PT1511761E - Processo para produção peptídeos cíclicos - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE PEPTÍDEOS CÍCLICOS"

Prioridade

Este pedido reivindica o beneficio do pedido provisório U.S. com o N°. de Série 60/461222, requerido a 7 de Abril de 2003, cujo conteúdo é aqui incorporado por referência.

Campo da Invenção A presente invenção abrange processos para a preparação e purificação de peptídeos ciclicos.

Antecedentes da Invenção A somatostatina é conhecida por possuir um potencial terapêutico muito amplo e poder ser administrada numa larga variedade de aplicações clinicas. A semi-vida média de somatostatina no plasma é extremamente curta reduzindo, por conseguinte, o número potencial de possiveis aplicações deste reagente. A investigação foi efectuada com o objectivo do desenvolvimento de análogos de somatostatina os quais exibissem maior estabilidade e eficácia. Uma série de compostos que foram avaliados como análogos de somatostatina potencialmente úteis foram os octapeptideos ciclicos. A avaliação do octapeptideo 1 cíclico, octreotida, demonstrou que o composto possuía excelente actividade biológica tanto in vitro como in vivo (Pless J., Metabolism 41, 5-6 (1992)). A octreotida possui a seguinte fórmula básica: D-Phe-Cys—Phe—D-Trp—Lys—Thr-Cys.......Thr-ol (SEQ. ID N°. 1) em que os átomos de enxofre dos resíduos Cys nas posições 2 e 7 estão ligados por uma ponte persulfureto. O grupo carboxílico do aminoácido C-terminal, treonina (Thr), é reduzido ao resíduo álcool Thr-ol (treoninol). A presença de D-fenilalanina (D-Phe) na extremidade N-terminal e de um álcool amino na extremidade C-terminal, juntamente com o resíduo de D-triptofano (D-Trp) e a ponte persulfureto, tornam a molécula muito resistente a degradação metabólica. A octreotida permite uma incubação de 24 horas em meios agressivos, tais como os sucos gástricos ou na mucosa intestinal. A octreotida inibe a hormona do crescimento durante um extenso período, inibe a secreção de glucagon em menor grau e inibe a secreção de insulina apenas de forma transiente. Deste modo, a octreotida é selectiva mais do que outros análogos de somatostatina na regulação dos níveis da hormona do crescimento no corpo e, por conseguinte, está presentemente indicada em acromegalia para controlar e reduzir os níveis plasmáticos de tal hormona. Igualmente, a octreotida é útil no tratamento de 2 alterações celulares de origem endócrina gastroenteropancreática e de determinados tipos de tumores. A síntese de octreotida e seus derivados tem sido descrita por dois métodos de sínteses gerais. 0 primeiro método é um procedimento de fase em solução, baseado na condensação do fragmento, como descrito por Bauer et al. Pedido de Patente Europeia N°. 29579 (1981) e Patente U.S. N°. 4395403. O processo compreende, geralmente, a remoção de um grupo protector de um resíduo hexapeptídico protegido; a ligação conjunta de duas unidades de peptídeos por uma ligação amida, em que uma compreende um resíduo hexapeptídico; a conversão de um grupo funcional na extremidade N- ou C-terminal do polipeptídeo resultante; e a oxidação do polipeptídeo. O processo envolve uma síntese longa, de múltiplas etapas e apresenta problemas adicionais durante a separação da octreotida das misturas da reacção porque todas as etapas de síntese são efectuadas na fase de solução. O segundo método para a síntese de octreotida sintetiza a totalidade da cadeia peptídica utilizando síntese de peptídeo de fase sólida, iniciando a síntese no resíduo treoninol. Este método requer que o resíduo treoninol seja protegido. O segundo processo de síntese, utiliza uma resina aminometil sobre a qual o resíduo treoninol é incorporado com as duas funções álcool protegidas na forma acetal. Mergler et al., "Peptides: Chemistry and Biology," Proceedings of the 12th American Peptide Symposium, Apresentação em Póster N°. 292 (Smith, J. A. e Rivier J. E., Eds ESCOM, Leiden) (1991) . A síntese é efectuada seguindo um esquema de protecção Fmoc/t-Bu; formando a ponte persulfureto sobre uma resina por oxidação dos 3 grupos tiol dos resíduos de cisteína previamente desprotegidos; e libertando e desprotegendo o peptídeo com uma mistura de 20% de TFA/DCM.

Alsina et al. descreveram a incorporação de um resíduo treoninol em resinas de carbonato activo em gue o grupo amino é protegido por um grupo Boc e a cadeia lateral é protegida por um grupo Bzl. Alsina et al., Tetrahedron Letters, 38, 883-886 (1997). Depois disso, a síntese continuou utilizando uma estratégia Boc/Bzl. A formação da ponte persulfureto foi efectuada directamente sobre a resina utilizando iodo e o peptídeo foi clivado da resina e os seus grupos protectores da cadeia lateral foram removidos simultaneamente com HF/anisole (9/1) . Numa etapa final, o grupo formilo foi removido com uma solução de piperidina/DMF. Neugebauer et al. descreveram uma síntese linear com um rendimento de apenas 7%. Neugebauer et al., PEPTIDES: CHEMISTRY, STRUCTURE AND BIOLOGY, p. 1017 (Marshal G. R. e Rivier J. E., Eds ESCOM, Leiden, 1990).

Edwards et al. divulgaram uma aproximação de tipo fase-sólida pela síntese progressiva sobre uma resina do peptídeo D-Phe-Cys(Acm)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(t-Bu)-

Cys (Acm)-HMP-resina (SEQ. ID N°. 1). Edwards et al., J. Med

Chem. 37, 3749-3757 (1994). Subsequentemente, o persulfureto foi preparado sobre a resina e o produto resultante libertado da resina por meio de aminólise com treoninol. O rendimento total relatado foi de apenas 14%.

