JP2009011208A - メチル−β−シクロデキストリンからなるインバリアントナチュラルキラーＴ細胞除去剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】リンパ球からインバリアントナチュラルキラーＴ細胞を選択的に除去する。
【解決手段】メチル−β−シクロデキストリンをリンパ球に加えてインバリアントナチュラルキラーＴ細胞を選択的に除去する。
【選択図】図１
【解決手段】メチル−β−シクロデキストリンをリンパ球に加えてインバリアントナチュラルキラーＴ細胞を選択的に除去する。
【選択図】図１
Description
本発明は、メチル−β−シクロデキストリン（MCD）からなるインバリアントナチュラルキラーＴ（iNKT）細胞除去剤およびMCDを用いてリンパ球からiNKT 細胞を選択的に除去する方法に関するものである。
免疫系を構成するリンパ球には、通常のT 細胞、B 細胞、およびナチュラルキラー（NK)細胞の三種類の細胞系列に加え、第四のリンパ球である NKT 細胞（これまで、NK細胞にのみ発現されていると考えられていたNKR-P1分子を発現するT細胞）が存在する。
1986年にNKT 細胞の特徴的抗原受容体遺伝子がクローニングされ、新しい遺伝子としてVα14遺伝子と名付けられた。本細胞の抗原受容体遺伝子は通常のT細胞の抗原受容体遺伝子とは明らかに異なる、実に奇妙な構造的特徴を示していた。すなわち、Vα14遺伝子を含む抗原受容体を構成するVJ遺伝子断片は、T 細胞受容体遺伝子クラスター中に存在しているにもかかわらず、NKT 細胞だけが使用し、通常のT 細胞は使用していないこと、並びにVα14遺伝子産物のアミノ酸配列は常に均一であったことである。
NKT 細胞に関しては以下のような知見がある。
(1)NKT 細胞は肝臓や骨髄などの胸腺以外の組織にきわめて高頻度に存在する。
(2)均一なVα14遺伝子産物はほとんどNKT 細胞が使用する唯一の受容体で、通常のT細胞には発現されていない。
(3)すべての純系マウスには例外なく、Vα14遺伝子産物を発現するNKT 細胞が存在することなどから、きわめて普遍的に存在する細胞であると考えられる。
(4)NKT 細胞が認識する抗原はリソソームに存在するisoglobotrihexosylceramide (iGb3) (最近、iGb3がiNKT細胞のリガンドであることを否定する論文が発行されたことから、本分子がiNKT細胞のリガンドであるか否かについては現在のところ不明)、Sphingomonas・Ehrlichia の細胞壁に存在するスフィンゴ糖脂質、Borrelia に存在するdiacylglycerol、 並びにMycobacterium由来のphosphatidylinositol mannoside などが挙げられるが、その代表的なものに、最初に発見された海綿由来のアルファガラクトシルセラミド（αGalCer) というスフィンゴ糖脂質がある。
NKT 細胞は幾つかの亜集団から構成されているが、その殆どはT細胞受容体として均一なVα14を発現することから、インバリアントNKT（iNKT）細胞と呼ばれている。
近年、iNKT 細胞が生体内において極めて重要な役割を演じていることが明らかとなってきた。研究の進展に伴い、iNKT 細胞と各種病態との関係並びに本細胞の生体防御における役割がある程度明らかになってきたことから、本細胞の役割を更に詳細に検討することは、各種疾患の予防、診断、更には早期治療を考える上において重要である。
iNKT 細胞が関与する病態はこれまでの予想よりもはるかに多く、自己免疫疾患発症制御、アレルギー反応調節、抗腫瘍作用、感染制御、流産などに関しては、iNKT 細胞の関与が確定的になっている。このことは、上述した病態、疾病の発症機序を再考する必要があることを意味している。
1986年にNKT 細胞の特徴的抗原受容体遺伝子がクローニングされ、新しい遺伝子としてVα14遺伝子と名付けられた。本細胞の抗原受容体遺伝子は通常のT細胞の抗原受容体遺伝子とは明らかに異なる、実に奇妙な構造的特徴を示していた。すなわち、Vα14遺伝子を含む抗原受容体を構成するVJ遺伝子断片は、T 細胞受容体遺伝子クラスター中に存在しているにもかかわらず、NKT 細胞だけが使用し、通常のT 細胞は使用していないこと、並びにVα14遺伝子産物のアミノ酸配列は常に均一であったことである。
NKT 細胞に関しては以下のような知見がある。
(1)NKT 細胞は肝臓や骨髄などの胸腺以外の組織にきわめて高頻度に存在する。
(2)均一なVα14遺伝子産物はほとんどNKT 細胞が使用する唯一の受容体で、通常のT細胞には発現されていない。
(3)すべての純系マウスには例外なく、Vα14遺伝子産物を発現するNKT 細胞が存在することなどから、きわめて普遍的に存在する細胞であると考えられる。
(4)NKT 細胞が認識する抗原はリソソームに存在するisoglobotrihexosylceramide (iGb3) (最近、iGb3がiNKT細胞のリガンドであることを否定する論文が発行されたことから、本分子がiNKT細胞のリガンドであるか否かについては現在のところ不明)、Sphingomonas・Ehrlichia の細胞壁に存在するスフィンゴ糖脂質、Borrelia に存在するdiacylglycerol、 並びにMycobacterium由来のphosphatidylinositol mannoside などが挙げられるが、その代表的なものに、最初に発見された海綿由来のアルファガラクトシルセラミド（αGalCer) というスフィンゴ糖脂質がある。
NKT 細胞は幾つかの亜集団から構成されているが、その殆どはT細胞受容体として均一なVα14を発現することから、インバリアントNKT（iNKT）細胞と呼ばれている。
近年、iNKT 細胞が生体内において極めて重要な役割を演じていることが明らかとなってきた。研究の進展に伴い、iNKT 細胞と各種病態との関係並びに本細胞の生体防御における役割がある程度明らかになってきたことから、本細胞の役割を更に詳細に検討することは、各種疾患の予防、診断、更には早期治療を考える上において重要である。
