[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

WO2012077811A1 - ガレクチン９を分泌する細胞、その製造方法及びその用途 - Google Patents

ガレクチン９を分泌する細胞、その製造方法及びその用途 Download PDF

Info

Publication number
WO2012077811A1
WO2012077811A1 PCT/JP2011/078623 JP2011078623W WO2012077811A1 WO 2012077811 A1 WO2012077811 A1 WO 2012077811A1 JP 2011078623 W JP2011078623 W JP 2011078623W WO 2012077811 A1 WO2012077811 A1 WO 2012077811A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
galectin
cells
cell
cancer
disease
Prior art date
Application number
PCT/JP2011/078623
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
平島　光臣
敏朗 仁木
智博 有川
総一 大水
健 門脇
Original Assignee
株式会社ガルファーマ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 株式会社ガルファーマ filed Critical 株式会社ガルファーマ
Priority to US13/992,018 priority Critical patent/US20130323176A1/en
Priority to JP2012547938A priority patent/JPWO2012077811A1/ja
Priority to EP11847227.3A priority patent/EP2650361A4/en
Priority to KR1020137017492A priority patent/KR20130103587A/ko
Priority to CN2011800597695A priority patent/CN103314102A/zh
Priority to CA2820642A priority patent/CA2820642A1/en
Publication of WO2012077811A1 publication Critical patent/WO2012077811A1/ja
Priority to US14/499,736 priority patent/US9528089B2/en
Priority to US15/217,251 priority patent/US20170010282A1/en

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A61K38/1732—Lectins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4612—B-cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4613—Natural-killer cells [NK or NK-T]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4614—Monocytes; Macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4635—Cytokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46433—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4726—Lectins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0635—B lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • C12N5/0637—Immunosuppressive T lymphocytes, e.g. regulatory T cells or Treg
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0645—Macrophages, e.g. Kuepfer cells in the liver; Monocytes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5094—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for blood cell populations
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells
    • G01N33/56972—White blood cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/50—Cell markers; Cell surface determinants
    • C12N2501/59—Lectins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/415—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from plants
    • G01N2333/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4724—Lectins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants

