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CN114437233A - 一种多肽二聚体的定向合成方法 - Google Patents

一种多肽二聚体的定向合成方法 Download PDF

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CN114437233A
CN114437233A CN202011227833.3A CN202011227833A CN114437233A CN 114437233 A CN114437233 A CN 114437233A CN 202011227833 A CN202011227833 A CN 202011227833A CN 114437233 A CN114437233 A CN 114437233A
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CN
China
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linear peptide
acm
fmoc
resin
dimer
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Application number
CN202011227833.3A
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马洪季
余仕文
钟祥龙
王宏欣
李培祥
龙镭
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Hubei Jianxiang Biopharmaceutical Co ltd
Original Assignee
Hubei Jianxiang Biopharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种多肽二聚体的定向合成方法。该方法包括以下步骤：1)制备含aa1(Trt)、aa2(Acm)的线性肽树脂A，含aa1(Acm)、aa2(Trt)的线性肽树脂B；2)采用裂解试剂1裂解树脂A、B得到aa1(活化基)、aa2(Acm)的线性肽A1，含aa1(Acm)、aa2(活化基)的线性肽B1；采用裂解试剂2裂解树脂A、B得到含aa1、aa2(Acm)的线性肽A2，含aa1(Acm)、aa2的线性肽B2；3)将含活化基的线性肽与不含活化基的线性肽第一次环化；4)脱除Acm，第二次环化，得到顺式或反式多肽二聚体。本发明通过对线性肽树脂Cys侧链保护基和裂解路径的双重选择，采用分步氧化的方式实现分子间二硫键的定向形成，所得的主产物单一，纯度高，收率高，有利于多肽二聚体大工业化生产。

Description

一种多肽二聚体的定向合成方法
技术领域
本发明涉及多肽合成领域，特别涉及一种多肽二聚体的定向合成方法。
背景技术
多肽合成中，两个巯基侧链可通过适当的氧化剂氧化成相应的二硫键，研究二硫键形成的方法是多肽合成领域中研究的热点和难点之一。空气氧化法、铁氰化钾氧化法、碘氧化法、双氧水氧化法、DMSO氧化法、三氟乙酸铊氧化法、Npys氧化法是多肽合成应用中的常用方法。某些多肽往往需要形成一对或多对二硫键，且二硫键可分为分子内形成或分子间形成，通过一步氧化法和分步氧化法实现。若巯基之间需要选择性形成两对以上的二硫键，一步氧化法要求该结构具有热力学稳定性天然构象，否则难以保证形成正确配对的二硫键。分步氧化法通过两对以上不同巯基保护基，利用其性质差异，分步氧化形成两对以上的二硫键。含有一对二硫键的环状多肽，例如缩宫素、特利加压素、奥曲肽、阿托西班等，在合成和储存过程中可能发生聚合形成二聚体，成为影响药物质量的重要杂质。杂质研究是药物质量研究的重要内容，也是药物质量保证的关键因素之一，为了保证临床用药安全，需要对合成过程中产生的工艺杂质和储存过程中产生的降解杂质进行详细的分析。此类二聚体杂质有α构型和β构型，即顺式二聚体和反式二聚体，为了便于杂质的研究，二聚体杂质的定向合成尤为关键。
专利申请文件CN110218242通过合成线性肽A：Mpa(Acm)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2或者线性肽B：Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(Acm)-Pro-Orn-Gly-NH2；用过氧化氢对线性肽A或线性肽B进行液相环化，随后采用碘/甲醇溶液进行二次环化，得到阿托西班顺式二聚体(α-Dimer)，其结构式为：
Figure BDA0002764179870000011
通过合成线性肽A：Mpa(Acm)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2和线性肽B：Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(Acm)-Pro-Orn-Gly-NH2；线性肽A和线性肽B(摩尔比1:1))混合，用过氧化氢进行液相环化，随后采用碘/甲醇溶液进行二次环化，得到阿托西班反式二聚体(β-Dimer)，其结构式为：
Figure BDA0002764179870000021
然而，采用该法合成顺式二聚体时，由于双氧水的强氧化性，易生成较多的小杂质，同时也有过度氧化的风险，收率较低；采用该法合成反式二聚体时，发现线性肽A和线性肽A之间或者线性肽B和线性肽B之间会发生反应，因此仍有顺式二聚体的产生，无法实现定向合成。
发明内容
针对上述现有多肽二聚体合成过程中存在的杂质多、收率低、无法实现定向合成等问题，本发明提供了一种多肽二聚体的定向合成方法，该法反应条件温和、反应时间较短，所得的产物纯度高，可作为杂质对照品用于多肽原料药及制剂的质量研究，从而有效的保障和控制多肽药物的质量。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
一种多肽二聚体的定向合成方法，包括以下步骤：(1)制备含aa1(Trt)、aa2(Acm)的线性肽树脂A，含aa1(Acm)、aa2(Trt)的线性肽树脂B；(2)采用裂解试剂1裂解树脂A、B得到含aa1(活化基)、aa2(Acm)的线性肽A1，含aa1(Acm)、aa2(活化基)的线性肽B1；采用裂解试剂2裂解树脂A、B得到含aa1、aa2(Acm)的线性肽A2，含aa1(Acm)、aa2的线性肽B2；(3)将含活化基的线性肽与不含活化基的线性肽于酸性溶液中第一次环化；(4)脱除Acm，第二次环化，得到顺式或反式多肽二聚体。在本发明的一些实施例中，所述aa1和aa2选自Cys、Mpa。
在本发明的一些实施例中，所述多肽选自缩宫素、阿托西班、奥曲肽、特利加压素、去氨加压素、乌拉立肽、生长抑素等肽链上含有两个巯基的多肽。
优选地，所述裂解试剂1选自TFA、含吡啶基二硫醚化合物、T的混合溶液；所述裂解试剂2选自TFA与T的混合溶液；其中T选自Tis、Mpr、间甲酚、Phenol、H2O中的一个或多个化合物。
作为优选方案，所述的二硫醚化合物选自2,2'-二硫双(5-硝基吡啶)、双硫氧吡啶、2,2'-二硫二吡啶及4,4'-二硫二吡啶。进一步优选2,2′-二硫二吡啶，2,2′-二硫二吡啶与巯基反应选择性较高且第一次环化反应速度最快。
作为优选方案，所述酸性溶液选自醋酸、盐酸、磷酸或其缓冲盐溶液，进一步优选醋酸，线性肽在醋酸水溶液的溶解性较好，且醋酸水溶液可以继续作为第二次环化采用碘氧化法的反应溶剂。
在本发明的一些实施例中，所述第二次环化采用碘氧化法或者双氧水氧化法。
在本发明的一些实施例中，二硫醚化合物优选为2,2'-二硫二吡啶，所述多肽二聚体的合成具体为如下步骤：(1)制备含aa1(Trt)、aa2(Acm)的线性肽树脂A，含aa1(Acm)、aa2(Trt)的线性肽树脂B；(2)采用裂解试剂1裂解树脂A、B得到aa1(S-Pyr)、aa2(Acm)的线性肽A1，含aa1(Acm)、aa2(S-Pyr)的线性肽B1；采用裂解试剂2裂解树脂A、B得到含aa1、aa2(Acm)的线性肽A2，含aa1(Acm)、aa2的线性肽B2；(3)将含S-Pyr的线性肽与不含S-Pyr的线性肽于酸性溶液中第一次环化；(4)脱除Acm，第二次环化，得到顺式或反式多肽二聚体。
进一步地，所述顺式多肽二聚体的合成具体为如下步骤：(1)制备含aa1(Trt)、aa2(Acm)的线性肽树脂A，(2)采用裂解试剂1裂解树脂A，得到含aa1(S-Pyr)、aa2(Acm)的线性肽A1；采用裂解试剂2裂解树脂A，得到含aa1、aa2(Acm)的线性肽A2，(3)取线性肽A1、A2于酸性溶液中第一次环化，(4)脱除Acm，第二次环化，得到顺式多肽二聚体；
或者(1)制备含aa1(Acm)、aa2(Trt)的线性肽树脂B，(2)采用裂解试剂1裂解树脂B得到含aa1(Acm)、aa2(S-Pyr)的线性肽B1；采用裂解试剂2裂解树脂B，得到含aa1(Acm)、aa2的线性肽B2，(3)取线性肽B1、B2于酸性溶液中第一次环化；(4)脱除Acm，第二次环化，得到顺式多肽二聚体。
进一步地，所述反式多肽二聚体的合成具体为如下步骤：(1)制备含aa1(Trt)、aa2(Acm)的线性肽树脂A，含aa1(Acm)、aa2(Trt)的线性肽树脂B；(2)采用裂解试剂1裂解树脂A、B，得到含aa1(S-Pyr)、aa2(Acm)的线性肽A1，含aa1(Acm)、aa2(S-Pyr)的线性肽B1；采用裂解试剂2裂解树脂A、B，得到含aa1、aa2(Acm)的线性肽A2，含aa1(Acm)、aa2的线性肽B2；(3)取线性肽A1、B2于酸性溶液中第一次环化；(4)脱除Acm，第二次环化，得到反式多肽二聚体；
或者(3)取线性肽A2、B1于酸性溶液中第一次环化；(4)脱除Acm，第二次环化，得到反式多肽二聚体。
发明通过对线性肽树脂Cys侧链保护基和裂解路径的双重选择，采用分步氧化的方式实现分子间二硫键的定向形成，在本发明的技术方案中，第一对二硫键的形成采用含吡啶基二硫醚化合物活化其中一条线性肽的巯基侧链再与另一条巯基裸露的线性肽进行定向反应，有效避免了二聚体合成过程中发生分子内或者分子间的二硫键错搭，所得的主产物单一，纯度高，收率高，且反应条件温和，反应时间较短，有利于多肽二聚体公斤级及工业化生产。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1、奥曲肽顺式二聚体的合成
奥曲肽线性肽树脂A合成
称量32.2g Amide AM树脂(20mmol，取代值为0.65mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入200ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。称取芴甲基氧羰基苏胺醇对羧基苯缩醛(27.59g,3.0eq.)、HOBt(8.91g,3.3eq.)溶于150ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(14.2ml,4.5eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-D-Phe-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到60.08g奥曲肽线性肽树脂A：D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr-ol-Amide AM树脂。
奥曲肽线性肽A1的合成
称取上述30.04g奥曲肽线性肽树脂A，加入300.0ml裂解试剂1[(TFA/Tis/H2O/间甲酚＝94.0/2.5/2.5/1.0)、2,2'-二硫双(5-硝基吡啶)(6.20g,2eq.)]中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到17.28g奥曲肽线性肽A1：
Figure BDA0002764179870000041
奥曲肽线性肽A2的合成
称取上述30.04g奥曲肽线性肽树脂A，加入300.0ml裂解试剂2(TFA/Tis/H2O/间甲酚＝94.0/2.5/2.5/1.0)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到17.02g奥曲肽线性肽A2：D-Phe-Cys-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys(Acm)-Thr-OH。
