MX2007000908A - Metodos para la produccion de proteinas de bajo peso molecular en alta cantidad, calidad, y bajo costo. - Google Patents

Abstract

La presente invención comprende un proceso para la producción, en alta cantidad y calidad y bajo costo, de una proteína de interés de bajo peso molecular (en particular, PTH 1 - 34) como proteína de fusión expresada en E.coli. La proteína de fusión en cuestión es luego purificada y se diva con enterokinasa bovina recombinante (proteasa producida in-house), luego de lo cual la proteína de bajo peso molecular de interés es purificada a homogeneidad, y se somete a los análisis que permitan garantizar el cumplimiento de todos los requisitos necesarios para la fabricación de un producto biofarmacéutico seguro y eficaz.

Description

ESTADO DE LA TÉCNICA Una extensa variedad de péptidos y proteínas pueden ser producidos por m|edio de sistemas de expresión recombinantes tanto en células procariotas como eucariotás. Cada uno de ellos presenta complicaciones características que encarecen los procesas y los hacen impracticables desde el punto de vista económico.

En particular, la expresión de proteínas heterólogas en bacterias padece de problemas muy frecuentes. Por ejemplo, para los pequeños péptidos suelen obtenerse niveles pobres de productividad debido a problemáticas asociadas al pequeño tamañc de los mismos, el cual les imposibilita adoptar conformaciones estables y solubles lo c ue a su vez deriva en la degradación proteolítica de estos productos. Otro problema asociado a la elevada expresión de proteínas heterólogas es la formación de cuerpos de inclusión. Los cuerpos de inclusión requieren ser resol ubi fizados para obtener la proteína correctamente plegada y funcional y esto implica una pérdida importante de tiempo y dinero hasta determinar el método adecuado para cumplir tal objetivo haci sndo a menudo prohibitivamente cara la producción de proteínas recombinantes p£ira uso terapéutico en humanos, diagnóstico o para investigación.

Para resolver esta problemática y satisfacer la demanda productiva se han desarrollado las llamadas proteínas de fusión que se basan en la expresión de proteínas quiméricas constituidas por un péptido de interés unido a otra proteína, denominada carrier, la cual puede mejorar la expresión, solubilidad, estabilidad y posterior recuperación del producto deseado. La industria farmacéutica ha adoptado esta estrategia para obtener proteínas transgénicas en bacterias. La gran mayoría de estas proteínas se generan fusionando la secuencia que codifica para el péptido de interés a secuencias d ; otras proteínas las cuales se sabe que tienen un buen nivel de expresión, de este modo la iniciación de la traducción ocurre en un entorno nucleotídico conocido y eficiente mejorando el nivel de expresión que se obtendría de otro modo. Las proteínas carriers suelen conferir otras propiedades de interés como localización celular específica, o la unión a ligandos para facilitar la purificación final de la quimera además del incremento de la estabilidad estructural y conformacional ya mencionadas. Entre los carriers más empleados se pueden citar los siguientes ejemplos; lacZ, trpE, proteína de unión a maltosa, glutatión-S-transferasa, etc.

Aunque la asociación de los péptidos resulta benéfica por los puntos ya discutidos con anterioridad, genera una problemática al momento de recuperar el producto de interés puro y aislado de la proteína carrier dada su vinculación covalente. Para resolver esto se practican clivajes direccionados a liberar el péptido original del carrier, idealmente el método de clivaje debe ser específico, eficiente, no debe modificar el producto final y no debe generar productos secundarios no deseados, hecho particularmente importante cuando se trata de la producción de biofármacos destinados a uso terapéutico en humanos. Además, el agente de corte debe ser activo en una amplia gama de condiciones a fin de adaptarse al medio en el cual se llevan a cabo las reacciones de corte teniendo en cuenta que se intentará maximizar la estabilidad del producto final de interés.

Una posible opción para el método de clivaje, contemplando los parámetros deseables en el agente de corte, es la enzima enterokinasa. Esta enzima de mamíferos cu nple el rol de activar el tripsinógeno clivando de manera específica tras la secuencia aminoacídica (Asp)4Lys (Light et al, J. Protein Chem. 10:475-480(1991 )). De este modo es posible generar el sitio de reconocimiento de esta enzima entre la p roteína carrier y el fragmento peptídico de interés, de modo tal de poder tratar el producto quimérico con la endopeptidasa recuperando de forma aislada la porción downstream al sitio de corte, ver US Pat. 4.769.326. Históricamente, el proceso de producc ión de proteínas de fusión ha encontrado en la enterokinasa una enorme desventaja eco nómica contraponiéndose a la amplia variedad de hechos a favor del uso de la misma. Esta invención provee una solución a los elevados costos resultantes, relativos a esta endopeptidasa en la cantidad y calidad en que se la requiere, ya que la proteasa en cuestión es obtenida por metodología recombinante, propia e interna, lo que se traduce en una sensible disminución en el costo global de producción de una proteína de linterés empleando los métodos revelados en la presente invención.

El uso de este sistema de proteínas de fusión, deja en el medio en el cual se produce la reacción de corte una mezcla de varios subproductos de los cuales solo se desea recuperar el péptido original. Con este fin se pueden adoptar varias estrategias, una de ellas, ya mencionada anteriormente, es utilizar la misma proteína carrier como ligando de una cromatografía de afinidad de forma de recuperar el producto de interés] aislado del extremo carrier que quedaría retenido en la resina cromatográfica. El arte ha desarrollado como alternativa la posibilidad de agregar residuos de histidinas en tándem a moléculas proteicas, estos muestran gran afinidad por ciertos metales como el N¡+2, facilitando la recuperación del fragmento a través de cromatografías con las resinas correspondientes.

