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TWI837077B - 藉由IgG結合肽之部位特異性RI標識抗體 - Google Patents

藉由IgG結合肽之部位特異性RI標識抗體 Download PDF

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TWI837077B
TWI837077B TW106119410A TW106119410A TWI837077B TW I837077 B TWI837077 B TW I837077B TW 106119410 A TW106119410 A TW 106119410A TW 106119410 A TW106119410 A TW 106119410A TW I837077 B TWI837077 B TW I837077B
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正山祥生
林明希男
中田德仁
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國立大學法人鹿兒島大學
日商日本醫事物理股份有限公司
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Abstract

本發明係關於包含可與放射性金屬核種結合之配位基的IgG結合肽、經放射性金屬核種標識之IgG結合肽、該IgG結合肽與IgG之複合體、及含有該IgG結合肽或複合體的核醫學影像診斷劑或癌症之診斷劑等。

Description

藉由IgG結合肽之部位特異性RI標識抗體
本發明係關於包含可與放射性金屬核種結合之配位基的IgG結合肽、經放射性金屬核種標識之IgG結合肽、該IgG結合肽與IgG之複合體、及含有該IgG結合肽或複合體的核醫學影像診斷劑或癌症之診斷劑等。
自先前以來，抗體便在各種研究、開發中，於靶分子之檢測中被較多地利用，且作為檢測試劑或診斷試劑，亦於產業方面變得極其重要。又，就其對於靶分子之特異性之方面而言，抗體亦作為用以治療疾病之醫藥品而受到關注。 為了對抗體附加功能，經由碘化或加成螯合化合物(非專利文獻1)等而利用放射性同位素進行標識。迄今為止，該等修飾主要經由抗體中所含之離胺酸之胺基或半胱胺酸之巰基、及活化之羧基等而進行，該等針對官能基具有特異性，但並非部位特異性，因此存在如下問題：由於對抗體之抗原結合部位之修飾等而使抗體之活性降低等問題，或難以控制所結合之化合物數量等問題。 為了克服此種問題，使用部位特異性地導入有特定官能基之抗體，而對抗體進行修飾。例如，藉由基因工程改型而將非天然胺基酸(非專利文獻2～4)或游離之半胱胺酸(非專利文獻5～6)導入至特定部位，藉此能夠實現特定部位之修飾。如上所述般不斷開發部位特異性抗體修飾技術，但在多數情況下，需要以抗體工程之方式改型抗體其自身，認為隨著該改型而造成抗體之功能降低或開發成本增高，而並非有利之方法。 [先前技術文獻] [非專利文獻] [非專利文獻1]Rodwell, J. D. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1986, 83, pp.2632 - 2636 [非專利文獻2]Axup, J. Y. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2012, 109, pp. 16101 - 16106 [非專利文獻3]Tian, F. et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111, pp. 1766 - 1771 [非專利文獻4]Zimmerman, E. S. et al., Bioconjugate chemistry, 2014, 25, pp. 351 - 361 [非專利文獻5]Shen, B. Q. et al., Nature biotechnology, 2012, 30, pp. 184 - 189 [非專利文獻6]Bernardes, G. J. et al., Nature protocols, 2013, 8, pp. 2079 - 2089
因此需要可特異性且簡便地對抗體進行修飾之方法。 為了解決上述課題，本發明者等人基於IgG結合肽與IgG Fc之複合體之X射線晶體結構分析，詳細地研究了結合狀態下之IgG結合肽之各胺基酸之位置與IgG Fc之各胺基酸之位置關係。進而，將可與交聯劑結合之胺基酸導入至肽中，藉由交聯劑對該胺基酸進行修飾，藉此製備藉由交聯劑而部位特異性地進行了修飾之IgG結合肽，發現使用其可對IgG進行修飾。又，本發明者發現可將經放射性金屬核種標識之IgG結合肽與IgG之複合體用作癌症之診斷劑，從而完成了本發明。 因此，本發明包含以下之實施形態。 (1)一種肽，其包含下述式I： (X1-3 )-C-(X2 )-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3 ) (I) (式中，X分別獨立為半胱胺酸以外之任意胺基酸殘基， C為半胱胺酸殘基， H為組胺酸殘基， Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸， G為甘胺酸殘基， Xaa2為麩胺酸殘基、麩醯胺殘基或天冬醯胺殘基， L為白胺酸殘基， V為纈胺酸殘基，且 W為色胺酸殘基) 所表示之含有13～17個胺基酸殘基之胺基酸序列，且可與人IgG結合，且包含可與放射性金屬核種結合之配位基。 (2)一種肽，其包含下述式I： (X1-3 )-C-(X2 )-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3 ) (I) (式中，X分別獨立為半胱胺酸以外之任意胺基酸殘基， C為半胱胺酸殘基， H為組胺酸殘基， Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸， G為甘胺酸殘基， Xaa2為麩胺酸殘基、麩醯胺殘基或天冬醯胺殘基， L為白胺酸殘基， V為纈胺酸殘基，且 W為色胺酸殘基) 所表示之含有13～17個胺基酸殘基之胺基酸序列，且可與人IgG結合，且經放射性金屬核種標識。 (3)一種肽，其包含下述式V： D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V) (式中， D為天冬胺酸殘基， C為半胱胺酸殘基， G為甘胺酸殘基， L為白胺酸殘基， W為色胺酸殘基， T為蘇胺酸殘基， Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸， Xaa2為丙胺酸殘基、絲胺酸殘基或蘇胺酸殘基， Xaa3為色胺酸殘基或酪胺酸殘基， Xaa4為組胺酸殘基、精胺酸殘基、絲胺酸殘基或蘇胺酸殘基， Xaa5為麩胺酸殘基、麩醯胺殘基、天冬醯胺殘基、精胺酸殘基、或天冬胺酸殘基，且 Xaa6為異白胺酸殘基或纈胺酸殘基)所表示之含有13個胺基酸殘基之胺基酸序列，且可與人IgG結合，且經由配位基而結合有放射性金屬核種。 (4)一種複合體，其係肽與IgG之複合體，且Xaa1經交聯劑修飾，該複合體係藉由上述所記載之肽與IgG之交聯反應而形成。 (5)一種核醫學影像診斷劑或癌症之診斷劑，其包含於肽上結合有放射性金屬核種的如(2)或(3)之肽或如(4)之複合體。 (6)一種確定受驗體有無罹患癌症之方法，其包含如下步驟： 使取自受驗體之樣品與於肽上結合有放射性金屬核種的如(2)或(3)之肽或如(4)之複合體反應之步驟； 測定樣品中之源自放射性金屬核種之放射能之能級或存在之步驟；及 基於放射能之能級或存在，確定受驗體有無罹患癌症之步驟。 (7)一種確定受驗體有無罹患癌症之方法，其包含如下步驟： 將於肽上結合有放射性金屬核種的如(2)或(3)之肽或如(4)之複合體投予至受驗體之步驟； 測定於受驗體中，源自放射性金屬核種之放射能之能級或存在之步驟；及 基於放射能之能級或存在，確定受驗體有無罹患癌症之步驟。 本說明書包含成為本申請之優先權之基礎之日本專利申請編號2016-117395號、2016-227025號之揭示內容。 本發明之IgG結合肽可容易地與放射性金屬核種結合，因此藉由使用本發明之IgG結合肽，可利用放射性金屬核種特異性且簡便地對IgG進行標識。又，本發明之IgG結合肽由於無需改變抗體分子之序列，故而不會隨著抗體分子之基因改型而導致功能降低。進而，無需先前所必需之利用放射性金屬核種對IgG進行直接標識之反應；又，不會因該反應導致抗體之功能降低。
＜IgG結合肽＞ 於一態樣中，本發明係關於包含可與放射性金屬核種結合之配位基之IgG結合肽。IgG結合肽中之配位基之位置並無特別限定，例如可連結於IgG結合肽之N末端或C末端、較佳為N末端。使配位基與肽連結之方法為業者所周知。例如，於使配位基連結於IgG結合肽之N末端之情形時，只要將N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS)、異硫氰基(ITC)、磺醯氯、羧醯氯、環氧乙烷、烷基氯、醛基、及羧酸酐等反應基加成於配位基上，使其與IgG結合肽之N末端之胺基反應即可。或者，亦可藉由周知之合成法等直接合成含有此種配位基之IgG結合肽。 作為本發明之IgG結合肽中所可包含之可與放射性金屬核種結合之配位基，可列舉螯合劑，例如二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、去鐵胺、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺二乙酸、三伸乙基四胺六乙酸(TTHA)、1,4,8,11-四氮雜環十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、吡哆醛二磷酸鹽(DPDP)、TPPS4 、伸乙基雙羥基苯基甘胺酸(EHPG)、六亞甲基二胺四乙酸、二甲基膦基甲烷(DMPE)、亞甲基二磷酸、二巰基丁二酸(DMPA)、及該等之衍生物等，但並不限定於該等。 於一實施形態中，於IgG結合肽上結合有放射性金屬核種。作為放射性金屬核種之例，可列舉111 In(銦)、89 Zr(鋯)、67/68 Ga(鎵)、99m Tc(鎝)、64 Cu(銅)，較佳為列舉111 In、及89 Zr。與IgG結合肽結合之放射性金屬核種可根據IgG結合肽、及後述之IgG結合肽與IgG之複合體之用途而選擇。例如，於癌症之檢測、診斷中可使用111 In、89 Zr、64 Cu、67/68 Ga、及99m Tc，例如可於PET(Positron Emission Tomography，正電子發射斷層攝影術)中使用89 Zr及64 Cu，於SPECT(Single Photon Emission Computed Tomography，單光子發射電腦斷層攝影術)中使用111 In及99m Tc。 放射性金屬核種亦可與IgG結合肽直接結合，但較佳為經由上述螯合劑等配位基而與IgG結合肽結合。關於放射性金屬核種與配位基之較佳之組合，業者可適當進行選擇(例如可參照櫻孔弘及橫山陽編輯，放射藥品學概論)，其例可列舉：111 In與DTPA；89 Zr與去鐵胺；64 Cu與DOTA或NOTA；99m Tc與二甲基膦基甲烷(DMPE)、DTPA、亞甲基二磷酸、二巰基丁二酸(DMPA)、二縮胺基硫脲、或二胺基乙二醇；67/68 Ga與去鐵胺或DTPA衍生物等，較佳為111 In與DTPA；89 Zr與去鐵胺；及64 Cu與DOTA或NOTA，進一步較佳為111 In與DTPA；及89 Zr與去鐵胺，更佳為111 In與DTPA。 