PL172257B1 - Sposób wytwarzania nowych analogów oligonukleotydów PL PL - Google Patents

Abstract

1, w którym R oznacza wodór, C 1-C 18-aikil. C 2-C 1 8 -a lkenyl, C2-C 18-alkinyl, C2-C 1 8-alkilokarbonyl, C3-C1 9-alkenylokarbonyl, C3-C 1 9 -alkinylokarb onyl, C6-C20-aryl, (C6-C 1 4)-arylo-(C1 -C8)-alkil, albo reszte o wzorze 2, R2 oznacza wodór, grupe hydroksy, C 1 -C1 9 -alkoksy, chlorowiec, azydo albo NH2, B oznacza zasade zwykla w chemii nukleotydów; a oznacza oksy albo metylen, n oznacza liczbe calkowita od 1 do 100, W oznacza okso, tiokso albo selenokso, V oznacza oksy, sulfandr yl albo imino; Y oznacza oksy, sulfand iy l, imino albo metylen; Y ' oznacza oksy, sulfandiyl, imino, (C H2)m albo V ( C H 2 ) m , gdzie m oznacza liczbe calkowita od 1 do 18, X oznacza hydroksy albo merkapto,. Z = Z ' oznacza hydroksy, merkapto, SeH, C 1 -C22-a lkoksy, -O -(CH2)b-N R12R13, gdzie b jes t lic zb a calkowita o d 1 do 6, R 1 3 oznacza C 1 -C 6-alkil albo R 1 2 i R13 razem z atomem azotu do którego s a one przylaczone tworza 3- 6-czlonowy pierscien, C1-C 1 6-alkil, C6-C20-aryl, (C6-C 14)-arylo-(C 1-C8)-alkil, (C6-C 1 4)-arylo-(C 1 C8)-alkoksy, przy czym aryl oznacza równiez heteroaryl, zas aryl ewentualnie jest podstawiony przez 1 ,2 albo 3 takie same lub rózne rodniki z sze- regu karboksy, amino, nitro, C 1 -C4 alkiloamino, C 1 ,-C6 -alkoksy, hydroksy, chloro- wiec i przez cyjano, C 1 -C 18-alkriomerkapto, NHR3, NR3 R4, rodnik o wzorze 3, albo grupe, która ulatwia wewnatrzkomórkowe wchlanianie albo sluzy jako znacznik (marker) sondy DNA albo przy hybrydyzacji analogu oligonukleotydu z docelowym kwasem nukleinowym atakuje ten ostatni przez wiazanie, poprzeczne usieciowa- nie albo odszczepienie, a zaokraglony nawias oznacza, ze R2 i sasiedni rodnik fos- forylowy m oga sie znajdowac w pozycji 2 ' - 1 3'- albo takze na odwrót w pozycji 3 ' - 1 2 ' -, przy czym kazdy nukleotyd m oze wystepowac w swojej konfiguracji D wzgled- nie L, a zasada B moze sie znajdowac w pozycji a wzglednie ß , z tym, z e jesli Z oz- nacza hydroksy, merkapto, metyl albo etoksy, to co najmniej jedna z grup X, Y, Y', V, W nie oznacza hydroksy, oksy wzglednie okso albo R1 nie oznacza wodoru, znam ienny tym , ze a) sprzega sie znanymi technikami sprzegania stopniowo w ilosci i w kolejno- sci wynikajacej z ukladu sekwencji w e w zorze produktu, jednostki nukleotydowe z 3'(2')-koncowa grup a fosforowa (V) i woln a grupa 5'-hydroksy lub merkapto o wzo- rze A ', w którym R 1, V , a, B, R2, Y , V , W m a ja wyzej podane znaczenie, WZÓR 1 P L 172257 B 1 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych analogów oligonukleotydów o wzorze 1, oraz ich fizjologicznie tolerowanych soli, w którym

R¹ oznacza wodór, C-C^-alkil, zwłaszcza Cf-C₆-alkil, C^C^-alkenyl, C2-C1—alkinyl, C₂-C₁₈-alkilokarbonyl, C3-Cj9-alkenylokarbonyl, C3-C₁9-alkinylokarbonyl, C₆-C20-aryl, (C₆-C1₄)-arylo-(C_r<C₈)-ałkil albo rodnik o wzorze 2;

R2 oznacza wodór, grupę hydroksy, CrC₁₈ -alkoksy, chlorowiec, azydo albo NH2;

B oznacza zasadę zwykłąw chemii nukleotydów, na przykład zasady naturalnejak adenina, cytozyna, guanina i tymina, albo zasady nienaturalne jak puryna, 2,6-diaminopuryna, 7-deazadenina,

7-deazaguanina, N⁴N⁴-etanocytozyna, N6N6-etano-2,6-diaminopuryna, pseudoizocytozyna;

a oznacza oksy albo metylen;

n oznacza liczbę całkowitą od 1 do 100, korzystnie 10 do 40;

W oznacza okso, tiokso albo selenokso;

V oznacza- oksy, sulfandiyl albo imino;

Y oznacza oksy, sulfandiyl, imino albo metylen;

Y' oznacza , oksy, sulfandiyl, imino, (CH2)_m albo V(CH2)_m, gdzie m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 18, szczególnie od 1 do 6;

X oznacza hydroksy albo merkapto;

U oznacza hydroksy, merkapto, SeH, C_rC₁₈ -alkoksy, zwłaszcza C'1-C₆-alkoksy, C1-C₁8-alkil, zwłaszcza C_rC₆-alkil, C₆-C20-aryl, (C₆-C₁₄)<arylo-(Cl-C₈)-alkil, NHR3, NR3R4 albo rodnik o wzorze 3 (OCH₂CH2)pO(CH2)qCH2R¹¹(3), gdzie

R3 oznacza CpCjg-alkil, zwłaszcza C_r»C₈-alkil, C6-C20-aryl, (C6-C,4)-arylo-(C_rC₈)-alkil, -(CH2)_c-/NH(CH2)c/d-NR1²R¹2, gdzie c jest liczbą całkowitą od 2 do 6, zaś djest liczbą całkowitą od 0 do 6, a R*2 niezależnie od siebie oznacza wodór albo C^-alkil albo C_rC4-alkoksy-Cl-C6<alkil, korzystnie metoksyetyl;

R4 oznacza C-C^-alkil, zwłaszcza C_rC8-alkil, a szczególnie korzystnie C_riC4-alkil, ^6^20^- aryl albo (C6-C_w) -arylo-(C1-C8)-alkil, albo w przypadku NR³R4 razem z R3 i atomem azotu, do którego sąone przyłączone oznacza 5-6-członowy pierścień heterocykliczny, który dodatkowo może zawierać dalszy heteroatom z szeregu O, S,N;p jest liczbą całkowitą od 1 do 100, korzystnie 3 do 20, a szczególnie korzystnie 3 do 8;

q jest liczbą całkowitą od 0 do 22, korzystnie 0 do 15;

Rⁿ oznacza wodór albo grupę funkcjonalnąjak hydroksy, amino NHRⁿ, COOH, CONH₂, COOR¹² albo chlorowiec, przy czym R¹² oznacza C^-C^-alkil, zwłaszcza metyl;

Z = Z', oznacza hydroksy, merkapto, SeH, ^C1^-C22 -alkoksy, korzystnie C6-CS8-alkoksy, -O-(CH2)b-NR¹²R¹³, gdzie b jest liczbącałkowitą od 1 do 6, a Rⁿ oznacza CrC6-alkil albo Rⁿ i Rⁿ razem z atomem azotu do którego są przyłączone tworzą 3-6-członowy pierścień, C^C^-alkil, korzystnie C^^C₈-alkil, C6-C20-aryl, (C6-C₁₄)-arylo-(C_rC8-alkil, korzystnie (C6-C₁o)<arylo-(C_r<C4)-alkil, (C6-C₁₄)-arylo-(C1-C8)-alkoksy, korzystnie (C6-C₁o)<arylo-(Cl-C4)-alkoksy, przy czym aryl oznacza również heteroaryl, a aryl ewentualnie jest podstawiony przez 12 albo 3 takie same lub różne rodniki z szeregu karboksy, amino, nitro, C1-C4-alkiloami.no, Q--^-alkoksy, hydroksy, chlorowiec i cyjano, C^-C^-alkilomerkapto, NHR3, NR3R4, rodnik o wzorze 3, albo oznaczają grupę, która ułatwia wewnątrzkomórkowe wchłanianie albo służy jako znacznik (marker) sondy DNA, albo przy hybrydyzacji analogu oligonukleotydu z docelowym kwasem nukleinowym atakuje ten ostatni przez wiązanie, poprzeczne usieciowanie lub odszczepienie, a zaokrąglony nawias oznacza, że R² i sąsiedni rodnik fosforylowy mogąsię znajdować w pozycji 2' i 3' albo na odwrót w pozycji 3' i 2', przy czym każdy nukleotyd może występować w swojej konfiguracji D względnie L zaś zasada B może się znajdować w pozycji a względnie P, z tym, że jeśli Z = hydroksy, merkapto, metyl albo etoksy,, to po najmniej jedna z grup X,- Y, Y', V, W nie oznacza hydroksy, oksy lub okso względnie R1 nie oznacza wodoru.

Korzystne są analogi oligonukleotydów o wzorze 1, oraz ich fizjologicznie tolerowane sole, w których zasada B znajduje się w pozycji β, nukleotydy występują w konfiguracji D, R² znajduje się w pozycji 2', zaś a oznacza oksy.

172 257

Szczególnie korzystne · są analogi oligonukleotydów o wzorze 1, w których

R¹ oznacza wodór, C_rC₆-alkil, korzystnie metyl, albo rodnik o wzorze 2;

R² oznacza wodór albo hydroksy, korzystnie wodór; n oznacza liczbę całkowitą od 10 do 40, korzystnie 12 do 30; m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, korzystnie 1;

U oznacza hydroksy, merkapto, C_rC₆-alkoksy, C_rC₆-alkil, NR³R⁴ albo NHR³, korzystnie hydroksy albo C_rC₆-alkil, gdzie R3 oznacza C_rC₈-alkil, korzystnie C_rC4-alkil, albo metoksyetyl, zaś B, W, V, Y, Y', X i Z mają wyżej podane znaczenie.

Zwłaszcza korzystne są analogi oligonukleotydów o wzorze 1, w którym · V, Y' i Y mają znaczenie oksy.

Następnie szczególnie korzystne są analogi oligonukleotydów o wzorze 1, w których V, Y, Y' i W oznaczają oksy względnie okso.

Całkiem szczególnie korzystne sąanalogi oligonukleotydów o wzorze 1, w którym V, Y, Y', W i U oznaczają oksy, okso względnie hydroksy.

Dalej korzystne sąanalogi oligonukleotydów o wzorze 1, gdzie R1 oznacza wodór.

Szczególnie korzystne sąanalogi oligonukleotydów o wzorze 1, w których U, V, W, X, Y' i Y oznaczają oksy, okso lub hydroksy, a R^l oznacza wodór.

Powtarzające się reszty jak R2, B, a, W, V, Y, U, R3, R4, p, q i Z mogą niezależnie od siebie mieć takie samo albo różne znaczenie, to znaczy na przykład V oznacza niezależnie od siebie oksy, sulfandiyl albo imino.

Chlorowiec oznacza korzystnie fluor, chlor albo brom.

Przez heteroaryl należy rozumieć resztę monocyklicznego lub bicyklicznego heteroaromatu (C3-C9), który w układzie pierścieni zawiera jeden lub dwa atomy N i/lub atom S albo O.

Przykładami grup, które ułatwiają wewnątrzkomórkowe wchłanianie, są różne rodniki lipofilowe jak -O-(CH2)_x-CH3, gdzie x oznacza liczbę całkowitąod 6 do 18, -O-(CH2)_n-CH=CH-(CH2)_m-CH3, gdzie n i m niezależnie od siebie oznaczają liczbę całkowitą od 6 do 12, -O-(CH2-Ch₂O)4-(CH2)9-CH3, -O-(CH₂CH₂O)_ir(CH2)₁₃-CH3 oraz -O-(CH2CH2O)₇-(CH2h₅-CH3, ale także reszty sterydowe jak cholesteryl i konjugaty, które wykorzystują naturalne układy nośników jak kwasy żółciowe, kwas foliowy, 2-(N-alkil, N-alkoksy)-aminoantrachinon, oraz konjugaty mannozy i peptydy odpowiednich receptorów, które za pośrednictwem receptorów prowadzą do endocytozy oligonukleotydów, jak EGF (Epidermal Growth Factor - naskórkowy czynnik wzrostu), bradykinina i PDGF (Platelet Derived Growth Factor - czynnik wzrostu z płytek krwi). Przez grupy znakujące (markery) należy rozumieć grupy fluoryzujące, na przykład pochodne dansylu (= N-dimetyło-1-aminonaftylo-5-sulfonyl), fluoresceiny albo kumaryny, albo grupy chemiluminescencyjne na przykład pochodne akrydyny, jak również wykrywalny testem ELISA układ digoksygeniny, grupę biotyny, która daje się badać w układzie biotyna/awidyna, a także ramiona łączące (łączniki) z grupami funkcjonalnymi, które pozwalają na dodatkowe podstawienie dającymi się wykrywać grupami znakującymi (Reporter-Gruppen), na przykład łącznik aminoalkilowy, który z aktywnym estrem akrydyniowym przekształca się w próbę chemiluminescencyjną. Typowymi grupami znakującymi (markerami) są: pochodna fluoresceiny o wzorze 13 (x = 2-18, korzystnie 4-6); ester akrydyniowy o wzorze 14; pochodna fluoresceiny o wzorze 15 (x = 2-18, korzystnie 4, R=H albo ^^-alkil, -fluoresceina dla x = 4 i R=CH3); konjugat biotyny o wzorze 16 (-biotyna dla R=Fmoc, R=H albo aminowa grupa zabezpieczająca); konjugat digoksygeniny o wzorze 17.

