CN118900696A - 雄性避孕 - Google Patents

Abstract

本发明总体涉及雄性对象的避孕方法，所述雄性对象可以是人或非人哺乳动物。本发明人意外地发现，透明带(ZP)蛋白，特别是透明带蛋白3(ZP3)，在人和小鼠睾丸的精原细胞、精母细胞和圆形和细长精子细胞中表达，但在成熟精子、支持细胞、间质细胞、精原干细胞和祖细胞中不存在。基于这些发现，透明带蛋白，特别是ZP3，构成免疫避孕策略的合适靶标，特别是旨在诱导暂时性和可逆性雄性不育的策略。

Description

雄性避孕

技术领域

本发明总体涉及雄性对象的避孕方法，所述雄性对象可以是人或非人哺乳动物。更具体地，本发明涉及抗原源，所述抗原源提供由精原细胞、精母细胞和精子但不由睾丸支持细胞、间质细胞、精原干细胞和祖细胞表达的蛋白质的至少一个免疫原性部分，所述抗原源优选为透明带(ZP)蛋白，尤其是ZP3蛋白。此类抗原源可用于可逆性雄性避孕处理的疫苗和药物组合物中。

发明背景

女性有多种避孕方法可供选择，但男性避孕选择仍然有限。避孕套是最受欢迎的选择，但存在一些缺点，例如感觉下降以及使用时需要谨慎。第二种选择是输精管切除术，但这种方法具有侵入性并且很大程度上不可逆。基于激素(单独使用雄激素或与孕激素组合使用)的雄性避孕方法已经被广泛测试，但未能完全抑制所有男性的精子发生。此外，这些方法涉及给予相对高剂量的睾酮和孕激素制剂，这通常会引起副作用，例如痤疮、情绪变化、体重增加、盗汗和性欲改变。人们一直担心长期使用雄激素的安全性。目前，有几个开发基于激素的雄性避孕药的项目(例如，联用内甾酮(nestorone)-睾酮凝胶或使用促孕雄激素-二甲雄龙17β-十一酮的雄性避孕药)正在进行中，但尚未证明其足够的功效和安全性。

显然，开发雄性避孕药是一项重大的医学挑战，仍然需要一种有效的可逆雄性避孕药。理想的雄性避孕药将是有效、安全、完全可逆的，并且可供广大潜在用户使用。其他考虑因素包括减少方案生效和逆转所需的时间、尽量减少并鉴定“无效者”以及确定长期安全性。

本发明的目的是提供用于雄性避孕的新型免疫治疗策略。

发明内容

本发明人意外地发现，透明带(ZP)蛋白，特别是透明带蛋白3(ZP3)，在人和小鼠睾丸的精原细胞、精母细胞和圆形和细长精子细胞中表达，但在成熟精子(spermatozoa)、支持细胞(Sertoli cell)、间质细胞(Leydig cells)、精原干细胞和祖细胞中不存在。基于这些发现，透明带蛋白，特别是ZP3，构成免疫避孕策略的合适靶标，特别是旨在诱导暂时性和可逆性雄性不育的策略。

ZP3通常存在于雌性中所谓的‘透明带’中，透明带形成围绕卵母细胞的胞外基质。该透明带会诱导精子的顶体反应，确定受精的物种特异性并防止哺乳动物的多精受精。

基于ZP蛋白的雌性免疫避孕已经成熟，尤其是在大型野生动物中(参见，例如，Gupta和Minhas，Frontiers In Bioscience，2017，Scholar，9，357-374，http：//www.bioscience.org/2017/v9s/af/492/2.htm；Mask等，2015，Theriogenology；84(2)：261-267)。已进行了大量研究，其中生育力的下降与抗体滴度有关(Shresta等，2015，Vaccine 33，133-140；Harris等，1999，Protein Expr Purif；16(2)：298-307；Martinez和Harris，2000，J Reprod Fertil.；120(1)：19-32)。

WO 89/03399涉及使用单克隆透明带抗体或透明带抗原(引发抗体反应)对女性进行免疫避孕。根据WO 89/03399，抗ZP抗体通过干扰精子对透明带的结合或穿透来抑制受精，而不会对卵巢功能产生不利影响。据称，该方法可以通过影响精子透明带反应来诱导暂时性不孕症。

本方法不依赖于抑制精子与透明带的结合或穿透，而是依赖于抑制睾丸中的精子发生，即，通过引发针对已发现表达ZP蛋白的精原细胞、精母细胞和/或精子细胞的免疫反应。

通过引发针对ZP蛋白和异位表达ZP的癌细胞的体液和/或细胞免疫反应的概念已被提出并证明可用于治疗某些癌症类型。Rahman等人(基于透明带蛋白(ZP)3免疫的卵巢癌新治疗策略.FASEB J.2012年1月；26(1)：324-33)证明，通过分别引发针对ZP3蛋白和表达ZP3的细胞的体液和细胞疫苗接种，可以治疗转基因小鼠中的恶性卵巢肿瘤。这些发现和类似的发现也已在以下中描述：国际专利公开WO2007/058536，其涉及治疗卵巢癌的免疫治疗方法；WO2019/086507，其涉及治疗肺癌的免疫治疗方法；WO2012/026820，其涉及治疗前列腺癌的免疫治疗方法；以及WO2016080830，其涉及治疗胰腺癌的免疫治疗方法

此前从未发现过ZP蛋白在人或动物精原细胞、精母细胞和精子细胞或睾丸中通常存在的任何其他类型细胞中的表达。因此，本发明首次提供了基于针对ZP蛋白的体液和/或细胞免疫反应的雄性对象避孕方法。由于睾丸支持细胞、间质细胞、精原干细胞和祖细胞不表达ZP蛋白(因此不会被免疫反应靶向)，所以在停止ZP3处理和免疫反应减弱后，精子发生可以重新开始，并且可以恢复正常生育力。Rahman等人已经证明了针对ZP蛋白的免疫反应可能是暂时的(FASEB J.2012年1月；26(1)：324-33，如上文所述)。这些发现意味着，本发明的方法引起的不育状态可能是暂时的/可逆的。

因此，本发明的第一方面涉及一种处理雄性对象的方法，特别是用于雄性对象的避孕方法，所述方法包括给予一种药物组合物，所述药物组合物包括：

a)免疫原性多肽源，其包含来自人透明带蛋白(hZP)的氨基酸序列的I类MHC限制性表位和II类MHC限制性表位中的至少一种；

b)T细胞，其包含与MHC-肽复合物结合的T细胞受体，其中所述肽是来自hZP的氨基酸序列的肽；或者，

c)特异性结合hZP的抗体或其片段；

其中优选地，hZP蛋白是人透明带蛋白3(hZP3)。

本发明的另一个方面涉及一种药物组合物，其包含：

a)免疫原性多肽源，其包含来自人透明带蛋白(hZP)的氨基酸序列的I类MHC限制性表位和II类MHC限制性表位中的至少一种；

b)T细胞，其包含与MHC-肽复合物结合的T细胞受体，其中所述肽是来自hZP的氨基酸序列的肽；或者，

c)特异性结合hZP的抗体或其片段；

其中优选地，hZP蛋白是人透明带蛋白3(hZP3)，用于处理雄性对象的方法，特别是用于雄性对象的避孕方法。

然而，本发明的另一个方面涉及以下：

a)免疫原性多肽源，其包含来自人透明带蛋白(hZP)的氨基酸序列的I类MHC限制性表位和II类MHC限制性表位中的至少一种；

b)T细胞，其包含与MHC-肽复合物结合的T细胞受体，其中所述肽是来自hZP的氨基酸序列的肽；或者，

c)特异性结合hZP的抗体或其片段；

其中优选地，hZP蛋白是人透明带蛋白3(hZP3)，在制备用于处理雄性对象的方法(特别是用于雄性对象的避孕方法)的药物组合物中的用途。

本发明的其他方面涉及药物组合物，其包含：

a)免疫原性多肽源，其包含来自人透明带蛋白(hZP)的氨基酸序列的I类MHC限制性表位和II类MHC限制性表位中的至少一种；

b)T细胞，其包含与MHC-肽复合物结合的T细胞受体，其中所述肽是来自hZP的氨基酸序列的肽；或者，

c)特异性结合hZP的抗体或其片段；

其中优选地，hZP蛋白是人透明带蛋白3(hZP3)；以及试剂盒，所述试剂盒包括含有一个或多个此类药物单位剂型的包装，以及含有印刷说明的说明书，用于在雄性对象中/作为雄性对象中的避孕方法给予一种或多种所述单位剂型。

应理解，除非另有明确说明，否则本发明的这些方面均涉及相同的组合物、相同的处理方法、相同的对象等。基于以下详细描述和附加的实验部分，本领域技术人员将清楚上述方法以及其中使用的组合物和药物试剂盒的具体细节和优选实施方式。

具体实施方式

对于本发明的方法，所要处理的对象优选为雄性，可以是人或非人哺乳动物。优选地，所要处理的对象是男性。本方法可在任何育龄雄性对象上实施。在本发明的优选实施方式中，对象为年龄为16岁或以上、优选为18岁或以上、20岁或以上、25岁或以上、30岁或以上或35岁或以上的男性。

在本发明的某些实施方式中，所要处理的对象不患有肺癌、前列腺癌或胰腺癌和/或任何与其直接相关的病理。在本发明的某些实施方式中，所要处理的对象不患有肺癌、前列腺癌或胰腺癌和/或任何与其直接相关的病理，其中癌细胞表达一种或多种或所有ZP蛋白。在本发明的进一步实施方式中，对象不患有任何涉及ZP蛋白和/或表达ZP的细胞的疾病或病理。在本发明的某些实施方式中，对象是健康对象。

本文与‘对象’直接结合使用的术语“处理”、“处置”或“治疗”(例如：“处理对象的方法”)通常是指向所述对象给予药物组合物的行为，无论其是用于治疗目的还是非治疗目的。这不应与与特定疾病或症状结合使用的术语“治疗”、“处理”或“处置”相混淆(例如：“治疗疾病的方法……”)，在这种情况下，这些术语确实暗示治疗或预防目的。

从本文之前的解释中可以明显看出，根据本发明处理雄性对象的方法总体上来说会影响精子发生，从而导致不育状态、生育力下降、无法使雌性性伴侣受孕等。因此，在本发明的特别优选的实施方式中，提供了一种如本文定义的方法，其中所述方法是雄性的避孕方法。在本发明的其他实施方式中，提供了如本文所定义的方法，其中所述方法是降低雄性生育力的方法、诱导雄性不育的方法、抑制精子发生的方法、诱导少精的方法、诱导无精的方法、显著减少精子数量的方法、诱导严重少精状态的方法、减少MOT的方法、减少TMS的方法和/或减少精液量的方法。在本发明的一个实施方式中，该方法导致精子数量少于5·10⁶个精子/ml精液，例如少于2.5·10⁶个精子/ml精液、少于1·10⁶个精子/ml精液、少于5·10⁵个精子/ml精液或少于1·10⁵个精子/ml精液，或最好是简单地无精子。

在本发明的优选实施方式中，如上文所定义的处理效果是可逆的或暂时的。在本发明的特别优选的实施方式中，雄性生育力参数，例如精子数量、精子活动力、MOT、TMS和精液量，在处理终止后恢复到基线水平的50％以上，例如60％以上、70％以上、80％以上或90％以上，其中基线水平是指处理开始之前的水平。在本发明的特别优选的实施方式中，雄性生育力参数，例如精子数量、精子活动力、MOT、TMS和精液量，在处理终止后恢复到正常生育雄性平均水平的50％以上，例如60％以上、70％以上、80％以上或90％以上。通常，所述雄性生育参数在处理终止后5年内，例如4年内、3年内、2.5年内、2年内、1.5年内、1年内、10个月内、8个月内、6个月内、5个月内、4个月内或3个月内恢复到所示水平。

基于本教导，本领域技术人员将理解，本发明的方法可能需要对雄性对象进行重复处理，即通过给予本文定义的药物组合物的加强剂量。因此，在本发明的某些实施方式中，提供了本文定义的方法，其中通过每3年一次、每2年一次、每年一次、每10个月一次、每8个月一次、每6个月一次、每5个月一次、每4个月一次、每3个月一次、每2个月一次或每月一次给予避孕有效量的药物组合物来处理雄性对象。基于本教导，本领域技术人员将理解，只要雄性对象希望保持不育状态(或者，如果雄性对象是非人哺乳动物，则只要希望所述非人哺乳动物保持不育状态)，就可以继续根据该方案对雄性对象进行处理。在本发明的某些实施方式中，该方法包括重复给予本发明的药物组合物，优选根据本文定义的方案，持续至少6个月，更优选至少9个月、至少12个月、至少2年、至少3年、至少4年或至少5年。

如本文所用，术语“避孕有效的″是指足以达到避孕效果″，本领域技术人员将基于本教导理解这一点。通常，“避孕有效量”是指足以达到前述定义的任何一种或任何组合效果的剂量或量和/或足以引发针对(天然)ZP糖蛋白和表达ZP蛋白的细胞的原发性(自身)免疫反应的剂量或量。这种有效剂量将取决于多种因素，包括患者的状况和总体健康状态。因此，基于本教导，受过训练的医务人员可以确定和调整给药方案，以提供最佳的治疗或预防效果。

本文所用的术语“药物组合物”是指任何化合物、材料、组合物和/或剂型，其在合理的医学判断范围内，适合以某种肠(胃外)的形式给予哺乳动物，尤其是人，而不会引起过度的毒性、刺激、过敏反应和其他并发症，且具有合理的效益/风险比。

如前文所定义，本发明的方法包括给予药物组合物，所述药物组合物包括：

a)免疫原性多肽源，其包含来自人透明带蛋白(hZP)的氨基酸序列的I类MHC限制性表位和II类MHC限制性表位中的至少一种；

b)T细胞，其包含与MHC-肽复合物结合的T细胞受体，其中所述肽是来自hZP的氨基酸序列的肽；或者，

c)特异性结合hZP的抗体或其片段；

其中优选地，hZP蛋白是人透明带蛋白3(hZP3)，并且其中组合物通常以避孕有效剂量或量给予。

本文中使用的术语“透明带蛋白”通常指人或哺乳动物透明带中发现的任何蛋白质。透明带是卵巢内每个卵泡内发育中的卵母细胞(卵、卵子)周围的特化的胞外基质。该基质被认为是由卵母细胞和卵泡颗粒细胞的分泌物形成的，并且在人卵母细胞中由四种类型的透明带糖蛋白ZP1、ZP2、ZP3和ZP4组成，它们在受精中具有不同的作用。多年来，ZP糖蛋白成分的命名一直不太一致，采用了包括表观分子量、蛋白质序列长度和序列同一性比较在内的多种标准，导致命名混乱。Harris等人[(1994)DNA seq.96：829-834]提出了一种统一的命名法，其中ZP基因按其编码蛋白质序列的长度从最长到最短的顺序命名。根据这些标准，由于小鼠ZP基因的顺序为ZP2、ZP1、ZP3，因此引入了一个新系统，其中ZP2变为ZPA，ZP1变为ZPB，ZP3变为ZPC。Hughes等[(1999)BBA-Gene Structure and Expression 1447：303-306]等报告称，已知小鼠ZP1基因的真正人直系同源物不是ZPB，但存在不同的人ZP1基因。现在普遍认为，有四个不同的(人)ZP糖蛋白家族ZP1、ZP2、ZP3和ZPB[参见Lefievre等(2004)Hum.Reprod.19：1580-1586]。根据此命名法，ZPB糖蛋白现在也称为ZP4。该命名法例如应用于Uniprot/SWISSprot、ensEMBL、BLAST(NCBI)、SOURCE、SMART、STRING、PSORT2、CDART、UniGene和SOSUI数据库，所有这些数据库均在Bioinformatic Harvester(http：// harvester.embl.de)中实施。

