TWI692525B

TWI692525B - 重組李斯特菌疫苗菌株及產製該菌株之方法

Info

Publication number: TWI692525B
Application number: TW104112751A
Authority: TW
Inventors: 亞努瓦勒巧; 羅柏特派提特
Original assignee: 美商艾德凡斯有限公司
Priority date: 2014-04-24
Filing date: 2015-04-21
Publication date: 2020-05-01
Also published as: SG11201608820WA; TW202041671A; BR112016024352A2; EP3134510A4; JP7009061B2; US20190240303A1; CA2946716A1; JP2020099352A; TW201546276A; KR20160145627A; EP3134510A1; SG10202011841WA; KR102491332B1; KR20220021021A; AU2015250111A1; MA39849A; JP2022105768A; JP2017513502A; CN106459887A; US10258679B2

Abstract

本發明提供了針對腫瘤或癌症的治療、預防及誘導免疫反應的方法，其包括投與一重組李斯特菌菌株至一個體之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一編碼可部分修補PrfA功能之突變型PrfA蛋白質的核酸。

Description

重組李斯特菌疫苗菌株及產製該菌株之方法

跟隨著高致癌風險的人類乳突狀瘤病毒(HR-HPV)型式的持續性感染被認為是必然(但不充分)的子宮頸侵襲性癌(ICC)病因。HPV 16及18為最普遍的惡性病變類型，佔ICC的70%以上，且超過高變質度前期病變的50%以上。HR-HPV E6及E7蛋白質係在非典型增生及惡性腫瘤中持續表現，分別破壞細胞週期調節蛋白p53及pRb。由非典型增生及侵襲性惡性病變所強制表現的E6及E7，以及這些蛋白質的病毒來源，使其成為極好的HPV治療性疫苗的靶標。

單核球增多性李斯特菌(Lm)係為一種經由食物傳染的革蘭氏陽性細菌，其有時可在人類中造成疾病，特別是老年人、新生兒、孕婦及免疫力低下的個體。除了會強烈活化先天性免疫及誘導細胞素反應以增強抗原表現細胞(APC)功能外，Lm具有在從吞噬溶酶體逃逸後於APC的胞質液中複製的能力，這主要係通過李斯特菌溶解素O(LLO)蛋白質的作用。這種獨特的細胞內生命週期讓由Lm分泌的抗原在MHC I及II類分子的範圍下被處理及呈現，導致強力的細胞毒性CD8⁺及Th1型CD4⁺ T細胞介導的免疫反應。Lm已在臨床前模式中作為癌症免疫治療的載體被廣泛研究。以Lm-LLO-E7免疫接種之小鼠誘導了表現E7的已建立腫瘤的消退並授予長期的保護。Lm-LLO-E7的治療功效係與其誘導E7特異性CTL的能力相互關聯，CTL係滲透於腫瘤位置及成熟樹突狀細胞、降低腫瘤內調節 CD4⁺ CD25⁺ T細胞的數量並抑制腫瘤血管生成。

Lm作為疫苗載體亦具有一些先天的優點。該細菌在體外無特殊要求而可非常有效地生長且其缺少LPS(在諸如沙門氏菌之革蘭氏陰性細菌中的一種主要毒性因子)。基因性減毒Lm載體亦提供額外的安全性，因為其可輕易地以抗生素消滅，以防嚴重的不良影響，且不像一些病毒載體，其不會發生遺傳物質整合入宿主基因體的情形。然而，總有關於活細菌疫苗(諸如Lm)的安全性重大考量，特別是關於其減毒的機制。

PrfA蛋白質係控制包括Lm所需的必要毒力基因之調節子的表現以繁殖於其脊椎動物宿主內；因此prfA突變強烈地損害了PrfA活化PrfA依賴型毒力基因的表現之能力。本發明藉由提供一在pGG55質體中攜載可修補部分PrfA功用的突變型prfA(D133V)基因之prfA突變型李斯特菌而解決了這問題。

於一實施例中，本發明係有關一種重組李斯特菌菌株，該重組李斯特菌菌株包括一重組核酸，該重組核酸包括一編碼一重組多肽之第一開放讀碼框架，該重組多肽包括融合至一異源抗原或其片段的一LLO蛋白質的N端片段，且其中該重組核酸更包括一編碼一突變型PrfA蛋白質之第二開放讀碼框架。

於一實施例中，本發明係有關一種重組李斯特菌菌株，該重組李斯特菌菌株包括一重組核酸，該重組核酸包括一編碼一重組多肽之第一開放讀碼框架，該重組多肽包括融合至一異源抗原或其片段的一LLO蛋白質的N端片段，且其中該重組核酸更包括一編碼一突變型PrfA蛋白質之第二開放讀碼框架，且其中該李斯特菌包括在prfA基因中的基因體突變或缺失。於另一實施例中，由該第二開放讀碼框架所編碼的突變型PrfA蛋白質補充了在該李斯特菌菌株的PrfA蛋白質中之基因體突變或缺失。於另一實施例中，由該第二開放讀碼框架所編碼的突變型PrfA蛋白質修補了在該李斯特菌菌株中的部分PrfA功能。

於一實施例中，本發明係有關一種針對個體腫瘤或癌症誘導免疫反應之方法，該方法包括向該個體投與一包括重組核酸的重組李斯特菌菌株之步驟，該重組核酸包括編碼一重組多肽之第一開放讀碼框架，該重組多肽包括融合至一異源抗原或其片段的一LLO蛋白質的N端片段，且其中該重組核酸更包括一編碼一突變型PrfA蛋白質之第二開放讀碼框架，藉以針對腫瘤或癌症誘導免疫反應。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括在prfA基因中的基因體突變或缺失。

本發明之其他特徵及優點將自以下詳細描述實例及圖式而變得顯而易見。然而，應瞭解在指示本發明之較佳實施例時，詳細描述及特定實例僅以說明的方式給出，此係因為熟習此項技術者根據此詳細描述將易於清楚在本發明之精神及範疇內的各種改變及修改。

在說明書的結論部分特別指出並明確主張本發明之標的。然而，通過參考以下詳細描述並同時閱讀附圖，可最好地理解本發明的組織和操作方法以及其目的、特徵和優點，其中：圖1係顯示Lm-E7及Lm-LLO-E7使用不同表現系統來表現並分泌E7。Lm-E7藉由將基因卡匣引入單核球增多性李斯特菌基因體之orfZ結構域中而產生(A)。hly啟動子驅動hly信息序列及LLO之前五個胺基酸(AA)繼而HPV-16 E7之表現。B)，Lm-LLO-E7藉由用質體pGG-55轉型prfA-菌株XFL-7而產生。pGG-55具有驅動LLO-E7之非溶血性融合體之表現的hly啟動子。pGG-55亦含有prfA基因以在活體內選擇由XFL-7保留的質體。

圖2係顯示Lm-E7及Lm-LLO-E7分泌E7。Lm-Gag(泳道1)、Lm-E7(泳道2)、Lm-LLO-NP(泳道3)、Lm-LLO-E7(泳道4)、XFL-7(泳道5)及10403S(泳道6)在Luria-Bertoni培養液中在37℃下隔夜生長。使相等數目之細菌(如由OD在600nm下吸光度測定)沈澱成粒，且使18ml各上清液經TCA沈澱。E7表現係利用西方墨點法分析。墨點依序用抗E7 mAb(單抗)及HRP接合之抗小鼠(Amersham)進行探針探查，且接著使用ECL偵測試劑顯影。

圖3係顯示LLO-E7融合體之腫瘤免疫治療功效。其顯示了小鼠中之在腫瘤接種後7、14、21、28及56天時的腫瘤大小(以毫米為單位)。未處理小鼠：空心圓形；Lm-LLO-E7：實心圓形；Lm-E7：正方形；Lm-Gag：空心菱形；及Lm-LLO-NP：實心三角形。

圖4係顯示來自經Lm-LLO-E7免疫接種之小鼠之脾細胞在暴露於TC-1細胞時增殖。C57BL/6小鼠用Lm-LLO-E7、Lm-E7或對照rLm菌株免疫接種並加強。脾細胞在加強後6天收集且以所示比率與經輻射照射的TC-1細胞一起塗盤。細胞用³H胸苷脈衝處理並收集。Cpm係定義為(實驗性cpm)-(無TC-1對照)。

圖5係顯示：A.在投與TC-1腫瘤細胞且隨後投與Lm-E7、Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7或無疫苗(未處理)之小鼠中，脾臟中E7特異性之分泌IFN-γ之CD8⁺T細胞之誘導及滲入腫瘤的數目。B.針對A所述之小鼠之脾臟及腫瘤中E7特異性CD8⁺細胞之誘導及滲入。

圖6係顯示含有PEST區之李斯特菌構築體誘導腫瘤內較高百分比之E7特異性淋巴細胞。A.來自1次實驗之代表性資料。B.來自所有3次實驗之資料之平均值及SF。

圖7A係顯示重組李斯特菌疫苗載體在細菌負荷(毒性)上的繼代效果。上圖：Lm-Gag。下圖：Lm-LLO-E7。圖7B係顯示重組Lm-E7在脾臟中的細菌負荷繼代效果。其描繪了來自4隻小鼠的脾臟均質物中每毫升的活細菌平均CFU。

圖8係顯示於投與經繼代的Lm-Gag後對投與未經繼代的Lm-Gag後針對HIV-Gag及LLO誘導抗原特異性CD8⁺ T細胞的結果。小鼠係以10³(A、B、E、F)或10⁵(C、D、G、H)CFU的經繼代李斯特菌疫苗載體免疫接種，並分析抗原特異性T細胞。B、D、F、H：未經繼代的李斯特菌疫苗載體。A-D：對MHC I類HIV-Gag肽的免疫反應。E-H：對LLO肽的免疫反應。I：來自以10⁵CFU的經繼代Lm-Gag免疫接種之小鼠的脾細胞經以來自HPV E7的對照肽刺激。

圖9A係顯示在LB穩定性研究中的質體分離情形。圖9B係顯示在TB穩定性研究中的質體分離情形。圖9C係顯示TB穩定性的定量分析。

圖10係顯示來自生長在LB中的細菌之可耐受氯黴素(CAP)及CAP敏感型活細菌的群落形成單位(CFU)數目。深色長條區域：CAP⁺；白色長條區域：CAP^-。每一時間點的兩個深色長條區域及兩個白色長條區域係表示二重複的樣本。

圖11係顯示來自在TB中生長的細菌之可耐受CAP及CAP敏感型活細菌之CFU數目。深色長條區域：CAP⁺；白色長條區域：CAP^-。每一時間點的兩個深色長條區域及兩個白色長條區域係表示二重複的樣本。

圖12係說明顯示D133V突變區域(箭頭處)之實際層析圖。混合物比例係顯示於括號中。

圖13係描述ADV451、452與453引子的位置以及在反應中prfA基因擴增的區段。

圖14係顯示使用引子ADV451及ADV453的PCR反應的特異性。

圖15係顯示使用引子ADV452及ADV453的PCR反應的特異性。

圖16係顯示使用引子ADV452及1奈克(ng)做為DNA起始數量以偵測野生型prfA序列之PCR反應的靈敏度。

圖17係顯示使用引子ADV452及5奈克做為DNA起始數量以偵測野生型prfA序列之PCR反應的靈敏度。

圖18係顯示描述於圖16中的PCR之吸光帶平均密度。

圖19係顯示描述於圖17中的PCR之吸光帶平均密度。

圖20係顯示使用引子ADV452以偵測野生型prfA序列之PCR反應核驗。

圖21係顯示描述於圖16中的PCR之吸光帶平均密度。

圖22係顯示Lm-LLO-E7中的D133V prfA突變分析結果。A：用於密度測定的原始影像；B：影像係經數位強化以促使低密度吸光帶的顯像。

應理解為了使圖式簡單清晰，圖中顯示的元件不一定是按比例繪製的。例如，為了清晰起見，一些元件的尺寸相對於其他元件被放大。此外，在考慮合適的地方，附圖標記可以在圖中重複使用，以指明對應的或類似的元件。

本發明於一實施例中提供了一種重組李斯特菌菌株，該重組李斯特菌菌株包括一重組核酸，該核酸包括一編碼一重組多肽之第一開放讀碼框架，該重組多肽包括融合至一異源抗原或其片段的一LLO蛋白質的N端片段，其中該重組核酸更包括一編碼一突變型PrfA蛋白質之第二開放讀碼框架，且其中該李斯特菌包括在prfA基因中的基因體突變或缺失。於另一實施例中，由該第二開放讀碼框架所編碼的突變型PrfA蛋白質補充了在該李斯特菌菌株的PrfA蛋白質中的基因體突變或缺失。於另一實施例中，由該第二開放讀碼框架所編碼的突變型PrfA蛋白質修補了在該李斯特菌菌株中的部分PrfA功能。於一實施例中，由該第二開放讀碼框架所編碼的突變型PrfA蛋白質係包括在位置133的點突變。於另一實施例中，該PrfA胺基酸序列在殘基133上的突變係由胺基酸D或Asp或Aspartate(天冬胺酸鹽，或Aspartic acid(天冬胺酸))突變為胺基酸V或Val或Valine(纈氨酸)。

本發明更提供一種包括本文中所提供的重組李斯特菌菌株之免疫原性組合物以及其使用方法，該等方法包含針對一疾病進行治療、預防以及誘導免疫反應，其中在一些實施例中，該疾病為腫瘤或癌症。

本發明亦提供用以在一個體中誘導抗疾病的細胞毒性T細胞(CTL)反應，以及治療病症及與該疾病相關的症狀之方法，該等方法包括投與本文中所提供的重組李斯特菌菌株，其中於一些實施例中該疾病為腫瘤或癌症。

於另一實施例中，本文中所提供的重組李斯特菌係為經減毒的李斯特菌。「減毒」及「經減毒的」可涵蓋經修飾以減少對宿主之毒性的細菌、病毒、寄生菌、傳染性生物體、普里昂蛋白、腫瘤細胞、該傳染性生物體內的基因及其類似物。宿主可為人類宿主或動物宿主或器官、組織或細胞。列舉一非限定性實例，細菌可經減毒的以減少對宿主細胞的結合、減少自一宿主細胞向另一宿主細胞的傳播、減少細胞外生長或減少於宿主細胞內之細胞內生長。減毒可藉由量測(例如)毒性指標(indicum或indicia)、LD₅₀、自器官清除之比率或競爭指數來評定(參見，例如Auerbuch等人，(2001)Infect.Immunity 69：5953-5957)。一般而言，減毒導致LD₅₀增加及/或清除比率增加至少25%，更一般地至少50%、最一般地至少100%(2倍)、普遍地至少5倍、更普遍地至少10倍、最普遍地至少50倍、經常至少100倍、更經常至少500倍且最經常至少1000倍、通常至少5000倍、更通常至少10,000倍、且最通常至少50,000倍、且最經常至少100,000倍。

熟習此項技術者將充分瞭解術語「經減毒之基因」可涵蓋調節宿主之毒性、病理學或病毒性、在宿主體內之生長或在宿主體內之存活的基因，其中該基因以減輕、降低或消除毒性、病理學或毒力的方式突變。降低或消除可藉由將突變基因調節之毒力或毒性與未突變(或親代)基因調節之毒力或毒性相比較來評定。「突變基因」涵蓋基因之調節區、基因之編碼區、基因之非編碼區或該等區之任何組合內之缺失、點突變及讀框轉移突變。

於一實施例中，本文中所提供者為一種用以在一個體中針對腫瘤或癌症誘導免疫反應之方法，該方法包括對該個體投與一包括本文中所提供的重組李斯特菌菌株之組合物的步驟，藉以針對腫瘤或癌症誘導免疫反應。

於一實施例中，本發明提供一種在一個體中治療腫瘤或癌症之方法，包括對該個體投與一包括本文中所提供的重組李斯特菌菌株之組合物的步驟。於另一實施例中，本發明提供一種保護一個體預防腫瘤或癌症之方法，包括對該個體投與本文中所提供的重組李斯特菌菌株。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽之質體。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一在prfA基因中的基因體突變或缺失。

於一實施例中，本文中所提供的方法更包括以一包括本發明的重組李斯特菌菌株之組合物增強一個體的步驟。於另一實施例中，該方法更包括以一包括本文中所提供的異源抗原或其片段之免疫原性組合物增強該個體的步驟。於另一實施例中，該方法更包括以一包括引導該個體的細胞表現該異源抗原之免疫原性組合物增強該個體的步驟。於另一實施例中，該細胞為腫瘤細胞。於另一實施例中，該細胞為表現抗原的細胞。於另一實施例中，該方法更包括以一包括本發明的重組李斯特菌菌株之疫苗增強該個體的步驟。

於一實施例中，在本文中所提供的LLO蛋白質及ActA蛋白質的上下文中的片段係指包括該LLO或ActA蛋白質的至少5個相連胺基酸殘基的胺基酸序列之肽或多肽。於另一實施例中，該術語係指包括該胺基酸序列中的至少10個相連胺基酸殘基、至少15個相連胺基酸殘基、至少20個相連胺基酸殘基、至少25個相連胺基酸殘基、至少40個相連胺基酸殘基、至少50個相連胺基酸殘基、至少60個相連胺基酸殘基、至少70個相連胺基酸殘基、至少80個相連胺基酸殘基、至少90個相連胺基酸殘基、至少100個相連胺基酸殘基、至少125個相連胺基酸殘基、至少150個相連胺基酸殘基、至少175個相連胺基酸殘基、至少200個相連胺基酸殘基、至少250個相連胺基酸殘基中之至少一者的胺基酸序列之肽或多肽，或LLO或ActA或多肽中的至少300個相連胺基酸殘基、至少350個相連胺基酸殘基、至少400個相連胺基酸殘基或至少450個相連胺基酸殘基的胺基酸序列之肽或多肽。

於另一實施例中，「片段」係為一包括生物活性(例如當單獨投藥時或如本文進一步所述的融合蛋白的上下文中投藥時，誘發針對由腫瘤細胞表現的異源抗原的免疫反應，或者當單獨施用或者當在融合蛋白的上下文中施用如本文進一步所述)之功能性片段。於另一實施例中，該片段在非融合形式中係有功能性的。

本發明於某些實施例中提供了與李斯特菌異源的核酸密碼子最佳化，或李斯特菌內源性的核酸密碼子最佳化。單核球增多性李斯特菌對於每一胺基酸所用的最佳密碼子係顯示於美國專利公開案第2007/0207170號中，其係以引用方式併入本文中。若核酸中的至少一密碼子係經以單核球增多性李斯特菌對於該胺基酸比在原本序列中的密碼子更為頻繁使用的密碼子替代，該核酸係經密碼子最佳化。

本文中所提供的N端LLO蛋白質片段以及異源性抗原於一實施例中係直接彼此融合。於另一實施例中，編碼該N端LLO蛋白質片段及該異源抗原之該等基因係直接彼此融合。於另一實施例中，該N端LLO蛋白質片段及該異源抗原係通過一連接肽而附接。於另一實施例中，該N端LLO蛋白質片段及該異源抗原係通過一異源肽而附接。於另一實施例中，該N端LLO蛋白質片段為該異源抗原的N端。於另一實施例中，該N端LLO蛋白質片段為該融合蛋白的最N端部分。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