Esta invención revela diferentes métodos para la producción de proteínas de in :erés de bajo peso molecular, y presenta, como ejemplo principal, la producción de PTH 1 - 34, molécula que comprende los 34 aminoácidos amino-terminales de la hormona paratiróidea humana (PTH). Esta hormona, actualmente disponible comercialriente a precios muy elevados, es uno de los reguladores del metabolismo del calcio y fósforo más importantes en mamíferos y es ampliamente utilizada para el tratamiento de la osteoporosis. Al día de la fecha, la PTH 1 -34 se produce tanto por síntesis química como a través de tecnología de ADN recombinante (véase por ejemplo US Pat. 5.861 .284). Sin embargo, en ambos casos los rendimientos reportados hasta ahori, tanto en masa de producto final como en pureza del mismo, no son económicamente viables. Asimismo, la utilización de insumos onerosos en diferentes etapas del proceso productivo encarecen ostensiblemente los costos de producción.

Por lo tanto, existe en la actualidad la imperiosa necesidad de contar con procesos para la producción de proteínas recombinantes de bajo peso molecular que subsanen todas las limitaciones, tanto en costos como en rendimiento, mencionadas en los párrafos previos. Los métodos para la producción de proteínas de interés de bajo peso molecular en alta cantidad, calidad, y bajo costo, revelados en la presente invención, inten :an dar respuesta a dicha necesidad.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención consiste en métodos para la producción de proteínas de interés de bajo peso molecular en alta cantidad, calidad, y bajo costo, a través de la expresión en bacterias de dicha proteína de interés como una proteína de fusión. Las proteí nas de fusión son una combinación entre la proteína de interés y una proteína o péptido conocido, las cuales pueden ser producidas en cultivos en grandes cantidades. La expresión de una proteína de interés como una proteína de fusión representa algún beneficio, como, por ejemplo, facilitar su purificación, aumentar su solubilidad, facilitar su detección, o disminuir su degradabilidad. La proteína de fusión, una vez expresada, es purificada y clivada convenientemente para liberar la proteína de interés, la cual es purificada a homogeneidad a posterior!.

Una gran variedad de proteínas de bajo peso molecular con utilidad terapéutica pueden ser producidas a través de los métodos revelados en la presente solicitud. Ejemplos de las mismas pueden ser la proinsulina, el factor estimulante de las colonias de granulocitos (G-CSF, filgrastim), la calcitonina, la hormona de crecimiento humana, el factor de crecimiento epidérmico (EGF), etc. Preferiblemente, la proteína de in erés es la PTH 1 -34. Esta molécula de 4 kD de peso molecular, también conocida como teriparatida, corresponde al fragmento peptídico activo (porción IM-terminal de 34 aminoácidos) de la hormona paratiroidea (PTH), reguladora primaria del metabolismo del calcio y fósforo del organismo. Esta molécula constituye, actualmente, la única alternativa verdaderamente efectiva para el tratamiento de la osteoporosis, un proceso donde el hueso va espontáneamente desgastándose (resorción), más rápidamente de lo que se forma, por lo cual se debilita.

Uno de los métodos para producir proteínas de interés de bajo peso molecular de la presente invención comprende la fermentación de bacterias, transformadas previamente con un vector de expresión codificante para una proteína de fusión de la forma X-B-Y, la purificación de dicha proteína de fusión, el clivaje de dicha proteína de fusión en X-B e Y, empleando un agente proteolítico, y, finalmente la purificación de Y, dónele X es una proteína que aumenta la solubilidad y la estabilidad de dicha proteína de fus;ión, B es un péptido reconocido por el agente proteolítico, e Y es la proteína de interés de bajo peso molecular. Las bacterias empleadas para la expresión de dicha proteína de fusión pueden ser, pero no están limitadas a, E. coli. La proteína X, el péptido B y el agente proteolítico pueden ser preferiblemente, pero no están limitados a, tiorrec oxina, (Asp)4Lys y enterokinasa bovina, respectivamente. El peso molecular de la prote ína de interés, Y, puede estar comprendido entre los 3 y los 30 kD, preferiblemente entre 3 y Ni +. El peso molecular de la proteína de interés, Y, puede estar comprendido enjtre los 3 y los 30 kD, preferiblemente entre 3 y 15 kD, y más preferiblemente entre 3 y 7 kD.

Más preferiblemente aún, la proteína de interés de bajo peso molecular es la PTljl 1 -34.

