sorted cells are insulin producing cells, they can be administered for the treatment of diabetes, particularly type 1 diabetes. Therefore, in this invention, the diabetes therapeutic agent containing the insulin producing cell obtained by the method mentioned above is provided.
  • the number of cells to be administered is not particularly limited as long as it is an amount that exerts an effect in treatment, and may be prepared by appropriately increasing or decreasing according to the size of the affected part or the size of the body.
  • pTAP-tagBFP The fragment was amplified by the PCR method using pTagBFP-Tubulin (evrogen) as a template and TagBFP_Tfwd and TagBFP_Trev as primers. The obtained fragment was inserted into pGEM-TAP, a self-made cloning vector. pGEM-TAP was prepared by PCR mutagenesis using pGEM-Teasy (Promega) as a template and pGEMTAP_MCS_Rev and pGEMTAP_MCS_Fwd as primers.
  • (B) pCTp-EGFP The fragment was amplified by PCR using pEGFP-N1 (Clontech) as a template and YF128_EXFP_Tfwd and YF129_EXFP_Trev as primers. The obtained fragment was inserted into pCM-TAP, a self-made cloning vector.
  • pCM-TAP was prepared by ligating the DraI fragment of pGEM-TAP and the NheI, AgeI blunt-ended fragment of pLysSRARE2 (Novagen).
  • tagBFP ⁇ Construction of a sequence containing a nucleic acid corresponding to a gene encoding a fluorescent protein>
  • a tagBFP Prepare the solutions in Table 8 using KOD-Plus-Neo (KOD-401, TOYOBO) according to the manufacturer's instructions, and perform PCR by using the above pTAP-tagBFP as a template and tagBFP fwd and TAP_IVTrev as primers. Amplified.
  • the amplified PCR product was treated with Dpn I (TOYOBO) at 37 ° C for 30 minutes, and then purified using MiniElute PCR purification Kit (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions (referred to as tagBFP PCR product) ).
  • (B) EGFP As in (a) above, amplification was performed by PCR using the above-described pCTp-EGFP as a template and TAPEGFP_IVTfwd and TAP_IVTrev as primers. Thus, PCR amplification was performed and the PCR product was purified (referred to as EGFP PCR product).
  • the amplified PCR product was purified using MiniElute PCR purification Kit (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions (referred to as 5'UTR PCR product).
  • (B) 3'UTR Similarly to the above (a), amplification was performed by PCR using IVT_3prime_UTR shown in Table 10 as a template and Fwd3UTR primer and Rev3UTR2T20 as primers, followed by purification (referred to as 3′UTR PCR product).
  • the amplified PCR product was treated with Dpn I (TOYOBO) at 37 ° C for 30 minutes, and then purified using MiniElute purification Kit (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions.
  • IVT template of the miRNA switch was prepared using the KOD-Plus-Neo (KOD-401, TOYOBO) according to the manufacturer's instructions, adjusting the solutions described in Table 12, and the above tagBFP PCR products, each miRNA target 5 ′ Amplification was carried out by PCR using UTR oligo-DNA and the above 3 ′ UTR PCR product as a template and T7FwdB primer and 3UTR120A rev primer as primers. Each miRNA target 5 ′ UTR oligo-DNA is shown in Table 13.
  • the amplified PCR product was treated with Dpn I (TOYOBO) at 37 ° C for 30 minutes, and then purified using MiniElute purification Kit (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions.
  • MRNA was prepared using each IVT template described above with MEGAscript T7 kit (Ambion) using the protocol described in Warren L, et al., Cell Stem Cell. 7 (5): 618-30 (2010). .
  • pseudouridine-5′-triphosphate and methylcytidine-5′-triphosphate (TriLink BioTechnologies) were used in place of uridine triphosphate and cytidine triphosphate, respectively.
  • guanidine-5′-triphosphate was diluted 5-fold with Anti Reverse cap Analog (New England Biolabs).
  • the reaction mixture was incubated at 37 ° C for 5 hours, TURBO DNase (Amibion) was added, and then incubated at 37 ° C for an additional 30 minutes.
  • the obtained mRNA was purified by FavorPrep Blood / Cultured Cells total RNA extraction column (Favorgen Biotech) and incubated at 37 ° C. for 30 minutes using Antarctic phosphatase (New England Biolabs). Then, it further refine
  • RNA expression profiles were performed using Agilent Technologies Human miRNA Microarray Release 19.0 according to the manufacturer's protocol. Data was analyzed using GeneSpring GX 12.6 software (Agilent Technologies).
  • Human iPS cells can be obtained by the 201B7 strain, 409B2 (available from RIKEN BioResource Center) described in Takahashi K, et al. Cell. 131: 861-72, 2007, or Okita K, et al, Stem Cells 31, 458-66. 606A1 described in Japanese, 2012.
  • KhES1 was obtained from Kyoto University and used.
  • Human iPS cells or ES cells were treated with CTK solution (ReproCELL) for 2 minutes, then the solution was removed, then treated with Accumax (Innovative Cell Technologies) for 5 minutes, and then dissociated into single cells by pipetting.
  • the cells were collected by centrifugation, transferred to a low-adhesion 6-well dish (Corning), 2 mM L-Glutamine, 150 ⁇ g / mL Transferrin, 50 ⁇ g / mL Ascorbic Acid (sigma), 4 ⁇ 10 ⁇ 4 M monothioglycerol (MTG), 0.5 Cultured in 1.5 ml / well STEMPRO 34 (Invitrogen) supplemented with% penicillin / streptomycin (Invitrogen), 10 ⁇ M ROCK inhibitor (Y-27632) and 2 ng / mL BMP4 (R & D) at 37 ° C and 5% oxygen EB was formed (day 0).
  • the obtained EB was washed with IMDM (Invitrogen), 2 mM L-glutamine, 150 ⁇ g / mL Transferrin, 50 ⁇ g / mL Ascorbic Acid, 4 ⁇ 10 ⁇ 4 M MTG, 10 ng / STEMPRO 34 supplemented with mL VEGF and 1 ⁇ M IWP-3 (Stemgent) was added to the dish and cultured at 37 ° C. under 5% oxygen condition for 4 days.
  • IMDM Invitrogen
  • 2 mM L-glutamine 150 ⁇ g / mL Transferrin
  • 50 ⁇ g / mL Ascorbic Acid 50 ⁇ g / mL Ascorbic Acid
  • 4 ⁇ 10 ⁇ 4 M MTG 10 ng / STEMPRO 34 supplemented with mL VEGF and 1 ⁇ M IWP-3 (Stemgent) was added to the dish and cultured at 37 ° C. under 5% oxygen condition for 4 days.
  • the medium On day 8 of induction (day 8), the medium was mixed with 2 mM L-glutamine, 150 ⁇ g / mL Transferrin, 50 ⁇ g / mL Ascorbic Acid, 4 ⁇ 10 ⁇ 4 M MTG, 0.5% penicillin / streptomycin, 10 ng / mL VEGF and 5 ng / mL. It exchanged for STEMPRO 34 which added mL bFGF, and culture
  • ⁇ Tube formation test> The separated endothelial cells were seeded on a 24-well plate coated with Matrigel (BD) at 2 ⁇ 10 5 cells / well and cultured in EGM-2 BulletKit medium. The next day, observations were made using a Biorevo BZ-9000 microscope.
  • BD Matrigel
  • microarray analysis was performed using human umbilical cord blood endothelial cells (HUVECs), and the top 5 miRNAs specifically expressed in endothelial cells (hsa-miR-10b-5p, hsa-miR-126-) 3p, hsa-miR-126-5p, hsa-miR-196b-5p and hsa-miR-216a-5p) were found (FIG. 1A).
  • HUVECs human umbilical cord blood endothelial cells
  • a miRNA switch having a sequence specifically recognized by these miRNAs and BFP (hereinafter referred to as miR-** miRNA switch) is prepared by the method described in Example 1, and is transferred to HUVECs together with EGFP mRNA as a control.
  • miR-** miRNA switch When introduced, HUVECs were successfully isolated by miR-126-3p miRNA switch and miR-126-5p miRNA switch (FIG. 1B). At this time, as a control, it was confirmed that BFP mRNA and EGFP mRNA could be separated by comparison with the results of introduction into HUVECs.
  • the miRNA switch in order to confirm whether or not endothelial cells can be separated by the miRNA switch, it was induced to cardiomyocytes by the method described above, and examination was made as to whether or not the endothelial cells contained in the induced cells can be separated.
  • the cell group after cardiomyocyte induction contains about 5-10% of cells that can be separated by miR-126-3p miRNA switch and miR-126-5p miRNA switch, and these cells are endothelial cell markers.
  • a CD31 was shown to be positive (FIGS. 2A and 2B).
  • the miR-208a miRNA switch could not separate CD31 positive cells.
  • miR-126-3p miRNA switch and miR-126-5p miRNA switch are useful for separating endothelial cells from heterogeneous cell groups. Furthermore, when a tube formation test was performed on the cells separated by the miR-126-5p miRNA switch, it was confirmed that the cells had angiogenic ability (FIG. 2C).
  • Hepatocyte isolation ⁇ Hepatocyte culture> Human primary hepatocytes were purchased from BioreclamationIVT and cultured in InVitroGRO CP Medium (BioreclamationIVT) supplemented with Torpedo Antibiotic Mix (BioreclamationIVT).
  • ⁇ Hepatocyte induction method As the human iPS cell, the 201B6 strain described in Takahashi K, et al. Cell. 131: 861-72, 2007 was used. Induction from human iPS cells into hepatocytes was performed by modifying the method described in Kajiwara M, et al, Proc Natl Acad Sci USA 109.12538-12543, 2012. Specifically, human iPS cells were seeded on a matrigel-coated plate, and RPMI 1640 medium supplemented with 1 ⁇ B27 supplement, 100 ng / ml activin A, 10 ⁇ M Y-27632 and 1 ⁇ M CHIR99021 was added.
  • Y-27632 was removed from the previous medium, and the medium was replaced with a culture solution containing 0.5 mM NaB.
  • day 1 On the next day (Day 1), Y-27632 was removed from the previous medium, and the medium was replaced with a culture solution containing 0.5 mM NaB.
  • day 5 On day 5, add 20% knockout serum replacement (KSR), 1 mM L-glutamine, 1% nonessential amino acids, 0.1 mM 2-mercaptoethanol, 1% DMSO, 10 ng / ml FGF and 20 ng / ml BMP4 The knockout DMEM was replaced and cultured for 6 days.
