JP5420791B1

JP5420791B1 - サルモネラ菌及びシート状ｍ細胞

Info

Publication number: JP5420791B1
Application number: JP2013173685A
Authority: JP
Inventors: 肇福永; 孝行江崎
Original assignee: 肇福永
Priority date: 2013-08-23
Filing date: 2013-08-23
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2033-08-23
Also published as: JP2015039366A; WO2015025638A1

Abstract

【課題】
Ｍ細胞（Microfold cell）内の機能強化に必要なタンパク質を増強させる無毒化されたサルモネラ菌と、この無毒化されたサルモネラ菌によりＭ細胞の機能強化に必要なタンパク質が増強されたシート状Ｍ細胞およびこのシート状Ｍ細胞を組み込んだ人工微小器官を提供する。
【解決手段】
Ｍ細胞に侵入可能なサルモネラ菌はサルモネラ菌（Ty2）が突然変異し無害化サルモネラ菌（Ty21a）であり、さらにこの無害化サルモネラ菌（Ty21a）には遺伝子組み換えによってＭ細胞の機能強化するガレクチン-９を産生する遺伝子が組み込まれているので、Ｍ細胞はガレクチン-９が増強され、このガレクチン-９はＭ細胞の機能を強化する。またＭ細胞に侵入した無害化サルモネラ菌（Ty21a）は時間の経過とともに消滅する。
【選択図】図１０

Description

本発明はＭ細胞内に侵入することでＭ細胞の機能を強化するサルモネラ菌及び人工微小器官または人工皮膚に用いるシート状Ｍ細胞に関する。

小腸の内側の粘膜固有層にリンパ小節が平板状に集合したパイエル板と呼ばれるリンパ組織がある。このパイエル板の一部で繊毛が未発達の領域に免疫に関して重要な働きをするＭ細胞（Microfold cell）が存在する。このＭ細胞は特殊に分化した腸管の上皮組織の一部と考えられ、腸管内腔側からエンドサイトーシスによって細菌（抗原）を取込み、基底膜（バソラテラル）側で接しているＴ細胞、Ｂ細胞或いはマクロファージに抗原を提示する。

特許文献１には、ＧＰ２がＭ細胞（Microfold cell）、特にヒトＭ細胞に特異的に発現しており、このＧＰ２をＭ細胞のマーカーとして使用することが提案されている。

特許文献２には、ガレクチン-９が免疫細胞に作用し、免疫を抑制する方向に制御し過剰な炎症を抑える機能を有していることが記載されている。

本発明者はＧＰ２とガレクチン-９の関連性について検証し、Ｍ細胞中のＧＰ２をタイトジャンクションに移動させることでシート形成能が発揮され、同時にＭ細胞はアレルゲンや細菌と結合するガレクチン-９を発現するという知見を得、これに基づき、Ｍ細胞を培養することでシート状の人工皮膚とすることを特許文献３に提案している。

一方、腸内細菌として知られるサルモネラ菌には、病原性のサルモネラ菌（Ty2)の他に、ワクチン株として使われる無害化されたサルモネラ菌（Ty21a)等が知られている。サルモネラ菌（Ty21a)はサルモネラ菌（Ty2)から突然変異（vi抗原の欠損,galE遺伝子の変異）したものである。

非特許文献１には、サルモネラ菌（Ty2）と（Ty21a)との相違点として、サルモネラ菌（Ty2）の表面はvi遺伝子により産生されるポリ多糖類からなる莢膜に覆われているが、サルモネラ菌（Ty21a)には莢膜が存在しないとの報告がなされている。

非特許文献２には、０．１％濃度のガラクトース溶液でサルモネラ菌（Ty21a)の発育が抑制されることが報告されている。

非特許文献３には、炭疽菌ワクチンをサルモネラ菌のワクチン株(Ty21a)で作成したことが報告されている。

非特許文献４には、アレルギー疾患ワクチンを開発する必要性と可能性について述べている。

特開２００８−１４１９９５号公報ＷＯ２０１２／０７７８１１特許第５１９７８８０号公報

Genetic stability of vaccine strain Salmonella Typhi Ty21a over 25 years; Dennis J. Kopecko et alInternational Journal of Microbiology 299(2009)233-246 CHARACTERRISTICS OF THE ATTENUATED ORAL VACCINE STRAIN ≪S. THY1≫ TY 21a; R. Germanier and E. Furer, Develop. bio1. Standard. Vol 53, pp. 3-7 Anthrax Protective Antigen Delivered by Salmonella enteric Serovar Typi Ty21a Protects Mice from aLethal Anthrax Spore Challenge; Manuel Osorio, et alINFECTION AND IMMUNITY, Apr. 2009, p 1475-1482 自己免疫疾患、アレルギーを対象とした各種抗原特異的治療ワクチン；石井保之、感染炎症炎症、免疫Ｖｏｌ. 41-4