第一次环化
称取上述17.28g奥曲肽线性肽A1，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
称取17.02g奥曲肽线性肽A2，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
将上述线性肽A1醋酸水溶液加至线性肽A2醋酸水溶液，室温搅拌反应1-2h形成中间体C。反应完毕，中间体C粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000053
使用0.1％TFA水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞80％的馏分合并，得到奥曲肽二聚体杂质中间体C：
Figure BDA0002764179870000051
第二次环化
往纯化后的奥曲肽二聚体杂质中间体C溶液，加入400ml醋酸，搅拌均匀；
缓慢加入碘乙醇溶液，保持溶液的颜色为淡黄色且不退去，室温下搅拌反应约16-20h，反应完毕加入抗坏血酸(Vc)淬灭反应，得到奥曲肽顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为86.42％，前杂0.47％、后杂1.74％。
奥曲肽顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000054
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到奥曲肽顺式二聚体(α-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000052
称量奥曲肽顺式二聚体(α-Dimer)的重量为13.09g，总收率为64.23％，HPLC纯度为97.82％，最大单杂为0.48％。
实施例2、奥曲肽反式二聚体的合成
奥曲肽线性肽树脂A合成
称量16.1g Amide AM树脂(10mmol，取代值为0.65mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入200ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。称取芴甲基氧羰基苏胺醇对羧基苯缩醛(13.80g,3.0eq.)、HOBt(4.45g,3.3eq.)溶于150ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(7.1ml,4.5eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH和Fmoc-D-Phe-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到30.44g奥曲肽线性肽树脂A：D-Phe-Cys(Trt)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Acm)-Thr-ol–Amide AM树脂。
奥曲肽线性肽树脂B合成
称量16.1g Amide AM树脂(20mmol，取代值为0.65mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入200ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。称取芴甲基氧羰基苏胺醇对羧基苯缩醛(13.80g,3.0eq.)、HOBt(4.45g,3.3eq.)溶于150ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(7.1ml,4.5eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-D-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH和Fmoc-D-Phe-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到29.96g奥曲肽线性肽树脂B：D-Phe-Cys(Acm)-Phe-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr-ol-Amide AM树脂。
奥曲肽线性肽A1的合成
称取上述30.44g奥曲肽线性肽树脂A，加入300.0ml裂解试剂1[(TFA/Tis/H2O/间甲酚＝94.0/2.5/2.5/1.0)、2,2'-二硫双(5-硝基吡啶)(6.20g,2eq.)]中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到17.28g奥曲肽线性肽A1：
Figure BDA0002764179870000061
奥曲肽线性肽B2的合成
称取上述29.96g奥曲肽线性肽树脂B，加入300.0ml裂解试剂2(TFA/Tis/H2O/间甲酚＝94.0/2.5/2.5/1.0)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到17.02g奥曲肽线性肽B2：D-Phe-Cys(Acm)-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH。
第一次环化
称取上述17.28g奥曲肽线性肽A1，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
称取17.02g奥曲肽线性肽B2，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
将上述线性肽A1醋酸水溶液加至线性肽B2醋酸水溶液，室温搅拌反应1-2h形成中间体D。反应完毕，中间体D粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000073
使用0.1％TFA水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞80％的馏分合并，得到奥曲肽二聚体杂质中间体D。
Figure BDA0002764179870000071
第二次环化
将纯化后的中间体D溶液，再加入400ml醋酸，搅拌均匀；
缓慢加入碘乙醇溶液，保持溶液的颜色为淡黄色且不退去，室温下搅拌反应约16-20h，反应完毕加入抗坏血酸(Vc)淬灭反应，得到奥曲肽反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为78.39％，前杂0.35％、后杂2.03％。
奥曲肽反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000074
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到奥曲肽反式二聚体(β-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000072
称量奥曲肽反式二聚体(β-Dimer)的重量为11.74g，总收率为57.58％，HPLC纯度为98.84％，最大单杂为0.86％。
实施例3、缩宫素顺式二聚体的合成
缩宫素线性肽树脂A合成
称量25.6g Rink Amide MBHA树脂(20mmol，取代值为0.78mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入200ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH(11.90g,2.0eq.)、HOBt(5.94g,2.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(9.5ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到62.52g缩宫素线性肽树脂A：H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide MBHA树脂。
缩宫素线性肽A1的合成
称取上述31.26g含aa1(Trt)、aa2(Acm)的缩宫素线性肽树脂A，加入312.6ml裂解试剂1[(TFA/Tis/H2O＝95.0/2.5/2.5)、2,2-二硫二吡啶(4.41g,2eq.)]中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到18.38g缩宫素线性肽A1：H-Cys(S-Pyr)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH2，即
Figure BDA0002764179870000081
缩宫素线性肽A2的合成
称取上述31.26g缩宫素线性肽树脂A，加入312.6ml裂解试剂2(TFA/Tis/H2O＝95.0/2.5/2.5)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到18.04g缩宫素线性肽A2：H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH2。
第一次环化
称取上述18.38g的缩宫素线性肽A1，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
称取18.04g的缩宫素线性肽A2，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
将上述线性肽A1醋酸水溶液加至线性肽A2醋酸水溶液，室温搅拌反应1-2h形成中间体E。反应完毕，中间体E粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000093
使用0.1％TFA水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞80％的馏分合并，得到缩宫素二聚体杂质中间体E。
Figure BDA0002764179870000091
第二次环化
将纯化后的中间体E溶液，再加入400ml醋酸，搅拌均匀；
缓慢加入碘乙醇溶液，保持溶液的颜色为淡黄色且不退去，室温下搅拌反应约16-20h，反应完毕加入抗坏血酸(Vc)淬灭反应，得到缩宫素顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为84.84％，前杂1.72％、后杂0.50％。
缩宫素顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000094
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到缩宫素顺式二聚体(α-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000092
称量缩宫素顺式二聚体(α-Dimer)的重量为13.79g，总收率为68.47％，HPLC纯度为98.73％，最大单杂为0.42％。
实施例4、缩宫素反式二聚体的合成
缩宫素线性肽树脂A合成
称量12.8g Rink Amide MBHA树脂(10mmol，取代值为0.78mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入100ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH(5.95g,2.0eq.)、HOBt(2.97g,2.2eq.)溶于50ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(4.7ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到32.04g缩宫素线性肽树脂A：H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide MBHA树脂。
缩宫素线性肽树脂B合成
