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KR20240167790A - 복합체의 제조 방법 - Google Patents

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KR20240167790A
KR20240167790A KR1020247027630A KR20247027630A KR20240167790A KR 20240167790 A KR20240167790 A KR 20240167790A KR 1020247027630 A KR1020247027630 A KR 1020247027630A KR 20247027630 A KR20247027630 A KR 20247027630A KR 20240167790 A KR20240167790 A KR 20240167790A
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KR
South Korea
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antibody
complex
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amino acid
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KR1020247027630A
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English (en)
Inventor
사토시 키시모토
유타 오츠카
토모유키 이마이
유다이 나리타
타쿠야 타케다
Original Assignee
니혼 메디피직스 가부시키가이샤
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Publication date
Application filed by 니혼 메디피직스 가부시키가이샤 filed Critical 니혼 메디피직스 가부시키가이샤
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Abstract

방사성 금속 핵종과 항체의 복합체의 제조 방법으로서, 방사성 금속 핵종과, 배위자 화합물로 수식된 항체를 물을 포함하는 반응액 중에서 반응시켜서, 상기 방사성 금속 핵종을 상기 배위자 화합물에 배위시키는 공정을 구비하고, 상기 반응액은 pH 완충제가 비함유이며, 또한 pH가 2 이상 10 이하이다. 상기 방사성 금속 핵종이 68Ga, 89Zr, 90Y, 111In, 177Lu 및 225Ac로부터 선택되는 적어도 1종인 것이 바람직하다. 상기 방사성 금속 핵종이 89Zr이며, 또한 상기 반응액의 pH가 2 이상 4 이하인 것도 바람직하다.

Description

복합체의 제조 방법
본 발명은 복합체의 제조 방법에 관한 것이다.
표적분자의 검출을 위한 시약 및 진단약, 또는 질환의 치료를 위한 의약품에의 이용을 목적으로 해서, 방사성 금속이 항체를 수식하는 배위자 화합물에 배위 한 복합체의 표지율에 관한 검토가 진행되고 있다.
특허문헌 1에는 방사성 지르코늄과, 배위자 화합물의 일종인 DTPA를 산성의 생리식염수 중에서 반응시켜서, Zr 착체의 형성을 행한 것이 개시되어 있다.
특허문헌 2에는 방사성 지르코늄과, 배위자 화합물의 일종인 DOTA를 중성의 HEPES 완충액 중에서 가열해서 반응시켜서, Zr 착체를 형성한 것이 개시되어 있다.
특허문헌 3에는 방사성 액티늄과 배위자 화합물의 일종인 DOTA를 수식한 리툭시맙을 염기성의 트리스 완충액 중에서 반응시켜서, Ac 착체의 형성을 행한 것이 개시되어 있다.
특허문헌 4에는 방사성 액티늄과 배위자 화합물의 일종인 DOTA를 수식한 재조합 IgG1 항체인 HuM-195를 pH5.5∼7.0의 겐티진산을 포함하는 아세트산 완충액 중에서 반응시켜서, Ac 착체의 형성을 행한 것이 개시되어 있다.
또한, 비특허문헌 1에는 방사성 지르코늄과, 배위자 화합물인 DOTA를 완충액 중에서 반응시켜서, Zr 착체를 형성하는 방법이 기재되어 있다.
미국 특허출원공개 제2014/147381호 명세서 미국 특허출원공개 제2019/038785호 명세서 미국 특허출원공개 제2015/0157742호 명세서 미국 특허출원공개 제2012/0220754호 명세서
Pandya et al. Chem Sci. 2017;8(3):2309-14
그러나, 특허문헌 1 및 2나 비특허문헌 1에 개시된 조건에서는 배위자 화합물과 방사성 동위 원소 사이의 착형성이 잘 진행되지 않고, 배위자 화합물을 수식한 항체(이하, 배위자 수식 항체)에 대해서 상기 방사성 동위 원소에 의한 충분한 표지율을 달성할 수 없다. 따라서, 배위자 수식 항체에 대해서 방사성 동위 원소에 의한 높은 표지율을 안정적으로 달성할 수 있는 반응 조건이 요구되고 있었다.
따라서, 본 발명은 배위자 수식 항체에 대해서 방사성 동위 원소에 의한 높은 표지율을 부여하는 것이 가능한, 방사성 동위 원소, 배위자 화합물 및 항체를 포함하는 복합체의 제조 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명자는 상기 과제를 해결하기 위해 예의검토한 결과, pH 완충제를 포함하지 않고, pH가 2 이상 10 이하인 물을 포함하는 반응액 중에서 방사성 금속 핵종과, 배위자 화합물로 수식된 항체를 반응시킴으로써, 배위자 수식 항체에 대해서 상기 방사성 동위 원소에 의한 높은 표지율을 부여할 수 있는 것을 찾아냈다.
즉, 본 발명은 방사성 금속 핵종과 배위자 수식 항체의 복합체의 제조 방법으로서, 방사성 금속 핵종과, 배위자 수식 항체를 물을 포함하는 반응액 중에서 반응시켜서, 상기 방사성 금속 핵종을 상기 배위자 화합물에 배위시키는 공정을 구비하고, 상기 반응액은 pH 완충제가 비함유이며, 또한 pH가 2 이상 10 이하인 복합체의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 의하면, 배위자 수식 항체에 대해서 방사성 동위 원소에 의한 높은 표지율을 부여하는 것이 가능한, 방사성 동위 원소, 배위자 화합물 및 항체를 포함하는 복합체의 제조 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 실시예 1 및 비교예 1에서 제조한 복합체의 SK-OV-3 종양 절편 및 MDA-MB-231 종양 절편에 대한 항원 결합 활성을 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 그 바람직한 실시형태에 의거하여 설명한다.
본 발명의 복합체의 제조 방법은 방사성 금속 핵종과, 배위자 수식 항체를 물을 포함하는 반응액 중에서 반응시켜서, 상기 방사성 금속 핵종을 상기 배위자 화합물에 배위시키는 공정을 구비한다. 본 공정은 반응액이 물을 포함하고, 또한 pH 완충제를 포함하지 않고, pH가 2 이상 10 이하인 상태에서 행한다. 본 공정을 거쳐 방사성 동위 원소가, 항체를 수식한 배위자 화합물에 배위결합에 추가해서 공유결합, 이온결합 등의 조합에 의해 결합하여, 항체를 직접적으로 표지하는 복합체가 얻어진다.
본 공정에 사용되는 방사성 동위 원소는 표지율을 높이는 관점으로부터, 수중에서 전리 가능한 화합물의 양태로 사용하는 것이 바람직하고, 방사성 동위 원소 이온의 양태로 사용하는 것이 보다 바람직하다(이하, 이들의 형태를 총칭해서 「방사성 동위 원소원」이라고도 한다.). 방사성 동위 원소원으로서는 예를 들면, 물을 주체로 하는 용매에 방사성 동위 원소 이온이 용해 또는 분산된 방사성 동위 원소 이온 함유액을 사용할 수 있다.
방사성 동위 원소의 핵종으로서는 바람직하게는 68Ga, 89Zr, 90Y, 111In, 177Lu 및 225Ac로부터 선택되는 적어도 1종이며, 표지율의 높이 및 용이함으로부터 89Zr 및 225Ac 중 적어도 1종이 특히 바람직하다.
89Zr은 β+선 괴변 핵종임과 아울러, 전자 포획 괴변 핵종이다. 89Zr은 예를 들면, 사이크로토론을 이용하여 89Y(p, n)89Zr의 핵반응에 의해 제조할 수 있다. 상세하게는 프로톤 조사후의 89Y 타겟을 산으로 용해한 용해액을, 89Zr을 흡착 가능한 포집제를 담지한 컬럼 카트리지 등에 통액한다. 그 후에 상기 컬럼 카트리지를 물 등의 용매로 세정한 후에 옥살산 수용액을 통액함으로써, 89Zr 이온을 용출시켜서 용액으로서 회수할 수 있다.
225Ac는 Th-229 제네레이터로부터의 밀킹, Th-232 핵파쇄법, Ra-226 중성자 부가법(226Ra(n, 2n)225Ra의 핵반응 및 225Ra의 β-붕괴를 경유하는 방법), Ra-226 광핵반응(226Ra(γ, n)225Ra의 핵반응 및 225Ra의 β-붕괴를 경유하는 방법), 또는 Ra-226 핵변환(사이크로톤을 사용한 226Ra(p, 2n)225Ac의 핵반응) 중 어느 하나에 의해 생성할 수 있다. Ra-226 핵변환을 사용하는 경우, 생성한 225Ac는 예를 들면, 226Ra 타겟으로부터 분리 정제함으로써 정제할 수 있고, 225Ac를 포함하는 226Ra 타겟을 산 등으로 용해하고, 용해액에 알칼리를 첨가함으로써 225Ac를 포함하는 염을 석출시키고, 상기 염을 분리 정제함으로써 정제한 225Ac를 얻을 수 있다.
본 공정에 사용되는 배위자 화합물은 방사성 동위 원소와 배위 가능한 화합물이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 이하의 유기 화합물 및 상기 화합물로부터 유래하는 구조를 포함하는 화합물을 들 수 있다.