上述した先行技術文献から以下のことが判明又は予測されている。
（１）Ｍ細胞は粘膜免疫に関する重要な働きをしている。
（２）ガレクチン−９が免疫抑制を誘導する。
（３）サルモネラ菌には病原性のサルモネラ・チフス菌（Ty2）などの他に無害化されたワクチン株であるサルモネラ菌（Ty21a)があり、サルモネラ・チフス菌（Ty2）の表面にはvi抗原による莢膜が形成され、ワクチン株であるサルモネラ菌（Ty21a)の表面には莢膜がない。

一方、食物アレルギー、アトピー性皮膚炎、ぜんそく、鼻炎などは、造血幹細胞に由来するマスト細胞表面や腸管粘膜表面に存在しているIgE抗体にアレルゲンが結合し、ヒスタミン等の化学伝達物質を放出することによって発症する。

ここで、前記ガレクチン−９は、IgE抗体を中和し、ヒスタミンの遊離を阻止することで、アレルギー症状を緩和していることが予測される。またＭ細胞におけるガレクチン−９の発現を増強すれば、アレルギーに対して有効であることも予測できる。

更に、遺伝子組み換えによって大腸菌やサルモネラ菌に特定のタンパク質を産生する遺伝子を組み込むことも当業者にとってそれほど困難が伴うものではない。
しかしながら、上記の判明又は予測されている事項から、如何に安全で且つ効果的なアレルギー症状の改善、予防を行えるようにするかは、何れの先行技術にも示唆されていない。

本発明者は実験によって以下の知見を得た。
（１）無害化されたサルモネラ菌（Ty21a）は通常のサルモネラ菌（Ty2）と比べると、Ｍ細胞への侵入能力は弱くなる。しかしながら、依然としてＭ細胞への侵入能力は維持している。
（２）Ｍ細胞に侵入した無害化されたサルモネラ菌（Ty21a）は増殖せずに時間の経過とともに消滅する。

上記の知見に基づき本発明をなすに至った。即ち、請求項１に係る発明は上記（１）及び（２）の知見に基づき、Ｍ細胞の機能強化を用途とした発明であり、具体的には、Ｍ細胞（Microfold cell）の機能強化用サルモネラ菌であって、このサルモネラ菌はＭ細胞に侵入可能であり、且つ病原性サルモネラ菌（Ty2）が突然変異した無害化サルモネラ菌（Ty21a）にガレクチン−９を産生する遺伝子が組み込まれたサルモネラ菌（Ty21a-DH）であり、Ｍ細胞への侵入能力は病原性サルモネラ菌（Ty2）より劣るが維持しており、Ｍ細胞内では増殖しない特徴を有している。

即ち請求項２に係る発明は、無害化サルモネラ菌（Ty21a）を遺伝子組み換えによってＭ細胞の機能強化に必要なタンパク質を産生する無害化サルモネラ菌である。ここで、Ｍ細胞の機能強化に必要なタンパク質を産生する無害化サルモネラ菌としてはガレクチン-９を産生するサルモネラ菌（Ty21a-DH）を一例として挙げることができる。

また、本発明は本発明者が先に提案したシート状のＭ細胞にも適用できる。この場合は、シート状のＭ細胞の一方の側にガレクチン-９などのＭ細胞の機能強化に必要なタンパク質を産生する遺伝子が組み込まれた無害化サルモネラ菌を供給し、無害化サルモネラ菌にシート状のＭ細胞を通過或いはＭ細胞に侵入させる。無害化サルモネラ菌がシート状のＭ細胞を通過（侵入）する間に、無害化サルモネラ菌はガレクチン-９などのＭ細胞の機能強化に必要なタンパク質を分泌し、Ｍ細胞内でのＭ細胞の機能強化に必要なタンパク質濃度が高まる。

請求項１に係る無害化されたサルモネラ菌は、経口投与することで、Ｍ細胞に侵入してＭ細胞内でＭ細胞の機能強化に必要なタンパク質を産生する。
ガレクチン−９を例にとるとＭ細胞で産生されたガレクチン−９はＭ細胞を通過する細菌や消化食物に結合し、免疫寛容を誘導する。またＭ細胞ポケット（Ｍ細胞の窪みに免疫細胞が集積している特殊な構造）で分泌されたガレクチン−９は、IgE抗体に結合して不活性化し、その結果、食物アレルギーやアトピー性疾患が改善される。

また、病原性サルモネラ菌（Ty2）はその表面がvi抗原からなる莢膜で覆われているが、無害化されたサルモネラ菌（Ty21a-DH）にはvi抗原からなる莢膜がない。ここで、ガレクチン-９などのＭ細胞の機能強化に必要なタンパク質はvi抗原からなる膜に結合しやすいが、サルモネラ菌（Ty21a-DH）にはvi抗原からなる膜がないので、分泌されたガレクチン-９などのＭ細胞の機能強化に必要なタンパク質はサルモネラ菌（Ty21a-DH）から遊離しＭ細胞内で濃度が高まる。