La presente invención también refiere a un método para la producción de PTH 1 -34 en alta cantidad, calidad, y bajo costo, que comprende la fermentación de bacterias; E. coli, transformadas previamente con un vector de expresión codificante para una prc teína de fusión de la forma X-A-B-Y, la purificación de dicha proteína de fusión, el c¡ ¡vaje de dicha proteína de fusión en X-A-B e Y, empleando un agente proteolítico, y, finalmente la purificación de Y, donde X es tiorredoxina, A es polihistidina, B es (Asp)4Lys, el agente proteolítico es enterokinasa bovina, e Y es la PTH 1 -34. El péptido o tag de polihistidina facilita sustancialmente la purificación de la proteína de fusión a i ravés de una cromatografía de afinidad a metales inmovilizados en una resina (IMAC, immobilized metal affmity chromatography). En particular, el metal inmovilizado es Ni2+. La purificación de la PTH 1 -34, una vez efectuado el clivaje de la proteína de fusión, puede incluir pasos de cromatografía y concentración. Pueden e nplearse diferentes tipos de cromatografía que incluyen cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de fase reversa. La cromatografía de intercambio iónico puede ser una cromatografía de intercambio catiónico. Además, pueden efectuarse múltiples pasos cromatográficos. Preferentemente, la purificación consiste en dos pasos cromatográficos. Más preferentemente, la purificación consiste en someter a la solución conteniendo la PTH 1 -34 a una cromatografía de fase reversa, resultando en un material cromatografiado por fase reversa; someter el material cromatografiado por fase reversa a una cromatografía de intercambio catiónico, dando como resultado PTH 1 -34 pura. Adicionalmente, la purificación puede contener un paso final de diafiltración / concentración.

Se encuentra actualmente en curso el procedimiento de depósito en virtud del Tratado de Budapest de la cepa productora de la proteína de fusión Tiorredoxina-(H¡s)6-(Asp)4Lys-PTH 1 -34. El nombre y dirección del depositario son DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg I b, 38124 Braunschweig, Alemania. El número de acceso correspondiente será suministrado oportunamente.

La invención refiere además a un método para la purificación de PTH 1 -34 a partir de una solución conteniendo productos del clivaje de una proteína de fus ón que comprende la PTH 1 -34 en su estructura. El método de purificación puede incluir pasos de cromatografía y concentración. Pueden emplearse diferentes tipos de cromatografía que incluyen cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de fase reversa. La cromatografía de intercambio iónico puede ser una cromatografía de intercambio catiónico. Además, pueden efectuarse múltiples pasos cromato gráficos. Preferentemente, el método de purificación consiste en dos pasos cromatográfíoos. Más preferentemente, el método de purificación de PTH 1 -34 consiste en someter a la solución conteniendo conteniendo productos del clivaje de una proteína de fu sión que comprende la PTH 1 -34 en su estructura a una cromatografía de fase reversa, resultando en un material cromatografiado por fase reversa; someter el material crómate grafiado por fase reversa a una cromatografía de intercambio catiónico, dando como resultado PTH 1 -34 pura. Adicionalmente, la purificación puede contener un paso final de diafíltración / concentración.

El agente proteolítico utilizado en los métodos descriptos es producido in-housc a través de la tecnología de DNA recombinante, lo que abarata sensiblemente el costo de este insumo, hecho que constituye una importantísima ventaja de la presente invención. Se encuentra actualmente en curso el procedimiento de depósito en virtud del Tratado de Budapest de la cepa productora del agente poteolítico. El nombre y dirección del depositario son DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg I b, 38124 Braunschweig, Alemania. El número c e acceso correspondiente será suministrado oportunamente.

La cromatografía de fase reversa de los métodos mencionados comprende la utilización de una matriz de fase reversa. Preferiblemente, dicha matriz es Bulk Packing Microsorb 300- 10 C4. Por otro lado, la cromatografía de intercambio catiónico de los métodos mencionados comprende la utilización de una matriz de intercambio catiónico. Preferiblemente, dicha matriz es CM-Sepharose Fast Flow. Adicionalmente, la concentración / diafíltración de los métodos mencionados comprende la utilización de una membrana o cartucho de cierto valor de corte de peso molecular. Preferentemente, dicho valor de corte es de 1 kDa.

Los siguientes ejemplos son ilustrativos, pero no limitantes, de la presente invención. Es menester aclarar que otras modificaciones y adaptaciones adecuadas que son obvias a aquéllos familiarizados con el arte se encuentran dentro del espíritu y alcance de la invención.

FIGURAS La Figura 1 muestra la expresión de la proteína de fusión conteniendo la PTH 1 -34 por parte de las bacterias productoras.

La Figura 2 corresponde al estudio de la localización celular de la proteína de fusión conteniendo la PTH 1 - 34.

La Figura 3 representa un análisis de las diferentes fracciones obtenidas tras la purificación de la proteína de fusión conteniendo la PTH 1 - 34.

La Figura 4 muestra un análisis comparativo entre la PTH 1 - 34 pura, producida por uno de los métodos de la presente invención, y un estándar de PTH 1 - 34.

PTHF: CTGGGTACCGATGACGACGACAAGTCAGTATCA PTHR: CCATGGAAGCTTTTAGAAGTTGTGAACGTCCTG El fragmento de PCR fue aislado y purificado con el kit QIAEXII (cat. 20021 , QIAGEN). Posteriormente, se realizó la digestión del fragmento con las enzi mas de restricción KprA y HmdlII. El vector plasmídico también fue digerido con las mismas enzimas, y posteriormente se realizó la ligación del fragmento y vector en presencia de ligasa. El vector de expresión resultante se denominó pBSPTH y cor él se transformaron bacterias E.coli BL21 (DE3), seleccionándose luego los clones recombinantes en presencia de ampicilina.