据此，本文使用术语ZP1、ZP2、ZP3和ZP4来表示四个ZP糖蛋白家族，其中ZP2、ZP3和ZP4分别对应于ZPA、ZPC和ZPB，这符合Harris等人提出的命名法。更具体地说，本文使用的术语hZP1、hZP2、hZP3和hZP4分别指具有SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ IDNO.4中列出的多肽骨架的蛋白质及其等位基因变体。

根据本发明，ZP蛋白最优选是ZP3蛋白。

相应的术语ZP和hZP也涵盖了自然界中可能出现的ZP序列的等位基因变体。等位基因变体特别包括由单核苷酸多态性(SNP)产生的变体。SNP可能落入基因的编码序列、基因的非编码区或基因之间的基因间区域内。编码序列内的SNP不一定会改变所产生的蛋白质的氨基酸序列。两种形式导致相同多肽序列的SNP被称为同义突变(有时称为沉默突变)-如果产生不同的多肽序列，则它们是非同义的。要将变体视为SNP，它必须出现在至少1％的群体中。在本发明的上下文中，`等位基因变体`还可以包括由(非同义)突变产生的多肽序列变体，即，由出现在不到1％的群体中的点突变、插入、缺失等产生的多肽变体。

因此，根据本发明，术语hZP1、hZP2、hZP3和hZP4包括与SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4分别存在微小序列修饰而不同的ZP蛋白。这类修饰包括但不限于：一个或几个氨基酸的变化，包括缺失(例如，肽的截短版本)、插入和/或取代。

‘等位基因变体’在本文中理解为与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的任一个具有至少90％、优选至少95％、更优选至少97％、再更优选至少98％、再更优选至少99％、再更优选至少99.5％和最优选至少99.9％的氨基酸序列同一性。

每个ZP蛋白包含将其引导至分泌途径的信号肽、带状(zona)结构域和位于羧基端附近的跨膜结构域，随后是短的胞质尾。在包括给予特异性结合hZP的抗体或其片段的本发明的实施方式中，所述抗体或其片段优选针对ZP胞外结构域。在涉及主动免疫的本发明的实施方式中，能够引发针对hZP的细胞免疫反应的免疫原性多肽源，原则上可以使用包含I类MHC限制性T细胞表位和/或II类MHC限制性T细胞表位的hZP的任何部分。

hZP3新生蛋白的氨基酸序列含有N端信号肽序列蛋白(SEQ ID NO：3中氨基酸位置1-22)、保守的"ZP胞外结构域″(SEQ ID NO：3中氨基酸位置23-350)，和原肽(SEQ ID NO：3中氨基酸位置351-424)，由共有弗林蛋白酶切割位点(CFCS；SEQ ID NO：3中氨基酸位置351-352)、阻断聚合的外部疏水贴片(EHP)和C端跨膜结构域(SEQ ID NO：3中氨基酸位置353-424)组成。hZP3信号肽在翻译过程中被切下，CFCS处的裂解使成熟的hZP3胞外域蛋白(由SEQ ID NO：3中的氨基酸位置23-350组成)与EHP分离，使其能够纳入新生的ZP细丝中。因此，成熟的hZP3胞外域的氨基酸骨架具有由hZP3的SEQ ID NO：3中的氨基酸位置23-350组成的氨基酸序列。该胞外域片段在本文中称为hZP3(23-350)(SEQ ID NO：5)。

在优选实施方式中，本发明涉及一种通过主动免疫的处理方法。主动免疫的方法优选包括给予能够引发针对人透明带蛋白(hZP)的细胞免疫反应的免疫原性多肽源，优选hZP3或hZP3(23-350)；包含结合MHC-肽复合物的T细胞受体的T细胞，其中肽是来自hZP的肽，优选来自hZP3或hZP3(23-350)；特异性结合hZP的抗体或其片段，优选结合hZP3或hZP3(23-350)；以及包含编码所述多肽或抗体的核酸序列的遗传构建体，其中遗传构建体被配置为在人体内递送和表达。

免疫原性多肽源可以是蛋白质物质源、核酸或其组合。蛋白质物质源可以是，例如是包含一种或多种充当免疫原的肽、多肽或蛋白质的组合物。或者，免疫原性多肽源可以是编码一种或多种免疫原性肽、多肽或蛋白质的核酸分子，该核酸分子在给予于所要处理的对象时表达免疫原性肽、多肽或蛋白质。核酸分子可以是DNA、cDNA RNA、mRNA、其变体、其片段或其组合，如，例如WO2014/165291和WO2013/087083中所述。免疫原性多肽源还可以是表达免疫原性多肽或呈递免疫原性多肽表位的细胞，优选是活细胞。优选地，细胞是微生物，更优选是细菌，例如，例如减毒活单核细胞增生李斯特菌，例如如WO2015/164121中所述。替代地，本发明的免疫原性多肽的细胞来源是自体或同种异体的树突细胞，其表面上呈递HLA分子中免疫原性多肽的至少一个表位。

在优选的实施方式中，免疫原性多肽包含选自hZP蛋白的氨基酸序列的连续氨基酸序列，其优选包含I类MHC限制性T细胞表位和II类MHC限制性T细胞表位中的至少一种。更优选地，免疫原性多肽包含选自hZP3蛋白的氨基酸序列(即SEQ ID NO：3)的连续氨基酸序列，其优选包含I类MHC限制性T细胞表位和至少一种II类MHC限制性T细胞表位中的至少一种，例如分别选自表I、II和III(如说明书所附)。更优选地，连续氨基酸序列包含具有低百分位级数的I类MHC限制性T细胞表位和II类MHC限制性T细胞表位中的至少一个(参见Moutaftsi等，Nat Biotechnol.2006年7月；24(7)：817-9和；Kotturi等，J Virol.2007年5月；81(10)：4928-40)。具有低百分位级数的I类MHC限制性T细胞表位优选地是百分位级数不高于1.00、0.80、0.40、0.30、0.20、0.15、0.10或0.05的表位(参见例如表I和III)。具有低百分位级数的II类MHC限制性T细胞表位优选地是百分位级数不高于2.50、2.40、2.05、2.00、1.80、1.60、1.40、1.20、1.10、1.00、0.90、0.70、0.60、0.50、0.40、0.20.0.15、0.10、0.05或0.02的表位。优选地，连续氨基酸序列选自蛋白水解hZP3片段的氨基酸序列组中的氨基酸序列，所述组由N端信号肽序列(SEQ ID NO：3中的位置1-22)、成熟胞外结构域序列(SEQ ID NO：3中的位置23-350，即SEQ ID NO：5)和原肽序列(SEQ ID NO：3中的氨基酸位置351-424)组成。图13给出了此类连续氨基酸序列的实例。

包含在免疫原性多肽内的hZP(3)蛋白的连续氨基酸序列优选地包含hZP(3)蛋白的免疫活性(序列)片段。术语″其免疫活性片段″在本领域中通常被理解为指包含至少一个表位的hZP(3)蛋白抗原的片段，这意味着免疫原性多肽至少包含来自hZP(3)蛋白抗原序列的4、5、6、7或8个连续氨基酸。根据本发明，该片段包含由此类MHC分子呈递给免疫系统的至少一种I类MHC或II类MHC结合肽。根据本发明的`免疫活性片段`包含来自ZP蛋白抗原或其同源物或类似物的序列的至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个连续氨基酸。尽管大多数MHC结合肽的长度为9个氨基酸，但可以通过它们的中央部分的凸起来容纳更长的肽(Guo等，1992，Nature；360(6402)：364-366；Speir等，2001，Immunity；14(1)：81-92)，从而得到长度为8至15个氨基酸的结合肽(Schumacher等，1991，Nature；350(6320)：703-706)。表2和表5给出了hZP3序列中I类MHC结合肽的例子。与II类蛋白结合的肽的大小不受限制(Nelson等，1999，Rev Immunogenet；1(1)：47-59；Yassai等，2002，J Immunol；168(3)：1281-1285)，长度从11到30个氨基酸不等(Rammensee 1995，Immunogenetics；41(4)：178-228)，甚至可能是整个蛋白质。然而，结合基序长约9个氨基酸。II类MHC可以容纳比I类MHC更长的肽，因为II类MHC结合沟的端部是开放的，因此(结合到沟中)的表位的任一端可能被额外的氨基酸延伸体(stretch)所侧接。表II给出了hZP3序列中的II类MHC结合肽的例子(即SEQ IDNO.39-65)。再更优选地，该片段包含细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和辅助T淋巴细胞(HTL)表位。然而，最优选地，该片段是需要抗原呈递细胞处理的肽，即该片段的长度至少约为18个氨基酸，这18个氨基酸不一定是来自hZP(3)蛋白抗原的连续序列。

因此，包含在免疫原性多肽内的hZP(3)蛋白的连续氨基酸序列的长度或免疫原性多肽本身的长度优选为至少18、19、20、21、22、25、27、30、33或35个氨基酸，并且优选不超过100、80、60、50、45、40、35、33或30个氨基酸。包含在免疫原性多肽内的hZP(3)蛋白的连续氨基酸序列的长度或免疫原性多肽本身的长度优选为19-50或19-45个氨基酸，更优选为25-40个氨基酸，甚至更优选为25-35个氨基酸，最优选为25-30个氨基酸。从可制造性的角度来看，长度约为25个氨基酸的免疫原性多肽是最佳的，同时仍然足够长以包含多个表位并通过抗原呈递细胞强力呈递(force presentation)。图13显示了此类免疫原性多肽的合适例子，其包括来自hZP3蛋白的连续氨基酸序列并且各自包含一个或多个I类MHC和/或II类MHC结合肽。

本文使用的术语″其同源物″是指与天然存在的多肽有微小修饰的差异但保持天然存在形式的基本多肽和侧链结构的多肽。这类变化包括但不限于：一个或几个氨基酸侧链的变化；一个或几个氨基酸的变化，包括缺失(例如，肽的截短版本)插入和/或取代；一个或几个原子的立体化学变化；和/或次要衍生化，包括但不限于：甲基化、糖基化、磷酸化、乙酰化、肉豆蔻酰化、异戊烯化、棕榈化、酰胺化和/或添加糖基磷脂酰肌醇。如本文所用，同源物或类似物具有与天然存在的多肽相比增强或基本相似的功能。通常，当最佳比对时，例如通过使用默认参数的程序GAP或BESTFIT最佳比对时，天然存在的多肽及其同源物共有至少一定百分比的序列同一性。GAP使用Needleman和Wunsch全局比对算法来比对两个序列的全长，最大化匹配数并最小化缺口数。通常，使用GAP默认参数，缺口产生罚分＝8和缺口延伸罚分＝2。对于蛋白质，默认评分矩阵是Blosum62(Henikoff和Henikoff，1992，PNAS 89，915-919)。序列比对和百分比序列同一性评分可以使用计算机程序确定，例如购自Accelrys Inc.(美国，加利福尼亚州92121-3752，圣地亚哥，Scranton路9685号)的GCGWisconsin软件包，版本10.3。或者，可以通过搜索数据库(例如FASTA、BLAST等)来确定百分比相似性或同一性。

本文中的同源物应理解为包含与上述天然存在的ZP多肽具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、再更优选至少95％、再更优选至少98％和最优选至少99％氨基酸序列同一性并且仍然能够引发至少由此可获得的免疫反应的免疫原性多肽。本文中的同源物或类似物可以包括取代、插入、缺失、额外的N端或C端氨基酸和/或额外的化学部分(例如碳水化合物)，以增加稳定性、溶解性和免疫原性。

根据本发明，按照本方法给予于人的免疫原性多肽可以是或包括蛋白质或糖蛋白、蛋白质或糖蛋白的消化物和/或其片段，其可以是纯化形式或可以包含在粗组合物中，优选是生物来源的，例如原核或真核细胞系的裂解物、超声产物或固定物。然而，更优选地，免疫原性多肽是或包括化学合成的(多)肽或体外酶促产生的(多)肽，其可以是纯化形式或可以包含在粗组合物中。

如本文所用的术语″表位″是指抗原的一部分，通常由短肽定义，当其在体内生理相关环境中存在时，能够引发细胞或体液免疫反应。″T细胞表位″是指与MHC分子结合的短肽或其部分，当其在某些MHC分子中存在时，可被某些T细胞识别。T细胞表位能够通过直接或间接地呈递在异二聚体膜MHC分子中来诱导细胞介导的免疫反应。优选地，在免疫原性多肽中，至少一个II类MHC限制性表位和至少一个I类MHC限制性表位存在于来自hZP(3)蛋白的氨基酸序列的连续氨基酸序列内，其中优选地，II类MHC限制性表位和至少一个I类MHC限制性表位分别选自表II、表I和表III。为了清楚起见，本发明的肽优选包含至少一个I类MHC呈递表位，并且优选还包含至少一个II类MHC呈递表位。这些表位中的每一个都是可呈递的，并且在经过本文所述处理后将与细胞上存在的相应特定MHC分子结合。因此，每个MHC限制性表位也可以称为MHC结合和/或可呈递表位。优选地，产生此类表位的C端的特异性蛋白酶体裂解位点恰好存在于表位的氨基酸序列之后，以便从免疫原性多肽中释放并呈递在I类MHC分子上。对于II类MHC呈递表位，长度要求不那么严格，因此II类结合肽对精确酶促生成的需求不那么绝对。简言之，MHC分子优先结合称为″锚″残基的特定氨基酸残基(K.Falk等，Nature 351：290-96(1991))。这种特征允许I类和II类MHC结合基序在任何已知肽序列中被识别(参见例如表I、III和II)。

在本上下文中，术语″MHC限制性表位″与T细胞表位同义。本文使用的术语″I类MHC限制性表位″是指由I类MHC相关的细胞毒性T淋巴细胞(也称为CD8+细胞、TCD8或CTL)识别的肽序列。本文使用的术语″II类MHC限制性表位″是指由II类MHC相关的辅助T细胞(也称为CD4⁺细胞、TCD4或HTL)识别的肽。″B细胞表位″是抗原的一部分，其能够结合免疫球蛋白的抗原结合位点，因此能够在没有MHC分子呈递的情况下刺激体液反应。如前所述，本发明中有用的多肽或编码所述多肽的核酸包含至少一个T细胞表位。但是，本发明并不排除使用还包含B细胞表位的多肽。本发明的免疫原性多肽还可以包括多个T细胞表位，以及任选的B细胞表位。当肽中存在多个表位时，表位可以串联取向或巢式(nested)或重叠构型，其中至少一个氨基酸残基可以由两个或更多个表位共有。

