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KR20010099668A - 펩타이드의 효소적 아미드화 - Google Patents

펩타이드의 효소적 아미드화 Download PDF

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Publication number
KR20010099668A
KR20010099668A KR1020017004269A KR20017004269A KR20010099668A KR 20010099668 A KR20010099668 A KR 20010099668A KR 1020017004269 A KR1020017004269 A KR 1020017004269A KR 20017004269 A KR20017004269 A KR 20017004269A KR 20010099668 A KR20010099668 A KR 20010099668A
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KR
South Korea
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glp
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amino acid
based medium
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KR1020017004269A
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도마디댄
스타우트제이에스.
스트리덤다니엘제이.
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와그너프레드더블유.
Original Assignee
추후보정
바이오네브라스카, 인코포레이티드
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Publication date
Application filed by 추후보정, 바이오네브라스카, 인코포레이티드 filed Critical 추후보정
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/575—Hormones
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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Abstract

본 발명은 C-말단 알파-카르복사마이드 그룹을 갖는 폴리펩타이드를 생산하는 방법를 제공한다. 그것은 특히 알파-카르복사마이드 그룹(C-말단 "Arg-NH2")을 갖는 C-말단 아르기닌 잔기를 갖는 펩타이드 산물을 형성하는 기질 폴리펩타이드의 절단에 이르게 하는 선택된 기질 폴리펩타이드의 효소적 변형과 관련된다. 본 방법은 (ⅰ)암모니아 시약 그리고 (ⅱ)기질 폴리펩타이드를 포함하는 수성-기초 용액을 (ⅲ)클로스트리페인과 접촉시키는 것을 포함한다.

Description

펩타이드의 효소적 아미드화{Enzymatic amidation of peptides}
시험관내(in vitro) DNA 조작시 숙주세포로 외부 유전정보를 이동시켜 미생물 숙주와 같은 광범위한 숙주세포에 있어서 내생의 그리고 외부의 단백질의 효과적인 발현을 유발시킬 수 있다. 재조합 DNA 기술은 단백질과 펩타이드의 선택, 증폭 그리고 조작을 가능하게 한다.
그러나, 재조합하여 생산한 단백질이나 펩타이드의 약간의 수식(modifications)은 DNA 서열을 변경함으로써 이루어질 수 없다. 많은 자연적으로 이루어지는 단백질과 펩타이드는 알파-카르복사마이드 그룹을 갖는 C-말단 아미노산 잔기를 포함하지만 그 아마이드 그룹은 발현을 통해 직접적으로 생산되지는 않는다. 대신 단백질 전구체가 유전자 발현으로 생산되고 아마이드는 단백질 전구체의 효소적 수식에 의해 생체내(in vivo)로 도입된다. 시험관내로 C-말단 알파-카르복실산 그룹을 알파-카르복사마이드 그룹으로 전환하기 위한 다양한 방법들이 존재하지만, 사용할 수 있는 방법들은 일반적으로 반응조건, 선택성, 쓰이는 시약의 형태 및/또는 사용되는 기질의 형태와 같은 많은 요소에 의해서 제한을 갖는다.
게다가, 많은 작은 외부 단백질과 올리고펩타이드는 숙주가 발현 후 펩타이드를 재소화할 수 있기 때문에 종종 성공적으로 대부분의 세포 숙주에서 과생산되어질 수 없다. 예를 들어, 원하는 펩타이드의 크기가 길이상 60에서 80 아미노산 유니트 이하인 경우에 최종산물 보다는 분해산물의 축적이 일반적으로 일어난다.
이러한 문제에 대응하여, 작은 펩타이드는 전형적으로 두 번째 거대 펩타이드(예, 베타-글루코시데이즈 또는 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼레이즈)를 포함하는 융합 단백질의 부분으로서 또는 원하는 펩타이드의 다수의 복사물(복수의 복사구조물)을 포함하는 재조합 구조물로서 발현된다. 어떠한 경우에도, 처음에 표현된 구조물은 일반적으로 원하는 펩타이드를 생산하기 위해서는 절단될 필요가 있다. 매우 자주, 재조합 구조물은 절단되어 펩타이드 전구체를 생산하고 그 펩타이드는 번역 후 수식되어 원하는 펩타이드를 생산한다. 펩타이드 전구체의 절단이 절단 산물의 C-말단 아미노산 잔기로 알파-카르복사마이드 그룹의 도입과 동시에 이루어 지도록 허여하는 부가적 방법을 갖는 것은 매우 유용할 것이다.
본 발명은 C-말단 알파-카르복사마이드 그룹을 갖는 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 37oC, pH 7.9의 1M NH4OH, 2.5mM DTT, 1mM CaCl2에서 GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO:1)의 클로스트리페인 촉매 아마이드화에 대한 시간의 함수로서 출발 물질과 생산물의 상대적인 양의 그래프를 보여준다.
도 2는 37oC, pH 9.0의 1M NH4OH, 2.5mM DTT, 1mM CaCl2에서 GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO:1)의 클로스트리페인 촉매 아마이드화에 대한 시간의 함수로서 출발 물질과 생산물의 상대적인 양의 그래프를 보여준다.
도 3은 37oC, pH 9.6의 1M NH4OH, 2.5mM DTT, 1mM CaCl2에서 GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO:1)의 클로스트리페인 촉매 아마이드화에 대한 시간의 함수로서 출발 물질과 생산물의 상대적인 양의 그래프를 보여준다.
도 4는 37oC, pH 10.4의 1M NH4OH, 2.5mM DTT, 1mM CaCl2에서 GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO:1)의 클로스트리페인 촉매 아마이드화에 대한 시간의 함수로서 출발 물질과 생산물의 상대적인 양의 그래프를 보여준다.
도 5는 37oC, pH 11.0의 1M NH4OH, 2.5mM DTT, 1mM CaCl2에서 GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse (SEQ ID NO:1)의 클로스트리페인 촉매 아마이드화에 대한 시간의 함수로서 출발 물질과 생산물의 상대적인 양의 그래프를 보여준다.
도 6은 효소의 고정형을 사용하는 클로스트리페인 촉매의 아마이드화 계열에서 유속의 함수로서 GLP-1(7-36)NH2의 수득율의 그래프를 보여준다.
도 7은 고정된 클로스트리페인을 사용하는 아르기닌-함유 펩타이드의 효소적 아마이드화를 실행하기 위한 장치의 도식적 표현을 보여준다.
본 발명은 C-말단 알파-카르복사마이드 그룹을 갖는 폴리펩타이드를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 특히 기질 폴리펩타이드가 절단하여 C-말단 알파-카르복사마이드그룹을 갖는 폴리펩타이드 산물을 형성하는 선택된 아르기닌-함유 기질 펩타이드의 효소적 수식에 관한 것이다. 본 방법은 (a)기질 폴리펩타이드("제 1 폴리펩타이드") 및 (b)암모니아 시약을 포함하는 실질적인 수용액을 (c)클로스트리페인(clostripain)과 접촉하는 것을 포함한다. 기질 폴리펩타이드는 적어도 코어 아미노산 서열의 하나의 카피를 포함하고 전형적으로 코어 아미노산 서열의 하나 이상의 카피를 포함한다(예, 복수카피 구조물). 코어 아미노산 서열의 C-말단 잔기는 인접한 아미노산 잔기에 알파-카르복실 펩타이드 결합(예, "Arg-Xaa" 펩타이드 결합)을 통해서 결합한다. 클로스트리페인은 엔도펩티데이즈이기 때문에 Xaa아미노산 잔기는 알파-카르복실 그룹이 펩타이드 결합("Arg-Xaa-Xaa,")을 통해서 다른 아미노산 잔기 또는 카르복실 차단 그룹("Arg-Xaa-R")에 결합되는 알파-카르복실 그룹을 갖는 아미노산 잔기를 나타낸다. 카르복실 차단 그룹들은 카르복실산의 산의 기능(-C(O)OH 그룹의 -"OH"부분)을 대신하는 유기의 기능적 그룹이어서 절단 혹은 가수분해되어 카르복실산 그룹("-C(O)OH그룹")을 재생산할 수 있다. 적절한 카르복실산 차단 그룹의 예에는 에스테르 그룹의 알콕시 부분(예, -C(O)OR그룹의 에톡시 혹은 벤질옥시 부분)과 비-펩타이드 아마이드 연결의 -NRR'부분(예, -C(O)NRR'그룹의 NRR'부분)을 포함한다. NRR'부분은 치환되지 않을 수도 있고(예, NH2) 또는 하나 또는 두 개의 치환기(예, NHEt 혹은 NMe2)로 치환될 수도 있다. 수성-기초 용액에 그러한 기질 폴리펩타이드가 클로스트리페인 존재하에 암모니아 시약과 접촉시, 기질 폴리펩타이드는 아르기닌 잔기의 알파-카르복실 펩타이드 결합에서 절단되어 알파-카르복사마이드 그룹("Arg-NH2)을 함유하는 C-말단 아르기닌 잔기를 갖는 두 번째 폴리펩타이드("폴리펩타이드 산물)가 생산된다.