La misma cepa de E.coli se empleó para la obtención en cantidad del plásmido, con la finalidad de corroborar su secuencia, y para la expresión de la proteína de fusión. En relación con la primera, se realizó el análisis de secuencia de la región codificante para PTH 1 - 34 de este vector (y la región 5'), corroborándose que tanto la región codificante para PTH 1 -34 como para el sitio de corte con enterokinasa bovina coinciden con las teóricas esperadas.

Ejemplo 2) Fermentación bacteriana: Expresión de la proteína de fusión y localización intracelular de la misma.

La expresión de la proteína de fusión se realiza por inducción de la expresión co i 1 m de isopropiltiogalactósido (IPTG) cuando el cultivo de bacterias transformadas alcanza una densidad óptica igual a 1. La fermentación se llevó a cabo empleando culi ¡vos en erlenmeyers. El estudio de la expresión de la proteína de fusión puede apreciarse en la Figura I .

Posteriormente, se realizó la lisis total de las bacterias y se estudió la localización celular de la proteína de fusión expresada, pudiéndose constatar que la misma se ubica en la fracción soluble intracelular de dichos microorganismos (véase la Figura 2) Figura 1. Expresión de la proteína de fusión conteniendo la PTH 1-34. SDS-lPAGE, tinción con Coomassie Blue. Calle 1 : Marcadores de peso molecular (66 kDa, ; 6 kDa, 24 kDa, 18.4 kDa y 14.2 kDa), Calle 2: Lisis total de bacterias antes de la inducc ión con IPTG, Calle 3. Lisis total de bacterias luego de 3 horas de inducción con IPTG. Se muestra como ejemplo el resultado de una fermentación en erlenmeyer del clon productor de la proteína de fusión, crecido hasta DO=l e inducido durante 3 hopas con IPTG I mM. 1 2 3 Proteína de Fusión Figura 2. Estudio de la localización de la proteína de fusión. A: SDS-PAGE. tinción con Coomassie Blue. B: Western Blot. Calle 1 : Marcadores de peso molecular (66 kDa, 36 kDa, 24 kDa, 18.4 kDda y 14.2 kDa), Calle 2: lisis total bacterias sin induc r, Calle 3: lisis total bacterias inducidas, Calle 4: fracción soluble intracelular bacterias inducidas, Calle 5: fracción insoluble intracelular bacterias inducidas. Se aprec que la proteína de fusión se localiza en la fracción soluble intracelular de E.coli BL21 ( DE3).

B 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Proteína de Fusión Ejemplo 3) Obtención de la proteína de fusión 3.1 ) Obtención del pellet de bacterias y lisis, obtención de la fracción soluble intracelular Se obtuvo el pellet de 1 .2 L del cultivo de bacterias del punto anter or por centrifugación 10 minutos a 7000 rpm. Seguidamente, se agregaron 60 mL de; buffer lisis (P04Na2H 20 mM, NaCl 500 m , Lisozima 1 mg/mL, pH 7.8), se resuspendió el pellet, y se enfrió en hielo 30 minutos y posteriormente se procedió a agijtar por inversión durante 10 minutos a 4°C.

Luego, se agregó Tritón X 100 1 % y 1 mL de solución de benzonasa (250 UI/mL), y se realizó una incubación con inversión durante 4 horas a 4°C, a fin de lograr la rupi ura del ADN bacteriano.

Finalmente, se centrifugó a 10000 g durante 30 minutos a 4°C, se sep aró el sobrenadante (volumen final: 60 mL, concentración proteica total: aproximadamente 20 mg/mL, determinado por método de Bradford; concentración de proteína específica: 6 -8 mg/mL, semicuantificado por SDS-PAGE en condiciones reductoras) y se lo censervó a -70°C, hasta su procesamiento en la próxima etapa. 3.2) Purificación de la proteína de fusión por cromatografía de afinidad a metales El material resultante del paso previo se sometió a una cromatografía de afinidad a metales, de acuerdo con los siguientes parámetros: 1 . Equipamiento: A. Columna: 1 ) Marca - Modelo: Pharmacia X -26 2) Diámetro: 26 mm 3) Volumen: 30 mL 4) Matriz: Ni-NTA Superflow QIAGEN N° catálogo 30450 2. Soluciones y buffers: A. Agua Milli Q B. Buffer A: P04NaH220 mM, CINa 0.5 M, pH 6.1 C. Buffer B: P04NaH2 20 mM, CINa 0.5 M, imidazol 50 mM pH 6.1 Buffer C: P04NaH2 20 mM, CINa 0.5 M, imidazol 250 6.1 E. Etanol al 20% F. NaOH 0.5 M 3. Material a ser cromatografiado A. Origen: Sobrenadante de lisis de bacterias de la etapa ánterior, diluirlo al 1/2 con P04NaH2 40 mM, CINa 1 M, pH 6.1.

B. Condiciones de la muestra: 1 ) Volumen: aproximadamente 600 mL (muestra ya d uída) Para equilibrar la columna, se pasaron a través de la columna en forma secuencial las siguientes soluciones y buffers en las cantidades abajo detalladas, a un fluj o de 8 mL/min: 5 volúmenes de columna ("ve") (150 mL) de agua Milli Q; y, finalmente, 5 ve (150 mL) de Buffer A.