本发明的免疫原性多肽优选包括一个或多个I类MHC限制性表位。正如本领域技术人员通常所知，包含单个MHC限制性表位的抗原仅可用于处理那些表达能够结合该特定肽的MHC等位基因产物的(小)患者亚群。据计算，在人中，含有受HLA-A1、-A2、-A3、-A24和-B7限制的CTL表位的疫苗将覆盖大多数种族背景的约80％的个体。因此，如果本方法用于处理人，则特别优选的是该方法包括给予包含一种或多种不同多肽的组合物，其包含一个、更优选两个、最优选三个I类MHC结合天然ZP(优选hZP3)表位，其选自HLA-A1、HLA-A2、HLA-A3、HLA-A24和HLA-B7限制性表位；或其同源物。

根据另一个实施方式，本发明的免疫原性多肽优选包括一个或多个II类MHC限制性表位。人中最常见的II类MHC等位基因产物包括HLA-DR1、-DR3、-DR4和-DR7。因此，该方法优选包括给予包含一种或多种不同多肽的组合物，所述一种或多种不同多肽包括一个、更优选两个、最优选三个II类MHC结合天然ZP(优选hZP3)表位，其选自HLA-DR1、HLA-DR3、HLA-DR4和HLA-DR7限制性表位；或其同源物。

在另一个实施方式中，本发明的方法包括给予包含一种或多种多肽的组合物，所述一种或多种多肽包括一个或多个I类MHC限制性表位和一个或多个II类MCH限制性表位，如上文和/或表2、5和3中分别所述；或其同源物。甚至，更优选地，所述组合物包含有效量的一种或多种不同的多肽，其共同包括包含在天然ZP(优选hZP3)糖蛋白之一中的基本上所有I类MHC和II类MHC结合表位；或所述一种或多种多肽的同源物。

在一个实施方式中，本方法包括给予包含一种或多种不同的免疫原性多肽的组合物。优选地，所述一种或多种不同的多肽共同包括至少50％、更优选至少70％、再更优选至少80％、再更优选至少90％和最优选至少95％的在天然ZP(优选hZP3或hZP3(23-350))或所述一种或多种多肽的同源物中所包含的I类MHC和II类MHC限制性表位。

在优选的实施方式中，本方法包括给予包含一种或多种选自图13中所示的肽的免疫原性肽的组合物，例如包含或由一个或多个选自SEQ ID NO.66-75的氨基酸序列组成的免疫原性肽。因此，该组合物可以包含包含或由选自SEQ ID NO.66-75的氨基酸序列组成的免疫原性肽之一。然而，优选地，该组合物包含包含或由选自SEQ ID NO.66-75的氨基酸序列组成的免疫原性肽中至少两种的组合。

在另一优选的实施方式中，本方法包括给予包含一种或多种免疫原性肽的组合物，所述免疫原性肽包含或由选自表III中所示的(即SEQ ID NO.76-85)表位的表位组成。因此，该组合物可以包含包含或由选自SEQ ID NO.76-85的氨基酸序列组成的免疫原性肽之一。然而，优选地，该组合物包含包含或由选自SEQ ID NO.76-85的氨基酸序列组成的免疫原性肽中至少两种的组合。特别优选的组合物包含一种或多种或所有免疫原性肽，所述免疫原性肽包含或由SEQ ID NO.79、80、81、83和84的氨基酸序列组成。

在优选实施方式中，本方法包括给予免疫原性多肽源，所述多肽包含天然ZP(优选hZP3或hZP3(23-350))糖蛋白的完整氨基酸骨架的至少50％、更优选至少70％、再更优选至少80％、再更优选至少90％和最优选至少95％；或所述多肽的同源物。

在特别优选的实施方式中，本方法包括给予包含免疫原性多肽源的组合物，该多肽包含天然ZP(优选hZP3或hZP3(23-350))或所述多肽的同源物的胞外结构域的90％、95％、97％、98％、99％或100％的完整氨基酸骨架。如前文所定义的本免疫原性多肽可被糖基化。不希望受理论的束缚，假设通过这些多肽的糖基化，其免疫原性至少在它们引起体液(B细胞反应)的范围内增加。因此，如前文所定义的免疫原性多肽优选被糖基化，其碳水化合物含量为基于糖蛋白或糖基化多肽的总重量的10-80wt.％、15-70wt.％或20-60wt.％不等。优选地，所述糖基化免疫原性多肽包含与人相应的天然带(zona)ZP糖蛋白相似的糖基化模式。

在另一个特别优选的实施方式中，该方法包括给予免疫原性多肽源，该多肽源是包含有效量的天然ZP(优选hZP3或hZP3(23-350))糖蛋白的多个不同重叠多肽片段的组合物，所述不同重叠多肽片段的长度在18-60个氨基酸之间，并且它们一起包含所述天然ZP的完整氨基酸骨架或所述天然ZP(优选hZP3或hZP3(23-350)或所述多肽的同源物)的胞外结构域的至少50％、更优选至少70％、再更优选至少80％、再更优选至少90％和最优选至少95％。更优选地，不同重叠多肽片段的长度为25-40个氨基酸，甚至更优选25-35个氨基酸和最优选25-30个氨基酸。通常，不同的连续18-60个氨基酸多肽片段之间的氨基酸序列重叠至少为7个氨基酸，优选至少为8个氨基酸，更优选至少为9个氨基酸，最优选至少为10个氨基酸。

已描述了最常见的I类和II类MHC等位基因的MHC结合基序。这些基序列出了作为特定I类和II类MHC等位基因的MHC结合锚的氨基酸残基。将MHC结合锚以及肽的氨基酸序列纳入考虑的复杂计算机算法用于预测和量化肽/MHC相互作用的结合亲和力。因此，从已知的透明带蛋白氨基酸序列的输入，这些算法列出了所有潜在的T细胞表位，每个表位都有其相应的预测结合评分(参见，例如，表I、III和II)。通常用于这些目的的生物信息学工具包括，例如，HLA_BIND(Parker等，1994，J.Immunol.152：163)、SYFPEITHI(Rammensee等，1995，Immunogenetics 41，178-228；Rammensee等，Landes Bioscience 1997，Internationaldistributor Springer Verlag GmbH&Co.KG，德国海德堡；http：//www.syfpeithi.de/)、NetMHC(Buus等，2003，Tissue Antigens.，62：378-84；Nielsen等，2003，Protein Sci.，12：1007-17；Nielsen等，2004，Bioinformatics，20(9)：1388-97；http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/)、TEPITOPE 2000(Stumiolo等，1999，Nature Biotechnology 17，555-562；http：//www.vaccinome.com/pages/597444/)以及(持续更新的)IEDB分析资源--T细胞表位预测工具：http：//tools.iedb.org/main/tcell/。

或者，技术人员将能够使用标准实验(《新编免疫学实验指南》(CurrentProtocols in Immunology)，韦利科学公司(Wiley-Interscience)2004)通过实验确定HTL和CTL结合表位。在优选的实施方式中，该方法包括给予包含有效量的天然ZP(优选hZP3或hZP3(23-350))糖蛋白的多个不同多肽片段的组合物，所述多肽片段的长度在18-100个氨基酸之间，其中每个多肽片段包含所述预测的潜在I类MHC或II类MHC限制性表位中的一个或多个。优选地，所述预测的潜在I类MHC或II类MHC限制性表位在不同多肽片段中的氨基酸序列不重叠。优选地，多个不同的多肽片段共同包含由上述一种或多种生物信息学工具预测的潜在I类MHC或II类MHC表位的至少50％、70％、80％、90％或95％。

在某些情况下，观察到相同的肽可能与几种I或II类MHC等位基因产物结合(参见例如表I、III和II)。在一个实施方式中，在本方法中使用这种`混杂`MHC结合肽是特别优选的。

本发明的免疫方法优选包括给予免疫原性活性多肽片段源，所述多肽片段选自如前文定义的透明带蛋白片段和/或其同源物，所述多肽片段包含受多种HLA分子限制的CTL和/或HTL表位，并且片段长度在18至45个氨基酸之间。观察到长度在18至45个氨基酸之间的肽具有优异的免疫原性性质，如WO02/070006中所述。肽可以有利地通过化学合成，并且可以任选地(部分)重叠和/或也可以连接到其他分子、肽或蛋白质。在肽的氨基或羧基端添加化学部分或额外的(修饰或D-)氨基酸以增加肽的稳定性和/或降低其生物降解性也是有利的。为了提高免疫原性/免疫刺激特性，可以通过，例如通过脂质化、延长和/或偶联方式附接所述部分(见下文)。肽可以通过，例如通过添加带电荷的或极性氨基酸来延长，以增强其溶解度和/或增加其在体内的稳定性。

为了免疫目的，上述本发明的免疫原性多肽还可以与蛋白质融合，例如但不限于破伤风毒素/类毒素、白喉毒素/类毒素或其他运载体分子。本发明的多肽还可以有利地与热休克蛋白融合，例如重组内源性(鼠)gp96(GRP94)作为免疫显性肽的运载体，如(参考文献：Rapp U K和Kaufmann S H，Int Immunol.2004年4月；16(4)：597-605；Zugel U，InfectImmun.2001；69(6)：4164-7)所述，或与Hsp70的融合蛋白(Triebel等；WO99/54464)。本发明的免疫原性多肽还可以与具有佐剂活性的分子(如下所列)偶联，特别是如下所列的TLR配体/激动剂。

本发明的免疫原性(多)肽的单个氨基酸残基可以通过肽键或肽键模拟物纳入肽中。本发明的肽键模拟物包括本领域技术人员熟知的肽骨架修饰。此类修饰包括酰胺羰基、α-碳、酰胺氮的修饰，酰胺键的完全替换、延伸、缺失或骨架交联。一般参见Spatola，《氨基酸、肽和蛋白质的化学和生物化学》(Chemistry and Biochemistry of Amino Acids)，第VII卷(Weinstein编，1983年)。已知几种肽骨架修饰，这些修饰包括ψ[CH₂S]、ψ[CH₂NH]、ψ[CSNH₂]、ψ[NHCO]、ψ[COCH₂]和ψ[(E)或(Z)CH＝CH]。上面使用的命名法遵循Spatola在上面建议的命名法。在这种上下文中，.psi.表示不存在酰胺键。括号内指定了替代酰胺基团的结构。

氨基酸模拟物也可以被纳入多肽。本文使用的″氨基酸模拟物″是除天然存在的氨基酸之外的部分，其在构象和功能上充当本发明多肽中的氨基酸的替代物。如果此类部分不干扰肽引发针对天然ZP T细胞表位的免疫反应的能力，则其作为氨基酸残基的替代物。氨基酸模拟物可以包括非蛋白质氨基酸，例如β-、γ-、δ-氨基酸、β-、γ-、δ-亚氨基酸(例如哌啶-4-羧酸)以及L-α-氨基酸的许多衍生物。本领域技术人员已知许多合适的氨基酸模拟物，它们包括环己基丙氨酸、3-环己基丙酸、L-金刚烷基丙氨酸、金刚烷基乙酸等。适用于本发明的肽的肽模拟物讨论于Morgan和Gainor(1989)Ann.Repts.Med.Chem.24：243-252。

本方法优选包括通过肠胃外或口服途径(优选肠胃外途径)给予本免疫原性多肽和包含它们的组合物。优选的给予途径包括但不限于肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及局部、透皮、吸入或栓剂或粘膜组织，例如通过灌洗阴道、直肠、尿道、口颊和舌下组织。优选的给予途径包括肌肉内注射、腹膜内注射、皮内注射和皮下注射。在另一个实施方式中，给予进入引流至淋巴结盆(basin)的解剖部位。在另一个实施方式中，给予进入多个淋巴结盆。

特别优选的是将本发明的药物皮内和皮下给予相结合。表皮中的DC明显不同于真皮和下皮层(subcutis)中的DC。皮内(真皮内)免疫将导致抗原加工和表皮DC的激活(朗格汉斯蛋白(Langerin)阳性朗格汉斯细胞)，其通过其树突状网络与角质形成细胞紧密接触。这还将最佳地激活朗格汉斯细胞和角质形成细胞之间相互作用中的炎症途径，随后将装载了抗原且激活的朗格汉斯细胞运输到皮肤引流淋巴结。皮下给予将激活其他DC亚群，其也将装载抗原并独立地前往皮肤引流淋巴结。可以想象，使用可以皮内和皮下给予的药物可能导致不同DC亚群协同刺激这些引流结中的T细胞。

包含一种或多种如上文定义的免疫原性多肽的药物组合物通常还将包含至少一种赋形剂。赋形剂在药学领域是众所周知的，例如可以在教科书中找到，例如《雷明顿药物科学》(Remington′s pharmaceutical sciences)，马克出版公司(Mack PublishingCompany)，1995。

根据一个优选的实施方式，典型的剂量方案包括每次免疫给予1-1000μg/肽的剂量，更优选每次免疫给予10-500μg/肽，再更优选每次免疫给予5-150μg/肽，至少一次。优选地，以2、3或4周的间隔重复给予该剂量一次、两次、三次或更多次。根据优选的实施方式，每次免疫给予5-150μg/肽，并且每个处理在2-3周内重复给予一次或多次。

在本方法中，通常以约1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000μg/免疫原性多肽或核酸分子或更多的剂量给予一种或多种免疫原性多肽至少一次。优选地，以2、3或4周的间隔重复给予该剂量一次、两次、三次或更多次。

在另一个优选实施方式中，要给予的本发明的免疫原性多肽源包括编码本文中如前定义的免疫原性多肽的核酸分子。包含编码免疫原性多肽的这种核酸分子的组合物可以包含编码如上定义的任何一种免疫原性多肽、多肽片段和/或肽的一种或多种不同的核酸分子。此外，核酸分子可以编码天然ZP的较大部分。例如，核酸分子可以编码包含ZP(优选hZP3，更优选hZP3(23-350))或所述多肽的同源物的完整氨基酸骨架的至少50％、70％、80％、90％、95％或100％的多肽。优选地，核酸分子编码完整氨基酸骨架的至少50％、70％、80％、90％、95％或99％的连续延伸体。核酸分子还可以编码来自如上定义的hZP(3)的连续氨基酸序列的多于一个(含有T细胞表位的)免疫活性片段，从而在编码的氨基酸序列中，不同的免疫活性片段可以通过间隔子或接头序列分开，就像串珠一样。

编码本发明的免疫原性多肽的核酸分子可以是DNA分子，优选是遗传构建体，其中编码免疫原性多肽的核苷酸序列(cDNA)操作性地连接到适当的表达调控序列，以确保免疫原性多肽在人对象的靶细胞中功能性表达，例如包括至少一个强启动子(例如病毒启动子)。用作DNA疫苗的遗传构建体，包括例如质粒或病毒载体，尤其在WO2014/165291、WO2016/123285和WO2017/136758中所述的。

或者，编码本发明的免疫原性多肽的核酸分子可以是RNA分子，例如mRNA、ssRNA、dsRNA或其组合。RNA分子可以例如配制成包含该分子的颗粒。

在本发明的某些特别优选的实施方式中，RNA是信使RNA(mRNA)，其涉及编码本发明的免疫原性多肽的RNA转录物。如本领域所确定的，mRNA通常包含5′-非翻译区(5′-UTR)、肽编码区和3′-非翻译区(3′-UTR)。在一些实施方式中，RNA是通过体外转录或化学合成产生的。在一个实施方式中，mRNA是通过使用DNA模板的体外转录产生的，其中DNA是指含有脱氧核糖核苷酸的核酸。