iNKT 細胞が関与する病態はこれまでの予想よりもはるかに多く、自己免疫疾患発症制御、アレルギー反応調節、抗腫瘍作用、感染制御、流産などに関しては、iNKT 細胞の関与が確定的になっている。このことは、上述した病態、疾病の発症機序を再考する必要があることを意味している。
これまでiNKT 細胞の役割については、主に本細胞を欠損させた遺伝子改変マウス（非特許文献１）を用いて行われてきた。しかし、この動物を入手するためには、資金面だけでなく、煩雑な手続き、更には動物を維持するための施設が必要である。また、遺伝子改変マウスは、見かけ上特定の細胞を解析するには優れたツールであるように思われるが、代償的に別の細胞の数や機能が変化すると共に、それに伴い様々な因子も変動するため、遺伝子改変マウスを用いた実験だけでは誤った結論を導き出す可能性が多分にある。そのため、遺伝子改変マウスを用いた実験と平行して、標的とする細胞に発現する特定の分子
に対する抗体を用いて、細胞を消失させる実験も行う必要がある。しかし、iNKT 細胞にのみ発現されている分子に対する単一の抗体が存在していないことから、抗体を用いてiNKT 細胞のみを消失させることは現時点では不可能である。
に対する抗体を用いて、細胞を消失させる実験も行う必要がある。しかし、iNKT 細胞にのみ発現されている分子に対する単一の抗体が存在していないことから、抗体を用いてiNKT 細胞のみを消失させることは現時点では不可能である。
MCDは水酸基がメチル化された環状糖であり、これまで、MCDは細胞膜に存在するコレステロールを除去することを主な目的として用いられてきた。しかしながら、iNKT 細胞に与える影響などは知られていなかった。
Science, 1997 Nov 28;278(5343):1623-6
Science, 1997 Nov 28;278(5343):1623-6
上述したごとく、これまでiNKT 細胞の役割を明らかにするために、種々の遺伝子改変マウスが用いられてきたが、アーチファクトが多いことから、間違った結論を導き出す可能性がある。本発明は、iNKT 細胞を選択的に消失させる方法を確立することにより、iNKT 細胞の真の役割を明らかにし、iNKT 細胞による生体防御機構の解明、本細胞関連疾患の病因解明、更には各種疾患の診断法・治療法に応用することを目的としている。
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討を行った。その結果、以下の点が明らかとなった。
(1) 通常のT細胞、NK細胞、B細胞はMCDに対して殆ど影響を受けないが、iNKT 細胞はMCDに対して高い感受性を示す。
(2) iNKT 細胞はMCD処理により、本来有する機能を消失する。
(3) MCDに対するiNKT 細胞の高い感受性は、本細胞が選択的にアポトーシスを起こすことに起因する。
以上の知見から、MCDがiNKT 細胞の選択的除去剤として使用できることを見出して、本発明を完成させた。
(1) 通常のT細胞、NK細胞、B細胞はMCDに対して殆ど影響を受けないが、iNKT 細胞はMCDに対して高い感受性を示す。
(2) iNKT 細胞はMCD処理により、本来有する機能を消失する。
(3) MCDに対するiNKT 細胞の高い感受性は、本細胞が選択的にアポトーシスを起こすことに起因する。
以上の知見から、MCDがiNKT 細胞の選択的除去剤として使用できることを見出して、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の通りである。
（I）iNKT 細胞が消失したリンパ球の調製方法であって、MCDをリンパ球に添加してリンパ球からiNKT 細胞を選択的に除去することを特徴とする方法。
（II）MCDを含む、iNKT 細胞除去剤。
（III）MCDとα-GalCer/CD1d テトラマーを含む、iNKT 細胞解析用キット。
（I）iNKT 細胞が消失したリンパ球の調製方法であって、MCDをリンパ球に添加してリンパ球からiNKT 細胞を選択的に除去することを特徴とする方法。
（II）MCDを含む、iNKT 細胞除去剤。
（III）MCDとα-GalCer/CD1d テトラマーを含む、iNKT 細胞解析用キット。
これまで、iNKT 細胞だけを選択的に除去することが困難であったことから、本発明はiNKT 細胞の非存在下における各種免疫担当細胞の役割を明らかにする上において極めて画期的な方法である。今回明らかになったiNKT 細胞のMCDに対する高感受性は、iNKT 細胞と他の細胞(T細胞、NK細胞、並びにB細胞など)の細胞膜に存在するコレステロールの役割が異なっていることを強く示唆していることから、本発明はコレステロールの免疫調節因子としての位置づけを明確にするだけでなく、iNKT 細胞と他のリンパ球との細胞膜構造の差異、iNKT 細胞の活性化機構、細胞表面分子の発現とシグナル伝達機構を明らかにする上において極めて有用な方法である。
以下に本発明を詳しく説明する。
本発明ではメチル−β−シクロデキストリン（MCD）をiNKT 細胞除去剤として用いる。
iNKT 細胞とは、Ｔ細胞受容体としてVα14を発現するNKT 細胞を意味する。
MCDは合成して用いてもよいし、市販のものを用いてもよい。例えば、Sigma-Aldrich社より購入することができる。
MCDをリンパ球に添加することで、T 細胞、NK 細胞、B 細胞にはほとんど影響を与えることなく、iNKT 細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導しiNKT 細胞を除去することができる。
本発明ではメチル−β−シクロデキストリン（MCD）をiNKT 細胞除去剤として用いる。
iNKT 細胞とは、Ｔ細胞受容体としてVα14を発現するNKT 細胞を意味する。
MCDは合成して用いてもよいし、市販のものを用いてもよい。例えば、Sigma-Aldrich社より購入することができる。
MCDをリンパ球に添加することで、T 細胞、NK 細胞、B 細胞にはほとんど影響を与えることなく、iNKT 細胞に対して選択的にアポトーシスを誘導しiNKT 細胞を除去することができる。
リンパ球はマウスやラットなどの実験動物から単離されたものを使用することが好ましいが、ヒトのリンパ球を用いてもよい。また、肝臓などから白血球を調製してこれを使用してもよい。