Definitions

  • the present invention relates to a cell that secretes galectin 9, a production method thereof, and a use thereof.
  • the present invention relates to a CD4 T cell secreting Gal-9 and its application technology.
  • Galectin 9 (galectin 9; Gal-9) belongs to the galectin family and exhibits physiological activity by binding to ⁇ -galactoside of N- or O-glycan (Non-patent Document 1). Galectin 9 was discovered and identified as a T cell apoptosis-inducing factor (Non-patent document 2) and an eosinophil migration factor (Non-patent document 3), but since then, various activities have been reported. For T cells, galectin 9 binds to Tim-3, induces apoptosis of Tim-3 positive T H 1 cells, and suppresses autoimmune inflammation by converging excessive T H 1 responses (non- Patent Document 4).
  • T H 17 cells are considered to be one of the causes or exacerbations of various intractable diseases such as autoimmune diseases, allergies and cancers, and Tim-3 is also expressed in these cells (non-patent literature). 5-6). Galectin 9 administration decreases T H 17 cells, while increasing inflammation-suppressing Treg cells (Non-patent Document 7). At present, the involvement and mechanism of Tim-3 in this decrease in T H 17 cells is unknown.
  • Non-patent Document 8 Induction of cells (Non-Patent Documents 9 to 10), induction of plasmacytoid dendritic cells (Non-Patent Document 11), suppression of degranulation from mast cells (Non-Patent Document 12), and the like are known. Many reports so far focus on the excessive immunosuppressive action of galectin 9, but galectin 9 enhances immunity depending on the scene.
  • Galectin 9 binds to Tim-3 on monocytes and dendritic cells and activates these cells to promote inflammatory cytokine production (Non-patent Document 13). In addition, when galectin 9 and Tim-3 interact with each other in macrophages, immunity to eliminate Mycobacterium tuberculosis is enhanced (Non-patent Document 14). That is, galectin 9 can regulate immunity in both directions.
  • Galectin-9 suppresses the generation of Th17, promotes the induction of regulatory T cells, and regulates experimental autoimmune arthritis.
  • Eur J Immunol, 40, 548-558 (2010) Tsuboi, Y. et al. Galectin-9 protects mice from the Shwartzman reaction by attracting prostaglandin E2-producing polymorphonuclear leukocytes.
  • Galectin-9 is a high affinity IgE-binding lectin with anti-allergic effect by blocking IgE-antigen complex formation.
  • Galectin-9 trafficking regulates apical-basal polarity in Madin-Darby canine kidney epithelial cells.
  • Galectin-9 induces osteoblast differentiation through the CD44 / Smad signaling pathway.
  • Plasmodium vivax parasites alter the balance of myeloid and plasmacytoid dendritic cells and the induction of regulatory T cells.
  • galectin-9 administration exerts a therapeutic effect on collagen-induced arthritis in mice and suppresses the decrease of Tim-3 positive T cells and increase of Treg cells, and the production of inflammatory cytokines such as IFN- ⁇ and IL-17 (Non-patent document 7).
  • galectin-9 knockout mice are more sensitive to rheumatoid arthritis-induced stimuli and show an increase in Tim-3 positive CD4 T cells (T H 1 and T H 17) and a decrease in Treg cells compared to wild type. (Non-Patent Document 7).
  • galectin 9 is secreted as an endogenous immune regulator and regulates immune balance.
  • cells that secrete galectin 9 or regulate immunity in vivo have not yet been identified.
  • Tim-3 is the most researched target of galectin 9, but it is impossible to explain all of the various activities of galectin 9 with Tim-3.
  • CD44, integrin and IgE which are adhesion factors for activated lymphocytes, have been identified as targets for galectin-9, and allergic hyperimmunity suppression and cancer cell metastasis suppression occur through these targets.
  • Non-Patent Documents 12, 15 to 16 It is not difficult to predict that the number of targets will increase further as research progresses. Thus, it is a property common to many lectins to interact with multiple targets and exhibit various activities.
  • all of the above-mentioned targets of galectin 9 exist on the cell membrane, and it goes without saying that galectin 9 secreted outside the cell binds to these targets and exerts its function. .
  • galectin 9 has no signal peptide and is basically localized in the cytoplasm, and a role in the cytoplasm or nucleus has also been reported (Non-patent Documents 17 to 18).
  • Non-patent Documents 17 to 18 considering the above-mentioned target on the cell membrane and the action of galectin 9, at least a part of galectin 9 should be secreted.
  • the secretory mechanism is completely unknown, and because of the established cells, even in vivo. There is no evidence that similar secretion occurs from cells of the same lineage. Above all, the fact that cells expressing galectin 9 do not always secrete it makes it difficult to identify galectin 9-secreting cells.
  • Galectin 9 is an important immune regulator, and if its secretory cells can be identified, galectin 9 is considered useful as an index for knowing immune balance.
  • galectin 9 serves as a surrogate marker for determining the effects of diagnosis or treatment of various immune diseases. obtain. Furthermore, it can be used for cell therapy in combination with a technique for purifying the cells, and application to the treatment of intractable diseases such as autoimmune diseases, allergies and cancer is also envisaged.
  • galectin 9 has a variety of immunoregulatory activities, but details of its mechanism of action are unclear. In addition, cells that secrete galectin 9 or control immune responses in vivo have not been identified. Details of immune control by galectin 9, for example, the details of differentiation control of T H 17 and Treg cells, or galectin 9 such as cells that secrete galectin 9 or control immune reaction in vivo Identification of cells capable of expressing the physiological activity based on this is desired.
  • an object of the present invention is to provide a cell capable of expressing a physiological activity based on galectin 9, a method for producing the same, and a use thereof.
  • the cell of the present invention is a cell containing galectin 9, and is characterized in that the galectin 9 is expressed on the cell surface.
  • the first method for producing cells of the present invention is the method for producing cells of the present invention, wherein galectin 9 is expressed on the cell surface of at least some of the cells in the animal by administering galectin 9 to the animal. .
  • the second method for producing a cell of the present invention is a method for producing the cell of the present invention, wherein galectin 9 is expressed on the cell surface of the animal cell by culturing the animal cell in the presence of galectin 9. It is.
  • the medicament of the present invention is a medicament comprising at least one selected from the group consisting of the cells of the present invention, crushed materials and extracts thereof.
  • the diagnostic method of the present invention diagnoses the presence or absence of galectin-9 or a galectin-9-binding substance in a test cell using at least one selected from the group consisting of the cells of the present invention, crushed materials and extracts thereof. Is the method.
  • the method for treating a disease according to the present invention or the method for reducing a symptom derived from the disease includes a step of administering to the animal at least one selected from the group consisting of the cell of the present invention, a disrupted product thereof, and an extract thereof. It is a method for treating a disease of the animal or a method for reducing symptoms derived from the disease.
  • the immune control method of the present invention is an immune control method in which the cells of the present invention are administered to an animal to control the immunity of the animal.
  • the cell detection method of the present invention is a method for detecting the cell by detecting galectin 9 expressed on the cell surface of the cell of the present invention as a marker.
  • a method for diagnosing an animal disease or a symptom derived from the disease comprises: In an animal tissue containing or not containing the cell of the present invention, the method for detecting a cell of the animal or the disease comprising the step of qualitatively or quantitatively detecting the cell of the present invention by the cell detection method of the present invention. This is a method for diagnosing the symptom from which it originates.
  • the method for determining the therapeutic effect of an animal disease according to the present invention comprises: Treating the animal with the disease; Before and after the treatment, respectively, the step of diagnosing the disease or the symptom derived from the disease by the method of diagnosing the disease of the animal or the symptom derived from the disease according to the present invention; And comparing the diagnosis results before and after the treatment.
  • the cell in the animal tissue containing the cell of the present invention, the cell is detected by the cell detection method of the present invention, and the detected cell is used as another cell in the animal tissue.
  • This is a method for separating cells.
  • the horizontal axis represents the number of days that have elapsed since the first sensitization, and the vertical axis represents the rate of increase (%) in foot volume.
  • “Vehicle” represents the result of the control experiment using only the solvent (no administration of human stabilized galectin 9), and “non-arthritis” represents the measurement result of the rat not developing arthritis.
  • the horizontal axis represents elapsed time, and the vertical axis represents the human stabilized galectin 9 concentration in plasma. It is a figure which shows the galectin 9 effect
  • EAE mouth MOG induction experimental allergic encephalitis
  • the horizontal axis represents the elapsed time after immunization, and the vertical axis represents the clinical score.
  • CD4 + CD62L + naive T cells were prepared from spleen cells of wild-type mice (WT) and galectin 9 knockout mice (Gal-9 KO), and anti-CD28 antibody in a 96-well plate coated with anti-CD3 antibody Shows the result of culturing with addition of TGF- ⁇ 1, mouse IL-2 and mouse IL-6 and further inducing T H 17 cell differentiation (T H 17 skewed) It is a graph. More specifically, it shows the result of quantifying the IL-17A concentration in the culture supernatant after 96 hours of culture by ELISA.
  • T H 17 cell differentiation suppression by galectin 9 is a graph showing the results of examining whether depends on Tim3 / Gal-9 interaction.
  • a naive T cell was stimulated with T H 17 cell differentiation induction for 96 hours by the method shown in FIG. 3 (d), human stabilized galectin 9 (30 nM) was added for the indicated period, and IL-17A in the culture supernatant was added. The concentration is quantified by ELISA.
  • the horizontal axis represents the treatment time with galectin 9, and the vertical axis represents the IL-17A concentration.
  • (b) shows the results of quantifying IL-17F, IL-21, IL-22, and IL23R mRNA expression by real-time RT-PCR method by giving T H 17 cell differentiation-inducing stimulus in the presence of human stabilized galectin 9 for 24 hours It is a graph.
  • Flow of naive T cells cultured for 24 hours under T H 17 differentiation-inducing stimulus (T H 17 skewed) and when TGF- ⁇ 1 and IL-6 are removed from the same differentiation-inducing stimulus (No skewed) is a graph showing the results (right) subjected to CD4 + Tim-3 + analysis of cells (left) and Tim-3 by neutralizing human stabilized galectin 9 antibody presence T H 17 differentiation induction inhibition assay by cytometry .
  • T H 17 differentiation inducing suppression by galectin 9 is a graph showing the results of any was examined whether involving N- linked sugar chains and O- linked oligosaccharides.
  • the horizontal axis represents the concentration of lactose or sucrose, and the vertical axis represents the concentration of IL-17A.
  • the T H 17 differentiation induction assay of (a) was performed using the N-glycosylation inhibitor swainsonine (2 ⁇ g / ml) or the O-glycosylation inhibitor Benzyl N-acetyl- ⁇ -D-galactosaminide (Benzyl- It is a graph showing the result performed in ( ⁇ -GalNAc, 2 mM).
  • the horizontal axis represents the concentration of swainsonine or Benzyl- ⁇ -GalNAc, and the vertical axis represents the concentration of IL-17A.
  • FIG. 1 it is a graph which shows the result of having measured the effect of Gal-9 on T H 1, T H 2 and T H 17 cell differentiation.
  • Human stabilized galectin 9 (or control PBS) is added to an assay system that induces differentiation of naive T cells into T H 1, T H 2 or T H 17, and each differentiation is assigned to each T H subtype. It represents the result of quantification by specific mRNA expression. No skewed is for TCR stimulation only.
  • FIG. 1 is a graph showing a result of T H 17 / Treg balance by galectin 9 was examined whether dependent on IL-2.
  • FIG. 1 The result of measuring the ratio of CD4 + CD25 + cells in cells cultured under the induction of T H 17 differentiation by flow cytometry after adding human stabilized galectin 9 (or control PBS) to naive T cells.
  • FIG. (b) It is a figure showing the ratio of the CD4 + CD25 + Foxp3 + cell of said (a).
  • Human stabilized galectin 9 (control is PBS) and IL-2 at the indicated concentration are added to naive T cells, and cultured under conditions for inducing differentiation of T H 17 to determine the IL-17A concentration in the culture supernatant.
  • results quantified by ELISA (d) It is a graph which shows the result of having measured the ratio of the Treg cell (CD4 + CD25 + Foxp3 + cell) when culture
  • Human-stabilized galectin 9 (control is PBS) is added to naive T cells, cultured under conditions for inducing differentiation of T H 17 and further cultured in the presence of PMA, ionomycin and brefeldin A, and in CD4 positive cells It is a figure showing the result of having measured the ratio of IL-17 + Foxp3 - cell and IL-17 - Foxp3 + cell by flow cytometry.
  • T H 17 skewed naive T cells to conditions that induce differentiation into T H 17 (T H 17 skewed ; in addition to TCR stimulation IL-2, TGF- ⁇ 1 and IL-6 stimulation) or from minus the IL-6 (TGF - ⁇ 1 alone), or a TGF- ⁇ 1-excluded (IL-6 alone) or TCR-stimulated only (No skewed) condition after culturing galectin 9 in the supernatant after culturing.
  • naive T cells prepared from mouse spleen cells (left), the cell surface galectin-9-positive (T H GAL9 cells: Gal-9 + T H) and negative (non-T H GAL9: Gal -9 - T H ) (Middle side), and galectin 9 secreted into the culture supernatant after stimulation with TCR was quantified by ELISA (right side).
  • (b) shows the results of examining the expression of cytokine mRNA in the cells by real-time RT-PCR.
  • (E) shows the results of co-culture of (c) above in the presence of IL-10 neutralizing antibody or TGF- ⁇ neutralizing antibody.
  • (F) shows results of stimulating naive T cells in the presence of IL-10 or human stabilized galectin 9 and inducing differentiation of T H 17 and quantifying the IL-17A concentration in the culture supernatant by ELISA.
  • a graph showing the results of examining the production of galectin 9, IL-10 and TGF-.beta.1 from CD25 + T H GAL9.
  • (C) shows the results of investigating the appearance of T H GAL9 cells by flow cytometry after adding IL-10 or human stabilized galectin 9 to naive CD4 T cells and culturing under TCR stimulation.
  • FIG. 1 shows the results of having verified that T H GAL9 and Tr1 have high similarity.
  • (a) Naive CD4 + T cells were stained with cell surface galectin 9 and stained with antibodies of LAP, NKG2D, LAG-3, and CTLA-4, which were previously reported Tr1 cell markers, and examined by flow cytometry. Results are shown.
  • (b) Na ⁇ ve CD4 + T cells stimulated with TCR, CD25 positive T cell population was subjected to the same staining and Foxp3 staining as in (a), and the results of examination by flow cytometry are shown.
  • (C) shows the results of examining the expression of galectin 9, Tim-3 and CD25 on the cell surface by flow cytometry for the cells prepared in (b).
  • (d) shows the result of culturing naive CD4 + T cells under Tr1 cell differentiation stimulation by adding IL-27, further stimulating with PMA and ionomycin, and quantifying IL-10 in the culture supernatant by ELISA.
  • (e) shows the result of quantifying galectin 9 in the culture supernatant of (d) above by ELISA.
  • Results are shown.
  • Human CD4 + T cells are cultured under TCR stimulation or unstimulated, and galectin 9 and CD25 on the cell surface are stained and measured by flow cytometry.
  • Human CD4 + T cells were cultured under TCR stimulation, and then sorted into cell surface galectin 9 positive (CD25 + T H GAL9) and negative (CD25 + non-T H GAL9) by sorting. After further culturing, galectin 9 in the supernatant is quantified by ELISA, and the expression of each cytokine mRNA is measured by real-time RT-PCR.
  • C Survival rate when WT mice were treated with CLP and human stabilized galectin 9 (30 ⁇ g / mouse; or PBS as a control) was administered intravenously once 24 hours later.
  • D Survival rate when WT mice were treated with CLP and human subcutaneous galectin 9 (30 ⁇ g / mouse; or PBS as a control) was administered once subcutaneously 24 hours later.
  • the horizontal axis represents the number of days elapsed after CLP treatment
  • the vertical axis represents the survival rate.
  • it is a graph which shows the result of having investigated the change of the cytokine balance which arises by administering the human stabilization galectin 9 to a CLP mouse
  • the figure shows that WT mice were given a single intravenous dose of human stabilized galectin 9 (30 ⁇ g / mouse; or PBS as a control) simultaneously with CLP, and spleen cells taken 24 hours later were cultured for 24 hours.
  • the result of quantifying cytokine in the serum by ELISA is shown.
  • the vertical axis represents the cytokine concentration.
  • T H GAL9 cells are included in the CD3 + NK1.1 ⁇ Gal-9 + and CD3 + GL-3 ⁇ Gal-9 + fractions.
  • “Spleen cells from CLP mouse” in the figure means “spleen cells removed from CLP mice”.
  • the survival rate is increased.
  • Mouse fibrosarcoma Meth A was introduced into the abdominal cavity according to a previously reported method (Non-patent Document 32), and immediately after that, human stabilized galectin 9 was administered 3 times / week (30 ⁇ g / mouse).
  • MRL / MpJUmmCrj-1pr / 1pr mouse is a spontaneous autoimmune disease model widely used as a model of systemic lupus erythematosus.
  • Human stabilized galectin 9 was intraperitoneally administered to this mouse ( ⁇ , 8 weeks old) at the indicated dose 3 times / week up to 22 weeks of age, and hindlimb footpad edema volume measurement over time (once a week) Body weight measurement (three times a week) and urine protein concentration measurement (once a week) were performed. This figure shows the results of examining changes in urinary protein concentration (a) and changes in body weight (b).
  • SRBC sheep erythrocytes
  • IgM antibody production against sheep erythrocytes is remarkably induced, so this system is widely used for the purpose of examining the effects of drugs on antibody production.
  • SRBC was intraperitoneally administered to C57BL / 6J mice ( ⁇ ), and immediately thereafter, human stabilized galectin 9 (30 ⁇ g / mouse) or PBS as a control was administered intraperitoneally once.
  • blood was collected from 3-5 mice and splenectomy was performed to examine antibody production and B cells.
  • SRBC-specific IgM concentration (b) total IgM concentration, and (c) total IgG concentration were examined by specific ELISA.
  • D MRL / MpJUmmCrj-1pr / 1pr mice ( ⁇ , 8 weeks old) were administered 30 ⁇ g / mouse of human stabilized galectin 9 or PBS three times / week as a control, and blood was collected on the seventh day. The result of having measured the density
  • “Days after SRBC injection” means the number of days elapsed after intraperitoneal administration of SRBC.
  • the analysis method by the flow cytometry method of the Germinal center B cell contained in a spleen cell in an Example is shown. Spleen cells were stained with anti-CD19 antibody and anti-GL-7 antibody, and a CD19 + GL-7 + cell population was defined as a Germinal center B cell. It is known that Centrocyte and Centroblast composing Germinal center B cells have different cell sizes, and Centroblast is larger. Therefore, the Germinal center B cell population was expanded to FSC and SSC, and FSC correlated with the cell size was separated into two cell populations around 350 as a guide, and temporarily designated as Centrocyte and Centroblast, respectively. When each CXCR4 expression was examined, high expression was confirmed by Centroblast.
  • FIG. 23 An example of the analysis result by the flow cytometry method on the fourth day after SRBC administration is shown.
  • B Changes in the number of Germinal center B cells (GC B cell), Centroblast, and Centrocyte over time. “Day post immunization” means the number of days elapsed after immunization.
  • C Shows the number of Germinal center B cells (GC B cells), Centroblast, and Centrocytes on the fourth day after SRBC administration. Galectin 9 knockout mice (Gal-9 KO) were administered PBS after SRBC administration.
  • mice spleen cells before SRBC administration (Day 0) and 7 days after administration (Day 7) were stained with CXCR5 and ICOS, which are said to be markers for CD4 and TFH, and the expression of cell surface galectin 9 in each cell population was flowed.
  • CXCR5 and ICOS which are said to be markers for CD4 and TFH
  • cell surface galectin 9 in each cell population was flowed.
  • A An example of a dot plot in which CD4 positive cells are developed by CXCR4 and ICOS expression, and cell surface galectin 9 expression of each cell population divided into 4 by CXCR4 and ICOS expression are shown.
  • B Shows the time course of the percentage of each cell population.
  • C The results of examining whether the ratio of each CD4 positive cell is changed by administration of human stabilized galectin 9 are shown.
  • (D) shows the result that the cell surface galectin 9 positive ratio of each cell population increases after SRBC administration.
  • E The results show that the expression level (MFI) of cell surface galectin 9 in each cell population increases after SRBC administration.
  • “Days after SRBC injection” means the number of days elapsed after intraperitoneal administration of SRBC. It is a figure which illustrates typically the effect
  • Histograms in gray are isotype control, solid gray lines are stained macrophages differentiated with M-CSF, black solid lines are macrophages differentiated with M-CSF and galectin 9 Stained with antibody.
  • B The transcription factor mRNA expression of the above cells was analyzed by real-time RT-PCR, and the results normalized by mRNA expression of ⁇ 2 microglobulin or glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase are shown on the vertical axis. The number of samples is 4, and statistical analysis is performed.
  • the number of samples is 4, and statistical analysis is performed. “Stimulated with” on the horizontal axis means which agonist (or PBS as a control) was stimulated.
  • Stimulated with on the horizontal axis means which agonist (or PBS as a control) was stimulated.
  • FIG. 30 it is a figure which shows that the CD11c positive cell differentiated with galectin 9 and M-CSF matured into the pDC-like macrophage by LPS stimulation.
  • Macrophages differentiated with M-CSF and galectin 9 by the method of FIG. 30 are cultured in LPS for 24 hours (control is PBS), and the expression of CD11c, PDCA-1, F4 / 80 and Ly-6C are flow sites. The result analyzed by the measurement method is shown.
  • the right figure shows the results of investigating granzyme B and Perforin expression of NK cells by flow cytometry after co-culturing naive NK cells and mature pDC-like macrophages for 5 hours.
  • the number of samples is 4 for statistical analysis. * P ⁇ 0.05.
  • the present inventors have conducted intensive research to clarify the details of immune regulation by galectin 9, and in particular, to regulate the differentiation of T H 17 and Treg cells, and secrete galectin 9 in vivo to enhance the immune response. Focus was placed on the identification of the cells to be controlled. Under these circumstances, the present inventors succeeded in identifying a novel CD4-positive T cell (T H GAL9 cell) that secretes galectin 9, and that this cell controls the differentiation of T H 17 and Treg cells. Revealed. Furthermore, the present inventors have discovered that the T H GAL9 cells in vitro increases with the addition of galectin 9.
  • T H GAL9 cells not only express galectin 9 on the cell surface, but also express known Tr1 cell markers, and secrete IL-10, so that they are the same as the currently defined Tr1 cells or The possibility of being a subgroup was suggested. In that case, galectin 9 is also useful as a marker for Tr1 cells, and is extremely important for purification of Tr1 cells and its application to therapy.
  • the “cell surface” is not particularly limited, but for example, refers to the surface of the cell membrane facing the outside of the cell. That is, the state where galectin 9 is expressed on the cell surface is not particularly limited. For example, galectin 9 is expressed on the cell membrane or the surface thereof, and all or part of galectin 9 is exposed to the outside of the cell. The state that is.
  • the present inventors using a mouse EAE model that is one of autoimmune disease models, suppresses differentiation of T H 17 cells and promotes Treg cell differentiation by galectin 9 but does not depend on Tim-3. It revealed that.
  • galectin 9 induced Tim-3-dependent apoptosis in differentiated Tim-3 positive T H 17 cells.
  • the present inventors have found that among CD4 positive T cells, there is a population expressing galectin 9 on the cell surface.
  • the CD4-positive T cells express galectin 9 on the cell surface is sometimes referred to as "T H GAL9 cells".
  • T H GAL9 cells When T H GAL9 cells are stimulated with TCR, for example, galectin 9 and IL-10 can be secreted following increased expression of CD25.
  • Treg cells may also secrete IL-10
  • T H GAL9 cells did not express Foxp3, which is a Treg marker, and were considered to be different cells from Treg cells.
  • T H GAL9 expressed all of the previously reported IL-10 production type 1 regulatory T cell (Tr1 cell) markers. However, these Tr1 markers were not critical markers for Tr1, since most CD25-positive CD4 cells stimulated with TCR induced expression.
  • CD4 + T cells other than T H GAL9 also expressed galectin 9 in the same amount as T H GAL9.
  • T H 17 cell differentiation by T H GAL9 cells is suppressed by an inhibitor of galectin 9, but not by IL-10 or TGF- ⁇ inhibitor. Revealed that galectin 9 is the active body.
  • the present inventors similarly express cells that express galectin 9 on the cell surface in T cells other than CD4-positive T cells, ⁇ T cells, natural killer cells (NK cells), B cells and the like. And the inventors have invented the cell of the present invention.
  • the cell of the present invention is a cell containing galectin 9, which is characterized by expressing galectin 9 on the cell surface, and is not particularly limited otherwise.
  • the cells of the present invention express galectin 9 on the cell surface is considered to support that the cells of the present invention secrete galectin 9. That is, it is considered that the expression of galectin 9 on the cell surface is observed in the process in which galectin 9 inside the cell is secreted and discharged outside the cell.
  • this explanation shows one possible mechanism, and the cell of the present invention is not limited by this explanation.
  • T H GAL9 cells is, for example, an autoimmune disease, directly or indirectly available very useful cell allergic diseases and tumors other diseases, for example, by the immunoregulatory It is useful for the prevention and treatment of illnesses, and is also useful as a reagent used in the medical field such as countermeasures against infectious diseases, immune diseases, organ transplantation, and further in fields such as assays and biotechnology.
  • galectin 9 is not limited to natural (wild-type) galectin 9 alone, for example, a modified galectin 9 (variant) having substantially the same activity as natural (wild-type) galectin 9 Or the like.
  • the galectin-9 variant has, for example, an activity such as specifically binding to a specific sugar chain possessed by the sugar chain recognition site of galectin 9 or an activity similar thereto (including qualitative activity and / or Or a substance that provides quantitative activity).
  • Galectin 9 (wild-type galectin 9) has, for example, apoptosis-inducing activity against specific cells.
  • the galectin-9 variant has the apoptosis-inducing activity of wild-type galectin 9 or an activity similar thereto.
  • the biological activity of galectin 9 may be altered or modified, and is preferred in some cases.
  • the modified galectin 9 is a biologically active reagent, which is equivalent to or more preferable than the wild type galectin 9 in the field of clinical examination, analysis, or medicine or medicine. It may show properties.
  • the “galectin 9 variant” is not particularly limited, but may be, for example, the galectin 9 variant described in Patent Document 1, and more specifically, for example, as follows.
  • the modified galectin 9 is, for example, wild-type galectin 9 or a protein or a salt thereof in which a linked peptide of a protein having substantially the same activity or a region near the same or a salt thereof, wild-type galectin 9 or substantially the same.
  • It comprises an amino acid sequence in which one or more amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence of the protein having the activity of the link peptide or in the vicinity thereof, and is at least decomposed with respect to the link peptide compared to the wild type galectin 9 A modified protein or a salt thereof whose sensitivity is modified, a protein having substantially the same activity as wild-type galectin 9 and having at least 70% homology with the amino acid sequence of galectin 9; Or at least 75% homology, or at least 80% Homology, or protein having at least 85% homology, or at least 90% homology, or at least 95% homology or a salt thereof, (1) N-terminal sugar chain of wild-type galectin 9 A recognition region (NCRD) or a polypeptide having substantially the same activity, and (2) a sugar chain recognition region (CCRD) on the C-terminal side of wild-type galectin 9 or a polypeptide having an activity substantially equivalent thereto. (3) a protein in which one or more amino acids in the amino
  • the galectin-9 variant has, for example, (1) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 below as the NCRD of wild-type galectin 9, or one or more amino acids deleted, substituted or substituted in the sequence. Added, or at least 70% homology, or at least 75% homology, or at least 80% homology, or at least 85 to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 7 below % Amino acid sequence having at least 90% homology, at least 90% homology, or at least 95% homology, and having lactose-binding ability, (2) wild-type galectin 9 The amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 below as CCRD or one or more amino acids deleted, substituted or added in the sequence Or at least 70% homology, or at least 75% homology, or at least 80% homology, or at least 85% homology to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 below Or an amino acid sequence having at least 90% homology or at least 95% homology and having lactose-binding ability
  • the link region (3) includes one or more amino acid residues (for example, 1 to 2, preferably 3 to 4, more preferably 5 to 6) in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 below.
  • Deletion analogues more preferably 7-8, in particular 1-9, etc., one or more of the amino acid residues (eg 1-9, preferably 1-8, Preferably 1-6, more preferably 1-4, in particular 1-2, etc.) substituted analogs substituted with other residues, one or more (eg 1-60, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, especially 1 to 5 amino acid residues (however, the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 10 and 11 below) (Excluding those shown in the portion excluding the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 below) Also it includes additional analogs.
  • the link region (3) includes those obtained by substituting the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9 below with HM, RIP, or an arbitrary two amino acid sequence.
  • Amino acid substitutions, deletions, or insertions may or may not cause significant changes in the physiological or chemical properties of the polypeptide, and in some cases may give favorable changes. Can do.
  • the amino acid substitution in the amino acid sequence can be selected from other amino acids in the class to which the amino acid belongs.
  • nonpolar (hydrophobic) amino acids include alanine, phenylalanine, leucine, isoleucine, valine, proline, tryptophan, methionine, etc.
  • polar (neutral) include glycine, serine, threonine, cysteine, tyrosine, Examples include asparagine and glutamine.
  • positively charged amino acids basic amino acids
  • negatively charged amino acids acidic amino acids
  • link region (3) the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 10 or 11 below, except for the amino acid sequence part shown in SEQ ID NO: 9 below, HM, RIP, or any 2 Substituted with the amino acid sequence, except for the amino acid sequence portion shown in the following SEQ ID NO: 9 among the amino acid sequences shown in the following SEQ ID NO: 10 or 11, leaving 6 amino acids, and the rest The thing which deleted the group etc. are mentioned.
  • amino acid residues in the amino acid sequence shown in the following SEQ ID NO: 10 or 11 (for example, except for the amino acid sequence portion shown in the following SEQ ID NO: 9, Alternatively, in the case of the following SEQ ID NO: 10, one or more (eg, 1 to 5, preferably 3 to 10, more preferably 5 to 5 amino acid sequence parts shown in the following SEQ ID NO: 11 may be excluded) Deletion analogs lacking 15, more preferably 7-20, especially 1-32, etc., one or more of the amino acid residues (eg 1-9, preferably 1-8, More preferably 1 to 6, more preferably 1 to 4, particularly 1 to 2 and the like, substituted analogs substituted with other residues, one or more (eg 1 to 60, preferably 1 to 40, more preferably 1 to 20, more preferably 1 to 10, Is 1 to 5 amino acid residues (however, the amino acid sequence shown in the following SEQ ID NOs: 10 and 11 excluding those shown in the portion excluding the amino acid sequence shown in the following SEQ ID NO:
  • the peptide or polypeptide of the present invention may include those having a primary structure conformation substantially equivalent to that of natural human galectin-9 protein, or a part thereof, and further, substantially natural and In particular, it may be included that has an equivalent biological activity. It can also be one of naturally occurring variants.
  • the human-derived protein (or peptide or polypeptide) is, for example, 60% relative to the amino acid sequence selected from the group consisting of SEQ ID NO: 1 to 3 in the sequence listing of WO02 / 37114A1, depending on the case.
  • a part of the human-derived protein means a peptide of a part of the human-derived protein (that is, a partial peptide of the protein), which is substantially the same as the galectin-9 protein of the present invention. Any one having equivalent activity may be used.
  • the partial peptide of the protein of the present invention is at least 5 or more, preferably 20 or more, more preferably 50 or more, more preferably 70 or more, more preferably among the constituent amino acid sequences of human galectin 9.
  • Peptides having an amino acid sequence of 100 or more, in some cases 200 or more preferably include those corresponding to consecutive amino acid residues, or, for example, in the sequence listing of WO02 / 37114A1 Among the amino acid sequences represented by SEQ ID NO: 1 to 3, those having the same homology as described above with respect to the homology to the corresponding region can be mentioned.
  • the activity of the galectin-9 variant and the activity of the wild-type (natural) galectin-9 are “substantially equivalent”, for example, the galectin-9 variant retains the sugar chain recognition activity of the natural galectin-9.
  • the activity of the modified galectin 9 and the activity of the wild type (natural) galectin 9 is “substantially equivalent”, for example, protein activity, more specifically, for example, predetermined cell damage It means that the activity, apoptosis-inducing activity, anti-inflammatory activity, anti-allergic activity, immunoregulatory activity, sugar chain binding activity, physiological activity and biological activity are substantially the same.
  • the meaning of the term may include the case of having substantially the same activity, and the substantially equivalent activity includes binding activity, cytotoxic activity, apoptosis-inducing activity, etc.
  • the substantially homogeneous activity means that the activities are qualitatively homogeneous, for example, physiologically, pharmacologically, or biologically homogeneous.
  • the activity such as binding activity, cytotoxic activity, apoptosis-inducing activity is equivalent (eg, about 0.001 to about 1000 times, preferably about 0.01 to about 100 times, more preferably about 0.1 to about 20 times, more preferably The amount of activity, the molecular weight of the protein, and other quantitative factors may be different.
  • T H GAL9 cell a CD4-positive T cell expressing galectin 9 on the cell surface was found, and it was found that it secreted galectin 9 to control the balance between T H 17 cells and Treg cells, and was named T H GAL9 cell.
  • T H GAL9 cells produce IL-10 and express latency-associated peptide (LAP), NKG2D, lymphocyte activation gene-3 (LAG-3), and Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4 (CTLA-4) on the cell surface
  • LAP latency-associated peptide
  • LAG-3 lymphocyte activation gene-3
  • CTLA-4 Cytotoxic T-Lymphocyte Antigen 4
  • Tr1 cells are cells that play an important role in immune tolerance induced by plasmacytoid dendritic cells (Non-patent Documents 20, 23 to 25, and 15 to 18).
  • na ⁇ ve CD4 + T cells are expressed as IL-. It is induced by applying TCR stimulation in the presence of 27 or Vitamin D3 / dexamethasone (Non-patent Documents 26 to 29).
  • the above-mentioned LAP, NKG2D, LAG-3, and CTLA-4 are known as cell surface markers for Tr1 cells, but they are also expressed in CD4 + CD25 + cells that do not produce IL-10.
  • the sufficient Tr1 cell marker is high expression of the inhibitory cytokine IL-10, which is considered to be the main body of its function.
  • immune cells other than T H GAL9 expressing galectin 9 on the cell surface were also found. It is suggested that these cell groups may be purified as surrogate markers for diagnosis as in the case of T H GAL9 cells, or may be purified using galectin 9 on the cell surface and applied to cell therapy.
  • the present invention provides a cell that secretes galectin 9 and its application technology.
  • the present invention provides a type 1 regulatory T cell that secretes Gal-9 and IL-10 and its application technology.
  • the present invention provides a technique for identifying a novel T cell (T H GAL9 cell) capable of secreting galectin 9 and making it available.
  • T H GAL9 cells not only express galectin 9 on the cell surface, but can also express, for example, known Tr1 cell markers and secrete IL-10.
  • the present invention also provides a technique of using galectin 9 as a marker for Tr1 cells, purifying the Tr1 cells and using them for therapeutic applications.
  • the T H GAL9 cells were stimulated with TCR, increased expression of CD25, provides a technique for secretory induction of galectin 9 and IL-10.
  • the present invention by naive T cell co-cultures commit T H GAL9 cells T H 17 cell differentiation, it suppresses the production of IL-17, and / or, also techniques increasing the Treg cells providing.
  • the present invention also provides a technique for performing immunoregulation with T H GAL9 cells in vivo.
  • the present invention uses cell surface galectin 9 as a marker to differentiate regulatory immune cells, and further uses cell surface galectin 9 as a marker to control IL-10 production type 1 Provided is a Tr1 cell sorting technique for sorting sex T cells (Tr1 cells).
  • T H GAL9 cells are used as biologically active reagents, diagnostic materials, therapeutic agents, etc. Useful.
  • the method for separating (or isolating) the cells of the present invention is not particularly limited, and those skilled in the art will be able to describe the present specification and drawings, And based on the technical common sense at the time of filing this application, it can be performed without requiring excessive trial and error.
  • the method of separating (or isolating) the cells of the present invention from the tissues of living organisms (animals) can be performed by using anti-galectin 9 antibody as described in Examples below.
  • a method of staining and separating (or isolating) by sorting may also be used.
  • the method for producing the cell of the present invention is not particularly limited.
  • the cell of the present invention is separated (or isolated) from the tissue of an animal that already has the cell of the present invention.
  • the method is fine.
  • the method for producing a cell of the present invention is a step of expressing galectin 9 on the cell surface of a cell that does not express galectin 9 on the cell surface and converting it into the cell of the present invention. May be included. This step can be performed, for example, in vivo or in vitro.
  • galectin 9 is administered to the animal to thereby form galectin on the cell surface of at least some of the cells in the animal. 9 may be used.
  • the cell surface of the animal cell can be obtained by culturing animal cells in the presence of galectin 9, as in the second production method of the present invention.
  • a method of expressing galectin 9 may be used.
  • the animal cell contains a cell expressing galectin 9 on the cell surface, and the animal cell is cultured in the presence of galectin 9.
  • the method for producing a cell of the present invention may be used in which the proportion of cells expressing galectin 9 on the cell surface is increased.
  • the term “diagnostic agent” refers to any agent that contributes to one or more of its diagnostic acts used in diagnosis in the present invention.
  • the diagnostic use of these may include a method for determining the presence of galectin-9 producing cells or a method for determining the presence of cells presenting a galectin-9 binding substance.
  • the diagnostic agent include those containing cells selected from the group consisting of cells expressing galectin 9 on the cell surface or cell homomodulates thereof.
  • the term “therapeutic agent” may be any agent that achieves or contributes to one or more of its therapeutic actions used in the treatment of the present invention.
  • the agent is a cell that expresses galectin 9 on the cell surface or a cell homomodulate thereof, the agent can be administered to a mammal.
  • the therapeutic agent may be used alone or in combination with other drugs (eg, galectin-9 variant administration and other known treatments for specific tumors, autoimmunity, etc., or mammals In combination with a gene delivery vehicle or the like that facilitates the expression of galectin 9 in the above).
  • the therapeutic agent may include a galectin-9 variant developed for other purposes, and further includes a galectin-9 agonist, a drug that modifies or regulates galectin-9 activity.
  • a galectin-9 agonist for example, organic low molecular weight compound or substance, peptide, peptidomimetic compound or substance, polynucleotide encoding galectin 9 variant polypeptide, galectin 9 variant polypeptide, stabilized against native galectin 9 against protease It may be a cell that expresses a transformed galectin-9 variant chimera or mutant and is transformed.
  • patient may refer to any living organism that can be treated or prevented in any manner, including but not limited to eukaryotic organisms.
  • the eukaryote that is a patient may be a vertebrate.
  • the patient is preferably a mammal. Examples of mammals include humans.
  • the present invention provides a technique for treating a disease, illness or abnormal condition resulting from a lack or lack of physiological or biological activity possessed by galectin 9.
  • the treatment technique include a step of providing a therapeutic agent containing the cell of the present invention (for example, T H GAL9 cell etc.) and / or a mammal having the disease or the like in an effective amount of the cell of the present invention (for example, T H GAL9 cells and the like) and the like, and the like.
  • the cell of the present invention has cytotoxic activity against malignant tumor cells, apoptosis-inducing activity against malignant tumor cells, antitumor activity (anticancer activity) against malignant tumor cells, activated T It can be used to exert apoptosis-inducing activity of cells, especially apoptosis-inducing activity, immunoregulatory activity, anti-inflammatory activity, anti-allergic activity of CD4-positive T cells, antitumor agents (anticancer agents), antiallergic agents, It can be expected as an immunomodulator, an autoimmune disease agent, an anti-inflammatory agent, and a corticosteroid substitute agent.
  • the treatment technique includes a method for treating autoimmune diseases in which activated T cells are prominent.
  • Autoimmune disease and “autoimmunity” all refer to a disorder characterized by autoimmunity in a mammal, which is a response of the immune system to self components. An autoimmune response can develop into symptoms that present clinical signs. Strictly speaking, transplant rejection is not an autoimmune reaction, but if a patient undergoes surgery, such as symptomatically replacing or transplanting cells, tissues, or organs, the body undergoing an allotransplant is It responds immunologically to transplantation.
  • the receptor During allogeneic transplantation of cells, tissues, or organs from one member of a species to another, the receptor (recipient) has an immune response sufficient to reject the transplanted cells, tissues, or organs When it happens, a “transplant rejection” occurs.
  • tumors that can be treated by the methods and therapeutic agents of the present invention may include malignant tumors, for example, tumors that metastasize are malignant tumors, generally malignant tumors are epithelial In some cases, it may be considered as cancer, sarcoma, leukemia, etc., but when simply called “cancer”, the general population may refer to a malignant tumor. Many. As used herein, “cancer” may be interpreted in a broad sense and should not be construed merely as an epithelial malignancy.
  • cancer may include epithelial malignant tumors and non-epithelial malignant tumors (including those that are tumorigenic or non-forming) and may include skin cancers (including melanoma) ), Breast cancer, ovarian cancer, uterine cancer, testicular malignant tumor, prostate cancer, bladder cancer, kidney cancer, thyroid cancer, pharyngeal / laryngeal cancer, tongue cancer, maxillary cancer, esophageal cancer, stomach cancer, colon / rectal cancer, lung / Bronchial cancer, liver cancer (including hepatocellular carcinoma, intrahepatic bile duct cancer), extrahepatic bile duct / gallbladder cancer, pancreatic cancer, leukemia, malignant lymphoma, plasmacytoma, osteosarcoma, chondrosarcoma, leiomyosarcoma, striated muscle Cells, liposarcomas, fibrosarcomas, malignant hemangiomas,
  • autoimmune diseases that can be treated by the methods and therapeutic agents of the present invention include multiple sclerosis, Hashimoto's thyroiditis, systemic lupus erythematosus (SLE), Goodpasture syndrome, pemphigus, receptor Autoimmunity, autoimmune hemolytic anemia, autoimmune thrombocytopenic purpura, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, schleroderma with anti-collagen antibody, complex connective tissue disease, polymyositis, pernicious anemia, Idiopathic Addison's disease, spontaneous infertility, glomerulonephritis, bullous genital acne, adrenergic drug resistance, chronic active hepatitis, primary biliary cirrhosis, autoimmune-based endocrine failure, vitiligo, vasculitis , Post-myocardial infarction, cardiac perforation syndrome, hives, atopic dermatitis, autoimmune-based asthma, autoimmune-
  • autoimmune diseases in the present invention include those in which animal models exist, for example, Sjogren's syndrome (autoimmune lacrimal adenitis or immune-mediated salivary glanditis), autoimmune myocarditis, primary bile Cirrhosis (PBC), inflammatory heart disease, mercury-induced renal autoimmunity, insulin-dependent diabetes (type I diabetes or IDD), post-thymectomy autoimmunity, central nervous system (CNS) demyelinating disorder, CNS lupus, Sleep attack, immune-mediated PNS disorder, osteoarthritis, rheumatoid arthritis, uveitis, medullary cystic fibrosis, autoimmune hemolytic disease, autoimmune vasculitis, ovarian autoimmune disease, scleroderma ) And the like.
  • autoimmune diseases characterized by central nervous system (CNS) demyelination disorders include multiple sclerosis (MS).
  • the peripheral nervous system (PNS) autoimmune disease may be, for example, Gearan-Barre syndrome (
  • the present invention relates to tumors including malignant tumors such as cancer, allergic diseases, inflammation, immune abnormalities, activated lymphocytes (in particular, activated T cells may be included, and activated B cells may be included).
  • a therapeutic agent comprising at least one selected from the group consisting of cells of the present invention (for example, T H GAL9 cells, etc.), crushed materials and extracts thereof,
  • the present invention discloses a method of treatment by administration of a cell of the present invention (for example, a T H GAL9 cell or the like or a composition containing the cell stimulating agent or the like) as a therapeutically active ingredient.
  • Autoimmune diseases that can be treated by the methods and compositions of the present invention include any autoimmune disease or transplant rejection (eg, including but not limited to the autoimmune diseases listed herein) ).
  • autoimmune disease or transplant rejection eg, including but not limited to the autoimmune diseases listed herein
  • the case of inducing apoptosis to (especially including activated T cells) should also be understood in the same manner as in the case of autoimmunity.
  • What contains at least one selected from the group consisting of cells of the present invention is an antitumor agent, antiallergic agent, immunomodulator, autoimmune disease It is promising as an agent that uses the same activity as an agent, anti-inflammatory agent, and corticosteroid, and is considered to exhibit useful biological activity against the following pathological symptoms and diseases.
  • Inflammatory diseases include various acute and chronic inflammations occurring in each organ, allergic and autoimmune inflammations, infectious diseases, and the like. Examples of acute and chronic diseases include pneumonia such as bronchitis, bronchial pneumonia, interstitial pneumonia, pneumonitis, bronchiolitis and acute mediastinitis, and inflammation of other organs such as epicardium.
  • Inflammation endocarditis, myocarditis, stomatitis, stomatitis, tonsillitis, pharyngitis, laryngitis, esophagitis, peritonitis, acute gastritis, chronic gastritis, acute enteritis, appendicitis, ischemic colitis, drug-induced colitis, Various acute and chronic hepatitis such as proctitis, hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, fulminant hepatitis, chronic hepatitis, cirrhosis, cholecystitis, acute pancreatitis, chronic pancreatitis, and acute and chronic nephritis, membranous nephritis , Glomerulonephritis, IgA nephropathy, various cystitis, encephalomyelitis, mastitis, dermatitis, superficial keratitis, dry ker
  • those containing at least one selected from the group consisting of the cells of the present invention are, for example, neurogenic inflammation (for example, neurogenic gastritis, It can also be effective for cystitis).
  • neurogenic inflammation for example, neurogenic gastritis, It can also be effective for cystitis.
  • galectin 9 was found to have a strong inhibitory effect on the inflammatory response in a capsaicin-induced neuronal skin inflammation model.
  • Capsaicin is a substance that causes neurogenic inflammation and pain by stimulating peripheral nerves.
  • Capsaicin has a free stimulating action of substance P, which is a neuropeptide stored at the sensory nerve C fiber terminal.
  • Substance P has the effect of releasing histamine from mast cells, resulting in dilation of blood vessels and edema.
  • sensory nerves are stimulated by the released histamine, substance P is released from the C fiber end, acts on the surrounding mast cells, and further releases histamine.
  • Galectins have an inhibitory effect on this pathogenesis
  • capsaicin binds to a capsaicin receptor (vanilloid receptor), which is a pain receptor sensor of sensory nerve endings, and causes pain. Pain is caused by the activation of sensory nerve endings by chemical stimulation (such as acid), thermal stimulation (such as boiling water), or excessive mechanical stimulation (such as bruise), and capsaicin receptors are painful due to such stimulation. Also involved. Thus, it is suggested that galectin 9 suppresses activation of nerve endings by capsaicin receptors, and the possibility of analgesic action such as reduction of pain associated with cancer and inflammation can be expected. Allergic inflammatory diseases include systemic anaphylaxis, bronchial asthma, hypersensitivity pneumonia, hay fever, allergic rhinitis, allergic conjunctivitis, allergic diseases caused by immune complexes, angioedema, and the like.
  • autoimmune inflammation includes systemic (rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus (erythematosus), nodular polyarteritis, scleroderma, polymyositis / dermatomyositis, Sjogren's syndrome, Behcet's disease), nervous system (multiple sclerosis, myasthenia gravis, HAM (HTLV-1 myelopathy), amyotrophic lateral sclerosis, etc.), endocrine (Graves' disease, Hashimoto's disease, type 1 diabetes, etc.
  • Blood such as idiopathic thrombocytopenic purpura, autoimmune hemolytic anemia, aplastic anemia), respiratory (such as sarcoidosis, pulmonary fibrosis), gastrointestinal tract (such as ulcerative colitis, Crohn's disease), Liver fistula (autoimmune hepatitis, primary biliary cirrhosis, primary sclerosing cholangitis, autoimmune cholangitis, etc.), renal / urinary system (antineutrophil cytoplasmic antibody related nephritis, vasculitis, Goodpasture syndrome, Anti glomerular basement membrane anti Body disease etc.).
  • Blood such as idiopathic thrombocytopenic purpura, autoimmune hemolytic anemia, aplastic anemia
  • respiratory such as sarcoidosis, pulmonary fibrosis
  • gastrointestinal tract such as ulcerative colitis, Crohn's disease
  • Liver fistula autoimmune hepatitis, primary biliary cirrhosis
  • Infectious disease is a general term for diseases caused by pathogens injuring cells, tissues, and organs of living organisms.
  • infectious diseases supervision: Rikuo Machinami, editing: Junichi Tsuji, Yasuhiko Sakamoto, “Standard Pathology (2nd edition)”, Medical Shoin, published on March 15, 2002 can be referred to.
  • Pathogens that cause infectious diseases in humans include 1) bacteria (including spirochetes, chlamydia, rickettsia), 2) viruses, 3) fungi, 4) plants (algae), 5) protozoa, 6) parasites (flux, stripes) Insects, nematodes), 7) arthropods.
  • Major diseases caused by each pathogen include bacterial infections (cholera, plague, E. coli infection, etc.), spirochete infections (leptospirosis, etc.), chlamydia infections (parrot disease, etc.), rickettsial infections (typhoid typhus, tetanus) ), Viral infections (such as herpes zoster, viral hemorrhagic fever, rabies), mycosis (such as perennialdosis, cryptococcosis, aspergosis), protozoal diseases (such as amoeba dysentery, malaria, toxoplasmosis), parasites (Such as fluke and nematosis), mycoplasma infection (such as mycoplasma pneumonia), and mycobacterial infection (such as tuberculosis and atypical mycobacterial disease).
  • bacterial infections cholera, plague, E. coli infection, etc.
  • spirochete infections leptospirosis, etc.
  • brain tumors such as glioblastoma multiforme
  • spinal cord tumor maxillary sinus cancer
  • pancreatic fluid gland cancer gingival cancer, tongue cancer, lip cancer, nasopharyngeal cancer, oropharyngeal cancer, hypopharyngeal cancer, larynx Cancer, thyroid cancer, parathyroid cancer, lung cancer, pleural tumor, cancerous peritonitis, cancerous pleurisy, esophageal cancer, stomach cancer, colon cancer, bile duct cancer, gallbladder cancer, pancreatic cancer, liver cancer, kidney cancer, bladder cancer , Prostate cancer, penile cancer, testicular cancer, adrenal cancer, cervical cancer, endometrial cancer, vaginal cancer, vulvar cancer, ovarian cancer, ciliated epithelioma, malignant bone tumor, soft tissue sarcoma, breast cancer, skin cancer, malignant melanoma Basal cell tumor, leukemia, myelofibrosis with my
  • the cell of the present invention is qualitatively or quantitatively detected by the cell detection method of the present invention in an animal tissue containing or not containing the cell of the present invention.
  • the disease of the said animal is not specifically limited, For example, each above-mentioned disease is mentioned.
  • the method for determining the therapeutic effect of a disease in an animal is according to the present invention before and after the step of treating the disease with respect to the animal.
  • a method comprising a step of diagnosing the disease or a symptom derived from the disease by a method for diagnosing the disease of the animal or a symptom derived from the disease, and a step of comparing the diagnosis results before and after the treatment.
  • the therapeutic effect of the disease can be determined.
