TW201741333A - Ｍｉｃ－１化合物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本發明係關於MIC-1化合物。更特定言之，其係關於包含MIC-1多肽及N端胺基酸延伸部分之化合物，其中該延伸部分由3至36個胺基酸殘基組成且其中該化合物之計算的pI低於6.5。本發明之化合物具有MIC-1活性。本發明亦關於包含此類化合物及醫藥學上可接受之賦形劑之醫藥組成物以及該等化合物之醫療用途。
Description
本發明係關於MIC-1化合物及其醫藥用途。
名稱為「SEQUENCE LISTING」的序列表為142,554位元組，其創建於2017年5月23日且以引用之方式併入本文中。
巨噬細胞抑制性細胞介素-1(MIC-1)首先描述於基於展示於活化巨噬細胞中之表現增加的實驗之1997(Bootcov等人，Proc.Natl.Acad.Sci.Oct 1997)中。MIC-1隨後已由其他人鑑別出及給予若干額外名稱，諸如胎盤轉型生長因子β(PTGF-β)、胎盤骨形態生成蛋白、生長分化因子-15(GDF15)、前列腺衍生因子(PDF)、非類固醇消炎藥活化基因(NAG-1)及PL74。
MIC-1係TGF-β超家族(與細胞生長及分化有關之肽激素之家族)之較遠的成員。MIC-1以分子量為24.5kDa之富含半胱胺酸之同源二聚體(homodimer)形式循環。最初據報導MIC-1藉由刺激(包括IL-1b、TNF-α、IL-2及TGF-b)在巨噬細胞中上調。亦展示MIC-1可減少脂多醣誘導之TNF-α產生且基於此等資料提議MIC-1為消炎細胞介素。
近年來，(Johnen等人，Nat Med.，2007年11月)來自患有
晚期癌症之患者之資料顯示與MIC-1循環量相關之重量損失。此等資料指示MIC-1會調節體重。此情況假設在用前列腺腫瘤細胞異種移植之小鼠中進行測試，其中升高之MIC-1含量與體重減輕及食物攝入減少相關，此影響可藉由向MIC-1投予抗體而逆轉。由於將重組MIC-1投予至小鼠會調節下丘腦神經肽γ及阿黑皮素原，故提議MIC-1藉由中樞機制調節食物攝入。此外，對於正常低脂肪膳食及高脂肪膳食過度表現MIC-1之轉殖基因小鼠增加較少重量及體脂肪(Macia等人，PLoS One，2012年4月)。此外，分別用低與高脂肪膳食兩者餵養之過度表現MIC-1之轉殖基因小鼠與用類似飲食之野生型動物相比具有改良之葡萄糖耐受性。
肥胖症最常由單獨過量卡路里攝入或結合能量消耗減小及/或缺少身體運動所導致。肥胖症係如糖尿病、心血管病、睡眠呼吸暫停及癌症之代謝疾病之公認風險因素。
本文描述MIC-1化合物，其包含MIC-1多肽及N端胺基酸延伸部分。
在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物具有良好的生物物理學特性。此等特性包括(但不限於)溶解度及穩定性。在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物具有改良之溶解度。在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物具有改良之化學穩定性。
在一個態樣中，本發明之化合物具有改良之生物物理學穩定性，如由減小之晶體形成趨勢所示。
在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物保持MIC-1受體效
力及對降低食物攝入及體重之活體內功效。此等MIC-1化合物可因此用於治療諸如肥胖症、糖尿病、心血管病(如血脂異常及動脈硬化)及其他病症(諸如脂肪性肝炎及糖尿病性腎病)之代謝障礙。
在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物包含MIC-1多肽及N端胺基酸延伸部分，其中該延伸部分由3至36個胺基酸殘基組成且其中該化合物之計算的pI低於6.5。
在本發明之一些具體實例中，MIC-1化合物之計算的pI低於6.1。
在本發明之一些具體實例中，MIC-1化合物之計算的pI高於4.7。
在本發明之一些具體實例中，MIC-1化合物之計算的pI高於4.7且低於6.1。
在本發明之一些具體實例中，MIC-1化合物之計算的pI在5.8至5.2之範圍內。
在一些具體實例中，呈同源二聚體之本發明之MIC-1化合物具有218-296、224-296或230-296個胺基酸殘基。
在一些具體實例中，本發明之MIC-1化合物包含長度在3-35、3-30、3-25、3-24、4-36、4-35、4-30、4-25、4-24、5-36、5-35、5-30、5-25、5-24、6-36、6-35、6-30、6-25、6-24、7-36、7-35、7-30、7-25、7-24、8-36、8-35、8-30、8-25、8-24、8-12、30-36、32-36、30-34或30-32個胺基酸殘基之範圍內之N端延伸部分。
在一些具體實例中，本發明之MIC-1化合物包含長度在
30-32個胺基酸殘基範圍內之N端延伸部分。
在一些具體實例中，本發明之MIC-1化合物包含酸性胺基酸殘基(天冬胺酸及麩胺酸)與鹼性胺基酸殘基(離胺酸、精胺酸及組胺酸)之數目相比過剩至少3、4、5或6個之N端延伸部分。
在本發明之一些具體實例中，MIC-1化合物包含由選自由以下組成之群的胺基酸殘基構成之N端延伸部分：A、E、G、P、S、T、Q及D，其中該延伸部分包含至少三個E及/或D胺基酸殘基。
在一些具體實例中，本發明之MIC-1化合物包含展示與SEQ ID NO：1之MIC-1具有至少85%、90%、95%或98%序列一致性的MIC-1多肽。
在一些具體實例中，本發明之MIC-1化合物包含MIC-1多肽，該MIC-1多肽包含與SEQ ID NO：1之MIC-1相比之以下取代中之一或多者：取代N3E、P11E、H18E、R21E、A30E、A47E、R53E、A54E、M57E、M57L、R67E、L68E、K69E、A75E、A81E、P85E、M86L、L105E及K107E及/或與SEQ ID NO：1之MIC-1相比前三個殘基之缺失(MIC-1-△1-3)或N3之缺失(消-N3(des-N3))。
在本發明之一特定具體實例中，MIC-1化合物包含MIC-1多肽及N端胺基酸延伸部分，該MIC-1化合物具有根據SEQ ID NO：87、90、92、93、94、97、98、99、100、101、102、108、109或164之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供MIC-1化合物，其在參(羥基甲基)胺基甲烷(Tris)緩衝液系統中在pH 8.0下之溶解度係約0.5、1.0、5.0、10、30或50mg/ml。
在一個態樣中，本發明提供一種編碼本發明之MIC-1化合物之聚核苷酸分子。
在一個態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含本發明之MIC-1化合物或其醫藥學上可接受之鹽、醯胺或酯及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
在一個態樣中，本發明提供一種本發明之MIC-1化合物，其用作醫藥品。
在一個態樣中，本發明提供一種本發明之MIC-1化合物，其用於預防及/或治療代謝病症，其中該代謝病症係肥胖症、2型糖尿病、血脂異常或糖尿病性腎病。
在一個態樣中，本發明提供一種本發明之MIC-1化合物，其用於例如藉由減少食物攝入、減輕體重、抑制食慾及誘發飽腹感而預防及/或治療飲食障礙，諸如肥胖症。
在一個態樣中，本發明提供一種本發明之MIC-1化合物，其用於預防及/或治療肥胖症。
在一個態樣中，本發明之化合物係MIC-1受體促效劑。在一個態樣中，本發明化合物抑制食物攝入。在一個態樣中，本發明化合物減輕體重。
在一個態樣中，本發明提供本發明之MIC-1化合物，其用於預防及/或治療心血管疾病。
在一個態樣中，本發明提供一種本發明之MIC-1化合物，其用於預防及/或治療血脂異常、動脈硬化、脂肪性肝炎或糖尿病性腎病。
圖1：有單12聚體建構嵌段之MIC-1化合物之表現。所有細胞在37℃下生長於TB中且在OD600達到1.0之後藉由添加0.5mM IPTG誘發蛋白質表現。在隔夜之後收集細胞且藉由將總溶胞物裝載於SDS-PAGE上來檢驗表現量。載入wtMIC-1作為陽性對照。
圖2：有雙12聚體建構嵌段之MIC-1化合物之表現。所有細胞在37℃下生長於TB中且在OD600達到1.0之後藉由添加0.5mM IPTG誘發蛋白質表現。在隔夜之後收集細胞且藉由將總溶胞物裝載於SDS-PAGE上來檢驗表現量。載入wtMIC-1作為陽性對照。
圖3：a)比較用12聚體-(4+2+_)、-(4+4+_)及-(4+3+_)起始之MIC-1化合物間之表現量。應注意，帶有12聚體-(4+3_)之組及由圓點指示之構築體在MIC-1主鏈中含有M57L。b)延伸之12聚體對表現量之影響。
另外，3.6組中之最低數據點係含有M57L之MIC-1化合物。在此圖中，「1.6末尾」表示TSTEEG，「2.6」表示TSESAT，「3.6」表示TSTEPS且「4.6」表示SEPATS。
圖4：帶有12聚體-(4+2+_)、12聚體-(4+3+_)+M57L、12聚體-(三個重複序列)及12聚體-(四個重複序列)之代表的SDS-PAGE。T：總蛋白質，S：可溶性溶離份，P：細胞集結粒(包涵體)。
圖5：有順次序突變之MIC-1化合物的溶解度。在此圖中，主鏈係MIC-1 △(1-3)。
本發明係關於一種MIC-1化合物，其包含MIC-1多肽。在
一個態樣中，本發明係關於一種MIC-1化合物，其包含MIC-1多肽及N端胺基酸延伸部分，其中該延伸部分由3至200個胺基酸殘基組成且其中該化合物之計算的pI低於6.5。
MIC-1
如本文所用，術語「MIC-1」意謂巨噬細胞抑制性細胞介素-1(MIC-1)，亦稱為生長分化因子15(GDF-15)、胎盤骨形態生成蛋白(PLAB)及非類固醇消炎藥活化基因(NAG-1)。MIC-1合成為62kDa細胞內同源二聚體前驅蛋白，其隨後藉由弗林蛋白酶樣蛋白酶裂解成24.5kDa同源二聚體。全長野生型人類MIC-1蛋白之序列可以寄存編號Q99988自UNIPROT資料庫獲得。308胺基酸前驅序列包括信號肽(胺基酸1-29)、前肽(胺基酸30-196)及MIC-1單體序列(胺基酸197-308)。本文中包括為SEQ ID NO：1之112胺基酸MIC-1單體序列。MIC-1單體含有九個半胱胺酸殘基，其使得形成4個鏈內二硫鍵及一個鏈間二硫鍵以產生共價連接之24.5kDa同源二聚體。已描述與MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)中之H6D對應的天然產生之突變。
如本文所用，術語「MIC-1化合物(MIC-1 compound)」係指包含MIC-1多肽及N端胺基酸延伸部分之化合物。MIC-1化合物典型地呈同源二聚體形式。
如本文所用，術語「MIC-1多肽(MIC-1 polypeptide)」係指SEQ ID NO：1之人類MIC-1單體序列或其類似物。若不另外陳述，則特定MIC-1殘基之數值參考係指112胺基酸單體序列(亦即殘基1係丙胺酸(A1)，且殘基112係異白胺酸(I112))。
如本文所用，術語「MIC-1類似物(MIC-1 analogue)」或「MIC-1之類似物(analogue of MIC-1)」係指MIC-1多肽，其係SEQ ID NO：1之單體MIC-1序列之胺基酸變體。換言之，MIC-1類似物係MIC-1多肽，其中與人類MIC-1(SEQ ID NO：1)相比時多個胺基酸殘基已發生變化。此等變化可獨立地代表一或多個胺基酸取代、添加及/或缺失。
MIC-1類似物可參考變化之胺基酸殘基、胺基酸殘基編號(亦即MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)中之對應位置)及變化(例如胺基酸殘基變化)加以描述。
在一個態樣中，MIC-1類似物係SEQ ID NO：1之MIC-1之功能變體。在本發明之一個態樣中，MIC-1類似物展示與SEQ ID NO：1之MIC-1具有至少85%、90%或95%之序列一致性。作為測定兩種類似物之間的序列一致性之方法的實例，比對SEQ ID NO：1之兩個肽H6D MIC-1及MIC-1。H6D MIC-1類似物相對於SEQ ID NO：1之MIC-1的序列一致性藉由減除不同殘基數目得到之經比對一致的殘基數目除以SEQ ID NO：1之MIC-1中殘基之總數而得到。因此，在該實例中序列一致性百分比為(112-1)/112×100。在MIC-1類似物之序列一致性之測定中，不包括N端胺基酸延伸部分。
在本發明之另一態樣中，相對於SEQ ID NO：1之人類MIC-1，MIC-1類似物包含例如少於15、10或5個胺基酸修飾(取代、缺失、添加(包括插入)及其任何組合)。本申請案中通篇所用之術語「胺基酸修飾(amino acid modification)」以與單體MIC-1(SEQ ID NO：1)相比發生胺基酸修飾之含義用。此修飾可由肽之胺基酸之缺失、胺基酸之添加、用另一胺基酸或共價連接於胺基酸的取代基取代一個胺基酸。