Analogi oligonukleotydów, które wiążą się względnie wstawiają się i/lub odszczepiają albo poprzecznie usieciowują kwasy nukleinowe, obejmują na przykład konjugaty akrydyny, psoralenu, fenantrydyny, naftochinonu, daunomycyny albo chloroetyloaminoarylu. Typowymi rodnikami wstawiającymi się i poprzecznie usieciowującymi są: pochodna akrydyny o wzorze 18 (x = 2-12, korzystnie 4); związek o wzorze 19 (x = 2-12, korzystnie 4); konjugat trimetylopsoralenu o wzorze 20 (= “psoralen” dla X = O, X = -NH albo -O-); konjugat fenantroliny o wzorze 21, konjugat psoralenu o wzorze 22; konjugat naftochinonu o wzorze 23; pochodna daunomycy172 257 ny o wzorze 24; związek o wzorze 25 (x = 1-18, X = alkil, chlorowiec, NO₂, CN, -(CO)-R); związek o wzorze 26 (x = 1-18, X = alkil, chlorowiec, NO2, CN, -(CO)-R).

Przykładami grup NR³R⁴, w których R³ i R⁴ razem z atomem azotu, do którego są one przyłączone tworzą 5- do 6-członowy pierścień heterocykliczny, który dodatkowo zawiera dalszy heteroatom, niech będą rodniki morfolinylo i imidazolidynylo.

Wynalazek nie ogranicza się do α- i β-D- lub L-rybofUranozydów, α- i β-D- lub L-dezoksyrybofuranozydów i odpowiednich karbocyklicznych analogów pięciopierścieniowych, ale odnosi się także do analogów oligonukleotydów zbudowanych z innych jednostek cukrowych, na przykład cukrów o rozszerzonym i zwężonym pierścieniu, acylicznych albo odpowiednich innych pochodnych cukrowych. Wynalazek dalej nie jest ograniczony do przykładowo przytoczonych pochodnych o wzorze 1 rodnika fosforanowego, ale dotyczy także znanych pochodnych defosfo.

Otrzymywanie analogów oligonukleotydów o wzorze 1 następuje podobnie jak synteza biologicznych oligonukleotydów w roztworze, albo korzystnie w fazie stałej, przy pomocy automatycznych syntezatorów.

Jednakże nie jest możliwa synteza na fazie stałej oligonukleotydów z rodnikiem fosforanowym albo fosforanoestrowym na końcu 3' przy pomocy standardowej chemii fosforamidynowej według Caruthers (M.D. Mateucci i M.H. Caruthers, J. Am. Chem. Soc. 103,3185 (1981)), ponieważ pierwsza jednostka nukleotydowa poprzez grupę 3'-hydroksy wiąże się na stałym nośniku i stąd te syntezy dają tylko oligonukleotydy z grupą 3'-hydroksy. Opisano różne sposoby według metody stałej fazy, ale wszystkie one są kłopotliwe i przy ich pomocy często nie daje się wytworzyć pochodnych takich jak ester fosforanowy albo alkilofosfoniany (R. Eritja i in, Tetrahedron Lett. 32,1511 (1991); P. Kumar i in, Tetrahedron Lett. 32,967 (1991); W.T. Markiewicz i T.K. Wyrzykiewicz, Phosphorus, Sulfur and Silicon 51/52, 374 (1990); E. Felder i in. Tetrahedron Lett. 25, 3967 (1984); R. Lohrmann i J. Ruth, DNA 3, 122 (1984)).

Przedmiotem wynalazku jest więc sposób wytwarzania analogów oligonukleotydów o wzorze 1, w którym podstawniki mają wyżej podane znaczenie, który polega na tym, że

a) sprzęga się znanymi technikami sprzęgania stopniowo, w ilości i w kolejności wynikającej z układu sekwencji we wzorze produktu, jednostki nukleotydowe z 3' (2')-końcowągrupą fosforową (V) i wolną grupą 5'-hydroksy lub merkapto o wzorze A', w którym R¹, V, a, B, R2, Y, V, W mają wyżej podane znaczenie, a G oznacza grupę odszczepialną z następnąjednostką nukleotydowąz grupą fosforową (III) lub fosforową (V) w pozycji 3', albo z jej aktywowanymi pochodnymi o wzorze A, w którym B, V, a, Y', R2, Z, X, W mają wyżej podane znaczenie, a R oznacza grupę odszczepialną lub

b) analog oligonukleotydu jest otrzymywany poprzez analogiczne sprzęga nie fragmentów oligonukleotydów wyżej wskazanych i w oligonukleotydach otrzymanych według (a) lub (b) grupy zabezpieczające, czasowo wprowadzone dla zabezpieczenia innych funkcji, zostają odszczepione i tak otrzymane analogi oligonukleotydów o wzorze 1 ewentualnie zostają przeprowadzone w ich fizjologicznie tolerowaną sól. Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się: jednostki nukleotydowe, w których zasada B znajduje się w pozycji β, nukleotydy występują w konfiguracji D, R2 znajduje się w pozycji 2', zaś a oznacza oksy. Korzystnie stosuje się jednostki nukleotydowe, w którychR1 oznacza wodór, C_r^₆-alkil, korzystnie metyl, albo rodnik o wzorze 2;

R2 oznacza wodór albo hydroksy, korzystnie wodór; m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, korzystnie 1;

U oznacza grupę hydroksy, merkapto, C_rC₆-alkoksy, C_r(C₆-alkil, NR³R4 albo NHR3, korzystnie hydroksy albo C_rC6-alkil, przy czym R3 oznacza C_rC₈-alkil, korzystnie C_rC4-alkil, albo metoksyetyl, zaś B, W, V, Y, Y', X i Z mają wyżej podane znaczenie, przy czym stosuje się jednostki nukleotydowe w ilości 10-40 korzystnie 12-30.

W sposobie stosuje się korzystnie jednostki nukleotydowe, w których V, Y i Y' oznaczają grupę oksy, lub w których W oznacza grupę okso, lub w których U oznacza grupę hydroksy.

172 257

W sposobie stosuje się korzystnie jednostki nukleotydowe, w których R1 oznacza wodór.W sposobie stosuje się korzystnie jednostki nukleotydowe z ugrupowieniem zawierającym fosfor, wprowadzonym do nukleotydu czynnikiem fosforynującym o wzorze ogólnym 3' w którym podstawniki R9 i R^w niezależnie od siebie oznaczają Cl, NR^sR6, NR7R⁸ lub Z'', przy czym Z” = Z, który ma wyżej podane znaczenie z tym, że grupy hydroksy, merkapto i SeH musząbyć w postaci zabezpieczonej,

R5, R6, R7 i R⁸ niezależnie od siebie oznaczają alkil C rCn lub R5 i R6 względnie R7 i R8 razem tworzą pierścień 5-6 członowy,

X' oznacza grupę oxy lub sulfandiylową, x' oznacza liczbę całkowitą zero lub 1, aDMTr oznacza grupę dimetoksytritylową. Jako składnik wyjściowy do syntezy na fazie stałej wprowadza się stały nośnik o wzorze 4, w którym A oznacza łącznik, który jest na przykład resztą kwasu dikarboksylowego, diolu, alkiloaminy, monoalkiloamidu kwasu dikarboksylowego, amidu kwasu, albo fosforanu o wzorze 27, w którym R=wodór albo Cpi^-alkil, który ewentualnie jest podstawiony przez -CN, korzystnie oznacza metyl albo 2-cyjanoetyl, T oznacza stały nośnik, na przykład z materiałów takich jak CPG (Controlled Pore Glass - szkło spiekane o kalibrowanych porach), żel krzemionkowy albo żywica organiczna jak polistyren (PS) albo szczepiony kopolimer z PS i poliglikolu etylenowego (POE), który w łańcuchu bocznymjest zmodyfikowany przez grupy funkcjonalne jak hydroksy, amino, chlorowiec albo COOH; D oznacza grupę zabezpieczającą która daje się usunąć bez odszczepienia łącznika A i rodnika X'-CH2CH2-S(O)_x-CH₂CH2 (patrz Bioorg. Chem. 14, (1986) 274-325), jak 4-metoksytetrahydropropanoil i dimetoksytrityl, korzystnie dimetoksytrityl, x jest liczbą całkowitą 0, 1 albo 2, zaś X' oznacza oksy albo sulfandiyl.

Łącznik A, który przez chemiczne wiązanie (amid, ester i inne) łączy stały nośnik T z rodnikiem zawierającym siarkę (Damka i inni, Nucleic Acids Res. 18,3813 (1990)), jest to korzystnie reszta kwasu bursztynowego (O-C(O)-CH2CH2-C(O)-, reszta kwasu szczawiowego, (O-C(O)-C(O)-), alkiloamina, korzystnie LCAA (Long Chain Alkyl Amin - alkiloamina o długim łańcuchu) albo poliglikol etylenowy. Szczególnie korzystna jest reszta kwasu bursztynowego. W określonych przypadkach, na przykład w kombinacji z podstawnikami, które nie wytrzymują dłuższego traktowania amoniakiem, korzystne są bardziej labilne łączniki jak oksalil. Wytwarzanie stałych nośników o wzorach 4 a-c jest opisane w przykładzie I.

Nośnik	D	X'	X	A-T
wzór 4a	DMTr	0	2	wzór 40
wzór 4b	DMTr	0	2	wzór 41
wzór 4c	DMTr	0	0	wzór 42

Synteza na fazie stałej może nastąpić według metody fosforanotrójestrowej, metody H-fosfonianowej i metody fosforamidowej, korzystnie metodąfosforamidynową(E. Sonveaux, Bioorg. Chem. 14, 274, (1986). Najpierw zawsze od nośnika o wzorze 4 odszczepia się grupę zabezpiecząjącąD, korzystnie kwasem, na przykład kwasem trój chlorooctowym w chlorku metylenu. W przypadku metody fosforamidynowej tak otrzymany nośnik o wzorze 4', w którym x, X', A i T mają wyżej podane znaczenie, w obecności słabego kwasu jak tetrazol, kondensuje się z nukleozydo-fosforamidynem o wzorze 5, w którym

B' oznacza B, przy czym ewentualnie występujące w B grupy NH2 mogą występować jako zabezpieczone,

R jest grupą zabezpieczającą która w łagodnych warunkach daje się usunąć, jak 4-metoksytetrahydropiranoil albo dimetoksytrityl,

R2 oznacza wodór, C_rC₁₈ -alkoksy, chlorowiec albo zabezpieczoną funkcję hydroksy lub amino, i

R5 i R6 niezależnie od siebie oznaczają C_rC₁₂-alkii albo oba rodniki razem tworzą 5- do 6-członowy pierścień,

Y oznacza oksy, sulfandiyl albo (CH2)_m, zaś

172 257 a, m, V i Z mają wyżej podane znaczenie.

Następnie tak otrzymany nośnik utlenia się w znany sposób wodąjodową(W = O) względnie TETD (dwusiarczek tetraetylotriuramowy) albo elementarną siarką (W = S) względnie selenem (W = Se) do nośnika pochodnego o wzorze 7, w którym R, V, B, R²', Z, X', W, Y, A i T mają wyżej podane znaczenie. Korzystnie wytwarza się nośniki o wzorze 7a.

Fosforamidyn o wzorze 5 można na przykład otrzymać z bis-amidynu o wzorze 6, w którym R⁷ i R⁸ sąrówne R⁵ i R⁶, zaś a, R, V, B', R2, Y, R⁵ i R⁶ mąjąwyżej podane znaczenie, przez reakcję z odpowiednim alkoholem albo tioalkoholem przy katalizie tetrazolem (przykład II, metoda A), gdy Z = alkoksy albo alkilomerkapto (J.E.Marugg i inni), Tetrahedron Lett. 27,2271, (1986).

Korzystnymi bis-amidynami są te o wzorze 6a.

W ten sposób wytwarza się na przykład amidyny o wzorach 8 a-m, w których

R⁵ i R6 mają wyżej podane znaczenie, Z oznacza a) O-CH2CH3, b) O-i-C₃H7, c) O-n-C6-H₁₃, d) O-n-C₁₈H₃7, e) wzór 28, f) wzór 29, g-k) rodnik o wzorze 3 (R¹¹ = H), gdzie oznacza przy g) p=3 i q=0, h) p=4 i q=9, i) p=5 i q=4 i przy k) p=8 i q= 13, p) CH3, m) wzór 30, i B' przy

a), c) i d) oznacza Cyt^1_Bu, przy b) i p) oznacza Thy i przy e)-k i m) oznacza Cyt^Bz.

Alternatywną metodą obładowania nośnika jest reakcja odczynnika fosforynującego o wzorze 9, w którym R⁹ i R¹⁰ niezależnie od siebie oznaczają Cl, albo Z, przy czym Z” = Z, z tym że hydroksy, merkapto i SeH muszą występować jako pochodne zabezpieczone (wzór 31, wzór 32) na przykład jako O-CH2CH2CN, O-CH3, S-CH2CH2CN, X'-CH₂CH2-S(O)_x. C^C^-N-D albo związek o wzorze 33, korzystnie jako X'-CH2CH2-S(O)_x, CH2CH2-X' -DMTr, gdzie x' oznacza liczbę całkowitą zero lub 1, zwłaszcza jako O-C^CIF-S-CI^Clf-O-DMTr, zaś R⁵, R6, r7, R⁸, X', DMTr i D mąjąwyżej podane znaczenie, z nukleozydem z wolną funkcją 3' (2') o wzorze 10, w którym Y''' oznacza Oksy albo sulfandiyl, zaś V, B' i R mają wyżej podane znaczenie, i następna kondensacj a tak otrzymanego związku na nośniku o wzorze 4', w obecności środka kondensacyjnego jak tetrazol (dla R9, R^w = NR5R6 względnie NR⁷R8 albo diizopropyloamina (dla R9, R’0 = Cl) często stanowi metodę szybszą (przykład III, metoda B). Następujące teraz utlenienie wodą jodową względnie siarką lub selenem prowadzi do związku o wzorze 7a. Teraz można usunąć grupę zabezpieczającąR i syntezę oligonukleotydu prowadzić dalej w znany sposób. Na końcu syntezy z tak otrzymanego związanego z nośnikiem analogu oligonukleotydu usuwa się grupy zabezpieczające w znany sposób i następnie analog oligonukleotydu o wzorze 1 odszczepia się z nośnika.