  • KSR knockout serum replacement
  • hepatocyte culture medium (Lonza) supplemented with 20 ng / ml hepatocyte growth factor (HGF) and 20 ng / ml oncostatin M (OSM), and further cultured for 7 days to obtain hepatocytes .
  • HGF hepatocyte growth factor
  • OSM oncostatin M
  • ⁇ Result> To isolate hepatocytes, microarray analysis was performed using primary hepatocytes, and the top 5 miRNAs specifically expressed in hepatocytes (hsa-miR-122-3p, hsa-miR-122-5p, hsa-miR) -192-5p, hsa-miR-194-5p and hsa-miR-215) were found (FIG. 4A). When these miRNA switches were prepared by the method of Example 1 and introduced into hepatocytes induced to differentiate from human iPS cells together with EGFP mRNA as a control, cells were successfully separated by miR-122-5p miRNA switch. (FIG. 4B).
  • Isolation of insulin producing cells ⁇ Insulin producing cell induction method>
  • a human iPS cell the 585A1 strain described in Okita K, et al, Stem Cells 31, 458-66, 2012 was used.
  • Induction of human iPS cells into insulin-producing cells is performed by the method described in Kunisada Y, et al, Stem Cell Res. 8: 274-284, 2012 and Nakagawa, M, et al, Sci Rep 4, 3594, 2014. It was. That is, the cells were cultured for 1 day in RPMI 1640 medium supplemented with 1 ⁇ B27 supplement, 10 ⁇ M Y-27632 and 3 ⁇ M CHIR99021.
  • the medium was changed to RPMI 1640 medium containing 1 ⁇ B27 supplement, 100 ng / ml activin A and 1 ⁇ M CHIR99021, and cultured for 3 days. Subsequently, the medium was changed to an Improved MEM Zinc Option medium supplemented with 0.5 ⁇ B27 supplement, 1 ⁇ M dorsomorphin, 2 ⁇ M retinoic acid and 10 ⁇ M SB431542, and cultured for 6 days.
  • the medium was changed to Improved MEM Zinc Option medium supplemented with 0.5 ⁇ B27 supplement, 10 ⁇ M forskolin, 10 ⁇ M dexamethasone, 5 ⁇ M Alk5 inhibitor II and 10 mM nicotinamide, and cultured for 8 days.

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Abstract

本発明は、内皮細胞、肝細胞またはインスリン産生細胞などの組織細胞の純度を高める方法を提供することを目的とする。本発明は、内皮細胞、肝細胞またはインスリン産生細胞に特異的に発現するmiRNAに認識される核酸配列を含むmRNAを細胞群に導入する工程を含む方法を提供することにより上記課題を解決する。

Description

組織細胞の選別方法
　本発明は、組織細胞の選別方法、特に、内皮細胞、肝細胞およびインスリン産生細胞の選別方法に関する。
　多能性幹細胞を利用した細胞移植療法に注目が置かれており、各組織細胞の誘導方法が報告されているが（非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３）、全ての細胞が所望の細胞へと誘導されることはなく、通常、他の細胞種が同時に含有される。このような細胞群を移植用細胞として用いるためには、ソーティング等により所望の細胞の純度を高める必要がある。
　現在、所望の細胞に対する表面マーカーを用いて細胞を選別する方法が行われているが、全ての組織細胞において、特異的な表面マーカーは認識されていない。
Kajiwara M, et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 109:12538-12543, 2012 Kunisada Y, et al, Stem Cell Res. 8:274-284, 2012 Nakagawa, M, et al, Sci Rep 4, 3594, 2014
　上記従来技術に鑑みて、組織細胞の純度を高めるためには別の観点から新たな選別方法が望まれている。すなわち、本発明の課題は、各組織細胞の選別するための指標を提供することにある。
　本発明者らは上記の課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、miRNA応答性mRNAを用いることにより、内皮細胞、肝細胞またはインスリン産生細胞などの組織細胞を高純度で精製できることを見出した。具体的には、各組織細胞群に特異的に発現するmiRNAをマイクロアレイ解析により見出した。続いて、これらのmiRNAの標的配列およびマーカー遺伝子を有するmRNA（miRNAスイッチ）を作製して、選別の対象となる細胞へ当該mRNAを導入したところ、細胞群の中において反応の異なる細胞が存在することを見出した、これらの細胞を抽出したところ、純度の高い目的の組織細胞であることを確認し、所望の組織細胞を選別する方法を見出した。本発明はそのような知見に基づいて完成されたものである。
　すなわち、本発明は次に記載の事項を提供するものである。
［１］miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程を含む、内皮細胞の選別方法であって、当該miRNA応答性mRNAが下記：
　(i) miR-126-3PまたはmiR-126-5Pによって特異的に認識される核酸配列、および
　(ii) 第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸配列
を含む、方法。
［２］miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程を含む、肝細胞の選別方法であって、当該miRNA応答性mRNAが下記：
　(i) miR-122-5Pによって特異的に認識される核酸配列、および
　(ii) 第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸配列
を含む、方法。
［３］miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程を含む、インスリン産生細胞の選別方法であって、当該miRNA応答性mRNAが下記：
　(i) miR-375によって特異的に認識される核酸配列、および
　(ii) 第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸配列
を含む、方法。
［４］前記miRNA応答性mRNAが、(i)および(ii)を5'から3'の方向に連結されている核酸配列を含む、［１］から［３］のいずれか1項に記載の方法。
［５］前記(ii)の第一のマーカー遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子および自殺遺伝子からなる群から選択される１またはそれ以上の遺伝子である、［１］から［４］のいずれか１項に記載の方法。
［６］前記蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、青色蛍光タンパク質（BFP）をコードする遺伝子である、［５］に記載の方法。
［７］前記アポトーシス誘導遺伝子が、Bimタンパク質をコードする遺伝子である、［５］に記載の方法。
［８］前記第一のマーカー遺伝子の翻訳量が少ない細胞を目的の細胞として選別する、［１］から［７］のいずれか１項に記載の方法。
［９］第二のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸を含む配列からなるmRNAを前記細胞群に導入する工程をさらに含み、当該第二のマーカー遺伝子が翻訳されている細胞を目的の細胞としてさらに選別する方法であって、当該第二のマーカー遺伝子が、第一のマーカー遺伝子とは異なる蛍光タンパク質または薬剤耐性遺伝子である、［１］から［８］のいずれか１項に記載の方法。
［１０］前記細胞群が、多能性幹細胞から分化誘導させた細胞群である、［１］から［９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１］内皮細胞の製造方法であって、下記：
(a) 多能性幹細胞から内皮細胞を含む細胞群を製造する工程、
(b) (i) miR-126-3PまたはmiR-126-5Pによって特異的に認識される核酸、および(ii) 第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸を含む配列からなるmiRNA応答性mRNAを前記工程（a）の細胞群に導入する工程、および
(c) 前記工程(ｂ)の第一のマーカー遺伝子の翻訳量が少ない細胞を選択する工程、
を含む、方法。
［１２］肝細胞の製造方法であって、下記：
(a) 多能性幹細胞から肝細胞を含む細胞群を製造する工程、
(b) (i) miR-122-5Pによって特異的に認識される核酸、および(ii) 第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸を含む配列からなるmiRNA応答性mRNAを前記工程（a）の細胞群に導入する工程、および
(c) 前記工程(ｂ)の第一のマーカー遺伝子の翻訳量が少ない細胞を選択する工程、
を含む、方法。
［１３］インスリン産生細胞の製造方法であって、下記：
(a) 多能性幹細胞からインスリン産生細胞を含む細胞群を製造する工程、
(b) (i) miR-375によって特異的に認識される核酸、および(ii) 第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸を含む配列からなるmiRNA応答性mRNAを前記工程（a）の細胞群に導入する工程、および
(c) 前記工程(ｂ)の第一のマーカー遺伝子の翻訳量が少ない細胞を選択する工程、
を含む、方法。
［１４］前記miRNA応答性mRNAが、(i)および(ii)を5'から3'の方向に連結されている核酸配列を含む、［１１］から［１３］のいずれか1項に記載の方法。
［１５］前記(ii)の第一のマーカー遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子および自殺遺伝子からなる群から選択される１またはそれ以上の遺伝子である、［１１］から［１４］のいずれか１項に記載の方法。
［１６］第二のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸を含む配列からなるmRNAを前記細胞群に導入する工程をさらに含み、当該第二のマーカー遺伝子が翻訳されている細胞を目的の細胞としてさらに選別する方法であって、当該第二のマーカー遺伝子が、第一のマーカー遺伝子とは異なる蛍光タンパク質または薬剤耐性遺伝子である、［１１］から［１５］のいずれか１項に記載の方法。
　本発明に示す方法により内皮細胞、肝細胞またはインスリン産生細胞などの組織細胞を容易に選別し、高純度にまで純化することができる。本発明の方法により細胞群に導入されたmRNAは一過的にのみ細胞内に存在するため、ゲノム中に組み込まれることなく、安全に標的細胞を選別することが可能である。また、本発明に示す方法により細胞を固定化することなく、生きた細胞を細胞内の活性化状態にあるmiRNAの発現量に基づいて選別することが可能である。さらには、本発明の方法により純化された細胞を移植治療の目的で使用することが可能となる。