如本文中所提供的，表現LLO-抗原融合體的重組李斯特菌菌株係誘導抗腫瘤免疫性(實例1)，誘發抗原特異性T細胞增殖(實例2)，產生抗原特異性及腫瘤浸潤性T細胞(實例3)。

於另一實施例中，本發明提供一種在一個體中治療腫瘤或癌症之方法，該方法包括向該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一重組多肽，該重組多肽包括LLO蛋白質的N端片段以及HPV E7抗原，以藉該重組李斯特菌菌株針對E7抗原誘導免疫反應，藉以在個體中治療腫瘤或癌症。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽之質體。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於一實施例中，術語「重組多肽」及「融合蛋白」在本文中係可互換使用。

於另一實施例中，本發明提供一種保護一個體預防腫瘤或癌症之方法，該方法包括向該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一重組多肽，該重組多肽包括LLO蛋白質的N端片段以及HPV E7抗原，以藉該重組李斯特菌菌株針對E7抗原誘導免疫反應，藉以保護個體預防腫瘤或癌症。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽之質體。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明提供一種在一個體中針對腫瘤或癌症誘導免疫反應之方法，該方法包括向該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一重組多肽，該重組多肽包括LLO蛋白質的N端片段以及HPV E7抗原，藉以在個體中針對腫瘤或癌症誘導免疫反應。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽之質體。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明提供一種在一個體中治療腫瘤或癌症之方法，該方法包括向該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一重組多肽，該重組多肽包括ActA蛋白質的N端片段以及異源抗原，以藉該李斯特菌菌株針對該異源抗原誘導免疫反應，藉以在個體中治療腫瘤或癌症。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽之質體。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明提供一種保護一個體預防腫瘤或癌症之方法，該方法包括向該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一重組多肽，該重組多肽包括一ActA蛋白質的N端片段以及一異源抗原，以藉該重組李斯特菌菌株針對該異源抗原誘導免疫反應，藉以保護個體預防腫瘤或癌症。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽之質體。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明提供一種在一個體中針對腫瘤或癌症誘導免疫反應之方法，該方法包括向該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一重組多肽，該重組多肽包括一異源蛋白質的N端片段以及一異源抗原，藉以在個體中針對腫瘤或癌症誘導免疫反應。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽之質體。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

該N端ActA蛋白質片段以及該異源性抗原於另一實施例中係直接彼此融合。於另一實施例中，編碼該N端ActA蛋白質片段及該異源抗原之該等基因係直接彼此融合。於另一實施例中，該N端ActA蛋白質片段及該異源抗原係通過一連接肽而附接。於另一實施例中，該N端ActA蛋白質片段及該異源抗原係通過一異源肽而附接。於另一實施例中，該N端ActA蛋白質片段為該異源抗原的N端。於另一實施例中，該N端ActA蛋白質片段為該融合蛋白的最N端部分。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明提供一種在一個體中針對腫瘤或癌症誘導免疫反應之方法，該方法包括向該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一重組多肽，該重組多肽包括一含有PEST胺基酸序列的肽以及一異源抗原，以藉該重組李斯特菌菌株針對該異源抗原誘導免疫反應，藉以在個體中治療腫瘤或癌症。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現該重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽之質體。於另一實施例中，該方法係保護一個體預防腫瘤或癌症。於另一實施例中，該方法於該個體中治療腫瘤或癌症。

該含有PEST胺基酸序列的肽以及該異源性抗原於另一實施例中係直接彼此融合。於另一實施例中，編碼該含有PEST胺基酸序列的肽及該異源抗原之該等基因係直接彼此融合。於另一實施例中，該含有PEST胺基酸序列的肽及該異源抗原係通過一連接肽而附接。於另一實施例中，該含有PEST胺基酸序列的肽及該異源抗原係通過一異源肽而附接。於另一實施例中，該含有PEST胺基酸序列的肽為該異源抗原的N端。於另一實施例中，該含有PEST胺基酸序列的肽為該融合蛋白的最N端部分。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明提供一種用以針對HPV疫苗接種一個體之方法，該方法包括向該個體投與本文中所提供的prfA變異型重組李斯特菌菌株之步驟，該李斯特菌係表現HPV抗原且其中該李斯特菌包括一表現變異型PrfA蛋白質之質體。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係表現一包括該HPV抗原之重組多肽。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽之質體。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本文中所提供者係為一在個體的脾臟及腫瘤微環境中增加T效應細胞對調節性T細胞(Tregs)之比例的方法，包括投與本文中所提供的免疫原性組合物。於另一實施例中，在個體中的脾臟及腫瘤微環境中增加T效應細胞對調節性T細胞(Tregs)之比例係致使在該個體中有更強烈的抗腫瘤反應。

於一實施例中，本文中所提供的突變型PrfA蛋白質係包括D133V胺基酸突變。於另一實施例中，該突變型PrfA蛋白質係由D133V胺基酸突變組成。於另一實施例中，一包括編碼本文中所提供的突變型PrfA蛋白質的開放讀碼框架之核酸係為一在該重組李斯特菌中的質體。於另一實施例中，該包括一編碼本文中所提供的突變型PrfA蛋白質的核酸之質體係為一整合性質體。於另一實施例中，該包括一編碼本文中所提供的突變型PrfA蛋白質的核酸之質體係為一游離或染色體外質體。

於一實施例中，本文中所提供的prfA突變型重組李斯特菌係包括該染色體prfA基因上的部分缺失或完全缺失。於另一實施例中，該prfA突變型李斯特菌係包括該prfA基因上的功能喪失型突變。

於一實施例中，本文中所提供的突變型PrfA蛋白質係補充了在一重組李斯特菌中prfA基因上的基因體缺失、不活化或突變。於另一實施例中，本文中所提供的突變型PrfA蛋白質係補充了在本文中所提供的重組李斯特菌中prfA基因上的基因體缺失、不活化或突變。於另一實施例中，本文中所提供的突變型PrfA蛋白質修補了在一包括prfA基因的基因體缺失、不活化或突變之重組李斯特菌中的部分PrfA功能。於另一實施例中，本文中所提供的突變型PrfA蛋白質修補了在一重組李斯特菌中的PrfA喪失型功能。

於一實施例中，一野生型PrfA蛋白質係由陳述於SEQ ID NO：31中的下列野生型核酸序列所編碼：

(SEQ ID NO：31)。

於一實施例中，一野生型PrfA蛋白質係包括陳述於SEQ ID NO：32中的胺基酸序列：

(SEQ ID NO：32)。

於一實施例中，一編碼突變型prfA序列之核酸序列係陳述於SEQ ID NO：33中：

(SEQ ID NO：33)

於一實施例中，本文中所提供的突變型PrfA蛋白質序列係包括一陳述於SEQ ID NO：34中之核酸序列：

(SEQ ID NO：34). 於另一實施例中，SEQ ID NO：34代表一包括D133V突變之突變型PrfA蛋白質。於另一實施例中，突變型PrfA蛋白質係與SEQ ID NO：34同源且包括D133V突變。於另一實施例中，突變型PrfA蛋白質係至少有90%與SEQ ID NO：34同源且包括D133V突變。於另一實施例中，突變型PrfA蛋白質係至少有85%與SEQ ID NO：34同源，並包括D133V突變。

於另一實施例中，該個體係處於發生HPV所介導之癌症發生(例如子宮頸、頭頸或肛門癌)風險中。於另一實施例中，該個體係呈HPV陽性。

於另一實施例中，該個體係表現了子宮頸上皮內腫瘤。於另一實施例中，該個體係表現了鱗狀上皮內病變。於另一實施例中，該個體係表現了在子宮頸內的非典型增生。

HPV為本發明該等方法之靶標，且於另一實施例中其為HPV 16。於另一實施例中，該HPV為HPV-18。於另一實施例中，該HPV係選自HPV-16及HPV-18。於另一實施例中，該HPV為HPV-31。於另一實施例中，該HPV為HPV-35。於另一實施例中，該HPV為HPV-39。於另一實施例中，該HPV為HPV-45。於另一實施例中，該HPV為HPV-51。於另一實施例中，該HPV為HPV-52。於另一實施例中，該HPV為HPV-58。於另一實施例中，該HPV為高危險型的HPV。於另一實施例中，該HPV為黏膜型HPV。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明提供一種針對所關注抗原疫苗接種一個體之方法，該方法包括向該個體以靜脈注射方式投與一免疫原性組合物之步驟，該免疫原性組合物包括免疫原性肽與所關注的抗原之融合體，其中該免疫原性肽係選自(a)LLO蛋白質的N端片段；(b)ActA蛋白質或其N端片段；以及(c)含有PEST胺基酸序列的肽，藉以針對所關注抗原疫苗接種個體。

於另一實施例中，本發明提供一種針對所關注抗原疫苗接種一個體之方法，該方法包括向該個體以靜脈注射方式投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一重組多肽，該重組多肽包括一融合至所關注抗原的免疫原性肽，其中該免疫原性肽係選自(a)LLO蛋白質的N端片段；(b)ActA蛋白質或其N端片段；以及(c)含有PEST胺基酸序列的肽，藉以針對所關注抗原疫苗接種個體。

於另一實施例中，本發明提供一種在一個體中針對所關注抗原誘導CTL反應之方法，該方法包括向該個體投與一包括或表現該所關注抗原之重組李斯特菌菌株之步驟，藉以在個體中針對所關注抗原誘導CTL反應。於另一實施例中，該投與步驟為靜脈注射或口服給藥。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

如本文中所提供的，表現LLO-抗原融合體的重組李斯特菌菌株係誘導抗腫瘤免疫性(實例1)，誘發抗原特異性T細胞增殖(實例2)，產生抗原特異性及腫瘤浸潤性T細胞(實例3)。因此，本發明之疫苗係有效針對HPV抗原E7及E6誘導免疫反應。

於另一實施例中，本發明提供一種用以在一個體中誘導癌症的消退之方法，該方法包括向該個體投與一包括本文中所提供的重組李斯特菌菌株的組合物之步驟。

於另一實施例中，本發明提供一種用以在一個體中降低癌症的復發發生率之方法，該方法包括向該個體投與一包括本文中所提供的重組李斯特菌菌株的組合物之步驟。

於另一實施例中，本發明提供一種用以在一個體中抑制腫瘤的形成之方法，該方法包括向該個體投與一包括本文中所提供的重組李斯特菌菌株的組合物之步驟。

於另一實施例中，本發明提供一種用以在一個體中誘導癌症的緩解之方法，該方法包括向該個體投與一包括本文中所提供的重組李斯特菌菌株的組合物之步驟。

於另一實施例中，本發明提供一種用以在一個體中阻礙腫瘤的生長之方法，該方法包括向該個體投與一包括本文中所提供的重組李斯特菌菌株的組合物之步驟。

於另一實施例中，本發明提供一種用以在一個體中减小腫瘤的大小之方法，該方法包括向該個體投與一包括本文中所提供的重組李斯特菌菌株的組合物之步驟。

於一實施例中，疾病為傳染性疾病、自體免疫疾病、呼吸系統疾病、癌前期病狀或癌症。

熟習此項技術者將充分瞭解術語「癌前期病狀」涵蓋(不限於)非典型增生、腫瘤前節結、大再生節結(MRN)、低度發育不良節結(LG-DN)、高度發育不良節結(HG-DN)、膽上皮發育不良、變異肝細胞之變異區(FAH)、變異肝細胞之節結(NAH)、染色體不平衡、端粒酶之異常活化、端粒酶之催化次單元之再表現、諸如CD31、CD34及BNH9之內皮細胞標記的表現(參見，例如Terracciano及Tomillo(2003)Pathologica 95：71-82；Su及Bannasch(2003)Toxicol.Pathol.31：126-133；Rocken及Carl-McGrath(2001)Dig.Dis.19：269-278；Kotoula等人，(2002)Liver 22：57-69；Frachon等人，(2001)J.Hepatol.34：850-857；Shimonishi等人，(2000)J.Hepatobiliary Pancreat.Surg.7：542-550；Nakanuma等人，(2003)J.Hepatobiliary Pancreat.Surg.10：265-281)。用於診斷癌症及非典型增生之方法係已揭露(參見(例如)Riegler(1996)Semin.Gastrointest.Dis.7：74-87；Benvggnu等人，(1992)Liver 12：80-83；Giannini等人，(1987)Hepatogastroenterol.34：95-97；Anthony(1976)Cancer Res.36：2579-2583)。

於一實施例中，感染性疾病為由(但不限於)以下病原體中之任一者引起的感染性疾病：BCG/結核病、瘧疾、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、三日瘧原蟲(plasmodium malariae)、間日瘧原蟲(plasmodium vivax)、輪狀病毒、霍亂、白喉-破傷風、百日咳、流感嗜血桿菌、B型肝炎、人類乳突狀瘤病毒、季節性流感、大流行性A型流感(H1N1)、麻疹及風疹、流行性腮腺炎、腦膜炎雙球菌A+C、單價、二價及三價口服脊髓灰質炎疫苗、肺炎球菌、狂犬病、破傷風類毒素、黃熱病、炭疽桿菌(Bacillus anthracis；炭疽)、肉毒桿菌毒素(Clostridium botulinum toxin；肉毒中毒)、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis；鼠疫)、重型天花(Variola major；天花)及其他相關痘瘡病毒、野兔熱弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis；野免熱)、病毒性出血熱、沙粒病毒(LCM、胡寧病毒(Junin virus)、馬秋波病毒(Machupo virus)、瓜納里托病毒(Guanarito virus)、賴薩熱(Lassa Fever)、布尼亞病毒(Bunyaviruses)(漢坦病毒(Hantaviruses)、裂谷熱(Rift Valley Fever))、黃病毒(登革熱)、絲狀病毒(埃博拉病毒(Ebola)、馬爾堡病毒(Marburg))、類鼻疽伯克霍爾德菌(Burkholderia pseudomallei)、貝納特氏立克次體(Coxiella burnetii；Q熱)、布氏桿菌種(Brucella species/brucellosis)、鼻疽伯克霍爾德氏菌(Burkholderia mallei；鼻疽)、鸚鵡熱衣原體(Chlamydia psittaci；鸚鵡熱)、蓖麻毒素(來自蓖麻(Ricinus communis))、產氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)之ε毒素(Epsilon toxin)、葡萄球菌腸毒素B(Staphylococcus enterotoxin B)、斑疹傷寒(Typhus fever；普氏立克次氏體(Rickettsia prowazekii))、其他立克次氏體(Rickettsias)、食物及水媒病原體、細菌(致瀉性大腸桿菌(Diarrheagenic E.coli)、病原性弧菌(Pathogenic Vibrios)、志賀菌種(Shigella species)、沙門氏菌BCG、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni)、小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersinia enterocolitica))、病毒(杯狀病毒(Caliciviruses)、A型肝炎、西尼羅河病毒(West Nile Virus)、拉克羅斯病毒(LaCrosse)、加利福尼亞腦炎(California encephalitis)、VEE、EEE、WEE、日本腦炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)、科薩努爾森林病毒(Kyasanur Forest Virus)、尼帕病毒(Nipah virus)、漢坦病毒(hantaviruses)、蜱傳出血熱病毒、切昆貢亞熱病毒(Chikungunya virus)、克里米亞-剛果出血熱病毒 (Crimean-Congo Hemorrhagic fever virus)、蜱傳腦炎病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、疱疹單純型病毒(HSV)、人類免疫缺乏病毒(HIV)、人類乳突狀瘤病毒(HPV))、原蟲(小球隱孢子蟲(Cryptosporidium parvum)、卡晏環孢子球蟲(Cyclospora cayatanensis)、腸蘭伯式鞭毛蟲(Giardia lamblia)、痢疾內阿米巴(Entamoeba histolytica)、弓形蟲(Toxoplasma))、真菌(小孢子蟲目(Microsporidia))、黃熱病、結核病(包括耐藥TB)、狂犬病、朊病毒、重度急性呼吸性症候群相關之冠狀病毒(SARS-CoV)、Coccidioides posadasii、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、細菌性陰道病、沙眼衣原體、細胞巨大病毒、性病性肉芽腫、杜氏嗜血桿菌(Hemophilus ducreyi)、淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhea)、蒼白密螺旋體(Treponema pallidum)、陰道毛滴蟲(Trichomonas vaginalis)或本文中未列出之本領域中已知之任何其他感染性疾病。

於另一實施例中，該傳染性疾病為家畜傳染性疾病。於另一實施例中，家畜疾病可傳染給人且稱作「人畜共通疾病(zoonotic disease)」。於另一實施例中，此等疾病包括(但不限於)口蹄疫(Foot and mouth disease)、西尼羅河病毒、狂犬病、犬小病毒(canine parvovirus)、貓白血病毒(feline leukemia virus)、馬流感病毒(equine influenza virus)、牛傳染性鼻氣管炎(infectious bovine rhinotracheitis；IBR)、假性狂犬病(pseudorabies)、經典豬瘟(classical swine fever；CSF)、由牛之牛疱疹病毒1型(BHV-1)感染引起之IBR，及豬之假性狂犬病(奧耶斯基氏病(Aujeszky's disease))、弓蟲病、炭疽、水泡性口炎病毒、馬紅球菌(rhodococcus equi)、野免熱、鼠疫(鼠疫耶爾森氏菌)、毛滴蟲。

於另一實施例中，本文中所提供的疾病係為呼吸性或發炎性疾病。於另一實施例中，該呼吸性或發炎性疾病係為慢性阻塞性肺臟疾病(COPD)。於另一實施例中，該疾病為哮喘。

於一實施例中，活減毒李斯特菌株能夠在不共同投與其他治療劑(諸如抗發炎劑或支氣管擴張劑)之情況下減輕哮喘症狀。於另一實施例中，本文提供之方法另外包含向個體共同投與一活減毒李斯特菌株及一或多種治療劑之步驟。於另一實施例中，治療劑為抗哮喘劑。於另一實施例中，藥劑為抗發炎劑、非類固醇抗發炎劑、抗生素、抗膽鹼激導性劑、支氣管擴張劑、皮質類固醇、短效β促效劑、長效β促效劑、組合吸入劑、抗組織胺劑或其組合。

於一實施例中，疾病為癌症或腫瘤。於一實施例中，該腫瘤為癌性的。於另一實施例中，利用本發明方法治療之癌症為乳癌。於另一實施例中，癌症為子宮頸癌。於另一實施例中，癌症為含Her2之癌症。於另一實施例中，癌症為黑色素瘤。於另一實施例中，癌症為胰臟癌。於另一實施例中，癌症為卵巢癌。於另一實施例中，癌症為胃癌。於另一實施例中，癌症為胰臟之癌性病變。於另一實施例中，癌症為肺腺癌。於另一實施例中，其為多形性膠質母細胞瘤。於另一實施例中，癌症為結腸直腸腺癌。於另一實施例中，癌症為肺鱗腺癌。於另一實施例中，癌症為胃腺癌。於另一實施例中，癌症為卵巢表面上皮贅生物(例如其良性、增生性或惡性變種)。於另一實施例中，癌症為口腔鱗狀細胞癌。於另一實施例中，癌症為非小細胞肺癌。於另一實施例中，癌症為子宮內膜癌。於另一實施例中，癌症為膀胱癌。於另一實施例中，癌症為頭部及頸部癌症。於另一實施例中，癌症為前列腺癌。於另一實施例中，癌症為口咽癌。於另一實施例中，癌症為肺癌。於另一實施例中，癌症為肛門癌。於另一實施例中，癌症為結腸直腸癌。於另一實施例中，所述癌症為食道癌。本發明該等方法所作為標靶的子宮頸瘤於另一實施例中係為鱗狀細胞癌。於另一實施例中，子宮頸瘤為腺癌。於另一實施例中，子宮頸瘤為腺鱗癌。於另一實施例中，子宮頸瘤為小細胞癌。於另一實施例中，子宮頸瘤為在本領域中已知的任何其它類型子宮頸瘤。