CB-TE2A(1,4,8,11-Tetraazabicyclo[6.6.2]hexadecane-4,11-diacetic acid)
CDTA(cyclohexane-trans-1,2-diamine tetra-acetic acid)
CDTPA(4-cyano-4-[[(dodecylthio)thioxomethyl]thio]-Pentanoic acid)
DOTA(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)
DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α',α'',α'''-tetramethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)
DOTAM(1,4,7,10-tetrakis(carbamoylmethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane)
DOTA-GA(α-(2-Carboxyethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)
DOTP(((1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetrakis(methylene))tetraphosphonic acid)
DOTMP(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrakis(methylenephosphonic acid))
DOTA-4AMP(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrakis(acetamidomethylenephosphonic acid)
DO2P(Tetraazacyclododecane dimethanephosphonic acid)
Deferoxamine(DFO)
DTPA(N,N-bis[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl]-glycine)
DTPA-BMA(5,8-Bis(carboxymethyl)-11-[2-(methylamino)-2-oxoethyl]-3-oxo-2,5,8,11-tetraazatridecan-13-oic acid)
EDTA(2,2', 2'', 2'''-(ethane-1,2-diylbis(azanetriyl))tetraacetic acid)
NOTA(1,4,7-Triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid)
OTP(1,4,7-Triazacyclononane-1,4,7-triyltris(methylenephosphonic acid)
TETPA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8,11-tetrapropionic acid)
TETA(1,4,8,11-Tetraazacyclotetradecane-N,N',N'',N'''-tetraacetic acid)
TTHA(3,6,9,12-Tetrakis(carboxymethyl)-3,6,9,12-tetraazatetradecanedioic acid)
HEHA(1,2,7,10,13-hexaazacyclooctadecane-1,4,7,10,13,16-hexaacetic acid)
1,2-HOPO(N,N',N'',N'''-tetra(1,2-dihydro-1-hydroxy-2-oxopyridine-6-carbonyl)-1,5,10,14-tetraazatetradecane)
PEPA(1,4,7,10,13-pentaazacyclopentadecane-N,N',N'',N''',N''''-penta-acetic acid)
H4octapa(N,N'-bis(6-carboxy-2-pyridylmethyl)-ethylenediamine-N,N'-diacetic acid)
H2bispa2(6,6'-({9-hydroxy-1,5-bis(methoxycarbonyl)-2,4-di(pyridine-2-yl)-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonane-3,7-diyl}bis(-methylene))dipicolinic acid)
H2dedpa(1,2-[{6-(carboxy)-pyridin-2-yl}-methylamino]ethane)
H2macropa(6-(1,4,10,13-tetraoxa-7,16-diazacyclooctadecan-N,N'-methyl)picolinic acid)
H5decapa(N,N''-bis(6-carboxy-2-pyridylmethyl)-diethylenetriamine-N,N',N''-triacetic acid)
H6phospa(N,N'-(methylenephosphonate)-N,N'-［6-(methoxycarbonyl)pyridin-2-yl]-methyl-1,2-diaminoethane)
HP-D03A(Hydroxypropyltetraazacyclododecanetriaceticacid)
이들 중, 본 공정에서 사용되는 배위자 화합물은 이하의 식(1)으로 나타내어지는 구조를 갖는 유기 화합물인 것이 바람직하다.
식(1) 중, R11, R13 및 R14는 각각 독립적으로 -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H4N, -(CH2)pPO3H2, 또는 -(CH2)pCONH2로 이루어지는 기이다. 상기 p는 각각 독립적으로 0 이상 3 이하의 정수이다.
식(1) 중, R12 또는 R15 중 일방이 수소원자, 카르복실기, 또는 탄소수 2 혹은 3의 카르복시알킬기이며, 타방이 상기 항체를 수식하기 위한 치환기이며, R12가 상기 항체를 수식하기 위한 치환기일 때 R15는 수소원자이며, R12가 상기 항체를 수식하기 위한 치환기가 아닐 때 R15는 상기 항체를 수식하기 위한 치환기이다.
본 공정에 사용되는 배위자 화합물은 보다 바람직하게는 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA), 또는 그 유도체로부터 유래하는 구조를 포함하는 화합물이며, 구체적으로는 이하에 나타내어지는 1개의 화합물 또는 상기 화합물로부터 유래하는 구조를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 본 공정에 사용되는 배위자 화합물은 바람직하게는 수용성이다.
DOTA(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)
DOTMA((1R,4R,7R,10R)-α,α',α'',α'''-tetramethyl-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)
DOTAM(1,4,7,10-tetrakis(carbamoylmethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane)
DOTA-GA(α-(2-Carboxyethyl)-1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid)
DOTP(((1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrayl)tetrakis(methylene))tetraphosphonicacid)
DOTMP(1,4,7,10-Tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrakis(methylenephosphonic acid))
DOTA-4AMP(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetrakis(acetamidomethylenephosphonic acid)
DO2P(Tetraazacyclododecane dimethanephosphonic acid)
본 공정에 있어서의 반응액은 물을 포함하고, pH 완충제 및 바람직하게는 유기 용매를 포함하지 않는다.
물로서는 본 기술분야에서 통상 사용되는 것을 채용할 수 있고, 예를 들면, 증류수나 이온 교환수를 사용할 수 있다.
pH 완충제는 물에 용해했을 때에 소정의 pH 범위에서 pH 완충작용을 발휘하는 것이다. 본 발명에 있어서는 반응액이 pH 완충제를 포함하지 않도록 함으로써, 상기 반응액 내에서 방사성 금속 핵종과, 배위자 화합물로 수식된 항체를 반응시킴으로써, 항체에 대해서 상기 방사성 동위 원소에 의한 높은 표지율을 부여할 수 있는 것을 찾아낸 것이다.
비함유로 하는 pH 완충제로서는 아세트산 나트륨, 아세트산 암모늄, 인산, 인산 완충 생리식염수, 트리스히드록시메틸아미노메탄 완충액(Tris 완충액), 4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산 완충액(HEPES 완충액), 또는 테트라메틸암모늄아세트산 완충액 등의 완충제이다.
「완충제가 비함유이다」란 반응액 중에 의도적으로 완충제를 함유시키지 않지만, 반응액 중에 불가피하게 완충제가 혼입하는 것은 허용하는 것을 의미한다.
비함유로 하는 유기 용매로서는 예를 들면, 수용성 유기 용매 및 비수용성 유기 용매를 들 수 있다.
상기 수용성 유기 용매로서는 메탄올 및 에탄올 등의 프로톤성 극성 용매, 및 아세토니트릴, N,N-디메틸포르미아미드, 테트라히드로푸란, 디메틸술폭시드 및 아세톤 등의 비프로톤성 극성 용매를 들 수 있다.
상기 비수용성 유기 용매로서는 헥산, 톨루엔, 아세트산 에틸 등을 들 수 있다.
이러한 유기 용매를 비함유로 함으로써, 예를 들면, 고상 추출법 등이라는 유기 용매를 분리하는 공정을 행할 필요가 없으므로, 농축에 의한 방사선 분해를 회피하면서, 높은 표지율을 안정적으로 달성할 수 있다.
「유기 용매가 비함유이다」란 반응액 중에 의도적으로 유기 용매를 함유시키지 않지만, 반응액 중에 불가피하게 유기 용매가 혼입되는 것은 허용하는 것을 의미한다.
또한, 본 발명에 있어서, 반응액의 pH는 2 이상 10 이하이다. 구체적으로는 방사성 동위 원소로서, 방사성 금속 핵종으로서 89Zr을 사용하는 경우에는 pH가 2 이상 4 이하인 것이 바람직하고, 또한 3인 것이 바람직하다. 방사성 금속 핵종으로서 225Ac를 사용하는 경우에는 pH가 4 이상 10 이하인 것이 바람직하고, 또한 6 이상 9 이하인 것이 바람직하다.
반응액의 pH를 상기 범위 내로 설정함으로써, 상기 반응액 내에서 방사성 금속 핵종과, 배위자 화합물로 수식된 항체를 반응시켰을 때에, 항체에 대해서 상기 방사성 동위 원소에 의한 높은 표지율을 부여할 수 있다.
반응액의 pH는 반응 개시전에 상기 pH의 범위 내가 되도록 조정한다. 구체적으로는 물에 대해서 염산 등의 무기산이나, 수산화나트륨 등의 금속 수산화물을 첨가해서 반응액의 pH를 조정한다.
또한, 반응액 중에서 방사성 금속 핵종과 배위자 수식 항체를 반응시킬 때는, 반응액 내에 방사성 금속 핵종을 미리 함유시킨 후에 배위자 수식 항체를 함유시켜서 반응시켜도 좋고, 반응액 중에 방사성 금속 핵종과 배위자 수식 항체를 동시에 함유시킬 수도 있다. 또한, 반응액 중에 배위자 수식 항체를 미리 함유시킨 후, 방사성 금속 핵종을 함유시킬 수도 있다.
이어서, 반응 압력을 예를 들면, 대기압으로 하고, 필요에 따라 가열한다. 가열함으로써, 짧은 제조 시간에 표지효율의 추가적인 향상을 달성할 수 있다. 구체적으로는 30℃ 이상 80℃ 이하인 것이 바람직하고, 방사성 동위 원소로서, 방사성 금속 핵종으로서 89Zr을 사용하는 경우에는 50℃ 이상 80℃ 이하인 것이 보다 바람직하고, 방사성 금속 핵종으로서 225Ac를 사용하는 경우에는 30℃ 이상 70℃ 이하인 것이 보다 바람직하다. 가열의 방법으로서는 반응계 외부로부터 열을 부여하는 방법을 들 수 있고, 예를 들면, 블록 히터, 에어 히터, 수욕, 유욕, 마이크로파 및 맨틀 히터 등을 들 수 있다. 특히 자동 합성 장치에의 장착이 가능한 관점으로부터, 블록 히터 또는 에어 히터를 사용한 가열이 바람직하다.
또, 반응시간은 상술의 반응온도인 것을 조건으로 해서, 바람직하게는 10분 이상 150분 이하, 더 바람직하게는 15분 이상 120분 이하이다.
본 공정에 있어서의 반응액량은 제조 스케일에 따라 적당하게 변경해도 좋지만, 제조 공정에 있어서의 실용성의 관점으로부터, 본 공정의 개시시에 있어서, 0.01mL 이상 100mL 이하가 현실적이다.