在一个实施方式中，RNA是体外转录RNA(IVT-RNA)，可通过体外转录适当的DNA模板获得。控制转录的启动子可以是任何RNA聚合酶的任何启动子。体外转录的DNA模板可通过克隆核酸(特别是cDNA)来获得，并将其引入适当的载体进行体外转录。cDNA可通过RNA逆转录获得。在一个实施方式中，RNA可能具有修饰的核苷。在一些实施方式中，RNA包含修饰的核苷来代替至少一个(例如，每个)尿苷。

RNA疫苗常用的递送方法和运载体分子包括：裸露的(m)RNA；具有体内电穿孔的裸露的(m)RNA；鱼精蛋白复合的(m)RNA；与带正电荷的水包油阳离子纳米乳液关联的(m)RNA；(m)RNA树枝状分子纳米颗粒(例如与化学修饰的树枝状分子关联并与聚乙二醇(PEG)-脂质复合的mRNA)；(m)RNA鱼精蛋白脂质体(例如PEG-脂质纳米颗粒中的鱼精蛋白复合的mRNA)；与阳离子聚合物(例如聚乙烯亚胺或‘PEI’)关联的(m)RNA；(m)RNA阳离子聚合物脂质体(例如与阳离子聚合物(例如PEI)和脂质组分关联的mRNA)；(m)RNA多糖颗粒(例如与多糖(例如壳聚糖、颗粒或凝胶)关联的mRNA)；(m)RNA阳离子脂质纳米颗粒(例如，阳离子脂质纳米颗粒中的mRNA，例如1，2-二油酰氧基-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)或二油酰基-磷脂酰乙醇胺(DOPE)脂质)；(m)RNA阳离子-脂质-胆固醇纳米颗粒(例如，与阳离子脂质和胆固醇复合的mRNA)；以及(m)RNA阳离子-脂质-胆固醇PEG纳米颗粒(例如，与阳离子脂质、胆固醇和PEG-脂质复合的mRNA)；如Pardi等人所述(mRNA疫苗-疫苗学的新时代(mRNA vaccines-a newera in vaccinology.)Nat Rev Drug Discov.2018年4月；17(4)：261-279)。

因此，本发明的一个方面涉及一种药物组合物，其包含编码如前文所定义的免疫原性多肽的RNA，以任何这些形式或运载体类型，以及这些药物组合物在如前文所定义的任何方法中的用途。

在本发明的特别优选的实施方式中，RNA是以RNA纳米颗粒的形式，其包含编码如前文所定义的免疫原性多肽的RNA，

在本发明的优选实施方式中，RNA纳米颗粒的平均直径在一个实施方式中范围为约50nm至约1000nm、约75nm至约800nm、约100至约700nm、约125至约600nm、约150nm至约500nm或约175nm至约400nm。

在一个实施方式中，本文所述的RNA纳米颗粒表现出小于约0.5、小于约0.4或小于约0.3的多分散性指数。举例来说，RNA纳米颗粒可以表现出约0.1至约0.3范围内的多分散性指数。

在本发明的特别优选的实施方式中，RNA纳米颗粒是脂质纳米颗粒，即含有脂质(特别是阳离子脂质)和RNA的颗粒。带正电荷的脂质体和带负电荷的RNA之间的静电相互作用导致RNA脂质颗粒的复合和自发形成。带正电荷的脂质体通常可以使用阳离子脂质(例如DOTMA)和附加脂质(例如DOPE)合成。在一个实施方式中，RNA脂质颗粒是纳米颗粒。

本文所述的RNA脂质纳米颗粒和包含RNA脂质纳米颗粒的组合物可用于在肠胃外给予后(特别是在静脉内给予后)将RNA递送至靶组织。可以使用脂质体制备RNA脂质纳米颗粒，所述脂质体可以通过将脂质在乙醇中的溶液注入水或合适的水相中获得。在一个实施方式中，水相具有酸性pH。在一个实施方式中，水相包含乙酸，例如，其量为约5mM。在一个实施方式中，脂质体和RNA脂质纳米颗粒包含至少一种阳离子脂质和至少一种附加脂质。在一个实施方式中，至少一种阳离子脂质包括1，2-二-0-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和/或1，2-二油酰-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)。在一个实施方式中，至少一种附加脂质包括1，2-二-(9Z-十八烯酰)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇(Choi)和/或1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)。在一个实施方式中，至少一种阳离子脂质包括1，2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)，并且至少一种附加脂质包括1，2-二-(9Z-十八烯酰)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。在一个实施方式中，脂质体和RNA脂质纳米颗粒包括1，2-二-O-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)和1，2-二-(9Z-十八烯酰)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。脂质体可用于通过将脂质体与RNA混合来制备RNA脂质纳米颗粒。

靶向脾脏的RNA脂质纳米颗粒描述于WO 2013/143683，其通过引用并入本文。已经发现，具有净负电荷的RNA脂质纳米颗粒可用于优先靶向脾脏组织或脾脏细胞，例如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在给予RNA脂质纳米颗粒后，脾脏中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA脂质纳米颗粒可用于在脾脏中表达RNA。在一个实施方式中，在给予RNA脂质纳米颗粒后，肺和/或肝脏中不发生或基本不发生RNA积累和/或RNA表达。在一个实施方式中，在给予RNA脂质纳米颗粒后，脾脏中的抗原呈递细胞，例如专职性抗原呈递细胞中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA脂质纳米颗粒可用于在此类抗原呈递细胞中表达RNA。在一个实施方式中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。RNA脂质纳米颗粒直径

在一个实施方式中，本文所述的脂质溶液、脂质体和RNA脂质纳米颗粒包括阳离子脂质。本文所用术语“阳离子脂质”是指具有净正电荷的脂质。阳离子脂质通过静电相互作用将带负电荷的RNA结合到脂质基质上。通常，阳离子脂质具有亲脂性部分，例如甾醇、酰基或二酰基链，并且脂质的头部基团通常带有正电荷。阳离子脂质的例子包括但不限于1，2-二-0-十八烯基-3-三甲基铵丙烷(DOTMA)、二甲基双十八烷基铵(DDAB)；1，2-二油酰-3-三甲基铵丙烷(DOTAP)；1，2-二油酰-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)；1，2-二酰氧基-3-二甲基铵-丙烷；1，2-二烷氧基-3-二甲基铵-丙烷；双十八烷基二甲基氯化铵(DODAC)、2，3-二(十四氧基)丙基-(2-羟乙基)-二甲基氮(DMRIE)、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-乙基磷酸胆碱(DMEPC)、1，2-二肉豆蔻酰-3-三甲基铵丙烷(DMTAP)、1，2-二油酰氧丙基-3-二甲基-羟乙基溴化铵(DORIE)和2，3-二油酰氧基-N-[2(精胺甲酰胺)乙基]-N，N-二甲基-I-丙铵三氟乙酸盐(DOSPA)。优选DOTMA、DOTAP、DODAC和DOSPA。在特定实施方式中，阳离子脂质是DOTMA和/或DOTAP。

可以加入附加脂质来调节RNA脂质纳米颗粒的总体正电荷与负电荷之比和物理稳定性。在某些实施方式中，附加脂质是中性脂质。如本文所用，“中性脂质”是指净电荷为零的脂质。中性脂质的例子包括但不限于1，2-二-(9Z-十八烯酰)-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、脑磷脂、胆固醇和脑苷脂。在特定实施方式中，附加脂质是DOPE、胆固醇和/或DOPC。

在某些实施方式中，RNA脂质纳米颗粒包括阳离子脂质和附加脂质。在示例性实施方式中，阳离子脂质为DOTMA，而附加脂质为DOPE。不希望受理论的束缚，至少一种阳离子脂质的量与至少一种附加脂质的量相比可能影响重要的RNA脂质纳米颗粒特性，例如RNA的电荷、颗粒大小、稳定性、组织选择性和生物活性。因此，在一些实施方式中，至少一种阳离子脂质与至少一种附加脂质的摩尔比为约10∶0至约1∶9、约4∶1至约1∶2或约3∶1至约1∶1。在特定实施方式中，摩尔比可以为约3∶1、约2.75∶1、约2.5∶1、约2.25∶1、约2∶1、约1.75∶1、约1.5∶1、约1.25∶1或约1∶1。在示例性实施方式中，至少一种阳离子脂质与至少一种附加脂质的摩尔比为约2∶1。

本公开的RNA脂质纳米颗粒的电荷为至少一种阳离子脂质中存在的电荷与RNA中存在的电荷之和。电荷比为至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷之比。至少一种阳离子脂质中存在的正电荷与RNA中存在的负电荷比通过以下等式计算：电荷比＝[(阳离子脂质浓度(mol))*(阳离子脂质中正电荷总数)]/[(RNA浓度(mol))*(RNA中负电荷总数)]。本领域技术人员可以使用常规方法确定RNA的浓度和至少一种阳离子脂质的量。

在一个实施方式中，在生理pH下，RNA脂质纳米颗粒中正电荷与负电荷的电荷比为约1.6∶2至约1∶2，或约1.6∶2至约1.1∶2。在具体实施方式中，在生理pH下RNA脂质纳米颗粒中的正电荷与负电荷的电荷比为约1.6∶2.0、约1.5∶2.0、约1.4∶2.0、约1.3∶2.0、约1.2∶2.0、约1.1∶2.0或约1∶2.0。

已经发现，具有这种电荷比的RNA脂质纳米颗粒可用于优先靶向脾脏组织或脾脏细胞，例如抗原呈递细胞，特别是树突细胞。因此，在一个实施方式中，在给予RNA脂质纳米颗粒后，脾脏中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA脂质纳米颗粒可用于在脾脏中表达RNA。在一个实施方式中，在给予RNA脂质纳米颗粒后，肺和/或肝脏中不发生或基本不发生RNA积累和/或RNA表达。在一个实施方式中，在给予RNA脂质纳米颗粒后，脾脏中的抗原呈递细胞，例如专职性抗原呈递细胞中发生RNA积累和/或RNA表达。因此，本公开的RNA脂质纳米颗粒可用于在此类抗原呈递细胞中表达RNA。在一个实施方式中，抗原呈递细胞是树突细胞和/或巨噬细胞。

根据本公开，本文描述的组合物可包含盐，例如氯化钠。不希望受理论的束缚，氯化钠用作离子渗透压剂，用于在与至少一种阳离子脂质混合之前预处理RNA。某些实施方式考虑了本公开中氯化钠的替代有机盐或无机盐。替代盐包括但不限于氯化钾、磷酸二钾、磷酸一钾、醋酸钾、碳酸氢钾、硫酸钾、醋酸钾、磷酸氢二钠、磷酸一钠、醋酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠、醋酸钠、氯化锂、氯化镁、磷酸镁、氯化钙和乙二胺四乙酸(EDTA)的钠盐。

通常，本文所述的包含RNA脂质纳米颗粒的组合物包含浓度优选为0mM至约500mM、约5mM至约400mM或约10mM至约300mM的氯化钠。在一个实施方式中，包含RNA脂质纳米颗粒的组合物含有与此类氯化钠浓度相对应的离子强度。

本文所述的组合物可包含稳定剂以避免产品质量的大幅损失，特别是在冷冻、冻干、喷雾干燥或储存(例如冷冻、冻干或喷雾干燥组合物的储存)期间RNA活性的大幅损失。

在一个实施方式中，稳定剂是碳水化合物。本文使用的术语“碳水化合物”是指并包括单糖、二糖、三糖、寡糖和多糖。

在本公开的实施方式中，稳定剂是甘露糖、葡萄糖、蔗糖或海藻糖。根据本公开，本文所述的RNA脂质纳米颗粒组合物具有适合于组合物稳定性(特别是适合于RNA脂质纳米颗粒稳定性且适合于RNA稳定性)的稳定剂浓度。

根据本公开，本文所述的RNA脂质纳米颗粒组合物具有适合于RNA脂质纳米颗粒稳定性(特别是适合于RNA稳定性)的pH值。在一个实施方式中，本文所述的RNA脂质纳米颗粒组合物具有约5.5至约7.5的pH值。

根据本公开，提供了包含缓冲剂的组合物。不希望受理论的束缚，缓冲剂的使用在组合物的制造、储存和使用过程中维持了组合物的pH值。在本公开的某些实施方式中，缓冲剂可以是碳酸氢钠、磷酸一钠、磷酸二钠、磷酸一钾、磷酸二钾、[三(羟甲基)甲基氨基]丙磺酸(TAPS)、2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸(Bicine)、2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1，3-二醇(Tris)、N-(2-羟基-1，1-双(羟甲基)乙基)甘氨酸(Tricine)、3-[[1，3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]-2-羟丙烷-1-磺酸(TAPSO)、2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸(HEPES)、2-[[1，3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(TES)、1，4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)、二甲基胂酸、2-吗啉-4-基乙磺酸(MES)、3-吗啉-2-羟基丙磺酸(MOPSO)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。其他合适的缓冲液可以是盐形式的乙酸、盐形式的柠檬酸、盐形式的硼酸和盐形式的磷酸。

本公开的某些实施方式考虑使用螯合剂。螯合剂是指能够与金属离子形成至少两个配位共价键，从而产生稳定的水溶性复合物的化合物。不希望受理论的束缚，螯合剂降低了游离二价离子的浓度，否则可能会在本公开中诱导加速的RNA降解。合适的螯合剂的例子包括但不限于乙二胺四乙酸(EDTA)、EDTA的盐、去铁胺B、去铁胺、二乙基二硫代氨基甲酸钠(dithiocarb sodium)、青霉胺、喷替酸钙、喷替酸的钠盐、二巯丁二酸(succimer)、曲恩汀(trientine)、次氮基三乙酸(nitrilotriacetic acid)、反式二氨基环己烷四乙酸(DCTA)、二乙烯三胺五乙酸(DTPA)、双(氨基乙基)乙二醇醚-N，N，N′，N′-四乙酸、亚氨基二乙酸、柠檬酸、酒石酸、富马酸或其盐。在某些实施方式中，螯合剂是EDTA或EDTA盐。在示例性实施方式中，螯合剂是EDTA二钠二水合物。

在一些实施方式中，EDTA的浓度为约0.05mM至约5mM，

在实施方式中，本公开的组合物是液体或固体。固体的非限制性例子包括冷冻形式或冻干形式。在优选实施方式中，组合物为液体。

本文所述的RNA，例如配制成RNA脂质纳米颗粒，可用作或用于制备用于治疗或预防处理的药物组合物或药物。

本公开的组合物可以以任何合适的药物组合物的形式给予。药物组合物在本领域中也称为药物制剂。在本公开的上下文中，药物组合物包含本文所述的RNA，例如配制成RNA脂质纳米颗粒的。

