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CN109414471A - Mic-1化合物及其用途 - Google Patents

Mic-1化合物及其用途 Download PDF

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CN109414471A
CN109414471A CN201780032204.5A CN201780032204A CN109414471A CN 109414471 A CN109414471 A CN 109414471A CN 201780032204 A CN201780032204 A CN 201780032204A CN 109414471 A CN109414471 A CN 109414471A
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Abstract

本发明涉及MIC‑1化合物。更具体地，其涉及包含MIC‑1多肽和N端氨基酸延伸体的化合物，其中所述延伸体由3至36个氨基酸残基组成，并且其中所述化合物具有低于6.5的经计算的pI。本发明的化合物具有MIC‑1活性。本发明还涉及包含这类化合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物以及该化合物的医药用途。

Description

MIC-1化合物及其用途
技术领域
本发明涉及MIC-1化合物及其药物用途。
序列表的援引并入
名称为“序列表(SEQUENCE LISTING)”的序列表为142,554个字节，创建于2017年5月24日，并且通过引用并入本文。
发明背景
基于在活化的巨噬细胞中显示出表达增加的实验，在1997年首次描述了巨噬细胞抑制细胞因子-1(MIC-1)(Bootcov等人,Proc.Natl.Acad.Sci.,1997年10月)。后来其他人鉴定了MIC-1并给出了几个另外的名称，如胎盘转化生长因子β(PTGF-β)、胎盘骨形态发生蛋白、生长分化因子-15(GDF15)、前列腺衍生因子(PDF)、非甾体抗炎药活化基因(NAG-1)和PL74。
MIC-1是TGF-β超家族(参与细胞生长和分化的肽激素家族)的远缘成员。MIC-1以分子量为24.5kDa的富含半胱氨酸的同型二聚体形式循环。最初报告MIC-1在巨噬细胞中被包括IL-1b、TNF-α、IL-2和TGF-b在内的刺激物上调。还显示了MIC-1可减少脂多糖诱导的TNF-α产生，并且基于这些资料提出MIC-1是一种抗炎性细胞因子。
最近，来自晚期癌症患者的数据(Johnen等人,Nat Med.,2007年11月)显示体重减轻与MIC-1的循环水平相关。这些资料表明MIC-1调节体重。该假说在异种移植前列腺肿瘤细胞的小鼠中进行了检验，其中升高的MIC-1水平与体重减轻和食物摄入减少相关，施用针对MIC-1的中和抗体能够逆转该效应。由于给小鼠施用重组MIC-1能够调节下丘脑神经肽Y和阿黑皮素原，因此提出MIC-1通过中枢机制调节食物摄入。此外，超表达MIC-1的转基因小鼠在用正常低脂肪饮食和高脂肪饮食喂养时均获得较低的体重和体脂肪(Macia等人,PLoSOne,2012年4月)。而且，与用类似的饮食喂养的野生型动物相比，分别用低脂肪和高脂肪饮食喂养的超表达MIC-1的转基因小鼠均具有改善的葡萄糖耐量。
肥胖症最常见的原因是单独的过量卡路里摄入，或者过量卡路里摄入加上能量消耗减少和/或缺乏体育锻炼。肥胖症是诸如糖尿病、心血管疾病、睡眠呼吸暂停和癌症等代谢性疾病的公认危险因素。
发明内容
本文描述了包含具有N端氨基酸延伸体的MIC-1多肽的MIC-1化合物。
在一个方面，本发明的MIC-1化合物具有良好的生物物理性质。这些性质包括但不限于溶解性和稳定性。在一个方面，本发明的MIC-1化合物具有改善的溶解性。在一个方面，本发明的MIC-1化合物具有改善的化学稳定性。
在一个方面，本发明化合物具有改善的生物物理稳定性，如通过降低的晶体形成趋势所示。
在一个方面，本发明的MIC-1化合物保持MIC-1受体功效以及降低食物摄入和体重的体内效力。因此，这些MIC-1化合物可用于治疗代谢失调，如肥胖症、糖尿病、诸如血脂异常和动脉硬化等心血管疾病以及诸如脂肪性肝炎和糖尿病肾病等其他病症。
一个方面，本发明的MIC-1化合物包含MIC-1多肽和N端氨基酸延伸体，其中所述延伸体由3至36个氨基酸残基组成，并且其中所述化合物具有低于6.5的经计算的pI。
在本发明的一些实施方案中，所述MIC-1化合物具有低于6.1的经计算的pI。
在本发明的一些实施方案中，所述MIC-1化合物具有高于4.7的经计算的pI。
在本发明的一些实施方案中，所述MIC-1化合物具有高于4.7且低于6.1的经计算的pI。
在本发明的一些实施方案中，所述MIC-1化合物具有在5.8-5.2范围内的经计算的pI。
在一些实施方案中，呈同型二聚体的本发明MIC-1化合物具有218-296、224-296或230-296个氨基酸残基。
在一些实施方案中，本发明的MIC-1化合物包含长度在3-35、3-30、3-25、3-24、4-36、4-35、4-30、4-25、4-24、5-36、5-35、5-30、5-25、5-24、6-36、6-35、6-30、6-25、6-24、7-36、7-35、7-30、7-25、7-24、8-36、8-35、8-30、8-25、8-24、8-12、30-36、32-36、30-34或30-32个氨基酸残基的范围内的N端延伸体。
在一些实施方案中，本发明的MIC-1化合物包含长度在30-32个氨基酸残基的范围内的N端延伸体。
在一些实施方案中，本发明的MIC-1化合物包含具有与碱性氨基酸残基(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)数目相比至少过剩3、4、5或6个的酸性氨基酸残基(天冬氨酸和谷氨酸)的N端延伸体。
在本发明的一些实施方案中，所述MIC-1化合物包含由选自A、E、G、P、S、T、Q和D的氨基酸残基组成的N端延伸体，其中所述延伸体包含至少三个E和/或D氨基酸残基。
在一些实施方案中，本发明的MIC-1化合物包含表现出与SEQ ID NO:1的MIC-1有至少85％、90％、95％或98％的序列同一性的MIC-1多肽。
在一些实施方案中，本发明的MIC-1化合物包含MIC-1多肽，该MIC-1多肽与SEQ IDNO:1的MIC-1相比包含一个或多个以下置换：N3E、P11E、H18E、R21E、A30E、A47E、R53E、A54E、M57E、M57L、R67E、L68E、K69E、A75E、A81E、P85E、M86L、L105E和K107E，和/或与SEQ ID NO:1的MIC-1相比包含前三个残基的缺失(MIC-1-Δ1-3)或N3的缺失(des-N3)。
在本发明的具体实施方案中，所述MIC-1化合物包含MIC-1多肽和N端氨基酸延伸体，其具有根据SEQ ID NO:87、90、92、93、94、97、98、99、100、101、102、108、109或164的氨基酸序列。
在一个方面，本发明提供了在三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液体系中在pH 8.0下的溶解度约为0.5、1.0、5.0、10、30或50mg/ml的MIC-1化合物。
在一个方面，本发明提供了编码本发明MIC-1化合物的多核苷酸分子。
在一个方面，本发明提供了包含本发明MIC-1化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯以及一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
在一个方面，本发明提供了用作药物的本发明MIC-1化合物。
在一个方面，本发明提供了用于预防和/或治疗代谢失调的本发明MIC-1化合物，其中所述代谢失调是肥胖症、2型糖尿病、血脂异常或糖尿病肾病。
在一个方面，本发明提供了用于例如通过减少食物摄入、减轻体重、抑制食欲和诱导饱腹感来预防和/或治疗饮食失调如肥胖症的本发明MIC-1化合物。
在一个方面，本发明提供了用于预防和/或治疗肥胖症的本发明MIC-1化合物。
在一个方面，本发明化合物是MIC-1受体激动剂。在一个方面，本发明化合物抑制食物摄入。在一个方面，本发明化合物减轻体重。
在一个方面，本发明提供了用于预防和/或治疗心血管疾病的本发明MIC-1化合物。
在一个方面，本发明提供了用于预防和/或治疗血脂异常、动脉硬化、脂肪性肝炎或糖尿病肾病的本发明MIC-1化合物。
附图简述
图1：具有单12-mer结构单元的MIC-1化合物的表达。所有细胞均在37℃下在TB中生长，并且在OD600达到1.0后通过添加0.5mM IPTG来诱导蛋白质表达。过夜后收获细胞，并且通过在SDS-PAGE上加载总裂解物来检查表达水平。加载wtMIC-1作为阳性对照。
图2：具有双12-mer结构单元的MIC-1化合物的表达。所有细胞均在37℃下在TB中生长，并且在OD600达到1.0后通过添加0.5mM IPTG来诱导蛋白质表达。过夜后收获细胞，并且通过在SDS-PAGE上加载总裂解物来检查表达水平。加载wtMIC-1作为阳性对照。
图3：a)由12mer-(4+2+_)、12mer-(4+4+_)和12mer-(4+3+_)开始的MIC-1化合物之间的表达水平的比较。应注意的是，带有12mer-(4+3_)的基团和由点表示的构建体在MIC-1的骨架中含有M57L。b)延伸的12mer对表达水平的影响。此外，在3.6组中最低的数据点为含有M57L的MIC-1化合物。在该图中，“1.6末位”表示TSTEEG，“2.6”表示TSESAT，“3.6”表示TSTEPS，“4.6”表示SEPATS。
图4：带有12mer-(4+2+_)、12mer-(4+3+_)+M57L、12mer-(三个重复)和12mer-(四个重复)的代表物的SDS-PAGE。T：总蛋白质，S：可溶性部分，P：细胞沉淀物(包涵体)。
图5：具有序列内突变的MIC-1化合物的溶解性。在该图中，骨架是MIC-1del(1-3)。
发明详述
本发明涉及包含MIC-1多肽的MIC-1化合物。在一个方面，本发明涉及包含MIC-1多肽和N端氨基酸延伸体的MIC-1化合物，其中所述延伸体由3至200个氨基酸残基组成，并且其中所述化合物具有低于6.5的经计算的pI。
MIC-1
如本文所用的术语“MIC-1”意为巨噬细胞抑制细胞因子-1(MIC-1)，也称为生长分化因子15(GDF-15)、胎盘骨形态发生蛋白(PLAB)和非甾体抗炎药活化基因(NAG-1)。MIC-1被合成为62kDa的细胞内同型二聚体前体蛋白，随后该前体蛋白被弗林蛋白酶样蛋白酶切割成24.5kDa的同型二聚体。全长野生型人MIC-1的序列可从UNIPROT数据库获得，登录号为Q99988。308个氨基酸的前体序列包括信号肽(氨基酸1-29)、前肽(氨基酸30-196)和MIC-1单体序列(氨基酸197-308)。112个氨基酸的MIC-1单体序列以SEQ ID NO:1包括于本文中。MIC-1单体含有9个半胱氨酸残基，其引起4个链内二硫键和1个链间二硫键的形成，从而产生共价连接的24.5kDa同型二聚体。已经描述了对应于MIC-1单体序列(SEQ ID NO:1)中的H6D的天然存在的突变。
如本文所用的术语“MIC-1化合物”是指包含MIC-1多肽和N端氨基酸延伸体的化合物。该MIC-1化合物通常是同型二聚体的形式。
如本文所用的术语“MIC-1多肽”是指SEQ ID NO:1的人MIC-1单体序列或其类似物。如果没有另外说明，则针对特定MIC-1残基的数值参照是指112个氨基酸的单体序列(即残基1是丙氨酸(A1)，并且残基112是异亮氨酸(I112))。
如本文所用的术语“MIC-1类似物”或“MIC-1的类似物”是指MIC-1多肽，其为SEQID NO:1的单体MIC-1序列的氨基酸变体。换言之，MIC-1类似物是MIC-1多肽，其中当与人MIC-1(SEQ ID NO:1)相比时许多氨基酸残基已经发生变化。这些变化可独立地表示一个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失。
