[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

RU2587634C2 - Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека - Google Patents

Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека Download PDF

Info

Publication number
RU2587634C2
RU2587634C2 RU2012153676/10A RU2012153676A RU2587634C2 RU 2587634 C2 RU2587634 C2 RU 2587634C2 RU 2012153676/10 A RU2012153676/10 A RU 2012153676/10A RU 2012153676 A RU2012153676 A RU 2012153676A RU 2587634 C2 RU2587634 C2 RU 2587634C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
population
cell
markers characteristic
expressing markers
Prior art date
Application number
RU2012153676/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2012153676A (ru
Inventor
Джин СЮЙ
Original Assignee
Янссен Байотек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=44912123&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2587634(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Янссен Байотек, Инк. filed Critical Янссен Байотек, Инк.
Publication of RU2012153676A publication Critical patent/RU2012153676A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2587634C2 publication Critical patent/RU2587634C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0613—Cells from endocrine organs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C12N5/0678—Stem cells; Progenitor cells; Precursor cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/54—Ovaries; Ova; Ovules; Embryos; Foetal cells; Germ cells
    • A61K35/545—Embryonic stem cells; Pluripotent stem cells; Induced pluripotent stem cells; Uncharacterised stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
    • C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/119—Other fibroblast growth factors, e.g. FGF-4, FGF-8, FGF-10
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/70—Enzymes
    • C12N2501/72—Transferases [EC 2.]
    • C12N2501/727—Kinases (EC 2.7.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/998—Proteins not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)