核酸疫苗的给予途径包括但不限于肌内、鼻内、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及局部、透皮、吸入或栓剂或粘膜组织，例如通过灌洗阴道、直肠、尿道、口颊和舌下组织。优选的给予途径包括肌肉内注射、腹膜内注射、皮内注射和皮下注射。遗传构建体可通过包括但不限于电穿孔方法和装置、传统注射器、无针注射装置或″微粒轰击基因枪(micro projectile bombardment gone gun)″等方式给予。

本发明的免疫原性多肽源还可以是表达和/或呈递免疫原性多肽的活细胞。细胞可以是自体或同种异体免疫细胞，例如来自所要处理对象的树突细胞，或者细胞可以是微生物细胞，更优选地是细菌，例如减毒活单核细胞增生李斯特菌。表达的免疫原性多肽优选地是如上文定义的免疫原性多肽。免疫原性多肽可以作为融合蛋白的一部分表达，其中优选地免疫原性多肽与生物体内源性的蛋白质融合，例如单核细胞增生李斯特菌LLO或ActA蛋白的N末端片段。例如，在WO2015/164121中描述了基于李斯特菌的疫苗的合适实施方式。表达本发明的免疫原性多肽的细菌可以口服或肠胃外给予，优选静脉内给予。

在本发明的另一个实施方式中，本发明的免疫原性多肽源是自体或同种异体树突细胞(DC)，其表面上呈递HLA分子中免疫原性多肽的至少一个MHC限制性表位。例如，可以通过将来自患者血液的DC(例如从患者/对象的单核细胞中分离的DC)与包含本发明的免疫原性多肽的组合物接触和/或装载包含本发明的免疫原性多肽的组合物，来离体制备此类树突细胞。与单核细胞或DC接触的免疫原性多肽优选地是如上文定义的免疫原性多肽。可以使用促进DC收获的药物，例如Progenipoietin^TM(孟山都公司(Monsanto)，密苏里州圣路易斯)或GM-CSF/IL-4。在用肽脉冲DC并清洗以去除未结合的肽后，将DC回输入患者体内。在该实施方式中，提供了一种组合物，其包含肽脉冲DC，其将脉冲肽表位呈递于其表面上的HLA分子。或者，可以使用来源于前体人树突细胞系并经设计用于递送抗原的同种异体DC，而不是使用来自对象的自体细胞，例如，WO2009/019320、WO2014/090795和WO2014/006058中所述。使用离体肽脉冲DC诱导免疫反应的方法为本领域技术人员所熟知。

本发明的另一个方面涉及一种药物制剂，其包括如前文所定义的多肽的现有来源作为活性成分。更具体地，该药物制剂包括作为活性成分的一种或多种上述免疫原性多肽，所述多肽选自ZP蛋白、其同源物以及所述ZP蛋白和其同源物的片段，或者，替代性地，如上文所定义的基因治疗载体。

根据第一实施方式，提供了一种包含一种或多种本发明的免疫原性多肽的药物制剂。所述多肽在药物组合物中的浓度可以变化很大，即从小于约0.1重量％、通常至少约1重量％到高达20重量％或更多。

该组合物优选除活性成分之外至少包括药学上可接受的运载体。药学运载体可以是任何适合将免疫原性多肽或基因治疗载体递送给患者的相容的、无毒的物质。对于多肽，可以使用无菌水、酒精、脂肪、蜡和惰性固体作为运载体。药学上可接受的佐剂、缓冲剂、分散剂等也可以被纳入药物组合物中。

根据特别优选的实施方式，本药物组合物包含佐剂，如本文前面更详细地定义的。本发明组合物中掺入的佐剂优选选自抗原呈递细胞上存在的Toll样受体(TLR)识别的配体组，包括脂肽(参见例如WO04/110486)、脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸(liopteichoic acid)、脂阿拉伯甘露聚糖、脂蛋白(来自支原体或螺旋体)、双链RNA(多聚I：C)、未甲基化的DNA、鞭毛蛋白、含CpG的DNA、Pam3cysSK4和咪唑并喹啉，以及这些配体的具有化学修饰的衍生物。技术人员将能够确定纳入本发明药物制剂中的这些佐剂中的任一种的确切量，以使其具有足够的免疫原性。根据另一个优选的实施方式，本发明药物制剂可以包含用于增强CTL免疫一种或多种的附加成分，如前所述。

本发明的药物制剂，例如包含免疫原性多肽源的组合物，其给予方式和药学上可接受的赋形剂的使用是本领域已知和惯用的，例如描述于《雷明顿：药物科学和实践》(Remington：The Science and Practice of Pharmacy)(Allen编，L.V.第22版，2012年，www.pharmpress.com)。

用于本发明的免疫原性多肽、编码它们的核酸或表达它们的细胞可以使用重组技术制备，例如描述于Ausubel等人的(《新编分子生物学方案》(Current Protocols inMolecular Biology)，格林出版公司和威利跨学科出版公司(Greene Publishing andWiley Interscience)，纽约(1987)，以及描述于Sambrook和Russell(2001)《分子克隆：实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第三版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，纽约冷泉港；两者均通过引用全文并入本文。另请参见Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：488(描述定点诱变)和Roberts等(1987)Nature 328：731-734或Wells，J.A.，等(1985)Gene 34：315(描述盒式诱变)。然而，更优选地，本发明的免疫原性多肽或编码它们的核酸通过化学合成制备。肽或核酸的化学合成是常规做法，本领域技术人员已知各种合适的方法。肽或核酸的化学合成还克服了与重组生产相关的问题，其更难以标准化并且需要广泛的纯化和质量控制措施。

在另一方面，本发明涉及T细胞，所述T细胞包含结合MHC-肽复合物的T细胞受体，其中所述肽优选为包含或由天然ZP(优选hZP3或hZP3(23-350))中包含的I类MHC和II类MHC限制性表位组成的肽，或所述一种或多种多肽的同源物。例如，可以通过以下方法获得此类T细胞，所述方法包括使T细胞与表达编码本发明的免疫原性多肽的多核苷酸的抗原呈递细胞接触和/或使T细胞与装载有本发明的免疫原性多肽的抗原呈递细胞接触；并且，任选地，培养所述T细胞。抗原呈递细胞(APC)优选为树突细胞(DC)。T细胞优选为CD8⁺细胞毒性T细胞或CD4⁺T辅助细胞。将编码免疫原性多肽的多核苷酸引入APC或DC可以使用本领域技术人员已知的任何方法进行，优选地，使用转染将根据本发明的多核苷酸引入APC或DC。优选地，编码免疫原性多肽的多核苷酸具有恰当的控制序列，或包含在恰当的表达载体中。使T细胞与本发明的免疫原性多肽接触可以通过本领域技术人员已知的任何方法进行。优选地，免疫原性多肽或包含在免疫原性多肽中的表位通过APC(优选为DC)表面上的I类MHC或II类MHC分子呈递给CD8⁺细胞毒性T细胞或CD4⁺T辅助细胞。本领域技术人员知道如何用肽装载APC或DC。可以使用本领域技术人员已知的任何方法来培养所述T细胞。在保持细胞存活的条件下维持T细胞在本文中也应解释为培养。优选地，将根据本发明的该方面的T细胞与如本发明的第一方面中定义的根据本发明的免疫原性多肽接触。获得和激活抗原特异性T细胞的离体方法在例如WO2017/173321中有更详细的描述。在此方面，本发明还涉及包含根据本发明的(活化的)T细胞的组合物，以及涉及本发明的方法，包括向对象给予避孕有效量的本文所述或通过本文所述方法产生的(活化的)T细胞。在实施方式中，给予包括给予约10⁶至10¹²个、约10⁸至10¹¹个或约10⁹至10¹⁰个所述(活化的)特异性T细胞。T细胞或其组合物优选通过静脉内、腹膜内、皮内或皮下给予。在另一个实施方式中，将T细胞或其组合物给予到引流至淋巴结盆的解剖部位中。在另一个实施方式中，给予进入多个淋巴结盆。在优选实施方式中，本发明涉及一种通过被动免疫进行处理的方法。该方法优选包括给予特异性结合人透明带(hZP)蛋白表位的抗体或其片段，优选该抗体或其片段特异性结合hZP3或hZP3(23-350)的表位。

″结合″感兴趣的抗原的抗体是指以足够的亲和力结合该抗原从而使得该抗体可用作靶向表达该抗原的细胞或组织的治疗剂，并且不与其他蛋白质发生显著的交叉反应的抗体。在这类实施方式中，抗体与″非靶标″蛋白结合的程度将小于抗体与其特定靶蛋白的结合的约10％，如通过荧光活化的细胞分选(FACS)分析或放射免疫测定(RIA)所确定。就抗体与靶分子的结合而言，针对特定多肽或特定多肽靶标上的表位，术语“特异性结合”、“特异性结合于”或对“......具有特异性”是指相对于非特异性相互作用而言具有可检测到的区别的结合。例如，特异性结合可通过测定某分子的结合并与对照分子的结合进行比较来测量，对照分子通常是结构上相似但没有结合活性的分子。例如，可通过与靶标相似的对照分子(例如过量的未标记的靶标)的竞争来确定特异性结合。在这种情况下，如果标记靶标与探针的结合被过量的未标记靶标竞争性抑制，则表明特异性结合。如本文所用的术语″特异性结合″或″特异性结合至″或″特异性针对″特定多肽或特定多肽靶标上的表位，可以通过以下呈现：例如，针对该靶标具有至少约10^-4M、或者至少约10^-5M、或者至少约10^-6M、或者至少约10^-7M、或者至少约10^-8M、或者至少约10^-9M、或者至少约10^-10M、或者至少约10^-11M、或者至少约10^-12M或更大的K_d(可如下所述确定)的分子。在一个实施方式中，术语″特异性结合″是指分子与特定多肽或特定多肽上的表位结合，而基本上不与任何其他多肽或多肽表位结合的结合。

可以使用表面等离子体共振试验在25摄氏度下测量″K_d″或"K_d值″，使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(Biacore公司(BIAcore，Inc.)，新泽西州皮斯卡塔韦的)，其中以约10-50个反应单位(RU)固定了抗原CM5芯片。简言之，根据供应商的说明，用N-乙基-N′-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)激活羧甲基化葡聚糖生物传感器芯片(CM5，Biacore公司)。用10mM醋酸钠(pH4.8)将抗原稀释至5μg/ml(约0.2μM)，然后以5μl/分钟的流速注射，以实现约10个反应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注入1M乙醇胺以阻断未反应的基团。对于动力学测量，在25℃下以约25μl/分钟的流速将抗体或Fab(0.78nM至500nM)的两倍连续稀释液注入含有0.05％Tween 20的PBS(PBST)中。缔合速率(k_on)和解离速率(k_off)是使用简单的一对一Langmuir结合模型(BIAcore评估软件3.2版本)通过同时拟合缔合和解离传感器图来计算的。平衡解离常数(K_d)以k_off/k_on的比率计算。参见，例如，Chen，Y.，等，(1999)J.Mol Biol 293：865-881。如果通过上述表面等离子体共振试验，缔合速率超过10⁶M^-1S^-1，则可以通过使用荧光猝灭技术测定缔合速率，该技术在25℃下测量在抗原浓度增加的情况下PBS中pH7.2下的20nM抗-抗原抗体(Fab形式)荧光发射强度(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)的增加或减少，如在光谱仪中测量的，例如配备有止流装置的光谱仪(Aviv仪器(Aviv Instruments))或带有搅拌红色比色皿的8000系列SLM-Aminco光谱仪(ThermoSpectronic)。根据本发明的"on速率″或″缔合的速率″或″缔合速率″或"k_on″也可以使用如上所述的相同表面等离子体共振技术，使用如上所述的BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore公司，新泽西州皮斯卡塔韦)来确定。

本文中使用的术语″抗体″具有广义，是指任何类型的免疫球蛋白分子，包括多克隆抗体、单克隆抗体(包括鼠、人、人适应(human-adapted)、人源化和嵌合单克隆抗体)、抗体片段、双特异性或多特异性抗体、二聚体、四聚体或多聚体抗体和单链抗体。

本发明的一个实施方式涉及包括向所述对象给予包含抗ZP抗体(优选抗hZP3或抗hZP3(23-350)抗体)的组合物的方法，其中该抗体通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、补体依赖性细胞毒性(CDC)或细胞凋亡来诱导细胞杀伤。如本领域的普通技术人员通常理解的，这些抗体效应功能可以由抗体的Fc部分介导，例如通过使一个或多个Fc效应结构域与具有吞噬或溶解活性的免疫细胞上的Fc受体结合或通过使一个或多个Fc效应结构域与补体系统的组分结合。通常，由Fc结合细胞或补体组分介导的一种或多种效应最终导致靶细胞(即表达ZP的细胞)的抑制和/或耗竭。人IgG同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4表现出不同的效应功能能力。ADCC可由IgG1和IgG3介导，ADCP可由IgG1、IgG2、IgG3和IgG4介导，CDC可由IgG1和IgG3介导。在本文所述的方法中，抗hZP3或抗hZP3(23-350)抗体优选为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。

在本文所述方法中，抗-hZP3或抗-hZP3(23-350)抗体通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)诱导对表达ZP3蛋白的细胞的体外和/或体内杀伤。在本文所述方法中，抗-hZP3或抗-hZP3(23-350)抗体通过补体依赖性细胞毒性(CDC)诱导对表达ZP蛋白的细胞的体外和/或体内杀伤。在本文所述方法中，抗-hZP3或抗-hZP3(23-350)抗体通过抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)诱导对表达ZP3蛋白的细胞的体外和/或体内杀伤。

在本文所述方法中，抗-hZP3或抗-hZP3(23-350)抗体通过细胞凋亡诱导对表达ZP3蛋白的细胞的体外和/或体内杀伤。

在本文所述方法中，抗ZP抗体可以以一系列亲和力(K_D)结合人ZP。在本发明的一个实施方式中，抗ZP抗体以高亲和力与ZP结合，例如，K_D等于或小于约10^-7M，例如但不限于1-9.9(或其中的任意范围或值，例如1、2、3、4、5、6、7、8或9).10^-8、10^-9、10^-10、10^-11、10^-12、10^-13、10^-14、10^-15或其中的任意范围或值，如本领域技术人员所实践的表面等离子体共振或Kinexa方法所确定。一种实例性亲和力等于或小于1·10^-8M。另一种实例性亲和力等于或小于1·10^-9M。

本发明优选使用的抗体是单克隆抗体。合适的(单克隆)抗体可以通过本领域公知的方法生成、筛选和生产，例如在教科书中所述，例如：《抗体：实验室手册》，第二版，E.A.Greenfield编，2014年，冷泉港实验室出版社。更具体地，Ranking等(1998年，Development 125，2415-2424)描述了针对hZP3胞外域的C末端肽(包含SEQ ID NO：3的氨基酸335-350)产生单克隆抗体H3.1。更优选地，用于本发明的抗体是人源化的，或甚至更优选地是人单克隆抗体，如可以通过本领域众所周知的方法获得，例如，分别在Olimpieri等etal.(Bioinformatics.2015；31(3)：434-435)和Sheehan和Marasco(MicrobiolSpectr.2015；3(1)：AID-0028-2014)中以及本文引用的参考文献中描述的方法。