關於本發明之IgG結合肽，以下加以詳細說明。 本說明書中所使用之「IgG」係指哺乳動物，例如人類及黑猩猩等靈長類，大鼠、小鼠、及兔等實驗動物，豬、牛、馬、綿羊、及山羊等家畜動物，以及狗及貓等玩賞動物之IgG，較佳為人類之IgG(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)。本說明書中之IgG進而較佳為人IgG1、IgG2、或IgG4、或者兔IgG，特佳為人IgG1、IgG2、或IgG4。 於一態樣中，本發明之IgG結合肽包含下述式I： (X1-3 )-C-(X2 )-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3 ) (I) (式中，X分別獨立為半胱胺酸以外之任意胺基酸殘基， C為半胱胺酸殘基， H為組胺酸殘基， Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸， G為甘胺酸殘基， Xaa2為麩胺酸殘基、麩醯胺殘基或天冬醯胺殘基， L為白胺酸殘基， V為纈胺酸殘基，且 W為色胺酸殘基) 所表示之含有13～17個胺基酸殘基之胺基酸序列，且可與人IgG結合。 於上述式中，N末端或C末端之X1-3 之記法係指1～3個半胱胺酸(C或Cys)以外的獨立之任意胺基酸殘基X連續，構成其之胺基酸殘基可相同或為不同之殘基，較佳為包含3個均不相同之殘基之序列。同樣地，X2 亦指2個半胱胺酸(C或Cys)以外的獨立之任意胺基酸殘基X連續，構成其之胺基酸殘基可相同或為不同之殘基，較佳為包含該2個連續之胺基酸殘基為不同殘基之序列。 式I之2個半胱胺酸殘基可進行雙硫鍵結而形成環狀肽。通常情況下，於式I之肽中，(於Xaa1為半胱胺酸殘基之情形時，不為Xaa1)外側之2個半胱胺酸殘基進行雙硫鍵結。或者，於式I之肽中，外側之2個半胱胺酸殘基中之硫基亦可藉由以下之式： [化1]所表示之連接子而連結。上述式中之虛線部分表示與硫基之鍵結部分。與通常之雙硫鍵相比而言，該連接子對於還原反應等穩定。因此，該連接子例如可於使用鋯等可使雙硫鍵不穩定化之放射性金屬核種時較佳地使用。 該肽例如可藉由以下之方法而獲得： 該方法包含如下步驟：將含有2個以上、較佳為2個半胱胺酸殘基之肽與以下之式： [化2]所表示之化合物(式中，R1 及R2 各自獨立為任意之鹵素原子)加以混合，獲得2個以上、較佳為2個半胱胺酸殘基中之硫基藉由以下之式： [化3]所表示之連接子連結之肽。上述式中之虛線部分表示與硫基之鍵結部分。 上述化合物中，R1 及R2 選自由較佳為F、Cl、Br、及I、進而較佳為Cl、Br、及I所組成之群。R1 及R2 較佳為相同，進而較佳為R1 及R2 均為Cl。 本方法中之混合步驟之條件只要為於肽之半胱胺酸殘基間產生連結反應之條件，則並無特別限定。例如，可於適當之緩衝液、例如含有氯化胍之緩衝液中，於室溫(例如約15℃～30℃)下將肽與上述化合物進行混合，藉此進行反應。該混合步驟可視需要加入適量之促進連結反應之觸媒而進行。 本方法之混合步驟中之肽與化合物之混合比率並無特別限定。肽與化合物之莫耳比率例如可設為1：0.2～1：10、較佳為1：0.5～1：5或1：1～1：2。 該混合步驟中之混合時間(反應時間)只要於肽之半胱胺酸殘基間產生連結反應則並無限定，例如可設為1分鐘～5小時、較佳為10分鐘～2小時或15分鐘～1小時。 本方法亦可視需要進而包含如下步驟：自進行上述步驟之後之混合物中分離雜質、例如未反應之肽及化合物等，對半胱胺酸殘基所連結之肽進行精製之步驟。該步驟可藉由本領域中所公知之方法、例如凝膠過濾層析法、離子交換管柱層析法、親和層析法、逆相管柱層析法、及HPLC(High Performance Liquid Chromatography，高效液相層析法)等層析法等而進行。 於式I之肽之胺基酸序列中進而特定胺基酸殘基X之式I'及式I''所表示之肽如下所示。 即，式I'所表示之肽包含 (X1-3 )-C-(X1 )-Y-H-(Xaa1)-G-N-L-V-W-C-(X1-3 ) (I') (式中，X分別獨立為半胱胺酸以外之任意胺基酸殘基， C為半胱胺酸殘基， Y為酪胺酸殘基， H為組胺酸殘基， Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸， G為甘胺酸殘基， N為天冬醯胺殘基， L為白胺酸殘基， V為纈胺酸殘基，且 W為色胺酸殘基) 所表示之含有13～17個胺基酸殘基之胺基酸序列。 式I''所表示之肽包含 (X1-3 )-C-A-(X1 )-H-(Xaa1)-G-E-L-V-W-C-(X1-3 ) (I'') (式中，X分別獨立為半胱胺酸以外之任意胺基酸殘基， C為半胱胺酸殘基， A為丙胺酸殘基， H為組胺酸殘基， Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸， G為甘胺酸殘基， E為麩胺酸殘基， L為白胺酸殘基， V為纈胺酸殘基，且 W為色胺酸殘基) 所表示之含有13～17個胺基酸殘基之胺基酸序列。 又，於式I之肽之胺基酸序列中進而特定胺基酸殘基X之式II所表示之肽如下所示。 即，式II所表示之肽包含 (X1-3 )-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3 ) (II) (式中，X分別獨立為半胱胺酸以外之任意胺基酸殘基， C為半胱胺酸殘基， H為組胺酸殘基， Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸， G為甘胺酸殘基， Xaa2為麩胺酸殘基、麩醯胺殘基或天冬醯胺殘基， L為白胺酸殘基， V為纈胺酸殘基， W為色胺酸殘基， Xaa3為丙胺酸殘基、絲胺酸殘基或蘇胺酸殘基，且 Xaa4為酪胺酸殘基或色胺酸殘基) 所表示之含有13～17個胺基酸殘基之胺基酸序列。 