JP2013526279A - ヒト胚性幹細胞の分化 - Google Patents

Abstract

本発明は、多能性幹細胞からのインスリン産生細胞への分化を促進させるための方法を提供する。特に、本発明は、細胞集団の５０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を産生するための方法を提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１０年５月１２日に出願された、米国特許仮出願シリアル番号６１／３３３，８３１号の利益を主張するものであり、当該出願を本明細書にその全容において、かつあらゆる目的について援用するものである。

（発明の分野）
本発明は、多能性幹細胞からのインスリン産生細胞への分化を促進させるための方法を提供する。特に、本発明は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団であって、その集団の５０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、細胞集団を産生する方法に関する。

Ｉ型糖尿病の細胞置換療法の進歩及び移植可能なランゲルハンス島の不足により、生着に適したインスリン産生細胞即ちβ細胞の供給源の開発に注目が集まっている。１つの手法として、例えば、胚性幹細胞のような多能性幹細胞から機能性のβ細胞を生成することがある。

脊椎動物の胚発生において、多能性細胞は、原腸形成として公知のプロセスにおいて、３つの胚葉（外胚葉、中胚葉、及び内胚葉）を含む細胞のグループを生じる。例えば、甲状腺、胸腺、膵臓、腸、及び肝臓等の組織は、内胚葉から中間段階を経て発達する。このプロセスにおける中間段階は、胚体内胚葉（definitive endoderm）の形成である。胚体内胚葉細胞は、ＨＮＦ−３ β、ＧＡＴＡ４、ＭＩＸＬ１、ＣＸＣＲ４、及びＳＯＸ１７などの多くのマーカーを発現する。

膵臓の形成は、胚体内胚葉の膵臓内胚葉への分化により起こる。膵臓内胚葉細胞は膵臓−十二指腸ホメオボックス遺伝子、ＰＤＸ１を発現する。ＰＤＸ１が存在しない場合、膵臓は、腹側芽及び背側芽の形成を越えて発達しない。したがって、ＰＤＸ１の発現は、膵臓器官形成において重要な工程に格付けされる。成熟した膵臓は、他の細胞型の中でも、外分泌組織及び内分泌組織を含む。外分泌組織及び内分泌組織は、膵臓内胚葉の分化によって生じる。

島細胞の特徴を保持する細胞がマウスの胚細胞から誘導されたことが報告されている。例えば、Ｌｕｍｅｌｓｋｙら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９２：１３８９、２００１年）は、マウスの胚幹細胞の、膵島と同様のインスリン分泌構造への分化を報告している。Ｓｏｒｉａら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ４９：１５７，２０００）は、ストレプトゾトシン誘発糖尿病のマウスにおいて、マウスの胚性幹細胞から誘導されたインスリン分泌細胞が糖血症を正常化することを報告している。

一例において、Ｈｏｒｉら（ＰＮＡＳ ９９：１６１０５，２００２）は、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）の阻害剤でマウス胚性幹細胞を処理することにより、β細胞に類似した細胞が生じたことを開示している。

他の例では、Ｂｌｙｓｚｃｚｕｋら（ＰＮＡＳ １００：９９８、２００３年）が、Ｐａｘ４を構成的に発現するマウス胚幹細胞からのインスリン産生細胞の生成を報告している。

Ｍｉｃａｌｌｅｆらは、レチノイン酸が、胚幹細胞のＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉の形成に対する関与を調整することができることを報告している。レチノイン酸は、胚における原腸形成の終了時に対応する期間中の、胚性幹細胞分化の４日目に培養液に添加すると、Ｐｄｘ１発現の誘発に最も効果的である（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５４：３０１、２００５年）。

Ｍｉｙａｚａｋｉらは、Ｐｄｘ１を過剰発現するマウス胚幹細胞株を報告している。この結果は、外因性のＰｄｘ１発現が、得られた分化細胞内でインスリン、ソマトスタチン、グルコキナーゼ、ニューロゲニン３、ｐ４８、Ｐａｘ６、及びＨｎｆ６遺伝子の発現を明らかに増加させたことを示している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５３：１０３０，２００４）。

Ｓｋｏｕｄｙらは、マウス胚性幹細胞内で、アクチビンＡ（ＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバー）が、膵臓外分泌遺伝子（ｐ４８及びアミラーゼ）、並びに内分泌遺伝子（Ｐｄｘ１、インスリン及びグルカゴン）の発現を上方制御することを報告している。最大作用は１ｎＭアクチビンＡを使用して観察された。Ｓｋｏｕｄｙらは、インスリン及びＰｄｘ１ ｍＲＮＡの発現レベルはレチノイン酸の影響を受けないが、３ｎＭ ＦＧＦ７で処理することによりＰｄｘ１の転写レベルが増加したことも観察している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９，２００４）。

Ｓｈｉｒａｋｉらは、胚幹細胞のＰＤＸ１陽性細胞への分化を特異的に高める増殖因子の効果を研究した。シラキらは、ＴＧＦ−β２によってＰＤＸ１陽性細胞が高い割合で再現可能に得られたことを観察している（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２００５ Ｊｕｎ；１０（６）：５０３〜１６．）。

Ｇｏｒｄｏｎらは、血清の非存在下、かつアクチビンとＷｎｔシグナル伝達阻害剤の存在下での、マウス胚性幹細胞からの短尾奇形［陽性］／ＨＮＦ−３ β［陽性］内胚葉細胞の誘導を示した（米国特許出願公開第２００６／０００３４４６（Ａ１）号）。

Ｇｏｒｄｏｎら（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ １０３，ｐａｇｅ １６８０６，２００６）は、「Ｗｎｔ及びＴＧＦ−β／ｎｏｄａｌ／アクチビンの同時シグナル伝達が前原始線条の形成には必要であった」と述べている。

しかしながら、胚幹細胞発達のマウスモデルは、例えば、ヒト等のより高等な哺乳動物内の発達プログラムを正確に模倣しない恐れがある。

Ｔｈｏｍｓｏｎらは、ヒト胚盤胞から胚幹細胞を単離した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４、１９９８年）。これと同時に、Ｇｅａｒｈａｒｔ及び共同研究者は、胎児生殖腺組織から、ヒト胚生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６，１９９８）。単に白血病抑制因子（ＬＩＦ）と共に培養すれば分化が阻止され得るマウス胚幹細胞とは異なり、ヒト胚性幹細胞は、非常に特殊な条件下で維持する必要がある（米国特許第６，２００，８０６号、国際公開ＷＯ ９９／２０７４１号；同ＷＯ ０１／５１６１６号）。