称量12.8g Rink Amide MBHA树脂(10mmol，取代值为0.78mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入100ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。称取Fmoc-Gly-OH(5.95g,2.0eq.)、HOBt(2.97g,2.2eq.)溶于50ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(4.7ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Cys(Acm)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到31.78g缩宫素肽树脂B：H-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-RinkAmide MBHA树脂。
缩宫素线性肽A1的合成
称取上述32.04g含aa1(Trt)、aa2(Acm)的缩宫素线性肽树脂A，加入320.4ml裂解试剂1[(TFA/Tis/H2O＝95.0/2.5/2.5)、2,2-二硫二吡啶(4.41g,2eq.)[中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到18.62g缩宫素线性肽A1：H-Cys(S-Pyr)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH2，即
Figure BDA0002764179870000111
缩宫素线性肽B2的合成
称取上述32.78g缩宫素线性肽树脂B，加入327.8ml裂解试剂2(TFA/Tis/H2O＝95.0/2.5/2.5)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到17.86g缩宫素线性肽B2：H-Cys(Acm)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2。
第一次环化
称取上述18.62g缩宫素线性肽A1，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
称取17.86g缩宫素线性肽B2，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
将上述线性肽A1醋酸水溶液加至线性肽B2醋酸水溶液，室温搅拌反应1-2h形成中间体F反应完毕，中间体F粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000113
使用0.1％TFA水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞80％的馏分合并，得到缩宫素二聚体杂质中间体F。
Figure BDA0002764179870000112
第二次环化
将纯化后的中间体F溶液，再加入400ml醋酸，搅拌均匀；
缓慢加入碘乙醇溶液，保持溶液的颜色为淡黄色且不退去，室温下搅拌反应约16-20h，反应完毕加入抗坏血酸(Vc)淬灭反应，得到缩宫素反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为70.28％，前杂1.89％、后杂0.86％。
缩宫素反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000114
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到缩宫素反式二聚体(β-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000121
称量缩宫素反式二聚体(β-Dimer)的重量为12.94g，总收率为64.23％，HPLC纯度为98.63％，最大单杂为0.37％。
实施例5、阿托西班顺式二聚体的合成
阿托西班线性肽树脂B合成
称量21.0g Rink Amide AM树脂(20mmol，取代值为0.95mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入200ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH(11.90g,2.0eq.)、HOBt(5.94g,2.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(9.5ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联联Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Tyr(Et)-OH、Mpa(Acm)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到41.38g阿托西班线性肽树脂B：Mpa(Acm)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Rink Amide AM树脂阿托西班线性肽B1的合成
称取上述20.69g阿托西班线性肽树脂B，加入206.9ml裂解试剂1[(TFA/Tis/H2O/间甲酚＝93.5/3.0/2.5/2.0)、2,2-二硫二吡啶(4.41g,2eq.)]中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至2500ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到10.13g阿托西班线性肽B1：Mpa(Acm)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(S-Pyr)-Pro-Orn-Gly-NH2，即
Figure BDA0002764179870000122
阿托西班线性肽B2的合成
称取上述20.69g阿托西班线性肽树脂B，加入206.9ml裂解试剂2(TFA/Tis/H2O/间甲酚＝93.5/3.0/2.5/2.0)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到9.96g缩宫素线性肽B2：Mpa(Acm)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2。
第一次环化
称取上述10.13g阿托西班线性肽B1，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
称取9.96g阿托西班线性肽B2，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
将上述线性肽B1醋酸水溶液加至线性肽B2醋酸水溶液，室温搅拌反应1-2h形成中间体G。反应完毕，中间体G粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000133
使用0.1％TFA水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞80％的馏分合并，得到阿托西班二聚体杂质中间体G。
Figure BDA0002764179870000131
第二次环化
往纯化后的中间体G溶液，滴加25％氨水调节pH＝8.0±0.5；
缓慢滴加1.2ml 30％过氧化氢溶液，室温下搅拌反应约1-2h，得到阿托西班顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为84.23％，前杂1.05％、后杂0.98％。
阿托西班顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000134
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到阿托西班顺式二聚体(α-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000132
称量阿托西班顺式二聚体(α-Dimer)的重量为14.34g，总收率为72.13％，HPLC纯度为97.96％，最大单杂为0.47％。
实施例6、阿托西班反式二聚体的合成
阿托西班线性肽树脂A合成
称量10.5g Rink Amide AM树脂(10mmol，取代值为0.95mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入100ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH(5.95g,2.0eq.)、HOBt(2.97g,2.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(4.7ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联联Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Tyr(Et)-OH、Mpa(Trt)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到22.12g阿托西班线性肽树脂A：Mpa(Trt)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Rink Amide AM树脂。
阿托西班线性肽树脂B合成
称量10.5g Rink Amide AM树脂(10mmol，取代值为0.95mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入100ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH(5.95g,2.0eq.)、HOBt(2.97g,2.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(4.7ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联联Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Tyr(Et)-OH、Mpa(Acm)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到22.86g阿托西班线性肽树脂B：Mpa(Acm)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Rink Amide AM树脂。
阿托西班线性肽A2的合成
称取上述22.12g阿托西班肽树脂A，加入22.12ml裂解试剂2(TFA/Tis/H2O/间甲酚＝93.5/3.0/2.5/2.0)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至2500ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到11.52g阿托西班线性肽A2：Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(Acm)-Pro-Orn-Gly-NH2。
阿托西班线性肽B1的合成
称取上述22.86g阿托西班线性肽树脂B，加入206.9ml裂解试剂1[(TFA/Tis/H2O/间甲酚＝93.5/3.0/2.5/2.0)、2,2-二硫二吡啶(4.41g,2eq.)]中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到10.69g阿托西班线性肽B1：Mpa(Acm)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(S-Pyr)-Pro-Orn-Gly-NH2，即
Figure BDA0002764179870000151
第一次环化
称取上述11.52g阿托西班线性肽A2，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
称取10.69g阿托西班线性肽B1，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
将上述线性肽A2醋酸水溶液加至线性肽B1醋酸水溶液，室温搅拌反应1-2h形成中间体H。反应完毕，中间体H粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000153