リンパ球やこれを含む白血球を使用する場合、MCDを0.5〜4 mM 作用させることが好ましく、1〜2 ｍＭ作用させることがより好ましい。例えば、37℃で約30分間処理することによりiNKT 細胞を選択的に除去することができる。
リンパ球やこれを含む白血球を使用する場合、MCDを0.5〜4 mM 作用させることが好ましく、1〜2 ｍＭ作用させることがより好ましい。例えば、37℃で約30分間処理することによりiNKT 細胞を選択的に除去することができる。
iNKT 細胞がリンパ球から選択的に除去されたことは、例えば、α-GalCer/CD1d テトラマー反応性が消失したことによって確認することができる。また、iNKT細胞はα-GalCerの刺激によって強力に活性化され、インターフェロン−γ（IFN-γ）やインタロイキン−４（IL-4）などのサイトカインを多量に産生することから、α-GalCerを作用させたときにIFN-γやIL-4などのサイトカインの誘導がなくなることによっても確認することができる。
MCDからなるiNKT 細胞除去剤はiNKT 細胞の機能解析に使用することができる。
例えば、MCD添加時と非添加時のリンパ球の性質を比較することでiNKT 細胞の機能解析が可能である。
また、iNKT 細胞を特異的ターゲットとした医薬品の評価やスクリーニングにも使用できる。
例えば、リンパ球に評価化合物を添加し、MCDの存在下、および非存在下で効果を比較することによって、iNKT 細胞を特異的に活性化する化合物を探索・取得することができる。このような化合物はiNKT 細胞が関与する疾患の治療薬または予防薬として有用である。
そのような疾患としては、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、骨関節症、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、多発性硬化症、特発性炎症ミオパシー、シェグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、甲状腺炎、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患、中枢又は末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、ギランバレー症候群、慢性炎症脱随性多発神経障害、肝胆道疾患、感染性又は自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑、接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症、蕁麻疹、肺の免疫疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症、過敏性肺炎、移植関連疾患、移植片拒絶反応、移植片対宿主疾患、又は各種病原微生物（ウイルス・細菌・真菌・寄生虫など）による感染症などが挙げられる。
例えば、MCD添加時と非添加時のリンパ球の性質を比較することでiNKT 細胞の機能解析が可能である。
また、iNKT 細胞を特異的ターゲットとした医薬品の評価やスクリーニングにも使用できる。
例えば、リンパ球に評価化合物を添加し、MCDの存在下、および非存在下で効果を比較することによって、iNKT 細胞を特異的に活性化する化合物を探索・取得することができる。このような化合物はiNKT 細胞が関与する疾患の治療薬または予防薬として有用である。
そのような疾患としては、全身性紅斑性狼瘡、リウマチ様関節炎、骨関節症、若年性慢性関節炎、脊椎関節症、多発性硬化症、特発性炎症ミオパシー、シェグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、甲状腺炎、真性糖尿病、免疫仲介腎疾患、中枢又は末梢神経系の脱髄疾患、特発性脱髄性多発神経障害、ギランバレー症候群、慢性炎症脱随性多発神経障害、肝胆道疾患、感染性又は自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変症、肉芽腫性肝炎、硬化性胆管炎、炎症性腸疾患、グルテン過敏性腸疾患、ウィップル病、自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、水疱性皮膚疾患、多形性紅斑、接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症、蕁麻疹、肺の免疫疾患、好球性肺炎、特発性肺線維症、過敏性肺炎、移植関連疾患、移植片拒絶反応、移植片対宿主疾患、又は各種病原微生物（ウイルス・細菌・真菌・寄生虫など）による感染症などが挙げられる。
本発明のキットはMCDとα-GalCer/CD1d テトラマーを含む、iNKT 細胞解析用キットである。
α-GalCer/CD1d テトラマーは、例えば、CD1dタンパク質を発現させ、α-GalCerと混合することによってα-GalCer/CD1dモノマーを作製し、これをビオチン−ストレプトアビジンなどを使用して架橋することによって得ることができる。具体的には、J. Exp. Med. (2000) 192:741-754に記載の方法によって得ることができる。CD1dタンパク質はヒトのものが好ましく、例えば、UniProt/Swiss Protのデータベースにアクセス番号P15813で登録されている配列を有するものを使用できるが、動物由来のものでもよい。なお、CD1d テ
トラマーはPhycoerythrinなどの蛍光物質で標識されたものが好ましい。
α-ガラクトシルセラミド（α-GalCer）は、ガラクトースが結合したセラミドよりなるスフィンゴ糖脂質である。これは、例えば、その２つの部分を互いに結合させる酵素セラミドガラクトシルトランスフェラーゼにより合成される。また、市販のものや海綿などから精製したものを用いることもできる。
MCDによりiNKT 細胞が除去されたことを、α-GalCer/CD1d テトラマーを用いて確認することができ、iNKT 細胞の解析に好適に使用することができる。