Abstract

Изобретение относится к клеточным технологиям. Описана клеточная популяция клеток человека, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где указанная изолированная популяция клеток человека получена путем культивирования линии эмбриональных стволовых клеток человека, выбранной из группы, включающей H1 (код NIH: WA01), Н7 (код NIH: WA07) и Н9 (код NIH: WA09) (WiCell Research Institute (WiCell)) в среде, дополненной активатором протеинкиназы С, причем более 60% клеток в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, одновременно экспрессируют PDX1 и NKX6.1, и где клетки в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, экспрессируют CDX2. Изобретение расширяет арсенал клеточных линий человека. 1 н. и 5 з.п. ф-лы, 5 ил., 2 табл., 4 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
Настоящая заявка истребует приоритет по предварительной заявке на патент США с серийным номером 61/333831, поданной 12 мая 2010 г., которая полностью включена в настоящий документ путем ссылки для любых целей.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение представляет способы стимулирования дифференцирования плюрипотентных стволовых клеток в инсулин-продуцирующие клетки. В частности, настоящее изобретение представляет способ получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Последние достижения в области заместительной клеточной терапии для лечения сахарного диабета 1 типа и нехватка доступных для трансплантации островков Лангерганса стимулировали интерес к разработке источников инсулин-продуцирующих клеток, или β-клеток, подходящих для трансплантации. Одним из подходов является формирование функциональных β-клеток из плюрипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
При эмбриональном развитии позвоночных плюрипотентные клетки дают начало группе клеток, содержащих три зародышевых листка (эктодерму, мезодерму и энтодерму) в ходе процесса, именуемого гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, будут развиваться из энтодермы через промежуточную стадию. Промежуточной стадией в данном процессе является образование дефинитивной энтодермы. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют ряд маркеров, таких как HNF3 бета, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX 17.
Формирование поджелудочной железы происходит при дифференцировании дефинитивной энтодермы в панкреатическую энтодерму. Клетки панкреатической энтодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса, PDX1. При отсутствии PDX1 развитие поджелудочной железы не происходит дальше формирования вентрального и дорзального зачатков. Таким образом, экспрессия PDX1 характеризует критическую стадию органогенеза поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа содержит, помимо других типов клеток, экзокринную ткань и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются при дифференцировании панкреатической энтодермы.
По имеющимся данным, клетки, обладающие свойствами островковых клеток, были получены из эмбриональных клеток мыши. Например, в работе Lumelsky et al. (Science 292:1389, 2001) сообщается о дифференцировании мышиных эмбриональных стволовых клеток в инсулин-секретирующие структуры, аналогичные островкам поджелудочной железы. В работе Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) сообщается, что полученные из мышиных эмбриональных стволовых клеток инсулин-секретирующие клетки нормализуют гликемию у мышей с диабетом, вызванным стрептозотоцином.
В одном примере в работе Hori et al. (PNAS 99: 16105, 2002) раскрывается, что обработка мышиных эмбриональных стволовых клеток ингибиторами фосфоинозитид-3-киназы (LY294002) приводила к получению клеток, подобных β-клеткам.
В другом примере в работе Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003) сообщается о получении инсулин-продуцирующих клеток из мышиных эмбриональных стволовых клеток с конститутивной экспрессией Pax4.
В работе Micallef et al. сообщается, что ретиноевая кислота может регулировать способность эмбриональных стволовых клеток формировать PDX1-положительную панкреатическую энтодерму. Ретиноевая кислота с наибольшей эффективностью индуцирует экспрессию Pdx1 при добавлении в культуры на 4 день дифференцирования эмбриональной стволовой клетки в течение периода, соответствующего концу гаструляции эмбриона (Diabetes 54:301, 2005).
В работе Miyazaki et al. сообщается о линии мышиных эмбриональных стволовых клеток со сверхэкспрессией PDX1. Результаты авторов показывают, что экспрессия экзогенного PDX1 явно повышает экспрессию генов инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина 3, p48, Pax6 и HNF6 в образующихся дифференцированных клетках (Diabetes 53: 1030, 2004).
В работе Skoudy et al. сообщается, что активин A (входящий в суперсемейство TGF-β) повышает экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилаза) и эндокринных генов (PDX1, инсулин и глюкагон) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдали при использовании активина A в концентрации 1 нМ. Авторы также отмечали, что уровень экспрессии инсулина и PDX1 mRNA не зависел от наличия ретиноевой кислоты. Однако обработка с использованием 3 нМ FGF7 привела к повышению уровня транскрипта для PDX1 (Biochem. J. 379: 749, 2004).
В работе Shiraki et al. изучены эффекты факторов роста, специфически ускоряющих дифференцирование эмбриональных стволовых клеток в PDX1-положительные клетки. Авторы отмечали, что TGF-β2 приводил к воспроизводимому увеличению доли PDX1-положительных клеток (Genes Cells, июнь 2005 г.; 10(6): 503-16).
В работе Gordon et al. продемонстрирована индукция образования брахиурических [положительных]/HNF3 бета [положительных] энтодермальных клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши в отсутствие сыворотки и в присутствии активина в сочетании с ингибитором сигнального каскада Wnt (патент США № 2006/0003446A1).
В работе Gordon et al. (PNAS, т. 103, стр. 16806, 2006) говорится: «Для образования передней первичной полоски требовались одновременно сигнальные каскады Wnt и TGF-бета/Nodal/активин».
Однако модель развития эмбриональных стволовых клеток на мышах не может в точности имитировать программу развития у высших млекопитающих, например у человека.
В работе Thomson et al. выделяли эмбриональные стволовые клетки из бластоцист человека (Science 282:114, 1998). Параллельно, Gearhart и соавторы получили клеточные линии эмбриональных зародышевых клеток человека (hEG) из ткани половых желез эмбриона (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, воспрепятствовать дифференцированию которых можно путем простого культивирования с фактором торможения лейкемии (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека необходимо культивировать в крайне специфических условиях (патент США № 6200806; международные заявки на патент №№ 99/20741, 01/51616).
В работе D'Amour et al. описывается производство обогащенных культур дефинитивной энтодермы, производной от эмбриональных стволовых клеток человека, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей привела к их дифференцированию в более зрелые клетки, обладающие характерными особенностями некоторых энтодермальных органов. Клетки дефинитивной энтодермы, производные от эмбриональных стволовых клеток человека, можно далее дифференцировать в PDX1-положительные клетки после добавления FGF-10 (патент США № 2005/0266554A1).
В работе D'Amour et al. (Nature Biotechnology - 24, 1392-1401 (2006)) говорится: «Мы разработали способ дифференцирования, преобразующий эмбриональные стволовые клетки человека (hES) в эндокринные клетки, способные синтезировать гормоны поджелудочной железы: инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Данный способ имитирует органогенез поджелудочной железы in vivo, проводя клетки через стадии, напоминающие образование дефинитивной энтодермы, энтодермы кишечной трубки, панкреатической энтодермы и превращение предшественников эндокринных клеток в клетки, экспрессирующие эндокринные гормоны».
В другом примере в работе Fisk et al. сообщается о системе для производства островковых клеток поджелудочной железы из эмбриональных стволовых клеток человека (патент США № 2006/0040387A1). В данном случае процесс дифференцирования был разделен на три стадии. Сначала эмбриональные стволовые клетки человека были дифференцированы до энтодермы с помощью комбинации бутирата натрия и активина А. Далее клетки культивировали с антагонистами TGF-β, такими как Ноггин, в комбинации с EGF или бетацеллюлином с получением PDX1-положительных клеток. Окончательное дифференцирование индуцировали никотинамидом.
В одном примере в работе Benvenistry et al. сообщается: «Мы делаем вывод, что сверхэкспрессия PDX1 повышала экспрессию панкреатических обогащенных генов, а для индукции экспрессии инсулина могут требоваться дополнительные сигналы, присутствующие только in vivo» (Benvenistry et al., Stem Cells 2006; 24:1923-1930).
В другом примере в работе Grapin-Botton et al. сообщается: «Ранняя активация Ngn3 почти во всех случаях индуцировала глюкагон-положительные клетки, уменьшая при этом количество клеток-предшественников поджелудочной железы. Как и в случае E11.5, предшественники PDX-1 могут дифференцироваться в инсулин-[положительные] и PP-[положительные] клетки» (Johansson KA et al., Developmental Cell 12, 457-465, март 2007 г.).
Например, в работе Diez et al. сообщается: «После 9 и 10 недель большинство глюкагон-положительных клеток одновременно экспрессировали инсулин, хотя на этих стадиях явно обнаруживались и отдельные клетки, экспрессирующие только инсулин. Клетки, одновременно экспрессирующие инсулин и глюкагон, наблюдали в течение всего периода исследования (от 9 до 21 недели), но они представляли лишь небольшую часть от общего количества экспрессирующих инсулин и глюкагон клеток» (J Histochem Cytochem., сентябрь 2009 г.; 57(9):811-24, 13 апреля 2009 г.).
В одном примере в работе Chen et al. сообщается: «(-)-индолактам V [(ILV)] активирует сигнальный каскад протеинкиназы С и задает поджелудочную спецификацию эмбриональных стволовых клеток человека, которые уже были определены для дифференцирования в линии энтодермы...ILV и ретиноевая кислота воздействуют через связанный механизм...ILV демонстрирует более сильную индукцию экспрессирующих PDX-1 клеток (большую процентную долю экспрессирующих PDX-1 клеток), чем ретиноевая кислота» (Nature Chemical Biology 5, 195-196 (апрель 2009 г.) doi:10.1038/nchembio0409-195).
В работе Lyttle et al. сообщается: «NKX6-1 со-локализованы только с инсулиновыми клетками, что указывает на то, что NKX6-1 участвует только в развитии бета-клеток человека» (Diabetologia, июль 2008 г.: 51(7):1169-80, 2008).
Таким образом, сохраняется значительная потребность в разработке лабораторных способов создания функциональной экспрессирующей инсулин клетки, более близкой к β-клетке. Настоящее изобретение представляет альтернативный подход к повышению эффективности дифференцирования эмбриональных стволовых клеток человека в экспрессирующие инсулин клетки путем генерирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ дифференцирования популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, содержащий следующие стадии:
а. культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b. дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы; и
c. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, посредством обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, средой, в которую добавлен активатор протеинкиназы С.
В одном варианте осуществления более 50% клеток в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые получены способами, составляющими предмет настоящего изобретения, одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фигурах 1A и 1B приведены данные по экспрессии PDX1, NKX6.1 и ISL-1 на стадии 4, день 4, протокола дифференцирования, приведенного в примере 1. На фиг. 1A приведены данные по экспрессии PDX1 и NKX6.1. На фиг. 1B приведены данные по экспрессии NKX6.1 и ISL-1.
На фигурах 2A и 2B показан эффект обработки активатором протеинкиназы С (PKC) на долю клеток, экспрессирующих PDX1, NKX6.1 и CDX2, анализируемый с помощью анализатора IN Cell Analyzer 1000 (фиг. 2A), а также сравнение различных активаторов PKC и эффектов их воздействия на долю клеток, экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, по данным, полученным на анализаторе IN Cell Analyzer (фиг. 2B).
На фигурах 3A, 3B и 3C приведены уровни циркулирующего C-пептида у мышей линии SCID с врожденным отсутствием клеток-киллеров, которым вводили клетки, составляющие предмет настоящего изобретения, под почечную капсулу (фиг. 3A) и через имплантированное под кожу устройство Theracyte (фиг. 3B). Уровни C-пептида регистрировали в указанные моменты времени. На фиг. 3C показано сравнение уровней С-пептида, наблюдаемых в группе, получавшей клетки под почечную капсулу, и группе, получавшей клетки через подкожное устройство Theracyte, через 12 недель после трансплантации.
На фигурах 4A, 4B, 4C и 4D показан эффект обработки активатором PKC на экспрессию PDX1, NKX6.1, NGN3 и PTF1 альфа в клетках, обработанных в соответствии со способами, описанными в примере 3.
На фигурах 5A, 5B, 5C и 5D показан эффект FGF7 на экспрессию NKX6.1, PDX1, PTF1 альфа и CDX2 в клетках, обработанных в соответствии со способами, описанными в примере 4.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Для ясности описания, а не для ограничения изобретения, подробное описание настоящего изобретения разделено на следующие подразделы, описывающие или иллюстрирующие определенные особенности, варианты осуществления или области применения настоящего изобретения.
Определения
Стволовые клетки представляют собой недифференцированные клетки, определяемые по их способности на уровне единичной клетки как самообновляться, так и дифференцировать с образованием клеток-потомков, таких как самообновляющиеся клетки-предшественники, необновляющиеся клетки-предшественники и окончательно дифференцированные клетки. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий дифференцирования из множества зародышевых листков (энтодермы, мезодермы и эктодермы), а также после трансплантации давать начало тканям, происходящим от множества зародышевых листков, и по существу способствовать формированию большинства, если не всех, тканей после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируют по потенциалу развития следующим образом: (1) тотипотентные, способные преобразоваться в любой из эмбриональных и внеэмбриональных типов клеток; (2) плюрипотентные, способные преобразоваться во все типы эмбриональных клеток; (3) мультипотентные, способные преобразоваться во множество клеточных линий, но в рамках одной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) могут порождать ГСК (самообновление), олигопотентные ограниченные клетки-предшественники крови и все типы клеток и элементы (например, тромбоциты), являющиеся стандартными составляющими крови); (4) олигопотентные, способные преобразоваться в более ограниченное подмножество клеточных линий, чем мультипотентные стволовые клетки; и (5) унипотентные, способные преобразоваться в единственную клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцирование представляет собой процесс, при помощи которого неспециализированная («некоммитированная») или менее специализированная клетка приобретает свойства специализированной клетки, например, нервной или мышечной клетки. Дифференцированная клетка или клетка с индуцированным дифференцированием представляет собой клетку, занявшую более специализированное («коммитированное») положение в линии дифференцирования клетки. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцирования обозначает клетку, дошедшую в ходе процесса дифференцирования до стадии, от которой в нормальных условиях она продолжит дифференцироваться до определенного типа клеток или множества типов клеток и не сможет в нормальных условиях дифференцироваться в иной тип клеток или вернуться обратно к менее дифференцированному типу. Дедифференцированием называется процесс, в ходе которого клетка возвращается к менее специализированному (или коммитированному) положению в линии дифференцирования. Используемый в настоящей заявке термин «линия дифференцирования клетки» определяет наследственность клетки, то есть определяет, из какой клетки произошла данная клетка и каким клеткам она может дать начало. В линии дифференцирования клетка помещается в наследственную схему развития и дифференцирования. Маркером, специфичным для линии дифференцирования, называется характерная особенность, специфически ассоциированная с фенотипом клеток конкретной линии дифференцирования, которую можно использовать для оценки дифференцирования некоммитированной клетки данную линию дифференцирования.
Используемые в настоящей заявке термины «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы», «клетки стадии 1» или «стадия 1», относятся к клеткам, экспрессирующим по меньшей мере один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобный гомеобоксный белок, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, включают в себя клетки-предшественники клеток первичной полоски, клетки первичной полоски, клетки мезоэнтодермы и клетки дефинитивной энтодермы.
Термин «клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы» в настоящем документе обозначает клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров: PDX1, NKX6.1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF6, HNF4 альфа, SOX9, HB9 или PROX1. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, включают в себя клетки панкреатической энтодермы, клетки первичной кишечной трубки и поздние клетки передней кишки.
Используемый в настоящей заявке термин «дефинитивная энтодерма» относится к клеткам, обладающим характерными особенностями клеток, происходящих в ходе гаструляции от эпибласта, и формирующим желудочно-кишечный тракт и его производные. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3 бета, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.
Используемый в настоящей заявке термин «маркеры» означает молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов с дифференциальной экспрессией в интересующих клетках. В данном контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышение уровня экспрессии для положительного маркера и понижение уровня экспрессии для отрицательного маркера. Поддающийся обнаружению уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида в интересующих клетках оказывается значительно выше или ниже по сравнению с другими клетками, что позволяет выявлять интересующую клетку и отличать ее от других клеток с помощью любого из множества известных в данной области способов.
Используемые в настоящей заявке термины «панкреатическая эндокринная клетка», или «клетка, экспрессирующая гормон поджелудочной железы», или «клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток», относятся к клетке, способной экспрессировать по меньшей мере один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.
Выделение, размножение и культивирование плюрипотентных стволовых клеток
Характеристика плюрипотентных стволовых клеток
Плюрипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или более стадиеспецифических эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые антителами, обозначаемыми как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998 г.). Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток in vitro приводит к потере экспрессии SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81 (при наличии) и к повышению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных плюрипотентных стволовых клетках, как правило, активна щелочная фосфатаза, которую можно обнаружить путем фиксации клеток с помощью 4% параформальдегида, с последующим обнаружением с помощью Vector Red, применяемого в качестве субстрата, в соответствии с инструкциями производителя (Vector Laboratories, г. Берлингейм, штат Калифорния). Недифференцированные плюрипотентные стволовые клетки также, как правило, экспрессируют OCT4 и TERT, определяемые с помощью ОТ-ПЦР.
Другим желательным фенотипическим свойством выращенных плюрипотентных стволовых клеток является потенциал дифференцирования в клетки всех трех зародышевых листков: в энтодермальные, мезодермальные и эктодермальные ткани. Плюрипотентность плюрипотентных стволовых клеток может быть подтверждена, например, путем инъекции клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), фиксирования образующихся тератом с помощью 4% параформальдегида и их гистологического исследования для получения доказательств наличия клеточных типов, происходящих от трех зародышевых листков. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентность можно определить по образованию эмбриоидных тел и их анализа на предмет присутствия маркеров, которые ассоциируются с тремя зародышевыми листками.
Выращенные линии плюрипотентных стволовых клеток могут быть кариотипированы с применением стандартного способа окрашивания с использованием красителя Гимза и сравнения с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», то есть эуплоидные клетки, в которых все человеческие хромосомы присутствуют и не имеют видимых изменений.
Источники плюрипотентных стволовых клеток
К типам плюрипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся устойчивые линии плюрипотентных клеток, получаемые из ткани, формируемой после вынашивания плода, в том числе из преэмбриональной ткани (такой как бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент в период вынашивания, как правило, но не обязательно, до срока приблизительно 10-12 недель беременности. Неограничивающими примерами являются устойчивые линии эмбриональных стволовых клеток человека или эмбриональных зародышевых клеток человека, например, линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7 и H9 (WiCell). Также возможно использование описываемых в настоящей заявке композиций во время первоначального установления или стабилизации таких клеток. В этом случае исходными клетками являются первичные плюрипотентные клетки, взятые напрямую из тканей-источников. Целям настоящего изобретения также соответствуют клетки, взятые из популяции плюрипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Целям настоящего изобретения также соответствуют линии мутантных эмбриональных стволовых клеток человека, такие как BG01v (BresaGen, г. Афины, штат Джорджия).
В одном варианте осуществления эмбриональные стволовые клетки человека готовят, как описано в работе Thomson et al. (патент США № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).
Культивирование плюрипотентных стволовых клеток
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки культивируют на слое питающих клеток, которые поддерживают плюрипотентные стволовые клетки в различных отношениях. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки культивируют в культуральной системе, по существу не содержащей питающих клеток, но, тем не менее, поддерживающей пролиферацию плюрипотентных стволовых клеток и не допускающей существенного дифференцирования. Рост плюрипотентных стволовых клеток в не содержащей питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды, кондиционированной предварительным культивированием клеток иного типа. В альтернативном варианте осуществления рост плюрипотентных стволовых клеток в не содержащей питающих клеток культуральной системе без дифференцирования поддерживается путем использования среды с химически определенным составом.
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток фибробластов эмбриона мыши в соответствии со способами, изложенными в работе Reubinoff et al. (Nature Biotechnology 18: 399-404 (2000)). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток фибробластов эмбриона мыши в соответствии со способами, изложенными в работе Thompson et al. (Science 6, ноябрь 1998 г.: т. 282, № 5391, стр. 1145-1147). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на любом из слоев питающих клеток, раскрытых в работе Richards et al, (Stem Cells 21: 546-556, 2003).
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека в соответствии со способами, изложенными в работе Wang et al. (Stem Cells 23: 1221-1227, 2005). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека, раскрытых в работе Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека, раскрытых в работе Miyamoto et al. (Stem Cells 22: 433-440, 2004). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека, раскрытых в работе Amit et al. (Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать на слое питающих клеток человека, раскрытых в работе Inzunza et al. (Stem Cells 23: 544-549, 2005).
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20020072117. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 6642048. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в международном патенте WO2005014799. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в работе Xu et al. (Stem Cells 22: 972-980, 2004). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20070010011. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050233446. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в патенте США № 6800480. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в культуральной среде, полученной в соответствии со способами, представленными в международном патенте WO2005065354.
В одном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в работе Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod. 105.046870, 19 октября 2005 г.). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в работе Levenstein et al. (Stem Cells 24: 568-574, 2006). В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050148070. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в патенте США № 20050244962. В альтернативном варианте осуществления плюрипотентные стволовые клетки можно культивировать в соответствии со способами, представленными в международной заявке на патент № WO2005086845.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на соответствующий культуральный субстрат. В одном варианте осуществления соответствующим культуральным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, такой как, например, полученный из базальной мембраны или тот, который может участвовать в лиганд-рецепторном взаимодействии с участием молекулы адгезивного слоя. В одном варианте осуществления соответствующим культуральным субстратом является MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® представляет собой растворимый препарат из клеток опухоли Энгельбрета-Холма-Суорма, который при комнатной температуре превращается в гель и образует восстановленную базальную мембрану.
В качестве альтернативы можно использовать другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток, последние могут включать в себя ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин, гепарансульфат и т.п., по отдельности или в различных комбинациях.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть высеяны на субстрат с соответствующим распределением по поверхности и в присутствии среды, поддерживающей выживаемость, размножение и сохранение требуемых характеристик клеток. Все эти характеристики улучшаются при тщательном подходе к распределению клеток при посеве и могут быть определены специалистом в данной области.
Соответствующая культуральная среда может быть изготовлена, например, из следующих компонентов: модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco № 11965-092, нокаутная модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (KO DMEM), Gibco № 10829-018, основная среда Хэма F12/50% DMEM, 200 мМ L-глутамина, Gibco № 15039-027; раствор неосновных аминокислот, Gibco 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma № M7522; рекомбинантный основной фактор роста фибробластов человека (bFGF), Gibco № 13256-029.
Формирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, из плюрипотентных стволовых клеток
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы из плюрипотентных стволовых клеток, содержащий следующие стадии:
а. культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b. дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы; и
c. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, посредством обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, средой, в которую добавлен активатор протеинкиназы С.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 60% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 70% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 80% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 90% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.
В одном аспекте настоящего изобретения популяция клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, можно дополнительно обрабатывать для получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток.
Эффективность дифференцирования может быть определена путем обработки популяции клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, экспрессированный клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для желательного вида клеток.
Способы оценки экспрессии маркеров белков и нуклеиновых кислот в культивированных или выделенных клетках являются стандартными для данной области. К подобным способам относятся количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), Нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (под ред. Ausubel et al., 2001, доп.)), а также способы иммунологического анализа, такие как иммуногистохимический анализ среза материала, Вестерн-блоттинг, а для маркеров, доступных в интактных клетках, - способ проточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Характеристики плюрипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам в данной области, и продолжается выявление дополнительных характеристик плюрипотентных стволовых клеток. К маркерам плюрипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или более из следующих маркеров: ABCG2, CRIPTO, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
После обработки плюрипотентных стволовых клеток с применением способов, составляющих предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки могут быть очищены путем воздействия на популяцию клеток агентом (например, антителом), специфически распознающим белковый маркер, например, CXCR4, экспрессируемый клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы.
К плюрипотентным стволовым клеткам, допустимым для использования в целях настоящего изобретения, относятся, например, эмбриональные стволовые клетки человека линии H9 (код NIH: WA09), эмбриональные стволовые клетки человека линии H1 (код NIH: WA01), эмбриональные стволовые клетки человека линии H7 (код NIH: WA07) и эмбриональные стволовые клетки человека линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также целям настоящего изобретения соответствуют клетки, экспрессирующие по меньшей мере один из следующих маркеров, характерных для плюрипотентных клеток: ABCG2, CRIPTO, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, NANOG, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81.
Маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, выбраны из группы, состоящей из SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, Brachyury, Mix-подобного гомеобоксного белка, FGF4, CD48, эомезодермина (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. Целям настоящего изобретения соответствует клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии дефинитивной энтодермы. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку-предшественник первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой мезэнтодермальную клетку. В другом аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, представляет собой клетку дефинитивной энтодермы.
Маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, выбраны из группы, состоящей из PDX1, NKX6.1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF6, HNF4 альфа, SOX9, HB9 и PROX1. Целям настоящего изобретения соответствует клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатической энтодермы. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, представляет собой клетку панкреатической энтодермы.
Маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, выбраны из группы, состоящей из NGN3, NEUROD, NKX2.2, PDX1, NKX6.1, PAX4 и PAX6. В одном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка способна к экспрессии по меньшей мере одного из следующих гормонов: инсулина, глюкагона, соматостатина и панкреатического полипептида. Целям настоящего изобретения соответствует клетка, экспрессирующая по меньшей мере один из маркеров, характерных для линии панкреатических эндокринных клеток. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, представляет собой панкреатическую эндокринную клетку. Панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, экспрессирующую гормоны. В альтернативном варианте осуществления панкреатическая эндокринная клетка может представлять собой панкреатическую клетку, секретирующую гормоны.
В одном аспекте настоящего изобретения панкреатическая эндокринная клетка представляет собой клетку, экспрессирующую маркеры, характерные для линии дифференцирования β-клеток. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцирования β-клеток, экспрессирует PDX1 и по меньшей мере один из следующих транскрипционных факторов: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 бета, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном аспекте настоящего изобретения клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии дифференцирования β-клеток, представляет собой β-клетку.
Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, может быть выявлено путем проверки на наличие маркеров до и после выполнения конкретного протокола. Плюрипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют такие маркеры. Таким образом, дифференцирование плюрипотентных клеток определяется по началу экспрессии таких маркеров.
Плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, с использованием любого известного специалистам способа или с использованием любого способа, предложенного в настоящем изобретении.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе Shinozaki et al., Development 131, 1651-1662 (2004).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе McLean et al., Stem Cells 25, 29-38 (2007).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 11/736908.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 11/779311.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 60/990529.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076889.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076900.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076908.
Например, плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, путем обработки плюрипотентных стволовых клеток в соответствии со способами, изложенными в заявке на патент США № 61/076915.
Дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы
В одном варианте осуществления настоящее изобретение представляет способ получения популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы из плюрипотентных стволовых клеток, содержащий следующие стадии:
а. культивирование популяции плюрипотентных стволовых клеток;
b. дифференцирование популяции плюрипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы; и
c. дифференцирование популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, посредством обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, средой, в которую добавлен активатор протеинкиназы С.
В одном аспекте настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 50% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 60% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 70% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 80% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1. В альтернативном варианте осуществления настоящее изобретение представляет популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, причем более 90% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX-1 и NKX6.1.
В одном варианте осуществления активатор протеинкиназы С выбран из группы, состоящей из (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактама, индолактама V (ILV), форбол-12-миристат-13-ацетата (PMA) и форбол-12,13-дибутирата (PDBu). В одном варианте осуществления активатор протеинкиназы С представляет собой (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактам. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(Трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактам можно использовать в концентрации от приблизительно 20 нМ до приблизительно 500 нМ. (2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(Трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактам в настоящем документе называется «TPB».
В одном варианте осуществления в среду, в которую добавлен активатор протеинкиназы С, дополнительно добавлен по меньшей мере один фактор, выбранный из группы, состоящей из фактора, способного ингибировать BMP, ингибитора сигнального каскада рецепторов TGFβ, а также фактора роста фибробластов.
В одном варианте осуществления фактор, способный ингибировать BMP, представляет собой Ноггин. Ноггин можно использовать в концентрации от приблизительно 50 нг/мл до приблизительно 500 нг/мл. В одном варианте осуществления Ноггин используют в концентрации 100 нг/мл.
В одном варианте осуществления ингибитор сигнального каскада рецептора TGFβ представляет собой ингибитор ALK5. В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 представляет собой ингибитор ALK5 II. Ингибитор ALK5 II можно использовать в концентрации от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 10 мкМ. В одном варианте осуществления ингибитор ALK5 II используют в концентрации 1 мкМ.
В одном варианте осуществления фактор роста фибробластов представляет собой FGF7. В альтернативном варианте осуществления фактор роста фибробласта представляет собой FGF10.
В одном варианте осуществления фактор роста фибробластов можно использовать в концентрации от приблизительно 50 пг/мл до приблизительно 50 мкг/мл. В одном варианте осуществления фактор роста фибробластов используют в концентрации 50 нг/мл.
Дифференцирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток
В одном варианте осуществления популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, дополнительно дифференцируются в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, с использования любого способа, известного специалистам в данной области.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D' Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в работе D' Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 11/736908.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 11/779311.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 60/953178.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 60/990529.
Например, популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут быть дополнительно дифференцированы в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатических эндокринных клеток, путем обработки популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в соответствии со способами, представленными в заявке на патент США № 61/289671.
Настоящее изобретение далее без ограничений иллюстрируется следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Формирование популяции клеток, составляющих предмет настоящего изобретения
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 культивировали в покрытых MATRIGEL® (разведение 1:30) (BD Biosciences; № по кат. 356231) чашках со средой RPMI (Invitrogen, № по кат. 22400) + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A (PeproTech; № по кат. 120-14) + 20 нг/мл WNT-3a (R&D Systems; № по кат. 1324-WN/CF) в течение одного дня, с последующей обработкой средой RPMI, дополненной 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затем
а. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 3), затем либо
c. обработка 1: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 в течение четырех дней (стадия 4 - основная среда - BM), либо
d. обработка 2: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II в течение четырех дней (стадия 4), либо
e. обработка 3: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 20 нм форбол-12,13-дибутирата (PDBu) (Calbiochem, № по кат. 524390) в течение четырех дней (стадия 4).
Образцы культур отбирали в дублях на стадии 4, день 4, и получали их изображения с помощью анализатора IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур анализа и последующего окрашивания для каждой лунки снимали по 100 проекций. Для каждой лунки с использованием программного обеспечения IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare) измеряли общее количество клеток, общее количество клеток, экспрессирующих PDX1, общее количество клеток, экспрессирующих NKX6.1, и общее количество клеток, экспрессирующих CDX-2. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общие количества клеток, экспрессирующих PDX 1, NKX6.1 и CDX-2, приведены в процентах от общей популяции клеток.
Как показано на фиг. 2A, во всех экспериментальных популяциях в конце стадии 4, день 4, приблизительно 92%±4% клеток в популяции экспрессировали PDX 1. При этом обработка PDBu (активатор протеинкиназы C) вызвала значительное увеличение доли клеток, экспрессирующих NKX6.1, в популяции, экспрессирующей PDX1 (фиг. 2A), по сравнению с популяциями клеток, обработанных либо основной средой (обработка 1), либо ингибитором ALK5 II в присутствии Ноггина (обработка 2). В группе, обработанной PDBu, 88%±4,2% от всей популяции экспрессировали NKX6.1, тогда как при обработке 2 NKX6.1 экспрессировали 62%±8% клеток, а при обработке 1 NKX6.1 экспрессировали 46,7%±0,2% клеток. Большинство экспрессирующих NKX6.1 клеток на стадии 4 также экспрессировали PDX1. Эти наблюдения подтверждаются наложением изображений экспрессии PDX1 и NKX6.1, полученных для конкретной популяции клеток (фиг. 1A). Приведенные данные показывают, что обработка клеток средой с добавлением активатора протеинкиназы С увеличила процент клеток, одновременно экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, в популяции клеток, которые экспрессируют маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы.
В популяции клеток, прошедших обработку 1, 10% клеток экспрессировали CDX2 (маркер ткани кишечника) (фиг. 2A). В популяциях клеток, прошедших обработку 2 или 3, CDX2 экспрессировали менее 5% клеток. Во всех случаях большинство клеток, экспрессировавших CDX2, не экспрессировали одновременно PDX1 и NKX6.1.
Параллельные популяции клеток стадии 3 также обрабатывали следующими активаторами протеинкиназы С: форбол-12-миристат-13-ацетат (PMA) с концентрацией 20 нМ (Calbiochem № 524400) или [(2S, 5S)-(E, E)-8-(5-(4-(трифторметил)фенил)-2,4-пентадиеноиламино)бензолактам] (TPB) с концентрацией 50 нМ (Calbiochem № 565740), которые были использованы вместо PDBu при указанной выше обработке 3. В конце стадии 4, день 4, 91% клеток в популяции, обрабатываемой PMA, и 90% клеток в популяции, обрабатываемой TPB, экспрессировали NKX6.1. Для общего количества клеток, экспрессировавших PDX1, при всех вариантах обработки значительных различий не наблюдали. См. фиг. 2B.
Приведенный пример показывает, что активаторы протеинкиназы C можно использовать при сравнительно низких концентрациях, чтобы стимулировать повышение экспрессии NKX6.1 и увеличить процент клеток, одновременно экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы.
Пример 2
Имплантация клеток, составляющих предмет настоящего изобретения, мышам с врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID-Bg)
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 культивировали в покрытых MATRIGEL® (разведение 1:30) чашках со средой RPMI + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A + 20 нг/мл WNT-3a в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI + 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затем
а. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 3), затем
c. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 50 нМ TPB в течение четырех дней (стадия 4).
Мышей линии SCID-Bg (С.B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdcscid-Lystbg N7) возрастом от пяти до шести недель приобрели в компании Taconic Farms. Мышей содержали в клетках-микроизоляторах со свободным доступом к стерилизованной пище и воде. В ходе подготовки к хирургической операции мыши были помечены нанесенной на ухо идентификационной меткой, у них была измерена масса тела, а также содержание глюкозы в крови с помощью ручного глюкометра (LifeScan, One Touch).
Мышей анестезировали смесью изофлурана и кислорода и на операционном поле выстригли шерсть малыми ножницами для животных. Перед операцией мышам подкожно ввели 0,1 мг/кг Buprenex. Операционное поле подготовили последовательным промыванием 70% раствором изопропилового спирта и 10% повидон-йодидом.
Находящиеся в конце четвертой стадии клетки механически собирали стеклянной пипеткой на 1 мл и далее переносили на не допускающие прикрепления планшеты и культивировали в течение ночи. В ходе предоперационной подготовки мышей клетки отцентрифугировали в 1,5 мл микроцентрифужной пробирке, большую часть супернатанта удалили, оставив количество среды, достаточное лишь для отбора осажденных клеток. Клетки отобрали с помощью пипетки с объемным вытеснением Rainin Pos-D, после чего пипетку перевернули, чтобы клетки могли осесть под собственным весом. Излишки среды вытеснили, оставив компактный препарат клеток для трансплантации.
При трансплантации для проникновения в почечную капсулу использовали катетер для внутривенных введений 24G × 1,9 см (3/4 дюйма), после чего иглу извлекли. Затем катетер продвинули под почечной капсулой к дистальному краю почки. Наконечник пипетки Pos-D плотно вставили во втулку катетера и ввели 5 миллионов клеток через катетер под почечную капсулу, к дистальному краю почки. Почечную капсулу загерметизировали, используя низкотемпературное прижигание, после чего почку вернули в первоначальное анатомическое положение. Одновременно агрегаты по 5 миллионов клеток загрузили в устройство для имплантации на 50 мкл при помощи наконечника пипетки Post-D. Устройства на 50 мкл приобрели в компании TheraCyte, Inc (г. Ирвайн, штат Калифорния). Устройство после загрузки клеток герметизировали медицинским клейким силиконом типа А (Dow Corning, № по каталогу 129109) и имплантировали под кожу мышам линии SICD-Bg (животные №№ 3 и 4). Мышцы сшили непрерывным швом с помощью викриловой нити 5-0, а кожу стянули скобами для ран. После операции мышам подкожно ввели 1,0 мг/кг Metacam. Мышей вывели из наркоза и дали им возможность полностью восстановиться.
После трансплантации мышей взвешивали раз в неделю и дважды в неделю брали анализ крови для определения уровня глюкозы. На разных сроках после трансплантации мышам интраперитонеально ввели 3 г/кг глюкозы. Через 60 минут после введения глюкозы через ретроорбитальный синус отобрали кровь, поместив ее в микроцентрифужные пробирки, содержащие небольшое количество гепарина. Кровь центрифугировали, плазму собирали во вторую микроцентрифужную пробирку, замораживали на сухом льду и хранили при -80°C до проведения анализа на С-пептид человека. Уровни человеческого С-пептида измеряли с помощью комплекта Mercodia/ALPCO Diagnotics Ultrasensitive C-peptide ELISA (№ по каталогу 80-CPTHU-E01, Alpco Diagnostics, г. Нью-Гемпшир) в соответствии с инструкциями производителя.
С-пептид человека обнаруживали в сыворотке крови животных и в группе почечной капсулы, и в группе с имплантированным устройством Theracyte, уже через 4-6 недель после трансплантации, и его концентрация нарастала во времени (фиг. 3A и 3B). По истечении трех месяцев в ответ на введение глюкозы регистрировались значительное количество циркулирующего С-пептида человека как у 100% животных с почечной капсулой, так и в группе с имплантированным устройством Theracyte. Через три месяца уровень стимулированного глюкозой С-пептида человека в сыворотке в группе почечной капсулы составил 1,7±0,5 нг/мл (n=4), а концентрация человеческого С-пептида у мышей с имплантированным устройством Theracyte составила 1±0,5 нг/мл (n=2) (фиг. 3C).
Данный пример показывает, что популяция клеток, одновременно экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, которую получили под действием активаторов протеинкиназы С, способна к дальнейшему дифференцированию в инсулин-секретирующие клетки in vivo. Способность к дальнейшему дифференцированию в инсулин-секретирующие клетки не зависит от локального окружения. Авторы показали, что клетки, одновременно экспрессирующие PDX1 и NKX6.1, способны к дальнейшему дифференцированию в инсулин-секретирующие клетки как в почечной капсуле, так и в иммуннопротекторном устройстве при его подкожной имплантации.
Пример 3
Альтернативный способ формирования популяции клеток, составляющих предмет настоящего изобретения
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 культивировали в покрытых MATRIGEL® (разведение 1:30) (BD Biosciences; № по кат. 356231) чашках со средой RPMI (Invitrogen, № по кат. 22400) + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A (PeproTech; № по кат. 120-14) + 20 нг/мл WNT-3a (R&D Systems; № по кат. 1324-WN/CF) в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI, дополненной 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затем
а. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 3), затем либо
c. обработка 4: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 20 нМ PDBu + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 4), или
d. обработка 5: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 20 нМ PDBu в течение четырех дней (стадия 4), или
e. обработка 6: DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 50 нг/мл FGF10 + 20 нМ PDBu в течение четырех дней (стадия 4).
Исследовали воздействие дополнительных факторов на опосредованное активатором протеинкиназы С увеличение процента клеток, одновременно экспрессирующих PDX1 и NKX6.1. Образцы культур отбирали в дублях на стадии 4, день 4, и анализ изображений проводили, как описано в примере 1 выше. Также регистрировали экспрессию ISL1 и NEUROD1.
В данном исследовании большинство клеток из популяции, экспрессирующей маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, демонстрировали положительную экспрессию PDX 1. Большинство клеток, экспрессирующих PDX1, также одновременно демонстрировали положительную экспрессию NKX6.1. Как показано в таблице 1, добавление одного только активатора PKC способствовало появлению клеток, экспрессирующих NKX6.1, в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы (обработка 4). На день 4 стадии 4 93% всей популяции были положительны по NKX6.1, и почти все клетки, экспрессирующие NKX6.1, демонстрировали положительную экспрессию PDX1.
Добавление ингибитора ALK5 II к среде, содержащей активатор протеинкиназы C (обработка 5), не оказывало никакого воздействия на наблюдаемое увеличение экспрессии NKX6.1. 57,1% клеток популяции экспрессировали NEUROD1, и 52,4% клеток популяции экспрессировали ISL1, что указывает на увеличение доли эндокринных клеток-предшественников в популяции после такой обработки. См. таблицу 1.
ПЦР-анализ взятых в этом примере образцов показал, что экспрессия PDX 1, NKX6.1 и PTF1 альфа возрастала в популяции клеток, прошедших обработку 4, по сравнению с клетками, прошедшими обработку 5. См. фиг. 4A-4D. С другой стороны, в клетках, получавших ингибитор ALK5 II и PDBu (обработка 5), наблюдали значительное увеличение экспрессии NGN3. См. фиг. 4A-4D.
Также исследовали эффект добавления FGF10 к среде, содержащей активатор протеинкиназы С (обработка 6). Добавление FGF10 в концентрации 50 нг/мл в сочетании с PDBu (обработка 6) привело к формированию популяции клеток, экспрессирующих маркер, характерный для линии панкреатической энтодермы, где 90% клеток в популяции экспрессируют NKX6.1, однако многие из экспрессирующих NKX6.1 клеток также демонстрировали положительную экспрессию CDX2. См. таблицу 1. Уровень мРНК для PDX1, NKX6.1 и PTF1 альфа не возрастал по сравнению с уровнем, наблюдаемым для клеток, обработанных PDBu и Ноггином. См. фиг. 4A-4D.
Данный пример показывает, что активатор протеинкиназы С в относительно низкой концентрации (примерно 20 нМ) в сочетании с ингибитором BMP можно использовать для формирования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, при этом более 90% клеток одновременно экспрессируют PDX1 и NKX6.1.
Таблица 1
  Доля общей популяции, %
PDX-1 NKX6.1 ISL-1 CDX-2 NeuroD1
PDBu+NG (обработка 4) 94,2 91,5 32,2 8,9 22,3
Alk5i+NG+PDBu (обработка 5) 90,7 80,3 52,4 15 57,1
FGF10+PDBu (обработка 6) 98,3 95 10,1 51,1 12,2
Пример 4
Альтернативный способ формирования популяции клеток, составляющих предмет настоящего изобретения
Клетки линии эмбриональных стволовых клеток человека H1 культивировали в покрытых MATRIGEL® (разведение 1:30) (BD Biosciences; № по кат. 356231) чашках со средой RPMI (Invitrogen, № по кат. 22400) + 0,2% FBS + 100 нг/мл активина A (PeproTech; № по кат. 120-14) + 20 нг/мл WNT-3a (R&D Systems; № по кат. 1324-WN/CF) в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI, дополненной 0,5% FBS + 100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затем
а. DMEM/F12 + 2% FBS + 50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем либо
b. обработка 7 (T7): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 3), либо
c. обработка 8 (T8): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 0,25 мкМ циклопамин-KAAD + 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) + 100 нг/мл Ноггина + 50 нг/мл FGF7 в течение четырех дней (стадия 3), затем либо
d. обработка 9 (T9): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 100 нг/мл Ноггина + 1 мкМ ингибитора ALK5 II + 20 нМ PDBu в течение четырех дней (стадия 4), или
e. обработка 10 (T10): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 50 нг/мл FGF10 + 20 нМ PDBu в течение четырех дней (стадия 4), или
f. обработка 11 (T11): DMEM с высоким содержанием глюкозы + 1% B27 + 20 нМ PDBu + 100 нг/мл Ноггина в течение четырех дней (стадия 4).
Образцы культур отбирали в дублях на стадии 4, день 4, и получали их изображения с помощью анализатора IN Cell Analyzer 1000 (GE Healthcare). Для компенсации возможных потерь клеток в ходе процедур анализа и последующего окрашивания для каждой лунки снимали по 100 проекций. Для каждой лунки с использованием программного обеспечения IN Cell Developer Toolbox 1.7 (GE Healthcare) измеряли общее количество клеток, общее количество клеток, экспрессирующих PDX1, общее количество клеток, экспрессирующих NKX6.1, и общее количество клеток, экспрессирующих CDX2. Для каждой повторной совокупности данных рассчитали средние значения и стандартные отклонения. Общие количества клеток, экспрессирующих PDX 1, NKX6.1 и CDX-2, приведены в процентах от общей популяции клеток.
В популяциях клеток, обработанных T7 с последующим добавлением среды T9, приблизительно 80% клеток в популяции экспрессировали NKX6.1. См. таблицу 2. В популяциях клеток, обработанных T7 с последующим добавлением среды T10, приблизительно 90% клеток экспрессировали NKX6.1, при этом в данном варианте обработки отмечали больше клеток, экспрессирующих CDX2. См. таблицу 2. Обработка популяций клеток T7 с последующей обработкой средой T11 приводила к популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где 93% клеток в популяции экспрессировали NKX6.1. Большинство клеток популяций, экспрессирующих NKX6.1, также экспрессировали PDX1.
Культуры, обработанные T8 с последующей обработкой средой T9, формировали популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где 56,7% клеток популяции экспрессировали NKX6.1. См. таблицу 2. Культуры, обработанные T8 с последующей обработкой средой T10, формировали популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где 63,5% клеток популяции экспрессировали NKX6.1, после обработки отмечалось возрастание числа клеток, экспрессирующих CDX2. См. таблицу 2. Культуры, обработанные T8 с последующей обработкой средой Т11, формировали популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где 74% клеток популяции экспрессировали NKX6.1. См. таблицу 2. Большинство экспрессирующих NKX6.1 клеток также экспрессировали PDX 1.
ПЦР-анализ также подтвердил результаты, полученные на анализаторе IN Cell, в том что обработка ретиноевой кислотой, циклопамином и Ноггином на стадии 3 с последующим добавлением активатора PKC на стадии 4 на день 4 стадии 4 приводила к повышению уровней мРНК для NKX6.1 и PTF1 альфа (фиг. 5A-5D).
Таблица 2
  Обработка 7 (RA+Ноггин+циклопамин) Обработка 8 (RA+Ноггин+циклопамин+FGF7)
  PDX-1 NKX6.1 CDX2 PDX-1 NKX6.1 CDX2
Обработка 9 95,6 80,5 3,1 93,6 56,7 3,2
Обработка 10 98,3 90,1 32 92,8 63,5 12
Обработка 11 96,6 93,1 12,9 94,2 74,6 5,5
Все цитируемые в настоящем документе публикации полностью включены в настоящий документ путем ссылки. Хотя различные аспекты настоящего изобретения проиллюстрированы выше путем ссылки на примеры и предпочтительные варианты осуществления, подразумевается, что сущность настоящего изобретения ограничивается не указанным выше описанием, а следующими пунктами формулы изобретения, составленными в соответствии с принципами патентного законодательства.