여기에서 이용되었듯이 , 용어 "암모니아 시약"은 "용해된 유리 암모니아"(즉, 수용액에 용해된 NH3)를 포함하거나 및/또는 클로스트리페인이 아르기닌-함유펩타이드를 절단하는 상태 하에서 수용액에 유리의 용해된 암모니아를 분비할 수 있는 시약을 말한다. 예를 들면, 암모니아 시약은 용해된 평형상태에서 유리 암모니아와 함께 하는 암모니아의 하나이상의 염을 포함한다. 유리 암모니아와 그 다양한 염들의 상대적인 양은 일반적으로 용액의 pH, 용액에 존재하는 다른 음이온들의 상대적 농도, 및/또는 암모니아의 특정 염의 농도와 같이 그 기술분야에 숙달된 사람들에게 잘 알려진 여러 파라미터들의 함수가 될 것이다. 암모니아의 pKa는 수용액에서 약 9.2이기 때문에, 암모니아 시약의 실질적인 부분이 9 또는 그 이상의 pH에서 일반적으로 유리 암모니아로 존재할 것이다. 암모니아의 pKa이상의 pH를 갖는 용액에서 암모니아의 반 이상이 일반적으로 용해된 유리 암모니아나 수산화암모늄("NH4OH")으로 존재할 것이다. 암모니아염의 음이온 부분은 일반적으로 주어진 용액에 존재하는 다른 음이온과 매우 빠른 교환을 하는 것으로 또한 이해되어질 것이다. 그러므로, pH10.0인 수용액이 클로라이드염("Cl-"), 아세테이트염("OAc-") 그리고 설페이트염("SO4-")을 함유한다면, 이 용액에 있는 암모니아시약은 용해된 유리 암모니아와 수산화암모늄("NH4OH")뿐만 아니라, 암모늄클로라이드("NH4Cl"), 암모늄아세테이트("NH4OAc"), 그리고 암모늄설페이트 ("(NH4)2SO4")를 함유할 것이다. 본 방법은 전형적으로 적어도 약 0.5M 암모니아 시약을 함유하는 수성-기초 반응 매체를 이용한다. 약 0.75M에서 1.5M의 암모니아 시약 농도는 효소 활성의 실질적 억제를 막는 동안 아마이드화된 산물 형성의 비율과 수득율을 최적화하는 것 사이의 균형을 깨뜨린다고 나타난다. 여기에서 이용되듯이, 암모니아 시약의 농도는 매체에 존재하는 유리 용해된 NH3의 평형에 기초한다.
본 방법의 한 구체예는 약 8.5이하의 pH를 갖고 바람직하게는 실질적 중성인 pH를 갖는 제 1 수성-기초 매체에 기질 폴리펩타이드의 용액을 형성하는 것을 포함한다. 기질 폴리펩타이드는 적어도 9.0 그리고 전형적으로는 약 9.0에서 약 11.0사이로 용액의 pH를 조절하고 기질 폴리펩타이드를 암모니아 시약의 존재하에서 고정된 형태의 클로스트리페인("고정된 클로스트리페인")과 접촉시킴으로써 알파-카르복시 펩타이드 결합에서 절단하여 C-말단 Arg-NH2잔기를 갖는 폴리펩타이드 산물을 형성할 수도 있다. 기질과 암모니아 시약은 바람직하게는 약 20분 이하동안 그리고 더 바람직하게는 약 5분 이하동안 고정된 클로스트리페인과 접촉한다.
전형적으로, 제 1 수성-기초 매체는 염기성 수용액("알칼리 매체")과 혼합하여 기질 폴리펩타이드와 암모니아 시약이 고정된 클로스트리페인과 접촉하기 직전에 pH를 올린다. 본 발명의 이런 구체예를 실시하는 하나의 방법은 크로마토그래피 칼럼에 고정된 클로스트리페인을 함유하는 레진(resin)을 채우는 것이다. 기질 스탁용액(stock solution)과 염기성 용액을 칼럼에 도입하기 전에 혼합하여 높은 pH 수용액에 기질 폴리펩타이드의 노출을 최소화 한다. 본 발명의 전형적인 구체예에서 염기성 수용액은 암모니아 시약을 함유한다. 그러나 약간의 혹은 모든 암모니아 시약이 반응 매체의 pH를 적어도 약 9.0까지 올리기 전에 반응 매체에 또한 존재할수도 있기 때문에 이러한 것은 요구되지 않는다.
일반적으로, 폴리펩타이드 산물을 고정된 효소와의 접촉으로부터 제거한 직후 반응 혼합물의 pH를 약 8.5이하의 수치 그리고 바람직하게는 실질적 중성인 pH(예, 약 6.5에서 8.0의 pH)로 맞추는 것이 바람직하다. 전형적으로, 혼합물이 고정된 클로스트리페인을 갖는 레진층을 포함하는 칼럼을 빠져나오자마자 폴리펩타이드 산물을 포함하는 반응 혼합물의 pH를 약 8.5 혹은 그 이하로 낮춘다. 이것은 클로스트리페인 촉매의 아마이드화 절단을 위해 이용한 상대적으로 높은 pH 수성 상태하에서 폴리펩타이드 산물이 분해되는 기회를 줄인다. 폴리펩타이드는 높은 pH 수성 상태하에서 라세미화 및/또는 가수분해에 의한 분해가 되기 쉽다고 알려져 있다.
기질과 생산물이 높은 pH 상태에 놓여지는 시간의 양을 최소화하기 위해 기질 폴리펩타이드가 암모니아 시약의 존재하에서 고정된 클로스트리페인과 접촉하는 상태를 선택하는 것이 전형적으로 유리하다. 본 방법은 기질과 생산물의 용액이 고정된 효소와 약 8.5이상의 pH에서 약 30분 이하의 시간동안 접촉하도록 제한하여 아마이드화 절단 생산물로의 기질의 높은 전환을 허용하는 방법으로 행해질 수 있다. 바람직하게 아미드화 절단은 기질/생산물 용액이 pH 8.5 혹은 그 이상에서 20분 이하동안 그리고, 보다 바람직하게는 약 5분 이하동안(예, 절단반응은 약 2-5분 동안 행해진다) 존재하는 방법으로 행해진다.
본 방법은 아르기닌 잔기를 함유하는 기질 펩타이드의 아마이드화 절단을 허용하여 알파-카르복사마이드 그룹을 갖는 C-말단 아르기닌 잔기("C-말단 Arg-NH2")를 갖는 펩타이드를 형성하도록 한다. 본 방법은 기질 펩타이드가 클로스트리페인 존재 하에 실질적인 수용액에서 암모니아 시약과 접촉하게 하는 것을 포함한다. 효소는 가용성 또는 고정형의 어느 하나로 존재한다.
여기에서 이용되었듯이, "클로스트리페인"이란 용어는 자연적인 다양한 효소와 그것들의 수식된 형태를 포함한다. 그 수식된 형태는 Arg-Xaa 펩타이드 결합에서 펩타이드를 함유하는 아르기닌을 아미드화하여 절단하는 클로스트리페인의 기능적 능력을 유지한다. 적절히 수식된 클로스트리페인의 예는 하나 혹은 그 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삭제 및/또는 부가에 의해 천연의 클로스트리페인과 다른 기능적 돌연변이체를 포함한다. 적절히 수식된 형태의 클로스트리페인의 다른 예는 아마이드화 하여 아르기닌-함유 펩타이드를 절단하는 능력을 유지하는 클로스트리페인의 기능적 조각, 예를 들어 많은 아미노산 잔기를 효소의 구성 하위단위의 하나 혹은 그 이상의 아미노- 및/또는 카르복실 말단으로부터 제거함으로써 생산된 천연 클로스트리페인의 기능적인 활성 조각을 나타내는 폴리펩타이드를 포함한다.
천연 클로스트리페인 (클로스트리펩티다아제B)은 클로스트리디아 (Clostridia)로 부터의 세포외 티올 엔도프로테아제(thiol endoprotease)이다. 이 프로테아제는 헤테로다이머이고 다른 알려진 티올 프로테아제와 동족이 아니다. 이 효소는 분자량 30,000에서 80,000이라고 보고되어 졌고 전형적으로 약 4.8에서 4.9의 등전점을 갖는다. 클로스트리페인은Clostridium histolyticum(Michael 등,J. Biol. Chem,243(18):4683-2602(1968))배양 여과액으로부터 처음 분리되었다. 그 효소는 Arg-Xaa 펩타이드 연결(특히 Arg-Pro 연결)에 대한 높은 특이성에 의해 구별되고 단백분해 활성과 아미데이즈/에스터레이즈 활성을 모두 갖는다. 예를 들어, 인슐린의 분리된 B 체인에서 클로스트리페인은 Lys-Ala 연결보다 Arg-Gly 연결을 500배 빨리 절단하고 글루카곤에서는 Arg-Arg, Arg-Ala 그리고 Lys-Try 결합에서만 절단이 일어난다. 이러한 세 개의 결합들의 상대적 초기 속도 는 1, 1/7 그리고 1/300이다(Labouesse,Soc. Chem. Biol,42:1293(1960)).
클로스트리페인의 활성은 다양한 활성화제와 억제제에 의해 조절된다고 알려져 있다. 클로스트리페인의 활성화제의 예는 칼슘이온과 시스테인, 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 그리고 다티오트레이톨(dithiothreitol)과 같은 머캅탄(mercaptan)을 포함한다. 클로스트리페인은 또한 토실-L-라이신 클로로메칠 케톤(tosyl-L-lysine chloromethyl ketone), 과산화수소, Co2+, Cu2+, Hg2+또는 Cd2+이온, DETA, 또는 시트레이트(citrate)의 존재하에 억제된다고 알려져 있다.
클로스트리페인은 미생물을 이용한 발효, 예를 들어 참조로 여기에 통합되는 개시물인 미국 특허 5,728,543에 기술된 방법을 사용하여 제조될 수도 있다. 이 과정에서,Clostridia는 클로스트리페인이 영양배지에 축적될 때까지 배양된다. 적절한 예는Clostridium histolyticum DSM 627과 같은Clostridia종들이다.Clostridia의 변형체와 이형체들은 그 미생물들이 클로스트리페인을 합성할 수 있는 한, 적절하다.