Arano et al. efectuaram um outro método de fase sólida para DTPA-octreotida. Arano et al., Bloconjugate Chem., 8, 442-446 (1997). A oxidação por iodo do peptídeo-DTPA produziu 4 DTPA-D-Phe-octreotida num rendimento global de 31,8% com base na Fmoc-Thr(tBu)-ol-resina de partida.

Wu et al. desenvolveram um método de síntese para a octreotida, em que a ligação persulfureto foi formada por oxidação utilizando uma solução diluída de octreotida com ar durante 48 horas. Wu et al., Tetrahedron Letters, 39, 1783-1784 (1998). Lee et al. efectuaram recentemente um novo método para ancorar Thr(ol) (ou Thr-ol) a uma resina de síntese de fase sólida para a preparação de octreotida. Ver, Patente U.S. N°. 5889146. Fmoc-Thr(ol)-tereftal-acetal foi carregado na resina e após construção de cadeias peptídicas utilizando química Fmoc, a ciclização do peptídeo foi obtida sobre a resina por oxidação com iodo. A clivagem do peptídeo-resina com ácido trifluoroacético, produziu octreotida com um rendimento global de >70% da Fmoc-Thr (ol)-tereftal-acetal-resina de partida. Todos estes procedimentos completaram a ciclização da octreotida quer sobre o peptídeo totalmente desprotegido quer sobre a resina.

Análogos adicionais cíclicos, cíclicos de ponte e de cadeia linear de somatostatina e métodos para a sua preparação são descritos nas Patentes U.S. Nos. 4310518 e 4235886; Memórias Descritivas das Patentes Europeias EP-A-1295; 70021; 113209; 215171; 203031; 214872; e 143307; e Memória Descritiva da Patente Belga BE-A-900089.

Sumário da Invenção A presente invenção abrange processos para a preparação e purificação de peptídeos cíclicos. Numa forma de realização, os processos compreendem (a) proporcionar um peptídeo linear 5 protegido, em que o peptídeo contém, pelo menos, dois resíduos protegidos contendo tiol, dos quais pelo menos um é protegido com um grupo protector ortogonal; (b) fazer reagir o peptídeo linear protegido com uma composição ácida para produzir um peptídeo linear semi-protegido, protegido com o grupo protector ortogonal sobre um dos resíduos contendo tiol; (c) purificar o peptídeo linear semi-protegido por cromatografia; (d) tratar o peptídeo linear semi-protegido purificado obtido na etapa (c) com um agente oxidante para produzir um peptídeo cíclico desprotegido; e (e) purificar o peptídeo cíclico desprotegido por cromatografia. Numa forma de realização, o processo compreende ainda a neutralização do excesso de agente oxidante após a etapa (d) . Numa outra forma de realização, o agente oxidante pode ser iodo.

Numa forma de realização preferida da invenção, o peptídeo cíclico é seleccionado do grupo consistindo de análogos de somatostatina, peptídeos aparentados com vasopressina, factores/peptídeos natriuréticos α-atriais (ANF/ANP), calcitoninas e outros peptídeos contendo persulfureto. Numa forma de realização mais preferida, o peptídeo cíclico é octreotida, calcitonina (salmão), desmopressina, oxitocina, nesiritida, ou eptifibatida.

Ainda numa outra forma de realização, o peptídeo linear da etapa (a) é unido a uma resina ou em solução.

Numa outra forma de realização da invenção, o grupo protector ortogonal é acetamidometilo, benzilo, 4-metoxibenzilo, terc-butilo, trimetilacetamidometilo, fenilacetamidometilo, ou terc-butilmercapto. De um modo preferido, o grupo ortogonal é um grupo protector lábil não ácido, tal como acetamidometilo (ACM). 6

Uma forma de realização da invenção abrange um processo para a preparação de um peptídeo cíclico possuindo uma pureza de, pelo menos, cerca de 98,5% por HPLC e, de um modo preferido, de pelo menos, cerca de 99% por HPLC. Outra forma de realização da invenção é a preparação de um peptídeo cíclico de elevada pureza, por um processo em que o produto de reacção após clivagem de uma resina de suporte, quando unido a uma resina de suporte, é parcialmente desprotegido e transporta, pelo menos, um grupo protector unido a um resíduo contendo tiol.

Outra forma de realização da invenção abrange um processo empregando Acm como um grupo protector para resíduos de cisteína.

Descrição Detalhada da Invenção A invenção abrange métodos para a preparação de polipeptídeos. Mais especificamente, a invenção abrange métodos para a preparação de polipeptídeos cíclicos em que, pelo menos, um grupo protector unido a resíduos contendo tiol, tais como resíduos de cisteína, não é clivado ou desprotegido dos resíduos contendo tiol sob as condições requeridas para a clivagem de outros grupos protectores. Deste modo, a cadeia peptídica não é completamente desprotegida, mas transporta, pelo menos, um grupo protector unido a um resíduo contendo tiol. Especificamente, a invenção abrange processos para a preparação de peptídeos cíclicos seleccionados do grupo consistindo de análogos de somatostatina, peptídeos aparentados com vasopressina, factores/peptídeos natriuréticos α-atriais (ANF/ANP), calcitoninas e outros peptídeos contendo persulfureto. Mais 7 especificamente, o peptídeo cíclico é seleccionado do grupo consistindo de octreotida, calcitonina (salmão), desmopressina, oxitocina, nesiritida e eptifibatida. A nesiritida possui a seguinte sequência peptídica: H-Ser-ProLys-Met-Val-Gln-Gly-Ser-Gly-i-1

Cys-Phe-Gly-Arg-Lys-Met-Asp-Arg-Ue-Ser-Ser-Ser-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Ly s-V al-Leu-Arg-Arg-His-OH A eptifibatida possui a seguinte sequência peptídica: I-1