使用0.1％TFA水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞80％的馏分合并，得到阿托西班二聚体杂质中间体H。
Figure BDA0002764179870000152
第二次环化
往纯化后的中间体H溶液，滴加25％氨水调节pH＝8.0±0.5；
缓慢滴加1.2ml 30％过氧化氢溶液，室温下搅拌反应约1-2h，得到阿托西班反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为76.25％，前杂0.85％、后杂1.44％。
阿托西班反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000162
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到阿托西班反式二聚体(β-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000161
称量阿托西班反式二聚体(β-Dimer)的重量为11.98g，总收率为60.25％，HPLC纯度为98.13％，最大单杂为0.64％。
实施例7、特利加压素顺式二聚体的合成
特利加压素线性肽树脂A合成
称量25.6g Rink Amide MBHA树脂(20mmol，取代值为0.78mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入200ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH(11.90g,2.0eq.)、HOBt(5.94g,2.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(9.5ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Gly-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到64.86g特利加压素线性肽树脂A：H-Gly-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Lys(Boc)-Gly-Rink AmideMBHA树脂。
特利加压素线性肽A1的合成
称取上述32.43g特利加压素线性肽树脂A，加入312.6ml裂解试剂1[(TFA/Tis/Phenol/H2O/间甲酚＝94/2/2/1/1)、4,4'-二硫二吡啶(4.41g,2eq.)]中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到19.24g特利加压素线性肽A1：
Figure BDA0002764179870000171
称取上述32.43g特利加压素肽树脂A，加入312.6ml裂解试剂2(TFA/Tis/Phenol/Mpr/间甲酚＝94/2/2/1/1)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到19.06g特利加压素线性肽A2：H-Gly-Gly-Gly-Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Lys-Gly-NH2。
第一次环化
称取上述19.24g特利加压素线性肽A1，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
称取19.06g特利加压素线性肽A2，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
将上述线性肽A1醋酸水溶液加至线性肽A2醋酸水溶液，室温搅拌反应1-2h形成中间体I。反应完毕，中间体I粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000173
使用0.1％TFA水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞80％的馏分合并，得到特利加压素二聚体杂质中间体I。
Figure BDA0002764179870000172
第二次环化
将纯化后的中间体C溶液，再加入400ml醋酸，搅拌均匀；
缓慢加入碘乙醇溶液，保持溶液的颜色为淡黄色且不退去，室温下搅拌反应约16-20h，反应完毕加入抗坏血酸(Vc)淬灭反应，得到特利加压素顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为86.92％，前杂2.56％、后杂1.42％。
特利加压素顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000174
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到特利加压素顺式二聚体(α-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000181
称量特利加压素顺式二聚体(α-Dimer)的重量为16.30g，总收率为66.40％，HPLC纯度为97.25％，最大单杂为0.89％。
实施例8、特利加压素反式二聚体的合成
特利加压素线性肽树脂A合成
称量12.8g Rink Amide MBHA树脂(10mmol，取代值为0.78mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入100ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH(5.95g,2.0eq.)、HOBt(2.97g,2.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(4.7ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Gly-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到32.66g特利加压素线性肽树脂A：H-Gly-Gly-Gly-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Lys(Boc)-Gly-Rink AmideMBHA树脂。
特利加压素线性肽树脂B合成
称量12.8g Rink Amide MBHA树脂(20mmol，取代值为0.78mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入100ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH(5.95g,2.0eq.)、HOBt(2.97g,2.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(4.7ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH和Fmoc-Gly-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到33.08g特利加压素线性肽树脂B：H-Gly-Gly-Gly-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Lys(Boc)-Gly-Rink AmideMBHA树脂。
特利加压素线性肽A1的合成
称取上述32.66g特利加压素线性肽树脂A，加入312.6ml裂解试剂1[(TFA/Tis/Phenol/H2O/间甲酚＝94/2/2/1/1)、4,4'-二硫二吡啶(4.41g,2eq.)]中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到18.82g特利加压素线性肽A1：
Figure BDA0002764179870000191
特利加压素线性肽B2的合成
称取上述33.08g含aa1(Acm)、aa2(Trt)的特利加压素肽树脂B，加入33.06ml裂解试剂2(TFA/Tis/Phenol/Mpr/间甲酚＝94/2/2/1/1)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到18.66g特利加压素线性肽B2：H-Gly-Gly-Gly-Cys(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2。
第一次环化
称取上述18.82g特利加压素线性肽A1，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
称取18.66g特利加压素线性肽B2，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
将上述线性肽A1醋酸水溶液加至线性肽B2醋酸水溶液，室温搅拌反应1-2h形成中间体J。反应完毕，中间体J粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000192
使用0.1％TFA水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞80％的馏分合并，得到特利加压素二聚体杂质中间体J。
Figure BDA0002764179870000201
反应完毕，中间体J溶液进行纯化处理。
第二次环化
将纯化后的中间体J溶液，再加入400ml醋酸，搅拌均匀；
缓慢加入碘乙醇溶液，保持溶液的颜色为淡黄色且不退去，室温下搅拌反应约16-20h，反应完毕加入抗坏血酸(Vc)淬灭反应，得到特利加压素反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为75.50％，前杂2.16％、后杂0.96％。
特利加压素反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000203
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到特利加压素反式二聚体(β-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000202
称量特利加压素反式二聚体(β-Dimer)的重量为13.47g，总收率为54.87％，HPLC纯度为96.89％，最大单杂为1.00％。
实施例9、去氨加压素顺式二聚体的合成
去氨加压素线性肽树脂B合成
称量25.6g Rink Amide MBHA树脂(20mmol，取代值为0.78mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入200ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH(11.90g,2.0eq.)、HOBt(5.94g,2.2eq.)溶于200ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(9.5ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Mpr(Acm)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到60.24g去氨加压素线性肽树脂B：Mpr(Acm)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-Gly-Rink Amide MBHA树脂。
去氨加压素线性肽B1的合成
称取上述30.12g去氨加压素线性肽树脂B，加入301.2ml裂解试剂1[(TFA/Tis/H2O/间甲酚＝93/3/3/1)、双硫氧吡啶(5.05g,2eq.)]中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到10.89g去氨加压素线性肽B1：
Figure BDA0002764179870000211
去氨加压素线性肽B2的合成
称取上述30.12g去氨加压素线性肽树脂B，加入301.2ml裂解试剂2(TFA/Tis/Mpr/间甲酚＝93/3/3/1)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到10.07g去氨加压素线性肽B2：Mpr(Acm)-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2。