배양은 전형적으로 혐기적으로, 단독 혹은 혼합 배양으로 예를 들면 질소와 같은 불활성 가스의 대기 하에 적절한 곳에서 산소가 없는 비-교반 배양액에서 또는 배양기에서 이루어 진다. 발효는 일반적으로 약 25℃에서 40℃의 온도, 그리고 pH 5에서 8.5 사이의 범위에서 이루어 진다. 배양 브로쓰(broth)는 일반적으로 1에서 3일 후에 탐지할 수 있는 효소의 축적을 보여준다. 클로스트리페인의 합성은 늦은 로그 성장 모양으로 시작하고 고정된 성장 형태에서 최대에 이른다. 효소의 생산 뒤에는 활성 분석의 방법(예, Mitchell,Meth. Enzym.:47:165-170(1997))이 따를 수 있다. 최적의 발효 상태가 각각의 미생물에 대해서 다르다 하더라도, 적절한 상태는 그 기술분야의 숙달된 사람에게 이미 알려져 있거나 이전의 시험에서 쉽게 정립될 수도 있다. 클로스트리페인은 배양 여과액으로부터 분리되어 예를 들어, 메탄올이나 황산 암모늄 침전, 이온 교환 혹은 겔 투과 크로마토그래피와 같은 고전적인 처리에 의해서 정제될 수 있다. 재조합하여 생산된 효소의 형태들(Witte 등,Microbiology, 140(5), 1175-1182(1994))은 또한 알려져 있고 그런 효소들이 Arg-Xaa 펩타이드 연결에서 선택적인 아미드화 절단을 할 수 있는 한, 본 발명의 방법에 적용될 수 있다.
클로스트리페인은 전형적으로 머캅탄(티올("-SH")기능기를 포함하는 화합물)과 같은 환원제로 처리하여 본 발명의 아미드화 절단반응에 적용되기 전에 활성화 된다. 적절한 환원제의 예에는 디티오트레이톨(dithiothreitol)("DTT"), 이티오에리트리톨("DTE"), 2-머캅토에탄올, 티오글리콜산, 시스테인 등이 있다. 클로스트리페인을 활성화시키기 위해 사용되는 머캅탄은 예를 들어 약 0.05mM과 약 100mM의 사이와 같이 넓은 범위에 걸쳐 변화할 수 있다. 바람직하게, 아미드화 절단 반응을 위한 본 효소의 활성은 약 0.1에서 5mM의 머캅탄(예.DTT)을 함유하는 수용액에서이루어 진다. 이런 방법 및/또는 아래에서 기술하는 칼슘이온 공급의 부가에 의해 활성화된 효소는 직접 사용하거나 크로마토그래피 또는 투석에 의해 활성 완충액으로부터 적절한 곳에서 제거할 수 있다.
클로스트리페인은 또한 칼슘이온(Ca2+이온)에 의해 활성화되기 때문에, 아미드화 절단반응에 이용되는 클로스트리페인을 함유하는 수용액은 전형적으로 CaCl2와 같은 Ca2+이온의 공급원을 포함한다. 예를 들면, 클로스트리페인은 약 0.01에서 2mM의 CaCl2를 함유하는 수용액으로서 이용된다. 그러나, 위에서 가리킨 바와 같이, 클로스트리페인은 본 발명의 이용에 앞서 Ca2+이온에의 노출에 의해 활성화되어 질 수도 있다.
이 출원에서, 아미노산 잔기를 위한 표준 단일 문자와 세 개의 문자 약어(37 C.F.R. 1.822를 보라)가 사용된다. 약어 "Hse"는 호모세린 락톤 및/또는 호모세린을 말한다. 이것은 예를 들어 펩타이드의 시아노겐 브로마이드 절단에서 시아노겐 브로마이드와 메치오닌 잔기의 반응에 의해 생산될 수 있는 두가지 형태의 아미노산 잔기의 혼합물을 나타낸다. 호모세린과 그것의 락톤은 평형 생산물의 혼합물로서 존재한다. 두 형태의 상대적인 양은 더 높은 pH에서는 유리 산(호모세린)의 형태가 선호되는 pH의 함수로서 변화할 것이다.
아미드화 절단 반응을 수행하기 위해 사용되는 수용성 배지는 우세하게 물로 구성되어 있지만, 그 배지는 약간의 물과 혼합될 수 있는 유기용매를 포함할 수 있다. 적절한 물과 혼합할 수 있는 유기용매의 예에는 알콜(메탄올, 에탄올, 1,4-부탄디올 그리고 트리플루오로에탄올과 같은), 케톤, 요소, 아미드(N,N-디메칠포름아미드("DMF"), N,N-디메칠아세트아미드("DMA"), 그리고 N-메칠피롤리디논("NMP") 같은), 카보네이트(프로필렌 카보네이트와 같은) 그리고 에테르(테트라하이드로 퓨란과 같은) 그리고 아세토니트릴이 있다. 수용성 배지가 일반적으로 20%(v/v)이하의 유기용매(즉, 20부피% 유기용매)를 포함하는 동안, 수용성 배지에 있는 유기용매의 존재는 클로스트리페인의 아미드화 활성은 저하시키는 반면, 단백분해 활성은 증강시키는 경향이 있다. 따라서, 본 아미드화 절단 반응은 전형적으로 상대적으로 낮은 수준의 유기 용매 이하를 포함하는 수용성 배지에서 행해진다. 전형적으로 수용성 반응배지는 10%(v/v)이하 그리고 보다 바람직하게는 5%(v/v)이하의 유기용매를 함유한다. 클로스트리페인의 가장 선호되는 아미드화 활성과 단배분해 활성의 비율은 유기용매가 실질적으로 없는, 즉, 약 1%(v/v)이하의 유기용매를 포함하는 수용성 배지에서 전형적으로 관찰되는 반면에, 많은 경우에 배지에서 소량의 유기용매를 함유하는 것이 유리할 수도 있다. 수용성 배지에 포함될 수 있는 특히 적절한 유기용매의 예에는 프로필렌 카보네이트, 아세토니트릴, 그리고 에탄올이 있다.
게다가 비록 아미드화 절단 반응의 온도가 넓은 범위 안에서 변화한다 할 지라도, 약 40℃에서 80℃ 사이의 반응온도가 전형적으로 적용된다. 바람직하게는 아미드화 절단반응은 20℃와 60℃ 사이의 온도에서 행해지고 약 25℃에서 50℃의 반응온도가 특히 적절하다. 본 아미드화 절단 반응은 전형적으로 적어도 약 9.0의 pH를 갖는 수성-기초 배지에서 행해진다. 바람직하게는, 효소적 촉매 아미드화 절단반응은 약 9.0에서 11.0사이에서 행해지고, pH9.5와 pH10.5사이의 범위가 특히 적절하다.
기질 폴리펩타이드가 C-말단 Arg-NH2를 갖는 해당 폴리펩타이드 산물로 변하기 위해 요구되는 시간은 반응 조건에 따라 넓은 제한 안에서 변화할 수 있다. 예를 들어, 단일-상 용액 방법을 사용하여 행할 때, 30분과 6시간 사이의 반응시간이 편의를 이유로 일반적으로 선호되는 반면에 실질적인 전환이 15분과 48시간 사이에서 행해질 수 있다. 아미드화 절단을 기질과 암모니아 시약을 고정된 클로스트리페인과 접촉시킴으로써 행할 때, 5분 혹은 더 적은 시간 후에 실질적인 전환(예, 40% 혹은 더 높은 전환)이 일어나도록 조건을 선택할 수 있다. 그 기술분야의 숙달된 사람들에게 알려졌듯이, 반응속도는 기질, 암모니아 시약 그리고 효소의 농도, 반응온도, 반응배지의 pH 그리고 반응 배지의 유기용매의 존재 유무를 포함한 다양한 요소들에 의해 영향을 받는다. 그러한 파라미터들 중에 하나 이상을 원하는 반응속도와 반응시간을 이루기 위해 조정할 수 있다.
아미드화 절단 반응에서 전형적으로 적용되는 상대적으로 높은 pH 조건은 예를 들어, 가수분해 절단 반응 및/또는 이성체화를 통해서 펩타이드 분해에 이르는 경향이 있고 후자는 L-아미노산 잔기의 해당 D-이성질체("D-오염물")로 변환시킬 수 있다. 분해 속도는 반응 배지의 온도와 pH 뿐만 아니라 염, 용매 등에 의해 영향 받는다는 것이 알려져 있다. 예를 들면, 1M의 NH4OH를 포함하는 GLP-1(7-36)NH2의 pH10.5 수용액을 44시간 동안 45℃에서 있도록 할 때, 충분한 양의 펩타이드가D-오염물로 분해한다. 비슷한 용액을 44시간 동안 44℃에서 중성의 pH에서 있도록 할 때, 실질적으로 적은 분해(8% D-오염물)가 감지되었고 비슷한 용액을 -20℃와 4oC에서 비슷한 시간동안 있게 했을 때, 필수적으로 어떠한 분해도 관찰되지 않았다.