Jeśli syntezę zamyka się w ostatnim cyklu jednostką o wzorze 5, otrzymuje się analog oligonukleotydu o wzorze 1 (R’=H), z grupą 5'-hydroksylową i zawierającą fosfor konjugacją na końcu 3'. Jeśli natomiast w ostatnim etapie kondensacji wprowadzi się odczynnik fosforylujący, na przykład o wzorze 9, gdzie R9=Z, z syntezy wynika analog oligonukleotydu o wzorze 1, gdzie R¹ = wzór 2, który zarówno na końcu 3' jak 5' wykazuje podstawienie zawierające fosforan.

Wytwarzanie oligonukleotydów z 3'-końcową grupą fosforamidanową jest możliwe na przykład przez reakcję nośnika o wzorze 4' (x = 0) z monomerem metoksy-fosforamidynu o wzorze 5 (Z = O-CH3) w obecności tetrazolu, gdy utlenianie przeprowadza się jak opisali Jager i in. (Biochemistry 27, 7237 (1988) za pomocą jodu/H2NR3 względnie HNR3R⁴, gdzie R3 i R⁴ mają wyżej podane znaczenie.

W określonych przypadkach (Z = NHR³, NR3R4, O, S albo Se) wprowadzenie grupy Z może nastąpić również metodą H-fosfonianową, gdy najpierw nukleozydo-H-fosfonian o wzorze 11, w którym R, V, a, B', Y', X' i W mająwyżej podane znaczenie, poddaje się reakcji z nośnikiem o wzorze 4' w obecności środka kondensacyjnego jak chlorek piwaloilu lub adamantoilu oraz zasady jak pirydyna. Wytworzony diester H-fosfonianu o wzorze 7b poddaje się teraz utleniającemu fosforamidowaniu (B. Froehler, Tetrahedron Lett. 27,5575 (1986) względnie utlenianiu wodą jodową, siarką albo selenem. W ten sposób można na przykład wytworzyć oligonukleotyd z 3'-końcową grupą cholesterylową, wychodząc z 7b (x = 0) z cholesterylo-oksykarbonylo-aminoalkiloaminy w obecności czterochlorku węgla. · Przez utleniające amidowanie 2-metoksyetyloaminą otrzymuje się na przykład oligonukleotydy z rodnikiem 3'-0-(2'-metoksyetylo)10

172 257

-fosforamiranowym. Dalsza byrowa łańcychowa następyje przy tym w znany sposgb werłyg metory fosforamirynowej, H-fosfonianowej albo trgjestrowej.

Wytwarzanie analoggw oligonudieotargw o wzorze 1 jest ralej możliwe metorą trgjestrową, gry grypę hyrrods^yli^’^^nośn^ o wzorze 4' porraje się reakcji z zabezpieczonym triestrem fosforanowym o wzorze 12, w dtgrym R, V, a, B', R2, Y', Z, W i X' mająwyżej porane znaczenie, w obecności śrorda donrensacyjnego. Korzystnymi orczynnikami konrensacyjnymi są chlordi dwasy arylosyfonowego jad · chlored mezytaienu 2.4.6-triizoaroaylobenzeny albo dwasn 8-chinolinosylfonowego, w obecności nydieofilowych kataiizatorgw jad imirazol, triazol, tetrazol, albo ich postawione pochorne jad N-metyloimirazoi, 3-nitrotriazol albo 5-(a-eitrofeeyio)-tetrαzoi. Szczegginie dorzystnymi środkami donrensacyjnymi są 4-aorstawione pochorne N-tlendy piryryny albo N-tlendy chinoliny (Efimov i in, Nycleic Acirs Research 13, (1985) 3651). W stosyndy ro metory H-fosfonianowej i fosforamirynowej, sposgb trgjestrowy jest dorzystny ponieważ nie wymaga roratdowego etapy ytieniania.

Jeśli syntezę oiigonykieotyru przearowadza się z syifαnriylowym (x = 0) albo syifieyiowym (x = 1) nośnidiem o wzorze 4', grypy te zostają na dońcy w znany sposgb (Fynakoshi i in, Proc. Natl. Acad Sci. 88, (1991) 6982) ytlenione ro rornida syfonylowego, aby zapewnić łatwe orszczepienie zasarami, dorzystnie amoniadiem.

Rorzaj aminowych gryp zabezpieczających zasary B' i jadość łącznida A w poszczeggl· nym arzypαrky stosyją się ro rorzajy porstawnida Z, ponieważ po zadończeniy syntezy myszą się one orszczepiać bez problemy. Na przydłar przy wytwarzaniy estry izopropylowego oligonykieotadu-3'-fosforanu (Z = O-i-C3H₇ rla B = Are i Cyt można pracować z grypami zabezpieczającymi benzoilo (Bz) lyb rla B = Gna z grypami zabezpieczającymi izobytyrylo-(i-By). Natomiast ro syntezy estry oligony^eotyro-3'-^e^lofosfonianowego (Z = CH3) albo estry etylowego (Z = O-C2H₅) stosuje się dorzystnie rla B = Are i Gya barrziej labilne grypy zabezpieczające fenodsyacetyl (PAC) wzglęrnie rla B = Cyt izo-bytyryl.

Niedtgre koejygata mają roSt^we grypy fyekcjoealee, dtgre przer wbyrowαeiem ro monomergw o wzorze 5 mysząbyć w orpowierni sposgb zabezpieczone. Na przydłar grypę darbodsylową fiuoresceiny zabezpiecza się jado ester aldilowy. W psocenie grypa amirowa może występować jado związed zabezpieczony N-Fmoc (fiyorenyiometodsydarbonyi). Grypy Oyrrodsylowe można zabezpieczyć przer readcjami ybocznymi przez acylowanie albo silyiowαnie (t-bytyiorimetyiosilyl). Grypy aminowe mogą rgwnież występować jado zabezpieczone triflyorocetylem. W wyjątdowych przypardach donjygaty mogąbyć tad mało stabilne, że zostajązmszczone jyż w waryndach orszczeaiαniα gryp zabezpieczających w syntezie oiigonykieotyry. W tadich przypadkachjest dorzystne wbyrować ro monomery o wzorze 5 taidoCerno ramię łączące (łącznid) z grypą fynkcjonainą, na arzakład Z = HN-(CH2)_X-NH-Fmoc, grzie x oznacza liczbę całdowitąor 2 ro 12, dorzystnie 4-6. Po wbyrowaeiu ro oiigonydieotyry i ysynięciy gryp zabezpieczających, dorzystnie amoniadiem, wolna grypa aminowa może zostać sprzężona z adtywnym estrem. Tad wytwarza się na przydłar poStny na zasary ester adryryniowy'.

Zsyntetyzowane pochorne oligonydleotyrgw charadteryzyje się przy pomocy spedtrometrii masowej eledtro-saray-ConizacajneC (Stylts iMasters, Rapir Commyn. Mass Spectr. 5, (1991) 350). Analogi oligonukieotyrgw o wzorze 1 werłyg wynalazdy testyje się na ich stabilność w syrowicy oraz wobec znanych egzonykieαz.

Nieoczediwanie stwierrzono, że wszystdie analogi oiigonydieotyrgw o wzorze 1, w porgwnaniy z niezmoryfidowanymi oiigonydieotydami, wydazyją znacznie porwyższoną stabilność wobec nydieaz syrowicy, porczas gry ich zachowanie się w hybryryzacji jest tyldo nieznacznie zmienione.

Porczas gry niezmoryfidowane oiigonykieotydy wydazyją w płorowej syrowicy cielęcej odres pgłtrwania odoło rwy gorizin, wszystdie analogi oiigonykleotargw o wzorze 1 są wystarczająco stabilne przez odoło 16 gorzin. Analogi oiigonykieotyrgw o wzorze 1 są ponarto stabilne wobec fosforiesterazy jary węży, porczas gry na fosforiesterazę ślerziony są orporne tyldo te, w dtgrych R1 nie oznacza worory. Niezmoryfidowane oiigonudleotyry są egzonydieoiitaczeie rozdłarane przez fosfodiesterazęjary węży or dońca 3', a przez fosforiesterazę ślerziony or dońca 5'.

172 257

Analogi oligonukleotydów o wzorze 1, na zasadzie parowania zasad Watsona-Cricka, tworzą z komplementarnymi sekwencjami nukleotydowymi stabilne dwuniciowe hybrydy, podczas gdy z dwuniciowymi kwasami nukleinowymi tworzą one, na zasadzie parowania zasad Hoogsteena, struktury potrójnych spirali. Dzięki temu możliwa jest regulacja lub tłumienie biologicznych funkcji kwasów nukleinowych przez analogi oligonukleotydów według wynalazku, na przykład tłumienie ekspresj i genów komórkowych a także onkogenów, oraz funkcj i genomów wirusowych. Stąd analogi oligonukleotydów o wzorze 1 sąmożliwe do zastosowaniajako środki lecznicze w terapii albo profilaktyce zakażeń wirusowych albo chorób nowotworowych.

Działanie oligonukleotydów według wynalazku badano na podstawie hamowania namnażania się wirusa HSV-1. Za skuteczne przeciw HSV-1 oligonukleotydy o wzorze 1 uznano na przykład:

Sekwencja

5' GGG GCG GGG CTC CAT GGG GG 5' CCG GAA AAC ATC GCG GTT GT 5' GGT GCT GGT GCT GGA CGA CA 5' GGC CCT GCT GTT CCG TGG CG 5' CGT CCA TGT CGG CAA ACA GCT 5' GAC GTT CCT CCT GCG GGA AG

EindtydziałmiajaaHIV1L

E8 ^lOssfcart)

UL 30 (śro<eel<)

UL 48 śro^kk)

UL 52 (rn^tekk)

UL 48 (sart))

IE4/5 (miejsce łączenie)

Wybrane sekwencje są w swojej naturalnej formie, także bez podstawienia 3', nieskuteczne przeciw HSV-1 w hodowli komórkowej, prawdopodobnie ponieważ ulegają szybkiemu rozkładowi w surowicy albo ponieważ ich penetracja do komórek jest za mała. Natomiast 3'-prdstawirne oligonukleotydy o wzorze 1 hamują namnażanie się HSV-1 w różniącym się stopniu. Jako przeciwwiśusowr nieczynne sekwencje kontrolne z odpowiednimi chemicznymi podstawieniami służyły.

5' CCA GGG TAC AGG TGG CCG GC

5' GAC TAA TCG GGA ATG TTA AG komoda

Oligmukleotyd o wzorze 1 zmodyfikowany psoralenem na końcu 3' (przykład IVs) rozpoznaje region IE4/5 HSV-2 i hamuje replikację HSV-2. Działanie przeciwwirusowe kmjugatów psoralenu można wyraźnie podwyższyć przez naświetlanie UV. Naturalnie genom HSV-1/2 ze swoimi 160 000 zasad przedstawia niezliczenie wiele innych sekwencji docelowych dla hamowania namnażania się wirusa, o różnej wydajności. Przez zmiany sekwencji nukleotydowych zasada terapeutyczna daje się zastosować także do dowolnych innych wirusów, bakterii albo innych patogenów. Przesłanką dla zastosowania do innych czynników wywołujących chorobę jest tylko znajomość genów istotnych dla cyklu życiowego danego czynnika etiologicznego. Są one w swojej sekwencji w wielkiej różnorodności zmagazynowane w tak zwanych pulach genów. Podobnie jest z onkogenami albo innymi genami komórkowymi, które mają być stłumione w swojej funkcji. Przykładami innych genów komórkowych są te, które ko^^jiąenzymy, receptory, kanaliki jonowe, immunomodulatory, czynniki wzrostu albo inne białka regulatorowe. Przykładami onkogenów są abl, neu, myc, myb, ras, fos, mos, erbB, ets, jun, p53, src i rel.

Sekwencje oligonuklertydowe nonsensowne względnie tworzące trypleksy są znane jako na przykład inhibitory kinazy białkowej zależnej od cyklo-AMP (L. Sheffield, Exp. Cell. Res. 192 (1991) 307), receptorów glicynowych wrażliwych na strychninę (Akagi i in, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86 (1989)86,8103), kanalika chlorkowego (Sorscher i in, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991) 7759), interleukiny 6 (Levy i in, J. Clin. Invest. 88 (1991) 696), zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (Becker i in, EMBO J. 8 (1989) 3685) i onkogenu c-myc (Postel i in, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88(1991) 8227). Dalsze przykłady sekwencji dla innych cząsteczek docelowych powinny uwidocznić możliwość szerokiego zastosowania oligmukleotydów według wynalazku.

a) oligonukleotydy nonsensowne przeciw HTV-1

5' ACA CCC AAT TCT GAA AAT GG 3' (miejsce łączenia)

5' AGG TCC CTG TTC GGG CGC CA 3' (miejsce wiązania primera)

172 257

b) EGF receptor (Epidermal Growth Factor Receptor - receptor czynnika naskórkowego wzrostu)

5' GGG ACT CCG GCG CAG CGC 3'

5' GGC AAA CTT TCT TTT CCT CC 3'

c) p53 supressor nowotworowy

5' GGG AAG GAG GAG GAT GAG ¹ G 3''

5' GGC AGT CAT CCA GCT TCG GAG 3'

d) onkogen c-fos

5' CCC GAG AAC ATC ATG GTC GAA G 3' 5' GGG GAA AGC CCG GCA AGG GG 3' (5' bez translacji) (ammotemiinany)) (ij ' niekcdUcjący) (start t^in^isa^cj)) (start ηΜ^υ^)) (5' mekodujący)

e) ELAM-1 (Endothelial Leukocyte Adhesion Molecule - cząsteczka śródbłonkowej adhezji leukocytów)

5' ACT GCT GCC TCT TGT CTC AGG 3' 55' metod^ący)

5' CAA TCA ATG ACT TCA AGA GTT C 3' sart Πμ^Ιηορ)

f) ICAM-1 (Intracelluar Adhesion Molecule - cząsteczka adhezji wewnątrzkomórkowej)

5' CTC CCC CAC CAC TTC CCC TC 3' (3 'bez ttandagi)

5' GCT GGG AGC CAT AGC GAG G 3' Utart ΙκακΟ

g) BCR-ABL (Philadelphia chaomosomeraanslocation - raanslokacja chromosomowa Philadelphia)

5' GCT GAA GGG CTT CTT CCT TAT TG 3' (punkt przerwania BCR-ABL)

Sondy DNA z analogów nukleotydów o wzorze 1, w przeciwieństwie do pochodnych oligonukleotydów z grupą 3'-hydaoksylową, dająejednej strony korzyść podwyższonej stabilności wobec nukleaz, a z drugiej pozwalają także łączenie takich samych lub różnych cząsteczek markerów na obu końcach oligonukleotydu. Jest korzystne, że różne grupy znacznikowe (markery) wewnątrz oligonukleotydu można selektywnie pobudzać (podwójne znakowanie). Bifunkcjonale podstawienia można także zastosować, aby wprowadzić na jednym końcu marker, a na drugim końcu dodatkową funkcję (na przykład znacznik powinowactwa). W tym celu można na przykład na końcu 3' oligonukleotydu wbudować biotynę, która rozpoznaje awidynę albo ^ptawidynę, jak również na końcu 5' poprzez łącznik alkiloaminowy wprowadzić ester akrydyniowy jako marker chemiluminescencyjny.