第一次环化
称取上述10.89g去氨加压素线性肽B1，加入2000ml纯化水搅拌溶解，滴加盐酸调节pH＝4-6；
称取上述10.07g去氨加压素线性肽B2，加入2000ml纯化水搅拌溶解，滴加盐酸调节pH＝4-6；；
将上述线性肽B1盐酸水溶液加至线性肽B2盐酸水溶液，室温搅拌反应1-2h形成中间体K。反应完毕，中间体K粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000213
使用0.1％TFA水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞80％的馏分合并，得到去氨加压素二聚体杂质中间体K。
Figure BDA0002764179870000212
第二次环化
往纯化后的中间体K溶液，滴加25％氨水调节pH＝8.0±0.5；
缓慢滴加1.2ml 30％过氧化氢溶液，室温下搅拌反应约1-2h，得到去氨加压素顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为87.21％，前杂1.06％、后杂2.16％。
去氨加压素顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000222
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到去氨加压素顺式二聚体(α-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000221
称量去氨加压素顺式二聚体(α-Dimer)的重量为14.29g，总收率为66.82％，HPLC纯度为98.17％，最大单杂为0.73％。
实施例10、去氨加压素反式二聚体的合成
去氨加压素线性肽树脂A合成
称量12.8g Rink Amide MBHA树脂(10mmol，取代值为0.78mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入100ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH(5.95g,2.0eq.)、HOBt(2.97g,2.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(4.7ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Mpr(Trt)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到28.85g去氨加压素线性肽树脂A：Mpr(Trt)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Arg(Pbf)-Gly-Rink Amide MBHA树脂。
去氨加压素线性肽树脂B合成
称量12.8g Rink Amide MBHA树脂(10mmol，取代值为0.78mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入100ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH(5.95g,2.0eq.)、HOBt(2.97g,2.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(4.7ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-D-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Mpr(Acm)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到29.82g去氨加压素线性肽树脂B：Mpr(Acm)-Tyr(tBu)-Phe-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Arg(Pbf)-Gly-Rink Amide MBHA树脂。
去氨加压素线性肽A2的合成
称取上述28.85g去氨加压素线性肽树脂A，加入288.5ml裂解试剂2(TFA/Mpr/H2O/间甲酚＝93/3/3/1)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到12.25g去氨加压素线性肽A2：Mpr-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Arg-Gly-NH2。
去氨加压素线性肽B1的合成
称取上述33.08g去氨加压素肽树脂B，加入33.06ml裂解试剂1[(TFA/Tis/H2O/间甲酚＝93/3/3/1)、双硫氧吡啶(5.05g,2eq.)]中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到11.83g去氨加压素线性肽B1：
Figure BDA0002764179870000231
第一次环化
称取上述12.25g去氨加压素线性肽A2，加入2000ml纯化水搅拌溶解，滴加盐酸调节pH＝4-6；；
称取11.83g去氨加压素线性肽B1，加入2000ml纯化水搅拌溶解，滴加盐酸调节pH＝4-6；；
将上述线性肽A2醋酸水溶液加至线性肽B1醋酸水溶液，室温搅拌反应1-2h形成中间体L。反应完毕，中间体L粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000232
使用0.1％TFA水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞80％的馏分合并，得到特利加压素二聚体杂质中间体L。
Figure BDA0002764179870000241
第二次环化
往纯化后的中间体L溶液，滴加25％氨水调节pH＝8.0±0.5；
缓慢滴加1.2ml 30％过氧化氢溶液，室温下搅拌反应约1-2h，得到去氨加压素反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为72.98％，前杂1.48％、后杂0.87％。
去氨加压素反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000243
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到去氨加压素反式二聚体(β-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000242
称量去氨加压素反式二聚体(β-Dimer)的重量为12.46g，总收率为58.27％，HPLC纯度为98.56％，最大单杂为0.55％。
实施例11、乌拉立肽顺式二聚体的合成
乌拉立肽线性肽树脂A合成
称量24.1g Wang树脂(20mmol，取代值为0.83mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入200ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(18.39g,2.0eq.)、HOBt(5.94g,2.2eq.)和DMAP(0.49g,0.2eq.)溶于200ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(9.5ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Thr(tBu)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到128.80g乌拉立肽线性肽树脂A：H-Thr(tBu)-Ala-Pro-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Ac m)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Wang树脂。
乌拉立肽线性肽A1的合成
称取上述64.40g乌拉立肽肽树脂A，加入644.0ml裂解试剂1[(TFA/Tis/Phenol/间甲酚＝95/2/2/1)、2,2-二硫二吡啶(4.41g,2eq.)]中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至6000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到38.72g乌拉立肽线性肽A1：H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys(S-Pyr)-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gl y-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH，即
Figure BDA0002764179870000251
H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH
乌拉立肽线性肽A2的合成
称取上述64.40g乌拉立肽肽树脂A，加入312.6ml裂解试剂2(TFA/Tis/Phenol/间甲酚＝95/2/2/1)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至6000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到37.98g乌拉立肽线性肽A2：H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-G ln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH。
第一次环化
称取上述38.72g乌拉立肽线性肽A1，加入2000ml纯化水搅拌溶解，滴加磷酸调节pH＝4.0-6.0；
称取上述37.98g乌拉立肽线性肽A2，加入2000ml纯化水搅拌溶解，滴加磷酸调节pH＝4.0-6.0；
将上述线性肽A1磷酸水溶液加至线性肽A2磷酸水溶液，室温搅拌反应1-2h形成中间体M。反应完毕，中间体M粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000263
使用0.1％TFA水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞80％的馏分合并，得到乌拉立肽二聚体杂质中间体M。
Figure BDA0002764179870000261
第二次环化
将纯化后的中间体M溶液，再加入400ml醋酸，搅拌均匀；
缓慢加入碘乙醇溶液，保持溶液的颜色为淡黄色且不退去，室温下搅拌反应约16-20h，反应完毕加入抗坏血酸(Vc)淬灭反应，得到乌拉立肽顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为79.26％，前杂0.96％、后杂1.82％。
乌拉立肽顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000264
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到乌拉立肽顺式二聚体(α-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000262
称量乌拉立肽顺式二聚体(α-Dimer)的重量为41.48g，总收率为59.16％，HPLC纯度为97.22％，最大单杂为0.80％。
实施例12、乌拉立肽反式二聚体的合成
乌拉立肽线性肽树脂A合成