대조적으로, pH 약 4에서 8.4 사이의 물에 용해된 GLP-1(7-36)NH2용액을 -20oC에서 45oC에 걸쳐 비슷한 시간동안 유지시켰을 때, 필수적으로 D-오염물의 형성이 감지되지 않았다. 1M의 염화 암모늄 용액에서 GLP-1(7-36)NH2의 분해를 8.4에서 10.5의 여러 pH에서 시험하는 부가적인 실험으로 펩타이드는 상대적으로 pH 8.4에서 안정하다는 것을 증명하였다. 충분한 분해(9%)가 이러한 상태 하의 pH 9.4에서 관찰되었고 pH가 더 높아질수록 분해속도가 더 빨라진다는 것을 감지하였다. 이러한 결과는 아미드화된 펩타이드 산물의 상대적으로 높은 pH(예, pH＞9.5)로의 노출이 기질과 아미드화된 산물의 충분한 분해를 피하기 위해 최소화되어져야 한다는 것을 제안한다.
클로스트리페인 촉매 이미드화 절단에서 암모니아염(암모니아 시약), X가 예를 들어 하이드록사이드, 클로라이드, 아세테이트, 혹은 설페이트 같은 암모늄 이온의 반대이온인 NH4X의 농도를 변화시키는 것의 효과를 고정된 pH와 온도(pH10.0, 45oC)에서 또한 시험하였다. NH4Cl/NH4OH의 농도(수성 NH4OH 용액의 pH를 염산으로 10.0으로 맞춤으로써 생성되는)를 0.5M에서 1.0M로 증가시키면 상대적으로 높은 pH에서 생성되는 D-오염물의 양을 실질적으로 증가시키지 않고 바람직한 아미드화 절단 산물의 형성 속도와 수득율에 있어서 증가를 가져온다. NH4OH는 여기에서 암모니아의 수산화염을 가리키는데 사용된다. 이것은 예를 들어, 수산화암모늄의 상업적 형태로, 암모니아를 물에 용해시킴으로써 생산되고, 물에서 용해된 NH3의 수화물과 평형을 이루어 존재한다. 다시 말해서, 수산화암모늄은 "유리 용해된 NH3"와 평형을 이루는 NH4 +OH-의 혼합물이다. NH4Cl/NH4OH의 농도를 더 증가(약 2M까지)시켜도 아미드화 산물의 최대 수득율 또는 분해 산물의 양에 있어서 충분한 증가를 제공하지 않았다. 그러나, NH4Cl/NH4OH 농도를 1.0M에서 2.0M로 증가시킴으로써 아미드화 산물의 최대 수득율에 도달하는데 요구되는 시간은 거의 3배에 달하기 때문에 NH4Cl/NH4OH 농도을 더 높일수록 효소의 활성을 억제하는 것 같다. 그러므로, 약 1.0M(예, 약 0.75M에서 1.25M 까지)의 NH4Cl/NH4OH 농도는 효소 활성의 충분한 억제를 피하는 반면 아미드화 산물 형성의 속도와 수득율을 최적화하는 것 사이의 균형을 깬다. pH에 덜 민감하고 약 10 이상의 pH를 갖는 용액에서 더 활성이 있는 변형 클로스트리페인을 찾는 것이 가능할 수 도 있다. 더욱이, 암모늄 이온의 다른 반대 이온, 예를 들어 설페이트, 클로라이드는 아미드화에 적절하고 추론에 의해서 반대이온들은 이러한 이온에 한정되지 않는다. 전형적으로, 용액평형반응 때문에, NH4OH와 하나 이상의 암모니아염(예, NH4Cl 및/또는 NH4OAc) 그리고 유리 용해된 NH3의 혼합물로서 존재할 것이다.
본 발명의 택일적 구체예에서, 아미드화 절단반응은 반응물(기질 펩타이드와 암모니아 시약)을 함유하는 수용액을 고정된 클로스트리페인을 함유하는 현탁액이나 레진층과 접촉시키는 것과 같은 연속방식으로 행해질 수 있다. 클로스트리페인은 다양한 전통적인 방법으로 고정 서포트(support)에 커플될 수 있다. 예를 들어, 고정된 클로스트리페인의 제제는 아가로오스 겔이나 메타크릴레이트-기초 레진상에 서 트레실 혹은 알데하이드 그룹 또는 CNBr-활성화 아가로오스와의 반응을 통해서 제조되어 왔다. 이런 방법으로 제조된 레진은 부착 효소의 매우 다양한 양을 갖을 수 있다. 본 방법의 사용을 위해 적당한 전형적인 레진은 약 0.1에서 10mg/ml를 그리고, 바람직하게는 약 1에서 5mg/ml의 고정 클로스트리페인을 포함한다. 이러한 제제는 pH 10의 암모니아 존재하에서 GLP-1(7-35)-Arg-Ala-Phe-Ala 서열을 갖는 폴리펩타이드를 C-말단 GLP-1(7-35)-Arg-NH2를 갖는 폴리펩타이드로 절단하는 것과 같이 기질을 아미드화 절단하는 것에 매우 활성이 있다. 수득율은 전형적으로 단일상 용액 반응에서 관찰되는 것과 비슷한 〉40%이다. 고정 클로스트리페인을 함유하는 레진은 칼럼에 채워져서 아미드화 절단반응을 위한 매우 유효한 촉매로서 작용할 수 있다.
고정 클로스트리페인을 사용하는 반응은 일반적으로 펩타이드 기질을 칼럼을 통해 적절한 수성 암모니아 용액에서 펌핑함으로써 행해질 수 있다. 이로인해 반응산물로부터 매우 성가신 클로스트리페인을 제거할 필요가 없어진다. 레진에 결합된 클로스트리페인은 반응 전에 머캅탄에 의해 활성화 될 수 있거나 환원제가 아미드화동안 존재할 수 있다. 전형적으로 효소는 반응 배지에서 머캅탄(DTT같은)과 칼슘염(CaCl2같은)을 단순히 함유함으로써 활성화 상태로 유지된다. 고정된 효소 반응-기초 아미드화는 또한 생산물의 분해에 이르게 할 수 있는 높은 pH 상태로의 펩타이드의 노출을 최소화하는 특히 D-오염물의 형성과 곁가지의 탈아미드화를 최소화 하는 방법을 가능하게 한다. 예를 들어, 두 개의 플로우-스트림(flow-stream), 안정한 상대적으로 낮은 pH(예, 약 pH 8.5이하)에서 펩타이드를 함유하는 하나와 반응을 위한 최종의 pH와 화학 조성을 제공하는 적절한 구성의 하나는 반응 혼합물의 레진층으로의 도입 전에 혼합되어 질 수 있다. 기질이 레진과 접촉되어 있는 시간은 전형적으로 약 20분 이하이고 바람직하게는 약 5분 이하이다. 게다가, 반응기를 빠져나오자마자 생산물 용액은 적절한 산 또는 완충용액과 혼합하여 아미드화 산물의 안정성이 현저하게 더 높은 pH 약 8.5 이하로 낮춘다.
본 방법은 C-말단 아르기닌 잔기를 갖는 다양한 펩타이드의 아미드화 형태를 생산하는데 유용하다. 생산되어지는 목표 펩타이드는 어떤 유용한 천연 서열, 변형된 천연 서열, 생물학적 활성을 갖는 비-천연 서열, 그것들의 잘려진 형태와 비슷한 형태와 같은 Arg-종결 폴리펩타이드 서열일 수 있다. 펩타이드는 약 300에서 20,000의 분자량을 갖을 수 있고 일반적으로는 400에서 10,000이다. 그런 펩타이드는 전형적으로 3에서 100개의 아미노산 잔기를, 그리고 바람직하게는 3에서 70개의 아미노산 잔기를 포함한다. 그런 펩타이드의 예는 성장호르몬 분비 인자, 그런 인자들의 전구체 그리고 그것들의 기능적 조각을 포함한다. 본 방법을 사용하여 C-말단 아미드화 펩타이드로 변형될 수 있는 기질 펩타이드의 적절한 예는 다음 폴리펩타이드를 포함한다:
GLP(1-35)-Arg-Xaa-R(SEQ ID NO:2):
His-Asp-Glu-Phe-Glu-Arg-His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa-R
그리고
GLP-1(7-35)-Arg-Xaa-R(SEQ ID NO:3):
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Xaa-R
여기서 R은 카르복실 차단 그룹, 아미노산 잔기, 혹은 펩티딜 그룹(즉, 알파-카르복실 펩타이드 결합을 통해 결합된 2개 이상의 아미노산 서열)을 나타낸다.
본 방법은 코어 아미노산 서열의 1개 이상의 카피를 포함하는 기질 폴리펩타이드를 아미드화 절단하는데 사용될 수도 있다. 그러한 다카피 구조물은 서로에게 직접적으로 연결된("인접하여 연결된") 인접 카피(copy)를 갖을 수도 있다. 그러나 매우 자주, 인접한 코어 아미노산 카피의 서열들은 링커 서열에 의해 연결된다. 링커 서열은 코어 아미노산 잔기의 인접 카피 사이에서 스페이스(spacer)로서 역할을 하는 상대적으로 짧은 아미노산 서열(전형적으로 5에서 10개 이상의 아미노산 잔기) 이다. 링커 서열의 아미노산 잔기는 일반적으로 효소적 화학적 절단 시약에 의해 선택적으로 절단될 수 있는 추가 사이트를 제공하도록 선택된다.
다음 실시예는 본 발명을 도시하고 같은 것을 제조하고 사용하는 통상적 기술의 하나를 제공하도록 나타내었다. 실시예는 발명의 범위를 한정하기 위해 의도되어지지 않았다.