W wielu przypadkach zachowanie się penetracji analogów oligonukleotydów według wynalazku jest bardziej pomyślne niż nieemodyfikowanych oligonukleotydów, szczególnie gdy wprowadzone sąrodniki lipofilowe. Wyższa stabilność oligonukleotydów jak również ich lepsza penetracja do komórek, w porównaniu z oligonukleotydami nieemodyfikowanymi, zaznacza wyższą aktywność biologiczną.

Wyżej wymienione diagnostyczne, profilaktyczne i terapeutyczne zastosowania analogów oligonukleotydów według wynalazku stanowiątylko reprezentatywny wybór przykładów i ich zastosowanie nie ogranicza się do nich. Ponadto analogi oligonukleotydów według wynalazku mogą być stosowane na przykład jako środki pomocnicze w biotechnologii i biologii molekularnej.

Oligonukleotydy wytwarzane sposobem według wynalazku mogą być stosowane w preparatach farmaceutycznych.

Preparaty te zawierają skuteczną ilość jednego lub więcej związków o wzorze 1 albo ich fizjologicznie tolerowanych soli, ewentualnie razem z fizjologicznie tolerowanymi środkami pomocniczymi i/lub nośnikami i/lub razem z innymi znanymi substancajmi czynnymi. Sposób

172 257 wytwarzania tych preparatów, polega na tym, że substancję czynną, razem z nośnikiem i ewentualnie innymi substancjami pomocniczymi, dodatkowymi albo czynnymi doprowadza się do odpowiedniej postaci do podawania. Podaje się korzystnie dożylnie, miejscowo albo donosowo.

W poniższych przykładach symbole literowe (a-y) oznaczają szczególne przypadki odpowiednich wzorów

Przykład I: wytwarzanie nośnika o wzorze 4

a) wytwarzanie nośnika o wzorze 4 przez reakcję aminopropylo-CPG z bursztynianem dimetoksytrityloeteru bishydroksyetylosulfonowego 4,56 g zwykłego eteru dimetoksytritylo(DMTr) bis-(2-hydroksyetylo)-sulfonu (10 mmoli) suszy się przez dwukrotne rozpuszczenie i zatężenie w abs. pirydynie, rozpuszcza się w 25 ml abs. pirydyny, dodaje się 1,78 g (14 mmoli) DMAP (dimetyloaminopirydyna) i 1,4 g bezwodnika kwasu bursztynowego i tę mieszaninę miesza się przez 3 godziny w temperaturze pokojowej. Po całkowitej reakcji zatęża się, osad celem usunięcia pirydyny trzykrotnie rozpuszcza się i zatęża w toluenie, po czym rozpuszcza się w 220 ml chlorku metylenu. Fazę organiczną przemywa się 10% kwasem cytrynowym (110 ml) i trzykrotnie 110 ml wody, suszy się nad siarczanem sodu i zatęża. Powstały stały osad suszy się pod próżnią (5,64 g). Z tego bursztynianu 1,67 g (3 mmole) rozpuszcza się dwukrotnie i zagęszcza w abs. pirydynie i rozpuszcza się w mieszaninie 0,65 ml pirydyny abs. i 6 ml tetrahydrofuranu abs. (THF). Następnie dodaje się roztwór 420 mg (3 mmole) p-nitrofenolu i 687 mg DCC (dicykloheksylokarbodiimid, 3,3 mmole) w 2,1 ml THF abs. i miesza się dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po całkowitej reakcji odwirowuje się od wytrąconego dicykloheksylomocznika. Osad przepłukuje się 1 ml abs. eteru i ponownie odwirowuje. 1,5 g nośnika aminopropylo-CPG firmy Fluka (500 A, 100 pmoli/g funkcji amino) przepłukuje się mieszaniną 1,8 ml DMF abs. i 350 pl trójetyloaminy, dodaje się połączone roztwory estru bursztynianowonitrofenylowego, zdekantowane z nad osadu, i wstrząsa się 16 godzin w temperaturze pokoj owej. Stały nośnik oddziela się i dla zablokowania grup reaktywnych wstrząsa się godzinę z 3 ml odczynnika maskującego (bezwodnik octowy/2.64utydyna/DMAP,: każdego po 0,25 M w THF). Następnie pochodną CPG-nośnika odsysa się, przemywa metanolem, THF, chlorkiem metylenu i eterem i suszy się pod próżnią w 40°C. Obładowanie nośnika o wzorze 4a składnikami . zawierającymi dimetoksytrityl wynosi 38 pmoli/g.

b) wytwarzanie nośnika o wzorze 4b przez reakcję TentaGel^R (^R = zastrzeżony znak towarowy firmy Rapp, Tubingen) z bursztynianem eteru dimetoksytritylowego bishydroksyetylosulfonu. Forma aminowa żywicy TentaGel, kopolimeru PS/POE z 250 pmoli/g fukcji aminowej (100 mg) przepłukuje się mieszaniną360 pl DMF i 70 pl trójetyloaminy, dodaje się 400 pmoli estru bursztynianowo-p-nitrofenylowego (wytwarzanie patrz przykład Ia) i wstrząsa się 16 godzin w temperaturze pokojowej. Następnie postępuje się jak opisano w przykładzie Ia). Obładowanie żywicy TentaGel o wzorze 4b składnikami zawierającymi dimetoksytrityl wynosi 98 pmoli/g.

c) wytwarzanie nośnika 4c przez reakcję TentaGel (forma hydroksy) z odczynnikiem fosforynującym o wzorze 9 (Z = DMTr-O-C^C^-S-C^C^-O-;

R9 = N(i-C3H7)₂; R10 = O-CH2CH2CN)

Formę hydroksy TentaGel żywicy z 500 pmoli/g funkcji hydroksy (50 mg) poddaje się reakcji z 10 równoważnikami odczynnika fosforynującego o wzorze 9 (Z = DMTr-O-CH2CH2-S-CH2CH2-O-, R⁹ =

N(i-C3H7)2, R¹⁰ = O-CH2CH2CN) w obecności 25 równoważników tetrazolu w acetonitrylu przy 22°C. Po utlenieniujodowodorem (1,3 jodu wTHF/woda/pirydyna 70:20:5 objętościowo) postępuje się jak w przykładzie Ia. Obładowanie nośnika o wzorze 4c składnikami zawierającymi dimetoksytrityl wynosi 247 pmoli/g.

Przykład II: wytwarzanie zabezpieczonego nukleozydo-3' -fosforamidynu o wzorze 8 a) wytwarztnie 8a 03- Cyt^lBu, Z = O-CH₂CH₃, RHRR 1-C₃H₇) 2 mnrnlm mukeeouydo-3'-fosforbisamidynu o wzorze 6 (B'=Cyt® u, r5=r6=r7=r8= i-C3H₇) dwukrotnie rozpuszczono i zatężono w 20 ml abs. acetonitrylu i rozpuszczono w 20 ml abs. acetoniktrylu. Następnie wkrapla się w ciągu 15 minut roztwór 2,4 mmola etanolu i 1,2 mmola sublimowanego tetrazolu w 5 ml abs. acetonitrylu. Po dalszym mieszaniu przez 2,5 godziny rozcieńcza się 75 ml chlorku me14

172 257 tylenu o ekstrahuje się fazę organiczn^50 ml 5% roztworu wodorowęglanu sodu. Roztwór wodny przemywa się dwukrotnie 50 ml chlorku metylenu, połączone fazy organiczne suszy się nad siarczanem sodu i zatęża pod próżnią. Dla oczyszczenia osad chromatografuje się na kolumnie z żelem krzemionkowym, stosując chlorek metylenu/n-heptan/trójetyloamina 45:45:10, objętościowo. Otrzymuje się 0,7 g pożądanego diastereomeru jako związek jednorodny w chromatografii cienkowarstwowej (31P-NMR α = 146,7, 147,5 ppm). Jako produkt uboczny dają się izolować ślady odpowiedniego bis-etylo-fosforynu (3'P-NMR a = 139,3 ppm).

b) wytwarzanie 8b (B' = Thy, Z = O-i-C₃H7, R⁵=R⁶= i-CH) wytwarzanie następuje przez fosforynowanie 5'-O-dimetoksytritylotymidyny o wzorze 10 (B' - Thy (pozycja β), R = DMTr, V = O, a = O, Y = 0,2 mmole) bisamidynem o wzorze 9 (Z = O-i-C₃H7, R⁹ = R¹⁰ = NO-CH)^ 4 mmole) w obecności tetrazolu (0,5 mmola) w 10 ml abs. chlorku metylenu. Dalej pracuje sięjakw przykładzie IIa (³¹P-NMRa = 145,04 ppm, 145,66 ppm).

c) wytwarzanie 8c (B' = Cyf^Bu, Z = -O-n-CgH^, R5=R6=i-C3H7) analogicznie jak w przykładzie Ha z bisamidynu o wzorze 6a (B' = Cyf^Bu, R5=r6=r7=r8= i-C3H₇), przez reakcję z równoważnikiem n-heksanolu przy katalizie tetrazolem (31*pNMR 148,1 ppm, 148,5 ppm).

d) wytwarzanie 8d (B' = Cyt¹®, z = -O-n-C^H^, R5=R6= i-C₃H₇) analogicznie jak w przykładzie IIa z bisamidynu o wzorze 6a (B' = Cyt, r5=r6=r7=r8= i-C-^j przez reakcję z równoważnikiem n-oktadekanolu przy katalizie tetrazolem (31P-NMR 147,2 ppm, 147,9 ppm).

e) wytwarzanie 8e B' = CytBz, z = 3-pirydylopropan-3-oksy, R⁵=R6=R7=R8= i-C₃H₇) analogicznie jak w przykładzie IIa z bisamidynu 6a (B' = CytBz, r5=r6=r7=r8= i-C^,

R2' = H) przez reakcję z równoważnikiem 3-pirydyno-(propan-3-olu) przy katalizie tetrazolem. W tym przypadku oba diastereomery można rozdzielić chromatografią kolumnową (31P-NMR diastereomer 1: 147,7 ppm, diastereomer 2: 148,2 ppm)

f) wytwarzanie 8f (B' = CytBz, z = p-nitrofenyloetyl-2-oksy, R5=R6= i-CH) analogicznie jak w przykładzie IIa z bisamidynu o wzorze 6a (B' = CytBz, r5=r6=r7=r8 = i-C₃H7) przez reakcję z równoważnikiem p-nitrofenylo-etan-2-olu przy katalizie tetrazolem (³¹P-NMr 148,1 ppm, 148,6 ppm).

g) wytwarzanie 8g (B' = CytBz, z = -(OCH2CH₂>3OCH3, R⁵=R6= i-C3H7) analogicznie jak w przykładzie IIa z bisamidynu 6a (B' = CytBz, r5=r6=r⁷=r8= i-C3H₇) przez reakcję z równoważnikiem eteru monometylowego trietylenoglikolu przy katalizie tetrazolem (31P-NMR 148,5 ppm, 148,9 ppm).

h) wytwarzanie 8h (B' = CytBz, z = -(OCHjC^^O^^, CH3 R5=R6 - -i-C₃H₇) analogicznie jak w przykładzie IIa z bisamidynu 6a (B' = CytBz, R⁵=R6=R⁷=R8 = i-C3H₇) przez reakcję z równoważnikiem eteru monodecylowego tetraetylenoglikolu przy katalizie tetrazolem (31P-NMR 148,4 ppm, 148,8 ppm).

i) wytwarzanie 8i (B' = CytBz, z = -(OC^C^s O(CH2^CH3, R5=R6= i-CH) analogicznie jak w przykładzie IIa z bisamidynu 6a (B' = CytBz, r5=r6=r7=R8= i-C^H) przez reakcję z równoważnikiem eteru monopentylowego pentaetylenoglikolu przy katalizie tetrazolem (31P-NMR 148,4 ppm, 148,9 ppm).

k) wytwarzanie 8k (B' = CytBz, z = -(OC^CH^O^^, R5=R6= i^H) analogicznie jak w przykładzie IIa z bisamidynu 6a (B' = CytBz, R5=R6=R'=R8= ϊ^Ι^) przez reakcję z równoważnikiem eteru monotetradecylowego oktaetylenoglikolu przy katalizie tetrazolem ^P-NMR 148,4 ppm, 148,8 ppm).

l) wytwarzanie 8p (B' = Thy, Z = CH3, R5=R6= i-C3H7 analogiczniejak w przykładzie IIb z 5' -O-dimetoksytritylotymidyny przez fosforynowanie odczynnikiem o wzorze 9 (Z = CH3, R⁹ = Cl, R^w = N(i-C₃H7), przy czym zamiast tetrazolu katalizuje się dwoma równoważnikami diizopropyloetyloaminy (³¹P-NMR 120,6 ppm, 121,0 ppm)

m) wytwarzanie 8m (B' = CytBz, Z = akrydyno-9-(butyl-4-oksy), R5=R6= i-C©) analogicznie jak w przykładzie IIa z bisamidynu o wzorze 6a (B' = CytBz, r5=r6=r7=r8=

I-C3H7) przez reakcję z równoważnikiem 9-(4-hydroksybutylo)akrydyny przy katalizie tetrazolem (31P-NMR 146,7 ppm, 147,4 ppm).