称量12.0g Wang树脂(10mmol，取代值为0.83mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入200ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(9.20g,2.0eq.)、HOBt(2.97g,2.2eq.)和DMAP(0.25g,0.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(4.7ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Thr(tBu)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到65.86g乌拉立肽线性肽树脂A：H-Thr(tBu)-Ala-Pro-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Wang树脂。
乌拉立肽肽树脂B合成
称量12.0g Wang树脂(10mmol，取代值为0.83mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入200ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。称取Fmoc-Tyr(tBu)-OH(9.20g,2.0eq.)、HOBt(2.97g,2.2eq.)和DMAP(0.25g,0.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(4.7ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH和Fmoc-Thr(tBu)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到65.12g乌拉立肽线性肽树脂B：H-Thr(tBu)-Ala-Pro-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Leu-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-Phe-Gly-Gly-Arg(Pbf)-Met-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Ile-Gly-Ala-Gln(Trt)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Gly-Cys(Trt)-Asn(Trt)-Ser(tBu)-Phe-Arg(Pbf)-Tyr(tBu)-Wang树脂。
乌拉立肽线性肽A1的合成
称取上述65.86g乌拉立肽线性肽树脂A，加入651.2ml裂解试剂1[(TFA/Tis/Phenol/间甲酚＝95/2/2/1)、2,2-二硫二吡啶(4.41g,2eq.)]中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至6000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到39.12g乌拉立肽线性肽A1：H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys(S-Pyr)-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH，即
Figure BDA0002764179870000281
H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys(Acm)-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH
乌拉立肽线性肽B2的合成
称取上述65.12g乌拉立肽肽树脂B，加入312.6ml裂解试剂2(TFA/Tis/Phenol/间甲酚＝95/2/2/1)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至6000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到37.55g乌拉立肽线性肽B2：H-Thr-Ala-Pro-Arg-Ser-Leu-Arg-Arg-Ser-Ser-Cys(Acm)-Phe-Gly-Gly-Arg-Met-Asp-Arg-Ile-Gly-Ala-Gln-Ser-Gly-Leu-Gly-Cys-Asn-Ser-Phe-Arg-Tyr-OH
第一次环化
称取上述39.12g乌拉立肽线性肽A1，加入2000ml纯化水搅拌溶解，滴加磷酸调节pH＝4.0-6.0；
称取上述37.55g乌拉立肽线性肽B2，加入2000ml纯化水搅拌溶解，滴加磷酸调节pH＝4.0-6.0；
将上述线性肽A1磷酸水溶液加至线性肽B2磷酸水溶液，室温搅拌反应1-2h形成中间体N。反应完毕，中间体N粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000282
使用0.1％TFA水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞80％的馏分合并，得到乌拉立肽二聚体杂质中间体N。
Figure BDA0002764179870000291
第二次环化
将纯化后的中间体N溶液，再加入400ml醋酸，搅拌均匀；
缓慢加入碘乙醇溶液，保持溶液的颜色为淡黄色且不退去，室温下搅拌反应约16-20h，反应完毕加入抗坏血酸(Vc)淬灭反应，得到乌拉立肽反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为69.04％，前杂1.28％、后杂1.58％。
乌拉立肽反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000293
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到乌拉立肽反式二聚体(β-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000292
称量乌拉立肽反式二聚体(β-Dimer)的重量为32.90g，总收率为46.92％，HPLC纯度为98.24％，最大单杂为0.46％。
实施例13、生长抑素顺式二聚体的合成
生长抑素线性肽树脂A合成
称量22.22g 2CTC树脂(20mmol，取代值为0.90mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入200ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。称取Fmoc-Cys(Acm)-OH(33.18g,4.0eq.)、DIEA(31.02g,12.0eq.)和DMAP(0.98g,0.4eq.)，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应5h。抽干，DMF洗涤4次。
加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(15.35g,2.0eq.)、HOBt(5.94g,2.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(9.5ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到76.84g生长抑素线性肽树脂A：H-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-2CTC树脂。
生长抑素线性肽A1的合成
称取上述38.42g生长抑素线性肽树脂A，加入384.2ml裂解试剂1[(TFA/Tis/H2O＝95.0/2.5/2.5)、2,2-二硫二吡啶(4.41g,2eq.)]中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到28.86g生长抑素线性肽A1：H-Ala-Gly-Cys(S-Pyr)-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(Acm)-OH，即
Figure BDA0002764179870000301
生长抑素线性肽A2的合成
称取上述38.42g生长抑素线性肽树脂A，加入384.2ml裂解试剂2(TFA/Tis/H2O＝95.0/2.5/2.5)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到27.23g生长抑素线性肽A2：H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(Acm)-OH。
第一次环化
称取上述28.86g的生长抑素线性肽A1，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
称取27.23g的生长抑素线性肽A2，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
将上述线性肽A1醋酸水溶液加至线性肽A2醋酸水溶液，室温搅拌反应1-2h形成中间体O。反应完毕，中间体O粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000302
使用0.1％TFA水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞80％的馏分合并，得到生长抑素二聚体杂质中间体O。
Figure BDA0002764179870000311
第二次环化
将纯化后的中间体O溶液，再加入400ml醋酸，搅拌均匀；
缓慢加入碘乙醇溶液，保持溶液的颜色为淡黄色且不退去，室温下搅拌反应约16-20h，反应完毕加入抗坏血酸(Vc)淬灭反应，得到生长抑素顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为58.23％，前杂3.42％、后杂4.52％。
生长抑素顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000313
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到生长抑素顺式二聚体(α-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000312
称量生长抑素顺式二聚体(α-Dimer)的重量为19.40g，总收率为59.23％，HPLC纯度为98.74％，最大单杂为0.39％。
实施例14、生长抑素反式二聚体的合成
生长抑素线性肽树脂A合成
称量22.22g 2CTC树脂(20mmol，取代值为0.90mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入200ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。称取Fmoc-Cys(Acm)-OH(33.18g,4.0eq.)、DIEA(31.02g,12.0eq.)和DMAP(0.98g,0.4eq.)，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应5h。抽干，DMF洗涤4次。
加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(15.35g,2.0eq.)、HOBt(5.94g,2.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(9.5ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到76.84g生长抑素线性肽树脂A：H-Ala-Gly-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Acm)-2CTC树脂。
生长抑素线性肽树脂B合成
称量22.22g 2CTC树脂(20mmol，取代值为0.90mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入200ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。称取Fmoc-Cys(Trt)-OH(46.89g,4.0eq.)、DIEA(31.02g,12.0eq.)和DMAP(0.98g,0.4eq.)，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应5h。抽干，DMF洗涤4次。