ダムールら（Ｄ’Ａｍｏｕｒ）は、高濃度のアクチビン及び低血清の存在下で、ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉の濃縮化された培養物が調製されたことを述べている（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５）。これらの細胞を、マウスの腎臓皮膜下で移植することにより、いくつかの内胚葉性器官の特徴を有する、より成熟した細胞への分化が見られた。ヒト胚性幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は、ＦＧＦ−１０の添加後、ＰＤＸ１陽性細胞に更に分化することができる（米国特許出願公開２００５／０２６６５５４（Ａ１）号）。

Ｄ’Ａｍｏｕｒら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４，１３９２〜１４０１（２００６））は、「我々はヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞を、膵臓ホルモンインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵臓ポリペプチド及びグレリンを合成できる内分泌細胞へと変換する分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵臓内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞へと向かう段階に類似した段階を通して細胞を指向させることにより、インビボでの膵臓器官形成を模倣する。」と述べている。

別の例において、Ｆｉｓｋらは、ヒト胚幹細胞から膵島細胞を産生するシステムを報告している（米国特許出願公開２００６／００４０３８７（Ａ１）号）。この場合、分化経路は３つの段階に分割された。先ず、ヒト胚性幹細胞を、酪酸ナトリウムとアクチビンＡの組み合わせを用いて内胚葉に分化した。次に、細胞をノギンなどのＴＧＦ−βアンタゴニストとＥＧＦ又はベータセルリンとの組み合わせと培養して、ＰＤＸ１陽性細胞を生成する。最終分化は、ニコチンアミドにより誘発された。

一例において、Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙらは、「我々は、ＰＤＸ１の過剰発現が、膵臓に豊富に存在する遺伝子の発現を上昇させたことを結論付ける。インスリン発現の誘導には、インビボでのみ存在する更なるシグナルを必要とする可能性がある。」と述べている（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｒｙら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００６；２４：１９２３〜１９３０）。

他の例では、Ｇｒａｐｉｎ−Ｂｏｔｔｏｎらは次のように記載している：「Ｎｇｎ３を初期活性化させると、ほぼ例外なくグルカゴン＋細胞を誘導し、膵臓前駆細胞プールを枯渇させた。Ｅｌ１．５からＰＤＸ１前駆細胞は形質転換受容性になり、インスリン［陽性］でＰＰ［陽性］の細胞へと分化した」（Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ ＫＡ ｅｔ ａｌ．、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ Ｃｅｌｌ １２，４５７〜４６５，Ｍａｒｃｈ ２００７）。

例えば、Ｄｉｅｚらは、「９〜１０週齢において、グルカゴン陽性細胞のほとんどはインスリンを共発現するが、個別のインスリンのみの細胞はこの段階で明らかに検出可能であったと述べている。インスリン及びグルカゴンを共発現する細胞は、全試験期間中（９〜２１週）に観察されたが、全インスリン及びグルカゴン発現細胞のごく一部に相当するにすぎなかった」（Ｊ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２００９ Ｓｅｐ；５７（９）：８１１〜２４．２００９ Ａｐｒ １３）。

一例として、Ｃｈｅｎらは、「（−）−インドラクタムＶ［（ＩＬＶ）］は、プロテインキナーゼＣシグナル伝達を活性化し、内胚葉系に既に拘束（commit）されたｈＥＳＣの膵臓特殊化に向かわせる．．．ＩＬＶ及びレチノイン酸は、関連メカニズムを介して機能する．．．ＩＬＶは、レチノイン酸よりも、高いＰＤＸ−１発現細胞誘導（ＰＤＸ−１を発現する細胞の割合）を示す」（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，１９５〜１９６（Ａｐｒｉｌ ２００９）ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｈｅｍｂｉｏ０４０９〜１９５）と述べている。

Ｌｙｔｔｌｅらは、「ＮＫＸ６−１がインスリン細胞のみと共局在したことは、ＮＫＸ６−１がヒトβ細胞発生に独占的に関与することを示す」（Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ ２００８ Ｊｕｌ：５１（７）：１１６９〜８０，２００８）と述べている。

したがって、β細胞に更によく類似する機能性インスリン発現細胞を生成するための、インビトロ法開発の必要性が今も大いに求められているままである。本発明は、細胞集団の５０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成することにより、ヒト胚性幹細胞からの、インスリンを発現する細胞への分化効率を改善させるという代替アプローチを用いた。

一実施形態において、本発明は、細胞集団の５０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。

一実施形態において、本発明は、多能性幹細胞集団を、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる方法を提供し、この方法は以下の工程、
ａ．多能性幹細胞集団を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団をプロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地で処理することにより、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、を含む。

一実施形態において、本発明の方法によって産生された膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団の中の５０％を超える細胞は、ＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する。

実施例１に概説される分化プロトコルのステージ４の４日目におけるＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１の発現を示す。 実施例１に概説される分化プロトコルのステージ４の４日目におけるＮＫＸ６．１及びＩＳＬ−１の発現を示す。 ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００で分析した、ＰＫＣ活性化因子処理が、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＣＤＸ２を発現する細胞の割合に与える影響を示す。 ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒによる様々なＰＫＣ活性化因子とそれらがＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１発現細胞の割合に与える影響の比較を示す。 本発明の細胞を、腎臓皮膜の下に受けた場合のＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスにおける循環Ｃペプチドを示す。Ｃペプチドレベルは記載の時点で検出した。 本発明の細胞を、皮下に移植されたＴｈｅｒａｃｙｔｅ社製デバイスの中で受けた場合のＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウスにおける循環Ｃペプチドを示す。Ｃペプチドレベルは記載の時点で検出した。 細胞を腎臓皮膜の下に受けた群と、Ｔｈｅｒａｃｙｔｅ社製デバイスの中で細胞を皮下に受けた群との間の、移植後１２週間後に観察されたＣペプチドレベルの比較を示す。 実施例３に記載の方法に従って処理された細胞における、ＰＫＣ活性化因子処理がＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、及びＰＴＦ１ α発現の発現に与える影響を示す。 実施例３に記載の方法に従って処理された細胞における、ＰＫＣ活性化因子処理がＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、及びＰＴＦ１ α発現の発現に与える影響を示す。 実施例３に記載の方法に従って処理された細胞における、ＰＫＣ活性化因子処理がＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、及びＰＴＦ１ α発現の発現に与える影響を示す。 実施例３に記載の方法に従って処理された細胞における、ＰＫＣ活性化因子処理がＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＮＧＮ３、及びＰＴＦ１ α発現の発現に与える影響を示す。 実施例４に記載の方法に従って処理された細胞における、ＦＧＦ７がＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１ α、及びＣＤＸ２の発現に与える影響を示す。 実施例４に記載の方法に従って処理された細胞における、ＦＧＦ７がＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１ α、及びＣＤＸ２の発現に与える影響を示す。 実施例４に記載の方法に従って処理された細胞における、ＦＧＦ７がＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１ α、及びＣＤＸ２の発現に与える影響を示す。 実施例４に記載の方法に従って処理された細胞における、ＦＧＦ７がＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１ α、及びＣＤＸ２の発現に与える影響を示す。