α-GalCer/CD1d テトラマーは、例えば、CD1dタンパク質を発現させ、α-GalCerと混合することによってα-GalCer/CD1dモノマーを作製し、これをビオチン−ストレプトアビジンなどを使用して架橋することによって得ることができる。具体的には、J. Exp. Med. (2000) 192:741-754に記載の方法によって得ることができる。CD1dタンパク質はヒトのものが好ましく、例えば、UniProt/Swiss Protのデータベースにアクセス番号P15813で登録されている配列を有するものを使用できるが、動物由来のものでもよい。なお、CD1d テ
トラマーはPhycoerythrinなどの蛍光物質で標識されたものが好ましい。
α-ガラクトシルセラミド（α-GalCer）は、ガラクトースが結合したセラミドよりなるスフィンゴ糖脂質である。これは、例えば、その２つの部分を互いに結合させる酵素セラミドガラクトシルトランスフェラーゼにより合成される。また、市販のものや海綿などから精製したものを用いることもできる。
MCDによりiNKT 細胞が除去されたことを、α-GalCer/CD1d テトラマーを用いて確認することができ、iNKT 細胞の解析に好適に使用することができる。
以下に実施例を示し、本発明をさらに具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
＜試薬＞
CD3ε (145-2C11)、TCRα/β (H57-597)、NK1.1 (PK136)、IFN-γ (R4-6A2)、Fcγ receptor (R) (2.4G2) に対するモノクローナル抗体(mAb)は、ハイブリドーマ（Max-Planck-Institute for Infection Biologyより入手）培養上清より精製したものを、また抗TCRγ/δ mAb (UC7-13D5) 、Phycoerythrin (PE) 標識抗CD3 mAb (145-2C11)、PE 標識抗TCRα/β mAb(H57-597)、Biotin 標識抗TCRα/β mAb (H57-597)、Biotin 標識抗NK1.1mAb (PK136) 、Biotin 標識抗IFN-γ mAb (XMG1.2) はBD PharMingen(Hamburg, Germany) より購入したものを実験に供した。
CD3ε (145-2C11)、TCRα/β (H57-597)、NK1.1 (PK136)、IFN-γ (R4-6A2)、Fcγ receptor (R) (2.4G2) に対するモノクローナル抗体(mAb)は、ハイブリドーマ（Max-Planck-Institute for Infection Biologyより入手）培養上清より精製したものを、また抗TCRγ/δ mAb (UC7-13D5) 、Phycoerythrin (PE) 標識抗CD3 mAb (145-2C11)、PE 標識抗TCRα/β mAb(H57-597)、Biotin 標識抗TCRα/β mAb (H57-597)、Biotin 標識抗NK1.1mAb (PK136) 、Biotin 標識抗IFN-γ mAb (XMG1.2) はBD PharMingen(Hamburg, Germany) より購入したものを実験に供した。
牛胎児血清(FCS) はTrace Biosciences (Castle Hill, HSW, Australia)、Percoll (比重：1.124g/ml) はBiochrom (Berlin, Germany)、RPMI 1640 はNISSUI PHAMACEUTICAL CO., LTD (Tokyo, Japan)、HEPES はDOJINDO LABORATORIES (Kumamoto, Japan) 、L-glutamine 及びpenicillin/streptomycin はInvitrogen (Carlsbad, CA, USA) 、2-mercaptoethanol、sodium hydrogen carbonate、ammonium chloride、TRIS及びsodium azide はWako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)、ウシ血清アルブミン (BSA) はThermo
(Hamilton, New Zealand)、streptavidin (SA) 標識Cy5 はBD PharMingen 、paraformaldehyde (PFA)はMerck (Darmstadt, Germany) 、またMCD はSigma-Aldrich より購入したものを実験に供した。
(Hamilton, New Zealand)、streptavidin (SA) 標識Cy5 はBD PharMingen 、paraformaldehyde (PFA)はMerck (Darmstadt, Germany) 、またMCD はSigma-Aldrich より購入したものを実験に供した。
＜実験手順＞
α-ガラクトシルセラミド (α-GalCer)/CD1d テトラマー の作製
マウスCD1d テトラマー はBirA biotylation site とCD1d を用いたバキュロウイルス発現系を用いて調製した（Infect. Immun.(2006) 74:5903-5913 ）。即ち、Sf9 insect cell line(BDBiosciences, Heidelberg, Germany)にマウスCD1d（His-tag付き）を発現したウイルス（J. Exp. Med. (2000) 192:741-754）を感染させ、Sf-900 無血清培地中で培養した。感染後3 又は4 日目の培養上清を回収し、hollow fiber tangential flow module (MiniKros 1100 cm2,Spectrum, MembraPure, Boddenheim, Germany) により濃縮した。CD1d 分子はコバルト塩化物イオンで荷電したNTA-sepharose カラム(Amersham Pharmacia