於上述式I'、式I''及式II之肽之胺基酸序列中，設為17個胺基酸殘基之情形時，自N末端起第1個及第2個以及第16個及第17個胺基酸殘基X亦可缺失，此種肽包含13個胺基酸長。 於本說明書中所使用之所謂「設為17個胺基酸殘基之情形時」係於藉由胺基酸編號稱呼肽之胺基酸殘基時，式I之肽係自最長之胺基酸長之17個殘基之N末端起，自第1個至第17個依序對其附加編號，從而方便地表現之用語。 又，於式I之肽之胺基酸序列中進而特定胺基酸殘基X之式III所表示之肽如下所示。 即，式III所表示之肽包含 (X1-3 )-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3 ) (III) (式中，X分別獨立為半胱胺酸以外之任意胺基酸殘基， C為半胱胺酸殘基， A為丙胺酸殘基， Y為酪胺酸殘基， H為組胺酸殘基， Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸， G為甘胺酸殘基， Xaa2為麩胺酸殘基、或麩醯胺殘基， L為白胺酸殘基， V為纈胺酸殘基，且 W為色胺酸殘基) 所表示之含有13～17個胺基酸殘基之胺基酸序列。 於上述式III之肽之胺基酸序列中，設為17個胺基酸殘基之情形時，自N末端起第1個及第2個、以及第16個及第17個胺基酸殘基X亦可缺失，此種肽亦可包含13個胺基酸長。 進而，上述各式之肽之胺基酸序列的半胱胺酸(C)以外之胺基酸殘基、即設為17個胺基酸殘基之情形時之自N末端起第1～3、5、6、15～17個之各胺基酸殘基較佳為選自以下者。此處，各大寫字母係胺基酸之一字母表述： 第1個胺基酸殘基=S、G、F、R、或無 第2個胺基酸殘基=D、G、A、S、P、高半胱胺酸、或無 第3個胺基酸殘基=S、D、T、N、E或R、 第15個胺基酸殘基=S、T或D、 第16個胺基酸殘基=H、G、Y、T、N、D、F、高半胱胺酸、或無、 第17個胺基酸殘基=Y、F、H、M、或無。 第5個胺基酸殘基=A或T、 第6個胺基酸殘基=Y或W。 又，於式I之肽之胺基酸序列中進而特定胺基酸殘基X之式IV所表示之肽如下所示。 即，式IV所表示之肽包含 D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV) (式中， D為天冬胺酸殘基， C為半胱胺酸殘基， H為組胺酸殘基， Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸， G為甘胺酸殘基， Xaa2為麩胺酸殘基、麩醯胺殘基或天冬醯胺殘基， L為白胺酸殘基， V為纈胺酸殘基， W為色胺酸殘基， T為蘇胺酸殘基， Xaa3為丙胺酸殘基或蘇胺酸殘基，且、 Xaa4為酪胺酸殘基或色胺酸殘基)所表示之含有13個胺基酸殘基之胺基酸序列。 於以下之1)～18)中列舉式I之肽之若干具體例，但當然並不受該等限制： 1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT (序列編號1)、 2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (序列編號2)、 3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS (序列編號3)、 4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH (序列編號4)、 5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (序列編號5)、 6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (序列編號6)、 7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (序列編號7)、 8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH (序列編號8)、 9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH (序列編號9)、 10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY (序列編號10)、 11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY (序列編號11)、 12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY (序列編號12)、 13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH (序列編號13)、 14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H (序列編號36) 15)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT (序列編號14)、 16)DCAYH(Xaa1)GNLVWCT (序列編號15)、 17)DCTYH(Xaa1)GELVWCT (序列編號16)、及 18)DCAWH(Xaa1)GELVWCT (序列編號17)、 (式中，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸，Xaa2為高半胱胺酸，較佳為高半胱胺酸彼此相互形成雙硫鍵)。 