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CN101238129A - 维持胚胎干细胞多能性的化合物 - Google Patents

维持胚胎干细胞多能性的化合物 Download PDF

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CN101238129A
CN101238129A CNA200680028606XA CN200680028606A CN101238129A CN 101238129 A CN101238129 A CN 101238129A CN A200680028606X A CNA200680028606X A CN A200680028606XA CN 200680028606 A CN200680028606 A CN 200680028606A CN 101238129 A CN101238129 A CN 101238129A
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CN
China
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methyl
amino
ethyl
xnr
group
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Pending
Application number
CNA200680028606XA
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English (en)
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陈水冰
丁胜
闫凤
P·G·舒尔茨
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IRM LLC
Scripps Research Institute
Original Assignee
IRM LLC
Scripps Research Institute
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
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Abstract

本发明涉及用于培养胚胎干细胞(ES)的方法和组合物。所述方法涉及在无血清条件下、在没有饲养细胞和LIF时，在维持细胞的多能性/自我更新的式(I)的小分子存在下使ES细胞生长。这些方法部分地促进胚胎干细胞生产中更好的一致性，提供了例如胚胎干细胞在再生医学中实际应用的新途径。

Description

维持胚胎干细胞多能性的化合物
相关专利的交叉参考
发明领域
本申请要求于2005年6月10日提交的临时专利申请序号为60/689,359的美国申请的优先权。该申请的全部内容在这里被整体引入作为参考并用于所有目的。
发明背景
本发明涉及用于培养胚胎干细胞(ES)的方法和组合物。所述方法涉及在无血清条件下、在没有饲养细胞和LIF时，在维持细胞的多能性/自我更新的小分子存在下使ES细胞生长。这些方法部分地促进胚胎干细胞生产中更好的一致性，提供了例如胚胎干细胞在再生医学中实际应用的新途径。
发明背景
胚胎干细胞很难维持培养，因为它们倾向于自发地分化(即，获得特化的结构和/或功能特点)。干细胞分化是由于许多因素，包括生长因子、细胞外基质的分子和成分、环境应激源以及直接的细胞间相互作用造成的。
保持在增殖、未分化阶段的小鼠或人胚胎干细胞的逐代培养，是一个包括将细胞在补充了胎牛血清的生长培养基中和有时在未分裂细胞的饲养层上进行培养的多步骤的过程。如果向培养基中加入细胞因子--白血病抑制因子(LIF)，小鼠的胚胎干细胞可以在体外在没有饲养细胞的情况下生长，但是其仅在中到高细胞密度下有效并且来自单细胞的集落形成需要血清或者饲养层的存在。另外，对于人类胚胎干细胞而言，即使存在血清，LIF也不足以支持自我更新。
本发明提供了在不使用LIF的无血清的培养条件下使用小分子使胚胎干细胞自我更新的方法。使用本发明的小分子来维持胚胎干细胞的多能性可使胚胎干细胞的生产有更好的一致性，提供了例如胚胎干细胞在再生医学中实际应用的新途径。
发明概述
本发明一方面提供了维持多能干细胞的方法，包括在：a)基础培养基；和b)式I的化合物及其N-氧化物衍生物、前体药物衍生物、受保护的衍生物、单个异构体和异构体混合物、以及可药用的盐和溶剂化物(例如水合物)中使细胞生长的步骤：
Figure S200680028606XD00021
其中：
R1选自氢、C1-6烷基、C2-6链烯基、C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-10环烷基-C0-4烷基和C3-10杂环烷基-C0-4烷基；其中R1的任何烷基或链烯基任选地被一到三个独立地选自卤素、羟基、C1-6烷基和-NR2R3的基团所取代；其中R1的任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基任选地被一到三个选自卤素、羟基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6链烯基、卤代烷基、卤代烷氧基、-XNR2R3、-XOXNR2R3、-XNR2S(O)0-2R3、-XC(O)NR2R3、-XNR2C(O)XOR2、-XNR2C(O)NR2R3、-XNR2XNR2R3、-XC(O)NR2XNR2R3、-XNR2XOR2、-XOR2、-XNR2C(＝NR2)NR2R3、-XS(O)0-2R4、-XNR2C(O)R2、-XNR2C(O)XNR2R3、-XNR2C(O)R4、-XC(O)R4、-XR4、-XC(O)OR3和-XS(O)0-2NR2R3的基团所取代；其中X是键或C1-4亚烷基；R2和R3独立地选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基；且R4是任选地被1到3个选自C1-6烷基、-XNR2R3、-XNR2XNR2R2、XNR2XOR2和-XOR2的基团所取代的C3-10杂环烷基；其中X、R2和R3如上所述。