取代：在一個態樣中，胺基酸可經保守取代來取代。如本文所用，術語「保守取代(conservative substitution)」指示一或多個胺基酸經另一生物類似殘基置換。實例包括用類似特徵取代胺基酸殘基，該等類似特徵係例如較小胺基酸、酸性胺基酸、極性胺基酸、鹼性胺基酸、疏水性胺基酸及芳族胺基酸。
在一個態樣中，胺基酸可藉經非保守取代來取代。如本文所用，術語「非保守取代(non-conservative substitution)」表示一或多個胺基酸經具有不同特徵之另一胺基酸置換。實例包括用酸性胺基酸殘基取代鹼性胺基酸殘基、用芳族胺基酸殘基取代極性胺基酸殘基等。在一個態樣中，非保守取代係將編碼胺基酸取代成具有不同特徵之另一編碼胺基酸。在一個態樣中，MIC-1類似物可包含將一或多個非天然及/或非胺基酸(例如胺基酸模擬物)取代至MIC-1之序列中。
人類MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)之3位的天冬醯胺殘基(N3)化學上不穩定。在本發明之一個態樣中，與單體MIC-1序列(SEQ ID NO：1)之3位對應之位置的天冬醯胺可取代成絲胺酸(N3S)、麩胺酸(N3E)、丙胺酸(N3A)或麩醯胺酸(N3Q)。在本發明之一個態樣中，與人類MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)之3位對應之位置的天冬醯胺已取代成麩胺酸(N3E)。
在本發明之一個態樣中，與人類MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)之2位對應之位置的精胺酸已取代成丙胺酸(R2A)，且與人類MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)之3位對應之位置的天冬醯胺已取代成麩胺酸(N3E)。
缺失及截短：在一個態樣中，本發明之MIC-1類似物可有一或多個胺基酸殘基自MIC-1(SEQ ID NO：1)之胺基酸序列缺失，其係單獨的或與一或多個插入或取代組合。
具有胺基酸缺失之MIC-1類似物可由「消(des)」、提及缺失之胺基酸殘基且之後係缺失之胺基酸的編碼(亦即單體MIC-1(SEQ ID NO：1)中之對應位置)來描述。在本發明之一些具體實例中，與人類單體MIC-1(SEQ ID NO：1)之3位對應之位置的天冬醯胺缺失(MIC-1消-N3，SEQ ID NO：2)。
截短N或C末端之一或多個胺基酸殘基之MIC-1類似物可由「MIC-1-△」及提及缺失之胺基酸殘基的編號(亦即單體MIC-1(SEQ ID NO：1)中之對應位置)來描述。在本發明之一些具體實例中，N末端之前三個殘基(A1、R2、N3)缺失(MIC-1-△1-3，SEQ ID NO：3)。
插入：在一個態樣中，本發明之MIC-1類似物可有一或多個胺基酸殘基插入至人類MIC-1之胺基酸序列中，其係單獨的或與一或多個缺失及/或取代組合。
在一個態樣中，本發明之MIC-1類似物可包括一或多個非天然胺基酸及/或非胺基酸插入至MIC-1之序列中。
如本文所使用，術語「蛋白質(protein)」或「多肽(polypeptide)」係指包含一系列藉由醯胺(或肽)鍵互連之胺基酸的化合物。
胺基酸為含有胺基及羧酸基及視情況存在的一或多個通常稱為側鏈之額外基團的分子。
術語「胺基酸(amino acid)」包括編碼(或蛋白型或天然)胺基酸(在彼等中20個標準胺基酸)以及未編碼(或非蛋白型或非天然)胺基酸。編碼胺基酸係天然併入蛋白質中之胺基酸。標準胺基酸係藉由基因密碼編碼之胺基酸。非編碼胺基酸在蛋白質中未發現，或不藉由標準細胞機制產生(例如其可已經受轉譯後修飾)。在下文中，未陳述光學異構體之MIC-1蛋白質之所有胺基酸應理解為意謂L-異構體(除非另外說明)。
如自以上實例顯而易見，可藉由胺基酸殘基之全稱、其單字碼及/或其三字碼鑑別胺基酸殘基。此三種方式完全等效。為讀者方便起見，下文提供單及三字母胺基酸代碼：
甘胺酸：G及Gly；脯胺酸：P及Pro；丙胺酸：A及Ala；纈胺酸：V及Val；白胺酸：L及Leu；異白胺酸：I及Ile；甲硫胺酸：M及Met；半胱胺酸：C及Cys；苯丙胺酸：F及Phe；酪胺酸：Y及Tyr；色胺酸：W及Trp；組胺酸：H及His；離胺酸：K及Lys；精胺酸：R及Arg；麩醯胺酸：Q及Gin；天冬醯胺：N及Asn；麩胺酸：E及Glu；天冬胺酸：D及Asp；絲胺酸：S及Ser；及蘇胺酸：T及Thr。
N端胺基酸延伸部分
在本發明之一些具體實例中，MIC-1化合物包含N端胺基酸延伸部分。
如本文所用，術語「N端胺基酸延伸部分(N-terminal amino acid extension)」意謂MIC-1多肽之N端經由醯胺鍵、較佳肽鍵連接至N端胺基酸延伸部分之C端。本文中，術語「N端胺基酸延伸部分(N-terminal amino acid extension)」、「N端延伸部分(N-terminal extension)」及「N延伸部
分(N-extension)」意謂相同物體且可互換使用。在一個具體例中，本發明化合物包含人類MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)，其中胺基酸延伸部分(亦即1位之丙胺酸(A1))經由肽鍵連接於N端。
在本發明之一些具體實例中N端胺基酸延伸部分之長度多達200個胺基酸殘基。在本發明之一特定具體實例中，N端胺基酸延伸部分具有3至36個胺基酸殘基。
在本發明之一個態樣中，N端胺基酸延伸部分中，酸性胺基酸殘基(天冬胺酸及麩胺酸)與鹼性胺基酸殘基(離胺酸、精胺酸及組胺酸)數目相比過剩至少3、4、5或6個。酸性胺基酸殘基「過剩」意謂酸性殘基之數目超過鹼性殘基之數目。酸性胺基酸殘基過剩之定義值如下計算：酸性殘基之數目減去鹼性殘基之數目。
甲硫胺酸係用於原核細胞(例如細菌，例如大腸桿菌)中蛋白質表現之初始胺基酸。在本發明之一些具體實例中，在蛋白質表現期間自蛋白質移除初始甲硫胺酸。因此，初始甲硫胺酸不包括在MIC-1化合物之N延伸部分之序列中。然而，熟習此項技術者已知，編碼初始甲硫胺酸之起始密碼子係蛋白質轉譯起始所需要的且應併入正核苷酸序列前方以無例外地用於蛋白質表現。
同時，可理解，N延伸部分具有初始甲硫胺酸之該等MIC-1化合物亦屬於本發明之範疇。
等電點(pI)
MIC-1化合物之計算的pI定義為化合物之淨計算電荷係零的pH值。隨pH值而變之MIC-1化合物之計算電荷使用表1中所述之胺基
酸殘基之pKa值及由B.Skoog及A.Wichman(Trends in Analytical Chemistry，1986，第5卷，第82-83頁)所述之方法獲得。半胱胺酸(Cys)之側鏈pKa僅包括在具有自由硫氫基之半胱胺酸之電荷計算中。舉例而言，呈同源二聚體之人類wtMIC-1之計算的pI值係8.8。
如本文所述，對呈同源二聚體之MIC-1化合物進行關於MIC-1化合物之pI計算。
在一個態樣中，本發明之MIC-1化合物具有良好的生物物
理學特性。此等特性包括(但不限於)溶解度及/或穩定性。
溶解度
人類野生型MIC-1係疏水性蛋白質，其基於同源二聚體之計算的pI係8.8。因此，野生型MIC-1僅可於中性pH水性緩衝液系統中溶解至約0.5mg/ml。MIC-1之低溶解度明顯妨礙其調配特性及治療用途，因此研發經溶解度工程改造之MIC-1化合物對於MIC-1分子工程改造十分重要。
在一個態樣中，本發明化合物具有相對於SEQ ID NO：1之人類MIC-1改良之溶解度(亦即可溶性更高)。
如本文所述，如實施例4中所述量測溶解度。
在某些具體實例中，本發明之MIC-1化合物在Tris緩衝液中在pH 8.0下之溶解度係至少1mg/ml。在其他具體實例中，本發明化合物在Tris緩衝液中在pH 8.0下之溶解度係至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少30mg/ml、或至少40mg/ml。
如本文所述，量測呈同源二聚體之MIC-1化合物之溶解度。
穩定性
人類野生型MIC-1序列係化學不穩定的且胺基酸序列之若干殘基可在儲存期間進行修飾，包括3位之天冬醯胺(N3)之去醯胺化及甲硫胺酸M43、M57及M86之氧化。某些殘基之化學不穩定性可影響醫藥特性，因此研發化學穩定之MIC-1化合物將係製造MIC-1治療性化合物之另一重要部分。
在一個態樣中，本發明之化合物具有相對於人類SEQ ID NO：
1之MIC-1改良之化學穩定性。
術語「化學穩定性(chemical stability)」係指導致形成相比於完整多肽潛在地具有降低之生物活性、減小之溶解度及/或增加之免疫原性效應之化學降解產物的多肽結構中之化學改變。可藉由在暴露於不同環境條件之後在各種時間點量測化學降解產物之量(例如藉由SEC-HPLC及/或RP-HPLC)來評估化學穩定性。
MIC-1可為化學不穩定的；且胺基酸序列(SEQ ID NO：1)之若干殘基可在儲存期間進行修飾，包括N3之去醯胺化及甲硫胺酸M43、M57及M86之氧化。某些殘基之化學不穩定性可影響醫藥特性，如作為治療性化合物之MIC-1之低化學穩定性。
在本發明之某些具體實例中，MIC-1單體序列(SEQ ID NO：1)之某些殘基進行修飾，例如藉由取代以增加MIC-1化合物之化學穩定性。為避免去醯胺化，N3可缺失或經其他胺基酸(例如E或Q)取代。為減少氧化，甲硫胺酸可經其他胺基酸(例如E或L)取代。
結晶
在一個態樣中，本發明化合物展示與SEQ ID NO：1之MIC-1相比在pH 8.0下減小之晶體形成趨勢。
免疫原性
在一個態樣中，本發明化合物具有低免疫原性風險。
試管內活性
在一個態樣中，相對於人類MIC-1(SEQ ID NO：1)，本發明化合物仍保持MIC-1受體效力。可在用人類MIC-1受體(hGFRAL，GDNF
家族受體α樣)及其信號傳導輔受體hRET51(原癌基因酪胺酸蛋白質激酶受體Ret同功異型物51)轉染之哺乳動物細胞中量測受體效力及功效。如實施例6中所述，受體複合物之MIC-1化合物活化藉由細胞外信號調節之激酶(ERK)之磷酸化來量測。
如本文所述，量測呈同源二聚體之MIC-1化合物之受體效力及功效。
活體內生物活性
在一個態樣中，本發明化合物在活體內有效，其可如此項技術中已知以任何適合之動物模型來測定。
非肥胖型史泊格多利大鼠(Sprague Dawley rat)為適合動物模型之一個實例，且食物攝入變化可在此等大鼠中活體內測定，例如如實施例7中所描述。在一個態樣中，在非肥胖型史泊格多利大鼠中本發明化合物抑制活體內食物攝入。膳食誘導之肥胖型(DIO)史泊格多利大鼠係適合動物模型之另一實例，且可在此類大鼠中活體內測定食物攝入變化，在一個態樣中，在DIO史泊格多利大鼠中，本發明化合物活體內抑制食物攝入且減輕體重。
產生方法
本發明之MIC-1化合物可藉助於熟習此項技術者已知之重組蛋白技術產生。一般而言，編碼相關蛋白質或其功能變異體之核酸序列經修飾以編碼所需MIC-1化合物。此經修飾之序列接著插入至表現載體中，其又轉型或轉染成表現宿主細胞。
編碼MIC-1化合物之核酸構築體可適當地為基因組、cDNA
或合成來源。藉由用熟知技術修飾基因密碼來實現胺基酸序列改變。
編碼MIC-1化合物之DNA序列通常插入至重組載體中，該載體可為任何載體，其可適宜地經受重組DNA程序，且載體之選擇將通常視其欲引入之宿主細胞而定。因此，載體可為自主複製載體，亦即以染色體外實體形式存在之載體，載體之複製獨立於染色體複製，例如質體。或者，載體可為當引入至宿主細胞中時整合至宿主細胞基因組中且連同其已整合之染色體進行複製之載體。
載體較佳係其中編碼MIC-1化合物之DNA序列可操作地連接於DNA轉錄所需之額外區段的表現載體。術語「可操作地連接(operably linked)」指示區段經排列以使得其共同為了其預期目的起作用，例如在啟動子中起始轉錄且經由編碼多肽之DNA序列進行直至其在終止子內終止。
因此，用於表現MIC-1化合物之表現載體將包含能夠起始且導引選殖基因或cDNA轉錄之啟動子。啟動子可為任何DNA序列，其於所選宿主細胞中展示轉錄活性且可衍生自編碼與宿主細胞同源或異源之蛋白質之基因。
另外，用於表現MIC-1化合物之表現載體將亦包含終止序列，一種經宿主細胞認識以終止轉錄之序列。終止序列可操作地連接於編碼多肽之核酸序列之3'端。在所選宿主細胞中具有功能之任何終止子均可用於本發明中。
MIC-1化合物之表現可針對在宿主細胞之細胞溶質中的細胞內表現或導引至分泌路徑中以便細胞外表現至生長培養基中。
細胞內表現係預設路徑且需要具有包含啟動子之DNA序
列，隨後編碼MIC-1化合物之DNA序列，隨後終止子之表現載體。
為了將MIC-1化合物導引至宿主細胞之分泌路徑中，需要分泌信號序列(亦稱為信號肽或前序列)作為MIC-1序列之延伸部分。編碼信號肽之DNA序列在正確閱讀框架中接合至編碼MIC-1化合物之DNA序列之5'端。信號肽可通常與蛋白質相關或可來自編碼另一分泌蛋白之基因。