図１Aは、HUVECと平滑筋細胞（AoSMC）（左図）または心筋細胞（MYH6-EIP4 d20 CMs）（右図）においてmiRNAの発現量をマイクロアレイで比較した結果を示す。下図は、解析結果のベン図を示す。図１Bは、各miRNAスイッチ（miR-208、miR-10b-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-196b-5およびmiR-216a5p）またはBFPをEGFPと共にHUVECsへ導入後のフローサイトメトリー解析の結果を示す。 図２Aは、各miRNAスイッチ（miR-208、miR-10b-5p、miR-126-3p、miR-126-5p、miR-196b-5およびmiR-216a5p）をEGFPと共にiPS細胞から分化誘導した内皮細胞を含む心筋細胞群へ導入後のフローサイトメトリー解析の結果、および上図のゲートで示された細胞を抽出し、CD31抗体で染色した結果を示す。negative fractionは、上図のゲート以外の細胞を抽出し、CD31抗体で染色した結果を示す。図２Bは、iPS細胞（201B7、409B2および606A1）およびES細胞（KhES1）から誘導した内皮細胞を含む心筋細胞群を各miRNAスイッチ（miR-208、miR-126-3p、およびmiR-126-5p）を用いて分離した細胞におけるCD31陽性細胞の含有率を示したグラフである。図２Cは、HUVECまたはmiR-126-5p miRNAスイッチを用いて分離した細胞をチューブ形成試験した結果を示す。 図３Aは、標的配列を2つ有するmiRNAスイッチの模式図を示す。図３Bは、iPS細胞から誘導した心筋細胞及び内皮細胞を各miRNAスイッチ（miR-126-3p+miR-208、miR-126-5p+miR-208、miR-208+miR-126-3p、miR-208+miR-126-5pおよびmiR-208））を用いて分離した細胞におけるCD31またはcTnTの陽性細胞の含有率をフローサイトメトリー解析した結果を示す。図３Cは、iPS細胞（201B7および409B2）およびES細胞（KhES1）から誘導した心筋細胞及び内皮細胞を各miRNAスイッチ（miR-126-3p+miR-208、miR-126-5p+miR-208、miR-208+miR-126-3p、miR-208+miR-126-5pおよびmiR-208））を用いて分離した細胞におけるCD31またはcTnT陽性細胞の含有率を示したグラフである。 図４Aは、初代肝細胞（Hepatocyte）と線維芽細胞（NHDF）においてmiRNAの発現量をマイクロアレイで比較した結果を示す。図４Bは、各miRNAスイッチ（コントロール、miR-122-3p、miR-122-5p、miR-192-5p、miR-194-5pおよびmiR-215）をEGFPと共にiPS細胞から分化誘導した肝細胞群へ導入後のフローサイトメトリー解析の結果を示す。 図５Aは、miR-122-5p miRNAスイッチをEGFPと共にiPS細胞から分化誘導した肝細胞群へ導入後のフローサイトメトリー解析の結果、および左図のゲートで示された細胞を抽出し、ALUBUMINまたはHNF4Aに対する抗体で染色しフローサイトメトリー解析した結果を示す。図５Bは、iPS細胞から分化誘導した肝細胞群をmiR-122-5p miRNAスイッチを用いて分離した細胞、miR-122-5p miRNAスイッチを用いて分離した以外の細胞（negative fraction）およびiPS細胞から分化誘導した肝細胞群（w/o sort）におけるALUBUMINまたはHNF4A陽性細胞の含有率を示したグラフである。図５Cは、iPS細胞から分化誘導した肝細胞群をmiR-122-5p miRNAスイッチを用いて分離した細胞、miR-122-5p miRNAスイッチを用いて分離した以外の細胞（negative fraction）およびiPS細胞から分化誘導した肝細胞群（w/o sort）をALUBUMINに対する抗体を用いて免疫染色を行った結果を示す。 図６Aは、miR-375 miRNAスイッチをEGFPと共にiPS細胞から分化誘導したインスリン産生細胞群へ導入後のフローサイトメトリー解析の結果を示す。図６Bは、iPS細胞から分化誘導したインスリン産生細胞群をmiR-375 miRNAスイッチを用いて分離した細胞、miR-375 miRNAスイッチを用いて分離した以外の細胞（negative fraction）およびiPS細胞から分化誘導したインスリン産生細胞群（w/o sort）におけるINSULIN陽性細胞の含有率を示したグラフである。図６Cは、iPS細胞から分化誘導したインスリン産生細胞群をmiR-375 miRNAスイッチを用いて分離した細胞、miR-375 miRNAスイッチを用いて分離した以外の細胞（negative fraction）およびiPS細胞から分化誘導したインスリン産生細胞群（w/o sort）をINSULINに対する抗体を用いて免疫染色を行った結果を示す。
　以下に本発明を、実施態様を示して詳細に説明する。しかしながら、本発明は以下の実施態様に限定されるものではない。
miRNA応答性mRNA
　本発明において、miRNA応答性mRNAは、単にmiRNAスイッチとも言うが、以下の(i)および(ii)の核酸配列を含むmRNAを意味する：
(i) miRNAによって特異的に認識される核酸配列、および(ii) 第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸配列。当該(i)miRNAによって特異的に認識される核酸配列と(ii) 第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸配列は、機能的に連結されている。
　本発明における「miRNA」とは、mRNAからタンパク質への翻訳の阻害やmRNAの分解を通して、遺伝子の発現調節に関与する、細胞内に存在する短鎖（20-25塩基）のノンコーディングRNAである。このmiRNAは、miRNAとその相補鎖を含むヘアピンループ構造を取ることが可能な一本差のpri-miRNAとして転写され、核内にあるDroshaと呼ばれる酵素により一部が切断されpre-miRNAとなって核外に輸送された後、さらにDicerによって切断されて機能する。
　(i)のmiRNAとは、選別すべき所望の細胞に特異的に発現しているmiRNAを適宜選択することができる。所望の細胞とは、後述する内皮細胞、肝細胞またはインスリン産生細胞などが例示される。特異的に発現しているmiRNAとは、他の細胞と比較して所望の細胞において、10％以上、20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上あるいはそれ以上の割合で高く発現しているmiRNAが例示される。このようなmiRNAは、データベースの情報（例えば、http://www.mirbase.org/又はhttp://www.microrna.org/）に登録されたmiRNA、及び／または当該データベースに記載されている文献情報に記載されたmiRNAより適宜選択することができる。例えば、表１に記載されたmiRNAが挙げられるが、これらには限定されない。
　表１． miRNAおよびその配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
　本発明において、miRNAによって特異的に認識される核酸配列は、例えば、当該miRNAに完全に相補的な配列であることが好ましい。あるいは、当該miRNAにおいて認識され得る限り、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していても良い。当該miRNAに完全に相補的な配列からの不一致は、所望の細胞において、通常にmiRNAが認識し得る不一致であれば良く、生体内における細胞内の本来の機能では、４０～５０％ 程度の不一致があっても良い。このような不一致は、特に限定されないが、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、若しくは１０塩基又は全認識配列の１％、５％、１０％、２０％、３０％、若しくは４０％の不一致が例示される。また、特には、細胞が備えているmRNA 上のmiRNA標的配列のように、特に、シード領域以外の部分に、すなわち miRNA の 3’ 側 16 塩基程度に対応する、標的配列内の 5’ 側の領域に、多数の不一致を含んでもよく、シード領域の部分は、不一致を含まないか、１塩基、２塩基、若しくは３塩基の不一致を含んでもよい。このような配列は、ＲＩＳＣが特異的に結合する塩基数を含む塩基長であればよく、長さは別段限定されないが、好ましくは、１８塩基以上、２４塩基未満の配列、より好ましくは、２０塩基以上、２２塩基未満の配列である。本発明において、miRNAによって特異的に認識される核酸配列は、所望の細胞および他の細胞へ当該配列を有するmiRNA応答性mRNAを導入し、所望の細胞においてのみ対応するマーカー遺伝子の発現が抑制されることを確認することによって、適宜決定して用いることができる。例えば、miR-126-3P、miR-126-5P、miR-122-5PおよびmiR-375によって特異的に認識される核酸配列は、表２に記載された標的配列が挙げられるが、これらには限定されない。
　表２． miRNAおよびその標的配列
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　本発明において使用される前記(ii)の「マーカー遺伝子」とは、細胞内で翻訳されて、マーカーとして機能し、細胞の選別を可能にする任意のタンパク質をコードする遺伝子である。細胞内で翻訳されてマーカーとして機能しうるタンパク質としては、一例としては、蛍光、発光、呈色、若しくは蛍光、蛍光タンパク質などの蛍光、発光又は呈色を補助することなどにより、視覚化し、定量化することができるタンパク質をコードする遺伝子、膜タンパク質、または、アポトーシス誘導遺伝子、自殺遺伝子などの、発現することで細胞を死滅させるタンパク質をコードする遺伝子を含むが、これらに限定されない。アポトーシス誘導遺伝子と組み合わせて、アポトーシス抑制遺伝子をマーカー遺伝子として用いることもできる。本明細書において、当該マーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸を含むmRNAより翻訳されたタンパク質を、マーカータンパク質と指称する。本発明において、「第一の」とは、２種類のマーカー遺伝子を用いる場合において、区別させるための用語であり、特段にマーカー遺伝子を限定するものではない。
　本発明において、蛍光タンパク質としては、Sirius、BFP、EBFPなどの青色蛍光タンパク質；mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFPなどのシアン蛍光タンパク質；TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green (例えば、hmAG1)、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPerなどの緑色蛍光タンパク質；TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBananaなどの黄色蛍光タンパク質；KusabiraOrange (例えば、hmKO2)、mOrangeなどの橙色蛍光タンパク質；TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberryなどの赤色蛍光タンパク質；TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed（例えば、hdKeimaRed）、mRasberry、mPlumなどの近赤外蛍光タンパク質が挙げられるが、これらには限定されない。
　本発明において、発光タンパク質としては、イクオリンを例示することができるが、これに限定されない。また、蛍光、発光又は呈色を補助するタンパク質として、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、βラクタマーゼなどの蛍光、発光又は呈色前駆物質を分解する酵素を例示することができるが、これらには限定されない。ここで本発明において、蛍光、発光又は呈色を補助する物質をマーカー遺伝子として使用する場合、目的とする細胞の選別において、対応する前駆物質と細胞群を接触させること、又は細胞群内に対応する前駆物質を導入することによって行われ得る。
　本発明において、アポトーシス誘導遺伝子とは、細胞に対してアポトーシス誘導活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を意味する。例えば、IκB、Smac/DIABLO、ICE、HtrA2/OMI、AIF、endonuclease G、Bax、Bak、Noxa、Hrk (harakiri)、Mtd、Bim、Bad、Bid、PUMA、activated caspase-3、Fas、Tk等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、好ましくは、Bimがアポトーシス誘導遺伝子として用いられる。