发明详述
定义
“烷基”作为一个基团和作为其它基团例如卤代烷基和烷氧基的结构元素，可以是直链或支链的。C1-4烷氧基包括甲氧基、乙氧基等。卤代烷基包括三氟甲基、五氟乙基等。
“芳基”是指包含6到10个碳原子的单环或稠合的二环芳环。例如，芳基可以是苯基或萘基，优选苯基。“亚芳基”是指衍生自芳基基团的二价基团。“杂芳基”被定义为其中一个或多个环原子是杂原子的芳基。例如杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并[1，3]二氧杂环戊烯、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、呋喃基、唑基、异唑基、三唑基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。
“环烷基”是指包含指定环原子数的饱和或部分不饱和的、单环、稠合二环或桥接的多环环系统。例如，C3-10环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。杂环烷基是指如本申请中所定义的环烷基，条件是一个或多个所述环碳被选自-O-、-N＝、-NR-、-C(O)-、-S-、-S(O)-或-S(O)2-的部分所替代，其中R是氢、C1-4烷基或氮保护基团。例如，在本申请中用于描述本发明化合物的C3-8杂环烷基包括吗啉代、吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮、2-氧代-吡咯-1-基、1，4-二氧杂-8-氮杂-螺[4-5]癸-8-基等。
“卤素”(或卤代)优选表示氯或氟，但也可以是溴或碘。
“治疗”是指减轻或缓解疾病和/或其伴随症状的方法。
优选的实施方案的说明
本发明涉及培养ES细胞的方法和组合物。所述方法涉及在没有饲养细胞和LIF的无血清条件下，在维持该细胞的多能性/自我更新的小分子存在下使ES细胞生长。
在一个实施方案中，关于式I的化合物：
R1选自氢、C1-6烷基、C2-6链烯基、C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-10环烷基-C0-4烷基和C3-10杂环烷基-C0-4烷基；其中R1的任何烷基或链烯基任选地被一至三个独立地选自卤素、羟基、C1-6烷基和-NR2R3的基团所取代；其中R1的任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基任选地被一至三个选自卤素、羟基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6链烯基、卤代烷基、卤代烷氧基、-XNR2R3、-XOXNR2R3、-XNR2S(O)0-2R3、-XC(O)NR2R3、-XNR2C(O)XOR2、-XNR2C(O)NR2R3、-XNR2XNR2R3、-XC(O)NR2XNR2R3、-XNR2XOR2、-XOR2、-XNR2C(＝NR2)NR2R3、-XS(O)0-2R4、-XNR2C(O)R2、-XNR2C(O)XNR2R3、-XNR2C(O)R4、-XC(O)R4、-XR4、-XC(O)OR3和-XS(O)0-2NR2R3的基团取代；其中X是键或C1-4亚烷基；R2和R3独立地选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基；且R4是任选地被1至3个选自C1-6烷基、-XNR2R3、-XNR2XNR2R2、XNR2XOR2和-XOR2的基团所取代的C3-10杂环烷基；其中X、R2和R3如上所述。
在另一个实施方案中，R1选自氢、甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、嘧啶基、3-羟基-1-甲基-丙基、羟基-乙基、苯基、吗啉代、苯甲基、[1，2，4]三唑-4-基、烯丙基、2-甲基-烯丙基、2-(2-氧代-吡咯烷-1-基)-乙基、哌嗪基-乙基、哌嗪基-丙基、噻唑基、唑基、吡啶基、吡唑基、哌啶基、噻唑基、乙基-吡咯烷基-甲基、吗啉代-丙基、二甲基-氨基-丙基、二乙基-氨基-丙基、二乙基-氨基-丁基、乙氧基-羰基-甲基和[1，2，4]三嗪-3-基、[1，3，4]噻二唑基；其中任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基任选地被1至3个独立地选自甲基、乙基、氰基、羟基、甲氧基、氨基-羰基-氨基、羟基-甲基、甲基-哌嗪基、甲基-哌嗪基-羰基、乙基-哌嗪基、甲基-哌嗪基-甲基、吗啉代-磺酰基、甲基-哌嗪基-磺酰基、甲基-哌嗪基-羰基-氨基、甲基-磺酰基-氨基、氨基-羰基、氨基-磺酰基、羟基-乙基、羟基-甲基-羰基-氨基、甲酰基-氨基、二甲基-氨基、二甲基-氨基-甲基、二甲基-氨基-乙基、异丙基-氨基-乙基、羧基、氨基-乙基-氨基、甲基-氨基-乙基、吗啉代-乙基、吗啉代-甲基、氨基-乙基、咪唑基-丙基、哌嗪基-乙基、哌嗪基、三氟甲基、二乙基-氨基-乙基、氟代、吗啉代、二甲基-氨基-乙基-氨基-羰基、二乙基-氨基-乙氧基、2-氨基-丙酰氨基、二甲基-氨基-吡咯烷基、(2-二甲氨基-乙基)-甲基-氨基、2-二甲氨基-1-甲基-乙氧基和二乙基-氨基的基团所取代。