熟習此項技術者已熟知用以分別接合編碼MIC-1化合物之DNA序列、啟動子、終止子及/或分泌信號序列及將其插入至含有複製所必須之資訊的適合載體中之程序(參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York,1989)。
引入編碼MIC-1化合物之DNA序列的宿主細胞可為能夠細胞內或細胞外表現MIC-1化合物之任何細胞。MIC-1化合物可藉由在允許表現MIC-1化合物之條件下在適合培養基中培養含有編碼MIC-1化合物之DNA序列且能夠表現MIC-1化合物的宿主細胞來製造。適用於表現MIC-1化合物之宿主細胞之非限制性實例係：大腸桿菌(Escherichia coli)、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及人胚腎(human embryonic kidney，HEK)、幼倉鼠腎(Baby Hamster Kidney，BHK)或中國倉鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)細胞系。若需要轉譯後修飾，則適合宿主細胞包括酵母、真菌、昆蟲及高等真核細胞(諸如哺乳動物細胞)。
在MIC-1化合物已經在宿主生物體中表現後，其可藉由習知技術回收且純化至所需品質。此等習知回收及純化技術之非限制性實例為離心、溶解、過濾、沈澱、離子交換層析、固定金屬親和層析(immobilized
metal affinity chromatography；IMAC)、逆相-高效液相層析(RP-HPLC)、凝膠過濾及冷凍乾燥。
MIC-1蛋白質之重組表現及純化之實例可見於例如Cordingley等人，J.Virol.1989,63，第5037-5045頁；Birch等人，Protein Expr Purif.,1995,6，第609-618頁及WO2008/043847中。
MIC-1蛋白質之微生物表現及純化之實例可見於例如Chich等人，Anal.Biochem,1995,224，第245-249頁及Xin等人，Protein Expr.Purif.2002,24，第530-538頁。
在實驗部分中包括製備多種本發明化合物之方法的特定實施例。
投藥模式
除非另外指示或上下文明顯矛盾，否則術語「治療(treatment)」意欲包括預防與最小化所提及之疾病、病症或病狀(亦即「治療」係指預防性與及治療性投予本發明化合物或包含本發明化合物之組成物)。
投藥途徑可為將本發明化合物有效輸送至身體中之所需或適當位置的任何途徑，諸如非經腸，例如皮下、肌肉內或靜脈內。或者，可經口、經肺、經直腸、經皮、經頰、舌下或經鼻投予本發明之化合物。
待投予之本發明化合物之量、多久投予本發明化合物之確定及投予何種本發明化合物(視情況與另一醫藥活性劑一起)之選擇與熟悉肥胖症及相關病症之治療的醫師協商決定。
醫藥組成物
包含本發明化合物或其醫藥學上可接受之鹽、醯胺或酯及醫藥學上可接受之賦形劑之醫藥組成物可如此項技術中已知來製備。
術語「賦形劑(excipient)」大體上指除活性治療成分以外的任何組分。賦形劑可為惰性物質、非活性物質及/或非醫藥活性物質。
賦形劑可用於各種目的，例如作為載劑、媒劑、稀釋劑、錠劑助劑及/或用以改良活性物質之投予及/或吸收。
用不同賦形劑調配醫藥活性成分在此項技術中已知，參見例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(例如第19版(1995)，及後來的版本)。
組合治療
用根據本發明之化合物進行之治療亦可與一或多種藥理活性物質(例如選自減肥醫藥品、食慾調節劑及用於治療及/或預防由肥胖症引起或與肥胖症相關之併發症及病症的醫藥品)組合。
醫藥適應症
在一個態樣中，本發明係關於用作醫藥品之本發明化合物。
在特定具體實例中，本發明化合物可用在特定具體實例中，本發明化合物可用於以下醫學治療：
(i)例如藉由減少食物攝入、減輕體重、抑制食慾及誘導飽腹感來預防及/或治療飲食障礙，諸如肥胖症。
(ii)預防及/或治療高血糖症、抗胰島素症及/或葡萄糖耐受性異常。
(iii)預防及/或治療血脂異常。
在一些具體實例中，本發明係關於一種體重管理之方法。在
一些具體實例中，本發明係關於一種降低食慾之方法。在一些具體實例中，本發明係關於一種減少食物攝入之方法。
一般而言，患有肥胖症之所有個體亦視為遭受超重。在一些具體實例中，本發明係關於一種治療或預防肥胖症之方法。在一些具體實例中，本發明係關於本發明之MIC-1化合物用於治療或預防肥胖症之用途。在一些具體實例中，患有肥胖症之個體係人類，諸如成人或孩童(包括嬰兒、兒童及青少年)。身體質量指數(BMI)係基於高度及體重之體脂肪之量度。計算公式係BMI=體重(以公斤計)/身高(以平方公尺計)。患有肥胖症之人類個體之BMI可為30；此個體亦可稱為肥胖。在一些具體實例中，罹患肥胖症之人類個體之BMI可為35或BMI在30至<40之範圍內。在一些具體實例中，肥胖症係重度肥胖症或病態肥胖症，其中人類個體之BMI可為40。
在一些具體實例中，本發明係關於一種治療或預防超重(視情況在至少一種重量相關之共生病症存在下)之方法。在一些具體實例中，本發明係關於本發明之MIC-1化合物用於治療或預防超重(視情況在至少一種體重相關之共生病症存在下)之用途。
在一些具體實例中，患有超重之個體為人類，諸如成人或孩童(包括嬰兒、兒童及青少年)。在一些具體實例中，患有超重之人類個體之BMI可為25，諸如BMI27。在一些具體實例中，患有超重之人類個體之BMI在25至<30之範圍內或在27至<30之範圍。在一些具體實例中，體重相關之共生病症選自由以下組成之群：高血壓、糖尿病(諸如2型糖尿病)、血脂異常、高膽固醇及阻塞型睡眠呼吸暫停(obstructive sleep apnoea)。
在一些具體實例中，本發明係關於一種減輕體重之方法。在一些具體實例中，本發明係關於本發明之MIC-1化合物用於減輕體重之用途。根據本發明待經受體重減輕之人類之BMI可為25，諸如BMI27或BMI30。在一些具體實例中，根據本發明待經受體重減輕之人類之BMI可為35或BMI40。術語「體重減輕」可包括治療或預防肥胖症及/或超重。
在一些具體實例中，本發明係關於一種治療或預防如動脈硬化之心血管病及諸如脂肪性肝炎及糖尿病性腎病之其他病症的方法。
本文所用之冠詞“一(a及an)”係指所述冠詞之一個或超過一個(即至少一個)文法賓語。舉例而言，「MIC-1多肽」意謂一種MIC-1多肽或超過一種MIC-1多肽。
特定具體實例
本發明藉由本發明之以下非限制性具體實例進一步加以描述：
1.一種MIC-1化合物，其包含MIC-1多肽及N端胺基酸延伸部分，其中該延伸部分由3至200個胺基酸殘基組成且其中該化合物之計算的pI低於6.5。
2.如具體實例1之化合物，其中該MIC-1多肽及該胺基酸延伸部分由109-312、112-312、115-312、112-148或115-148個胺基酸殘基組成。
3.如具體實例1之之化合物，其中該化合物係同源二聚體。
4.如具體實例1之化合物，其中該呈同源二聚體之化合物由218-296、224-296、230-296、218-310、224-310、230-310、218-360、224-360、230-360、
218-624、224-624、230-296或230-296個胺基酸殘基組成。
5.由MIC-1多肽與N端胺基酸延伸部分組成之化合物，其中該延伸部分由3至200個胺基酸殘基組成且其中該化合物之計算的pI低於6.5。
6.如具體實例1至5之化合物，其中該計算的pI低於6.1。
7.如具體實例1至5之化合物，其中該計算的pI低於6.0。
8.如具體實例1至5中任一項之化合物，其中該計算的pI低於6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3、或5.2、5.1、或5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1或4.0。
9.如具體實例1至7中任一項之化合物，其中該計算的pI高於4.7。
10.如具體實例1至7中任一項之化合物，其中該計算的pI高於4.8。
11.如具體實例1至7中任一項之化合物，其中該計算的pI高於4.9。
12.如具體實例1至7中任一項之化合物，其中該計算的pI高於5.0。
13.如具體實例1至7中任一項之化合物，其中該計算的pI高於5.1。
14.如具體實例1至5中任一項之化合物，其中該計算的pI在6.5-3.0、6.5-3.5、6.5-4.0、6.1-3.0、6.1-3.5、6.1-4.0、6.1-4.7、6.1-4.9、6.1-5.0、6.1-5.1、6.0-3.0、6.0-3.5、6.0-4.0、5.9-3.0、5.9-3.5、5.9-4.0、5.9-5.0、5.9-5.1、5.8-3.0、5.8-3.5、5.8-4.0、5.8-5.1、5.8-5.2、5.5-3.0、5.5-3.5、5.5-4.0或5.0-4.0之範圍內。
15.如具體實例1至14中任一項之化合物，其中該計算的pI在5.8至5.2之範圍內。
16.根據前述具體實例中任一項之化合物，其中該延伸部分之長度在3-100、3-50、3-40、3-30、5-100、5-50、5-40、5-30、10-100、10-50、10-40、
10-30、3-36、3-30、3-25、3-24、3-12、4-36、4-30、4-24、4-12、5-36、5-30、5-24、5-12、6-36、6-30、6-24、6-12、7-36、7-30、7-24、7-12、8-36、8-30、8-24、8-12、30-36、32-36、30-34或30-32個胺基酸殘疾之範圍內。
17.根據前述具體實例中任一項之化合物，其中該延伸部分之長度係3至36個胺基酸。
18.如前述具體實例中任一項之化合物，其中該延伸部分之長度在30至32個胺基酸殘基之範圍內。
19.如前述具體實例中任一項之化合物，其中該延伸部分中，酸性胺基酸殘基(天冬胺酸或麩胺酸)與鹼性胺基酸殘基(離胺酸、精胺酸或組胺酸)之數目相比過剩至少3、4、5、6、7、8、9或10個。
20.如具體實例1至18中任一項之化合物，其中該延伸部分包含與鹼性胺基酸殘基(離胺酸或精胺酸或組胺酸)之數目相比過剩至少15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%或75%之酸性胺基酸殘基(天冬胺酸或麩胺酸)。
21.如前述具體實例中任一項之化合物，其中該延伸部分包含至少15%酸性胺基酸殘基。
22.如具體實例21之化合物，其中該延伸部分包含至少25%酸性胺基酸殘基。
23.如前述具體實例中任一項之化合物，其中該延伸部分由選自由以下組成之群的胺基酸殘基構成：A、E、G、P、S、T、D、N及Q，其中該延伸部分包含至少三個E及/或D胺基酸殘基。
24.如前述具體實例中任一項之化合物，其中該延伸部分由選自由以下
組成之群的胺基酸殘基構成：A、E、G、P、S、T、Q及D，其中該延伸部分包含至少三個E及/或D胺基酸殘基。
25.如具體實例23或24之化合物，其中該延伸部分包含至少三個E及至少一個P。
26.如具體實例25之化合物，其中該延伸部分進一步包含S、G、T及A。
27.如具體實例26之化合物，其中該延伸部分包含6個Ser、4個Pro、4個Gly、4個Thr、4個Glu及2個Ala。
28.如具體實例27之化合物，其中該延伸部分包含兩個選自由以下組成之群的序列：SPAGSPTSTEEG、TSESATPESGPG、TSTEPSEGSAPG及SEPATSGSETPG。
29.如具體實例28之化合物，其中該延伸部分進一步包含6至8個SPAGSPTSTEEG、TSESATPESGPG、TSTEPSEGSAPG或SEPATSGSETPG之連續胺基酸，諸如前6至8個胺基酸殘基，後6至8個殘基或內部6至8個殘基。
30.如具體實例23至29中任一項之化合物，其中該延伸部分以S開始。
31.如具體實例30中任一項之化合物，其中該延伸部分以SE開始。
32.如具體實例31中任一項之化合物，其中該延伸部分以SEP開始。
33.如具體實例1至24中任一項之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：SPAGSP(SEQ ID NO：4)、TSESAT(SEQ ID NO：5)、TSTEPE(SEQ ID NO：6)、SEPATS(SEQ ID NO：7)、TSTEEG(SEQ ID NO：8)、PESGPG(SEQ ID NO：9)、SGSAPG(SEQ ID NO：10)、GSETPG(SEQ ID