목적으로 하는 방사성 동위 원소에 의한 표지율을 높이는 관점으로부터, 반응액 중의 항체의 농도는 본 공정의 개시시에 있어서, 바람직하게는 1μmol/L 이상 2000μmol/L 이하, 보다 바람직하게는 5μmol/L 이상 100μmol/L 이하, 더 바람직하게는 10μmol/L 이상 50μmol/L 이하이다.
또, 본 발명에 있어서는 필요에 따라서, 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 말토오스, 락토오스, 아라비노오스, 크실로오스, 소르비톨, 프룩토오스, 글루코오스, 만노스, 멜레치토스, 및 니스토스로 이루어지는 당류의 군으로부터 선택되는 적어도 1종, 바람직하게는 글루코오스, 크실로오스, 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 및 소르비톨로 이루어지는 당류의 군으로부터 선택되는 적어도 1종을 반응액 내에 첨가할 수 있다. 이것에 의해, 항체, 나아가서는 방사성 동위 원소, 배위자 화합물 및 항체를 포함하는 복합체의 응집을 억제할 수 있다.
이들 응집 억제제의 첨가량은 예를 들면, 10mmol/L 이상 2000mmol/L 이하인 것이 바람직하고, 100mmol/L 이상 1000mmol/L 이하인 것이 보다 바람직하다.
또, 최종적으로 얻은 복합체에 있어서, 배위자 화합물은 링커를 통해 항체와 접속되어 있어도 좋다.
항체로서는 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체 등을 들 수 있지만, 바람직하게는 인간의 IgG이며, 더 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2, 또는 IgG4이다.
링커로서는 치환 또는 무치환의 알킬기, 치환 또는 무치환의 헤테로알킬기, 폴리에틸렌글리콜(PEG)기, 펩티드, 당쇄, 디술피드기 및 이들의 조합 등을 들 수 있다.
바람직하게는 배위자 화합물은 링커를 통해, 항체를 부위 특이적으로, 보다 바람직하게는 Fc 영역을 수식하고 있다. 이 경우, 링커는 하기 식(2)으로 나타내어지는 13 이상 17 이하의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드(이하, 「항체 수식 펩티드」라고도 한다.)를 포함하고, 또한 가교제로 수식된 항체 수식 펩티드와 항체의 가교반응에 의해 형성되어 있는 것을 사용할 수 있다.
또, 식(2)에 있어서, 아미노산 서열의 지면 좌측이 N말단측을 나타내고, 아미노산 서열의 지면 우측이 C말단측을 나타내는 것으로서 설명한다. 배위자 화합물이 링커로서 항체 수식 펩티드를 통해 항체와 접속될 경우, 배위자 화합물과 항체 수식 펩티드가 연결되는 위치는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 항체 수식 펩티드의 N말단 또는 C말단, 바람직하게는 N말단에 직접 또는 간접적으로 연결할 수 있다. 또한, 항체 수식 펩티드의 C말단은 그 안정성의 향상 등을 위해서 아미드화 등의 수식을 받고 있어도 좋다.
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)‥(2)
식 중, Xa, Xb, Xc 및 Xd는 각각 연속하는 a개의 X, 연속하는 b개의 X, 연속하는 c개의 X, 및 연속하는 d개의 X를 나타내고, X는 측쇄에 티올기 및 할로아세틸기를 모두 갖지 않는 아미노산 잔기이며, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 이상 5 이하의 정수이며, 또한 a+b+c+d≤14를 만족하고, Xaa1 및 Xaa3은 각각 독립적으로 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산으로부터 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, 또는 일방이 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산으로부터 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, 타방이 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산으로부터 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, Xaa1과 Xaa3이 연결되어 있고, Xaa2는 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산 잔기, 또는 디아미노프로피온산 잔기이며, 상기 가교제로 수식되어 있다.
상기 식(2)에 있어서의 X에 포함될 수 있는 아미노산 잔기로서는 예를 들면, 글리신, 알라닌, 페닐알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루탐산, 아르기닌, 히스티딘, 세린, 트레오닌, 티로신, 메티오닌 등의 아미노산으로부터 유래하는 것을 들 수 있고, X는 동일한 종류의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 잔기여도 좋고, 각각 다른 종류의 아미노산으로 이루어지는 아미노산 잔기여도 좋다.
식(2) 중의 a, b, c 및 d는 상술한 범위의 수이면 특별히 제한은 없지만, 펩티드와 항체의 결합 안정성의 관점으로부터, a+b+c+d≤14를 조건으로 해서, a는 바람직하게는 1 이상 3 이하의 정수, b는 바람직하게는 1 이상 3 이하의 정수, c는 바람직하게는 3 이상 5 이하의 정수, 및 d는 바람직하게는 1 이상 3 이하의 정수이다.
Xaa1 및 Xaa3은 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산으로부터 유래하는 아미노산 잔기이며, 상기 아미노산은 각각 동일해도 좋고, 상이해도 좋다. 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산으로서는 예를 들면, 시스테인, 호모시스테인을 들 수 있다. 이러한 아미노산 잔기는 디술피드 결합에 의해 결합되어 있거나, 또는 이하의 식(3)으로 나타내는 링커를 통해, 술피드기가 결합되어 있는 것이 바람직하다. 식(3) 중, 파선부분은 술피드기와의 결합 부분을 나타낸다.
Xaa1 및 Xaa3은 상술한 조합 대신에 Xaa1 및 Xaa3 중 일방이 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산으로부터 유래하는 아미노산 잔기이며, 타방이 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산으로부터 유래하는 아미노산 잔기여도 좋다. 이들은 티오에테르 결합를 통해 결합되어 있다. 할로아세틸기는 그 말단이 요오드 등의 할로겐으로 치환되어 있고, 타방의 측쇄에 있어서의 티올기와의 반응에 의해 할로겐이 탈리해서 티오에테르 결합이 형성된다.
식(2)으로 나타내어지는 항체 수식 펩티드의 구체적인 아미노산 서열은 예를 들면, 국제공개 2016/186206호, 국제공개 2017/217347호 및 국제공개 2018/230257호에 기재된 펩티드를 들 수 있고, 이들을 사용할 수도 있다.
이들 중, 항체 수식 펩티드의 아미노산 서열로서, 이하의 서열(1)∼(14) 중 어느 하나를 갖고 있는 것이 바람직하고, 이하의 서열(1), (2), (13) 또는 (14)을 갖고 있는 것이 더욱 바람직하다. 이하의 아미노산 서열(1)∼(14)에 있어서, (Xaa2)는 리신 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산, 또는 디아미노프로피온산을 나타내고, (Xaa1) 및 (Xaa3)은 모두 호모시스테인 잔기를 나타낸다. 또한, 이하의 아미노산 서열(1)∼(14) 중, (Xaa1), (Xaa2) 및 (Xaa3) 이외의 아미노산은 1문자 약호로 표기한다.
(1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(서열 번호 9)
(2)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(서열 번호 10)
(3)RCAYH(Xaa2)GELVWCS(서열 번호 11)
(4)GPRCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(서열 번호 12)
(5)SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(서열 번호 13)
(6)GDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(서열 번호 14)
(7)GPSCAYH(Xaa2)GELVWCTFH(서열 번호 15)
(8)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCSFH(서열 번호 16)
(9)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTHH(서열 번호 17)
(10)GPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(서열 번호 18)
(11)SPDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(서열 번호 19)
(12)SDDCAYH(Xaa2)GELVWCTFY(서열 번호 20)
(13)RGNCAYH(Xaa2)GQLVWCTYH(서열 번호 21)
(14)G(Xaa1)DCAYH(Xaa2)GELVWCT(Xaa3)H(서열 번호 22)
본 발명의 상기의 실시형태는 이하의 기술사상을 포함하는 것이다.
[1]방사성 금속 핵종과 항체의 복합체의 제조 방법으로서,
방사성 금속 핵종과, 배위자 화합물로 수식된 항체를 물을 포함하는 반응액 중에서 반응시켜서, 상기 방사성 금속 핵종을 상기 배위자 화합물에 배위시키는 공정을 구비하고,
상기 반응액은 pH 완충제가 비함유이며, 또한 pH가 2 이상 10 이하인 복합체의 제조 방법.
[2]상기 방사성 금속 핵종이 68Ga, 89Zr, 90Y, 111In, 177Lu 및 225Ac로부터 선택되는 적어도 1종인 [1]에 기재된 복합체의 제조 방법.
[3]상기 방사성 금속 핵종이 89Zr이며, 또한 상기 반응액의 pH가 2 이상 4 이하인 [1] 또는 [2]에 기재된 복합체의 제조 방법.
[4]상기 방사성 금속 핵종이 225Ac이며, 또한 상기 반응액의 pH가 5 이상 10 이하인 [1]∼[3] 중 어느 1항에 기재된 복합체의 제조 방법.
[5]상기 반응액에 포함되는 상기 항체의 농도가 1μmol/L 이상 2000μmol/L 이하인 [1]∼[4] 중 어느 1항에 기재된 제조 방법.
[6]상기 반응액을 30℃ 이상 80℃ 이하로 가열해서 상기 방사성 금속 핵종을 상기 배위자 화합물에 배위시키는 [1]∼[5] 중 어느 1항에 기재된 복합체의 제조 방법.
[7]상기 반응액은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 말토오스, 락토오스, 아라비노오스, 크실로오스, 소르비톨, 프룩토오스, 글루코오스, 만노스, 멜레치토스, 및 니스토스로 이루어지는 당류의 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 응집 저해제를 포함하는 [1]∼[6] 중 어느 1항에 기재된 복합체의 제조 방법.
[8]상기 배위자 화합물이 하기 식(1)으로 나타내어지는 [1]∼[7] 중 어느 1항에 기재된 복합체의 제조 방법.