Una vez que la columna fue equilibrada, se sembró el material a ser cromatogi afiado. Dicha siembra se efectuó temperatura ambiente y a un flujo de 2 - 3 mL/min. Luego, la elución se efectuó a un flujo de 6 mL/min y a igual temperatura, pasando a través de la columna las siguientes soluciones y buffers en el siguiente orden: 1 ve (30 mL) de Buffer A; 4 ve (120 mL) de Buffer B; y, finalmente, 2 a 10 ve (60 - 300 mL) de Buffer C.

Concluido este paso, se pasaron a través de la columna en forma secuencial las siguientes soluciones y buffers en las cantidades más abajo detalladas, con la finalidad de limpiarla y acondicionarla: 3 ve (90 mL) de Agua Milli Q; 3 ve (90 mL) de NaOH 0.5 M; y, finalmente, 3 ve (90 mL) de Etanol al 20%.

Las fracciones obtenidas (PS, LAV y ELU) y la muestra original (ORI) fueron ensayadas para determinar proteínas totales (por método de Bradford) y para la proteína de interés (estimada por SQS-PAGE, véase Figura 3). La fracción ELU se conservó a +4/+8 °C hasta su posterior procesamiento en la etapa siguiente, mientras que el resto de las fracciones se descartaron.

Figura 3. SDS-PAGE de las diferentes fracciones obtenidas tras la cromatografía de afinidad a metales. Calle 1 : Marcadores de Peso Molecular (66 kDa, 36 LDa, 24 kDa, 18.4 kDa y 14.2 kDa), Calle 2: ORI, Calle 3: PS, Calle 4: LAV, Calle i : ELU. Esta metodología analítica permite obtener una estimación de la concentración de la proteína de fusión en cada fracción. Nótese la intensidad de la banda correspondiente a la proteína de fusión en la calle 5.

Proteína de Fusión Ejemplo 4) Obtención de PTH 1 -34 4.1 ) Obtención de la enterokinasa bovina recombinante para el clivaje de la protejína de fusión conteniendo la PTH 1 -34.

Se realizó la producción de enterokinasa bovina recombinante (bEK) a partir de duodeno bovino. Luego de aislar el ARNm, se obtuvo el cDNA específico y se clonó en un vector apropiado para su expresión como proteína de fusión con tiorredoxina, polihistidina y sitio de corte de enterokinasa. El vector de expresión resultante se denominó pBSbEK.

La proteína de fusión, expresada como cuerpos de inclusión, fue desnaturalizada y purificada con una resina de afinidad. Luego se realizó el refolding de la misma donde tuvo lugar la autocatálisis para la obtención de la bEK, la cual fue purificada luego por intercambio iónico y acondicionada para su almacenamiento. La proteasa producida de esta manera demostró poseer actividad biológica, y se la utilizó para digerir la proteína de fusión conteniendo la PTH 1 -34 (ver punto siguiente). 4.2) Digestión de la proteína de fusión con enterokinasa bovina recombinante La muestra seleccionada en el paso anterior se diluyó 1/10 con AcH 20 mM pH 5 |y se le agrega Cl2Ca hasta concentración final 2 mM. Luego se le agregó enterokinasa bovina (producida en forma recombinante in- house, véase el punto anterior) en una proporción 1 /5000 (masa en masa) respecto de la proteína de fusión. Posteriormente, se incubó toda la noche a temperatura ambiente.

Se obtuvo de esta forma la fracción DIG, la cual, junto con la muestra original (ORI), fue sometida a un SDS-PAGE para asegurar la digestión completa de la proteína de fusión. Adicionalmente, el rendimiento del corte se puede determinar por HPLC en fase reversa C4 (siembra directa de la muestra) y cuantificando el pico correspondiente a la PTH 1 -34. El rendimiento esperado es del 10-15% (masa de PTH 1 -34 determinada por HPLC/masa de proteína de fusión determinada por método de Bradford).

La fracción D1G se conserva a +4/+8 °C hasta su posterior procesamiento la etapa siguiente. 4.3) Purificación de la PTH 1 -34 4.3.1 ) Cromatografía 1 : fase reversa (C4) El material resultante del paso previo se sometió a una cromatografía de fase reversa, según los parámetros descriptos a continuación: 1. Equipamiento: A. Columna: 1 ) Marca - Modelo: Pharmacia - X 16 2) Diámetro: 16 mm 3) Volumen: 100 mL 4) Matriz: Resina C4, HPLC Bulk Packing Microsorb B00- 10 N° catálogo: ROP 503 10 (Varían) Soluciones y Buffers: A. Agua Milli Q B. Fase Móvil 1 (FM 1): Agua Milli Q + TFA 0.1 % C. Fase Móvil 2 (FM2): Acetonitrilo + TFA 0.1 % D. Metanol al 50 % Material a ser cromatografiado A. Origen: Fracción DIG del paso anterior. B. Condiciones de la muestra: 1 ) Volumen: 3 L.

Para equilibrar la columna, se pasaron a través de la misma en forma secuencial las siguientes soluciones o buffers en las cantidades más adelante detalladas, a un flujo de 8 - 10 mL/min: I ve (100 mL) de FM 1 ; luego, se aplicó un gradiente de FM 1 ¦ FM2 comenzando en una relación 100:0 de dichas soluciones hasta alcanzar una relación 0: 100 de dichas soluciones en un volumen total de 1 ve ( 100 mL); una vez concluido el gradiente, se pasó a través de la columna 1 ve (100 mL) de FM2; luego, se aplicó un gradiente de FM2-FM 1 comenzando con una relación 100:0 de dichas soluciones hasta alcanzar una relación 0: 100 de dichas soluciones en un volumen total de 1 ve ( l 00 mL): y finalmente, se pasó a través de la columna 1 ve ( 100 mL) de F l .