NO：11)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：12)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：13)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：14)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP(SEQ ID NO：15)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP(SEQ ID NO：16)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP(SEQ ID NO：17)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT(SEQ ID NO：18)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT(SEQ ID NO：19)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT(SEQ ID NO：20)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE(SEQ ID NO：21)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE(SEQ ID NO：22)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE(SEQ ID NO：23)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS(SEQ ID NO：24)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS(SEQ ID NO：25)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS(SEQ ID NO：26)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG(SEQ ID NO：27)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG(SEQ ID NO：28)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG(SEQ ID NO：29)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG(SEQ ID NO：30)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG(SEQ ID NO：31)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG(SEQ ID NO：32)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG(SEQ ID NO：33)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG(SEQ ID NO：34)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG(SEQ ID NO：35)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG(SEQ ID NO：36)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG(SEQ ID NO：37)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG(SEQ ID NO：38)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(SEQ ID NO：70)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：71)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：39)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：40)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：41)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：42)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：43)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：44)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO：45)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：46)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：47)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：48)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO：49)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：50)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：51)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：52)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO：53)、GEPS
(SEQ ID NO：118)、GPSE(SEQ ID NO：119)、GPES(SEQ ID NO：120)、GSPE(SEQ ID NO：121)、GSEP(SEQ ID NO：122)、GEPQ(SEQ ID NO：123)、GEQP(SEQ ID NO：124)、GPEQ(SEQ ID NO：125)、GPQE(SEQ ID NO：126)、GQEP(SEQ ID NO：127)或GQPE(SEQ ID NO：128)、PEDEETPEQE(SEQ ID NO：129)、PDEGTEEETE(SEQ ID NO：130)、PAAEEEDDPD(SEQ ID NO：131)、AEPDEDPQSED(SEQ ID NO：132)、AEPDEDPQSE(SEQ ID NO：133)、AEPEEQEED(SEQ ID NO：134)、AEPEEQEE(SEQ ID NO：135)、GGGS(SEQ ID NO：136)、GSGS(SEQ ID NO：137)、GGSS(SEQ ID NO：138)及SSSG(SEQ ID NO：139)。
34.如具體實例1至24中任一項之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：SPAGSP、TSESAT、TSTEPE、SEPATS、TSTEEG、PESGPG、SGSAPG、GSETPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG、GEPQ、GEPS、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
35.如具體實例1至24中任一項之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之任何2至6者之任何組合：SPAGSP、TSESAT、TSTEPE、SEPATS、TSTEEG、PESGPG、SGSAPG、GSETPG、GEPQ、GEPS、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
36.如具體實例1至24中任一項之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
37.如具體實例36之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之2至9者之任何組合：GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
38.如具體實例1至24中任一項之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
39.如具體實例38之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之2至9者之任何組合：GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
40.如具體實例39之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：GEPSGEPSGEPSGEPSGEPS(SEQ ID NO：140)、GPSEGPSEGPSEGPSEGPSE(SEQ ID NO：141)、GPESGPESGPESGPESGPES(SEQ ID NO：142)、GSPEGSPEGSPEGSPEGSPE(SEQ ID NO：143)及GSEPGSEPGSEPGSEPGSEP(SEQ ID NO：144)。
41.如具體實例1至24中任一項之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
42.如具體實例41之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之2至9者之任何組合：GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
43.如具體實例42之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：GEPQGEPQGEPQGEPQGEPQ(SEQ ID NO：145)、GEQPGEQPGEQPGEQPGEQP(SEQ ID NO：146)、GPEQGPEQGPEQGPEQGPEQ(SEQ ID NO：147)、GPQEGPQEGPQEGPQEGPQE(SEQ ID NO：148)、GQEPGQEPGQEPGQEPGQEP(SEQ ID NO：149)及GQPEGQPEGQPEGQPEGQPE(SEQ ID NO：150)。
44.如具體實例1至24中任一項之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：PEDEETPEQE、PDEGTEEETE、PAAEEEDDPD、
AEPDEDPQSED、AEPDEDPQSE、AEPEEQEED及AEPEEQEE、GGGS、GSGS、GGSS及SSSG。
45.如具體實例1至24中任一項之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之兩者至三者之任何組合：PEDEETPEQE、PDEGTEEETE、PAAEEEDDPD、AEPDEDPQSED、AEPDEDPQSE、AEPEEQEED、AEPEEQEE及AEEAEEAEEAEEAEE。
46.如具體實例1至24中任一項之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：SEQ ID NO：54、SEQ ID NO：55、SEQ ID NO：56、SEQ ID NO：57、SEQ ID NO：58、SEQ ID NO：59、SEQ ID NO：60、SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO：69、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO：72、SEQ ID NO：161、SEQ ID NO：162、SEQ ID NO：181、SEQ ID NO：182、SEQ ID NO：183、SEQ ID NO：184、SEQ ID NO：185、SEQ ID NO：186、SEQ ID NO：187、SEQ ID NO：188、SEQ ID NO：189、SEQ ID NO：190、SEQ ID NO：191、SEQ ID NO：192、SEQ ID NO：193、SEQ ID NO：194及SEQ ID NO：195。
47.如前述具體實例中任一項之化合物，其中該延伸部分在N端包含1至3個丙胺酸胺基酸殘基。
48.如前述具體實例中任一項之化合物，其中該延伸部分在C端包含1個4甘胺酸及絲胺酸胺基酸殘基。