Mpa-HarOly-Asp-Trp-ProCys-NH2 O produto de reacção pode ser purificado para obter um peptídeo cíclico de elevada pureza. Como aqui utilizado, o termo "elevada pureza" refere-se a uma composição compreendendo, pelo menos, cerca de 98,5% como determinado por HPLC e, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 99% como determinado por HPLC. Como aqui utilizado, o termo "peptídeo cíclico" refere-se a um peptídeo contendo, pelo menos, dois (2) resíduos contendo tiol ligados por uma ponte persulfureto. A síntese do peptídeo semi-protegido pode ser realizada por métodos de síntese peptídica conhecidos, por exemplo, sobre um suporte sólido ou em solução, entre outros. 0 processo da invenção para a preparação de peptídeos cíclicos é um processo em que, pelo menos, um resíduo contendo tiol do material de partida é protegido por um grupo protector ortogonal que não é clivado ou desprotegido de um residuo contendo tiol sob as condições requeridas para a clivagem de outros grupos protectores ou clivagem do peptideo da resina. Como aqui utilizado, o termo "grupo protector ortogonal" refere-se a um grupo protector que é quimicamente resistente sob um conjunto de condições seleccionadas, mas é lábil sob um outro conjunto de condições. Grupos protectores ortogonais incluem, mas não estão limitados a, pelo menos um acetamidometilo (Acm), benzilo (Bzl), 4-metoxibenzilo (Mob), terc-butilo (Tbu ou t-Bu), trimetilacetamidometilo (Tacm), fenilacetamidometilo (Phacm), ou terc-butilmercapto (StBu). De um modo preferido, o grupo protector ortogonal é um grupo lábil não ácido, tal como acetamidometilo. Deste modo, no processo da presente invenção, a cadeia peptídica não é completamente desprotegida após desprotecção ou clivagem, mas transporta pelo menos um grupo protector unido a um residuo contendo tiol (um polipeptídeo semi-protegido). Opcionalmente, o polipeptídeo semi-protegido pode ser purificado utilizando quaisquer métodos adequados. Subsequentemente, os restantes grupos protectores no polipeptídeo semi-protegido são removidos e é formadauma ponte persulfureto para obter um peptideo cíclico utilizando qualquer método convencional. Por exemplo, um método inclui, mas não está limitado a, oxidação do tiol por um agente oxidante tal como o iodo. 0 peptideo cíclico é purificado por métodos adequados para obter um peptideo cíclico de elevada pureza. Opcionalmente, se presente, o agente oxidante em excesso pode ser neutralizado antes da purificação. De um modo preferido, a purificação é efectuada utilizando HPLC. 9

Com o objectivo de clarificar e como um auxilio na compreensão da invenção, como aqui divulgada e reivindicada, os seguintes termos e abreviaturas são definidos abaixo: TIS - Triisopropilsilano

Trt - tritilo

Mpa - ácido mercaptopropiónico.

Num polipeptideo, um ou mais dos resíduos contendo tiol, são protegidos utilizando um grupo protector ortogonal, tal como acetamidometilo (Acm) . Quando o Acm é utilizado como um grupo protector do resíduo contendo tiol, a clivagem acidolítica do peptideo irá produzir uma sequência peptídica transportando um grupo Acm. Por exemplo, na preparação de octreotida, se o Acm é utilizado como um grupo protector de um primeiro resíduo contendo tiol, e. g., o residuo de cisteína unido a Thr-ol, a clivagem acidolítica do peptideo irá produzir uma sequência peptídica transportando um grupo Acm, por exemplo, D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr(ol). Os peptídeos podem ser caracterizados por um perfil específico de impurezas relacionadas observadas por análise de HPLC. Algumas destas impurezas são facilmente separadas do pico principal enquanto que outras eluem mais proximo do pico principal. A purificação grosseira por HPLC preparativa produz o peptideo parcialmente protegido com uma pureza de, pelo menos, cerca de 95%, de um modo preferido, pelo menos, cerca de 98,5% e, de um modo muito preferido, pelo menos, cerca de 99% como determinado por HPLC, e a uma concentração de cerca de 0,1 g/L a cerca de 10 g/L. A adição de uma quantidade aproximadamente equivalente de um agente oxidante, tal como o iodo, resulta na desprotecção do grupo protector ortogonal e ciclização simultânea da molécula através de uma ponte persulfureto. Uma avaliação do perfil 10 cromatográfico nesta etapa mostra claramente que algumas das impurezas que foram previamente eluídas próximo do pico principal são agora distintas do pico do produto. Deste modo, o produto pode ser facilmente purificado uma segunda vez por métodos, tal como HPLC, ou outros métodos conhecidos, para obter um peptideo purificado, tal como a octreotida, com elevada pureza. Por estes meios, obtém-se facilmente um produto de elevada pureza com elevado rendimento, sem a necessidade de vários ciclos de reciclagem que requerem grandes volumes de solventes, tempos de operação longos e resultam numa pureza e num rendimento inferiores do produto final em comparação com métodos convencionais actualmente utilizados. 0 processo para a sintese peptídica de acordo com uma forma de realização da invenção é efectuado pelo esquema seguinte: a) Proporcionar uma sequência peptidica contendo, pelo menos, dois residuos protegidos contendo tiol, dos quais, pelo menos, um é protegido com um grupo protector lábil não ácido/ b) Clivagem de grupos protectores sensíveis a ácidos utilizando uma composição ácida compreendendo vários captadores para formar um peptideo linear semiprotegido; c) Purificação grosseira do peptideo linear semi-protegido por um método cromatográfico adequado; d) Desprotecção do grupo protector lábil não ácido residual do peptideo linear semi-protegido e ciclização do peptideo linear via formação de uma ligação persulfureto por um método adequado, para formar uma solução do peptideo cíclico em bruto; e 11 e) Purificação da solução do peptídeo ciclico em bruto por método de separação adequado para obter um produto peptídico ciclico. A solução peptidica resultante pode ser seca para obter um produto peptidico ciclico seco. Quando o peptídeo é sintetizado sobre uma fase sólida, tal como uma resina e os grupos protectores ortogonais são grupos lábeis não ácidos, a composição ácida utilizada para a desprotecção de grupos protectores sensíveis a ácidos também cliva o peptídeo resultante semi-protegido da resina.