　本発明において自殺遺伝子とは、細胞におけるその発現がその細胞にとって致死的である遺伝子を意味する。本発明において、自殺遺伝子は、それ自体で細胞死をもたらすもの（例えば、ジフテリアＡ毒素）であってもよく、またはこの遺伝子の発現が、特定の薬物に対して細胞を感受性にするもの（例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子の発現により、抗ウィルス化合物に対して細胞を感受性にする）であってもよい。自殺遺伝子として、例えば、ジフテリアＡ毒素、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子（HSV-TK）、カルボキシペプチダーゼG2（CPG2）、カルボキシルエステラーゼ（CA）、シトシンデアミナーゼ（CD）、チトクロームP450（cyt-450）、デオキシシチジンキナーゼ（dCK）、ニトロレダクターゼ（NR）、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（PNP）、チミジンホスホリラーゼ（TP）、水痘帯状疱疹ウィルスチミジンキナーゼ（VZV-TK）、キサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（XGPRT）をコードする遺伝子等が挙げられるが、これらに限定されない。本発明において、好ましくは、HSV-TKが自殺遺伝子として用いられる。
　本発明において、上記マーカー遺伝子は、局在化シグナルをコードする遺伝子を備えていてもよい。局在化シグナルとしては、核局在化シグナル、細胞膜局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、タンパク質分泌シグナル等を挙げることができ、具体的には、古典的核移行配列（NLS）、Ｍ９配列、ミトコンドリア標的配列(MTS)、小胞体移行配列を挙げることができるが、これらには限定されない。このような局在化シグナルは、後述するイメージングサイトメトリー等で、目的の細胞を選別する工程を画像上で行うときに特に有利である。
　本発明において、miRNAによって特異的に認識される核酸配列と第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸配列が機能的に連結されるとは、マーカー遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ただし、開始コドンを含む。）の５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、及び／または当該オープンリーディングフレーム内に、少なくとも１つのmiRNAの標的配列を備えることを意味する。miRNA応答性mRNAは、好ましくは、５’末端から、５’から３’の向きに、Ｃａｐ構造（７メチルグアノシン５’リン酸）、マーカー遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム並びに、ポリＡテイルを備え、５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、及び／またはオープンリーディングフレーム内に少なくとも１つのmiRNAの標的配列を備える。mRNAにおけるmiRNAの標的配列の位置は、５’ＵＴＲであっても、３’ＵＴＲであってもよく、オープンリーディングフレーム内（開始コドンの３’側）であってもよく、これらのすべてにmiRNAの標的配列を備えていてもよい。したがって、miRNA標的配列の数は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つあるいはそれ以上であっても良い。
　好ましくは、miRNA応答性mRNAは、(i)および(ii)の核酸配列が、5'から3'の方向にこの順序で連結されている。このとき、ｃａｐ構造とmiRNAの標的配列との間の塩基数及び塩基の種類は、ステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよい。例えば、ｃａｐ構造とmiRNA標的配列との間の塩基数は、０～５０塩基、好ましくは、１０～３０塩基となるように設計することができる。また、miRNA標的配列と開始コドンとの間の塩基数及び塩基の種類は、ステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよく、miRNA標的配列と開始コドンと間の塩基数は、０～５０塩基、好ましくは、１０～３０塩基となるような配置にて設計することができる。
　本発明において、miRNA応答性mRNA 中のmiRNA標的配列内には、開始コドンとなるAUGが存在しないことが好ましい。例えば、miRNAの標的配列が５’ＵＴＲに存在し、かつ、当該標的配列内にAUGを含む場合には、３'側に連結されるマーカー遺伝子との関係上でインフレームとなるように設計されることが好ましい。あるいは、標的配列内にAUGを含む場合、標的配列内のAUGをGUGに変換して使用することも可能である。また、標的配列内のAUGの影響を最小限に留めるために、５’ＵＴＲ内における標的配列の配置場所を適宜変更することができる。例えば、ｃａｐ構造と標的配列内のAUG配列との間の塩基数が、０～６０塩基、例えば、０～１５塩基、１０～２０塩基、２０～３０塩基、３０～４０塩基、４０～５０塩基、５０～６０塩基となるような配置にて設計され得る。
　本発明において、miRNAの標的配列が５’ＵＴＲに存在する場合、例えば、下記のような配列が採用され得る。
　表３． miRNAおよびそれに対応するmiRNA応答性mRNA中の５’ＵＴＲの配列　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　本発明において、miRNAの標的配列が５’ＵＴＲに存在する場合、それに続くマーカー遺伝子の下流（すなわち、３’ＵＴＲ）は、例えば、下記の配列が採用され得る。この時、５’ＵＴＲと３’ＵＴＲの間に挟まれて配置されるマーカー遺伝子は、上記したような任意の遺伝子が使用され得る。
　表４．３’ＵＴＲの配列
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　本発明において、マーカー遺伝子として例えばBFPをコードする遺伝子が使用される場合、本発明におけるmiRNA応答性mRNAの全長は、例えば、下記の配列が採用され得る。
　表５． miRNAおよびそれに対応するmiRNA応答性mRNAの全長
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
miRNA応答性mRNAの導入
　本発明において、miRNA応答性mRNAを細胞に導入する方法として、DNAの形態またはmRNAの形態で導入することができる。
　miRNA応答性mRNAをDNAの形態で導入する場合、例えば、ウィルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウィルスベクターとしては、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウィルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウィルスベクター、センダイウィルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、miRNA応答性mRNAが発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。
　miRNA応答性mRNAがRNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell.7:618-630）。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。
　異なる２種以上のmiRNA応答性mRNAを導入する場合、あるいはmiRNA応答性mRNAと、後述するコントロールとなるmRNA（以下、コントロールmRNAとも指称する）とを用いる場合には、複数のmRNAを細胞群に共導入することが好ましい。共導入した２種以上のmRNAの細胞内での割合は個々の細胞で維持されるため、これらのmRNAから発現するタンパク質の活性比は、細胞集団内において一定となるためである。この時の導入量は、導入される細胞群、導入するmRNA、導入方法および導入試薬の種類により異なり、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。
　本発明において、コントロールmRNAとは、マーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸を含む配列または薬剤耐性遺伝子のコード領域に対応する核酸を含む配列からなるmRNAであって、miRNAの標的部位を有さないmRNAが例示される。コントロールmRNAは、好ましい態様においては、miRNA応答性mRNAとともに細胞群に導入されて、miRNA応答性mRNAが導入された細胞を確認し、識別するためのコントロールとして機能し得る。また、miRNA応答性mRNAからの蛍光や発光などの信号強度の定量化の際のコントロールとして機能し得る。コントロールmRNAの導入量もまた、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。
　本発明において使用される「薬剤耐性遺伝子」は、対応する薬剤に対して抵抗性を有するタンパク質を発現する遺伝子であれば何でもよい。例えば、抗生物質耐性遺伝子を含むが、これらに限定されない。抗生物質耐性遺伝子としては、例えば、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子、ブラストサイジン耐性遺伝子、ゲンタマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子等が挙げられる。本発明において、好ましくは、ピューロマイシン耐性遺伝子またはブラストサイジン耐性遺伝子が抗生物質耐性遺伝子として用いられる。
　本発明の一実施態様による選別方法において、より好ましくは、miRNA応答性mRNAとコントロールmRNAを同時に、標的細胞を含む細胞群へ導入する工程を含む。かかる工程は、好ましくは、miRNA応答性mRNAとコントロールmRNAとの共導入により実施することができる。コントロールmRNAを用いることで、miRNA応答性mRNAの細胞への導入効率が低い場合においても、miRNA応答性mRNAから翻訳されるマーカータンパク質が低いまたは翻訳されない細胞を目的の細胞として選別することが可能となる。
　本発明において、コントロールmRNAを用いる場合、当該コントロールmRNAに含まれるマーカー遺伝子は、miRNA応答性mRNAに含まれるマーカー遺伝子と異なることが好ましい。例えば、miRNA応答性mRNAに含まれるマーカー遺伝子がアポトーシス誘導遺伝子または自殺遺伝子である場合、コントロールmRNAに含まれるマーカー遺伝子は、蛍光タンパク質をコードする遺伝子であり得る。この場合、蛍光が確認される細胞を、例えばFACSを用いてソートすることにより、選択的に分離した後、アポトーシス誘導遺伝子または自殺遺伝子の発現が抑制された細胞を標的細胞として選別することにより、選別の精度向上を図ることができる。
　また、薬剤耐性遺伝子のコード領域に対応する核酸を含む配列からなるコントロールmRNAは、任意のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸を含む配列からなるmiRNA応答性mRNAとともに用いることができる。この場合、マーカー遺伝子の種類に関わらず、miRNA応答性mRNAが導入された細胞が選択的に薬剤耐性を有することになり、選別の精度向上を図ることができる。
　一方、miRNA応答性mRNAに含まれるマーカー遺伝子およびコントロールmRNAに含まれるマーカー遺伝子は、その両者に同種の遺伝子が用いられることもあり得る。例えば、miRNA応答性mRNAに含まれるマーカー遺伝子とコントロールmRNAに含まれるマーカー遺伝子の両者に蛍光タンパク質をコードする遺伝子が用いられることがあり得て、この場合には、両蛍光タンパク質の蛍光波長が異なることが望ましい。
　なお、蛍光タンパク質をコードする遺伝子に替えて、発光タンパク質あるいは、蛍光、発光又は呈色を補助するタンパク質をコードする遺伝子を同様の組み合わせで用いることも可能である。
　本発明におけるコントロールmRNAは、別段限定されることはないが、例えば、下記に示すmRNAなどが使用され得る。
　表６．コントロールmRNA
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
　本発明の一実施態様による選別方法によれば、miRNA応答性mRNAと、任意選択的にコントロールmRNAとを、細胞群に導入する工程を実施することで、標的細胞を含有しうる細胞群から標的細胞を選別可能な状態にすることができる。すなわち、標的細胞を含有しうる２種以上の細胞を含む細胞群の中から、所望の細胞について、他の細胞種と異なる検出可能な信号情報を提示した状態とすることができる。後述する製造方法によって、選別工程をさらに実施することで、標的細胞を選択的に分離することができるようになる。
内皮細胞の選別方法