Claims (6)

1. Изолированная популяция клеток человека, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, где указанная изолированная популяция клеток человека получена путем культивирования линии эмбриональных стволовых клеток человека, выбранной из группы, включающей H1 (код NIH: WA01), Н7 (код NIH: WA07) и Н9 (код NIH: WA09) (WiCell Research Institute (WiCell)) в среде, дополненной активатором протеинкиназы С, причем более 60% клеток в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, одновременно экспрессируют PDX1 и NKX6.1, и где клетки в популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, экспрессируют CDX2.
2. Популяция клеток по п. 1, в которой более 70% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX1 и NKX6.1.
3. Популяция клеток по п. 1, в которой более 80% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX1 и NKX6.1.
4. Популяция клеток по п. 1, в которой более 90% клеток в популяции одновременно экспрессируют PDX1 и NKX6.1.
5. Выделенная популяция клеток по п. 1, в которой клетки в популяции клеток экспрессируют ISLS1 и/или NEUORD1.
6. Выделенная популяция клеток по п. 1, в которой активатор протеинкиназы С выбран из группы, состоящей из (2S,5S)-(Е,Е)-8-(5-(4-(Трифторметил)фенил)-2,4-пентадиемоиламино)бензолактама (ТРВ), форбол-12-миристат-13-ацетата (РМА) и форбол-12,13-дибутирата (PDBu).
RU2012153676/10A 2010-05-12 2011-05-11 Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека RU2587634C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US33383110P 2010-05-12 2010-05-12
US61/333,831 2010-05-12
PCT/US2011/036043 WO2011143299A2 (en) 2010-05-12 2011-05-11 Differentiation of human embryonic stem cells

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016118225A Division RU2663339C1 (ru) 2010-05-12 2011-05-11 Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2012153676A RU2012153676A (ru) 2014-06-20
RU2587634C2 true RU2587634C2 (ru) 2016-06-20

Family

ID=44912123

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012153676/10A RU2587634C2 (ru) 2010-05-12 2011-05-11 Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
RU2016118225A RU2663339C1 (ru) 2010-05-12 2011-05-11 Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2016118225A RU2663339C1 (ru) 2010-05-12 2011-05-11 Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека

Country Status (17)

Country Link
US (2) US9752125B2 (ru)
EP (2) EP3498825A1 (ru)
JP (4) JP6050225B2 (ru)
KR (2) KR101986176B1 (ru)
CN (2) CN107338217B (ru)
AR (1) AR081040A1 (ru)
AU (1) AU2011250912A1 (ru)
BR (1) BR112012028855A2 (ru)
CA (1) CA2800610C (ru)
DK (1) DK2569419T3 (ru)
ES (1) ES2728900T3 (ru)
MX (1) MX351515B (ru)
PH (1) PH12018500672A1 (ru)
RU (2) RU2587634C2 (ru)
SG (2) SG185511A1 (ru)
WO (1) WO2011143299A2 (ru)
ZA (1) ZA201209383B (ru)