Una vez que la columna fue equilibrada, el material a ser cromatografiado, acondicionado previamente añadiéndole 30 % de FM l , se sembró en la columna. Dicha siembra se efectuó a temperatura ambiente y a un flujo de 8 mL/min. Luego, la elución se efectuó a 8 - 10 mL/min y a igual temperatura, pasando a través de la colu na las soluciones y buffers detallados a continuación en el siguiente orden: 2 ve (200 mL) de FM LFM2 (80:20); y, finalmente, un gradiente de FM 1 -FM2, comenzando de una relación 80:20 de dichas soluciones hasta una relación 60:40 de dichas solucione s en un volumen total de 10 ve ( 1000 mL).

Una vez concluido este paso, y a los fines de limpiar la columna, se aplicaron las siguientes soluciones, en orden: 2 ve (200 mL) de FM2; un gradiente de FM 2-FM I , comenzando en una relación de 100:0 de dichas soluciones hasta alcanzar una relación de 0: 100 de dichas soluciones en un volumen total de 1 ve (100 mL); 1 ,0 ve (1 (30 mL) de FM l ; y, finalmente, 2 ve (200 mL) de metanol al 50%.

A través de esta etapa de purificación, se obtuvieron dos fracciones, PS y EUU . Las fracciones obtenidas (PS y ELU) y la muestra original (ORI) fueron ensaya<ji as por SDS-PAGE en condiciones reductoras (evaporando previamente el acetohitri lo), utilizándose plata como agente revelador.

La fracción ELU se conservó a +4/+8 °C hasta su posterior procesamiento en la etapa siguiente, mientras que el resto de las fracciones se descartaron. Se debió descartar la "cola" del pico correspondiente a la PTH 1 -34 de la fracción elegida, pues correspondía a agregados de dicha molécula.

El rendimiento de esta etapa del proceso fue de aproximadamente 80 %. 4.3.2) Cromatografía 2: intercambio catiónico El material resultante del paso anterior es cromatografiado usando una matriz de intercambio catiónico, como se describe a continuación: 1. Equipamiento: A. Columna: 1 ) Marca - Modelo: Pharmacia - X 16 2) Diámetro: 16 mm 3) Volumen: 10 mL 4) Matriz: CM-Sepharose FF, marca: GE Healthcare, ° Catálogo: 17-0719-01 Soluciones y buffers: A. Agua Milli Q B. Etanol al 20 % C. Solución : NaOH 0,5 N, NaCl 3M D. Buffer D: AcH 0.1 M, pH 5 E. Buffer E: AcH 0.1 M, NaCl 0.5 M, pH 5 3. Material a ser cromatografiado A. Fracción seleccionada de la cromatografía en fase reversa B. Condiciones de la muestra: 1 ) Volumen: 45 mL aproximadamente Para equilibrar la columna, se pasaron a través de ella las siguientes soluciones olbuffers en las cantidades más abajo detalladas en forma secuencial, a un flujo de 8 mL/ iin: 10 ve (50 mL) de Agua Milli Q; 10 ve (50 mL) de Buffer D; y, finalmente, 10 ve (50 mL) de Agua Milli Q.

Una vez que la columna fue equilibrada, se sembró el material a ser cromatografiado previa dilución al 1 /5 con Buffer D. Dicha siembra se efectuó a temperatura ambiente a un flujo de 8 mL/min. Luego, la elución se efectuó a igual flujo y temperatura, ¿asando las siguientes soluciones y buffers a través de la columna, en el siguiente orde : 5 ve (25 mL) de Buffer D; un gradiente de Buffer D - Buffer E, comenzando qon una relación 100:0 de dichos buffers hasta una relación 0: 100 de dichos buffer? en un volumen total de 20 ve (200 mL); y, finalmente, 5 ve (50 mL) de Buffer E.

Una vez concluido el paso, se pasaron a través de la columna en forma secuer cial las siguientes soluciones o buffers en las cantidades más abajo detalladas, para limpiarla: 5 ve (25 mL) de Agua Milli Q; 3 ve ( 15 mL) de Solución ; 5 ve (25 mL) de Agua Milli Q; y, finalmente, 3 ve (15 mL) de Agua Milli Q.

La fracción seleccionada conteniendo PTH 1 -34 pura y la muestra originall fueron sometidas a diferentes ensayos analíticos, como la determinación de proteínas totales (por método de Bradford), la determinación de proteína específica y pureza (poi HPLC en fase reversa), SDS-PAGE coloreados tanto por Coomassie-Blue como por tinción argéntica, y Western Blot.

Luego, La fracción conteniendo PTH 1 -34 se filtró estéril y se conservó a 4°C. La pureza de la PTH 1 - 34 fue superior al 99 %. 4.3.3) Diafiltración / concentración La solución conteniendo PTH 1 -34 se diafiltró con buffer AcH 50 mM pH 4 y se concentró a una concentración mayor o igual a 0.5 mg/mL. Para tal fin, se real zó una filtración tangencial con un cartucho de corte 1 kDa ( MWCO), a una relación entre 1 y 5 mL por cm de superficie del cartucho. El proceso se extendió por aproximadamente 5 horas. El paso de diafiltración/concentración es de realización opcional.