　本発明において、内皮細胞とは、血管の内表面を構成する扁平で薄い細胞であるが、本発明では内皮前駆細胞と区別されない。本発明における内皮細胞は、培養を継続することで管構造を形成することができる細胞であってもよく、さらに好ましくは、アセチル化低密度リポタンパク質（ａｃ－ＬＤＬ）を取り込む能力がある細胞をいう。内皮細胞は、例えば、特に限定されないが、ＣＤ３１のようなマーカーが発現していることによって特徴づけられる。
　本発明において、内皮細胞を選別するために用いるmiRNA応答性mRNAに含まれるmiRNAによって特異的に認識される核酸配列は、miR-126-3PまたはmiR-126-5Pによって特異的に認識される核酸配列であることが好ましい。
　選別の対象となる細胞群は、内皮細胞を含有しうる任意の細胞であれば良い。例えば、多能性幹細胞から分化誘導させた細胞群であってもよく、生体内から取り出した細胞の集団であってもよいが、これらには限定されない。したがって、内皮細胞を含有するか否かが不明な細胞群にmiRNA応答性mRNAを導入することもあり得る。好ましい実施態様において、細胞群は、多能性幹細胞から分化誘導された細胞群であり得る。このような分化誘導は、内皮細胞へ特異的な誘導に限定されず、他の細胞種、例えば、心筋細胞を取得することを目的とした分化誘導も含有される。
　多能性幹細胞から内皮細胞を製造する方法として、例えば、Li et al., J. Cell Biochem., 106:194-199, 2009など既知の方法を適宜用いて行い得る。
肝細胞の選別方法
　本発明において、肝細胞とは、アルブミンのmRNAまたはHNF4Aを発現している細胞として定義される。本発明の別の態様においては、肝細胞はグリコーゲンの蓄積、低比重リポタンパク質（LDL）の取り込み、アルブミンの分泌、アンモニア代謝と尿素合成、シトクロムP450活性、脂質代謝、薬物代謝などの肝細胞の機能として公知の機能のいずれかひとつ、あるいは複数の組み合わせによって特徴づけられる細胞と定義してもよい。
　本発明において、肝細胞を選別するために用いるmiRNA応答性mRNAに含まれるmiRNAによって特異的に認識される核酸配列は、miR-122-5Pによって特異的に認識される核酸配列であることが好ましい。
　選別の対象となる細胞群は、肝細胞を含有しうる任意の細胞であれば良い。例えば、多能性幹細胞から分化誘導させた細胞群であってもよく、生体内から取り出した細胞の集団であってもよいが、これらには限定されない。したがって、肝細胞を含有するか否かが不明な細胞群にmiRNA応答性mRNAを導入することもあり得る。好ましい実施態様において、細胞群は、多能性幹細胞から分化誘導された細胞群であり得る。このような分化誘導は、肝細胞へ特異的な誘導に限定されない。
　多能性幹細胞から肝細胞を製造する方法として、例えば、WO2001/081549、Takayama K, et al, Stem Cell Reports. 1:322-335, 2013、Kajiwara M, et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 109: 12538-12543, 2012、Hay DC, et al, Stem Cells. 26: 894-902, 2008など既知の方法を適宜用いて行い得る。
インスリン産生細胞の選別方法
　本発明において、インスリン産生細胞とは、インスリンのmRNAを発現している細胞と定義される。
　本発明において、インスリン産生細胞細胞を選別するために用いるmiRNA応答性mRNAに含まれるmiRNAによって特異的に認識される核酸配列は、miR-375によって特異的に認識される核酸配列であることが好ましい。
　選別の対象となる細胞群は、インスリン産生細胞を含有しうる任意の細胞であれば良い。例えば、多能性幹細胞から分化誘導させた細胞群であってもよく、生体内から取り出した細胞の集団であってもよいが、これらには限定されない。したがって、インスリン産生細胞を含有するか否かが不明な細胞群にmiRNA応答性mRNAを導入することもあり得る。好ましい実施態様において、細胞群は、多能性幹細胞から分化誘導された細胞群であり得る。このような分化誘導は、インスリン産生細胞へ特異的な誘導に限定されない。
　多能性幹細胞からインスリン産生を誘導させる方法として、例えば、アクチビン（Ａｃｔｉｖｉｎ）やレチノイン酸（ＲＡ）を用いて分化誘導する方法などが例示される（特開２００９-２２５６６１号公報、E.Kroon et al.,Nature Biotechnology(2008)Vol.26,No．4:443-452、K.A.D’Amour et al.,Nature Biotechnology(2006)Vol.24,No.11:1392-1401、W.Jiang,Cell Research(2007)17:333-344、J.H.Shim et al.,Diabetologia(2007)50:1228-1238、R.Maehra et al.,PNAS(2009),vol.106,No.37:15768-15773）。さらに、多能性幹細胞へＰＤＸ１を導入して培養する方法（米国特許7534608号公報および特開2006-075022号公報）、低分子化合物を適宜組み合わせて多能性幹細胞に作用させてインスリン産生細胞を製造する方法（WO2011/081222およびKunisada Y et al.,Stem Cell Res.(2012) vol.8,No.2:274-284.）も例示される。
多能性幹細胞
　本発明において多能性幹細胞とは、生体に存在する多くの細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であり、本発明で使用される肝細胞に誘導される任意の細胞が包含される。多能性幹細胞には、特に限定されないが、例えば、胚性幹（ES）細胞、核移植により得られるクローン胚由来の胚性幹（ntES）細胞、精子幹細胞（「GS細胞」）、胚性生殖細胞（「EG細胞」）、人工多能性幹（iPS）細胞、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞（Muse細胞）などが含まれる。好ましい多能性幹細胞は、製造工程において胚、卵子等の破壊をしないで入手可能であるという観点から、iPS細胞であり、より好ましくはヒトiPS細胞である。
　(A) 胚性幹細胞
　胚性幹細胞（ES細胞）は、ヒトやマウスなどの哺乳動物の初期胚（例えば胚盤胞）の内部細胞塊から樹立された、多能性と自己複製による増殖能を有する幹細胞である。
　ES細胞は、受精卵の8細胞期、桑実胚後の胚である胚盤胞の内部細胞塊に由来する胚由来の幹細胞であり、成体を構成するあらゆる細胞に分化する能力、いわゆる分化多能性と、自己複製による増殖能とを有している。ES細胞は、マウスで1981年に発見され(M.J. Evans and M.H. Kaufman (1981), Nature 292:154-156)、その後、ヒト、サルなどの霊長類でもES細胞株が樹立された(J.A. Thomson et al. (1998), Science 282:1145-1147; J.A. Thomson et al. (1995), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:7844-7848;J.A. Thomson etal. (1996), Biol. Reprod., 55:254-259; J.A. Thomson and V.S. Marshall (1998), Curr. Top. Dev. Biol., 38:133-165)。
　ES細胞は、対象動物の受精卵の胚盤胞から内部細胞塊を取出し、内部細胞塊を線維芽細胞のフィーダー上で培養することによって樹立することができる。また、継代培養による細胞の維持は、白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor (LIF))、塩基性線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))などの物質を添加した培養液を用いて行うことができる。ヒトおよびサルのES細胞の樹立と維持の方法については、例えばUSP5,843,780; Thomson JA, et al. (1995), Proc Natl. Acad. Sci. U S A. 92:7844-7848；Thomson JA, et al. (1998), Science. 282:1145-1147； H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932；M. Ueno et al. (2006), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:9554-9559；H. Suemori et al. (2001), Dev. Dyn., 222:273-279;H. Kawasaki et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99:1580-1585；Klimanskaya I, et al. (2006), Nature. 444:481-485などに記載されている。
　ES細胞作製のための培養液として、例えば0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸、2mM L-グルタミン酸、20% KSRおよび4ng/ml bFGFを補充したDMEM/F-12培養液を使用し、37℃、5% CO2、湿潤雰囲気下でヒトES細胞を維持することができる(H. Suemori et al. (2006), Biochem. Biophys. Res. Commun., 345:926-932)。また、ES細胞は、3～4日おきに継代する必要があり、このとき、継代は、例えば1mM CaCl2および20% KSRを含有するPBS中の0.25% トリプシンおよび0.1mg/mlコラゲナーゼIVを用いて行うことができる。
　ES細胞の選択は、一般に、アルカリホスファターゼ、Oct-3/4、Nanogなどの遺伝子マーカーの発現を指標にしてReal-Time PCR法で行うことができる。特に、ヒトES細胞の選択では、OCT-3/4、NANOG、ECADなどの遺伝子マーカーの発現を指標とすることができる(E. Kroon et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26:443-452)。
　ヒトＥＳ細胞株は、例えばWA01(H1)およびWA09(H9)は、WiCell Reserch Instituteから、KhES-1、KhES-2およびKhES-3は、京都大学再生医科学研究所(京都、日本)から入手可能である。
　(B) 精子幹細胞
　精子幹細胞は、精巣由来の多能性幹細胞であり、精子形成のための起源となる細胞である。この細胞は、ES細胞と同様に、種々の系列の細胞に分化誘導可能であり、例えばマウス胚盤胞に移植するとキメラマウスを作出できるなどの性質をもつ(M. Kanatsu-Shinohara et al. (2003) Biol. Reprod., 69:612-616; K. Shinohara et al. (2004), Cell, 119:1001-1012)。神経膠細胞系由来神経栄養因子(glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF))を含む培養液で自己複製可能であるし、またES細胞と同様の培養条件下で継代を繰り返すことによって、精子幹細胞を得ることができる(竹林正則ら(2008),実験医学,26巻,5号(増刊),41～46頁,羊土社(東京、日本))。
　(C) 胚性生殖細胞
　胚性生殖細胞は、胎生期の始原生殖細胞から樹立される、ES細胞と同様な多能性をもつ細胞であり、LIF、bFGF、幹細胞因子(stem cell factor)などの物質の存在下で始原生殖細胞を培養することによって樹立しうる(Y. Matsui et al. (1992), Cell, 70:841-847; J.L. Resnick et al. (1992), Nature, 359:550-551)。
　(D) 人工多能性幹細胞