(식 중, R11, R13 및 R14는 각각 독립적으로 -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H4N, -(CH2)pPO3H2, -(CH2)pCONH2 또는 -(CHCOOH)(CH2)pCOOH로 이루어지는 기이며, R12 또는 R15 중 일방이 수소원자, 카르복실기, 또는 탄소수 2 혹은 3의 카르복시알킬기이며, 타방이 상기 항체를 수식하기 위한 치환기이며, p가 0 이상 3 이하의 정수이며, R12가 상기 항체를 수식하기 위한 치환기일 때 R15는 수소원자이며, R12가 상기 항체를 수식하기 위한 치환기가 아닐 때 R15는 상기 항체를 수식하기 위한 치환기이다.)
[9]상기 배위자 화합물이 링커를 통해 상기 항체의 Fc 영역을 부위 특이적으로 수식하고 있는 [1]∼[8] 중 어느 1항에 기재된 복합체의 제조 방법.
[10]상기 항체가 인간 IgG 항체이며,
상기 링커가 하기 식(Y)으로 나타내어지는 13 이상 17 이하의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드를 포함하고, 가교제로 수식된 상기 펩티드와 상기 항체의 가교반응에 의해 형성되어 있는 [1]∼[9] 중 어느 1항에 기재된 복합체의 제조 방법.
(Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)‥(Y)
(식 중, Xa, Xb, Xc 및 Xd는 각각 연속하는 a개의 X, 연속하는 b개의 X, 연속하는 c개의 X, 및 연속하는 d개의 X를 나타내고, X는 측쇄에 티올기 및 할로아세틸기를 모두 갖지 않는 아미노산 잔기이며, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 이상 5 이하의 정수이며, 또한 a+b+c+d≤14를 만족하고, Xaa1 및 Xaa3은 각각 독립적으로 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산으로부터 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, 또는 일방이 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산으로부터 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, 타방이 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산으로부터 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, Xaa1과 Xaa3이 연결되어 있고, Xaa2는 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산 잔기, 또는 디아미노프로피온산 잔기이며, 상기 가교제로 수식되어 있다.)
실시예
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명의 범위는 실시예에 제한되지 않는다.
〔실시예 1〕 89Zr 퍼투주맙 복합체의 제조
(1)펩티드 수식 퍼투주맙의 합성
국제공개 2017/217347호에 기재된 방법으로, 하기 식(4)으로 나타내어지는 17개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 얻었다. 이 펩티드의 아미노산 서열은 동 문헌 명세서의 단락 〔0038〕에 기재된 서열 번호 2에 있어서, Xaa1이 리신 잔기인 서열과 동일하며, 상기 리신 잔기의 측쇄 말단 아미노기가 하기 식(4)의 R1로 나타내어지는 구조로 수식되어 있다. 또한, 2개의 시스테인 잔기간에서 디술피드 결합을 형성하고 있고, 펩티드의 N말단에는 디글리콜산 및 8개의 PEG를 갖는 링커구조를 통해, 아지드기가 결합되어 있다.
(식 중, Gly는 글리신을, Pro는 프롤린을, Asp는 아스파르트산을, Cys는 시스테인을, Ala는 알라닌을, Tyr은 티로신을, His는 히스티딘을, Lys는 리신을, Glu는 글루탐산을, Leu는 류신을, Val은 발린을, Trp은 트립토판을, Phe는 페닐알라닌을, Thr는 트레오닌을 나타낸다.)
이어서, 20mmol/L 아세트산-아세트산 나트륨 완충액(pH6.0) 6.5mL를 첨가한 원심관에 퍼투주맙 용액 1mL(퍼투주맙(판매명 Perjeta, Roche사제)을 30mg 함유한다.)를 첨가했다. 그 후에 상기 17개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드의 디메틸술폭시드(DMSO) 용액(펩티드 농도:2.4mmol/L) 140μL를 첨가한 후에 즉시 피펫팅을 하고, 실온에서 정치하여 60분간 반응시킴으로써 펩티드 수식 퍼투주맙을 포함하는 용액을 얻었다.
다음에 상술한 바와 같이 해서 얻은 펩티드 수식 퍼투주맙을 포함하는 용액을 20mmol/L 아세트산-아세트산 나트륨 완충액(pH6.0) 22.5mL로 희석하고, IgG-BP 컬럼(서열로서 GSGGSGPDCAYHRGELVWCTFH로 나타내어지는 펩티드 5632nmol을 용량 5mL의 Hitrap NHS-activated HP 컬럼(Cytiva사제)에 고상화한 컬럼, 펩티드시스테인 잔기 사이는 디술피드 결합으로 가교된다)에 통액하고, 항체를 유지시켰다. 이 컬럼에 0.15mol/L 염화나트륨 함유 0.10mol/L 아세트산-아세트산 나트륨 완충액(pH5.7)을 통액하고, 퍼투주맙 1분자에 대해서 2분자의 펩티드로 수식된 펩티드 수식 항체(이하, 「2가 펩티드 수식 퍼투주맙」이라고 한다.)를 제거한 후에 0.1mol/L 글리신 염산 완충액(pH3.5)을 통액하고, 퍼투주맙 1분자에 대해서 1분자의 펩티드로 수식된 펩티드 수식 퍼투주맙(이하, 「1가 펩티드 수식 퍼투주맙」이라고 한다.)을 포함하는 획분을 회수했다.
퍼투주맙 처방 완충액(수크로오스를 41g/L, L-히스티딘을 3.1g/L, 및 빙초산을 657mg/L의 농도로 포함하는 수용액) 10mL를 미리 첨가한 한외 여과 필터(아미콘울트라-15, Merck사제)에 상기 1가 펩티드 수식 퍼투주맙을 포함하는 획분을 주입하고, 원심기로 원심했다(원심조건:25℃, 3000xg, 20분). 원심후, 여과액을 버리고, 다시 퍼투주맙 처방 완충액을 첨가해서 용액의 전량이 15mL가 되도록 하고, 동 조건으로 2회째의 원심을 행했다.
이어서, 상술한 바와 같이 해서 얻어진 용액에 대해서 퍼투주맙 처방 완충액을 첨가함으로써, 그 1가 펩티드 수식 퍼투주맙의 농도가 15mg/mL로 조정된 펩티드 수식 퍼투주맙 용액(이하 「용액 A」라고 하는 경우가 있다)을 얻었다. 이 때, 용액 A의 1가 펩티드 수식 퍼투주맙의 농도는 UV-Vis 분광 광도계(NanoDrop-2000, Thermo Scientific사제)를 이용하여, 측정 파장 280nm, 측정 광로 길이 1mm, 흡광계수 0.1%(280nm) 1.37(1mg/mL IgG 용액의 280nm에 있어서의 흡광계수)를 측정 조건으로 설정해서 측정했다.
(2)배위자 수식 퍼투주맙의 합성
이하 식(L1-4)에 나타내는 DOTAGA-DBCO를 Bernhard et al. DOTAGA-Anhydride:AValuable Building Block for the Preparation of DOTA-Like Chelating Agents Chem.Eur. J. 2012, 18, 7834-7841에 기재된 방법을 기초로 해서 제조했다.
이 DOTAGA-DBCO에 물을 첨가해서 농도가 4mg/mL인 DOTAGA-DBCO 함유 용액(이하 「용액 B」라고 하는 경우가 있다)으로 했다.
이어서, 용액 A 0.6mL(1가 펩티드 수식 퍼투주맙을 9mg, 0.06μmol 포함한다)를 마이크로 튜브에 첨가했다. 이어서, 용액 B 0.33mL를 첨가해서 즉시 피펫팅했다. 이 마이크로 튜브를 37℃로 설정한 블록 히터 상에서 1시간 정치하고, 상기 (1)에서 합성한 1가 펩티드 수식 퍼투주맙 및 상기 DOTAGA-DBCO를 클릭 반응시켰다.
다음에 상기와 같이 해서 얻은 반응 혼합액을 퍼투주맙 처방 완충액으로 10mL가 되도록 희석하고, 프로테인 A 컬럼(1mL MabSelect SuRe, Cytiva사제)에 통액하고, 펩티드 수식 항체를 유지시켰다. 이 컬럼에 0.15mol/L 염화나트륨 함유 0.02mol/L 히스티딘 완충액(pH6.0)을 통액하고, 미반응의 DOTAGA-DBCO를 세정한 후에 0.1mol/L 글리신 염산 완충액(pH3.5)을 통액하고, 배위자 수식 퍼투주맙을 포함하는 획분을 회수했다.
미리 주사용수 10mL를 첨가한 한외 여과 필터(아미콘울트라-15, Merck사제)에 상기에서 얻어진 회수 용액의 전량을 첨가하고, 원심기로 원심했다(원심조건:25℃, 3000xg, 20분). 원심후, 여과액을 버리고, 다시 주사용수 13.5mL를 첨가해서 동 조건으로 원심했다. 이 원심은 합계로 2회 행하고, 최후에 주사용수로 희석함으로써, 1가 펩티드 수식 항체가 DOTAGA-DBCO와 반응해서 얻어진 1가 배위자 수식 퍼투주맙의 농도가 15mg/mL인 배위자 수식 퍼투주맙 용액(이하 「용액 C」라고 하는 경우가 있다)을 얻었다.
(3)표지반응
89Y(p, n)89Zr의 핵반응에 의해 얻어지고, 89Zr4+ 이온 수용액(니혼 메지피직스사제)으로 조제된 89Zr을 바이알에 첨가해서, 용매를 증류 제거했다.
상기 바이알에 0.1mol/L의 염산을 첨가해서 피펫팅으로 저면을 중심으로 잘 씻어 넣고, 마이크로 튜브에 방사능으로서 19.8MBq 분주했다. 이 마이크로 튜브에 0.1mol/L 염산과 주사용수를 첨가한 후, 1mol/L 수산화나트륨 수용액을 첨가함으로써 pH3.0의 89Zr4+ 이온 용액 545.6μL(반응액 중의 방사능 농도:36.3MBq/mL)를 얻었다. pH는 pH 시험지에 의해 측정했다.