任何与ZP蛋白的胞外结构域(例如hZP3的胞外结构域，即hZP3(23-350)，所述胞外蛋白具有SEQ ID NO：5的氨基酸序列)结合的抗体均可用于本发明。可用于本发明的合适抗体的例子包括，例如，能够交叉阻断一种或多种已知与hZP3(23-350)结合的参考抗体的结合的抗体。已知特异性结合hZP3(23-350)的一种此类参考抗体是Ranking等人(1998，同上)描述的H3.1抗体，其杂交瘤可从ATCC获得，登录号为：ATCC CRL-2569。

因此，本发明中使用的优选抗体能够交叉阻断至少一种已知与ZP特异性结合(优选与hZP3结合，更优选与hZP3(23-350)或所述多肽的同源物结合)的抗体的结合。更优选地，所述抗体具有交叉阻断H3.1抗体(登录号：ATCC CRL-2569)结合的能力。抗ZP抗体交叉阻断参考抗体结合的能力在本文中定义为当靶分子首先被抗-ZP抗体结合时，将参考抗体与包含ZP、hZP3或hZP3(23-350)氨基酸序列的合适靶分子的结合降低至少10％、20％、50％、75％、90％、95％、99％、99.9％或99.99％的能力，或反之亦然(即当靶分子首先被参考抗体结合时，抗-ZP抗体的结合降低)。交叉阻断的能力原则上可以使用任何类型的免疫试验来确定，优选竞争性免疫试验，包括例如ELISA、固相直接或间接放射免疫试验(RIA)，固相直接或间接酶免疫试验(EIA)，夹心(sandwich)竞争试验(参见Stahli等，酶学方法(Methods in Enzymology)9：24-253(1983)2)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见，Kirkland等J.Immunol.137：3614-3619(1986))；固相直接标记试验，固相直接标记夹心试验(参见《抗体实验室手册》(Antibodies：A Laboratory Manual)，第二版，2014；同上)；使用I¹²⁵标记的固相直接标记RIA(参见，Morel等，Molec.Immunol.25(1)：7-15(1988))；固相直接生物素-亲和素EIA(Cheung等，Virology 176：546-552(1990))；和直接标记的RIA(Moldenhauer等Scand.J.Immunol.32：77-82(1990))。通常，这类试验涉及使用与固体表面结合的纯化的靶分子、未标记的测试抗体和标记的参考抗体。通过确定在测试抗原结合蛋白存在的情况下结合固体表面的标记物的量来测量竞争性抑制。通常，所述测试抗体过量存在。

在本文所述的本发明的方法中，抗-ZP抗体可以作为合适的药物组合物提供，所述药物组合物包含抗-ZP抗体和药学上可接受的运载体。合适的载体和制剂，包括其他人蛋白质(例如人血清白蛋白)描述于，例如，《雷明顿：药学科学与实践》(Remington：The Scienceand Practice of Pharmacy)，第21版，Troy，D.B.编，Lipincott Wlliams和Wilkins，宾夕法尼亚州费城，2006年，第5部分，药物制造，第691-1092页，尤其参见第958-989页。

本文所述本发明方法中抗ZP抗体的给予方式可以是任何合适的途径，例如肠胃外给予，例如皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺部、经粘膜(口服、鼻内、阴道内或直肠)或本领域技术人员熟知的其他方式，如本领域所熟知的。本文所述本发明方法中的抗ZP抗体可以通过任何合适的途径给予患者，例如通过静脉内(i.v.)输注或推注注射、肌肉内或皮下或腹膜内给予进行肠胃外给予。

在本发明的方法中，抗ZP抗体以避孕有效量给予，并且有时可以为0.005mg至约100mg/kg，例如，约0.05mg至约30mg/kg或约5mg至约25mg/kg、或约4mg/kg、约8mg/kg、约16mg/kg或约24mg/kg、或例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg，但可能甚至更高，例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90或100mg/kg。

本发明还涉及一种通过靶向治疗对雄性对象进行避孕的方法，通常通过给予包含能够免疫特异性结合人透明带(hZP)蛋白表位的抗体或其片段的组合物，优选能够免疫特异性结合人透明带蛋白3(hZP3)表位的抗体或其片段，其中所述抗体或片段是免疫偶联物的一部分，例如免疫毒素或抗体一药物偶联物。

术语“免疫偶联物”是指其中抗体或其片段化学连接到另一个分子的偶联物。当连接到抗体或其片段的分子是毒素时，免疫偶联物被称为免疫毒素。使用免疫偶联物可以将药物部分靶向递送到精原细胞、精母细胞和/或精子。从而寻求最大效力和最小全身暴露。设计和改进抗体偶联物的努力集中在单克隆抗体(mAb)的选择性以及药物连接和药物释放特性上。

如本领域技术人员将理解的，抗ZP抗体部分可以是具有本文前面关于被动免疫实施方式描述的任何或所有特征的抗ZP抗体。免疫偶联物还可以包含仅能够免疫特异性结合人透明带(hZP)蛋白表位的抗体或其片段，优选能够免疫特异性结合人透明带蛋白3(hZP3)表位的抗体或其片段，而不诱导任何效应子机制。

本发明的免疫方法还可以包括给予至少一种佐剂，优选共同给予至少一种佐剂。佐剂可以包括疫苗接种领域中已知的任何佐剂，并且可以使用教科书(如《新编免疫学实验指南》(Current Protocols in Immunology)，韦利科学公司(Wiley-Interscience)2004)进行选择。

佐剂在本文中旨在包括任何物质或化合物，当其与抗原组合使用以对人或动物进行免疫时，其刺激免疫系统，从而激发、增强或促进针对抗原的免疫反应，优选不产生针对佐剂本身的特异性免疫反应。与在相同条件下但不存在佐剂的情况下针对抗原产生的免疫反应相比，优选的佐剂将针对给定抗原的免疫反应增强至少1.5、2、2.5、5、10或20倍。本领域中存在用于确定佐剂在动物或人组中相对于相应对照组产生的针对给定抗原的免疫反应的统计平均增强的测试。佐剂优选能够增强针对至少两种不同抗原的免疫反应。本发明的佐剂通常为对人外来的化合物，从而排除人内源性的免疫刺激化合物，例如白细胞介素、干扰素和其他激素。

本领域技术人员熟知多种佐剂。合适的佐剂包括例如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、不完全弗氏佐剂(IFA)、Montanide^TM ISA-51、Montanide^TM ISA 720(法国Seppic公司生产的佐剂)、α-半乳糖神经酰胺、明矾、磷酸铝、氢氧化铝、N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，也称为nor-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二-棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基-磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，也称为MTP-PE)、DDA(2-二甲基双十八烷基溴化铵、多聚IC、多聚A-多聚U、RIBI^TM、GERBU^TM、Pam3^TM、Carbopol^TM、Specol^TM、Titermax^TM、破伤风类毒素、白喉类毒素、脑膜炎球菌外膜蛋白、白喉蛋白CRM₁₉₇。优选的佐剂包括抗原呈递细胞上存在的Toll样受体(TLR)识别的配体。本领域已知多种TLR识别的配体，包括例如脂肽(参见例如WO 04/110486)、脂多糖、肽聚糖、脂磷壁酸、脂阿拉伯甘露聚糖、脂蛋白(来自支原体或螺旋体)、双链RNA(多聚I：C)、多聚ICLC(Hiltonol^TM，由美国Oncovir公司(Oncovir，Inc.)生产)、未甲基化的DNA、鞭毛蛋白、含CpG的寡核苷酸、生长因子和细胞因子，例如单核细胞因子、淋巴因子、白细胞介素、趋化因子(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-12、INFa、INF-y、GM-CSF、LT-a.)、Pam3CysSK4和咪唑并喹啉，以及具有化学修饰的这些配体的衍生物。特别优选使用多聚I：C(poly I：C)。

本发明的方法可以适当地与免疫调节疗法相结合。特别优选的是，当本发明的方法包括给予能够引发针对hZP的细胞或体液免疫反应的免疫原性多肽源时，该方法与免疫调节疗法组合。可以与本发明的方法组合的免疫调节疗法可以从以下一种或多种中选择：使用检查点抑制剂，例如针对PD1、PDL1、CTLA4、TIM-3和/或LAG-3的抗体；使用靶向所选定的TNF受体家族成员的抗体，例如针对CD40、4-1BB、CD137、OX-40/CD134和/或CD27的抗体；使用免疫抑制细胞因子，例如IL-10、TGF-β和/或IL-6；使用细胞因子，例如IL-7、IL-15和IL-21和/或IL-2，因为这些细胞因子具有扩增经历抗原的T细胞的能力；使用TLR激动剂和/或TLR配体；使用不变的自然杀伤T(iNKT)细胞的激动剂，例如合成的iNKT激动剂。

本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含：

a)免疫原性多肽源，其包含来自人透明带蛋白(hZP)的氨基酸序列的I类MHC限制性表位和II类MHC限制性表位中的至少一种；

b)T细胞，其包含与MHC-肽复合物结合的T细胞受体，其中所述肽是来自hZP的氨基酸序列的肽；或者，

c)特异性结合hZP的抗体或其片段；

如本文中前述所述和定义的，其中优选地，hZP蛋白是人透明带蛋白3(hZP3)；

通常与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合。

本文所用的术语″赋形剂″是指可能存在于本公开的药物组合物中但不是活性成分的物质。赋形剂的例子包括但不限于运载体、粘合剂、稀释剂、润滑剂、增稠剂、表面活性剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、调味剂或着色剂。本公开的药物组合物可含有盐、缓冲剂、防腐剂和任选的其他治疗剂。在一个实施方式中，本公开的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的运载体、稀释剂和/或赋形剂。适用于本公开的药物组合物的防腐剂包括但不限于苯扎氯铵、氯丁醇、对羟基苯甲酸酯和硫柳汞。术语″稀释剂″涉及稀释试剂(diluting agent)和/或稀薄剂(thinning agent)。此外，术语″稀释剂″包括流体、液体或固体悬浮液和/或混合介质中的任一种或多种。合适的稀释剂的例子包括乙醇、甘油和水。术语″运载体″是指一种组分，可以是天然的、合成的、有机的、无机的，其中合并活性成分以促进、增强或实现药物组合物的给予。本文使用的运载体可以是一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或包封物质，其适合于向对象给予。合适的运载体包括但不限于无菌水、林格氏液、乳酸林格氏溶液、无菌氯化钠溶液、等渗盐水、聚亚烷基二醇、氢化萘，以及，特别地，生物相容性的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物。在一个实施方式中，本公开的药物组合物包括等渗盐水。用于治疗用途的药学上可接受的运载体、赋形剂或稀释剂在制药领域中是众所周知的，例如，描述于《雷明顿药物科学》(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，马克出版公司(Mack Publishing Co.)(A.RGennaro编，1985)。可以根据预期的给予途径和标准药学实践来选择药物运载体、赋形剂或稀释剂。本公开的药物组合物优选包含一种或多种如本文前面定义的佐剂。

以及试剂盒，所述试剂盒包括含有一个或多个此类药物单位剂型的包装，以及含有印刷说明的说明书，用于在雄性对象中/作为雄性对象中的避孕方法给予一种或多种所述单位剂型。

本发明的另一方面提供了一种药物试剂盒，所述药物试剂盒包括含有本文定义的药物组合物的包装和含有印刷的说明的说明书，用于根据本文公开的方法将所述药物组合物给予雄性对象以进行避孕。

根据本发明的实施方式，药物试剂盒包括容器，例如纸板盒，其中装有含有本发明组合物的小瓶，以及插入容器的说明书，通常是包含印刷信息的患者信息说明书，该信息可以包括试剂盒中所含药物组合物的形式和组成的描述、产品预期处理适应症的指示、产品使用说明以及与使用相关的不良反应和禁忌症的信息和警告。本领域的普通技术人员基于本文提供的信息将理解，作为根据本发明试剂盒一部分的说明书通常将包含与本发明处理方法相关的处理适应症、用途、处理方案等的信息，如上文所述。

除非另有定义，用于公开本发明的所有术语(包括技术和科学术语)具有本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义。通过进一步的指导，包括术语定义以更好地理解本发明的教导。

除非文中另有明确说明，否则如本文中所用的“一个”、“一种”和“该/所述”包括单数和复数形式。举例来说，“一个/种隔室”是指一个/种隔室或多于一个/种隔室。

本文中使用的“约”在涉及可测量值(如参数、量、持续时间等)时，是指包括与特定值相差+/-10％或更少，更优选+/-5％或更少，甚至更优选为+/-1％或更少的变量，只要这些变量适用于执行所公开的发明即可。但应理解，修饰语“约”涉及的值其本身也是具体公开的。

本文所用的术语″包含″、″包含有″、″包含了″与″包括″、″包括有″、″包括了″或″涵盖″、″涵盖有″、″涵盖了″同义，其列举了以下内容(如组件)的存在，并且并不排除或阻碍本领域或本公开中已知的其它未提及的组件、特征、要素、构件、步骤。

以端点列举的数字范围包括该范围内包含的所有数字和分数，以及所列举的端点。技术人员将理解，本发明可以包含任意数量的上述特定特征。

实施例

实施例1：透明带蛋白3在正常睾丸中的新表达

透明带糖蛋白3(ZP3)中的表达最初被认为是卵母细胞特有的，最近扩展到卵巢癌、前列腺癌、结直肠癌和肺癌。之前对携带ZP3阳性卵巢肿瘤的转基因小鼠模型成功进行了ZP3免疫接种，强调了ZP3适用于癌症免疫治疗。进行这项研究旨在确定健康人和小鼠组织中除卵巢以外的任何其他正常组织是否可能表达ZP3，这对于排除ZP3癌症免疫治疗的脱靶效应非常重要。

材料和方法

人组织样品

从波兰比亚韦斯托克医科大学病理形态学系(Medical University ofBialystok Department of Pathomorphology)和大学生物库(University Biobank)的存档石蜡块或冷冻组织中检查了正常人体组织样品(n＝94；对象年龄为30-45岁)(n＝10/卵巢；n＝8/睾丸；n＝7/子宫肌层平滑肌；n＝7/骨骼肌；n＝6/前列腺和附睾，以及n＝5/对于小肠、大肠、肝脏、胰腺、胃、淋巴结、脑、肺、肾和乳腺的每种组织类型)。在手术过程中采集样品，并由病理学家检查以确保它们是健康组织并且没有任何癌细胞。手术期间取出的人体睾丸样品(n＝6)来自比亚韦斯托克医科大学生物库。所有雄性对象均未出现不育或生精成熟停滞的情况。基于以下特征对睾丸结构和精原细胞、精母细胞和精子细胞进行鉴定和区分：1)核结构的典型大小；2)在上皮中的位置；3)典型的粗线期(pachytene)形态；4)染色质凝聚模式。人精液样品(n＝6)是从波兰比亚韦斯托克医科大学生殖和妇科内分泌系的IVF项目招募的因夫妇不孕不育问题(诊断为女性因素)接受处理的男性患者中获得的。精液样品是在禁欲3天后通过手淫获取的。在室温下液化30-60分钟后，根据WHO指南(WHO2010)评估精液参数，并将样品用于IVF程序。使用其余样品使用上游(swim-up)法收集精子。本研究排除了少于15×10⁶个精子/毫升的样品。所有对象在入选前均已获得书面知情同意书。波兰比亚韦斯托克的比亚韦斯托克医科大学当地人研究伦理委员会批准了这项研究。