特に、本発明者の知見から病原性サルモネラ菌（Ty2）はＭ細胞内で増殖するが、サルモネラ菌（Ty21a-DH）はＭ細胞内で増殖せずに時間の経過とともに死滅する。したがって、安全性は極めて高い。

また、サルモネラ菌（Ty21a-DH）がＭ細胞内で増殖しないことは、Ｍ細胞の機能強化に必要なタンパク質の分散を局所的に限定し、Ｍ細胞近傍に存在するIgE抗体のみを不活性化することができる。このことは今までにない局所的治療薬の概念を創設するものである。

一方、請求項２に係るシート状Ｍ細胞は、サルモネラ菌（Ty21a-DH）が通過しているため、Ｍ細胞内部のガレクチン-９などのＭ細胞の機能強化に必要なタンパク質の濃度が高くなり、その結果タイトジャンクションに移動したＧＰ２との結合が強化されるため、シート形状を維持することが可能になる。
また、Ｍ細胞の機能強化に必要なタンパク質がガレクチン-９である場合、Ｍ細胞内部のガレクチン-９濃度が高いため、免疫寛容効果に優れ、人工皮膚等に応用すると更に高い効果が期待できる。

本発明に係るサルモネラ菌（Ty21a-DH）と、対照となるサルモネラ菌（Ty21a）、サルモネラ・チフス菌（Ty2）、大腸菌（E.coli）を１％ガラクトースＢＴＢ寒天培地に接種し、３７℃、２４時間後のコロニーを示す写真。サルモネラ菌（Ty21a-DH 菌番号♯29、♯35、♯38）、サルモネラ菌（Ty21a）、サルモネラ・チフス菌（Ty2）及び大腸菌（E.coli）のＤＮＡを抽出し、galE遺伝子プライマーで遺伝子増幅（ＰＣＲ）を行い、増幅産物をエチレン・ブロマイド含有１％アガロース・ゲルで電気泳動させ、紫外線照射下で撮影した写真。サルモネラ菌（Ty21a-DH 菌番号♯29、♯35、♯38）、サルモネラ菌（Ty21a）及びサルモネラ・チフス菌（Ty2）のＤＮＡを抽出し、galE遺伝子プライマーで遺伝子増幅（ＰＣＲ）を行い、ダイレクトシーケンス法で決定したgalE遺伝子配列を示す図。サルモネラ菌（Ty21a-DH 菌番号♯29、♯35、♯38）、サルモネラ菌（Ty21a）、サルモネラ・チフス菌（Ty2）及び大腸菌（E.coli）のＤＮＡを抽出し、galE遺伝子プライマーで遺伝子増幅（ＰＣＲ）を行い、増幅産物を制限酵素Alulで切断し、切断物をエチレン・ブロマイド含有４％アガロース・ゲルで電気泳動させ、紫外線照射下で撮影した写真。サルモネラ・チフス菌（Ty2）のガラクトース濃度の違いによる発育を経時的に観察したグラフ。サルモネラ菌（Ty21a）のガラクトース濃度の違いによる発育を経時的に観察したグラフ。サルモネラ菌（Ty21a-DH）、サルモネラ菌（Ty21a）及び大腸菌（E.coli）の０．１％ガラクトース濃度での発育を経時的に観察したグラフ。サルモネラ・チフス菌（Ty2）とサルモネラ菌（Ty21a-DH）の赤色蛍光写真。サルモネラ菌（Ty21a-DH）、サルモネラ菌（Ty2）及び大腸菌（E.coli）のシート状Ｍ細胞の侵入状態を説明した図サルモネラ菌（Ty2）とサルモネラ菌（Ty21a-DH）の、シート状Ｍ細胞に侵入した後の発育状態を検証した図。 Transwell（登録商標）の下層に配置したＤＣ細胞（抗原提示貪食細胞）内におけるサルモネラ菌（Ty2）とサルモネラ菌（Ty21a-DH）の発育状態を検証した図。ガレクチン−９の保持状態を示すＭ細胞の顕微鏡写真で、（ａ）はサルモネラ菌（Ty21a-DH）が侵入していないＭ細胞の顕微鏡写真、（ｂ）はサルモネラ菌（Ty21a-DH）が侵入したＭ細胞の顕微鏡写真。 LTβR抗体の保持状態を示すＭ細胞の顕微鏡写真で、（ａ）はサルモネラ菌（Ty21a-DH）が侵入していないＭ細胞の顕微鏡写真、（ｂ）はサルモネラ菌（Ty21a-DH）が侵入したＭ細胞の顕微鏡写真。