本發明該等方法所作為標靶的子宮頸瘤於另一實施例中係為鱗狀細胞癌。於另一實施例中，子宮頸瘤為腺癌。於另一實施例中，子宮頸瘤為腺鱗癌。於另一實施例中，子宮頸瘤為小細胞癌。於另一實施例中，子宮頸瘤為在本領域中已知的任何其它類型子宮頸瘤。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於一實施例中，術語「腫瘤抗原」、「抗原多肽」或「外來抗原」在本文中係可互換使用，且包含腫瘤抗原、腫瘤相關抗原、血管生成抗原或傳染性疾病抗原。於另一實施例中，本文中所提供的抗原為自體抗原，該自體抗原係存在於宿主內但宿主因免疫耐受性而未對該自體抗原引起免疫反應。

於一個實施例中，該抗原為人類乳突狀瘤病毒-E7(HPV-E7)抗原，其於一實施例中係選自HPV16(於一實施例中，GenBank寄存編號AAD33253)，且於另一實施例中係選自HPV18(於一實施例中，GenBank寄存編號P06788)。於另一實施例中，該抗原多肽為HPV-E6，其於一實施例中係選自HPV16(於一實施例中，GenBank寄存編號AAD33252、AAM51854、AAM51853或AAB67615)，且於另一實施例中係選自HPV18(於一實施例中，GenBank寄存編號P06463)。於另一實施例中，該抗原多肽為Her/2-neu抗原。於另一實施例中，該抗原多肽為前列腺特異性抗原(PSA)(於一實施例中，GenBank寄存編號CAD30844、CAD54617、AAA58802或NP_001639)。於另一實施例中，該抗原多肽為角質層胰蛋白酶(SCCE)抗原(於一實施例中，GenBank寄存編號AAK69652、AAK69624、AAG33360、AAF01139或AAC37551)。於另一實施例中，該抗原多肽為腎母細胞瘤抗原1(Wilms tumor antigen1)，其於另一實施例中為WT-1端粒酶(GenBank寄存編號P49952、P22561、NP_659032、CAC39220.2或EAW68222.1)。於另一實施例中，該抗原多肽為hTERT或端粒酶(GenBank寄存編號NM003219(變異型1)、NM198255(變異型2)、NM 198253(變異型3)或NM 198254(變異型4))。於另一實施例中，該抗原多肽為蛋白酶3(於一實施例中，GenBank寄存編號M29142、M75154、M96839、X55668、NM 00277、M96628或X56606)。於另一實施例中，該抗原多肽為酪胺酸酶相關蛋白2(TRP2)(於一實施例中，GenBank寄存編號NP_001913、ABI73976、AAP33051或Q95119)。於另一實施例中，該抗原多肽為高分子量黑色素瘤相關抗原(HMW-MAA)(於一實施例中，GenBank寄存編號NP_001888、AAI28111或AAQ62842)。於另一實施例中，該抗原多肽為睪蛋白(於一實施例中，GenBank寄存編號AAF79020、 AAF79019、AAG02255、AAK29360、AAD41588或NP_659206)。於另一實施例中，該抗原多肽為NY-ESO-1抗原(於一實施例中，GenBank寄存編號CAA05908、P78358、AAB49693或NP_640343)。於另一實施例中，該抗原多肽為PSCA(於一實施例中，GenBank寄存編號AAH65183、NP_005663、NP_082492、O43653或CAB97347)。於另一實施例中，該抗原多肽為介白素(IL)13受體α(於一實施例中，GenBank寄存編號NP_000631、NP_001551、NP_032382、NP_598751、NP_001003075或NP_999506)。於另一實施例中，該抗原多肽為碳酸酐酶IX(CAIX)(於一實施例中，GenBank寄存編號CAI13455、CAI10985、EAW58359、NP_001207、NP_647466或NP_001101426)。於另一實施例中，該抗原多肽為癌胚抗原(CEA)(於一實施例中，GenBank寄存編號AAA66186、CAA79884、CAA66955、AAA51966、AAD15250或AAA51970)。於另一實施例中，該抗原多肽為MAGE-A(於一實施例中，GenBank寄存編號NP_786885、NP_786884、NP_005352、NP_004979、NP_005358或NP_005353)。於另一實施例中，該抗原多肽為細胞凋亡抑制蛋白(於一實施例中，GenBank寄存編號AAC51660、AAY15202、ABF60110、NP_001003019或NP_001082350)。於另一實施例中，該抗原多肽為GP100(於一實施例中，GenBank寄存編號AAC60634、YP_655861或AAB31176)。於另一實施例中，該抗原多肽為本領域中已知的任一其他抗原多肽。於另一實施例中，本發明該等組合物及方法中的抗原多肽係包括該抗原多肽的免疫原性部分。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，抗原為端粒酶(TERT)。於另一實施例中，抗原為LMP-1。於另一實施例中，抗原為p53。於另一實施例中，抗原為間皮素(mesothelin)。於另一實施例中，抗原為EGFRVIII。於另一實施例中，抗原為碳酸酐酶IX(CAIX)。於另一實施例中，抗原為PSMA。於另一實施例中，抗原為HMW-MAA。於另一實施例中，抗原為HIV-1 Gag。於另一實施例中，抗原為酪胺酸酶相關蛋白2。於另一實施例中，抗原係選自Her-2、HIV-1 Gag、LMP-1、p53、PSMA、癌胚抗原(CEA)、LMP-1、血管舒緩素相關肽酶3(KLK3)、KLK9、Muc、酪胺酸酶相關蛋白2、Muc1、FAP、IL-13R α2、PSA(前列腺特異性抗原)、gp-100、熱休克蛋白質70(HSP-70)、β-HCG、EGFR-III、顆粒白血球群落刺激因子(G-CSF)、血管生成素、血管生成素-1、Del-1、纖維母細胞生長因子：酸性(aFGF)或鹼性(bFGF)、抑濾泡素、顆粒白血球群落刺激因子(G-CSF)、肝細胞生長因子(HGF)/分散因子(SF)、介白素-8(IL-8)、瘦體素、中期因子(Midkine)、胎盤生長因子、血小板衍生的內皮細胞生長因子(PD-ECGF)、血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)、多效蛋白(PTN)、前顆粒蛋白(Progranulin)、增生蛋白(Proliferin)、轉型生長因子-α(TGF-α)、轉型生長因子-β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管內皮生長因子(VEGF)/血管滲透因子(VPF)、VEGFR、VEGFR2(KDR/FLK-1)或其片段、FLK-1或其抗原決定區、FLK-E1、FLK-E2、FLK-I1、內皮糖蛋白或其片段、神經菌毛蛋白1(NRP-1)、血管生成素1(Ang1)、Tie2、血小板衍生生長因子(PDGF)、血小板衍生生長因子受體(PDGFR)、轉型生長因子-β(TGF-β)、內皮糖蛋白、TGF-β受體、單核球趨化蛋白-1(MCP-1)、VE-鈣黏素(VE-cadherin)、CD31、蝶素(ephrin)、TGF-β受體、單核球趨化蛋白-1(MCP-1)、VE-cadherin、CD31、ephrin、ICAM-1、V-CAM-1、VAP-1、E-選滯蛋白、血纖維蛋白溶酶原活化因子(plasminogen activators)、血纖維蛋白溶酶原活化抑制因子-1(plasminogen activators inhibitor-1)、一氧化氮合成酶(NOS)、COX-2、AC133，或Id1/Id3、血管生成素3、血管生成素4、血管生成素6、CD105、EDG、HHT1、ORW、ORW1或TGF-β輔受體，或其組合。於另一實施例中，抗原為嵌合Her2/neu抗原，如在美國專利申請公開案第2011/0142791號揭示，其全文係以引用方式併入本文中。本文中所提供的抗原片段的使用係亦為本發明所涵蓋。

於另一實施例中，本文提供之腫瘤抗原為腫瘤相關抗原，其於一實施例中為以下腫瘤抗原中之一者：MAGE(黑色素瘤相關抗原E)蛋白質，例如MAGE 1、MAGE 2、MAGE 3、MAGE 4、酪胺酸酶；突變體ras蛋白質；突變體p53蛋白質；p97黑色素瘤抗原、與晚期癌症相關之ras肽或p53肽；與頸癌相關之HPV 16/18抗原、與乳癌相關之KLH抗原、與結腸直腸癌相關之CEA(癌胚抗原)、與黑色素瘤相關之MART1抗原或與前列腺癌相關之PSA抗原。於另一實施例中，用於本文提供之組合物及方法之抗原為黑色素瘤相關抗原，其於一實施例中為TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、gp-100、酪胺酸酶、HSP-70、β-HCG或其組合。應瞭解，熟習此項技術者將能使用本文中未提及但在本領域中已知之任何異源抗原以用於本文提供之方法及組合物。應理解亦本發明提供(但不因此限於)一包括編碼本文所揭示的該等抗原中之至少一者之核酸的减毒李斯特菌。本發明涵蓋了編碼該等已揭示抗原之突變體、突變蛋白質、剪接變異體、片段、截斷之變異體、可溶性變異體、細胞外結構域、細胞內結構域、成熟序列以及其類似物的核酸。提供了編碼該等抗原之抗原決定基、寡肽及多肽之核酸。亦提供了密碼子最優化之實施例，也就是說，最優化在李斯特菌中的表現。所引用之參考文獻、GenBank寄存編號及本文中所揭示之核酸、肽及多肽全部係以引用方式併入本文中。於另一實施例中，所選定的核酸序列係可編碼一全長基因或一截短的基因、一融合基因或標記基因，並可為一cDNA、基因體DNA、DNA片段(較佳為cDNA)。其係可經突變或依需要而以其他方式修飾。這些修飾包含密碼子最優化以在選定的宿主細胞或細菌(即李斯特菌)中最優化密碼子的使用。經選定的序列亦可編碼一分泌型、胞質型、細胞核型、細胞膜結合型或細胞表面型多肽。

於一實施例中，血管內皮生長因子(VEGF)為一個與血小管生成(胚胎循環系統的重新形成)及血管生成(來自原有血管結構的血管之生長)二者有關之重要信息傳導蛋白質。於一實施例中，VEGF活性係主要限制於血管內皮細胞，僅管其確實在少數的其他類型細胞(例如，刺激單核白血球細胞/巨噬細胞的遷移)上具有效果。在體外，已顯示VEGF可刺激內皮細胞發生有絲分裂及細胞遷移。VEGF也增強了微血管滲透性且有時被稱為血管滲透因子。

於一實施例中，VEGF家族的所有成員係通過結合到細胞表面上的酪氨酸激酶受體(VEGFRs)來刺激細胞的反應，使其它們二聚化並通過磷酸轉移化而變成活性的。VEGF受體具有一由7個免疫球蛋白樣結構域組成的胞外部分、單個跨膜的橫跨區域以及一含有分裂酪氨酸激酶結構域的胞內部分。

於一實施例中，VEGF-A為VEGFR-2(KDR/Flk-1)配位體以及VEGFR-1(Flt-1)配位體。於一實施例中，VEGFR-2介導幾乎全部已知的對VEGF的細胞反應。VEGFR-1功能尚未明確，儘管其被認為會調節VEGFR-2的信息傳導，其於一實施例中通過螯合VEGF而防止與VEGFR-2的結合，而於一實施例中係在胚胎內的血管生成期間非常重要。於一實施例中，VEGF-C及VEGF-D為VEGFR-3的配位體，其於一實施例中介導淋巴血管生成。

於一實施例中，本發明之抗原為VEGF受體或其片段，而在一實施例中其為VEGFR-2，且於另一實施例中為VEGFR-1，並在另一實施例中為VEGFR-3。

於一實施例中，血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)係在經活化的內皮細胞(ECs)上有高度表現並參與新血管的形成。於一實施例中，VEGFR2係結合VEGF所有的5種同型異構物。於一實施例中，在ECs上通過VEGFR2的VEGF信息傳導係誘導了增殖、遷移及最終的分化。於一實施例中，VEGFR2的小鼠同系物為胎肝激酶基因-1(Flk-1)，其為一強力的治療靶標，且在腫瘤的生成、入侵及轉移中有重要的角色。於一實施例中，VEGFR2亦稱為激酶插入區域受體(一種第三型的受體酪胺酸激酶)(KDR)、分化群309(CD309)、FLK1、Ly73、Krd-1、VEGFR、VEGFR-2或6130401C07。

於其他實施例中，該抗原係源自真菌病原體、細菌、寄生蟲、蠕蟲或病毒。於其他實施例中，該抗原係選自破傷風類毒素、來自流感病毒的血凝素分子、白喉類毒素、HIV gp120、HIV gag蛋白質、IgA蛋白酶、胰島素肽B、馬鈴薯粉狀瘡痂病菌(Spongospora subterranea)抗原、弧菌抗原、沙門氏菌抗原、肺炎雙球菌抗原、呼吸道融合病毒抗原、流感嗜血桿菌外膜蛋白、幽門螺桿菌脲酶、腦膜炎雙球菌線毛蛋白、淋病雙球菌線毛蛋白、黑色素瘤相關抗原(TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、GP-100、酪胺酸酶、 MART-1、HSP-70、β-HCG)、來自HPV-16、-18、-31、-33、-35或-45類型之人類乳突狀瘤病毒的人類乳突狀瘤病毒抗原E1及E2、腫瘤抗原CEA、Ras蛋白質、突變或以其他方式、p53蛋白質、突變或以其他方式、Muc1或PSA。

於其他實施例中，該抗原係與下列疾病中之一者有關：霍亂、白喉、嗜血桿菌屬、A型肝炎、B型肝炎、流行性感冒、麻疹、腦膜炎、流行性腮腺炎、百日咳、天花、肺炎球菌性肺炎、脊髓灰質炎、狂犬病、風疹、破傷風、肺結核、傷寒、水痘-帶狀皰疹、百日咳和黃熱病、來自Addison氏病的免疫原及抗原、過敏、過敏症、Bruton氏症候群、癌症，包括實體瘤和血源性腫瘤、濕疹、橋本甲狀腺炎、多肌炎、皮肌炎、第1型糖尿病、後天性免疫缺失症候群、移植排斥(諸如腎臟、心臟、胰腺、肺、骨骼、及肝臟移植)、Grave氏病、多內分泌自體免疫疾病、肝炎、微觀多動脈炎、結節性多動脈炎、天皰瘡、原發性膽汁性肝硬變、惡性貧血、腹部疾病、抗體介導的腎炎、腎小球腎炎、風濕性疾病、系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、血清陰性脊柱關節病(seronegative spondylarthritides)、鼻炎、sjogren氏症候群、全身性硬化症、硬化性膽管炎、Wegener氏肉芽腫病、皰疹樣皮炎、牛皮癬、白癜風、多發性硬化、腦脊髓炎、Guillain-Barre二氏症候群、重症肌無力、Lambert-Eaton二氏症候群、鞏膜、鞏膜外層、眼色素層炎、慢性皮膚粘膜念珠菌病、蕁麻疹、嬰兒期暫時性低丙種球蛋白血症、骨髓瘤、X性聯遺傳過度IgM症候群、Wiskott-Aldrich二氏綜合症、運動失調性毛細血管擴張症、自身免疫性溶血性貧血、自身免疫性血小板減少症、自體免疫白血球低下症、特發性巨球蛋白血、澱粉樣變性病、慢性淋巴細胞性白血病、非Hodgkin氏淋巴瘤、瘧疾環子孢子蛋白、微生物抗原、病毒抗原、自體抗原及李斯特菌。

於另一實施例中，HPV E6抗原在本發明之方法中係用來代替E7抗原或除E7抗原外針對子宮頸癌進行治療、預防或誘導免疫反應。

於另一實施例中，ActA蛋白質片段在本發明之方法中係用來代替LLO片段或除LLO片段外針對子宮頸癌進行治療、預防或誘導免疫反應。

於另一實施例中，含有PEST胺基酸序列的蛋白質片段在本發明之方法中係用來代替LLO片段或除LLO片段外針對子宮頸癌進行治療、預防或誘導免疫反應。

於另一實施例中，本發明提供一種用以在一個體中誘導一抗E7細胞毒性T細胞(CTL)反應之方法，該方法包括向該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一重組多肽，該重組多肽包括一LLO蛋白質的N端片段以及一HPV E7抗原，藉以在個體中誘導抗E7 CTL反應。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株包括一編碼該重組多肽之質體。於另一實施例中，該方法更包括以本發明之重組李斯特菌菌株增強該個體之步驟。於另一實施例中，該方法更包括以一包括E7抗原的免疫原性組合物增強該個體之步驟。於另一實施例中，該方法更包括以一引導該個體的細胞表現E7抗原之免疫原性組合物增強該個體之步驟。於另一實施例中，該CTL反應能夠對HPV所介導的疾病、病症或症狀有治療功效。於另一實施例中，該CTL反應能夠對HPV所介導的疾病、病症或症狀有預防效果。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明提供一種在一個體中治療或改善HPV所介導的疾病、病症或症狀之方法，該方法包括向該個體投與一重組李斯特菌菌株之步驟，該重組李斯特菌菌株包括一重組多肽，該重組多肽包括一LLO蛋白質的N端片段以及一HPV E7抗原，以藉該重組李斯特菌菌株針對E7抗原誘導免疫反應，藉以在個體中治療或改善HPV所介導的疾病、病症或症狀。於另一實施例中，該個體為人類個體。於另一實施例中，該個體為非人類個體。於另一實施例中，該個體為本技術領域中已知的任一其他類型個體。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，HPV所介導的疾病、病症或症狀為生殖器疣。於另一實施例中，HPV所介導的疾病、病症或症狀為非生殖器疣。於另一實施例中，HPV所介導的疾病、病症或症狀為呼吸道乳頭狀瘤。於另一實施例中，HPV所介導的疾病、病症或症狀為本領域中已知的任一其他 HPV所介導的疾病、病症或症狀。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

本發明的該等方法及組合物的抗原於另一實施例中為HPV E7抗原。於另一實施例中，該抗原為HPV E6蛋白質。於另一實施例中，該抗原為本領域中已知的任一其他HPV蛋白質。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

「E7抗原」於另一實施例中係指E7蛋白質。於另一實施例中，該術語係指E7片段。於另一實施例中，該術語係指E7肽。於另一實施例中，該術語係指本領域中已知的任一其他類型的E7抗原。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

本發明的該等方法及組合物的E7蛋白質於另一實施例中為HPV 16 E7蛋白質。於另一實施例中，該E7蛋白質為HPV-18 E7蛋白質。於另一實施例中，該E7蛋白質為HPV-31 E7蛋白質。於另一實施例中，該E7蛋白質為HPV-35 E7蛋白質。於另一實施例中，該E7蛋白質為HPV-39 E7蛋白質。於另一實施例中，該E7蛋白質為HPV-45 E7蛋白質。於另一實施例中，該E7蛋白質為HPV-51 E7蛋白質。於另一實施例中，該E7蛋白質為HPV-52 E7蛋白質。於另一實施例中，該E7蛋白質為HPV-58 E7蛋白質。於另一實施例中，該E7蛋白質為高危險型HPV E7蛋白質。於另一實施例中，該E7蛋白質為黏膜型HPV E7蛋白質。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