小鼠组织样品

共检测了n＝40个正常3月龄野生型C57BL小鼠新鲜或固定的石蜡块组织样品(对于卵巢、睾丸、脾脏和骨骼肌，n＝10)。

细胞培养

鼠生精细胞GC-2(spd)ts(CRL-2196；ATCC，Manassas，VA)、鼠间质细胞肿瘤(BLTK-1)(Kananen，Markkula等1996)和小鼠支持细胞系-1(MSC-1)(Rebois1982)细胞系(ATCC)在补充有10％(GC-2(spd)ts和BLTK-1)或5％(MSC-1)胎牛血清(FBS；Biochrom，德国柏林)、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素(P/S溶液；西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)，密苏里州圣路易斯)的DMEM/F12培养基(GIBCO，英国佩斯利)中培养，培养温度为37℃，在CO₂含量为5％的湿润气氛中培养。将原代人支持细胞系HSerC(#4520；ScienCell研究实验室(ScienCell Research Laboratories)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)培养在支持细胞培养基(SerCM，#4521；ScienCell研究实验室)中，将原代人间质细胞系HLC(#4510；ScienCell研究实验室)培养在间质细胞培养基(LCM；#4511；ScienCell研究实验室)中，培养温度为37℃，在CO₂含量为5％的湿润气氛中培养。为了每个RNA分离和免疫细胞化学研究进行三次独立的细胞接种，实验以三重复进行。

RNA分离

使用基于TRIzol的提取方法进行总RNA分离(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)。使用NanoDrop(赛默飞世尔，马萨诸塞州沃尔瑟姆)通过吸光度测量确定提取的RNA的定量和质量。进行凝胶电泳以确定分离的RNA的完整性。

RT-PCR分析

在进行逆转录(RT)反应之前，将1μg总RNA与脱氧核糖核酸酶(DNase I)(Invitrogen)在室温下孵育30分钟，并用25mM EDTA溶液在65℃下抑制10分钟。根据制造商的方案，使用SensiFAST cDNA合成试剂盒(Bioline试剂有限公司(Bioline ReagentsLtd)，英国伦敦)进行RT反应。第一链cDNA用作PCR模板(初始变性为96℃，持续3分钟，然后35个循环，循环条件为94℃，持续1分钟，57℃，持续45秒，以及72℃，持续45秒，最后在72℃下延伸5分钟)。引物序列如下：小鼠Zp3基因F：GAGCTTTTCGGCATTTCAAG，R：AGCTTATCGGGGATCTGGTT和小鼠Ppia基因F：CATCCTAAAGCATACAGGTCCTG，R：TCCATGGCTTCCACAATGTT；人

ZP3基因F：ATGCAGGTAACTGACGATGC，R：CCATCAGACGCAGAGAGAAA，

人FSHR基因F：TGGGCTCAGGATGTCATCATCGGA，

R：TGGATGACTCGAAGCTTGGTGAGG，人LHR基因F：CTGAGTGGCTGGGACTATGA，R：CCAAATCAGGACCCTAAGGA；和人PPIA基因F：GCCAAGACTGAGTGGTTGGATG，R：GAGTTGTCCACAGTCAGCAATGG。

实时定量PCR(qPCR)

对于实时qPCR，使用SYBR Green PCR主混合物(应用生物系统(AppliedBiosystems)，加利福尼亚州福斯特城)和热循环仪7500实时PCR系统(应用生物系统)。反应条件如下：50℃下2分钟，95℃下10分钟，95℃下15秒，60℃下1分钟，至多40个扩增循环。通过熔化曲线分析和琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，以确保单产物扩增。分离每个反应产物(用于RT-PCR和qPCR)并通过测序分析进行验证。将所研究基因的表达水平对管家基因肽基脯氨酰异构酶A(PPIA)标准化。引物序列如下：小鼠Zp3 F：CCAACGACCAGACTGTGGAA，R：AGGACTATAGCTGCCAGGGT；小鼠PpiaF：CATACAGGTCCTGGCATCTTGTC，R：AGACCACATGCTTGCCATCCAG；和人ZP3 F：TGGCAACAGCATGCAGGTA，R：CTGAGTGGCTGGGACTATGA，人FSHRF：GCCAAGAGAGCAAGGTGACA，R：CTCGAAGCTTGGTGAGGACA，人LHR F：CCGGTCTCACTCGACTATCACT，R：AAGCTTGAGATGGGATCACTTTG，和人PPIA F：GTTCTTCGACATTGCCGTCG，R：TGTCTGCAAACAGCTCAAAGG。

RNAscope原位杂交

根据制造商的方案，使用RNAscope 2.0HD试验(目录号310033，高级细胞诊断(Advanced Cell Diagnostics)[ACD]，加利福尼亚州海沃德)处理福尔马林固定石蜡包埋的组织样品。简言之，将载玻片在二甲苯(2x5分钟)、100％EtOH(2x1分钟)中脱蜡，并在室温下风干5分钟。将每片切片在室温下用过氧化氢处理10分钟，然后在蒸馏水中洗涤两次。将载玻片在抗原修复缓冲液中煮沸15分钟，然后立即浸入蒸馏水中。接下来，将载玻片在100％EtOH中洗涤并风干。对于每个切片，用疏水笔绘制屏障，并在40℃的HybEZ^TM烤箱(ACD)中施加蛋白酶30分钟。将载玻片在蒸馏水中洗涤两次。应用针对靶转录物(小鼠ZP3：ACD-447551，人ZP3：ACD-442631)的探针以及针对阳性(亲环蛋白B-PPIB，管家基因，人ACD-313901；小鼠ACD-313911)和阴性对照(DapB-靶向细菌基因的阴性对照探针，ACD-310043)的探针。然后，将载玻片在烤箱中以40℃的温度孵育2小时，并在洗涤缓冲液中洗涤2x2分钟。此后，施用杂交放大剂(AMP)，在40℃(AMP 1-4)或室温(AMP 5和6)下施用30分钟(AMP1、3、5)或15分钟(AMP2、4、6)，每一步之间进行两次洗涤。最后一次清洗后，将等体积的BROWN-A和BROWN-B试剂合并，在室温下施用在切片上10分钟。用蒸馏水洗涤两次后，将载玻片在50％Gill苏木精(载体实验室公司(Vector Laboratories))，美国加利福尼亚州伯林盖姆)中复染2分钟，然后在0.02％氨水中洗10秒，在蒸馏水中洗两次。用Pertex(HistolabProducts，瑞典哥德堡)安装脱水载玻片(在70％EtOH中2x2分钟，在100％EtOH中2x2分钟，在二甲苯中5分钟)。

免疫组织化学染色

利用杂交瘤技术(East，Gulyas等1985，Rankin，Tong等1998)产生针对人(同种型IgG1κ)和小鼠(同种型IgG2a)ZP3的单克隆抗体。杂交瘤(CRL-2462^TM和CRL-2569^TM)在CELLine生物反应器1000mL悬浮烧瓶(Argos Technologies-Cole-Parmer，Vernon Hills，IL)中的DMEM培养基中培养，DMEM培养基含有4mM L-谷氨酰胺、1.5g/L碳酸氢钠和4.5g/L葡萄糖，并补充有10mM HEPES、0.1 5mg/ml草酰乙酸、0.05mg/ml丙酮酸、0.0082mg/mL牛胰岛素和0.05mM 2-巯基乙醇。细胞隔室中施加了20％FBS，营养培养基中施加了1％FBS。根据细胞生长情况，每约5天左右收获一次细胞，然后纯化收获物。

将福尔马林或Bouin固定的石蜡包埋样品脱蜡并水化。将载玻片放入抗原修复缓冲液(10mM柠檬酸缓冲液，含0.05％Tween20，pH＝6)中煮沸15分钟。然后，将切片放入加湿室中，在室温下用3％BSA孵育1小时，以减少非特异性背景染色。接下来，将载玻片放入加湿室中，在4℃下与一抗抗ZP3(0.125μg/mL)或抗波形蛋白(ab28028；Abcam，英国剑桥；稀释度1：300)孵育过夜。将载玻片放入PBS中的0.5％H₂O₂中，在室温下孵育20分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。将DAKO聚合物(DAKO EnVision+系统-HRP标记聚合物；安捷伦，加利福尼亚州圣克拉拉)施加在每个切片上，并在室温下在加湿室中孵育30分钟。施加DAB+色原(DAKO)5分钟。将载玻片在dH₂O中洗涤，在Mayer苏木精(西格玛-奥德里奇，密苏里州圣路易斯)中复染，脱水并用Pertex(Histolab Products)安装。作为抗体的对照，用3％BSA和DAKO聚合物孵育组织，以区分非特异性染色和特异性染色。

免疫细胞化学染色

在胶原蛋白涂覆的显微镜载玻片盖玻片上培养的GC-2(spd)ts细胞用PBS洗涤两次，并在3.7％多聚甲醛(PFA)中固定20分钟。对于精子染色，制作精子涂片并在室温下风干至少1小时。接下来，将载有精子的载玻片在PBS中的4％PFA中固定1小时。在PBS中冲洗载玻片，并用PBS中的0.5％Triton X-100处理15分钟。为了阻断非特异性结合位点，在封闭溶液(PBS中的2％BSA和0.05％Tween20)中孵育细胞。此后，将细胞与原代小鼠单克隆抗ZP3抗体孵育1小时，或进行在封闭溶液中稀释的抗ZP3抗体与抗α-微管蛋白抗体(ab52866，Abcam；稀释度1：300)双重染色。洗涤后，用Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG(A11029；赛默飞世尔，马萨诸塞州沃尔瑟姆；稀释度1：500)或Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG(A11034；赛默飞世尔；稀释度1：500)和Alexa Fluor 546山羊抗小鼠IgG(A11030；赛默飞世尔；稀释度1：500)孵育细胞45分钟。使用DAPI染料作为复染剂来检测细胞核。作为抗体的对照，用2％BSA或Alexa Fluor-488山羊抗小鼠IgG作为一抗孵育细胞，以区分非特异性染色和特异性染色。

全视野小鼠生精小管(seminiferous tubule)染色

全视野小鼠生精小管染色按先前描述的方式进行(Makela，Cisneros-Montalvo等2020)。简言之，处死三只成年WT雄性小鼠，并在+4℃下用4％PFA固定生精小管2小时。阻断(PBS中0.3％Triton X-100中的2％BSA+10％FBS)之后，将生精小管在+4℃下与以下一抗孵育过夜：小鼠单克隆抗人ZP3抗体(1μg/ml)、抗GFRa1抗体(AF560，R&D系统，明尼苏达州，明尼阿波利斯；稀释度1：250)和抗SALL4抗体(1：2000，ab29112，英国，剑桥)。洗涤后，将小管与相应的二抗(A11055、A10036和A31573，生物技术公司，美国加利福尼亚州卡尔斯巴德，所有抗体的稀释度均为1：500)在室温下孵育1小时。最后，将小管排列到衬条中，安装并成像(蔡司LSM880，卡尔蔡司，德国耶拿)。

结果

除了卵巢外，ZP3还在正常人和野生型(WT)小鼠睾丸的生精细胞中表达

定量PCR分析显示Zp3在WT小鼠卵巢和睾丸中表达(图1A-1B，表1)。

表1.不同人和小鼠组织/细胞中ZP3 mRNA水平表征。

在用作阴性对照的WT小鼠脾脏和肌肉中未检测到Zp3表达(图1A-1B)。免疫组织化学染色和RNAscope原位杂交定位了小鼠卵巢初级卵泡、次级卵泡和室性卵泡(antralfollicle)的卵母细胞中丰富的Zp3蛋白和mRNA转录物(分别为图2A和2C)。同样，小鼠睾丸中的精原细胞、精母细胞、圆形和细长精子细胞中也定位了丰富的Zp3蛋白和mRNA(分别为图2B和2D)。小鼠原始卵泡卵母细胞和睾丸支持细胞和间质细胞以及精子均不表达Zp3(图2A-2D)。在人中，来自卵巢卵泡的卵母细胞中(分别为图3A和3C)以及睾丸精原细胞、精母细胞、圆形和细长精子细胞中也定位了丰富的ZP3蛋白和mRNA转录物(分别为图3B和3D)。在人睾丸支持细胞和间质细胞中均未检测到ZP3表达，无论是mRNA水平还是蛋白质水平(图3B和3D)。亲环蛋白B用作阳性对照，其在小鼠和人卵巢和睾丸中大量表达(图4，左栏)。DapB用作阴性对照，在任何性腺样品中均未检测到(图4，右栏)。省略一抗用作免疫组织化学分析的对照，在小鼠和人睾丸中均未检测到染色(图5A-B)。为了识别支持细胞，用支持细胞标志物波形蛋白对睾丸组织进行免疫染色。在支持细胞的细胞质中观察到波形蛋白的阳性免疫反应，薄薄的一层细胞质穿过整个上皮(图6A-B)。在人原始卵泡卵母细胞中未发现ZP3 mRNA转录物(图7A)，而在初级(图7B)、次级(图7C)和室性(图7D)卵泡中则定位到大量表达。在小鼠GC-2spd(ts)永生化生精细胞系和作为阳性对照的WT小鼠卵巢中也发现了Zp3表达(图8A)。在间质肿瘤细胞系BLTK-1和支持MSC-1细胞中未检测到Zp3表达(图8A)。WT小鼠骨骼肌用作Zp3阴性对照(图8A)。免疫细胞化学研究发现小鼠GC-2spd(ts)细胞的细胞质中有Zp3表达(图8B)。在无一抗的对照分析中未检测到染色(图8B)。在人原代支持细胞(HSerC)和间质细胞(HLC)中均未检测到ZP3 mRNA表达(图9A-9B)。作为对照，分别分析了HSerC和HLC细胞的FSHR和LHR表达。HSerC表达FSHR而不表达LHR，而HLC表达LHR而不表达FSHR(图9A-9B)。在用作阳性对照的人卵巢中发现了ZP3、LHR、FSHR表达，而在用作阴性对照的人肌肉中未检测到(图9A-9B)。GFRa1阳性(GDNF家族受体α-1)精原细胞被认为是雄性生殖系的干细胞和祖细胞(SSPC)(分化中的精原细胞(differentiating spermatogonia)，在分化并致力于精子发育的A1精原细胞之前的细胞)，因此负责终生的精子生产。为了检查SSPC中的Zp3表达，对成年小鼠睾丸进行了全视野生精小管染色。在成年小鼠生精上皮的基底膜上未观察到小鼠单克隆抗ZP3抗体的免疫反应性，这表明GFRa1/SALL4阳性(Spalt-样4，一种泛精原细胞标志物)SSPC以及分化中的祖精原细胞(GFRa1阴性/SALL4阳性)不表达ZP3(图10)。在人精子中也未检测到ZP3 mRNA表达(图11)。在用作阳性对照的人卵巢中发现了ZP3表达，而在用作阴性对照的人肌肉中未检测到ZP3表达(图11A)。使用免疫细胞化学分析在人精子中未检测到ZP3染色(图11B)。