作為式I之肽之較佳具體例，可列舉： 1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT (序列編號1)、 2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (序列編號2)、 13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH (序列編號13)、及 14)G(Xaa2)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa2)H (序列編號36)； 作為特佳之例，可列舉2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH (序列編號2)(式中，Xaa1為離胺酸殘基，Xaa2為高半胱胺酸，較佳為半胱胺酸彼此及/或高半胱胺酸彼此相互形成雙硫鍵)。 又，於一態樣中，本發明之IgG結合肽之廣義之一級結構包含下述式V： D-C-(Xaa2)-(Xaa3)-(Xaa4)-(Xaa1)-G-(Xaa5)-L-(Xaa6)-W-C-T (V) (式中， D為天冬胺酸殘基， C為半胱胺酸殘基， G為甘胺酸殘基， L為白胺酸殘基， W為色胺酸殘基， T為蘇胺酸殘基， Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸， Xaa2為丙胺酸殘基、絲胺酸殘基或蘇胺酸殘基， Xaa3為色胺酸殘基或酪胺酸殘基， Xaa4為組胺酸殘基、精胺酸殘基、絲胺酸殘基或蘇胺酸殘基， Xaa5為麩胺酸殘基、麩醯胺殘基、天冬醯胺殘基、精胺酸殘基、或天冬胺酸殘基，且 Xaa6為異白胺酸殘基或纈胺酸殘基)所表示之含有13個胺基酸殘基之胺基酸序列。 式V之2個半胱胺酸殘基可進行雙硫鍵結而形成環狀肽。通常情況下，式V之肽之(於Xaa1為半胱胺酸殘基之情形時，不為Xaa1)外側之2個半胱胺酸殘基進行雙硫鍵結。或者，於式V之肽中，外側之2個半胱胺酸殘基中之硫基亦可藉由以下之式： [化4]所表示之連接子而連結。上述式中之虛線部分表示與硫基之鍵結部分。與通常之雙硫鍵相比，該連接子對於還原反應等穩定。因此，該連接子例如可於使用鋯等可使雙硫鍵不穩定化之放射性金屬核種時較佳地使用。該肽可藉由本說明書中所記載之方法而製備。 於以下之18)～29)中列舉式V之肽之若干具體例，但當然並不受該等限制： 18)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT (序列編號18)、 19)DCAYT(Xaa1)GNLVWCT (序列編號19)、 20)DCSYT(Xaa1)GNLVWCT (序列編號20)、 21)DCTWT(Xaa1)GNLVWCT (序列編號21)、 22)DCTYH(Xaa1)GNLVWCT (序列編號22)、 23)DCTYR(Xaa1)GNLVWCT (序列編號23)、 24)DCTYS(Xaa1)GNLVWCT (序列編號24)、 25)DCTYT(Xaa1)GNLVWCT (序列編號25)、 26)DCTYT(Xaa1)GELVWCT (序列編號26)、 27)DCTYT(Xaa1)GRLVWCT (序列編號27)、 28)DCTYT(Xaa1)GDLVWCT (序列編號28)、及 29)DCTYT(Xaa1)GNLIWCT (序列編號29)、 (式中，Xaa1為離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸)。 如上所述，本發明之上述式之肽之特徵在於：於各胺基酸序列中具有相隔之至少2個半胱胺酸(C)殘基，且以可於該半胱胺酸殘基間形成雙硫鍵之方式配置有半胱胺酸殘基；較佳之肽亦可2個半胱胺酸殘基進行雙硫鍵結而形成環狀肽，且於各半胱胺酸殘基之N末端側及C末端側具有1或2個半胱胺酸以外之任意胺基酸殘基。於各半胱胺酸殘基之N末端側及C末端側具有1或2個胺基酸殘基之情形時，設為17個胺基酸殘基之情形時之自N末端起第1～2、16～17個各胺基酸殘基為上述例示者。 如上所述，於本發明之肽中，Xaa1係離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、及麩胺酸殘基等蛋白質構成胺基酸、以及二胺基丙酸及2-胺基辛二酸等非蛋白質構成胺基酸，較佳為離胺酸殘基。Xaa1較佳為可藉由後述之交聯劑而修飾。於本說明書中，所謂「非蛋白質構成胺基酸」係指不用於在生物體中構成蛋白質之胺基酸。為了提高藉由交聯劑而修飾本發明之肽時之部位特異性，本發明之肽較佳為於其序列中完全不具有、或幾乎不具有(例如，僅具有1個或2個)與Xaa1相同之殘基。例如，於Xaa1為離胺酸殘基之情形時，本發明之肽較佳為於其序列中，於Xaa1以外之位置完全不具有、或幾乎不具有離胺酸殘基。 與其他人類免疫球蛋白(IgA、IgE、IgM)相比，本發明之肽之與人IgG之結合親和性高約10倍以上、較佳為約50倍以上、更佳為約200倍以上。本發明之肽與人IgG之結合相關之解離常數(Kd)可藉由表面電漿子共振光譜分析(例如使用BIACORE系統)而確定，例如為1×10-1 M～未達1×10-3 M、較佳為未達1×10-4 M、更佳為未達1×10-5 M。 本發明之IgG結合肽與IgG之Fc區結合。如後述之實施例中所示般，本發明之IgG結合肽於上述Xaa1中，鄰近IgG Fc之特定區域、即人IgG Fc中之依照EU編號之Lys248殘基(以下，於本說明書中亦簡記為「Lys248」，相當於人IgG CH2(序列編號30)之第18個殘基)或Lys246殘基(以下，於本說明書中亦簡記為「Lys246」，相當於人IgG CH2(序列編號30)之第16個殘基)、較佳為Lys248。 