Um exemplo específico do processo de síntese peptidica acima descrito compreende as etapas de: 1. Preparação de uma sequência peptidica protegida sobre uma resina. Por exemplo, na preparação de octreotida, um material de partida adequado pode ser a resina Thr(ol)(t-Bu)-2-clorotritilo. Depois disso, um peptídeo linear é sintetizado por um ciclo de operações repetitivas pela seguinte ordem. 1.1. Ligação de um aminoácido protegido por Fmoc adequado com um reagente de ligação adequado ao resíduo do grupo amino terminal unido à resina, para formar um fragmento peptídico protegido por Fmoc unido à resina. 1.2. Lavagem do produto da etapa 1.1 com, pelo menos, um solvente para remover a totalidade dos compostos solúveis da resina. 1.3. Desprotecção do grupo Fmoc. 12 1.4. Lavagem com pelo menos um solvente para remover a totalidade dos compostos solúveis da resina. 1.5. Adição de residuos de aminoácidos adicionais de acordo com a sequência requerida, seguida por lavagem com, pelo menos, um solvente e desprotecção do grupo Fmoc consoante necessário. 1.6. Acoplamento do último aminoácido D-Phe (N-protegido). 1.7. Lavagem e secagem do peptideo-resina. 2. Clivagem do peptideo linear intermédio (parcialmente protegido) da resina e desprotecçao simultânea dos grupos protectores sensíveis a ácidos utilizando uma composição ácida compreendendo ácido trifluoroacético (TFA) e vários captadores para formar um peptideo linear semi-protegido. 3. Purificação grosseira do peptideo linear semi-protegido por um método cromatográfico adequado. 4. Desprotecção do grupo protector residual do peptideo linear semi-protegido. 5. Ciclização do peptideo linear via formação de uma ligação persulfureto por um método adequado, para formar uma solução do peptideo cíclico em bruto. 6. Purificação da solução do peptideo cíclico em bruto por um método de separação adequado. 13

Quando se sintetiza o peptídeo sobre um suporte sólido, as resinas adequadas para utilização no processo incluem, mas não estão limitadas a resinas clorotritilo. Os agentes de acoplamento adequados incluem, mas não estão limitados a tetrafluoroborato de 2-(lH-benzotriazole-l-il)-1,1,3,3- tetrametilurónio (TBTU). Os solventes adequados para utilização nas etapas de lavagem do processo incluem, mas não estão limitados a dimetilformamida (DMF), diclorometano (DCM), metanol (MeOH), ou isopropanol (IPA). Os grupos protectores adequados para o residuo aminoácido terminal incluem, mas não estão limitados a 9-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) ou Boc. Os grupos protectores adequados para os resíduos de cisteína incluem Acm. 0 grupo protector do resíduo aminoácido terminal é removido por qualquer método conhecido, tal como reacção com solução de piperidina em DMF. Embora um especialista na técnica possa substituir os reagentes por outros reagentes adequados. A clivagem do intermediário linear parcialmente protegido do suporte da resina pode ser efectuada por adição de uma composição ácida. A composição ácida é, de um modo preferido, baseada em material ácido, tal como TFA e contém reagentes captadores incluindo, mas não limitados a etanoditiol (EDT) e água. A razão relativa de material ácido para captador para água pode ser desde cerca de 85% a cerca de 99% de material ácido, desde cerca de 0,1% a 15% de captador, e desde cerca de 0,1% a 15% de água em peso. Uma composição ácida preferida compreende cerca de 95% de TFA, cerca de 2,5% de EDT e cerca de 2,5% de água. O produto peptídico em bruto pode ser purificado por qualquer método conhecido. De um modo preferido, o peptídeo é 14 purificado utilizando HPLC numa coluna de fase reversa (RP) . O produto purificado resultante é seco e pode ser liofilizado.

As formas de realização especificas do processo da presente invenção incluem, mas não estão limitadas à sintese da octreotida, eptifibatida, desmopressina e calcitonina de salmão, como abaixo exemplificado.

Uma forma de realização da presente invenção proporciona um processo para a preparação de octreotida compreendendo as etapas de: a) proporcionar um peptideo linear protegido possuindo a fórmula X-D-Phe-Cys(X)-Phe-D-Trp-Lys(X)-Thr(X)-Cys(Acm)-

Tbr(X)-ol, em que X é grupo protector idêntico ou diferente; b) fazer reagir o peptideo linear da etapa (a) com uma composição ácida para produzir D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol; c) purificar o produto da etapa (b) por HPLC; d) tratar o peptideo linear resultante da etapa (c) com um agente oxidante para produzir (2,7 ciclico) D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol; e e) purificar o produto da etapa (d) por HPLC.

Outra forma de realização da presente invenção proporciona um processo para a preparação de eptifibatida compreendendo as etapas de: 15 a) proporcionar um peptídeo linear protegido possuindo a fórmula Mpa(X)-Har(X)-Gly-Asp(X)-Trp-Pro-Cys(Acm), em que X é grupo protector idêntico ou diferente; b) fazer reagir o peptídeo linear da etapa (a) com uma composição ácida para produzir Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys (Acm) -NH2; c) purificar o produto da etapa (b) por HPLC; d) tratar o peptídeo linear resultante da etapa (c) com um agente oxidante para produzir (1,7 cíclico) Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2; e e) purificar o produto da etapa (d) por HPLC.

Ainda outra forma de realização da presente invenção proporciona um processo para a preparação de desmopressina compreendendo as etapas de: a) proporcionar um peptídeo linear protegido possuindo a fórmula Mpa(X)-Tyr(X)-Phe-Gln(X)-Asn(X)-Cys(Acm)-Pro-D-

Arg(X)-Gly, em que X é grupo protector idêntico ou diferente; b) fazer reagir o peptídeo linear da etapa (a) com uma composição ácida para produzir Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2; c) purificar o produto da etapa (b) por HPLC; 16 d) tratar o peptídeo linear resultante da etapa (c) com um agente oxidante para produzir (1,6 ciclico) Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2; e e) purificar o produto da etapa (d) por HPLC.