「E6抗原」於另一實施例中係指E6蛋白質。於另一實施例中，該術語係指E6片段。於另一實施例中，該術語係指E6肽。於另一實施例中，該術語係指本領域中已知的任一其他類型的E6抗原。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

本發明的該等方法及組合物的E6蛋白質於另一實施例中為HPV 16 E6蛋白質。於另一實施例中，該E6蛋白質為HPV-18 E6蛋白質。於另一實施例中，該E6蛋白質為HPV-31 E6蛋白質。於另一實施例中，該E6蛋白質為HPV-35 E6蛋白質。於另一實施例中，該E6蛋白質為HPV-39 E6蛋白質。於另一實施例中，該E6蛋白質為HPV-45 E6蛋白質。於另一實施例中，該E6蛋白質為HPV-51 E6蛋白質。於另一實施例中，該E6蛋白質為HPV-52 E6蛋白質。於另一實施例中，該E6蛋白質為HPV-58 E6蛋白質。於另一實施例中，該E6蛋白質為高危險型HPV E6蛋白質。於另一實施例中，該E6蛋白質為黏膜型HPV E6蛋白質。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於一實施例中，E6和E7抗原的組係預期落入本文中所提供的「異源抗原」之範圍內。

本發明的該等方法及組合物所誘導的免疫反應於另一實施例中為T細胞反應。另一實施例中，該免疫反應包括細胞毒性T細胞反應。另一實施例中，該免疫反應包括T細胞反應。另一實施例中，該免疫反應為CD8⁺ T細胞反應。另一實施例中，該免疫反應包括CD8⁺ T細胞反應。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

本發明該等方法及組合物的N端LLO蛋白質片段於另一實施例中係包括SEQ ID No：2。於另一實施例中，該片段包括LLO信息肽。於另一實施例中，該片段包括SEQ ID No：2。於另一實施例中，該片段大約由SEQ ID No：2組成。於另一實施例中，該片段基本上係由SEQ ID No：2組成。於另一實施例中，該片段係對應SEQ ID No：2。於另一實施例中，該片段係與SEQ ID No：2同源。於另一實施例中，該片段係與SEQ ID No：2的一片段同源。於一些實例中所使用的△LLO長度為416個胺基酸(不包括信息序列)，而自胺基端包含含有胱胺酸484的活化結構域在內的88個殘基係經截斷。本領域技術人員將明白任一不具有該活化結構域(特別是不具有胱胺酸484)的△LLO係適用於本發明該等方法及組合物中。於另一實施例中，E7及/或E6抗原與任一包含PEST胺基酸序列及SEQ ID NO：1的△LLO之融合體增強了該抗原的細胞介導與抗腫瘤免疫性。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

用以構築本發明該等疫苗之LLO蛋白質於另一實施例中係具有以下序列：MKKIMLVFITLILVSLPIAQQTEAKDASAFNKENSISSMAPPASPPASPKTP

(GenBank寄存編號P13128；SEQ ID NO：3；核酸序列係陳述於GenBank寄存編號X15127中)。對應於此序列的前蛋白的前25個胺基酸為信息序列且在其由細菌分泌時自LLO裂解。因此，於此實施例中，全長活性LLO蛋白質長度為504個殘基。於另一實施例中，全長LLO蛋白質具有本領域中已知的任一全長野生型LLO蛋白質的胺基酸序列。於另一實施例中，係使用SEQ ID NO：3做為併入本發明的疫苗中之LLO片段來源。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，使用於本發明該等組合物及方法之LLO蛋白質N端片段係具有以下序列：

(SEQ ID NO： 2)。

於另一實施例中，該LLO片段係具有以下序列：

(SEQ ID NO：4)。

於另一實施例中，「李斯特菌溶解素O蛋白質」或「LLO蛋白質」係指野生型LLO蛋白質，除非已說明其為野生型LLO蛋白質的片段。於另一實施例中，「截短的LLO」或「△LLO」係指包括PEST胺基酸結構域的LLO的片段。於另一實施例中，該等術語係指一包括PEST序列的LLO片段。於另一實施例中，該等術語係指一包括推想的PEST序列之LLO片段。

於另一實施例中，該等術語係指在羧基端不含活化結構域且並不包含胱胺酸484之LLO片段。於另一實施例中，該等術語係指一非為溶血性的LLO片段。於另一實施例中，該LLO片段係通過該活化結構域的缺失或突變而變為非溶血性。於另一實施例中，該LLO片段係通過胱胺酸484的缺失或突變而變為非溶血性。於另一實施例中，該LLO片段係通過另一位置的缺失或突變而變為非溶血性。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，該LLO片段係由野生型LLO蛋白質的約前441個胺基酸組成。於另一實施例中，該LLO片段係由LLO的約前420個胺基酸組成。於另一實施例中，LLO片段為LLO蛋白質之非溶血性形式。

於另一實施例中，LLO片段係包含一對應上述該等胺基酸範圍中之一者的同源LLO蛋白質的殘基。殘基數量於一實施例中並不需要完全與上面列舉的殘基數量相符合；例如，若該同源LLO蛋白質相對於本文中所用LLO蛋白質係具有插入或缺失，那麼殘基數量係可相應地調整。

於另一實施例中，LLO片段係為本領域中已知的任一其他LLO片段。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明該等方法的重組多肽係由重組李斯特菌菌株所表現。於另一實施例中，其表現係經由該重組李斯特菌菌株攜載的核苷酸分子所介導。

於一實施例中，該重組李斯特菌菌株係藉由一編碼該重組多肽之質體而表現該重組多肽。於另一實施例中，該質體包括一編碼細菌轉錄因子之基因。於另一實施例中，該質體係編碼一李斯特菌轉錄因子。於另一實施例中，該轉錄因子為PrfA。於另一實施例中，該PrfA為突變型PrfA。於另一實施例中，該PrfA係含有一D133V胺基酸突變。於另一實施例中，該轉錄因子為本領域中已知的任一其他轉錄因子。於另一實施例中，該質體所編碼的突變型PrfA係補充了該李斯特菌中的基因體PrfA突變、缺失或不活化。於另一實施例中，該質體所編碼的突變型PrfA係修復了該具有基因體PrfA突變、缺失或不活化之李斯特菌中的部分PrfA功能。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，由本文中所提供的一重組李斯特菌所包括的質體係包括一編碼代謝酶之開放讀碼框架。於另一實施例中，該質體包括一編碼代謝酶之第三開放讀碼框架。於另一實施例中，該代謝酶為細菌代謝酶。於另一實施例中，該代謝酶為李斯特菌代謝酶。於另一實施例中，該代謝酶為胺基酸代謝酶。於另一實施例中，該胺基酸代謝基因係參與細胞壁合成路徑。於另一實施例中，該代謝酶為D-胺基酸胺基轉移酶基因(dat)的產物。於另一實施例中，該代謝酶為丙胺酸消旋酶基因(dal)的產物。於另一實施例中，該代謝酶為本領域中已知的任一其他代謝酶。於另一實施例中，該質體攜載一編碼dal蛋白質之開放讀碼框架。於另一實施例中，該質體攜載一編碼dat蛋白質之開放讀碼框架。於另一實施例中，該質體攜載一編碼dal及dat蛋白質之開放讀碼框架。於另一實施例中，於該質體攜載一編碼dal及/或dat蛋白質之開放讀碼框架時，其係補充了一重組李斯特菌菌株中的dal/dat突變。因此，dal/dat重組李斯特菌係亦可設想在本發明中使用。於另一實施例中，除了本文進一步所述的任一其他突變外，本文中所提供的重組李斯特菌係包括一dal/dat突變。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本文中所提供的李斯特菌菌株係缺乏胺基酸代謝酶。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係缺乏D-麩胺酸合成酶基因。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係缺乏dat基因。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係缺乏dal基因。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係缺乏dga基因。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係缺乏涉及二胺庚二酸(DAP)的合成之基因。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係缺乏涉及半胱胺酸合成酶A(CysK)的合成之基因。於另一實施例中，該基因係為不依賴維生素B12的甲硫胺酸合成酶。於另一實施例中，該基因係為trpA。於另一實施例中，該基因係為trpB。於另一實施例中，該基因係為trpE。於另一實施例中，該基因係為asnB。於另一實施例中，該基因係為gltD。於另一實施例中，該基因係為gltB。於另一實施例中，該基因係為leuA。於另一實施例中，該基因係為argG。於另一實施例中，該基因係為thrC。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係缺乏本文上述該等基因中之一或多者。

於另一實施例中，本文中所提供的李斯特菌菌株係缺乏一合成酶。於另一實施例中，該基因係為胺基酸合成基因。於另一實施例中，該基因係為folP。於另一實施例中，該基因係為二氫尿苷合成酶家族蛋白質。於另一實施例中，該基因係為ispD。於另一實施例中，該基因係為ispF。於另一實施例中，該基因係為磷酸烯醇丙酮酸合成酶。於另一實施例中，該基因係為hisF。於另一實施例中，該基因係為hisH。於另一實施例中，該基因係為fliI。於另一實施例中，該基因係為核醣體大次單元假尿苷合成酶。於另一實施例中，該基因係為ispD。於另一實施例中，該基因係為雙功能性GMP合成酶/麩胺酸醯胺轉移酶蛋白質。於另一實施例中，該基因係為cobS。於另一實施例中，該基因係為cobB。於另一實施例中，該基因係為cbiD。於另一實施例中，該基因係為尿紫質-III C-甲基轉移酶/尿紫質-III合成酶。於另一實施例中，該基因係為cobQ。於另一實施例中，該基因係為uppS。於另一實施例中，該基因係為truB。於另一實施例中，該基因係為dxs。於另一實施例中，該基因係為mvaS。於另一實施例中，該基因係為dapA。於另一實施例中，該基因係為ispG。於另一實施例中，該基因係為folC。於另一實施例中，該基因係為檸檬酸合成酶。於另一實施例中，該基因係為argJ。於另一實施例中，該基因係為3-去氧-7-phosphoheptulonate合成酶。於另一實施例中，該基因係為吲哚-3-甘油磷酸酯合成酶。於另一實施例中，該基因係為鄰氨基苯甲酸合成酶/麩胺酸醯胺轉移酶組成物。於另一實施例中，該基因係為menB。於另一實施例中，該基因係為甲萘醌特異性異分支酸合成酶。於另一實施例中，該基因係為磷酸核醣甲醯基甘胺脒(phosphoribosylformylglycinamidine)合成酶I或II。於另一實施例中，該基因係為磷酸核醣胺基咪唑羧酶-琥珀羧胺(phosphoribosylaminoimidazole-succinocarboxamide)合成酶。於另一實施例中，該基因係為carB。於另一實施例中，該基因係為carA。於另一實施例中，該基因係為thyA。於另一實施例中，該基因係為mgsA。於另一實施例中，該基因係為aroB。於另一實施例中，該基因係為hepB。於另一實施例中，該基因係為rluB。於另一實施例中，該基因係為ilvB。於另一實施例中，該基因係為ilvN。於另一實施例中，該基因係為alsS。於另一實施例中，該基因係為fabF。於另一實施例中，該基因係為fabH。於另一實施例中，該基因係為假尿苷合成酶。於另一實施例中，該基因係為pyrG。於另一實施例中，該基因係為truA。於另一實施例中，該基因係為pabB。於另一實施例中，該基因係為一atp合成酶基因(如atpC、atpD-2、aptG、atpA-2等)。

於另一實施例中，該基因係為phoP。於另一實施例中，該基因係為aroA。於另一實施例中，該基因係為aroC。於另一實施例中，該基因係為aroD。於另一實施例中，該基因係為plcB。

於另一實施例中，本文中所提供的李斯特菌菌株係缺乏一肽轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為ABC轉運蛋白/ATP-結合/通透酶蛋白質。於另一實施例中，該基因係為寡肽ABC轉運蛋白/寡肽-結合蛋白質。於另一實施例中，該基因係為寡肽ABC轉運蛋白/通透酶蛋白質。於另一實施例中，該基因係為鋅ABC轉運蛋白/鋅-結合蛋白質。於另一實施例中，該基因係為醣ABC轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為磷轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為ZIP鋅轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為EmrB/QacA家族的抗藥性轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為硫轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為質子依賴型寡肽轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為鎂轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為甲酸鹽/亞硝酸鹽轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為亞精胺/腐胺ABC轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為Na/Pi-共轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為醣磷轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為麩胺酸ABC轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為主要協助家族轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為甘胺酸內鹽/L-脯氨酸ABC轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為鉬ABC轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為磷壁質酸ABC轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為鈷ABC轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為氨轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為胺基酸ABC轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為細胞分化ABC轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為錳ABC轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為鐵化合物ABC轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為麥芽糖/麥芽糊精ABC轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為Bcr/CflA家族的抗藥性轉運蛋白。於另一實施例中，該基因係為上述蛋白質中之一者之次單元。

於一實施例中，本文中所提供的為一種用以將李斯特菌轉型以得到一重組李斯特菌之核酸分子。於另一實施例中，本文中所提供用以將李斯特菌轉型之核酸係缺乏毒性基因。於另一實施例中，該核酸分子係整合至該李斯特菌基因體中並攜載一無功能的毒性基因。於另一實施例中，該毒性基因係於該重組李斯特菌中突變。於另一實施例中，該核酸分子係用以使該李斯特菌基因體中表現的內源性基因不活化。於另一實施例中，該毒性基因係為actA基因、inlA基因、inlB基因、inlC基因、inlJ基因、plbC基因、bsh基因或prfA基因。本領域技術人員應理解該毒性基因係可為本領域中已知與該重組李斯特菌中之毒性相關的任一基因。

於一實施例中，本文中所提供的活減毒李斯特菌為重組李斯特菌。於另一實施例中，本文中所提供的重組李斯特菌包含基因體內化素C(inlC)基因的突變。於另一實施例中，重組李斯特菌包含基因體actA基因及基因體內化素C基因的突變或缺失。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。於一實施例中，李斯特菌向鄰近細胞之易位係通過與該過程有關的actA基因及/或inlC基因之缺失而受到抑制，藉以引起出乎意料的高程度減毒作用以及增加的免疫原性與做為菌株骨架的實用性。

熟習此項技術者將充分瞭解術語「減毒」可涵蓋細菌在動物體中造成疾病之能力的減少。換言之，例如該經减毒的李斯特菌菌株的致病特性與野生型李斯特菌相比係已減少，儘管該經减毒的李斯特菌菌株能夠在培養基中生長並維持。以該經减毒的李斯特菌菌株靜脈接種的Balb/c小鼠做一實例，50%的接種動物生存(LD₅₀)之致命劑量係在野生型李斯特菌以上較佳增加至少約10倍、更佳至少約100倍、更佳至少約1,000倍、甚至更佳至少約10,000倍以及最佳至少約100,000倍。李斯特菌的减毒菌株因而為不會殺死所投與動物之細菌，或於投與的細菌數量遠大於野生型未減毒細菌殺死相同動物的所需數量時才會殺死該動物之細菌。經减毒的細菌也應解釋為一種因為其生長所需的營養物不存在而無法在一般環境中複製之細菌。因此，該細菌僅限於在一提供有所需營養物的受控環境中複製。本發明之减毒菌株由於無法進行未受控的複製，因此對環境係安全的。

於另一實施例中，本文中所提供的李斯特菌菌株為inlA突變體、inlB突變體、inlC突變體、inlJ突變體、prfA突變體、actA突變體、dal/dat突變體、突prfA變體、plcB缺失突變體或缺少plcA及plcB二者之雙重突變體。於另一實施例中，該李斯特菌包括這些基因中個別基因或其基因組合之缺失或突變。於另一實施例中，本文中所提供的李斯特菌係缺少該等基因中之每一者。於另一實施例中，本文中所提供的李斯特菌係缺少本文所提供之至少一及多達十個任一基因，包含actA、prfA及dal/dat基因。於另一實施例中，prfA突變體為D133V PrfA突變體。

於一實施例中，李斯特菌菌株之染色體中係缺少代謝基因、毒力基因等。於另一實施例中，李斯特菌菌株之染色體中及任一游離基因元件中係缺少代謝基因、毒力基因等。於另一實施例中，在毒力菌株之基因體中係缺少代謝基因、毒力基因等。於一實施例中，染色體中之毒力基因係經突變。於另一實施例中，毒力基因係由染色體中刪除。於另一實施例中，李斯特菌菌株之染色體中的代謝基因、毒力基因等係經突變。於另一實施例中，李斯特菌菌株之染色體中及任一游離基因元件中的代謝基因、毒力基因等係經突變。於另一實施例中，在毒力菌株之基因體中的代謝基因、毒力基因等係經突變。於另一實施例中，毒力基因係由染色體中刪除。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於一實施例中，本文中所提供的重組李斯特菌菌株係經减毒。於另一實施例中，該重組李斯特菌係缺少actA毒力基因。於另一實施例中，該重組李斯特菌係缺少prfA毒力基因。於另一實施例中，該重組李斯特菌係缺少inlB基因。於另一實施例中，該重組李斯特菌係缺少actA及inlB基因二者。於另一實施例中，本文中所提供的重組李斯特菌菌株係包括內源性actA基因的不活化突變。於另一實施例中，本文中所提供的重組李斯特菌菌株係包括內源性inlB基因的不活化突變。於另一實施例中，本文中所提供的重組李斯特菌菌株係包括內源性inlC基因的不活化突變。於另一實施例中，本文中所提供的重組李斯特菌菌株係包括內源性actA及inlB基因的不活化突變。於另一實施例中，本文中所提供的重組李斯特菌菌株係包括內源性actA及inlC基因的不活化突變。於另一實施例中，本文中所提供的重組李斯特菌菌株係包括內源性actA、inlB及inlC基因的不活化突變。於另一實施例中，本文中所提供的重組李斯特菌菌株係包括內源性actA、inlB及inlC基因的不活化突變。於另一實施例中，本文中所提供的重組李斯特菌菌株係包括內源性actA、inlB及inlC基因的不活化突變。於另一實施例中，本文中所提供的重組李斯特菌菌株係包括下列基因中任一單一基因或其組合中的不活化突變：actA、dal、dat、inlB、inlC、prfA、plcA、plcB。

熟習此項技術者將瞭解術語「突變」及其語法上的同等用語係包含該序列(核酸或胺基酸序列)的任一型式的突變或改變，且包含一缺失突變、截斷、不活化、斷裂或易位。這些型式的突變在本領域中係容易得知。

於一實施例中，為了選擇包括一編碼代謝基因或本文中所提供的互補基因之質體的營養缺陷型細菌，經轉型的營養缺陷型細菌係生長於一將針對該胺基酸代謝基因或互補基因之表現篩選的培養基上。於另一實施例中，一對於D-麩胺酸合成營養缺陷的細菌係以一包含用於D-麩胺酸合成之基因的質體轉型，且該營養缺陷型細菌將缺乏D-麩胺酸下生長，而尚未以該質體轉型，或不表現該編碼用於D-麩胺酸合成之蛋白質之質體的營養缺陷型細菌將不會生長。於另一實施例中，當經轉型並表現本發明的質體(若該質體包括一編碼用於D-丙胺酸合成之胺基酸代謝酶的分離核酸)，一對於D-丙胺酸合成營養缺陷的細菌將在缺乏D-丙胺酸下生長。此類用於製造包括或缺乏必需生長因子、補充劑、胺基酸、維生素、抗生素及其類似物之適當培養基的方法係為本領域中所熟知，且為可購得的(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)。