172 257

Przykład III: wytwarzanie związanego z nośnikiem nukleotydu o wzorze 7

a) metoda A: wytwarzanie nośnika o wzorze 7a przez sprzęganie nukleozydo-3'-fosforamidynu 8b

7,5 mg nośnika z przykładu Ia, który zawiera 0,2 pmola eteru dimetoksytritylowego bishydroksyetylosulfonu, traktuje się 3% kwasem trójchlorooctowym, przy czym grupa zabezpieczająca DMTr zostaje odszczepiona, przemywa się acetonitrylem i następnie poddaje się reakcji z 2 pmol nukleozydo-3'-fosforamidynem o wzorze 8b (B'=Thy, Z = O-i-C3H₇, R5=R6=i-C₇ H₇) w obecności tetrazolu (10 pmoli) w acetonitrylu. Następnie utlenia się jodem (dla W = O; 1,3 g jodu w THF/woda/pirydyna 70:20:5 objętościowo, 5, minut.

b) metoda B: wytwarzanie nośnika o wzorze 7a-2 (B' = Thy, Z = O-i^Ity) przez reakcję z odczynnikiem fosforynującym o wzorze 9 odczynnik fosforynujący o wzorze 9 (Z - n-oktyl, R9=R¹⁽⁾ =Cl, 1 równoważnik), w obecności

1,2 równoważnika diizopropyloetyloaminy (DIPEA) w abs. acetonitrylu albo chlorku metylenu, reaguje w -78°C z nukleozydem o wzorze 10(1 równoważnie 5'-0-dimetoksytritylotymidyny, B' = pozycja β, Y' = O) do odpowiedniego monochlorku nukleozydo-3'-0-n-oktylofosfonu. Nośnik o wzorze 4a traktuje się jak opisano w metodzie A, dla odszczepienia grupy zabezpieczającej D=DMTr, przemywa się acetonitrylem i w obecności DIPEA poddaje się reakcji z przygotowanym in situ nadmiarem monochlorku nukleozydo-3'-O-n-oktylofosfonu. Po utlenieniu jodowodorem otrzymuje się nukleotyd związany z nośnikiem, o wzorze 7a-2, który jest do dyspozycji w dalszej syntezie oligonukleotydu.

Przykład IV. wytwarzanie oligonukleotydów o wzorze 1 (w danym przypadku monomer jest β-D-dezoksyrybonukleozydem)

a) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1a (R1=R2 = H, Z = O-i-C₃H7, a = U=V=W=X=Y= Y' = O, B = Thy, n = 9)

TpTpTpTpTpTpTpTpTpTp-(O-i-C3H7)

0,2 pmola nośnika 7a-1 (B' = Thy, W=O, Z^O-i-CkJT) z przykładu 3a traktuje się kolejno następującymi odczynnikami:

1. acetonitaye

2. 3% kwas trój chlorooctowy w dichlorometanie

3. acetonitryl abs.

4. 4 pmole 5'-0-dimetoksytymidyna-3'-kwas fosforawy-e-ester cyjanoetylowy-diizopropyloamidyn i 25 pmoli tetrazolu w 0,15 ml acetonitrylu abs.

5. acetonitryl

6. 20% bezwodnik octowy w THF z 40% lutydyny i 10% dimetyloaminopirydyny

7. acetonitryl

8. Jod (1,3 g w THF/woda/pirydyna, 70:20:5 objętościowo)

Etapy 1-8, dalej zwane cyklem reakcji, powtarza się 8 razy dla zbudowania pochodnej dekatymidyłanowej. Po zakończonej syntezie następuje odszczepienie grupy dimetoksytritylowej, jak opisano w etapach 1 do 3. Przez 1,5-godzinne traktowanie amoniakiem oligonukleotyd zostaje oddzielony od nośnika i równocześnie -eliminuje się grupy β-cyjanoetylowe. Ponieważ oligonukleotyd nie zawiera aminowych grup zabezpieczających, dalsze traktowanie amoniakiem nie jest potrzebne. Otrzymany surowy produkt ester izopropylowy dekatymidylano-3'-fosforanu oczyszcza się elektroforezą w żelu poliakrylamidowym albo HPLC.

b) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1b (R1=R2=H, Z = O-1-C3H7, a=U=V=W= =X=Y=Y' = O) d(CpGpTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApApApCpApGpCpTp-O-i-C3H7)

Synteza następuje analogicznie jak w przykładzie IVa, jednak z różnymi zasadami nukleinowymi w monomerze. W etapach syntezy 1 do 8 monomer występuje jako ogólnie 5'-0-dimetoksytrityl-nuklelozyd-3' -kwas fosforawy-β-cyjanoetylester-diαlkiloamid, przy czym funkcje amino adeniny (Ade), cytozyny (Cyt) albo guaniny (Gua) są zaopatrzone w odpowiednie grupy zabezpieczające. W tym przykładzie stosuje się N6-benzoil-Ade (Ade^Bz), N4-benzoil-Cyt (Cyt^Bz) i N²-izobutyryl-Gua (Gua^lBu). Budowa łańcucha następuje wychodząc z nośnika o wzorze 7a (B' =

172 757 =Thy, W = O, Z = O-i-C₃H₇) jak opisano w przykładzie IVa, kiedy odpowiednie monomoery są kondensowane stosownie do powyższej sekwencji. .Dla odseczepienia aminowych grup zabezpieczających następuje w tym przypadku dodatkowe traktowanie amoniakiem (16 godzin w 50°C).

c) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1c (R1=R2=H, Z = O-CH^H^ a=U=V= =W=X=Y=Y' = O) d^pGpTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApApApCpApGpCp-O-C^CHd

Wychodząc z nośnika o wzorze 7a-3 (B' = Cyt^Bu, W = O, Z = O-C₂H5), którego wytworzenie następuje przy pomocy monomeru 8a według metody A (przykład. IIIA), syntezę przeprowadza się analogicznie jak w przykładzie IVb. W tym przypadku stosuje się do wytwarzania bardziej podatne na zasady podstawienia (jak tu dla Z = O-C^ity), korzystnie bardziej labilne aminowe grupy zabezpieczające N6-fenoksyacetyl-Ade (Ade PAC), N⁴-ieoburayl-Cyt (Cyt¹¹³¹¹), N²-f’enoksyacetyl-Gua (Gua^PAC), które na końcu syntezy są łatwiejsze do odszczepienia. Usunięcie grup zabezpieczających amoniakiem trwa wtedy tylko 2 godziny w 50°C. Jeśli produkt traktuje się w 50°C amoniakiem przez dalszych 6 godzin, otrzymuje się jako produkt uboczny, przez odszczepienie estru etylowego fosforanu, około 5 do 10% oligonukleotydo-3'-fosforanu.

d) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1d (R1=R2=h, Z = O-(CH2)1₇CH-j, a=U= =V=X=Y=Y' = O, W=O, wyjąwszy oba ostatnie 5'-końcowe fosforotionianowe wiązania internukleotydowe, gdzie W=S (oznaczone jako Ps)) d(Cp(Gp(TpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApApApCpApGpCp-O-(CH2)l₇CH()

Wychodząc z nośnika o wzorze 7a-4 (B' = Cyt^lBu, W=O, Z = O-(CH2)l₇cH(), który otrzymuje się przy pomocy monomeru 8d według metody A (przykład IIIa), syntezę przeprowadza się analogicznie jak w przykładzie IVc ebaadeiej labilnymi grupami zabezpieczającymi. Po sprzężeniu przedostatniego (G) i ostatniego (C) nukleotydu, zamiastj odowodoru do utlenienia siarki stosuje się TETD (roztwór 0,4 M dwusiarczku tetraetylotiuramu w aceronitaylu). Przez 2-godzinne traktowanie amoniakiem usuwa się grupy zabezpieczające. Otrzymuje się oligonukleotyd o wzorze 1d z dwoma 5'-końcowymi fosforotionianowymi międey-nukleorydowymi wiązaniami i rodnikiem 3'-0-n-o.ktadecylo-fbsforanowo eterowym.

e) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1e (R1=R2=H, Z=CH-j, a=V=W=X=Y=Y' = O, U=O, wyjąwszy oba 5'-końcowe metylofosfonianowe wiązania intemukleotydowe, gdzie U=CH-j (oznaczone jako pm)) d(Cp_MiGp_MiTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApApApCpApGpCpTp_Mi)

Wychodząc z nośnika o wzorze 7a-5 (B' = Thy, W = O, Z=CHd, którego otrzymywanie następuje za pomocąmonomeau 7p według metody A (przykład IIIa), syntezę przeprowadza się analogicznie jak w przykładzie IVc. Do sprzęgania dwu ostatnich jednostek nukleotydowych (G i C) zamiast normalnych, zabezpieczonych cyjanoetylem monomerów (wzór 8, Z = OCH2CH2CN), stosuje się odpowiednie metylofosfonianoamidyny (wzór 8, Z = CH3). Odszczepienie z nośnika stężonym amoniakiem (1,5 godziny, temperatura pokojowa) następuje po 6-godzinnym traktowaniu etylenodiamina/etynol/woda (5:4:1 objętościowo) celem uwolnienia funkcji aminowych zasad. W wyniku otrzymuje się oligonukleotydo-3'-merylofosfbn1an z dwoma 5'-końcowymi metylofosfonianowymi wiązaniami internukleotydowymi o wzorze 1e.

f) wytwarzanie oligonukleotydu 1f (R1=R2=H, Z=CH3, X=S, a=U=V=W=Y=Y' = O) d(CpGpTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApApApCpApGpCp₍s).M;)

Wychodząc z nośnika 4a z przykładu Ia, w pierwszym cyklu reakcji sprzęga się metylofosfonamidyn o wzorze 8 (Z^Ity), B' =Cyti^Bu R5=R6 = i-C(H7)jak opisano w przykładzie IIIa. Utlenienie przeprowadza się TETD. Następnie syntetyzuje się dalej jak w przykładzie IIIc. Po odszczepieniu grup zabezpieczających jak w przykładzie IIIe otrzymuje się oligonukleotydo-T-metylofosfonotionian 1 f.

g) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1 g (R1=R2=H, Z=X=S, a=U=V=W=Y=Y'=O) d(CpGpTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApApApCpApGpCp_(S)_S)

Analogicznie do syntezy opisanej w przykładzie IVb, wychodząc z nośnika o wzorze 4a, jednak z tą różnicąże stosuje się w pierwszym etapie kondensacji nukleozydo-3'-fosforamidyn o

172 257 wzorze 8 (Z = 2,4-dichlorrSirbenzyl, R⁵=R6=etyl) zamiast meSylrfrsfbnamidynu. Wprowadzenie drugiego atomu S udaje się znowu przez utlenienie TETD (0,4 M w acetonitrylu). Odszczepienie grupy dichlorrbenzylrtir następuje w znany sposób tirfenrlem/trieSylrłminą. Po odszczepieniu grup zabezpieczających stężonym amoniakiem otrzymuje się rligrnuklerSydr-3'-frsfośodiSionian o wzorze 1g.

h) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1h (R1=R2=H, Z = p-nitrofenyloetyl-2-oksy, a=U=V=W=X=Y=Y = O)

D(C.pGpTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApA.pApCpApGpCp-O-CH₂CH2-<O^- NO2)

Wychodząc z nośnika o wzorze 7a-6 (B'=Cyt^Bz, W=O, Z=p-niSśrfenyloeSyl-2-rksy), którego otrzymywanie następuje przy pomocy monomeru o wzorze 8f według metody A (przykład IIIa), syntezę przeprowadza się analogicznie jak w przykładzie IVb. Po odszczepieniu grup zabezpieczających przez 10-godzinne traktowanie amoniakiem w 55°C, otrzymuje się oligonukleotydr-3'-O-(p-niSrrfenyloetylo)fosforan o wzorze 1h.

i) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1i (R¹⁼R2=H, Z = 3-pirydyloprrpłn-3-oksy, a=U=V=W=X=Y=Y' = O) m d(CpGpTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApApApCpApGpCp-O-(CH2)3-<O2/ ,

Wychodząc z nośnika o wzorze 7a-7 (B' = Cyt^u, W=O, Z = -O-(CH2)3 -<O>N ’ który jak opisano w przykładzie IIIa wytwarza się przy pomocy amidynu o wzorze 8e, syntezajest analogiczna jak w przykładzie IVc.

k) wytwarzanie rligrnu.kleotydu o wzorze 1k (R1=R2=H, Z = -O-(CH₂CH₂O)₃CH₃, a=U=V=W=X=Y=Y' = O d(GpApGpGpApCpGpTpTpCpCpTpCpCpTpGpCpGpGpGpApApGpGpCp-O-(CH2CH₂O)3CH3)

Wychodząc z nośnika o wzorze 7a-8 (B=CytBz, W=O, Z = -O-(CH₂CH₂O)₃CH₃), który jak opisano w przykładzie IIIa otrzymano za pomocą amidynu o wzorze 8g, synteza oligonukleotydu przebiega według powyższej sekwencji, analogicznie jak w przykładzie IVb.

l) wytwarzanie rligrnukleoSydu o wzorze 11 (R1=R2=H, Z = -O-(CH2CH₂O)₅(CH2)4CH3, a=U=V=W=X=Y=Y' = O d(CpGpTpCpCpApTpGpTpCpGpG>CpApApApCpApGpCp-O-(CH₂CH₂O)₅(CH2)₄CH₃)