開示を分かりやすくするため、限定を目的とすることなく、「発明を実施するための形態」を本発明の特定の特徴、実施形態、又は用途を、説明又は例示する下記の小節に分割する。

定義
幹細胞は、単独の細胞レベルで自己複製し分化して子孫細胞を生成するという、これらの両方の能力で定義される未分化細胞であり、子孫細胞には、自己複製前駆細胞、非再生前駆細胞、及び最終分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、インビトロで複数の胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）から様々な細胞系の機能的細胞へと分化する能力によって、また移植後に複数の胚葉の組織を生じさせ、胚盤胞への注入後、全てではないとしても殆どの組織を提供する能力によっても、特徴付けられる。

幹細胞は、発生能によって、（１）全ての胚種及び胚体外細胞型を生じさせ得る能力を意味する全能性、（２）全ての胚細胞型を生じさせ得る能力を意味する多能性、（３）細胞系の小集合を生じさせ得るが、全て特定の組織、器官、又は生理学的システム内で生じさせ得る能力を意味する複能性（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己再生）、血液細胞に限定された寡能性前駆細胞、並びに血液の通常の構成要素である全細胞型及び要素（例えば、血小板）を含む子孫を産生できる）、（４）複能性幹細胞と比較して、より限定された細胞系の小集合を生じさせる能力を意味する少能性、並びに（５）１つの細胞系（例えば、精子形成幹細胞）を生じさせる能力を意味する単能性に分類される。

分化は、特殊化されていない（unspecialized）（「未拘束の（uncommitted）」）又は比較的特殊化されていない細胞が、例えば、神経細胞又は筋細胞などの特殊化された細胞の特徴を獲得するプロセスである。分化細胞又は分化を誘導された細胞は、細胞系内でより特殊化された（「拘束された」）状況を呈している細胞である。分化プロセスに適用した際の用語「拘束された」は、通常の環境下で特定の細胞型又は細胞型の小集合に分化し続ける分化経路の地点に進行しており、かつ通常の環境下で異なる細胞型に分化し又はより分化されていない細胞型に戻ることができない細胞を指す。脱分化は、細胞が細胞系内で比較的特殊化されて（又は拘束されて）いない状況に戻るプロセスを指す。本明細書で使用される場合、細胞系は、細胞の遺伝、即ちその細胞がどの細胞から由来したか、またどの細胞を生じさせることができるかを規定する。細胞系は、発生及び分化の遺伝スキーム内にその細胞を位置付けるものである。系特異的マーカーとは、対象とする系の細胞の表現型と特異的に関連した特徴を指し、拘束されていない細胞の対象とする系への分化を評価するために使用することができる。

本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」又は「ステージ１細胞」又は「ステージ１」とは、以下のマーカー、即ち、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ−様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、又はＯＴＸ２のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、原始線条前駆体細胞、原始線条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。

本明細書で使用するとき、「膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカー、即ち、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１ β、ＰＴＦ１ α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４ α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、又はＰＲＯＸ１のうちの少なくとも１つを発現する細胞を指す。膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞としては、膵臓内胚葉細胞、原腸管細胞、後部前腸細胞が挙げられる。

本明細書で使用するとき、「胚体内胚葉」は、原腸形成中、胚盤葉上層から生じ、胃腸管及びその誘導体を形成する細胞の特徴を保持する細胞を指す。胚体内胚葉細胞は、以下のマーカーを発現する：ＨＮＦ３ β、ＧＡＴＡ４、ＳＯＸ１７、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭＩＸＬ１。

本明細書で使用するとき、「マーカー」は、対象とする細胞で差異的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、差異的な発現は、陽性マーカーのレベルの増大及び陰性マーカーのレベルの減少を意味する。マーカー核酸又はポリペプチドの検出可能なレベルは、他の細胞と比較して対象とする細胞において充分に高いか又は低いことから、当該技術分野において知られる各種の方法のいずれを用いても対象とする細胞を他の細胞から識別及び区別することが可能である。

本明細書で使用するとき、「膵臓内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」又は「膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のホルモン、即ち、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することが可能な細胞を指す。

多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、ステージ特異的胚抗原（ＳＳＥＡ）３及び４、並びにＴｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１と呼ばれる抗体を使用して検出可能なマーカーのうちの１つ以上を発現することができる（Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８）。インビトロで多能性幹細胞を分化させると、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１の発現が減少し（存在する場合）、ＳＳＥＡ−１の発現が上昇する結果になる。未分化の多能性幹細胞は、典型的には、細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定した後、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ Ｃａｌｉｆ．））によって記載されるようにＶｅｃｔｏｒ Ｒｅｄを基質として現像することによって検出することができる、アルカリホスファターゼ活性を有する。未分化の多能性幹細胞はまた、ＲＴ−ＰＣＲにより検出されるように、一般にＯＣＴ４及びＴＥＲＴも発現する。

増殖させた多能性幹細胞の別の望ましい表現型は、３つの胚葉の全て、即ち、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の細胞に分化し得るものである。多能性幹細胞の多能性は、例えば細胞を重症複合型免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、４％パラホルムアルデヒドを使用して形成した奇形腫を固定した後、それらを３つの胚葉からの細胞型の痕跡に関して組織学的に検査することにより確認することができる。代替的に、多能性は、胚様体を形成し、この胚様体を３つの胚葉に関連したマーカーの存在に関して評価することにより決定することができる。

増殖させた多能性幹細胞株は、標準的なＧバンド法を使用し、対応する霊長類種の発表されている核型と比較することで、核型を決定することができる。細胞は「正常な核型」を有する細胞を獲得することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数体であり、ヒト染色体が全て揃っておりかつ目立った変化のないことを意味する。