本发明优选的化合物选自：N-{3-[7-(2-乙基-2H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{4-甲基-3-[1-甲基-7-(2-甲基-2H-吡唑-3-基氨基)-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{3-[7-(2，6-二甲基-吡啶-4-基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{3-[7-(3-羟基-苯基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{3-[7-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{3-[7-(3-氨基-苯基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{3-[7-(3-甲磺酰基氨基-苯基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-[4-甲基-3-(1-甲基-7-甲氨基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺；和N-[3-(7-乙氨基-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺。
另外优选的式I化合物详见于以下实施例和表1。
用途
ES细胞来源于植入前的胚胎并保留了胎儿的生成细胞的发育潜能，能够在体外和体内产生所有三个胚层的细胞和组织类型。ES细胞可被视为每次分裂时必须在自我更新(多能性)或可选择的分化之间进行选择的细胞。控制选择分化路径的信号由细胞微环境中的生长因子提供。生长因子可来自血清或由饲养细胞产生。
鉴别这些生长因子和限定它们各自的输入是了解由干细胞介导的组织增殖、转化、修复的发育和生理学上调控的关键。而且，将这些知识扩展到控制离体干细胞的扩增和分化上可保持在再生医学和生物制药发明中的应用前景。
小鼠ES细胞最初分离并联合培养在有丝分裂失活的小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上。成纤维细胞饲养层的必要功能是提供细胞因子--白血病抑制因子(LIF)。LIF缺失的成纤维细胞在支持自我更新上是有缺陷的且LIF可取代小鼠ES细胞常规增殖与重新诱导中对饲养细胞的需求。LIF与连接gp130受体的相关细胞因子提供了唯一的在分子水平上限定的维持小鼠ES细胞长期自我更新性的途径，该ES细胞保留了未分化表型、多能性和胚胎增殖能力的基本特性。
ES细胞可在添加LIF的商品化的血清代用品中增殖，但是这仅在中至高细胞密度时有效且从单细胞到集落形成需要血清或饲养层存在。而且，对于人ES细胞，即使存在血清，LIF也不足以支持自我更新。
本发明的方法支持了在无饲养细胞和LIF的无血清条件下培养多能干细胞。本发明的化合物通过它们与ERK1和RasGAP间的相互作用影响小鼠ES细胞的自我更新。例如，持续的ERK1/2活化导致神经元分化，同时抑制RasGAP可激活通过Ras或Ras类的GTP酶信号通路，其可依次通过P13K或其它信号通路增强自我更新。
骨形态生成蛋白(BMP)作为包含在血清中的或由饲养层提供的因子也被涉及，其协同LIF在体外维持未分化的小鼠ES细胞。目前的研究表明BMP可通过激活Smad通路和诱导Id基因的表达而替代ES细胞培养中对血清和饲养细胞的需求，Id基因是一种Smad信号通路的共有靶点，其通过负调节碱性的螺旋-环-螺旋蛋白质阻断分化。尽管BMP促进ES细胞的自我更新性的确切机制尚未确定，最近的研究表明它也可能抑制不依赖Smads的促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路。重要的是，对p38 MAPK的抑制促进缺乏Alk-3(BMPRIA)的胚泡产生ES细胞，且ES细胞可以从缺乏Smad4(所有Smad的共同配偶体)的胚泡中产生，支持了BMP通过基于存在或不存在血清或饲养细胞的不同机制来起作用的假说。
考虑到血清和饲养细胞提供细胞存活信号(其表现为生长因子与细胞因子)的可能性和外部的存活信号在低细胞密度环境中(此时来自自分泌和旁分泌因子的刺激作用最小)尤为重要，ES细胞在较差的培养条件下(即，在无血清和饲养细胞条件下)有可能出现细胞凋亡。在低细胞密度下，ES细胞很少产生多能性的集落。为分析单个细胞因子、生长因子以及其它分子对ES细胞自我更新和分化的作用，最好能够保护细胞免于在无血清和无饲养细胞条件下细胞凋亡。虽然使用添加了N2和B27的培养基在无血清和无饲养条件下扩增ES细胞改善了生存力，并因此使其甚至在低细胞密度条件下存活，但LIF加上这些添加物仍不能支持ES细胞的自我更新，除非培养基更进一步地补充BMP。因为N2和B27添加物包含激素(皮质酮、黄体酮和T3)与视黄醇乙酸酯(视黄酸的前体)并且这些组分中的部分用于ES细胞分化方案，它们的存在使对单个细胞因子、生长因子以及其它分子对ES细胞自我更新和分化作用的分析复杂化。