  • the disease of the said animal is not specifically limited, For example, each above-mentioned disease is mentioned.
  • the recombinant galectins 9 used in this example are all human-stabilized galectins 9 (G9NC (null)), and were prepared according to the methods already reported (Non-Patent Documents 12, 33, Patent Document 1).
  • the sample was 95% or more by protein purity assay by SDS-PAGE and Comassie brilliant blue staining, and the endotoxin contamination amount by limulus nephelometry was 0.1 ng or less per 1 mg human stabilized galectin.
  • the binding affinity of human stabilized galectin 9 to mouse Tim-3 is equivalent to mouse galectin 9.
  • the molar concentration was calculated as molecular weight 33065.
  • G9NCRD1 CGTCCTCATATGGCCTCTCAGCGGTTCCCAG SEQ ID NO: 1
  • G9NCRD6 CGACCCGCATATCGTGGAAGCTGATGTAGGACAG SEQ ID NO: 2
  • G9CCRD5 CGTCCTCATATGAACTCCCCGCCATCCCCACCTATG SEQ ID NO: 3
  • G9CCRD6 CGACCGGGATCCCTATGTCTGCACATGGGTCAG SEQ ID NO: 4 It was used.
  • Jurkat cells T cell-derived cells
  • the cell line was maintained at 37 ° C. under 5% CO 2 in RPMI-1640 medium (Sigma, St. Louis, USA) supplemented with 10% FCS.
  • Total RNA was extracted from Jurkat cells as follows. That is, Jurkat cells cultured using RPMI-1640 medium containing 10% FBS are collected by centrifugation. Wash cells twice with 10 ml PBS. To the washed cell pellet, 15 ml of ISOGEN (trade name: Nippon Gene) is added per 2 ⁇ 10 8 cells, and total RNA is extracted according to the manual (Nippon Gene). Purification of poly (A) + RNA from total RNA and cDNA synthesis were performed as follows.
  • RNA extracted from Jurkat cells is dissolved in DEPC-treated water to a concentration of 1 mg / ml.
  • Poly (A) + RNA is purified from total RNA according to the manual using PolyATtract mRNA Isolation System (trade name: Promega).
  • Purified poly (A) + RNA is dissolved in DEPC-treated water to a concentration of 5 ⁇ g / 20 ⁇ l.
  • cDNA is synthesized from 5 ⁇ g of poly (A) + RNA according to the manual (Not Id (T) 18 is used as a primer).
  • NdeI-BamHI site of the pET-11a vector was subjected to the N-terminal side carbohydrate-binding domain (N-terminal carbohydrate recognition domain, NCRD) and the C-terminal side sugar chain-binding domain (NCRD) ( CCRD) was inserted, and an expression vector of modified galectin 9 (G9NC (null)) lacking the linker peptide was prepared.
  • NCRD N-terminal carbohydrate recognition domain
  • NCRD C-terminal side sugar chain-binding domain
  • G9NC modified galectin 9
  • cDNA corresponding to the C-terminal CRD of human galectin 9 and (2) cDNA corresponding to the N-terminal CRD of human galectin 9 were obtained from galectin 9 cDNA. That is, a cDNA corresponding to the C-terminal CRD of human galectin 9 (G9CCRD) was amplified from the cDNA using PCR primer: G9CCRD5 + G9CCRD6. G9CCRD was cleaved with a restriction enzyme (NdeI + BamHI) and then inserted into a pET-11a vector treated with the same restriction enzyme to obtain pET-G9CCRD. PCR was performed using a KOD DNA polymerase kit (TOYOBO Code No. KOD-101).
  • PCR reaction mixture (dNTP mix, 25 mM MgCl 2 , 10 ⁇ Buffer, KOD DNA polymerase (0.05 u), primer and template cDNA) was reacted under the following PCR cycle conditions: treatment at 94 ° C. for 2 minutes After that, a cycle (treatment at 98 ° C. for 15 seconds, then 65 ° C. for 2 seconds, and 74 ° C. for 30 seconds) was performed 25 times, and finally the reaction was stopped at 4 ° C.
  • the PCR-amplified fragment was inserted into a vector using Ligation high kit (TOYOBO Code No. LGK-101). The reaction was carried out by mixing the insert: vector molar ratio at about 5: 1, and adding and mixing ligation high of 1/2 (volume) of the total DNA solution (volume). It was inserted by reacting at 16 ° C. for 16 hours (O / N).
  • a cDNA (G9NCRD) corresponding to the N-terminal CRD of human galectin 9 was amplified from the galectin 9 cDNA using PCR primers: G9NCRD1 + G9NCRD6. After cleaving G9NCRD with a restriction enzyme (NdeI), the resulting fragment was treated with the same restriction enzyme (NdeI) and further inserted into dephosphorylated pET-G9CCRD to obtain pET-G9NC (null). PCR amplification and vector integration were performed as described above.
  • pET-G9NC encodes a polypeptide having an amino acid sequence in which the 29 amino acid sequence from the 149th Pro to the 177th Ser of human M-type galectin 9 is replaced with a His-Met sequence. ing. That is, it has a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 below and encodes a polypeptide having an amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 below. (SEQ ID NO: 5) (SEQ ID NO: 6)
  • Recombinant protein was expressed by culturing Escherichia coli in 2 ⁇ YT medium containing 2% (w / v) glucose and 100 ⁇ g / ml ampicillin, and when the absorbance at 600 nm reached 0.7, 0.1M isopropyl- ⁇ -D-thiogalactopyranoside was added (final concentration, 0.1 mM) to induce expression of the recombinant protein. After culturing at 20 ° C. for 18 hours, the cells were collected by centrifugation and suspended in 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.5 M NaCl, 1 mM DTT, 1 mM PMSF.
  • the suspension was sonicated for 10 minutes, 10% (w / v) Triton X-100 was added (final concentration, 1%), and the mixture was stirred at 4 ° C. for 30 minutes. After centrifugation at 15,000 ⁇ g for 30 minutes, the recombinant protein in the resulting supernatant was purified by affinity chromatography using lactose-agarose. The endotoxin was removed using Cellufine ET Clean L (Chisso), and the endotoxin removal was confirmed by the Limulus turbidimetric kinetic method using a toxinometer.
  • FIG. 28 shows the result of electrophoresis of the obtained recombinant protein.
  • SDS-PAGE conditions are as follows: Gel, Acrylamide-BIS (12% gel), buffer for electrophoresis, 25 mM Tris-192 mM glycine-0.1% SDS, electrophoresis conditions, 180 V, 45 min. , Staining, CBB, 60 ° C./30 min.
  • the electrophoresis sample was adsorbed on Strata Clean TM Resin (Stratagene), and 1 ⁇ sample buffer (62.5 mM Tris-HCl, Ph6.8, 2% (w / v) SDS, 5% (W / V) 2 ⁇ ME, Glycerol) to 0.2 mg / ml, 98 ° C./3 min. After the heat treatment, electrophoresis was performed with a protein amount of about 2 ⁇ g per lane. The purified G9NC (null) could be stably stored at 4 ° C. for over 600 days.
  • Antibody The following antibodies were used for cell staining.
  • Anti-mouse CD4-FITC antibody Becton Dickinson or eBioscience, San Diego, CA
  • Anti-mouse Tim-3-PE antibody eBioscience
  • anti-mouse galectin 9-Alexa488 antibody clone 108A2, Galpharma
  • anti-mouse galectin 9-PE Antibody clone 108A2, Biolegend
  • anti-mouse CD25-APC antibody Biolegend
  • anti-mouse Foxp3-APC antibody eBioscience
  • anti-human / mouse LAP-PE antibody R & D Systems
  • Anti-mouse NKG2D-PE antibody Biolegend
  • Anti-mouse LAG-3-PE antibody Biolegend
  • Anti-mouse CTLA-4-PE antibody Biolegend
  • anti-mouse IL-17 antibody- for FACS
  • anti-mouse PDCA-1-APC antibody Biolegend
  • Annexin V-EGFP Apoptosis Detection kit (Medical & Biological Laboratories, Nagoya, Japan) was used.
  • staining of intracellular antigens cells were immobilized and permeabilized using BD Cytofix / Cytoperm Kit (Becton Dickinson). These kits were used according to the manufacturer's instructions.
  • Non-patent Document 34 Quantification of human galectin 9 concentration was carried out according to a previously reported method (Non-patent Document 34). The quantification of mouse galectin 9 concentration was performed according to a previously reported method (Non-Patent Document 16) with the following three improvements. The first is that the anti-mouse galectin 9 antibody coated on the plate was changed to clone 108A2 (Galpharma), and the second was the use of a biotin-labeled anti-mouse galectin 9 polyclonal antibody (Galpharma) for the detection antibody.
  • the third point is that a color reaction was performed using horseradish peroxidase-labeled streptavidin (Endogen) instead of the tertiary antibody in accordance with the change of the detection antibody.
  • This system specifically detects mouse galectin 9 and does not react even if human stabilized galectin 9 is added at 30 nM in the measurement sample.
  • Mouse or human IL-17A, mouse TNF- ⁇ , mouse IL-12, mouse IFN- ⁇ , and mouse IL-13 were detected using appropriate DuoSet (R & D Systems), and mouse IL-10 was detected using Mouse IL- 10 ELISA MAX Standard (Biolegend), Mouse Anti-SRBC IgM ELISA Kit (Life Diagnostics) for detection of anti-mouse SRBC IgM, Mouse Total IgM ELISA Kit and Mouse total detection for mouse total IgM antibody and mouse total IgG antibody, respectively.
  • Total IgG ELISA Kit (both Bethyl) and anti-dsDNA antibody were detected using Levis anti-dsDNA-mouse ELISA KIT (Shiba Goat) according to the manufacturer's instructions.
  • mice and MRL / MpJUmmCrj-1pr / 1pr mice were obtained from Japan Charles River (Yokohama, Japan), and galectin-9 knockout mice and mouse galectin-9 transgenic mice of the same strain were obtained from Galpharma (Takamatsu, Japan).
  • Lewis rats (LEW / Ssn) were obtained from Japan SLC (Hamamatsu, Japan). Mice used for the experiment were given a normal environment where they could eat and drink water freely every day and every 12 hours, and were raised under humane considerations in accordance with national laws and international guidelines. This protocol has been approved by the Kagawa University Experimental Animal Committee.
  • CD4 + CD62L + naive T cells from spleen cells obtained from 8-10 week old male C57BL / 6J mice using CD4 + CD62L + T cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) The naive T cells having a purity of 94% or more were obtained.
  • Naive T-cells with 10% heat-immobilized fetal bovine serum and RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St.
  • T H 1 mouse IL-12 in cell differentiation inducing (10 mg / ml, R & D systems) and anti-IL-4 antibody (10 ⁇ g / ml, Becton Dickinson) and, T H 2 murine IL-4 in the cell differentiation induction ( 20 mg / ml, R & D systems) and anti-IL-12 antibody (10 ⁇ g / ml, Becton Dickinson) were added.
  • Tr1 differentiation was performed using 96-well plates coated with anti-CD3 antibody at a concentration of 10 ⁇ g / ml, and naive T cells were cultured for 3 days in the presence of 2 ⁇ g / ml anti-CD28 antibody and 25 ng / ml IL-27. .
  • human stabilized galectin 9 (30 nM), lactose (3, 10, 30 mM), sucrose (3, 10, 30 mM), anti-Tim-3 neutralizing antibody (10 ⁇ g / ml, eBioscience) and rat IgG2a ( 10 ⁇ g / ml, eBioscience) and the like were added and cultured.
  • Peripheral blood mononuclear cells were isolated by overlaying peripheral blood of healthy individuals in a specific gravity separation solution (Rinhosepar, Nakalai Tesque, Kyoto, Japan) and centrifuging according to the manufacturer's instructions.
  • CD4 T cells were isolated from the obtained peripheral blood single cells using CD4 + T Cell Isolation Kit II (Miltenyi Biotec) according to the manufacturer's instructions.
  • the CD4 + T cells to TCR stimulation as with culturing mouse naive T cells, cells were suspended in RPMI 1640 medium containing 10% heat inactivated already fetal bovine serum and penicillin G and streptomycin, 96-well plate coated with anti-CD3 antibody at a concentration of 1 ⁇ g / ml was seeded at a density of 2 ⁇ 10 5 cells / 0.1 ml / well, and anti-CD28 antibody (2 ⁇ g / ml, Becton Dickinson) was added and incubated for 96 hours .
  • human IL-2 (5 ng / ml, R & D systems) was used, and human IL-1 ⁇ (50 ng / ml, R & D systems) or IL-1 ⁇ and IL-6 The cells were cultured for 9 days under the combination stimulation of IL-1 ⁇ and mouse IL-23 (50 ng / ml, R & D systems).
  • mRNA was quantified by real-time RT-PCR according to previous reports, SYBR Green I was used to stain the amplified nucleic acid, and ABI PRISM 7000 sequence detector (Applied Biosystems, Foster City, CA) was used for the measurement (non-patented) Reference 36). Primers were purchased from Takara Bio (Otsu, Japan). The specific mRNA expression level was expressed as a ratio using the mRNA expression level of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) quantified by the same method as an internal standard.
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • FIG. 1 shows the therapeutic effect of human stabilized galectin 9 in rat collagen-induced arthritis.
  • the collagen solution used for sensitization was adjusted in the following manner. Bovine type II collagen (BCII; Collagen Research Center) and Muramyl dipeptide (MDP; Peptide Institute) were mixed to 1.6 mg / ml and 0.4 mg / ml, respectively, and the same volume of incomplete Freund's adjuvant (IFA; Difco) was added. Added, mixed and emulsified. One ml of this collagen solution per Lewis rat ( ⁇ , 6-7 weeks old) was administered intradermally on the back (Day 0).
  • BCII Bovine type II collagen
  • MDP Muramyl dipeptide
  • This antibody is considered to recognize a protein having a correct three-dimensional structure because it recognizes the sugar chain recognition domain on the N-terminal side of galectin 9 and does not react with human galectin 9 modified with SDS.
  • anti-human galectin 9CT rabbit polyclonal antibody was used as the secondary antibody. This antibody was prepared by immunizing rabbits with a sugar chain recognition domain on the C-terminal side of human galectin 9, and cross-reacting with other galectins was absorbed and removed. The ELISA does not cross mouse and rat galectin-9. In other words, this ELISA can measure complete human stabilized galectin 9 that has not undergone degradation / denaturation.
  • moment analysis software (provided by Kenji Tabata, Fujisawa Pharmaceutical, graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University) was used to perform pharmacokinetic analysis by the moment analysis method.
  • the stabilized galectin 9 concentration in the blood was very low, and the 0.6 mg / kg administration that showed a sufficient therapeutic effect in the previous arthritis model showed a maximum blood concentration of 0.943.
  • ng / ml, t1 / 2 was 7.6 hours, and MRT was 12.5 hours.
  • Naive T cells were prepared from spleen cells of wild type mice (WT) and galectin 9 knockout mice (Gal-9 KO), and 2 ⁇ 10 5 cells / on 96-well plate (Becton Dickinson) coated with anti-CD3 antibody. After seeding at a density of 0.1 ml / well and adding anti-CD28 antibody (2 ⁇ g / ml, Becton Dickinson), the cells were cultured for 96 hours (No skewed).
  • T H 17 cell differentiation inducing human TGF-.beta.1 in the system in (3 ng / ml, R & D systems), murine IL-2 (5 ng / ml , R & D systems) and mouse IL-6 (20 ng / ml , R & D systems) was 96 hours at the added condition (T H 17 skewed).
  • IL-17A concentration in each cell culture supernatant was quantified by ELISA, IL-17A expression was markedly induced by T H 17 differentiation-inducing stimulation, but the induction was induced by galectin 9 knockout compared to wild type. Mice were significantly higher.
  • the amount of IL-10 mRNA in the cells remaining after the culture supernatant was extracted as described above was quantified by a real-time RT-PCR method.
  • the expression level of IL-10 mRNA was expressed as a ratio of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) signal measured by the same method as an internal standard.
  • GPDH glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
  • Galectin 9 knockout mice had more severe and persistent symptoms of experimental allergic encephalitis (EAE) induced by MOG (33-55) compared to wild-type mice (FIG. 3a).
  • EAE experimental allergic encephalitis
  • FIG. 3a In wild-type mice, almost no infiltration of CD3-positive cells is observed locally 20 weeks after the onset of EAE, whereas infiltration of CD3-positive cells is evident in knockout mice (FIG. 3b).
  • FIG. 3c In the spleen of the knockout mouse 20 weeks after the onset, an increase in CD4 + CD25 + cells producing IL-17 and a decrease in Foxp3 positive cells were observed compared to the wild type (FIG. 3c).
  • FIG. 4 shows the effect that galectin 9 suppresses T H 17 cell differentiation without depending on the Tim3 / Gal-9 interaction.
  • T H 17 cell differentiation induction stimulation was given to CD4 + CD62L + naive T cells prepared from C57BL / 6J mice by the method of FIG. The starting time of the stimulation was 0 hour, and the cells were cultured in the presence of 30 nM human stabilized galectin 9 or control PBS in each period shown in the figure. Thereafter, the cells were washed with a medium and continued to stimulate T H 17 cell differentiation.
  • Naive T cells were cultured for 24 hours under T H 17 differentiation-inducing stimulation (T H 17 skewed), and CD4 + Tim-3 + cells were measured by flow cytometry.
  • Na ⁇ ve T cells cultured for 24 hours under the conditions in which TGF- ⁇ 1 and IL-6 were excluded from the same differentiation-inducing stimulus were used as controls (No skewed). In both cases, Tim-3 expressing cells were hardly detected.
  • IL-17 production is strongly induced when naive T cells are stimulated with anti-CD28 antibodies, IL-2, TGF- ⁇ 1 and IL-6 in plates coated with anti-CD3 antibody and cultured for 4 days.
  • galectin 9 When 30 nM galectin 9 was added to this T H 17 differentiation induction system, IL-17 production was markedly suppressed by galectin 9 treatment from the start of differentiation to 18 hours.
  • the IL-17 production inhibitory effect equivalent to the galectin 9 treatment was shown (FIG. 4a). On the contrary, the pretreatment for 24 hours before induction of T H 17 differentiation had no inhibitory effect (FIG. 4a).
  • IL-17F associated with the differentiation of T H 17, it was examined mRNA levels of IL-21, IL-22 and IL-23R, in the case of performing 24 hours galectin 9 treatment than T H 17 differentiation start IL- Expression of not only 17A but all these T H 17-related genes was suppressed (FIG. 4b), suggesting the possibility that T H 17 cell differentiation is suppressed.
  • Galectin 9 is a ligand for Tim-3 and interacts with Tim-3 expressing T H 1 cells to induce apoptosis (Non-patent Document 4). Since Tim-3 expression has also been reported in T H 17 cells (Non-Patent Documents 5 to 6), the possibility of Tim-3 being involved in suppression of T H 17 differentiation by galectin 9 was examined.
  • O-linked glycan is involved in inhibition of T H 17 differentiation induction by galectin 9] 5 the T H 17 differentiation inducing suppression by galectin 9 instead of N- linked sugar chains, O- linked glycan exhibits the results suggest the involvement of.
  • FIG. 6 shows the effect of Gal-9 on T H 1, T H 2 and T H 17 cell differentiation.
  • 30 nM human-stabilized galectin 9 or control PBS is added to naive T cells, and differentiation induction stimuli of T H 1, T H 2 and T H 17, or anti-CD3 antibody and anti-CD28 antibody after 96 hours of culture in each condition of only TCR stimulation with (No skewed), it was quantified specific mRNA expression in real-time RT-PCR in the T H subtype.
  • Human stabilized galectin 9 did not affect the expression of mRNA specific for T H 1 and T H 2 cells, and significantly suppressed IL-17A and ROR ⁇ t mRNA expression specific for T H 17 cells only.
  • IFN- ⁇ and IL-4 mRNA were measured under the T H 17 differentiation-inducing conditions in the above experiment, no change in expression by human stabilized galectin 9 was observed.
  • T H 17 differentiation is known to be suppressed by these cytokines, it was suggested that the action of galectin 9 is not to increase the expression of these cytokines.
  • FIG. 7 shows that the increase in CD25 and Foxp3 expression by galectin 9 is dependent on IL-2.
  • 30 nM human-stabilized galectin 9 is added to naive T cells (or control PBS) and cultured for 24 hours under T H 17 differentiation-inducing conditions.
  • human-stabilized galectin 9 CD4 + CD25 + cells The percentage increased significantly, which was also reflected in the increase in CD25 mRNA.
  • b When the ratio of CD4 + CD25 + Foxp3 + cells was examined after 96 hours of culture under the above conditions (a), it was significantly increased by the addition of stabilized galectin 9.
  • Galectin 9 T H 17 was in cell differentiation inducing conditions increase the mRNA levels of CD4 + CD25 + increase in cell and CD25 (Fig. 7a), increased CD4 + CD25 + Foxp3 + cells despite the T H 17 cells differentiation conditions From these results (FIG. 7b), it was suggested that galectin 9 has a strong Treg cell differentiation-inducing action.
  • IL-2 which is a ligand for CD25, has been reported to suppress T H 17 cell differentiation (Non-patent Document 39), and in the T H 17 cell differentiation induction system actually used in this Example, IL-2 Suppressed IL-17 production in a concentration-dependent manner, but the effect of IL-2 alone was weak (FIG.
  • FIG. 7c was synergistically enhanced by the addition of galectin 9 (FIG. 7c).
  • enhancement of Foxp3 expression by galectin 9 was induced only in the presence of IL-2 (FIG. 7d).
  • About 7% of CD25 positive CD4 cells become Foxp3 - IL-17A + and about 25% become Foxp3 + IL17A - cells by induction of T H 17 cell differentiation, but when galectin 9 is added, Foxp3 - IL-17A + cells Decreased to about 2%, while Foxp3 + IL17A ⁇ cells increased to about 50% (FIG. 7e).
  • the expression of CD25 in this system was enhanced 24 hours after induction of differentiation, but it took 72 hours to enhance Foxp3 expression, and the expression level was increased by galectin 9 (FIG. 7f).
  • FIG. 8 shows the results of identification of T H cells expressing galectin 9 on the cell surface.
  • Naive T cells were cultured for 96 hours under the conditions shown in FIG. 6a and unstimulated (No stim), and the concentration of galectin 9 in the culture supernatant was quantified by ELISA. The secretion of galectin 9 was only TCR stimulated (No skewed), and increased under differentiation conditions into T H 1 and T H 2 cells, but was suppressed under differentiation conditions into T H 17.
  • IL-2, TGF- ⁇ 1, and IL-6 are added in addition to TCR stimulation.
  • nM human-stabilized galectin 9 (or control PBS) is added to naive T cells, respectively, under unstimulated (No stim), TCR-stimulated only (No skewed), and T H 17 differentiation-inducing stimulation conditions. After culturing for 96 hours, galectin 9 in the supernatant was quantified by ELISA. The ELISA is specific for mouse galectin 9 and is not affected by the added 30 nM human stabilized galectin 9. Human stabilized galectin 9 increased galectin 9 secretion from naive T cells cultured under these conditions.
  • galectin 9 mRNA was quantified by real-time RT-PCR using the cells of (c) above, but no statistically significant difference was observed in the cells of each condition in the figure.
  • galectin 9 and CD25 on the cell surface of (a) above were stained and measured by flow cytometry, the proportion of cells expressing galectin 9 on the cell surface was unstimulated with CD4 positive cells. Although it was less than 2%, it increased to about 4% under TH1, TH2 differentiation-inducing stimulation, or TCR stimulation. On the other hand, the T H 17 differentiation-inducing condition remained at less than 2%.
  • the proportion of cell surface galectin 9-positive cells by each differentiation stimulus is in good agreement with the secretion of galectin 9.
  • the above cells were sorted by sorting into cell surface galectin 9 positive and negative, and galectin 9 mRNA was quantified by real-time RT-PCR, and no statistical difference was found between the two.
  • these cells were fixed / permeabilized and stained with an anti-galectin 9 antibody to stain all the galectin 9 contained in the cells and measured by flow cytometry. In this case as well, there is a difference between the two cells. There wasn't.
  • recombinant galectin 9 As already shown, addition of recombinant galectin 9 under T H 17 cell differentiation conditions suppressed T H 17 differentiation, but addition of this galectin also enhanced endogenous galectin 9 secretion (FIG. 8c).
  • recombinant galectin 9 added is a human type and exhibits physiological activity also in mouse cells, but is not detected by ELISA used for measurement of galectin 9 in the culture supernatant.
  • the mRNA amount of galectin 9 did not show a significant difference between the T H 17 induction condition and the non-induction condition (FIG. 8d).
  • Galectin 9 does not have a signal peptide, and its secretory mechanism is completely unknown. However, it is considered that galectin 9 passes through the cell membrane directly from the cytoplasm where it is localized or through some transport device. The inventors thought that galectin 9 secreting galectin 9 could be detected on the cell surface and secreted the cells using anti-galectin 9 antibody. As a result, a cell population expressing galectin 9 on the cell surface was successfully detected. By the way, this galectin 9 staining was performed in the presence of lactose.
  • galectin 9 binds to many glycolipids and glycoproteins existing on the cell surface, so that the secreted galectin 9 is secondarily bound to the cell surface and the target cell.
  • 30 mM lactose completely suppressed the binding of secondary galectin 9 to cells, while it did not affect the antigen-antibody reaction.
  • 30 mM lactose was added.
  • Nearly 2% of naive T cells before TCR stimulation express galectin 9 on the cell surface, and of course, most of them are CD25 ⁇ cells (FIG. 8e).
  • TCR stimulation increased CD25 + cells, but at the same time increased galectin-9 positive cells, up to about 10% of the CD25 + cell population (FIG.
  • FIG. 9 shows that T H GAL9 secretes galectin 9 by TCR stimulation and increases the expression of IL-10 and TGF- ⁇ , and that T H GAL9 controls the T H 17 / Treg balance.
  • T H GAL9 cells were prepared naive T cells, further cell surface galectin-9-positive cells (T H GAL9 cells: Gal-9 + T H) and negative cells (non-T H GAL9: Gal -9 - T H ) was sorted by sorting.
  • T H GAL9 cells were cultured for 96 hours under the presence or absence of TCR stimulation (anti-CD28 antibody added in anti-CD3 antibody-coated plate), and galectin 9 secreted into the culture supernatant was quantified by ELISA. Only T H GAL9 cells induced galectin 9 secretion by TCR stimulation. (b) Cytokine mRNA expression in the cells was examined by real-time RT-PCR. T H GAL9 cells had higher expression of IL-10 and TGF- ⁇ compared to non-T H GAL9 cells, while expression of IL-4 and IL-17A was lower.
  • T H GAL9 cells Gal-9 + T H
  • non-T H GAL9 Gal-9 - T H
  • 1 After mixing at a ratio of 1, the cells were co-cultured for 90 hours with only TCR stimulation.
  • IL-17A secreted into the culture supernatant was quantified by ELISA, while Foxp3 mRNA expression was quantified by real-time RT-PCR.
  • Addition of T H GAL9 cells suppressed IL-17A secretion, while Foxp3 expression increased.
  • T H GAL9 The CD4 T cell that expresses galectin 9 on the cell surface discovered in FIG. 8 is named T H GAL9, and it is assumed that this cell secretes galectin 9 and controls the TH17 / Treg balance.
  • T H GAL9 did not express significantly higher galectin 9 than other T cells (FIG. 8f).
  • T H GAL9 actually releases galectin 9 by purifying T H GAL9 by sorting and examining its properties.
  • T H GAL9 also highly expressed the inhibitory cytokines IL-10 and TGF- ⁇ , while the expression of IL-4 and IL-17 was significantly low. Furthermore, it was proved by co-culture experiments that T H GAL9 suppresses T H 17 and promotes Treg differentiation.
  • T H GAL9 is at representative of IL-10 are inhibited cytokine with high expression, but there is a report of suppressing T H 17 differentiation (Non-Patent Document 40), T H 17 in an assay system used in at least 9 It was shown in experiments (d, e) using inhibitors and experiments (f) using recombinant IL-10 that the main body of the drug effect to suppress differentiation induction was galectin-9. By the way, the concentration of galectin 9 secreted from T H GAL9 in the culture supernatant is about 150 pg / ml in the experimental result of FIG. 9a. Is much lower.
  • T H GAL9 interacts with galectin 9 paracrine or cell-surface in a state very close state or adhesion, to the target cell is considered that it would be acting to the target cells.
  • Galectin 9 induces cell death in many cells at high concentrations. Therefore, dark secretion is dangerous, and T H GAL9 is expected to be regulated by galectin 9 after contacting and recognizing the target cell.
  • FIG. 10 shows the results of CD25 + T H GAL9 producing IL-10 and TGF- ⁇ 1 by TCR stimulation.
  • Naive CD4 T cells are cultured for 96 hours under TCR stimulation and separated into CD25 + T H GAL9, CD25 + non-T H GAL9 and CD25 ⁇ non-T H GAL9 by sorting. Each cell was further cultured for 96 hours under TCR stimulation, and galectin 9 in the culture supernatant was quantified by ELISA.
  • IL-10 and TGF- ⁇ 1 expression in the cells of (a) above was quantified by real-time RT-PCR. As a result, an increase in the mRNA expression level of T H GAL9 cells when TCR repeated stimulation galectin 9 secretion of growth and IL-10 and TGF-beta was observed.
  • FIG. 11 shows the result of increasing T H GAL9 by adding stabilized galectin-9.
  • FIG. 8 shows a result of staining cells with CD25 and cell surface galectin 9 and measuring by flow cytometry. Addition of human stabilized galectin 9 also acted on unstimulated naive CD4 T cells and increased Gal-9 + CD25 ⁇ cells.
  • T H GAL9 decreases in T H 17 differentiation-inducing conditions ( Figure 8e), the proportion of T H GAL9 rose significance by stabilized galectin 9 added.
  • IL-10 is known to promote the differentiation of Tr1, a suppressor T cell, and may have an effect on the increase of T H GAL9. From the results of (b), at least TCR In the increase of T H GAL9 by stimulation, the involvement of IL-10 was considered to be low.
  • FIG. 12 shows the results of comparison between T H GAL9 cells and Tr1 cells.
  • IL-10 production type 1 regulatory T cells (Tr1 cells) regulate immunity in various fields, and the possibility of autoimmune diseases and cancer treatment using Tr1 cells has been discussed.
  • Tr1 cells IL-10 production type 1 regulatory T cells
  • Tr1 cell markers reported so far include LAP (Non-patent Document 21), NKG2D (Non-patent Document 20), LAG-3 (Non-patent Document 22), and CTLA-4 (Non-patent Document 41). . In contrast to Treg, Tr1 cells are thought not to express Foxp3 (Non-Patent Documents 42 to 43). Therefore, the expression of Tr1 cell markers was examined before and after TCR stimulation of naive CD4 + T cells.
  • Naive CD4 + T cells were stimulated with TCR in the presence or absence of IL-27 (25 ng / ml) and cultured for 3 days to promote differentiation into Tr1. A portion of the culture supernatant after 3 days was recovered, and IL-10 (d) and galectin 9 concentration (e) were quantified by ELISA. The remaining cells were stimulated with PMA (50 ng / ml) and ionomycin (1 ⁇ g / ml) for 4 hours in the presence of brefeldin A (10 ⁇ g / ml), stained with IL-10 inside the cell and galectin 9 on the cell surface and flowed. Measured by cytometry (f).
  • T H GAL9 showed no expression of Tim-3 (FIG. 12c).
  • T H GAL9 and Tr1 have similar properties, suggesting that T H GAL9 may be the same as or a subpopulation of Tr1. Therefore, when naive T cells were cultured for 3 days under TCR stimulation in the presence of IL-27, one of the differentiation factors of Tr1, IL-10 and galectin-9 secretion were significantly increased by adding IL-27. (FIGS. 12d and e). Furthermore, the cells after differentiation induction were divided into cell surface galectin 9 positive and negative, and the IL-10 expression levels were compared.
  • T H GAL9 is a cell with very similar properties to Tr1. In fact, T H GAL9 satisfies the current definition of Tr1, and in that sense it can be said to be a subgroup of Tr1. Until now, many of the immunoregulatory activities of Tr1 have been thought to depend on IL-10. However, as shown in FIG. 9, galectin 9 instead of IL-10 is essential for the balance control of T H 17 / Treg. is there.
  • Tr1 induction methods there is a method using high-concentration IL-10, but in this case, culture for several weeks is required.
  • FIG. 11c when the increase in T H GAL9 was examined by the addition of IL-10, the culture was performed for 96 hours, and it may be possible that the effect of IL-10 was short.
  • FIG. 13 in order to further clarify the relationship between THGAL9 and Tr1, cells having a Tr1 marker were examined in galectin-9 knockout mice.
  • Table 1 below shows the results of examining the ratio of cell surface galectin 9-positive cells (T H GAL9) in CD4 positive T cells in each organ.
  • Organs means “organ”.
  • Thymus means “thymus”.
  • LN means lymph node.
  • Spleen means “spleen”.
  • Peyer's patch means “Peier board”.
  • PBMC means “peripheral blood mononuclear cells”.
  • Phhenotype means “Phenotype”.
  • Cells means “cells”. Since many T cells in Thymus (thymus) are immature with CD4 and CD8 double positive, we focused only on CD4 SP (CD4 single positive) T cells.
  • T H GAL9 cells were examined in a variety of lymphoid organs, about 1/4 of CD4 single positive cells thymus, lymph nodes, spleen, from peripheral blood and Peyer Release CD4 + CD25 - T cells 4%, 7%, 15% and 7% respectively.
  • FIG. 14 shows the effect of galectin 9 on human T cells and the results of identification of T H GAL9 cells.
  • CD25 was stained and measured by flow cytometry.
  • the cells of (a) above were stained with CD25 and Foxp3, and the expression of each was measured by flow cytometry.
  • Human stabilized galectin 9 (30 nM) or control PBS is added to human CD4 + T cells, cultured for 9 days under stimulation of differentiation into T H 17 cells, and IL-17 concentration in the culture supernatant was quantified by ELISA.
  • Human CD4 + T cells were cultured for 96 hours under TCR stimulation or non-stimulation, and galectin 9 and CD25 on the cell surface were stained and measured by flow cytometry.
  • Human CD4 + T cells were cultured for 96 hours under TCR stimulation, and then sorted into galectin 9 positive cells (CD25 + T H GAL9) and negative cells (CD25 + non-T H GAL9) by sorting. . Each was further cultured for 96 hours under TCR stimulation, and galectin 9 in the culture supernatant was quantified by ELISA, while each cytokine mRNA expression shown in the figure was measured by real-time RT-PCR.
  • CD4 + CD25 ⁇ T cells that express galectin 9 are present on the cell surface in the peripheral blood of healthy people, and CD4 + that expresses galectin 9 on the cell surface when stimulated with TCR.
  • CD25 + T cells were significantly increased (FIG. 10d). These cells secreted significantly more galectin 9 and had higher IL-10 and TGF- ⁇ mRNA expression than CD4 + CD25 + T cells that did not express galectin 9 on the cell surface (FIG. 10e).
  • IL-2 and INF- ⁇ mRNA expression there was no significant difference in IL-2 and INF- ⁇ mRNA expression, and IL-4 and IL-17 mRNA expression was rather low in cells expressing galectin 9 on the cell surface (FIG. 10e).
  • Function of galectin 9 These results are equivalent in human and mouse, it was revealed that there exists a T H GAL9 cells in humans.
  • T H GAL9 can function as a cell that secretes galectin 9 and regulates the T H 17 / Treg balance. It is a very important finding in the clinical application of galectin 9, especially stabilized galectin 9, that the action of galectin 9 is the same in both mice and humans. Furthermore, since it was shown that T H GAL9 is also present in humans, it is considered that immune control by galectin 9 is well preserved across animal species. Since T H GAL9 can be detected by galectin 9 on the cell surface, it is possible to isolate and purify the cell alive as shown in FIG. 9a, and it is easy to develop an application technique using this cell. .
  • T H GAL-9 has been shown to increase with the addition of stabilized galectin-9, and we have also discovered one of the techniques to increase the number of cells that may be useful for various future applications in vitro.
  • T cells other than T H GAL9 also express the equivalent galectin 9 but do not secrete it.
  • T H GAL9 only can secrete galectin 9 is thought to be due to the secretion mechanisms present in this cell, if it is possible to control it, may be also a new method of immune regulation.
  • the discovery of T H GAL9 is considered to be an important contribution to the elucidation of the galectin-9 secretion mechanism. For example, comprehensive expression profiling using T H GAL9 and other T cells may be performed at the mRNA level or protein level.
  • T H GAL9 may also be used as a surrogate marker that indirectly knows the immune balance, for example, the diagnosis of various immune diseases, cancers, infectious diseases, etc., the sensitivity to them, or the index to examine the effects of drugs As.
  • galectin 9 on the cell surface is detected as an intermediate of secretion, and therefore galectin 9-expressing cells other than T H GAL9 can be searched using galectin 9 expression on the cell surface as an index. is expected. At least the exposure on the cell surface is the result of translocating the cell membrane, and it is secreted in a broad sense. Therefore, the existence of a group of cells expressing galectin on the cell surface was investigated in various pathological models.
  • FIG. 15 shows a mouse treated with peritonitis (cecal ligation and puncture: CLP) by the cecal ligation and puncture method, which is a serious peritonitis model.
  • CLP cecal ligation and puncture
  • BALB / c mice are used. This is a model in which a hole is made in the cecum ligated using a G21 needle and the subsequent survival is examined over time.
  • FIG. 16 shows the results of examining the effectiveness of human stabilized galectin 9 administration in CLP. This finding has been made by Okayama University School of Medicine and Professor Akihiro Matsukawa, and has already been presented at academic societies, etc., so here we outline the results. Peritonitis was developed by CLP, and the survival rate was examined over time.
  • A Comparison between C57BL / 6J wild type mouse (WT) and mouse galectin-9 transgenic mouse (Gal-9 Tg).
  • C Survival rate when WT mice were treated with CLP and human stabilized galectin 9 (30 ⁇ g / mouse; or PBS as a control) was administered intravenously once 24 hours later.
  • D Survival rate when WT mice were treated with CLP and human-stable galectin 9 (30 ⁇ g / mouse; or PBS as a control) was administered once subcutaneously 24 hours later.
  • E Survival rate when human stabilized galectin 9 (30 ⁇ g / mouse; or PBS as a control) is administered once subcutaneously to nude mice simultaneously with CLP. Stabilized galectin 9 significantly prolonged the survival rate of mice with this single peritonitis immediately after CLP or 24 hours after CLP even for this severe peritonitis. However, this effect was not seen in nude mice (Fig. 16e), strongly suggesting that stabilized galectin 9 acts via T cells.
  • FIG. 17 shows the results of examining spleen cells from a mouse 24 hours after CLP, culturing for 24 hours, and examining the cytokine concentration in the culture supernatant. This has also been reported in academic societies by Okayama University School of Medicine and Professor Akihiro Matsukawa. In mouse spleen cells administered with stabilized galectin-9, production of TNF- ⁇ , IL-12, and IL-10 was decreased, while production of IL-17 was increased. So far, galectin 9 has been shown to reduce IL-17 in autoimmune disease models, but here it increased. Galectin 9 is a bidirectional immunomodulator, and its action varies depending on the scene or cell.
  • Non-patent Document 13 it suppresses TNF- ⁇ in autoimmune diseases, but on the other hand, it has been reported that it acts on monocytes and dendritic cells to stimulate TNF- ⁇ production. It is not difficult to imagine that the direction of galectin 9 changes depending on the type of galectin. Inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IL-12, and IL-17 work to eliminate microorganisms, but also cause tissue destruction by excessive inflammation. Although the detailed mechanism is unknown, the fact that the administration of stabilized galectin 9 improves the survival rate is considered that the change in cytokine balance seen here favors survival under peritonitis. It is obvious that it plays an important role in galectin-9 peritonitis (or sepsis).
  • FIG. 18 shows the result of staining spleen cells 24 hours after CLP with CD3, NK1.1, GL-3 and cell surface galectin 9 and analyzing them by flow cytometry.
  • Cell surface galectin-9 expressing cells are increased by the administration of stabilized galectin-9.
  • NKT cells CD3 + NK1.1 +
  • cell populations containing T H GAL9 CD3 + NK1.1 ⁇ and CD3 + GL-3 ⁇
  • ⁇ T cells CD3 + GL3 +
  • FIG. 19 shows the result of investigating cell surface galectin 9-positive cells at the time of administering stabilized galectin 9 to a cancer-bearing mouse.
  • administration of stabilized galectin 9 prolongs survival when administered to mice transplanted intraperitoneally with mouse fibrosarcoma Meth A (Non-patent Document 32).
  • Meth A was introduced into the peritoneal cavity, and immediately after that, human stabilized galectin 9 was intraperitoneally administered at 30 times / week (30 ⁇ g / mouse). 7 days after transplantation of Meth A, intraperitoneal cells and spleen cells were taken out, stained with the indicated cell surface markers, and the results of measurement by flow cytometry are shown.
  • (A) shows the result of developing CD4-positive cells of peritoneal cells with CD25 and cell surface galectin 9 expression.
  • Administration of human stabilized galectin 9 markedly increased the proportion of cells that expressed galectin 9 on the cell surface, while CD25 + Gal-9 ⁇ decreased.
  • CD25 + Gal-9 ⁇ cells are a cell population containing Treg that is thought to suppress immunity against cancer.
  • (B) shows the result of expanding the cells of (a) with the expression of internal CD8-positive cells by CD25 and cell surface galectin-9 expression. The proportion of CD8 cells that expressed galectin 9 on the cell surface was significantly increased by administration of human stabilized galectin 9.
  • (C) Spleen cells of Meth A carrier cancer mice administered with human stabilized galectin 9 are stained with PDCA-1, CD11c and cell surface galectin 9 and measured by flow cytometry.
  • Plasma cell-like galectin 9 expression levels were compared in plasmacytoid dendritic cells: pDC, pDC-like macrophages: pDC-M ⁇ , classical dendritic cells: cDC, and cells different from dendritic cells and macrophages: nonDCM ⁇ .
  • pDC-like macrophages have been shown to suppress symptoms when they are transferred into cells in a model of acute lung injury (44). In this case as well, it is imagined that galectin 9 secreted by pDC-like macrophages constitutes the main effect.
  • FIGS. 20 to 21 show the results of examining the effectiveness of human stabilized galectin 9 in a spontaneous autoimmune disease model.
  • MRL / MpJUmmCrj-1pr / 1pr mouse is a spontaneous autoimmune disease model widely used as a model of systemic lupus erythematosus.
  • Human stabilized galectin 9 was intraperitoneally administered to this mouse ( ⁇ , 8 weeks old) at the indicated dose 3 times / week up to 22 weeks of age, and hindlimb footpad edema volume measurement over time (once a week; As in FIG. 1, measurement was performed using PLETHYSMOMETER), body weight measurement (three times a week), and urinary protein concentration measurement (once a week).
  • FIG. 22 shows the results of examining the effect of stabilized galectin 9 on antibody production.
  • stabilized galectin 9 is effective in model mice of systemic lupus erythematosus, suggesting the possibility of acting on antibody production and B cell suppression. Therefore, the action of the stabilized galectin 9 was examined using an anti-sheep erythrocyte IgM antibody production system by administration of sheep erythrocytes (SRBC), which is widely used in examining the effects of drugs on antibody production.
  • SRBC sheep erythrocytes
  • FIG. 23 shows a B cell analysis method.
  • CD19 and GL-7 of spleen cells are stained and developed by flow cytometry, it is divided into Germinal center B cells (CD19 + GL-7 + ) and other B cells (CD19 + GL-7 ⁇ ).
  • Germinal center B cell is separated according to the cell size according to the FSC value, it can be separated into a relatively large cell Centroblast and a relatively small cell Centrocyte. This separation of Centroblast and Centrocyte by FSC was in good agreement with the reports of high and low CXCR4 expression, respectively, and was used for further analysis.
  • FIG. 24 shows spleen cells extracted from the mouse of FIG. 22 examined over time.
  • the Germinal center B cells were decreased, and both Centroblast and Centrocyte were decreased (a, b).
  • both Germinal center B cells, Centroblast and Centrocyte were more than wild type. This is consistent with the action of galectin 9 in vivo that is assumed from the administration of stabilized galectin 9. That is, it was suggested that galectin 9 is a factor that suppresses B cell and antibody production in vivo. Thus, there should be cells that secrete galectin 9 to negatively control B cells and antibody production.
  • the cell surface galectin 9 expression of B cells was first examined. As a result, it was found that B cells expressed galectin 9 on the cell surface both in the Germinal center B cell and other B cells, and the expression was high in the Germinal center B cell (a). In addition, it was found that, among the Germinal center B cells, Centroblast showed higher expression of cell surface galectin 9 (b). On the other hand, as long as it was examined with Germinal center B cells, administration of stabilized galectin 9 did not affect the expression of galectin 9 on the cell surface, but it was found that the proportion of cells expressing galectin 9 increased by sensitization with SRBC. .
  • CD4 T cells are deeply involved in B cell maturation, and the role of CD4-positive cells called Follicular B helper T cells (TFH) is said to be particularly large. Therefore, in FIG. 26, mouse spleen cells on day 7 after SRBC administration were stained with CXCR5 and ICOS, which are said to be CD4 and TFH markers, and the expression of cell surface galectin 9 in each cell population was examined by flow cytometry. . As shown in (a to d), the cell surface galectin-9 expression levels of these CD4 T cells vary. ICOS ⁇ CXCR5 + CD4 positive cells and ICOS + CXCR5 ⁇ CD4 positive cells showed particularly high expression. The possibility that these cells secrete galectin 9 to control antibody production was shown.
  • FIG. 27 the effects of administration of human stabilized galectin 9 are schematically illustrated and summarized.
  • the concentration that appears in the blood after administration is very low, and there is a high possibility that it has no medicinal effect at least in immune control. It may be present at a higher concentration when passing through the subcutaneously administered site and lymphatic vessels / lymph nodes, and at that time, it may have an effect on immune cells.
  • the administered human stabilized galectin 9 is rapidly excreted from the body, so that immune cells affected by high concentrations of galectin 9 replace the stabilized galectin 9 after excretion.
  • T H GAL9 that expresses galectin 9 on the cell surface and secretes it to regulate the T H 17 / Treg balance. Furthermore, T H GAL9 was also found to increase with the addition of human stabilized galectin-9. In other words, the administered human stabilized galectin 9 induces T H GAL9 in addition to its direct action, and the induced T H GAL9 secretes a necessary dose of galectin 9 locally and acts on various cells. It is done. This consistently explains that the immunoregulatory activity of stabilized galectin 9 persists.
  • cDC classical dendritic cells
  • pDC dendritic cells for plasma cells
  • pDC-like macrophages were shown using cells obtained in a Meth A-carcinoma mouse model.
  • an examination example with another cancer type is shown. That is, as shown in FIG. 29, administration of galectin 9 prolonged the survival of the cancer-bearing mice, and at that time, pDC-like macrophages increased.
  • a mouse lung cancer-derived tumor cell line LLC is inoculated into C57BL / 6 ( ⁇ , 7-10 weeks of age) into the abdominal cavity of 5x10 5 cells (Day 0).
  • the results of examining the change in survival rate when administered intraperitoneally (PBS as a control) are shown.
  • the horizontal axis (Days after tumor inoculation) represents the number of days after LLC inoculation, and the vertical axis (Percent survival) represents the survival rate in percent.
  • Statistical analysis was performed by log rank test.
  • B The results obtained by staining the peritoneal cells on day 7 in (a) with antibodies of CD11c, PDCA-1, Ly-6C and F4 / 80 and analyzing by flow cytometry.
  • the ratio of cells expressing pDC markers CD11c and PDCA-1 and also expressing the macrophage marker Ly-6C or F4 / 80, that is, pDC-like macrophages increased significantly. It was. It is envisioned that pDC-like macrophages are involved in survival extension by galectin-9.
  • Each group is represented by Mean ⁇ SEM using 5 mice. *** P ⁇ 0.001.
  • galectin 9 promotes the differentiation of CD11c positive cells by M-CSF in vitro in a Tim-3 independent manner
  • galectin 9 promoted the differentiation of CD11c positive cells by M-CSF in a test tube in a Tim-3 independent manner.
  • Bone marrow cells were washed from the femur and tibia of mice and cultured in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum and antibiotics to remove adherent cells (mature macrophages).
  • the remaining bone marrow cells were cultured for 7 days in a medium containing GM-CSF (Peprotech, 20 ng / ml) or M-CSF (R & D systems, 20 ng / ml), this time washing away non-adherent cells, Adherent cells were analyzed by flow cytometry. Since> 95% of the adherent cells were F4 / 80 and CD11b double positive, they were determined to be mature macrophages. The results of examining how the expression of CD11c in the cells is affected by human stabilized galectin 9 (30 nM) given during differentiation are shown.
  • Galectin 9 did not affect CD11c expression in macrophages differentiated with GM-CSF, but increased CD11c expression in macrophages differentiated with M-CSF.
  • B M-CSF differentiation assay in the presence of lactose (30 mM), an inhibitor of galectin 9, or sucrose (30 mM) as a control, and Tim-3 neutralizing antibody (eBiosciences, RMT-3-23, 10 ⁇ g / ml) or isotype control antibody (eBiosciences, 10 ⁇ g / ml). Lactose inhibited the increase in CD11c expression by galectin 9, but Tim-3 neutralizing antibody did not affect the increase in CD11c expression. Tim-3 is the most well-known molecule as a target of galectin 9, but it was suggested that it is not involved in the increase of CD11c expression by galectin 9 in this experiment.
  • FIG. 30 shows that galectin 9 is capable of differentiating macrophages into dendritic cells by increasing CD11c expression of macrophages that differentiate with M-CSF.
  • galectin 9 promotes the differentiation of human peripheral blood mononuclear cells into classical dendritic cells (Dai, SY et al, J Immunol, 2005 175: 2974-81). Therefore, in this example, the phenotype of the obtained cells was examined in detail. The result is shown in FIG. (A) Analysis by flow cytometry revealed that galectin-9 increased B220 and IA / IE expression, while CD14 expression decreased.
  • F4 / 80 which is widely used as a macrophage marker, is highly expressed regardless of the addition of galectin 9, and maintains the macrophage expression system.
  • B When the transcription factor mRNA was analyzed by real-time RT-PCR, IRF4 and IRF8 required for dendritic cell differentiation were increased by galectin-9.
  • SpiB which is said to be expressed in pDC progenitor cells, was increased by galectin 9, and Id2, which was supposed to suppress the transcription factor E2-2 of mature pDC, was also increased by addition of galectin 9.
  • C Furthermore, TLR7, TLR8 and TLR9 mRNAs were also increased by the addition of galectin-9.
  • TLR9 agonist The indicated TLR agonist was added to macrophages differentiated for 7 days in the presence of M-CSF and galectin 9, and after 6 hours of culture, IFN- ⁇ and IFN- ⁇ mRNA expression was measured by real-time RT-PCR. Results are shown.
  • the agonists used were LPS (100 ng / ml, Sigma): TLR4 agonist, R848 (5 ⁇ g / ml, Imgenex): TLR7 / 8 agonist, CpG (TypeA CpG ODN1585, 10 ⁇ g / ml, Invivogen): TLR9 agonist. Mature pDCs should highly express type 1 interferon upon stimulation with these TLR agonists, but no high increase was observed.
  • macrophages differentiated by M-CSF and human-stabilized galectin 9 show a phenotype close to pDC, but have not reached mature pDC, and are therefore considered precursors of pDC-like macrophages. It was suggested that galectin 9 induces differentiation of macrophages into pDC-like macrophages.
  • CD11c positive cells differentiated with galectin 9 and M-CSF mature into pDC-like macrophages upon LPS stimulation As shown in FIG. 32, CD11c positive cells differentiated with galectin 9 and M-CSF matured into pDC-like macrophages by LPS stimulation.
  • galectin 9 differentiates macrophages differentiated with M-CSF into cells of the phenotype that appear to be precursors of pDC-like macrophages.
  • mRNA expression levels were normalized by the mRNA expression of ⁇ 2 microglobulin or glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase and expressed on the vertical axis. The number of samples is 4 for statistical analysis. ** P ⁇ 0.01, *** P ⁇ 0.001.
  • IRF7 a transcription factor essential for the expression of type 1 interferon that characterizes pDC, is markedly elevated by LPS stimulation.
  • E2-2 which is said to be highly expressed in mature pDC, increased markedly by LPS treatment for 6 hours and decreased after 24 hours.
  • FIG. 32 shows that pDC-like macrophage precursors differentiated by galectin 9 become a phenotype of mature pDC-like macrophages upon LPS stimulation. Furthermore, the function of the mature pDC-like macrophage was examined. The result is shown in FIG. (A) Since pDC is known to highly express type 1 interferon, do pDC-like macrophages matured in vitro secrete IFN- ⁇ and IFN- ⁇ , which are representative of type 1 interferon? Whether or not was examined by ELISA.
  • the concentration of IFN- ⁇ and IFN- ⁇ in the culture supernatant obtained by adding the TLR agonist indicated on the horizontal axis (control PBS) to pDC-like macrophages to which LPS stimulation was applied for 24 hours by the method of FIG. 32 and culturing for 18 hours was quantified with a specific ELISA kit purchased from PBL Interferon Source, and the concentration is shown on the vertical axis. Statistical analysis was performed with 4 samples each. *** P ⁇ 0.001.
  • the TRL agonist concentrations used were LPS: 100 ng / ml, R848: 5 ⁇ g / ml, CpG: 10 ⁇ g / ml.
  • naive NK cells When these cells were stained with the dye DIOC 18 (3) (3,39-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate, Sigma) that stains the cell membrane and co-cultured with naive NK cells 30 times the number of cells, and in addition to naive NK cells. In addition, matured pDC-like macrophages differentiated in vitro with twice the number of cells were added and co-cultured to examine the death of Yac-1 cells. Naive NK cells were purified from mouse spleen cells using MACS Anti-DX5 beads (Miltenyi Biotech).
  • the co-culture was performed for 5 hours, and then dead cells were stained with propidium iodide, and the percentage of the DIOC 18 (3) positive cells (total Yac-1 cells) was analyzed by flow cytometry. .
  • Yac-1 alone culture was also performed (sample on the horizontal axis ( ⁇ )). The number of samples is statistically analyzed with 4. *** P ⁇ 0.001.
  • pDC-like macrophages matured in vitro significantly increased the anticancer activity of NK cells.
  • the anticancer activity by NK cells is largely due to the action of Granzyme B and Perforin, which are cytotoxic proteins that are encapsulated and released.
  • pDC-like macrophages matured in vitro and NK cells were co-cultured at the above ratio for 5 hours, and the cells were immobilized and permeabilized using Cytofix / Cytoperm solution (BD Biosciences), and anti-Granzyme B antibody (Clone 16G6 , EBiosciences) and anti-Perforin antibody (Clone eBioMAK-D, eBiosciences) and the results of analysis by flow cytometry are shown.
  • Control is NK cell culture alone (indicated by the horizontal axis in the figure) The number of samples is 4 for statistical analysis.
  • pDC-like macrophages matured in vitro were found to increase Granzyme B and Perforin expression in NK cells.
  • galectin 9 promotes differentiation into pDC-like macrophages, and when the cells are matured with LPS, they can promote anticancer activity through activation of NK cells. Indicated. As shown in FIG. 29, administration of galectin 9 prolongs the survival of the cancer-bearing mice, and increases pDC-like macrophages. It is considered that pDC-like macrophages are enhancing the anticancer activity of the living body through the activation of NK cells as shown in FIG. 33, which is considered to be a cause of the survival extension of the cancer-bearing mouse.
  • Table 2 below shows the results of analyzing various pharmacokinetic parameters by the moment analysis method based on the blood kinetics of human stabilized galectin 9 (FIG. 1).
  • Model Independent Pharmacokinetic Analysis means “independent pharmacokinetic analysis model”.
  • Dose means the dose of human stabilized galectin 9.
  • Cmax means maximum blood concentration.
  • Tmax means the time to reach the maximum blood concentration.
  • AUC means the area under the blood concentration curve.
  • T1 / 2” means half-life.
  • MRT means mean residence time.
  • CLtot means systemic clearance.
  • the cells of the present invention can be used for example in autoimmune diseases, allergic diseases, tumors and the like by performing immune control via secretion of galectin 9 in vivo. It can be used for treatment of a disease or reduction of symptoms derived from the disease.
  • the cell of the present invention is an excellent marker for identifying type 1 regulatory T cells (Tr1 cells) that secrete galectin 9 and IL-10, for example. It can be applied to isolate Tr1 cells.
  • the present invention is not limited to the above description and the description of the above-described embodiments and examples, and can be arbitrarily modified and modified without departing from the scope of the claims.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)