多能性幹細胞の供給源
使用が可能な多能性幹細胞の種類としては、妊娠期間中の任意の時期（必ずしもではないが、通常は妊娠約１０〜１２週よりも前）に採取した前胚性組織（例えば胚盤胞など）、胚性組織又は胎児組織などの、妊娠後に形成される組織に由来する多能性細胞の樹立株が含まれる。非限定的な例は、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ１、Ｈ７及びＨ９（ＷｉＣｅｌｌ）などのヒト胚性幹細胞又はヒト胚生殖細胞の樹立株である。更に、こうした細胞の初期の株化又は安定化の際に本開示の組成物を使用することも考えられるが、その場合は、供給源となる細胞は供給源の組織から直接採取される１次多能性細胞であろう。フィーダー細胞の不在下で既に培養された多能性幹細胞集団から採取した細胞も好適である。例えば、ＢＧ０１ｖ（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ａｔｈｅｎｓ，ＧＡ）等の変異ヒト胚性幹細胞株も好適である。

一実施形態において、ヒト胚性幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５，１９９８；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ ｆｆ．，１９９８；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４，１９９５）に記載の通りに調製される。

多能性幹細胞の培養
一実施形態において、多能性幹細胞は、フィーダー細胞の層上で培養され、このフィーダー細胞は、多能性幹細胞を様々な方法で支持する。代替的に、多能性幹細胞は、本質的にフィーダー細胞が存在しないにも関わらず、実質的な分化を受けないで多能性幹細胞の増殖を支持する培養液システム中で培養される。無フィーダー培養液中での分化なしでの多能性幹細胞の増殖は、以前に他の細胞型で培養することによって馴化された培地を使用して支持される。代替的に、無フィーダー培養液中での分化なしでの多能性幹細胞の増殖は、合成培地を使用して支持される。

一実施形態において、多能性幹細胞は、Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３９９〜４０４（２０００））に開示されている方法に従って、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｔｈｏｍｐｓｏｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ６ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １９９８：Ｖｏｌ．２８２．ｎｏ．５３９１，ｐｐ．１１４５〜１１４７）に開示されている方法に従って、マウス胚性線維芽細胞フィーダー細胞層上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｒｉｃｈａｒｄｓら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：５４６〜５５６，２００３）に開示されているフィーダー細胞層の任意の１つの上で培養されてもよい。

一実施形態において、多能性幹細胞は、Ｗａｎｇら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：１２２１〜１２２７，２００５）に開示されている方法に従って、ヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。代替実施形態において、多能性幹細胞は、Ｓｔｏｊｋｏｖｉｃら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５ ２３：３０６〜３１４，２００５）に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｍｉｙａｍｏｔｏら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：４３３〜４４０，２００４）に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ａｍｉｔら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ ６８：２１５０〜２１５６，２００３）に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｉｎｚｕｎｚａら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：５４４〜５４９，２００５）に開示されているヒトフィーダー細胞層の上で培養されてもよい。

一実施形態において、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００２／００７２１１７号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第６６４２０４８号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開特許ＷＯ２００５０１４７９９号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｘｕら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０，２００４）に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００７／００１００１１号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００５／０２３３４４６号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許第６８００４８０号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開特許ＷＯ２００５０６５３５４号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。

一実施形態において、多能性幹細胞は、Ｃｈｅｏｎら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０，Ｏｃｔｏｂｅｒ １９，２００５）に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、Ｌｅｖｅｎｓｔｅｉｎら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４，２００６）に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００５／０１４８０７０号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、米国特許出願公開２００５／０２４４９６２号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。あるいは、多能性幹細胞は、国際公開ＷＯ０２００５０８６８４５号に開示されている方法に従って誘導された培地の中で培養されてもよい。

多能性幹細胞は、好適な培養基質上で平板培養することができる。一実施形態において、好適な培養基質は、例えば基底膜から誘導されたもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成し得るもの等の細胞外マトリックス成分である。一実施形態において、好適な培養培地は、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）である。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）は、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ Ｓｗａｒｍ腫瘍細胞からの可溶性製剤であり、室温でゲル化して再構成基底膜を形成する。

他の細胞外マトリックス成分及び成分混合物は代替物として好適である。増殖させる細胞型に応じて、これは、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸塩等を、単独で又は様々な組み合わせで含み得る。

多能性幹細胞は、細胞の生存、増殖、及び所望の特徴の維持を促進する培地の存在下、基質上に好適な分布で平板培養されてもよい。これら全ての特徴は、播種分布に細心の注意を払うことから利益が得られ、かつ当業者により容易に決定可能である。

好適な培地は、以下の成分、例えば、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１９６５−０９２；ノックアウトダルベッコ変法イーグル培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１０８２９−０１８；ハムＦ１２／５０％ ＤＭＥＭ基礎培地、２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１５０３９−０２７；非−必須アミノ酸溶液、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ Ｎｏ．Ｍ７５２２；ヒト組み換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、Ｇｉｂｃｏ Ｎｏ．１３２５６−０２９などから調製することができる。

多能性幹細胞からの、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を産生するための方法を提供し、この方法は、
ａ．多能性幹細胞集団を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を、プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地で処理することにより、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、を含む。

本発明の一態様において、本発明は、集団の５０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の６０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の７０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の８０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の９０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。

本発明の一態様において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、膵内臓分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を形成するために更に処理されてもよい。

分化の効率は、所望の細胞型に特徴的なマーカーを発現する細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に認識する作用剤（例えば、抗体など）に、処理した細胞集団を暴露することにより測定することができる。

培養又は単離された細胞中のタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当技術分野にて標準的である。これらには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、インサイツハイブリダイゼーション（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら、ｅｄｓ．２００１年付録）参照）、及び切片材料の免疫組織学的解析等の免疫測定法、ウェスタンブロット、及び無傷細胞内に到達出来るマーカーに関して、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳ）（例えば、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、ニューヨーク：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９８年）参照）が含まれる。

多能性幹細胞の特徴は当業者に周知であり、多能性幹細胞の更なる特徴は、継続して同定されている。例えば多能性幹細胞マーカーとしては、以下のもののうちの１つ以上の発現が挙げられる：ＡＢＣＧ２、ＣＲＩＰＴＯ、ＦＯＸＤ３、コネキシン（CONNEXIN）４３、コネキシン４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ナノグ（NANOG）、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０、又はＴｒａ １−８１。

多能性幹細胞を本発明の方法で処理した後、処理した細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞により発現される、例えばＣＸＣＲ４等のタンパク質マーカーを特異的に認識する作用剤（例えば、抗体等）に暴露することにより、分化した細胞を精製することができる。