ガレクチン‐９を分泌するサルモネラ菌（Ty21a-DH）の調整
調整の概略は、ガレクチン−９の遺伝子をプラスミドに組み込み、このプラスミドをサルモネラ菌（Ty21a）に導入する。
即ち、データベースで公開されているガレクチン−９の遺伝子情報に基いて作成されたガレクチン−９の遺伝子DNA配列にタンパクを菌体外に分泌させる大腸菌の遺伝子HlyABDのDNA配列を追加する。この操作でサルモネラ菌（Ty21a）が産生したガレクチン−９が菌体外に分泌される。
また、htrAプロモータ（タンパク合成酵素結合部位）をガレクチン−９の遺伝子の上流側に配置する。
上記の遺伝子配列を含んだプラスミドpGB-2をサルモネラ菌（Ty21a）に導入する。

具体的には、サルモネラ菌（Ty21a）をLBブロス（寒天を含まない培地）２０ｍｌを振盪培養（２００ｒｐｍ）すると、３〜４時間で対数増幅期に達する。この間で菌濁度（Ｏ.Ｄ.）が０．７５になるまで発育させる。この時点で発育したサルモネラ菌（Ty21a）を氷水中に置き、１５分間維持する。次いで速やかに５０ｍｌ遠心チューブに移し、４０００ｇ、４℃、１０分間遠心沈殿させる。

上記の遠心法で回収したサルモネラ菌（Ty21a）にHEPES緩衝液２０ｍｌを加え洗浄し、同様に、４０００ｇ、４℃、１０分間遠心沈殿させる。上澄みを吸引除去し、残りの沈渣に１０％グリセロール含有HEPES緩衝液２００μｌを加え、氷水中に維持する。

前記で作成したプラスミドpGB-2（２０ｐｇ〜２０ｎｇ）をサルモネラ菌（Ty21a）の１００μｌを入れたエレクトロンポレーション（電気物理的なパルスで細胞膜の透過性を高めることによってプラスミドＤＮＡを細胞に導入する）専用チューブに（氷水中）加え、この容器をエレクトロンポレーション装置にセットする。そして、２５００Ｖ、５分間のパルスを実施する。

この後、エレクトロンポレーション装置から取り出し、即座に１ｍｌのＳＯＣブロスを加え、別の減菌チューブに移し替える。これを３７℃の浸透培養器で１時間培養する。そして、この一部を取り出し、抗生物質（スペクトロマイシン）含有ＬＢ寒天培地に接種し、発育してきたプラスミド組み込みサルモネラ菌（Ty21a）のなかでガレクチン−９を分泌するものをサルモネラ菌（Ty21a-DH 菌番号♯29、♯35、♯38）として以降の実験に用いた。

サルモネラ菌（Ty21a-DH）の鑑別
サルモネラ菌（Ty21a-DH）を他の菌種から鑑別する必要があり、以下の方法を用いて同定を行った。
（市販の細菌同定キットによる鑑別）
細菌を鑑別するために多くの市販キットが入手可能である。具体的にはアピ２０Ｅ（ビオメリュージャパン、東京）を用いて同定を行った。２０個のプラスチック・ウエルに細菌が分解する可能性のある基質（糖やタンパク質）もしくは菌が合成する可能性があるアミノ酸を検出する試薬をあらかじめウェルに加え乾燥されたものがキットとして用意されている。
目的の細菌が発育可能な寒天培地に接種し、３７℃の培養器で１８時間培養する。発育してきた細菌はコロニー（肉眼で確認できる菌の塊）を形成している。

図１から分かるように、本発明に係るサルモネラ菌（Ty21a-DH）は青色で小型のコロニーを形成し、サルモネラ菌（Ty21a）も青色で小型のコロニーを形成し、サルモネラ菌（Ty2）は黄色で大型のコロニーを形成し、大腸菌（E.coli）も青色で小型のコロニーを形成した。

上記のコロニーの一部を滅菌綿棒で掻き取り、キットに添付されている５ｍｌの生理食塩水容器に均一な細菌の混濁液を作成し、２０個のプラスチック・ウエルに流し込む。２０個のプラスチック・ウエルは１枚のプラスチック・トレイに固定されているため、取り扱いが容易であるように設計されている。このトレイを３７℃の培養器で１８時間培養する。目的とする細菌により利用・分解するパターンが異なっているため、このパターンを企業が収集しているデータベースで検索し統計確率で細菌を同定する。具体的な方法はキットの説明書に記載されている。
このキットを用いてサルモネラ菌（Ty21a-DH）をサルモネラ・チフス菌の一種と同定した。

(１％ガラクトースBTB寒天培地上の発育形態での鑑別)
サルモネラ菌（Ty21a-DH）をサルモネラ・チフス菌（Ty2）から鑑別する方法として１％ガラクトースBTB寒天培地を用いた。
具体的には、４０gのハート・インフュージョン（HI）粉末に５gのNaClを加え、PHを1NのHClで7.1に調整後、蒸留水で１０００ｍｌにし、オートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌（ＨＩ寒天培地）。ブルムティモールブルー（ＢＴＢ）１gを０．１ＮのNaOH ２５ｍｌに溶解させ、４７５ｍｌの滅菌水に加えた（ＢＴＢ溶液）。