Biotech, Uppsla, Sweden)を用いた金属キレートクロマトグラフィー(Chelating sepharose Fast flow, Amersham Pharmacia Biotech) で精製した。タンパク質は200 mM イミダゾールで溶出し、ultrafiltration (Ultrafree Units, Millipore, Bedford, MA) により0.5 ml まで濃縮し、その精製度とタンパク質量はそれぞれSDS-PAGE 並びにBradford reagent (Bio-Rad, Munchen,Germany) にて確認した。精製したCD1d タンパク質はBirA 酵素（Avidity, Denver, CO）でBiotin と結合させ、ゲル濾過(Superdex 200 HR10/30, Amersham Pharmacia Biotek) により精製した。モル濃度が3:1 (lipid:protein) になるように0.5 % Tween 20添加PBS に溶解したα-GalCer （Kirin Brewery, Co., Tokyo, Japan）
とCD1d タンパク質を混合し、室温にて一晩反応させた。α-GalCer/CD1d monomer にSA
-PE をモル濃度で1:4 (monomer : SA-PE) の割合になるように加え、4 量体を生成した。Gel-filtration (Superdex 200 HR10/30, AmershamPharmacia Biotek) によりα-GalCer と結合したPE 標識CD1d テトラマーを精製した。
α-ガラクトシルセラミド (α-GalCer)/CD1d テトラマー の作製
マウスCD1d テトラマー はBirA biotylation site とCD1d を用いたバキュロウイルス発現系を用いて調製した（Infect. Immun.(2006) 74:5903-5913 ）。即ち、Sf9 insect cell line(BDBiosciences, Heidelberg, Germany)にマウスCD1d（His-tag付き）を発現したウイルス（J. Exp. Med. (2000) 192:741-754）を感染させ、Sf-900 無血清培地中で培養した。感染後3 又は4 日目の培養上清を回収し、hollow fiber tangential flow module (MiniKros 1100 cm2,Spectrum, MembraPure, Boddenheim, Germany) により濃縮した。CD1d 分子はコバルト塩化物イオンで荷電したNTA-sepharose カラム(Amersham Pharmacia
Biotech, Uppsla, Sweden)を用いた金属キレートクロマトグラフィー(Chelating sepharose Fast flow, Amersham Pharmacia Biotech) で精製した。タンパク質は200 mM イミダゾールで溶出し、ultrafiltration (Ultrafree Units, Millipore, Bedford, MA) により0.5 ml まで濃縮し、その精製度とタンパク質量はそれぞれSDS-PAGE 並びにBradford reagent (Bio-Rad, Munchen,Germany) にて確認した。精製したCD1d タンパク質はBirA 酵素（Avidity, Denver, CO）でBiotin と結合させ、ゲル濾過(Superdex 200 HR10/30, Amersham Pharmacia Biotek) により精製した。モル濃度が3:1 (lipid:protein) になるように0.5 % Tween 20添加PBS に溶解したα-GalCer （Kirin Brewery, Co., Tokyo, Japan）
とCD1d タンパク質を混合し、室温にて一晩反応させた。α-GalCer/CD1d monomer にSA
-PE をモル濃度で1:4 (monomer : SA-PE) の割合になるように加え、4 量体を生成した。Gel-filtration (Superdex 200 HR10/30, AmershamPharmacia Biotek) によりα-GalCer と結合したPE 標識CD1d テトラマーを精製した。
肝内白血球の調製
日本チャールズリバー(横浜)より購入し、群馬大学医学部附属動物実験施設においてspecific pathogen-free 環境下で飼育・交配したC57BL/6 マウス(8〜12 週齢の雄または雌)を頚椎脱臼もしくはジエチルエーテルにより安楽死させた後、肝臓を摘出した。肝臓はcomplete medium (CM: 20 mM HEPES・10%sodium hydrogen carbonate・L-glutamine (293μg/ml)・penicillin (100U/ml)・streptomycin (100μg/ml)・FCS (10%)・2-mercaptoethanol (50 mM)含有RPMI1640 培地)にて潅流後、金属メッシュで潰し、細胞浮遊液を500 rpmで20 秒間遠心した。さらに上清を1500 rpmで5 分間遠心後、沈渣に40 % percoll(CMで希釈)を加え、70 % percoll(CM で希釈)に重層した。1800 rpmで23 分間遠心した後、40 % 並びに70 % percoll の中間層を回収した。Lysis buffer (蒸留水にammonium chloride
8.3 mg を溶解し0.17 M Tris buffer (pH 7.65) 111 ml を加えたもの) により溶血後、CM にて洗浄し1 × 106 /ml となるように細胞をCM に浮遊させた。
日本チャールズリバー(横浜)より購入し、群馬大学医学部附属動物実験施設においてspecific pathogen-free 環境下で飼育・交配したC57BL/6 マウス(8〜12 週齢の雄または雌)を頚椎脱臼もしくはジエチルエーテルにより安楽死させた後、肝臓を摘出した。肝臓はcomplete medium (CM: 20 mM HEPES・10%sodium hydrogen carbonate・L-glutamine (293μg/ml)・penicillin (100U/ml)・streptomycin (100μg/ml)・FCS (10%)・2-mercaptoethanol (50 mM)含有RPMI1640 培地)にて潅流後、金属メッシュで潰し、細胞浮遊液を500 rpmで20 秒間遠心した。さらに上清を1500 rpmで5 分間遠心後、沈渣に40 % percoll(CMで希釈)を加え、70 % percoll(CM で希釈)に重層した。1800 rpmで23 分間遠心した後、40 % 並びに70 % percoll の中間層を回収した。Lysis buffer (蒸留水にammonium chloride