상기 89Zr4+ 이온 용액에 용액 C60μL(1가 배위자 수식 퍼투주맙을 6nmol 포함한다)를 첨가함으로써, 반응액 중의 1가 배위자 수식 퍼투주맙의 농도를 10μmol/L로 하고, 보르텍스 믹서로 교반했다. 이어서, 블록 히터를 이용하여 70℃에서 30분간 가열하고, 89Zr4+ 이온을 배위자 수식 퍼투주맙의 배위자에 배위시키고, 89Zr 퍼투주맙 복합체를 합성했다.
반응 혼합물의 0.5μL를 빼내고, 박층 크로마토그래피(iTLC-SG, Agilent사제, 전개 용매:EDTA 수용액(0.1mol/L)과 염산(1mol/L)의 혼합액(체적비 1:1))로 분리했다. 전개후의 박층 크로마토그램을 TLC 해석 장치(GITAStar, 엠에스 키키 가부시키가이샤제)에 도입하고, 반응 혼합물 중의 미반응의 89Zr을 포함하는 전89Zr 방사능 카운트 및 89Zr 퍼투주맙 복합체의 방사능 카운트를 각각 측정했다. 전89Zr 방사능 카운트에 대한 89Zr 퍼투주맙 복합체의 방사능 카운트의 백분률은 99.3%였다.
〔실시예 2〕 89Zr 트라스트주맙 복합체의 제조
(1)펩티드 수식 트라스트주맙의 합성
20mmol/L 아세트산-아세트산 나트륨 완충액(pH6.0) 25mL를 첨가한 원심관에 칭량한 트라스트주맙(판매명 Herceptin, Roche사제) 50mg분을 용해하고, 2mg/mL의 용액으로 했다. 그 후에 실시예 1(1)과 동일한 17개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드의 DMSO 용액(농도:2.4mmol/L) 233μL를 첨가한 후에 즉시 피펫팅을 하고, 실온에서 정치하여 60분간 반응시킴으로써 펩티드 수식 트라스트주맙을 포함하는 용액을 얻었다.
다음에 상기와 같이 해서 얻은 펩티드 수식 트라스트주맙을 포함하는 용액을 20mmol/L 아세트산-아세트산 나트륨 완충액(pH6.0) 25mL로 희석하고, IgG-BP 컬럼(실시예 1(1)에서 사용한 것과 동일)에 첨가했다. 이 컬럼에 0.15mol/L 염화나트륨 함유 0.10mol/L 아세트산-아세트산 나트륨 완충액(pH5.7)을 통액하고, 트라스트주맙 1분자에 대해서 2분자의 펩티드로 수식된 펩티드 수식 항체(이하, 「2가 펩티드 수식 트라스트주맙」이라고 한다.)를 제거한 후에 0.15mol/L 염화나트륨 함유 0.10mol/L 아세트산-아세트산 나트륨 완충액(pH3.5)을 통액하고, 트라스트주맙 1분자에 대해서 1분자의 펩티드로 수식된 펩티드 수식 항체(이하, 「1가 펩티드 수식 트라스트주맙」이라고 한다.)를 포함하는 획분을 회수했다.
트라스트주맙 처방 완충액(19g/L 트레할로스 수화물, 470mg/L L-히스티딘 염산염, 300mg/L L-히스티딘)을 미리 첨가한 한외 여과 필터(아미콘울트라-15, Merck사제)에 상기 1가 펩티드 수식 트라스트주맙을 포함하는 획분을 주입하고, 원심기로 원심했다(원심조건:20℃, 2330xg, 20분). 원심후, 여과액을 버리고, 다시 트라스트주맙 처방 완충액을 첨가해서 용액의 전량이 15mL가 되도록 하고, 동 조건으로 2회째의 원심을 행했다. 또, 트라스트주맙 처방 완충액의 첨가, 여과액의 추출 및 원심조작은 합계 3회 행했다.
이어서, 상술한 바와 같이 해서 얻어진 용액에 대해서 트라스트주맙 처방 완충액을 첨가함으로써, 1가 펩티드 수식 트라스트주맙의 농도가 15mg/mL로 조정된 펩티드 수식 트라스트주맙 용액(이하 「용액 D」라고 하는 경우가 있다)을 얻었다. 이 때, 용액 D의 1가 펩티드 수식 트라스트주맙의 농도는 UV-Vis 분광 광도계(NanoDrop-2000, Thermo Scientific사제)를 이용하여, 상술한 바와 같이 측정했다.
(2)배위자 수식 트라스트주맙의 합성
용액 D 0.6mL(1가 펩티드 수식 트라스트주맙을 9mg, 0.06μmol 포함한다)를 마이크로 튜브에 첨가했다. 이어서, 실시예 1(2)와 마찬가지으로 조제한 용액 B 0.33mL를 첨가해서 즉시 피펫팅했다. 이 마이크로 튜브를 37℃로 설정한 블록 히터 상에서 1시간 정치하고, 상기 (1)에서 합성한 펩티드 수식 트라스트주맙 및 DOTAGA-DBCO를 클릭 반응시켰다.
다음에 상기와 같이 해서 얻은 반응 혼합액을 트라스트주맙 처방 완충액으로 10mL가 되도록 희석하고, 프로테인 A 컬럼(1mL MabSelect SuRe, Cytiva사제)에 통액하고, 항체를 유지시켰다. 이 컬럼에 0.15mol/L 염화나트륨 함유 0.02mol/L 히스티딘 완충액(pH6.0)을 통액하고, 미반응의 DOTAGA-DBCO를 세정한 후에 0.1mol/L 글리신 염산 완충액(pH3.5)을 통액하고, 배위자 수식 트라스트주맙을 포함하는 획분을 회수했다.
미리 주사용수 10mL를 첨가한 한외 여과 필터(아미콘울트라-15, Merck사제)에 상기에서 얻어진 회수 용액의 전량을 첨가하고, 원심기로 원심했다(원심조건:25℃, 3000xg, 20분). 원심후, 여과액을 버리고, 다시 주사용수 13.5mL를 첨가해서 동 조건으로 원심했다. 이 원심은 합계로 4회 행하고, 최후에 주사용수로 희석함으로써, 1가 펩티드 수식 항체가 DOTAGA-DBCO와 반응해서 얻어진 1가 배위자 수식 트라스트주맙의 농도가 15mg/mL인 배위자 수식 트라스트주맙 용액(이하 「용액 E」라고 하는 경우가 있다)을 얻었다.
(3)표지반응
89Zr4+ 이온을 36.3MBq/mL로 포함하는 pH3.0의 89Zr4+ 이온 용액 545.6μL를 이용하여, 용액 C 대신에 용액 E로 변경한 이외는 실시예 1(3)과 동일하게 해서 89Zr4+ 이온을 배위자 수식 트라스트주맙의 배위자에 배위시키고, 89Zr 트라스트주맙 복합체를 합성했다. 실시예 1(3)과 마찬가지로 박층 크로마토그래피법에 의해 반응 혼합물을 분석한 결과, 전89Zr 방사능 카운트에 대한 89Zr 트라스트주맙 복합체의 방사능 카운트의 백분률은 99.5%였다.
〔실시예 3〕 225Ac 퍼투주맙 복합체의 제조
(1)배위자 수식 퍼투주맙의 합성
실시예 1(1) 및 (2)와 동일한 순서에 따라 배위자 수식 퍼투주맙을 합성하고, 용액 C를 얻었다.
(2)표지반응
오크리지 국립 연구소로부터 구입한 225Ac(NO3)3이 들어간 바이알에 0.2mol/L의 염산을 첨가해서 피펫팅으로 저면을 중심으로 잘 씻어 넣고, 마이크로 튜브에 방사능으로서 0.332MBq 분주했다. 이 마이크로 튜브에 0.2mol/L 염산과 주사용수를 첨가한 후, 1mol/L 수산화나트륨 수용액을 첨가함으로써 pH7.0의 225Ac3+ 이온 용액(반응액 중의 방사능 농도:1.2MBq/mL) 276μL를 얻었다. pH는 pH 시험지에 의해 측정했다.
상기 225Ac3+ 이온 용액에 용액 C30μL(1가 배위자 수식 퍼투주맙을 3nmol 포함한다)를 첨가함으로써, 반응액 중의 1가 배위자 수식 퍼투주맙의 농도를 9.8μmol/L로 하고, 보르텍스 믹서로 교반했다. 이어서, 블록 히터를 이용하여 40℃에서 30분간 가열하고, 225Ac3+ 이온을 배위자 수식 퍼투주맙의 배위자에 배위시키고, 225Ac 퍼투주맙 복합체를 합성했다.
반응 혼합물의 2μL를 빼내고, 박층 크로마토그래피(iTLC-SG, Agilent사, 전개 용매:EDTA 수용액(0.1mol/L)과 염산(1mol/L)의 혼합액(체적비 1:1))로 분리했다. 전개후의 박층 크로마토그램을 TLC 해석 장치(GITAStar, 엠에스 키키 가부시키가이샤제)에 도입하고, 반응 혼합물 중의 미반응의 225Ac를 포함하는 전225Ac 방사능 카운트 및 225Ac 퍼투주맙 복합체의 방사능 카운트를 각각 측정했다. 전225Ac 방사능 카운트에 대한 225Ac 퍼투주맙 복합체의 방사능 카운트의 백분률은 91.0%였다.
〔실시예 4〕 225Ac 트라스트주맙 복합체의 제조
(1)배위자 수식 트라스트주맙의 합성
실시예 2(1) 및 (2)와 동일한 순서에 따라 배위자 수식 트라스트주맙을 합성하고, 용액 E를 얻었다.