Families Citing this family (45)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9080145B2 (en) 2007-07-01 2015-07-14 Lifescan Corporation Single pluripotent stem cell culture
DK2185693T3 (da) 2007-07-31 2019-09-23 Lifescan Inc Differentiering af humane embryoniske stamceller
MX2010005805A (es) 2007-11-27 2010-06-09 Lifescan Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
KR20190057164A (ko) 2008-02-21 2019-05-27 얀센 바이오테크 인코포레이티드 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물
EP2310492B1 (en) 2008-06-30 2015-07-22 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
AU2009309044B2 (en) 2008-10-31 2015-07-09 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
JP5785088B2 (ja) 2008-10-31 2015-09-24 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の膵内分泌系への分化
EP3363444B1 (en) 2008-11-14 2022-09-14 ViaCyte, Inc. Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells
BRPI0920956A2 (pt) 2008-11-20 2015-08-18 Centocor Ortho Biotech Inc Cultura de células-tronco pluripotentes em microveículos
BRPI0921996A2 (pt) 2008-11-20 2015-08-18 Centocor Ortho Biotech Inc Métodos e composições para cultura e ligação de células em substratos planos.
CA2768643C (en) 2009-07-20 2018-09-18 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
RU2701335C2 (ru) 2009-12-23 2019-09-25 Янссен Байотек, Инк. Способ получения популяции панкреатических эндокринных клеток, соэкспрессирующих nkx6.1 и инсулин, и способ лечения диабета
JP6013196B2 (ja) 2010-03-01 2016-10-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法
RU2587634C2 (ru) 2010-05-12 2016-06-20 Янссен Байотек, Инк. Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
MX355340B (es) 2010-08-31 2018-04-16 Janssen Biotech Inc Diferenciación de células madre embrionarias humanas.
SG10201506852VA (en) 2010-08-31 2015-10-29 Janssen Biotech Inc Differentiation of human embryonic stem cells
JP6312591B2 (ja) 2011-06-21 2018-04-18 ノヴォ ノルディスク アー／エス 多能性幹細胞からの胚体内胚葉の効率的な誘導
RU2668798C2 (ru) 2011-12-22 2018-10-02 Янссен Байотек, Инк. Способы in vitro пошаговой дифференцировки полюрипотентных клеток
CN104160018A (zh) 2012-03-07 2014-11-19 詹森生物科技公司 用于扩增和维持多能干细胞的成分确定的培养基
ES2690118T3 (es) 2012-06-08 2018-11-19 Janssen Biotech, Inc. Diferenciación de células madre embrionarias humanas en células endocrinas pancreáticas
CN113265370A (zh) * 2012-06-26 2021-08-17 塞拉克西斯股份有限公司 可用于治疗胰岛素依赖性糖尿病的干细胞和胰腺细胞
JP6470687B2 (ja) * 2012-09-03 2019-02-13 ノヴォ ノルディスク アー／エス 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製
GB201216796D0 (en) * 2012-09-20 2012-11-07 Cambridge Entpr Ltd In vitro pancreatic differentiation
DK2938722T3 (da) 2012-12-31 2022-02-14 Janssen Biotech Inc Suspension og klyngedannelse af humane pluripotente celler til differentiering til endokrine pankreasceller
ES2837763T3 (es) * 2012-12-31 2021-07-01 Janssen Biotech Inc Cultivo de células madre embrionarias humanas en la interconexión aire-líquido para la diferenciación en células endocrinas pancreáticas
US10370644B2 (en) 2012-12-31 2019-08-06 Janssen Biotech, Inc. Method for making human pluripotent suspension cultures and cells derived therefrom
MX2015008578A (es) 2012-12-31 2015-09-07 Janssen Biotech Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas en celulas endocrinas pancreaticas mediante el uso de relugadores de hb9.
EP3569694A1 (en) 2013-06-11 2019-11-20 President and Fellows of Harvard College Sc-beta cells and compositions and methods for generating the same
EP2896688A1 (en) * 2014-01-20 2015-07-22 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) A method of producing beta pancreatic cells from progenitor cells through the use of hydrogen peroxide
CN117821369A (zh) 2014-05-16 2024-04-05 詹森生物科技公司 小分子增强胰腺内分泌细胞中的mafa表达的用途
WO2016038038A1 (en) * 2014-09-08 2016-03-17 Fundacion Publica Andaluza Progreso Y Salud Method for obtaining pancreatic beta cell surrogates by increasing pancreatic and duodenal homeobox 1 (pdx-1) expression
WO2016100898A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived b cells and uses thereof
DK3234110T3 (da) 2014-12-18 2024-05-13 Harvard College FREMGANGSMÅDER TIL GENERERING AF STAMCELLE-AFLEDTE ß-CELLER OG ANVENDELSER DERAF
CN113234661A (zh) 2014-12-18 2021-08-10 哈佛学院校长同事会 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法
WO2016100921A1 (en) * 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College METHODS FOR GENERATING STEM CELL-DERIVED β CELLS AND USES THEREOF
US10392598B2 (en) 2015-06-19 2019-08-27 Emory University Methods of measuring cell purity for making quality control determinations and related compositions
US11274280B2 (en) 2016-02-24 2022-03-15 Novo Nordisk A/S Generation of functional beta cells from human pluripotent stem cell-derived endocrine progenitors
MA45479A (fr) 2016-04-14 2019-02-20 Janssen Biotech Inc Différenciation de cellules souches pluripotentes en cellules de l'endoderme de l'intestin moyen
JPWO2018159805A1 (ja) * 2017-03-03 2020-01-09 国立大学法人京都大学 膵前駆細胞の製造方法
CN111630155B (zh) * 2017-11-15 2024-05-03 沃泰克斯药物股份有限公司 胰岛细胞制备性组合物和使用方法
WO2020033879A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Semma Therapeutics, Inc. Stem cell derived islet differentiation
CA3139292A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 Timothy M. BRUHN Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances
US20220370184A1 (en) 2019-05-31 2022-11-24 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
CN114206480B (zh) 2019-05-31 2024-06-04 W.L.戈尔及同仁股份有限公司 生物相容性膜复合材料
CA3139585C (en) 2019-05-31 2024-01-23 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2009123458A (ru) * 2006-11-20 2010-12-27 Октагене Гмбх (De) Генетическая абляция клеток, несущих ген prp, с использованием стратегии направленной промоторной ловушки для получения бессывороточных рекомбинантных белков в качестве терапевтических препаратов