Wychodząc z nośnika o wzorze 7a-9 (B' = Cyt^Bz, W=O, Z = -O^C^C^O^C^^C^), który jak opisano w przykładzie IIIa wytwarza się za pomocą amidynu 8i, prowadzi się syntezę oligonukleotydu analogicznie jak w przykładzie IVb.

m) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1m (R1=R2=H, Z = -O-(CH2CH₂O)8(CH2)i₃CH3, a=U=V=W=X=Y==Y = O) d(CpGpTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApApApCpApGpCp-O-(CH2CH2Ok8(CH2)₁₃CH₁3)

Wychodząc z nośnika o wzorze 7a- 10(B'=CytBz, w=O, Z=-O-(Cł ^CH^yCiy^CI^), który jak opisano w przykładzie IIIa wytwarza się za pomocą amidynu 8k, syntezę oligonukleotydu prowadzi się analogicznie jak w przykładzie IVb.

n) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1n (R1=R²=H, Z = -(CH3)N(CH₂)₂N(CH3)2, a=U=V=W=X=Y=Y’ = O) d(CpGpTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApApApCpApGpCp-N(CH3)₂(CH₂)2N(CH3)2

Wychodząc z nośnika 4c z przykładu Ic, syntezę oligrnukleoSydu przeprowadza sięj ak opisano w przykładzie IVa, wyjąwszy że do pierwszej reakcji kondensacji stosuje się metoksy-fosforamidyn o wzorze 8 (B' = Cyt^u Z=OCH₃, R5=R6=N(i-C₃H₇)2 i oksydatywne amidowanie przeprowadza się dwukrotnie po 15 minut 0,1 M rrztworemjrdu w THF/N,N',N'-tr1meSylretylenodiamma/ 2:1 objętościowo. Stabilny wobec zasad nośnik siarczkowy po zbudowaniu sekwencji rligonukleotydu utlenia się NaJO4 w znany sposób do labilnego wobec zasad nośnika sulfonowego. Odszczepienie od nośnika oraz grup zabezpieczających (PAC dla Ade i Gua, iBu dla Cyt) następuje t-butylaminą/metanolem (1:1 objętościowo) w 50°C przez 16 godzin. Otrzymuje się oligonukleot:ydo-3' -trimetyloetylendiamino-fosforamidan 1 n.

o) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1o (R¹⁼R2=h, Z = -HN(CH2)₂O-CH3, a=U=V= =W=X=Y=Y' = O)

172 257 r(CaGpTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpAaApApCpApGpCp-HN(CH2)2O-CH3) Analogicznie jad w przydłarzie IVn, odsyratywne amirowanie następyje rwykroteie po minyt 0,1 M roztworemjory w THF/2-metodsyetaioam-nie (2:1 objętościowo). Po orszczepieniy gryp zabezpieczających otrzymyje się oiigonydieotyro-3'-(2-metoldsyetyio)-fbsfbramirαe 1o.

p) wytwarzanie oiigonukleotyru o wzorze 1p (R1 = wzgr 2, R2=H, Z=S, a=U=V=W=X= =Y=Y' ·= O) r(asCp^τaCpCpAaTpGpTpCp^^CaAaApAaCaApGaCas)

Syntezę przeprowarza się wychorząc z nośnida o wzorze 4 jad opisano w przydłarzie IVb.

W tym przypαdky po sprzęgnięciy pierwszej jernostdi (wzgr 8; B' = Cyt^Bz, Z = O-CH2CH2CN, r5=r6=n(--C₃H7)2 ytlenienie się TETD. Po ysynięciy grypy zabezpieczającej DMTr, wolna grypa 5'-hydrodsy ostatniej roranej zasary jest fosforynowana bis-cyjanoetylodsy-fosforamirynem o wzorze 9 (R9=N(i-C₃H7)2, Z = R^w = OCH2CH2CN) i następnie ytleniana TETD ro tiofosforany. Cyjanoetylowe grypy zabezpieczające eiiminuje się tradtowaniem amoniadiem. Otrzymyje się oiigonydieotyro-3'5'-bis-tiofosforan 1p.

q) wytwarzanie oligonydieotydy o wzorze 1q (R1 = wzgr 2, R2 = H, Z = O-i-C₃H7, a=U=V=W=X=Y=Y' = O) r(i-c₃H7-o-aCpGaTpCaCaApTp^τaCaGaGpCpApApApCpAaGpCaTa-o-i-c₃H7) Syntezę prze^rowar^ się jad opisano w przykłαdzie IVb. Po ysynięciy grypy zabezpieczającej

DMTr, w ostatniej roranej zasarzie wolną grypę 5'-hy<rrodsy fosforynnie się cyianoetyioksy-i-propaioksy-fosforamiOynem o wzorze 9 (R9=N(i-C₃H7)2, R¹⁰=OCH2CH2CN, Z'' = O-i-C₃H₇) następnie ytlenia się Codowodorem. Powstaje oiigonydieotaro-3'5'-bis-izoaropylo ester fosforanowy 1q.

r) wytwarzanie oligonydieotyry o wzorze 1r (R1 = wzgr 2, R2 = H, Z = ^^^7, a=U=V=W=X=Y=Y' = Z' = O r(CH₃(CH2)7-pCpGaTaCpCpAaTaGpTpCpGaGaCpApApApCaApGaCpTp-(CH2)7CH3) Wychorząc z nośnida o wzorze 7a-2 (B'=Thy, W=O, Z=(CH2)₇CH3), dtgrego otrzymywanie jest opisane w przydłarzie IIIb, syntezę prowarzi się analogicznie jad w przykładzie IVc. Po ysynięciy grypy zabezpieczającej DMTr, wolną grypę 5'-hyrrodsy w ostatniej roranej zasarzie fosforynyje się n-oktyiodichlorofosfanem o wzorze 9 (Z=(CH2)₇CH3, R9=R¹⁽⁾=Cl) przy zastosowaniy DIPEA (riizoproayloetyioamina). Po ytleniee-y i hydroiizie oiigoeydieotyr zostaje orszczeaiony or nośnidajad w przydłarzie IVe. Otrzymyje się oi-gonykieotaro-3'5^, -bis-(n-odtalofosfoeian) 1 r.

s) wytwarzanie oiigony.dieotyru o wzorze 1s (R1=R2=H, Z = “psoralen”, a=U=V=W= =X=Y=Y' = O) r(GaGpCpGaCpCpCaGpGpCpCaTpGaCpGpAaGpApApAaGaCpGpCpGp-psorαien) Synteza następyje analogicznie jad w przyd^zie IVc, wychorząc z nośnida o wzorze

7a-11 (B'=Gya^PAC, Z = “psoralen”, W=O), dtgry analogiczniejad w arzydładzie IIIa otrzymano z monomery o wzorze 8 (B'=GyaPP-C Z = “psoralen”, R⁵=R6= i^]^), dtgry yprzernio otrzymano z bisamiryny 6a (B' = GyaPAC, r5-r8= i-C₃H₇) przez readcję z “psoralenem-H analogicznie jad w arzykłαdzie IIa (U.Pieles i U. Englisch, Nycleic Acir Research (1989) 17,285). Po orszczepieniy gryp zabezpieczających amoniadiem otrzymyje się oiigonydieotyr 1s, dtgry na dońcy 3' ma związany ester fosforanowy psoraleny.

t) wytwarzanie oiigonydleotyry o wzorze 1t (R1=R2=H, Z = “biotyna”, a=U=V=W=X= =Y=Y' = O r(GaGaCpGpCaCpCaGpGpCpCpTpGpCpGaApGaApAaAaGpCpGpCpGa-biotyna Synteza przebiega analogicznie jad w arzykłαdzie IVc, wychorząc z nośnida o wzorze

7a-12 (B' = GyaPP-C, Z = “biotyna”, W=O), dtgry analogicznie jad w przydłarzie IIIa wytworzono z monomery o wzorze 8 (B' = GyaPAC, z = “biotyna”, R⁵=R6 = i-CH), dtgry uprzernio otrzymano z bisamiryny 6a (B' = GyaPAC, R⁵-R8 = i-C3H7) przez readcję z “biotyną” H (R.Pon, Tetraherron Lett. (1991) 32, 1715) analogicznie jad w przydłarzie IIa. Po orszczepieniy gryp zabezpieczających amoniadiem otrzymyje się oiigonudieotyr 1t, dtgry na dońcy 3' ma związany ester fosforanowy “biotyny”.

172 257

u) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1u (R1=R2=H, Z = “fluoesceein”” , a=UJ=V=W= =X=Y=Y = O) d(GpGpCpGpCpCpCpGpGpCpCpTpGpCpGpApGpApApApGpCpGpCpCjp-fluoresceina

Syntezajest analogicznajak w przykładzie IVc, wychodząc z nośnika o wzorze 7a-13 (B' = Gua^PAC, Z = “fluoresceina”, W=O), który analogicznie jak w przykładzie ma wytworzono z monomeru o wzorze 9 (B' = Gua^PAC , Z = “fluoesccem”” ,-8==-8= i- ć-C3H7), który upezedoio ozrzymano z bisamidynu 6a (B' = Gua^PAC, 15--18= = i-C3H₇) pezez redccję “ “fluoresceiną” H (Schubert i in, Nucleic Acid Research (1991) 18, 3427), analogicznie z przykładem Ha. Po odszczepieniu grup zabezpieczających amoniakiem otrzymuje się oligonukleotyd 1u, który na końcu 3' ma związany ester fosforanowy “fluoresceiny”.

v) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1v (R1=R2=H, Z=akoydyn-9-yl-bue-4-oksy, aaUaV=W=X=Y=Y'- O d(CpGpTpCpCpApTpCpTpCpGpGpCpApApApCpApGpCp-(αkrydye-9-yl-but-4-oksy')

Wychodząc z nośnika o wzorze 7a-14 (B' = Cyt^Bz, W=O, Z=a^k^dyn-9-^,y“-bu^1^-4-oksy), który wytwarza się za pomocą monomeru 8m, analogiczniejak w przykładzie HIa, syntezę oligonukleotydu przeprowadza się jak w przykładzie IVb. Po odbezpieczeniu otrzymuje się oligonukleotyd o wzorze 1v, który na końcu 3' zawiera ester fosforanowy a^dyn^-yl-buM-ylu.

w) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1w (R¹⁼R2=H, Z=HN(CH2)3NH(C”2)4NH(CH^NH^ a=U=V=W=XaY=Y' = O d(CpGpTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApApApCpApGpCp-HN(CH2)3 NH(C”2)4NH(C^W

Synteza przebiega analogicznie jak w przykładzie 4n, przy czym oksydatywne amidowanie' przeprowadza-się sperminą. Następnie przeprowadza się reakcję maskującą bezwodnikiem kwasu trójfluorooctowego zamiast bezwodnika octowego. Po odszczepieniu grup zabezpieczających otrzymuje się oligonukleotyd o wzorze 1w, który na końcu 3' zawiera rodnik fosforamidanowy spermmy.

x) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1x (R1=R2=H, Z=azyoydyl-N-etyl-2-oksy, a=U=V=W=X=Y=Y'^ O) /CH?

D(CpGpTpCpCpApTpGpTpCpGpGpCpApApApCpApGpCp-0(CH2)2N \q”.] )

Synteza przebiega analogicznie jak w przykładzie IVc, wychodząc z nośnika o wzorze 7a15 (B' = CytBz, z = azyoydy“-N-eey“-2-oksy, W=0), który analogicznie jak w przykładzie IIIa wytwarza się z monomeru o wzorze 8 (B' = Cyt^Bz, Z = azyrydyl-N-etyl-2-oksy, R⁵=R6 = i-C₃H₇), który uprzednio otrzymano z bisamidynu o wzorze 6a (B'=CytBz, R5-R8 - i-C₃H)i pzzez eeakcć ę z N-(2-hydooksyetylo)αzyrydyną analogicznie jak w przykładzie Ha. Po odszczepieniu grup zabezpieczających amoniakiem otrzymuje się oligonukleotyd 1x, który na końcu 3' ma związany ester fosforanowy azyrydyn-N-et-2-ylu.

y-1) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze 1y-1 (R1=R2=H, Z = O-aameyd , dba ps W=S i

5'CpSCpSCpSGpSApSApSApSApSCpSApSTpSCpSGpSCpSGpSGpSTpSTpSGpSTpS-O

-famezyl

Synteza przebiega analogicznie jak w przykładzie IVd, wychodząc z nośnika o wzorze 7a16 (B-Thy, Z = O-“arnezyl), który analogicznie jak w przykładzie IIIa wytworzono z monomeru' o wzorze 8 (B'-Thy, Z = O-jaeneryl ,-8==-8== i-C₃H₇) k ^ć^yy urzzddi^io otrrymeoo z eienmidenu 6a (B-Thy, R5-R8= i-C3”7) przez reakcję z famezolem analogicmie jak w przykładzie IIb. Utlenianie w tym przypadku przeprowadza się roztworem TETD jak w przykładzie IVd. Po odszczepieniu grup zabezpieczających amoniakiem otrzymuje się alfosforotionian oligonukleotydu 1y-1, który na końcu 3', który na końcu 3' ma związany ester tiofosforanowy “ernezylu.

y-2) wytwarzanie oligonukleotydu 1y-2 (R1=R2=H, Z = -O-fityl, dla ps(s) W=U=S)

5' CpS(S)CpS(S)GpGpApApApApCpApTpCpGpCp<CcpTpTpS(S)<C7S(S)Tp-O-fieyl 3'

Synteza przebiega analogicznie jak w przykładzie IVy-1, wychodząc z nośnika o wzorze 7a-17 (B-Thy, Z=O-fityl), który analogicznie jak w przykładzie IIIa wytworzono z monomeru o