(2)표지반응
pH7.0의 225Ac3+ 이온 용액(반응액 중의 방사능 농도:0.98MBq/mL) 276μL를 이용하여, 용액 C 대신에 용액 E로 변경한 이외는 실시예 3(2)와 동일하게 해서 225Ac 이온을 배위자 수식 트라스트주맙의 배위자에 배위시키고, 225Ac 트라스트주맙 복합체를 합성했다. 실시예 3(2)와 마찬가지로 박층 크로마토그래피법에 의해 반응 혼합물을 분석한 결과, 전225Ac 방사능 카운트에 대한 225Ac 트라스트주맙 복합체의 방사능 카운트의 백분률은 83.6%였다.
〔실시예 5〕안정제 첨가 조건에서의 225Ac 퍼투주맙 복합체의 제조
(1)배위자 수식 퍼투주맙의 합성
실시예 1(1) 및 (2)와 동일한 순서에 따라 배위자 수식 퍼투주맙을 합성하고, 용액 C를 얻었다.
(2)표지반응
pH7.0의 225Ac3+ 이온 용액(반응액 중의 방사능 농도:1.5MBq/mL) 186μL를 이용하여, 반응액에 500mmol/L 수크로오스 수용액 90μL를 첨가한 이외는 실시예 3(2)와 동일하게 해서 225Ac 이온을 배위자 수식 퍼투주맙의 배위자에 배위시키고, 225Ac 퍼투주맙 복합체를 합성했다.
실시예 3(2)와 마찬가지로 박층 크로마토그래피법에 의해 반응 혼합물을 분석한 결과, 전225Ac 방사능 카운트에 대한 225Ac 퍼투주맙 복합체의 방사능 카운트의 백분률은 91.0%였다.
〔실시예 6〕산성조건에서의 225Ac 트라스트주맙 복합체의 제조
(1)배위자 수식 트라스트주맙의 합성
실시예 2(1) 및 (2)와 동일한 순서에 따라 배위자 수식 트라스트주맙을 합성하고, 용액(E)을 얻었다.
(2)표지반응
오크리지 국립 연구소로부터 구입한 225Ac(NO3)3이 들어간 바이알에 0.2mol/L의 염산을 첨가해서 피펫팅으로 저면을 중심으로 잘 씻어 넣고, 마이크로 튜브에 방사능으로서 0.301MBq 분주했다. 이 마이크로 튜브에 0.2mol/L 염산과 주사용수를 첨가한 후, 1mol/L 수산화나트륨 수용액을 첨가함으로써 pH4.0의 225Ac3+ 이온 용액(반응액 중의 방사능 농도:1.1MBq/mL) 272μL를 얻었다. pH는 pH 시험지에 의해 측정했다.
225Ac3+ 이온 용액으로서 상기 225Ac3+ 이온 용액을 사용한 이외는 실시예 4(2)와 동일한 방법으로 225Ac 트라스트주맙 복합체를 합성하고, 박층 크로마토그래피법에 의해 반응 혼합물을 분석한 결과, 전225Ac 방사능 카운트에 대한 225Ac 트라스트주맙 복합체의 방사능 카운트의 백분률은 93.0%였다.
〔비교예 1〕 2단계 방법에 의한 89Zr 퍼투주맙 복합체의 제조
(1)89Zr 표지 DOTAGA-DBCO의 제조
방사능으로서 19.9MBq의 89Zr4+ 이온을 함유하는 0.1mol/L 염산 20μL에 대해서, DOTAGA-DBCO(농도:0.3mmol/L)와 아세트산 나트륨(농도:0.156mol/L)을 함유하는 수용액 20μL(배위자를 6nmol 포함한다) 및 겐티진산(농도:0.15mol/L)과 아세트산 나트륨(농도:0.156mol/L)을 함유하는 수용액 20μL를 첨가하고, 70℃에서 60분간 반응시켜서 DOTAGA-DBCO를 89Zr4+에 배위시켰다. 얻어진 89Zr 표지 DOTAGA-DBCO의 반응 혼합물의 0.5μL를 빼내고, 박층 크로마토그래피(iTLC-SG, Agilent사, 전개 용매:주사용수와 아세토니트릴의 혼합액(체적비 1:1))로 분리했다. 전개후의 박층 크로마토그램을 TLC 해석 장치(GITAStar, 엠에스 키키 가부시키가이샤제)에 도입하고, 반응 혼합물 중의 미반응의 89Zr을 포함하는 전89Zr 방사능 카운트 및 89Zr 표지 DOTAGA-DBCO의 방사능 카운트를 각각 측정했다. 전89Zr 방사능 카운트에 대한 89Zr 표지 DOTAGA-DBCO의 방사능 카운트의 백분률은 98.7%였다.
(2)펩티드 수식 퍼투주맙
실시예 1(1)과 동일한 순서에 따라 펩티드 수식 퍼투주맙을 합성했다.
(3)89Zr 퍼투주맙 복합체의 제조
상기에서 얻어진 89Zr 표지 DOTAGA-DBCO 용액 90μL에 용액 A 0.06mL(1가 항체를 6nmol 포함한다)를 첨가해서 37℃에서 90분간 반응시키고, 항체와 89Zr 표지 DOTAGA-DBCO를 클릭 반응으로 결합시켜서, 89Zr 퍼투주맙 복합체를 배위자에의 89Zr 표지 공정과 89Zr 배위자의 클릭 반응의 2공정으로 이루어지는 제법으로 얻었다. 얻어진 89Zr 퍼투주맙 복합체의 반응 혼합물 중의 미반응의 89Zr을 포함하는 전89Zr 방사능 카운트 및 89Zr 퍼투주맙 복합체의 방사능 카운트를 실시예 1(3)과 동일한 방법으로 측정한 결과, 전89Zr 방사능 카운트에 대한 89Zr 퍼투주맙 복합체의 방사능 카운트의 백분률은 82.4%였다.
〔비교예 2〕 2단계 방법에 의한 89Zr 트라스트주맙 복합체의 제조
(1)89Zr 표지 DOTAGA-DBCO의 제조
비교예 1(1)과 동일한 순서에 따라 방사능으로서 19.8MBq의 89Zr4+ 이온을 이용하여 89Zr 표지 DOTAGA-DBCO를 제조했다. 얻어진 89Zr 표지 DOTAGA-DBCO의 반응 혼합물의 0.5μL를 빼내고, 박층 크로마토그래피(iTLC-SG, Agilent사, 전개 용매:주사용수와 아세토니트릴의 혼합액(체적비 1:1))로 분리했다. 전개후의 박층 크로마토그램을 TLC 해석 장치(GITAStar, 엠에스 키키 가부시키가이샤제)에 도입하고, 반응 혼합물 중의 미반응의 89Zr을 포함하는 전89Zr 방사능 카운트 및 89Zr 표지 DOTAGA-DBCO의 방사능 카운트를 각각 측정했다. 전89Zr 방사능 카운트에 대한 89Zr 표지 DOTAGA-DBCO의 방사능 카운트의 백분률은 98.6%였다.
(2)펩티드 수식 트라스트주맙
실시예 2(1)과 동일한 순서에 따라 펩티드 수식 트라스트주맙을 합성했다.
(3)89Zr 트라스트주맙 복합체의 제조
상기에서 얻어진 89Zr 표지 DOTAGA-DBCO 용액 90μL에 용액 D 0.06mL(1가 항체를 6nmol 포함한다)를 첨가해서 37℃에서 90분간 반응시키고, 항체와 89Zr 표지 DOTAGA-DBCO를 결합시켜서, 89Zr 트라스트주맙 복합체를 얻었다. 얻어진 89Zr 트라스트주맙 복합체의 반응 혼합물 중의 미반응의 89Zr을 포함하는 전89Zr 방사능 카운트 및 89Zr 트라스트주맙 복합체의 방사능 카운트를 실시예 1(3)과 동일한 방법으로 측정한 결과, 전89Zr 방사능 카운트에 대한 89Zr 트라스트주맙 복합체의 방사능 카운트의 백분률은 81.7%였다.
〔비교예 3〕 2단계 방법에 의한 225Ac 퍼투주맙 복합체의 제조
(1)225Ac 표지 DOTAGA-DBCO의 제조
방사능으로서 0.6MBq의 225Ac3+ 이온을 함유하는 0.2mol/L 염산 20μL에 대해서, DOTAGA-DBCO(농도:0.3mmol/L)와 아세트산 나트륨(농도:0.156mol/L)을 함유하는 수용액 40μL 및 아세트산 나트륨 수용액(농도:0.156mol/L) 20μL를 첨가하고, 70℃에서 60분간 반응시켜서 225Ac3+를 DOTAGA-DBCO에 배위시켰다. 얻어진 225Ac 표지 DOTAGA-DBCO 반응 혼합물의 2μL를 빼내고, 박층 크로마토그래피(iTLC-SG, Agilent사, 전개 용매:주사용수와 아세토니트릴의 혼합액(체적비 1:1))로 분리했다. 전개후의 박층 크로마토그램을 TLC 해석 장치(GITAStar, 엠에스 키키 가부시키가이샤제)에 도입하고, 반응 혼합물 중의 미반응의 225Ac를 포함하는 전225Ac 방사능 카운트 및 225Ac 표지 DOTAGA-DBCO의 방사능 카운트를 각각 측정했다. 전225Ac 방사능 카운트에 대한 225Ac 표지 DOTAGA-DBCO의 방사능 카운트의 백분률은 98.9%였다.
(2)펩티드 수식 퍼투주맙
실시예 1(1)과 동일한 순서에 따라 펩티드 수식 퍼투주맙을 합성했다.