本発明における使用に好適な多能性幹細胞は、例えばヒト胚性幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０９）、ヒト胚性幹細胞株Ｈｌ（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０１）、ヒト胚幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨ ｃｏｄｅ：ＷＡ０７）、及びヒト胚性幹細胞株ＳＡ００２（Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）を含む。多能性細胞に特徴的な以下のマ−カー、即ち、ＡＢＣＧ２、ＣＲＩＰＴＯ、ＣＤ９、ＦＯＸＤ３、コネキシン４３、コネキシン４５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ナノグ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦＩ、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ １−６０及びＴｒａ １−８１のうちの少なくとも１つを発現する細胞も本発明での使用に適している。

胚体内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＳＯＸ１７、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ β、ＧＳＣ、ＣＥＲ１、ノーダル（Nodal）、ＦＧＦ８、短尾奇形、Ｍｉｘ様ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４、ＣＤ４８、エオメソダーミン（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２からなる群から選択される。胚体内胚葉系に特徴的なマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞は本発明での使用に好適である。本発明の一態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原始線条前駆細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。

膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーは、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＨＮＦ１ β、ＰＴＦ１ α、ＨＮＦ６、ＨＮＦ４ α、ＳＯＸ９、ＨＢ９、及びＰＲＯＸ１からなる群から選択される。膵内胚葉系に特徴的なこれらのマーカーのうちの少なくとも１つを発現する細胞が本発明における使用に適している。本発明の一態様では、膵内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵内胚葉細胞である。

膵臓内分泌系に特徴的なマーカーは、ＮＧＮ３、ニューロＤ（NeuroD）、ＮＫＸ２．２、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６からなる群から選択される。一実施形態では、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモン：インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドのうちの少なくとも１つを発現することができる。膵臓内分泌系の特徴を示すマーカーを少なくとも１つ発現する細胞は、本発明での使用に好適である。本発明の一態様において、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってよい。また、膵臓内分泌細胞は膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。

本発明の一態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、以下の、ＰＤＸ１、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮＫＸ６．１、ニューロＤ、ＩＳＬ１、ＨＮＦ３ β、ＭＡＦＡ、ＰＡＸ４、及びＰＡＸ６の転写因子の少なくとも１つとを発現する。本発明の一態様では、β細胞系に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。

多能性幹細胞の、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化
胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の形成は、以下の特定のプロトコルの前後に、マーカーの存在に関して試験することにより判定することができる。多能性幹細胞は、典型的にはそのようなマーカーを発現しない。したがって、多能性細胞の分化は、細胞がそれらの発現を開始した際に検出されることになる。

多能性幹細胞は、当技術分野における任意の方法により、又は本発明で提案される任意の方法により、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。

例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒらの、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３、１５３４〜１５４１（２００５年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。

例えば、多能性幹細胞は、Ｓｈｉｎｏｚａｋｉらの、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１、１６５１〜１６６２（２００４年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現している細胞に分化され得る。

例えば、多能性幹細胞は、ＭｃＬｅａｎらの、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５、２９〜３８（２００７年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。

例えば、多能性幹細胞は、Ｄ’Ａｍｏｕｒらの、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞に分化され得る。

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号１１／７３６，９０８号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号１１／７７９，３１１号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号６０／９９０，５２９号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号６１／０７６，８８９号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号６１／０７６，９００号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号６１／０７６，９０８号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。

例えば、多能性幹細胞は、米国特許出願シリアル番号６１／０７６，９１５号に開示される方法に従って、多能性幹細胞を処理することによって、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化させることができる。

胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞への分化
一実施形態では、本発明は、多能性幹細胞から、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を産生するための方法を提供し、この方法は、
ａ．多能性幹細胞集団を培養する工程と、
ｂ．多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、
ｃ．胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を、プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地で処理することにより、胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、を包む。

本発明の一態様において、本発明は、集団の５０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の６０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の７０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の８０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。代替実施形態において、本発明は、集団の９０％超の細胞がＰＤＸ−１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を提供する。

一実施形態では、プロテインキナーゼＣ活性化因子は、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタム、インドラクタムＶ（ＩＬＶ）、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）、及びホルボール−１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢｕ）からなる群から選択される。一実施形態では、プロテインキナーゼＣ活性化因子は、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタムである。（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタムは、約２０ｎＭ〜約５００ｎＭの濃度で使用することができる。（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ（pentadiemoylamino））ベンゾラクタムは、本明細書で「ＴＰＢ」と称される。

一実施形態において、プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地は、ＢＭＰ阻害能を有する因子、ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤、及び線維芽細胞増殖因子からなる群から選択される少なくとも１つの因子が追加される。

一実施形態では、ＢＭＰ阻害能を有する因子はノギンである。ノギンは、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬの濃度で使用することができる。一実施形態では、ノギンは１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。

一実施形態では、ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤は、ＡＬＫ５の阻害剤である。一実施形態では、ＡＬＫ５の阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩである。ＡＬＫ５阻害剤ＩＩは、約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用されてもよい。一実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩは１μＭの濃度で使用される。

一実施形態において、線維芽細胞増殖因子はＦＧＦ７である。代替実施形態では、線維芽細胞（fibpoblast）増殖因子はＦＧＦ１０である。

一実施形態において、線維芽細胞増殖因子は、約５０ｐｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で使用されてもよい。一実施形態では、線維芽細胞増殖因子は５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される。

膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞の、膵臓内分泌系のマーカーを発現する細胞への分化
一実施形態において、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団は、当技術分野における任意の方法により、膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団に更に分化される。

例えば、Ｄ’ Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を処理することによって、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団に更に分化してもよい。

例えば、Ｄ’Ａｍｏｕｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６に開示されている方法に従って、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を処理することによって、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団に更に分化してもよい。

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル番号１１／７３６，９０８号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させてもよい。

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル番号１１／７７９，３１１号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させてもよい。

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル番号６０／９５３，１７８号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させてもよい。

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル番号６０／９９０，５２９号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させてもよい。

例えば、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を米国特許出願シリアル番号６１／２８９，６７１号に開示された方法に従って処理することで、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を膵臓内分泌系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと更に分化させてもよい。

本発明を以下の実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。

（実施例１）
本発明の細胞集団の形成
ヒト胚性幹細胞株Ｈｌ細胞を、０．２％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；カタログ＃１２０−１４）＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ＃ １３２４−ＷＮ／ＣＦ）を追加したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ＃：２２４００）を有する、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ＃ ３５６２３１）をコーティングしたディッシュ上で１日培養した後で、０．５％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを追加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで、
ａ．２％のＦＢＳ及び５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７＋０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｃ．処理１：１％のＢ２７を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理する（ステージ４−基本培地−ＢＭ）、若しくは
ｄ．処理２：１％のＢ２７＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理する（ステージ４）、又は
ｅ．処理３：１％のＢ２７＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ＋２０ｎＭのホルボール−１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢｕ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ＃５２４３９０）を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理した（ステージ４）。