因此，开发在无血清培养条件下用于ES细胞自我更新的小分子，如本发明所述，将使ES细胞的生产具有更强的一致性，提供了在研究领域和再生医学领域中的ES细胞实际应用的新途径。
另外，开发在无血清培养条件下用于ES细胞自我更新的小分子，如本发明所述，对于限定ES细胞培养环境从而提供自我更新或分化的信号输入的限定和控制是必要的。
多能性的机制也可有助于我们对肿瘤发生的理解(多能干细胞可在体内形成肿瘤，而且在“stemness”基因上的分子改变也可导致肿瘤)。此外，有越来越多的证据表明干细胞与肿瘤细胞间的近亲关系：正常干细胞与肿瘤细胞自我更新的机制相似；涉及干细胞自我更新的发育信号通路的失控与肿瘤生成有关；肿瘤包括可能源自正常干细胞的“癌症干细胞”。
制备本发明化合物的方法
本发明也包括制备本发明化合物的方法。在所述的反应中，保护活性官能团是必需的，例如羟基、氨基、亚氨基、硫代或羧基基团，在希望其存在于终产物的情况下，避免它们不必要地参与反应。常规的保护基团可以按照标准规程使用，例如，参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts in“有机化学中的保护基团”，John Wiley and Sons，1991。
式I化合物可按下述反应方案I的程序制备：
反应方案I
Figure S200680028606XD00081
其中R1如发明概述中式I所定义。
式I化合物可通过使用合适的酰基活化剂(例如，HATU)在合适的碱(例如DIEA等)和适宜溶剂(例如，DMF)存在下将式2化合物与式3化合物偶合来制备，反应可能需3小时完成。
式I化合物可按下述反应方案II的程序制备：
反应方案II
Figure S200680028606XD00082
其中R1如发明概述中式I所定义。
式I化合物可通过将式4化合物与合适的胺在不存在或存在适宜溶剂(例如，AcOH-水)的条件下反应来制备。式I化合物也可通过将式4化合物与合适的胺在升高的温度下于加有对-甲苯磺酸的合适溶剂(例如，1-丁醇)中进行反应来制备。
或者，式I化合物可通过将式4化合物与式RiH的化合物按三种反应方法进行制备。对于杂芳基胺或芳基胺，反应在适当的催化剂(例如Pd(II)盐等)与适当的溶剂(例如，1，4-二烷，或其类似物)存在下、在温度约80至约150℃之间进行，可能需约20小时完成。烷基胺取代的反应条件包括在适当的溶剂(例如，DMSO、DMF等)中将式4化合物与5-10当量的胺进行加热。对于式4化合物与芳基胺的缩合，这些反应在酸(例如TsOH、HOAc、HCl等)存在下于合适溶剂(例如DMSO、DMF、乙醇等)中进行。
式I化合物合成的详细实例可见于下文的实施例。
制备本发明化合物的其它方法
本发明的化合物可通过将游离碱形式的化合物与可药用的无机或有机酸反应制备成可药用的酸加成盐。或者，本发明化合物的可药用的碱加成盐可通过将该化合物的游离酸形式与可药用的无机或有机碱反应制备。或者，本发明化合物的盐形式可用原料或中间体的盐制备。
本发明化合物的游离酸或游离碱形式可分别从相应的碱加成盐或酸加成盐制备。例如酸加成盐形式的本发明化合物通过用适当的碱(例如，氢氧化铵溶液、氢氧化钠，等等)处理可转化为相应的游离碱。本发明化合物的碱加成盐形式通过用适当的酸(例如，盐酸等)处理可转化为相应的游离酸。
本发明化合物的非氧化形式可在0至80C下于合适的惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醇、二烷水溶液等)中通过用还原剂(例如硫、二氧化硫、三苯基膦、氢硼化锂、氢化硼钠、三氯化磷、三溴化物，等等)处理本发明化合物的N-氧化物来制备。
本发明化合物的前体药物衍生物可通过本领域普通技术人员所知方法(例如，对于更多的细节可参见Saulnier等人(1994)，Bioorganic andMedicinal Chemistry Letters，Vol.4，p.1985)进行制备。例如，适宜的前体药物可通过将非衍生的本发明的化合物与合适的氨基甲酰化试剂(例如，1，1-酰氧基烷基碳酰氯(1，1-acyloxyalkylcarbanochloridate)、对-硝基苯基碳酸酯，等等)反应来制备。
本发明化合物受保护的衍生物可通过本领域普通技术人员所知方法进行制备。适用于产生和去除保护基团的技术的详细说明可见于T.W.Greene，“有机化学中的保护基团”，第3版，John Wiley and Sons，Inc.，1999。
本发明化合物可被方便地制成或在本发明的操作中形成溶剂化物(例如水合物)。本发明化合物的水合物可通过从水/有机溶剂混合物中重结晶来方便地制备，所用有机溶剂如二英、四氢呋喃或甲醇。
本发明化合物可通过将化合物的外消旋混合物与光学活性的拆分试剂反应形成一对非对映异构的化合物、分离该非对映异构体并且回收光学纯的对映异构体体制备成其单个立体异构体。当对映异构体的拆分可使用本发明化合物的共价非对映异构体衍生物来实现时，优选易分离的混合物(例如，结晶的非对映异构体的盐)。非对映异构体具有不同的物理性质(例如熔点、沸点、溶解度、反应性等)并可通过利用这些差异而容易地分离。非对映异构体可通过色谱，或优选地，通过基于溶解度差异的分离/拆分技术来分离。随后通过任何不会导致消旋作用的操作方法将光学纯的对映异构体与拆分试剂一起进行回收。适用于从其外消旋混合物中拆分立体异构体的技术的更详细说明可见于Jean Jacques，Andre Collet，Samuel H.Wilen，“对映异构体，外消旋物和拆分”，John Wiley And Sons，Inc.，1981.