Outra forma de realização da presente invenção proporciona um processo para a preparação de calcitonina (salmão) compreendendo as etapas de: a) proporcionar um peptídeo linear protegido possuindo a fórmula Cys(X)-Ser(X)-Asn(X)-Leu-Ser(X)-Thr(X)-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(X)-Leu-Ser(X)-Gm(X)-Glu(X)-Leu-His(X)-

Lys(X)-Leu-Gln(X)-Thr(X)-Tyr(X)-Pro-Arg(X)-Thr(X)-Asn(X)-Thr(X)-Gly-Ser(X)-Gly-Thr(X) , em que X é grupo protector idêntico ou diferente; b) fazer reagir o peptídeo linear da etapa (a) com uma composição ácida para produzir Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2; c) purificar o produto da etapa (b) por HPLC; d) tratar o peptídeo linear resultante da etapa (c) com um agente oxidante para produzir (1,7 cíclico) Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-

His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2; e e) purificar o produto da etapa (d) por HPLC. 17

Embora a presente invenção seja descrita em relação a exemplos específicos e formas de realização preferidas, subentende-se que a presente invenção não está limitada a estes exemplos e formas de realização. A presente invenção como assim reivindicada inclui variações dos exemplos específicos e formas de realização preferidas aqui descritos, como serão evidentes a um especialista na técnica.

Exemplos

Exemplo 1: Preparação de H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-

Cys(Acm)-Thr-ol (SEQ. ID N°.l) A sintese do peptídeo foi efectuada por um procedimento progressivo Fmoc SPPS (sintese peptidica em fase sólida) partindo da resina Thr (t-Bu)-ol-2-Cl-Trt (100 g, carregamento de 0,7 mmol sobre 1 g de resina pré-carregada) . Após lavagem da resina, introduziu-se o segundo aminoácido (Fmoc-Cys(Acm)) para iniciar a primeira etapa de ligação. O aminoácido protegido por Fmoc foi activado in situ utilizando TBTU/HOBt (N- hidroxibenzotriazole) e ligado subsequentemente à resina durante 50 minutos. A diisopropiletilamina foi utilizada durante a ligação como uma base orgânica. O fim da ligação foi indicado pelo teste da ninidrina. Após lavagem da resina, o grupo protector Fmoc da α-amina foi removido com 20% de piperidina em DMF durante 20 min. Estas etapas foram repetidas cada vez com um outro aminoácido, de acordo com a sequência peptidica. Todos os aminoácidos utilizados eram protegidos por Fmoc-Na excepto o último aminoácido da sequência, Boc-D-Phe. Os aminoácidos trifuncionais foram protegidos na cadeia lateral como se segue: Thr(t-Bu), Cys(Trt), Cys(Acm) , e Lys(Boc) . Três equivalentes dos 18 aminoácidos activados foram empregues nas reacções de ligação. No fim da síntese, o peptídeo-resina foi lavado com DMF, seguido por DCM, e seco sob vácuo para obter 223 g de peptídeo-resina seco. 0 peptídeo, preparado como acima descrito, foi clivado da resina utilizando uma solução de 95% de TFA, 2,5% de TIS, 2,5% de EDT, durante 2 horas à temperatura ambiente. 0 produto foi precipitado pela adição de 10 volumes de éter, filtrado e seco sob vácuo, para obter 111,7 g de pó. Foi identificado por LC/MS como H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol.

Exemplo 2: Preparação de Octreotida D-Phe-Cys—Phe •-D-Trp—Lys —Thr-Cys-Thr-ol O peptídeo em bruto H-D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol (SEQ. ID N°. 1) (100 g, preparado como descrito no exemplo (1)) foi purificado numa coluna preparativa RP-HPLC Cis. Fracções contendo >95% de produto puro foram combinadas e diluídas para concentrações de cerca de 1 g/L. Uma quantidade equimolar de iodo em ácido acético foi adicionada sob agitação vigorosa à temperatura ambiente e, subsequentemente, o excesso de iodo foi neutralizado por uma pequena quantidade de ácido ascórbico. A solução resultante foi carregada numa coluna RP-HPLC Ci8 e purificada para obter fracções contendo trifluoroacetato de octreotida com uma pureza de >98,5%. Após tratamento para substituir o trifluoroacetato, as fracções foram 19 recolhidas e liofilizadas para obter o peptídeo seco final. 0 rendimento foi de 33 g (>98,5% puro).

Exemplo 3: Preparação de Mpa-Har-Gly-Asp-Trp--Cys(Acm)-NH2 (precursor da Eptifibatida) A sintese do peptideo foi efectuada por um procedimento progressivo regular Fmoc SPPS (sintese peptidica em fase sólida) partindo da resina 2-Cl-Trt (50 g). O primeiro aminoácido (Fmoc-Cys(Acm)) foi carregado sobre a resina numa etapa preliminar para proporcionar um carregamento de cerca de 0,7 mmol/g. Após lavagem da resina, um segundo aminoácido (Fmoc-Pro) foi introduzido para iniciar a primeira etapa de ligação. O aminoácido protegido por Fmoc foi activado in situ utilizando TBTU/HOBt e ligado subsequentemente à resina durante 50 minutos. A diisopropiletilamina ou colidina foram utilizadas durante a ligação como uma base orgânica. O fim da ligação foi indicado pelo teste da ninidrina. Após lavagem da resina, o grupo protector Fmoc da α-amina foi removido com 20% de piperidina em DMF durante 20 min. Estas etapas foram repetidas cada vez com um outro aminoácido, de acordo com a sequência peptidica. Todos os aminoácidos utilizados eram protegidos por Fmoc-Na excepto o último bloco de construção na sequência, os aminoácidos Trifuncionais Trt-Mpa foram protegidos na cadeia lateral como se segue: Asp(tBu), Har(Pbf), e Cys(Acm). Três equivalentes dos aminoácidos activados foram empregues nas reacções de ligação. No fim da sintese, o peptídeo-resina foi lavado com DMF, seguido por DCM, e seco sob vácuo para obter 80 g de peptídeo-resina seco. 20 0 peptídeo, preparado como acima descrito, foi clivado da resina por lavagem com uma solução de 1% de TFA em DCM. A solução resultante foi neutralizada por adição de DIPEA e concentrada para cerca de 10% em conteúdo peptidico. A amidação da parte C-terminal foi alcançada por activação da extremidade carboxilica com DCC/HOBt e ligação com solução de amónia em IPA. Após remoção do solvente, o peptideo protegido foi precipitado em éter e seco. Os grupos protectores foram removidos utilizando uma solução de 95% de TFA, 2,5% de TIS, 2,5% de EDT, durante 2 horas à temperatura ambiente. O produto foi precipitado pela adição de 10 volumes de éter, filtrado e seco sob vácuo, para obter 30 g de produto.