Abstract

　ガレクチン９に基づく生理活性を発現し得る細胞、その製造方法及び用途を提供する。　前記目的を達成するために、本発明の細胞は、ガレクチン９を含む細胞であって、前記ガレクチン９を細胞表面に発現していることを特徴とする。

Description

ガレクチン９を分泌する細胞、その製造方法及びその用途
　本発明は、ガレクチン９を分泌する細胞、その製造方法及びその用途に関する。例えば、本発明は、Gal-9を分泌するCD4　T細胞及びその応用技術に関する。
　ガレクチン９(galectin　9;　Gal-9)は、ガレクチンファミリーに属し、N-またはO-glycanのβガラクトシドに結合して生理活性を発揮する(非特許文献１)。ガレクチン９はT細胞アポトーシス誘導因子(非特許文献２)及び好酸球遊走因子(非特許文献３)として発見同定されたが、それ以降、現在までに多岐に渡る活性が報告されている。T細胞に関しては、ガレクチン９はTim-3に結合してTim-3陽性TH1細胞のアポトーシスを誘導し、過剰なTH1反応を収束させることで自己免疫性の炎症を抑制する(非特許文献４)。TH17細胞は自己免疫疾患、アレルギーや癌等、様々な難治性疾患の原因または増悪因子の一つと考えられている細胞で、この細胞にもTim-3が発現している(非特許文献５～６)。ガレクチン９投与はTH17細胞を減少させ、一方で炎症抑制性のTreg細胞を増加させる(非特許文献７)。現在のところ、このTH17細胞減少へのTim-3の関与、およびメカニズムは不明である。
　ガレクチン９のT細胞以外への作用には前述の好酸球遊走活性以外にもCD11bLy-6C単球タイプ骨髄由来抑制細胞の誘導(非特許文献８)、CD11bLy-6G好中球タイプ骨髄由来抑制細胞の誘導(非特許文献９～１０)や形質細胞様樹状細胞の誘導(非特許文献１１)、肥満細胞からの脱顆粒抑制（非特許文献１２）等が知られている。これまでの報告はガレクチン９の過剰免疫抑制作用に着目したものが多いが、ガレクチン９は場面によっては免疫を高進する。ガレクチン９は単球や樹状細胞上のTim-3に結合してこれらの細胞を活性化し、炎症性サイトカイン産生を促進する（非特許文献１３）。またマクロファージでガレクチン９とTim-3が相互作用すると結核菌を排除する免疫が高進する（非特許文献１４）。つまりガレクチン９は免疫を両方向性に調整することができる。
国際公開第2005/093064号パンフレット(WO　2005/093064)
Hirabayashi,　J.　et　al.　Oligosaccharide　specificity　of　galectins:　a　search　by　frontal　affinity　chromatography.　Biochim　Biophys　Acta,　1572,　232-254　(2002) Wada,　J.,　Ota,　K.,　Kumar,　A.,　Wallner,　E.I.　&　Kanwar,　Y.S.　Developmental　regulation,　expression,　and　apoptotic　potential　of　galectin-9,　a　β-galactoside　binding　lectin.　J　Clin　Invest,　99,　2452-2461　(1997) Matsumoto,　R.　et　al.　Human　ecalectin,　a　variant　of　human　galectin-9,　is　a　novel　eosinophil　chemoattractant　produced　by　T　lymphocytes.　J　Biol　Chem,　273,　16976-16984　(1998) Zhu,　C.　et　al.　The　Tim-3　ligand　galectin-9　negatively　regulates　T　helper　type　1　immunity.　Nat　Immunol,　6,　1245-1252　(2005) Chen,　Y.　et　al.　Anti-IL-23　therapy　inhibits　multiple　inflammatory　pathways　and　ameliorates　autoimmune　encephalomyelitis.　J　Clin　Invest,　116,　1317-1326　(2006) Nakae,　S.,　Iwakura,　Y.,　Suto,　H.　&　Galli,　S.J.　Phenotypic　differences　between　Th1　and　Th17　cells　and　negative　regulation　of　Th1　cell　differentiation　by　IL-17.　J　Leukoc　Biol,　81,　1258-1268　(2007) Seki,　M.　et　al.　Galectin-9　suppresses　the　generation　of　Th17,　promotes　the　induction　of　regulatory　T　cells,　and　regulates　experimental　autoimmune　arthritis.　Clin　Immunol,　127,　78-88　(2008) Arikawa,　T.　et　al.　Galectin-9　expands　immunosuppressive　macrophages　to　ameliorate　T-cell-mediated　lung　inflammation.　Eur　J　Immunol,　40,　548-558　(2010) Tsuboi,　Y.　et　al.　Galectin-9　protects　mice　from　the　Shwartzman　reaction　by　attracting　prostaglandin　E2-producing　polymorphonuclear　leukocytes.　Clin　Immunol,　124,　221-233　(2007) Dardalhon,　V.　et　al.　Tim-3/galectin-9　pathway:　regulation　of　Th1　immunity　through　promotion　of　CD11b+Ly-6G+　myeloid　cells.　J　Immunol,　185,　1383-1392　(2010) Nobumoto,　A.　et　al.　Galectin-9　expands　unique　macrophages　exhibiting　plasmacytoid　dendritic　cell-like　phenotypes　that　activate　NK　cells　in　tumor-bearing　mice.　Clin　Immunol,　130,　322-330　(2009) Niki,　T,　et　al.Galectin-9　is　a　high　affinity　IgE-binding　lectin　with　anti-allergic　effect　by　blocking　IgE-antigen　complex　formation.　J　Biol　Chem,　284,　32344-32352　(2009) Anderson,　A.C.　et　al.　Promotion　of　tissue　inflammation　by　the　immune　receptor　Tim-3　expressed　on　innate　immune　cells.　Science,　318,　1141-1143　(2007) Jayaraman,　P.　Tim3　binding　to　galectin-9　stimulates　antimicrobial　immunity.　J　Exp　Med,　207,　2343-2354　(2010) Katoh,　S.　et　al.　Galectin-9　inhibits　CD44-hyaluronan　interaction　and　suppresses　a　murine　model　of　allergic　asthma.　Am　J　Respir　Crit　Care　Med,　176,　27-35　(2007) Nobumoto,　A.　et　al.　Galectin-9　suppresses　tumor　metastasis　by　blocking　adhesion　to　endothelium　and　extracellular　matrices.　Glycobiology,　18,　735-744　(2008) Mishra,　R.　et　al.　Galectin-9　trafficking　regulates　apical-basal　polarity　in　Madin-Darby　canine　kidney　epithelial　cells.　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A,　107,　17633-17638　(2010) Tanikawa,　R.　et　al.　Galectin-9　induces　osteoblast　differentiation　through　the　CD44/Smad　signaling　pathway.　Biochem　Biophys　Res　Commun　394,　317-322　(2010) Chabot,　S.　et　al.　Regulation　of　galectin-9　expression　and　release　in　Jurkat　T　cell　line　cells.　Glycobiology,　12,　111-118　(2002) Fujio,　K.,　Okamura,　T.　&　Yamamoto,　K.　The　Family　of　IL-10-secreting　CD4+　T　cells.　Adv　Immunol,　105,　99-130　(2010) Ochi,　H.　et　al.　Oral　CD3-specific　antibody　suppresses　autoimmune　encephalomyelitis　by　inducing　CD4+　CD25-　LAP+　T　cells.　Nat　Med,　12,　627-635　(2006) Okamura,　T.　et　al.　CD4+CD25-LAG3+　regulatory　T　cells　controlled　by　the　transcription　factor　Egr-2.　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A,　106,　13974-13979　(2009) Wakkach,　A.　et　al.　Characterization　of　dendritic　cells　that　induce　tolerance　and　T　regulatory　1　cell　differentiation　in　vivo.　Immunity,　18,　605-617　(2003) Jangpatarapongsa,　K.　et　al.　Plasmodium　vivax　parasites　alter　the　balance　of　myeloid　and　plasmacytoid　dendritic　cells　and　the　induction　of　regulatory　T　cells.　Eur　J　Immunol,　38,　2697-2705　(2008) Kavousanaki,　M.,　Makrigiannakis,　A.,　Boumpas,　D.　&　Verginis,　P.　Novel　role　of　plasmacytoid　dendritic　cells　in　humans:　induction　of　interleukin-10-producing　Treg　cells　by　plasmacytoid　dendritic　cells　in　patients　with　rheumatoid　arthritis　responding　to　therapy.　Arthritis　Rheum,　62,　53-63　(2010) Awasthi,　A.　et　al.　A　dominant　function　for　interleukin　27　in　generating　interleukin　10-producing　anti-inflammatory　T　cells.　Nat　Immunol,　8,　1380-1389　(2007) Stumhofer,　J.S.　et　al.　Interleukins　27　and　6　induce　STAT3-mediated　T　cell　production　of　interleukin　10.　Nat　Immunol,　8,　1363-1371　(2007) Fitzgerald,　D.C.　et　al.　Suppression　of　autoimmune　inflammation　of　the　central　nervous　system　by　interleukin　10　secreted　by　interleukin　27-stimulated　T　cells.　Nat　Immunol,　8,　1372-1379　(2007) Barrat,　F.J.　et　al.　In　vitro　generation　of　interleukin　10-producing　regulatory　CD4(+)　T　cells　is　induced　by　immunosuppressive　drugs　and　inhibited　by　T　helper　type　1　(Th1)-　and　Th2-inducing　cytokines.　J　Exp　Med,　195,　603-616　(2002) Uhlig,　H.H.　et　al.　Characterization　of　Foxp3+CD4+CD25+　and　IL-10-secreting　CD4+CD25+　T　cells　during　cure　of　colitis.　J　Immunol,　177,　5852-5860　(2006) Maynard,　C.L.　et　al.　Regulatory　T　cells　expressing　interleukin　10　develop　from　Foxp3+　and　Foxp3-　precursor　cells　in　the　absence　of　interleukin　10.　Nat　Immunol,　8,　931-941　(2007) Nagahara,　K.　et　al.　Galectin-9　increases　Tim-3+　dendritic　cells　and　CD8+　T　cells　and　enhances　antitumor　immunity　via　galectin-9-Tim-3　interactions.　J　Immunol,　181,　7660-7669　(2008) Nishi,　N.　et　al.　Development　of　highly　stable　galectins:　truncation　of　the　linker　peptide　confers　protease-resistance　on　tandem-repeat　type　galectins.　FEBS　Lett,　579,　2058-2064　(2005) Seki,　M.　et　al.Beneficial　effect　of　galectin　9　on　rheumatoid　arthritis　by　induction　of　apoptosis　of　synovial　fibroblasts.　Arthritis　Rheum,　56,　3968-3976　(2007) Wilson,　N.J.　et　al.　Development,　cytokine　profile　and　function　of　human　interleukin　17-producing　helper　T　cells.　Nat　Immunol,　8,　950-957　(2007) Oomizu,　S.　et　al.　Oral　administration　of　pulverized　Konjac　glucomannan　prevents　the　increase　of　plasma　immunoglobulin　E　and　immunoglobulin　G　levels　induced　by　the　injection　of　syngeneic　keratinocyte　extracts　in　BALB/c　mice.　Clin.　Exp.　Allergy,　36,　102-110　(2006) Lu,　L.H.　et　al.　Characterization　of　galectin-9-induced　death　of　Jurkat　T　cells.　J　Biochem,　141,　157-172　(2007) Park,　H.　et　al.　A　distinct　lineage　of　CD4　T　cells　regulates　tissue　inflammation　by　producing　interleukin　17.　Nat　Immunol,　6,　1133-1141　(2005) Laurence,　A.　et　al.　Interleukin-2　signaling　via　STAT5　constrains　T　helper　17　cell　generation.　Immunity,　26,　371-381　(2007) Mills,　K.H.　Induction,　function　and　regulation　of　IL-17-producing　T　cells.　Eur　J　Immunol,　38,　2636-2649　(2008) Brun,　V.,　Bastian,　H.,　Neveu,　V.　&　Foussat,　A.　Clinical　grade　production　of　IL-10　producing　regulatory　Tr1　lymphocytes　for　cell　therapy　of　chronic　inflammatory　diseases.　Int　Immunopharmacol,　9,　609-613　(2009) Levings,　M.K.　et　al.　Differentiation　of　Tr1　cells　by　immature　dendritic　cells　requires　IL-10　but　not　CD25+CD4+　Tr　cells.　Blood,　105,　1162-1169　(2005) Roncarolo,　M.G.　&　Gregori,　S.　Is　FOXP3　a　bona　fide　marker　for　human　regulatory　T　cells？　Eur　J　Immunol,　38,　925-927　(2008) Kojima,　K.　et　al.　Galectin-9　attenuates　acute　lung　injury　by　expanding　CD14-　plasmacytoid　dendritic　cell-like　macrophages.　Am　J　Respir　Crit　Care　Med,　184,　328-339　(2011)
　前述のようなガレクチン９の活性の解明は、その殆どがリコンビナントタンパク質を投与・添加することによって行われてきた。例えば、ガレクチン９投与は、マウスのコラーゲン誘導関節炎に治療効果を発揮し、Tim-3陽性T細胞の減少とTreg細胞の増加、及びIFN-γやIL-17等の炎症性サイトカイン産生を抑制する(非特許文献７)。重要なことに、ガレクチン９ノックアウトマウスは関節リウマチ誘導刺激に高感受性で、野生型と比較してTim-3陽性CD4　T細胞（TH1及びTH17）の増加とTreg細胞の減少が見られる(非特許文献７)。これらの性質はリコンビナントタンパク質を投与して解明されたガレクチン９の作用に矛盾しない。従ってガレクチン９は内在性の免疫制御因子として分泌され、免疫バランスを調整していることは自明である。しかし、生体内でガレクチン９を分泌し、又は免疫を調整している細胞は未だ同定されていない。
　Tim-3はガレクチン９のターゲットとして最も研究が進んでいるが、ガレクチン９の多彩な活性の全てをTim-3で説明することは不可能である。実際に現在までに活性化リンパ球の接着因子であるCD44、インテグリンやIgEがガレクチン９のターゲットとして同定されており、それらのターゲットを介してアレルギー性の過剰免疫抑制や癌細胞の転移抑制が起こる（非特許文献１２、１５～１６）。今後、研究の進展によって更にターゲットが増えることは予想に難くない。このように複数のターゲットに相互作用して多彩な活性を示すのは多くのレクチンに共通した性質である。ところで以上に挙げたガレクチン９のターゲットはどれも細胞膜上に存在しており、細胞外に分泌されたガレクチン９がそれらのターゲットに結合して機能を発揮するのは言うまでも無いように思われる。
　ところが、ガレクチン９はシグナルペプチドを持たず、基本的に細胞質に局在しており、細胞質または核内での役割も報告されている（非特許文献１７～１８）。しかし、前述の細胞膜上のターゲットおよびガレクチン９の作用を考えるとガレクチン９の少なくとも一部は分泌される筈である。実際にT細胞や肥満細胞に由来する株化細胞からガレクチン９が分泌される報告があるが（非特許文献１２、１９）、その分泌メカニズムは全く不明であり、また株化細胞ゆえに生体内でも同系統の細胞から同様な分泌が行われる確証は無い。何よりガレクチン９を発現している細胞が必ずしもそれを分泌するとは限らないことが、ガレクチン９分泌細胞の同定を著しく困難にしている。
　ガレクチン９は重要な免疫制御因子であり、その分泌細胞を同定することが出来れば、免疫バランスを知る指標として有用と考えられ、例えば様々な免疫疾患の診断または治療の効果を判定するサロゲートマーカーとなり得る。更にその細胞を精製する技術と組み合わせることで細胞療法にも使用可能と考えられ、自己免疫疾患、アレルギー、癌などの難治性疾患治療への応用も想定される。
　このように、ガレクチン９は、多彩な免疫制御活性を持つが、その作用メカニズムの詳細は不明な部分が多い。また、生体内においてガレクチン９を分泌し、又は免疫反応を制御している細胞等も未同定である。ガレクチン９による免疫制御の詳細、例えばTH17とTreg細胞の分化制御の詳細を明らかにすること、又は、生体内でガレクチン９を分泌し、若しくは免疫反応を制御する細胞等の、ガレクチン９に基づく生理活性を発現し得る細胞の同定が望まれている。
　そこで、本発明は、ガレクチン９に基づく生理活性を発現し得る細胞、その製造方法及び用途を提供することを目的とする。
　前記目的を達成するために、本発明の細胞は、ガレクチン９を含む細胞であって、前記ガレクチン９を細胞表面に発現していることを特徴とする。
　本発明の細胞の第１の製造方法は、動物にガレクチン９を投与することにより、前記動物における少なくとも一部の細胞の細胞表面にガレクチン９を発現させる、前記本発明の細胞の製造方法である。
　本発明の細胞の第２の製造方法は、動物の細胞を、ガレクチン９の存在下で培養することにより、前記動物の細胞の細胞表面にガレクチン９を発現させる、前記本発明の細胞の製造方法である。
　本発明の医薬は、前記本発明の細胞、その破砕物及び抽出物からなる群から選択される少なくとも一つを含む医薬である。
　本発明の診断方法は、前記本発明の細胞、その破砕物及び抽出物からなる群から選択される少なくとも一つを用いて、被検細胞におけるガレクチン９又はガレクチン９結合性物質の有無を診断する方法である。
　本発明による疾患の治療方法又は前記疾患に由来する症状の軽減方法は、前記本発明の細胞、その破砕物及び抽出物からなる群から選択される少なくとも一つを動物に投与する工程を含む、前記動物の疾患の治療又は前記疾患に由来する症状の軽減方法である。
　本発明の免疫制御方法は、前記本発明の細胞を動物に投与して、前記動物の免疫を制御する免疫制御方法である。
　本発明の細胞検出方法は、前記本発明の細胞の細胞表面に発現されたガレクチン９をマーカーとして検出することにより、前記細胞を検出する方法である。
　本発明による、動物の疾患又は前記疾患に由来する症状の診断方法は、
　前記本発明の細胞を含むか又は含まない動物組織において、前記本発明の細胞検出方法により、前記本発明の細胞を定性的又は定量的に検出する工程を含む、前記動物の疾患又は前記疾患に由来する症状の診断方法である。
　本発明による動物の疾患の治療効果の判定方法は、
　前記動物に対し、前記疾患の治療を行う工程と、
　前記治療の前後において、それぞれ、本発明による前記動物の疾患又は前記疾患に由来する症状の診断方法により、前記疾患又は前記疾患に由来する症状を診断する工程と、
　前記治療の前後における前記診断結果を対比する工程とを含むことを特徴とする。
　本発明による細胞の分離方法は、前記本発明の細胞を含む動物組織において、前記本発明の細胞検出方法により、前記細胞を検出し、検出された前記細胞を、前記動物組織中の他の細胞から分離する、細胞の分離方法である。
　本発明によれば、上記のとおり、ガレクチン９に基づく生理活性を発現し得る細胞、その製造方法及び用途を提供することができる。
実施例における、ラットコラーゲン誘導関節炎モデルにおけるヒト安定化ガレクチン９の治療効果を示す図である。（a）のスケジュールに従ってLewis　rat　(♀,　6～7週齢)を感作し、足の腫れが顕著になった初回感作より１４日目より表示用量のヒト安定化ガレクチン９（またはコントロールとしてPBS）を皮下投与し、足の腫れを経時的にモニターした。（b）は、３回／週投与の結果を示すグラフである。（c）は、一回の投与量を0.6mg/kgに固定し、１回／週または２回／週で投与した時の結果を示すグラフである。（b）及び（c）において、横軸は、初回感作時からの経過日数を表し、縦軸は、足の容積の増加率（％）を表す。「Vehicle」は、対照実験として溶媒のみ（ヒト安定化ガレクチン９の投与なし）で行った結果を表し、「non-arthritis」は、関節炎を発症していないラットの測定結果を表す。 実施例における、ヒト安定化ガレクチン９のラットにおける体内動態試験結果を示すグラフである。すなわち、同図は、Lewis　rat　(♀,　6～7週齢)に表示用量のヒト安定化ガレクチン９を単回皮下投与し、血漿中のヒト安定化ガレクチン９を特異的ELISAで測定した結果を表す。横軸は、経過時間を表し、縦軸は、血漿中のヒト安定化ガレクチン９濃度を表す。 実施例における、マウスMOG誘導性実験的アレルギー性脳炎（EAE）へのガレクチン９作用を示す図である。(a)　雌性C57BL/6Jマウス(WT)と同系統のガレクチン９ノックアウトマウス(Gal-9　KO)における経時的なEAE臨床スコアのグラフである。横軸は、免疫感作後の経過時間を表し、縦軸は、臨床スコアを表す。(b)　感作後20週目のマウス(WTとGal-9　KO(Gal-9-/-))脊髄のヘマトキシリン／エオシン染色と、抗CD3抗体による免疫染色の組織顕微鏡写真である。(c)　感作後20週目のEAE感作野生型マウス(WT)、EAE感作ガレクチン９ノックアウトマウス(Gal-9　KO)および週齢をあわせた未感作マウス(Naive)より、それぞれ調製した鼠径部リンパ節の細胞を、CD4、CD25、IL-17及びFoxp3抗体で染色した結果を示す図である。図中、「Naive」は、ナイーブT細胞を表す。(d)　CD4+　CD62L+ナイーブT細胞を野生型マウス(WT)及びガレクチン９ノックアウトマウス(Gal-9　KO)の脾臓細胞より調製し、抗CD3抗体をコーティングした96-ウェルプレート中で抗CD28抗体を添加して培養(No　skewed)、またはさらにヒトTGF-β1、マウスIL-2及びマウスIL-6を添加して培養し、TH17細胞分化を誘導した(TH17　skewed)結果を示すグラフである。より具体的には、96時間培養後の培養上清中のIL-17A濃度をELISAで定量した結果を表す。(e)上記(d)で培養上清を抽出後に残った細胞内のIL-10　mRNA量をリアルタイムRT-PCR法で定量した結果を示すグラフである。(f)　上記(a)の系で雌性C57BL/6JマウスにEAEを発症させ、感作後14日目と16日目にヒト安定化ガレクチン９を皮下投与（コントロール群にPBSを投与）し、感作19日目まで臨床スコアを記録し、その後マウス脊髄をヘマトキシリン／エオシンで組織染色した結果を示す図である。グラフ中、横軸は、免疫感作後の経過時間を表し、縦軸は、臨床スコアを表す。 実施例における、ガレクチン９によるTH17細胞分化抑制が、Tim3/Gal-9相互作用に依存するか否かを調べた結果を示すグラフである。(a)　図３(d)の方法でナイーブT細胞にTH17細胞分化誘導刺激を96時間与え、ヒト安定化ガレクチン９（30nM）を表示の期間添加して培養上清中のIL-17A濃度をELISAで定量した結果を表す。横軸は、ガレクチン９による処理時間を表し、縦軸は、IL-17A濃度を表す。(b)　ヒト安定化ガレクチン９存在下でTH17細胞分化誘導刺激を24時間与え、IL-17F、IL-21、IL-22及びIL23R　mRNA発現をリアルタイムRT-PCR法で定量した結果を示すグラフである。(c)　ナイーブT細胞をTH17分化誘導刺激下で24時間培養した場合(TH17　skewed)と、同分化誘導刺激よりTGF-β1及びIL-6を除いた場合(No　skewed)のフローサイトメトリーによるCD4+Tim-3+細胞の解析（左）とTim-3中和抗体存在下でヒト安定化ガレクチン９によるTH17分化誘導抑制アッセイを行った結果（右）を示すグラフである。(d)　ナイーブT細胞をTH17分化誘導刺激下で96時間培養後、ヒト安定化ガレクチン９を添加してアポトーシスを起こしたTim-3陽性細胞(TH17細胞)をフローサイトメトリーで測定した結果を示すグラフである。 実施例において、ガレクチン９によるTH17分化誘導抑制に、N-結合型糖鎖とO-結合型糖鎖のいずれが関与するかを調べた結果を示すグラフである。(a)　TH17分化誘導アッセイをヒト安定化ガレクチン９と表示濃度のラクトース（ガレクチン阻害剤）存在下で行った結果を示す。ラクトースのコントロールにはスクロースを用いた。横軸は、ラクトース又はスクロースの濃度を表し、縦軸は、IL-17Aの濃度を表す。(b)　（a）のTH17分化誘導アッセイをN-グリコシレーション阻害剤のswainsonine(2μg/ml)またはO-グリコシレーション阻害剤のBenzyl　N-acetyl-α-D-galactosaminide(Benzyl-α-GalNAc,　2mM)中で行った結果を表すグラフである。横軸は、swainsonine又はBenzyl-α-GalNAcの濃度を表し、縦軸は、IL-17Aの濃度を表す。 実施例において、TH1,　TH2　及びTH17細胞分化に及ぼすGal-9の効果を測定した結果を示すグラフである。(a)　ナイーブT細胞をTH1、TH2またはTH17に分化誘導するアッセイ系にヒト安定化ガレクチン９(またはコントロールのPBS)を添加し、それぞれの分化を各THサブタイプに特異的なmRNA発現で定量した結果を表す。No　skewedはTCR刺激のみの場合。(b)上記(a)の安定化ガレクチン９存在下でTH17分化誘導を行った細胞のIFN-γ及びIL-4　mRNAの発現を表す。 実施例において、ガレクチン９によるTH17/Tregバランス調整がIL-2に依存するか否かを調べた結果を示す図である。(a)ナイーブT細胞にヒト安定化ガレクチン９(またはコントロールのPBS)を添加し、TH17分化誘導条件下に培養した細胞のCD4+CD25+細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した結果を表す図である。(b)上記(a)のCD4+CD25+Foxp3+細胞の割合を表す図である。(c)ナイーブT細胞にヒト安定化ガレクチン９(コントロールはPBS)及び表示濃度のIL-2を添加して、TH17分化誘導条件下に培養し、培養上清中のIL-17A濃度をELISAで定量した結果。(d)上記(c)の条件で培養した時のTreg細胞(CD4+CD25+Foxp3+細胞)の割合をフローサイトメトリーで測定した結果を示すグラフである。(e)　ナイーブT細胞にヒト安定化ガレクチン９(コントロールはPBS)を添加し、TH17分化誘導条件下に培養した後、PMAとイオノマイシン及びbrefeldin　A存在下で更に培養し、CD4陽性細胞中のIL-17+Foxp3-細胞とIL-17-Foxp3+細胞の割合をフローサイトメトリーで測定した結果を表す図である。(f)ナイーブT細胞を上記(e)の条件で培養し、各時点でCD25及びFoxp3のmRNA発現をリアルタイムRT-PCRで定量した結果を表すグラフである。横軸は、経過時間を表し、縦軸は、発現量を表す。 実施例における、細胞表面にガレクチン９を発現するCD4陽性　T細胞（THGAL9）の確認（同定）を表す図である。(a)ナイーブT細胞を図６ａの各条件、及び未刺激(No　stim)で培養し、培養上清中のガレクチン９濃度をELISAで定量した結果を表す。TCR刺激のみはNo　skewedと表記した。(b)ナイーブT細胞をTH17に分化誘導する条件（TH17　skewed；　TCR刺激に加えてIL-2、TGF-β1及びIL-6刺激）またはそれからIL-6を除いたもの(TGF-β1　alone)、またはそれからTGF-β1を除いたもの(IL-6　alone)またはTCR刺激のみ(No　skewed)の各条件で培養後に上清中のガレクチン９をELISAで定量した結果を表す。(c)ナイーブT細胞にヒト安定化ガレクチン９(またはコントロールのPBS)を添加し、未刺激(No　stim)、TCR刺激のみ(No　skewed)及びTH17分化誘導刺激条件下で培養した後、上清中のガレクチン９をELISAで定量した結果を表す。(d)上記(c)の細胞を用いてガレクチン９mRNA量をリアルタイムRT-PCRで定量した結果を示す。(e)上記(a)の各条件で培養した細胞の、細胞表面ガレクチン９とCD25を染色してフローサイトメトリーで測定した結果を示す。(f)上記（e）のNo　skewed条件で培養した細胞を細胞表面ガレクチン９陽性（Gal-9+）と陰性（Gal-9-）に分けてソーティングし、ガレクチン９mRNAをリアルタイムRT-PCRで定量した結果(左)及びそれら細胞を固定化／細胞膜浸透化後に抗ガレクチン９抗体で染色して細胞の全ガレクチン９を染色した時のフローサイトメトリーによる測定結果を示す。 実施例において、THGAL9の機能を調べた結果を示す。(a)マウス脾臓細胞より調製したナイーブT細胞（左側）を、細胞表面ガレクチン９陽性（THGAL9細胞：Gal-9＋TH)と陰性（non-THGAL9：Gal-9-TH)にソーティングし（中側）、それぞれをTCR刺激して培養上清中に分泌されたガレクチン９をELISAで定量した結果（右側）を示す。(b)上記細胞のサイトカインmRNA発現をリアルタイムRT-PCRで調べた結果を示す。(c)ナイーブT細胞をTH17分化誘導刺激下で培養後、THGAL9細胞(Gal-9＋TH)またはnon-THGAL9(Gal-9-TH)細胞と1:1の比で混合し、その後はTCR刺激のみを与えて共培養し、培養上清中のIL-17AをELISAで（左側）、Foxp3　mRNAの発現をリアルタイムRT-PCRで定量（右側）した結果を示す。(d)上記の共培養を、ガレクチン９の阻害剤、ラクトース(またはコントロールのスクロース)存在下で行い、培養上清中のIL-17A濃度をELISAで定量した結果を示す。（e）上記（c）の共培養をIL-10中和抗体またはTGF-β中和抗体存在下で行った結果を示す。（f）ナイーブT細胞をIL-10またはヒト安定化ガレクチン９存在下にTH17分化誘導刺激し、培養上清中のIL-17A濃度をELISAで定量した結果を示す。 実施例において、CD25+THGAL9からのガレクチン９、IL-10及びTGF-β1の産生を調べた結果を示すグラフである。(a)ナイーブCD4　T細胞をTCR刺激下で培養し、ソーティングによりCD25+THGAL9、CD25+non-THGAL9及びCD25-non-THGAL9に分離後、それぞれの細胞をさらにTCR刺激下で培養し、培養上清中のガレクチン９濃度をELISAで定量した結果を示す。(b)上記(a)の細胞のIL-10及びTGF-β1発現をリアルタイムRT-PCRによって定量した結果を示す。 実施例において、THGAL9細胞がガレクチン９添加により誘導されることを調べた結果を示すグラフである。（a）ナイーブCD4　T細胞にヒト安定化ガレクチン９(またはコントロールのPBS)を添加し、未刺激(No　stim)、TCR刺激のみ(Neutral)またはTH17分化誘導刺激条件下（Th17　skewed）で培養した後、細胞表面のガレクチン９、CD25の発現をフローサイトメトリー法で調べた結果を示す。（b）ナイーブCD4　T細胞をIL-10中和抗体、IL-10R中和抗体またはTGF-β中和抗体の存在下でTCR刺激し、THGAL9細胞の出現をフローサイトメトリー法で調べた結果を示す。（c）ナイーブCD4　T細胞にIL-10またはヒト安定化ガレクチン９を添加し、TCR刺激下で培養した後、THGAL9細胞の出現をフローサイトメトリー法で調べた結果を示す。 実施例において、THGAL9とTr1に高い類似性があることを検証した結果を示す図である。(a)ナイーブCD4+T細胞を細胞表面ガレクチン９を染色すると共に、既報のTr1細胞マーカーであるLAP、NKG2D、LAG-3及び　CTLA-4の各抗体で染色し、フローサイトメトリー法で調べた結果を示す。(b)　ナイーブCD4+T細胞をTCR刺激し、CD25陽性となったT細胞集団で（a）と同じ染色及びFoxp3染色を行い、フローサイトメトリー法で調べた結果を示す。（c）（b）で調製した細胞を細胞表面のガレクチン９、Tim-3及びCD25の発現をフローサイトメトリー法で調べた結果を示す。(d)ナイーブCD4+T細胞をIL-27添加によるTr1細胞分化刺激下で培養した後、PMAとイオノマイシンで更に刺激し、培養上清中のIL-10をELISAで定量した結果を示す。(e)上記(d)の培養上清中のガレクチン９をELISAで定量した結果を示す。(f)上記(d)のPMA／イオノマイシン処理をbrefeldin　A　(10　μg/ml)存在下で行って細胞内部にIL-10を蓄積させ、細胞表面のガレクチン９と細胞内のIL-10を染色してフローサイトメトリー法で測定した結果を示す。 実施例において、ガレクチン９ノックアウトマウスではTr1マーカーを持つ細胞が減少することを調べた結果を示す。（a）ガレクチン９ノックアウトマウスと野生型マウスの脾臓細胞におけるCD4、NKG2D、LAG-3、LAP、CTLA-4の発現をフローサイトメトリー法で測定した結果を示す。（b）ガレクチン９ノックアウトマウスと野生型マウスのナイーブCD4　T細胞をTCR刺激のみ（No　skewed）またはTH17分化誘導刺激条件下（Th17　skewed）で培養し、IL-10　mRNAの発現をリアルタイムRT-PCRで調べた結果を示す。（c）（b）のNo　skewed条件で培養した細胞をbrefeldin　A　(10　μg/ml)存在下でPMA／イオノマイシン処理時を行い、細胞内部に蓄積したIL-10を染色してフローサイトメトリー法で測定した結果を示す。 実施例において、ヒトTH17/Treg分化に対するガレクチン９の作用を調べた結果及びヒトTHGAL9細胞を同定した結果を示す。(a)健常人4人より得た抹消血CD4+T細胞にヒト安定化ガレクチン９（若しくはコントロールのPBS）を添加し、TCR刺激下または未刺激で培養してCD25陽性細胞をフローサイトメトリー法で測定した結果を示す。(b)上記(a)細胞のCD25+Foxp3+割合をフローサイトメトリー法で測定した結果を示す。(c)ヒトCD4+T細胞にヒト安定化ガレクチン９（若しくはコントロールのPBS）を添加し、TH17細胞分化誘導刺激下で培養して、培養上清中のIL-17をELISAで定量した結果を示す。(d)ヒトCD4+T細胞をTCR刺激下、または未刺激で培養し、細胞表面のガレクチン９とCD25を染色してフローサイトメトリー法で測定した結果を示す。(e)ヒトCD4+T細胞をTCR刺激下培養した後、ソーティングにより細胞表面ガレクチン９陽性　(CD25+THGAL9)と陰性　(CD25+non-THGAL9)に分離し、それぞれをTCR刺激下でさらに培養後、上清中のガレクチン９をELISAで定量、各サイトカインmRNA発現をリアルタイムRT-PCRで測定した結果を示す。 重篤な腹膜炎モデルである盲腸結紮穿刺法（cecal　ligation　and　puncture：CLP）の処置を施したマウスを例示する写真である。 実施例において、ヒト安定化ガレクチン９の重篤な腹膜炎モデルにおける有効性を調べた結果を示すグラフである。盲腸結紮穿刺法（cecal　ligation　and　puncture：CLP）により腹膜炎を発症させ、経時的に生存率を調べた。（a）C57BL/6J野生型マウス（WT）とマウスガレクチン９のトランスジェニックマウス（Gal-9　Tg）の比較を示す。（b）WTマウスにCLPと同時にヒト安定化ガレクチン９（30μg/マウス;またはコントロールとしてPBS）を単回静脈内投与したときの生存率を示す。（c）WTマウスにCLP処置を施し、その24時間後にヒト安定化ガレクチン９（30μg/マウス;またはコントロールとしてPBS）を単回静脈内投与したときの生存率を示す。（d）WTマウスにCLP処置を施し、その24時間後にヒト安定化ガレクチン９（30　μg/マウス;またはコントロールとしてPBS）を単回皮下投与したときの生存率を示す。（e）ヌードマウスにCLPと同時にヒト安定化ガレクチン９（30μg/マウス;またはコントロールとしてPBS）を単回皮下投与したときの生存率を示す。各図において、横軸は、CLP処置後の経過日数を表し、縦軸は、生存率を表す。 実施例において、CLPマウスにヒト安定化ガレクチン９を投与することで起こるサイトカインバランスの変化を調べた結果を示すグラフである。同図は、WTマウスにCLPと同時にヒト安定化ガレクチン９（30μg/マウス;またはコントロールとしてPBS）を単回静脈内投与し、その24時後に取り出した脾臓細胞を24時間培養して、培養上清中のサイトカインをELISAで定量した結果を示す。縦軸は、サイトカインの濃度を表す。 実施例において、CLPマウスにヒト安定化ガレクチン９を投与することで誘導される細胞表面ガレクチン９陽性細胞を調べた結果を示す。WTマウスにCLPと同時にヒト安定化ガレクチン９（30μg/マウス;またはコントロールとしてPBS）を単回静脈内投与し、その24時後に取り出した脾臓細胞の細胞表面CD3ε、NK1.1、GL-3及び細胞表面ガレクチン９の発現を各抗体で染色してフローサイトメトリー法で測定した結果。CD3+NK1.1+：NKT細胞、CD3-NK1.1+:NK細胞、CD3+GL-3+:γσT細胞。THGAL9細胞はCD3+NK1.1-Gal-9+及びCD3+GL-3-Gal-9+の分画に含まれる。同図中の「Spleen　cells　from　CLP　mouse」は、「CLPマウスから取り出した脾臓細胞」を意味する。 既報のようにヒト安定化ガレクチン９を坦癌マウスに投与すると生存率が上昇するが、その際に起こる免疫細胞の変化及びそれら細胞表面のガレクチン９発現を実施例において調べた結果を示す。マウス繊維肉腫Meth　Aを既報の方法（非特許文献３２）に従って腹腔内に導入し、その直後よりヒト安定化ガレクチン９を3回／週投与（30μg/マウス）した。Meth　A移植より7日後に腹腔内細胞と脾臓細胞を取り出して表示の細胞表面マーカーを染色し、フローサイトメトリー法で測定した結果を示す。（a）腹腔細胞の内CD4陽性細胞をCD25と細胞表面ガレクチン９発現で展開した結果。ヒト安定化ガレクチン９投与によって細胞表面にガレクチン９を発現した細胞の割合が著しく増加し、一方CD25+Gal-9-は減少した。CD25+Gal-9-細胞は、癌に対する免疫を抑制すると考えられるTregを含む細胞集団である。（b）腹腔細胞の内CD8陽性細胞をCD25と細胞表面ガレクチン９発現で展開した結果を示す。ヒト安定化ガレクチン９投与によって細胞表面にガレクチン９を発現したCD8　細胞の割合が著しく増加している。（c）ヒト安定化ガレクチン９を投与したMeth　A坦癌マウスの脾臓細胞をPDCA-1、CD11c及び細胞表面ガレクチン９で染色し、フローサイトメトリー法で測定した結果を示す。形質細胞様樹状細胞：pDC、pDC様マクロファージ：pDC-Mφ、古典的樹状細胞：cDC、及び樹状細胞やマクロファージと異なる細胞：nonDCMφ（図中では、「other　spleen　cells」）のそれぞれで細胞表面ガレクチン９発現レベルを比較した。 実施例において、ヒト安定化ガレクチン９の自然発症性自己免疫疾患モデルでの有効性を調べた結果を示す。MRL/MpJUmmCrj-1pr/1prマウスは全身性エリテマトーデスのモデルとして汎用される自然発症性自己免疫疾患モデルである。このマウス（♀、8週齢）にヒト安定化ガレクチン９を表示の用量で3回／週のスケジュールで22週齢まで腹腔内投与し、経時的に後肢足蹠浮腫容積測定（週一回）、体重測定（週三回）、尿中蛋白濃度測定（週一回）を行った。本図では尿蛋白濃度変化（a）と体重変化（b）を調べた結果を示す。図２０（a）において、横軸は、投与後の経過週数を表し、縦軸は、尿中蛋白濃度を表す。すべてのデータは、所定の各時点におけるｎ＝７～１０の動物の平均値を表す。統計的な違いは、双方向のANOVAを用いて分析し、グループ間の差異は、ボンフェローニのposttestsを用いて評価した（*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001）。図２０（b）において、横軸は、投与後の経過日数を表し、縦軸は、体重増加量を表す。すべてのデータは、所定の各時点におけるｎ＝６～８の動物の平均値±SEMを表す。統計的な違いは、双方向のANOVAを用いて分析し、グループ間の差異は、ボンフェローニのposttestsを用いて評価した（*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001）。 図２０の実験における後肢足蹠浮腫容積変化（a）と、実験終了時（22週齢目）のヘマトクリット値（b）を調べた結果を示す。図２１（a）において、横軸は、投与後の経過週数を表し、縦軸は、後肢足蹠浮腫容積変化を表す。すべてのデータは、所定の各時点におけるｎ＝６～１０の動物の平均値±SEMを表す。統計的な違いは、双方向のANOVAを用いて分析し、グループ間の差異は、ボンフェローニのposttestsを用いて評価した（*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001）。図２１（b）において、横軸は、ヒト安定化ガレクチン９投与用量を表し、縦軸は、実験終了時（22週齢目）のヘマトクリット値を表す。すべてのデータは、所定の各時点におけるｎ＝６～８の動物の平均値±SEMを表す。統計的な違いは、双方向のANOVAを用いて分析し、グループ間の差異は、ダネットの多重比較検定を用いて評価した（*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001）。 実施例において、ヒト安定化ガレクチンの抗体産生に与える影響を調べた結果を示す。羊赤血球（SRBC）をマウスに投与すると羊赤血球に対するIgM抗体産生が著しく惹起されるため、このシステムは薬物の抗体産生への影響を調べる目的に汎用される。C57BL/6Jマウス(♀)にSRBCを腹腔内投与し、その直後にヒト安定化ガレクチン９（30μg/マウス）またはコントロールとしてPBSを単回腹腔内投与した。それぞれの時点で、3-5匹のマウスより採血及び脾臓摘出を行い抗体産生及びB細胞を調べた。（a）SRBC特異的なIgM濃度、（b）全IgM濃度、（c）全IgG濃度をそれぞれの特異的なELISAで調べた結果を示す。（d）MRL/MpJUmmCrj-1pr/1prマウス（♀、8週齢）に30μg/マウスのヒト安定化ガレクチン９またはコントロールとしてPBSを3回／週投与し、7日目に採血した。血清中の抗二本鎖DNA抗体（代表的な自己抗体）濃度を特異的なELISAで測定した結果を示す。図中、「Days　after　SRBC　injection」は、SRBC腹腔内投与後の経過日数を意味する。 実施例における、脾臓細胞に含まれるGerminal　center　B細胞のフローサイトメトリー法による解析方法を示す。脾臓細胞を抗CD19抗体と抗GL-7抗体で染色し、CD19+GL-7+の細胞集団をGerminal　center　B細胞とした。Germinal　center　B細胞を構成するCentrocyteとCentroblastは細胞の大きさが異なり、Centroblastの方が大きいことが知られている。そこでGerminal　center　B細胞集団をFSCとSSCに展開し、細胞の大きさに相関するFSCで約350付近を目安に二つの細胞集団に分離し、仮にそれぞれCentrocyteとCentroblastとした。それぞれのCXCR4発現を調べたところ、Centroblastで高い発現が確認された。これは公知のCentroblastとCentrocyteの性質に一致する。よって以後の解析でCentrocyteとCentroblastを分離して解析する必要がある際には本図に示した方法、すなわちCD19+GL-7+の細胞集団をFSCとSSCに展開して分離する方法で行った。 実施例において、ガレクチン９はB細胞にも作用することを調べた結果を示す。C57BL/6Jマウス(♀)またはガレクチン９ノックアウトマウスにSRBCを腹腔内投与し、その直後にヒト安定化ガレクチン９（30μg/マウス）またはコントロールとしてPBSを単回腹腔内投与した。それぞれの時点で、3-5匹のマウスより採血及び脾臓摘出を行い、B細胞を図２３に示したフローサイトメトリー法により調べた結果を示す。（a）SRBC投与後4日目のフローサイトメトリー法による解析結果の一例を示す。（b）Germinal　center　B細胞（GC　B　cell）、CentroblastおよびCentrocyte数の経時変化を示す。「Day　post　immunization」は、免疫感作後の経過日数を意味する。（c）SRBC投与後4日目のGerminal　center　B細胞（GC　B　cell）、CentroblastおよびCentrocyte数を示す。ガレクチン９ノックアウトマウス（Gal-9　KO）にはSRBC投与後にPBSを投与した。 実施例において、B細胞の細胞表面にガレクチン９が発現していることを調べた結果を示す。（a）SRBC投与7日目の脾臓細胞を、図２３に示したフローサイトメトリー法でGerminal　center　B細胞とその他のB細胞に分離し、それぞれの細胞集団の細胞表面ガレクチン９発現を調べた結果を示す。（b）（a）のGerminal　center　B細胞を図２３に示したフローサイトメトリー法で更にCentrocyteとCentroblastに分離し、それぞれの細胞集団の細胞表面ガレクチン９発現を調べた結果を示す。（c）図２４（B）で調べたGerminal　center　B細胞の細胞表面ガレクチン９発現を調べた結果を示す。SRBC投与によって細胞表面にガレクチン９を発現したGerminal　center　B細胞の割合は増加したが、ヒト安定化ガレクチン９を投与してもその割合に変化は無かった。 実施例において、抗体産生刺激下の脾臓細胞中ヘルパーT細胞のサブタイプと、それぞれの細胞表面ガレクチン９発現を解析した結果を示す。前述のようにガレクチン９は抗体産生及びB細胞にも作用する。生体内でB細胞の分化、抗体産生はヘルパーT細胞に制御されており、特にFollicular　B　helper　T　cells　(TFH)と呼ばれるCD4陽性細胞の役割が大きいと言われている。そこで、SRBC投与前（Day0）と投与7日目（Day7）のマウス脾臓細胞をCD4及びTFHのマーカーと言われているCXCR5及びICOSで染色し、それぞれの細胞集団の細胞表面ガレクチン９発現をフローサイトメトリー法により調べた。（a）CD4陽性細胞をCXCR4とICOS発現で展開したドットプロットの例と、CXCR4とICOS発現で4分割した各細胞集団の細胞表面ガレクチン９発現を示す。（b）それぞれの細胞集団の割合の経時変化を示す。（c）ヒト安定化ガレクチン９投与によってそれぞれのCD4陽性細胞の割合が変化するかどうかを調べた結果を示す。（d）それぞれの細胞集団の細胞表面ガレクチン９陽性割合がSRBC投与後に上昇する結果を示す。（e）それぞれの細胞集団の細胞表面ガレクチン９の発現量（MFI）がSRBC投与後に上昇する結果を示す。図中、「Days　after　SRBC　injection」は、SRBC腹腔内投与後の経過日数を意味する。 ヒト安定化ガレクチン９投与によって起こる作用を模式的に例示する図である。 実施例における、ガレクチン９改変体組換え蛋白質の電気泳動図である。 実施例において、ガレクチン９投与がLLC坦癌マウスの生存を延長し、その際にpDC様マクロファージが増加したことを示す図である。（a）マウス肺癌由来腫瘍細胞株LLCを腹腔接種したマウスに、30μgのヒト安定化ガレクチン９（またはコントロールとしてPBS）を3回／週で坦癌時より腹腔内投与した時の生存率を調べた結果を示すグラフである。横軸の「Days　after　tumor　inoculation」は、腫瘍接種後の日数を意味する。縦軸の「Percent　survival」は、生存率を表す。（b）LLC接種７日後の腹腔内細胞をマクロファージマーカー（Ly-6C及びF4/80）、樹状細胞マーカー（CD11c）及び形質細胞用樹状細胞マーカー（PDCA-1）の抗体で染色し、フローサイトメトリーで解析した結果を示す。 実施例において、ガレクチン９が試験管内でM-CSFによるCD11c陽性細胞の分化をTim-3非依存的に促進したことを示す図である。（a）マウス骨髄細胞をGM-CSFまたはM-CSF中で7日間培養して樹状細胞への分化を促進し樹状細胞のマーカーの一つであるCD11cの発現を調べた。安定化ガレクチン９（30nM）の分化へ与える影響を調べた結果を示す。（b）（a）の分化アッセイをガレクチン９の阻害剤であるラクトース（コントロールにはスクロース）またはTim-3の中和抗体中で行った結果を示す。 実施例において、ガレクチン９とM-CSFで分化したCD11c陽性細胞がpDC様マクロファージの前駆体細胞であることを確認した結果を示す図である。（a）図３０のM-CSFまたはM-CSFとガレクチン９で7日間培養した細胞を表示のマクロファージ及び樹状細胞マーカーの抗体で染色し、フローサイトメトリー法で解析した結果を示す。グレーで内塗られたヒストグラムはアイソタイプコントロール、グレーの実線がM-CSFで分化させたマクロファージを表示の抗体で染色したもの、黒の実線がM-CSFとガレクチン９で分化させたマクロファージを表示の抗体で染色したもの。（b）上記細胞の転写因子mRNA発現をリアルタイムRT-PCRで解析し、β2ミクログロブリンまたはグリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼのmRNA発現で標準化した結果を縦軸に示す。それぞれサンプル数は４で統計解析を行っている。（c）上記細胞のToll-likeリセプターmRNA発現をリアルタイムRT-PCRで解析し、β2ミクログロブリンまたはグリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼのmRNA発現で標準化した結果（Relative　mRNA　level：相対的なRNAレベル）を縦軸に示す。それぞれサンプル数は４で統計解析を行っている。（d）上記細胞に表示のToll-likeリセプターアゴニストを添加して6時間後のIFN-αとIFN-βmRNA発現をリアルタイムRT-PCRで解析し、β2ミクログロブリンまたはグリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼのmRNA発現で標準化した結果を縦軸に示す。それぞれサンプル数は４で統計解析を行っている。横軸の「Stimulated　with」は、どのアゴニスト（または、対照としてのPBS）で刺激したかを意味する。 実施例において、ガレクチン９とM-CSFで分化したCD11c陽性細胞がLPS刺激によってpDC様マクロファージに成熟したことを示す図である。（a）図３０の方法でM-CSFとガレクチン９で分化したマクロファージをLPS中で24時間培養し（コントロールはPBS）、CD11c、PDCA-1、F4/80およびLy-6Cの発現をフローサイトメトリー法によって解析した結果を示す。（b）図３０の方法でM-CSFとガレクチン９で分化したマクロファージをLPS中で6時間または24時間培養し、表示のmRNA発現をリアルタイムRT-PCRで解析した結果（Relative　mRNA　level：相対的なRNAレベル）を縦軸に示す。（c）図３０の方法でM-CSFとガレクチン９で分化させたマクロファージをLPSで24時間培養した（コントロールはPBS)）後、I-A/I-Eの発現をフローサイトメトリー法で解析した結果の一例を示す。グレーのヒストグラムはアイソタイプコントロール、破線のヒストグラムがPBSコントロール、実線のヒストグラムがLPS刺激。LPS処理群とコントロールPBS群（それぞれn=4）で、I-A/I-E陽性細胞の割合を棒グラフに表し、統計解析した結果を示す。 実施例において、LPS刺激によってより成熟した表現系を持つようになったpDC様マクロファージの機能を調べた結果を示す図である。（a）図３２（a）の方法でLPS刺激を与えることで成熟させたpDC様マクロファージに横軸に表示した各TLRアゴニスト（コントロールはPBS）を添加し、18時間培養した培養上清中のIFN-αとIFN-βをELISAで調べた結果を示す。縦軸は濃度を表す。サンプル数は各４で統計解析している。***P<0.001。（b）図３２（a）の方法でLPS刺激を与えることで成熟させたpDC様マクロファージがNK細胞を活性化して抗癌活性を高めることを調べた結果を示す。左図横軸表示のNKはマウスリンパ腫Yac-1細胞とマウスより調製したナイーブNK細胞共培養（Yac-1:NK=1:30）した場合、NK+ｐDC-MφはYac-1、ナイーブNK及び成熟したpDC様マクロファージを1:30:60の割合で共培養した場合、（－）はYac-1単独培養の結果で、それぞれ5時間培養後に細胞死を起こしたYac-1細胞の割合をフローサイトメトリー法で解析して縦軸に示した。サンプル数はそれぞれ４で統計解析している。***P<0.001。右図はナイーブNK細胞と成熟したpDC様マクロファージを5時間共培養した後にNK細胞のGranzymeBとPerforin発現をフローサイトメトリー法で調べた結果を示す。サンプル数はそれぞれ４で統計解析している。*P<0.05。
　以下、本発明についてさらに詳細に説明する。ただし、本発明は、以下の説明により限定されない。
　本発明者らは、鋭意研究を行い、ガレクチン９による免疫制御の詳細を明らかにすること、中でもTH17とTreg細胞の分化制御の詳細と、生体内でガレクチン９を分泌し、免疫反応を制御する細胞の同定に注力した。こうした中で本発明者らは、ガレクチン９を分泌する新規のCD4陽性T細胞（THGAL9細胞）を同定することに成功し、この細胞がTH17とTreg細胞の分化を制御することを明らかにした。さらに本発明者らはin　vitroにおいてTHGAL9細胞がガレクチン９の添加で増加することを発見した。THGAL9細胞は、細胞表面にガレクチン９を発現しているだけでなく、既知のTr1細胞マーカーも発現しており、またIL-10を分泌することから現時点で定義されるTr1細胞と同一またはその部分集団である可能性が示唆された。その場合、ガレクチン９はTr1細胞のマーカーとしても有用であり、Tr1細胞の精製とその治療への応用へも極めて重要となる。なお、本発明において、「細胞表面」は、特に限定されないが、例えば、細胞膜の細胞外に面した側の表面をいう。すなわち、ガレクチン９を細胞表面に発現している状態とは、特に限定されないが、例えば、ガレクチン９を細胞膜またはその表面に発現しており、ガレクチン９の全体または一部を細胞外に露出している状態をいう。
　本発明者らは、自己免疫疾患モデルの一つであるマウスEAEモデルを用いてガレクチン９によるTH17細胞分化抑制とTreg細胞分化促進はIL-2に依存するがTim-3には依存しないことを明らかにした。一方で、ガレクチン９は、分化したTim-3陽性TH17細胞にTim-3依存的なアポトーシスを誘導した。本発明者らは、CD4陽性T細胞の中に、ガレクチン９を細胞表面に発現した集団があることを見出した。以下において、ガレクチン９を細胞表面に発現したCD4陽性T細胞を「THGAL9細胞」ということがある。THGAL9細胞をTCRで刺激すると、例えば、CD25の発現上昇に引き続いてガレクチン９やIL-10を分泌することが可能である。Treg細胞もIL-10を分泌することがあるが、THGAL9細胞はTregのマーカーであるFoxp3を発現しておらず、Treg細胞とは異なる細胞であると考えられた。THGAL9は既報のIL-10産生タイプ1制御性T細胞（Tr1細胞）マーカーの全てを発現していた。ところが、これらのTr1マーカーは、TCR刺激を受けた殆どのCD25陽性CD4細胞が発現誘導するためにTr1の決定的なマーカーでは無かった。興味深いことにTHGAL9以外のCD4+T細胞も細胞内部にはTHGAL9と同等量のガレクチン９を発現していた。THGAL9細胞をTH17細胞分化にコミットしたナイーブT細胞と共培養するとIL-17の産生を抑制し、Treg細胞を増加させた。これらの作用はリコンビナントガレクチン９と同様であり、生体内でガレクチン９の分泌を介した免疫制御を行う細胞が、THGAL9細胞であることが強く示唆された。また、ヒトにも同様の性質を持つTHGAL9細胞が存在することが示された。以上の知見は、細胞表面のガレクチン９はTr1の優れたマーカーであり、さらにはTHGAL9細胞は自己免疫疾患、アレルギー疾患や腫瘍その他の疾患治療に直接または間接的に使用可能な極めて有用な細胞であることを示すものである。
　さらに、本発明者らは、THGAL9細胞によるTH17細胞分化抑制はガレクチン９の阻害剤によって抑制されるが、IL-10やTGF-β阻害剤では抑制されないことを示し、本抑制においてはガレクチン９が活性の本体であることを明らかにした。
　さらに、本発明者らは、CD4陽性T細胞以外の他のT細胞、γδT細胞、ナチュラルキラー細胞（NK細胞）、B細胞等においても、同様に、細胞表面にガレクチン９を発現している細胞が存在することを見出し、本発明の細胞を発明するに至った。本発明の細胞は、前述のとおり、ガレクチン９を含む細胞であって、前記ガレクチン９を細胞表面に発現していることを特徴とし、それ以外は特に限定されない。
　本発明の細胞がガレクチン９を細胞表面に発現していることは、本発明の細胞がガレクチン９を分泌する細胞であることを裏付けていると考えられる。すなわち、細胞内部のガレクチン９が分泌されて細胞外部に排出される過程で、細胞表面におけるガレクチン９発現が観察されると考えられる。ただし、この説明は、可能性のあるメカニズムの一つを示すものであり、本発明の細胞は、この説明により限定されない。
　本発明の細胞（THGAL9細胞等）は、例えば、自己免疫疾患、アレルギー疾患や腫瘍その他の疾患治療に直接または間接的に使用可能な極めて有用な細胞であり、例えば、免疫制御をして病気の予防・治療に有用であり、また、例えば、感染症対策、免疫疾患、臓器移植などの医療分野、さらには、アッセイ、バイオなどの分野に用いる試薬などとしても有用である。
　なお、本発明において、「ガレクチン９」とは、天然（野生型）ガレクチン９のみに限定されず、例えば、天然（野生型）ガレクチン９と実質的に同等の活性を有するガレクチン９改変体（バリアント）等であっても良い。ガレクチン９改変体は、例えば、ガレクチン９の糖鎖認識部位が保有する特定の糖鎖に対して特異的に結合するといった活性又はそれと類似した活性（本活性のうちには定性的な活性及び／又は定量的な活性が含まれてよい）を提供する物質であっても良い。ガレクチン９（野生型ガレクチン９）は、例えば、特定の細胞に対してアポトーシス誘導活性を有するが、本発明において、前記ガレクチン９改変体は野生型ガレクチン９が有するアポトーシス誘導活性あるいはそれと類縁の活性を有するものであってよく、ガレクチン９が有する生物活性が改変又は修飾されているものであってよいし、ある場合には好ましい。本発明において、ガレクチン９改変体とは、生物活性を有する試薬として、臨床検査の分野、分析の分野、あるいは医学又は医薬などの分野で、野生型ガレクチン９と同等又は野生型ガレクチン９よりは好ましい性質を示すものであっても良い。