概括地说，式I化合物可通过下述方法进行制备，其包括：
(a)反应方案I和II的那些反应；和
(b)任选地将本发明的化合物转化为可药用盐；
(c)任选地将本发明化合物的盐形式转化为非盐形式；
(d)任选地将本发明化合物的非氧化形式转化为可药用的N-氧化物；
(e)任选地将本发明化合物的N-氧化物形式转化为其非氧化形式；
(f)任选地从本发明化合物异构体的混合物中拆分单个异构体；
(g)任选地将本发明的非衍生化合物转化为可药用的前体药物衍生物；和
(h)任选地将本发明化合物的前体药物衍生物转化为其非衍生形式。
在没有明确描述原料的制备的情况下，所述化合物为已知或可通过本领域类似的已知方法或如下文实施例中所公开的方法进行制备。
本领域的技术人员应当理解上述转化仅仅是本发明化合物制备方法的代表，可类似地使用其它熟知方法。
实施例
通过下述实例进一步例证本发明的式I化合物的制备(实施例)，但并不限制本发明的范围。
实施例1
N-{3-[7-(3-氨基-苯基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺
将5-溴-2，4-二氯-嘧啶(2.41g，10.6mmol)在约-20℃下用甲胺(8M在乙醇中，3.3mL)在四氢呋喃(15mL)中缓慢地进行处理。在约-20℃下搅拌30分钟后，将反应混合物分配在CHCl3和饱和NaHCO3之间。水层用另外的CHCl3萃取两次并将合并的有机层用MgSO4干燥，过滤和浓缩。粗产物经柱色谱法(SiO2，乙酸乙酯/己烷＝3/7)纯化以得到1.76g(75％)白色固体状的(5-溴-2-氯-嘧啶-4-基)-甲胺。
将(5-溴-2-氯-嘧啶-4-基)-甲胺(3.75g，16.9mmol)、三(二苯亚甲基丙酮)二钯(0)(388mg，0.4mmol)和三-2-呋喃基膦(777mg，3.3mmol)在DMF中的混合物在室温下搅拌20分钟，然后加入三丁基乙烯基锡(5.93mL，20.3mmol)。在大约65℃搅拌16小时后，将反应混合物冷却至室温并与10％氟化钾水溶液(800mL)和乙醚(600mL)一起搅拌1小时，之后通过一层Celite过滤。用另外一部分乙醚(200mL)冲洗Celite。分离水层并用CHCl3萃取。合并的有机萃取物用MgSO4干燥并减压浓缩以产生粗的油状物，其通过快速柱色谱(SiO2，乙酸乙酯/己烷＝1/4)纯化以提供白色固体状的(2-氯-5-乙烯基-嘧啶-4-基)-甲胺(2.63g，92％)。
将(2-氯-5-乙烯基-嘧啶-4-基)-甲胺(2.50g，14.7mmol)在CHCl3/MeOH(15mL/15mL)中的溶液用臭氧鼓泡30分钟，然后在-78℃下通过氩气流3分钟。使反应混合物加温至室温并用二甲基硫醚(3.24mL，44.1mmol)处理。反应混合物减压浓缩得到无色油，其通过快速柱色谱(SiO2，乙酸乙酯/己烷＝1/3)经硅胶纯化得到白色固体状的2-氯-4-甲氨基-嘧啶-5-甲醛(2.40g，95％)。
将2-氯-4-甲氨基-嘧啶-5-甲醛(1.08g，6.3mmol)和N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基苯甲酰胺(2.04g，6.9mmol)在甲醇(70mL)中的溶液在45℃下搅拌2小时，然后先后用氰基硼氢化钠(1.19g，18.9mmol)和醋酸(1mL)处理。在室温下搅拌2小时后，反应混合物用CHCl3稀释并用饱和NaHCO3洗涤。有机层用MgSO4干燥并减压浓缩。残余物用快速柱色谱(SiO2，乙酸乙酯/己烷＝1/2)纯化得到白色固体状的N-{3-[(2-氯-4-甲氨基嘧啶-5-基甲基)氨基]-4-甲基苯基}-3-三氟甲基苯甲酰胺(1.80g，64％)。
在0℃下向搅拌的N-{3-[(2-氯-4-甲氨基嘧啶-5-基甲基)氨基]-4-甲基苯基}-3-三氟甲基苯甲酰胺(559mg，1.24mmol)和三乙胺(693μL，4.97mmol)在四氢呋喃(15mL)的溶液中加入三光气(147mg，0.49mmol)在四氢呋喃(5mL)中的溶液，并将混合物在室温下搅拌30分钟。滤出沉淀物并将滤液在110℃下搅拌3小时。然后将反应混合物用乙酸乙酯稀释并用饱和NaHCO3洗涤。有机层用MgSO4干燥并在减压下浓缩得到粗的油状物，其通过快速柱色谱(SiO2，乙酸乙酯/己烷＝1/2)纯化得到白色固体状的N-[3-(7-氯-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-4-甲苯基]-3-三氟甲基苯甲酰胺(420mg，71％)。
将N-[3-(7-氯-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-4-甲基苯基]-3-三氟甲基苯甲酰胺(35-0mg，73-6mmol)和苯二胺(79-5mg，736mmol)的混合物在100℃搅拌1小时。将混合物冷却至室温并混悬于甲醇中。收集沉淀物并用甲醇洗涤得到白色固体状的N-{3-[7-(3-氨基-苯氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺(34mg，84％)；1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ9.22(s，1H)，8.29(s，1H)，8.25(d，1H)，8.10(s，1H)，7.95(d，1H)，7.78-7.76(m，2H)，7.62(dd，1H)，7.30(d，1H)，7.05(d，1H)，6.88(d，1H)，6.87(s，1H)，6.17(dd，1H)，4.92(s，2H)，4.67(d，1H)，4.49(d，1H)，3.33(s，3H)，2.12(s，3H)；MS m/z 548.3(M+1)。