49.如前述具體實例中任一項之化合物，其中該延伸部分在C端包含(Gly-Ser)n或(Ser-Gly)n序列，其中n係1與8之間的整數。
50.如前述具體實例中任一項之化合物，其中該延伸部分在C端包含
GGGS、GSGS、GGSS或SSSG。
51.如前述具體實例中任一項之化合物，其中該MIC-1多肽展示與野生型MIC-1(SEQ ID NO：1)具有至少80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%之序列一致性。
52.如具體實例51之化合物，其中該MIC-1多肽展示與野生型MIC-1(SEQ ID NO：1)具有至少95%之序列一致性。
53.如具體實例1至51中任一項之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽最多具有10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸修飾。
54.如具體實例1至53中任一項之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽具有最多7、6、5、4、3或2個胺基酸修飾。
55.一種化合物，其包含MIC-1多肽，其中該化合物之計算的pI低於6.5。
56.如前述具體實例中任一項之化合物，其中與野生型MIC-1(SEQ ID NO：1)相比，該MIC-1多肽包含以下取代中之一或多者：P11E、H18E、R21E、A30E、M43L、M43E、A47E、R53E、A54E、M57E、M57L、H66E、R67E、L68E、K69E、A75E、A81E、P85E、M86F、M86L、Q90E、T92E、L105E、K107E。
57.如前述具體實例中任一項之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含以下取代中之一或多者：R2S、R2A、N3S、N3E、N3A、N3T、N3P、N3G、N3V、N3H、N3Y或N3Q。
58.如前述具體實例中任一項之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1
相比，該MIC-1多肽包含N3之缺失(消-N3)。
59.如前述具體實例中任一項之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含M57E或M57L取代。
60.如前述具體實例中任一項之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含M86L或M86F取代。
61.如具體實例60之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽進一步包含Q90E或T92E取代。
62.如前述具體實例中任一項之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含H66E取代。
63.如前述具體實例中任一項之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含R67E取代。
64.如前述具體實例中任一項之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含前3、4、5或6個殘基之缺失。
65.如前述具體實例中任一項之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含前3個殘基之缺失。
66.如具體實例1至56中任一項之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：154(M43L/消-N3)之序列。
67.如具體實例1至56中任一項之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：155(M43L/△1-3)之序列。
68.如具體實例1至56中任一項之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：156(M57E/H66E/消-N3)之序列。
69.如具體實例1至56中任一項之化合物，其中該MIC-1多肽具有根
據SEQ ID NO：157(M57L/△1-3)之序列。
70.如具體實例1至56中任一項之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：158(M57L/消-N3)之序列。
71.如具體實例1至56中任一項之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：159之序列(M86L/△1-3)。
72.如具體實例1至56中任一項之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：160(M86L/消-N3)之序列。
73.如具體實例1至56中任一項之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：222(M57L,M86L/消-N3)之序列。
74.如具體實例1至55中任一項之化合物，其中該MIC-1多肽具有根據SEQ ID NO：1之序列。
75.一種MIC-1化合物，其包含MIC-1多肽及N端胺基酸延伸部分，其中該化合物包含根據以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117或164。
76.一種MIC-1化合物，其包含MIC-1多肽及N端胺基酸延伸部分，其中該化合物包含根據以下之胺基酸序列：SEQ ID NO：100、104、106、107、108、109、111、112、113、114、115、116、117或164。
77.如前述具體實例中任一項之化合物，其展示與SEQ ID NO：1之MIC-1相比改良之溶解度。
78.如前述具體實例中任一項之化合物，其展示在Tris緩衝液系統中在pH 8.0下與SEQ ID NO：1之MIC-1相比改良之溶解度。
79.如具體實例1至78中任一項之化合物，其中在Tris緩衝液系統中在pH 8.0下與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該化合物之溶解度改良2倍、5倍、10倍、50倍、高至100倍以上。
80.如具體實例1至79中任一項之化合物，其中在Tris緩衝液系統中在pH 8.0下該化合物之溶解度係0.5、1.0、5.0、10、30或50mg/ml。
81.如具體實例80之化合物，其中在Tris緩衝液系統中在pH 8.0下該化合物之溶解度係30mg/ml。
82.如前述具體實例中任一項之化合物，其中在pH 8.0下與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1化合物展示減小之晶體形成趨勢。
83.如具體實例82之化合物，其中該晶體形成趨勢在Tris緩衝液系統中在pH 8.0下進行量測。
84.如前述具體實例中任一項之化合物，其中該化合物具有低免疫原性風險。
85.如前述具體實例中任一項之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該化合物對於減少食物攝入及/或減輕體重具有改良之活體內功效。
86.根據具體實例1至85中任一項之化合物，其用作醫藥品。
87.如具體實例1至85中任一項之化合物，其用於預防及/或治療代謝病症。
88.如具體實例87之化合物，其用於預防及/或治療代謝病症，其中該代謝病症係肥胖症、2型糖尿病、血脂異常或糖尿病性腎病。
89.如具體實例1至85中任一項之化合物，其用於預防及/或治療飲食障礙，諸如肥胖症。
90.如具體實例89之化合物，其用於藉由減少食物攝入、減輕體重、抑制食慾及/或誘發飽腹感預防及/或治療肥胖症。
91.如具體實例1至85中任一項之化合物，其用於預防及/或治療心血管疾病。
92.如具體實例91之化合物，其用於預防及/或治療血脂異常、動脈硬化、脂肪性肝炎或糖尿病性腎病。
93.一種醫藥組成物，其包含根據具體實例1至85中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽、醯胺或酯，及一或多種醫藥學上可接受之賦形劑。
94.一種如具體實例1至85中任一項之化合物的用途，其用於製造用以預防及/或治療代謝病症之醫藥品，其中該代謝病症係肥胖症、2型糖尿病、血脂異常或糖尿病性腎病。
95.一種如具體實例1至85中任一項之化合物的用途，其用於製造用以預防及/或治療飲食障礙之醫藥品。
96.一種如具體實例1至85中任一項之化合物的用途，其用於製造用以預防及/或治療肥胖症之醫藥品。
97.一種如具體實例1至85中任一項之化合物的用途，其用於製造用以藉由減少食物攝入、減輕體重、抑制食慾及誘發飽腹感而預防及/或治療肥胖症之醫藥品。
98.一種如具體實例1至85中任一項之化合物的用途，其用於製造用以預防及/或治療心血管疾病之醫藥品。
99.一種如具體實例1至85中任一項之化合物的用途，其用於製造用
以預防及/或治療血脂異常、動脈硬化、脂肪性肝炎或糖尿病性腎病之醫藥品。
100.一種治療及/或預防代謝病症之方法，其藉由投予醫藥活性量之如具體實例1至85中任一項之化合物而實現，其中該代謝病症係肥胖症、2型糖尿病、血脂異常或糖尿病性腎病。
101.一種治療及/或預防飲食障礙之方法，其藉由投予醫藥活性量之如具體實例1至85中任一項之化合物而實現。
102.一種治療及/或預防肥胖症之方法，其藉由投予醫藥活性量之如具體實例1至85中任一項之化合物而實現。
103.一種藉由減少食物攝入、減輕體重、抑制食慾及/或誘發飽腹感來治療及/或預防肥胖症之方法，其藉由投予醫藥活性量之如具體實例1至85中任一項之化合物而實現。
104.一種治療及/或預防心血管疾病之方法，其藉由投予醫藥活性量之如具體實例1至85中任一項之化合物而實現。
105.一種治療及/或預防血脂異常、動脈硬化、脂肪性肝炎或糖尿病性腎病之方法，其藉由投予醫藥活性量之如具體實例1至85中任一項之化合物而實現。
106.一種聚核苷酸分子，其編碼如具體實例1至85中任一項之化合物。
實施例
縮寫清單
「主峰(main peak)」係指純化層析圖中具有以毫吸收度單位計之最高UV強度且含有融合蛋白之峰。
HPLC係高效液相層析。
SDS-PAGE係十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳。
IMAC係固定化金屬親和層析。
SEC為尺寸排外層析法。
MS係質譜分析。
在本說明書中，希臘字母可由其符號或對應書面名稱表示，例如：α=alpha；β=beta；ε=epsilon；γ=gamma；δ=delta；ω=omega等。此外，希臘字母μ可由「u」表示，例如在μl=ul或μM=uM中。
MIC-1化合物之設計
在本發明之一態樣中，MIC-1化合物經設計具有增加之溶解度。在本發明之一態樣中，此情況藉由獎N端「酸性」延伸部分添加至MIC-1多肽中來達成。在本發明之一態樣中，藉由修飾MIC-1多肽之胺基酸序列溶解度增加且穩定性改良。舉例而言，將延伸部分添加至MIC-1多肽之N端，及/或在MIC-1多肽之胺基酸序列內實現修飾(順次序突變)。
N延伸部分設計：
在N端胺基酸延伸部分之設計中，排除F、I、L、M、V、W及Y，因為其可造成蛋白質聚集。亦排除H、K及R，因為其可導致不合需要之結合於細胞膜上。對於N延伸部分序列，A、E、G、P、S、T、D、N及Q較佳。E及D尤其較佳，因為其藉由降低化合物之pI值會增加溶解度。特定言之，當MIC-1化合物表現於大腸桿菌中時，對於一些N延伸部分，在極N端添加一個或兩個額外丙胺酸以增加初始甲硫胺酸移除效率。
不同N端胺基酸延伸部分基於以上原理進行設計。一些N
延伸部分包含源自人類蛋白質之序列(人類化序列)；一些包含人工設計之序列(例如GS、SG、AEE、AES、GEPQ(SEQ ID NO：123)、GEPS(SEQ ID NO：118))；一些包含人類化序列或人工序列之若干重複序列；一些包含以上之組合。設計若干6殘基序列(6聚體)。N延伸部分可包含6聚體、6聚體之一部分(例如6聚體之1至5個殘基)或以上之組合中之一或多者。人工序列之胺基酸殘基(包括6聚體)及人類化序列可以任何次序排列。
一些代表性6聚體及6聚體之組合列於表2中：
順次序突變：
MIC-1(SEQ ID NO：1)之某些內部殘基經例如取代修飾。舉
例而言，為增加MIC-1化合物之溶解度，MIC-1之疏水性殘基可經親水性殘基、較佳經酸性殘基取代；帶正電荷殘基可經酸性殘基等取代。為減少氧化，甲硫胺酸可經其他胺基酸(例如E、F或L)取代。
用於增加溶解度之順次序突變包括(但不限於)：P11E、H18E、R21E、A30E、A47E、R53E、A54E、M57E、R67E、L68E、K69E、A75E、A81E、P85E、L105E及K107E。
用於減少氧化之順次序突變包括(但不限於)：M43L、M57E、M57L、M86F及M86L。