8.3 mg を溶解し0.17 M Tris buffer (pH 7.65) 111 ml を加えたもの) により溶血後、CM にて洗浄し1 × 106 /ml となるように細胞をCM に浮遊させた。
MCD 処理
CM に含まれるコレステロールを除去するため、白血球を無血清培地にて2回洗浄した後、MCD 含有無血清培地中で37℃で30 分間反応させた。反応後、MCD を除去するため、無血清培地で2 回洗浄し、実験に供した。
CM に含まれるコレステロールを除去するため、白血球を無血清培地にて2回洗浄した後、MCD 含有無血清培地中で37℃で30 分間反応させた。反応後、MCD を除去するため、無血清培地で2 回洗浄し、実験に供した。
フローサイトメトリー
抗体の非特異的結合を防ぐため、細胞を抗FcγR (2.4G2) mAb と4℃で15 分間反応させた後、FITC、PE、Biotin 標識mAb と4℃で15 分間反応させた。Biotin 標識抗体はSA-標識Cy5(BD ParMingen)にて視覚化した。染色後、細胞を1 % PFA 含有PBS (-) で固定後、FACSCalibur (BD Biosciences)により取り込み、CellQuest software(BD Biosciences) により解析した。
α-GalCer/CD1d テトラマー による染色は、blocking 後、PE 標識α-GalCer/CD1d テトラマー と室温で15 分間反応させた。
抗体の非特異的結合を防ぐため、細胞を抗FcγR (2.4G2) mAb と4℃で15 分間反応させた後、FITC、PE、Biotin 標識mAb と4℃で15 分間反応させた。Biotin 標識抗体はSA-標識Cy5(BD ParMingen)にて視覚化した。染色後、細胞を1 % PFA 含有PBS (-) で固定後、FACSCalibur (BD Biosciences)により取り込み、CellQuest software(BD Biosciences) により解析した。
α-GalCer/CD1d テトラマー による染色は、blocking 後、PE 標識α-GalCer/CD1d テトラマー と室温で15 分間反応させた。
細胞内分子検出
抗体の非特異的結合を防ぐため、肝内白血球を抗FcγR mAb と4℃で15 分間反応させた。Biotin 標識抗TCRα/β mAb 並びにBiotin 化抗NK1.1 mAb を用いて細胞表面上のTCRα/β/NK1.1 を染色した後、抗TCRα/β mAb (10 μg/ml) 並びに抗NK1.1 mAb (10 μg/ml)
を用いて、4℃で15 分間を2 回反応させ、細胞表面上のTCRα/β並びにNK1.1 を過飽和させた。Cytofix/Cytoperm solution(BD ParMingen) にて20 分、室温にて反応させた後、Perm/Wash solution (BD ParMingen) にて2 回洗浄した。細胞内TCRα/β、並びにNK1.1 を検出するため、PE 標識抗TCRα/β mAb、並びにPE 標識抗NK1.1 mAb により4℃で15分間反応させ、Perm/Wash solution にて2 回洗浄した。FACS buffer にて細胞を浮遊させた後、FACSCalibur (BD Biosciences) により取り込み、CellQuest software により解析した。
抗体の非特異的結合を防ぐため、肝内白血球を抗FcγR mAb と4℃で15 分間反応させた。Biotin 標識抗TCRα/β mAb 並びにBiotin 化抗NK1.1 mAb を用いて細胞表面上のTCRα/β/NK1.1 を染色した後、抗TCRα/β mAb (10 μg/ml) 並びに抗NK1.1 mAb (10 μg/ml)
を用いて、4℃で15 分間を2 回反応させ、細胞表面上のTCRα/β並びにNK1.1 を過飽和させた。Cytofix/Cytoperm solution(BD ParMingen) にて20 分、室温にて反応させた後、Perm/Wash solution (BD ParMingen) にて2 回洗浄した。細胞内TCRα/β、並びにNK1.1 を検出するため、PE 標識抗TCRα/β mAb、並びにPE 標識抗NK1.1 mAb により4℃で15分間反応させ、Perm/Wash solution にて2 回洗浄した。FACS buffer にて細胞を浮遊させた後、FACSCalibur (BD Biosciences) により取り込み、CellQuest software により解析した。
ELISA
サイトカイン(IFN-γ並びにIL-4) は、enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) により測定した。96 穴平底プレートに1 × 105 /well となるように分注した細胞を、α-GalCer (100 ng/ml)、あるいはphorbol myristate acetate(PMA;10 ng/ml)(Sigma-Aldrich)並びにionomycin (1 ng/ml) と72 時間共培養した後、培養上清を回収した。抗IFN-γ mAb (R4-6A2)(5 μg/ml)を37℃で1 時間コートし、3% BSA 含有PBS にて37℃で2 時間ブロッキングした96 穴平底プレートに上述した培養上清、並びに段階希釈したrIFN-γ (PEPR
OTECH EC,London, UK) を加え、4 ℃ で一晩反応させた。Biotin 標識抗IFN-γ mAb(XMG1.2) (2 μg/ml) により37℃で2 時間反応後、ペルオキシダ−ゼ標識SA(Calbiochem) により37℃で2 時間反応させ、基質としてo-phenylenediamine tablet (Sigma-Aldrich)、並びに過酸化水素(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 含有リン酸・クエン酸緩衝液にて発色させた。塩酸にて反応停止後、吸光度490 nm にて測定し、標準曲線より定量した。また、IL-4 の測定は、IL-4 ELISA kit (Pierce Biotechnology, Inc. USA)を用いて定量した。