Family Cites Families (241)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US709392A (en) 1902-05-06 1902-09-16 Haydn Brown Suture-clamp.
US2232142A (en) 1940-09-27 1941-02-18 Schumann Seymour Wound clip
US2814296A (en) 1954-04-15 1957-11-26 S & R J Everett & Co Ltd Surgical needles
US3209652A (en) 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
CA1201400A (en) 1982-04-16 1986-03-04 Joel L. Williams Chemically specific surfaces for influencing cell activity during culture
US4499802A (en) 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5215893A (en) 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
US5804178A (en) 1986-11-20 1998-09-08 Massachusetts Institute Of Technology Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue
US5567612A (en) 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
US4898156A (en) 1987-05-18 1990-02-06 Mitek Surgical Products, Inc. Suture anchor
NZ229354A (en) 1988-07-01 1990-09-26 Becton Dickinson Co Treating polymer surfaces with a gas plasma and then applying a layer of endothelial cells to the surface
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
ATE181575T1 (de) 1991-04-25 1999-07-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Rekombinierte humane antikörper gegen den humanen interleukin 6-rezeptor
US5449383A (en) 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
US5341922A (en) 1993-02-24 1994-08-30 Ethicon, Inc. Peelable foil suture packaging
CA2159804A1 (en) 1993-04-08 1994-10-27 Hayden G. Coon Cell culturing method and medium
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (ru) 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US6703017B1 (en) 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
EP0800829B2 (en) 1994-12-29 2012-07-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Use of a pm-1 antibody or of a mh 166 antibody for enhancing the anti-tumor effect of cisplatin or carboplatin
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
CA2297176A1 (en) 1997-04-24 1998-10-29 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory diseases
CA2294944A1 (en) 1997-07-03 1999-01-14 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells from peripheral blood
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
ATE462004T1 (de) 1997-09-16 2010-04-15 Centocor Inc Methoden zur kompletten chemischen synthese und zusammensetzung von genen und genomen
US6800480B1 (en) 1997-10-23 2004-10-05 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
CO4980885A1 (es) 1997-12-29 2000-11-27 Ortho Mcneil Pharm Inc Compuestos de trifenilpropanamida utiles en el tratamiento de inflamaciones y metodos para preparar dicho compuesto
CA2320040C (en) 1998-03-18 2007-05-22 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US6413773B1 (en) 1998-06-01 2002-07-02 The Regents Of The University Of California Phosphatidylinositol 3-kinase inhibitors as stimulators of endocrine differentiation
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6610540B1 (en) 1998-11-18 2003-08-26 California Institute Of Technology Low oxygen culturing of central nervous system progenitor cells
US6413556B1 (en) 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
CA2359159A1 (en) 1999-01-21 2000-07-27 Vitro Diagnostics, Inc. Immortalized cell lines and methods of making the same
US6815203B1 (en) 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
US6306424B1 (en) 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
AU7719300A (en) 1999-09-27 2001-04-30 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
EP1240518A4 (en) 1999-12-13 2006-05-17 Scripps Research Inst MARKERS FOR THE IDENTIFICATION AND INSULATION OF PRE-GENERIC CELLS OF A AND B PANCREAS ISOLATED CELLS
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
JP4621410B2 (ja) 2000-06-26 2011-01-26 Ｎｃメディカルリサーチ株式会社 神経細胞へ分化しうる細胞分画の調製方法及び神経変性疾患治療薬の製造方法
CA2426654C (en) 2000-10-23 2010-12-21 Smithkline Beecham Corporation 2,4,8-trisubstituted-8h-pyrido[2,3-d}pyrimidin-7-one compounds
US6849643B2 (en) 2000-12-08 2005-02-01 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Indazolyl-substituted pyrroline compounds as kinase inhibitors
AU2002227371B2 (en) 2000-12-08 2007-05-10 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Macroheterocylic compounds useful as kinase inhibitors
US6599323B2 (en) 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
JP2005503759A (ja) 2001-01-24 2005-02-10 アメリカ合衆国 幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化方法
US6713446B2 (en) 2001-01-25 2004-03-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Formulation of boronic acid compounds
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
DE10290025T1 (de) 2001-04-19 2003-10-09 Develogen Ag Verfahren zur Differenzierung von Stammzellen in Insulin-produzierende Zellen
WO2002088335A1 (fr) 2001-04-24 2002-11-07 Ajinomoto Co., Inc. Cellules souches et procede d'extraction de ces cellules
WO2002092756A2 (en) 2001-05-15 2002-11-21 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Insulin producing cells derived from human embryonic stem cells
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
AU2002319780A1 (en) 2001-08-06 2003-02-24 Bresagen, Ltd. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US6617152B2 (en) 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
EP1298201A1 (en) 2001-09-27 2003-04-02 Cardion AG Process for the production of cells exhibiting an islet-beta-cell-like state
US20030138951A1 (en) 2001-10-18 2003-07-24 Li Yin Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
JP4330995B2 (ja) 2001-11-15 2009-09-16 チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 絨毛膜絨毛、羊水、および胎盤からの胎児性幹細胞を単離、増殖、および分化させる方法、ならびにその治療的使用方法
EP2264146A1 (en) 2001-12-07 2010-12-22 Geron Corporation Islet cells from human embryonic stem cells
CA2469370C (en) 2001-12-07 2014-07-08 Macropore Biosurgery, Inc. Adipose-derived cell processing unit
WO2003054169A1 (en) 2001-12-21 2003-07-03 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
WO2003055992A2 (en) 2001-12-28 2003-07-10 Cellartis Ab A method for the establishment of a pluripotent human blastocyst-derived stem cell line
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
CA2482716A1 (en) 2002-04-17 2003-10-23 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method of forming pancreatic .beta. cells from mesenchymal cells
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
ES2300573T3 (es) 2002-05-08 2008-06-16 Janssen Pharmaceutica Nv Inhibidores de cinasa sustituidos con pirrolina.
US20060003446A1 (en) 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
AU2003273573A1 (en) 2002-05-28 2003-12-19 Becton, Dickinson And Company Expansion and transdifferentiation of human acinar cells
RU2004135382A (ru) 2002-06-05 2005-06-27 Янссен Фармацевтика Н.В. (Be) Замещенные пирролины в качестве ингибиторов киназы
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
WO2004011621A2 (en) 2002-07-29 2004-02-05 Es Cell International Pte Ltd. Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose
US20040063204A1 (en) 2002-08-14 2004-04-01 Lijun Yang Bone marrow cell differentiation
EP1539928A4 (en) 2002-09-06 2006-09-06 Amcyte Inc POSIOTIVE PANCREATIC ENDOCRINE PROGENITOR CELLS CD56 IN ADULT HUMAN BEINGS
US9969977B2 (en) 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
AU2003285172A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 The Johns Hopkins University Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
WO2004050827A2 (en) 2002-12-05 2004-06-17 Technion Research & Development Foundation Ltd. Cultured human pancreatic islets, and uses thereof
EP2457999B1 (en) 2002-12-16 2018-10-17 Technion Research & Development Foundation Ltd. Culture medium for pluripotent stem cells
RU2359671C2 (ru) 2003-01-29 2009-06-27 Такеда Фармасьютикал Компани Лимитед Способ получения препарата с покрытием
CA2514539C (en) 2003-01-29 2012-03-06 Takeda Pharmaceutical Company Limited Process for producing coated preparation
WO2004073633A2 (en) 2003-02-14 2004-09-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
US20070154981A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
CA2520861A1 (en) 2003-03-27 2004-10-14 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
WO2004090110A2 (en) 2003-03-31 2004-10-21 Bresagen Inc. Compositions and methods for the control, differentiation and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
EP1649013B1 (en) 2003-06-27 2016-01-20 DePuy Synthes Products, Inc. Cartilage and bone repair and regeneration using postpartum-derived cells
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
WO2005017117A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Martin Haas Multipotent amniotic fetal stem cells (mafsc) and banking of same
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
WO2005021728A2 (en) 2003-08-27 2005-03-10 Stemcells California, Inc. Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations
US6939633B2 (en) 2003-09-17 2005-09-06 General Motors Corporation Fuel cell shutdown and startup using a cathode recycle loop
JP2007515433A (ja) 2003-12-17 2007-06-14 アラーガン　インコーポレイテッド Ｃｙｐ２６ａおよびｃｙｐ２６ｂの選択的阻害剤を使用するレチノイド反応性障害の処置方法
US20060030042A1 (en) 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
CN112813019A (zh) 2003-12-23 2021-05-18 维亚希特公司 定形内胚层
EP2722387B1 (en) 2003-12-23 2019-12-11 Viacyte, Inc. Definitive endoderm
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
TWI334443B (en) 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US20050233446A1 (en) 2003-12-31 2005-10-20 Parsons Xuejun H Defined media for stem cell culture
US7794704B2 (en) 2004-01-23 2010-09-14 Advanced Cell Technology, Inc. Methods for producing enriched populations of human retinal pigment epithelium cells for treatment of retinal degeneration
US20080241107A1 (en) 2004-01-23 2008-10-02 Copland Iii John A Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells
GB2441530B (en) 2004-02-12 2009-09-23 Univ Newcastle Stem Cells
JP4901471B2 (ja) 2004-02-19 2012-03-21 国立大学法人京都大学 体細胞核初期化物質のスクリーニング方法
WO2005086860A2 (en) 2004-03-09 2005-09-22 Gang Xu Methods for generating insulin-producing cells
WO2005086845A2 (en) 2004-03-10 2005-09-22 Regents Of The University Of California Compositions and methods for growth of embryonic stem cells
WO2005097980A2 (en) 2004-03-26 2005-10-20 Geron Corporation New protocols for making hepatocytes from embryonic stem cells
CA2555571C (en) 2004-04-01 2012-10-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage
JP4926946B2 (ja) 2004-04-27 2012-05-09 ヴィアサイト，インコーポレイテッド Ｐｄｘ１発現性内胚葉
GB0410011D0 (en) * 2004-05-05 2004-06-09 Novartis Forschungsstiftung Neural cell differentiation method
EP1786896B1 (en) 2004-07-09 2018-01-10 Viacyte, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
KR20070083559A (ko) 2004-08-13 2007-08-24 더 유니버시티 오브 죠지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 인간 배아 줄기세포에서의 자가재생 및 분화를 위한 조성물및 방법
WO2006026473A2 (en) 2004-08-25 2006-03-09 University Of Georgia Research Foundation, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS UTILIZING MYC AND GSK3ß TO MANIPULATE THE PLURIPOTENCY OF EMBRYONIC STEM CELLS
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
JP5420837B2 (ja) 2004-09-08 2014-02-19 ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 胚幹細胞の培地及び培養
WO2006029198A2 (en) 2004-09-08 2006-03-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Culturing human embryonic stem cells
WO2006083782A2 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Es Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
ES2627419T3 (es) 2005-03-04 2017-07-28 Lifescan, Inc. Células estromales adultas derivadas del páncreas
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
CN103361302A (zh) 2005-03-31 2013-10-23 斯丹姆涅恩有限公司 从高度纯化来自羊膜的细胞群获得的细胞裂解产物的组合物
CN100425694C (zh) 2005-04-15 2008-10-15 北京大学 诱导胚胎干细胞向胰腺细胞分化的方法
WO2006113470A2 (en) 2005-04-15 2006-10-26 Geron Corporation Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities
WO2006114097A2 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Aarhus Universitet Biosurface structure array
JP4557797B2 (ja) 2005-05-20 2010-10-06 株式会社日立製作所 光ディスク装置
CN101238129A (zh) 2005-06-10 2008-08-06 Irm责任有限公司 维持胚胎干细胞多能性的化合物
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
WO2006137787A1 (en) 2005-06-21 2006-12-28 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for cell culture
AU2006262369B2 (en) 2005-06-22 2012-07-05 Asterias Biotherapeutics, Inc. Suspension culture of human embryonic stem cells
JP5345388B2 (ja) 2005-06-30 2013-11-20 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 環式アニリノ−ピリジノトリアジン
US20080194021A1 (en) 2005-07-29 2008-08-14 Mays Robert W Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells
AU2006274438A1 (en) 2005-07-29 2007-02-01 Australian Stem Cell Centre Limited Compositions and methods for growth of pluripotent cells
WO2007025234A2 (en) 2005-08-26 2007-03-01 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Generation of pancreatic endocrine cells from primary duct cell cultures and methods of use for treatment of diabetes
JP2009506769A (ja) 2005-09-02 2009-02-19 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 間充織幹細胞誘導方法
GB2444686B (en) 2005-09-12 2010-08-25 Es Cell Int Pte Ltd Differentiation of pluripotent stem cells using p38 MAPK inhibitors or prostaglandins
WO2008048671A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 University Of Illinois Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
AU2006304318B2 (en) 2005-10-14 2012-12-06 Regents Of The University Of Minnesota Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype
EP3584311A1 (en) 2005-10-27 2019-12-25 Viacyte, Inc. Pdx-1 expressing dorsal and ventral foregut endoderm
ES2367525T3 (es) 2005-12-13 2011-11-04 Kyoto University Factor de reprogramación celular.
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
KR20080109775A (ko) 2006-02-23 2008-12-17 노보셀, 인크 분화가능한 세포를 배양하는데 유용한 조성물 및 방법
JP6110048B2 (ja) 2006-03-02 2017-04-05 ヴィアサイト，インコーポレイテッド 内分泌前駆細胞、膵臓ホルモン発現細胞及びそれらの製造方法
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
AU2007244675A1 (en) 2006-04-28 2007-11-08 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
US8685730B2 (en) 2006-05-02 2014-04-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Methods and devices for differentiating pluripotent stem cells into cells of the pancreatic lineage
JP5288209B6 (ja) 2006-05-02 2018-06-27 ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 幹細胞の内胚葉細胞および膵臓系列細胞への分化方法
WO2007139929A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 The Burnham Institute For Medical Research Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
CN101541953A (zh) 2006-06-02 2009-09-23 佐治亚大学研究基金会 通过从人胚胎干细胞获得的定形内胚层细胞的分化得到胰和肝内胚层细胞及组织
WO2007143193A1 (en) 2006-06-02 2007-12-13 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Pancreatic and liver endoderm cells and tissue by differentiation of definitive endoderm cells obtained from human embryonic stems
WO2007149182A2 (en) 2006-06-19 2007-12-27 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
CA2656175C (en) 2006-06-26 2018-08-28 Lifescan, Inc. Conditioned media obtained from amniotic fluid-derived cells for pluripotent stem cell culture
AU2007270069B2 (en) 2006-07-06 2013-05-16 Es Cell International Pte Ltd Method for stem cell culture and cells derived therefrom
AU2007277364B2 (en) 2006-07-26 2010-08-12 Viacyte, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
KR101331510B1 (ko) 2006-08-30 2013-11-20 재단법인서울대학교산학협력재단 저농도의 포도당을 함유하는 인간 배아줄기세포용 배지조성물 및 이를 이용한 인간 배아 줄기세포로부터 인슐린생산 세포 또는 세포괴로 분화시키는 방법, 그리고그로부터 유도된 인슐린 생산 세포 또는 세포괴
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2008039521A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Nmt Medical, Inc. Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
AU2007311026B2 (en) 2006-10-17 2012-05-17 Stiefel Laboratories, Inc. Talarazole metabolites
WO2008048647A1 (en) 2006-10-17 2008-04-24 Cythera, Inc. Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
JP5067949B2 (ja) 2006-11-09 2012-11-07 独立行政法人国立国際医療研究センター 霊長類動物胚性幹細胞の培養及び継代方法、並びにその分化誘導方法
WO2008086005A1 (en) 2007-01-09 2008-07-17 University Of South Florida Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
EP2126045A4 (en) 2007-01-30 2010-05-26 Univ Georgia EARLY MESODERM CELLS, STABLE POPULATION OF MESENDODERM CELLS WITH THE ABILITY TO GENERATE ENDODERM AND MESODERM CELL LINES AND MULTIPOTENTIAL MIGRATION CELLS
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
US7688908B2 (en) 2007-03-12 2010-03-30 Samsung Electronics Co., Ltd. System and method for processing wireless high definition video data using a shortened last codeword
WO2008148105A1 (en) 2007-05-25 2008-12-04 Medistem Laboratories, Inc. Endometrial stem cells and methods of making and using same
WO2009012428A2 (en) 2007-07-18 2009-01-22 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
RU2010107181A (ru) 2007-07-31 2011-09-20 Лайфскен, Инк. (Us) Дифференцировка плюрипотентных стволовых клеток с использованием питающих клеток человека
DK2185693T3 (da) 2007-07-31 2019-09-23 Lifescan Inc Differentiering af humane embryoniske stamceller
MX2010002179A (es) 2007-08-24 2010-04-27 Stichting Het Nl Kanker I Composicion para el tratamiento de enfermedades neoplasicas.
US20110151447A1 (en) 2007-11-06 2011-06-23 Children's Medical Center Corporation Method to produce induced pluripotent stem (ips) cells from non-embryonic human cells
MX2010005805A (es) * 2007-11-27 2010-06-09 Lifescan Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009096049A1 (ja) 2008-02-01 2009-08-06 Kyoto University 人工多能性幹細胞由来分化細胞
WO2009101407A2 (en) 2008-02-11 2009-08-20 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
KR20190057164A (ko) 2008-02-21 2019-05-27 얀센 바이오테크 인코포레이티드 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물
WO2009110215A1 (ja) 2008-03-03 2009-09-11 独立行政法人 科学技術振興機構 繊毛細胞の分化誘導方法
SG188918A1 (ru) 2008-03-17 2013-04-30 Agency Science Tech & Res
EP2283117B1 (en) 2008-04-21 2013-10-23 Viacyte, Inc. Methods for purifying pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US8338170B2 (en) * 2008-04-21 2012-12-25 Viacyte, Inc. Methods for purifying endoderm and pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
WO2009132083A2 (en) 2008-04-22 2009-10-29 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of pdx1+ pancreatic cells
US8623648B2 (en) 2008-04-24 2014-01-07 Janssen Biotech, Inc. Treatment of pluripotent cells
US7939322B2 (en) 2008-04-24 2011-05-10 Centocor Ortho Biotech Inc. Cells expressing pluripotency markers and expressing markers characteristic of the definitive endoderm
EP2993226B1 (en) 2008-06-03 2020-12-16 Viacyte, Inc. Growth factors for production of definitive endoderm
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
EP2310492B1 (en) 2008-06-30 2015-07-22 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
JP5785088B2 (ja) 2008-10-31 2015-09-24 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の膵内分泌系への分化
AU2009309044B2 (en) 2008-10-31 2015-07-09 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells to the pancreatic endocrine lineage
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
EP2356213B1 (en) 2008-11-04 2019-05-29 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods for differentiation thereof
EP3363444B1 (en) 2008-11-14 2022-09-14 ViaCyte, Inc. Encapsulation of pancreatic cells derived from human pluripotent stem cells
BRPI0920956A2 (pt) 2008-11-20 2015-08-18 Centocor Ortho Biotech Inc Cultura de células-tronco pluripotentes em microveículos
WO2010063848A1 (en) 2008-12-05 2010-06-10 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Method and medium for neural differentiation of pluripotent cells
WO2010091241A2 (en) * 2009-02-06 2010-08-12 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods for promoting the generation of definitive endoderm
CA2768643C (en) 2009-07-20 2018-09-18 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
JP5819826B2 (ja) 2009-07-20 2015-11-24 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の分化
FI20096288A0 (fi) 2009-12-04 2009-12-04 Kristiina Rajala Formulations and methods for culturing stem cells
RU2701335C2 (ru) 2009-12-23 2019-09-25 Янссен Байотек, Инк. Способ получения популяции панкреатических эндокринных клеток, соэкспрессирующих nkx6.1 и инсулин, и способ лечения диабета
EP2542666A4 (en) 2010-03-02 2014-05-07 Univ Singapore CULTURE ADDITIVES FOR PROMOTING A STEM CELL PROGRAMMING AND DIFFERENTIATION REACTION
JP5909482B2 (ja) 2010-03-31 2016-04-26 ザ スクリプス リサーチ インスティテュート 細胞の再プログラム
JP2013524836A (ja) 2010-04-25 2013-06-20 マウント・シナイ・スクール・オブ・メディスン 多能性細胞からの前部前腸内胚葉の生成
RU2587634C2 (ru) * 2010-05-12 2016-06-20 Янссен Байотек, Инк. Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
BR112013002811A8 (pt) 2010-08-05 2020-01-28 Wisconsin Alumni Res Found meios básicos simplificados para cultura celular pluripotente de humano
SG187947A1 (en) 2010-08-31 2013-03-28 Janssen Biotech Inc Differentiation of pluripotent stem cells
MY177150A (en) 2011-02-28 2020-09-08 Stempeutics Res Malaysia Sdn Bhd Isolation and expansion of adult stem cells, their therapeutic composition and uses thereof
US20130274184A1 (en) 2011-10-11 2013-10-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Er stress relievers in beta cell protection
RU2668798C2 (ru) 2011-12-22 2018-10-02 Янссен Байотек, Инк. Способы in vitro пошаговой дифференцировки полюрипотентных клеток
US10519422B2 (en) 2012-02-29 2019-12-31 Riken Method of producing human retinal pigment epithelial cells
ES2690118T3 (es) 2012-06-08 2018-11-19 Janssen Biotech, Inc. Diferenciación de células madre embrionarias humanas en células endocrinas pancreáticas
EP2970892A1 (en) 2013-03-15 2016-01-20 The Jackson Laboratory Isolation of non-embryonic stem cells and uses thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2009123458A (ru) * 2006-11-20 2010-12-27 Октагене Гмбх (De) Генетическая абляция клеток, несущих ген prp, с использованием стратегии направленной промоторной ловушки для получения бессывороточных рекомбинантных белков в качестве терапевтических препаратов