用於增加化學穩定性之順次序突變包括(但不限於)：R2S、R2A、N3S、N3E、N3A、N3T、N3P、N3G、N3V、N3H、N3Y及N3Q。
MIC-1化合物之pI計算
MIC-1化合物之計算的pI定義為化合物之淨計算電荷係零的pH值。隨pH值而變之MIC-1化合物之計算電荷使用表1中所述之胺基酸殘基之pKa值及由B.Skoog及A.Wichman(Trends in Analytical Chemistry，1986，第5卷，第82-83頁)所述之方法獲得。半胱胺酸(Cys)之側鏈pKa僅包括在具有自由硫氫基之半胱胺酸之電荷計算中。舉例而言，呈同源二聚體之人類wtMIC-1之計算的pI值係8.8。
在本文中且在整個文檔中，若未另外陳述，則對於呈同源二聚體之MIC-1化合物實施MIC-1化合物之pI計算。
材料及方法
一般製備方法
實施例1：MIC-1化合物之表現及醱酵
將MIC-1化合物之cDNA次選殖至pET11b衍生載體中。當細胞密度達到OD600 1.0時，在大腸桿菌中藉由0.5mM異丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導呈包涵體之MIC-1化合物之過度表現。在37℃下於TB中連續生長20h之後，收集細胞且製備用於LC/MS及UPLC之樣品以確定分子量。
在作為補充劑之限定化學成分培養基中經分批進料方法進行醱酵。醱酵收率主要視不同化合物而定，化合物間之醱酵收率在1g/L至
8g/L間變化。
實施例2：純化及再摺疊：
MIC-1化合物如下進一步純化：
將大腸桿菌於10mM Tris緩衝液(pH 8.0)中之漿料(20% w/v)超聲處理(3秒開/關間隔，於冰上，維持5分鐘)且MIC-1化合物藉由離心(10,000 x g，維持30分鐘)粒化。包涵體於20mM Tris(pH 8.0)中藉由8M尿素再溶解，且藉由離心(10,000 x g，維持30分鐘)移除殘渣。收集所得清液層中之MIC-1化合物且稀釋至再摺疊緩衝液(50mM Tris，pH 8.5及10% DMF或10% DMSO)中至最終濃度0.1mg/ml。再摺疊方法於冷室中持續48小時。所得溶液藉由0.4μm過濾器過濾且裝載於使用Q Sepharose快速流動樹脂(GE Healthcare)之疏水性相互作用管柱或陰離子交換層析(50mM Tris，pH 8.0，0-500mM NaCl)上，如Protein Purification.Principles and Practice Series：Springer Advanced Texts in Chemistry Scopes,Robert K.第3版，1994(第6章及第8章)中所一般描述。在一些情況下進一步純化藉由尺寸排阻層析使用經50mM Tris(pH 8.0)及200mM NaCl操作之HiLoad 26/60 Superdex pg 75管柱(GE Healthcare)實現。為儲存，將MIC-1化合物轉移至DPBS中且冷凍儲存。
實施例3：本發明之MIC-1化合物之pH依賴性溶解度
此實驗之目的係篩檢具有改良之溶解度的MIC-1化合物，且確定用於調配之最佳pH窗口。
將MIC-1化合物以3mg/ml至10mg/ml之間的濃度範圍溶解於水及乙醇(60%水及40%乙醇)之混合物中。用SpeedVac(Concentrator Plus，Eppendorf)蒸發溶劑6小時，以獲得MIC-1化合物之集結粒。
對於此pH依賴性溶解度曲線分析使用以下緩衝液：乙酸鹽緩衝液(pH 3至pH 6)；Tris緩衝液(pH 7至pH 9)；CAPS緩衝液(pH 10至pH 11)。
將緩衝劑添加MIC-1化合物一起連同至96孔盤之各孔中。使用量可能非完全相同，但所有均靶向12-18mg/ml內之理論濃度。清液層
中MIC-1濃度濃度藉由UPLC(表6)測定。基於該等結果，與wtMIC-1相比，在pH 6至9與之間本發明之MIC-1化合物之溶解度明顯改良。MIC-1化合物之最佳pH窗口屬於對於調配較佳之pH範圍，例如pH 6.5至8.5。
實施例4：在pH 8下MIC-1化合物之最大溶解度
為測試最大溶解度，將MIC-1化合物以3mg/ml至10mg/ml之間的濃度範圍溶解於水及乙醇(60%水及40%乙醇)之混合物中。接著，將溶液(各孔150μL)等分至96孔盤(Corning)中。用SpeedVac(Concentrator Plus，Eppendorf)蒸發溶劑6小時，以獲得MIC-1化合物之集結粒。將Tris緩衝液(pH 8.0，無賦形劑)添加至96孔盤之各孔中。添加至孔中之緩衝液之量少於溶解孔中之整個集結粒所需之量，以使得獲得最大濃度。盤於盤振盪器上在800rpm(MixMate，Eppendorf)下振盪2小時。集結粒在3600g下短暫離心5min。將上清液轉移至深96孔盤中且用40%乙醇稀釋20倍。接著，使所有樣本經受UPLC(Acquity，Waters)、盤讀取器(Infinite M200 pro，Tecan)及UV光譜儀(NanoDrop 8000，Thermo Scientific)以確定濃度(表7)
基於該等結果，在pH 8.0下本發明之MIC-1化合物之溶解度明顯改良。特別言之，具有N延伸部分之MIC-1化合物在pH 8.0下獲得大於30mg/ml之溶解度。
試管內活性篩選之通用方法
實例5：BHK21-hGFRAL-IRES-hRET細胞系之建立
此實例之目的係建立用於測試MIC-1活性之基於細胞之試管內分析。哺乳動物細胞經轉染且穩定表現全長MIC-1受體(hGFRAL)及
其全信號傳導輔受體hRET51。
表現全長hGFRAL及全長hRET51之質體藉由將編碼全長hGFRAL及全長hRET51之合成之DNA核苷酸構築插入至哺乳動物表現載體pEL中。IRES(內部核糖體入口部位)係兩個DNA序列之間的常用連接子，以使得兩個DNA序列可同時轉譯至mRNA中。pEL載體主鏈藉由Taihegene CRO公司提供。
將兩百萬個BHK21細胞接種於10cm皮氏培養皿(petri dish)中且於培養基(DMEM+10% FBS+1% PS)中培養隔夜。細胞用pEL-hGFRAL-IRES-hRET質體轉染。將經轉染細胞以不同密度分離至新穎10cm培養皿中且生長於選擇培養基(DMEM+10% FBS+1% PS+1mg/ml G418)中大於2週，得到單個純系。將單個純系轉移至6孔盤且培養至100%匯合。hGFRAL及hRET之mRNA表現藉由qPCR來量測。獲取成功轉染之純系且針對MIC-1結合測試(圖15及表13)。
實施例6：基於MIC-1細胞之試管內活性分析
wtMIC-1與MIC-1化合物誘導BHK21-hGFRAL-IRES-hRE穩定細胞中ERK1/2之磷酸化(表8)。自結果可推斷出MIC-1、GFRAL及RET之三元複合物使RET蛋白質酪胺酸激酶磷酸化以藉由ERK1/2之磷酸化經由包含ERK/MAPK路徑之信號路徑誘導MIC-1之活體內活性。
使用BHK21-hGFRAL-IRES-hRET篩選MIC-1化合物之結果示於表8中。僅具有N延伸部分之MIC-1化合物或具有順次序突變之MIC-1類似物僅獲得等於或甚至高於wtMIC-1之試管內活性。此外，N延伸部分及順次序突變之組合亦可得到類似活性。
MIC-1之溶解度增加亦可藉由MIC-1多肽與人類血清白蛋白(HSA)之N端融合來達成。已知HSA融合可增加MIC-1之溶解度。測試兩種此類HSA-MIC-1融合蛋白之試管內活性(表9)。
觀察到效力顯著損失，因此表明具有高溶解度之此等MIC-1融合蛋白不保持受體效力。
活體內功效
實施例7：瘦弱史泊格多利大鼠中MIC-1化合物對食物攝入之影響
在9至11週齡之瘦弱雄性史泊格多利大鼠中量測本發明之MIC-1化合物之活體內功效。動物在黑暗時段開始之前1-2小時，每天用8奈莫耳/公斤體重之劑量(對於兩種HSA-MIC-1融合蛋白係4nmol/kg)注射一次。在適當緩衝溶液中皮下投予化合物(1-4ml/kg)。食物攝入之變化藉由自動食物監測系統(對於大鼠係BioDAQ系統及HM2系統)來量測。在BioDAQ系統中，動物單個圈養；且在HM2系統中，動物在每個籠3隻動物下以群組圈養。在n=4-8個動物中測試各化合物。在實驗之前使動物適
應至少7天。所收集之資料表示為自開始各每天12小時黑暗階段至隨後黑暗階段量測之每天食物攝入(24小時食物攝入)。藉由自媒劑組之平均每天食物攝入減去治療組之平均每天食物攝入來計算回應於所投予化合物之食物攝入之每天變化。若使用雙尾司徒頓t測試( )p<0.1，則變化視為顯著。結果表示為與研究時段期間記錄之媒劑(百分比)相比，食物攝入之「最大減少」。資料亦表示為食物攝入之「積累減少」，其呈研究時段期間食物攝入之顯著(p<0.1)每天降低(百分比)之總和的形式。
本發明人出人意料地發現此等MIC-1化合物不僅增加分子溶解度，而且等於或甚至比wtMIC-1更佳之功效(表10)。舉例而言，根據SEQ ID NO：105及SEQ ID NO：106之化合物具有最大及積累活體內功效，該
功效在皮下給藥下大於wtMIC-1 40-50%。功效增加此外與溶解度增加相關，因為與wtMIC-1相比，根據SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：104、SEQ ID NO：105及SEQ ID NO：106之化合物均具有升高的溶解度且活體內功效顯著較大。此相關性似乎並非藉由試管內Emax變化來闡述，因為除根據SEQ ID NO：105之化合物外，相比於wtMIC-1，表10中之所有化合物具有Emax。實際上，化合物SEQ ID NO：105具有與wtMIC-1相比較低的Emax且與wtMIC-1相比仍更活體內有效。此外，在化合物之間試管內效力類似，因為化合物均不具有不同於wtMIC-1之EC50。因此，增加之活體內功效與增加之溶解度之間的相關性出人意料且不可藉由增加之試管內受體活化之變化來簡單闡述。
實施例8：不同12聚體嵌段之MIC-1表現及初始Met移除效率
在人體中，N-甲醯基-甲硫胺酸藉由免疫系統識別為外來物質，或作為由受損細胞釋放報警信號，且刺激身體對抗可能的感染(Pathologic Basis of Veterinary Disease5：Pathologic Basis of Veterinary Disease,By James F.Zachary,M.Donald McGavin)。另外，甲硫胺酸係可容易氧化之不穩定的殘基。因此，N-Met裂解效率對於MIC-1表現極為重要。
存在4種不同類型的12聚體，且其所有均由3個Ser、2個Pro、2個Gly、2個Thr、2個Glu及1個Ala組成。然而，各重複序列中之12個殘基以不同方式排列。
關於不同12聚體對表現量及N-Met裂解效率之影響所知甚少。因此，分別由單個及雙12聚體起始之MIC-1化合物之系統研究非常必要。
將MIC-1化合物之cDNA次選殖至pET11b衍生載體中。當細胞密度達到OD600 1.0時，在大腸桿菌中藉由0.5mM異丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導呈包涵體之MIC-1化合物或可溶性蛋白質之過度表現。在37℃下於TB中連續生長20h之後，收集細胞且於緩衝液A(20mM Tris，pH 8.0)中超聲處理。在10,000g下離心所得混合物20min且藉由LC/MS及SDS-PAGE分析以確定分子量。
在作為補充劑之限定化學成分培養基中經分批進料方法進行醱酵。醱酵收率主要視不同化合物而定，化合物間之醱酵收率在1g/L至8g/L間變化。
經設計用於單個12聚體測試之化合物及結果示於表11及圖1中。
帶有雙12聚體之化合物列於表12中，且亦展示結果(參看表12及圖2)。
總之，以12聚體-1嵌鍛開始之N延伸部分不在大腸桿菌中表現。對於其他12聚體嵌段，蛋白質表現得以實現，但僅作為初始序列之12聚體-4致使甲硫胺酸完全裂解。另外，12聚體-2系列之N-met裂解效率比12聚體-3系列更佳。
實施例9：具有2×或2.5×12聚體N延伸部分之MIC-1肽化合物之表現量及包涵體比率
(1)具有2.5×12聚體N延伸部分之MIC-1化合物之表現
關於蛋白質產生方法，參看實施例8。結果示於表13、圖3及圖4中。
儘管延伸之12聚體(6aa)使24aa位於遠離N端處，但在不同組中MIC-1化合物之表現量大大不同。來自12聚體-1之片段明顯不適用於表現，其與先前結果一致。12聚體-(4+_+3.6)及-(4+_+4.6)之平均表現量比其他相對較高。
(2)具有2×或2.5×12聚體N延伸部分之MIC-1化合物之包涵體比率
對於大規模蛋白質產生，包涵體通常視為良好選擇，主要歸因於其較佳的放大特性，其主要包括：高表現量、簡單回收步驟及高純度、蛋白酶抗性及良好過程穩定性。
MIC-1化合物可表現包涵體或可溶性形式，其主要視化合物之pI及延伸部分長度而定。結果示於表14及圖4中。
有順次序突變之MIC-1化合物之溶解度示於表15及圖5中(主鏈係MIC-1 △(1-3))。