实施例2
N-[4-甲基-3-(1-甲基-7-甲氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺
Figure S200680028606XD00131
在0℃下将7N NH3(13.9mL)在甲醇中的溶液加入4-氯-2-甲硫基-5-嘧啶甲酸乙酯(4.50g，19.4mmol)在甲醇中的搅拌的溶液中，并将混合物在室温搅拌2小时。反应混合物用乙酸乙酯稀释并用饱和NaHCO3溶液洗涤。有机层通过MgSO4干燥，过滤和浓缩。粗产物从乙酸乙酯与己烷的混合溶剂中结晶得到2.90g(66％)白色固体状的4-氨基-2-甲硫基-5-嘧啶甲酸乙酯。
向搅拌的4-氨基-2-甲硫基-5-嘧啶甲酸乙酯(2.79g，13.1mmol)的溶液中加入4N NaOH(3.9mL)并将混合物在60℃搅拌3小时。浓缩反应混合物可定量地得到钠盐形式的4-氨基-2-甲硫基-5-嘧啶甲酸盐。
向钠盐形式的4-氨基-2-甲硫基-5-嘧啶甲酸(1.28g，6.2mmol)、N-(3-氨基-4-甲基-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺(1.82g，6.2mmol)和DIEA(3.22mL，18.5mmol)在DMF的溶液中加入HATU(2.82g，7.42mmol)，并将混合物在室温下搅拌1小时。反应混合物用乙酸乙酯稀释并用5％Na2S2O3的水溶液、饱和NaHCO3的水溶液和盐水洗涤。有机层通过MgSO4干燥并减压浓缩。粗产物从甲醇中结晶得到白色固体状的4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺(1-79g，61％)。
在0℃下向搅拌的4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-甲酸[2-甲基-5-(3-三氟甲基-苯甲酰基氨基)-苯基]-酰胺(286mg，0.62mmol)和二异丙基乙胺(864μL，4.96mmol)在二烷(10mL)中的溶液中加入三光气(184mg，0.62mmol)的二烷溶液(2mL)，并将混合物在100℃搅拌12小时。反应混合物用乙酸乙酯(50mL)稀释，并用饱和NaHCO3溶液洗涤。将有机层用MgSO4干燥，过滤，减压浓缩，从甲醇中结晶得到白色固体状的]-[4-甲基-3-(7-甲硫基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(166mg，55％)。
在0℃下将N-[4-甲基-3-(7-甲巯基-2，4-二氧-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(218mg，0.45mmol)加入NaH(在矿物油中60％的分散液，19.7mg，0.49mmol)在DMF的混悬液中。当停止产生H2时，加入碘甲烷(84μl，1.35mmol)并将反应混合物在室温下搅拌3小时。混合物用乙酸乙酯稀释，并用5％的Na2S2O3水溶液洗涤以除去DMF。有机层用MgSO4干燥并减压浓缩。粗产物从甲醇中结晶得到白色固体状的N-[4-甲基-3-(1-甲基-7-甲硫基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(184mg，82％)。
将间氯过氧苯甲酸(最高77％，97mg，44mmol)加入搅拌的N-[4-甲基-3-(1-甲基-7-甲硫基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(184mg，0.37mmol)在DMF(4mL)和氯仿(4mL)的混合溶剂中的溶液中，并将混合物在室温下搅拌1小时。混合物用氯仿稀释，并用5％的Na2S2O3水溶液和饱和NaHCO3溶液洗涤。有机层用MgSO4干燥并减压浓缩得到N-[3-(7-甲基亚磺酰基-1-甲基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(167mg，88％)。
将N-[3-(7-甲基亚磺酰基-1-甲基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(30mg，58μmol)溶解于在四氢呋喃中的2M甲胺溶液(1mL)中，并将混合物在60℃搅拌1小时。将反应混合物浓缩，溶于DMSO中，并通过制备型LCMS纯化得到N-[4-甲基-3-(1-甲基-7-甲氨基-2，4-二氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(20mg，71％)；1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ10.70(s，1H)，8.95(s，0.33H，8.85(s，0.66H)，8.39(m，3H)，8.11(d，1H)，7.93(t，1H)，7.84(m，2H)，7.49(d，1H)，3.65(d，2H)，3.58(s，1H)，3.08(m，3H)，2.17(s，3H)；MS m/z 485.3(M+1)。
通过重复上述实施例所描述的方法，使用适宜的原料，获得了如表1所鉴定的以下的式I化合物。
表1