Ejemplo 6) Escalado Se realizó el escalado de los procesos de fermentación y purificación antes descr ptos. A partir de 2 fermentaciones bacterianas de 51 y 54 litros se recu peraron aproximadamente 17 y 20 gramos de proteína de fusión conteniendo la PTH 1 - 34, respectivamente. Después del corte enzimático se obtuvieron aproximadamente 1 .7 y 2 gramos de PTH 1 - 34, y, luego del proceso de purificación de la misma, 0 85 y 1 gramos de PTH 1 - 34 pura, material suficiente para la producción de 850 y 1 .000 pens multidosis de este producto, respectivamente. La pureza de la PTH 1 - 34 o tenida supera el 99 %.

Ejemplo 7) Control de Calidad El material conteniendo PTH 1 -34 pura fue sometido a una serie de ensayos para verificar la calidad del producto. Dichos procedimientos incluyeron, aunque no estuvieron limitados a, SDS/PAGE, en condiciones reductoras y no reductoras. contra estándar vigente (véase la Figura 4), Western Blot, actividad biológica in vitro (contra estándar vigente), determinación de la secuencia completa de aminoácidos (demostrándose que los aminoácidos secuenciados coinciden en su totalidad con la secuencia teórica esperada de la PTH 1 -34 humana), y análisis de HPLC en fase reversa para la determinación de proteínas relacionadas (producto oxidado, deamidado, olivado, etc.).

Los resultados obtenidos para todos estos ensayos fueron altamente satisfacto -ios, lo que demuestra que la calidad de la PTH 1 -34 producida es adecuada para la fabricación de un producto biofarmacéutico.

Figura 4. SDS-PAGE, tinción argéntica. Calle 1 : Fracción conteniendo la PTH 1 - 34 pura, Calle 2: Estándar de PTH 1 - 34 (Bachem), Calle 3: Marcadores d i Peso Molecular. En la Calle 1 se observa una banda única cuyo peso molecular coincide con el del estándar de PTH 1 - 34 de la Calle 2.