MIC-1类似物可通过参考变化的氨基酸残基、氨基酸残基的编号(即在MIC-1单体序列(SEQ ID NO:1)中的相应位置)和变化(例如，氨基酸残基变化)来描述。
在一个方面，所述MIC-1类似物为SEQ ID NO:1的MIC-1的功能变体。在本发明的一方面，所述MIC-1类似物表现出与SEQ ID NO:1的MIC-1有至少85％、90％或95％的序列同一性。作为确定两种类似物之间序列同一性的方法的一个实例，比对H6D MIC-1和SEQ ID NO:1的MIC-1这两种肽。H6D MIC-1类似物相对于SEQ ID NO:1的MIC-1的序列同一性通过将比对的同等残基数目减去不同残基的数目再除以SEQ ID NO:1的MIC-1中的残基总数而得出。因此，在所述实例中，序列同一性百分比为(112-1)/112×100。在确定MIC-1类似物的序列同一性时，不包括N端氨基酸延伸体。
在本发明的另一方面，相对于SEQ ID NO:1的人MIC-1，所述MIC-1类似物包含少于例如不到15、10或5个氨基酸修饰(置换、缺失、添加(包括插入)及其任何组合)。在本申请中通篇使用的术语“氨基酸修饰”以如下含义使用：与单体MIC-1(SEQ ID NO:1)相比，对氨基酸的修饰。该修饰可以是氨基酸的缺失、氨基酸的添加、将一个氨基酸置换为另一氨基酸或共价连接至该肽的氨基酸的取代基的结果。
置换：在一个方面，氨基酸可通过保守置换来取代。如本文所用的术语“保守置换”表示一个或多个氨基酸被生物学上类似的另一残基代替。实例包括具有类似特性的氨基酸残基的置换，例如小氨基酸、酸性氨基酸、极性氨基酸、碱性氨基酸、疏水性氨基酸和芳香族氨基酸的置换。
在一个方面，氨基酸可以通过非保守置换来取代。如本文所用的术语“非保守置换”表示一个或多个氨基酸被具有不同特性的另一氨基酸代替。实例包括用酸性氨基酸残基置换碱性氨基酸残基、用芳香族氨基酸残基置换极性氨基酸残基，等等。在一个方面，非保守置换是将编码氨基酸置换为具有不同特性的另一编码氨基酸。在一个方面，所述MIC-1类似物可包含一个或多个非天然和/或非氨基酸例如氨基酸模拟物向MIC-1序列内的置换。
人MIC-1单体序列(SEQ ID NO:1)的位置3(N3)处的天冬酰胺残基是化学不稳定的。在本发明的一个方面，在对应于单体MIC-1序列(SEQ ID NO:1)的位置3的位置处的天冬酰胺可被置换为丝氨酸(N3S)、谷氨酸(N3E)、丙氨酸(N3A)或谷氨酰胺(N3Q)。在本发明的一个方面，在对应于人MIC-1单体序列(SEQ ID NO:1)的位置3的位置处的天冬酰胺已被置换为谷氨酸(N3E)。
在本发明的一个方面，在对应于人MIC-1单体序列(SEQ ID NO:1)的位置2的位置处的精氨酸已被置换为丙氨酸(R2A)，并且在对应于人MIC-1单体序列(SEQ ID NO:1)的位置3的位置处的天冬酰胺已被置换为谷氨酸(N3E)。
缺失和截短：在一个方面，本发明的MIC-1类似物可以单独地或与一个或多个插入或置换相组合地，从MIC-1的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)中缺失一个或多个氨基酸残基。
具有氨基酸缺失的MIC-1类似物可以如下描述：“des”，提及缺失的氨基酸残基，之后是缺失的氨基酸的编号(即在单体MIC-1(SEQ ID NO:1)中的相应位置)。在本发明的一些实施方案中，在对应于人单体MIC-1(SEQ ID NO:1)的位置3的位置处的天冬酰胺缺失(MIC-1des-N3，SEQ ID NO:2)。
在N端或C端具有一个或多个氨基酸残基的截短的MIC-1类似物可通过“MIC-1-Δ”并提及缺失的氨基酸残基的编号(即在单体MIC-1(SEQ ID NO:1)中的相应位置)来描述。在本发明的一些实施方案中，在N端的前三个残基(A1、R2、N3)缺失(MIC-1-Δ1-3，SEQ ID NO:3)。
插入：在一个方面，本发明的MIC-1类似物可以单独地或与一个或多个缺失和/或置换相组合地，具有插入到人MIC-1的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基。
在一个方面，本发明的MIC-1类似物可包含一个或多个非天然氨基酸和/或非氨基酸向MIC-1序列中的插入。
例如在本文中使用的术语“蛋白质”或“多肽”是指包含一系列通过酰胺(或肽)键互连的氨基酸的化合物。氨基酸是含有胺基团和羧酸基团以及可选的一个或多个通常被称为侧链的额外基团的分子。
术语“氨基酸”包括编码(或蛋白型或天然)氨基酸(其中有20种标准氨基酸)以及非编码(或非蛋白型或非天然)氨基酸。编码氨基酸是天然地并入蛋白质中的氨基酸。标准氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。非编码氨基酸或者不存在于蛋白质中，或者不通过标准细胞机制产生(例如，它们可能已经经历翻译后修饰)。在下文中，未说明其光学异构体的MIC-1蛋白质的所有氨基酸都应被理解为意指L-异构体(除非另有说明)。
从上文可以明显看出，氨基酸残基可通过其全名、其单字母代码和/或其三字母代码来表示。这三种方式是完全等同的。为方便读者，以下提供单字母和三字母氨基酸代码：
甘氨酸：G和Gly；脯氨酸：P和Pro；丙氨酸：A和Ala；缬氨酸：V和Val；亮氨酸：L和Leu；异亮氨酸：I和Ile；甲硫氨酸：M和Met；半胱氨酸：C和Cys；苯丙氨酸：F和Phe；酪氨酸：Y和Tyr；色氨酸：W和Trp；组氨酸：H和His；赖氨酸：K和Lys；精氨酸：R和Arg；谷氨酰胺：Q和Gln；天冬酰胺：N和Asn；谷氨酸：E和Glu；天冬氨酸：D和Asp；丝氨酸：S和Ser；和苏氨酸：T和Thr。
N端氨基酸延伸体
在本发明的一些实施方案中，所述MIC-1化合物包含N端氨基酸延伸体。
如本文所用的术语“N端氨基酸延伸体”意为MIC-1多肽的N端经由酰胺键(优选肽键)与N端氨基酸延伸体的C端连接。术语“N端氨基酸延伸体”、“N端延伸体”和“N-延伸体”在本文中含义相同并且可互换使用。在一个实施方案中，本发明化合物包含人MIC-1单体序列(SEQ ID NO:1)，在N端(即位置1处的丙氨酸(A1))经由肽键连接有氨基酸延伸体。
在本发明的一些实施方案中，所述N端氨基酸延伸体长达200个氨基酸残基。在本发明的具体实施方案中，所述N端氨基酸延伸体具有3至36个氨基酸残基。
在本发明的一个方面，所述N端氨基酸延伸体具有与碱性氨基酸残基(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)数目相比至少过剩3、4、5或6个的酸性氨基酸残基(天冬氨酸和谷氨酸)。酸性氨基酸残基“过剩”是指酸性残基的数目超过碱性残基的数目。通过将酸性残基的数目减去碱性残基的数目来计算定义的酸性氨基酸残基的过剩值。
甲硫氨酸是用于在原核细胞(例如，细菌，例如大肠杆菌)中表达蛋白质的起始氨基酸。在本发明的一些实施方案中，起始甲硫氨酸在蛋白质表达期间从蛋白质中被去除。因此，起始甲硫氨酸不包括于MIC-1化合物的N-延伸体的序列中。然而，本领域技术人员知道，编码起始甲硫氨酸的起始密码子是蛋白质翻译起始所必需的，并且应该毫无例外地掺入核苷酸序列的正前方以供蛋白质表达。
同时可以理解，包含具有起始甲硫氨酸的N-延伸体的那些MIC-1化合物也落在本发明的范围内。
等电点(pI)
MIC-1化合物的经计算的pI被定义为在该化合物的净计算电荷为零时的pH。使用表1中描述的氨基酸残基的pKa值以及B.Skoog和A.Wichman(Trends in AnalyticalChemistry,1986,vol.5,pp.82-83)中所描述的方法获得MIC-1化合物随pH而变的计算电荷。半胱氨酸(Cys)的侧链pKa仅包括在针对具有游离巯基的半胱氨酸的电荷计算中。作为实例，呈同型二聚体的人wtMIC-1的经计算pI值为8.8。
如本文所述，对呈同型二聚体的MIC-1化合物进行MIC-1化合物的pI计算。
表1：用于计算pI的氨基酸残基的pKa。pKa值是在“Correlation ofElectrophoretic Mobilities from Capillary Electrophoresis withPhysicochemical Properties of Proteins and Peptides by Rickard EC,Strohl MM,Nielsen RG.Analytical Biochemistry 1991,vol 197,pp 97-207”中描述的那些pKa值。
在一个方面，本发明的MIC-1化合物具有良好的生物物理性质。这些性质包括但不限于溶解性和/或稳定性。
溶解性
人野生型MIC-1是疏水性蛋白质，其基于同型二聚体计算的pI为8.8。因此，野生型MIC-1在中性pH水性缓冲液体系中只能溶解至约0.5mg/ml。MIC-1的低溶解度明显阻碍了其配制性质和治疗用途，因此开发针对溶解性工程化的MIC-1化合物对于MIC-1分子工程化至关重要。
在一个方面，本发明化合物相对于SEQ ID NO:1的人MIC-1具有改善的溶解度(即更可溶)。
如本文所述，如实施例4中所述测定溶解度。
在某些实施方案中，本发明的MIC-1化合物在Tris缓冲液中在pH8.0下具有至少1mg/ml的溶解度。在其他实施方案中，本发明的化合物在pH 8.0的Tris缓冲液中具有至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少30mg/ml或至少40mg/ml的溶解度。
如本文所述，对呈同型二聚体的MIC-1化合物测量溶解度。
稳定性
人野生型MIC-1序列是化学不稳定的，并且氨基酸序列的几个残基可在储存期间被修饰，包括在位置3(N3)处的天冬酰胺的脱酰胺化和甲硫氨酸M43、M57和M86的氧化。某些残基的化学不稳定性可影响药学性质，因此开发化学稳定的MIC-1化合物将是获得MIC-1治疗性化合物的另一重要部分。
在一个方面，本发明化合物相对于SEQ ID NO:1的人MIC-1具有改善的化学稳定性。
术语“化学稳定性”是指多肽结构的化学变化，导致形成可能具有与完整多肽相比降低的生物活性、降低的溶解度和/或增加的免疫原性效应的化学降解产物。化学稳定性可以通过在暴露于不同环境条件之后的各个时间点测量化学降解产物的量来评估，例如，通过SEC-HPLC和/或RP-HPLC。
MIC-1可以是化学不稳定的；并且氨基酸序列(SEQ ID NO:1)的几个残基可在储存期间被修饰，包括N3的脱酰胺化和甲硫氨酸M43、M57和M86的氧化。某些残基的化学不稳定性可影响药学性质，如作为治疗性化合物的MIC-1的低化学稳定性。
在本发明的某些实施方案中，MIC-1单体序列(SEQ ID NO:1)的某些残基被修饰，例如，通过置换来增加MIC-1化合物的化学稳定性。为避免脱酰胺化，N3可缺失或置换为其他氨基酸，例如E或Q。为减少氧化，甲硫氨酸可置换为其他氨基酸，例如E或L。
结晶
在一个方面，本发明化合物与SEQ ID NO:1的MIC-1相比在pH 8.0下显示出减小的晶体形成趋势。
免疫原性
在一个方面，本发明化合物具有低免疫原性风险。
体外活性
在一个方面，本发明化合物相对于人MIC-1(SEQ ID NO:1)保持MIC-1受体功效。受体功效和效力可在用人MIC-1受体(hGFRAL、GDNF家族受体α样)及其信号传导共同受体hRET51(原癌基因酪氨酸-蛋白激酶受体Ret同种型51)转染的哺乳动物细胞中测量。如实施例6中所述，通过细胞外信号调节激酶(ERK)的磷酸化来测量受体复合物的MIC-1化合物活化。
如本文所述，对呈同型二聚体的MIC-1化合物测量受体功效和效力。
体内生物活性
在一个方面，本发明化合物在体内是有效的，其可在任何合适的动物模型中如本领域已知的那样来确定。