실시예 1- pH 7.9에서의 클로스트리페인 촉매 아미드화
기질 펩타이드, GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:;2mg)을 1M 수성 NH4OH 900μL에서 용해하였고 pH를 빙초산을 이용하여 7.9로 맞추었다. 그리고 나서 그 기질 용액을 클로스트리페인을 추가하기 전에 15분 동안 37oC에서 배양하였다. 클로스트리페인(1mg)을 1mM CaCl2를 함유하는 25mM 디티오트레이톨 1ml에서 용해하였고 15분 동안 실온에서 두었다. 클로스트리페인 용액(100μL)을 기질용액을 함유하는 시험관에 37oC에서 넣었다. 시험관을 막고 거꾸로 흔들었고 배쓰에서 37oC에서 유지하였다.
클로스트리페인 촉매 반응의 과정을 시간 간격(일반적으로 매 5분에서 10분)으로 반응 혼합물 25μL를 분별 제거함으로써 모니터 하였다. 클로스트리페인 스탁 용액의 추가 직후에 클로스트리페인 0시간 점을 반응 혼합물에서 제거하였다. 반응 분별은 빙초산으로 10배 희석하였고, 5 미크론 C18 역상 칼럼을 사용하는 HPLC로분석하였고 다음 버퍼: A:95%(v/v)물,5%(v/v)아세토니트릴, 0.1%(v/v)트리클로로산; B:5%(v/v)물, 95%(v/v) 아세토니트릴, 0.1%(v/v) 트리클로로산 의 직쇄의 구성물질로 뽑아내었다.
결과(도 1)는 의미있는 아미드화를 나태내지 않았다. 아미드화 없이 GLP-1(7-36)OH(SEQ ID NO: 4)를 생산하는 Arg36에서의 Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:6)를 제거하는 가수분해는 Lys34에서의 경미한 가수분해로 GLP-1(7-34)OH(SEQ ID NO:5)를 생산하는 일차 반응이다. GLP-1(7-36)OH (SEQ ID NO:4)의 양은 5분 후에 최대 약 55%(GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse)(SEQ ID NO:1)에 달하고 Lys34에서 느린 가수분해 절단하여 GLP-1(7-34)OH(SEQ ID NO:5)를 생산하기 때문에 감소한다. Lys34에서의 절단은 2차적 사이트를 향한 약간의 가수분해 활성이 존재하다는 것을 나타낸다. Lys34에서 관찰되는 현저한 양의 2차적 가수분해 절단 다소 예상 밖이었다.
GLP(7-36)OH(SEQ ID NO:4):
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-OH
GLP(7-34)OH(SEQ ID NO:5)
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys
실시예2- pH 9.0에서의 클로스트리페인 촉매 아미드화
GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:1)의 1M 수성 NH4OH, pH 9.0 그리고 37oC에서의 클로스트리페인 촉매 아미드화를 실시예 1에서 기술된 과정과 분석법으로 실시하였다. pH를 빙초산으로 9.0으로 맞추었다.
pH 9.0에서 실시하는 반응의 결과(도 2)는 약 10분 후에 23.6% GLP-1(7-36)NH2의 최대 수득율을 생산하는 현저한 양의 아미드화를 나타낸다. 10분의 반응 시간에서 아미드화와 가수분해의 비율(GLP-1(7-36)NH2/GLP-1(7-36)OH의 비율)은 1.4였다. pH 9.0에서 GLP-1(7-34)OH를 생산하는 Lys34의 가수분해는 더 느리고 60분 후에 단지 7.4%가 관찰되었다.
GLP-1(7-35)-Arg-NH2(SEQ ID NO:4)
His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-NH2
실시예3-pH9.6에서의 클로스트리페인 촉매 아미드화
GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:1)의 클로스트리페인 촉매 아미드화는 1M 수성 NH4OH, pH 9.6 그리고 37oC에서 실시예 1에서 기술된 공정과 분석 후에 행하였다. pH를 빙초산을 이용하여 9.6으로 맞추었다.
결과(도 3)는 10분과 20분 사이에 GLP-1(7-36)NH2(38.1%)의 최대 수득율을 보여준다. 10분에서의 아미드화와 가수분해의 비율은 5.1이었다. 클로스트리페인의활성은 pH 9.0(실시예 2)에 비해서 조금 더 낮아서 GLP-1(7-36)NH2의 최대 수득율은 조금 더 늦은 시간에 일어난다.
실시예4- pH 10.4에서의 클로스트리페인 촉매 아미드화
GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:1)의 클로스트리페인 촉매 아미드화를 1M 수성 NH4OH, pH 10.4 그리고 37oC에서 실시예 1에서 기술된 공정과 분석 다음에 행하였다. pH를 방초산을 이용하여 10.4로 맞추었다. pH 10.4에서 의도한 아미드화의 결과를 도 4에 나타내었다. 이런 pH에서 GLP-1(7-36)NH2의 최대 수득율(42.3%)이 약 30분 후에 생산되었다. 30분의 반응시간에서 아미드화와 가수분해의 비율은 4.7이었다. GLP-1(7-34)OH의 60분 후(보이지는 않는다)의 수득율은 9.4%이고 pH 9.0과 9.6에서 관찰된 양과 비슷하다. 이것은 pH 10.4에서 Lys34의 가수분해 절단의 양이 더 낮은 pH 수치에서보다 더 낮다는 것을 증명한다.
실시예5- pH 11.0에서의 클로스트리페인 촉매 아미드화
GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:1)의 클로스트리페인 촉매 아미드화를 1M 수성 NH4OH, pH11.0 그리고 37oC에서 실시예 1에서 기술한 공정 후에 행하였다. pH를 빙초산을 이용하여 11.0으로 맞추었다. pH 11.0에서 의도한 아미드화의 결과를 도 5에서 보여주었다. 이런 pH에서는 약 60분 후에 27.6% 수득율의 GLP-1(7-36)NH2(SEQ ID NO:4)가 얻어졌다. 60분 반응에서의 가수분해에 대한 아미드화의 비율은 7.0이었다. 그러나 반응은 더 낮은 어떤 pH에서 보다 훨씬 더 느리게 진행하였고 60분 후에 최대 수득율에 도달하지 못했다. 아미드화는 상대적으로 높은 pH에서 가수분해 절단보다 매우 선호되었고 60분 후에 조차도 GLP-1(7-36)OH(SEQ ID NO:4)의 수득율은 GLP-1(7-36)NH2보다 더 느리게 증가하고 있었다. GLP(7-34)OH(SEQ ID NO:5)를 생산하는 Lys34의 가수분해는 이런 더 높은 pH에서 관찰되지 않았다.
실시예6-GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Met-His-Ala-Glu의 클로스트리페인 촉매 아미드화
GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Met-His-Ala-Glu(SEQ ID NO:7)의 클로스트리페인 촉매 아미드화를 실시예 1에서 기술한 공정 다음에 1M 수성 NH4OH 그리고 37oC에서 조사하였다. 아미드화를 pH 10.3과 10.8에서 실행하였고 각각 32.9%와 12.4% GLP-1(7-36)NH2의 최대 수득율을 생산하였다. 표 Ⅰ에서는 기질로서 GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:1)의 클로스트리페인 촉매 아미드화와 이러한 결과들의 비교를 보여준다. 그 결과는 최적의 pH 범위가 9.0에서 11.0사이이고 바람직하게는 pH 9.5와 10.5사이라는 것을 제시한다.
표 I
pH를 함수로 한 아미드화의 수득율 및 선택성
수득율 비율
pH 기질 GLP-1(7-36)NH2(%)a GLP-1(7-36)NH2/GLP(7-36)OHb
7.9 GLP(7-36)AFAHse 없음 nd
9.0 GLP(7-36)AFAHse 3.6 1.4
9.6 GLP(7-36)AFAHse 38.1 3.1
10.4 GLP(7-36)AFAHse 42.3 4.7
11.0 GLP(7-36)AFAHse 27.6c 7.0
10.3 GLP(7-36)AFAHAE 32.9 nd
10.8 GLP(7-36)AFAHAE 12.4 nd
a- 최대 수득율
b- 관찰되는 최대 수득율에서의 비율
c-60분 후(아직 얻어지지 않은 최대 수득율)
실시예 7- 합성 기질의 아미드화
"XXXX"가 3개 혹은 4개의 아미노산 잔기의 펩타이드 조각을 나타내는 일반적 구조 Val-Lys-Gly-Arg-XXXX의 합성 기질("VKGRXXXX";SEQ ID NO:8)을 1M의 염화암모늄, pH 10.4, 2mm DTT, 1mM 염화칼슘에서 45oC에서 클로스트리페인과 함께 배양하였다. 반응 혼합물의 분별을 여러 시간 간격으로 행하고 빙초산으로 냉각시키고 미세 전기영동으로 분석하였다. 표 Ⅱ에서는 여러 기질에 대해 동일한 클로스트리페인 농도에서 10분 후에 기질의 퍼센트 절단을 요약하였다. HPLC 분석에 의해 밝혀진 모든 경우에서의 주요 산물은 Val-Lys-Gly-Arg("VKGR-NH2";SEQ ID NO:9)의 C-말단 알파-카르복사마이드였다. 명백하게, 천연의 C-종결 조각은 매우 다양할 수 있고 여전히 아미드화 절단의 대상이 되는 상당한 능력을 갖는다.