ステージ４の４日目に培養液を２回サンプリングし、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて撮像した。ウェルあたり１００視野の撮像を得て、バイオアッセイ及び続く染色手順の間の任意の細胞ロスを補正した。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｔｏｏｌｂｏｘ １．７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを用いて、各ウェルから総細胞数、総ＰＤＸ１発現細胞、総ＮＫＸ６．１発現細胞及び総ＣＤＸ−２発現細胞の測定値を得た。各複製データセットについて平均及び標準偏差を算出した。総ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＣＤＸ−２の発現細胞を、全細胞集団中の割合として報告した。

図２Ａに示されるように、ステージ４（４日目）、の終了時の全ての実験集団において、細胞集団のおよそ９２％±４％がＰＤＸ１を発現した。しかしながら、ＰＤＢｕ（プロテインキナーゼＣ活性化因子）による処理は、基本培地（処理１）、又はＡＬＫ５阻害剤ＩＩ＋ノギン（処理２）のいずれかで処理された細胞集団と比較して、ＰＤＸ１発現集団におけるＮＫＸ６．１発現細胞の割合に顕著な増加を引き起こした（図２Ａ）。ＰＤＢｕで処理された群では、全集団の８８％±４．２％がＮＫＸ６．１を発現し、処理２を受けた細胞の６２％±８％はＮＫＸ６．１を発現し、処理１を受けた細胞の４６．７±０．２％はＮＫＸ６．１を発現した。ステージ４のＮＫＸ６．１発現細胞のほとんどは、ＰＤＸ１も発現した。これらの観察結果は、所与の細胞集団から得たＰＤＸ１発現とＮＫＸ６．１発現との画像をオーバーレイすることによって確認された（図１Ａ）。これらのデータは、プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地で細胞を処理することによって、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団においてＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する細胞の割合が増加したことを示している。

処理１を受けた細胞集団では、細胞の１０％がＣＤＸ２（腸マーカー）を発現した（図２Ａ）。処理２又は３のいずれかを受けた細胞集団では、細胞の５％未満がＣＤＸ２を発現した。いずれの場合にも、ＣＤＸ２発現細胞のほとんどは、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現しなかった。

ステージ３の細胞の並列集団を、上記処理３におけるＰＤＢｕの代わりに、次のプロテインキナーゼＣ活性化因子、２０ｎＭの濃度のホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ＃５２４４００）、又は５０ｎＭの濃度の［（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル（pheny））−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム］（ＴＰＢ）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ＃５６５７４０）で同様に処理した。

ステージ４の終了時に（４日目）、ＰＭＡで処理された細胞集団の９１％が、及びＴＰＢで処理された細胞集団の９０％が、ＮＫＸ６．１を発現した。これら処理の全てにおける総ＰＤＸ１発現細胞に有意差は観察されなかった。図２Ｂを参照。

この例は、プロテインキナーゼＣ活性化因子を比較的低濃度で使用して、ＮＫＸ６．１発現の上方調節を容易にし、かつ膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団内におけるＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する細胞の割合を増加させることができることを示している。

（実施例２）
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）−ｂｅｉｇｅ（Ｂｇ）マウスへの、本発明の細胞の移植
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、０．２％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａを添加したＲＰＭＩ培地を有する、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）をコーティングしたディッシュ上で１日培養し、次いで０．５％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを添加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで
ａ．２％のＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７＋０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、次いで
ｃ．１％のＢ２７＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ＋５０ｎＭのＴＰＢを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理した（ステージ４）。

５〜６週齢のオスのＳＣＩＤ−ｂｅｉｇｅマウス（Ｃ．Ｂ−Ｉｇｈ−１ｂ／ＧｂｍｓＴａｃ−Ｐｒｋｄｃ^scid−Ｌｙｓｔ^bgＮ７）をＴａｃｏｎｉｃ Ｆａｒｍｓより購入した。滅菌した餌と水を自由に利用できるような状態で、マウスをｍｉｃｒｏｉｓｏｌａｔｏｒケージ内に収容した。外科手術を準備するため、マウスをイヤータグで同定し、体重を測定し、手持ち式ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ（ＬｉｆｅＳｃａｎ；ＯｎｅＴｏｕｃｈ）を用いて血糖を測定した。

マウスにイソフルラン（isolflurane）と酸素の混合物で麻酔をかけ、手術部位を小動物用はさみで剪毛した。マウスには手術前に皮下に０．１ｍｇ．ｋｇ Ｂｕｐｒｅｎｅｘを投与した。７０％のイソプロピルアルコール及び１０％のポビドンヨウ素で連続的に洗浄することで手術部位を準備した。

ステージ４の終了時に、１ｍＬのガラス製ピペットを用いて細胞を機械的に回収し、続いて非接着性プレートに移し一晩培養した。マウスの手術前準備の間に、細胞を１．５ｍＬ遠心管で遠心し、次いで細胞ペレットを回収するのに必要最低限を残しつつほとんどの上清を除去した。細胞をＲａｉｎｉｎ製Ｐｏｓ−Ｄポジティブディスプレイスメント式ピペットに回収し、ピペットを反転させて重力により細胞を沈降させた。移植用に充填した細胞調製物を残して過剰な培地を除去した。

移植用に２４Ｇ×１．９ｃｍ（３／４”）のＩ．Ｖ．カテーテルを用い、腎臓皮膜を貫通させ、針を除去した。次いで腎臓被膜下でカテーテルを腎臓の遠位極まで前進させた。Ｐｏｓ−Ｄピペットチップをカテーテルのハブにしっかりと取り付け、腎臓皮膜下でカテーテルを通してピペットから５百万個の細胞を分配し、腎臓の遠位極に供給した。腎臓皮膜を低温焼灼でシールし、腎臓を解剖学的な元の位置に戻した。並行して、Ｐｏｓｔ−Ｄピペットチップを用い、５百万個の細胞を含有している細胞凝集物を５０μＬデバイスに充填した。５０μＬデバイスはＴｈｅｒａＣｙｔｅ，Ｉｎｃ（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）から購入した。細胞充填後にデバイスを医療用接着剤ｓｉｌｉｃｏｎｅ ｔｙｐｅ Ａ（Ｄｏｗ Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ＃１２９１０９）によりシールし、ＳＩＣＤ／Ｂｇマウス（動物番号３及び４）の皮下に移植した。５〜０ ｖｉｃｒｙｌを用いて連続縫合することで筋を縫合し、皮膚を創傷クリップにより閉じた。マウスには手術後に１．０ｍｇ．ｋｇ Ｍｅｔａｃａｍを皮下投与した。マウスを麻酔から覚めさせ、完全に回復させた。