本發明之肽可藉由慣用之液相合成法、固相合成法等肽合成法、利用自動肽合成機之肽合成等(Kelley et al., Genetics Engineering Principles and Methods, Setlow, J.K. eds., Plenum Press NY. (1990)Vol.12, p.1 - 19; Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis (1989) W.H. Freeman Co.; Houghten, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1985) 82: p. 5132;「新生化學實驗講座1 蛋白質IV」(1992)日本生化學會編，東京化學同人)而製造。或者，亦可藉由使用編碼本發明之肽之核酸的基因重組法或噬菌體顯示法等而製造肽。例如可藉由將編碼本發明之肽之胺基酸序列的DNA組入至表現載體中，導入至宿主細胞中進行培養而製造目標肽。所製造之肽可藉由常用方法，例如凝膠過濾層析法、離子交換管柱層析法、親和層析法、逆相管柱層析法、HPLC等層析法、硫酸銨分餾、超過濾、及免疫吸附法等進行回收或精製。 於肽合成中，例如準備保護各胺基酸(無論天然或非天然)之所欲結合之α-胺基與α-羧基以外之官能基的胺基酸類，於各個胺基酸之α-胺基與α-羧基之間進行肽鍵形成反應。通常情況下，使位於肽之C末端之胺基酸殘基之羧基經由適當之間隔子或連接子而與固相結合。將以上述方式獲得之二肽之胺基末端之保護基選擇性去除，於與下一胺基酸之α-羧基之間形成肽鍵。連續進行此種操作而製造側基得到保護之肽，最後將所有之保護基去除，自固相進行分離。保護基之種類或保護方法、肽結合法之詳細內容於上述文獻中有詳細記載。 利用基因重組法之製造例如可藉由包含如下步驟之方法而進行：將編碼本發明之肽之DNA插入至適當之表現載體中，於適當之宿主細胞中導入載體，對細胞進行培養，自細胞內或自細胞外液回收目標肽。載體並無限定，例如為質體、噬菌體、黏接質體、噬菌粒、及病毒等載體。作為質體載體，並無限定，可列舉源自大腸桿菌之質體(例如pET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)、源自枯草桿菌之質體(例如pUB110、pTP5等)、及源自酵母之質體(例如YEp13、YCp50等)等。作為噬菌體載體，並無限定，可列舉T7噬菌體顯示載體(T7Select10-3b、T7Select1-1b、T7Select1-2a、T7Select1-2b、T7Select1-2c等(Novagen))、及λ噬菌體載體(Charon4A、 Charon21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP、λZAPII等)。作為病毒載體，並無限定，例如可列舉：反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、牛痘病毒、及仙台病毒等動物病毒，以及桿狀病毒等昆蟲病毒等。作為黏接質體載體，並無限定，可列舉：Lorist 6、Charomid9-20、及Charomid9-42等。作為噬菌粒載體，並無限定，例如已知有pSKAN、pBluescript、pBK、及pComb3H等。於載體中，可包含用以使目標DNA表現之調節序列、或用以篩選包含目標DNA之載體的選擇標記物、用以插入目標DNA之多選殖區域等。於此種調節序列中包含啟動子、促進子、終止子、S-D序列或核糖體結合部位、複製開始點、及多聚A部位(Poly(A)site)等。又，選擇標記物例如可使用安比西林耐性基因、新黴素耐性基因、康黴素耐性基因、及二氫葉酸還原酶基因等。用以導入載體之宿主細胞係大腸桿菌或枯草桿菌等細菌、酵母細胞、昆蟲細胞、動物細胞(例如哺乳動物細胞)、及植物細胞等，於該等細胞中之轉形或轉染例如包含磷酸鈣法、電穿孔法、脂轉染法、粒子槍(particle gun)法、及PEG(polyethylene glycol，聚乙二醇)法等。轉形細胞之培養可依照宿主生物之培養中所使用之通常方法而進行。例如，大腸桿菌或酵母細胞等微生物之培養液含有宿主微生物可合成代謝之碳源、氮源、及無機鹽類等。為了使本發明之肽之回收變容易，較佳為使藉由表現而生成之肽分泌至細胞外。其可藉由如下方式進行：使編碼能夠自該細胞分泌肽之肽序列的DNA結合於編碼目標肽之DNA之5'末端側。轉移至細胞膜之融合肽被訊息肽酶切斷，而將目標肽分泌放出至培養基。或者，亦可回收細胞內所儲積之目標肽。於此情形時，對細胞進行物理或化學性破壞，使用蛋白質精製技術而回收目標肽。 因此，本發明進而亦關於編碼本發明之肽之核酸。此處，核酸包含DNA或RNA(例如mRNA)。 於使本發明之IgG結合肽與其他蛋白質融合之情形時，可於分別製備IgG結合肽與其他蛋白質之後，視需要使用連接子而使IgG結合肽與蛋白質融合，亦可藉由基因重組法，視需要加入適當之連接子而製成融合蛋白質。於此情形時，較佳為以無損與IgG之結合性之方式由本發明之IgG結合肽製作融合蛋白質。 ＜經交聯劑修飾之肽＞ 於一態樣中，本發明中之上述IgG結合肽較佳為經交聯劑修飾。 如上所述，本發明之IgG結合肽如後述之實施例中所示般，於上述Xaa1中，鄰近IgG Fc之特定區域、即人IgG Fc中之依照EU編號之Lys248或Lys246、較佳為Lys248。因此，藉由交聯劑對本發明之IgG結合肽之Xaa1進行修飾，使其與IgG進行交聯反應，藉此可於IgG結合肽之Xaa1與IgG Fc之Lys248或Lys246、較佳為Lys248之間部位特異性地形成交聯結構。