(3)225Ac 퍼투주맙 복합체의 제조
상기에서 얻어진 225Ac 표지 DOTAGA-DBCO 용액 40μL에 용액 A 0.06mL(1가 항체를 6nmol 포함한다)를 첨가해서 37℃에서 90분간 반응시키고, 항체와 225Ac 표지 DOTAGA-DBCO를 결합시켜서, 225Ac 퍼투주맙 복합체를 얻었다. 얻어진 225Ac 퍼투주맙 복합체의 반응 혼합물의 2μL를 빼내고, 박층 크로마토그래피(iTLC-SG, Agilent사, 전개 용매:EDTA 수용액(0.1mol/L)과 아세토니트릴의 혼합액(체적비 1:1)로 분리했다. 전개후의 박층 크로마토그램을 TLC 해석 장치(GITAStar, 엠에스 키키 가부시키가이샤제)에 도입하고, 반응 혼합물 중의 미반응의 225Ac를 포함하는 전225Ac 방사능 카운트 및 225Ac 퍼투주맙 복합체의 방사능 카운트를 각각 측정했다. 전225Ac 방사능 카운트에 대한 225Ac 퍼투주맙 복합체의 방사능 카운트의 백분률은 67.3%였다.
〔비교예 4〕 2단계 방법에 의한 225Ac 트라스트주맙 복합체의 제조
(1)225Ac 표지 DOTAGA-DBCO의 제조
비교예 3(1)과 동일한 순서에 따라 225Ac 표지 DOTAGA-DBCO를 제조했다. 얻어진 225Ac 표지 DOTAGA-DBCO의 반응 혼합물의 2μL를 빼내고, 박층 크로마토그래피(iTLC-SG, Agilent사, 전개 용매:주사용수와 아세토니트릴의 혼합액(체적비 1:1))로 분리했다. 전개후의 박층 크로마토그램을 TLC 해석 장치(GITAStar, 엠에스 키키 가부시키가이샤제)에 도입하고, 반응 혼합물 중의 미반응의 225Ac를 포함하는 전225Ac 방사능 카운트 및 225Ac 표지 DOTAGA-DBCO의 방사능 카운트를 각각 측정했다. 전225Ac 방사능 카운트에 대한 225Ac 표지 DOTAGA-DBCO의 방사능 카운트의 백분률은 98.8%였다.
(2)펩티드 수식 트라스트주맙
실시예 2(1)과 동일한 순서에 따라 펩티드 수식 트라스트주맙을 합성했다.
(3)225Ac 트라스트주맙 복합체의 제조
상기에서 얻어진 225Ac 표지 DOTAGA-DBCO 용액 40μL에 용액 D 0.06mL(1가 항체를 6nmol 포함한다)를 첨가해서 37℃에서 90분간 반응시키고, 항체와 225Ac 표지 DOTAGA-DBCO를 결합시켜서, 225Ac 트라스트주맙 복합체를 얻었다. 얻어진 225Ac 트라스트주맙 복합체의 반응 혼합물의 2μL를 빼내고, 박층 크로마토그래피(iTLC-SG, Agilent사, 전개 용매:EDTA 수용액(0.1mol/L)과 아세토니트릴의 혼합액(체적비 1:1)로 분리했다. 전개후의 박층 크로마토그램을 TLC 해석 장치(GITAStar, 엠에스 키키 가부시키가이샤제)에 도입하고, 반응 혼합물 중의 미반응의 225Ac를 포함하는 전225Ac 방사능 카운트 및 225Ac 트라스트주맙 복합체의 방사능 카운트를 각각 측정했다. 전225Ac 방사능 카운트에 대한 225Ac 트라스트주맙 복합체의 방사능 카운트의 백분률은 67.2%였다.
1단계에서 항체 표지를 행한 실시예 1∼6은 모두 고표지율을 나타냈다. 한편, 2단계에서 표지를 행한 비교예 1∼4는 표지율이 낮고, 2단계에 의한 제조 방법에 비해서 1단계에 의한 제조 방법의 쪽이 우수한 것이 나타내어졌다.
〔비교예 5〕1단계 방법에 의한 225Ac 트라스트주맙 복합체의 제조(미국 특허출원공개 제2015/0157742호 명세서를 참고로 조건 설정)
(1)배위자 수식 트라스트주맙
실시예 2(1) 및 (2)와 동일한 순서에 따라 배위자 수식 트라스트주맙을 합성했다. 합성한 배위자 수식 트라스트주맙을 미리 0.15mol/L 염화나트륨-50mmol/L 아세트산 나트륨 완충액(pH7.2) 10mL를 첨가한 한외 여과 필터(아미콘울트라-15, Merck사제)에 첨가하고, 원심기로 원심했다(원심조건:25℃, 3000xg, 20분). 원심후, 여과액을 버리고, 다시 0.15mol/L 염화나트륨-50mmol/L 아세트산 나트륨 완충액(pH7.2) 13.5mL를 첨가해서 동 조건으로 원심했다. 이 원심은 합계로 4회 행하고, 최후에 0.15mol/L 염화나트륨-50mmol/L 아세트산 나트륨 완충액(pH7.2)으로 희석함으로써, 1가 항체 농도가 5mg/mL인 배위자 수식 항체 용액(이하 「용액 F」라고 하는 경우가 있다)을 얻었다.
(2)225Ac 트라스트주맙 복합체의 제조
선행 기술 문헌의 개시 조건을 참고로 하기와 같이 225Ac 트라스트주맙 복합체를 (1)의 배위자 수식 트라스트주맙을 이용하여 제조했다.
오크리지 국립 연구소로부터 구입한 225Ac(NO3)3이 들어간 바이알에 0.2mol/L의 염산을 첨가해서 피펫팅으로 저면을 중심으로 잘 씻어 넣고, 마이크로 튜브에 방사능으로서 0.288MBq(액량 5μL) 분주했다. 이 마이크로 튜브에 주사용수 5μL, 100mmol/L Tris 완충액(pH9.0) 500μL를 첨가하고, pH9.0의 225Ac3+ 이온 용액(반응액 중의 방사능 농도:0.56MBq/mL) 510μL를 얻었다. pH는 pH 시험지에 의해 측정했다.
상기 225Ac3+ 이온 용액에 용액 F를 20μL 첨가해서 40℃에서 15분 가열해서 225Ac 트라스트주맙 복합체를 합성하고, 실시예 3(2)와 마찬가지로 박층 크로마토그래피법에 의해 반응 혼합물을 분석한 결과, 전225Ac 방사능 카운트에 대한 225Ac 트라스트주맙 복합체의 방사능 카운트의 백분률을 측정했다. 그 결과는 10.0%였다.
〔비교예 6〕1단계 방법에 의한 225Ac 트라스트주맙 복합체의 제조(미국 특허출원공개 제2012/0220754호 명세서)
(1)배위자 수식 트라스트주맙
실시예 2(1) 및 (2)와 동일한 순서에 따라 배위자 수식 트라스트주맙을 합성했다. 합성한 배위자 수식 트라스트주맙을 미리 생리식염수 10mL를 첨가한 한외 여과 필터(아미콘울트라-15, Merck사제)에 첨가하고, 원심기로 원심했다(원심조건:25℃, 3000xg, 20분). 원심후, 여과액을 버리고, 다시 생리식염수 13.5mL를 첨가해서 동 조건으로 원심했다. 이 원심은 합계로 4회 행하고, 최후에 생리식염수로 희석함으로써, 1가 항체 농도가 10mg/mL인 배위자 수식 항체 용액(이하 「용액 G」라고 하는 경우가 있다)을 얻었다.
(2)225Ac 트라스트주맙 복합체의 제조
선행 기술 문헌의 개시 조건을 참고로 하기와 같이 225Ac 트라스트주맙 복합체를 (1)의 배위자 수식 트라스트주맙을 이용하여 제조했다.
오크리지 국립 연구소로부터 구입한 225Ac(NO3)3이 들어간 바이알에 0.2mol/L의 염산을 첨가해서 피펫팅으로 저면을 중심으로 잘 씻어 넣고, 마이크로 튜브에 방사능으로서 0.272MBq(액량 75μL) 분주했다. 이 마이크로 튜브에 주사용수 225μL, 3mol/L 아세트산 나트륨 완충액 100μL, 포화 겐티진산 용액 20μL를 첨가하고, 225Ac3+ 이온 용액(반응액 중의 방사능 농도:0.65MBq/mL) 420μL를 얻었다. pH는 pH 시험지에 의해 측정하고, 5.5로부터 7.0의 범위내인 것을 확인했다.
상기 225Ac3+ 이온 용액에 용액 G를 100μL 첨가해서 37℃에서 90분 가열해서 225Ac 트라스트주맙 복합체를 합성하고, 실시예 3(2)와 마찬가지로 박층 크로마토그래피법에 의해 반응 혼합물을 분석한 결과, 전225Ac 방사능 카운트에 대한 225Ac 트라스트주맙 복합체의 방사능 카운트의 백분률을 측정했다. 그 결과는 17.9%였다.
1단계에서 225Ac 표지를 행한 실시예 3∼6은 모두 고표지율을 나타냈다. 한편, 선행 기술 문헌의 조건을 바탕으로 설정한 조건으로 표지를 행한 비교예 5∼6은 표지율이 낮고, 선행 기술 문헌에 의한 제조 방법에 비해서 본 발명의 1단계에 의한 제조 방법의 쪽이 우수한 것이 나타내어졌다.
〔실시예 7〕응집 억제제 첨가 조건에서의 89Zr 트라스트주맙 복합체의 제조
(1)배위자 수식 트라스트주맙의 합성
실시예 2(1) 및 (2)와 동일한 순서에 따라 배위자 수식 트라스트주맙을 합성하고, 용액 E를 얻었다.
(2)표지반응
89Y(p, n)89Zr의 핵반응에 의해 얻어지고, 89Zr4+ 이온 수용액(니혼 메지피직스사제)으로 조제된 89Zr을 바이알에 첨가해서, 용매를 증류 제거했다.