非肥胖型Sprague Dawley大鼠是合适的动物模型的一个实例，并且例如如实施例7所述，可在这类大鼠体内确定食物摄入的变化。在一个方面，本发明化合物在非肥胖型Sprague Dawley大鼠中抑制体内食物摄入。饮食诱发的肥胖(DIO)Sprague Dawley大鼠是合适的动物模型的另一个实例，并且可以在这类大鼠体内确定食物摄入的变化。在一个方面，本发明化合物在DIO Sprague Dawley大鼠中抑制体内食物摄入并且减轻体重。
生产方法
本发明的MIC-1化合物可借助于本领域技术人员已知的重组蛋白技术来产生。通常，将编码感兴趣的蛋白质或其功能变体的核酸序列被修饰为编码所需的MIC-1化合物。随后将这种修饰的序列插入到表达载体中，该表达载体继而转化或转染至表达宿主细胞中。
编码MIC-1化合物的核酸构建体可适当地为基因组、cDNA或合成来源的。通过公知的技术修饰遗传密码来实现氨基酸序列的改变。
通常将编码MIC-1化合物的DNA序列插入到重组载体中，该载体可以是可方便地经历重组DNA程序的任何载体，并且载体的选择通常依赖于其将被引入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒。或者，该载体可以是当引入宿主细胞中时被整合至宿主细胞基因组中并且随同其已整合至的染色体一起复制的载体。
所述载体优选为表达载体，其中编码MIC-1化合物的DNA序列可操作地连接至DNA转录所需的附加区段。术语“可操作地连接”表示这些区段被排列为使得它们共同为了其预期目的而起作用，例如，转录在启动子中开始，并且通过编码多肽的DNA序列继续进行，直至其在终止子内终止。
因此，用于表达MIC-1化合物的表达载体将包含能够启动并引导克隆基因或cDNA的转录的启动子。该启动子可以是任何DNA序列，该DNA序列在所选宿主细胞中显示出转录活性，并且可衍生自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。
另外，用于表达MIC-1化合物的表达载体还将包含终止序列，即被宿主细胞识别以终止转录的序列。终止序列可操作地连接至编码多肽的核酸序列的3’端。在所选宿主细胞中具有功能的任何终止子均可在本发明中使用。
MIC-1化合物的表达可针对在宿主细胞的胞质溶胶中的细胞内表达或被引导至分泌途径中以便细胞外表达至生长培养基中。
细胞内表达是默认途径且需要具有如下DNA序列的表达载体，该DNA序列包含启动子，随后是编码MIC-1化合物的DNA序列，随后是终止子。
为了将MIC-1化合物的序列引导至宿主细胞的分泌途径中，需要分泌信号序列(也称为信号肽或前序列)作为该MIC-1序列的延伸。编码信号肽的DNA序列在正确的读框中连接至编码该MIC-1化合物的DNA序列的5’末端。信号肽可以通常与蛋白质相关联，或者可以来自编码另一分泌性蛋白质的基因。
用来分别连接编码MIC-1化合物的DNA序列、启动子、终止子和/或分泌信号序列以及用来将它们插入含有复制必需信息的适当载体中的程序是本领域技术人员公知的(参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor,New York,1989)。
引入编码MIC-1化合物的DNA序列的宿主细胞可以是能够在细胞内或细胞外表达该MIC-1化合物的任何细胞。MIC-1化合物可通过在允许表达该MIC-1化合物的条件下在合适的营养培养基中培养含有编码该MIC-1化合物的DNA序列且能够表达该MIC-1化合物的宿主细胞来产生。适合于表达MIC-1化合物的宿主细胞的非限制性实例为：大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及人胚肾(HEK)、幼仓鼠肾(BHK)或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。若需要翻译后修饰，则合适的宿主细胞包括酵母、真菌、昆虫和高等真核细胞如哺乳动物细胞。
一旦MIC-1化合物已经在宿主生物体中表达，其可通过常规技术回收并纯化至所需质量。这类常规回收和纯化技术的非限制性实例是离心、溶解、过滤、沉淀、离子交换色谱法、固定化金属亲和色谱法(IMAC)、反相高效液相色谱法(RP-HPLC)、凝胶过滤和冷冻干燥。
MIC-1蛋白质的重组表达和纯化的实例可见于例如Cordingley等人,J.Virol.1989,63,pp5037-5045；Birch等人,Protein Expr Purif.,1995,6,pp 609-618和WO2008/043847中。
MIC-1蛋白质的微生物表达和纯化的实例可见于例如Chich等人,Anal.Biochem,1995,224,pp 245-249和Xin等人,Protein Expr.Purif.2002,24,pp530-538。
在实验部分中包括制备多种本发明化合物的方法的具体实例。
包涵体和蛋白质表达
MIC-1化合物可在细菌如大肠杆菌中表达。在本发明的背景中，所述具有N-延伸体的MIC-1多肽的大规模蛋白质生产可采用包涵体(IB)，因为这代表了控制工艺回收、蛋白质纯度、蛋白酶降解和总体蛋白质稳定性的有益方法。这对于大规模蛋白质生产尤其重要。对于IB质量至关重要的是MIC-1多肽的平衡，其中N-延伸体溶解度部分地通过计算的pI和IB形成来控制。
给药方式
除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则术语“治疗”意在包括预防和最小化所提及的疾病、病症或病况(即，“治疗”是指预防性和治疗性施用本发明化合物或包含本发明化合物的组合物)。
给药途径可以是有效地将本发明化合物输送至身体中的所需或适当位置的任何途径，诸如肠胃外，例如皮下、肌肉内或静脉内途径。或者，可口服、经肺、经直肠、经皮、经颊、舌下或经鼻施用本发明化合物。
与熟悉肥胖症和相关病症治疗的医师协商决定待施用的本发明化合物的量，确定本发明化合物的给药频率，以及选择哪种或哪些本发明化合物任选地与另一药学活性剂一起施用。
药物组合物
包含本发明化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯和药学上可接受的赋形剂的药物组合物可以如本领域已知的那样制备。
术语“赋形剂”宽泛地指除活性治疗成分以外的任何组分。赋形剂可以是惰性物质、无活性物质和/或非医药活性物质。
赋形剂可用于各种目的，例如作为载体、媒介物、稀释剂、片剂助剂和/或用来改善活性物质的给药和/或吸收。
药学活性成分与各种赋形剂的配制是本领域已知的，参见例如Remington:TheScience and Practice ofPharmacy(例如第19版(1995)和任何后续版本)。
联合治疗
采用本发明化合物进行的治疗还可以联合一种或多种药学活性物质，该药学活性物质例如选自抗肥胖剂、食欲调节剂以及用于治疗和/或预防由肥胖症引起或与肥胖症相关的并发症和病症的药剂。
药物适应症
在一个方面，本发明涉及用作药物的本发明化合物。
在特定的实施方案中，本发明化合物可用于以下医学治疗：
(i)例如通过减少食物摄入、减轻体重、抑制食欲和诱导饱腹感来预防和/或治疗饮食失调，如肥胖症。
(ii)预防和/或治疗高血糖症、胰岛素抵抗和/或葡萄糖耐量减低。
(iii)预防和/或治疗血脂异常。
在一些实施方案中，本发明涉及体重管理方法。在一些实施方案中，本发明涉及降低食欲的方法。在一些实施方案中，本发明涉及减少食物摄入的方法。
通常，所有罹患肥胖症的受试者也被认为罹患超重。在一些实施方案中，本发明涉及治疗或预防肥胖症的方法。在一些实施方案中，本发明涉及本发明的MIC-1化合物在治疗或预防肥胖症中的用途。在一些实施方案中，罹患肥胖症的受试者是人，如成人或儿科病人(包括婴儿、儿童和青少年)。身体质量指数(BMI)是基于身高和体重的体脂肪量度。计算公式是BMI＝以千克为单位的体重/以米为单位的身高2。罹患肥胖症的人类受试者可具有≥30的BMI；该受试者也可被称为肥胖的。在一些实施方案中，罹患肥胖症的人类受试者可具有≥35的BMI或≥30至<40范围内的BMI。在一些实施方案中，该肥胖症为重度肥胖症或病态肥胖症，其中该人类受试者可具有≥40的BMI。
在一些实施方案中，本发明涉及任选地在至少一种体重相关共病的存在下治疗或预防超重的方法。在一些实施方案中，本发明涉及本发明的MIC-1化合物任选地在至少一种体重相关共病的存在下治疗或预防超重的用途。
在一些实施方案中，罹患超重的受试者是人，如成人或儿科病人(包括婴儿、儿童和青少年)。在一些实施方案中，罹患超重的人类受试者可具有≥25的BMI，如≥27的BMI。在一些实施方案中，罹患超重的人类受试者具有25至<30范围内的BMI或27至<30范围内的BMI。在一些实施方案中，所述体重相关共病选自高血压、糖尿病(如2型糖尿病)、血脂异常、高胆固醇和阻塞性睡眠呼吸暂停。
在一些实施方案中，本发明涉及减轻体重的方法。在一些实施方案中，本发明涉及本发明的MIC-1化合物在减轻体重中的用途。根据本发明经历体重减轻的人可具有≥25的BMI，如≥27的BMI或≥30的BMI。在一些实施方案中，根据本发明经历体重减轻的人可具有≥35的BMI或≥40的BMI。术语“体重减轻”可包括肥胖症和/或超重的治疗或预防。
在一些实施方案中，本发明涉及用于治疗或预防心血管疾病如动脉硬化以及其他病症如脂肪性肝炎和糖尿病肾病的方法。
本文使用的词语“一个”和“一种”是指一个(种)或多于一个(种)(即，至少一个(种))该词的语法对象。举例来说，“一个MIC-1多肽”是指一个MIC-1多肽或多于一个MIC-1多肽。
具体实施方案
通过以下本发明的非限制性实施方案进一步描述本发明：
1.包含MIC-1多肽和N端氨基酸延伸体的MIC-1化合物，其中所述延伸体由3至200个氨基酸残基组成，并且其中所述化合物具有低于6.5的经计算的pI。
2.根据实施方案1所述的化合物，其中所述MIC-1多肽和氨基酸延伸体由109-312、112-312、115-312、112-148或115-148个氨基酸残基组成。
3.根据实施方案1所述的化合物，其中所述化合物是同型二聚体。
4.根据实施方案1所述的化合物，其中所述呈同型二聚体的化合物由218-296、224-296、230-296、218-310、224-310、230-310、218-360、224-360、230-360、218-624、224-624、230-296或230-296个氨基酸残基组成。
5.由具有N端氨基酸延伸体的MIC-1多肽组成的化合物，其中所述延伸体由3至200个氨基酸残基组成，并且其中所述化合物具有低于6.5的经计算的pI。
6.根据实施方案1-5所述的化合物，其中所述经计算的pI低于6.1。
7.根据实施方案1-5所述的化合物，其中所述经计算的pI低于6.0。
8.根据实施方案1-5中任一项所述的化合物，其中所述经计算的pI低于6.4、6.3、6.2、6.1、6.0、5.9、5.8、5.7、5.6、5.5、5.4、5.3或5.2、5.1或5.0、4.9、4.8、4.7、4.6、4.5、4.4、4.3、4.2、4.1或4.0。
9.根据实施方案1-7中任一项所述的化合物，其中所述经计算的pI高于4.7。
10.根据实施方案1-7中任一项所述的化合物，其中所述经计算的pI高于4.8。
11.根据实施方案1-7中任一项所述的化合物，其中所述经计算的pI高于4.9。
12.根据实施方案1-7中任一项所述的化合物，其中所述经计算的pI高于5.0。
13.根据实施方案1-7中任一项所述的化合物，其中所述经计算的pI高于5.1。
14.根据实施方案1-5中任一项所述的化合物，其中所述经计算的pI在6.5-3.0、6.5-3.5、6.5-4.0、6.1-3.0、6.1-3.5、6.1-4.0、6.1-4.7、6.1-4.9、6.1-5.0、6.1-5.1、6.0-3.0、6.0-3.5、6.0-4.0、5.9-3.0、5.9-3.5、5.9-4.0、5.9-5.0、5.9-5.1、5.8-3.0、5.8-3.5、5.8-4.0、5.8-5.1、5.8-5.2、5.5-3.0、5.5-3.5、5.5-4.0或5.0-4.0的范围内。
15.根据实施方案1-14中任一项所述的化合物，其中所述经计算的pI在5.8-5.2的范围内。