Habiendo descripto completamente la invención, será de fácil comprensión para aquéllos familiarizados con el arte que ésta puede efectuarse dentro de un rango amplio y equivalente de condiciones, formulaciones y otros parámetros sin afectar el alcance de la invención o alguna de sus aproximaciones. Todas las patentes y publicacionesl citadas en la presente se incorporan exclusivamente como referencia.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiendo descrito y ejemplificado la naturaleza y objeto principal de la presente invención, así como también la manera en que la misma puede llevarse a la práctica, se declara reivindicar como de propiedad y de derechos exclusivos: I ) Un método para la producción de una proteína de interés de bajo peso mo|ecular, CARACTERIZADO POR comprender los siguientes pasos: a. Fermentación de bacterias, transformadas previamente con un vector de expresión codificante para una proteína de fusión de la forma X-B b. Purificación de dicha proteína de fusión, c. Clivaje de dicha proteína de fusión en X-B e Y, empleando un agejite proteolítico, d. Purificación de Y, donde X es una proteína que aumenta la solubilidad y la estabilidad de dicha proteína de fusión, B es un péptido reconocido por el agente proteolítico, e Y es la proteína de interés de bajo peso molecular. 2) El método de la reivindicación 1 , CARACTERIZADO PORQUE las bacterias son E. coli. 3) El método de reivindicación 1 , CARACTERIZADO PORQUE X es tiorredoxina. 4) El método de la reivindicación 1 , CARACTERIZADO PORQUE B es (Asp)4Lys. 5) El método de la reivindicación 4, CARACTERIZADO PORQUE el agente proteolítico es enterokinasa bovina. 6) El método de la reivindicación 1 , CARACTERIZADO PORQUE el peso molecular de Y está comprendido entre los 3 y los 30 kD. 7) El método de la reivindicación 6, CARACTERIZADO PORQUE el peso molecular de Y está comprendido entre los 3 y los 15 kD. 8) El método de la reivindicación 7, CARACTERIZADO PORQUE el peso molecular de Y está comprendido entre los 3 y los 7 kD. 9) El método de la reivindicación 8, CARACTERIZADO PORQUE Y es PTfl 1 - 34. 0) Un método para la producción de una proteína de interés de bajo peso molecular, CARACTERIZADO POR comprender los siguientes pasos: a. Fermentación de bacterias, transformadas previamente con un vec :or de expresión codificante para una proteína de fusión de a forma X-A-B-Y, b. Purificación de dicha proteína de fusión, c. Clivaje de dicha proteína de fusión en X-A-B e Y, empleando un gente proteolítico, d. Purificación de Y, donde X es una proteína que aumenta la solubilidad y la estabilidad de diclha proteína de fusión, A es un péptido que facilita la purificación de la proteí la de fusión, B es un péptido reconocido por el agente proteolítico, e Y es la prcteína de interés de bajo peso molecular. 1 1 ) El método de la reivindicación 10, CARACTERIZADO PORQUE las bacterias son E. col i. 12) El método de reivindicación 10, CARACTERIZADO PORQUE X es tiorredoxina. 13) El método de reivindicación 10, CARACTERIZADO PORQUE A es polihistidina. 14) El método de reivindicación 13, CARACTERIZADO PORQUE la purifickción de la proteína de fusión se realiza mediante una cromatografía de afinidad metales. 15) El método de la reivindicación 10, CARACTERIZADO PORQUE B es (Asp)4Lys. 16) El método de la reivindicación 15, CARACTERIZADO PORQUE el agente proteolítico es enterokinasa bovina. 17) El método de la reivindicación 10, CARACTERIZADO PORQUE el peso molecular de Y está comprendido entre los 3 y los 30 kD. 18) El método de la reivindicación 17, CARACTERIZADO PORQUE el peso molecular de Y está comprendido entre los 3 y los 15 kD. 19) El método de la reivindicación 18, CARACTERIZADO PORQUE el peso molecular de Y está comprendido entre los 3 y los 7 kD. 20) El método de la reivindicación 19, CARACTERIZADO PORQUE Y es PTH 34. 21 ) Un método para la producción de una proteína de interés de bajo peso molecular, CARACTERIZADO POR comprender los siguientes pasos: a. Fermentación de bacterias, transformadas previamente con un vectjor de expresión codificante para una proteína de fusión de a forma ?-?-ß-?, b. Purificación de dicha proteína de fusión, c. Clivaje de dicha proteína de fusión en X-A-B e Y, empleando un agente proteolítico, d. Purificación de Y, donde las bacterias son E. coli, X es tiorredoxina, A es polihistidina, B es (Asp)4Lys, el agente proteolítico es enterokinasa bovina, e Y es la proteíra de interés de bajo peso molecular. 22) El método de la reivindicación 21 , CARACTERIZADO PORQUE el peso molecular de Y está comprendido entre los 3 y los 30 kD. 23) El método de la reivindicación 22, CARACTERIZADO PORQUE el peso molecular de Y está comprendido entre los 3 y los 15 kD. 24) El método de la reivindicación 23, CARACTERIZADO PORQUE el peso molecular de Y está comprendido entre los 3 y los 7 kD. 25) El método de la reivindicación 24, CARACTERIZADO PORQUE Y es PTH 1 - 34. 26) Un método para la producción de PTH 1 -34, CARACTERIZADO POR comprender los siguientes pasos: a. Fermentación de bacterias, transformadas previamente con un vectbr de expresión codificante para una proteína de fusión de la forma X-A-¡B-Y, b. Purificación de dicha proteína de fusión, c. Clivaje de dicha proteína de fusión en X-A-B e Y, empleando un agente proteolítico, d. Purificación de Y, donde las bacterias son E.coli, X es tiorredoxina, A es polihistidina, B es (Asp)4Lys, el agente proteolítico es enterokinasa bovina, e Y es PTH 1 -34. 27) El método de la reivindicación 26, CARACTERIZADO PORQUE la purificación de la etapa d. consiste en uno o múltiples pasos cromatográfícjas. 28) El método de la reivindicación 27, CARACTERIZADO PORQUE la purificación de la etapa d. consiste en un paso cromatográfico. 29) El método de la reivindicación 27, CARACTERIZADO PORQUE la purificación de la etapa d. consiste en múltiples pasos cromatográflcos. 30) El método de la reivindicación 27, CARACTERIZADO PORQUE la purificación de la etapa d. consiste en dos pasos cromatográflcos. 31 ) El método de la reivindicación 30, CARACTERIZADO PORQUE la purificación de la etapa d. consiste en los siguientes pasos cromatográflcos, en orden: i. Cromatografía de fase reversa, ii. Cromatografía de intercambio catiónico. 32) El método de la reivindicación 31 , CARACTERIZADO PORQUE la cromatografía de fase reversa del paso i. comprende el uso de una matriz le fase reversa. 33) El método de la reivindicación 32, CARACTERIZADO PORQUE la matj-iz de fase reversa es Bulk Packing Microsorb 300-10 C4. 34) El método de la reivindicación 31 , CARACTERIZADO PORQUE la cromatografía de intercambio iónico del paso ii. comprende el uso de una Imatriz de intercambio catiónico. 35) El método de la reivindicación 34, CARACTERIZADO PORQUE la matriz de intercambio catiónico es CM-Sepharose Fast Flow. 36) El método de la reivindicación 31 , CARACTERIZADO PORQUE comprende adicionalmente el paso iii. diafiltración / concentración. 37) Un método para la purificación de PTH 1 -34 a partir de una solución conteniendo productos del clivaje de una proteína de fusión que comprendí la PTH 1 -34 en su estructura, CARACTERIZADO PORQUE consiste en los] siguientes pasos cromatográflcos, en orden: i. Cromatografía de fase reversa, ii. Cromatografía de intercambio catiónico. 38) El método de la reivindicación 37, CARACTERIZADO PORQUE la cromatografía de fase reversa del paso i. comprende el uso de una matriz dle fase reversa. 39) El método de la reivindicación 38, CARACTERIZADO PORQUE la matrjz de fase reversa es Bulk Packing Microsorb 300-10 C4. 40) El método de la reivindicación 37, CARACTERIZADO PORQUE la cromatografía de intercambio iónico del paso ii. comprende el uso de una|matriz de intercambio catiónico. 41 ) El método de la reivindicación 40, CARACTERIZADO PORQUE la matHz de intercambio catiónico es CM Sepharose Fast Flow. 42) El método de la reivindicación 37, CARACTERIZADO PORQUE comprbnde adicionalmente el paso iii. diafiltración / concentración.