표 II
기질(VKGR-XXXX)"XXXX" 남아있는 기질의 퍼센트(반응 10분후) SEQ ID NO
AFFG 50.7 10
AFAM 56.7 11
AFM 73.1 12
APAG 64.7 13
AFAHse 67 14
AFHse 71 15
LAFG 82.9 16
AAGG 81.9 17
ALAG 78.7 18
AAPG 82.5 19
LAAG 85 20
AAFG 80.8 21
QAQG 90.6 22
HAEG 95.4 23
실시예8-클로스트리페인에 의한 GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse의 아미드화 절단에 의한 GLP-1(7-36)NH2의 실험실 규모의 제조
재조합 기술에 의해 제조된 동결건조한 펩타이드 GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:1)를 pH 10.5로 맞춘 1.16M NH4OH, 0.25M HCl, 2.5mM DTT, 1mM CaCl24.24mg/ml에 녹이고, 클로스트리페인을 효소:기질의 비율을 1:300으로 하여 첨가하였다. 반응을 4.5시간동안 45oC에서 10mM EDTA로 식히기 전에 수행하도록 하였다. GLP-1(7-36)NH2산물(SEQ ID NO:4)를 Amberchrome에서 역상 상태를 사용하여 크로마토그래피로 정제하고 동결건조 하였다.
펩타이드 산물은 GLP-1(7-36)NH2의 실험실적 오차 안에서 이론적 조성에 동일한 아미노산 조성을 갖고, 확실히 기대한 양의 티로신과 트립토판을 반영하는 흡수 스펙트럼을 갖고, MALDI-TOF 매스 스펙트로메트리에 의해 측정된 원자 매스 3298을 갖고(기대한 실험실적 오차안에서 동일한), 이론적으로 동일한 서열을 갖고, 펩타이드의 합성 상업적 시료에 동일하게 이동하였다. 폴리펩타이드 산물은 그러므로 GLP-1(7-36)NH2로 규명되었다.
실시예9- 클로스트리페인의 단백 분해 활성에 대한 유기용매의 효과
2.5mM 디티오트레이톨, 1mM 염화칼슘, 50mM 트리신 버퍼, pH 8.5에서 2mg의 N-Bz-Phe-Val-Arg-p-니트로아닐린의 기질 용액(1mL)을 실온에서 10μg의 클로스트리페인과 함께 10%(v/v)의 유기용매를 포함하는 수용액에서 배양하였다. 처음 속도는 자유 p-니트로페놀레이트 음이온의 광학적 검출에 의해 결정하였다.
표 III
클로스트리페인 단백분해 활성에 대한 유기용매의 효과
유기 용매 유기용매가 없는 배지에 대한 상대적인 활성(%(v/v))
아세토니트릴 180
프로필렌 카보네이트 264
트리플루오로에탄올 200
디메칠포름아마이드 123
디메칠아세트아마이드 108
테트라하이드로퓨란 26
1,4-부탄다이올 116
N-메칠피롤리돈 90
이러한 반응을 다양한 양의 유기 용매의 존재하에 반복하였고 단백분해 활성을 위한 최적의 농도를 프로필렌 카보네이트(10%), N,N-디메칠포름아마이드(20%),트리플로로 에탄올(20%), 그리고 아세토니트릴(20%)에서 결정하였다.
실시예10-유기용매에 의한 클로스트리페인 아미드화 활성의 억제
다양한 유기 용매의 존재하에서 최대 얻어진 아미화 수준을 2.5mM DTT, 1mM 염화칼슘, 2M 암모늄 아세테이트, pH10.4, 45oC에서 1mL 반응에서 20μg의 클로스트리페인과 함께 GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:1; 2mg/ml)로 결정하였다. 반응 혼합물의 분별을 통상의 시간 간격으로 제거하였고 초산으로 식히고 역상 HPLC 칼럼상에서 HPLC 분석법으로 분석하였다.
표 Ⅳ
클로스트리페인 아미드화 활성에 대한 유기용매의 효과
용매 아미드화 정도( 전환된 기질의 %)
수성 대조군(유기용매 없음) 44
20%트리플루오로에탄올 9
10%프로필렌카보네이트 29
20%아세토니트릴 18
표 Ⅳ의 결과는 아미드화 활성의 억제가 이러한 용매의 존재하에서 명백하다는 것을 보여준다. 일련의 반응을 1.25M NH4OH, pH 10.0, 2.5mM DTT, 1mM CaCl2, 45oC에서, 다양한 매우 낮은 아세토니트릴과 에탄올의 농도에서 기질에 대한 효소의 비율을 1:190으로 하여 실행하였다(표Ⅴ). 낮은 수준의 아세토니트릴 혹은 에탄올은 트랜스아미드화 수득율, 반응 속도, 혹은 GLP-1(7-36)NH2의 GLP-1(7-36)OH에 대한 비율에 거의 영향을 주지 않으나, 생산되는 D-오염물질의 양을 감소시킨다.
표 Ⅴ
용매 최대 수득율(%) 최대 수득율(min) %D GLP-(7-36)NH2/GLP-1(7-36)OH
물 60 90 3.4 4.9
4%아세토니트릴 57 90 1 3.9
4%아세토니트릴 59 120 1.2 4.1
4%아세토니트릴 60 90 nd 5.2
10%에탄올 58 150 nd 3.3
5%에탄올 59 120 nd 4.0
2.5%에탄올 62 90 nd 5.4
사용된 약어: nd- 아직 결정되지 않았음; %D-D-오염물의 퍼센트
실시예11-트랜스아미드화에 대한 암모니아 농도의 영향
GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:1)의 아미드화 절단에 대한 pH 10에서의 다양한 암모니아 농도(0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5 그리고 2M)의 효과를 다음 반응 조건하 즉, 4mg/ml GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:1), 2.5mM DTT, 1mM CaCl2, 45oC, 기질에 대한 효소의 비율= 1:190 에서 조사하였다. 결과는 아래의 표 Ⅵ과 같다. 세 개의 암모니아 농도, 1.0, 1.25, 그리고 1.5M이 비슷한 수득율(각각 43,45 그리고 44%)을 보였다. 모두 같은 양의 D-오염물질을 생산하였고,4.2%와 각각의 비율이 대강 같았다.
표 Ⅵ
암모니아 농도의 효과
NH4OH 농도(M) 최대 수득율a(%) 시간b(min) GLP-1(7-36)NH2/GLP-1(7-36)OHc D-오염물d(%)
0.5 34 30 1.6:1 3.4
0.75 39 40 2.5:1 3.5
1.0 43 60 4.4:1 4.2
1.25 45 100 5:1 4.2
1.5 44 140 5.6:1 4.2
2.0 41 165 7.5:1 4.3
a- GLP-1(7-36)NH2의 최대 수득율;
b- 최대 수득율이 얻어질 때의 시간;
c-최대 수득율을 얻기 위해 요구되는 시간에서의 GLP-1(7-36)NH2/GLP-1(7-36)OH의 비율
d-생산물의 분해로 인한 D-아미노산 형성을 경유한 D-오염물의 %
실시예12- 트랜스아미드화에 대한 암모늄 반대 음이온의 영향
트랜스아미드화에 대한 암모니아 시약에 존재하는 다양한 반대 음이온의 효과를 조사하였다. 반응을 쌍으로 pH를 맞춰서 즉, 염화암모늄, 초산암모늄, 황산암모늄의 존재하에 실시하였다. 2.5mM DTT, 1mM CaCl2, 45oC 그리고 1:190의 효소 기질의 비율로 구성된 반응 배지에서 염산, 초산 혹은 황산으로 pH 10.0에 맞춰진 1.25M의 NH4OH로 GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:1;1.28mg/mL)의 아미드화 절단반응을 쌍으로 실시하였다.
결과는 아래 표 Ⅶ과 같다. 모든 반응의 생산 수득율은 D-오염물질의 양이 거의 동일한 것처럼 거의 동일하고 그러므로 천연의 반대이온은 GLP-1(7-36)NH2를 생산하는 아미드화에 대한 영향이 거의 없다.
표 Ⅶ
암모늄 이온의 반대이온의 효과
반대이온 GLP-1(7-36)NH2수득율a %D-오염물b
Cl- 51% 4.7%
OAc- 51% 4.8%
SO4 - 42% 4.0%
a-150분 후에 어떤 반응도 최대 수득율에 도달하지 않았다.
b-생산물의 분해로 인한 D-아미노산 형성을 경유한 %D-오염물(150분에서)
실시예13- 트랜스아미드화에 대한 CaCl 2 농도의 영향
GLP-1((7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:1;1과 5mg/mL)의 아미드화 절단을염산으로 pH 10.0으로 맞춘 1.25M NH4OH, 2.5mM DTT, 효소의 기질에 대한 비율이 1:200인 것의 존재하에서 0, 0.1, 1.0 그리고 10mM CaCl2(표 Ⅷ)를 포함하는 반응에서 조사하였다. 부가된 칼슘의 존재하에서 아무런 활성도 관찰되지 않았다. 그러므로 이러한 양이온은 활성을 위해 요구되며 0.1mM 초과의 농도는 트랜스아미드화의 수득율에 영향을 주지 않는다.