加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Ser(tBu)-OH(15.35g,2.0eq.)、HOBt(5.94g,2.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(9.5ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Ala-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到76.84g生长抑素线性肽树脂B：H-Ala-Gly-Cys(Acm)-Lys(Boc)-Asn(Trt)-Phe-Phe-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Phe-Thr(tBu)-Ser(tBu)-Cys(Trt)-2CTC树脂。
生长抑素线性肽A1的合成
称取上述38.42g生长抑素线性肽树脂A，加入384.2ml裂解试剂1[(TFA/Tis/H2O＝95.0/2.5/2.5)、2,2-二硫二吡啶(4.41g,2eq.)]中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到28.86g生长抑素线性肽A1：H-Ala-Gly-Cys(S-Pyr)-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys(Acm)-OH，即
Figure BDA0002764179870000331
生长抑素线性肽B2的合成
称取上述37.52g生长抑素线性肽树脂B，加入375.2ml裂解试剂2(TFA/Tis/H2O＝95.0/2.5/2.5)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到26.76g生长抑素线性肽B2：H-Ala-Gly-Cys(Acm)-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH。
第一次环化
称取上述28.86g生长抑素线性肽A1，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
称取26.76g生长抑素线性肽B2，加入200ml醋酸和1800ml纯化水形成10％的醋酸水溶液；
将上述线性肽A1醋酸水溶液加至线性肽B2醋酸水溶液，室温搅拌反应1-2h形成中间体P反应完毕，中间体P粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000333
使用0.1％TFA水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞80％的馏分合并，得到生长抑素二聚体杂质中间体P。
Figure BDA0002764179870000332
第二次环化
将纯化后的中间体P溶液，再加入400ml醋酸，搅拌均匀；
缓慢加入碘乙醇溶液，保持溶液的颜色为淡黄色且不退去，室温下搅拌反应约16-20h，反应完毕加入抗坏血酸(Vc)淬灭反应，得到生长抑素反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为56.79％，前杂3.52％、后杂2.12％。
生长抑素反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000334
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到生长抑素反式二聚体(β-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000341
称量生长抑素反式二聚体(β-Dimer)的重量为16.23g，总收率为49.54％，HPLC纯度为98.68％，最大单杂为0.43％。
对比例1、缩宫素顺式二聚体的合成
缩宫素线性肽树脂A合成
称量25.6g Rink Amide MBHA树脂(20mmol，取代值为0.78mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入200ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH(11.90g,2.0eq.)、HOBt(5.94g,2.2eq.)溶于100ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(9.5ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到63.86g含aa1(Trt)、aa2(Acm)的缩宫素线性肽树脂A：H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide MBHA树脂。
缩宫素线性肽A2的合成
称取上述63.86g缩宫素线性肽树脂A，加入638.6ml裂解试剂(TFA/Tis/H2O＝95.0/2.5/2.5)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至6500ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到36.53g缩宫素线性肽A2：H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH2。
第一次环化
称取上述36.53g缩宫素线性肽A2，加入2000ml纯化水搅拌溶解，滴加25％氨水调节pH＝8.0±0.5；
缓慢滴加1.2ml 30％过氧化氢溶液，室温下搅拌反应约1-2h，形成缩宫素二聚体杂质中间体E。
Figure BDA0002764179870000351
第二次环化
往中间体E溶液加入400ml醋酸，搅拌均匀；
缓慢加入碘乙醇溶液，保持溶液的颜色为淡黄色且不退去，室温下搅拌反应约16-20h，反应完毕加入抗坏血酸(Vc)淬灭反应，得到缩宫素顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为63.11％，前杂4.86％、后杂2.18％。
缩宫素顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000353
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到缩宫素顺式二聚体(α-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000352
称量缩宫素顺式二聚体(α-Dimer)的重量为2.64g，总收率为13.11％，HPLC纯度为95.86％，最大单杂为1.67％。
对比例2、缩宫素反式二聚体的合成
缩宫素线性肽树脂A合成
称量12.8g Rink Amide MBHA树脂(10mmol，取代值为0.78mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入100ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。称取Fmoc-Gly-OH(5.95g,2.0eq.)、HOBt(2.97g,2.2eq.)溶于50ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(4.7ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Cys(Trt)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到33.28g含aa1(Trt)、aa2(Acm)的缩宫素线性肽树脂A：H-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide MBHA树脂。
缩宫素线性肽树脂B合成
称量12.8g Rink Amide MBHA树脂(10mmol，取代值为0.78mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加入100ml DMF溶胀30min，抽干。再用DMF洗涤两次，抽干。称取Fmoc-Gly-OH(5.95g,2.0eq.)、HOBt(2.97g,2.2eq.)溶于50ml DMF中，于0～10℃下加入DIC(4.7ml,3.0eq.)活化4min，加入至合成反应柱中，25±5℃氮气保护下反应2～4h。抽干，DMF洗涤4次。加入20％PIPE/DMF脱除Fmoc保护两次，脱保护时间分别为5min+10min，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH和Fmoc-Cys(Acm)-OH。脱除Fmoc保护基，再经过DMF洗涤4次、DCM洗涤3次、MeOH洗涤3次，干燥后得到31.56g缩宫素线性肽树脂B：H-Cys(Acm)-Tyr(tBu)-Ile-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Leu-Gly-Rink Amide MBHA树脂。
缩宫素线性肽A2的合成
称取上述33.28g缩宫素肽树脂A，加入320.4ml裂解试剂(TFA/Tis/H2O＝95.0/2.5/2.5)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到18.87g缩宫素线性肽A2：H-Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys(Acm)-Pro-Leu-Gly-NH2。
缩宫素线性肽B2的合成
称取上述32.56g缩宫素肽树脂B，加入327.8ml裂解试剂(TFA/Tis/H2O＝95.0/2.5/2.5)中，于25±5℃下裂解反应1～4h。反应完毕，过滤，用100ml TFA洗涤树脂。滤液加至3000ml冰冻的异丙醚中沉降，析出固体、离心，洗涤后得到17.89g缩宫素线性肽B2：H-Cys(Acm)-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2。
第一次环化
称取上述18.87g缩宫素线性肽A2和17.89g缩宫素线性肽B2，加入2000ml纯化水搅拌溶解，滴加25％氨水调节pH＝8.0±0.5；
缓慢滴加1.2ml 30％过氧化氢溶液，室温下搅拌反应约1-2h，形成缩宫素二聚体杂质中间体F。
Figure BDA0002764179870000371
第二次环化
往中间体F溶液加入400ml醋酸，搅拌均匀；
缓慢加入碘乙醇溶液，保持溶液的颜色为淡黄色且不退去，室温下搅拌反应约16-20h，反应完毕加入抗坏血酸(Vc)淬灭反应，得到缩宫素反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为13.84％，前杂44.29％、后杂0.86％，其中前杂保留时间与缩宫素顺式二聚体(α-Dimer)一致，说明在第一次环化，线性肽A2和线性肽A2之间或者线性肽B2和线性肽B2之间会发生反应，生成缩宫素顺式二聚体，因此，无法实现定向合成。
缩宫素反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液使用0.45μm有机膜过滤，用反相液相色谱纯化分离，填料为反相C18，粒径为8μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000373
使用0.1％醋酸水溶液和乙腈进行梯度洗脱，将纯度＞90％的馏分合并，得到二聚体杂质并样，并样于32℃水浴旋蒸浓缩去除有机溶剂，冷冻干燥后得到缩宫素反式二聚体(β-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000372
称量缩宫素反式二聚体(β-Dimer)的重量为1.80g，总收率为8.92％，HPLC纯度为97.15％，最大单杂为1.13％。
对比例3、阿托西班顺式二聚体的合成
阿托西班线性肽树脂B合成
称量10.6g Rink Amide AM树脂(10mmol，取代值为0.95mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加70ml DCM溶胀30min，抽干。用DMF洗涤2次，抽干。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