この溶液４０ｍｌにNaS₂O₃5H₂O(チオ硫酸ナトリウム５水化物)１gを加えオートクレーブで１２１℃、２０分間滅菌する。蒸留水１００ｍｌにガラクトース３３ｇを溶解させ、０．２２μｍのフィルターで濾過滅菌した（ガラクトース溶液）。

HI寒天培地１リットルを５５℃に維持し、調整したBTB溶液４０ｍｌおよびガラクトース溶液３０ｍｌを加え、よく撹拌し滅菌シャーレに２５ｍｌ分注し、固化したものをＢＴＢ寒天培地とする。この寒天培地にサルモネラ菌（Ty21a-DH）、サルモネラ・チフス菌(Ty2)及び大腸菌(E.coli)を接種し、３７℃の培養器で１８時間培養した。

発育してきた其々のコロニーの形態の違い（サルモネラ菌Ty21a-DHは小型青色、サルモネラ・チフス菌(Ty2)は大型黄色,大腸菌（E.coli）は中型緑色、サルモネラ菌（Ty21a）は小型青色を図１に示している。

(galEの遺伝子解析による鑑別)
サルモネラ菌（Ty21a-DH 菌番号♯29、♯35、♯38）、サルモネラ菌（Ty21a）、サルモネラ・チフス菌（Ty2）及び大腸菌（E.coli）はgalE遺伝子を有している。
サルモネラ菌（Ty21a）は、galE遺伝子の２か所に点突然変異があることが知られており、サルモネラ菌（Ty21a）をサルモネラ・チフス菌（Ty2）からの鑑別に利用することができる。サルモネラ・チフス菌（Ty2）のガラクトースの代謝過程はガラクトース→ガラクトース1‐リン酸→UDPガラクトース→ UDPグルコース → グルコース1‐リン酸→グルコース6‐リン酸の順に変化し、galE遺伝子の産物であるUDPヘキソース-4-エピメラーゼはUDPガラクトース→UDPグルコースを触媒する。

（galE遺伝子の配列解析）
具体的には、細菌核酸抽出キットを用いてサルモネラ菌（Ty21a-DH菌番♯29、♯35、♯38）のＤＮＡを抽出精製する。１６ＳリボソームRNAをコードしている遺伝子を下記のプライマーで増幅する。
5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’
5’-AAGGAGGTGWTCCARCC-3’
増幅産物を図２に示すように、ダイレクトシーケンス法で遺伝子配列を決定し、ネット上のデータベース（NCBI,DDBC,ENBL）で検索し、サルモネラ菌と同定した。

次にgalE遺伝子を下記の特異プライマーで増幅する。
5’-ATTACATGTCACACTTTTCGCATC -3’
5’-ATCGATGGGATTAAATGGGGTCAT-3’
同様に基準とするサルモネラ・チフス菌(Ty2)及びサルモネラ菌（Ty21a）のDNAを抽出し、同じプライマーでgalE遺伝子を増幅、増幅産物をダイレクトシーケンス法で遺伝子配列を決定する。図３に示すように、決定された遺伝子配列を比較し、サルモネラ菌（Ty21a-DH菌番号菌番♯29、♯35、♯38）及びサルモネラ菌（Ty21a）のgalE遺伝子の２か所に点突然変異が存在することを確認した。

（galE遺伝子の制限酵素切断パターン解析）
図４に示したように、上記プライマーで増幅した増幅産物を制限酵素ALu1で切断し、電気泳動パターンでサルモネラ菌（Ty21a-DH）のgalE遺伝子の点突然変異を確認した。

ガラクトースによるサルモネラ菌Ty21a-DHの発育阻害）
galE遺伝子の点突然変異によりUDPヘキソース-4-エピメラーゼが産生されないことにより、UDPガラクトースがサルモネラ菌（Ty21a-DH）の菌体内部で蓄積し、細菌内部の浸透圧が増加することにより菌体が壊れ死滅する。

この現象を確認するためガラクトース濃度１％、0.1％、0％をハートインヒュージョン培地（HIブロス）で作成した。このガラクトース含有HIブロスに対数増幅期のサルモネラ菌（Ty21a-DH）、サルモネラ菌（Ty21a）、サルモネラ・チフス菌(Ty2)及び大腸菌(E. coli)を接種し、菌液濁度をO.D=0.2に調整する。以降、経時的な菌液濁度の変化（２０分間毎）を小型振盪培養装置 TV100070 (ADVANTEC, 東京)で測定した。