16.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述延伸体的长度在3-100、3-50、3-40、3-30、5-100、5-50、5-40、5-30、10-100、10-50、10-40、10-30、3-36、3-30、3-25、3-24、3-12、4-36、4-30、4-24、4-12、5-36、5-30、5-24、5-12、6-36、6-30、6-24、6-12、7-36、7-30、7-24、7-12、8-36、8-30、8-24、8-12、30-36、32-36、30-34或30-32个氨基酸残基的范围内。
17.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述延伸体的长度为3至36个氨基酸。
18.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述延伸体的长度在30-32个氨基酸残基的范围内。
19.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述延伸体具有与碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸或组氨酸)数目相比至少过剩3、4、5、6、7、8、9或10个的酸性氨基酸残基(天冬氨酸或谷氨酸)。
20.根据实施方案1-18中任一项所述的化合物，其中所述延伸体包含与碱性氨基酸残基(赖氨酸或精氨酸或组氨酸)数目相比至少过剩15％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、70％或75％的酸性氨基酸残基(天冬氨酸或谷氨酸)。
21.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述延伸体包含至少15％的酸性氨基酸残基。
22.根据实施方案21所述的化合物，其中所述延伸体包含至少25％的酸性氨基酸残基，
23.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述延伸体由选自A、E、G、P、S、T、D、N和Q的氨基酸残基组成，其中所述延伸体包含至少三个E和/或D氨基酸残基。
24.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述延伸体由选自A、E、G、P、S、T、Q和D的氨基酸残基组成，其中所述延伸体包含至少三个E和/或D氨基酸残基。
25.根据实施方案23或24所述的化合物，其中所述延伸体包含至少三个E和至少一个P。
26.根据实施方案25所述的化合物，其中所述延伸体还包含S、G、T和A。
27.根据实施方案26所述的化合物，其中所述延伸体包含6个Ser、4个Pro、4个Gly、4个Thr、4个Glu和2个Ala。
28.根据实施方案27所述的化合物，其中所述延伸体包含两个选自SPAGSPTSTEEG、TSESATPESGPG、TSTEPSEGSAPG和SEPATSGSETPG的序列。
29.根据实施方案28所述的化合物，其中所述延伸体还包含SPAGSPTSTEEG、TSESATPESGPG、TSTEPSEGSAPG或SEPATSGSETPG中的6-8个连续氨基酸，如前6-8个氨基酸残基、最后6-8个残基或内部6-8个残基。
30.根据实施方案23至29中任一项所述的化合物，其中所述延伸体起始于S。
31.根据实施方案30中任一项所述的化合物，其中所述延伸体起始于SE。
32.根据实施方案31中任一项所述的化合物，其中所述延伸体起始于SEP。
33.根据实施方案1至24中任一项所述的化合物，其中所述延伸体包含一个或多个以下序列：SPAGSP(SEQ ID NO:4)、TSESAT(SEQ ID NO:5)、TSTEPE(SEQ ID NO:6)、SEPATS(SEQ ID NO:7)、TSTEEG(SEQ ID NO:8)、PESGPG(SEQ ID NO:9)、SGSAPG(SEQ ID NO:10)、GSETPG(SEQ ID NO:11)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO:12)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO:13)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO:14)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP(SEQ ID NO:15)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP(SEQ ID NO:16)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP(SEQ ID NO:17)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT(SEQ ID NO:18)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT(SEQ ID NO:19)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT(SEQ ID NO:20)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE(SEQ ID NO:21)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE(SEQ ID NO:22)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE(SEQ ID NO:23)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS(SEQ ID NO:24)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS(SEQ ID NO:25)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS(SEQ ID NO:26)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG(SEQ ID NO:27)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG(SEQ ID NO:28)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG(SEQ ID NO:29)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG(SEQ ID NO:30)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG(SEQ ID NO:31)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG(SEQ ID NO:32)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG(SEQ ID NO:33)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG(SEQ ID NO:34)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG(SEQ ID NO:35)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG(SEQ ID NO:36)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG(SEQ ID NO:37)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG(SEQ ID NO:38)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(SEQ ID NO:70)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO:71)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG(SEQ IDNO:39)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO:40)、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO:41)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG(SEQ IDNO:42)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO:43)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO:44)、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG(SEQ IDNO:45)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO:46)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO:47)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG(SEQ IDNO:48)、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO:49)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO:50)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG(SEQ IDNO:51)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO:52)、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO:53)、GEPS(SEQ ID NO:118)、GPSE(SEQ ID NO:119)、GPES(SEQ ID NO:120)、GSPE(SEQ ID NO:121)、GSEP(SEQ ID NO:122)、GEPQ(SEQ ID NO:123)、GEQP(SEQ ID NO:124)、GPEQ(SEQ ID NO:125)、GPQE(SEQ ID NO:126)、GQEP(SEQ ID NO:127)或GQPE(SEQ ID NO:128)、PEDEETPEQE(SEQ ID NO:129)、PDEGTEEETE(SEQ ID NO:130)、PAAEEEDDPD(SEQ ID NO:131)、AEPDEDPQSED(SEQ ID NO:132)、AEPDEDPQSE(SEQ IDNO:133)、AEPEEQEED(SEQ ID NO:134)、AEPEEQEE(SEQ ID NO:135)、GGGS(SEQ ID NO:136)、GSGS(SEQ ID NO:137)、GGSS(SEQ ID NO:138)和SSSG(SEQ ID NO:139)。
34.根据实施方案1至24中任一项所述的化合物，其中所述延伸体包含一个或多个以下序列：SPAGSP、TSESAT、TSTEPE、SEPATS、TSTEEG、PESGPG、SGSAPG、GSETPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG、SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG、GEPQ、GEPS、GGGS、GSGS、GGSS和SSSG。