172 257 wzorze 8 (B-Thy, Z=O-fityl, R5=R6= i-C^), który uprzednio otrzymano z bisamidynu 6a (B'=Thy, R5-R8= i-C3H7) przez reakcję z fitolem analogicznie jak w przykładzie IIb. Nukleotydy 2,31 , 19 e 20 (kolejność nukleotydów odpowiada kiennkow) syneety- od 31 ' do są wedhig jednostek wzoru 8 (Z = 2.4-dichlorotiobeozyi, R5, R6 = ^1¾). Utlenianie dla tych nukleotydów przeprowadza się roztworem TETD. W innych cyklach reakcji utlenia się jodowodorem. Po odszczepieniu grap zabezpieczających amoniakiem otrzymuje się oligonukleotyd o wzorze 1y-2, który zawiera 3' - i 5'-końcowe, w tym przypadku dwa fosforoditionianowe wiązania intemukieozydowe i na końcu 3' ester fosforanowy farnezyln.

y-3) wytwarzanie oligonukleotydu o wzorze ly-3 (R¹=R2=H, Z = “-O-cholesterol”, dla pMe

5' RpMeCpMeGpGpApApApApRpApTpCpGpCpGpGpTpTpMeGpMeTp-O-cholesteroi

Synteza przebiega analogicznie jak w przykładzie IVy-1, wychodząc z nośnika o wzorze 7a18 (B-Thy, Z = O-cholesterol), który analogicznie jak w przykładzie Dla wytworzono z monomeru o wzorze 8 (B'=Thy, Z=□-cholesterol, r5=r6= i-C^), który uprzednio otrzymano z bisamidynu 6a (B-Thy, R⁵-R8 = i-C₃H₇) przez reakcję z “cholesterolem” analogicznie jak w przykładzie IIb. Nukleotydy 2, 3, 19 i 20 wprowadzono z metylofosfona^idynów o wzorze 8 (Z=RH₃), jak opisano w przykładzie IVe. W tym przypadku utlenia się jodowodorem. Po ¹ odszczepieniu grup zabezpieczających (por. przykład IVd) otrzymuje się oligonukleotyd 1y-3, który zawiera 3'- i 5'-końcowe, w tym przypadku dwa metylofosfonianowe wiązania iotemnkieoZydOwe i mi końcu 3' eetee ef^sff^rra^<^iw^r‘‘“^ο^^ιοΗ!”.

y-4) wytwarzanie oligonukieotydn o wzorze ly-4 (R*=R2=H, Z = -O-testosteron, dla pMe U=CH3)

5'RpMeCpMeGpMeGpMeApMeApMeApApCpApTpCpGpCpMeGpMeGpMeTpMeTpMeGpMeTp-eestotteron

Synteza przebiega analogicznie jak w przykładzie IAy-', wychodząc z nośnika o wzorze 7a-19 (B-Thy, Z = O-teteosteron), który analogicznie jak w przykładzie IIIa wytworzono z monomeru o wzorze 8 (B-Thy, Z = O-Testosteron, R5=R6= i-C'-!^), który uprzednio otrzymano z bitamidynn 6a (B-Thy, R5-R8= i-C₃H7) przez reakcję z “testosterem” analogicznie jak w przykładzie IIb. Nukleotydy 2 do 7 oraz 15 do 20, analogicznie jak w przykładzie IVe, wprowadzono z metyiofosfooamidynów o wzorze 8 (Z=CH3). W tym przypadku utlenia się jodowodorem. Po odszczepieniu grup zabezpieczający otrzymuje się oligonukleotyd ly-4, który zawiera związane 3' - i 5' -końcowe, w tym przypadku sześć metylofosfonianowych wiązań zytowych i na końcu 3' ester fosforanowy “testosteronu”.

y-5) wytwarzanie oligonukleotydn o wzorze ly-5 (R'=R2=H, Z = -O-witamina A, dla pMe(S) U=CH' i W=S, dla pS U=S i W=0)

5' RpMe(S)CpMe(S)GpMe(S)GpMe(S)ApMe(S)ApMe(S)ApSApSRpSApSTpSHpSGpSCpMe(S)GpMe(S)TpMe(S)TpMe(S)GpMe(S)Tp-O-witamina A

Synteza następuje analogicznie jak w przykładzie 0Vy-4, wychodząc z nośnika o wzorze 7a-20 (B-Thy, Z = O-wiammina A), który analogicznie jak w przykładzie IIIa wytworzono z monomeru o wzorze 8 (B'=Thy, Z = OWYtk^mi^a A, R5=R6= i-C'^), który uprzednio otrzymano z bisamidynu 6a (B-Thy, R5-R⁸= i-C₃I I7) przez reakcję z “witaminą A-alkoholem” analogicznie jak w przykładzie IIb. Nukleotydy 2 do 7 oraz 15 do 20,jak w przykładzie IVe, wprowadzono z metylofosforamidynów o wzorze 8 (Z=CH3). Utlenia się w tym przypadku TETD jak opisano w przykładzie IVd. Po odszczepieniu grup zabezpieczających otrzymuje się oiigonnkieotyd ly-5, który zawiera 3' - i 5'-końcowe, w tym przypadku sześć metylofotfonoeiniaooowych i wewnętrznych siedem fosfororotionianowch wiązań ioeeronkieozydowych. Na końcu 3' znajduje się do tego ester fosforanowy “witaminy A”.

y-6) wytwarzanie oiigonnkieotydn o wzorze ly-6 (R’=H, R2= O-CH', R2=H dla T,Z = -□-witamina E

2'-O-CH₃(CpCpGpGpApApApApCpApUpHpGpCpGpGpUpUpGp)Tp-O-wieamma E

Synteza przebiega analogicznie jak w przykładzie IVy-4, wychodząc z nośnika o wzorze 7a-21 (B-Thy, Z = O-witamina E), który analgicznie jak w przykładzie IIIa został wytworzony

172 257 z monomeru o wzorze 8 (B-Thy, Z = O-wiramina E, r5=r6= i-C₃H7), który uprzednio otrzymano z bisamidynu 6a (B-Thy, R5-R⁸= i-C₃H7) przez reakcję z tokoferolem analogicznie jak w przykładzie IIb. Nukleotydy 2 do 20 wprowadzono z 2'-O-meryloaybonukleoeydo-fosforamidynów o wzorze 5 (R=DMTr, R2 = O-CH3H7). Utlenia się jodowodoremjak opisano w przykładzie IVa. Po odszczepieniu labilnych fenok(yacitylowych grup zabezpieczających otrzymuje się 2'-O-merylol1gorybonukleotyd ly-6, który na końcu 3' zawiera ester fosforanowy “witaminy E”.

Przykład^/: Sprawdzanie stabilności wobec nukleaz 10 nmoli badanego oligonukleotydu rozpuszczono w 450 μ1 20% płodowej surowicy cielęcej w płynie RPMI i 50 ml wody bidestylowanej i inkubowano w 37°C. Natychmiast oraz po 1,2,4,7i 24 godzinach pobierano próbki, 10 pl do elektroforezy w żelu i 20 μΐ do HPLC. Celem przerwania reakcji dodawano 5 μ1 względnie 10 μΐ formamidu i ogrzewano 5 minut w 95°C. Do elektroforezy próbki nakładano na 15% żel poliakaylamidowy (2% BIS) i rozwijano przy około 3000 woltogodzin. Prążki uwidoczniano barwieniem srebrowym. Do analizy HPLC próbki wstrzykiwano do kolumny Gen-Pak Fax (firma Waters/Millipore) i przy przepływie 1 ml/min chaomatogaafowano 5 do 50% buforem A w B (bufor A: 10 mM wodorofosforan sodu, 0,1 M NaCl w acetonij-yl/woda 1:4 (objętościowo) pH 6,8; bufor B: jak A, ale 1,5 M NaCl).

Przykład VI. Aktywność paeeciwwiausowa

Działanie paeeciwwiausowe związków według wynalazku badano w doświadczeniu in vitro. W tym celu związki według wynalazku w różnych rozcieńczeniach dodawano do hodowli komórek HeLa i Vero w płytkach mikabriraacyjnych. Po 3 godzinach hodowle zakażano różnymi wirusami patogennymi dla człowieka (na przykład wirusy opryszczki HSV-1, HSV-2, ortomyksowirusy grypy A2, p1koanawiausy rhinowifus 2). 48 do 72 godziny po zakażeniu efekt terapeutyczny oznaczano na podstawie efektu cytopatogennego mikroskopowo i odczynem czerwieni obojętnej (test barwny według Fintera) forometaycenie (Finter N.B, w “Interferons”, N.B. Finter i in, North Holland Publishing Co, Amsterdam 1966). Najmniejsze stężenie, przy którym około połowa zakażonych komórek nie wykazywała efektu cytopatogennego, traktowano jako minimalne stężenie hamujące (MHK)

Przykład VII. Wytwarzanie odczynnika fosforynującego DMTr-O-C^C^-S-CH2CH₂O-P-/OCH₂CH₂CN/-/N(i-C₃H7)2/ (zastrzeżenie 8; X-O, x' = zero, R⁹=OCH2CH2CN,

Siarczek bi(-hydaoksyetylu (3,05 g) rozpuszczono w 75 ml absolutnej pirydyny i ten roztwór ochłodzono do 0°C. Mieszając, w ciągu godziny wkrapla się chlorek dimetoksytritylu rozpuszczony w 60 ml abs. pirydyny. Po ogrzaniu mieszaniny reagującej do temperatury pokojowej mieszano dalej jeszcze przez 1,5 godziny. Roztwór uzupełniono wodą (5 ml) i zatężono pod próżnią. Pozostałość rozpuszczono w 250 ml chlorku metylenu, ekstrahowano ten roztwór trzykrotnie porcjami po 125 ml 0,1M buforu fosforanowego pH 7, fazę organiczną suszono nad siarczanem sodu i zatężano pod próżnią. Surowy produkt chromatografowa^ w kolumnie z żelem krzemionkowym, ester octowy/n-heptan/trójetylo-amina (gradient 6:14:1 do 2:14:1 do 2:2:1 objętościowo). Otrzymuje się 5,3 g eteru bi(-hydaok(yerylosiaaczku-mono-(dimetoksytairylu) DMTr-O-CH2CH₂-S-CH2CH₂OH (52%).

Roztwór tego związku dimetoksyrritylu (1,06 g) i terrazolu (88 mg) w 12,5 ml abs. acetonitrylu wkroplono powoli (20 min) do roztworu cyjanoetok(y-dl-ieopropyloam1no-fosfoaanu (0,75 g) w abs. acetonitrylu (20 ml). Po dalszych 3 godzinach reakcji roztwór reakcyjny rozcieńczono 95 ml chlorku metylenu i przemyto 5% roztworem węglanu sodu (65 ml). Fazę organiczną suszono nad siarczanem sodu i zatężono pod próżnią. Pozostałość oczyszcza się przez chromatografię w kolumnie żelu krzemionkowego, ester octowy/n-heksan/trójetyloamina 11:8:1 objętościowo. Otrzymuje się 1,25 g (80%) pożądanego odczynnika fosforynującego (3¹P-NMR:ó 148 ppm/d/, 99% całkowitej zawartości fosforu).

172 257

Opisane w przydłarzie IV związki y-1 ro y-6 posiarają następyjące rornidi:

farnezyl o wzorze 34 fityl o wzorze 35 “witamina A” o wzorze 36 “witamina E” o wzorze 37 “cholesterol” o wzorze 38 testosteron o wzorze 39

U-P-G

W

WZÓR A B

Z-P -X ll

W

WZÓR A'

172 257

W

WZÓR 1

Z - P - T II w

WZÓR 2

172 257 /R⁹

DMTr -X’- CH₂CH₂- S(0) _χ, - C H₂CH₂ -X’ - P^_r1Q

WZÓR 3'

D-X’-CH CH -S(0) -CH CH -A-T

L L. X Z. ά

WZÓR 4

HX’-CH₂-CH2-S(O)_x-CH₂CH₂-A-T

WZÓR 4'

172 257

WZÓR 5

R-V

B*

WZÓR 6

DMTr- O

B’

WZÓR 6a

172 257 χ .1 X ο—ω-ο

ο= ο— __co

Χ^ ο

I

X X

I ο

ι _CM

CM

X ο

I ο

I ο

Jc\j ο

CM

CN

Γ

X

-ο

Ν

172 257

W = P

WZÓR 7b

I R

Z-P'^N<_R6

WZÓR 8 /

Z”-P<_R1O

WZÓR 9

172 257

WZÓR 10

II

W

WZÓR 11

W

WZÓR 12

172 257

WZÓR 14

172 257 >=Ο

Η

WZOR 17

172 257

WZÓR 18

WZÓR 21

172 257

WZÓR 22

WZÓR 23

WZÓR 24

172 257 ci-ch₂ch₂^ „_3C.^N^^CH2>x-°·

X

WZOR 25 ci-ch₂ch₂^ _ n^7V(ch₂)_x-o

Cl -CH₀CH₀ ²² X

WZOR 26

O

II

-O- P-OI

OR

WZOR 27

172 257

O - (CH₂)₃

WZÓR 28

Ο - (CH₂)₂-<2l· ^Ν°2

WZÓR 29 (CH₂)4-O-

WZÓR 30

172 257

R⁵

-N< fi \_R ⁶

WZÓR 31

R⁷

-<_r8

WZÓR 32

WZÓR 34

X

172 257

WZÓR 35

WZÓR 37

172 257 ⁰ ιΑ₀Λ>

Η

WZÓR 38

WZÓR 39

172 257

OEt

I

O-C-(CH₉)₉-C-N-(CH?)o-Si -CPG II II I I

OH OEt

WZÓR 40

-O-C- (CH₉)₉-C - N -TentaGel II II I

O OH

WZÓR 41

O

II

-O- P-O-TentaGel I och₂-ch₂-cn

WZÓR 42

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 6,00 zł

Claims (8)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób pYytwarzania nawych walogów oligonokleotydów oraz icO fizjologiconie tolerowanych soli o wzorze 1, w którym R¹ oznacza worgr, C1-C18 -ald-l, C2-C₁₈-aldenyl, C^-Cjg-aldinyl, C₂-C₁₈-aldilodarbonyl, C3-C₁9-aldenylodarbonyl, C3-C₁₉-aldmylodarbonyl, C₆-C₂o-aryl, (C₆-C₁₄)-arylo-(Ci-C₈)-aldil, albo resztę o wzorze 2;