移植後に、マウスを週に１回計量し、週に２回血糖を測定した。移植に続き、マウスには様々な間隔で３ｇ／ｋｇグルコースを腹腔内投与し、グルコース注入の６０分後に、ヘパリンを少量含有している遠心管に後眼窩静脈洞から血液を吸引した。血液を遠心分離し、２本目の遠心管中に血漿を配置し、ドライアイス上で凍結させ、その後、ヒトＣ−ペプチドアッセイを実施するまでの間−８０℃で保管した。製造者による取扱説明書に従い、Ｍｅｒｃｏｄｉａ／ＡＬＰＣＯ Ｄｉａｇｎｏｔｉｃｓ Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ Ｃ−ｐｅｐｔｉｄｅ ＥＬＩＳＡ（Ｃａｔ Ｎｏ．８０−ＣＰＴＨＵ−Ｅ０１，Ａｌｐｃｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＮＨ）を用いてヒトＣペプチドレベルを測定した。

移植後４〜６週で早くも、腎臓皮膜群及びＴｈｅｒａｃｙｔｅ社製デバイスを受けた群の両方の動物血清中でヒトＣペプチドが検出され、時間経過に伴って増加した（図３Ａ及び図３Ｂ）。３ヵ月の終わりに、腎臓皮膜及びＴｈｅｒａｃｙｔｅ社製デバイスを移植された群の両方の動物の１００％において、グルコース投与に応答して顕著な量の循環ヒトＣペプチドを検出することができた。３ヵ月後の腎臓皮膜群におけるグルコース刺激されたヒトＣペプチドの血中濃度は１．７±０．５ｎｇ／ｍＬであり（ｎ＝４）、Ｔｈｅｒａｃｙｔｅ社製デバイス移植群では１±０．５ｎｇ／ｍＬ（ｎ＝２）であった（図３Ｃ）。

この実施例は、プロテインキナーゼＣ活性化因子によって生成されるＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共発現細胞集団が、インビボでインスリン分泌細胞に更に分化する能力を有することを示している。インスリン分泌細胞への更なる分化の可能性は、局所環境に依存しない。本発明者らは、腎臓皮膜及び皮下部位の中の免疫保護デバイス内の両方において、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１共発現細胞がインスリン分泌細胞へと更に分化し得ることを示している。

（実施例３）
本発明の細胞集団を形成するための代替方法
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、０．２％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；カタログ＃１２０−１４）＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ＃ １３２４−ＷＮ／ＣＦ）を添加したＲＰＭＩ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ＃：２２４００）を有する、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ＃ ３５６２３１）をコーティングしたディッシュ上で１日培養した後で、０．５％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを追加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで、
ａ．２％のＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．１％のＢ２７＋０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理し（ステージ３）、続いて又は
ｃ．処理４：１％のＢ２７＋２０ｎＭのＰＤＢｕ＋１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理する（ステージ４）、又は
ｄ．処理５：１％のＢ２７＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ＋２０ｎＭのＰＤＢｕを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理する（ステージ４）、又は
ｅ．処理６：１％のＢ２７＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０＋２０ｎＭのＰＤＢｕを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間処理する（ステージ４）。

プロテインキナーゼＣ活性化因子によって媒介されるＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する細胞の割合の増加に与える追加因子の影響を調べた。ステージ４の４日目に培養液を２回サンプリングし、上の実施例１に記載の通りに画像解析を行った。ＩＳＬ１及びＮＥＵＲＯＤ１の発現も記録した。

この研究では、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団の大部分は、ＰＤＸ１の発現に陽性であった。ＰＤＸ１発現細胞のほとんどもまたＮＫＸ６．１に共陽性であった。表１に示されるように、ＰＫＣ活性化因子のみの追加は、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団におけるＮＫＸ６．１発現細胞の形成を促進した。ステージ４の４日目までに、全集団の９３％はＮＫＸ６．１陽性であり、ＮＫＸ６．１発現細胞のほとんど全てはＰＤＸ１の発現に陽性であった。

プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地へのＡＬＫ５阻害剤ＩＩの添加（処理５）は、観察されたＮＫＸ６．１発現の増加に影響を与えなかった。細胞集団の５７．１％はニューロＤ１を発現し、細胞集団の５２．４％はＩＳＬ１を発現し、この処理の後に内分泌前駆体細胞集団の割合が増加したことを示唆している。表１を参照されたい。

この実施例から得たサンプルのＰＣＲ分析は、ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１、及びＰＴＦ１ αの発現が、処理５を受けた細胞と比べて、処理４を受けた細胞集団で増加したことを明らかにした。図４Ａ〜図４Ｄ参照。その一方で、ＮＧＮ３の発現の顕著な増加が、ＡＬＫ５阻害剤２及びＰＤＢｕを与えられた（処理５）細胞で観察された。図４Ａ〜図４Ｄ参照。

プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した（処理６）培地に対するＦＧＦ１０の添加の影響もまた調べた。ＰＤＢｕと組み合わせた５０ｎｇ／ｍＬの濃度でのＦＧＦ１０の添加（処理６）は、細胞集団の９０％がＮＫＸ６．１を発現する膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成したが、ＮＫＸ６．１発現細胞の多くはＣＤＸ２陽性でもあった。表１参照。ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＰＴＦ１ αのｍＲＮＡレベルは、ＰＤＢｕ及びノギンで処理された細胞で観察されるレベルよりも増加しなかった。図４Ａ〜図４Ｄされたい。

この実施例は、比較的低濃度（約２０ｎＭ）のプロテインキナーゼＣ活性化因子とＢＭＰ阻害剤の組み合わせを使用して、細胞の９０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成することができることを示している。