Figure S200680028606XD00151
Figure S200680028606XD00161
Figure S200680028606XD00181
测定方法
使用饲养细胞依赖性的小鼠ES细胞系(其使用Oct4-GFP报告基因结构进行了基因工程操作并在未分化的多能性阶段表达绿色荧光蛋白(GFP))，对化合物在无饲养细胞和LIF条件下维持ES细胞未分化状态的能力进行筛选。本发明化合物在不需要LIF和饲养细胞下维持了小鼠ES细胞超过10次传代的未分化状态。多能ES细胞表达Oct4、Nanog、ALP、SSEA-1并形成致密的集落。通过松散的集落与扁平的和/或鹅卵石样细胞的存在来指示分化。通过本发明化合物扩增的小鼠ES细胞保留了多潜能细胞的多种标记物，包括Oct-4、nanog、SSEA-1和ALP，可在体外分化为功能性的神经元和心肌细胞并且可在体内供给健康的嵌合体小鼠。通过所述的TOPflash报告基因检测法还发现本发明化合物不能激活Wnt通路，而且通过免疫印迹法发现其不能激活JAK-STAT通路。
维持小鼠胚胎干细胞(mES)的自我更新
在涂覆了明胶的细胞培养板上在GM中用饲养细胞维持小鼠ES细胞。小鼠ES细胞每三天用0.05％胰蛋白酶-EDTA(0.5ml/孔)传代。最佳分传比是1∶6。
维持ES细胞及下文所述实施例4和5所用的材料包括：Oct4-GFPmES细胞(饲养层依赖性的细胞)；mES R1细胞(非饲养层依赖性的细胞)；DMEM(GIBCO，11965-084)；用于基因敲除的DMEM(KO DMEM)(GIBCO，10829-018)；DMEM/F12(GIBCO，11330-032)；胎牛血清(FBS)(GIBCO，26140-079)；用于基因敲除的血清替代品(KO-SR)，(GIBCO，10828-028)；B-27无血清添加剂(50X)，(GIBCO17504-044)；N-2添加剂(100X)(GIBCO，17502-048)；LIF(106个单位)(Chemicon，ESG1106)；L-谷氨酰胺(GIBCO，25030-081)；非必需氨基酸(GIBCO，11140-050)；2-巯基乙醇(1000X)，(GIBCO，21985-023)；0.05％胰蛋白酶-EDTA(GIBCO，25300-054)；0.1％明胶溶液(Stemcell tech.，07903)；基础培养基(BM):KODMEM、15％KO-SR、1X L-谷氨酰胺、1X非必须氨基酸、1X 2-巯基乙醇；以及生长培养基(GM)：基础培养基+103单位的LIF。
鉴定本发明化合物的筛选方法：
384孔板在37℃下用0.1％明胶溶液涂覆过夜。吸去明胶溶液。将Oct4-GFP小鼠ES(饲养层依赖性的)细胞在涂覆过明胶的板子上以1000个细胞/50μl GM/孔接种。培养过夜后，将培养基更换为BM并将5μM的化合物加入各孔。培养3天后，更换培养基并再次添加化合物。再过3天后，固定细胞并用荧光成像读板系统(FLIPR)进行检测。其中细胞保持GFP表达的孔被选为基础采样信号。基础采样信号经小鼠ES细胞集落形态学进行进一步验证。使用这种方法，确认本发明化合物可在无饲养层条件下维持小鼠ES细胞的自我更新。
实施例3
小鼠ES细胞在分化培养基(DM)中保持多能性。
通过视黄酸(RA)诱导的DM：BM+0.3μM RA，通过FBS诱导的DM：DMEM、20％FBS。将96孔板在37℃下用0.1％的明胶溶液涂覆过夜。吸去明胶溶液。将小鼠ES细胞在涂覆过明胶的板上以104个细胞/50μl GM/孔接种。培养过夜后，将培养基更换为DM并将3μM的本发明化合物加入各孔。培养三天后，将培养基更换为新鲜的培养基和化合物。再培养3天后，固定细胞并利用多能性标记的表达和集落形态学进行检测。有效浓度通过GFP表达的维持和集落形态学进行测定。本发明不同化合物的有效浓度的列表公开于下表3。
实施例4
无饲养层的多次传代的培养条件
将六孔板用每孔0.1％的明胶1ml涂覆并在37℃下孵育过夜。在除去明胶溶液后，小鼠ES细胞在每孔中以2×105个细胞/2ml培养基进行接种。细胞每三天用0.05％胰蛋白酶-EDTA(0.5ml/孔)传代。最佳分传比依赖于不同的培养基(表2)。表2显示了不同的无饲养层培养条件的实例，其中本发明化合物是N-{4-甲基-3-[1-甲基-7-(2-甲基-2H-吡唑-3-基氨基)-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺(化合物213，表1)。
表2.不同的无饲养层的培养条件
    培养基 最佳分传比
含有血清的培养条件 基础培养基+3μM本发明化合物     1∶6
无血清的培养条件 DMEM/F12，1X N2添加剂，1X B27添加剂，1X L-谷氨酰胺，1X-非必需氨基酸，1X 2-巯基乙醇，1μM本     1∶3
发明化合物
最佳的无血清培养条件-N2B27 DMEM/F12，1X N2添加剂，1X B27添加剂，1X L-谷氨酰胺，1X-非必需氨基酸，1X 2-巯基乙醇，103 LIF，300nM本发明化合物     1∶4
最佳的无血清培养条件-N2 DMEM/F12，1X N2添加剂，1X L-谷氨酰胺，1X-非必需氨基酸，1X 2-巯基乙醇，103 LIF，300nM本发明化合物     1∶3
表3：
Figure S200680028606XD00211
Figure S200680028606XD00221
Figure S200680028606XD00231