35.根据实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中所述延伸体包含以下序列中的任意2-6个的任意组合：SPAGSP、TSESAT、TSTEPE、SEPATS、TSTEEG、PESGPG、SGSAPG、GSETPG、GEPQ、GEPS、GGGS、GSGS、GGSS和SSSG。
36.根据实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中所述延伸体包含一个或多个以下序列：GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS和SSSG。
37.根据实施方案36所述的化合物，其中所述延伸体包含以下序列中的2-9个的任意组合：GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS和SSSG。
38.根据实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中所述延伸体包含一个或多个以下序列：GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GGGS、GSGS、GGSS和SSSG。
39.根据实施方案38所述的化合物，其中所述延伸体包含以下序列中的2-9个的任意组合：GEPS、GPSE、GPES、GSPE、GSEP、GGGS、GSGS、GGSS和SSSG。
40.根据实施方案39所述的化合物，其中所述延伸体包含一个或多个以下序列：GEPSGEPSGEPSGEPSGEPS(SEQ ID NO:140)、GPSEGPSEGPSEGPSEGPSE(SEQ ID NO:141)、GPESGPESGPESGPESGPES(SEQ ID NO:142)、GSPEGSPEGSPEGSPEGSPE(SEQ ID NO:143)和GSEPGSEPGSEPGSEPGSEP(SEQ ID NO:144)。
41.根据实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中所述延伸体包含一个或多个以下序列：GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS和SSSG。
42.根据实施方案41所述的化合物，其中所述延伸体包含以下序列中的2-9个的任意组合：GEPQ、GEQP、GPEQ、GPQE、GQEP、GQPE、GGGS、GSGS、GGSS和SSSG。
43.根据实施方案42所述的化合物，其中所述延伸体包含一个或多个以下序列：GEPQGEPQGEPQGEPQGEPQ(SEQ ID NO:145)、GEQPGEQPGEQPGEQPGEQP(SEQ ID NO:146)、GPEQGPEQGPEQGPEQGPEQ(SEQ ID NO:147)、GPQEGPQEGPQEGPQEGPQE(SEQ ID NO:148)、GQEPGQEPGQEPGQEPGQEP(SEQ ID NO:149)和GQPEGQPEGQPEGQPEGQPE(SEQ ID NO:150)。
44.根据实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中所述延伸体包含一个或多个以下序列：PEDEETPEQE、PDEGTEEETE、PAAEEEDDPD、AEPDEDPQSED、AEPDEDPQSE、AEPEEQEED以及AEPEEQEE、GGGS、GSGS、GGSS和SSSG。
45.根据实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中所述延伸体包含以下序列中的两至三个的任意组合：PEDEETPEQE、PDEGTEEETE、PAAEEEDDPD、AEPDEDPQSED、AEPDEDPQSE、AEPEEQEED、AEPEEQEE和AEEAEEAEEAEEAEE。
46.根据实施方案1-24中任一项所述的化合物，其中所述延伸体包含一个或多个以下序列：SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQID NO:188、SEQ ID NO:189、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:191、SEQ ID NO:192、SEQ ID NO:193、SEQ ID NO:194和SEQ ID NO:195。
47.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述延伸体在N端包含1-3个丙氨酸氨基酸残基。
48.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述延伸体在C端包含1-4个甘氨酸和丝氨酸氨基酸残基。
49.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述延伸体在C端包含(Gly-Ser)n或(Ser-Gly)n序列，其中n是1-8的整数。
50.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述延伸体在C端包含GGGS、GSGS、GGSS或SSSG。
51.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽表现出与野生型MIC-1(SEQ ID NO:1)有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
52.根据实施方案51所述的化合物，其中所述MIC-1多肽表现出与野生型MIC-1(SEQ ID NO:1)有至少95％的序列同一性。
53.根据实施方案1-51中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽与SEQ ID NO:1的MIC-1相比具有最多10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸修饰。
54.根据实施方案1-53中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽与SEQ ID NO:1的MIC-1相比具有最多7、6、5、4、3或2个氨基酸修饰。
55.包含MIC-1多肽的化合物，其中所述化合物具有低于6.5的经计算的pI。
56.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽与野生型MIC-1(SEQ ID NO:1)相比包含一个或多个以下置换：P11E、H18E、R21E、A30E、M43L、M43E、A47E、R53E、A54E、M57E、M57L、H66E、R67E、L68E、K69E、A75E、A81E、P85E、M86F、M86L、Q90E、T92E、L105E、K107E。
57.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽与SEQ ID NO:1的MIC-1相比包含一个或多个以下置换：R2S、R2A、N3S、N3E、N3A、N3T、N3P、N3G、N3V、N3H、N3Y或N3Q。
58.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽与SEQ ID NO:1的MIC-1相比包含N3的缺失(des-N3)。
59.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽与SEQ ID NO:1的MIC-1相比包含M57E或M57L置换。
60.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽与SEQ ID NO:1的MIC-1相比包含M86L或M86F置换。
61.根据实施方案60所述的化合物，其中所述MIC-1多肽与SEQ ID NO:1的MIC-1相比还包含Q90E或T92E置换。
62.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽与SEQ ID NO:1的MIC-1相比包含H66E置换。
63.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽与SEQ ID NO:1的MIC-1相比包含R67E置换。
64.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽与SEQ ID NO:1的MIC-1相比包含前3、4、5或6个残基的缺失。
65.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽与SEQ ID NO:1的MIC-1相比包含前3个残基的缺失。
66.根据实施方案1-56中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽具有根据SEQID NO:154(M43L/des-N3)的序列。
67.根据实施方案1-56中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽具有根据SEQID NO:155(M43L/Δ1-3)的序列。
68.根据实施方案1-56中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽具有根据SEQID NO:156(M57E/H66E/des-N3)的序列。
69.根据实施方案1-56中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽具有根据SEQID NO:157(M57L/Δ1-3)的序列。
70.根据实施方案1-56中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽具有根据SEQID NO:158(M57L/des-N3)的序列。
71.根据实施方案1-56中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽具有根据SEQID NO:159(M86L/Δ1-3)的序列。
72.根据实施方案1-56中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽具有根据SEQID NO:160(M86L/des-N3)的序列。
73.根据实施方案1-56中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽具有根据SEQID NO:222(M57L，M86L/des-N3)的序列。
74.根据实施方案1-55中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽具有根据SEQID NO:1的序列。
75.包含MIC-1多肽和N端氨基酸延伸体的MIC-1化合物，其中所述化合物包含根据SEQ ID NO:89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117或164的氨基酸序列。
76.包含MIC-1多肽和N端氨基酸延伸体的MIC-1化合物，其中所述化合物包含根据SEQ ID NO:100、104、106、107、108、109、111、112、113、114、115、116、117或164的氨基酸序列。
77.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其与SEQ ID NO:1的MIC-1相比显示出改善的溶解性。