於另一實施例中，一旦該包括本發明之質體的營養缺陷型細菌在適當的培養基上篩選，該等細菌係在一選擇壓力存在下增殖。這樣的增殖包含使細菌在不具有營養缺陷因子培養基中生長。在營養缺陷型細菌中存在表現胺基酸代謝酶之質體會確保該質體將與細菌一起複製，藉此持續篩選出具有該質體的細菌。熟習此項技術者在配備有本文中本發明及方法時將容易能夠藉由調整包括該質體之營養缺陷型細菌所生長之培養基的體積而放大來使李斯特菌疫苗載體的製造規模。

熟習此項技術者將瞭解，於另一實施例中係採用其他營養缺陷型菌株及補充系統以用於本發明內。

於一實施例中，本文中所提供的重組李斯特菌菌株係表現一重組多肽。於另一實施例中，重組李斯特菌菌株係包括一編碼一重組多肽之質體。於另一實施例中，本文中所提供的重組核酸係在本文中所提供的重組李斯特菌菌株上之質體內。於另一實施例中，該質體為一未整合至該重組李斯特菌菌株的染色體中之游離質體。於另一實施例中，該質體係為一整合至該重組李斯特菌菌株的染色體內的整合性質體。於另一實施例中，該質體為多重複製質體。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係以1 x 10⁹-3.31 x 10¹⁰CFU之劑量投與至人類個體。於另一實施例中，該劑量為5-500 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為7-500 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為10-500 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為20-500 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為30-500 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為50-500 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為70-500 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為100-500 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為150-500 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為5-300 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為5-200 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為5-150 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為5-100 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為5-70 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為5-50 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為5-30 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為5-20 x 10⁸CFU。於另一實施例中，該劑量為1-30 x 10⁹CFU。於另一實施例中，該劑量為1-20 x 10⁹CFU。於另一實施例中，該劑量為2-30 x 10⁹CFU。於另一實施例中，該劑量為1-10 x 10⁹CFU。於另一實施例中，該劑量為2-10 x 10⁹CFU。於另一實施例中，該劑量為3-10 x 10⁹CFU。於另一實施例中，該劑量為2-7 x 10⁹CFU。於另一實施例中，該劑量為2-5 x 10⁹CFU。於另一實施例中，該劑量為3-5 x 10⁹CFU。

於另一實施例中，該劑量為1 x 10⁷個有機體。於另一實施例中，該劑量為1 x 10⁸個有機體。於另一實施例中，該劑量為1 x 10⁹個有機體。於另一實施例中，該劑量為1.5 x 10⁹個有機體。於另一實施例中，該劑量為2 x 10⁹個有機體。於另一實施例中，該劑量為3 x 10⁹個有機體。於另一實施例中，該劑量為4 x 10⁹個有機體。於另一實施例中，該劑量為5 x 10⁹個有機體。於另一實施例中，該劑量為6 x 10⁹個有機體。於另一實施例中，該劑量為7 x 10⁹個有機體。於另一實施例中，該劑量為8 x 10⁹個有機體。於另一實施例中，該劑量為10 x 10⁹個有機體。於另一實施例中，該劑量為1.5 x 10¹⁰個有機體。於另一實施例中，該劑量為2 x 10¹⁰個有機體。於另一實施例中，該劑量為2.5 x 10¹⁰個有機體。於另一實施例中，該劑量為3 x 10¹⁰個有機體。於另一實施例中，該劑量為3.3 x 10¹⁰個有機體。於另一實施例中，該劑量為4 x 10¹⁰個有機體。於另一實施例中，該劑量為5 x 10¹⁰個有機體。每一劑量及劑量範圍代表本發明的一獨立實施例。

於一實施例中，本發明組合物的重複投與(劑量)可在第一次治療療程後立即或幾天、幾周或幾個月的時間間隔之後著手進行以達到腫瘤消退。於另一實施例中，重複劑量係可在第一次治療療程後立即或幾天、幾周或幾個月的時間間隔後著手進行以達到腫瘤生長的抑制。可通過本領域中任一已知的技術來確定評估，包括諸如成像技術、血清腫瘤標記物分析、檢體分析、或腫瘤相關症狀的存在、不存在或改善分析之診斷方法。

熟習此項技術者將瞭解術語「增強」可涵蓋投與一免疫原性組合物或重組李斯特菌菌株劑量至一個體。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。於另一實施例中，本發明該等方法係施與兩次增強(總共接種3次)。於另一實施例中，係施與三次增強。於另一實施例中，係施與四次增強。於另一實施例中，係施與五次增強。於另一實施例中，係施與六次增強。於另一實施例中，係施與超過六次增強。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於一實施例中，本發明之一方法更包括以本發明的重組李斯特菌菌株增強一人類個體的步驟。於另一實施例中，該使用在增強接種中的重組李斯特菌菌株係與使用在初始的「促發」接種中的菌株相同。於另一實施例中，該增強菌株係與該促發菌株不同。於另一實施例中，係於該促發及增強接種中使用相同的劑量。於另一實施例中，係於增強中使用較大的劑量。於另一實施例中，係於增強中使用較小的劑量。於另一實施例中，本發明該等方法更包括投與該個體一增強疫苗接種之步驟。於另一實施例中，該增強疫苗接種係於一單一促發疫苗接種後發生。於另一實施例中，一單一增強疫苗接種係於該促發疫苗接種後投與。於另一實施例中，係於該促發疫苗接種後投與兩次增強疫苗接種。於另一實施例中，係於該促發疫苗接種後投與三次增強疫苗接種。於另一實施例中，於促發及增強菌株之間的時間係實驗性地由本領域技術人員所決定。於另一實施例中，於促發及增強菌株之間的時間係自一天並高達一星期，於另一實施例中其係高達兩周，於另一實施例中其係高達三周，於另一實施例中其係高達四周，於另一實施例中其係高達五周，於另一實施例中其係高達6至8周，且於另一實施例中該增強菌株係於該促發菌株之後投與高達8至12周。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明之一方法更包括以一包括該E7抗原的免疫原性組合物對該人類個體進行接種之步驟。於另一實施例中，該免疫原性組合物係包括一重組E7蛋白質或其片段。於另一實施例中，該免疫原性組合物係包括一表現重組E7蛋白質或其片段之核苷酸分子。於另一實施例中，非李斯特菌的接種係於接種李斯特菌之前施與。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

本發明該等方法及組合物的重組李斯特菌菌株於另一實施例中係為重組單核球增多性李斯特菌菌株。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為重組斯氏李斯特菌(Listeria seeligeri)菌株。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為重組格氏李斯特菌(Listeria grayi)菌株。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為重組格氏李斯特菌(Listeria ivanovii)菌株。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為重組穆氏李斯特菌(Listeria murrayi)菌株。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為重組魏氏李斯特菌(Listeria welshimeri)菌株。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為本領域中已知的任一其他李斯特菌菌種的重組菌株。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

本發明提供了一些李斯特菌菌種及菌株，用以製造或基因工程化本發明的減毒李斯特菌。於一實施例中，該李斯特菌菌株係為野生型單核球增多性李斯特菌10403S(見Bishop及Hinrichs，(1987)J.Immunol.139：2005-2009；Lauer等人，(2002)J.Bact.184：4177-4186)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為(經噬菌體治癒的)單核球增多性李斯特菌DP-L4056(見Lauer等人，(2002)J.Bact.184：4177-4186)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌DP-L4027，其係經噬菌體治癒並缺失hly基因(見Lauer等人，(2002)J.Bact.184：4177-4186；Jones及Portnoy，(1994)Infect.Immunity 65：5608-5613)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌DP-L4029，其係經噬菌體治癒，並缺失ActA基因(見Lauer等人，(2002)J.Bact.184：4177-4186；Skoble等人，(2000)J.Cell Biol.150：527-538)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌DP-L4042(△PEST)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌DP-L4097(LLO-S44A)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌DP-L4364(△lplA；硫辛酸蛋白質連接酶)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌DP-L4405(△inlA)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌DP-L4406(△inlB)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌CS-L0001(△ActA-△inlB)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌CS-L0002(△ActA-△lplA)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌 CS-L0003(L461T-△lplA)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌DP-L4038(△ActA-LLO L461T)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌DP-L4384(S44A-LLO L461T)(見Brockstedt等人，(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：13832-13837；支援資訊)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌；其硫辛酸蛋白質突變(見O'Riordan等人，(2003)Science 302：462-464)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌DP-L4017(在溶血素基因中10403S hly(L461T)點突變)(見2003年7月24日申請之美國臨時專利申請案第60/490,089號)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌EGD(見GenBank寄存編號AL591824)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌EGD-e(見GenBank寄存編號NC_003210；寄存編號BAA-679)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為缺失uvrAB之單核球增多性李斯特菌DP-L4029(見2004年2月2日申請之美國臨時專利申請案第60/541,515號)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌ActA-/inlB-雙重突變體(見ATCC寄存編號PTA-5562)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌lplA突變體或hly突變體(見Portnoy等人提出之美國專利申請案第20040013690號)。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係為單核球增多性李斯特菌DAL/DAT雙重突變體(見Frankel及Portnoy提出之美國專利申請案第20050048081號)。本發明涵蓋了試劑及方法，其包含上述李斯特菌菌株及(例如)經質體及/或基因體整合修飾以含有編碼以下基因：hly(LLO；李斯特菌溶素)、iap(p60)、inlA、inlB、inlC、dal(丙胺酸消旋酶)、dat(D-胺基酸轉胺酶)、plcA、plcB、actA中之一者或任一組合之核酸，或任何介導生長、傳播、單壁微脂粒之分解、雙壁微脂粒之分解之核酸的這些菌株，所述菌株結合至宿主細胞，由宿主細胞吸收。本發明並不受限於以上所揭示之特定菌珠。

於另一實施例中，本發明之一重組李斯特菌菌株係已通過一動物宿主繼代。於另一實施例中，繼代使菌株作為疫苗載體之功效最大化。於另一實施例中，繼代使李斯特菌菌株之免疫原性穩定。於另一實施例中，繼代使李斯特菌菌株之毒力穩定。於另一實施例中，繼代增加李斯特菌菌株之免疫原性。於另一實施例中，繼代增加李斯特菌菌株之毒力。於另一實施例中，繼代移除了李斯特菌菌株之不穩定子菌株。於另一實施例中，繼代減少了李斯特菌菌株之不穩定子菌株的流行率。於另一實施例中，該李斯特菌菌株係含有一編碼該含有抗原的重組肽之基因的基因體插入。於另一實施例中，李斯特菌菌株攜載了該一包括編碼該含有抗原的重組肽之基因的載體。於另一實施例中，繼代係以本文中所述方式進行。於另一實施例中，繼代係以本領域中已知的任一其他方法來進行。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，使用在本發明該等方法中的重組李斯特菌菌株係已儲存在一冷凍細胞庫。於另一實施例中，該重組李斯特菌菌株係已儲存為冷凍乾燥狀態。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明該等方法及組合物之細胞庫係為一主細胞庫。於另一實施例中，該細胞庫係為一工作細胞庫。於另一實施例中，該細胞庫係為優良製造規範(GMP)細胞庫。於另一實施例中，該細胞庫係意欲用於臨床等級材料的生產。於另一實施例中，該細胞庫係符合供人類使用管制措施的規定。於另一實施例中，該細胞庫為本領域中已知的任一其他類型的資料庫。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

「優良製造規範」於另一實施例中係由美國聯邦法規(United States Code of Federal Regulations)的21 CFR 210-211部分所定義。於另一實施例中，「優良製造規範」係由其他用於臨床等級材料的生產或用於人體消耗的標準所定義，例如除美國外的國家之標準。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，使用於本發明該等方法中之重組李斯特菌菌株係來自一批次的疫苗劑量。

於另一實施例中，使用於本發明該等方法中之重組李斯特菌菌株係來自於美國專利案第8,114,414號中所供方法所生產之冷凍或冷凍乾燥儲備料，其係以引用方式併入本文中。

於另一實施例中，本發明的肽為一種融合蛋白。於另一實施例中，「融合蛋白」係指一包括二或更多個藉由肽鍵或其他化學鍵而連接一起之蛋白質的肽或多肽。於另一實施例中，該等蛋白質係以一或更多個設於二或更多個蛋白質之間的胺基酸(例如一間隔體)而連接一起。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明之疫苗更包括一佐劑。本發明之方法及組合物中所用之佐劑於另一實施例中為顆粒球/巨噬細胞群落刺激因子(GM-CSF)蛋白質。於另一實施例中，佐劑包含GM-CSF蛋白質。於另一實施例中，佐劑為編碼GM-CSF之核苷酸分子。於另一實施例中，佐劑包含編碼GM-CSF之核苷酸分子。於另一實施例中，佐劑為皂素QS21。於另一實施例中，佐劑包含皂素QS21。於另一實施例中，佐劑為單磷醯基脂質A。於另一實施例中，佐劑包含單磷醯基脂質A。於另一實施例中，佐劑為SBAS2。於另一實施例中，佐劑包含SBAS2。於另一實施例中，佐劑為含未甲基化CpG之寡核苷酸。於另一實施例中，佐劑包含含未甲基化CpG之寡核苷酸。於另一實施例中，佐劑為免疫刺激性細胞激素。於另一實施例中，佐劑包含免疫刺激性細胞激素。於另一實施例中，佐劑為編碼免疫刺激性細胞激素之核苷酸分子。於另一實施例中，佐劑包含編碼免疫刺激性細胞激素之核苷酸分子。於另一實施例中，佐劑為或包含羽莖糖苷。於另一實施例中，佐劑為或包含細菌有絲分裂原。於另一實施例中，佐劑為或包含細菌毒素。於另一實施例中，佐劑為或包含本領域中已知之任何其他佐劑。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明之核苷酸在運作上係連接一驅動李斯特菌菌株中所編碼的肽之表現的啟動子/調節序列。有利於驅動一基因構成表現之啟動子/調節序列係在本領域中所熟知，且包含但不限於(例如)李斯特菌的P_hlyA、P_ActA及p60啟動子、鏈球菌bac啟動子、鏈黴菌sgiA啟動子及蘇雲金芽孢桿菌phaZ啟動子。於另一實施例中，編碼本發明的肽的核酸之誘導型及組織特異性表現係藉由在一誘導型或組織特異性啟動子/調節序列的控制下置放編碼該肽的核酸而達成。有利於其目的之組織特異性或誘導型啟動子/調節序列實例包含(但不限於)MMTV LTR誘導型啟動子，以及SV40後強化子/啟動子。於另一實施例中，係使用了一經誘導以對諸如金屬、醣皮質素等誘導劑做出反應之啟動子。因此，應理解本發明包含了任一已知或未知的啟動子/調節序列之使用，且能夠驅動在運作上與其相連的期望蛋白質的表現。

本發明之方法及組合物中所用之ActA蛋白質之N端片段於另一實施例中係具有SEQ ID NO：5中陳述的序列：

於另一實施例中，ActA片段包含SEQ ID NO：5中陳述之序列。於另一實施例中，ActA片段為本領域中已知之任何其他ActA片段。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，編碼ActA蛋白質之片段之重組核苷酸係包括SEQ ID NO：6中陳述之序列：

於另一實施例中，重組核苷酸具有SEQ ID NO：6中陳述之序列。於另一實施例中，重組核苷酸包括編碼ActA蛋白質的片段之任何其他序列。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於本發明該等方法及組合物的另一實施例中，PEST胺基酸序列係融合至E7或E6抗原。如本文中所提供的，表現PEST胺基酸序列-抗原融合體的重組李斯特菌菌株係誘導抗腫瘤免疫性(實例3)，並產生抗原特異性及腫瘤浸潤性T細胞(實例4)。再者，包括抗原及含有PEST胺基酸序列KENSISSMAPPASPPASPKTPIEKKHADEIDK(SEQ ID NO：1)之融合蛋白顯示了增強的細胞介導的免疫性。

因此，抗原與源自其他原核生物體之其他LM PEST胺基酸序列及PEST胺基酸序列之融合物亦可增強抗原之免疫原性。於另一實施例中，PEST胺基酸序列具有選自SEQ ID NO：7-12之序列。於另一實施例中，PEST胺基酸序列係為來自LM ActA蛋白質之PEST胺基酸序列。於另一實施例中，PEST胺基酸序列為KTEEQPSEVNTGPR(SEQ ID NO：7)、KASVTDTSEGDLDSSMQSADESTPQPLK(SEQ ID NO：8)、KNEEVNASDFPPPPTDEELR(SEQ ID NO：9)或RGGIPTSEEFSSLNSGDFTDDENSETTEEEIDR(SEQ ID NO：10)。於另一實施例中，PEST胺基酸序列係來自鏈球菌屬(Streptococcus sp)之鏈球菌溶血素O蛋白質。於另一實施例中，PEST胺基酸序列係來自化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes)鏈球菌溶血素O，例如在胺基酸35-51處之KQNTASTETTTTNEQPK(SEQ ID NO：11)。於另一實施例中，PEST胺基酸序列係來自類馬鏈球菌(Streptococcus equisimilis)鏈球菌溶血素O，例如在胺基酸38-54處之KQNTANTETTTTNEQPK(SEQ ID NO：12)。於另一實施例中，PEST胺基酸序列為自原核生物體獲得之PEST胺基酸序列。於另一實施例中，PEST胺基酸序列為該項領域中已知的任一其他PEST胺基酸序列。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

其他原核生物體之PEST胺基酸序列係可根據諸如由(例如)Rechsteiner及Rogers(1996,Trends Biochem.Sci.21：267-271)針對LM描述之方法鑑別。或者，來自其他原核生物體之PEST胺基酸序列亦可基於此方法鑑別。預期將有PEST胺基酸序列之其他原核生物體包括(但不限於)其他李斯特菌種。於另一實施例中，該PEST胺基酸序列係嵌入該抗原蛋白質內。因此，於另一實施例中，「融合體」係指一包括該抗原以及連接於該抗原的一端或嵌入該抗原內之i)一N端LLO蛋白質(tLLO)、ii)一N端ActA蛋白質或iii)一PEST胺基酸序列二者之抗原蛋白質。

於另一實施例中，PEST胺基酸序列係使用本領域中已知之任何其他方法或演算法鑑別，例如CaSPredictor(Garay-Malpartida HM,Occhiucci JM,AlvesJ,Belizario JE.Bioinformatics.2005年6月；21冊，增刊1：i169-76)。於另一實施例中，係使用下列方法：PEST指數藉由將值1分配給胺基酸Ser、Thr、Pro、Glu、Asp、Asn或Gln來針對每一30-35個胺基酸的序列段(stretch)計算。PEST殘基中之各者之係數值(CV)為1且其他胺基酸(非PEST)中之各者的係數值為0。