   R² oznacza worgr, grypę hyrrodsy, C_r<C₁₈-aldodsy, chlorowiec, azyro albo NH2,

   B oznacza zasarę zwykłą w chemii nUdleotyrów; a oznacza odsy albo metylen; n oznacza liczbę całdowitą or 1 ro 100;

   W oznacza odso, tiodso albo selenodso;

   Y oznacza odsy, sylfanriyl albo imino;

   Y oznacza odsy, sylfanriyl, imino albo metylen;

   Y oznacza odsy, sylfanriyl, imino, (CH2)_m albo V(CH2)_m, grzie m oznacza liczbę całdowitą or 1 ro 18;

   X oznacza hyrrodsy albo merdapto;

   U oznacza hyrrodsy, merdapto, SeH, C_r<C₁1-aldodsy, C1-C_u-aldii, C6-C2o-aryl, (C6-C₁₄)-arylo-(C_r<C8)-aldil, NHR3, NR³R⁴ albo rornid o wzorze 3-(OCH₂CH2)p O(CH2)_qCH2R“, przy czym R3 oznacza C_r(C₁l-aikil, C6-C2o-aryl, (C6-C₁₄)-aryio-(C_Γ<Cl)-αikii, 2-(CH2)c-/NH(CH2)c/r-NR¹²R¹², gdzie c jest liczbą całdowitą or 2 ro 6 i r jest liczbą całdowitą od 0 ro 6, zaś R¹² niezależnie or siebie oznacza worgr albo albo Cl-C4-alkodsy-Cl-C6-aikii;

   R4 oznacza ^C1'^C11 -aldil, C6-C₂o-aryl albo (C6-C₁o)-αrylo-(Cl-C8)-aidil albo w przypardy NR3R4 razem z R3 i atomem azoty ro dtórego są one przyłączone oznacza 5 - 6-członowy pierścień heterocydliczny, dtgry roratdowo może zawierać ralszy heteroatom z szeregy O, S, N;

   p jest liczbą całdowitą or 1 ro 100; q jest liczbą całkowitą or 0 ro 22,

   R1 oznacza worgr albo grapę fynkcjonainą;

   Z = Z' oznacza hyrrodsy, merdapto, SeH, C_r<C₂2-aikodsy, -O-(CH2)_b-NR¹²R¹3, grzie b jest liczbą caftowitą or 1 ro 6, Rⁿ oznacza CrCC-alda albo R¹² i R^B razem z atomem azoty ro dtgrego są one przyłączone tworzą 3- 6-członowy pierścień, C6-C20-aryl, ^-C^-arylo-(C1 -C^-aUdil, (C6-C₁4)-arylo-(C₁Cl)-aikoksy, przy czym aryl oznacza również heteroaryl, zaś aryl ewentyalnie jest porstawiony przez 1,2 albo 3 tadie same lyb różne rornidi z szeregy darbodsy, amino, nitro, C_r<C4-aldiloamino, C_rιC6-aikoksy, hydroksy, chlorowiec i przez cyjano; C1-C11 -aldilomerdapto, NHR3, NR3r4, rornid o wzorze 3, albo grapę, dtgra yłatwia wewnątrzdomgrdowe wchłanianie albo słyży jado znacznid (marder) sonry DNA albo przy hybryryzacCi analogi oiigonydieotyry z rocelowym dwasem nukieinowym atadyje ten ostatni przez wiązanie, poprzeczne ysieciowanie albo (Wszczepienie, a zaokrągiony nawias oznacza, że R2 i sąsierni rodeik fosforylowy mogą się znajrować w pozycji 2'- i 3'- albo tadże na orwrgt w pozycji 3'- i 2'-, przy czym dażry nydleotyr może występować w swojej donfigyracji D wzgiędme L, a zasara B może się znajrować w pozycji α wzglęrnie β, z tym, że jeśli Z oznacza hyrrodsy, merdapto, metyl albo etodsy, to co najmniej jerna z gryp X, Y, Y', V, W nie oznacza hyrrodsy, odsy wzglęrnie odso albo R1 nie oznacza worory, znamienny tym, że

   a) sprzęga sżę ananymi technikah1l spmęgprża gaopaiowo w iloświ ΐ w kolwj ności wycidającej z ydłary sedwencji we wzorze proruktu, jernostdi eykieotyrowe z 3' ^j-końcowągrapą fosforową (V) i wolną grypą 5'-hyrrodsy lyb merdapto o wzorze A', w dtgrym R1, V, a, B, R2, Y, V, W mająwyżej porane znaczenie, a G oznacza grypę orszczepialnąz następnącernostdąnukieotyrowąz grupąfosforową(HIj lyb fosforową (V) w pozycji 3', albo z jej .adtywowanymi pochor172 257 nymi o wzorze A, w którym B, V, a, Y', R², Z, X; W mają wyżej podane znaczenie a R oznacza grupę odszczepialną lub

   b) analog oligonukleotydu jest otrzymywany poprzez analogiczne sprzęganie fragmentów oligonukleotydów, i w oligonukleotydach otrzymanych według (a) albo (b) grupy zabezpieczające, czasowo wprowadzone dla zabezpieczenia, zostająodszczepione i tak otrzymane analogi oligonukleotydów o wzorze 1 zostają ewentualnie przeprowadzone w ich fizjologicznie tolerowaną sól.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się jednostki nukleotydowe, w których zasada B znaj duj e się w pozycj i β, nukleotydy występująw konfiguracj i D, R² znaj duje się w pozycji 2' zaś a oznacza oksy.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się jednostki nukleotydowe, w których

   R¹ oznacza wodór, C_rC₆-alkil, korzystnie metyl, albo rodnik o wzorze 2;

   R2 oznacza wodór albo hydroksy, korzystnie wodór; m oznacza liczbę całkowitą od 1 do 6, korzystnie 1;

   U oznacza hydroksy, merkapto, C_rC6-alkoksy, C^-alkil, NR³R⁴ albo NHR³, korzystnie hydroksy albo C_r(36-alkil, przy czym R3 oznacza Cp-Cg-alkil, korzystnie C_r^4-alkil, albo metoksyetyl, zaś B, W, V, Y, Y', X i Z mają wyżej podane znaczenie, przy czym stosuje się jednostki nukleotydowe w ilości. 10-40, korzystaie 12-30.
4. 4. Sposób według zastrz, 1. znamienny tym, że stosuje się jednostki nukleotydowe, w których V, Y i Y' oznaczają grupę oksy.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się jednostki nukleotydowe, w których W oznacza grupę okso.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się jednostki nukleotydowe, w których U oznacza grupę hydroksy.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się jednostki nukleotydowe, w których R1 oznacza wodór.
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje sięjednostki nukleotydowe z ugrupowaniem zawierającym fosfor, wprowadzonym do nukleotydu czynnikiem fosforynującym o wzorze ogólnym 3', w którym podstawniki R⁹ i R¹⁰ niezależnie od siebie oznaczają Cl, NR⁵R⁶, NR⁷R8 lub Z”, przy czym Z = Z, który ma wyżej podane znaczenie z tym, że grupy hydroksy, merkapto i SeH muszą być w postaci zabezpieczonej, R⁵, R6, R7 i R8 niezależnie od siebie oznaczają alkil C_rCj2 lub R5 i R6 względnie R7 i R8 razem tworzą pierścień 5-6 członowy, X' oznacza grupę oxy lub sulfandiylową, x' oznacza liczbę całkowitą zero lub 1, a DMTr oznacza grupę dimetoksytritylową.

   Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania nowych analogów oligonukleotydów o cennych właściwościach biologicznych i farmakologicznych. Ich zastosowanie obejmuje używanie jako inhibitorów ekspresji genów (oligonukleotydy nonsensowne, rybozymy, oligonukleotydy sensowne i oligonukleotydy tworzące trypleksy), jako sondy do badania kwasów nukleinowych i jako środków pomocniczych w biologii molekularnej.

   Oligonukleotydy znajdują w¹ rosnącym stopniu zastosowanie jako inhibitory ekspresji genów (G. Zon, Pharmaceutical Research 5,539 (1988); J.S. Cohen, Topics in Molecular and Structural Biology, 12, (1989) Macmillan Press; C. Helene i J.J. Toulme, Biochemica et Biophysica Acta 1049, 99 (1990); E. Uhlmann i A. Peyman, Chemical Reviews 90, 543 (1990)). Oligonukleotydy nonsensowne są to fragmenty kwasu nukleinowego, których sekwencja zasad jest komplementarna do sekwencj i mRNA, który ma być hamowany. Ten docelowy mRNA może pochodzić z komórek, wirusów albo innych patogenów. Jako komórkowe sekwencje docelowe wchodzą w rachubę na przykład sekwencje receptorów, enzymów, immunomodulatorów, kanalików jonowych albo onkogenów. Hamowanie namnażania się wirusów przy pomocy nonsensow4

   172 257 nych -oligonukleotydów opisano na przykład dla RSV (Rous Sarcoma Virus - wirus mięsaka Rousa), HSV-1 i HSV-2 (Herpes simplex - wirus opryszczki zwykłej typ I i II), HIV (Human Immunodeficiency Virus - ludzki wirus niewydolności immunologicznej), oraz wirusów grypy. Używa się przy tym oligonukleotydów, które sąkomplementarne do wirusowych kwasów nukleinowych. Natomiast oligonukleotydy sensowne są w swojej sekwencji tak pomyślane, że na przykład wiążą (“wychwytują”) białka wiążące kwasy nukleinowe albo enzymy działające na kwasy nukleinowe i w ten sposób hamują ich biologiczną aktywność (Helene 1990). Jako wirusowe związki docelowe należy tu wymienić na przykład Odwrotną transkryptazę, polimerazę DNA· i białka-transaktywatory. Dla oligonukleotydów tworzących trypleksy docelowyjest DNA i po związaniu się z nim tworzą one strukturę potrójnej spirali. Podczas gdy przy pomocy oligonukleotydów nonsensownych ogólnie biorąc ulega hamowaniu obróbka mRNA (rozszczepienie itd), albojego translacja do białka, oligonukleotydy tworzące trypleksy hamują transkrypcję albo replikację DNA (Helene i in, 1990; Uhlmann i Peyman 1990). Jest jednak również możliwe w pierwszej hybrydyzacji związać jednomciowy kwas nukleinowy z nonsensownym oligonukleotydem, z wytworzeniem nici podwójnej, która następnie w drugiej hybrydyzacj i z oligonukleotydem tworzącym trypleks wytwarza strukturę trypleksu. Przy tym regiony nonsensowny i tworzący trypleks mogą się mieścić w dwu oddzielnych oligonukleotydach albo w jednym. Dalszym zastosowaniem syntetycznych oligonukleotydów są tak zwane rybozymy, które na zasadzie swojej aktywności rybonukleazy rozkładają docelowy RNA (J.J. Rossi i N. Sarver, TIBTECH 8,179 (1990).

   W rozpoznawaniu DNA stosuje się fragmenty kwasów nukleinowych odpowiednio znakowane, jako tak zwane sondy DNA albo próby DNA do swoistej hybrydyzacji z kwasem nukleinowym, który ma być badany. Swoiste wytworzenie podwójnej nici śledzi się przy tym przy pomocy znacznika (markera), który przeważnie jest nieradioaktywny. W ten sposób można badać choroby genetyczne, złośliwe, wirusowe albo wywołane przez inne patogeny.

   Dla większości wymienionych zastosowań nadają się mało lub nie nadają się wcale oligonukleotydy występujące w swojej naturalnej postaci. Muszą one zostać zmodyfikowane chemicznie tak, aby odpowiadały specjalnym wymaganiom. Stąd aby mogły być zastosowane w układach biologicznych, na przykład do hamowania namnażania się wirusów, oligonukleotydy muszą odpowiadać następującym warunkom:

   1. W warunkach in vivo, także zarówno w surowicy jak wewnątrzkomórkowo, muszą wykazywać wystarczającą stabilność.

   2. Muszą być w takim stanie, aby mogły przechodzić przez błonę komórkową i jądrową.

   3. W warunkach fizjologicznych muszą w sposób swoisty do zasad wiązać się ze swoim docelowym kwasem nukleinowym, aby rozwinąć efekt inhibicyjny.

   Dla sond DNA te wymagania nie są nieodzowne; jednak te oligonukleotydy muszą być podstawione tak, aby możliwe było badanie na przykład przy pomocy fluorescencji, chemiluminescencji, kolorymetrii albo swoistego barwienia (Beck i Koster, Anal. Chem. 62,2258 (1990)).

   Zmiany chemiczne oligonukleotydu następują przeważnie w ten sposób, że rdzeń fosforanowy, jednostka rybozowa albo zasada nukleinową zostają odpowiednio zmienione (Cohen 1989, Uhlmann i Peyman 1990). Dalszączęsto używanąmetodąjest wytwarzanie 5'-k.onjugatów oligonukleotydów przez reakcję grupy 5'-hydroksy z odpowiednimi odczynnikami fosforylującymi.

   Oligonukleotydy, które są zmodyfikowane tylko na końcu 5' mają tę wadę, że zostają rozłożone w surowicy. Natomiast gdy wszystkie internukleotydowe reszty fosforanowe są zmienione, często drastycznie zmieniają się właściwości oligonukleotydu. Na przykład rozpuszczalność oligonukleotydu metylofosfonianowego w środowisku wodnym jest zmniejszona i zredukowana jest zdolność hybrydyzacji. Oligonukleotydy fosforotionianowe działająnieswoiście, tak że na przykład również homooligomery są skuteczne przeciw wirusom.

   Stąd zadanie polega na tym, aby postawić do dyspozycji analogi oligonukleotydów o swoistym działaniu, podwyższonej stabilności w surowicy i dobrej rozpuszczalności.

   172 257