78.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其与SEQ ID NO:1的MIC-1相比在Tris缓冲液体系中在pH 8.0下显示出改善的溶解度。
79.根据实施方案1-78中任一项所述的化合物，其中所述化合物与SEQ ID NO:1的MIC-1相比在Tris缓冲液体系中在pH 8.0下具有超过2倍、5倍、10倍、50倍直至100倍的溶解性改善。
80.根据实施方案1-79中任一项所述的化合物，其中所述化合物在Tris缓冲液体系中在pH 8.0下具有0.5、1.0、5.0、10、30或50mg/ml的溶解度。
81.根据实施方案80所述的化合物，其中所述化合物在Tris缓冲液体系中在pH8.0下具有30mg/ml的溶解度。
82.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1化合物与SEQ IDNO:1的MIC-1相比在pH 8.0下显示出降低的晶体形成趋势。
83.根据实施方案82所述的化合物，其中所述晶体形成趋势在Tris缓冲液体系中在pH 8.0下进行测量。
84.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有低免疫原性风险。
85.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述化合物与SEQ ID NO:1的MIC-1相比具有改善的降低食物摄入和/或减轻体重的体内效力。
86.根据实施方案1-85中任一项所述的化合物，其用作药物。
87.根据实施方案1-85中任一项所述的化合物，其用于预防和/或治疗代谢失调。
88.根据实施方案87所述的化合物，其用于预防和/或治疗代谢失调，其中所述代谢失调是肥胖症、2型糖尿病、血脂异常或糖尿病肾病。
89.根据实施方案1-85中任一项所述的化合物，其用于预防和/或治疗饮食失调，如肥胖症。
90.根据实施方案89所述的化合物，其用于通过减少食物摄入、减轻体重、抑制食欲和/或诱导饱腹感来预防和/或治疗肥胖症。
91.根据实施方案1-85中任一项所述的化合物，其用于预防和/或治疗心血管疾病。
92.根据实施方案91所述的化合物，其用于预防和/或治疗血脂异常、动脉硬化、脂肪性肝炎或糖尿病肾病。
93.药物组合物，其包含根据实施方案1-85中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐、酰胺或酯以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
94.根据实施方案1-85中任一项所述的化合物在制备用于预防和/或治疗代谢失调的药物中的用途，其中所述代谢失调是肥胖症、2型糖尿病、血脂异常或糖尿病肾病。
95.根据实施方案1-85中任一项所述的化合物在制备用于预防和/或治疗饮食失调的药物中的用途。
96.根据实施方案1-85中任一项所述的化合物在制备用于预防和/或治疗肥胖症的药物中的用途。
97.根据实施方案1-85中任一项所述的化合物在制备通过减少食物摄入、减轻体重、抑制食欲和/或诱导饱腹感来预防和/或治疗肥胖症的药物中的用途。
98.根据实施方案1-85中任一项所述的化合物在制备用于预防和/或治疗心血管疾病的药物中的用途。
99.根据实施方案1-85中任一项所述的化合物在制备用于预防和/或治疗血脂异常、动脉硬化、脂肪性肝炎或糖尿病肾病的药物中的用途。
100.通过施用药学活性量的根据实施方案1-85中任一项所述的化合物来治疗和/或预防代谢失调的方法，其中所述代谢失调是肥胖症、2型糖尿病、血脂异常或糖尿病肾病。
101.通过施用药学活性量的根据实施方案1-85中任一项所述的化合物来治疗和/或预防饮食失调的方法。
102.通过施用药学活性量的根据实施方案1-85中任一项所述的化合物来治疗和/或预防肥胖症的方法。
103.通过施用药学活性量的根据实施方案1-85中任一项所述的化合物来减少食物摄入、减轻体重、抑制食欲和/或诱导饱腹感从而治疗和/或预防肥胖症的方法。
104.通过施用药学活性量的根据实施方案1-85中任一项所述的化合物来治疗和/或预防心血管疾病的方法。
105.通过施用药学活性量的根据实施方案1-85中任一项所述的化合物来治疗和/或预防血脂异常、动脉硬化、脂肪性肝炎或糖尿病肾病的方法。
106.编码根据实施方案1-85中任一项所述的化合物的多核苷酸分子。
实施例
缩写列表
“主峰”是指纯化色谱图中具有以毫吸光度(milliabsorbance)为单位的最高UV强度且含有融合蛋白的峰。
HPLC为高效液相色谱法。
SDS-PAGE为十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。
IMAC为固定化金属亲和色谱法。
SEC为大小排阻色谱法。
MS为质谱法。
在本说明书中，希腊字母可用其符号或相应的书面名称表示，例如：α＝alpha；β＝beta；ε＝epsilon；γ＝gamma；ω＝omega；Δ＝delta；等等。此外，希腊字母μ也可用“u”表示，例如在μl＝ul或μM＝uM中。
MIC-1化合物的设计
在本发明的一个方面，将MIC-1化合物设计为具有增加的溶解度。在本发明的一个方面，这通过向MIC-1多肽添加N端“酸性”延伸体来实现。在本发明的一个方面，通过修饰MIC-1多肽的氨基酸序列来增强溶解性并改善稳定性。例如，将延伸体添加至MIC-1多肽的N端，和/或在MIC-1多肽的氨基酸序列内进行修饰(序列内突变)。
N-延伸体设计
在N端氨基酸延伸体的设计中，将F、I、L、M、V、W和Y排除在外，因为它们可有助于蛋白质聚集。还排除了H、K和R，因为它们可在细胞膜上引起不希望的结合。针对N-延伸体序列优选A、E、G、P、S、T、D、N和Q。特别优选E和D，因为它们通过减小化合物的pI值而增加溶解度。特别地，对于一些N-延伸体，当MIC-1化合物在大肠杆菌中表达时，在最N端处添加一个或两个额外的丙氨酸，从而提高起始甲硫氨酸去除效率。
基于以上原则设计了各种N端氨基酸延伸体。一些N-延伸体包含源自人蛋白质的序列(人源化序列)；一些包含人工设计的序列(例如，GS、SG、AEE、AES、GEPQ(SEQ ID NO:123)、GEPS(SEQ ID NO:118))；一些包含人源化序列或人工序列的几个重复；一些包括上述的组合。设计了几种6个残基的序列(6-mer)。N-延伸体可包含一个或多个6-mer、6-mer的一部分(例如，6-mer的1-5个残基)或上述的组合。人工序列(包括6-mer)和人源化序列的氨基酸残基可以以任意顺序排列。
表2中列出了一些代表性的6-mer和6-mer的组合：
表2：6-mer和6-mer的组合
表3：N-延伸体的实例
序列内突变
MIC-1(SEQ ID NO:1)的某些内部残基例如通过置换来修饰。例如，为了提高MIC-1化合物的溶解度，MIC-1的疏水性残基可用亲水性残基置换，优选用酸性残基置换；带正电荷的残基可以用酸性残基置换，等等。为了减少氧化，甲硫氨酸可用其他氨基酸例如E、F或L置换。
用于提高溶解度的序列内突变包括但不限于：P11E、H18E、R21E、A30E、A47E、R53E、A54E、M57E、R67E、L68E、K69E、A75E、A81E、P85E、L105E和K107E。
用于减少氧化的序列内突变包括但不限于：M43L、M57E、M57L、M86F和M86L。
用于提高化学稳定性的序列内突变包括但不限于：R2S、R2A、N3S、N3E、N3A、N3T、N3P、N3G、N3V、N3H、N3Y和N3Q。
MIC-1化合物的pI计算
MIC-1化合物的经计算的pI被定义为在该化合物的净计算电荷为零时的pH。使用表1中描述的氨基酸残基的pKa值以及B.Skoog和A.Wichman(Trends in AnalyticalChemistry,1986,vol.5,pp.82-83)中所描述的方法获得MIC-1化合物随pH而变的计算电荷。半胱氨酸(Cys)的侧链pKa仅包括在针对具有游离巯基的半胱氨酸的电荷计算中。作为实例，呈同型二聚体的人wtMIC-1的经计算pI值为8.8。
在此，并且在通篇文件中，如果没有另外说明，对呈同型二聚体的MIC-1化合物进行MIC-1化合物的pI计算。
表4：包含N-延伸体和MIC-1(SEQ ID NO:1)/MIC-1类似物的MIC-1化合物的经计算的pI值
*“GEPQ”或“GEPS”的氨基酸残基可以以任何顺序排列
材料与方法
通用制备方法
实施例1：MIC-1化合物的表达和发酵
将MIC-1化合物的cDNA亚克隆至pET11b衍生的载体中。当细胞密度达到OD600为1.0时，通过0.5mM异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)在大肠杆菌中诱导MIC-1化合物作为包涵体的过表达。在37℃下在TB中连续生长20小时后，收获细胞并制备用于LC/MS和UPLC的样品从而确认分子量。
在作为补充物的限定化学成分培养基中经补料分批工艺进行发酵。发酵产率很大程度上取决于不同的化合物，该发酵产率在化合物间在1g/L至8g/L之间变化。
实施例2：纯化和重折叠：
MIC-1化合物进一步如下纯化：
对大肠杆菌在10mM Tris缓冲液pH 8.0中的浆液(20％w/v)进行超声处理(在冰上，开/关间隔3秒，持续5分钟)，并通过离心(10,000xg，30分钟)使MIC-1化合物沉淀。用含有8M尿素的20mM Tris pH8.0重新溶解包涵体，并通过离心(10,000xg，30分钟)除去残渣。收集所得上清液中的MIC-1化合物，并稀释至重折叠缓冲液(50mM Tris，pH 8.5和10％DMF或10％DMSO)中至终浓度为0.1mg/ml。重折叠过程在冷室中持续48小时。将所得溶液通过0.4μm过滤器过滤，并加载到使用Q Sepharose Fast Flow树脂(GE Healthcare)的疏水相互作用柱或阴离子交换色谱(50mM Tris pH 8.0，0-500mM NaCl)上，如ProteinPurification.Principles and Practice Series:Springer Advanced Texts inChemistry Scopes,Robert K.第3版,1994(第6章和第8章)中所概述。在一些情况下，使用以50mM Tris pH 8.0和200mM NaCl运行的HiLoad26/60Superdex pg 75柱(GEHealthcare)，通过大小排阻色谱法进行进一步纯化。为了储存，将MIC-1化合物转移至DPBS，并冷冻储存。
表5：合成的MIC-1化合物或MIC-1类似物及其根据实施例4测定的在Tris缓冲液中在pH 8下的最大溶解度
*N.D.：未确定
实施例3：本发明的MIC-1化合物的pH依赖性溶解度
本实验的目的是筛选具有改善的溶解度的MIC-1化合物，并确定制剂的最佳pH窗口。
将MIC-1化合物溶解于水和乙醇(60％水和40％乙醇)的混合物中，其浓度范围为3mg/ml至10mg/ml。用SpeedVac(Concentrator Plus,Eppendorf)蒸发溶剂6小时，得到所述MIC-1化合物的沉淀物。
以下缓冲液用于该pH依赖性溶解度曲线试验：乙酸盐缓冲液(pH 3至pH 6)；Tris缓冲液(pH 7至pH 9)；CAPS缓冲液(pH 10至pH 11)。
将缓冲液与MIC-1化合物一起添加至96孔板的每个孔中。所使用的量可以不完全相同，但均以12-18mg/ml内的理论浓度为目标。通过UPLC测定上清液中的MIC-1化合物的浓度(表6)。基于该结果，本发明的MIC-1化合物与wtMIC-1相比在pH 6-9下的溶解度显著改善。MIC-1化合物的最佳pH窗口落在针对制剂所优选的pH范围内，例如，pH 6.5-8.5。
表6：MIC-1类似物的pH依赖性溶解度测定(mg/ml)
实施例4：MIC-1化合物在pH8下的最大溶解度