用於鑑別PEST胺基酸序列之各方法係代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明之LLO蛋白質、ActA蛋白質或其片段不需完全為本文中所陳述該等序列中所陳述者，而可做出保有融合至本文中其他處所陳述抗原的LLO或ActA蛋白質的功能特性之其他變更、修飾或改變。於另一實施例中，本發明利用了LLO蛋白質、ActA蛋白質或其片段之類似物。類似物於另一實施例中與自然發生的蛋白質或肽不同之處在於保守的胺基酸序列差異或不影響序列的修飾，或其二者。

於另一實施例中，完整的E7蛋白質或其片段係融合至LLO蛋白質、ActA蛋白質或含有PEST胺基酸序列的肽，以產生本發明方法的重組肽。於另一實施例中，所使用的E7蛋白質(完整的或做為該等片段的來源)具有下列序列：MHGDTPTLHEYMLDLQPETTDLYCYEQLNDSSEEEDEIDGPAGQAEPDRAHYNIVTFCCKCDSTLRLCVQSTHVDIRTLEDLLMGTLGIVCPICSQKP(SEQ ID No：13)。於另一實施例中，該E7蛋白質為SEQ ID No：13之同系物。於另一實施例中，該E7蛋白質為SEQ ID No：13之變異體。於另一實施例中，該E7蛋白質為SEQ ID No：13之異構體。於另一實施例中，該E7蛋白質為SEQ ID No：13之片段。於另一實施例中，該E7蛋白質為SEQ ID No：13之同系物片段。於另一實施例中，該E7蛋白質為SEQ ID No：13之變異體片段。於另一實施例中，該E7蛋白質為SEQ ID No：13之異構體片段。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，E7蛋白質之序列為：MHGPKATLQDIVLHLEPQNEIPVDLLCHEQLSDSEEENDEIDGVNHQHLPARRAEPQRHTMLCMCCKCEARIELVVESSADDLRAFQQLFLNTLSFVCPWCASQQ(SEQ ID No：14)。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：14之同系物。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：14之變異體。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：14之異構體。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：14之片段。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：14之同系物片段。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：14之變異體片段。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：14之異構體片段。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，E7蛋白質具有下列GenBank登錄號中之一者所陳述之序列：M24215、NC_004500、V01116、X62843或M14119。於另一實施例中，E7蛋白質為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的同系物。於另一實施例中，E7蛋白質為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的變異體。於另一實施例中，E7蛋白質為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的異構體。於另一實施例中，E7蛋白質為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的片段。於另一實施例中，E7蛋白質為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的同系物片段。於另一實施例中，E7蛋白質為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的變異體片段。於另一實施例中，E7蛋白質為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的異構體片段。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，完整的E6蛋白質或其片段係融合至LLO蛋白質、ActA蛋白質或含有PEST胺基酸序列的肽，以產生本發明方法的重組肽。於另一實施例中，所使用的E6蛋白質(完整的或做為該等片段的來源)具有下列序列：MHQKRTAMFQDPQERPRKLPQLCTELQTTIHDIILECVYCKQQLLRREVYDFAFRDLCIVYRDGNPYAVCDKCLKFYSKISEYRHYCYSLYGTTLEQQYNKPLCDLLIRCINCQKPLCPEEKQRHLDKKQRFHNIRGRWTGRCMSCCRSSRTRRETQL(SEQ ID No：15)。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：15之同系物。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：15之變異體。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：15之異構體。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：15之片段。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：15之同系物片段。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：15之變異體片段。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：15之異構體片段。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，E6蛋白質之序列為：MARFEDPTRRPYKLPDLCTELNTSLQDIEITCVYCKTVLE LTEVFEFAFKDLFVVYRDSIPHAACHKCIDFYSRIRELRHYSDSVYGDTLEKLTNTGLYNLLIRCLRCQKPLNPAEKLRHLNEKRRFHNIAGHYRGQCHSCCNRARQERLQRRRETQV(SEQ ID No：16)。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：16之同系物。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：16之變異體。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：16之異構體。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：16之片段。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：16之同系物片段。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：16之變異體片段。於另一實施例中，該E6蛋白質為SEQ ID No：16之異構體片段。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，E6蛋白質具有下列GenBank登錄號中之一者所陳述之序列：M24215、M14119、NC_004500、V01116、X62843或M14119。於另一實施例中，E6蛋白質為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的同系物。於另一實施例中，E6蛋白質為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的變異體。於另一實施例中，E6蛋白質為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的異構體。於另一實施例中，E6蛋白質為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的片段。於另一實施例中，E6蛋白質為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的同系物片段。於另一實施例中，E6蛋白質為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的變異體片段。於另一實施例中，E6蛋白質為來自上述GenBank登錄號中之一者之序列的異構體片段。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，「同源性」係指與LLO序列(例如SEQ ID NO：2-4中之一者)之一致性大於60%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於64%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於68%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於72%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於75%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於78%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於 80%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於82%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於83%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於85%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於87%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於88%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於90%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於92%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於93%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於95%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於96%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於97%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於98%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性大於99%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：2-4中之一者之一致性為100%。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，「同源性」係指與E7序列(例如SEQ ID NO：13-14中之一者)之一致性大於60%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於62%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於64%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於68%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於72%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於75%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於78%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於80%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於82%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於83%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於85%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於87%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於88%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於90%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於92%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於93%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於95%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於96%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於97%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於98%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性大於99%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：13-14中之一者之一致性為100%。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，「同源性」係指與E6序列(例如SEQ ID NO：15-16中之一者)之一致性大於60%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於64%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於68%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於72%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於75%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於78%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於80%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於82%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於83%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於85%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於87%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於88%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於90%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於92%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於93%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於95%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於96%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於97%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於98%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性大於99%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：15-16中之一者之一致性為100%。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，「同源性」係指與PEST胺基酸序列(例如SEQ ID NO：1及7-12中之一者)或與ActA序列(例如SEQ ID NO：5-6中之一者)之一致性大於60%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於60%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於64%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於68%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於72%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於75%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於78%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於80%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於82%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於83%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於85%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於87%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於88%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於90%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於92%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於93%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於95%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於96%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於97%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於98%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性大於99%。於另一實施例中，「同源性」係指與SEQ ID NO：1及7-12或與SEQ ID NO：5-6中之一者之一致性為100%。每種可能性代表本發明的一獨立實施例。

於一實施例中，利用本領域中已充分描述之方法，包含免疫墨點分析，或利用許多可獲得的套裝軟體中之任一者經由所建立之方法經由電腦演算法分析胺基酸序列，對本文中所列之任何胺基酸序列之蛋白質及/或肽同源性進行測定。舉例而言，此等套裝中之一些包含FASTA、BLAST、MPsrch或Scanps套裝，且於其他實施例中可採用Smith及Waterman演算法之用法及/或供分析用之整體/局部或BLOCKS比對。判定同源性之各種方法代表本發明的一獨立實施例。

於另一實施例中，本發明之LLO蛋白質、ActA蛋白質或其片段係藉由化學共軛作用而附接於該抗原。於另一實施例中，戊二醛係用於該共軛作用上。於另一實施例中，該共軛作用係使用本領域中任一已知的適當方法來進行。每種可能性代表本發明的另一實施例。

於另一實施例中，本發明之融合蛋白可藉由任何適宜方法來製備，包含(例如)選殖並限制性分解適宜的序列或藉由下述之方法直接化學合成。於另一實施例中，可選殖子序列且可使用適宜的限制酶切剪適宜的子序列。於另一實施例中可接著連接該等片段以產生期望的DNA序列。於另一實施例中，編碼該融合蛋白的DNA係使用DNA擴增法(例如聚合酶鏈反應(PCR))產生。首先，分別擴增天然DNA任一側新末端上之區段。一個經擴增序列之5'端編碼肽連接子，而另一經擴增序列之3'端亦編碼肽連接子。由於第一片段之5'端與第二片段之3'端互補，故可將該兩個片段(例如在LMP瓊脂糖上部分純化後)用作第三PCR反應中之重疊模板。經擴增序列將含有密碼子、開放位點之羧基側上之區段(現形成胺基序列)、連接子及開放位點之胺基側上之序列(現形成羧基序列)。接著將插入子接合至質體。

於另一實施例中，LLO蛋白質、ActA蛋白質(或其片段)以及該抗原(或其片段)係通過本領域技術人員已知的手段而接合。於另一實施例中，該抗原或其片段係直接或通過一連接子(間隔體)而接合該ActA蛋白質或LLO蛋白質。於另一實施例中，該嵌合分子係以一單鏈融合蛋白質形式重組表現。

於另一實施例中，本發明的融合肽係使用標準的化學肽合成技術而合成。於另一實施例中，該嵌合分子係合成為一單鏈相連多肽。於另一實施例中，LLO蛋白質、ActA蛋白質(或其片段)，以及該抗原(或其片段)係單獨合成，並接著藉由一分子的胺基末端與另一分子的羧基末端的縮合而融合，藉以形成一肽鍵。於另一實施例中，該ActA蛋白質或LLO蛋白質以及抗原係各自以一肽間隔體分子的一端而縮合，藉以形成一相連的融合蛋白。

於另一實施例中，本發明之多肽及蛋白質係通過固相肽合成(SPPS)而製備，如Stewart等人於Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，1984,Pierce Chemical Company,Rockford,Ill.中所述；或如Bodanszky及Bodanszky(The Practice of Peptide Synthesis,1984,Springer-Verlag,New York)所述。於另一實施例中，經適當保護之胺基酸殘基經由其羧基黏附至經衍生化且不溶性之聚合載體上，如交叉鏈結之聚苯乙烯或聚醯胺樹脂。「經適當保護的」指在胺基酸之α-胺基及任何側鏈官能基上存在有保護基。此側鏈保護基通常對溶劑、試劑及合成中所用的反應條件係穩定的，且在不影響最終肽產物之條件下是可移去的。寡肽逐步的合成係藉由移去最初胺基酸中之N-保護基而進行，並與所期望的肽的序列中之下一個胺基酸的羧基末端結合。此胺基酸也經過適當的保護。納入之胺基酸之羧基可予以活化，以藉由形成為一反應性基團(諸如形成為碳化二亞胺、對稱酸酐或諸如羥基苯並三唑或五氟苯基酯之「活性酯」基)而可與所支撐結合的胺基酸之N-末端反應。該含有本發明之疫苗及組合物之醫藥組合物於另一實施例中係藉由熟習此項技術者已知的任何方法(諸如非經腸道、癌旁、經黏膜、經皮、肌肉內、靜脈內、皮內、皮下、腹膜內、心室內、顱內、陰道內或腫瘤內)投與一個體。

在本文提供的方法及組合物的另一實施例中，疫苗或組合物係通過口服施用，並因此製成適於口服施用的形式，即以固體或液體製劑形式。適合的固體口服劑型包含錠劑、膠囊、藥丸、顆粒、片粒等等。適合的液體口服劑型包括溶液、懸浮液、分散液、乳劑、油劑等等。於本發明的另一實施例中，活性成分係製成膠囊。根據此實施例，除了活性化合物及插入載體或稀釋劑，本發明的組合物包括硬凝膠膠囊。

於另一實施例中，疫苗或組合物係通過靜脈注射、動脈注射或肌肉內注射液體製備物施用。適合的液體製劑包含溶液、懸浮液、分散液、乳劑、油劑等等。於一實施例中，醫藥組合物係通過靜脈注射投與，並因此製成適合用於靜脈注射施用的形式。於另一實施例中，醫藥組合物係通過動脈注射投與，並因此製成適合用於動脈注射投與的形式。於另一實施例中，醫藥組合物係通過肌肉內注射投與，並因此製成適合用於肌肉內注射投與的形式。

熟習此項技術者將瞭解術語「治療」可涵蓋治療性治療以及預防性或預防手段，其中其目的係預防或減輕如本文描述之靶向病理性病狀或病症。因此，於一實施例中，治療可能包含直接影響或治癒疾病、病症或病狀，壓制、抑制、預防、減弱其嚴重程度、延遲其發作、減弱與其相關的症狀，或其組合。因此，於一實施例中，「治療」尤其可涵蓋延遲發展、加速緩解、誘導緩解、放大緩解、加速恢復、提高替代治療的效率或降低其耐受性，或其組合。於一實施例中，「預防」或「阻礙」尤其可涵蓋延遲症狀發作、防止疾病復發、降低復發發病的次數或頻率、提高症狀發病之間的潛伏期，或其組合。於一實施例中，「壓制」或「抑制」尤其可涵蓋降低症狀嚴重程度、降低急性發病的嚴重程度、降低症狀的數量、降低與疾病相關的症狀的發生率、降低症狀的潛伏期、改善症狀、減少繼發症狀、減少繼發性感染、延長患者存活時間，或其組合。

於一實施例中，症狀為原發性的，而於另一實施例中，症狀為繼發性的。於一實施例中，「原發性」係指症狀為特定疾病或病症的直接結果，而於一實施例中，「繼發」係指症狀源自原發性原因或由其引起。於一實施例中，本發明所用的的組合物可治療原發性或繼發性症狀或繼發性併發症。於另一實施例中，「症狀」可為任何疾病或病理狀況的表現。

於另一實施例中，本發明提供了一包括本發明疫苗、施用器以及描述本發明該等方法的使用的教學材料之試劑組。儘管典型的試劑組係在下文中描述，鑒於本發明揭示內容其他有用試劑組的內容物對於熟習此項技術者而言將變得顯而易見。這些試劑組中之每一者代表本發明的一獨立實施例。

於一實施例中，單數形式的詞語(諸如「一」、「一個」及「該」)係包含其對應的複數形式，除非上下文中另有明確規定。

在整個本申請中，本發明的各種實施例可以以範圍的形式呈現。應理解，範圍形式的描述僅僅是為方便和簡潔起見，不應被看作是對本發明的範圍的固定的限制。因此，範圍的描述應當被認為具體公開了所有可能的子範圍以及該範圍內的單個數值。例如，從1到6的範圍的描述應當被認為具體公開了子範圍，如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6，等等，以及該範圍內的單個數值，例如，1、2、3、4、5和6。這對於任何範圍廣度均適用。

無論何時在本文中標示數值範圍，其是指包含該指定範圍內的任何例舉數字(分數或整數)。該等用語「範圍在」一第一標示數值及一第二標示數值「之間」，以及「範圍從」一第一標示數值「至」一第二標示數值，在本文中係可互換使用，且其係指包含該第一及第二標示數值以及其之間的所有分數和整數的數字。

熟習此項技術者應充分瞭解術語「約」在用於修改一個數字定義的參數時，可涵蓋在數量上加上或減去該參數表示數值的5%，或於另一實施例中加上或減去該參數表示數值的10%，或於另一實施例中加上或減去該參數表示數值的15%，或於另一實施例中加上或減去該參數表示數值的20%之參數變化。

熟習此項技術者應瞭解術語「個體」可涵蓋需要針對病況或其後遺症之療法或易罹患該病況或其後遺症之哺乳動物(包含成人或人類幼兒、青少年或青年人)，且亦可包含非人類哺乳動物(諸如狗、貓、豬、牛、綿羊、山羊、馬、大鼠及小鼠)。亦應充分瞭解該術語可涵蓋牲畜。術語「個體」並不排除在各方面正常之個體。

熟習此項技術者將瞭解用於治療目的之術語「哺乳動物」是指歸類為哺乳動物的任何動物，包含(但不限於)人類、家畜及農畜，以及動物園動物、參與運動項目的動物或寵物動物，諸如犬科動物(包含狗)及馬、貓、牛、豬、羊等。

在下面的實例中係描述了多個特定細節，以提供對本發明的徹底理解。然而，熟習此項技術者將會理解可以在不具有這些特定細節的情況下實施本發明。在其他例子中，為避免使本發明不夠清晰，未對公知的方法、程序及元件進行詳細描述。因此這些實例不應以任何方式解釋為限制本發明範圍的廣度。

實驗細節部分 實例1：LLO-抗原融合體誘導抗腫瘤免疫性 材料及實驗方法(實例1-2) 細胞株

C57BL/6同基因TC-1腫瘤係以HPV-16 E6及E7永生化並以c-Ha-ras致癌基因轉型。TC-1(由T.C.Wu(Johns Hopkins University School of Medicine,Baltimore,MD)提供)為一種表現較低含量HPV-16 E6及E7且經c-Ha-ras致癌基因轉型之高度致瘤性肺上皮細胞。TC-1在37℃、10% CO₂下生長於含有10% FCS、2mM L-麩醯胺酸、100U/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素、100μM非必需胺基酸、1mM丙酮酸鈉、50微莫耳(mcM)2-ME、400微克(mcg)/毫升G418及10%國家標準菌種保存中心-109培養基(National Collection Type Culture-109 medium)的RPMI 1640中。C3為來自經HPV 16之完整基因體永生化且經pEJ-ras轉型之C57BL/6小鼠的小鼠胚胎細胞。EL-4/E7為經E7以反轉錄病毒方式轉導之胸腺瘤EL-4。

單核球增多性李斯特菌菌株及增殖

所用李斯特菌菌株為Lm-LLO-E7(游離型表現系統中之hly-E7融合基因；圖1A)、Lm-E7(整合於李斯特菌基因體中之單複本E7基因卡匣)、Lm-LLO-NP(「DP-L2028」；游離型表現系統中之hly-NP融合基因)及Lm-Gag(「ZY-18」；整合於染色體中之單複本HIV-1 Gag基因卡匣)。E7藉由PCR使用引子5'-GGCTCGAGCATGGAGATACACC-3'(SEQ ID No：17；XhoI位點加下劃線)及5'-GGGGACTAGTTTATGGTTTCTGAGAACA-3'(SEQ ID No：18；SpeI位點加下劃線)擴增且接合至pCR2.1(Invitrogen,San Diego,CA)。E7藉由XhoI/SpeI分解而由pCR2.1切除並接合至pGG-55。將hly-E7融合基因及多潛能轉錄因子prfA選殖至pAM401(一種多複本穿梭質體(Wirth R等人，J Bacteriol,165：831,1986))中，產生pGG-55。hly啟動子驅動hly基因產物的前441個胺基酸之表現，(其缺乏溶血性C端，下文稱為「△LLO」，且具有在SEQ ID No：25中所陳述的序列)，且利用XhoI位點連接至E7基因，產生以LLO-E7形式轉錄及分泌之hly-E7融合基因。李斯特菌之prfA陰性菌株XFL-7(由Dr.Hao Shen,University of Pennsylvania所提供)經pGG-55 轉型，針對在活體內質體之保留進行選擇(圖1A-B)。hly啟動子及基因片段係使用引子5'-GGGGGCTAGCCCTCCTTTGATTAGTATATTC-3'(SEQ ID No：19；NheI位點加下劃線)及5'-CTCCCTCGAGATCATAATTTACTTCATC-3'(SEQ ID No：20；XhoI位點加下劃線)產生。prfA基因係使用引子5'-GACTACAAGGACGATGACCGACAAGTGATAACCCGGGATCTAAATAAATCCGTTT-3'(SEQ ID No：27；XbaI位點加下劃線)及5'-CCCGTCGACCAGCTCTTCTTGGTGAAG-3'(SEQ ID No：21；SalI位點加下劃線)進行PCR擴增。Lm-E7藉由將含有驅動E7表現及分泌之hly啟動子及信息序列之表現卡匣引入LM基因體之orfZ結構域中而產生。E7藉由PCR使用引子5'-GCGGATCCCATGGAGATACACCTAC-3'(SEQ ID No：22；BamHI位點加下劃線)及5'-GCTCTAGATTATGGTTTCTGAG-3'(SEQ ID No：23；XbaI位點加下劃線)進行擴增。E7接著接合至pZY-21穿梭載體中。LM菌株10403S經所得質體pZY-21-E7轉型，該質體包含插入對應於LM基因體之orfX、Y、Z結構域之1.6-kb序列中間的表現卡匣。同源性結構域允許E7基因卡匣藉由同源重組插入orfZ結構域。篩選E7基因卡匣整合至orfZ結構域中之殖株。細菌生長於具有(Lm-LLO-E7及Lm-LLO-NP)或不具有(Lm-E7及ZY-18)氯黴素(20μg/ml)之腦心浸液培養基中。細菌以等分試樣形式冷凍在-80℃下。表現利用西方墨點法驗證(圖2)。