其他多种正常人和小鼠组织均为ZP3阴性

在其他多种正常人组织中，免疫组织化学染色未检测到ZP3的表达，例如小肠(图12a)、大肠(图12b)、肝脏(图12c)、胰腺(图12d)、胃(图12e)、淋巴结(图12f)、脑(图12g)、肺(图12h)、附睾(图12i)、前列腺(图12j)、肾脏(图12k)、乳腺(图12l)、平滑肌子宫肌层(图12m)和骨骼肌(图12n)。

讨论

ZP3已被证明在几种癌症(卵巢癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌)中表达，这引发了将其用作癌症免疫治疗靶点的概念。使用转基因小鼠卵巢颗粒细胞瘤模型，ZP3免疫也已被证明是治疗卵巢癌的有效方法。所采用的免疫策略有可能有效治疗表达ZP3的其他癌症类型。本研究旨在表征健康组织中ZP3的表达，以及癌症免疫中脱靶效应的可能性。

本研究结果显示，ZP3在人和小鼠睾丸的精原细胞、精母细胞和精子细胞中出现了新的表达。然而，在成熟的精子、精原干细胞和祖细胞以及支持细胞或间质细胞中没有发现表达。在卵巢中，ZP3是卵母细胞成功受精所必需的，但目前还没有关于卵巢外ZP3功能的任何数据。除卵巢和睾丸外，在任何其他健康正常组织中均未发现蛋白质ZP3表达。

在目前的研究中，使用了几种技术来检查/确认ZP3的表达。使用特异性单克隆抗体分析ZP3蛋白的定位，并使用灵敏的RNAscope原位杂交法通过睾丸中的RNA转录物确认其存在。

在雌性动物中，ZP3免疫诱导自身免疫性卵巢炎和卵巢萎缩(Lou，Y.H.，K.K.Park，S.Agersborg，P.Alard和K.S.Tung(2000).″重靶向T细胞介导的炎症：自身抗体作用的新视角(Retargeting T cell-mediated inflammation：a new perspective on autoantibodyaction.)″J Immunol 164(10)：5251-5257)。当原始卵巢卵泡被选中生长并成为初级卵泡时，它们开始在卵母细胞周围的糖蛋白层中表达ZP抗原，并变得易受ZP3特异性抗体和自身反应性免疫细胞的影响。已证实抗体与正在生长或成熟的卵泡中的ZP3蛋白结合后，诱导T细胞介导的炎症，使得正在发育的卵泡退化。最近，已证实在主动免疫的小鼠中，在仔细选择B细胞表位后，ZP3疫苗可诱发可逆性不孕，且不会对卵巢产生不良影响(Paterson，M.，Z.A.Jennings，M.R.Wilson和R.J.Aitken(2002).″ZP3和ZP3肽在灵长类动物模型中的避孕潜力(The contraceptive potential of ZP3 and ZP3 peptides in a primatemodel.)″J Reprod Immunol 53(1-2)：99-107)。对于嵌合肽疫苗，所定义的B细胞表位有一个关键的氨基酸取代，以防止与天然ZP3 T细胞表位发生交叉反应，但不会阻止B细胞对ZP3的反应(Lou，Y.，J.Ang，H.Thai，F.McElveen和K.S.Tung(1995).″透明带肽3疫苗诱导抗体和无卵巢病理的可逆性不孕(A zona pellucida 3 peptide vaccine inducesantibodies and reversible infertility without ovarian pathology.)″J Immunol155(5)：2715-2720)。这种ZP3疫苗能够成功防止怀孕，而不会引起卵巢病理。

睾丸中ZP3抗原的表达为使用ZP3免疫进行雄性避孕带来了令人惊讶的可能性。任何其他正常雄性组织以及睾丸体细胞中均没有ZP3表达，从而降低了伴随损害其他器官的风险。然而，应仔细选择ZP3表位以避免破坏睾丸组织和使其能够穿过血睾屏障。这种免疫的另一个重要特征是其可逆性。此外，由于睾丸中合成睾酮的间质细胞不表达ZP3，因此可能不会发生不利的内分泌副作用，前提是没有由于表位的充足选择而发生整体自身免疫反应。此外，由于在SSPC以及支持细胞中未检测到ZP3表达，因此抗ZP3雄性避孕治疗不太可能破坏生精干细胞而诱发不可逆的不育症；因此这种雄性避孕策略在停止后可以是可逆的。

总之，本文报道了人和小鼠生精细胞中新的卵巢外ZP3表达，以及一系列正常人和小鼠组织中ZP3表达的缺失。这些关于正常非性腺组织中ZP3表达缺失的发现为任何ZP3癌症免疫疗法提供了重要的背景信息。由于睾丸中ZP3的表达，任何未来雄性(如前列腺癌、肺癌或结直肠癌)的ZP3癌症免疫疗法临床试验都应谨慎。除了癌症免疫疗法外，睾丸中ZP3表达的发现还提出了另一种治疗策略。睾丸ZP3表达在精原细胞、精母细胞和精子细胞中的排他性定位使ZP3免疫成为雄性免疫避孕的一个有希望的新靶点。进一步的研究还应解决ZP3在睾丸中的功能作用，特别是ZP3免疫是否对雄性生育力具有长期或可逆的影响。

附图说明

图1：不同野生型(WT)小鼠组织中的Zp3表达概况。正常小鼠睾丸、卵巢、脾脏和肌肉中Zp3表达的qPCR分析(A)。Zp3的表达对同一样品中的Ppia表达标准化。正常小鼠睾丸、卵巢、脾脏和肌肉中管家基因Ppia和Zp3在2％琼脂糖凝胶中的RT-PCR分析(B)。左侧显示扩增子大小。

M，标志物；MU，肌肉；OV，卵巢；SP，脾脏；TE，睾丸；H₂O，无核酸酶水。

图2：野生型(WT)小鼠卵巢和睾丸中Zp3的免疫组织化学定位和RNAscope原位杂交。小鼠卵巢(A)和睾丸(B)中Zp3蛋白的定位以及小鼠卵巢(C)和睾丸(D)中Zp3 mRNA转录物的定位。右侧上框显示下框的更高放大倍数，显示小鼠睾丸中的ZP3蛋白/转录物定位(B、D)。小鼠睾丸中，黑色箭头表示阳性ZP3蛋白染色或单个转录物定位，白色箭头表示阴性支持细胞，蓝色箭头表示阴性间质细胞。比例尺，100μm(A，C)和50μm(B，D)。

图3：正常人卵巢和睾丸中ZP3 mRNA转录物的免疫组织化学定位和RNAscope原位杂交。人卵巢(A)和睾丸(B)中ZP3蛋白的定位以及人卵巢(C)和睾丸(D)中Zp3 mRNA转录物的定位。右侧上框显示下框的更高放大倍数，显示人睾丸中的ZP3蛋白/转录物定位(B、D)。人睾丸中，黑色箭头表示阳性ZP3蛋白染色或单个转录物定位，白色箭头表示阴性支持细胞，蓝色箭头表示阴性间质细胞。比例尺，100μm(A，B)和50μm(C，D)。

图4：组织切片质量和原位杂交特异性分析。野生型小鼠卵巢(A-B)和人正常卵巢(C-D)以及小鼠正常睾丸(E-F)和人正常睾丸(G-H)的石蜡切片与亲环蛋白B互补的阳性对照探针(左栏)和针对细菌DapB基因的阴性对照探针(右栏)杂交。用苏木精复染切片。比例尺为50μm。

图5：免疫组织化学研究中一抗特异性分析。用3％BSA和DAKO EnVision+System-HRP标记的聚合物孵育野生型小鼠睾丸(A)和人睾丸(B)的石蜡切片。用苏木精复染切片。比例尺，50μm。

图6：波形蛋白(支持细胞标志物)的免疫组织化学定位。

波形蛋白在小鼠(A)和人(B)睾丸中的定位。分析一抗在小鼠(C)和人(D)睾丸中的特异性。比例尺，50μm。

图7：正常人卵巢中ZP3 mRNA转录物的RNAscope原位杂交。ZP3mRNA转录物在原始(A)、初级(B)、次级(C)和室性(D)卵泡的卵母细胞中的定位。右侧上框显示下框的更高放大倍数，揭示了ZP3在室性卵泡卵母细胞中的定位(D)。比例尺，100μm(A)，50μm(B，C)和200μm(D)。框放大倍数，40倍；比例尺，50μm。

图8：小鼠GC-2spd(ts)细胞系中的Zp3表达。在GC-2spd(ts)细胞系、BLTK-1细胞系、MSC-1细胞系、卵巢和肌肉中对管家基因Ppia和Zp3进行2％琼脂糖凝胶RT-PCR分析(A)。左侧显示扩增子大小。小鼠生精GC-2spd(ts)细胞系中Zp3的免疫细胞化学定位(B)。下分图示出无一抗对照染色。BLTK-1，鼠间质细胞肿瘤；GC-2spd(ts)，小鼠生精细胞系；M，标志物；MSC-1，小鼠支持细胞系-1；MU，肌肉；OV，卵巢；H₂O，无核酸酶水。比例尺，10μm。

图9：人原代支持细胞和间质细胞中的ZP3、FSHR和LHR表达概况。对人原代HSerC和HLC细胞以及正常人卵巢和肌肉中ZP3、FSHR和LHR表达的qPCR分析(A)。Zp3的表达对同一样品中的PPIA表达标准化。在2％琼脂糖凝胶中对人原代HSerC和HLC细胞以及正常人卵巢和肌肉中的ZP3、FSHR、LHR和管家基因PPIA进行RT-PCR分析(B)。HLC，原代人间质细胞系；HSerC，原代人支持细胞系；M，标志物；MU，肌肉；OV，卵巢；H₂O，无核酸酶水。

图10：小鼠精原干细胞和祖细胞，SSPC，中ZP3的免疫组织化学定位。使用针对SSPC标志物GFRa1(红色)、ZP3(绿色)和泛精原细胞标志物SALL4(蓝色)的抗体对成年小鼠全视野生精小管进行染色的共聚焦显微镜图像。白色箭表示GFRa1/SALL4阳性SSPC，白色箭头指向GFRa1阴性/SALL4阳性分化中的祖精原细胞。比例尺50μm。

图11：人精子中的ZP3表达。人精子、卵巢和肌肉中的管家基因PPIA和ZP3在2％琼脂糖凝胶中的RT-PCR分析(A)。左侧显示扩增子大小。人精子中ZP3和α-微管蛋白的免疫细胞化学定位(B)。下分图示出无一抗对照染色。M，标志物；MU，肌肉；OV，卵巢；SP，脾脏；H₂O，无核酸酶水。比例尺，10μm。

图12：ZP3在几种正常人体组织中的免疫组织化学定位。ZP3蛋白在人小肠(a)、大肠(b)、肝脏(c)、胰腺(d)、胃(e)、淋巴结(f)、脑(g)、肺(h)、附睾(i)、前列腺(j)、肾脏(k)、乳腺(1)、平滑肌子宫肌层(m)和骨骼肌(n)中的定位。比例尺，50μm。

图13：选定的hZP3肽序列。方框和椭圆形分别包含预测的I类MHC和II类MHC结合物，如表2和表5以及表3中所示。星号表示潜在的N连接糖基化位点，序列上方的括号标志着具有O连接聚糖簇的区域。

表格

表I：预测的hZP3蛋白中所含的I类MHC配体：

表II：预测的hZP3蛋白中所含的II类MHC配体：

表III：rhZP3蛋白的HLA-A2限制性T细胞表位：

表IV：人透明带蛋白：

Claims (12)

1.通过向雄性对象给予药物组合物来治疗所述对象的方法，所述药物组合物包含：

a)免疫原性多肽源，其包含来自人透明带蛋白(hZP)的氨基酸序列的I类MHC限制性表位和II类MHC限制性表位中的至少一种；

b)T细胞，其包含与MHC-肽复合物结合的T细胞受体，其中所述肽是来自hZP的氨基酸序列的肽；或者，

c)特异性结合hZP的抗体或其片段，其中优选地，所述hZP蛋白是人透明带蛋白3(hZP3)；

其中所述方法是避孕方法、降低雄性生育力的方法、诱导雄性不育的方法、抑制精子发生的方法、诱导少精的方法、诱导无精的方法、减少精子数量的方法、诱导严重少精状态的方法、减少MOT的方法、减少TMS的方法和/或减少精液量的方法。

2.如权利要求1所述的方法，其中免疫原性多肽源是组合物，其包括：a1)一种或多种免疫原性肽，其包括或由选自SEQ ID NO.66-75的氨基酸序列组成；和/或，a2)一种或多种免疫原性肽，其包括或由选自SEQ ID NO.76-85的氨基酸序列组成。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述雄性对象是男性对象。

4.如权利要求1所述的方法，其中，其中所述免疫原性多肽源包括以下的至少一种：

a)蛋白质物质组合物，其包括至少一种免疫原性多肽源，所述免疫原性多肽包括来自hZP氨基酸序列的I类MHC限制性表位和II类MHC限制性表位中的至少一种；

b)编码所述免疫原性多肽的氨基酸序列的核酸分子；

c)表达所述免疫原性多肽的细胞；以及，

d)呈递MHC-肽复合物的抗原呈递细胞，其中所述肽是来自hZP氨基酸序列的肽。

5.如权利要求4所述的方法，其中：

a)所述蛋白质物质组合物包括至少一种免疫原性多肽，其包括选自hZP氨基酸序列的至少18个氨基酸的连续氨基酸序列，并且其中所述连续氨基酸序列包括I类MHC限制性T细胞表位和II类MHC限制性T细胞表位中的至少一种；

b)所述核酸分子是：i)DNA分子，其是用于在人细胞中表达所述免疫原性多肽的表达构建体；或，ii)RNA分子，其能够在人细胞中翻译成所述免疫原性多肽；

c)所述细胞是微生物细胞，优选李斯特菌细胞；以及，d)所述抗原呈递细胞是自体或同种异体树突细胞，其离体装载有免疫原性多肽，所述免疫原性多肽包含来自hZP的氨基酸序列的I类MHC限制性表位和II类MHC限制性表位中的至少一种。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述蛋白质物质组合物包含多于一种的不同免疫原性多肽，每种免疫原性多肽包含选自hZP的氨基酸序列的至少18个氨基酸的连续氨基酸序列，并且长度在18-100个氨基酸的范围内，优选长度在18-60个氨基酸的范围内。

7.如权利要求1所述的方法，其中所述hZP是hZP3(23-350)。

8.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性肽源共同包含以下的至少一种：a)hZP3或hZP3(23-350)的完整氨基酸序列的至少50％、70％、80％、90％或95％；以及，b)由基于计算机的算法生物信息学工具预测的潜在MHC I和/或MHC II表位的至少50％、70％、80％、90％或95％。

9.如权利要求16所述的方法，其中所述方法还包括给予至少一种佐剂，优选共同给予至少一种佐剂。

10.如权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性肽源是能够在人细胞中翻译成所述免疫原性多肽的信使RNA。

11.如权利要求11所述的方法，其中所述一种或多种免疫原性肽源是包含mRNA和阳离子脂质的脂质纳米颗粒。

12.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其片段是特异性结合hZP3(23-350)的人源化或人单克隆抗体或其片段。