표 Ⅷ
아미드화 절단에 대한 CaCl2농도의 영향
CaCl2농도(mM) 기질 농도(mg/mL) 최대 수득율a(%) GLP-1(7-36)NH2/GLP-1(7-36)OHb
0 1 NA NA
0.1 1 60 4.6:1
1.0 1 59 4.4:1
10 1 59 4.4:1
0 5 2 -
2 5 47 4.3:1
NA- 활성이 없음;
a-GLP-1(7-36)NH2의 최대 수득율;
b-최대 수득율을 얻을 때의 GLP-1(7-36)NH2/GLP-1(7-36)OH
실시예14- 아미드화 절단에 대한 효소 농도의 영향
1:200, 1:400, 1:800 의 효소/기질 비율에서 GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:1;1mg/mL)의 아미드화 절단을 염산으로 pH 10.0으로 맞춘 1.25M NH4OH, 2.5mM DTT, 0.5mM CaCl2, 45℃에서 질소하에서(표 Ⅸ) 조사하고 실시예 1과같이 분석하였다. GLP-1(7-36)NH2의 수득율은 모든 경우에서 50-60%사이였지만 기질에 대한 효소의 비율이 더 낮은 경우에 최대 수득율에 도달하는 시간이 상당히 더 길었고 1:800의 비율에서 360분에 달하였다. 기질 농도가 더 큰 경우에 비록 반응이 더 적은 산물을 생산하고 더 긴 시간동안 최대의 수득율에 도달했을지라도 수득율은 분명히 알아볼 수 있었다. 기질과 생산물이 연장된 시간동안 알칼리성 pH에 노출되기 때문에 반응 시간이 높은 pH 상태하에서 증가하면 D-오염물의 양이 증가할 것으로 기대된다.
표 Ⅸ
효소/기질 비율
기질 농도a(mg/mL) 효소/기질비율 최대 수득율b(%) (min) D-오염물c(%)
1 1:200 59 90 3%
1 1:400 60 190 4.5%
1 1:800 58 360 6%
5 1:400 51 90 nd
a- GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(SEQ ID NO:1)
b- GLP-1(7-36)NH2의 최대 수득율과 그것이 일어나는 시간
c-최대 수득율 시간에서의 %D-오염물(D-아미노산 형성을 경유한 생산물의 분해로 인함)
실시예15- 클로스트리페인 활성을 위해 요구되는 머캅탄의 환원
최대의 활성을 얻기 위해, 클로스트리페인을 전형적으로 머캅탄으로 처리한다. 머캅탄, DTT의 농도를 0, 0.5, 1.0, 2.5에서 조사하였다. 아미드화 반응의 상태는 1mg/mL GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse, 염산으로 pH 10.0으로 맞춘 1.25M NH4OH, 0.5mM CaCl2, 45oC, N2(g)로 살포한 헤드스페이스(headspace), 기질에 대한 효소 비율이 1:400이고 실시예 1에서와 같이 반응을 분석하였다.
부가된 DTT의 부재하에서 단지 20% 수득율의 아미드화 산물 GLP-1(7-36)NH2이 얻어졌다. 0.5에서 5mM의 존재하에서 실시하였을 때, 모든 반응은 약 60%의 GLP-1(7-36)NH2를 생산하였다. 그러므로, 아미드화 절단의 최적의 수득율을 얻기 위해서는 머캅탄과 같은 환원제로의 효소의 환원이 요구된다.
실시예16- 다른 Arg-특이적 프레테아제에 의한 아미드화
GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse(0.5와 2mg/mL의 사이)를 pH 10과 8.5에서 1M의 수산화암모늄에 용해시키고 6개의 다른 단백분해 효소로 각각 배양하였고 그중 5개는 클로스트리페인과 비슷하게 아르기닌 잔기의 카르복실 펩티드 결합을 절단하는 특이성을 갖는다. 이것들은 트립신, 트롬빈, 카텝신 B(또한 pH 5.5에서 시험하였다), 응고 인자 Xa, 플라스민 그리고 파파인을 포함한다. 파파인은 아르기닌 결합에 특이적이지 않다 하더라도 티올 프로테아제 이다. 이런 프로테아제들중 어느 것도 실시예 1에서 기술한 역상 크로마토그래피에 의해 분석한 바와 같이, GLP-1(7-36)NH2를 생산하지 않았다. 효소: 기질 비율은 1:50에서 1:100의 사이에 있었고 프로테아제 특이적 첨가제를 적절한 곳에 부가하였다(예, 염화칼슘). 이런 상태하에서 단지 클로스트리페인은 측정할 수 있는 GLP-1(7-36)NH2를 생산하였다.
실시예17- 클로스트리페인 친화도 정제
클로스트리페인을 11cm 높이의 층에 덥개로 씌워진 1.2cm ID 칼럼에 Toyopearl TSKgel AF-Red 레진으로 채워진 칼럼을 사용하여 친화도 크로마토그래피(Ullman 등,Biol. Chem. Hoppe-Seyler,375, 89-92 (1994))로 정제하였다. 버퍼 A(25mM Hepes, 5mM CaCl2, pH 8)와 버퍼B(25mM Hepes, 5mM CaCl2, 1M NaCl, pH 8)을 0.45μm 나일론 필터를 통해 여과하였고 10분 동안 진공으로 가스를 제거하였다.
클로스트리페인(57.3mg; Worthington)을 버퍼 A에 15% 버퍼 B 3mL에서 14.5mg/mL 용해시키고 버퍼 A에서 15%B로 미리 평형화시킨 칼럼에 1mL/min으로 적용하였다. 칼럼을 버퍼A에서 15% 버퍼B로 5분 동안 용출하였고 그리고 나서 직선의 기울기로 버퍼 A에서 버퍼 B를 15%에서 100%까지하여 50분 넘게 용출하였다. 분획을 모으고 클로스트리페인을 포함하는 것들을, 아미드화에 촉매작용을 미치는 능력에 의해 동정되듯이, 풀을 만들고 5mM 이티오트레이톨을 구성하고 울트라여과(ultrafiltration)에 의해 농축하였다.
실시예18- 클로스트리페인의 Toyopearl AF-Formyl-650M 레진으로의 고정
보존제를 함유하는 슬러리로서 제공된 Toypearl AF-Formyl-650M 레진을 이용 가능한 45um 프릿(frit)의 10mL 칼럼에 부가하고, 0.1M Mes 버퍼, 5mM CaCl2, pH 5의 2 칼럼 부피로 세척하였다. 5mM Hepes에서 정제된 클로스트리페인을 같은 부피의 0.1M Mes로 희석하여 최종 pH를 5.5로 하고 배출된 레진에 부가하였다. 소듐 시아노보로하이드라이드(1M 150μL)를 그리고 나서 부가하고 레진 슬러리를 뚜껑이 채워진 칼럼에서 23-25oC에서 20시간 동안 연속적인 역전으로 혼합하였다. 분석을 위한 용출제를 보존하면서 칼럼을 흘려 보내고 그 레진을 2 칼럼 부피의 1M Tris-HCl, 5mM CaCl2, pH 7.8로 세척하였다. 이러한 버퍼의 칼럼부피에 50μL의 소듐시아노보로하이드라이드를 부가하고 그 혼합물을 1시간 동안 혼합하였다. 그리고 나서 레진을 10칼럼부피의 1M NaCl, 25mM Hepes, 5mM CaCl2, pH 8로 세척하였고 그리고나서 NaCl을 함유하지 않는 같은 양의 버퍼로 세척하였다. 용액으로부터 효소의 손실을 측정함으로써 결과물인 클로스트리페인 레진의 분석은 1.8과 4.4mg 사이의 효소가 mL당의 레진에 커플되었다는 것을 보여주었다. 클로스트리페인 레진을 사용할 때까지 이런 버퍼에서 4℃에서 보관하였다.
비슷하게, 다른 레진에 고정된 클로스트리페인은 비슷한 결과를 낳았다. 실시예들은 알데하이드 기초 레진과 Ultra Link(Pierce) 그리고 아잘락톤(azalactone) 기초 레진인 Toyopearl Amino Link 그리고 Toyopearl Formyl 650M(Toso Haas, Inc.)을 포함한다. 고정된 클로스트리페인을 포함하는 모든 이러한 레진들은 GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse의 GLP-1(7-36)NH2로의 아미드화 절단을 일반적으로 50에서 60%의 범위에서 77%까지의 수득율로 생산하였다.
실시예19- 고정된 클로스트리페인 촉매 반응
pH 8.5에서 50mM Hepes, 5mM CaCl2에서의 고정된 클로스트리페인 레진을35mL/min으로 흐름(flow) 어댑터와 페리스탈틱(peristaltic) 펌프가 장착된 2.5cm ID 유리 덮개가 있는(jacketed) 칼럼에 로딩하였다. 47oC의 물을 덮개를 통해 순환시켰다. 그리고나서 레진을 47oC에서 1mm DTT와 1mM CaCl2200mL로 8mL/min으로 pH 8.5에서 세척하였다. 기술한 칼럼 제조 후에 칼럼을 아미드화 절단을 위해 준비시켰다.
도 6에서 도시한 장치를 GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse의 연속적인 아미드화 절단을 위해 사용하였다. 1.25mM HCl을 함유하는 7.5% 수성 아세토니트릴에 있는 기질 용액(0.65mg/mL)("용액 1")은 47oC 워터배쓰에서 평형화되었고 페리스탈틱 펌프에 Tee-연결 1에 연결되는 이런 라인의 배출구를 갖는 Tubing 1로 연결되었다. 2.5M NH4OH, 2mM DTT, 그리고 2mM CaCl2의 용액 13L를 제조하고 농 염산으로 pH 10.0으로 맞추었고("용액 2"), 47oC의 워터배쓰에 놓고 또한 Tee-연결 1에 연결된 Tubing 2를 통해 페리스탈틱 펌프에 연결하였다. 펌프로부터 세 번째 튜빙인 Tubing 3는 용액 3(1.25mM HCl)을 실온에서 칼럼의 유출물에 연결된 튜빙 Tee-연결 2에 펌프를 따라 전달한다. Tee-연결 2의 배출구를 이 반응의 생산물로서 수집하였다. 실제로, 그 펌프의 펌핑 라인은 ID Tygon 튜빙에서 0.125이고 Tubing 1,2, 그리고 3의 펌핑 속도는 약 3에서 6mL/min으로 동일하다. 용액 1과 용액 2를 펌핑해서 그것들이 Tee 연결 1에서 만나고 그것들은 pH 10에서 혼합물 생성을 혼합하고 결과물인 용액은 Tee-연결 1을 빠져나가고 칼럼에 다가간다. 이런 용액은 칼럼을통해서 지나가고, Tee 연결 2에 6mL/min의 유속로 들어간다. Tee-연결 2에서, 칼럼의 배출물이 GLP-1(7-36)NH2를 포함하는 반응용액의 pH를 낮추는 역할을 하는 1.25M HCl 용액과 섞인다. 사용된 유속에서 기질과 생산물이 레진과 접촉한 동안의 시간은 약 5분이다. 이런 방법으로 기질 및/또는 생산물이 pH 10의 수성 상태에 노출된 시간은 5분 이하이다.