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Nelson SB1, Schaffer AE, Sander M., The transcription factors Nkx6.1 and Nkx6.2 possess equivalent activities in promoting beta-cell fate specification in Pdx1+ pancreatic progenitor cells, Development. 2007 Jul;134(13):2491-500. *

Also Published As

Publication number Publication date
JP2013526279A (ja) 2013-06-24
US20110281355A1 (en) 2011-11-17
MX351515B (es) 2017-10-17
WO2011143299A3 (en) 2012-03-01
US20170327793A1 (en) 2017-11-16
JP7149190B2 (ja) 2022-10-06
PH12018500672A1 (en) 2019-03-11
EP2569419A2 (en) 2013-03-20
MX2012013156A (es) 2013-01-17
CN102884176B (zh) 2017-09-05
JP2019068849A (ja) 2019-05-09
CN107338217A (zh) 2017-11-10
JP7535079B2 (ja) 2024-08-15
AR081040A1 (es) 2012-05-30
KR101903562B1 (ko) 2018-10-02
AU2011250912A1 (en) 2012-11-22
CA2800610C (en) 2019-09-24
DK2569419T3 (da) 2019-05-13
JP2022133411A (ja) 2022-09-13
EP2569419A4 (en) 2014-03-26
US9752125B2 (en) 2017-09-05
RU2663339C1 (ru) 2018-08-03
KR20180110180A (ko) 2018-10-08
ZA201209383B (en) 2018-12-19
CN107338217B (zh) 2021-02-09
ES2728900T3 (es) 2019-10-29
KR101986176B1 (ko) 2019-06-05
RU2018120334A (ru) 2019-12-02
JP6050225B2 (ja) 2016-12-21
SG10201503652WA (en) 2015-08-28
EP2569419B1 (en) 2019-03-20
CA2800610A1 (en) 2011-11-17
SG185511A1 (en) 2012-12-28
WO2011143299A2 (en) 2011-11-17
JP2017012178A (ja) 2017-01-19
JP6469047B2 (ja) 2019-02-13
EP3498825A1 (en) 2019-06-19
KR20130064750A (ko) 2013-06-18
RU2012153676A (ru) 2014-06-20
RU2018120334A3 (ru) 2022-04-07
CN102884176A (zh) 2013-01-16
BR112012028855A2 (pt) 2015-09-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7535079B2 (ja) ヒト胚性幹細胞の分化
RU2701335C2 (ru) Способ получения популяции панкреатических эндокринных клеток, соэкспрессирующих nkx6.1 и инсулин, и способ лечения диабета
RU2599420C2 (ru) Дифференцирование плюрипотентных стволовых клеток
RU2627168C2 (ru) Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
RU2579278C2 (ru) Популяция панкреатических эндокринных клеток-предшественников для снижения концентрации глюкозы в крови и способ дифференцировки панкреатических эндодермальных клеток
EP2456858B1 (en) Differentiation of human embryonic stem cells
KR20120037986A (ko) 인간 배아 줄기 세포의 분화
RU2805433C1 (ru) Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
RU2782271C2 (ru) Дифференцирование эмбриональных стволовых клеток человека
AU2018202016B2 (en) Differentiation of human embryonic stem cells
US20230151332A1 (en) Methods for making insulin in vivo