西方墨點法

李斯特菌菌株在37℃下生長於Luria-Bertoni培養基中，且在相同的600nm量測光密度下收集。上清液經TCA沈澱且再懸浮於補充有0.1N NaOH之1倍樣品緩衝液中。將相同量之各細胞沈澱物或各經TCA沈澱之上清液裝載於4-20% Tris-甘胺酸SDS-PAGE凝膠(NOVEX,San Diego,CA)上。將凝膠轉移至聚偏二氟乙烯上，且用抗E7單株抗體(mAb)(Zymed Laboratories,South San Francisco,CA)進行探針探查，接著與HRP接合之抗小鼠二級抗體(Amersham Pharmacia Biotech,Little Chalfont,U.K.)一起培養，用Amersham ECL偵測試劑顯影，並曝光於Hyperfilm(Amersham Pharmacia Biotech)上。

量測腫瘤生長

腫瘤每隔一天用測徑規跨越最短及最長表面直徑量測。此等兩個量測值之平均值以平均腫瘤直徑(以毫米為單位)對各時間點之形式作圖。小鼠在腫瘤直徑達至20mm時犧牲。僅顯示存活小鼠之各時間點之腫瘤量測值。

李斯特菌重組體對所確立之腫瘤生長的作用

6至8週大的C57BL/6小鼠(Charles River)在左側腹皮下接受2 x 10⁵個TC-1細胞。腫瘤接種後一週，腫瘤直徑已達至4-5mm之可觸知的大小。八隻一組的小鼠接著在第7天及第14天以0.1 LD₅₀ Lm-LLO-E7(10⁷個CFU)、Lm-E7(10⁶個CFU)、Lm-LLO-NP(10⁷個CFU)或Lm-Gag(5 x 10⁵個CFU)腹膜內處理。

⁵¹ Cr釋放分析

C57BL/6小鼠(6-8週大)係以0.1 LD₅₀ Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag腹膜內免疫接種。免疫接種後十天，收集脾臟。脾細胞與作為餵養細胞之經輻射照射的TC-1細胞(100：1，脾細胞：TC-1)係建立成培養細胞；活體外刺激5天，接著用於標準⁵¹Cr釋放分析，使用以下靶標：EL-4、EL-4/E7或以E7 H-2b肽(RAHYNIVTF)脈衝處理之EL-4。E：T細胞比率(以三重複進行)為80：1、40：1、20：1、10：1、5：1及2.5：1。在37℃下培育4小時後，細胞係經沈澱成粒，且自各孔移除50μl上清液。樣品係以Wallac 1450閃爍計數器(Gaithersburg,MD)分析。特異性溶解百分比係以[(實驗性每分鐘計數(cpm)-自發性cpm)/(總cpm-自發性cpm)]×100形式測定。

TC-1特異性增殖

C57BL/6小鼠係以0.1 LD₅₀ Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag免疫接種且藉由20天後以1 LD₅₀ Lm-LLO-E7、Lm-E7、Lm-LLO-NP或Lm-Gag腹膜內注射來加強。加強後六天，自經免疫接種小鼠及未處理小鼠收集脾臟。在每孔具有2.5 x 10⁴、1.25 x 10⁴、6 x 10³或3 x 10³個經輻射照射的TC-1細胞做為E7 Ag來源之情況下，或在無TC-1細胞情況下或在10μg/ml Con A情況下，脾細胞係在平底96孔盤中以每孔5×10⁵個細胞建立培養細胞。細胞於45小時後每孔係以0.5μCi[³H]胸苷/孔脈衝處理。孔盤於18小時後係使用Tomtec收集器96(Orange,CT)收集，且以Wallac 1450閃爍計數器評估增殖。cpm之變化係計算為實驗性cpm-無Ag cpm。

流動細胞計數分析

C57BL/6小鼠係以0.1 LD₅₀ Lm-LLO-E7或Lm-E7靜脈內(i.v)免疫接種且30天後加強。針對CD8(53-6.7，經PE接合)、CD62配位體(CD62L；MEL-14，經APC接合)及E7 H-2Db四聚體之三色流動細胞分析係使用具有CellQuest®軟體之FACSCalibur®流式細胞儀(Becton Dickinson,Mountain View,CA)進行。加強5天後收集之脾細胞在室溫下用負載有E7肽(RAHYNIVTF)或對照(HIV-Gag)肽之H-2Db四聚體染色。四聚體以1/200稀釋度使用且由Dr.Larry R.Pease(MayoClinic,Rochester,MN)及由NIAID Tetramer Core Facility及NIH AIDS研究及參考試劑計劃(NIH AIDS Research and Reference Reagent Program)提供。分析四聚體⁺、CD8⁺、CD62L^低細胞。

B16F0-Ova實驗

24隻C57BL/6小鼠係以5×10⁵個B16F0-Ova細胞接種。在第3天、第10天及第17天，八隻一組的小鼠係以0.1 LD₅₀ Lm-OVA(10⁶個cfu)、Lm-LLO-OVA(10⁸個cfu)免疫接種，且八隻動物保持未經處理。

統計

針對腫瘤直徑之比較，測定各組之腫瘤大小之平均值及SD，且利用史都登氏t試驗法(Student's t test)確定統計顯著性。p

0.05視為顯著。

結果

比較Lm-E7及Lm-LLO-E7影響TC-1生長之能力。皮下腫瘤建立在C57BL/6小鼠之左側腹。七天後，腫瘤已達至可觸知的大小(4-5mm)。小鼠在第7天及第14天用0.1 LD₅₀ Lm-E7、Lm-LLO-E7或作為對照的Lm-Gag及Lm-LLO-NP進行疫苗接種。Lm-LLO-E7誘導75%所建立之TC-1腫瘤之完全消退，同時該組中之另2隻小鼠中之腫瘤生長得到控制(圖3)。相形之下，用Lm-E7及Lm-Gag免疫接種並不誘導腫瘤消退。此實驗多次重複，結果總是極其相似。另外，在不同免疫接種實驗方案下針對Lm-LLO-E7獲得相似結果。在另一實驗中，單次免疫接種能夠治癒小鼠之所建立之5mm TC-1腫瘤。

在其他實驗中，在其他2種表現E7之腫瘤細胞株：C3及EL-4/E7情況下，獲得相似結果。為了證實用Lm-LLO-E7疫苗接種之功效，分別在第60天或第40天用TC-1或EL-4/E7腫瘤細胞再攻擊腫瘤已消除之動物。用Lm-LLO-E7免疫接種之動物保持無腫瘤直至實驗結束(在TC-1情況下為第124天而對於EL-4/E7為第54天)。

因此，抗原以帶有△LLO之融合蛋白質形式表現係增強了抗原之免疫原性。

實例2：LM-LLO-E7處理誘發TC-1特異性脾細胞增殖

為了量測Lm-E7與Lm-LLO-E7對T細胞之誘導，在經免疫接種之小鼠中量測TC-1特異性增殖反應(一種抗原特異性免疫活性的測量)。來自經Lm-LLO-E7免疫接種之小鼠之脾細胞在暴露於做為E7來源之經輻射照射TC-1細胞時，在20：1、40：1、80：1及160：1之脾細胞：TC-1比率下增殖(圖4)。相反地，來自經Lm-E7及rLm對照免疫接種之小鼠之脾細胞僅展示出背景程度之增殖。

實例3：E7與LLO、ActA或PEST序列之融合體增強E7特異性免疫且產生腫瘤浸潤性E7特異性CD8 ⁺ 細胞 材料及實驗方法

將包括100mcl含2×10⁵個TC-1腫瘤細胞之磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)加400mcl(微升)MATRIGEL®之500mcl MATRIGEL®(BD Biosciences,Franklin Lakes,N.J.)皮下植入12隻C57BL/6小鼠之左側腹(n=3)。小鼠在第7天、第14天及第21天腹膜內免疫接種，且在第28天收集脾臟及腫瘤。腫瘤MATRIGEL自小鼠中移除且在4℃下在含有2毫升(ml)RP 10培養基之試管中在冰上培育隔夜。腫瘤用鑷子切碎，切成2mm塊狀物，且在37℃下與3ml酶混合物(0.2mg/ml膠原酶-P、1mg/ml DNAse-1於PBS中)一起培育1小時。組織懸浮液經由耐綸篩過濾且用含5%胎牛血清+0.05% NaN₃之PBS洗滌以用於四聚體及IFN-γ染色。

將脾細胞及腫瘤細胞以10⁷個細胞/毫升在布雷菲德菌素A(brefeldin A)存在下與1微莫耳(mcm)E7肽一起培育5小時。細胞經洗滌兩次且在4℃下在50mcl抗小鼠Fc受體上清液(2.4 G2)中培育1小時或隔夜。細胞針對表面分子CD8及CD62L染色、透化、使用透化試劑組Golgi-stop®或Golgi-Plug®(Pharmingen,San Diego,Calif.)固定，且針對IFN-γ染色。使用雙雷射流式細胞儀FACSCalibur獲得了500,000個事件並使用Cellquest軟體(Becton Dickinson,Franklin Lakes,NJ)分析。計算經活化(CD62L^低)CD8⁺ T細胞內分泌IFN-γ之細胞之百分比。

針對四聚體染色，H-2D^b四聚體裝載有藻紅素(PE)接合之E7肽(RAHYNIVTF，SEQ ID NO：24)，在室溫下染色1小時，且在4℃下用抗別藻藍蛋白(APC)接合之MEL-14(CD62L)及FITC接合之CD8⁺染色30分鐘。分析細胞，比較脾臟及腫瘤中四聚體⁺ CD8⁺ CD62L^低細胞。

結果

為了分析Lm-ActA-E7增強抗原特異性免疫之能力，小鼠用TC-1腫瘤細胞植入且用Lm-LLO-E7(1×10⁷個CFU)、Lm-E7(1×10⁶個CFU)或Lm-ActA-E7(2×10⁸個CFU)免疫接種，或未經處理的(未處理)。來自Lm-LLO-E7及Lm-ActA-E7組之小鼠的腫瘤與Lm-E7或未處理小鼠中相比含有較高百分比之分泌IFN-γ之CD8⁺ T細胞(圖5A)及四聚體特異性CD8⁺細胞(圖5B)。

在另一實驗中，腫瘤負載小鼠經投與Lm-LLO-E7、Lm-PEST-E7、Lm-△PEST-E7或Lm-E7epi，且量測腫瘤內E7特異性淋巴細胞之含量。小鼠在第7天及第14天用0.1 LD₅₀之4種疫苗處理。腫瘤在第21天收集且用CD62L、CD8之抗體及用E7/Db四聚體染色。在用Lm-LLO-E7及Lm-PEST-E7疫苗接種之小鼠中看到腫瘤內四聚體陽性淋巴細胞之百分比增加(圖6A)。此結果在三次實驗中為可再現的(圖6B)。

因此，Lm-LLO-E7、Lm-ActA-E7及Lm-PEST-E7各自有效誘導腫瘤浸潤性CD8⁺ T細胞及腫瘤消退。

實例4：通過小鼠繼代李斯特菌疫苗載體誘發對異源性及內源性抗原的免疫反應增加 材料及實驗方法 細菌菌株

血清型1之單核球增多性李斯特菌10403S(ATCC,Manassas,Va.)為使用在這些研究中的野生型生物體以及以下所述構築體之親代菌株。菌株10403S於腹膜內注入BALB/c小鼠時係具有約5 x 10⁴個CFU的LD₅₀。「Lm-Gag」為一含有使用經修飾穿梭載體pKSV7而穩定整合至李斯特菌基因體中之HIV-1菌株HXB(帶有形成合胞體的表現型之亞型B實驗室菌株)gag基因的重組LM菌株。Gag蛋白質係通過該菌株表現並分泌，如通過西方墨點法所判定。所有的菌株係長在腦心浸液(BHI)培養液或瓊脂盤(Difco Labs,Detroit,Mich)中。

細菌培養

來自於表現繼代抗原及/或融合蛋白之單一殖株的細菌係經選殖並隔夜培養在BHI培養液中。此培養物的等分試樣係以無任何添加劑的狀態下冷凍在-70℃下。由此儲備料，培養物係生長至O.D.600nm的值為0.1至0.2，且其等分試樣係再以無任何添加劑的狀態下冷凍在-70℃下。上述步驟係為製備經選殖的細菌庫而使用，但在每次繼代之後一些細菌殖株係經選殖並檢查靶標抗原的表現情況，如本文中所述。經確定表現外來抗原的殖株係使用於下次的繼代中。

小鼠中的細菌繼代

6至8週大的雌性BALB/c(H-2d)小鼠係購自Jackson Laboratories(Bar Harbor,Me)並保持在無病原體的微隔離器環境中。於冷凍儲存於-70℃下的儲備培養物之等分試樣中的活菌效價係藉由在使用前解凍並塗在BHI瓊脂盤上而判定。總之，5 x 10⁵個細菌係以腹膜內注入BALB/c小鼠。於3天後，脾臟係經收集及均質化，且脾臟均質物的連續稀釋物係隔夜培養在BHI培養液並塗在BHI瓊脂盤上。為進一步的繼代，係再讓等分試樣生長至O.D.600nm的值為0.1至0.2，冷凍在-70℃，並再通過連續稀釋來判定細菌效價。於初始的繼代(繼代0)之後，此序列重複總共4次。

胞內細胞素IFN-γ染色

淋巴細胞係於細胞毒性T細胞(CTL)對於HIV-GAG(AMQMLKETI；SEQ ID No：25)、李斯特菌LLO(GYKDGNEYI；SEQ ID No：26)或HPV病毒基因E7(RAHYNIVTF)(SEQ ID No：24)的抗原決定區存在或不存在下，以濃度1微莫耳培養在含有50U/ml人類重組IL-2及1μl/ml布雷菲德菌素A(brefeldin A(Golgistop^TM；PharMingen,San Diego,CA))的完全RPMI-10中。細胞首先進行表面染色，接著洗滌並使用Cytofix/Cytoperm試劑組根據製造商建議(PharMingen,San Diego,CA)接受胞內細胞素染色。對於胞內IFN-γ染色，係使用與FITC接合的大鼠抗小鼠型IFN-γ單株抗體(殖株XMG 1.2)以及其同型對照抗體(大鼠IgG1；皆來自PharMingen)。總之，10⁶個細胞係在4℃下於含有1%牛血清蛋白及0.02%疊氮化鈉(FACS緩衝液)的PBS中染色30分鐘，隨後在FACS緩衝液中洗滌3次。樣本資料係於FACScan^TM流式細胞儀或FACSCalibur^TM儀器(Becton Dickinson,San Jose,CA)上獲得。針對CD8(PERCP接合，大鼠抗小鼠型，殖株53-6.7， Pharmingen，San Diego，Calif.)、CD62L(APC接合，大鼠抗小鼠型，殖株MEL-14)及胞內IFN-γ之三色流動細胞分析係使用FACSCalibur®流式細胞儀(Becton Dickinson,Mountain View,CA)進行，且資料係進一步以CELLQuest軟體(Becton Dickinson,Mountain View,CA)分析。於針對CD8⁺及胞內IFN-γ染色分析之前，細胞係圈選為CD8高及CD62L^低。

結果 在小鼠中的繼代增加了重組單核球增多性李斯特菌的毒力

使用三種不同的構築體來判定繼代對重組李斯特菌疫苗載體的衝擊。這些構築體中的二者攜載了該繼代抗原中的基因體插入：第一種係包括HIV gag基因(Lm-Gag)，而第二種係包括HPV E7基因(Lm-E7)。第三種(Lm-LLO-E7)係包括針對該與截短型式LLO及編碼prfA(控制李斯特菌毒力因子的正調節因子)的基因融合之繼代抗原之帶有該融合基因的質體。此質體係用以補充prfA陰性突變體，藉以在一活宿主中，選擇壓力會有利於保存該質體，因為沒有該質體細菌是無毒力的。三種構築體全部在體外廣泛地增殖許多細菌世代。

如通過脾臟中存活的細菌數量所量測，繼代細菌在前兩次的每次繼代中會造成細菌毒力的增加。對於Lm-Gag及Lm-LLO-E7，每次繼代的毒力增加直到第二次繼代(圖7A)。該含有質體的構築體Lm-LLO-E7顯示了最急劇的毒力增加。於繼代之前，初始的Lm-LLO-E7免疫接種劑量必須增加至10⁷個細菌且脾臟必須在第2天收集以回收細菌(而對於Lm-Gag係在第3天收集其初始劑量10⁵個細菌)。於初次繼代後，Lm-LLO-E7的標準劑量係足以在第3天收集。對於Lm-E7，在未經繼代的細菌中毒力係增加1.5個數量級(圖7B)。

因此，通過小鼠繼代會增加李斯特菌疫苗菌株的毒力。

繼代增加了單核球增多性李斯特菌菌株誘導CD8 ⁺ T細胞的能力

接著，繼代對於誘導抗原特異性CD8⁺ T細胞的功效係藉由具有對MHC I類特異的免疫顯性肽之胞內細胞素染色法，使用HIV-Gag肽 AMQMLKETI(SEQ ID No：25)及LLO 91-99(GYKDGNEYI；SEQ ID No：26)而判定。10³個CFU的繼代細菌(Lm-Gag)注入小鼠內誘發了顯著數量的HIV-Gag特異性CD8⁺ T細胞，而相同劑量的未經繼代Lm-Gag未誘導出可偵測到的Gag特異性CD8⁺ T細胞。縱然增加未經繼代的細菌劑量100倍，其並未補償其相對的無毒力；事實上，甚至在較高劑量下並未有可偵測到的Gag特異性CD8⁺ T細胞被誘發。隨著經繼代的細菌之相同劑量增加係增加了50%的Gag特異性T細胞誘導(圖8)。相同的抗原特異性CD8⁺ T細胞誘導模式係在LLO特異性CD8⁺ T細胞上觀察到，顯示這些結果並未由繼代抗原的特性所造成，因為其在LLO(內源性李斯特菌抗原)上可觀察到。

因此，通過小鼠繼代會增加李斯特菌疫苗菌株的免疫原性。

實例5：在沒有抗生素下含有PrfA的質體在具有PrfA缺失的LM菌株中係穩定的 材料及實驗方法 細菌

單核球增多性李斯特菌菌株XFL7係在prfA基因中含有300個鹼基對缺失。XFL7攜載可部分恢復毒力並授予CAP耐受性的pGG55，且已在美國專利申請公開案第200500118184號中描述。