실제로 유속를 Tee -연결 2의 배출물을 반복적으로 채취하여 HPLC 분석법으로 실시예 1에서 기술한 바와 같이 평가 시 최대의 생산물과 최소한의 오염물질을 이루도록 맞춘다. 도 7에서는 위에서 기술한 상태 하에서 이러한 반응의 결과를 보여주고, 여기서 칼럼의 수득율과 유속를 실험을 위해 시간의 함수로 기록하였다. 평균 수득율은 14mL/min의 순 유속에서 GLP-1(7-36)NH2형성에 50%에 가깝고 최대 64%에 가깝다. 44mL/min과 같이 흐름이 너무 빠르면, 수득율은 34%로 떨어진다. 흐름을 16mL/min으로 돌리면 수득율은 50% 가까이 되돌아 왔다.
생산물의 형성이 최적이 아닐 때, 생산물의 형성이 레진에 결합된 클로스트리페인에 기질 용액의 더 긴 노출을 허락하는데 낮다면 흐름은 감소하고 또는 효소에의 과노출이 Lys34의 절단 때문에 GLP-1(7-34)의 증가된 양에 의해 명백하다면 그 흐름은 증가한다. HCl농도를 중성화하는 것에서의 변경, 기질 농도, 온도, 유기용매 농도 그리고 고정된 클로스트리페인의 속도에 영향을 주는 다른 인자들은 산물 형성을 최적화하도록 맞춰질 수 있는 변수들이라는 것은 그 기술분야에 숙달된 누구에게도 알려져 있다.
실시예20- 고정된 아미드화 절단: 칼럼 파라미터의 효과
두 개의 다른 레진에 대한 고정된 클로스트리페인의 일련의 반응을 유속, GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse 농도, 온도, 레진 양과 GLP-1(3-36)NH2의 수득율을 실시예 19에 유사하게 그리고 비슷한 환경에서 그러나 1×15cm 칼럼에서 수행된 반응에 대해 표로 만든 표 Ⅹ에 나타내었다. 일반적으로 온도를 낮추면 유속(1과 2, 3 그리고 4, 6 그리고 7의 엔트리를 비교하라)와 GLP-1(7-36)Ala-Phe-Ala-Hse 농도의 상당한 변화가 있기 때문에 수득율이 감소한다(23oC에서의 제 1 4 엔트리와 45oC에서의 그것을 비교하라)는 결론이 난다. 이러한 변수들과 칼럼 반응의 다른 파라미터들은 수득율을 변화시킨다. 이 연구에서, 수득율은 반응에 사용된 정확한 상태에 따라 4에서 63%로 다양하고 그 반응은 칼럼반응의 다양한 파라미터들을 변화시킴으로써 최적화 될 수 있다는 것을 증명하였다.
표 Ⅹ
효소 반응기 시도의 비교
기본 레진 GLP-1(7-36)APAHse(mg/mL) 유속(mL/min) 수득율% 온도oC
1.아미노링크 0.1 1 56 23
2.아미노링크 0.14 0.1 24 23
3.아미노링크 1 0.1 4 23
4.아미노링크 1 4 11 23
5.아미노링크 0.14 0.5 61 45
6.아미노링크 1 4 48 45
7.아미노링크 1 3 57 45
10.아미노링크 0.1 3 63 45
11.아미노링크 0.25 2 50 45
12.토요펄포르밀(toyopearlFormyl) 0.25 2-4 60 45
13.울트라링크 0.25 1 46 45
14.토요펄포르밀 0.25 2 62 45
15.토요펄포르밀 0.5 2 57 45
16.토요펄포르밀 1 2 53 45
본 발명은 다양한 특이적 그리고 도식적 구체예와 기술을 참조하여 서술하였다. 그러나, 많은 변수들과 변형을 발명의 정신과 범위 내에 남아있으면서 가할 수 있다는 것을 이해해야 한다.

Claims (25)

  1. (ⅰ)(a)암모니아 시약과 (b)알파-카르복실 그룹을 통해서 인접 아미노산 잔기의 알파-아미노 그룹에 펩타이드 결합을 통해 결합된 C-말단 아르기닌 잔기를 갖는 적어도 하나의 코어 아미노산 서열로 이루어진 기질 폴리펩타이드를 포함하는 수성-기초 배지를 (ⅱ)클로스트리페인과 접촉시켜 펩타이드 결합을 절단하고 C-말단 Arg-NH2잔기를 갖는 폴리펩타이드 산물을 생성하는 것으로 이루어지는 C-말단 알파-카르복사마이드 그룹을 갖는 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 수성-기초 배지가 적어도 약 80부피% 물을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 수성-기초 배지가 약 10부피% 이하의 유기용매를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 수성-기초 배지에 유기용매가 실질적으로 없는 것을 특징으로하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 암모니아 시약이 염화암모늄, 수산화암모늄, 초산암모늄, 황산암모늄 그리고 그것들의 혼합물로부터 채택한 암모니아염으로 이루어지는 것을특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 수성-기초 배지가 적어도 0.5M 암모니아 시약으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 약 4oC에서 약 80oC의 온도로 기질 폴리펩타이드와 암모니아 시약을 클로스트리페인과 접촉하는 것으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 코어 아미노산 서열이 GLP-1(7-35)-Arg로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 8항에 있어서, 코어 아미노산 서열이 GLP-1(7-35)Arg-Ala-Phe-Ala로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 코어 아미노산 서열이 GLP-1(7-35)Arg-Ala-Phe-Ala-Hse 또는 GLP-1(7-35)Arg-Ala-Phe-Ala-Met-His-Ala-Glu으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 11항에 있어서, 코어 아미노산 서열이 Xaa가 아미노산 잔기이고 R이 알파-카르복실 차단 그룹인 GLP-1(7-35)-Arg-Xaa-R 아미노산 서열로 이루어진 것을특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 기질 폴리펩타이드가 적어도 두 개의 코어 아미노산 서열 카피를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 코어 아미노산 서열 인접 카피가 링커 서열로 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 기질 폴리펩타이드와 암모니아 시약을 약 9.0에서 약 11.0의 pH를 갖는 수성-기초 배지에서 클로스트리페인과 접촉시키는 것으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 수성-기초 배지가 추가로 CaCl2로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 수성-기초 배지가 추가로 환원제로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 환원제가 머캅탄으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 머캅탄이 디티오트레이톨(dithiotreitol), 디티오에리트리톨(dithioerythritol), 2-머캅토에탄올, 티오글리콜산(thioglycolic acid), 시스테인, 글루타치온 그리고 그것들의 혼합물로 구성된 그룹에서 선택된 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 1항에 있어서, 클로스트리페인이 고정형의 클로스트리페인인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 코어 아미노산 서열이 알파-카르복실 펩타이드 결합을 통해서 인접 아미노산 잔기에 결합된 C-말단 Arg 잔기를 갖는, 적어도 하나의 코어 아미노산 서열로 이루어진 기질 폴리펩타이드를 포함하는 제 1 수성-기초 배지를 제공하고; 제 1 수성-기초 배지를 적어도 약 9.0의 pH를 갖는 제 2 수성-기초 배지를 형성하는 암모니아 시약을 포함하는 알칼리성 배지와 혼합하고; 두 번째 수성-기초 배지를 고정형 클로스트리페인과 접촉시켜서 알파-카르복실 펩타이드 결합에서 기질 폴리펩타이드를 절단하고 C-말단 Arg-NH2잔기를 갖는 폴리펩타이드 산물을 포함하는 생산물 수성-기초 배지를 생산하는 것으로 이루어진 C-말단 알파-카르복사마이드 그룹을 갖는 폴리펩타이드를 생산하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 제 2 수성-기초 배지가 약 9.0에서 약 11.0의 pH를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 20항에 있어서, 추가로 생산물 수성-기초 배지를 폴리펩타이드 산물과 약 8.5이하의 pH를 갖는 제 3 수성-기초 배지를 형성하도록 맞추는 pH로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 22항에 있어서, 접촉 단계가 제 2 수성-기초 배지를 약 20분 이하 동안 고정된 클로스트리페인과 접촉하는 것으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 20항에 있어서, 코어 아미노산 서열이 GLP-1(7-35)-Arg로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 20항에 있어서, 추가로 고정된 클로스트리페인을 머캅탄, CaCl2또는 그것들의 혼합물로 활성화시켜서 활성화된 클로스트리페인을 형성하고; 제 2 수성-기초 배지를 활성화된 고정된 클로스트리페인과 접촉시키는 것으로 이루어진 것을 특징으로 하는 방법.
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