为了测定最大溶解度，将MIC-1化合物溶解于水和乙醇(60％水和40％乙醇)的混合物中，其浓度范围为3mg/ml至10mg/ml。然后将溶液(每孔150μL)等分至96孔板(Corning)中。用SpeedVac(Concentrator Plus,Eppendorf)蒸发溶剂6小时，得到MIC-1化合物的沉淀物。将Tris缓冲液(pH 8.0，不含赋形剂)添加至96孔板的每个孔中。添加至孔中的缓冲液的量小于使孔中的全部沉淀物溶解所需的量，从而达到最大浓度。将板在板振荡器上以800rpm(MixMate,Eppendorf)振荡2小时。将沉淀物以3600g离心5分钟。将上清液转移到96深孔板中，并用40％乙醇稀释20倍。然后使所有样品经历UPLC(Acquity，Waters)、读板器(Infinite M200pro，Tecan)和UV光谱仪(NanoDrop 8000，Thermo Scientific)，从而确定浓度(表7)。
基于该结果，本发明的MIC-1化合物的溶解度在pH 8.0下显著改善。特别是，具有N-延伸体的MIC-1化合物在pH 8.0下达到了大于30mg/ml的溶解度。
表7：MIC-1化合物在pH 8.0下的最大溶解度测定
体外活性筛选通用方法
实施例5：BHK21-hGFRAL-IRES-hRET细胞系的建立
本实施例的目的是建立基于细胞的体外试验来测定MIC-1活性。转染哺乳动物细胞，其稳定表达全长MIC-1受体(hGFRAL)及其完整信号传导共同受体hRET51。
通过将编码全长hGFRAL和全长hRET51的合成DNA核苷酸插入哺乳动物表达载体pEL中来构建表达全长hGFRAL和全长hRET51的质粒。IRES(内部核糖体进入位点)是两个DNA序列之间常用的连接体，使得这两个DNA序列可同时被翻译成mRNA。pEL载体骨架由Taihegene CRO公司提供。
将2百万个BHK21细胞接种在10cm培养皿中，并在培养基(DMEM+10％FBS+1％PS)中培养过夜。用pEL-hGFRAL-IRES-hRET质粒转染细胞。将经转染的细胞以不同的密度分至新的10cm培养皿中，并在选择培养基(DMEM+10％FBS+1％PS+1mg/ml G418)中生长超过2周，获得单克隆。将单克隆转移至6孔板中并培养至100％汇合。通过qPCR测定hGFRAL和hRET的mRNA表达。挑取成功转染的克隆，并针对MIC-1结合对其进行检测(图15和表13)。
实施例6：基于细胞的MIC-1体外活性试验
wtMIC-1和MIC-1化合物在BHK21-hGFRAL-IRES-hRET稳定细胞中均诱导ERK1/2的磷酸化(表8)。从结果可以得出以下结论，MIC-1、GFRAL和RET的三元复合物使RET蛋白酪氨酸激酶发生磷酸化，从而通过ERK 1/2的磷酸化经由包含ERK/MAPK途径的信号途径来诱导MIC-1的体内活性。
表8中示出了使用BHK21-hGFRAL-IRES-hRET筛选MIC-1化合物的结果。仅具有N-延伸体的MIC-1化合物或仅具有序列内突变的MIC-1类似物达到的体外活性等于或甚至高于wtMIC-1。另外，N-延伸体和序列内突变的组合也可实现类似的活性。
表8：MIC-1化合物的体外活性
提高MIC-1的溶解度也可以通过MIC-1多肽与人血清白蛋白(HSA)的N端融合来实现。已知HSA融合可以提高MIC-1的溶解度。测定了两种这样的HSA-MIC-1融合蛋白的体外活性(表9)。
表9：HSA-MIC-1缀合物的pERK EC50
观察到显著的功效损失，因此证明这些具有高溶解度的MIC-1融合蛋白不保持受体功效。
体内效力
实施例7：瘦型Sprague Dawley大鼠中MIC-1化合物对食物摄入的影响
在9-11周龄的瘦型雄性Sprague Dawley大鼠中测定了本发明MIC-1化合物的体内效力。在黑暗期开始前1-2小时，向动物每日一次注射8nmol/kg体重(4nmol/kg，对于两种HSA-MIC-1融合蛋白)的剂量。皮下施用(1-4ml/kg)在合适的缓冲溶液中的化合物。通过自动食物监测系统(针对大鼠的BioDAQ系统和HM2系统)测量食物摄入的变化。在BioDAQ系统中，动物单独圈养；而在HM2系统中，动物分组圈养，每个笼子最多3只动物。每种化合物均在n＝4-8只动物中测试。在实验前，使动物适应环境至少7天。所收集的数据被表示为从每日12小时黑暗期开始至次日黑暗期所测量的每日食物摄入(24小时食物摄入)。通过治疗组的平均每日食物摄入减去媒介物组的平均每日食物摄入来计算食物摄入响应于所施用化合物的每日变化。使用双尾student t检验，如果p<0.1，则变化被视为是显著的。结果被表示为研究期间记录的食物摄入相对于媒介物的“最大减少”(百分比)。数据还被表示为食物摄入的“累积减少”，其为研究期间显著性(p<0.1)每日食物摄入减少(百分比)的总和。
表10：瘦型SD大鼠中MIC-1化合物的每日剂量(8nmol/kg)对食物摄入的影响
注：*表示施用剂量为4nmol/kg体重。
发明人惊奇地发现，这些MIC-1化合物不仅增加了溶解度分子，而且还导致与wtMIC-1相等或甚至更好的效力(表10)。例如，根据SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:106的化合物具有最大的和累积的体内效力，其比皮下给药的wtMIC-1大了40-50％。效力的增加还与溶解度的增加相关，因为根据SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105和SEQ ID NO:106的化合物与wtMIC-1相比均具有升高的溶解度和显著更高的体内效力。该相关性似乎不能通过体外Emax的变化来解释，因为表10中除了根据SEQ ID NO:105的化合物之外的所有化合物均具有与wtMIC-1相当的Emax。事实上，化合物SEQ ID NO:105具有比wtMIC-1更低的Emax，而其在体内仍然比wtMIC-1更有效。此外，体外功效在化合物之间是相当的，因为化合物均不具有与wtMIC-1不同的EC50。因此，增加的体内效力和增加的溶解度之间的关联性是令人惊讶的，并且不能简单地通过增加的体外受体激活的变化来解释。
实施例8：不同12-mer单元的MIC-1表达和起始Met去除效率
在人体中，N-甲酰基-甲硫氨酸被免疫系统识别为外来物质，或者由受损细胞释放的警告信号，并且刺激身体对抗潜在的感染(Pathologic Basis of VeterinaryDisease5:Pathologic Basis of Veterinary Disease,By James F.Zachary,M.DonaldMcGavin)。此外，甲硫氨酸是易被氧化的不稳定残基。因此，N-Met切割效率对MIC-1表达非常重要。
有4种不同类型的12mer，并且它们均由3个Ser、2个Pro、2个Gly、2个Thr、2个Glu和1个Ala组成。然而，在每个重复中这12个残基以不同方式排列。
关于不同的12mer对表达水平和N-Met切割效率的影响知之甚少。因此，对分别以单和双12mer起始的MIC-1化合物进行系统研究是非常必要的。
将MIC-1化合物的cDNA亚克隆至pET11b衍生的载体中。当细胞密度达到OD600为1.0时，通过0.5mM异丙基β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)在大肠杆菌中诱导MIC-1化合物作为包涵体或可溶性蛋白质的过表达。在37℃下在TB中连续生长20小时后，收获细胞并在缓冲液A(20mM Tris，pH 8.0)中进行超声处理。将所得混合物以10,000g离心20分钟，并且通过LC/MS和SDS-PAGE进行分析以确认分子量。
在作为补充物的限定化学成分培养基中经补料分批工艺进行发酵。发酵产率很大程度上取决于不同的化合物，该发酵产率在化合物间在1g/L至8g/L之间变化。
在表11和图1中示出了针对单12mer试验所设计的化合物和结果。
表11：单12-mer结构单元的初始Met去除效率
N/A：表示具有N-延伸体的MIC-1不在大肠杆菌中表达。
表12中列出了带有双12mer的化合物，并且也示出了结果(参见表12和图2)。
表12：双12-mer结构单元的初始Met去除效率
N/A：表示具有N-延伸体的MIC-1不在大肠杆菌中表达。
总之，以12mer-1单元开始的N-延伸体不能在大肠杆菌中表达。对于其他12mer单元，实现了蛋白质表达，但仅有作为初始序列的12mer-4导致完全的甲硫氨酸切割。此外，12mer-2系列的N-met切割效率优于12mer-3系列。
实施例9：具有2*或2.5*12merN-延伸体的MIC-1肽化合物的表达水平和包涵体比率
(1)具有2.5*12mer N-延伸体的MIC-1肽化合物的表达
蛋白质生产方法见实施例8。结果在表13、图3和图4中示出。
表13：用于2.5*12mer试验的构建体和蛋白质生产
注：“.6”表示12mer的前6个氨基酸，“末位”表示12mer的最后6个氨基酸，“内部”表示12mer的内部6个氨基酸。
尽管延伸的12mer(6个氨基酸)使24个氨基酸远离N端，但MIC-1化合物的表达水平在不同组之间变化很大。显然，来自12mer-1的片段不适于表达，这与之前的结果一致。12mer-(4+_+3.6)和12mer-(4+_+4.6)的平均表达水平相对高于其他。
(2)具有2*或2.5*12mer N-延伸体的MIC-1化合物的包涵体比率
对于大规模蛋白质生产，包涵体通常被视为良好的选择，这主要是由于它更好的放大性能，主要包括：高表达水平、简单的回收步骤和高纯度、蛋白酶抗性和良好的工艺稳定性。
MIC-1化合物可作为包涵体或可溶形式表达，这主要取决于化合物的pI和延伸长度。结果在表14和图4中示出。
表14：MIC-1化合物在细胞胞质溶胶中的溶解度及其pI值
注：★此处的数值是通过SDS-PAGE估算的
具有序列内突变的MIC-1化合物的溶解度在表15和图5中示出(骨架为MIC-1 del(1-3))。
表15：具有序列内突变的MIC-1化合物的溶解度
研究了以12mer-(4+2+_)、12mer-(4+4+_)和12mer-(4+3+_)开始的MIC-1化合物表达包涵体的能力。结果表明，当pI>5.1时，包涵体比率>90％。此外，具有序列内突变M57E/H66E的MIC-1化合物主要表达可溶性部分。

Claims (15)

1.MIC-1化合物，其包含MIC-1多肽和N端氨基酸延伸体，其中所述延伸体由3至36个氨基酸残基组成，并且其中所述化合物具有低于6.5的经计算的pI。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物是同型二聚体，并且由218-296、224-296或230-296个氨基酸残基组成。
3.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述延伸体的长度在3-36、3-30、3-24、3-12、4-36、4-30、4-24、4-12、5-36、5-30、5-24、5-12、6-36、6-30、6-24、6-12、7-36、7-30、7-24、7-12、8-36、8-30、8-24、8-12、30-36、32-36、30-34或30-32个氨基酸残基的范围内。
4.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述延伸体具有与碱性氨基酸残基(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)数目相比至少过剩3、4、5或6个的酸性氨基酸残基(天冬氨酸和谷氨酸)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述延伸体由选自A、E、G、P、S、T、Q和D的氨基酸残基组成，并且其中所述延伸体包含至少三个E和/或D氨基酸残基。
6.根据权利要求5所述的化合物，其中所述延伸体包含6个Ser、4个Pro、4个Gly、4个Thr、4个Glu和2个Ala。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中所述延伸体包含一个或多个以下序列：
SPAGSP(SEQ ID NO:4)、