상기 바이알에 0.1mol/L의 염산을 814μL 첨가하고, 피펫팅으로 저면을 중심으로 잘 씻어 넣고, 89Zr4+ 이온을 1000MBq/mL로 포함하는 용액을 얻었다. 이 용액 20μL를 마이크로 튜브에 분주하고, 0.1mol/L 염산 40μL와, 응집 억제제로서 주사용수 또는 300mmoL/L로 조정한 소르비톨, 크실로오스, 글루코오스, 트레할로스, 수크로오스 수용액 중 어느 하나 300μL와, 주사용수 210μL를 첨가한 후, 1mol/L 수산화나트륨 수용액을 첨가함으로써 pH3.0의 89Zr4+ 이온 용액 570μL(반응액 중의 방사능 농도:35MBq/mL)를 얻었다. pH는 pH 시험지에 의해 측정했다.
상기 89Zr4+ 이온 용액에 용액 E 30μL(1가 배위자 수식 트라스트주맙을 3nmol 포함한다)를 첨가함으로써, 반응액 중의 1가 배위자 수식 트라스트주맙의 농도를 5μmol/L로 하고, 보르텍스 믹서로 교반했다. 이어서, 블록 히터를 이용하여 70℃에서 30분간 가열하고, 89Zr4+ 이온을 배위자 수식 트라스트주맙의 배위자에 배위시키고, 89Zr 트라스트주맙 복합체를 합성했다.
(평가)
사이즈 배제 크로마토그래피(SEC) 분석에 있어서, RI 검출기를 사용한 크로마토그램을 취득해서 표지율을 평가했다. 또 SEC 분석에 있어서, UV 검출기를 사용한 크로마토그램을 취득해서 응집체의 비율을 평가함으로써 응집 억제제에 의한 항체의 안정화 효과를 검증했다. 액체 크로마토그래피 장치로서 Waters사제의 e2695형 세퍼레이션 모듈을 사용하고, UV 검출기로서 Waters사제의 2489형 UV/Vis 검출기를 사용하고, RI 검출기로서 Raytest사제의 Gabi Star 검출기를 사용하고, 하기의 조건으로 분석했다. 또, RI 검출기를 사용한 크로마토그램 중의 전피크 면적값에 대한 89Zr 트라스트주맙 복합체의 피크 면적값의 면적 백분률을 표지율로 했다. 또한, UV 검출기를 사용한 크로마토그램 중의 89Zr 트라스트주맙 복합체의 피크(이하 「주피크」라고 하는 경우가 있다.), 그 이외로서 검출되는 피크를 응집체의 피크로 했다.
제조 종료후(0일점) 및 14일간 보존했을 경우의 각각의 표지율을 표 1에, 각 성분의 비율을 표 2에 나타낸다. 실시예 2와 비교해서 배위자 수식 항체의 농도가 낮기 때문에, 표지율은 저하되어 있지만, 모두 표지율 50%를 초과하고 있고, 응집 억제제를 첨가한 경우에도, 응집 억제제를 첨가하지 않는 경우에 비해서 20% 이상 표지율이 저하되는 일은 없었다. 또한 14일간 보존했을 때, 응집 억제제를 첨가하지 않는 경우에 비해서 응집 억제제를 첨가한 경우에서는 응집체의 형성이 억제되었다.
〔HPLC 조건〕
컬럼:TOSOH TSKgel guardcolumnSWXL(6mm×4cm), TOSOH TSKgel G3000SWXL(5μm, 7.8×30cm)
컬럼 온도:25℃ 부근의 일정 온도
이동상:0.2mol/L 아르기닌 염산염 함유 0.1mol/L 인산 2수소나트륨 완충액(pH6.8)
유량:매분 1.0mL
면적 측정 범위:15분
검출 파장(UV):280nm
검출 범위(RI):50∼803keV
〔항원 결합 활성의 평가〕
항원 결합 활성은 in vitro 오토라디오그래피(ARG)로 확인했다. ATCC(American Type Culture Collection)로부터 구입한 HER2 양성의 인간 난소암 세포주인 SK-OV-3 세포 및 HER2 음성의 인간 유방암 세포주인 MDA-MB-231 세포를 자성 BALB/c nu/nu 마우스(니혼 챨스리버사제)의 협복 피하에 각각 5×106cells 및 1×107cells 투여해서 담암 마우스를 제작했다. 그 후에 SK-OV-3 종양 및 MDA-MB-231 종양을 적출해서 티슈테크 O.C.T. 컴파운드(사쿠라파인테크재팬사제)에 포매해서 동결 절편을 제작했다. 1% 소 혈청 알부민 함유 PBS에 실시예 1 및 비교예 1에서 얻어진 방사성 복합체를 각각 5kBq/mL가 되도록 첨가하고, SK-OV-3 종양 절편 및 MDA-MB-231 종양 절편을 침지했다. 절편을 이메이징 플레이트에 콘택트한 후, 스캐너 타입 화상 해석 장치(GE 헬스 케어 재팬제, Typhoon FLA 7000)로 판독하고, 절편에 결합한 방사능량을 평가했다. 결과를 도 1에 나타낸다. 그래프의 종축은 사용한 종양 절편에 설정한 ROI내의 카운트값을 ROI의 면적으로 제산한 값을, 표준선원의 카운트값을 ROI의 면적으로 제산한 값으로 보정한 값을 나타내고, 횡축은 평가에 사용한 종양 절편의 세포종을 나타낸다. 그래프는 각 샘플내에 설정한 ROI의 평균값±표준편차를 나타낸다. 실시예 1 및 비교예 1의 기재에 따라서 제조한 방사성 복합체에 있어서, HER2에 대한 결합 활성이 확인되었다. 실시예 1 및 비교예 1에 따라서 제조한 방사성 복합체는 SK-OV-3 종양 절편에만 결합되고, HER2 선택적인 결합 활성이 확인되었다.
본 출원은 일본에서 출원된 특원 2022-057723(출원일:2022년 3월 30일)을 기초로 하고 있고 이들의 내용은 본 명세서에 모두 포함되는 것이다.

Claims (10)

  1. 방사성 금속 핵종과 항체의 복합체의 제조 방법으로서,
    방사성 금속 핵종과, 배위자 화합물로 수식된 항체를 물을 포함하는 반응액 중에서 반응시켜서, 상기 방사성 금속 핵종을 상기 배위자 화합물에 배위시키는 공정을 구비하고,
    상기 반응액은 pH 완충제가 비함유이며, 또한 pH가 2 이상 10 이하인 복합체의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 방사성 금속 핵종이 68Ga, 89Zr, 90Y, 111In, 177Lu 및 225Ac로부터 선택되는 적어도 1종인 복합체의 제조 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 방사성 금속 핵종이 89Zr이며, 또한 상기 반응액의 pH가 2 이상 4 이하인 복합체의 제조 방법.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 방사성 금속 핵종이 225Ac이며, 또한 상기 반응액의 pH가 5 이상 10 이하인 복합체의 제조 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 반응액에 포함되는 상기 항체의 농도가 1μmol/L 이상 2000μmol/L 이하인 제조 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 반응액을 30℃ 이상 80℃ 이하로 가열해서 상기 방사성 금속 핵종을 상기 배위자 화합물에 배위시키는 복합체의 제조 방법.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 반응액은 수크로오스, 트레할로스, 만니톨, 말토오스, 락토오스, 아라비노오스, 크실로오스, 소르비톨, 프룩토오스, 글루코오스, 만노스, 멜레치토스, 및 니스토스로 이루어지는 당류의 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 응집 저해제를 포함하는 복합체의 제조 방법.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 배위자 화합물이 하기 식(1)으로 나타내어지는 복합체의 제조 방법.

    (식 중, R11, R13 및 R14는 각각 독립적으로 -(CH2)pCOOH, -(CH2)pC5H4N, -(CH2)pPO3H2, -(CH2)pCONH2 혹은 -(CHCOOH)(CH2)pCOOH로 이루어지는 기이며, R12 또는 R15 중 일방이 수소원자, 카르복실기, 또는 탄소수 2 혹은 3의 카르복시알킬기이며, 타방이 상기 항체를 수식하기 위한 치환기이며, p가 0 이상 3 이하의 정수이며, R12가 상기 항체를 수식하기 위한 치환기일 때 R15는 수소원자이며, R12가 상기 항체를 수식하기 위한 치환기가 아닐 때 R15는 상기 항체를 수식하기 위한 치환기이다.)
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 배위자 화합물이 링커를 통해 상기 항체의 Fc 영역을 부위 특이적으로 수식하고 있는 복합체의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 항체가 인간 IgG 항체이며,
    상기 링커가, 하기 식(Y)으로 나타내어지는 13 이상 17 이하의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩티드를 포함하고, 가교제로 수식된 상기 펩티드와 상기 항체의 가교반응에 의해 형성되어 있는 복합체의 제조 방법.
    (Xa)-Xaa1-(Xb)-Xaa2-(Xc)-Xaa3-(Xd)‥(Y)
    (식 중, Xa, Xb, Xc 및 Xd는 각각 연속하는 a개의 X, 연속하는 b개의 X, 연속하는 c개의 X, 및 연속하는 d개의 X를 나타내고, X는 측쇄에 티올기 및 할로아세틸기를 모두 갖지 않는 아미노산 잔기이며, a, b, c 및 d는 각각 독립적으로 1 이상 5 이하의 정수이며, 또한 a+b+c+d≤14를 만족하고, Xaa1 및 Xaa3은 각각 독립적으로 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산으로부터 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, 또는 일방이 측쇄에 티올기를 갖는 아미노산으로부터 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, 타방이 측쇄에 할로아세틸기를 갖는 아미노산으로부터 유래하는 아미노산 잔기를 나타내고, Xaa1과 Xaa3이 연결되어 있고, Xaa2는 리신 잔기, 아르기닌 잔기, 시스테인 잔기, 아스파르트산 잔기, 글루탐산 잔기, 2-아미노수베르산 잔기, 또는 디아미노프로피온산 잔기이며, 상기 가교제로 수식되어 있다.)
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