　人工多能性幹(iPS)細胞は、特定の初期化因子を、DNA、RNA又はタンパク質の形態で体細胞に導入することによって作製することができる、ES細胞とほぼ同等の特性、例えば分化多能性と自己複製による増殖能、を有する体細胞由来の人工の幹細胞である（K. Takahashi and S. Yamanaka (2006) Cell, 126:663-676; K. Takahashi et al. (2007), Cell, 131:861-872; J. Yu et al. (2007), Science, 318:1917-1920; Nakagawa, M.ら,Nat. Biotechnol. 26:101-106 (2008)；国際公開WO 2007/069666）。初期化因子は、ES細胞に特異的に発現している遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-cording RNAまたはES細胞の未分化維持に重要な役割を果たす遺伝子、その遺伝子産物もしくはnon-coding RNA、あるいは低分子化合物によって構成されてもよい。初期化因子に含まれる遺伝子として、例えば、Oct3/4、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Klf4、Klf2、c-Myc、N-Myc、L-Myc、Nanog、Lin28、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、beta-catenin、Lin28b、Sall1、Sall4、Esrrb、Nr5a2、Tbx3またはGlis1等が例示され、これらの初期化因子は、単独で用いても良く、組み合わせて用いても良い。初期化因子の組み合わせとしては、WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D, et al. (2008), Nat. Biotechnol., 26: 795-797、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 2: 525-528、Eminli S, et al. (2008), Stem Cells. 26:2467-2474、Huangfu D, et al. (2008), Nat Biotechnol. 26:1269-1275、Shi Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3, 568-574、Zhao Y, et al. (2008), Cell Stem Cell, 3:475-479、Marson A, (2008), Cell Stem Cell, 3, 132-135、Feng B, et al. (2009), Nat Cell Biol. 11:197-203、R.L. Judson et al., (2009), Nat. Biotech., 27:459-461、Lyssiotis CA, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:8912-8917、Kim JB, et al. (2009), Nature. 461:649-643、Ichida JK, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:491-503、Heng JC, et al. (2010), Cell Stem Cell. 6:167-74、Han J, et al. (2010), Nature. 463:1096-100、Mali P, et al. (2010), Stem Cells. 28:713-720、Maekawa M, et al. (2011), Nature. 474:225-9.に記載の組み合わせが例示される。
　上記初期化因子には、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤［例えば、バルプロ酸(VPA)、トリコスタチンA、酪酸ナトリウム、MC 1293、M344等の低分子阻害剤、HDACに対するsiRNAおよびshRNA（例、HDAC1 siRNA Smartpool（登録商標）(Millipore)、HuSH 29mershRNA Constructs against HDAC1 (OriGene)等）等の核酸性発現阻害剤など］、MEK阻害剤（例えば、PD184352、PD98059、U0126、SL327およびPD0325901）、Glycogen synthase kinase-3阻害剤（例えば、BioおよびCHIR99021）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5-azacytidine）、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、BIX-01294 等の低分子阻害剤、Suv39hl、Suv39h2、SetDBlおよびG9aに対するsiRNAおよびshRNA等の核酸性発現阻害剤など）、L-channel calcium agonist (例えばBayk8644)、酪酸、TGFβ阻害剤またはALK5阻害剤（例えば、LY364947、SB431542、616453およびA-83-01）、p53阻害剤（例えばp53に対するsiRNAおよびshRNA）、ARID3A阻害剤（例えば、ARID3Aに対するsiRNAおよびshRNA）、miR-291-3p、miR-294、miR-295およびmir-302などのmiRNA、Wnt Signaling（例えばsoluble Wnt3a）、神経ペプチドY、プロスタグランジン類（例えば、プロスタグランジンE2およびプロスタグランジンJ2）、hTERT、SV40LT、UTF1、IRX6、GLISl、PITX2、DMRTBl等の樹立効率を高めることを目的として用いられる因子も含まれており、本明細書においては、これらの樹立効率の改善目的にて用いられた因子についても初期化因子と別段の区別をしないものとする。
　初期化因子は、タンパク質の形態の場合、例えばリポフェクション、細胞膜透過性ペプチド（例えば、HIV由来のTATおよびポリアルギニン）との融合、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入してもよい。
　一方、DNAの形態の場合、例えば、ウィルス、プラスミド、人工染色体などのベクター、リポフェクション、リポソーム、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入することができる。ウィルスベクターとしては、レトロウィルスベクター、レンチウィルスベクター（以上、Cell, 126, pp.663-676, 2006; Cell, 131, pp.861-872, 2007; Science, 318, pp.1917-1920, 2007）、アデノウィルスベクター(Science, 322, 945-949, 2008)、アデノ随伴ウィルスベクター、センダイウィルスベクター（WO 2010/008054）などが例示される。また、人工染色体ベクターとしては、例えばヒト人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、細菌人工染色体(BAC、PAC)などが含まれる。プラスミドとしては、哺乳動物細胞用プラスミドを使用しうる(Science, 322:949-953, 2008)。ベクターには、核初期化物質が発現可能なように、プロモーター、エンハンサー、リボゾーム結合配列、ターミネーター、ポリアデニル化サイトなどの制御配列を含むことができるし、さらに、必要に応じて、薬剤耐性遺伝子(例えばカナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子など）、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリアトキシン遺伝子などの選択マーカー配列、緑色蛍光タンパク質(GFP)、βグルクロニダーゼ(GUS)、FLAGなどのレポーター遺伝子配列などを含むことができる。また、上記ベクターには、体細胞への導入後、初期化因子をコードする遺伝子もしくはプロモーターとそれに結合する初期化因子をコードする遺伝子を共に切除するために、それらの前後にLoxP配列を有してもよい。
　また、RNAの形態の場合、例えばリポフェクション、マイクロインジェクションなどの手法によって体細胞内に導入しても良く、分解を抑制するため、5-メチルシチジンおよびpseudouridine (TriLink Biotechnologies)を取り込ませたRNAを用いても良い（Warren L, (2010) Cell Stem Cell. 7:618-630）。
　iPS細胞誘導のための培養液としては、例えば、10～15％FBSを含有するDMEM、DMEM/F12又はDME培養液（これらの培養液にはさらに、LIF、penicillin/streptomycin、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）または市販の培養液[例えば、マウスES細胞培養用培養液(TX-WES培養液、トロンボＸ社)、霊長類ES細胞培養用培養液（霊長類ES/iPS細胞用培養液、リプロセル社）、無血清培地（mTeSR、Stemcell Technology社、Essential 8、Life Technologies社、StemFit、Ajinomoto社）]などが含まれる。
　培養法の例としては、たとえば、37℃、5％CO2存在下にて、10％FBS含有DMEM又はDMEM/F12培養液上で体細胞と初期化因子とを接触させ約4～7日間培養し、その後、細胞をフィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上にまきなおし、体細胞と初期化因子の接触から約10日後からbFGF含有霊長類ES細胞培養用培養液で培養し、該接触から約30～約45日又はそれ以上ののちにiPS様コロニーを生じさせることができる。
　あるいは、37℃、5% CO2存在下にて、フィーダー細胞(たとえば、マイトマイシンC処理STO細胞、SNL細胞等)上で10％FBS含有DMEM培養液（これにはさらに、LIF、ペニシリン/ストレプトマイシン、ピューロマイシン、L-グルタミン、非必須アミノ酸類、β-メルカプトエタノールなどを適宜含むことができる。）で培養し、約25～約30日又はそれ以上ののちにES様コロニーを生じさせることができる。望ましくは、フィーダー細胞の代わりに、初期化される体細胞そのものを用いる（Takahashi K, et al. (2009), PLoS One. 4:e8067またはWO2010/137746）、もしくは細胞外基質（例えば、Laminin-5（WO2009/123349）、マトリゲル（BD社）およびiMatrix511 (Nippi社) ）を用いる方法が例示される。
　この他にも、血清を含有しない培地を用いて培養する方法も例示される（Sun N, et al. (2009), Proc Natl Acad Sci U S A. 106:15720-15725）。さらに、樹立効率を上げるため、低酸素条件（0.1％以上、15％以下の酸素濃度）によりiPS細胞を樹立しても良い（Yoshida Y, et al. (2009), Cell Stem Cell. 5:237-241またはWO2010/013845）。
　上記培養の間には、培養開始2日目以降から毎日1回新鮮な培養液と培養液交換を行う。また、核初期化に使用する体細胞の細胞数は、限定されないが、培養ディッシュ100cm2あたり、約５×１０３～約５×１０６細胞の範囲である。
　iPS細胞は、形成したコロニーの形状により選択することが可能である。このほかにも、体細胞が初期化された場合に発現する遺伝子（例えば、 SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-2-54、TRA-1-60およびTRA-1-80）を指標として選択することができる。
　本明細書中で使用する「体細胞」なる用語は、卵子、卵母細胞、ES細胞などの生殖系列細胞または分化全能性細胞を除くあらゆる動物細胞（好ましくは、ヒトを含む哺乳動物細胞）をいう。体細胞には、非限定的に、胎児(仔)の体細胞、新生児(仔)の体細胞、および成熟した健全なもしくは疾患性の体細胞のいずれも包含されるし、また、初代培養細胞、継代細胞、および株化細胞のいずれも包含される。具体的には、体細胞は、例えば（1）神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）、（2）組織前駆細胞、（3）リンパ球、上皮細胞、内皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞（皮膚細胞等）、毛細胞、肝細胞、胃粘膜細胞、腸細胞、脾細胞、膵細胞(膵外分泌細胞等)、脳細胞、肺細胞、腎細胞および脂肪細胞等の分化した細胞などが例示される。
　また、iPS細胞を移植用細胞の材料として用いる場合、拒絶反応が起こらないという観点から、移植先の個体のHLA遺伝子型が同一もしくは実質的に同一である体細胞を用いることが望ましい。ここで、「実質的に同一」とは、移植した細胞に対して免疫抑制剤により免疫反応が抑制できる程度にHLA遺伝子型が一致していることであり、例えば、HLA-A、HLA-BおよびHLA-DRの3遺伝子座あるいはHLA-Cを加えた4遺伝子座が一致するHLA型を有する体細胞である。
　(E) 核移植により得られたクローン胚由来のES細胞
　核移植により得られたクローン胚由来のES細胞（nt ES細胞）は、核移植技術によって作製されたクローン胚由来のES細胞であり、受精卵由来のES細胞とほぼ同じ特性を有している（T. Wakayama et al. (2001), Science, 292:740-743; S. Wakayama et al. (2005), Biol. Reprod., 72:932-936; J. Byrne et al. (2007), Nature, 450:497-502）。すなわち、未受精卵の核を体細胞の核と置換することによって得られたクローン胚由来の胚盤胞の内部細胞塊から樹立されたES細胞がnt ES(nuclear transfer ES)細胞である。nt ES細胞の作製のためには、核移植技術（J.B. Cibelli et al. (1998), Nature Biotechnol., 16:642-646）とES細胞作製技術との組み合わせが利用される (若山清香ら (2008), 実験医学, 26巻, 5号 (増刊), 47～52頁) 。核移植においては、哺乳動物の除核した未受精卵に、体細胞の核を注入し、数時間培養することで初期化することができる。