結果を図５〜７に示す。即ち、図５からは、ガラクトース濃度が０.１％ではサルモネラ・チフス菌（Ty2）の発育に全く影響を及ぼさないが、ガラクトース濃度が１％になると死滅はしないがサルモネラ・チフス菌（Ty2）の発育が抑えられることが分かる。
図６からは、サルモネラ菌（Ty21a）に関しては、ガラクトース濃度が０.１％でも１％でも５時間で発育が抑えられる（減少する）ことが分かる。
図７からは、サルモネラ菌（Ty21a-DH）もサルモネラ菌（Ty21a）と同様に発育が抑えられることが分かる。

（vi莢膜遺伝子欠損によるvi抗原の欠損）
病原菌であるサルモネラ・チフス菌（Ty2）は菌体表面に莢膜といわれている膜が菌体全体を覆っている。この莢膜はvi遺伝子により産生されるポリ多糖体から構成されている。しかし、vi遺伝子欠損しているサルモネラ菌（Ty21a）はvi莢膜が菌体表面で検出されなかった。

vi莢膜の有無を確認する方法として、vi莢膜に対する抗体(抗viポリクローナル抗体)を用いた血清凝集法を用いた。
具体的には上記BTB寒天培地に発育してきたサルモネラ菌（Ty21a）の一部を白金線等で掻き取り、スライド・グラスに移し、事前に滴下しておいた蒸留水と混ぜることにより均一な菌のエマルジョンを作成した。このエマルジョンに抗vi抗体(BD,東京)を１滴（５０μｌ）加え、ローター等で混和し、細菌と抗体の反応を肉眼で確認する。vi莢膜を有するサルモネラ・チフス菌（Ty2）は顆粒を有した白濁を呈し、大腸菌（E.coli）、サルモネラ菌（Ty21a）、サルモネラ菌（Ty21a-DH）は変化が認められなかった。

（ガレクチン-９のvi抗原との結合性）
サルモネラ・チフス菌（Ty2）のvi抗原はガレクチン-９が結合可能なポリ多糖体を形成しているが、vi欠損サルモネラ菌にはガレクチン-９が結合できない。この現象を蛍光色素結合ガレクチン-９を用いて共焦点顕微鏡で確認した。

具体的には、ガレクチン-９遺伝子組み換え体（R&D,東京）を滅菌蒸留水１ｍｌに溶解させ、プロテイン蛍光ラベルキット（モレキュラープローブ、USA）を用いて蛍光色素であるAlexa 594をガレクチン-９に結合させる。添付の蛍光色素含有チューブに溶解したガレクチン-９溶液を加え、４℃で1時間、転倒混和させる。この溶液に添付の緩衝溶液を５００ｍｌ加え、蛍光色素結合ガレクチン-９とした。ＭＨ培地で対数増幅期に達したサルモネラ・チフス菌(Ty2)の一部を取り出し、滅菌リン酸緩衝液（PBS）を用いて１０^７ CFU/ｍｌの濃度に調整（CFUは菌の数の単位）。蛍光色素結合ガレクチン-９の２０μｌを調整した菌液１ｍｌに加え、４℃で４８時間、転倒混和させる。この一部をコラーゲン固定した共焦点顕微鏡用カバーグラスにとり、乾燥させた後、共焦点顕微鏡で観察した。
同様にサルモネラ菌（Ty21a-DH）を観察した。

図８から、サルモネラ・チフス菌（Ty2）は表面にvi抗原からなるポリ多糖類が形成されており、このポリ多糖類がガレクチン‐９の結合によって赤色に染色されていることと、サルモネラ菌（Ty21a-DH）はvi抗原が欠損しているため、ガレクチン‐９が結合できず染色されていないことが分かる。

次に、本発明に係るサルモネラ菌（Ty21a-DH）のＭ細胞に対する侵入に関して、サルモネラ・チフス菌（Ty2）及び大腸菌（E.coli）と比較した。
尚、実験にはシート状Ｍ細胞を用いた。このシート状Ｍ細胞は本発明者が開発したもので、以下の手順によって作製する。

先ず、Ｍ細胞をTranswell（登録商標）のフィルター上に培養する。この培養は、先ずＭ細胞の濃度を8×１０^５ｃｅｌｌ／ｍｌに調整し、培養容器４ｃｍ^２に対し２ｍｌの割合で細胞溶液をTranswell（登録商標）のフィルター上に加えた。上層及び下層には２０％ウシ胎児血清を含んだ細胞培養溶液を加えた。当初４日目に上下層の細胞培養溶液を新しい溶液を交換し、次の４日目に再度、細胞培養溶液を交換した。更に２日後にM細胞がフィルター面いっぱいに増えていることを確認した。Ｍ細胞が培養容器全面に広がった時点で、上下層の細胞培養溶液を血清成分がない細胞培養液に交換し、下層には抗ＬＴβＲ抗体２０μｌを添加した。この抗ＬＴβＲ抗体の刺激により、細胞内のＧＰ２が細胞間接着部（タイトジャンクション）に移動し、細胞同士の結合が強固になる。２日後に培養液を交換、以降２日毎に細胞培養液を交換し６日後にＭ細胞シートが完成した。