如上所述，藉由交聯劑及各種化合物對本發明之IgG結合肽之Xaa1進行修飾，使其與IgG進行交聯反應，藉此可將各種化合物特異性且簡便地導入至IgG中。又，根據本發明，可經由IgG結合肽而導入化合物，因此可將各種結構之化合物導入至IgG中。進而，本發明之方法由於所獲得之產物之產率較高，又，不伴隨抗體其本身之改型，因此亦具有使抗體之功能減低之可能性較低之優點。 本發明之IgG結合肽亦可對於人類以外之動物、較佳為哺乳動物之IgG使用。於此情形時，關於本發明之IgG結合肽所結合之IgG中之部位，只要為閱讀本說明書之業者，則例如可藉由將人IgG之序列與其他動物之IgG之序列進行對照而容易地特定。 於本發明中，所謂「交聯劑」係用以使本發明之IgG結合肽與IgG Fc藉由共價鍵而連結之化學物質。關於本發明之交聯劑，業者可進行適當選擇，可設為具有至少2處能夠與所期望之胺基酸(例如離胺酸殘基、半胱胺酸殘基、天冬胺酸殘基、麩胺酸殘基、2-胺基辛二酸、或二胺基丙酸、及精胺酸等)鍵結之部位的化合物。其例並無限定，可列舉：DSG(disuccinimidyl glutarate，二丁二醯亞胺基戊二酸酯)、DSS(disuccinimidyl suberate、二丁二醯亞胺基辛二酸酯)等含有較佳為2個以上丁二醯亞胺基之交聯劑，DMA(dimethyl adipimidate・2HCl、己二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DMP(dimethyl pimelimidate・2HCl、庚二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、及DMS(dimethyl suberimidate・2HCl、辛二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)等含有較佳為2個以上醯亞胺酸部分之交聯劑，以及DTBP(dimethyl 3,3'-dithiobispropionimidate・2HCl、3,3'-二硫代雙丙亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)及DSP(dithiobis(succinimidyl propionate)、二硫代雙丁二醯亞胺基丙酸)等具有SS鍵之交聯劑。 本發明之IgG結合肽亦可藉由其他功能性物質、例如IgA或VHH等抗體、標識物質及/或其他藥劑而修飾。IgG結合肽與其他功能性物質之連結可藉由業者所公知之方法、例如疊氮基與二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne)之反應、或馬來醯亞胺基與氫硫基之反應等而進行。於藉由標識物質進行標識之情形時，本發明之IgG結合肽與IgG形成複合體，藉此能夠經由該標識物質進行IgG之檢測或定量。標識物質並無限定，例如包含上述放射性同位素金屬核種、螢光色素、化學發光色素、以及生物素及GFP(綠色螢光蛋白質)等螢光蛋白質、發光蛋白質、以及過氧化酶等酵素，較佳之標識物質之例係螢光素及FITC(Fluorescein Isothiocyanate，螢光異硫氰酸鹽)等螢光素衍生物、玫瑰紅及四甲基玫瑰紅等玫瑰紅衍生物、以及德克薩斯紅等螢光色素。於藉由其他藥劑對本發明之肽進行修飾之情形時，藥劑並無限定，例如可列舉：奧利他汀(Auristatin)、美登素、多柔比星、博萊黴素、或該等之衍生物等抗癌劑；以及與血-腦障壁上之受體結合而能夠向中樞神經轉移之藥劑、或與癌細胞等結合而能夠向抗體之細胞內轉移之藥劑等靶向製劑。 經本發明之交聯劑修飾之IgG結合肽例如可藉由使依照上述＜IgG結合肽＞之項目中所記載之方法而獲得之IgG結合肽與交聯劑進行反應而製造。於此情形時，需要對IgG結合肽中之上述Xaa1之胺基酸殘基之側鏈進行特異性修飾，其例如可藉由選擇Xaa1之種類與交聯劑之組合而實現。例如，DSS或DSG等含有丁二醯亞胺基之交聯劑與存在於離胺酸殘基之側鏈及多肽之N末端之一級胺反應，因此在將IgG結合肽之N末端阻斷後與DSS或DSG反應，藉此可由DSS或DSG僅對離胺酸殘基之側鏈進行特異性修飾。關於此種胺基酸殘基與交聯劑之組合，業者可進行適當選擇。 經本發明之交聯劑修飾之IgG結合肽例如亦可藉由如下方式而製造：使用經交聯劑修飾之胺基酸殘基而進行肽合成。同樣地，於藉由標識物質及/或其他藥劑修飾IgG結合肽之情形時，亦可使用經過該等修飾之胺基酸殘基而進行肽合成，藉此製備經標識物質及/或其他藥劑修飾之IgG結合肽。 又，本發明之IgG結合肽為了使其穩定性提高等，例如亦可藉由N末端之PEG化(加成聚乙二醇)、及C末端之醯胺化等進行修飾。於進行PEG化之情形時之PEG之分子數並無特別限定，例如可加成1～50分子、1～20分子、2～10分子、2～6分子、或4分子之PEG。 ＜交聯反應＞ 於一態樣中，本發明係關於生產IgG結合肽與IgG之複合體之方法，該方法包含將本發明之經交聯劑修飾之IgG結合肽與IgG進行混合之步驟。藉由本步驟，可於經交聯劑修飾之IgG結合肽與IgG之間產生交聯反應。交聯反應尤其可於IgG結合肽之上述Xaa1之胺基酸殘基與IgG Fc之Lys248或Lys246、較佳為Lys248之間部位特異性地發生。 該混合步驟之條件只要為於本發明之IgG結合肽與IgG之間產生交聯反應之條件下進行者，則並無特別限定。例如，可藉由將本發明之IgG結合肽與IgG於適當之緩衝劑中、室溫(例如約15℃～30℃)下加以混合而進行反應。該混合步驟亦可視需要加入適量之促進交聯反應之觸媒而進行。 該混合步驟中之本發明之IgG結合肽與IgG之混合比率並無特別限定。