称取8.92g Fmoc-Gly-OH(3.0eq)、5.40g HOBt(4.0eq)溶解于40ml DMF中，于0℃～10℃下加入6.2ml DIC(4.0eq)，活化5min，加入合成反应柱中，于30℃±3℃搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Tyr(Et)-OH、Mpa(Acm)-OH。经洗涤干燥后得到19.8g阿托西班线性肽树脂B：Mpa(Acm)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Rink Amide AM树脂。
阿托西班线性肽B2合成
将上述肽树脂B加入200ml裂解试剂(TFA/Tis/Phenol/Mpr＝92.5/2.5/2.5/2.5))中，于25℃±5℃裂解反应2h。反应结束后，过滤，滤液加入到1.6L 0℃±5℃的甲基叔丁基醚中沉降，离心，洗涤后即可得到阿托西班线性肽B2：Mpa(Acm)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2。
第一次环化
加入5L纯化水，搅拌溶解，采用稀氨水将溶液PH值调至7.0～7.5，加入10ml过氧化氢溶液，搅拌反应1～2h，得到阿托西班二聚体杂质中间体G：
Figure BDA0002764179870000381
第二次环化
往阿托西班中间体G粗品溶液，缓慢加入6mol/L的碘/甲醇溶液，直至反应溶液呈红棕色，且搅拌3min不褪色，继续搅拌反应4～6小时，如果反应过程中溶液颜色褪色，补加碘/甲醇溶液保证反应溶液呈红棕色。反应结束后，加入维生素C/甲醇溶液淬灭反应，直至反应溶液呈无色溶液。即可得到阿托西班顺式二聚体(α-Dimer)粗品溶液，粗品HPLC纯度为42.53％，前杂8.26％、后杂2.68％。
用0.45μm滤膜过滤，用半制备反相高效液相色谱法纯化分离，所用的填料为C18，粒径10μm，孔径为
Figure BDA0002764179870000383
色谱柱规格为50mm*250mm。采用0.3％乙酸/纯化水作为流动相A、乙腈(色谱纯)作为流动相B，检测波长为230nm，用5％流动相B平衡10min，1min内升到34％，在60min内从34％升到50％直到洗脱结束,收集37min～41min组分。将收集合格样品溶液于30℃±5℃下浓缩去除乙腈，冷冻干燥后得到1.03g阿托西班顺式二聚体(α-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000382
称量阿托西班顺式二聚体(α-Dimer)的重量为1.03g，收率为5.18％，HPLC纯度为98.39％，最大单杂为0.96％。
对比例4、阿托西班反式二聚体的合成
阿托西班线性肽树脂A合成
称量12.5g Rink Amide AM树脂(10mmol，取代值为0.80mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加70ml DCM溶胀30min，抽干。用DMF洗涤2次，抽干。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
称取8.92g Fmoc-Gly-OH(3.0eq)、5.40g HOBt(4.0eq)溶解于40ml DMF中，于0℃～10℃下加入6.2ml DIC(4.0eq)，活化5min，加入合成反应柱中，于30℃±3℃搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Tyr(Et)-OH、Mpa(Trt)-OH。经洗涤干燥后得到20.5g阿托西班线性肽树脂A：Mpa(Trt)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Acm)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Rink Amide AM树脂。
阿托西班肽树脂B合成
称量10.6g Rink Amide AM树脂(10mmol，取代值为0.95mmol/g)，加入多肽合成反应柱中，加70ml DCM溶胀30min，抽干。用DMF洗涤2次，抽干。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
称取8.92g Fmoc-Gly-OH(3.0eq)、5.40g HOBt(4.0eq)溶解于40ml DMF中，于0℃～10℃下加入6.2ml DIC(4.0eq)，活化5min，加入合成反应柱中，于30℃±3℃搅拌反应2～3h，茚三酮检测呈阴性。抽干，DMF洗涤3次。加入20％PIP/DMF脱Fmoc保护两次(时间分别为5min+10min)，DMF洗涤6次。
重复以上步骤，依次偶联Fmoc-Orn(Boc)-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-D-Tyr(Et)-OH、Mpa(Acm)-OH。经洗涤干燥后得到19.8g阿托西班线性肽树脂B：Mpa(Acm)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr(tBu)-Asn(Trt)-Cys(Trt)-Pro-Orn(Boc)-Gly-Rink Amide AM树脂。
阿托西班线性肽A2的合成
将上述线性肽树脂A加入200ml裂解试剂(TFA/Tis/H2O/间甲酚＝93.5/3.0/2.5/2.0)中，于25℃±5℃裂解反应2h。反应结束后，过滤，滤液加入到1.6L 0℃±5℃的甲基叔丁基醚中沉降，离心，洗涤后即可得到阿托西班线性肽A2：和Mpa-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys(Acm)-Pro-Orn-Gly-NH2。
阿托西班线性肽B2的合成
将上述线性肽树脂B加入200ml裂解试剂(TFA/Tis/H2O/间甲酚＝93.5/3.0/2.5/2.0)中，于25℃±5℃裂解反应2h。反应结束后，过滤，滤液加入到1.6L 0℃±5℃的甲基叔丁基醚中沉降，离心，洗涤后即可得到阿托西班线性肽B2：Mpa(Acm)-D-Tyr(Et)-Ile-Thr-Asn-Cys-Pro-Orn-Gly-NH2。
第一次环化：
将上述线性肽A2和线性肽B2加入4L纯化水，搅拌溶解，采用稀氨水将溶液pH值调至7.0～7.5，加入10ml过氧化氢溶液，搅拌反应1～2h。得到阿托西班二聚体杂质中间体H：
Figure BDA0002764179870000401
第二次环化：
往阿托西班中间体H粗品溶液，缓慢加入6mol/L的碘/甲醇溶液，直至反应溶液呈红棕色，且搅拌3min不褪色，继续搅拌反应4～6小时，如果反应过程中溶液颜色褪色，补加碘/甲醇溶液保证反应溶液呈红棕色。反应结束后，加入维生素C/甲醇溶液淬灭反应，直至反应溶液呈无色溶液。即可得到阿托西班杂质反式二聚体(β-Dimer)粗品溶液。粗品HPLC纯度为13.84％，前杂2.63％、后杂44.29％，保留时间与阿托西班顺式二聚体(α-Dimer)一致，说明在第一次环化，线性肽A2和线性肽A2之间或者线性肽B2和线性肽B2之间会发生反应，生成阿托西班顺式二聚体，因此，无法实现定向合成。
用0.45μm滤膜过滤，用半制备反相高效液相色谱法纯化分离，所用的填料为C18，粒径10μm，孔径色谱柱规格为50mm*250mm。采用0.3％乙酸/纯化水作为流动相A、乙腈(色谱纯)作为流动相B，检测波长为230nm，用5％流动相B平衡10min，1min内升到34％，在60min内从34％升到50％直到洗脱结束,收集37min～41min组分。将收集合格样品溶液于30℃±5℃下浓缩去除乙腈，冷冻干燥后得到0.62g阿托西班反式二聚体(β-Dimer)：
Figure BDA0002764179870000402
称量阿托西班反式二聚体(β-Dimer)的重量为0.62g，收率为3.12％，HPLC纯度为98.05％，最大单杂为1.04％。

Claims (10)

1.一种多肽二聚体的定向合成方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备含aa1(Trt)、aa2(Acm)的线性肽树脂A，含aa1(Acm)、aa2(Trt)的线性肽树脂B；(2)采用裂解试剂1裂解树脂A、B得到含aa1(活化基)、aa2(Acm)的线性肽A1，含aa1(Acm)、aa2(活化基)的线性肽B1；采用裂解试剂2裂解树脂A、B得到含aa1、aa2(Acm)的线性肽A2，含aa1(Acm)、aa2的线性肽B2；(3)将含活化基的线性肽与不含活化基的线性肽于酸性溶液中第一次环化；(4)脱除Acm，第二次环化，得到顺式或反式多肽二聚体。
2.根据权利要求1所述的多肽二聚体的定向合成方法，其特征在于，所述aa1和aa2选自Cys、Mpa。
3.根据权利要求1所述的多肽二聚体的定向合成方法，其特征在于，所述多肽选自缩宫素、阿托西班、奥曲肽、特利加压素、去氨加压素、乌拉立肽、生长抑素。
4.根据权利要求1～3任一所述的多肽二聚体的定向合成方法，其特征在于，所述裂解试剂1选自TFA、含吡啶基二硫醚化合物、T的混合溶液；所述裂解试剂2选自TFA与T的混合溶液；其中T选自Tis、Mpr、间甲酚、Phenol、H2O中的一个或多个化合物。
5.根据权利要求4所述的多肽二聚体的定向合成方法，其特征在于，所述的含吡啶基二硫醚化合物选自2,2'-二硫双(5-硝基吡啶)、双硫氧吡啶、2,2'-二硫二吡啶及4,4'-二硫二吡啶。
6.根据权利要求5所述的多肽二聚体的定向合成方法，其特征在于，所述的含吡啶基二硫醚化合物为2,2'-二硫二吡啶，所述多肽二聚体的合成具体为如下步骤：(1)制备含aa1(Trt)、aa2(Acm)的线性肽树脂A，含aa1(Acm)、aa2(Trt)的线性肽树脂B；(2)采用裂解试剂1裂解树脂A、B得到aa1(S-Pyr)、aa2(Acm)的线性肽A1，含aa1(Acm)、aa2(S-Pyr)的线性肽B1；采用裂解试剂2裂解树脂A、B得到含aa1、aa2(Acm)的线性肽A2，含aa1(Acm)、aa2的线性肽B2；(3)将含S-Pyr的线性肽与不含S-Pyr的线性肽于酸性溶液中第一次环化；(4)脱除Acm，第二次环化，得到顺式或反式多肽二聚体。
7.根据权利要求6所述的多肽二聚体的定向合成方法，其特征在于，所述顺式多肽二聚体的合成具体为如下步骤：(1)制备含aa1(Trt)、aa2(Acm)的线性肽树脂A，(2)采用裂解试剂1裂解树脂A，得到含aa1(S-Pyr)、aa2(Acm)的线性肽A1；采用裂解试剂2裂解树脂A，得到含aa1、aa2(Acm)的线性肽A2，(3)取线性肽A1、A2于酸性溶液中第一次环化，(4)脱除Acm，第二次环化，得到顺式多肽二聚体；
或者(1)制备含aa1(Acm)、aa2(Trt)的线性肽树脂B，(2)采用裂解试剂1裂解树脂B得到含aa1(Acm)、aa2(S-Pyr)的线性肽B1；采用裂解试剂2裂解树脂B，得到含aa1(Acm)、aa2的线性肽B2，(3)取线性肽B1、B2于酸性溶液中第一次环化；(4)脱除Acm，第二次环化，得到顺式多肽二聚体。
8.根据权利要求6所述的多肽二聚体的定向合成方法，其特征在于，所述反式多肽二聚体的合成具体为如下步骤：(1)制备含aa1(Trt)、aa2(Acm)的线性肽树脂A，含aa1(Acm)、aa2(Trt)的线性肽树脂B，(2)采用裂解试剂1裂解树脂A、B，得到含aa1(S-Pyr)、aa2(Acm)的线性肽A1，含aa1(Acm)、aa2(S-Pyr)的线性肽B1；采用裂解试剂2裂解树脂A、B，得到含aa1、aa2(Acm)的线性肽A2，含aa1(Acm)、aa2的线性肽B2；(3)取线性肽A1、B2于酸性溶液中第一次环化；(4)脱除Acm，第二次环化，得到反式多肽二聚体；
或者(3)取线性肽A2、B1于酸性溶液中第一次环化；(4)脱除Acm，第二次环化，得到反式多肽二聚体。
9.根据权利要求1～3任一所述的多肽二聚体的定向合成方法，其特征在于，所述酸性溶液选自醋酸、盐酸、磷酸或其缓冲盐溶液。
10.根据权利要求1～3任一所述的多肽二聚体的定向合成方法，其特征在于，所述第二次环化采用碘氧化法或者双氧水氧化法。
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