　(F) Multilineage-differentiating Stress Enduring cells
　Multilineage-differentiating Stress Enduring cells （Muse細胞）は、WO2011/007900に記載された方法にて製造された多能性幹細胞であり、詳細には、線維芽細胞または骨髄間質細胞を長時間トリプシン処理、好ましくは8時間または16時間トリプシン処理した後、浮遊培養することで得られる多能性を有した細胞であり、SSEA-3およびCD105が陽性である。
　本発明よって選別された細胞は、医療用に投与することができる。従って、本発明の方法によって選別された細胞を含む治療剤を提供する。選別された細胞が、内皮細胞である場合、冠動脈疾患や下肢虚血疾患(バージャー病や閉塞性動脈硬化症など)を含む重症虚血性疾患患者の治療のために投与することができる。したがって、本発明では、上記の方法で選別された内皮細胞を含む血管再生剤を提供する。選別された細胞が、肝細胞である場合、肝硬変などの慢性肝不全、急性肝不全など肝不全の治療のために投与することができる。したがって、本発明では、上述した方法により得られた肝細胞を含む肝疾患治療剤を提供する。選別された細胞が、インスリン産生細胞である場合、糖尿病、特に１型糖尿病の治療のために投与することができる。したがって、本発明では、上述した方法により得られたインスリン産生細胞を含む糖尿病治療剤を提供する。投与される細胞数は治療において効果を発揮するような量であれば特に限定されるものではなく、患部の大きさや体躯の大きさに合わせて適宜増減して調製されてもよい。
miRNAスイッチの作製
＜PCR用プライマー＞
　表７に以下に用いるPCR用プライマーを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
＜鋳型プラスミドDNA＞
（a）pTAP-tagBFP
　pTagBFP-Tubulin (evrogen) を鋳型にして、プライマーとして、TagBFP_TfwdおよびTagBFP_Trevを用いて、PCR 法により断片を増幅した。得られた断片を、自作のクローニングベクターであるpGEM-TAP に挿入した。pGEM-TAPは、pGEM-Teasy (Promega) を鋳型にして、プライマーとして、pGEMTAP_MCS_RevおよびpGEMTAP_MCS_Fwdを用いて、PCR mutagenesisにより作製した。
（b）pCTp-EGFP
　pEGFP-N1 (Clontech) を鋳型にして、プライマーとして、YF128_EXFP_TfwdおよびYF129_EXFP_Trevを用いて、PCR 法により断片を増幅した。得られた断片を、自作のクローニングベクターであるpCM-TAPに挿入した。pCM-TAPは、上記pGEM-TAPのDraI 断片と pLysSRARE2 (Novagen) のNheI, AgeI 平滑末端化断片をライゲーションすることにより作製した。
＜蛍光タンパク質をコードする遺伝子に対応する核酸を含む配列の構築＞
（a）tagBFP
　KOD-Plus-Neo(KOD-401,TOYOBO)を用いて、製造者の指示に従って、表８の溶液を調整し、上記のpTAP-tagBFPを鋳型として、tagBFP fwdおよびTAP_IVTrevをプライマーとして用いてPCRによって増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
  
　増幅されたPCR産物をDpn Ｉ(TOYOBO)を用いて37°Cで30分処理した後、MiniElute PCR purification Kit (QIAGEN)を用いて、製造者の指示に従って精製を行った（tagBFP PCR産物と言う）。
（b）EGFP
　上記（a）と同様に、上記のpCTp-EGFPを鋳型として、TAPEGFP_IVTfwdおよびTAP_IVTrevをプライマーとして用いてPCRによって増幅した。より、PCR増幅を行い、PCR産物を精製した（EGFP PCR産物と言う）。
＜5’UTRおよび3’UTR配列の構築＞
（a）5’UTR
　KOD-Plus-Neo(KOD-401,TOYOBO)を用いて、製造者の指示に従って、表９の溶液を調整し、表１０に示すIVT_5prime_UTRを鋳型として、TAP_T7_G3C fwd primerおよびRev5UTR primerをプライマーとして用いてPCRによって増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
  
　増幅されたPCR産物を、MiniElute PCR purification Kit (QIAGEN)を用いて、製造者の指示に従って精製を行った（5'UTR PCR産物と言う）。
（b）3’UTR
　上記（a）と同様に、表１０に示すIVT_3prime_UTRを鋳型として、Fwd3UTR primerおよびRev3UTR2T20をプライマーとして用いてPCRによって増幅し、精製を行った（3'UTR PCR産物と言う）。
＜IVT_EGFPテンプレートの構築＞
　KOD-Plus-Neo(KOD-401,TOYOBO)を用いて、製造者の指示に従って、表１１の溶液を調整し、上記のEGFP PCR産物、5'UTR PCR産物および3'UTR PCR産物を鋳型として、TAP_T7_G3C fwd primerおよび3UTR120A rev primerをプライマーとして用いてPCRによって増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
  
　増幅されたPCR産物をDpn Ｉ(TOYOBO)を用いて37°Cで30分処理した後、MiniElute PCR purification Kit (QIAGEN)を用いて、製造者の指示に従って精製を行った。
＜miRNA応答性mRNAのIVT（in vitro transcription）テンプレートの構築＞
　miRNAスイッチのIVTテンプレートは、KOD-Plus-Neo(KOD-401,TOYOBO)を用いて、製造者の指示に従って、表１２に記載の溶液を調整し、上記のtagBFP PCR産物、各miRNA標的5'UTR oligo-DNAおよび上記の3'UTR PCR産物を鋳型として、T7FwdB primerおよび3UTR120A rev primerをプライマーとして用いてPCRによって増幅した。各miRNA標的5'UTR oligo-DNAは、表１３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
  
　増幅されたPCR産物をDpn I(TOYOBO)を用いて37°Cで30分処理した後、MiniElute PCR purification Kit (QIAGEN)を用いて、製造者の指示に従って精製を行った。
＜mRNAの合成及び生成＞
　Warren L, et al., Cell Stem Cell. 7(5):618-30 (2010) に記載のプロトコールを用いて、MEGAscript T7 kit (Ambion)により、上述した各IVTテンプレートを用いてmRNAを作製した。この反応において、ウリジン三リン酸及びシチジン三リン酸に替えて、シュードウリジン－5’－三リン酸及びメチルシチジン－5’－三リン酸(TriLink BioTechnologies)をそれぞれ用いた。IVT(mRNA合成)反応の前に、グアニジン－5’－三リン酸は、Anti Reverse cap Analog (New England Biolabs)で5倍希釈した。反応混合液を37°Cで5時間インキュベートして、TURBO DNase (Amibion)を加えた後、37°Cでさらに30分インキュベートした。得られたmRNAは、FavorPrep Blood ／ Cultured Cells total RNA extraction column (Favorgen Biotech)で精製し、Antarctic phosphatase (New England Biolabs)を用いて37C°で30分インキュベートした。その後、RNeasy Mini Elute Cleanup Kit (QIAGEN)により、さらに精製した。
内皮細胞の分離
＜HUVECsの培養＞
　ヒト臍帯血内皮細胞（HUVECs）は、ロンザ社から購入し(C2517A)、EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (Lonza)を用いて培養した。
＜マイクロアレイ解析＞
　miRNAの発現プロファイルは、 製造者プロトコールに従って、Agilent Technologies Human miRNA Microarray Release 19.0を用いて行った。データは、 GeneSpring GX 12.6 software (Agilent Technologies)を用いて解析した。
＜内皮細胞を含む心筋細胞の誘導法＞
　ヒトiPS細胞は、Takahashi K, et al. Cell. 131: 861-72, 2007に記載の201B7株、409B2（理研バイオリソースセンターより入手可能）または、Okita K, et al, Stem Cells 31, 458-66, 2012に記載の606A1を用いた。ヒトES細胞は、KhES1を京都大学より入手し用いた。ヒトiPS細胞またはES細胞をCTK solution（ReproCELL）で2分処理後、溶液を除去し、続いてAccumax（Innovative Cell Technologies）で5分処理後、ピペッティングによりシングルセルへと解離した。遠心分離により細胞を回収し、低接着6 wellディッシュ（Corning）へ移し、2mM L-Glutamine、150μg/mL Transferrin、50μg/mL Ascorbic Acid（sigma）、4×10-4M monothioglycerol (MTG)、0.5% penicillin/streptomycin (Invitrogen)、10 μM ROCK inhibitor (Y-27632)および2ng/mL BMP4（R&D）を添加した1.5 ml/well STEMPRO 34（Invitrogen）中、37℃、5%酸素条件下にて培養して、EBを形成させた（day0）。翌日（day1）、2mM L-Glutamine、150μg/mL Transferrin、50μg/mL Ascorbic Acid、4×10-4M MTG、0.5% penicillin/streptomycin、18ng/mL BMP4（最終濃度として10 ng/ml）、10ng/mL bFGF（最終濃度として5ng/ml）および12ng/mL Activin A（最終濃度として6 ng/ml）を添加したSTEMPRO34を等量、EBの培養を行っている6 wellプレート中に加え、37℃、5%酸素条件にて３日間培養した。誘導4日目に（day4）、得られたEBをIMDM（Invitrogen）にて洗浄し、2 mM L-glutamine、150μg/mL Transferrin、50μg/mL Ascorbic Acid、4×10-4M MTG、10ng/mL VEGFおよび1μM IWP-3（Stemgent）を添加したSTEMPRO 34をディッシュに加えて、37℃、5%酸素条件下で、４日間培養した。誘導8日目に（day8）、培地を、2 mM L-glutamine、150μg/mL Transferrin、50μg/mL Ascorbic Acid、4×10-4M MTG、0.5% penicillin/streptomycin、10ng/mL VEGFおよび5ng/mL bFGFを添加したSTEMPRO 34に交換し、4日間、37℃、5％酸素条件下で培養した。この時、2 日に1度同じ条件の培地に交換した。誘導12日目に（day12）、通常の酸素濃度のインキュベーターに移し、8日間培養した。この時、2 日に1度同じ条件の培地に交換した。
＜チューブ形成試験＞
　分離した内皮細胞は、2x105 cells/wellでMatrigel （BD）をコートした24-well plateに播種し、EGM-2 BulletKit medium中で培養した。翌日、Biorevo BZ-9000 microscopeを用いて観察をした。
＜結果＞