TSESAT(SEQ ID NO:5)、
TSTEPE(SEQ ID NO:6)、
SEPATS(SEQ ID NO:7)、
TSTEEG(SEQ ID NO:8)、
PESGPG(SEQ ID NO:9)、
SGSAPG(SEQ ID NO:10)、
GSETPG(SEQ ID NO:11)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO:12)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO:13)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO:14)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSP(SEQ ID NO:15)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSP(SEQ ID NO:16)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSP(SEQ ID NO:17)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESAT(SEQ ID NO:18)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESAT(SEQ ID NO:19)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESAT(SEQ ID NO:20)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPE(SEQ ID NO:21)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPE(SEQ ID NO:22)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPE(SEQ ID NO:23)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSEPATS(SEQ ID NO:24)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATS(SEQ ID NO:25)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATS(SEQ ID NO:26)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEEG(SEQ ID NO:27)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEEG(SEQ ID NO:28)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEEG(SEQ ID NO:29)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGPESGPG(SEQ ID NO:30)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGPESGPG(SEQ ID NO:31)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGPESGPG(SEQ ID NO:32)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSGSAPG(SEQ ID NO:33)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSGSAPG(SEQ ID NO:34)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSGSAPG(SEQ ID NO:35)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGGSETPG(SEQ ID NO:36)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGGSETPG(SEQ ID NO:37)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGGSETPG(SEQ ID NO:38)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPS(SEQ ID NO:70)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPSEG(SEQ ID NO:71)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSESATPESGPG(SEQ ID NO:39)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO:40)、
SEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO:41)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO:42)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO:43)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO:44)、
SEPATSGSETPGTSESATPESGPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO:45)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO:46)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO:47)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO:48)、
SEPATSGSETPGTSTEPESGSAPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO:49)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSPAGSPTSTEEG(SEQ ID NO:50)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSESATPESGPG(SEQ ID NO:51)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGTSTEPESGSAPG(SEQ ID NO:52)、
SEPATSGSETPGSEPATSGSETPGSEPATSGSETPG(SEQ ID NO:53)、
GGGS(SEQ ID NO:136)、
GSGS(SEQ ID NO:137)、
GGSS(SEQ ID NO:138)和
SSSG(SEQ ID NO:139)。
8.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中所述延伸体包含一个或多个以下序列：
GEPS(SEQ ID NO:118)、
GPSE(SEQ ID NO:119)、
GPES(SEQ ID NO:120)、
GSPE(SEQ ID NO:121)、
GSEP(SEQ ID NO:122)、
GEPSGEPSGEPSGEPSGEPS(SEQ ID NO:140)、
GPSEGPSEGPSEGPSEGPSE(SEQ ID NO:141)、
GPESGPESGPESGPESGPES(SEQ ID NO:142)、
GSPEGSPEGSPEGSPEGSPE(SEQ ID NO:143)、
GSEPGSEPGSEPGSEPGSE(SEQ ID NO:144)、
GEPQ(SEQ ID NO:123)、GEQP(SEQ ID NO:124)、
GPEQ(SEQ ID NO:125)、GPQE(SEQ ID NO:126)、
GQEP(SEQ ID NO:127)、GQPE(SEQ ID NO:128)、
GEPQGEPQGEPQGEPQGEPQ(SEQ ID NO:145)、
GEQPGEQPGEQPGEQPGEQP(SEQ ID NO:146)、
GPEQGPEQGPEQGPEQGPEQ(SEQ ID NO:147)、
GPQEGPQEGPQEGPQEGPQE(SEQ ID NO:148)、
GQEPGQEPGQEPGQEPGQEP(SEQ ID NO:149)、
GQPEGQPEGQPEGQPEGQPE(SEQ ID NO:150)、
GGGS(SEQ ID NO:136)、
GSGS(SEQ ID NO:137)、
GGSS(SEQ ID NO:138)和
SSSG(SEQ ID NO:139)。
9.根据权利要求1-6中任一项所述的化合物，其中所述延伸体包含一个或多个以下序列：
PEDEETPEQE(SEQ ID NO:129)、
PDEGTEEETE(SEQ ID NO:130)、
PAAEEEDDPD(SEQ ID NO:131)、
AEPDEDPQSED(SEQ ID NO:132)、
AEPDEDPQSE(SEQ ID NO:133)、
AEPEEQEED(SEQ ID NO:134)、
AEPEEQEE(SEQ ID NO:135)、
AEEAEEAEEAEEAEE(SEQ ID NO:151)、
GGGS(SEQ ID NO:136)、
GSGS(SEQ ID NO:137)、
GGSS(SEQ ID NO:138)和
SSSG(SEQ ID NO:139)。
10.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽表现出与SEQ IDNO:1的MIC-1有至少85％、90％、95％或98％的序列同一性。
11.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽与SEQ ID NO:1的MIC-1相比包含一个或多个以下置换：N3E、P11E、H18E、R21E、A30E、A47E、R53E、A54E、M57E、M57L、H66E、R67E、L68E、K69E、A75E、A81E、P85E、M86L、Q90E、T92E、L105E和K107E。
12.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中所述MIC-1多肽与SEQ ID NO:1的MIC-1相比包含前三个残基的缺失(MIC-1-Δ1-3)或N3的缺失(des-N3)。
13.MIC-1化合物，其包含MIC-1多肽和N端氨基酸延伸体，其中所述化合物包含根据SEQID NO:100、104、106、107、108、109、111、112、113、114、115、116、117或164的氨基酸序列。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的化合物，其中所述化合物在Tris缓冲液体系中在pH 8.0下的溶解度为0.5、1.0、5.0、10、30或50mg/ml。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的化合物，其用于预防和/或治疗代谢失调，其中所述代谢失调是肥胖症、糖尿病、心血管疾病如血脂异常、动脉硬化、脂肪性肝炎或糖尿病肾病。
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