探究以12聚體-(4+2+_)、12聚體-(4+4+_)及12聚體-(4+3+_)起始之MIC-1化合物表現包涵體之能力。展示當pI>5.1時，包涵體比率>90%。另外，有順次序突變M57E/H66E之MIC-1化合物主要表現可溶性溶離份。
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張旭家
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<223> N端延伸部分
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<223> N端延伸部分
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
<223> N端延伸部分
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<212> PRT
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<220>
<223> N端延伸部分
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<212> PRT
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<220>
<223> N端延伸部分
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<212> PRT
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<220>
<223> N端延伸部分
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<212> PRT
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<220>
<223> N端延伸部分
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<212> PRT
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<220>
<223> N端延伸部分
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<212> PRT
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<220>
<223> N端延伸部分
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<212> PRT
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<220>
<223> N端延伸部分
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<220>
<223> N端延伸部分
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<212> PRT
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<220>
<223> N端延伸部分
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
<223> 連接子
<400> 153
<210> 154
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<212> PRT
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<220>
<223> MIC-1多肽
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<220>
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<220>
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<220>
<223> MIC-1多肽
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MIC-1多肽
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<212> PRT
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<220>
<223> MIC-1多肽
<400> 159
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<212> PRT
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<220>
<223> MIC-1多肽
<400> 160
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
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<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 162
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 163
<210> 164
<211> 143
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MIC-1多肽加N端延伸部分
<400> 164
<210> 165
<211> 134
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MIC-1多肽加N端延伸部分
<400> 165
<210> 166
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 166
<210> 167
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 167
<210> 168
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 168
<210> 169
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 169
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<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 170
<210> 171
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 171
<210> 172
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 172
<210> 173
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 173
<210> 174
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N外延伸部分
<400> 174
<210> 175
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 175
<210> 176
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 176
<210> 177
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 177
<210> 178
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 178
<210> 179
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 179
<210> 180
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 180
<210> 181
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 181
<210> 182
<211> 133
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MIC-1多肽加N端延伸部分
<400> 182
<210> 183
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> N端延伸部分
<400> 183
<210> 184
<211> 30
<212> PRT
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<220>
<223> N端延伸部分
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<212> PRT
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<223> N端延伸部分
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<223> N端延伸部分
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<223> N端延伸部分
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<213> 人工序列
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<223> N端延伸部分
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<223> N端延伸部分
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<223> MIC-1多肽加N端延伸部分
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<223> MIC-1多肽加N端延伸部分
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<213> 人工序列
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<223> MIC-1多肽加N端延伸部分
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<223> MIC-1多肽加N端延伸部分
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<223> MIC-1多肽加N端延伸部分
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<223> MIC-1多肽加N端延伸部分
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<223> MIC-1多肽加N端延伸部分
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<223> MIC-1多肽加N端延伸部分
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MIC-1多肽
<400> 222
Claims (20)
- 一種MIC-1化合物，其包含MIC-1多肽及N端胺基酸延伸部分，其中該延伸部分由3至36個胺基酸殘基組成且其中該化合物之計算的pI低於6.5。
- 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該化合物係同源二聚體(homodimer)且由218-296、224-296或230-296個胺基酸殘基組成。
- 如申請專利範圍第1項或第2項之化合物，其中該計算的pI低於6.1。
- 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中該計算的pI高於4.7。