Exemplo 4: Preparação de Eptifibatida

Mpa-Har-Gly-Asp—Trp-Pro-Cys NH2 O peptideo em bruto Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2 (30 g, preparado como descrito no exemplo 3) foi purificado numa coluna preparativa RP-HPLC Cis. Fracções contendo >95% de produto puro foram combinadas e diluidas para concentrações de cerca de 1 g/L. Uma quantidade equimolar de iodo em ácido acético foi adicionada sob agitação vigorosa à temperatura ambiente e, subsequentemente, o excesso de iodo foi neutralizado por uma pequena quantidade de ácido ascórbico. A solução resultante foi carregada numa coluna RP-HPLC Cis e purificada, para obter fracções contendo trifluoroacetato de eptifibatida com uma pureza de >98,5%. As fracções foram recolhidas e liofilizadas para obter o peptideo seco final 6, 9 g (>98,5% puro) . 21

Exemplo 5: Preparação de Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2 (precursor da Desmopressina) pelo método SPPS A síntese do peptídeo foi efectuada por um procedimento progressivo regular Fmoc SPPS partindo da resina de amido de Rink (50 g) . O primeiro aminoácido (Fmoc-Gly) foi carregado sobre a resina por um procedimento de ligação regular após remoção do grupo Fmoc da resina. Após lavagem da resina, introduziu-se o segundo aminoácido (Fmoc-D-Arg(Pbf)) para continuar a elongação da sequência. Os aminoácidos protegidos por Fmoc foram activados in situ utilizando TBTU/HOBt e ligados subsequentemente à resina durante cerca de 50 minutos. A diisopropiletilamina ou colidina foram utilizadas durante a ligação como uma base orgânica. O fim da ligação foi indicado pelo teste da ninidrina. Após lavagem da resina, o grupo protector Fmoc da α-amina foi removido com 20% de piperidina em DMF durante 20 min. Estas etapas foram repetidas cada vez com um outro aminoácido, de acordo com a sequência peptídica. Todos os aminoácidos utilizados eram protegidos por Fmoc-N" excepto o último bloco de construção na sequência, Trt-Mpa. Os aminoácidos trifuncionais foram protegidos na cadeia lateral como se segue: Gln(Trt), D-Arg(Pbf), Tyr(tBu) e Cys(Acm). Três equivalentes dos aminoácidos activados foram empregues nas reacções de ligação. No fim da síntese, o peptídeo-resina foi lavado com DMF, seguido por DCM, e seco sob vácuo para obter 91 g de peptídeo-resina seco. O peptídeo, preparado como acima descrito, foi clivado da resina utilizando uma solução de 89% de TFA, 5,0% de Fenol, 1,0% de TIS, 2,5% de EDT, 2,5% de água, durante 1,5 horas à 22 temperatura ambiente. 0 produto foi precipitado pela adição de 10 volumes de éter, filtrado e seco sob vácuo, para obter 49,0 g de pó. Foi identificado por LC/MS como Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-Nlb.

Exemplo 6: Preparação de Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2 (precursor da Desmopressina) método em solução A síntese do peptídeo foi efectuada por um método progressivo regular de "síntese em solução". O segundo aminoácido (Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH) é dissolvido em DMF e pré-activado por adição de TBTU/HOBt na presença de DIPEA. O primeiro aminoácido (Gly-NH2) é dissolvido em DMF, é adicionado, e a reacção continua durante cerca de 1 h à temperatura ambiente. O DMF é removido sob baixa pressão e o resíduo é dissolvido em acetato de etilo. A solução orgânica é lavada várias vezes com HC1 aquoso (IN), água e NaHCCç (5%) . Depois da solução ser seca sobre Na2S04, o solvente é evaporado para obter Fmoc-D-Arg(Pbf)-Gly-NH2. O grupo Fmoc é removido por dissolução em piperidina/DMF (20%) . A solução é concentrada e o di-peptídeo em bruto é precipitado em éter frio. Por um procedimento semelhante, o resto dos aminoácidos são adicionados sequencialmente para obter um peptídeo linear protegido final. Os aminoácidos protegidos por Fmoc são activados in situ utilizando TBTU/HOBt e ligados subsequentemente à cadeia peptídica em crescimento. A diisopropiletilamina ou colidina são utilizadas durante a ligação como uma base orgânica. O fim da ligação é determinado pelo teste de HPLC ou TLC. Estas etapas são repetidas cada vez com um outro aminoácido, de acordo com a sequência peptídica. Todos os aminoácidos utilizados são protegidos por Fmoc-Na excepto o último bloco de construção na 23 sequência, Trt-Mpa. Os aminoácidos Trifuncionais são protegidos na cadeia lateral como se segue: Gln(Trt), D-Arg(Pbf), Tyr(tBu) e Cys(Acm). O peptideo, preparado como acima descrito, é desprotegido dos seus grupos protectores ácido-lábeis utilizando uma solução de 91,5% de TFA, 1,0% de TIS, 2,5% de EDT, 5,0% de água, durante 1,5 horas à temperatura ambiente. O produto em bruto, Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2 é precipitado pela adição de 10 volumes de éter, filtrado e seco sob vácuo, para obter pó fino. O produto é identificado por LC/MS.