サイトカイン(IFN-γ並びにIL-4) は、enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) により測定した。96 穴平底プレートに1 × 105 /well となるように分注した細胞を、α-GalCer (100 ng/ml)、あるいはphorbol myristate acetate(PMA;10 ng/ml)(Sigma-Aldrich)並びにionomycin (1 ng/ml) と72 時間共培養した後、培養上清を回収した。抗IFN-γ mAb (R4-6A2)(5 μg/ml)を37℃で1 時間コートし、3% BSA 含有PBS にて37℃で2 時間ブロッキングした96 穴平底プレートに上述した培養上清、並びに段階希釈したrIFN-γ (PEPR
OTECH EC,London, UK) を加え、4 ℃ で一晩反応させた。Biotin 標識抗IFN-γ mAb(XMG1.2) (2 μg/ml) により37℃で2 時間反応後、ペルオキシダ−ゼ標識SA(Calbiochem) により37℃で2 時間反応させ、基質としてo-phenylenediamine tablet (Sigma-Aldrich)、並びに過酸化水素(Wako Pure Chemical Industries,Ltd.) 含有リン酸・クエン酸緩衝液にて発色させた。塩酸にて反応停止後、吸光度490 nm にて測定し、標準曲線より定量した。また、IL-4 の測定は、IL-4 ELISA kit (Pierce Biotechnology, Inc. USA)を用いて定量した。
＜結果＞
１．肝内白血球に及ぼすMCD の影響
肝内白血球にMCD を作用させたところ、T(CD3+NK1.1-)細胞、NK(CD3-NK1.1+)細胞、B(CD3-NK1.1-)細胞(肝臓に存在するCD3-NK1.1-の殆どはB 細胞）は殆ど影響を受けなかったが、NKT(CD3+NK1.1+)細胞はリンパ球画分中に検出できなくなった（図１）。
NKT 細胞の殆どはT 細胞受容体(TCR)としてVα14 を発現し、抗原提示分子であるCD1d によって提示されたα-GalCerと結合する。そこで、α-GalCer/CD1d テトラマーを用いて同様に解析したところ、MCD 処理によりα-GalCer/CD1d テトラマー反応性細胞がリンパ球画分中から検出できなくなった（図２）。iNKT細胞はCD4の発現により2つの細胞（CD4+8-細胞とCD4-8-細胞）に大別することができるが、両細胞共、MCD処理により検出できなくなった（図３）。
１．肝内白血球に及ぼすMCD の影響
肝内白血球にMCD を作用させたところ、T(CD3+NK1.1-)細胞、NK(CD3-NK1.1+)細胞、B(CD3-NK1.1-)細胞(肝臓に存在するCD3-NK1.1-の殆どはB 細胞）は殆ど影響を受けなかったが、NKT(CD3+NK1.1+)細胞はリンパ球画分中に検出できなくなった（図１）。
NKT 細胞の殆どはT 細胞受容体(TCR)としてVα14 を発現し、抗原提示分子であるCD1d によって提示されたα-GalCerと結合する。そこで、α-GalCer/CD1d テトラマーを用いて同様に解析したところ、MCD 処理によりα-GalCer/CD1d テトラマー反応性細胞がリンパ球画分中から検出できなくなった（図２）。iNKT細胞はCD4の発現により2つの細胞（CD4+8-細胞とCD4-8-細胞）に大別することができるが、両細胞共、MCD処理により検出できなくなった（図３）。
２．細胞内TCR/NK1.1 発現に及ぼすMCD の影響
MCD 処理により肝内iNKT 細胞がリンパ球画分中に検出できなくなった原因として、細胞表面からTCR/NK1.1 が消失した可能性も考えられたため、細胞内についても解析した。
すなわち、MCD 処理後の肝内白血球内のTCR/NK1.1 の検出を試みたが、肝内白血球の細胞内にTCR/NK1.1 を発現する細胞は検出できなかった。
このことは、iNKT 細胞が検出できなくなった原因が、TCR/NK1.1の脱落あるいは内在化したことに起因するのではなく、iNKT 細胞自体が消失したことを示唆している。
MCD 処理により肝内iNKT 細胞がリンパ球画分中に検出できなくなった原因として、細胞表面からTCR/NK1.1 が消失した可能性も考えられたため、細胞内についても解析した。
すなわち、MCD 処理後の肝内白血球内のTCR/NK1.1 の検出を試みたが、肝内白血球の細胞内にTCR/NK1.1 を発現する細胞は検出できなかった。
このことは、iNKT 細胞が検出できなくなった原因が、TCR/NK1.1の脱落あるいは内在化したことに起因するのではなく、iNKT 細胞自体が消失したことを示唆している。
３. iNKT 細胞の機能に及ぼすMCD 処理の影響
MCD 処理後のiNKT 細胞の機能的変化を調べるため、MCD 処理した肝内白血球をα-GalCer と共培養し、培養上清中のIFN-γ 並びにIL-4 の量を測定した。MCD未処理群ではα-GalCerによって高濃度のIFN-γ 並びにIL-4 が検出されたが、MCD処理群では両サイトカイン共殆ど検出されなかった。
他方、PMA 並びにIonomycine （T細胞受容体を介さず直接細胞に刺激を与える活性化剤：iNKT細胞を含む全ての細胞を活性化する作用を有する）で刺激した場合には、IFN-γ・IL-4 両者共検出された（図４）。
MCD 処理後のiNKT 細胞の機能的変化を調べるため、MCD 処理した肝内白血球をα-GalCer と共培養し、培養上清中のIFN-γ 並びにIL-4 の量を測定した。MCD未処理群ではα-GalCerによって高濃度のIFN-γ 並びにIL-4 が検出されたが、MCD処理群では両サイトカイン共殆ど検出されなかった。