　本発明において、「ガレクチン９改変体」は、特に限定されないが、例えば、特許文献１に記載のガレクチン９改変体等であっても良く、より具体的には、例えば、以下のとおりである。ガレクチン９改変体は、例えば、野生型ガレクチン９又はそれと実質的に同等の活性を有するタンパク質のリンクペプチド又はその近傍領域が改変されているタンパク質又はその塩、野生型ガレクチン９又はそれと実質的に同等の活性を有するタンパク質のリンクペプチド又はその近傍領域のアミノ酸配列において１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、野生型ガレクチン９と比較して少なくともリンクペプチドに対する分解感受性が改質されているといった改変の施されたタンパク質又はその塩、野生型ガレクチン９と実質的に同等の活性を有するタンパク質であって且つガレクチン９のアミノ酸配列と少なくとも70％以上の相同性、又は少なくとも75％以上の相同性、又は少なくとも80％以上の相同性、又は少なくとも85％以上の相同性、又は少なくとも90％以上の相同性、又は少なくとも95％以上の相同性を有するタンパク質又はその塩、(1)野生型ガレクチン９のN末端側の糖鎖認識領域(NCRD)又はそれと実質的に同等の活性を有するポリペプタイドと(2)野生型ガレクチン９のC末端側の糖鎖認識領域(CCRD)又はそれと実質的に同等の活性を有するポリペプタイドとを、(3)野生型ガレクチン９のリンクペプチドのアミノ酸配列において１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる改変リンクペプチドを介して結合してあるタンパク質又はその塩などであってよい。
　好ましい態様では、ガレクチン９改変体は、例えば、(1)野生型ガレクチン９のNCRDとして下記配列番号７に示されているアミノ酸配列又はその配列において１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたもの、あるいは、下記配列番号７に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも70％以上の相同性、又は少なくとも75％以上の相同性、又は少なくとも80％以上の相同性、又は少なくとも85％以上の相同性、又は少なくとも90％以上の相同性、又は少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、ラクトース結合能を有するものであって、(2)野生型ガレクチン９のCCRDとして下記配列番号８に示されているアミノ酸配列又はその配列において１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたもの、あるいは、下記配列番号８に示されているアミノ酸配列に対して少なくとも70％以上の相同性、又は少なくとも75％以上の相同性、又は少なくとも80％以上の相同性、又は少なくとも85％以上の相同性、又は少なくとも90％以上の相同性、又は少なくとも95％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つ、ラクトース結合能を有するものであって、(3)上記(1)と(2)を結合しているリンク領域として下記配列番号９に示されているアミノ酸配列又はその配列において１個又はそれ以上のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたもので、好ましくはマトリックスメタロプロテアーゼなどのタンパク分解酵素に対してネイティブな（野生型の）ガレクチン９より安定化されているものが挙げられる。当該リンク領域(3)としては、下記配列番号９に示されているアミノ酸配列中のアミノ酸残基が１個以上（例えば、１～2個、好ましくは3～4個、さらに好ましくは5～6個、さらに好ましくは7～8個、特には１～9個など）欠けている欠失類縁体、該アミノ酸残基の１個以上（例えば、１～9個、好ましくは1～8個、さらに好ましくは１～6個、さらに好ましくは１～4個、特には１～2個など）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個以上（例えば、１～60個、好ましくは１～40個、さらに好ましくは１～20個、さらに好ましくは１～10個、特には１～5個など）のアミノ酸残基（ただし、下記配列番号１０及び１１に示されているアミノ酸配列のうち下記配列番号９に示されているアミノ酸配列を除いた部分で示されるものは除く）が付加されている付加類縁体も包含する。代表的な場合、当該リンク領域(3)としては、下記配列番号９に示されているアミノ酸配列をHM,RIP,又は任意の２アミノ酸の配列で置換したものなどが挙げられる。アミノ酸の置換、欠失、あるいは挿入は、ポリペプチドの生理的な特性や化学的な特性に大きな変化を生ぜしめないものであることもできるし、ある場合には好ましい変化を与えるものであることができる。該アミノ酸配列中のアミノ酸の置換体としては、そのアミノ酸が属するところのクラスのうちの他のアミノ酸類から選ぶことができる。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、トリプトファン、メチオニンなどが挙げられ、極性（中性）としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミンなどが挙げられ、陽電荷をもつアミノ酸（塩基性アミノ酸）としては、アルギニン、リジン、ヒスチジンなどが挙げられ、陰電荷をもつアミノ酸（酸性アミノ酸）としては、アスパラギン酸、グルタミン酸などが挙げられる。
　また、当該リンク領域(3)としては、下記配列番号１０又は１１に示されているアミノ酸配列を、下記配列番号９に示されているアミノ酸配列部分を除いて、HM,RIP,又は任意の２アミノ酸の配列で置換したもの,下記配列番号１０又は１１に示されているアミノ酸配列のうち下記配列番号９に示されているアミノ酸配列部分を除いてそのうちの６アミノ酸を残して、それ以外の残基を削除したものなどが挙げられる。また、当該リンク領域(3)としては、下記配列番号１０又は１１に示されているアミノ酸配列中のアミノ酸残基（ただし、例えば、下記配列番号９に示されているアミノ酸配列部分を除いて、あるいは、下記配列番号１０の場合、下記配列番号１１に示されているアミノ酸配列部分を除いてよい）が１個以上（例えば、１～5個、好ましくは3～10個、さらに好ましくは5～15個、さらに好ましくは7～20個、特には１～32個など）欠けている欠失類縁体、該アミノ酸残基の１個以上（例えば、１～9個、好ましくは1～8個、さらに好ましくは１～6個、さらに好ましくは１～4個、特には１～2個など）が他の残基で置換されている置換類縁体、１個以上（例えば、１～60個、好ましくは１～40個、さらに好ましくは１～20個、さらに好ましくは１～10個、特には１～5個など）のアミノ酸残基（ただし、下記配列番号１０及び１１に示されているアミノ酸配列のうち下記配列番号９に示されているアミノ酸配列を除いた部分で示されるものは除く）が付加されている付加類縁体も包含する。
　例えば、天然（野生型）のヒトガレクチン９タンパク質の特徴であるドメイン構造あるいは糖結合能が維持されている上記変異体は、全て本発明に包含される。また本発明のペプチドあるいはポリペプチドは天然のヒトガレクチン９タンパク質と実質的に同等の一次構造コンフォメーションあるいはその一部を有しているものも含まれてよいと考えられ、さらに天然のものと実質的に同等の生物学的活性を有しているものも含まれてよいと考えられる。さらに天然に生ずる変異体の一つであることもできる。本発明において、ヒト由来のタンパク質（又はペプチドあるいはポリペプチド）は、例えば、WO02/37114A1の配列表のSEQ　ID　NO:1～3から成る群から選ばれたアミノ酸配列に対し、60%、場合によっては70%より高い相同性を有しているものが挙げられ、より好ましくはそれに対し、80%あるいは90%以上の相同アミノ酸配列を有するものが挙げられる。本発明において、ヒト由来のタンパク質の一部のものとは、該ヒト由来のタンパク質の一部のペプチド（すなわち、該タンパク質の部分ペプチド）であって、本発明の、ガレクチン９タンパク質と実質的に同等な活性を有するものであればいずれのものであってもよい。例えば、該本発明のタンパク質の部分ペプチドは、該ヒトガレクチン９の構成アミノ酸配列のうち少なくとも５個以上、好ましくは20個以上、さらに好ましくは50個以上、より好ましくは70個以上、もっと好ましくは100個以上、ある場合には200個以上のアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられ、好ましくはそれらは連続したアミノ酸残基に対応するものであるか、あるいは、例えば、該WO02/37114A1の配列表のSEQ　ID　NO:1～3のいずれか一で示されるアミノ酸配列のうち対応する領域に対する相同性に関して、上記と同様の相同性を有するものが挙げられる。
（配列番号７）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
（配列番号８）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
（配列番号９）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000003
（配列番号１０）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000004
（配列番号１１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000005
　本発明において、ガレクチン９改変体の活性と野生型（天然）ガレクチン９の活性が「実質的に同等」とは、例えば、前記ガレクチン９改変体が天然型ガレクチン９の糖鎖認識活性を保持していることをいう。別の観点からは、ガレクチン９改変体の活性と野生型（天然）ガレクチン９の活性が「実質的に同等」とは、例えば、タンパク質の活性、より具体的には、例えば、所定の細胞傷害活性、アポトーシス誘起活性、抗炎症活性、抗アレルギー活性、免疫調節活性、糖鎖結合活性、生理的な活性、生物学的な活性が実質的に同じであることを意味する。さらにまた、その用語の意味の中には、実質的に同質の活性を有する場合を包含していてよく、該実質的に同質の活性としては、結合活性、細胞傷害活性、アポトーシス誘起活性などを挙げることができる。該実質的に同質の活性とは、それらの活性が性質的に同質であることを示し、例えば、生理的に、薬理学的に、あるいは生物学的に同質であることを示す。例えば、結合活性、細胞傷害活性、アポトーシス誘起活性などの活性が、同等(例えば、約0.001～約1000倍、好ましくは約0.01～約100倍、より好ましくは約0.1～約20倍、さらに好ましくは約0.5～約2倍)であることが好ましいが、これらの活性の程度、タンパク質の分子量などの量的な要素は異なっていてもよい。
　本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び／又は改変（あるいは修飾）をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
　本発明ではガレクチン９を細胞表面に発現するCD4陽性T細胞を見出し、それがガレクチン９を分泌してTH17細胞とTreg細胞のバランスを制御することを見出してTHGAL9細胞と命名した。THGAL9細胞はIL-10を産生することおよび細胞表面にLatency-associated　peptide(LAP)、NKG2D、lymphocyte　activation　gene-3　(LAG-3)、Cytotoxic　T-Lymphocyte　Antigen　4　(CTLA-4)を発現していることよりFoxp3陰性の抑制性T細胞すなわちTr1細胞(非特許文献２０～２２)と同一またはその部分集団である可能性が示唆された。
　Tr1細胞は形質細胞様樹状細胞によって誘導される免疫寛容に重要な役割を果たす細胞であり(非特許文献２０、２３～２５、１５～１８)、in　vitroではナイーブCD4+T細胞をIL-27またはVitamin　D3/dexamethasoneの存在下でTCR刺激を与えることで誘導される(非特許文献２６～２９)。Tr1細胞の細胞表面マーカーとして前述のLAP,　NKG2D,　LAG-3,　CTLA-4が知られているが、これらはIL-10を産生しないCD4+CD25+細胞にも発現しているため、信頼に足るTr1細胞マーカーはその機能の本体と考えられている抑制性サイトカインIL-10の高発現である。ところがIL-10の産生はTr1細胞だけでなくTreg細胞を含む他の細胞群にも見られることから、確定的なマーカーには成り得ず(非特許文献３０～３１)、また細胞内に存在するIL-10の発現を指標に、生きたまま細胞を簡便に精製する技術も存在しないことは、Tr1研究およびその応用を困難にしている。
　本発明では、前述のとおり、細胞表面にガレクチン９を発現するTHGAL9以外の免疫細胞も見出した。それらの細胞群についてもTHGAL9細胞同様に診断のサロゲートマーカーとして、または細胞表面のガレクチン９を用いて精製し細胞療法へ応用する可能性が示唆される。
　本発明は、ガレクチン９を分泌する細胞及びその応用技術を提供する。例えば、本発明は、Gal-9とIL-10を分泌するタイプ1制御性Ｔ細胞及びその応用技術を提供する。本発明は、ガレクチン９を分泌し得る新規のT細胞（THGAL9細胞）を同定し、それを利用可能とする技術を提供している。該THGAL9細胞を利用して、TH17細胞とTreg細胞の分化を制御する技術も提供する。THGAL9細胞は、細胞表面にガレクチン９を発現しているだけでなく、例えば、既知のTr1細胞マーカーも発現し、またIL-10を分泌し得る。本発明では、ガレクチン９をTr1細胞のマーカーとして利用し、該Tr1細胞を精製すると共にそれを治療への応用に利用する技術も提供する。本発明では、THGAL9細胞をTCRで刺激して、CD25の発現上昇、ガレクチン９やIL-10の分泌誘導を行う技術を提供する。また、本発明では、THGAL9細胞をTH17細胞分化にコミットしたナイーブT細胞と共培養することにより、IL-17の産生を抑制したり、及び／又は、Treg細胞を増加させる技術も提供している。本発明は、また、生体内で、THGAL9細胞でもって、免疫制御を行う技術を提供する。また、本発明は、細胞表面のガレクチン９をマーカーとして使用し、制御性免疫細胞を分別する細胞分別技術や、さらには、細胞表面のガレクチン９をマーカーとして使用し、IL-10産生タイプ1制御性T細胞（Tr1細胞）を分別するTr1細胞分別技術を提供する。
　本発明で見出された細胞、例えば、THGAL9細胞は、生物活性を有する試薬として、診断材、治療剤などとして、剤臨床検査の分野、分析の分野、あるいは医学又は医薬などの分野で有用である。
　本発明の細胞（例えば、THGAL9細胞）を、生体（動物）の組織から分離（又は単離）する方法は、特に限定されず、当業者であれば、本願明細書及び図面の記載、並びに本願出願時の技術常識に基づいて、過度の試行錯誤を要せずに行うことができる。例えば、本発明の細胞（例えば、THGAL9細胞）を、生体（動物）の組織から分離（又は単離）する方法は、後述の実施例に記載のように、細胞を抗ガレクチン９抗体で染色し、ソーティングにより分離（又は単離）するという方法でも良い。
　本発明の細胞（例えば、THGAL9細胞）の製造方法も特に限定されず、例えば、すでに本発明の細胞を有している動物の組織から、本発明の細胞を分離（又は単離）する方法でも良い。また、これに加え、又はこれに代えて、本発明の細胞の製造方法は、ガレクチン９を細胞表面に発現していない細胞の細胞表面にガレクチン９を発現させて本発明の細胞に変換する工程を含んでいても良い。この工程は、例えば、生体内（in　vivo）で行うこともできるし、生体外（in　vitro）で行うこともできる。生体内（in　vivo）で行う方法としては、例えば、本発明の前記第１の製造方法のように、動物にガレクチン９を投与することにより、前記動物における少なくとも一部の細胞の細胞表面にガレクチン９を発現させる方法でも良い。生体外（in　vitro）で行う方法としては、例えば、本発明の前記第２の製造方法のように、動物の細胞を、ガレクチン９の存在下で培養することにより、前記動物の細胞の細胞表面にガレクチン９を発現させる方法でも良い。また、本発明の前記第２の製造方法は、例えば、前記動物の細胞が、細胞表面にガレクチン９を発現している細胞を含み、前記動物の細胞を、ガレクチン９の存在下で培養することにより、細胞表面にガレクチン９を発現している細胞の割合を増加させる、本発明の細胞の製造方法であっても良い。
　本明細書で使用の用語「診断剤」とは、本発明における診断において使用する１つまたはそれ以上のその診断行為に寄与するような任意の薬剤をいう。これらものの診断への使用は、ガレクチン９産生細胞の存在を決定するための方法あるいはガレクチン９結合性物質を提示する細胞の存在を決定するための方法を含むものであってよい。診断剤としては、例えば、細胞表面にガレクチン９を発現する細胞またはその細胞ホモジュネートからなる群から選択されたものを含有するものが挙げられる。
　本明細書で使用の用語「治療剤」とは、本発明における治療において使用する１つまたはそれ以上のその治療行為を達成するかまたは達成するのに寄与する任意の薬剤であってよい。例えば、治療剤が細胞表面にガレクチン９を発現する細胞またはその細胞ホモジュネートである場合、その薬剤は、哺乳動物に投与されることができる。該治療剤は、単独で、あるいは他の薬剤（例えば、ガレクチン９改変体の投与と共に使用され且つ特定の腫瘍あるいは自己免疫などに対するその他の公知の処置法に使用されるような薬物、あるいは哺乳動物でのガレクチン９の発現を容易に行いうるような遺伝子送達ビヒクルなど）と組み合わせて、その治療目的を達成するものであってよい。例えば、該治療剤は、他の目的のために開発されたガレクチン９改変体を含むものであってよく、さらには、ガレクチン９のアゴニスト、ガレクチン９活性を修飾又は調節する薬物を含むものであってよく、例えば、有機低分子化合物又は物質、ペプチド、ペプチド様化合物又は物質、ガレクチン９改変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ガレクチン９改変体ポリペプチド、プロテアーゼに対してネイティブなガレクチン９より安定化されているガレクチン９改変体のキメラ体あるいは変異体などを発現し且つ形質転換された細胞であってよい。
　本明細書で「患者」とは、生きている生物で任意の治療又は予防処置可能なものをさしてよく、真核生物を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、患者である真核生物としては、脊椎動物であってよい。したがって、例えば、患者は、好ましくは哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、ヒトが挙げられる。
　本発明の治療剤及び／又は診断剤の一般的製造および使用法を以下説明する。１つの態様では、本発明は、ガレクチン９が保有する生理活性又は生物活性の不足又は欠如に起因する疾患・病気・異常状態を処置する技術を提供する。該処置技術としては、例えば、本発明の細胞（例えば、THGAL9細胞等）含有治療剤を提供する工程及び／又は当該疾患などを有する哺乳動物に有効量の本発明の細胞（例えば、THGAL9細胞等）含有治療剤を投与する工程などが挙げられる。本発明の細胞（例えば、THGAL9細胞等）は、悪性腫瘍細胞に対する細胞傷害活性、悪性腫瘍細胞に対してのアポトーシス誘導活性、悪性腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性（抗ガン活性）、活性化Ｔ細胞のアポトーシス誘導活性、特にCD4陽性T細胞のアポトーシス誘導活性、免疫調節活性、抗炎症作用、抗アレルギー作用を発揮するように使用してよく、抗腫瘍剤（抗ガン剤）、抗アレルギー剤、免疫調節剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤及び副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤として期待できる。
　該処置技術は、活性化Ｔ細胞が顕著な自己免疫疾患を処置する方法を包含する。「自己免疫疾患」、および「自己免疫」とはすべて、哺乳動物での自己免疫によって特徴づけられる障害（これは、自己成分に対する免疫系の応答である）をいう。自己免疫応答は、臨床的兆候を現す症状に進展し得るものである。厳密にいえば、移植拒絶は自己免疫反応ではないが、患者が症状的に細胞、組織、または器官を置換したりあるいは移植するといった外科手術を受ける場合、同種移植を受ける体というものは、外来移植に対して免疫学的に反応するものである。種の１つのメンバーから他の種への、細胞、組織、または器官の同種移植中に、受容体（レシピエント）では移植された細胞、組織、または器官を拒絶するのに十分な免疫応答が生じる場合では、「移植拒絶」が起こるのである。
　本発明の方法および治療剤によって処置することができる「腫瘍」の例としては、悪性腫瘍が含まれていてよく、例えば、転移をする腫瘍は悪性腫瘍で、一般的にその悪性腫瘍は上皮性と非上皮性のものがあるとされ、ある場合には、ガン、肉腫、白血病などに区分して考えられることもあるが、単に「ガン」と呼んだ場合、一般人では悪性腫瘍を指すことが多い。本明細書で「ガン」とは、広い意味で解釈してよく、単に上皮性の悪性腫瘍と解釈すべきではない。本明細書において「ガン」とは、上皮性悪性腫瘍及び非上皮性悪性腫瘍（腫瘍形成性のものも非形成性のものも含む）を包含していてよく、皮膚ガン（メラノーマを含めてよい）、乳ガン、卵巣ガン、子宮ガン、睾丸悪性腫瘍、前立腺ガン、膀胱ガン、腎ガン、甲状腺ガン、咽頭・喉頭ガン、舌ガン、上顎ガン、食道ガン、胃ガン、結腸・直腸ガン、肺・気管支ガン、肝ガン（肝細胞癌、肝内胆管ガンを含む）、肝外胆管・胆嚢ガン、膵臓ガン、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、悪性血管腫、悪性血管内皮腫、脳腫瘍（メニンギオーマ、グリオーマ、アストロサイトーマなどを含む）等が挙げられるが、これらに限定されることなく、本発明の細胞（例えば、THGAL9細胞等）を使用することで好ましい結果が得られるもの、さらには本発明の細胞（例えば、THGAL9細胞等）が関与して何らかの生理的又は生物学的な応答が得られるものは含まれてよいと理解されるべきである。
　本発明の方法および治療剤によって処置することができる「自己免疫疾患」の例としては、多発性硬化症、橋本甲状腺炎、全身性エリテマトーデス(SLE)、グッドパスチャー(Goodpasture)症候群、天疱瘡、レセプター自己免疫、自己免疫溶血性貧血、自己免疫血小板減少性紫斑病、変形性関節症、慢性関節炎リウマチ、抗コラーゲン抗体による強皮症(schleroderma)、複合化結合組織病、多発性筋炎、悪性貧血、特発性アジソン病、自発性不妊症、糸球体腎炎、水疱性類天庖瘡、アドレナリン作用性薬物耐性、慢性活性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫ベースの内分泌腺不全、白斑、脈管炎、心筋梗塞後遺症(post-myocardial　infarction)、心臓穿孔症候群、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、自己免疫ベースの喘息、自己免疫ベースの炎症性反応、肉芽腫症障害、強直性(alkylizing)脊椎炎、連鎖球菌感染後(poststreptococcal)糸球体腎炎、自己免疫溶血性貧血、脳炎、リンパ腫に対する二次的自己免疫反応、変性障害、萎縮性障害などが挙げられる。レセプター自己免疫を表す自己免疫疾患としては、例えば、グレーブス病、重症筋無力症、インスリン耐性症などが挙げられる。アドレナリン性薬物耐性の自己免疫疾患としては、例えば、喘息および嚢胞性線維症などが挙げられる。
　本発明における他の自己免疫疾患としては、例えば、動物モデルが存在するものが挙げられ、例えば、シェーグレン症候群（自己免疫涙腺炎(dacryodentis)または免疫媒介唾液腺炎）、自己免疫心筋炎、原発性胆汁性肝硬変(PBC)、炎症性心臓病、水銀誘導性腎自己免疫、インスリン依存性糖尿病(I型糖尿病またはIDD)、胸腺切除術後自己免疫、中枢神経系(CNS)脱髄障害、CNS狼瘡、睡眠発作、免疫媒介PNS障害、変形性関節症、慢性関節炎リウマチ、ブドウ膜炎、髄質嚢胞性線維症、自己免疫溶血性疾患、自己免疫脈管炎、卵巣自己免疫疾患、ト強皮症(scheroderma)などが挙げられる。中枢神経系(CNS)脱髄障害によって特徴づけられる自己免疫疾患としては、例えば、多発性硬化症(MS)などが挙げられる。末梢神経系(PNS)自己免疫疾患は、例えば、ギヤン－バレー症候群(GBS)であってよい。
　本発明は、ガンなどの悪性腫瘍を含む腫瘍、アレルギー性疾患、炎症、免疫異常、活性化リンパ球（特には活性化T細胞が挙げられ、また活性化B細胞を含んでいてもよい）を含む自己免疫疾患などの疾患や病気に悩む哺乳動物を、本発明の細胞（例えば、THGAL9細胞等）、その破砕物及び抽出物からなる群から選択される少なくとも一つを含む治療剤（例えば、治療活性成分として本発明の細胞（例えば、THGAL9細胞等）もしくは当該細胞刺激剤などを含む組成物）の投与により処置する方法を開示するものである。本発明の方法および組成物により処置されることのできる自己免疫疾患としては、任意の自己免疫疾患または移植拒絶（例えば、本明細書中に列挙される自己免疫疾患を含むが、それらに限定されない）が挙げられる。
　本発明に関し、ガンなどの悪性腫瘍細胞を含む腫瘍細胞に対して細胞傷害作用を得たり、抗アレルギー作用を得たり、抗炎症作用を得たり、免疫異常を正常化せしめたり、活性化リンパ球（特には活性化Ｔ細胞を含んでいてもよい）に対してアポトーシスを誘導せしめる場合も、上記自己免疫の場合と同様に理解されるべきである。
　本発明の細胞（例えば、THGAL9細胞等）、その破砕物及び抽出物からなる群から選択される少なくとも一つを含むものは、抗腫瘍剤、抗アレルギー剤、免疫調節剤、自己免疫疾患用剤、抗炎症剤、副腎皮質ステロイドホルモンと同様な活性を利用する薬剤として有望で、次に示すような病的症状並びに疾患に対して有用な生物活性を示すと考えられる。
　炎症性疾患には、各臓器でおこる種々の急性および慢性炎症、アレルギー性および自己免疫性の炎症、感染症等がある。
　急性および慢性疾患としては、肺炎では、例えば、気管支炎、気管支肺炎、間質性肺炎、肺臓炎、細気管支炎や急性縦隔炎などが挙げられ、さらにその他の臓器の炎症、例えば、心外膜炎、心内膜炎、心筋炎、口内炎、口角炎、扁桃炎、咽頭炎、喉頭炎、食道炎、腹膜炎、急性胃炎、慢性胃炎、急性腸炎、虫垂炎、虚血性大腸炎、薬物性大腸炎、直腸炎、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、劇症肝炎、慢性肝炎などの種々の急性および慢性肝炎や肝硬変、胆嚢炎、急性膵炎、慢性膵炎、また急性および慢性腎炎、膜性腎炎、糸球体腎炎、IgA腎症などや、種々の膀胱炎、脳髄炎、乳腺炎、皮膚炎、表層角膜炎、乾性角結膜炎、種々の中耳炎や鼻炎、副鼻腔炎や鼻茸など、歯肉炎、歯周炎、歯周囲炎など、種々様々な炎症が含まれる。
　また、本発明の細胞（例えば、THGAL9細胞等）、その破砕物及び抽出物からなる群から選択される少なくとも一つを含むものは、例えば、神経性炎症（例えば、神経性胃炎、神経性膀胱炎など）にも効果を発揮し得る。例えば、ガレクチン９はカプサイシン誘導神経性皮膚炎症モデルにおいて、その炎症反応に対する強い抑制効果が認められた。カプサイシンは末梢神経を刺激することにより、神経性炎症や痛みを引き起こす物質である。カプサイシンは、知覚神経Ｃ線維末端に貯蔵されている神経ペプチドであるサブスタンスＰの遊離刺激作用を有する。サブスタンスＰは肥満細胞からヒスタミンを遊離させる作用を有し、その結果血管が拡張され、浮腫が生じる。また、遊離されたヒスタミンにより知覚神経が刺激を受け、Ｃ線維末端からサブスタンスＰが放出され、その周囲の肥満細胞に作用し、更にヒスタミンを遊離させるという増強サイクルが成立する。ガレクチンはこの病態形成の抑制作用を有する。
　さらに、カプサイシンは、感覚神経終末の痛み受容センサーであるカプサイシン受容体（バニロイドレセプター）に結合し、痛みを引き起こす。痛みは化学的刺激（酸など）、熱刺激（熱湯など）や過剰な機械的刺激（打撲など）によって感覚神経終末が活性化されることによって引き起こされ、カプサイシン受容体はこのような刺激による痛みにも関与している。そこで、ガレクチン９がカプサイシン受容体による神経終末の活性化を抑制することが示唆され、ガンや炎症に伴う痛みの軽減等、鎮痛作用への可能性も期待できる。
　アレルギー性炎症疾患には、全身性アナフィラキシー、気管支喘息、過敏性肺炎、花粉症、アレルギー性鼻炎、アレルギー性結膜炎、免疫複合体がおこすアレルギー性疾患、血管神経性浮腫等が挙げられる。
　また、自己免疫性の炎症（自己免疫疾患）には、全身性（慢性関節リウマチ、全身性エリトマトーデス（エリテマトーデス）、結節性多発性動脈炎、強皮症、多発性筋炎・皮膚筋炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病など）、神経系（多発性硬化症、重症筋無力症、HAM(HTLV-1脊髄症）、筋萎縮性側索硬化症など）、内分泌性（バセドウ病、橋本病、１型糖尿病など）、血液（特発性血小板減少性紫斑病、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血など）、呼吸器（サルコイドーシス、肺繊維症など）、消化管（潰瘍性大腸炎、クローン病など）、肝臟（自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、自己免疫性胆管炎など）、腎・尿路系（抗好中球細胞質抗体関連腎炎、血管炎、グッドパスチャー症候群、抗糸球体基底膜抗体病など）等がある。
　感染症は、病原体が生体の細胞・組織・臓器を傷害することによって生じる疾患の総称である。なお、感染症については、監修：町並陸生、編集：秦順一、坂本穆彦、「標準病理学（第２版）」、医学書院、2002年３月15日発行を参考にすることができる。ヒトに感染症をもたらす病原体には、１）細菌（スピロヘータ、クラミジア、リケッチアを含む）、２）ウイルス、３）真菌、４）植物（藻類）、５）原虫、６）寄生虫（吸虫、条虫、線虫）、７）節足動物がある。各病原体がもたらす主な疾患には、細菌性感染症（コレラ、ペスト、大腸菌感染症など）、スピロヘータ感染症（レプトスピラ症など）、クラミジア感染症（オウム病など）、リケッチア感染症（発疹チフス、破傷風など）、ウイルス性感染症（帯状疱疹、ウイルス性出血熱、狂犬病など）、真菌症（ガンジダ症、クリプトコッカス症、アスペルギウス症など）、原虫性疾患（アメーバー赤痢、マラリア、トキソプラズマ症など）、寄生虫（吸虫症、線虫症など）、その他、マイコプラズマ感染症（マイコプラズマ肺炎など）、ミコバクテリア感染症（結核、非定型抗酸菌症など）が挙げられる。
　ガンおよび肉腫については、脳腫瘍（多型性膠芽腫など）、脊髄腫瘍、上顎洞ガン、膵液腺ガン、歯肉ガン、舌ガン、口唇ガン、上咽頭ガン、中咽頭ガン、下咽頭ガン、喉頭ガン、甲状腺ガン、副甲状腺ガン、肺ガン、胸膜腫瘍、癌性腹膜炎、癌性胸膜炎、食道ガン、胃ガン、大腸ガン、胆管ガン、胆嚢ガン、膵臓ガン、肝ガン、腎臓のガン、膀胱ガン、前立腺ガン、陰茎ガン、精巣腫瘍、副腎のガン、子宮頸ガン、子宮体ガン、膣ガン、外陰ガン、卵巣ガン、繊毛上皮腫、悪性骨腫瘍、軟部肉腫、乳ガン、皮膚ガン、悪性黒色腫、基底細胞腫、白血病、骨髄化性を伴う骨髄線維症、悪性リンパ腫、ホジキン病、形質細胞腫、グリオーマなどが挙げられる。
　本発明によれば、例えば、前述のとおり、前記本発明の細胞を含むか又は含まない動物組織において、前記本発明の細胞検出方法により、前記本発明の細胞を定性的又は定量的に検出することにより、動物の疾患又は前記疾患に由来する症状を診断することができる。前記動物の疾患は、特に限定されないが、例えば、前述の各疾患が挙げられる。また、本発明によれば、例えば、前述のとおり、動物の疾患の治療効果の判定方法は、前記動物に対し、前記疾患の治療を行う工程と、前記治療の前後において、それぞれ、本発明による前記動物の疾患又は前記疾患に由来する症状の診断方法により、前記疾患又は前記疾患に由来する症状を診断する工程と、前記治療の前後における前記診断結果を対比する工程とを含む方法により、動物の疾患の治療効果を判定することができる。前記動物の疾患は、特に限定されないが、例えば、前述の各疾患が挙げられる。
　以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
　以下の実施例は、当業者であれば、当該実施例における詳細な記載及び本願出願時の技術常識に基づいて、過度の試行錯誤を要することなく実施することができる。また、以下の実施例において、観察された現象が起こるメカニズムの考察を示している場合は、そのメカニズムは、可能性の一つを示すものであって、本発明を限定するものではない。
〔実験材料及び方法〕
　以下に、特に重要な実験材料及び方法の詳細を記す。
（リコンビナントガレクチン９）
　本実施例で用いたリコンビナントガレクチン９は、全てヒト安定化ガレクチン９(G9NC(null))であり、既報(非特許文献１２、３３、特許文献１)の方法に準じて調製した。標品はSDS-PAGE及びクマッシー・ブリリアントブルー染色によるタンパク質純度検定で95%以上、またリムラス比濁動態試験によるエンドトキシン混入量は1mgヒト安定化ガレクチンあたり0.1ng以下であった。また、ヒト安定化ガレクチン９のマウスTim-3への結合親和性はマウスガレクチン９と同等である。モル濃度の計算は分子量33065として行った。
　なお、特許文献１に記載の、ヒト安定化ガレクチン９(G9NC(null))の調製方法は、下記のとおりである。
（Ａ）ガレクチン９改変体発現ベクターの構築
発現ベクターの作製には、
（１）Ｊｕｒｋａｔ細胞のｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ画分から調製したｃＤＮＡ
（２）ｐＥＴ－１１ａベクター（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ）
（３）ＰＣＲ用プライマー：
Ｇ９ＮＣＲＤ１：ＣＧＴＣＣＴＣＡＴＡＴＧＧＣＣＴＴＣＡＧＣＧＧＴＴＣＣＣＡＧ　配列番号１
Ｇ９ＮＣＲＤ６：ＣＧＡＣＣＧＣＡＴＡＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＡＴＧＴＡＧＧＡＣＡＧ　配列番号２
Ｇ９ＣＣＲＤ５：ＣＧＴＣＣＴＣＡＴＡＴＧＡＣＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＣＣＡＣＣＴＡＴＧ　配列番号３
Ｇ９ＣＣＲＤ６：ＣＧＡＣＣＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＴＧＴＣＴＧＣＡＣＡＴＧＧＧＴＣＡＧ　配列番号４
を使用した。
　Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｔ細胞由来細胞）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より入手した。セルラインは、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、米国）中で５％ＣＯ２の条件下３７℃で維持した。Ｊｕｒｋａｔ細胞からのｔｏｔａｌ　ＲＮＡの抽出は、次のようにして行った。すなわち、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地を用いて培養したＪｕｒｋａｔ細胞を遠心して集める。１０ｍｌのＰＢＳで細胞を２度洗浄する。洗浄した細胞の沈殿に、細胞２ｘ１０８個あたり１５ｍｌのＩＳＯＧＥＮ（商品名：ニッポンジーン）を加え、マニュアル（ニッポンジーン）に従ってｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出する。ｔｏｔａｌ　ＲＮＡからのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡ　の精製とｃＤＮＡ合成は、次のようにして行った。すなわち、Ｊｕｒｋａｔ細胞から抽出したｔｏｔａｌ　ＲＮＡを、１ｍｇ／ｍｌの濃度になるようＤＥＰＣ処理水に溶解する。ＰｏｌｙＡＴｔｒａｃｔ　ｍＲＮＡ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ（商品名：Ｐｒｏｍｅｇａ）を用い、マニュアルに従ってｔｏｔａｌ　ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを精製する。精製したｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを５μｇ／２０μｌの濃度になるようＤＥＰＣ処理水に溶解する。Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（商品名：Ａｍｅｒｓｈａｍ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、マニュアルに従って５μｇのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡからｃＤＮＡを合成する（プライマーにはＮｏｔ　Ｉ－ｄ（Ｔ）１８を使用する）。
　次に、下記スキームに示す手順でｐＥＴ－１１ａベクターのＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩ　ｓｉｔｅにガレクチン９のＮ－末端側糖鎖結合ドメイン（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ　ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ　ｄｏｍａｉｎ，ＮＣＲＤ）とＣ－末端側糖鎖結合ドメイン（ＣＣＲＤ）を挿入し、リンカーペプチドを欠く改変型ガレクチン９（Ｇ９ＮＣ（ｎｕｌｌ））の発現　ベクターを作製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000006
　まず、ガレクチン９ｃＤＮＡからそれぞれ（１）ヒトガレクチン９のＣ－末端側ＣＲＤに対応するｃＤＮＡと（２）ヒトガレクチン９の　Ｎ－末端側ＣＲＤに対応するｃＤＮＡを取得した。すなわち、ｃＤＮＡからＰＣＲ用プライマー：Ｇ９ＣＣＲＤ５＋Ｇ９ＣＣＲＤ６を用いてヒトガレクチン９の　Ｃ－末端側ＣＲＤに対応するｃＤＮＡ（Ｇ９ＣＣＲＤ）を増幅した。Ｇ９ＣＣＲＤを制限酵素（ＮｄｅＩ＋ＢａｍＨＩ）で切断した後、同じ制限酵素で処理した　ｐＥＴ－１１ａベクターに挿入してｐＥＴ－Ｇ９ＣＣＲＤを得た。ＰＣＲは、ＫＯＤ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ　Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．ＫＯＤ－１０１）を使用して行った。ＰＣＲ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　ｍｉｘｔｕｒｅ（ｄＮＴＰ　ｍｉｘ，２５ｍＭ　ＭｇＣｌ２，１０×Ｂｕｆｆｅｒ，ＫＯＤ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（０．０５ｕ），プライマー及び鋳型ｃＤＮＡ）を以下のようなＰＣＲのサイクルの条件で反応させた：９４℃で２分処理した後、サイクル（９８℃で１５秒、次に６５℃で２秒、そして７４℃で３０秒処理）を２５回行い、最後に４℃で反応を停止した。ＰＣＲ増幅された断片のベクターへの挿入は、Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈ　ｋｉｔ（ＴＯＹＯＢＯ　Ｃｏｄｅ　Ｎｏ．ＬＧＫ－１０１）を使用して行った。反応は、インサート：ベクターのモル比を約５：１で混合し、その総ＤＮＡ溶液（体積）量の１／２（体積）量の試薬Ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈを加えて混合して行った。１６℃で１６時間（Ｏ／Ｎ）反応させることで挿入した。
　一方、該ガレクチン９ｃＤＮＡからＰＣＲ用プライマー：Ｇ９ＮＣＲＤ１＋Ｇ９ＮＣＲＤ６を用いてヒトガレクチン９のＮ－末端側ＣＲＤに対応するｃＤＮＡ（Ｇ９ＮＣＲＤ）を増幅した。Ｇ９ＮＣＲＤを制限酵素（ＮｄｅＩ）で切断した後、得られた断片を同じ制限酵素（ＮｄｅＩ）で処理し、さらに脱リン酸化したｐＥＴ－Ｇ９ＣＣＲＤに挿入してｐＥＴ－Ｇ９ＮＣ（ｎｕｌｌ）を得た。ＰＣＲ増幅並びにベクターへの組み込みは上記と同様にして行った。ｐＥＴ－Ｇ９ＮＣ（ｎｕｌｌ）は、ヒトのＭ型ガレクチン９の第１４９番目のＰｒｏから第１７７番目のＳｅｒまでの２９個のアミノ酸配列をＨｉｓ－Ｍｅｔ配列に置き換えたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。すなわち、下記配列番号５で示される塩基配列を持つものであり、下記配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。
（配列番号５）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
（配列番号６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
　（Ｂ）ガレクチン９改変体組換え蛋白質の発現及び精製
上記工程（Ａ）で得られた発現用プラスミドベクターｐＥＴ－Ｇ９ＮＣ（ｎｕｌｌ）を大腸菌（ＢＬ２１（ＤＥ３））に導入した。導入は、エレクトロポレーション法により行った。すなわち、ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ　ＢＬ２１（ＤＥ３）とプラスミドベクター水溶液を混合し、１．８ｋＶの電圧でのエレクトロポレーション法によりトランスフェクションを行った。
　組換え蛋白質の発現は、大腸菌を２％（ｗ／ｖ）グルコース及び１００μｇ／ｍｌアンピシリン含有２×ＹＴ培地中で培養し、６００ｎｍでの吸光度が０．７に達した時点で０．１Ｍイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトピラノシドを添加（最終濃度、０．１ｍＭ）して、組換え蛋白質の発現を誘導して行った。２０℃で１８時間培養した後、遠心により菌体を集め、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），０．５Ｍ　ＮａＣｌ，１ｍＭ　ＤＴＴ，１ｍＭ　ＰＭＳＦに懸濁した。懸濁液を１０分間音波処理した後、１０％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を加え（最終濃度、１％）４℃で３０分間撹拌した。１５，０００×ｇで３０分間遠心し、得られた上清液中の組換えタンパク質を、ラクトース－アガロースを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。エンドトキシンの除去にはセルファインETクリーンL（チッソ）を用い、エンドトキシンが除去されたことはトキシノメーターを用いたリムラス比濁キネティック法によって確認した。
　結果、純度の高い標品が比較的高い収率で得られた。得られた組換え蛋白質の電気泳動の結果を図２８に示す。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ条件は次の通りである：Ｇｅｌ，Ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ－ＢＩＳ（１２％　ｇｅｌ），電気泳動用バッファ，２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－１９２ｍＭ　グリシン－０．１％ＳＤＳ，泳動条件，１８０Ｖ，４５ｍｉｎ．，染色，ＣＢＢ，６０℃／３０ｍｉｎ．電気泳動サンプルは、Ｓｔｒａｔａ　ＣｌｅａｎＴＭ　Ｒｅｓｉｎ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に吸着させ、１×ｓａｍｐｌｅ　ｂｕｆｆｅｒ（６２．５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，Ｐｈ６．８，２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ，５％（Ｗ／Ｖ）２－ＭＥ，Ｇｌｙｃｅｒｏｌ）で０．２ｍｇ／ｍｌに調整し、９８℃／３ｍｉｎ．の熱処理後レーンあたり約２μｇのタンパク量で電気泳動をした。精製されたＧ９ＮＣ（ｎｕｌｌ）は、４℃で６００日間以上安定に保存することができた。
（抗体）
　細胞の染色には、以下の抗体を用いた。抗マウスCD4-FITC抗体　(Becton　DickinsonまたはeBioscience,　San　Diego,　CA)、抗マウスTim-3-PE抗体　(eBioscience)、抗マウスガレクチン９-Alexa488抗体(クローン108A2、Galpharma)、抗マウスガレクチン９-PE抗体(クローン108A2、Biolegend)、抗マウスCD25-APC抗体(Biolegend)、抗マウスFoxp3-APC抗体(eBioscience)、抗ヒト／マウスLAP-PE抗体(R&D　Systems)、抗マウスNKG2D-PE抗体(Biolegend)、抗マウスLAG-3-PE抗体(Biolegend)、抗マウスCTLA-4-PE抗体(Biolegend)、抗マウスIL-17抗体-（FACS用）、抗マウスPDCA-1-APC抗体（Biolegend）、抗マウスCD11c-Alexa488抗体（Biolegend）、抗マウスCD19抗体（Biolegend）、抗マウスGL-7抗体（Biolegend）、抗マウスCXCR4抗体（Biolegend）、抗マウスICOS-PE抗体（eBiosciences）、抗マウスCXCR5-APC抗体（BD　Pharmingen）抗ヒトガレクチン９-Alexa488抗体(クローン9M1-3、Galpharma)、抗ヒトCD4-FITC抗体(Biolegend)、抗ヒトCD4-PE抗体(Biolegend)、抗ヒトCD25-APC抗体(Biolegend)、抗ヒト／マウスFoxp3-PE抗体(Biolegend)、抗マウスIL-10抗体（Biolegend）、抗マウスIL-10中和抗体(R　&　D　Systems)、抗マウスIL-10R中和抗体（R　&　D　Systems）、抗マウスTGF-β中和抗体（R　&　D　Systems）。
（その他の試薬）
　アポトーシス測定にはAnnexin　V-EGFP　Apoptosis　Detection　kit　(Medical　&　Biological　Laboratories,　Nagoya,　Japan)を用いた。細胞内部抗原の染色にはBD　Cytofix/Cytoperm　Kit(Becton　Dickinson)を用いて細胞の固定化及び細胞膜浸透化を行った。これらのキットはメーカー提供の使用説明書に従って用いた。
（フローサイトメトリー）
　染色した細胞の測定はFACS　Calibur　(Becton　Dickinson)を用いて行い、データの解析にはFlowJo　software　(Tree　Star,　Ashland,　OR)を用いた。細胞の分取が必用な時にはFACS　Aria　(Becton　Dickinson)を用いた。
（ELISA）
　ヒトガレクチン９濃度の定量は既報の方法に従って行った(非特許文献３４)。
　マウスガレクチン９濃度の定量は既報の方法(非特許文献１６)に準じ、以下の3点を改良して行った。一つ目はプレートにコートする抗マウスガレクチン９抗体をクローン108A2(Galpharma)に変更した点で、二つ目は検出用の抗体にビオチンラベルした抗マウスガレクチン９ポリクローナル抗体　(Galpharma)を用いた点、三つ目は検出用抗体の変更に伴って三次抗体の代わりに西洋ワサビペルオキシダーゼ標識したストレプトアビジン(Endogen)を用いて発色反応を行った点である。この系はマウスガレクチン９を特異的に検出し、測定サンプル中にヒト安定化ガレクチン９が30　nMで添加されていても反応しない。マウスまたはヒトIL-17A、マウスTNF-α、マウスIL-12、マウスIFN-γ、マウスIL-13の検出はそれぞれ適当なDuoSet　(R&D　Systems)を、マウスIL-10の検出にはMouse　IL-10　ELISA　MAX　Standard　(Biolegend)を、抗マウスSRBC　IgMの検出には、Mouse　Anti-SRBC　IgM　ELISA　Kit（Life　Diagnostics）、マウス全IgM抗体及びマウス全IgG抗体の検出はそれぞれMouse　Total　IgM　ELISA　KitとMouse　Total　IgG　ELISA　Kit（共にBethyl）を、抗dsDNA抗体の検出はレビス　抗dsDNA－マウス　ELISA　KIT（シバヤギ）を用い、それぞれメーカー提供の使用説明書に従って行った。
（動物）
　C57BL/6J　マウス及びMRL/MpJUmmCrj-1pr/1prマウスは日本チャールズリバー　(Yokohama,　Japan)より、同系統のガレクチン９ノックアウトマウス及びマウスガレクチン９トランスジェニックマウスはGalpharma　(Takamatsu,　Japan)より入手した。Lewis系ラット（LEW/Ssn）は日本エスエルシー（Hamamatsu,　Japan）より入手した。実験に供するマウスには12時間毎の日夜リズムと自由に採食・採水できる通常の環境を与え、国法と国際指針に準拠した人道的な配慮のもと飼育した。また本研究プロトコールは香川大学実験動物委員会の承認済みである。
　以下に実験方法を説明する。
〔マウスナイーブT細胞の単離と培養〕
　CD4+　CD62L+ナイーブT細胞は8～10週齢の雄性C57BL/6Jマウスより得た脾臓細胞よりCD4+CD62L+　T　cell　Isolation　Kit　(Miltenyi　Biotec,　Bergisch　Gladbach,　Germany)を用い、メーカー提供の使用説明書に従って単離し、純度は94%以上のナイーブT細胞を得た。ナイーブT細胞を10%の加熱非動化済みの牛胎児血清及びpenicillin　G　(10　IU/ml,　Sigma-Aldrich)とstreptomycin　(100μg/ml,　Sigma-Aldrich)を含むRPMI　1640(Sigma-Aldrich,　St.　Louis,　MO)培地中に懸濁し、抗CD3抗体を1μg/mlの濃度でコーティングした96-wellプレート(Becton　Dickinson)　に2x105cells/0.1ml/　wellの密度で播種して抗CD28抗体(2μg/ml,　Becton　Dickinson)を添加後に72-96時間37度のCO2インキュベーター内で培養した。TH17細胞分化誘導にはこの系中にヒトTGF-β1　(3ng/ml,　R&D　systems)、マウスIL-2　(5ng/ml,　R&D　systems)　及びマウスIL-6　(20ng/ml,　R&D　systems)　を添加した。TH1細胞分化誘導にはマウスIL-12(10　mg/ml,　R&D　systems)及び抗IL-4抗体(10μg/ml,　Becton　Dickinson)　を、TH2細胞分化誘導にはマウスIL-4　(20mg/ml,　R&D　systems)及び抗IL-12抗体(10μg/ml,　Becton　Dickinson)を添加した。Tr1分化には抗CD3抗体を10μg/mlの濃度でコーティングした96-wellプレートを用い、2μg/mlの抗CD28抗体と25　ng/mlのIL-27存在下でナイーブT細胞を3日間培養した。また実験によってはヒト安定化ガレクチン９　(30nM)、ラクトース(3,　10,　30mM)、スクロース　(3,　10,　30　mM)、抗Tim-3中和抗体　(10μg/ml,　eBioscience)やラットIgG2a　(10μg/ml,　eBioscience)等を添加して培養した。
〔THGAL9細胞のTH17細胞分化への作用〕
　CD25陰性THGAL9(細胞表面にガレクチン９を発現しているCD25-CD4+T細胞)とnon-THGAL9細胞(細胞表面ガレクチン９-CD25-CD4+　T細胞)はソーティングで単離した(細胞純度97%以上)。一方、ナイーブT細胞をTH17分化誘導条件下で6時間培養してTH17への分化をコミットさせた後に回収し、CD25陰性THGAL9またはnon-THGAL9細胞と1:1(5x104　cells:5x104　cells)の比で混合し、その後はTCR刺激のみで90時間培養した。ガレクチン９の作用を阻害するには、系中に30　mMのラクトースを添加した。
〔ヒトCD4　T細胞の単離と培養〕
　末梢血単核細胞は健常人の抹消血を比重分離液　(リンホセパール、Nakalai　Tesque,　Kyoto,　Japan)に重層し、メーカー提供の使用説明書に従って遠心分離して単離した。得られた抹消血単各細胞よりCD4+　T　Cell　Isolation　Kit　II　(Miltenyi　Biotec)を用い、メーカー提供の使用説明書に従ってCD4　T細胞を単離した。CD4+T細胞をTCR刺激するには、マウスナイーブT細胞の培養と同様に、細胞を10%の加熱非動化済みの牛胎児血清及びpenicillin　Gとstreptomycinを含むRPMI　1640培地中に懸濁し、抗CD3抗体を1μg/mlの濃度でコーティングした96-wellプレートに2x105　cells/0.1　ml/　wellの密度で播種して抗CD28抗体　(2　μg/ml,　Becton　Dickinson)を添加後に96時間培養した。
　この培養細胞よりヒトTHGAL9細胞及びヒトnon-TH17細胞を分離するには細胞を抗ヒトガレクチン９-Alexa488抗体(クローン9M1-3、Galpharma)で染色し、FACS　Ariaを用いてソーティングした。ソーティング後の細胞純度は97%以上であった。細胞は上記のTCR刺激下でさらに96時間培養し、実験に供した。ヒトCD4+T細胞のTH17細胞への分化誘導は既報(非特許文献３５)の方法を用いた。簡潔には、上記TCR刺激に加えてヒトIL-2(5　ng/ml,　R&D　systems)を用い、さらにヒトIL-1β　(50　ng/ml,　R&D　systems)または同IL-1βとIL-6の組合せ、もしくは同IL-1βとマウスIL-23　(50　ng/ml,　R&D　systems)の組合せ刺激下で9日間培養した。
〔リアルタイムRT-PCR〕
　mRNAの定量は既報に準じてリアルタイムRT-PCR法で行い、増幅した核酸の染色にSYBR　Green　Iを、測定にはABI　PRISM　7000　sequence　detector　(Applied　Biosystems,　Foster　City,　CA)を用いた(非特許文献３６)。プライマーはタカラバイオ　(Otsu,　Japan)より購入した。特定のmRNA発現量は同方法によって定量されたglyceraldehyde-3-phosphate　dehydrogenase　(GAPDH)のmRNA発現量を内部標準としてその比で表した。
〔統計解析〕
　データの統計解析には解析ソフトPrism(Graphpad　software)を用い、nonparametric　two-tailed　Mann-Whitney法、Logrank　test法、及び2-way　ANOVA法等によって統計的な有意差の有無を判定し、p<0.05を持って有意とした。棒グラフまたは折れ線グラフのデータは全てMean±SEM(n>3)である。
〔実験結果と考察〕
〔ヒト安定化ガレクチン９はラット関節炎に持続的な治療効果を示す〕
図１にラットコラーゲン誘導性関節炎におけるヒト安定化ガレクチン９の治療効果を示す。感作に用いるコラーゲン溶液は以下の要領で用事調整した。ウシタイプIIコラーゲン(BCII;　Collagen　Research　Center)とMuramyl　dipeptide(MDP;　Peptide　Institute)をそれぞれ1.6　mg/mlと0.4　mg/mlになるように混合し、それと同体積のincomplete　Freund's　adjuvant(IFA;　Difco)を添加して混合し、乳化した。このコラーゲン溶液をLewis　rat　(♀,　6～7週齢)一匹あたり1mlを背部の皮内に投与した（Day0）。投与は少なくとも10箇所／ラットに分散して行った。7日目に同様に調製したコラーゲン溶液0.3ml／ラットを尾基底部にブースター投与した。安定化ガレクチン９はブースター投与後7日目より表示の用量・スケジュールで皮下投与した（a）。関節炎発症に伴う足の腫脹の測定は2人の観察者がそれぞれ独立にplethysmometer(Muromachi　Kikai　Co.,　Ltd)を用いて行った。両後足の体積の合計を経時的に測定し、初期値からの変化割合（％）で表した。ヒト安定化ガレクチン９を本モデルにおいて週３回皮下投与すると、既に発症した関節の腫れを用量依存的に縮小し、0.06mg/kgでほぼ完全な治療効果を呈した（b）。次に投与量を0.6mg/kgに固定して週1回と週2回投与で治療効果を比較したところ、両者共にほぼ同等の治療効果を示した（c）。皮下注射により薬効が持続する例はよく知られており、例えば抗体薬では皮下投与すると徐々に血中に放出されるため、全身投与と比較して体内により長く循環する。
〔ヒト安定化ガレクチン９皮下投与における体内動態〕
　そこで安定化ガレクチン９皮下投与時の体内動態を調べた。Lewis　rat　(♀,　6～7週齢)に表示の用量のヒト安定化ガレクチン９を単回皮下投与し、投与前（0分）、投与後5分、15分、30分、1時間、2時間、4時間、8時間、16時間、24時間、48時間及び72時間に経時的に血漿採血し、血中安定化ガレクチン９濃度を特異的なELISAによって測定した。ELISAの一次抗体は抗ヒトガレクチン９モノクローナル抗体9S2-3を用いた。この抗体はガレクチン９のN末側の糖鎖認識ドメインを認識し、SDSで変性したヒトガレクチン９には反応しないことより、正しい立体構造のタンパク質を認識すると考えられる。一方、二次抗体には抗ヒトガレクチン９CTウサギポリクローナル抗体を用いた。この抗体はウサギをヒトガレクチン９のC末側の糖鎖認識ドメインで免疫して調製し、他のガレクチンに対する交差反応は吸収除去してある。また本ELISAはマウス及びラットのガレクチン９に交差しない。つまり本ELISAは分解・変性を受けていない完全なヒト安定化ガレクチン９を測定することが出来る。
　血中ヒト安定化ガレクチン９濃度を元にモーメント解析ソフトウェア（田端健司、藤沢薬品工業、京都大学大学院薬学研究科より提供）を使用し、モーメント解析法による薬物動態解析を行った。その結果、図２及び表２に示すように、血中の安定化ガレクチン９濃度は非常に低く、先の関節炎モデルで十分な治療効果を示した0.6mg/kg投与では血中最高濃度が0.943ng/ml、t1/2が7.6時間、MRTが12.5時間であった。In　vitroのIL-17産生抑制においては安定化ガレクチン９の効果が見られるのが10nM（約0.3μg/ml）以上の濃度が必要で、30nM（約1μg/ml）で統計的有意差が見られた（非特許文献７）。つまり血中に出て来たヒト安定化ガレクチン９が薬効を示すとは考えられず、恐らく投与部位及びリンパ管・リンパ節を経由する比較的高濃度の間に免疫系細胞に影響を与えていると想像される。また投与後速やかに体内から排出されることは本実験および別の体内動態試験より確認されている。つまり安定化ガレクチン９の持続した薬効は投与時から短い間に作用を受けた細胞に担われており、安定化ガレクチン９の直接的な作用では無いと考えられる。生体内にはガレクチン９を産生・放出して免疫を制御している細胞が存在しているのは、前記背景技術において説明したように自明であるがその同定は非常に困難である。ガレクチン９を分泌して免疫を制御している細胞を同定することは、ガレクチン９の作用メカニズムの詳細を解明することと合わせて重要な課題であり、それを達成することは医学・産業への大きな貢献となる。
〔ガレクチン９はEAEを抑制する内在性因子である〕
　図３に、MOG誘導性実験的アレルギー性脳炎（EAE）へのガレクチン９の治療効果を示す。このモデルでの脳炎発症はTh17依存的であることが知られている。(a)EAE発症には雌性C57BL/6Jマウス(WT)または同系統のガレクチン９ノックアウトマウス(Gal-9　KO)を用いた。300μgのMycobacterium　tuberculosis　(H37RA,　Difo)を添加したCFA中に調製した150μgのMOG(35-55)ペプチドをマウスに皮下投与して感作し、その同日及び2日後に200　ngのpertussis　toxin　(List　Biological　Laboratory)を静脈投与し、経時的に臨床スコアを目視により記録した。臨床スコアは以下の基準によって判定した。
臨床スコア0:　異常なし
臨床スコア1:　尾の緊張低下
臨床スコア2:　後肢の不全対麻痺
臨床スコア3:　後肢の対麻痺
臨床スコア4:　四肢麻痺
臨床スコア5:　瀕死又は死亡
　(b)感作後20週目の上記マウス脊髄のヘマトキシリン／エオシン染色と、抗CD3抗体による免疫染色。野生型(WT)と比較してガレクチン９ノックアウトマウス　(Gal-9-/-)の脊髄には細胞の浸潤と組織破壊が顕著に見られた。浸潤細胞の多くはCD3陽性であることよりT細胞だと考えられる。
　(c)感作後20週目のEAE感作野生型マウス(WT)、EAE感作ガレクチン９ノックアウトマウス(Gal-9　KO)および週齢をあわせた未感作マウス(Naive)より脾臓細胞を調製し、CD4、CD25、IL-17及びFoxp3抗体で染色した。ガレクチン９ノックアウトマウスでは野生型に比してCD4+CD25+IL-17+細胞が有意に増加しており一方CD4+CD25+Foxp3+細胞は有意に減少していた。
　(d)ナイーブT細胞を野生型マウス(WT)及びガレクチン９ノックアウトマウス(Gal-9　KO)の脾臓細胞より調製し、抗CD3抗体をコーティングした96-well　plate　(Becton　Dickinson)　に2x105　cells/0.1　ml/　wellの密度で播種して抗CD28抗体　(2　μg/ml,　Becton　Dickinson)を添加後に96時間培養した(No　skewed)。TH17細胞分化誘導にはこの系中にヒトTGF-β1　(3　ng/ml,　R&D　systems)、マウスIL-2　(5　ng/ml,　R&D　systems)　及びマウスIL-6　(20　ng/ml,　R&D　systems)　を添加した条件で96時間培養した(TH17　skewed)。それぞれの細胞培養上清中のIL-17A濃度をELISAで定量したところ、TH17分化誘導刺激によってIL-17A発現は著明に誘導されるが、その誘導は野生型に比べてガレクチン９ノックアウトマウスの方が有意に高かった。
　(e)上記で培養上清を抽出後に残った細胞内のIL-10　mRNA量をリアルタイムRT-PCR法で定量した。IL-10　mRNA発現量は同方法によって測定されたglyceraldehyde-3-phosphate　dehydrogenase　(GAPDH)のシグナルを内部標準とし、その比で表した。IL-10　mRNA発現レベルはNo　skewed、TH17　skewed共にガレクチン９ノックアウトマウスの方が野生型に比して有意に低かった。
　(f)前述(a)の系で野生型雌性C57BL/6JマウスにEAEを発症させ、感作後14日目と16日目にヒト安定化ガレクチン９を0.3μg/マウスまたは3μg/マウスで皮下投与した。コントロール群にはPBSを投与した。感作19日目まで臨床スコアを記録し、その後マウスの脊髄をヘマトキシリン／エオシン染色した。ヒト安定化ガレクチン９投与は0.3μg/マウスの投与で臨床スコアを低下させる傾向を示し、3μg/マウスでは統計的に有意な臨床スコア低下を示した(p<0.05、2-way　ANOVA法)。
　ガレクチン９ノックアウトマウスでは、野生型のマウスに比してMOG(33-55)で誘導した実験的アレルギー性脳炎（EAE）の症状がより重篤でかつ持続した(図３ａ)。野生型マウスではEAE発症から20週後の局所にCD3陽性細胞の浸潤は殆ど見られないが、ノックアウトマウスではCD3陽性細胞の浸潤が明らかである(図３ｂ)。発症後20週目におけるノックアウトマウスの脾臓では野生型に比してIL-17を産生するCD4＋CD25+細胞の増加とFoxp3陽性細胞の減少が観察された(図３ｃ)。さらにノックアウトマウスのナイーブT細胞（CD4+CD62L+CD25-）でTH17を分化誘導すると野生型の細胞を用いるのと比してIL-17産生が明らかに上昇していたが(図３ｄ)、その一方でIL-10　mRNA発現はノックアウトマウスで低下していた(図３ｅ)。そこでガレクチン９のEAEモデルでの治療効果を検討したところ、症状が顕著になる免疫後14日よりガレクチン９を週2回皮下投与すると、0.3μgでも臨床症状及び組織学的所見が明らかに改善した(図３ｆ)。
これらの結果はガレクチン９は内在性の免疫制御因子としてTh17/Tregバランスを調整していることを示しており、既報のマウス関節炎の実験結果より引き出された帰結（非特許文献７）がEAEにおいて更に確認・検証されたことになる。
〔ガレクチン９によるTH17細胞分化抑制はTim3に依存しない〕
　図４には、ガレクチン９が、Tim3/Gal-9相互作用に依存しないでTH17細胞分化を抑制する効果を示す。