Exemplo 7: Preparação de Desmopressina

Mpa-Tyr-Phe-Gin—Asn-Cys-Pro-D-Arg-Gly-NH2 O peptideo em bruto Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2 (SEQ. ID N°. 3) (49 g, preparado como descrito no exemplo 5) foi purificado numa coluna preparativa RP-HPLC Ci8. Fracções contendo >95% de produto puro foram combinadas e diluidas para concentrações de cerca de 1 g/L. Uma quantidade equimolar de iodo em ácido acético foi adicionada sob agitação vigorosa à temperatura ambiente e, subsequentemente, o excesso de iodo foi neutralizado por uma pequena quantidade de ácido ascórbico. A solução resultante foi carregada numa coluna RP-HPLC Cis e purificada para obter fracções contendo trifluoroacetato de desmopressina com uma pureza de >98,5%. Após troca do ião homólogo para acetato, as fracções foram recolhidas e 24 liofilizadas para obter o peptídeo seco final 14,9 g (>99,0 puro).

Exemplo 8: Preparação de Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2. (Precursor da

Calcitonina de salmão) A síntese do peptídeo foi efectuada por um procedimento progressivo regular Fmoc SPPS partindo da resina de amido de Rink (30 g) . O primeiro aminoácido (Fmoc-Pro) foi carregado sobre a resina por um procedimento de ligação regular após remoção do grupo Fmoc da resina. Após lavagem da resina, introduziu-se o segundo aminoácido (Fmoc-Thr(tBu)) para continuar a elongação da sequência. Os aminoácidos protegidos por Fmoc foram activados in situ utilizando TBTU/HOBt e ligados subsequentemente à resina durante cerca de 60 minutos. A diisopropiletilamina ou colidina foram utilizadas durante a ligação como uma base orgânica. O fim da ligação foi indicado pelo teste da ninidrina. Após lavagem da resina, o grupo protector Fmoc da α-amina foi removido com 20% de piperidina em DMF durante 20 min. Estas etapas foram repetidas cada vez com um outro aminoácido, de acordo com a sequência peptídica. Todos os aminoácidos utilizados eram protegidos por Fmoc-Na. Os aminoácidos trifuncionais foram protegidos na cadeia lateral como se segue: Cys(Trt), Ser (tBu), Asn(Trt), Gln(Trt), Thr(tBu), Glu(tBu), His(Trt), Lys(Boc) , Arg(Pbf), Tyr(tBu) e Cys(Acm) . Três equivalentes dos aminoácidos activados foram empregues nas reacções de ligação. No fim da síntese, o peptídeo-resina foi lavado com DMF, seguido por DCM, e seco sob vácuo para obter 77 g de peptídeo-resina seco. 25 0 peptídeo, preparado como acima descrito, foi clivado da resina utilizando uma solução de 94% de TFA, 1,0% de TIS, 2,5% de EDT, 2,5% de água, durante 1,5 horas à temperatura ambiente. O produto foi precipitado pela adição de 10 volumes de éter, filtrado e seco sob vácuo, para obter 42,0 g de pó. Foi identificado por LC/MS como Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys (Acm) -Vai-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2.

Exemplo 9: Preparação de Calcitonina (salmão) O peptideo em bruto Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2 (42 g, preparado como descrito no exemplo 7) foi purificado numa coluna preparativa RP-HPLC Ci8. Fracções contendo >95% de produto puro foram combinadas e diluídas para concentrações de cerca de 1 g/L. Uma quantidade equimolar de iodo em ácido acético foi adicionada sob agitação vigorosa à temperatura ambiente e, subsequentemente, o excesso de iodo foi neutralizado por uma pequena quantidade de ácido ascórbico. A solução resultante foi carregada numa coluna RP-HPLC Ci8 e purificada para obter fracções contendo trifluoroacetato de calcitonina com uma pureza de >98,5%. Após troca do ião homólogo para acetato, as fracções foram recolhidas e liofilizadas para obter o peptídeo seco final 8,8 g (>99,0% puro) . O método analítico para cromatografia de fase reversa (HPLC) utilizou uma coluna C18 de 5μ, TFA a 0,05% em eluente acetonitrilo/água e um caudal de 1 mL/min.