（実施例４）
本発明の細胞集団を形成するための代替方法
ヒト胚性幹細胞株Ｈ１細胞を、０．２％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ；カタログ＃１２０−１４）＋２０ｎｇ／ｍＬのＷＮＴ−３ａ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ；カタログ＃ １３２４−ＷＮ／ＣＦ）を添加したＲＰＭＩ培地を（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；カタログ＃：２２４００）有する、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（１：３０希釈）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；カタログ＃ ３５６２３１）をコーティングしたディッシュ上で１日培養した後で、０．５％のＦＢＳ＋１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを追加したＲＰＭＩ培地で更に２日間にわたって処理し（ステージ１）、次いで、
ａ．２％のＦＢＳ＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２で３日間にわたって処理し（ステージ２）、次いで
ｂ．処理７（Ｔ７）：１％のＢ２７＋０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理する（ステージ３）、又は
ｃ．処理８（Ｔ８）：１％のＢ２７＋０．２５μＭのシクロパミン−ＫＡＡＤ＋２μＭのレチノイン酸（ＲＡ）＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ７を添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理する（ステージ３）、次いで
ｄ．処理９（Ｔ９）：１％のＢ２７＋１００ｎｇ／ｍＬのノギン＋１μＭのＡＬＫ５阻害剤ＩＩ＋２０ｎＭのＰＤＢｕを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理する（ステージ４）、又は
ｅ．処理１０（Ｔ１０）：１％のＢ２７＋５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０＋２０ｎＭのＰＤＢｕを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理する（ステージ４）、又は
ｆ．処理１１（Ｔ１１）：１％のＢ２７＋２０ｎＭのＰＤＢｕ＋１００ｎｇ／ｍＬのノギンを添加したＤＭＥＭ（高グルコース）で４日間にわたって処理した（ステージ４）。

ステージ４の４日目に培養液を２回サンプリングし、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて撮像した。ウェルあたり１００視野の撮像を得て、バイオアッセイ及び続く染色手順の間の任意の細胞ロスを補正した。ＩＮ Ｃｅｌｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒ Ｔｏｏｌｂｏｘ １．７（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）ソフトウェアを用いて、各ウェルから総細胞数、総ＰＤＸ１発現細胞、総ＮＫＸ６．１発現細胞、及び総ＣＤＸ２発現細胞の測定値を得た。各複製データセットについて平均及び標準偏差を算出した。総ＰＤＸ１、ＮＫＸ６．１及びＣＤＸ−２の発現細胞は、全細胞集団の割合として報告された。

Ｔ７培地及びその後のＴ９培地で処理された細胞集団では、細胞集団の約８０％がＮＫＸ６．１を発現した。これについては、表２を参照されたい。Ｔ７培地及びその後のＴ１０培地で処理された細胞集団では、細胞の９０％がＮＫＸ６．１を発現したが、この処理ではより多くのＣＤＸ２発現細胞が観察された。表２を参照されたい。Ｔ７培地及びその後のＴ１１培地で処理された細胞集団は、細胞集団の９３％がＮＫＸ６．１を発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成した。その集団におけるほとんどのＮＫＸ６．１発現細胞は、ＰＤＸ１も発現した。

Ｔ８培地及びその後のＴ９培地で処理された培養液は、細胞集団の５６．７％がＮＫＸ６．１を発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成した。表２を参照されたい。Ｔ８培地及びその後のＴ１０培地で処理された培養液は、細胞集団の６３．５％がＮＫＸ６．１を発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成し、本発明者らはこの処理の後により多くのＣＤＸ２発現細胞を観察した。表２を参照されたい。Ｔ８培地及びその後のＴ１１培地で処理された培養液は、細胞集団の７４％がＮＫＸ６．１を発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団を生成した。表２を参照されたい。ＮＫＸ６．１発現細胞のほとんどはＰＤＸ１も発現した。

ステージ３でレチノイン酸、シクロパミン、及びノギンで処理した後、ステージ４でＰＫＣ活性化因子を加えることにより、ステージ４の４日目までにＮＫＸ６．１及びＰＴＦ１ αのｍＲＮＡレベルの上昇がもたらされた（図５Ａ〜図５Ｄ）という点で、ＰＣＲ分析はＩＮ Ｃｅｌｌ ａｎａｌｙｓｉｓも支持した。

本明細書の全体を通じて引用した刊行物は、その全体を参照により本明細書に組み込むものとする。以上、本発明の様々な態様を実施例及び好ましい実施形態を参照して説明したが、本発明の範囲は、上記の説明文によってではなく、特許法の原則の下で適宜解釈される以下の特許請求の範囲によって定義されるものである点は認識されるであろう。

Claims (20)

1. 膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団であって、前記集団の５０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、細胞集団。
2. 前記集団の６０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、請求項１に記載の細胞集団。
3. 前記集団の７０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、請求項１に記載の細胞集団。
4. 前記集団の８０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、請求項１に記載の細胞集団。
5. 前記集団の９０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、請求項１に記載の細胞集団。
6. 細胞集団の５０％超の細胞がＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を共発現する、膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する前記細胞集団を生成する方法であって、該方法は、
   ａ．多能性幹細胞集団を培養する工程と、
   ｂ．前記多能性幹細胞集団を、胚体内胚葉系（definitive endoderm lineage）に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、
   ｃ．前記胚体内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する前記細胞集団を、プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した培地の中で、前記膵臓内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞集団へと分化させる工程と、を含む方法。
7. 前記プロテインキナーゼＣ活性化因子が、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタム、インドラクタムＶ、ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート、及びホルボール−１２，１３−ジブチレートからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
8. 前記プロテインキナーゼＣ活性化因子が、（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタムである、請求項６に記載の方法。
9. 前記（２Ｓ，５Ｓ）−（Ｅ，Ｅ）−８−（５−（４−（トリフルオロメチル）フェニル）−２，４−ペンタジエノイルアミノ）ベンゾラクタムが、約２０ｎＭ〜約５００ｎＭの濃度で使用される、請求項８に記載の方法。
10. プロテインキナーゼＣ活性化因子を追加した前記培地が、ＢＭＰ阻害能を有する因子、ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤、及び線維芽細胞増殖因子からなる群からの少なくとも１つの因子を更に追加される、請求項６に記載の方法。
11. ＢＭＰ阻害能を有する前記因子がノギンである、請求項１０に記載の方法。
12. ノギンが、約５０ｎｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬの濃度で使用される、請求項１１に記載の方法。
13. ノギンが約１００ｎｇ／ｍＬの濃度で使用される、請求項１１に記載の方法。
14. 前記ＴＧＦβ受容体シグナル伝達阻害剤がＡＬＫ５阻害剤である、請求項１０に記載の方法。
15. 前記ＡＬＫ５阻害剤がＡＬＫ５阻害剤ＩＩである、請求項１４に記載の方法。
16. ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが、約０．１μＭ〜約１０μＭの濃度で使用される、請求項１５に記載の方法。
17. ＡＬＫ５阻害剤ＩＩが約１μＭの濃度で使用される、請求項１６に記載の方法。
18. 前記線維芽細胞増殖因子がＦＧＦ７である、請求項１０に記載の方法。
19. 前記線維芽細胞増殖因子がＦＧＦ１０である、請求項１０に記載の方法。
20. 前記線維芽細胞増殖因子が、約５０ｐｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬの濃度で使用できる、請求項１０に記載の方法。

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