　(a)　図３(d)の方法で、C57BL/6Jマウスより調製したCD4+　CD62L+ナイーブT細胞にTH17細胞分化誘導刺激を与えた。刺激開始時を0時間とし、図に示したそれぞれの期間30　nMのヒト安定化ガレクチン９またはコントロールのPBS存在下で培養した。その後、細胞を培地で洗浄し、TH17細胞分化誘導刺激を継続した。96時間目の培養上清を抽出し、培地中のIL-17濃度を前述のELISAで定量した。TH17細胞分化誘導の0～18時間にヒト安定化ガレクチン９が存在すると、TH17細胞分化は顕著に抑制された。一方で分化誘導前24時間のヒト安定化ガレクチン９処理は無効であった。
　(b)前述の30　nMヒト安定化ガレクチン９をTH17細胞分化誘導開始から24時間添加した細胞及びコントロールのPBS添加細胞のIL-17F、IL-21、IL-22及びIL23R　mRNA発現をリアルタイムRT-PCR法で定量した。ヒト安定化ガレクチン９によって、これら全てのmRNA発現が有意に低下した。
　(c)ナイーブT細胞をTH17分化誘導刺激下で24時間培養し(TH17　skewed)、CD4+Tim-3+細胞をフローサイトメトリーで測定した。同分化誘導刺激よりTGF-β1及びIL-6を除いた条件で24時間培養したナイーブT細胞をコントロールとした(No　skewed)。どちらにおいてもTim-3の発現細胞はほとんど検出されなかった。また前述(a:０～９６)の条件でヒト安定化ガレクチン９によるTH17分化誘導抑制試験を行い、ヒト安定化ガレクチン９存在時に抗Tim-3中和抗体(10μg/ml、αTim-3)またはアイソタイプコントロール抗体(10μg/ml、IgG2a)を添加した。培養96時間目の上清中のIL-17AをELISAで定量したところ、抗Tim-3抗体によるヒト安定化ガレクチン９の作用抑制は見られなかった。
　(d)ナイーブT細胞をTH17分化誘導刺激下で96時間培養後、分化したTH17細胞を含む細胞集団にヒト安定化ガレクチン９(30　nM)を添加し、4時間後にアポトーシスを起こしたTim-3陽性細胞、つまり、TH17をフローサイトメトリーで検出した。ヒト安定化ガレクチン９添加時に抗Tim-3抗体(10μg/ml、αTim-3)またはアイソタイプコントロール抗体(10μg/ml、IgG2a)を添加した条件でも実験を行った。ヒト安定化ガレクチン９によってTH17細胞のアポトーシスが誘導され、その効果は抗Tim-3抗体によって有意に抑制された。この結果は、分化したTH17細胞は、Tim-3依存的にガレクチン９によってアポトーシスの誘導を受けることを示唆する。
　IL-17産生はナイーブT細胞を抗CD3抗体コーティングしたプレート中で抗CD28抗体、IL-2、TGF-β1およびIL-6で刺激し、4日間培養すると強く誘導される。このTH17分化誘導系に30nMのガレクチン９を添加したところ分化開始から18時間までのガレクチン９処置によってIL-17産生は著明に抑制され、最初の24時間ガレクチン９処理を行うと4日間通してのガレクチン９処理と同等のIL-17産生抑制効果を示した(図４ａ)。これに反して、TH17分化誘導前24時間前処置では抑制効果は無かった(図４ａ)。TH17の分化に関連するIL-17F、IL-21、IL-22およびIL-23RのmRNAレベルを検討したところ、TH17分化開始より24時間ガレクチン９処置を行った場合にはIL-17Aのみならずこれら全てのTH17関連遺伝子の発現が抑制されており(図４ｂ)、そのためにTH17細胞分化が抑制される可能性が示唆された。ガレクチン９はTim-3のリガンドであり、Tim-3発現TH1細胞と相互作用してアポトーシスを誘導する(非特許文献４)。TH17細胞にもTim-3の発現が報告されているので(非特許文献５～６)、ガレクチン９によるTH17分化抑制にTim-3が関与している可能性を検討した。ところがガレクチン９が分化抑制作用を示すTH17細胞分化誘導開始より24時間目ではTim-3発現細胞は殆ど検出されず(図４ｃ)、またガレクチン９によるTH17分化抑制はTim-3中和抗体を添加しても解除されなかった(図４ｃ)。その一方で分化誘導4日目では5～10%のT細胞がTim-3を発現しており、このTH17細胞はガレクチン９でアポトーシスを起こし、抗Tim-3中和抗体はそれを有為に抑制した(図４ｄ)。これらの結果は、ガレクチン９によるTH17細胞分化抑制にはTim-3の関与は無いが、Tim-3を発現している活性化TH17細胞のアポトーシス誘導にはTim-3が関与していることを強く示唆する。
〔ガレクチン９によるTH17分化誘導抑制にはO-結合型糖鎖が関与する〕
　図５に、ガレクチン９によるTH17分化誘導抑制にはN-結合型糖鎖でなく、O-結合型糖鎖が関与することを示唆する結果をを示す。
　(a)ナイーブT細胞をTH17分化誘導刺激条件下で培養し、最初の24時間にヒト安定化ガレクチン９(30　nM)またはコントロールとしてPBSを添加した。その24時間の間にガレクチンの阻害剤であるラクトースを3　mM、10　mMまたは30　mMの濃度で添加し、96時間後に培養上清中のIL-17A濃度を定量した。ラクトースのコントロールとしてはガレクチン９に作用を持たないスクロースを用いた。ヒト安定化ガレクチン９による抑制作用はラクトースによって濃度依存的に消失したことより、ヒト安定化ガレクチン９のレクチン活性がTH17分化抑制に必要であることが示された。
　(b)前述(a)の条件で、今度は、ラクトースの代わりにN-グリコシレーション阻害剤のswainsonine　(2μg/ml)またはO-グリコシレーション阻害剤のBenzyl　N-acetyl-α-D-galactosaminide　(Benzyl-α-GalNAc,　2mM)を添加した。96時間後に培養上清中のIL-17A濃度を定量したところ、swainsonineではヒト安定化ガレクチン９の効果が有意に残存していたが、Benzyl-α-GalNAcではヒト安定化ガレクチン９の効果に有意差が見られなくなった。この結果はガレクチン９によるTH17分化抑制にはO-グリコシレーションを受けた糖タンパクが関与していることを暗示する。
　ガレクチン９によるTH17細胞分化抑制をガレクチン９の低分子リガンドであるラクトース存在下で行ったところ、TH17分化抑制効果は添加するラクトースの濃度依存的に減少したが、ガレクチン９に結合しないスクロースは全く影響を与えなかった(図５ａ)。この結果はTH17分化抑制にはガレクチン９のレクチン活性が必用であり、ターゲット細胞が発現する多糖へ結合して作用することを示唆している。そこでガレクチン９のターゲットがO-グリカンなのかN-グリカンなのかを絞り込むために、O-グリカンの阻害剤Benzyl-α-GalNAcおよびN-グリカンの阻害剤swainsonineを用いたところ、ガレクチン９によるTH17分化抑制活性はBenzyl-α-GalNAcniyotteによって有意に抑制された(図５ｂ)。これまでにガレクチン９によるアポトーシス誘導にはN-グリカンが重要であることが知られていたが(非特許文献４、３７)、TH17細胞分化抑制にはO-グリカンが重要であることが暗示された。
〔ガレクチン９によるTH1,　TH2　及びTH17細胞分化への作用〕
　図６には、TH1,　TH2　及びTH17細胞分化に及ぼすGal-9の効果を示す。
　(a)ナイーブT細胞に30　nMのヒト安定化ガレクチン９(またはコントロールのPBS)を添加し、TH1、TH2、TH17の各分化誘導刺激、または抗CD3抗体及び抗CD28抗体によるTCR刺激のみ(No　skewed)のそれぞれの条件下に96時間培養後、各THサブタイプに特異的なmRNA発現をリアルタイムRT-PCRで定量した。ヒト安定化ガレクチン９はTH1及びTH2細胞に特異的なmRNAの発現に影響を与えず、唯一TH17細胞に特異的なIL-17A及びRORγtのmRNA発現を有意に抑制した。
　(b)上記実験のTH17分化誘導条件におけるIFN-γとIL-4　mRNAを測定したところ、どちらもヒト安定化ガレクチン９による発現の変化は見られなかった。TH17分化はこれらのサイトカインによって抑制されることが知られているが、ガレクチン９の作用はこれらのサイトカイン発現を上昇させるためではないことが示唆された。
　ガレクチン９によるヘルパーT細胞分化抑制はTH17細胞に特異的で、IL-12によるTH1細胞分化やIL-4によるTH2細胞分化に対しては無効であり、TH1、TH2、TH17それぞれの分化特異的な転写因子の発現においてもガレクチン９で抑制されるのはTH17の転写因子RORγのみであった(図６ａ)。またTH1やTH2への分化が増強された場合にはTH17細胞分化が抑制されることが知られているが(非特許文献３８)、ガレクチン９を添加したTH17分化誘導系においてIFN-γやIL-4のmRNAは増強されておらず、従ってTH1やTH2の増強は可能性から排除された(図６ｂ)。
〔ガレクチン９はIL-2依存的にIL-17産生を抑制し、またCD25とFoxp3発現を増強する〕
　図７は、ガレクチン９によるCD25とFoxp3発現上昇はIL-2に依存するという結果を示す。
　(a)ナイーブT細胞に30　nMのヒト安定化ガレクチン９を添加し(またはコントロールのPBS)、TH17分化誘導条件下に24時間培養するとヒト安定化ガレクチン９添加によってCD4+CD25+細胞の割合が有意に上昇し、これはCD25　mRNAの上昇にも反映されていた。
　(b)上記(a)の条件で96時間培養後にCD4+CD25+Foxp3+細胞の割合を調べると、安定化ガレクチン９の添加により有意に上昇していた。
　(c)ナイーブT細胞に30　nMのヒト安定化ガレクチン９　(コントロールはPBS)及び図に示した濃度のIL-2を添加して、TH17分化誘導条件下に96時間培養し、培養上清中のIL-17A濃度を定量した。ガレクチン９によるIL-17A産生抑制作用はIL-2存在下でのみ発揮された。一方IL-2単独でもIL-17A産生抑制傾向は見られたがその作用は弱く、100　ng/ml　IL-2においても統計的な有意差は無かった。
　(d)上記(c)の条件で96時間培養した細胞中のTreg細胞の割合を測定した。安定化ガレクチン９によってCD4+CD25+Foxp3+細胞、つまりTreg細胞が増加するのはIL-2を添加した場合に限定された。
　(e)ナイーブT細胞に30　nMのヒト安定化ガレクチン９を添加　(コントロールはPBS)し、TH17分化誘導条件下に96時間培養した後、PMA(50　ng/ml)とイオノマイシン(1　μg/ml)及びbrefeldin　A　(10μg/ml)存在下で更に6時間培養した。CD4陽性細胞中のIL-17+Foxp3-細胞とIL-17-Foxp3+細胞の割合をフローサイトメトリーで測定すると、ガレクチン９はIL-17+Foxp3-細胞の減少とIL-17-Foxp3+細胞の増加を誘導していた。
　(f)ナイーブT細胞を上記(e)の条件で培養し、図に示した各時点でCD25及びFoxp3のmRNA発現をリアルタイムRT-PCRで定量した。CD25の発現はTH17分化誘導刺激開始24時間で上昇したが、Foxp3の上昇には72時間を要した。どちらのmRNA発現も安定化ガレクチン９添加によって有意に上昇した。
　ガレクチン９はTH17細胞分化誘導条件でCD4+CD25+細胞の増加とCD25のmRNAレベルを増加させ　(図７ａ)、TH17細胞分化条件にも係わらずCD4+CD25+Foxp3+細胞を増加させたことより(図７ｂ)、ガレクチン９には強力なTreg細胞分化誘導作用があることが示唆された。CD25のリガンドであるIL-2は、TH17細胞分化を抑制すると報告されており(非特許文献３９)、実際に本実施例で用いているTH17細胞分化誘導系においてもIL-2は濃度依存的にIL-17産生を抑制したがIL-2単独の効果は弱く(図７ｃ)、ガレクチン９の添加によって相乗的に高められた(図７ｃ)。またガレクチン９によるFoxp3発現増強はIL-2存在下でのみ誘導された(図７ｄ)。TH17細胞分化誘導によってCD25陽性CD4細胞中の約7%がFoxp3-　IL-17A+に、約25　%　がFoxp3+IL17A-細胞となるが、ガレクチン９を添加するとFoxp3-IL-17A+細胞が約2%に減少し、一方でFoxp3+IL17A-細胞は約50%に増加した(図７ｅ)。この系におけるCD25の発現は分化誘導後24時間後より増強されるがFoxp3発現増強には72時間を要し、いずれもガレクチン９によって発現量が上昇した　(図７ｆ)。
〔細胞表面Gal-9陽性細胞の同定〕
　図８には、細胞表面にガレクチン９を発現するTH細胞の同定を行った結果を示す。
　(a)ナイーブT細胞を図６ａの各条件、及び未刺激(No　stim)で96時間培養し、培養上清中のガレクチン９濃度をELISAで定量した。ガレクチン９の分泌はTCR刺激のみ(No　skewed)、TH1及びTH2細胞への分化条件では上昇したが、TH17への分化条件では抑制された。
　(b)ナイーブT細胞をTH17に分化誘導する系にはTCR刺激に加えてIL-2、TGF-β1及びIL-6が添加されている。この完全系(TH17　skewed)よりIL-6を除いたもの(TGF-β1　alone)、TGF-β1を除いたもの(IL-6　alone)およびTCR刺激のみ(No　skewed)の各条件で96時間培養後の上清に含まれるガレクチン９をELISAで定量した。IL-6の添加によってガレクチン９濃度は顕著に低下した。一方TGF-β1の添加にもガレクチン９の濃度を低下させる傾向が見られたが有意差は無かった。
　(c)ナイーブT細胞に30　nMのヒト安定化ガレクチン９(またはコントロールのPBS)を添加し、未刺激(No　stim)、TCR刺激のみ(No　skewed)及びTH17分化誘導刺激条件下でそれぞれ96時間培養した後、上清中のガレクチン９をELISAで定量した。ELISAはマウスガレクチン９に特異的で、添加した30　nMのヒト安定化ガレクチン９の影響を受けない。ヒト安定化ガレクチン９はこれらの条件で培養したナイーブT細胞からのガレクチン９分泌を上昇させた。
　(d)上記(c)の細胞を用いてガレクチン９mRNA量をリアルタイムRT-PCRで定量したが、図中の各条件の細胞において統計的有意差は認められなかった。
　(e)その一方で、上記(a)の細胞表面のガレクチン９とCD25を染色してフローサイトメトリーで測定したところ、細胞表面にガレクチン９を発現する細胞の割合は未刺激ではCD4陽性細胞の2%弱であるが、TH1、TH2分化誘導刺激下、またはTCR刺激下に約4%に上昇した。その一方でTH17分化誘導条件では2%弱に留まった。各分化刺激による細胞表面ガレクチン９陽性細胞の割合はガレクチン９の分泌とよく一致している。
　(f)上記の細胞を細胞表面ガレクチン９陽性と陰性にソーティングして分け、ガレクチン９mRNAをリアルタイムRT-PCRで定量したところ、両者に統計的な差は見られなかった。またそれら細胞を固定化／細胞膜浸透化後に抗ガレクチン９抗体で染色して細胞が含有する全てのガレクチン９を染色してフローサイトメトリーにより測定したが、この場合にも両細胞に差は見られなかった。
　これまでに示したようにガレクチン９の添加はTH17分化を強力に抑制する。また既に報告されているようにTCRのみの刺激時や、TH1やTH2への細胞分化条件はTH17細胞分化を抑制する。そこでこれらの条件で培養したナイーブT細胞の培養上清中ガレクチン９濃度を調べたところ、TH1およびTH2細胞への分化条件においてその濃度は高く、TH17細胞分化条件では抑制されていた(図８ａ)。TH17細胞分化誘導にはTGF-βとIL-6を必要とするが、IL-6がガレクチン９の分泌抑制を起こしていることが判った(図８ｂ)。既に示したようにTH17細胞分化条件においてもリコンビナントガレクチン９を添加するとTH17分化が抑制されるが、このガレクチンの添加によって内在性ガレクチン９の分泌も増強された(図８ｃ)。ちなみに添加したリコンビナントガレクチン９はヒト型であり、マウス細胞にも生理活性を示すが培養上清中のガレクチン９測定に用いるELISAでは検出されない。またガレクチン９の分泌量に差があるにもかかわらずガレクチン９のmRNA量はTH17誘導条件下と非誘導条件で有意な差を示さなかった(図８ｄ)。
　これらの結果よりNo　skewed、TH1やTH2分化誘導系にはガレクチン９を分泌する細胞が存在していることが判った。ガレクチン９はシグナルペプチドを持たず、その分泌メカニズムについては全く不明であるが、その局在場所である細胞質から直接、または何らかの輸送装置を通って細胞膜を通過することは間違いないと考えられる。発明者らはガレクチン９を分泌する細胞には細胞表面に分泌の中間状態のガレクチン９が検出できるのではないかと考え、抗ガレクチン９抗体を用いて細胞を染色した。その結果、細胞表面にガレクチン９発現する細胞集団を検出することに成功した。ところで、このガレクチン９染色はラクトース存在下で行った。ガレクチン９は細胞表面に数多く存在する糖脂質や糖タンパク質に結合するので、分泌したガレクチン９が二次的に細胞表面に結合したものと、目的の細胞とを区別するためである。予備検討の結果、30　mMのラクトースは二次的なガレクチン９の細胞への結合を完全に抑制し、一方で抗原抗体反応には影響を与えないことを確認し、細胞表面のガレクチン９染色時には常に30　mMラクトースを添加した。TCR刺激前のナイーブT細胞の2％弱は細胞表面にガレクチン９を発現しており、当然ながらそのほとんどはCD25-細胞である(図８ｅ)。TCR刺激はCD25+細胞を増加させるが、同時にガレクチン９陽性細胞も増加させ、CD25+細胞集団の約10％に上った　(図８ｅ)。これに対して、TH17細胞分化誘導条件ではCD25+細胞もCD25+Gal-9+細胞も明らかに減少した　(図８ｅ)。それぞれのTH細胞分化系におけるガレクチン９分泌（図８a）と細胞表面にガレクチン９を発現する細胞の割合（図８e）はよく相関しているおり、ガレクチン９を分泌する細胞はこれら細胞表面にガレクチン９を発現している細胞集団である可能性が強く示唆された。ガレクチン９を分泌する細胞はガレクチン９を高発現している可能性が高いと考え、CD4+CD25+　T細胞を細胞表面のガレクチン９発現の有無でフローサイトメトリー法を用いて分離精製し、それぞれのガレクチン９mRNA量をReal　time　RT-PCRで調べたが、予想に反して両者に有為な差は見られなかった（図８f）。またそれぞれの細胞を細胞膜浸透化キット（BD　Cytofix/Cytoperm）を用いて細胞内外に存在する全てのガレクチン９を染色したところ、ガレクチン９の発現に差は見られなかった　(図８ｆ)。これらの結果は図８dとも良く一致するが、細胞表面のガレクチン９発現と分泌の関係については更なる実験で証明が必要となった。以後、ガレクチン９を細胞表面に発現しているCD4　T細胞をTHGAL9と仮称する。
〔THGAL9細胞の活性〕
　図９には、THGAL9はTCR刺激によりガレクチン９を分泌し、IL-10及びTGF-βを発現上昇すること、及びTHGAL9はTH17/Tregバランスを制御する結果を示す。
　(a)マウス脾臓細胞よりナイーブT細胞を調製し、さらに細胞表面ガレクチン９陽性細胞（THGAL9細胞：Gal-9＋TH)と陰性細胞（non-THGAL9：Gal-9-TH)をソーティングにより分取した。それぞれの細胞をTCR刺激（抗CD3抗体コートプレート中で抗CD28抗体を添加）の有無の条件下96時間培養し、培養上清に分泌されたガレクチン９をELISAで定量した。THGAL9細胞のみTCR刺激によってガレクチン９分泌が誘導された。
　(b)上記細胞のサイトカインmRNA発現をリアルタイムRT-PCRで調べた。THGAL9細胞はnon-THGAL9細胞と比較してIL-10及びTGF-βの発現が高く、一方でIL-4及びIL-17Aの発現は低かった。
　(c)ナイーブT細胞をTH17分化誘導刺激下で6時間培養後、THGAL9細胞(Gal-9＋TH)またはnon-THGAL9(Gal-9-TH)細胞と1:1の比で混合し、その後はTCR刺激のみ与えて90時間共培養した。培養上清に分泌されたIL-17AをELISAで定量し、一方Foxp3　mRNAの発現はリアルタイムRT-PCRで定量した。THGAL9細胞の添加によりIL-17A分泌が抑制され、一方でFoxp3の発現は上昇した。
　(d)上記の共培養を、ガレクチン９を拮抗阻害する30mMのラクトース(またはコントロールのスクロース)存在下で行った。ラクトース添加によってTHGAL9細胞によるIL-17A産生抑制は解除された。この結果は、THGAL9細胞は抑制性サイトカインIL-10やTGF-βを産生しているがTH17分化抑制においてはガレクチン９が必須な働きをしていることを示唆する。
　(e)THGAL9によるTH17分化抑制作用にIL-10とTGF-βの関与が低いことを裏付けるため、前述（c）のTHGAL9は共培養によるTH17抑制系にIL-10及びTGF-βの中和抗体をそれぞれ10μg/mlの濃度で添加したところ、これらの中和抗体はTHGAL9の作用を阻害しなかった。
　(f)更にIL-10の関与を問うために前述（c）のアッセイ系にリコンビナントIL-10を添加してIL-17産生への作用を調べた。調べた範囲の濃度においてIL-10は統計的に有為な抑制効果を示さなかった。
　図８で発見した細胞表面にガレクチン９を発現するCD4　T細胞をTHGAL9と仮称し、これがガレクチン９を分泌してTH17/Tregバランスを制御する細胞であると仮定したが、その一方で、THGAL9はそれ以外のT細胞と比較して有為に高いガレクチン９を発現しているわけではなかった（図８f）。図９ではTHGAL9をソーティングで精製し、その性質を調べることでTHGAL9が実際にガレクチン９を放出することを発見した。THGAL9は抑制性サイトカインであるIL-10、TGF-βも高発現しており、一方でIL-4、IL-17の発現は有為に低かった。更にTHGAL9がTH17を抑制しTreg分化を促進することを共培養実験によって証明した。THGAL9が高発現するIL-10は抑制性サイトカインの代表格で、TH17分化を抑制するという報告もあるが(非特許文献４０)、少なくとも図９で用いたアッセイ系においてTH17分化誘導を抑制する薬効の本体は大部分ガレクチン９であることが阻害剤を用いた実験（d、e）及びリコンビナントIL-10を用いた実験（f）で示された。ところでTHGAL9から分泌されたガレクチン９の培養上清中濃度は、図９aの実験結果では150pg/ml程度であり、安定化ガレクチン９を用いて薬効が見られる濃度（30nM：1μg/ml）よりも遥かに低い。恐らくTHGAL9はターゲット細胞に非常に近接した状態、もしくは接着した状態でパラクラインもしくは細胞表面のガレクチン９を用いて相互作用し、ターゲット細胞へ作用しているのではないかと考えられる。ガレクチン９は高濃度においては多くの細胞に細胞死を誘導する。よって無闇な分泌は危険であり、THGAL9はターゲット細胞にコンタクトして認識した上でガレクチン９による制御を行っていると予想される。
　図１０には、CD25+THGAL9はTCR刺激によりIL-10とTGF-β1を産生する結果を示す。
　(a)ナイーブCD4　T細胞をTCR刺激下で96時間培養し、ソーティングによりCD25+THGAL9、CD25+non-THGAL9及びCD25-non-THGAL9に分離する。それぞれの細胞をさらにTCR刺激下で96時間培養し、培養上清中のガレクチン９をELISAで定量した。
　(b)上記(a)の細胞のIL-10及びTGF-β1発現をリアルタイムRT-PCRによって定量した。
　その結果、THGAL9細胞をTCR反復刺激するとガレクチン９分泌量の増加とIL-10及びTGF-βのmRNA発現レベルの増加が観察された。
〔THGAL9は安定化ガレクチン９添加で増加する〕
　図１１にはTHGAL9が安定化ガレクチン９添加によって増加する結果を示す。
　（a）図８（c）の細胞をCD25と細胞表面ガレクチン９で染色し、フローサイトメトリー法で測定した結果を示す。ヒト安定化ガレクチン９の添加は未刺激のnaive　CD4　T細胞にも働き、Gal-9+CD25-細胞を増加させた。TH17分化誘導条件ではTHGAL9が減少するが（図８e）、安定化ガレクチン９添加によってTHGAL9の割合は有為に上昇した。またガレクチン９を多く分泌するGal-9+CD25+細胞の割合もTCR刺激依存的にヒト安定化ガレクチン９添加が有為に上昇させた。一方、安定化ガレクチン９添加はGal-9-CD25+細胞の割合もTCR刺激依存的に上昇させた。この細胞集団にはTregが含まれており、ガレクチン９のTreg分化促進作用の結果だと考えられる。
　（b）THGAL9はガレクチン９に加えてIL-10、TGF-βを産生する。これらのサイトカインがTCR刺激によるTHGAL9の増加に関与している可能性を調べるために、ナイーブCD4　T細胞をIL-10中和抗体、IL-10R中和抗体またはTGF-β中和抗体の存在下でTCR刺激し、THGAL9細胞の出現をフローサイトメトリー法で調べた結果を示す。これらサイトカインの中和はTHGAL9の増加に全く影響を与えなかった。
　（c）IL-10は抑制性のT細胞であるTr1の分化を促進することが知られており、THGAL9の増加にも影響する可能性が考えられる、（b）の結果より少なくともTCR刺激によるTHGAL9の増加においてはIL-10の関与は低いと考えられた。そこで今度はナイーブCD4　T細胞にIL-10（またはコントロールとしてヒト安定化ガレクチン９）を添加し、TCR刺激下で培養してTHGAL9細胞の出現をフローサイトメトリー法で調べた結果が、本実験系においてIL-10によるTHGAL9の増加は見られなかった。
〔THGAL9細胞とTr1細胞の比較〕
　図１２にはTHGAL9細胞とTr1細胞の比較を行った結果を示す。IL-10産生タイプ1制御性T細胞(Tr1細胞)は様々な場で免疫を制御しており、Tr1細胞を用いた自己免疫疾患や癌治療についての可能性も議論されている。このTr1細胞には現在いくつかのマーカーが提唱されているが、この細胞のもっとも顕著な特徴は大量にIL-10を分泌することにある。本発明者らの見出したTHGAL9細胞もIL-10を産生していることより、Tr1細胞との比較を行った。これまで報告されているマウスのTr1細胞マーカーにはLAP(非特許文献２１)、NKG2D(非特許文献２０)、LAG-3(非特許文献２２)及びCTLA-4(非特許文献４１)がある。またTregとは対照的にTr1細胞はFoxp3を発現していないと考えられている(非特許文献４２～４３)。そこでナイーブCD4+T細胞のTCR刺激前後で、Tr1細胞マーカー発現を検討した。
　(a)ナイーブCD4+T細胞を既報のTr1細胞マーカーであるLAP、NKG2D、LAG-3及びCTLA-4で染色し、THGAL9細胞との関連をフローサイトメトリー法で調べた。CD25-THGAL9細胞はこれら全てのTr1細胞マーカーを発現していたが、CD25-non-THGAL9細胞には発現が見られなかった。
　(b)これら細胞をTCR刺激し、CD25陽性となったT細胞集団で同じ測定を行うと、殆ど全てのCD25陽性CD4細胞がTr1マーカーを発現するようになった。
　(c)(b)の細胞を細胞表面ガレクチン９とTim-3で染色した結果を示す。THGAL9にはTim-3発現が無いことが示された。
　（d,e,f）ナイーブCD4+T細胞をIL-27(25ng/ml)の存在下または非存在下でTCR刺激を加え、3日間培養しTr1への分化誘導を促進した。3日後の培養上清を一部回収しIL-10（d）及びガレクチン９濃度（e）をELISAにより定量した。残った細胞はbrefeldin　A　(10μg/ml)存在下でPMA(50ng/ml)とイオノマイシン(1μg/ml)で4時間刺激し、細胞内部のIL-10と細胞表面のガレクチン９で染色してフローサイトメトリー法にて測定した（f）。
　TCR刺激前のCD25-THGAL9細胞は、既知のTr1細胞マーカーの全てを発現していたが、細胞表面にガレクチン９を発現しないCD25-CD4+　Non-THGAL9細胞には発現が見られなかった(図１２ａ)。この結果はTHGAL9とTr1が非常に似通った細胞であることを示している。一方で、TCR刺激によってCD25を発現した細胞では、発現量には違いがあるが殆どの細胞が上記のTr1細胞マーカーを発現するようになった(図１２ｂ)。もともとTr1マーカーとして報じられているこれらのマーカーは細胞の活性化マーカーでもあり、TCR刺激を受けた細胞では量の多少はあれ発現が見られることはむしろ当然だと考えられる。またTHGAL9細胞にはFoxp3が発現しておらず、Tregとは異なる細胞であることが確認された（図１２b）。またTHGAL9にはTim-3の発現も見られなかった　(図１２c)。THGAL9とTr1は類似の性質を持っており、THGAL9はTr1と同一もしくはその部分集団である可能性が示唆された。そこでTr1の分化因子の一つであるIL-27存在下でナイーブT細胞をTCR刺激下で3日間培養したところ、IL-27を添加することでIL-10及びガレクチン９分泌が有為に高まることが示された（図１２d,e）。更に分化誘導後の細胞を細胞表面ガレクチン９陽性と陰性で分け、それぞれのIL-10発現量を比較したところ、ガレクチン９陽性の細胞集団の約半分がIL-10を発現しており、一方でガレクチン９陰性の細胞集団では20%以下であった（図１２f）。今回の結果はTHGAL9がTr1と非常に良く似た性質の細胞であることを示した。実際のところ現在のTr1の定義をTHGAL9は満たしておりその意味においてTr1の部分集団だといえる。これまでTr1の免疫制御活性はその多くがIL-10に依存すると考えられてきたが、図９で示したようにTH17/Tregのバランス制御においてはIL-10ではなくガレクチン９が必須である。ところでTr1の誘導法を示した中には高濃度IL-10を用いた方法もあるが、その場合には数週間の培養を要する。図１１cにおいてIL-10の添加でTHGAL9の増加を調べた際には96時間の培養であり、IL-10の効果が発揮されるには短時間であった可能性も考えられる。
　図１３ではTHGAL9とTr1の関係を更に明らかにするために、ガレクチン９ノックアウトマウスでTr1マーカーを持つ細胞を調べた。
　（a）ガレクチン９ノックアウトマウスと野生型マウスの脾臓細胞をCD4及びNKG2D、LAG-3、LAPまたはCTLA-4で染色し、フローサイトメトリー法で測定した結果を示す。ガレクチン９ノックアウトマウスではTr1マーカー陽性細胞の割合が野生型と比較して減少していた。
　（b）ガレクチン９ノックアウトマウスと野生型マウスのナイーブCD4　T細胞をTCR刺激のみ（No　skewed）またはTH17分化誘導刺激条件下（Th17　skewed）で培養し、IL-10mRNAの発現をリアルタイムRT-PCRで調べた結果を示す。ガレクチン９ノックアウトマウスではIL-10産生が有為に減少していた。
　（c）（b）のNo　skewed条件で培養した細胞をbrefeldin　A(10μg/ml)存在下でPMA（50　ng/ml）とイオノマイシン（1μg/ml）処理を4時間行い、細胞内部に蓄積したIL-10を染色してフローサイトメトリー法で測定した結果を示す。ガレクチン９ノックアウトマウスではIL-10陽性細胞が優位に減少していた。
　これらの結果は、全て、THGAL9とTr1が非常に似通った細胞であり、現在のTr1定義においてはTHGAL9がTr1と同一もしくはその部分集団であることを示すものである。
　下記表１に、各臓器におけるCD4陽性T細胞中の細胞表面ガレクチン９陽性細胞（THGAL9）の割合を調べた結果を示す。下記表１中、「Organs」は、「臓器」を意味する。「Thymus」は、「胸腺」を意味する。「LN」は、リンパ節を意味する。「Spleen」は、「脾臓」を意味する。「Peyer’s　patch」は、「パイエル板」を意味する。「PBMC」は、「末梢血単核球」を意味する。「Phenotype」は、「表現型（Phenotype）」を意味する。「cells」は、「細胞」を意味する。Thymus（胸腺）においてはT細胞の多くがCD4とCD8の二重陽性の未熟な状態であるので、ここではCD4　SP（CD4単陽性）のT細胞にのみに着目した。なお、THGAL9細胞の存在を、種々のリンパ器官で調べたところ、胸腺のCD4単陽性細胞の約1/4、リンパ節、脾臓、抹消血及びパイエル盤由来のCD4+CD25-T細胞の各4%、7%、15%及び7%であった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
〔ヒトTH17/Treg分化に対するガレクチン９の作用とヒトTHGAL9細胞の同定〕
　ヒトとマウスの免疫系が同一で無いことは良く知られていることから、本研究におけるマウス及びマウスの細胞を用いて解明したガレクチン９の機能がヒトにも当てはまる保証は無い。ヒトでもガレクチン9がTH17/Tregバランス制御を行うこと、およびヒトにもTHGAL9細胞が存在していることを確認することが臨床応用を考える上で必須である。図１４には、ヒトT細胞へのガレクチン９の作用とTHGAL9細胞を同定した結果を示す。
　(a)健常人4人より得た抹消血CD4+T細胞にヒト安定化ガレクチン９(30nM)若しくはコントロールのPBSを添加し、TCR刺激下96時間培養した。CD25を染色し、フローサイトメトリー法で測定した。
　(b)上記(a)の細胞をCD25及びFoxp3で染色し、それぞれの発現をフローサイトメトリー法で測定した。
　(c)ヒトCD4+T細胞にヒト安定化ガレクチン９(30nM)若しくはコントロールのPBSを添加し、TH17細胞への分化誘導刺激下で9日間培養し、培養上清中のIL-17濃度をELISAで定量した。
　(d)ヒトCD4+T細胞をTCR刺激下、または未刺激で96時間培養し、細胞表面のガレクチン９とCD25を染色してフローサイトメトリー法で測定した。
　(e)ヒトCD4+T細胞をTCR刺激下96時間培養した後、ソーティングにより細胞表面にガレクチン９陽性細胞(CD25+THGAL9)と陰性細胞　(CD25+non-THGAL9)に分取した。それぞれをTCR刺激下でさらに96時間培養し、培養上清中のガレクチン９をELISAで定量し、一方図に示した各サイトカインmRNA発現をリアルタイムRT-PCRで測定した。
　ヒト抹消血より得たCD4+T細胞をガレクチン９存在下で培養したところ、ガレクチン９によってCD25陽性細胞とCD25+Foxp3+細胞の割合が増加し、その増加はTCR刺激によってさらに増強した　(図10ａ～ｂ)。つぎに、ヒトTH17分化誘導系にガレクチン９を添加し、IL-17の放出を指標にTH17分化を調べたところ、ガレクチン９によってIL-17分泌は抑制された(図10ｃ)。これらの知見はマウス細胞で解明されたガレクチン９の機能と同等である。さらに、健常人の抹消血中には、細胞表面にガレクチン９を発現するCD4+CD25-　T細胞が　1-4%存在しており、これをTCR刺激すると細胞表面にガレクチン９を発現するCD4+CD25+T細胞が顕著に増加した(図10ｄ)。この細胞は細胞表面にガレクチン９を発現しないCD4+CD25+　T細胞と比較して有意に多くのガレクチン９を分泌し、IL-10及びTGF-βのmRNA発現も高かった(図10ｅ)。その一方でIL-2及びINF-γのmRNA発現には優位差が無く、IL-4及びIL-17　mRNA発現はむしろ細胞表面にガレクチン９を発現する細胞において低値を示した(図10ｅ)。これらの結果よりガレクチン９の機能はヒトとマウスで同等であり、ヒトにおいてもTHGAL9細胞が存在していることが明らかとなった。
　本実施例によれば、THGAL9が、ガレクチン９を分泌し、TH17/Tregバランスを調整する細胞として機能し得ることが確認された。ガレクチン９の作用がマウスにおいてもヒトにおいても同様であることはガレクチン９、特に安定化ガレクチン９の臨床応用においては非常に重要な知見である。さらにTHGAL9がヒトにも存在していることが示されたことより、ガレクチン９による免疫制御は動物種を超えてよく保存されていると考えられる。THGAL9は細胞表面のガレクチン９で検出できるため、図９aで示したように、細胞を生きたまま単離精製することが可能であり、この細胞を利用した応用技術の開発も容易である。更にTHGAL-9は安定化ガレクチン９添加で増加することが示され、この将来様々な応用に有用だと考えられる細胞をin　vitroで増加させる技術の一つも発見した。THGAL9以外のT細胞も同等のガレクチン９を発現しているにも関わらずそれを分泌しない。THGAL9のみガレクチン９を分泌できるのは、この細胞に存在する分泌メカニズムによると考えられ、それを制御することが出来れば、免疫制御の新たな方法ともなり得る。THGAL9の発見は、ガレクチン９分泌メカニズムの解明にも重要な貢献となると考えられる。例えばTHGAL9とそれ以外のT細胞を用いた網羅的な発現プロファイリングをmRNAレベルやタンパクレベルで行うことが方法として考えられる。またTHGAL9は免疫バランスを間接的に知るサロゲートマーカーとして利用できる可能性もあり、例えば様々な免疫性疾患、癌、感染症などの診断やそれらへの感受性の診断または薬剤の効果を調べる指標としてである。
〔THGAL9以外の細胞表面にガレクチン９を発現する細胞〕
　ヒト安定化ガレクチン９投与は前述の自己免疫疾患モデル以外にも様々な病態モデルにおいて薬効を示すことが示されている。これらの場面においても投与したガレクチン９が引き金となり、THGAL9ガレクチン９を含むガレクチン９分泌細胞が誘導されている可能性がある。THGAL9は細胞表面にガレクチン９を発現する細胞として同定され、それがガレクチン９分泌能を持つことが確認された。発明者らは細胞表面のガレクチン９は分泌の中間体として検出されていると考えており、よって細胞表面のガレクチン９発現を指標にTHGAL9以外のガレクチン９発現細胞を探索することができると予想される。少なくとも細胞表面に露出していることは既に細胞膜をトランスロケートした結果であり、広義には分泌されていることになる。そこで様々な病態モデルにおいて細胞表面にガレクチンを発現した細胞群の存在を調べた。
〔腹膜炎モデルでの安定化ガレクチン９の作用とその際に誘導される細胞表面ガレクチン９発現細胞〕
　図１５には重篤な腹膜炎モデルである盲腸結紮穿刺法による腹膜炎（cecal　ligation　and　puncture：CLP）の処置を施したマウスを示す。ここではBALB/ｃマウスを用いている。G21のニードルを用いて結紮した盲腸に穴を開け、その後の生存を経時的に調べるモデルである。
　図１６にはヒト安定化ガレクチン９投与のCLPでの有効性を調べた結果を示す。この知見は岡山大学医学部、松川昭博教授によって行われ、既に学会等で発表されているのでここでは結果の概略を説明する。CLPにより腹膜炎を発症させ、経時的に生存率を調べた。（a）C57BL/6J野生型マウス（WT）とマウスガレクチン９のトランスジェニックマウス（Gal-9　Tg）の比較。（b）WTマウスにCLPと同時にヒト安定化ガレクチン９（30μg/マウス;またはコントロールとしてPBS）を単回静脈内投与したときの生存率。（c）WTマウスにCLP処置を施し、その24時間後にヒト安定化ガレクチン９（30μg/マウス;またはコントロールとしてPBS）を単回静脈内投与したときの生存率。（d）WTマウスにCLP処置を施し、その24時間後にヒト安定化ガレクチン９（30μg/マウス;またはコントロールとしてPBS）を単回皮下投与したときの生存率。（e）ヌードマウスにCLPと同時にヒト安定化ガレクチン９（30　μg/マウス;またはコントロールとしてPBS）を単回皮下投与したときの生存率。
安定化ガレクチン９はこの重篤な腹膜炎に対してもCLP直後またはCLPから24時間後の単回投与でマウスの生存率を有為に延長した。しかしながら、この効果はヌードマウスでは見られなかったことより（図１６e）、安定化ガレクチン９がT細胞を介して作用していることが強く示唆された。
　図１７にはCLP後24時間のマウスより脾臓細胞を取り出して24時間培養し、培養上清中のサイトカイン濃度を調べた結果を示す。これも岡山大学医学部、松川昭博教授らにより学会等で既報である。安定化ガレクチン９投与したマウス脾臓細胞ではTNF-α、IL-12、IL-10の産生が低下し、一方でIL-17の産生が上昇していた。これまで自己免疫疾患モデルにおいてガレクチン９はIL-17を低下させる作用を示したがここでは上昇させた。ガレクチン９は両方向性の免疫調整因子であり、場面によって、または細胞によって作用が異なる。例えば自己免疫疾患においてTNF-αを抑制するが、一方で単球や樹状細胞に作用してTNF-α産生を刺激することは既報であり（非特許文献１３）、IL-17においても場面によってガレクチン９の方向性が変わることは想像に難くない。TNF-α、IL-12、IL-17などの炎症性サイトカインは微生物排除に働く一方で過度の炎症惹起によって組織破壊も起こす。詳細なメカニズムは不明であるが、安定化ガレクチン９投与が生存率を向上させている事実は、ここで見られたサイトカインバランスの変化が腹膜炎下での生存に有利に働いていると考えられる。ガレクチン９腹膜炎（または敗血症）においても重要な働きを行っていることは自明である。
　図１８はCLP24時間後の脾臓細胞をCD3、NK1.1、GL-3および細胞表面ガレクチン９で染色し、フローサイトメトリー法で解析した結果を示す。安定化ガレクチン９投与によって細胞表面ガレクチン９発現細胞が増加している。特に目立った増加を見せたのはNKT細胞（CD3+NK1.1+）、THGAL9を含む細胞集団（CD3+NK1.1-及びCD3+GL-3-）、γδT細胞（CD3+GL3+）である。特にNKT細胞、NK細胞及びγδT細胞は少なくともこのモデルにおいては、その殆ど全てが細胞表面ガレクチン９陽性であることが始めて示された。これらの細胞はTHGAL9同様に、ガレクチン９によって免疫を制御している可能性が非常に高い。これらの細胞を移入することが重篤な腹膜炎治療に有用であることが示唆される。
　図１９は坦癌マウスに安定化ガレクチン９を投与し、その際の細胞表面ガレクチン9陽性細胞を調べた結果を示す。既報のように安定化ガレクチン９投与はマウス繊維肉腫Meth　Aを腹腔内に移植したマウスに投与すると生存を延長する（非特許文献３２）。その方法に従ってMeth　Aを腹腔内に導入し、その直後よりヒト安定化ガレクチン９を3回／週で腹腔内投与（30μg/マウス）した。Meth　A移植より7日後に腹腔内細胞と脾臓細胞を取り出して表示の細胞表面マーカーを染色し、フローサイトメトリー法で測定した結果を示す。
（a）腹腔細胞の内CD4陽性細胞をCD25と細胞表面ガレクチン９発現で展開した結果を示す。ヒト安定化ガレクチン９投与によって細胞表面にガレクチン９を発現した細胞の割合が著しく増加し、一方CD25+Gal-9-は減少した。CD25+Gal-9-細胞は癌に対する免疫を抑制すると考えられるTregを含む細胞集団である。
（b）（a）の細胞を内CD8陽性細胞をCD25と細胞表面ガレクチン９発現で展開した結果を示す。ヒト安定化ガレクチン９投与によって細胞表面にガレクチン９を発現したCD8細胞の割合が著しく増加した。
（c）ヒト安定化ガレクチン９を投与したMeth　A坦癌マウスの脾臓細胞をPDCA-1、CD11c及び細胞表面ガレクチン９で染色し、フローサイトメトリー法で測定した結果を示す。形質細胞様樹状細胞：pDC、pDC様マクロファージ：pDC-Mφ、古典的樹状細胞：cDC、及び樹状細胞やマクロファージと異なる細胞：nonDCMφのそれぞれで細胞表面ガレクチン９発現レベルを比較した。pDC様マクロファージは急性肺障害のモデルにおいてそれを細胞移入すると症状を抑制することが示されている（非特許文献４４）。この場合にもpDC様マクロファージが分泌するガレクチン９が効果の主体を成していることが想像される。
　この坦癌モデルにおいても投与した安定化ガレクチン９が薬効を示すときに前述したように細胞表面にガレクチン９を発現した細胞が出現している。これらの細胞の移入が癌治療に有用であることが示唆され、またこれら細胞をマーカーとして癌の進行や治療の効果を診断できる可能性が示唆される。
　図２０～２１はヒト安定化ガレクチン９の自然発症性自己免疫疾患モデルでの有効性を調べた結果を示す。MRL/MpJUmmCrj-1pr/1prマウスは全身性エリテマトーデスのモデルとして汎用される自然発症性自己免疫疾患モデルである。このマウス（♀、8週齢）にヒト安定化ガレクチン９を表示の用量で3回／週のスケジュールで22週齢まで腹腔内投与し、経時的に後肢足蹠浮腫容積測定（週一回；図１と同様にPLETHYSMOMETERを用いて測定）、体重測定（週三回）、尿中蛋白濃度測定（週一回）を行った。高用量30　μg/マウスでは尿蛋白濃度（図２０a）、体重変化（図２０b）、後肢足蹠浮腫容積変化（図２１a）と、実験終了時（22週齢目）のヘマトクリット値（図２１b）の全てにおいて統計的に有為な治療効果を示した。全身性エリテマトーデスは非常に重篤な自己免疫疾患であり、過去50年間高用量のステロイド投与以外の治療選択肢が無かった。この疾患は自己抗体の産生が顕著であり、よって抗体産生を抑制する治療法が解決策だと考えられてきた。2011年にFDAより認可されたbelimumabはB細胞を抑制する抗体であり、この疾患治療のターゲットとしてB細胞及び自己反応性抗体の産生抑制が重要であることが臨床研究により裏付けされた。
　図２２は安定化ガレクチン９の抗体産生に対する作用を調べた結果を示す。前述したように安定化ガレクチン９は全身性エリテマトーデスのモデルマウスに有効性を示すため、抗体産生及びB細胞抑制に作用している可能性が示唆される。そこで抗体産生への薬物の効果を調べる際に汎用される羊赤血球（SRBC）投与による抗羊赤血球IgM抗体産生系を用い、安定化ガレクチン９の作用を調べた。C57BL/6Jマウス(♀)にSRBCを腹腔内投与し、その直後にヒト安定化ガレクチン９（30μg/マウス）またはコントロールとしてPBSを単回腹腔内投与した。それぞれの時点で、3-5匹のマウスより採血及び脾臓摘出を行い抗体産生及びB細胞を調べた。その結果、ヒト安定化ガレクチン９投与によってSRBC特異的なIgMの濃度は低下したが（a）、全IgM濃度（b）、全IgG濃度（c）には統計的な変化を与えないことが判明した。更にMRL/MpJUmmCrj-1pr/1prマウス（♀、8週齢）に30μg/マウスのヒト安定化ガレクチン９またはコントロールとしてPBSを3回／週投与し、7日目に採血し、血清中の抗二本鎖DNA抗体（自己免疫性抗体の代表）濃度を調べたところ、安定化ガレクチン９投与によって抗二本鎖DNA抗体が有為に抑制されることが判った。これらの作用は抗体産生の本体であるB細胞へ安定化ガレクチン９が作用している可能性を示唆するものである。
　図２３にはB細胞解析方法を示す。脾臓細胞のCD19とGL-7を染色してフローサイトメトリー法で展開すると、Germinal　center　B細胞（CD19+GL-7+）とそれ以外のB細胞（CD19+GL-7-）に分かれる。更にGerminal　center　B細胞をFSC値に従って細胞の大きさによって分離すると比較的大きな細胞のCentroblastと比較的小さな細胞のCentrocyteに分離できる。このFSCによるCentroblastとCentrocyteの分離はそれぞれがCXCR4高発現、低発現である報告と良く一致しており、以降の解析に採用した。
　図２４は図２２のマウスより摘出した脾臓細胞を経時的に調べたものである。安定化ガレクチン９投与後4日目にGerminal　center　B細胞が減少しており、CentroblastとCentrocyteが共に減少していることが判った（a,b）。またガレクチン９ノックアウトマウスにSRBCを投与し、4日目に脾臓細胞を解析すると、Germinal　center　B細胞、Centroblast及びCentrocyteの両者とも野生型と比較して多かった。これは安定化ガレクチン９投与から想定される生体内におけるガレクチン９の作用に矛盾しない。つまりガレクチン９は生体内においてもB細胞および抗体産生を抑制している因子であることが示唆された。よってB細胞及び抗体産生を負に制御するためにガレクチン９を分泌する細胞が存在するはずである。
　図２５では先ずB細胞の細胞表面ガレクチン９発現を調べた。その結果B細胞はGerminal　center　B　細胞も、それ以外のB細胞も全て細胞表面にガレクチン９を発現しており、Germinal　center　B細胞においてその発現が高いことが判った（a）。またGerminal　center　B細胞の中ではCentroblastの方が細胞表面ガレクチン９発現が高いことが判った（b）。一方、Germinal　center　B細胞で調べる限り、安定化ガレクチン９投与は細胞表面のガレクチン９発現に影響を与えないが、SRBCによる感作によっては細胞表面ガレクチン９発現細胞の割合が上昇することが判った。
　B細胞の成熟にはCD4　T細胞が深く関わっており、特にFollicular　B　helper　T　cells　(TFH)と呼ばれるCD4陽性細胞の役割が大きいと言われている。そこで、図２６ではSRBC投与7日目のマウス脾臓細胞をCD4及びTFHのマーカーと言われているCXCR5及びICOSで染色し、それぞれの細胞集団の細胞表面ガレクチン９発現をフローサイトメトリー法により調べた。(a～d)に示されたようにこれらのCD4　T細胞の細胞表面ガレクチン９発現レベルは様々である。特に高い発現を示したのはICOS-CXCR5+のCD4陽性細胞とICOS+CXCR5-のCD4陽性細胞である。これらの細胞がガレクチン９を分泌して抗体産生を制御している可能性が示された。
　これら細胞表面にガレクチン９を発現している細胞群は全身性エリテマトーデスを含む自己免疫疾患治療や診断に有用である可能性が示された。
　図２７では、ヒト安定化ガレクチン９投与による作用を模式的に例示してまとめた。図１に示したように、ヒト安定化ガレクチン９を皮下投与するとその薬理効果は持続する。しかし、図２に示したように投与後に血中に現れる濃度は非常に低く、少なくとも免疫制御において薬効を持たない可能性が高い。皮下投与した投与部位及びリンパ管・リンパ節の経由時にはより高い濃度で存在していると考えられ、その際に免疫細胞に作用を与えている可能性が考えられる。ところが、図２に示したように、投与したヒト安定化ガレクチン９は速やかに体内より排出されるため、高濃度のガレクチン９に作用を受けた免疫細胞が安定化ガレクチン９の排出後にそれに代わって免疫制御を行っている可能性が考えられる。本発明において、発明者らはガレクチン９を細胞表面に発現し、更にそれを分泌してTH17/Tregバランスを調整する新規細胞THGAL9を発見した。更にTHGAL9はヒト安定化ガレクチン９添加によって増加することも発見した。すなわち投与されたヒト安定化ガレクチン９は、その直接作用の他にTHGAL9を誘導し、その誘導されたTHGAL9が局所でガレクチン９を必要な用量分泌して各種の細胞に作用すると考えられる。これは安定化ガレクチン９の免疫制御活性が持続することを矛盾無く説明する。発明者らは細胞表面ガレクチン９は分泌の中間状態であると考え、細胞表面ガレクチン９発現を指標として、THGAL9以外のガレクチン９を分泌する（可能性がある）様々な細胞集団を発見した。それらの細胞はTHGAL9のようにガレクチン９を分泌することで免疫を調整していると考えられる。
〔ガレクチン９投与はLLC坦癌マウスの生存を延長し、その際にpDC様マクロファージが増加する〕
　図１９（c）に示したように、発明者らは古典的樹状細胞（cDC）、形質細胞用樹状細胞（pDC）、及びpDC様マクロファージが細胞表面にガレクチン９を発現していることをMeth　A　坦癌マウスモデルで得られた細胞を用いて示した。さらに、本実施例では、別の癌種での検討例を示す。すなわち、図２９に示す通り、ガレクチン９投与が坦癌マウスの生存を延長し、その際にpDC様マクロファージが増加した。
（a）C57BL/6（♀、７～１０週齢）にマウス肺癌由来腫瘍細胞株LLCを5x105細胞腹腔へ接種し（Day0）、当日よりヒト安定化ガレクチン９を30μg、3回／週で腹腔内投与（コントロールはPBS）した時の生存率変化を経時的に調べた結果を示す。横軸（Days　after　tumor　inoculation）はLLC接種後の日数を、縦軸（Percent　survival）は生存率をパーセントで表している。統計解析はログランク検定によって行った。　
（b）（a）の７日目の腹腔細胞をCD11c、PDCA-1、Ly-6C及びF4/80の抗体で染色し、フローサイトメトリー法で解析した結果を示す。ガレクチン９投与群ではpDCマーカーであるCD11cとPDCA-1を発現しており、且つマクロファージマーカーであるLy-6CまたはF4/80を発現している細胞、つまりpDC様マクロファージの割合が優位に上昇していた。pDC様マクロファージがガレクチン９による生存延長に関与していることが想像される。各グループ５匹のマウスを用いてMean±SEMで表している。***P<0.001。　
〔ガレクチン９は試験管内においてM-CSFによるCD11c陽性細胞の分化をTim-3非依存的に促進する〕
　図３０に示す通り、本実施例において、ガレクチン９は、試験管内においてM-CSFによるCD11c陽性細胞の分化をTim-3非依存的に促進した。
（a）マウスの大腿骨及び脛骨から骨髄細胞を洗い出し、10％のウシ胎児血清と抗生物質を含むRPMI-1640培地中で2時間培養して接着細胞（成熟マクロファージ）を除去した。残った骨髄細胞をGM-CSF(Peprotech、20ng/ml)またはM-CSF(R　&　D　systems、20ng/ml)を含む培地中で7日間培養し、今度は非接着細胞を洗浄して除き、接着細胞をフローサイトメトリーで解析した。接着細胞の＞95％はF4/80とCD11ｂ二重陽性であることから、成熟したマクロファージだと判定された。その細胞におけるCD11cの発現が、分化中に与えたヒト安定化ガレクチン９（30nM）によってどのように影響されるかを調べた結果を示す。ガレクチン９はGM-CSFで分化したマクロファージのCD11ｃ発現には影響を与えなかったが、M-CSFで分化させたマクロファージのCD11ｃ発現を上昇させた。
（b）（a）のM-CSFによる分化アッセイをガレクチン９の阻害剤であるラクトース（30mM）またはコントロールとしてスクロース（30mM）の存在下で行った結果と、Tim-3中和抗体（eBiosciences、RMT-3-23、10μg/ml）またはアイソタイプコントロール抗体（eBiosciences、10μg/ml）中で行った結果を示す。ラクトースはガレクチン９によるCD11ｃ発現上昇を阻害したが、Tim-3の中和抗体はCD11ｃ発現上昇に影響を与えなかった。Tim-3はガレクチン９のターゲットとして最もよく知られた分子であるが、本実験のガレクチン９によるCD11ｃ発現上昇においては関与が無いことが示唆された。
〔ガレクチン９とM-CSFで分化したCD11c陽性細胞はpDC様マクロファージの前駆体細胞である〕
　図３０で、ガレクチン９はM-CSFで分化するマクロファージのCD11ｃ発現を上昇させることより、マクロファージを樹状細胞へ分化させている可能性が示された。既報のようにガレクチン９はヒト末梢血単核球の古典的樹状細胞への分化を促進する（Dai,　S.Y.　et　al,　J　Immunol,　2005　175:2974-81)。そこで、本実施例では、得られた細胞の表現型を詳細に調べた。その結果を、図３１に示す。
（a）フローサイトメトリー法による解析ではガレクチン９によってB220、I-A/I-E発現が上昇し、一方でCD14発現が減少することが判った。一方マクロファージのマーカーとして汎用されるF4/80はガレクチン９の添加によらず高発現しており、マクロファージの表現系を維持している。
（b）転写因子mRNAをリアルタイムRT-PCRで解析したところ、樹状細胞の分化に必要とされるIRF4及びIRF8がガレクチン９によって上昇していた。またpDCの前駆細胞に発現しているとされるSpiBがガレクチン９によって上昇しており、成熟pDCの転写因子E2-2を抑制するとされるId2もガレクチン９添加によって上昇した。
（c）さらにTLR7、TLR8及びTLR9のmRNAもガレクチン９添加によって上昇した。
（d）M-CSFとガレクチン９存在下で７日間分化させたマクロファージに表示のTLRアゴニストを添加し、6時間培養した後でIFN-αとIFN-β　mRNA発現をリアルタイムRT-PCRで測定した結果を示す。用いたアゴニストはそれぞれLPS(100ng/ml、Sigma):TLR4アゴニスト、R848（5μg/ml、Imgenex）:TLR7/8アゴニスト、CpG(TypeA　CpG　ODN1585、10μg/ml、Invivogen):TLR9アゴニストである。成熟したpDCであればこれらTLRアゴニスト刺激によってタイプ１インターフェロンを高発現するはずであるが、高い上昇は見られなかった。
これらの結果、M-CSFとヒト安定化ガレクチン９によって分化したマクロファージはpDCに近い表現型を示すが成熟したpDCには達しておらず、よってpDC様マクロファージの前駆体と考えられる。ガレクチン９はマクロファージをpDC様マクロファージへと分化誘導することが示唆された。
〔ガレクチン９とM-CSFで分化したCD11c陽性細胞はLPS刺激によってpDC様マクロファージに成熟する〕
　図３２に示すように、ガレクチン９とM-CSFで分化したCD11c陽性細胞は、LPS刺激によってpDC様マクロファージに成熟した。
（a）これまでの結果よりガレクチン９はM-CSFで分化したマクロファージをpDC様マクロファージの前駆体と思われる表現系の細胞に分化させることが示された。その細胞にLPS刺激を与えることでpDC様マクロファージへと分化が進むかどうかを検討した。図３０の方法でM-CSFとガレクチン９により分化したマクロファージを100ng/mlのLPS（コントロールはPBS）中で24時間培養しCD11c、Ly-6C及びF4/80の発現をフローサイトメトリー法で解析した結果を示す。サンプル数はそれぞれ４で統計解析している。LPS刺激によってpDCの表現型であるCD11cとPDCA-1二重陽性細胞の割合が上昇し、一方でマクロファージの表現型であるLy-6C及びF4/80の発現も上昇した。これはLPS刺激によって前駆体から成熟度の高いpDC様マクロファージへと分化が進んだ結果と考えられる。
（b）図３０の方法でM-CSFとガレクチン９により分化したマクロファージを100ng/mlのLPS（コントロールはPBS）中で6時間または24時間培養し、表示のmRNA発現をリアルタイムRT-PCRで測定した結果を示す。mRNA発現量はβ2ミクログロブリンまたはグリセロアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼのmRNA発現で標準化し、縦軸に表した。サンプル数はそれぞれ４で統計解析している。**P<0.01、***P<0.001。pDCを特徴付けるタイプ1型インターフェロンの発現に必須な転写因子であるIRF7がLPS刺激によって顕著に上昇している。また成熟したpDCに高発現しているとされるE2-2はLPSを6時間処理することによって著明に上昇し、24時間後は逆に低下した。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。
（c）図３０の方法でM-CSFとガレクチン９で分化させたマクロファージを100ng/mlのLPSで24時間培養し（コントロールはPBS)、I-A/I-Eの発現をフローサイトメトリー法で解析した結果の一例を示す。グレーのヒストグラムはアイソタイプコントロール、破線のヒストグラムがPBSコントロール、実線のヒストグラムがLPS刺激。LPS処理群とコントロールPBS群（それぞれn=4）で、I-A/I-E陽性細胞の割合を棒グラフに表し、統計解析した結果を示す。I-A/I-Eの発現はLPS刺激によって上昇した。*P<0.05。
　これらの結果、ガレクチン９によってpDC様マクロファージの前駆体と考えられる細胞に分化したマクロファージはLPS刺激によってより成熟したpDC様マクロファージの表現型を示すことが確認された。
　図３２では、ガレクチン９によって分化したpDC様マクロファージ前駆体がLPS刺激によって成熟したpDC様マクロファージの表現型になることを示した。さらに、その成熟型pDC様マクロファージの機能を調べた。その結果を、図３３に示す。
（a）pDCはタイプ１型インターフェロンを高発現することが知られているので、In　vitroで成熟させたpDC様マクロファージがタイプ１型インターフェロンの代表であるIFN-αとIFN-βを分泌するか否かをELISAで検討した。図３２の方法でLPS刺激を24時間加えたpDC様マクロファージに横軸に表示したTLRアゴニスト（コントロールはPBS）を添加し、18時間培養した培養上清中のIFN-αとIFN-βの濃度をPBL　Interferon　Sourceより購入した特異的ELISAキットにより定量し、濃度を縦軸に示した。サンプル数はそれぞれ４で統計解析した。***P<0.001。用いたTRLアゴニスト濃度はLPS:　100　ng/ml、R848：5μg/ml、、CpG：10μg/mlである。この結果IFN-βの産生は確認され、その発現がR848(TLR7/8アゴニスト)によってコントロールより上昇することが示された。
（b）In　vitroで成熟させたpDC様マクロファージが抗癌作用を示すことを調べた結果を示す。癌細胞としてマウスリンパ腫YAC-1細胞　を用いた。この細胞を細胞膜を染色する色素DIOC18(3)（3,39-dioctadecyloxacarbocyanine　perchlorate、Sigma)で染色し、これに30倍の細胞数のナイーブNK細胞を共培養した場合、及びナイーブNK細胞に加えてその2倍細胞数のIn　vitroで分化させた成熟pDC様マクロファージを加えて共培養した場合でYac-1細胞の細胞死を調べた。ナイーブNK細胞はマウス脾臓細胞よりMACS　Anti-DX5　beads(Miltenyi　Biotech)を用いて精製した。共培養は５時間行い、その後ヨウ化プロピジウムで死細胞を染色し、DIOC18(3)　陽性細胞（全Yac-1細胞）の内何パーセントが細胞死しているかをフローサイトメトリー法によって解析した。コントロールとしてYac-1単独培養も行った（横軸（－）のサンプル）。各サンプル数は４で統計解析している。***P<0.001。この結果In　vitroで成熟させたpDC様マクロファージはNK細胞による抗癌活性を有為に上昇させた。　NK細胞による抗癌活性はそれが内包し放出する細胞障害性タンパク質であるGranzyme　BとPerforinの働きが大きい。そこでIn　vitroで成熟させたpDC様マクロファージとNK細胞を前述の比率で5時間共培養し、細胞をCytofix/Cytoperm溶液（BD　Biosciences）を用いて固定化・浸透化し、抗Granzyme　B抗体（Clone　16G6、eBiosciences）と抗Perforin抗体（Clone　eBioMAK-D、eBiosciences）で染色し、フローサイトメトリー法で解析した結果を示す。コントロールはNK細胞単独培養（図中横軸　-　と表示）。サンプル数はそれぞれ４で統計解析している。その結果In　vitroで成熟させたpDC様マクロファージはNK細胞のGranzyme　BおよびPerforin発現を上昇させることが判った。
これらの結果より、ガレクチン９はpDC様マクロファージへの分化を促進することがIn　vitroで確認され、その細胞をLPSで成熟させると、NK細胞の活性化を介した抗癌作用を促進することが示された。図２９に示したようにガレクチン９を投与すると坦癌マウスの生存を延長し、その際にはpDC様マクロファージが増加する。pDC様マクロファージは図３３に示したようなNK細胞の活性化等を介して生体の抗癌作用を高めていると考えられ、それが坦癌マウスの生存延長の一因だと考えられる。
〔参考例〕
　下記表２は、ヒト安定化ガレクチン９の血中動態（図１）の結果に基づき、モーメント解析法で各種薬物動態パラメーターを解析した結果を示す。下記表２中、「Model　Independent　Pharmacokinetic　Analysis」は、「独立した薬物動態解析モデル」を意味する。「Dose」は、ヒト安定化ガレクチン９の用量を意味する。「Cmax」は、最高血中濃度を意味する。「Tmax」は、最高血中濃度到達時間を意味する。「AUC」は、血中濃度曲線下面積を意味する。「t1/2」は、半減期を意味する。「MRT」は、平均滞留時間を意味する。「CLtot」は、全身クリアランスを意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　以上、説明したとおり、本発明の細胞（例えば、THGAL9細胞等）は、例えば、生体内でガレクチン９の分泌を介した免疫制御を行うことにより、自己免疫疾患、アレルギー疾患、腫瘍その他の疾患の治療又は前記疾患に由来する症状の軽減等に用いることができる。また、本発明の細胞は、例えば、細胞表面ガレクチン９がガレクチン９とIL-10を分泌するタイプ1制御性T細胞(Tr1細胞)を同定する優れたマーカーであることにより、当該マーカーを使用してTr1細胞を分離するなどに応用できる。
　さらに、本発明は、上記説明並びに前述の実施形態及び実施例の記載に限定されず、特許請求の範囲から逸脱しない限りにおいて、任意の改変及び変形が可能である。