- 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中該計算的pI在5.8-5.2之範圍內。
- 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中該延伸部分之長度在3-36、3-30、3-24、3-12、4-36、4-30、4-24、4-12、5-36、5-30、5-24、5-12、6-36、6-30、6-24、6-12、7-36、7-30、7-24、7-12、8-36、8-30、8-24、8-12、30-36、32-36、30-34或30-32個胺基酸殘基之範圍內。
- 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中該延伸部分之長度在30-32個胺基酸殘基之範圍內。
- 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中在該延伸部分中，酸性胺基酸殘基(天冬胺酸及麩胺酸)與鹼性胺基酸殘基的數目(離胺酸、精胺酸及組胺酸)相比過剩至少3、4、5或6個。
- 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中該延伸部分由選自由以下組成之群的胺基酸殘基構成：A、E、G、P、S、T、Q及D，且其中該延伸部分包含至少三個E及/或D胺基酸殘基。
- 如申請專利範圍第9項之化合物，其中該延伸部分包含6個Ser、4個Pro、4個Gly、4個Thr、4個Glu及2個Ala。
- 如申請專利範圍第10項之化合物，其中該延伸部分以SEP開始。
- 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：SPAGSP(SEQ ID NO：4)、TSESAT(SEQ ID NO：5)、TSTEPE(SEQ ID NO：6)、SEPATS(SEQ ID NO：7)、TSTEEG(SEQ ID NO：8)、PESGPG(SEQ ID NO：9)、SGSAPG(SEQ ID NO：10)、GSETPG(SEQ ID NO：11)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：12)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：13)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：14)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP(SEQ ID NO：15)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP(SEQ ID NO：16)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP(SEQ ID NO：17)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT(SEQ ID NO：18)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT(SEQ ID NO：19)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT(SEQ ID NO：20)、 SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE(SEQ ID NO：21)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE(SEQ ID NO：22)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE(SEQ ID NO：23)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS(SEQ ID NO：24)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS(SEQ ID NO：25)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS(SEQ ID NO：26)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG(SEQ ID NO：27)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG(SEQ ID NO：28)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG(SEQ ID NO：29)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG(SEQ ID NO：30)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG(SEQ ID NO：31)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG(SEQ ID NO：32)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG(SEQ ID NO：33)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG(SEQ ID NO：34)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG(SEQ ID NO：35)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG(SEQ ID NO：36)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG(SEQ ID NO：37)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG(SEQ ID NO：38)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(SEQ ID NO：70)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO：71)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：39)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：40)、 SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：41)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：42)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：43)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：44)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO：45)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：46)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：47)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：48)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO：49)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO：50)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO：51)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO：52)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO：53)、GGGS(SEQ ID NO：136)、GSGS(SEQ ID NO：137)、GGSS(SEQ ID NO：138)及SSSG(SEQ ID NO：139)。
- 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者：GEPS(SEQ ID NO：118)、GPSE(SEQ ID NO：119)、GPES(SEQ ID NO：120)、 GSPE(SEQ ID NO：121)、GSEP(SEQ ID NO：122)、GEPSGEPSGEPSGEPSGEPS(SEQ ID NO：140)、GPSEGPSEGPSEGPSEGPSE(SEQ ID NO：141)、GPESGPESGPESGPESGPES(SEQ ID NO：142)、GSPEGSPEGSPEGSPEGSPE(SEQ ID NO：143)、GSEPGSEPGSEPGSEPGSE(SEQ ID NO：144)、GEPQ(SEQ ID NO：123)、GEQP(SEQ ID NO：124)、GPEQ(SEQ ID NO：125)、GPQE(SEQ ID NO：126)、GQEP(SEQ ID NO：127)、GQPE(SEQ ID NO：128)、GEPQGEPQGEPQGEPQGEPQ(SEQ ID NO：145)、GEQPGEQPGEQPGEQPGEQP(SEQ ID NO：146)、GPEQGPEQGPEQGPEQGPEQ(SEQ ID NO：147)、GPQEGPQEGPQEGPQEGPQE(SEQ ID NO：148)、GQEPGQEPGQEPGQEPGQEP(SEQ ID NO：149)、GQPEGQPEGQPEGQPEGQPE(SEQ ID NO：150)、GGGS(SEQ ID NO：136)、GSGS(SEQ ID NO：137)、GGSS(SEQ ID NO：138)及SSSG(SEQ ID NO：139)。
- 如申請專利範圍第1項至第9項中任一項之化合物，其中該延伸部分包含以下序列中之一或多者： PEDEETPEQE(SEQ ID NO：129)、PDEGTEEETE(SEQ ID NO：130)、PAAEEEDDPD(SEQ ID NO：131)、AEPDEDPQSED(SEQ ID NO：132)、AEPDEDPQSE(SEQ ID NO：133)、AEPEEQEED(SEQ ID NO：134)、AEPEEQEE(SEQ ID NO：135)、AEEAEEAEEAEEAEE(SEQ ID NO：151)、GGGS(SEQ ID NO：136)、GSGS(SEQ ID NO：137)、GGSS(SEQ ID NO：138)及SSSG(SEQ ID NO：139)。
- 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中該MIC-1多肽展示與SEQ ID NO：1之MIC-1至少85%、90%、95%或98%的序列一致性。
- 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含以下取代中之一或多者：N3E、P11E、H18E、R21E、A30E、A47E、R53E、A54E、M57E、M57L、H66E、R67E、L68E、K69E、A75E、A81E、P85E、M86L、Q90E、T92E、L105E及K107E。
- 如前述申請專利範圍中任一項之化合物，其中與SEQ ID NO：1之MIC-1相比，該MIC-1多肽包含前三個殘基(MIC-1-△1-3)之缺失或N3之缺失(消-N3(des-N3))。
- 一種MIC-1化合物，其包含MIC-1多肽及N端胺基酸延伸部分，其中 該化合物包含根據SEQ ID NO：100、104、106、107、108、109、111、112、113、114、115、116、117或164之胺基酸序列。
- 如申請專利範圍第1項至第18項中任一項之化合物，其中該化合物在Tris緩衝液系統中在pH 8.0下之溶解度係0.5、1.0、5.0、10、30或50mg/ml。
- 一種用於預防及/或治療代謝病症之如申請專利範圍第1項至第19項中任一項之化合物，其中該代謝病症係肥胖症、糖尿病、心血管樣血脂異常(cardiovascular like dyslipidaemia)、動脈硬化、脂肪性肝炎或糖尿病性腎病。
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