他方、PMA 並びにIonomycine （T細胞受容体を介さず直接細胞に刺激を与える活性化剤：iNKT細胞を含む全ての細胞を活性化する作用を有する）で刺激した場合には、IFN-γ・IL-4 両者共検出された（図４）。
４． MCD 処理によるiNKT 細胞のアポトーシス
肝内白血球がMCD 処理後リンパ球画分中に検出できなくなった原因が、アポトーシスによるか否かを調べるため、MCD 処理後の肝内白血球の大きさを、フローサイトメーターにより解析した。その結果、通常のリンパ球よりも小さい細胞画分中に多数のリンパ球が検出された（図５）。
各種モノクローナル抗体並びにα-GalCer/CD1d テトラマーを用いてその細胞を解析したところ、その多くがiNKT 細胞であった。
サイズが小さくなったiNKT 細胞を各種モノクローナル抗体あるいはα-GalCer/CD1d テトラマーとAnexin V を用いて染色したところ、殆ど全てのiNKT 細胞がAnexin V 陽性であった（図６）。
このことから、MCD処理により、iNKT 細胞がアポトーシスを起こしていることが明らかとなった。
肝内白血球がMCD 処理後リンパ球画分中に検出できなくなった原因が、アポトーシスによるか否かを調べるため、MCD 処理後の肝内白血球の大きさを、フローサイトメーターにより解析した。その結果、通常のリンパ球よりも小さい細胞画分中に多数のリンパ球が検出された（図５）。
各種モノクローナル抗体並びにα-GalCer/CD1d テトラマーを用いてその細胞を解析したところ、その多くがiNKT 細胞であった。
サイズが小さくなったiNKT 細胞を各種モノクローナル抗体あるいはα-GalCer/CD1d テトラマーとAnexin V を用いて染色したところ、殆ど全てのiNKT 細胞がAnexin V 陽性であった（図６）。
このことから、MCD処理により、iNKT 細胞がアポトーシスを起こしていることが明らかとなった。
以下、結果をまとめた。
（１）MCD を処理することにより、iNKT 細胞がリンパ球画分中に検出できなくなった。
（２）iNKT 細胞の消失に伴い、本来本細胞が有するサイトカイン産生能が消失した。
（３）MCD を処理することにより、iNKT 細胞がアポトーシスを起こした。
（４）上述したMCD の作用は他の白血球には殆ど認められなかった。
（１）MCD を処理することにより、iNKT 細胞がリンパ球画分中に検出できなくなった。
（２）iNKT 細胞の消失に伴い、本来本細胞が有するサイトカイン産生能が消失した。
（３）MCD を処理することにより、iNKT 細胞がアポトーシスを起こした。
（４）上述したMCD の作用は他の白血球には殆ど認められなかった。
これまで困難とされていたiNKT 細胞を選択的に除去（アポトーシス）せしめる方法を発明した。本発明はコレステロールの免疫調節因子としての位置づけを明確にするだけでなく、iNKT 細胞と他のリンパ球との細胞膜構造の差異、iNKT 細胞の活性化機構、細胞表面分子の発現とシグナル伝達機構を明らかにする上においても極めて有用な方法である。
Claims (3)
- インバリアントナチュラルキラーＴ（iNKT）細胞が消失したリンパ球の調製方法であって、メチル−β−シクロデキストリンをリンパ球に添加してリンパ球からiNKT 細胞を選択的に除去することを特徴とする方法。
- メチル−β−シクロデキストリンを含む、iNKT 細胞除去剤。
- メチル−β−シクロデキストリンとα-ガラクトシルセラミド/CD1d テトラマーを含む、iNKT 細胞解析用キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2007175271A JP5131740B2 (ja) | 2007-07-03 | 2007-07-03 | メチル−β−シクロデキストリンからなるインバリアントナチュラルキラーＴ細胞除去剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| JP2007175271A JP5131740B2 (ja) | 2007-07-03 | 2007-07-03 | メチル−β−シクロデキストリンからなるインバリアントナチュラルキラーＴ細胞除去剤 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2009011208A true JP2009011208A (ja) | 2009-01-22 |
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| JP (1) | JP5131740B2 (ja) |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114404445A (zh) * | 2021-10-28 | 2022-04-29 | 中国药科大学 | 环糊精在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007070311A (ja) * | 2005-09-09 | 2007-03-22 | Gunma Univ | α−ガラクトシルセラミドからなる感染症予防剤及び感染症治療剤 |
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- 2007-07-03 JP JP2007175271A patent/JP5131740B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Title |
|---|
| JPN6012040105; 臨床免疫 , 2005, Ｖｏｌ．４４（６） * |
| JPN6012040106; Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｖｏｌ． ３２３（１）, 20070531, ｐｐ． １１-２３ * |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114404445A (zh) * | 2021-10-28 | 2022-04-29 | 中国药科大学 | 环糊精在制备治疗溃疡性结肠炎药物中的应用 |
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