Claims (62)

  1. 　ガレクチン９を含む細胞であって、
    　前記ガレクチン９を細胞表面に発現していることを特徴とする細胞。
  2. 　T細胞である請求項１に記載の細胞。
  3. 　CD4陽性T細胞である請求項２に記載の細胞。
  4. 　濾胞性BヘルパーT細胞（Follicular　B　helper　T　cells:TFH）である請求項３に記載の細胞。
  5. 　T細胞受容体（TCR）で刺激することにより、CD25の発現量が上昇し、さらに、ガレクチン９及びインターロイキン１０（ＩＬ－１０）の少なくとも一方を分泌する請求項３又は４に記載の細胞。
  6. 　Foxp3を発現していない請求項３から５のいずれか一項に記載の細胞。
  7. 　γδT細胞である請求項２に記載の細胞。
  8. 　ナチュラルキラー細胞（NK細胞）である請求項１に記載の細胞。
  9. 　B細胞である請求項１に記載の細胞。
  10. 　NKT細胞である請求項１に記載の細胞。
  11. 　古典的樹状細胞（cDC）である請求項１に記載の細胞。
  12. 　形質細胞様樹状細胞（pDC）である請求項１に記載の細胞。
  13. 　pDC様マクロファージ（pDC-Mφ）である請求項１に記載の細胞。
  14. 　動物にガレクチン９を投与することにより、前記動物における少なくとも一部の細胞の細胞表面にガレクチン９を発現させる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞の製造方法。
  15. 　動物の細胞を、ガレクチン９の存在下で培養することにより、前記動物の細胞の細胞表面にガレクチン９を発現させる、請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞の製造方法。
  16. 　前記動物の細胞が、細胞表面にガレクチン９を発現している細胞を含み、
    　前記動物の細胞を、ガレクチン９の存在下で培養することにより、細胞表面にガレクチン９を発現している細胞の割合を増加させる、請求項１５に記載の細胞の製造方法。
  17. 　前記動物が、哺乳類である請求項１４から１６のいずれか一項に記載の製造方法。
  18. 　前記哺乳類が、ヒトである請求項１７に記載の製造方法。
  19. 　請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞、その破砕物及び抽出物からなる群から選択される少なくとも一つを含む医薬。
  20. 　ガレクチン９の生理活性又は生物活性の不足又は欠如に起因する疾患の治療又は症状の軽減に用いる請求項１９に記載の医薬。
  21. 　ガレクチン９又はガレクチン９結合性物質を含む細胞の有無の診断に用いる診断剤である、請求項１９に記載の医薬。
  22. 　免疫調節剤である、請求項１９に記載の医薬。
  23. 　抗腫瘍剤である、請求項１９に記載の医薬。
  24. 　前記腫瘍が、悪性腫瘍である請求項２３に記載の医薬。
  25. 　前記悪性腫瘍が、上皮性悪性腫瘍である請求項２４に記載の医薬。
  26. 　前記悪性腫瘍が、非上皮性悪性腫瘍である請求項２４に記載の医薬。
  27. 　前記非上皮性悪性腫瘍が、腫瘍形成性の非上皮性悪性腫瘍及び腫瘍非形成性の非上皮性悪性腫瘍の少なくとも一方である請求項２６に記載の医薬。
  28. 　前記悪性腫瘍が、皮膚ガン、メラノーマ、乳ガン、卵巣ガン、子宮ガン、睾丸悪性腫瘍、前立腺ガン、膀胱ガン、腎ガン、甲状腺ガン、咽頭・喉頭ガン、舌ガン、上顎ガン、食道ガン、胃ガン、結腸・直腸ガン、肺・気管支ガン、肝ガン、肝細胞癌、肝内胆管ガン、肝外胆管・胆嚢ガン、膵臓ガン、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、悪性血管腫、悪性血管内皮腫、脳腫瘍、メニンギオーマ、グリオーマ、及びアストロサイトーマからなる群から選択される少なくとも一つである請求項２４に記載の医薬。
  29. 　抗アレルギー剤である。請求項１９に記載の医薬。
  30. 　自己免疫疾患用剤である。請求項１９に記載の医薬。
  31. 　抗炎症剤である、請求項１９に記載の医薬。
  32. 　副腎皮質ステロイドホルモン代替用剤である、請求項１９に記載の医薬。
  33. 　細胞、組織、又は器官の移植に伴う拒絶反応の抑制剤である、請求項１９に記載の医薬。
  34. 　敗血症の治療又は症状の軽減に用いる、請求項１９に記載の医薬。
  35. 　感染症の治療又は症状の軽減に用いる、請求項１９に記載の医薬。
  36. 　請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞、その破砕物及び抽出物からなる群から選択される少なくとも一つを用いて、被検細胞におけるガレクチン９又はガレクチン９結合性物質の有無を診断する方法。
  37. 　請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞、その破砕物及び抽出物からなる群から選択される少なくとも一つを動物に投与する工程を含む、前記動物の疾患の治療又は前記疾患に由来する症状の軽減方法。
  38. 　前記動物が、哺乳類である請求項３７に記載の方法。
  39. 　前記哺乳類が、ヒトである請求項３８に記載の方法。
  40. 　前記疾患が、ガレクチン９の生理活性又は生物活性の不足又は欠如に起因する疾患である請求項３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 　前記疾患が、免疫の異常に起因する疾患である、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
  42. 　前記疾患が、自己免疫性疾患である、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
  43. 　前記疾患が、腫瘍である、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
  44. 　前記腫瘍が、悪性腫瘍である請求項４３に記載の方法。
  45. 　前記悪性腫瘍が、上皮性悪性腫瘍である請求項４４に記載の方法。
  46. 　前記悪性腫瘍が、非上皮性悪性腫瘍である請求項４４に記載の方法。
  47. 　前記非上皮性悪性腫瘍が、腫瘍形成性の非上皮性悪性腫瘍及び腫瘍非形成性の非上皮性悪性腫瘍の少なくとも一方である請求項４６に記載の方法。
  48. 　前記悪性腫瘍が、皮膚ガン、メラノーマ、乳ガン、卵巣ガン、子宮ガン、睾丸悪性腫瘍、前立腺ガン、膀胱ガン、腎ガン、甲状腺ガン、咽頭・喉頭ガン、舌ガン、上顎ガン、食道ガン、胃ガン、結腸・直腸ガン、肺・気管支ガン、肝ガン、肝細胞癌、肝内胆管ガン、肝外胆管・胆嚢ガン、膵臓ガン、白血病、悪性リンパ腫、形質細胞腫、肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、悪性血管腫、悪性血管内皮腫、脳腫瘍、メニンギオーマ、グリオーマ、及びアストロサイトーマからなる群から選択される少なくとも一つである請求項４４に記載の方法。
  49. 　前記疾患が、アレルギー性疾患である。請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
  50. 　前記疾患が、細胞、組織、又は器官の移植に伴う拒絶反応である、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
  51. 　前記疾患が、敗血症である、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 　前記疾患が、感染症である、請求項３７から４０のいずれか一項に記載の方法。
  53. 　前記疾患に由来する症状が、炎症である、請求項３７から５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 　請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞を動物に投与して、前記動物の免疫を制御する免疫制御方法。
  55. 　請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞の細胞表面に発現されたガレクチン９をマーカーとして検出することにより、前記細胞を検出する方法。
  56. 　請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞が、IL-10産生タイプ1制御性T細胞（Tr1細胞）である請求項５５に記載の細胞検出方法。
  57. 　請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞が、制御性免疫細胞である請求項５５に記載の細胞検出方法。
  58. 　請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞を含むか又は含まない動物組織において、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の細胞検出方法により、請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞を定性的又は定量的に検出する工程を含む、前記動物の疾患又は前記疾患に由来する症状の診断方法。
  59. 　動物の疾患の治療効果の判定方法であって、
    　前記動物に対し、前記疾患の治療を行う工程と、
    　前記治療の前後において、それぞれ、請求項５８に記載の診断方法により、前記疾患又は前記疾患に由来する症状を診断する工程と、
    　前記治療の前後における前記診断結果を対比する工程とを含むことを特徴とする、前記動物の疾患の治療効果の判定方法。
  60. 　請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞を含む動物組織において、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の細胞検出方法により、前記細胞を検出し、検出された前記細胞を、前記動物組織中の他の細胞から分離する、細胞の分離方法。
  61. 　請求項６０に記載の細胞の分離方法により請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞を前記動物組織から分離する工程を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞の製造方法。
  62. 　請求項６０に記載の細胞の分離方法により請求項１から１３のいずれか一項に記載の細胞を前記動物組織から分離する工程をさらに含む、請求項１４から１６のいずれか一項に記載の製造方法。
PCT/JP2011/078623 2010-12-09 2011-12-09 ガレクチン９を分泌する細胞、その製造方法及びその用途 WO2012077811A1 (ja)