Lisboa, 19 de Setembro de 2006 26

Claims (20)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a preparação de peptídeos cíclicos compreendendo as etapas de: a) proporcionar um peptídeo linear protegido contendo, pelo menos, dois resíduos protegidos contendo tiol dos quais, pelo menos, um resíduo contendo tiol é protegido com um grupo protector ortogonal; b) fazer reagir o peptídeo linear protegido com uma composição ácida para produzir um peptídeo linear semi-protegido com o grupo protector ortogonal sobre um dos resíduos contendo tiol; c) purificar o peptídeo linear semi-protegido; d) tratar o peptídeo linear semi-protegido purificado obtido na etapa (c) com um agente oxidante para produzir um peptídeo cíclico; e 1, em que o consistindo aparentados natriuréticos a-atriais peptídeos contendo persulfureto. e) purificar o peptídeo cíclico purificado.
2. 2. Processo da reivindicação seleccionado do grupo somatostatina, peptídeos factores/peptídeos calcitoninas, e outros cíclico para obter um peptídeo peptídeo cíclico é de análogos de com vasopressina, (ANF/ANP) , 1
3. 3. Processo da reivindicação 1, em que o peptídeo cíclico é seleccionado do grupo consistindo de octreotida, calcitonina (salmão) , desmopressina, oxitocina, nesiritida, e eptifibatida.
4. 4 . Processo da reivindicação 1, em que o peptídeo linear protegido proporcionado na etapa (a) é unido a uma resina.
5. 5. Processo da reivindicação 1, em que o peptídeo cíclico purificado da etapa (e) possui uma pureza de, pelo menos, cerca de LO OD è por HPLC.
6. 6. Processo da reivindicação 1, em que o peptídeo cíclico purificado da etapa (e) possui uma pureza de, pelo menos, cerca de 99% por HPLC.
7. 7 . Processo da reivindicação 1, em que o grupo protector ortogonal é um grupo protector lábil não ácido seleccionado do grupo consistindo de acetamidometilo, benzilo, 4-metoxibenzilo, terc-butilo, trimetilacetamidometilo, fenilacetamidometilo, e terc-butilmercapto.
8. 8. Processo da reivindicação 7, em que o grupo protector lábil não ácido é acetamidometilo.
9. 9. Processo da reivindicação 1, compreendendo ainda a neutralização do excesso de agente oxidante após a etapa (d) .
10. 10. Processo da reivindicação 1, compreendendo ainda a secagem do peptídeo cíclico purificado. 2
11. 11. Processo da reivindicação 1, em que a composição ácida compreende ácido trifluoroacético.
12. 12. Processo da reivindicação 11, em que a composição ácida compreende ainda triisopropilsilano e etanoditiol.
13. 13. Processo da reivindicação 1, em que o agente oxidante é iodo.
14. 14. Processo da reivindicação 1, em que as etapas de purificação (d) e (e) são efectuadas utilizando HPLC.
15. 15. Processo da reivindicação 1, compreendendo as etapas de a) proporcionar um peptídeo linear protegido possuindo a fórmula X-D-Phe-Cys(X)-Phe-D-Trp-Lys(X)-Thr(X)-Cys-(Acm)-Thr(X)-ol, em que X é grupo protector idêntico ou diferente; b) fazer reagir o peptídeo linear protegido da etapa (a) com uma composição ácida para produzir um peptídeo linear semi-protegido D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-ol; c) purificar o peptídeo linear semi-protegido da etapa (b) utilizando HPLC; d) tratar o peptídeo linear semi-protegido purificado da etapa (c) com um agente oxidante para produzir um peptídeo cíclico (2,7 cíclico) D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-ol; e 3 e) purificação do peptídeo cíclico da etapa (d) utilizando HPLC para obter um peptídeo cíclico purificado.
16. 16. Processo da reivindicação 1, compreendendo as etapas de: a) proporcionar um peptídeo linear protegido possuindo a fórmula Mpa(X)-Har(X)-Gly-Asp(X)-Trp-Pro-Cys(Acm), em que X é grupo protector idêntico ou diferente; b) fazer reagir o peptídeo linear protegido da etapa (a) com uma composição ácida para produzir um peptídeo linear semi-protegido Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)NH2/ c) purificar o peptídeo linear semi-protegido da etapa (b) utilizando HPLC; d) tratar o peptídeo linear semi-protegido purificado da etapa (c) com um agente oxidante para produzir um peptídeo cíclico (1,7 cíclico) Mpa-Har-Gly-Asp-Trp-Pro-Cys(Acm)-NH2; e e) purificar o peptídeo cíclico da etapa (d) utilizando HPLC para obter um peptídeo cíclico purificado.
17. 17. Processo da reivindicação 1, compreendendo as etapas de: a) proporcionar um peptídeo linear protegido possuindo a fórmula Mpa(X)-Tyr(X)-Phe-Gln(X)-Asn(X)-Cys(Acm)-Pro-D- Arg(X)-Gly, em que X é grupo protector idêntico ou diferente; 4 b) fazer reagir o peptídeo linear protegido da etapa (a) com uma composição ácida para produzir um peptideo linear semi-protegido Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2/ c) purificar o peptideo linear semi-protegido da etapa (b) utilizando HPLC; d) tratar o peptideo linear semi-protegido purificado da etapa (c) com um agente oxidante para produzir um peptideo ciclico (1,6 ciclico) Mpa-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-D-Arg-Gly-NH2; e e) purificar o peptideo ciclico da etapa (d) utilizando HPLC para obter um peptideo ciclico purificado.
18. 18. Processo da reivindicação 1, compreendendo as etapas de: a) proporcionar um peptideo linear protegido possuindo a fórmula Cys(X)-Ser(X)-Asn(X)-Leu, Ser (X)-Thr(X)-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys(X)-Leu-Ser(X)-Gin(X)-Glu(X)-Leu-His(X) - Lys(X)-Leu-Gln(X)-Thr(X)-Tyr(X)-Pro-Arg(X)-Thr(X)-Asn(X)-Thr(X)-Gly-Ser(X)-Gly-Thr(X)-Pro-NH2; em gue X é grupo protector idêntico ou diferente; b) fazer reagir o peptideo linear protegido da etapa (a) com uma composição ácida para produzir um peptideo linear semi-protegido Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu- Gly-Lys -Leu- Ser-Gln-Glu-Leu-His -Lys -Leu-Gln- Thr- Tyr- Pro-Arg- Thr- Asn- Thr-Gly-Ser-Gly- Thr- Pr o -NH2; 5 c) purificar o peptídeo linear semi-protegido da etapa (b) utilizando HPLC; d) tratar o peptideo linear semi-protegido purificado da etapa (c) com um agente oxidante para produzir um peptideo cíclico (1,7 cíclico) Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Acm)-Val-Leu-Gly-Lys-Leu-Ser-Gla-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr-Pro-Arg-Thr-Asn-Thr-Gly-Ser-Gly-Thr-Pro-NH2; e e) purificar o peptídeo cíclico da etapa (d) utilizando HPLC para obter um peptídeo cíclico purificado.
19. 19. em que o uma pureza Processo da reivindicação 15, 16, 17 ou 18, peptídeo cíclico purificado da etapa (e) possui de, pelo menos, cerca de 98,5% por HPLC.
20. 20 . Processo da reivindicação 15, 16, 17, ou 18 em que o peptídeo cíclico purificado da etapa (e) possui uma pureza de, pelo menos, cerca de 99% por HPLC. Lisboa, 19 de Setembro de 2006 6