应当理解，实施例和本文所述的实施方案仅用于说明性的目的，在此基础上，本领域技术人员可以进行各种修饰或改变并且这些修饰和改变包含于本申请的主旨和范围以及所附权利要求的范围之内。所有在此处引用的公开物、专利和专利申请均引入本文作为参考。

Claims (5)

1.一种维持多能干细胞的方法，其包括在a)基础培养基；和b)式I的化合物及其可药用盐、水合物、溶剂合物和异构体中使细胞生长的步骤：
其中：
R1选自氢、C1-6烷基、C2-6链烯基、C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-10环烷基-C0-4烷基和C3-10杂环烷基-C0-4烷基；其中R1的任何烷基或链烯基可任选地被一到三个独立地选自卤素、羟基、C1-6烷基和-NR2R3的基团所取代；其中R1的任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基可任选地被一到三个选自卤素、羟基、氰基、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C2-6链烯基、  卤代烷基、  卤代烷氧基、-XNR2R3、-XOXNR2R3、-XNR2S(O)0-2R3、-XC(O)NR2R3、-XNR2C(O)XOR2、-XNR2C(O)NR2R3、-XNR2XNR2R3、-XC(O)NR2XNR2R3、-XNR2XOR2、-XOR2、-XNR2C(＝NR2)NR2R3、-XS(O)0-2R4、-XNR2C(O)R2、-XNR2C(O)XNR2R3、-XNR2C(O)R4、-XC(O)R4、-XR4、-XC(O)OR3和-XS(O)0-2NR2R3的基团所取代；其中X是键或C1-4亚烷基；R2和R3独立地选自氢、C1-6烷基和C3-12环烷基；且R4任选地被1到3个选自C1-6烷基、-XNR2R3、-XNR2XNR2R2、XNR2XOR2和-XOR2的基团所取代的C3-10杂环烷基；其中X、R2和R3如上所述。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是人胚胎干细胞。
4.如权利要求4所述的化合物，其中R1选自氢、甲基、乙基、异丙基、环丙基、环丁基、环戊基、环己基、嘧啶基、3-羟基-1-甲基-丙基、羟基-乙基、苯基、吗啉代、苯甲基、[1，2，4]三唑-4-基、烯丙基、2-甲基-烯丙基、2-(2-氧代-吡咯烷-1-基)-乙基、哌嗪基-乙基、哌嗪基-丙基、噻唑基、唑基、吡啶基、吡唑基、哌啶基、噻唑基、乙基-吡咯烷基-甲基、吗啉代-丙基、二甲基-氨基-丙基、二乙基-氨基-丙基、二乙基-氨基-丁基、乙氧基-羰基-甲基和[1，2，4]三嗪-3-基、[1，3，4]噻二唑基；其中任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基任选地被1至3个独立地选自甲基、乙基、氰基、羟基、甲氧基、氨基-羰基-氨基、羟基-甲基、甲基-哌嗪基、甲基-哌嗪基-羰基、乙基-哌嗪基、甲基-哌嗪基-甲基、吗啉代-磺酰基、甲基-哌嗪基-磺酰基、甲基-哌嗪基-羰基-氨基、甲基-磺酰基-氨基、氨基-羰基、氨基-磺酰基、羟基-乙基、羟基-甲基-羰基-氨基、甲酰基-氨基、二甲基-氨基、二甲基-氨基-甲基、二甲基-氨基-乙基、异丙基-氨基-乙基、羧基、氨基-乙基-氨基、甲基-氨基-乙基、吗啉代-乙基、吗啉代-甲基、氨基-乙基、咪唑基-丙基、哌嗪基-乙基、哌嗪基、三氟甲基、二乙基-氨基-乙基、氟、吗啉代、二甲基-氨基-乙基-氨基-羰基、二乙基-氨基-乙氧基、2-氨基-丙酰氨基、二甲基-氨基-吡咯烷基、(2-二甲氨基-乙基)-甲基-氨基、2-二甲氨基-1-甲基-乙氧基和二乙基-氨基的基团所取代。
5.如权利要求4所述的化合物，其选自：N-{3-[7-(2-乙基-2H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{4-甲基-3-[1-甲基-7-(2-甲基-2H-吡唑-3-基氨基)-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{3-[7-(2，6-二甲基-吡啶-4-基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{3-[7-(3-羟基-苯基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{3-[7-(3-氨基-苯基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{3-[7-(3-甲磺酰基氨基-苯基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-{3-[7-(2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺；N-[4-甲基-3-(1-甲基-7-甲基氨基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺；和N-[3-(7-乙氨基-1-甲基-2-氧代-1，4-二氢-2H-嘧啶并[4，5-d]嘧啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺。
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