　内皮細胞を分離するため、ヒト臍帯血内皮細胞（HUVECs）を用いてマイクロアレイ解析を行い、内皮細胞で特異的に発現する上位５つのmiRNA（hsa-miR-10b-5p、hsa-miR-126-3p、hsa-miR-126-5p、hsa-miR-196b-5pおよびhsa-miR-216a-5p）を見出した（図１A）。これらのmiRNAに特異的に認識される配列とBFPを有するmiRNAスイッチ（以下、miR-** miRNAスイッチと言う。）を実施例１に記載の方法で作製し、対照となるEGFP mRNAとともにHUVECsへ導入したところ、miR-126-3p miRNAスイッチおよびmiR-126-5p miRNAスイッチによりHUVECsを分離することに成功した（図１B）。このときコントロールとして、BFP mRNAおよびEGFP mRNAをHUVECsへ導入した結果と比較し、分離できることを確認した。さらに、当該miRNAスイッチにより内皮細胞が分離できるかを確認するため、上述の方法で心筋細胞へ誘導し、誘導後の細胞に含有する内皮細胞が分離可能かについて検討を行った。その結果、心筋細胞誘導後の細胞群に、miR-126-3p miRNAスイッチおよびmiR-126-5p miRNAスイッチにより分離できる細胞が、5-10％程度含まれており、当該細胞は内皮細胞マーカーであるCD31が陽性であることが示された（図２Aおよび図２B）。一方、miR-208a miRNAスイッチではCD31陽性細胞の分離はできなかった。従って、miR-126-3p miRNAスイッチおよびmiR-126-5p miRNAスイッチによって、不均一な細胞群から内皮細胞を分離するために有用であることが示唆された。さらに、miR-126-5p miRNAスイッチで分離された細胞を、チューブ形成試験を行ったところ、血管新生能を有していることが確認された（図２C）。
　続いて、心筋細胞および内皮細胞へ特異的な2つのmiRNAに特異的に認識される配列を有するmiRNAスイッチを用いて、心筋細胞および内皮細胞を同時に分離できるかを検討した。すなわち、図３Aに記載のmiR-208aおよびmiR-126-3pまたはmiR-126-5pを有する４つの組み合わせのmiRNAスイッチを作製し、iPS細胞から心筋細胞を誘導した細胞群へ対照となるEGFP mRNAとともに導入し、BFPの蛍光強度CD31陽性細胞の含有率とcTnT陽性細胞の含有率を測定したところ、各マーカー陽性細胞を分離できることが示された（図３Bおよび図３C）。また、このとき、miR-126-5p+miR-208aの組み合わせを用いた場合、比較的BFPの蛍光強度の低下が強くみられることが確認された。
肝細胞の分離
＜肝細胞の培養＞
　ヒト初代肝細胞は、BioreclamationIVTより購入し、Torpedo Antibiotic Mix (BioreclamationIVT)を添加したInVitroGRO CP Medium (BioreclamationIVT)中で培養した。
＜肝細胞誘導法＞
　ヒトiPS細胞は、Takahashi K, et al. Cell. 131: 861-72, 2007に記載の201B6株を用いた。ヒトiPS細胞から肝細胞への誘導は、Kajiwara M, et al, Proc Natl Acad Sci U S A. 109:12538-12543, 2012に記載の方法を修正して行った。すなわち、ヒトiPS細胞をマトリゲルをコートしたプレートへ播種し、1× B27 supplement、100 ng/ml activin A、10 μM Y-27632および1 μM CHIR99021を添加したRPMI 1640 mediumを加えた。翌日（1日目）、先の培地からY-27632を除き、0.5 mM NaBを加えた培養液に交換した。5日目、培地を20% knockout serum replacement (KSR)、1 mM L-glutamine、1% nonessential amino acids、0.1 mM 2-mercaptoethanol、1% DMSO、10 ng/ml FGFおよび20 ng/ml BMP4を添加したknockout DMEMに交換し、6日間培養した。１１日目、培地を20 ng/ml hepatocyte growth factor (HGF)および20 ng/ml oncostatin M (OSM)を添加したhepatocyte culture medium (Lonza)へ交換し、さらに7日間培養し、肝細胞を得た。
＜結果＞
　肝細胞を分離するため、初代肝細胞を用いてマイクロアレイ解析を行い、肝細胞で特異的に発現する上位５つのmiRNA（hsa-miR-122-3p、hsa-miR-122-5p、hsa-miR-192-5p、hsa-miR-194-5pおよびhsa-miR-215）を見出した（図４A）。これらのmiRNAスイッチを実施例１の方法で作製し、対照となるEGFP mRNAとともにヒトiPS細胞から分化誘導した肝細胞へ導入したところ、miR-122-5p miRNAスイッチにより細胞を分離することに成功した（図４B）。当該分離された細胞について、ALBUMINおよびHNF4Aの発現を調べたところ、いずれも陽性である細胞が分離できることが示された（図５Aおよび図５B）。さらに、miR-122-5pを指標として分離した細胞は、免疫染色によりALBUMIN陽性細胞であることが確認された（図５C）。
インスリン産生細胞の分離
＜インスリン産生細胞誘導法＞
　ヒトiPS細胞は、Okita K, et al, Stem Cells 31, 458-66, 2012に記載の585A1株を用いた。ヒトiPS細胞からインスリン産生細胞への誘導は、Kunisada Y, et al, Stem Cell Res. 8:274-284, 2012およびNakagawa, M, et al, Sci Rep 4, 3594, 2014に記載の方法で行った。すなわち、1× B27 supplement, 10 μM Y-27632 and 3 μM CHIR99021を添加したRPMI 1640 medium中で1日培養した。翌日（1日目）、1× B27 supplement, 100 ng/ml activin A and 1 μM CHIR99021を含有するRPMI 1640 mediumへ培地交換し、3日間培養した。続いて、細胞を0.5× B27 supplement、1 μM dorsomorphin、2 μM retinoic acidおよび10 μM SB431542を添加したImproved MEM Zinc Option mediumへ培地を交換し、6日間培養した。さらに、0.5× B27 supplement、10 μM forskolin、10 μM dexamethasone、5 μM Alk5 inhibitor IIおよび10 mM nicotinamideを添加したImproved MEM Zinc Option mediumへ培地を交換し、8日間培養した。
＜結果＞
　インスリン産生細胞において、特異的に発現するmiRNAは、過去の報告（Francis, N., et al., Microrna 3, 54-63, 2014、Lahmy, R., et al, Mol Biol Rep 41, 2055-2066, 2014およびOzcan, S. Mol Endocrinol 28, 1922-1933, 2014）に従ってhas-miR-375を用いた。上記の方法で miR-375 miRNAスイッチを作製し、対照となるEGFP mRNAとともにヒトiPS細胞から分化誘導したインスリン産生細胞へ導入したところ、当該miRNAスイッチにより細胞を分離することに成功した（図６Aおよび図６B）。当該分離された細胞について、免疫染色によりINSULIN陽性細胞であることが確認された（図６C）。

Claims (16)

  1. 　miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程を含む、内皮細胞の選別方法であって、当該miRNA応答性mRNAが下記：
    　(i) miR-126-3PまたはmiR-126-5Pによって特異的に認識される核酸配列、および
    　(ii) 第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸配列
    を含む、方法。
  2. 　miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程を含む、肝細胞の選別方法であって、当該miRNA応答性mRNAが下記：
    　(i) miR-122-5Pによって特異的に認識される核酸配列、および
    　(ii) 第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸配列
    を含む、方法。
  3. 　miRNA応答性mRNAを細胞群に導入する工程を含む、インスリン産生細胞の選別方法であって、当該miRNA応答性mRNAが下記：
    　(i) miR-375によって特異的に認識される核酸配列、および
    　(ii) 第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸配列
    を含む、方法。
  4. 　前記miRNA応答性mRNAが、(i)および(ii)が5'から3'の方向に連結されている核酸配列を含む、請求項１から３のいずれか1項に記載の方法。
  5. 　前記(ii)の第一のマーカー遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子および自殺遺伝子からなる群から選択される１またはそれ以上の遺伝子である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 　前記蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、青色蛍光タンパク質（BFP）をコードする遺伝子である、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記アポトーシス誘導遺伝子が、Bimタンパク質をコードする遺伝子である、請求項５に記載の方法。
  8. 　前記第一のマーカー遺伝子の翻訳量が少ない細胞を目的の細胞として選別する、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 　第二のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸を含む配列からなるmRNAを前記細胞群に導入する工程をさらに含み、当該第二のマーカー遺伝子が翻訳されている細胞を目的の細胞としてさらに選別する方法であって、当該第二のマーカー遺伝子が、第一のマーカー遺伝子とは異なる蛍光タンパク質または薬剤耐性遺伝子である、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 　前記細胞群が、多能性幹細胞から分化誘導させた細胞群である、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
  11. 　内皮細胞の製造方法であって、下記：
    (a) 多能性幹細胞から内皮細胞を含む細胞群を製造する工程、
    (b) (i) miR-126-3PまたはmiR-126-5Pによって特異的に認識される核酸、および(ii) 第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸を含む配列からなるmiRNA応答性mRNAを前記工程（a）の細胞群に導入する工程、および
    (c) 前記工程(ｂ)の第一のマーカー遺伝子の翻訳量が少ない細胞を選択する工程、
    を含む、方法。
  12. 　肝細胞の製造方法であって、下記：
    (a) 多能性幹細胞から肝細胞を含む細胞群を製造する工程、
    (b) (i) miR-122-5Pによって特異的に認識される核酸、および(ii) 第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸を含む配列からなるmiRNA応答性mRNAを前記工程（a）の細胞群に導入する工程、および
    (c) 前記工程(ｂ)の第一のマーカー遺伝子の翻訳量が少ない細胞を選択する工程、
    を含む、方法。
  13. 　インスリン産生細胞の製造方法であって、下記：
    (a) 多能性
    幹細胞からインスリン産生細胞を含む細胞群を製造する工程、
    (b) (i) miR-375によって特異的に認識される核酸、および(ii) 第一のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸を含む配列からなるmiRNA応答性mRNAを前記工程（a）の細胞群に導入する工程、および
    (c) 前記工程(ｂ)の第一のマーカー遺伝子の翻訳量が少ない細胞を選択する工程、
    を含む、方法。
  14. 　前記miRNA応答性mRNAが、(i)および(ii)が5'から3'の方向に連結されている核酸配列を含む、請求項１１から１３のいずれか1項に記載の方法。
  15. 　前記(ii)の第一のマーカー遺伝子が、蛍光タンパク質をコードする遺伝子、アポトーシス誘導遺伝子および自殺遺伝子からなる群から選択される１またはそれ以上の遺伝子である、請求項１１から１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 　第二のマーカー遺伝子のコード領域に対応する核酸を含む配列からなるmRNAを前記細胞群に導入する工程をさらに含み、当該第二のマーカー遺伝子が翻訳されている細胞を目的の細胞としてさらに選別する方法であって、当該第二のマーカー遺伝子が、第一のマーカー遺伝子とは異なる蛍光タンパク質または薬剤耐性遺伝子である、請求項１１から１５のいずれか１項に記載の方法。
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