自李斯特菌萃取質體的實驗方案開發

1mL的單核球增多性李斯特菌Lm-LLO-E7研究工作細胞庫小管係接種至27mL含有34μg/mL CAP的BH1培養基中並在37℃及200rpm下生長24小時。

七個該培養物的2.5mL樣本係沉澱成粒(以15000rpm進行5分鐘)，且沉澱物係以50μl溶菌酶溶液在37℃下培養不同的時間量(自0至60分鐘)。

溶菌酶溶液：

- 29μl 1M磷酸氫二鉀

- 21μl 1M磷酸二氫鉀

- 500μl 40%蔗糖(已通過0.45/μm的濾膜進行過濾滅菌)

- 450μl水

- 60μl溶菌酶(50mg/mL)

於與溶菌酶一起培養之後，其懸浮液係依前述方法離心並丟棄上清液。各沉澱物係接著藉由一改良版QIAprep Spin Miniprep Kit®(Qiagen,Germantown,Maryland)實驗方案而接受質體萃取。對於該實驗方案的改變如下：

1.緩衝液PI、P2及N3的體積係全部增加3倍以讓增加的生物體完全裂解。

2.於加入P2之前將2mg/mL溶菌酶加入再懸浮細胞中。裂解溶液係接著於中和之前在37℃下培養15分鐘。

3.質體DNA係再懸浮成30μL而非50μL，以增加濃度。

於其他實驗中，細胞係在P1緩衝液及溶菌酶中培養15分鐘，接著在室溫下與P2(裂解緩衝液)及P3(中和緩衝液)一起培養。

來自於各繼代培養物的等體積分離質體DNA係在0.8%瓊脂糖凝膠上跑膠並以溴化乙菲錠染色及顯影任一結構或分離不穩定性的跡象。

這些結果顯示了由單核球增多性李斯特菌Lm-LLO-E7所萃取的質體提高了隨溶菌酶培養時間增加的功效，且在約培養50分鐘時達至最佳程度。

這些結果提供了由李斯特菌疫苗菌株萃取質體的有效方法。

複印培養

原培養物的稀釋物係於塗在存有或未存有34μg/mL CAP之含有LB或TB瓊脂的培養皿上。選擇性瓊脂或非選擇性瓊脂上的菌落數差異係用以判定該質體是否有任何顯見的分離不穩定性。

結果

pGG55質體於沒有抗生素下在單核球增多性李斯特菌菌株XFL7中的基因穩定性(即在缺少選擇壓力下該質體被細菌保留或保持穩定與該細菌相關聯的程度；例如，抗生素選擇壓力)係藉由在Luria-Bertani培養基(LB：5g/L NaCl、10g/ml大豆蛋白腖、5g/L酵母菌萃取物)及Terrific Broth培養基(TB：10g/L葡萄糖、11.8g/L大豆蛋白腖、23.6g/L酵母菌萃取物、2.2g/L KH₂PO₄、9.4g/L K₂HPO₄)二者中以二重複培養方式的連續繼代培養而評估。裝在250mL擋板搖瓶中的50mL新鮮培養基係以固定數量的細胞(1 OD mL)接種，接著以24小時的間隔繼代培養。培養物係在37℃下以200rpm於一軌道振盪器中進行接種。於每次繼代培養時係測量其OD₆₀₀值以用於計算經過的細胞倍增時間(或其世代)，直至在LB培養基中達到30個世代或在TB培養基中達到42個世代。在每一繼代培養階段(約每4個世代)中係藉由離心將已知數量的細胞(15 OD mL)沉澱成粒，且質體DNA係使用上述Qiagen QIAprep Spin Miniprep®實驗方案進行萃取。於純化後，質體DNA係接受瓊脂糖凝膠電泳，接著進行溴化乙菲錠染色。儘管於該等樣本之間在製備中的質體數量有輕微的變化，關於細菌的世代數量其整體趨勢為一恆定數量的質體(圖9A-B)。因此，pGG55表現出在菌株XFL7中的穩定性，即使在沒有抗生素的情況下。

在瓊脂培養皿上利用複印培養對各階段繼代培養的穩定性研究中亦監測了質體的穩定性。與瓊脂糖凝膠電泳的結果一致，在整個LB或TB液體培養(分別為圖10及11)的研究中含有質體的細胞數量整體上並沒有變化。

這些發現顯示出編碼prfA質體在沒有抗生素下表現了其在含有prfA突變的李斯特菌菌株中的穩定性。

材料與方法(實例6-10)

PCR試劑：該等用以擴增prfA基因及鑑別D133V突變之引子係顯示於表1之中。該等引子ADV451、452及453之儲備液係藉由稀釋TE緩衝液中的引子至400μM而製備。儲備液的等分試樣係進一步以水(PCR等級)稀釋至20μM以製備工作溶液。該等引子係儲存在-20℃下。使用於PCR中的試劑係顯示於表2之中。

質體DNA的製備

具有(pGG55 D133V)或不具有(pGG55 WT)prfA突變的pGG55質體係使用PureLink^TM HiPure Plasmid Midiprep Kit(Invitrogen,K2100-05)根據製造商的說明藉由大腸桿菌或單核球增多性李斯特菌的小量製備進行萃取及純化。對於來自李斯特菌的質體純化，攜載pGG55 D133V 或野生型質體的細菌菌株係由冷凍的儲備料劃線塗在含有氯黴素(25μg/ml)的BHI瓊脂培養皿中。取自各菌株的單一菌落係在5ml選擇性培養基中(具有25μg/ml氯黴素的BHI培養液)以劇烈搖晃方式在37℃下生長6小時，以1：500比例下接種於100ml選擇性培養基之中並在近似的條件下隔夜生長。取自隔夜培養物的細菌係藉由在4,000 x g下離心10分鐘而收集，並再懸浮於含有2mg/ml溶菌酶(Sigma,L7001)的緩衝液R3(再懸浮緩衝液)之中。細菌懸浮物於進行常規的實驗方案之前係在37℃下培養至少1小時。溶出質體之濃度及純度係在分光光度計中以260nm及280nm量測。為製備模板DNA，pGG55 D133V及WT質體係由該小量製備儲備液再懸浮於水中，最終濃度為1ng/μl。對於pGG55 WT質體，係由該1ng/μl溶液製備連續10倍稀釋液，其係對應10^-1至10^-7的稀釋度。

測試臨床等級材料之prfA特異性PCR實驗方案

反應混合物係含有1倍PCR緩衝液、1.5mM MgCl₂、0.8mM dNTPs、各為0.4μM的引子、0.05U/μl的Taq DNA聚合酶以及0.04ng/μl的pGG55 D133V模板質體。每一試驗中，係需要10個小管且各管中的25μl反應溶液之關鍵組分係顯示於表3之中。在PCR反應中，係以足夠用於11個反應的試劑製備主要混合液(如在表4中所示)，且此PCR混合液中的24μl係加入至各小管內。隨後，總量為1μl的連續稀釋pGG55 WT質體係加入至對應的小管中：管3中為1ng；管4中為100pg；管5中為10pg；管6中為1pg；管7中為100fg；管8中為10fg；管9中為1fg；管10中為0.1fg。此連續稀釋度係用以計算出標準曲線以判定該方法的靈敏度。此外，0.5μl的水及0.5μl的引子ADV451(20μM儲備液)係加入管1，且1μl的水係加入管2中，而完成25μl的最終體積。每小管中用於25μl的反應的之各試劑數量係顯示於表5中。使用在該反應中的PCR循環條件係顯示於表6中。

於PCR反應結束後，5μl的注膠緩衝液(6倍，具有溴酚藍)係加入至各樣本中且其10μl係通過在TBE緩衝液中的1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析。凝膠尺寸為7公分 x 7公分且具有15個樣本槽(1毫米 x 2毫米)梳齒。此凝膠係在100V下跑膠~30分鐘，直至溴酚藍染劑達到凝膠的中間。此凝膠係以溴化乙菲錠(0.5μg/ml)染色20分鐘，在水中去染10分鐘。此凝膠係照以UV光以顯影及攝像。其影像係使用吸光帶密度測定軟體分析(Quantity One version 4.5.1,BioRad)。

^a pGG55 WT(管3中為1ng；管4中為100pg；管5中為10pg；管6中為1pg；管7中為100fg；管8中為10fg；管9中為1fg；管10中為0.1fg)。^b 在管1中加入0.5μl的水及0.5μl的引子ADV451(20μM儲備液)；在管2加入1μl的水。

定序：

該等質體的定序係使用雙脫氧定序法而完成。質體pGG55 D133V及pGG55 WT係以不同比例(1：1、1：10、1；100、1：1,000及1：10,000)混合。質體於混合物中的總量係維持恆定(500μg)，且該含有野生型序列的質體係以相對於該D133V質體的10倍連續稀釋而判定該方法的靈敏度。

結果 實例6：定序並非是靈敏的D133V突變復原偵測方法。

為評估定序在偵測野生型prfA序列時的靈敏度，pGG55 D133V及WT質體係以不同的比例混合並定序。其結果係顯示於圖12中，並顯示出定序在鑑別prfA D133V突變時有高度的特異性(圖12)。另一方面，其靈敏度低且在序列中具有可偵測的波峰之野生型prfA pGG55質體最大稀釋度為1/10(圖12)。總而言之，儘管定序是非常有特異性的，但該方法的靈敏度低且不適合用來篩選稀有事件的存在，諸如在Lm-LLO-E7樣本中的prfA D133V突變之反突變體。

實例7：偵測D133V突變復原之高特異性及靈敏性PCR方法之開發。

鑒於定序對偵測稀有事件的低靈敏性，有必要開發具有相似特異性之更靈敏方法以偵測D133V突變復原成野生型。為達此目標，我們設計了一種基於PCR的方法，其特別擴增野生型序列且有足夠的靈敏度在D133V突變序列的10,000,000個複本中偵測至少一prfA的野生型複本。我們設計了3種引子用於此方法中：ADV451、ADV452及ADV453(表1)。ADV451及ADV452二者為正向引子且其在3’位置的最後一個核苷酸不同，以鑑別在prfA基因的398位置處之A→T(D133V)突變。ADV453引子為位於ADV451及ADV452引子黏合位置下游約300個鹼基處之反向引子(圖13)。期望以引子ADV451或ADV452及ADV453獲得的PCR吸光帶為326個鹼基。在嚴格條件下，ADV451引子應只擴增pGG55 D133V質體，而ADV452會對野生型prfA基因有特異性。

實例8：PCR方法的特異性。

使用引子ADV451的反應係非常有特異性且擴增經突變的D133V prfA序列(泳道1至3)，而非該野生型序列(泳道4至6)。然而，當使用5ng的模板DNA時，在泳道4中可偵測到非常微弱的吸光帶，但以1ng則無法偵測到(圖14)。

如在圖15中所示，使用ADV452引子的反應只擴增野生型prfA序列(泳道4、5、6)，且當使用攜載D133V prfA突變之pGG55做為模板時係無法偵測到吸光帶(泳道1、2、3)，甚至在反應中使用5ng的質體時(圖16)。總而言之，該等使用引子ADV451及ADV452的PCR反應係非常有特異性且能夠鑑別出pGG55質體中在prfA基因398位置處的A

T(D133V)突變。根據這些結果，我們選出1ng的用量做為模板DNA在反應中所使用的標準用量。

實例9：PCR方法的靈敏度。

反應的靈敏度係使用1ng的模板DNA來測試。對於攜載野生型prfA序列的質體，用量漸少的DNA(對應10^-1至10^-7的10倍稀釋度)係包含在反應中以評估靈敏度。於這些反應中僅有引子ADV452及ADV453被使用。於有30個循環的PCR反應中(10個循環使用黏合溫度53℃，另外的20個循環使用黏合溫度50℃)，該方法的靈敏度為1/100,000(資料未顯示)。如圖5中所示，對於D133V反突變體的偵測將PCR的循環數增至37個循環會改善該方法的視覺靈敏度至10^-6，且沒有顯著損害其特異性。當使用1ng的質體做為DNA初始用量時，於10^-6稀釋物中可見到一明顯的吸光帶，其對應了在一百萬個D133V突變體中一個野生型序列複本的偵測程度。於長時間曝光後只有在泳道1及9中見到非常微弱的吸光帶，再度確保該方法穩健的特異性。另一方面，當在一開始使用5ng的DNA時，可在10^-7稀釋物中輕易偵測到吸光帶而增加PCR的靈敏度。然而，相似強度的吸光帶亦可使用pGG55 D133V質體而偵測到，顯示出該方法的特異性極限(圖17)。使用pGG55 D133V質體所觀察到的吸光帶可能是因使用引子ADV452的D133V突變的非特異性擴增而產生，其可隨著循環數的增加而顯著累積。這些結果指出此方法在沒有顯著損害特異性下的靈敏度極限係位於1：1,000,000至1：10,000,000之間。

實例10：表現具有LLO於E7上(LM-LLO-E7)之融合蛋白的重組李斯特菌

此菌株係比野生型親代菌株10403S減毒約4至5logs，並分泌融合蛋白tLLO-E7。此免疫療法係基於通過毒力基因轉錄活化子prfA的不可逆缺失而由10403S衍生之XFL7架構。PrfA係調節數個毒力基因的轉錄，諸如李斯特菌溶解素O(LLO)、ActA、PlcA(磷脂酶A)、PlcB(磷脂酶B)等，該等基因係單核球增多性李斯特菌之體內胞內生長及存活所需。在體外質體pGG55係由Lm-LLO-E7通過以氯黴素選擇的手段而保留。然而在體內由Lm-LLO-E7所保留的質體係攜載經突變的prfA(D133V)的複本，其在DNA的結合與該等毒力基因的轉錄活化上已表現出比野生型PrfA的活性較低。我們已觀察到當與野生型菌株10403S相比時，使用經突變的prfA補充會導致由Lm-LLO-E7所分泌的LLO量降低約40倍。這意味著菌株Lm-LLO-E7可能表現出由PrfA所調節的毒力基因(諸如actA、inlA、inlB、inlC、plcB等)的表現降低。於Lm-LLO-E7中，使用經突變的prfA複本補充可能造成由PrfA所調節的不同毒力基因的表現降低，導致了約4至5logs的全面衰減。

儘管本發明的某些特徵已經在本文中圖示並描述，本領域技術人員可想到許多修改、替換、改變或等效物。因此，應理解所附申請專利範圍係意欲涵蓋落入本發明真實精神內的所有此類修改及改變。

<110> 美商艾德凡斯有限公司

<120> 重組李斯特菌疫苗菌株及產製該菌株之方法

<130> P-77775-USP

<140> 104112751

<141> 2015-04-21

<160> 36

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 32

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 1

<210> 2

<211> 441

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 2

<210> 3

<211> 529

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 3

<210> 4

<211> 416

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 4

<210> 5

<211> 390

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 5

<210> 6

<211> 1170

<212> DNA

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 6

<210> 7

<211> 14

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 7

<210> 8

<211> 28

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 8

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 9

<210> 10

<211> 33

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 10

<210> 11

<211> 17

<212> PRT

<213> 鏈球菌屬G148

<400> 11

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> 類馬鏈球菌

<400> 12

<210> 13

<211> 98

<212> PRT

<213> 人類乳突狀瘤病毒類型16

<400> 13

<210> 14

<211> 105

<212> PRT

<213> 人類乳突狀瘤病毒類型16

<400> 14

<210> 15

<211> 158

<212> PRT

<213> 人類乳突狀瘤病毒類型16

<400> 15

<210> 16

<211> 158

<212> PRT

<213> 人類乳突狀瘤病毒類型16

<400> 16

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 17

<210> 18

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 18

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<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

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<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

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<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 21

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 22

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 23

<210> 24

<211> 9

<212> PRT

<213> 人類乳突狀瘤病毒類型16

<400> 24

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> 人類免疫缺乏病毒

<400> 25

<210> 26

<211> 9

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 26

<210> 27

<211> 55

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引子

<400> 27

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<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於擴增prfA基因及鑑別D133V突變之ADV451正向引子

<400> 28

<210> 29

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於擴增prfA基因之ADV452正向引子

<400> 29

<210> 30

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 用於擴增prfA基因之ADV453正向引子

<400> 30

<210> 31

<211> 714

<212> DNA

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 31

<210> 32

<211> 237

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 32

<210> 33

<211> 714

<212> DNA

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 33

<210> 34

<211> 237

<212> PRT

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 34

<210> 35

<211> 364

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> Lovaxin_C_pGG55

<400> 35

<210> 36

<211> 364

<212> DNA

<213> 單核球增多性李斯特菌

<400> 36

Claims

一種重組李斯特菌菌株，該重組李斯特菌菌株包括游離(episomal)質體，該質體包含重組核酸，該核酸包括編碼重組多肽之第一開放讀碼框架，該重組多肽包括融合至異源抗原或其片段之LLO蛋白質的N端片段，且其中該重組核酸更包括編碼突變型PrfA蛋白質之第二開放讀碼框架，該突變型PrfA蛋白質包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列。
如請求項1之重組李斯特菌菌株，其中該李斯特菌在該prfA基因中包括缺失、不活化或突變。
如請求項1之重組李斯特菌菌株，其中該突變型PrfA蛋白質係由SEQ ID NO：33所編碼。
如請求項2之重組李斯特菌菌株，其中由該第二開放讀碼框架所編碼之突變型PrfA蛋白質補足(complement)於該李斯特菌菌株中的prfA基因體突變、缺失或不活化，或修補於該李斯特菌菌株中的部分PrfA功能。
如請求項1之重組李斯特菌菌株，其中該異源抗原係為人類乳突狀瘤病毒-E7(HPV-E7)或HPV-E6。
如請求項5之重組李斯特菌菌株，其中該HPV-E7係來自HPV16。
如請求項1之重組李斯特菌菌株，其中該LLO蛋白質之N端片段係選自包括SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4之序列，或其中該LLO蛋白質之N端片段為SEQ ID NO：3之片段。
如請求項1之重組李斯特菌菌株，其中該重組李斯特菌菌株係重組單核球增多性李斯特菌菌株。
一種醫藥組合物，其包括如請求項1至8中任一項之重組李斯特菌菌株。
一種如請求項1至8中任一項之重組李斯特菌菌株的用途，其係用於製備在人類個體中針對腫瘤或癌症誘導免疫反應的藥物。
如請求項10之用途，其中該李斯特菌係通過靜脈注射或口服給藥而投與該個體。
如請求項11之用途，其中該藥物中的重組李斯特菌菌株係以1 x 10⁷至3.31 x 10¹⁰個有機體之劑量投與該人類個體。
如請求項12之用途，其中該重組李斯特菌菌株於投與前係儲存於冷凍或冷凍乾燥狀態中。
如請求項10之用途，其更包括以該包括重組李斯特菌菌株之藥物增強(boosting)該人類個體之步驟。
如請求項10之用途，其進一步包括以包括或引導該E7抗原表現之免疫原性組合物接種該人類個體之步驟，或進一步包含投與其他治療劑至該個體之步驟。
如請求項10之用途，其中該免疫反應係細胞毒性T細胞抗腫瘤免疫反應。
如請求項10之用途，其中該用途係致使保護個體對抗腫瘤或癌症。
如請求項10之用途，其中該用途係致使針對腫瘤或癌症治療個體。
如請求項17或18之用途，其中該癌症係子宮頸癌、頭頸癌(HNC)或肛門癌。