Ｍ細胞シートを通過（侵入）するサルモネラ菌Ty21a-DHの検出
上記Ｍ細胞シートを用いてサルモネラ菌（Ty21a-DH）がＭ細胞を通過することができることを確認した。
具体的には、対数増幅期のサルモネラ菌（Ty21a-DH）、サルモネラ・チフス菌(Ty2)及び大腸菌(E. coli)を１０^９CFU/mlに調整し、それぞれを別のＭ細胞シートが形成されたウェルの上層に菌液を５０μｌ加えた。３７℃、５％炭酸ガスの培養器で１時間静置。滅菌ピペットで下層の培養液を回収。滅菌PBSで希釈系列を作成し、TSA寒天培地に接種。３７℃の恒温培養器内に１８時間静置した。発育してきた細菌のコロニーをカウントし、希釈倍率を加味して、Ｍ細胞内を通過してきた細菌を定量検出した。

一方、Ｍ細胞内に侵入した細菌数を定量する方法として以下の方法を実施した。菌液を５０μｌ加え、３７℃、５％炭酸ガスの培養器に１時間静置したTranswell（登録商標）を３７℃に加温した血清成分のない細胞培養溶液で其々のウェルの上下層を３回洗浄し、添加した余分の細菌を除去した。更に血清成分のない細胞培養溶で抗生物質ゲンタマイシン２５０μｇ/ｍｌ濃度溶液を作成し、Transwell（登録商標）の上下層にそれぞれ２ｍｌを加え、３７℃、５％炭酸ガスの培養器で２時間静置した。

これによりＭ細胞周辺の余分な細菌が殺菌され、Ｍ細胞に侵入したサルモネラ菌（Ty21a-DH）及びサルモネラ・チフス菌(Ty2)だけを検出できる。（抗生物質ゲンタマイシンは細胞に取り込まれない性質がある。この性質を利用し、細胞侵入性細菌を定量検出することができる。）

結果を図９に示した。この図９から、大腸菌（E.coli）はシート状Ｍ細胞を通過できないこと、サルモネラ菌（Ty21a-DH）は侵入できるが通過量は１４分の１程度まで低下することが分かる。

２時間後、細胞周辺のゲンタマイシンを滅菌PBSで３回洗浄する。細胞内に生きている細菌を取り出すため、界面活性剤Triton-X 100 0.1％溶液でＭ細胞を溶解させ、細菌を回収。滅菌PBSで希釈系列を作成し、TSA寒天培地に接種した。３７℃の恒温培養器内に１８時間静置。発育してきた細菌のコロニーをカウントし、希釈倍率を加味して、Ｍ細胞内に侵入した細菌を定量検出した。

Ｍ細胞に侵入後のサルモネラ菌（Ty21a-DH）の消長
ヒトの上皮細胞内及び赤血球内のガラクトース濃度は通常０．０１％と言われている。上記試験管内の実験から０．１％でサルモネラ菌（Ty21a-DH）の発育抑制が認められたが、細胞内においては０．０１％ガラクトース濃度でも発育抑制があることをＭ細胞内に侵入したサルモネラ菌（Ty21a-DH）の時間経過と共に減少していくことで確認した。
具体的には、Transwell（登録商標）を２つ用意し、細菌を接種後１時間および２時間で、上記で記載の方法を用いてＭ細胞に残存する細菌を定量検出する。
対照としてサルモネラ・チフス菌(Ty2)を用いて観察した。
結果を図１０に示す。この図１０から、サルモネラ菌（Ty2）については侵入後、２時間経過した時点で１時間経過時の２５倍まで増殖し、サルモネラ菌（Ty21a-DH）については２時間経過した時点でほぼ消滅したことが分かる。

ＤＣ細胞に貪食された後のサルモネラ菌Ty21a-DHの消長
Transwell（登録商標）に下層に配置したＤＣ細胞（抗原提示貪食細胞）内においてサルモネラ菌（Ty21a）が死滅することを確認した。
具体的には、ヒトから採取されたマクロファージをサイトカインGM-CSFおよびIL-4を培養液に加え, ３７℃、５％炭酸ガスの培養器で４８時間静置した。
培養容器内に浮遊している細胞をＤＣ細胞と見做し、細胞を回収後、新たな培養容器に接種した。この操作を数回繰り返した細胞をＤＣ細胞として見做し、１０^６個/mlをTranswell（登録商標）の下層に２ｍｌ加えた。この構成によりＭ細胞シートを通過してくる細菌はTranswell（登録商標）下層の培養液の中とＤＣ細胞に貪食される細菌とに分かれる。これらの細菌数を継時的に計数する。計数方法は上記に記載した方法に準じるがＭ細胞の代わりにＤＣ細胞とする。
対照としてサルモネラ・チフス菌(Ty2)を用いて観察した。
結果を図１１に示す。