Priority Applications (8)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/992,018 US20130323176A1 (en) 2010-12-09 2011-12-09 Galectin-9-secreting cell, and production method and use of the same
JP2012547938A JPWO2012077811A1 (ja) 2010-12-09 2011-12-09 ガレクチン９を分泌する細胞、その製造方法及びその用途
EP11847227.3A EP2650361A4 (en) 2010-12-09 2011-12-09 GALECTIN-9 DETERGENT CELL, MANUFACTURING METHOD AND APPLICATION THEREOF
KR1020137017492A KR20130103587A (ko) 2010-12-09 2011-12-09 갈렉틴 9를 분비하는 세포, 그 제조 방법 및 그 용도
CN2011800597695A CN103314102A (zh) 2010-12-09 2011-12-09 分泌半乳糖凝集素9的细胞、其制造方法及其用途
CA2820642A CA2820642A1 (en) 2010-12-09 2011-12-09 Galectin-9-secreting cell, and production method and use of the same
US14/499,736 US9528089B2 (en) 2010-12-09 2014-09-29 Method for increasing the proportion of animal cells secreting galectin-9
US15/217,251 US20170010282A1 (en) 2010-12-09 2016-07-22 Galectin-9-secreting cell, and production method and use of the same

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2010-274467 2010-12-09
JP2010274467 2010-12-09

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/992,018 A-371-Of-International US20130323176A1 (en) 2010-12-09 2011-12-09 Galectin-9-secreting cell, and production method and use of the same
US14/499,736 Division US9528089B2 (en) 2010-12-09 2014-09-29 Method for increasing the proportion of animal cells secreting galectin-9

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012077811A1 true WO2012077811A1 (ja) 2012-06-14

Family

ID=46207293

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2011/078623 WO2012077811A1 (ja) 2010-12-09 2011-12-09 ガレクチン９を分泌する細胞、その製造方法及びその用途

Country Status (7)

Country Link
US (3) US20130323176A1 (ja)
EP (1) EP2650361A4 (ja)
JP (1) JPWO2012077811A1 (ja)
KR (1) KR20130103587A (ja)
CN (1) CN103314102A (ja)
CA (1) CA2820642A1 (ja)
WO (1) WO2012077811A1 (ja)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5420791B1 (ja) * 2013-08-23 2014-02-19 肇 福永 サルモネラ菌及びシート状ｍ細胞
WO2014064951A1 (ja) * 2012-10-25 2014-05-01 Fukunaga Hajime Ｍ細胞及び人工皮膚シート
US10426805B2 (en) 2017-12-07 2019-10-01 Hajime Fukunaga Method for producing lactic acid bacteria controlling M cells
EP4059511A4 (en) * 2019-11-11 2024-01-24 Gbiologics Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITION, COMPRISING A RECOMBINANT STABILIZED GALECTIN 9 PROTEIN, FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF RHEUMATOID ARTHRITIS AND BONE DISEASE

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013192215A1 (en) * 2012-06-18 2013-12-27 Yale University Compositions and methods for diminishing an immune response
FR3021970B1 (fr) * 2014-06-06 2018-01-26 Universite Sciences Technologies Lille Anticorps dirige contre la galectine 9 et inhibiteur de l'activite suppressive des lymphocytes t regulateurs
WO2016008005A1 (en) * 2014-07-14 2016-01-21 The Council Of The Queensland Institute Of Medical Research Galectin immunotherapy
US20180153901A1 (en) * 2015-03-18 2018-06-07 Blood Systems, Inc. Reversal of latency of retroviruses with a galectin protein
US20170199176A1 (en) * 2016-01-11 2017-07-13 Nodality, Inc. T cell populations in diagnosis, prognosis, prediction, and monitoring
AU2018355588C1 (en) 2017-10-27 2023-04-27 New York University Anti-Galectin-9 antibodies and uses thereof
US20220185896A1 (en) * 2019-05-01 2022-06-16 New York University Anti-galectin-9 antibodies and uses thereof
MX2022008421A (es) * 2020-01-07 2022-09-23 Hifibio Hk Ltd Anticuerpo anti-galectina-9 y usos del mismo.
CN114681438B (zh) * 2022-05-17 2024-03-19 中国医学科学院基础医学研究所 二甲双胍及其它含胍化合物在逆转Gal-10结晶趋势并缓解相关疾病中应用
CN116570707A (zh) * 2023-06-25 2023-08-11 西南医科大学 半乳糖凝集素1在预防和治疗脓毒血症药物中的应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002037114A1 (fr) 2000-11-01 2002-05-10 Galpharma Co., Ltd. Agent permettant de detecter l'aptitude d'une tumeur cancereuse a se metastaser
WO2005009306A2 (en) 2003-07-29 2005-02-03 Ljubomir Georgijevic Panties with an inflatable segment
JP2006124299A (ja) * 2004-10-27 2006-05-18 Galpharma Co Ltd ガレクチン９誘導因子
JP2007209328A (ja) * 2006-01-13 2007-08-23 Galpharma Co Ltd ガレクチン−９利用遺伝子治療剤

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003189874A (ja) * 2001-12-28 2003-07-08 Galpharma Co Ltd ガレクチン−９活性制御剤
KR20050103474A (ko) 2003-01-24 2005-10-31 가르파마 컴퍼니 리미티드 갈렉틴 9 함유 의약
JP2004244411A (ja) * 2003-01-24 2004-09-02 Galpharma Co Ltd ガレクチン９含有医薬
EP1619203A1 (en) * 2003-04-28 2006-01-25 Galpharma Co., Ltd. Galectin 9-inducing factor
JP4792390B2 (ja) 2004-03-29 2011-10-12 株式会社ガルファーマ 新規ガレクチン９改変体タンパク質及びその用途
EP1767634A4 (en) 2004-06-14 2008-10-22 Galpharma Co Ltd NEW GALECTIN 8 MODIFICATION PROTEIN AND USE THEREOF
WO2007018229A1 (ja) * 2005-08-11 2007-02-15 Galpharma Co., Ltd. 成人ｔ細胞白血病治療
JP2007131540A (ja) * 2005-11-08 2007-05-31 Galpharma Co Ltd Ｃｄ４４機能抑制因子による抗アレルギー薬、免疫抑制薬および抗腫瘍薬
JP2007137774A (ja) * 2005-11-14 2007-06-07 Galpharma Co Ltd 抗炎症剤及びエンドトキシンショック抑制剤

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002037114A1 (fr) 2000-11-01 2002-05-10 Galpharma Co., Ltd. Agent permettant de detecter l'aptitude d'une tumeur cancereuse a se metastaser
WO2005009306A2 (en) 2003-07-29 2005-02-03 Ljubomir Georgijevic Panties with an inflatable segment
JP2006124299A (ja) * 2004-10-27 2006-05-18 Galpharma Co Ltd ガレクチン９誘導因子
JP2007209328A (ja) * 2006-01-13 2007-08-23 Galpharma Co Ltd ガレクチン−９利用遺伝子治療剤

Non-Patent Citations (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Hyoujun Byourigaku, 2nd Edition", 15 March 2002, IGAKU-SHOIN LTD.
AKIRA YAMAUCHI ET AL.: "Galectin-9 Induces Maturation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells", JAPANESE JOURNAL OF CLINICAL IMMUNOLOGY, vol. 28, no. 6, 2005, pages 381 - 388, XP055069281 *
ANDERSON, A.C. ET AL.: "Promotion of tissue inflammation by the immune receptor Tim-3 expressed on innate immune cells", SCIENCE, vol. 318, 2007, pages 1141 - 1143, XP002490579, DOI: doi:10.1126/science.1148536
ARIKAWA, T. ET AL.: "Galectin-9 expands immunosuppressive macrophages to ameliorate T-cell-mediated lung inflammation", EUR J IMMUNOL, vol. 40, 2010, pages 548 - 558
AWASTHI, A. ET AL.: "A dominant function for interleukin 27 in generating interleukin 10-producing anti-inflammatory T cells", NAT IMMUNOL, vol. 8, 2007, pages 1380 - 1389
BARRAT, F.J. ET AL.: "In vitro generation of interleukin 10-producing regulatory CD4(+) T cells is induced by immunosuppressive drugs and inhibited by T helper type 1 (Thl)- and Th2-inducing cytokines", J EXP MED, vol. 195, 2002, pages 603 - 616, XP002275080, DOI: doi:10.1084/jem.20011629
BRUN, V.; BASTIAN, H.; NEVEU, V.; FOUSSAT, A: "Clinical grade production of IL-10 producing regulatory Tri lymphocytes for cell therapy of chronic inflammatory diseases", INT IMMUNOPHARMACOL, vol. 9, 2009, pages 609 - 613, XP026067811, DOI: doi:10.1016/j.intimp.2009.01.032
CHABOT, S. ET AL.: "Regulation of galectin-9 expression and release in Jurkat T cell line cells", GLYCOBIOLOGY, vol. 12, 2002, pages 111 - 118, XP003008706, DOI: doi:10.1093/glycob/12.2.111
CHEN, Y. ET AL.: "Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis", J CLIN INVEST, vol. 116, 2006, pages 1317 - 1326
DAI, S.Y. ET AL., J IMMUNOL, vol. 175, 2005, pages 2974 - 81
DARDALHON, V. ET AL.: "Tim-3/galectin-9 pathway: regulation of Thl immunity through promotion of CDllb+Ly-6G+ myeloid cells", J IMMUNOL, vol. 185, 2010, pages 1383 - 1392
FITZGERALD, D.C. ET AL.: "Suppression of autoimmune inflammation of the central nervous system by interleukin 10 secreted by interleukin 27-stimulated T cells", NAT IMMUNOL, vol. 8, 2007, pages 1372 - 1379
FUJIO, K.; OKAMURA, T.; YAMAMOTO, K.: "The Family of IL-10-secreting CD4+ T cells", ADV IMMUNOL, vol. 105, 2010, pages 99 - 130
HIRABAYASHI, J. ET AL.: "Oligosaccharide specificity of galectins: a search by frontal affinity chromatography", BIOCHIM BIOPHYS ACTA, vol. 1572, 2002, pages 232 - 254, XP004380519, DOI: doi:10.1016/S0304-4165(02)00311-2
JANGPATARAPONGSA, K. ET AL.: "Plasmodium vivax parasites alter the balance of myeloid and plasmacytoid dendritic cells and the induction of regulatory T cells", EUR J IMMUNOL, vol. 38, 2008, pages 2697 - 2705
JAYARAMAN, P: "Tim3 binding to galectin-9 stimulates antimicrobial immunity", J EXP MED, vol. 207, 2010, pages 2343 - 2354
KATOH, S. ET AL.: "Galectin-9 inhibits CD44-hyaluronan interaction and suppresses a murine model of allergic asthma", AM J RESPIR CRIT CARE MED, vol. 176, 2007, pages 27 - 35, XP002615392, DOI: doi:10.1164/RCCM.200608-1243OC
KAVOUSANAKI, M.; MAKRIGIANNAKIS, A.; BOUMPAS, D.; VERGINIS, P: "Novel role of plasmacytoid dendritic cells in humans: induction of interleukin-10-producing Treg cells by plasmacytoid dendritic cells in patients with rheumatoid arthritis responding to therapy", ARTHRITIS RHEUM, vol. 62, 2010, pages 53 - 63
KOJIMA, K. ET AL.: "Galectin-9 attenuates acute lung injury by expanding CD14- plasmacytoid dendritic cell-like macrophages", AM J RESPIR CRIT CARE MED, vol. 184, 2011, pages 328 - 339
LAURENCE, A. ET AL.: "Interleukin-2 signaling via STAT5 constrains T helper 17 cell generation", IMMUNITY, vol. 26, 2007, pages 371 - 381
LEVINGS M.K ET AL.: "Differentiation of Tr1 cells by immature dendritic cells requires IL- 10 but not CD25+CD4+ Tr cells.", BLOOD, vol. 105, no. 3, 2005, pages 1162 - 1169, XP055029314 *
LEVINGS, M.K. ET AL.: "Differentiation of Trl cells by immature dendritic cells requires IL-10 but not CD25+CD4+ Tr cells", BLOOD, vol. 105, 2005, pages 1162 - 1169, XP055029314, DOI: doi:10.1182/blood-2004-03-1211
LU, L.H. ET AL.: "Characterization of galectin-9-induced death of Jurkat T cells", J BIOCHEM, vol. 141, 2007, pages 157 - 172
MATSUMOTO, R. ET AL.: "Human ecalectin, a variant of human galectin-9, is a novel eosinophil chemoattractant produced by T lymphocytes", J BIOL CHEM, vol. 273, 1998, pages 16976 - 16984, XP002944823, DOI: doi:10.1074/jbc.273.27.16976
MAYNARD, C.L. ET AL.: "Regulatory T cells expressing interleukin 10 develop from Foxp3+ and Foxp3- precursor cells in the absence of interleukin 10", NAT IMMUNOL, vol. 8, 2007, pages 931 - 941, XP002533938, DOI: doi:10.1038/NI1504
MILLS, K.H.: "Induction, function and regulation of IL-17-producing T cells", EUR J IMMUNOL, vol. 38, 2008, pages 2636 - 2649
MISHRA, R. ET AL.: "Galectin-9 trafficking regulates apical-basal polarity in Madin-Darby canine kidney epithelial cells", PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 107, 2010, pages 17633 - 17638
NAGAHARA, K. ET AL.: "Galectin-9 increases Tim-3+ dendritic cells and CD8+ T cells and enhances antitumor immunity via galectin-9-Tim-3 interactions", J IMMUNOL, vol. 181, 2008, pages 7660 - 7669
NAKAE, S.; IWAKURA, Y.; SUTO, H.; GALLI, S.J.: "Phenotypic differences between Th1 and Th17 cells and negative regulation of Thl cell differentiation by IL-17", J LEUKOC BIOL, vol. 81, 2007, pages 1258 - 1268
NIKI, T. ET AL.: "Galectin-9 is a high affinity IgE-binding lectin with anti-allergic effect by blocking IgE-antigen complex formation", J BIOL CHEM, vol. 284, 2009, pages 32344 - 32352, XP055184510, DOI: doi:10.1074/jbc.M109.035196
NISHI, N. ET AL.: "Development of highly stabilized galectins: truncation of the linker peptide confers protease-resistance on tandem-repeat type galectins", FEBS LETT, vol. 579, 2005, pages 2058 - 2064
NOBUMOTO, A. ET AL.: "Galectin-9 expands unique macrophages exhibiting plasmacytoid dendritic cell-like phenotypes that activate NK cells in tumor-bearing mice", CLIN IMMUNOL, vol. 130, 2009, pages 322 - 330, XP025915069, DOI: doi:10.1016/j.clim.2008.09.014
NOBUMOTO, A. ET AL.: "Galectin-9 suppresses tumor metastasis by blocking adhesion to endothelium and extracellular matrices", GLYCOBIOLOGY, vol. 18, 2008, pages 735 - 744
OCHI, H. ET AL.: "Oral CD3-specific antibody suppresses autoimmune encephalomyelitis by inducing CD4+ CD25-LAP+ T cells", NAT MED, vol. 12, 2006, pages 627 - 635, XP002489889, DOI: doi:10.1038/nm1408
OKAMURA, T. ET AL.: "CD4+CD25-LAG3+ regulatory T cells controlled by the transcription factor Egr-2", PROC NATL ACAD SCI U S A, vol. 106, 2009, pages 13974 - 13979, XP055182027, DOI: doi:10.1073/pnas.0906872106
OOMIZU, S. ET AL.: "Oral administration of pulverized Konjac glucomannan prevents the increase of plasma immunoglobulin E and immunoglobulin G levels induced by the injection of syngeneic keratinocyte extracts in BALB/c mice", CLIN. EXP. ALLERGY, vol. 36, 2006, pages 102 - 110
PARK, H. ET AL.: "A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17", NAT IMMUNOL, vol. 6, 2005, pages 1133 - 1141, XP002472833, DOI: doi:10.1038/ni1261
RONCAROLO, M.G.; GREGORI, S: "Is FOXP3 a bona fide marker for human regulatory T cells", EUR J IMMUNOL, vol. 38, 2008, pages 925 - 927
See also references of EP2650361A4
SEKI, M. ET AL.: "Beneficial effect of galectin-9 on rheumatoid arthritis by induction of apoptosis of synovial fibroblasts", ARTHRITIS RHEUM, vol. 56, 2007, pages 3968 - 3976, XP009140525, DOI: doi:10.1002/art.23076
SEKI, M. ET AL.: "Galectin-9 suppresses the generation of Thl7, promotes the induction of regulatory T cells, and regulates experimental autoimmune arthritis", CLIN IMMUNOL, vol. 127, 2008, pages 78 - 88, XP022535315, DOI: doi:10.1016/j.clim.2008.01.006
STUMHOFER, J.S. ET AL.: "Interleukins 27 and 6 induce STAT3-mediated T cell production of interleukin 10", NAT IMMUNOL, vol. 8, 2007, pages 1363 - 1371
TANIKAWA, R. ET AL.: "Galectin-9 induces osteoblast differentiation through the CD44/Smad signaling pathway", BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN, vol. 394, 2010, pages 317 - 322, XP026988983, DOI: doi:10.1016/j.bbrc.2010.02.175
TSUBOI, Y. ET AL.: "Galectin-9 protects mice from the Shwartzman reaction by attracting prostaglandin E2-producing polymorphonuclear leukocytes", CLIN IMMUNOL, vol. 124, 2007, pages 221 - 233, XP022156798, DOI: doi:10.1016/j.clim.2007.04.015
UHLIG, H.H. ET AL.: "Characterization of Foxp3+CD4+CD25+ and IL-10-secreting CD4+CD25+ T cells during cure of colitis", J IMMUNOL, vol. 177, 2006, pages 5852 - 5860
WADA, J.; OTA, K.; KUMAR, A.; WALLNER, E. I.; KANWAR, Y. S: "Developmental regulation, expression, and apoptotic potential of galectin-9, a (3-galactoside binding lectin", J CLIN INVEST, vol. 99, 1997, pages 2452 - 2461
WAKKACH, A. ET AL.: "Characterization of dendritic cells that induce tolerance and T regulatory 1 cell differentiation in vivo", IMMUNITY, vol. 18, 2003, pages 605 - 617, XP002265204, DOI: doi:10.1016/S1074-7613(03)00113-4
WILSON, N.J. ET AL.: "Development, cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T cells", NAT IMMUNOL, vol. 8, 2007, pages 950 - 957, XP002472837, DOI: doi:10.1038/ni1497
ZHU, C. ET AL.: "The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T helper type 1 immunity", NAT IMMUNOL, vol. 6, 2005, pages 1245 - 1252, XP002490576, DOI: doi:10.1038/ni1271

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014064951A1 (ja) * 2012-10-25 2014-05-01 Fukunaga Hajime Ｍ細胞及び人工皮膚シート
US9265863B2 (en) 2012-10-25 2016-02-23 Hajime Fukunaga M cells and artificial skin sheet
JP5420791B1 (ja) * 2013-08-23 2014-02-19 肇 福永 サルモネラ菌及びシート状ｍ細胞
WO2015025638A1 (ja) * 2013-08-23 2015-02-26 ケイ・アンド・アイ有限会社 サルモネラ菌及びシート状ｍ細胞
US10426805B2 (en) 2017-12-07 2019-10-01 Hajime Fukunaga Method for producing lactic acid bacteria controlling M cells
EP4059511A4 (en) * 2019-11-11 2024-01-24 Gbiologics Inc. PHARMACEUTICAL COMPOSITION, COMPRISING A RECOMBINANT STABILIZED GALECTIN 9 PROTEIN, FOR THE PREVENTION OR TREATMENT OF RHEUMATOID ARTHRITIS AND BONE DISEASE

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2012077811A1 (ja) 2014-05-22
US20130323176A1 (en) 2013-12-05
EP2650361A1 (en) 2013-10-16
CA2820642A1 (en) 2012-06-14
US20170010282A1 (en) 2017-01-12
KR20130103587A (ko) 2013-09-23
US20150093366A1 (en) 2015-04-02
EP2650361A4 (en) 2015-09-30
US9528089B2 (en) 2016-12-27
CN103314102A (zh) 2013-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2012077811A1 (ja) ガレクチン９を分泌する細胞、その製造方法及びその用途
Heymann et al. Hepatic macrophage migration and differentiation critical for liver fibrosis is mediated by the chemokine receptor C‐C motif chemokine receptor 8 in mice
Zhou The new face of anaphylatoxins in immune regulation
ES2710444T3 (es) Un polipéptido de interleucina 34 aislado para uso en la prevención del rechazo de trasplante y el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias
AU2015265916B2 (en) Pharmaceutical combinations for immunotherapy
WO2013192215A1 (en) Compositions and methods for diminishing an immune response
Aravindhan et al. Cell type-specific immunomodulation induced by helminthes: effect on metainflammation, insulin resistance and type-2 diabetes
Talker et al. Monocyte biology conserved across species: Functional insights from cattle
Laird et al. γδ T cells acquire effector fates in the thymus and differentiate into cytokine-producing effectors in a Listeria model of infection independently of CD28 costimulation
JP2023021131A (ja) 免疫を調節するペプチド、ポリペプチド又は細胞を作製する方法
Todosenko et al. The pathogenic subpopulation of Th17 cells in obesity
JP5717116B2 (ja) 抗原特異的ヒトＴｈ１７細胞を調整する方法
Noakes et al. Innate and adaptive immunity
Talker et al. Transcriptomic signature and metabolic programming of bovine classical and nonclassical monocytes indicate distinct functional specializations
Da Silva et al. Different roles of helper T lymphocytes during dendritic cells vaccine in experimental breast cancer
Chimen Immunomodulation by adipokines in type 1 diabetes
US20230338423A1 (en) Targetable immune checkpoint for immunotherapy
Ihantola T-cell dysfunction and autoantigen recognition in type 1 diabetes
Hay Investigation into the regulation of CD46 function in T cells
JP2009011208A (ja) メチル−β−シクロデキストリンからなるインバリアントナチュラルキラーＴ細胞除去剤
Xiong KLF2: A Kruppel like Family Transcription Factor in Myeloid Cells Negatively Regulates Th2 Response
EP3986451A1 (en) Bacteria-engineered to elicit antigen-specific t-cells
HONG et al. 4 Developmental
Slauenwhite The Functional Characterization of Invariant Natural Killer T Cells and the Chemokine Receptor CXCR6 in a Mouse Model of Inflammatory Arthritis
Quimby et al. Overview of immunology in the mouse: molecular and cellular immunology

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 11847227

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

DPE1 Request for preliminary examination filed after expiration of 19th month from priority date (pct application filed from 20040101)
ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2820642

Country of ref document: CA

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2012547938

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2011847227

Country of ref document: EP

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 20137017492

Country of ref document: KR

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13992018

Country of ref document: US