サルモネラ菌（Ty21a-DH）通過（侵入）によりＭ細胞で増加するガレクチン-９
上記で作成されたＭ細胞シートにサルモネラ菌（Ty21a-DH）５×１０^８個をシートの上から加え、３７℃、５％炭酸ガスの培養条件で１時間静置した。
ＰＢＳで細菌を洗い流し、２％パラホルムアルデヒドで１時間固定、再度ＰＢＳでパラホルムアルデヒドを洗い流した。ブロッキング試薬で非特異的反応をブロックし、一次抗体としてガレクチン-9抗体を抗体希釈液で１０００倍に希釈した。この溶液を上下層に加え、４℃で振盪させながら４８時間反応させた。
TBST洗浄溶液で余分な抗体を洗い流し、蛍光色素標識の２次抗体を１時間作用させ、余分な抗体を洗い流す。上下層に蒸留水を加え、共焦点顕微鏡で観察し、ガレクチン−９の発現の増加を確認した。
結果を図１２に示す。この図１２から、サルモネラ菌（Ty21a-DH）から分泌したガレクチン−９がＭ細胞内で保持されていることが分かる。

サルモネラ菌（Ty21a-DH）通過（侵入によりＭ細胞で増加するLTβＲ
同様に１次抗体としてLTβＲ抗体を加え、同様に、共焦点顕微鏡で観察し、LTβＲの発現の増加を確認した。
結果を図１３に示す。この図１３から、LTβR抗体もガレクチン−９と同様に、Ｍ細胞内で保持されていることが分かる。

本発明に係るサルモネラ菌（Ty21a-DH）は、その用途をＭ細胞の機能の改善に特化することで、今までに想定することができなかった効果を発揮する。したがって、食物アレルギーやアトピー性皮膚炎などの治療薬、更にはＭ細胞ポケットおよびパイエル板の局所的な抗炎症作用を期待した治療法の開発が可能となる。

また、シート状Ｍ細胞を利用することで、人工微小器官(Gut-On-Chip）を構築し、Ｍ細胞と免疫細胞の動態を観察できる装置の開発も可能となる。
例えば、Ｍ細胞とＭ細胞ポケットにリンパ球やマスト細胞、マクロファージの集簇を再現することが可能となる。この人工微小器官の上層を腸管内部、下層を腸リンパ管として見做し、上層から様々な腸内常在菌、乳酸菌、病原菌および食物消化物を投与し、下層には食物アレルギー患者から採取した血液の免疫細胞を循環させることにより免疫細胞の挙動、サイトカインの増減およびＭ細胞の形態を共焦点顕微鏡観察下で生きている細胞観察が可能となる。これらの一連のＭ細胞の観察は今後の腸管免疫の理論形成に重要な示唆を与えることに貢献できる。

Ｍ細胞に取り込まれ、ガレクチン−９の結合が免疫寛容を誘導しているのであれば、細胞間のタイトジャンクションを通過してきた細菌や消化食物はガレクチン-９が結合しないまま免疫に認識され、結果として炎症を惹起すると考えられる。

例えば、小麦粉に含まれるグルテンは細胞接着部位（タイトジャンクション）に結合し、細胞間の結合を開くことにより体内に入りアレルギーを引き起こす食物アレルギー（Ciliac病）として知られている。また、粉ミルクに混在しているCronobacter sakazakiiが細胞間接着を破壊し、その間を通過するという報告から牛乳アレルギーの誘因因子としての可能性がある。これらの検証もＭ細胞株を用いた人工微小器官(Gut-On-Chip）にヒト免疫細胞を循環させるシステムを用いて検証可能となる。

Claims

Ｍ細胞（Microfold cell）の機能強化用サルモネラ菌であって、このサルモネラ菌はＭ細胞に侵入可能であり、且つ病原性サルモネラ菌（Ty2）が突然変異した無害化サルモネラ菌（Ty21a）にガレクチン−９を産生する遺伝子が組み込まれたサルモネラ菌（Ty21a-DH）であり、Ｍ細胞への侵入能力は病原性サルモネラ菌（Ty2）より劣るが維持しており、Ｍ細胞内では増殖しないことを特徴とするサルモネラ菌。
人工微小器官または人工皮膚用のシート状Ｍ細胞であって、このシート状Ｍ細胞は無害化サルモネラ菌（Ty21a）にガレクチン−９を産生する遺伝子が組み込まれたサルモネラ菌（Ty21a-DH）を侵入させたことで、Ｍ細胞の機能強化に必要なガレクチン−９の発現が増強していることを特徴とするシート状Ｍ細胞。