本發明之IgG結合肽與IgG之莫耳比率例如可設為1：1～20：1，較佳為設為2：1～20：1或5：1～10：1。 該混合步驟中之混合時間(反應時間)只要可於本發明之IgG結合肽與IgG之間產生交聯反應，則並無限定，例如可設為1分鐘～5小時，較佳為設為10分鐘～2小時或15分鐘～1小時。 生產本發明之IgG結合肽與IgG之複合體之方法可視需要進而包含如下步驟：自進行上述步驟之後之混合物中分離雜質，例如未反應之IgG結合肽、IgG、及試劑等，對該複合體進行精製之步驟。該步驟可藉由本領域中所公知之方法，例如凝膠過濾層析法、離子交換管柱層析法、親和層析法、逆相管柱層析法、及HPLC等層析法等進行。 ＜複合體＞ 於一態樣中，本發明係關於本發明之IgG結合肽與IgG之複合體。該複合體可藉由上述交聯反應而形成。因此，本發明較佳為關於一種IgG結合肽與IgG之複合體，其係IgG結合肽之上述Xaa1之胺基酸殘基與IgG Fc之Lys248或Lys246、較佳為Lys248部位特異性地經由交聯劑進行結合而成。 本發明之複合體係藉由部位特異性之交聯反應而形成，因此該交聯反應對IgG之活性造成負面影響之可能性小。又，藉由將經修飾之IgG結合肽與IgG連結，可對IgG附加新的功能性。例如，與附加有111 In、89 Zr、64 Cu、67/68 Ga、及99m Tc等放射性金屬核種之IgG結合肽連結的IgG可用於癌症之檢測、診斷用途。於此情形時，IgG可根據癌症種類而適當選擇，例如若為乳癌則可使用曲妥珠單抗(Trastuzumab)，若為大腸癌則可使用西妥昔單抗(Cetuximab)。 ＜核醫學影像診斷劑或癌症之診斷劑、以及核醫學影像診斷法或確定有無罹患癌症之方法＞ 於一態樣中，本發明係關於一種核醫學影像診斷劑或癌症之診斷劑，其包含結合有放射性金屬核種之上述IgG結合肽、經上述交聯劑修飾之IgG結合肽、或經上述交聯劑修飾之IgG結合肽與IgG之複合體。 本發明之核醫學影像診斷劑可用於測定生物體內之各種物質之分佈狀況及/或體內動態。例如，本發明之包含IgG結合肽與IgG之複合體之核醫學影像診斷劑可用於測定成為IgG之標靶之炎症標記物等抗原之分佈狀況、及IgG抗體自身之體內動態。 作為成為本發明之癌症之診斷劑之對象的癌，並無限定，例如可列舉：乳癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌、卵巢癌、大腸癌、例如結腸癌、胃癌、宮頸癌、腦腫瘤、骨髓瘤、骨肉瘤、肺癌、白血病及惡性淋巴瘤等。 本發明之核醫學影像診斷劑或癌症之診斷劑可藉由經口投予或非經口投予(例如靜脈注射、肌肉注射、皮下投予、腹腔內投予、直腸投予、或經黏膜投予等)進行投予。又，本發明之核醫學影像診斷劑或癌症之診斷劑可根據投予路徑而製成適當之劑型。具體而言，可製備為顆粒劑、錠劑、丸劑、膠囊劑、糖漿劑、乳劑、懸浮劑、靜脈注射、動脈注射、或肌肉注射用注射劑、點滴劑、外用劑、或栓劑等各種製劑形態。關於投予方法及劑型，業者可根據患者之性別、年齡、體重、症狀等進行適當選擇。 本發明之核醫學影像診斷劑或癌症之診斷劑可依照常用方法而製劑化(例如參照Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton，美國)，亦可為一併含有醫藥上所容許之載體或添加物者。 作為本發明之核醫學影像診斷劑或癌症之診斷劑中所可含有之載體及醫藥添加物之例，可列舉：水、醫藥上所容許之有機溶劑、膠原蛋白、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、羧基乙烯基聚合物、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸鈉、海藻酸鈉、水溶性聚葡萄糖、羧甲基澱粉鈉、果膠、甲基纖維素、乙基纖維素、三仙膠、阿拉伯膠、酪蛋白、瓊脂、聚乙二醇、雙甘油、甘油、丙二醇、凡士林、石蠟、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、及作為醫藥添加物而容許之界面活性劑等。 實際之添加物可根據本發明之核醫學影像診斷劑或癌症之診斷劑之劑型，自上述中單獨選擇或適當組合而選擇，但並不限定於該等。例如，於作為注射用製劑使用之情形時可使用如下者：將本發明之IgG結合蛋白質或IgG結合蛋白質與IgG之複合體溶解於例如生理鹽水、緩衝液、葡萄糖溶液等溶液中，於其中加入容器吸附抑制劑、例如Tween80、Tween 20、明膠、人血清白蛋白等而成者。或者，為了製成於使用前溶解而再構成之劑型，亦可為經冷凍乾燥者，作為用以冷凍乾燥之穩定劑，例如可使用甘露醇、葡萄糖等糖醇及/或糖類。 本發明之核醫學影像診斷劑或癌症之診斷劑之有效投予量及投予間隔可根據患者之性別、年齡、體重、及症狀等而適當選擇。 於一態樣中，本發明係關於一種確定受驗體有無罹患癌症之方法，其包含如下步驟： 使取自受驗體之樣品與本說明書中所記載之IgG結合肽、或IgG結合肽與IgG之複合體反應之步驟，且係放射性金屬核種與上述IgG結合肽結合之步驟； 測定樣品中之源自放射性金屬核種之放射能之能級或存在之步驟；及 基於放射能之能級或存在，確定受驗體有無罹患癌症之步驟。 於一態樣中，本發明係關於一種檢測受驗體中之抗原或IgG之方法，其包含如下步驟： 使取自受驗體之樣品和本說明書中所記載之IgG結合肽與IgG之複合體反應之步驟，且係放射性金屬核種與上述IgG結合肽結合之步驟； 測定樣品中之源自放射性金屬核種之放射能之能級或存在之步驟；及 基於放射能之能級或存在，檢測抗原或IgG之步驟。 藉由檢測樣品中之抗原或IgG，可推測受驗體中之抗原或IgG之分佈狀況及/或體內動態。 作為本方法中所使用之樣品，可列舉組織及生物樣本。作為組織之例，可列舉：病變部位，例如乳房、肝臟、胰腺、前列腺、卵巢、大腸、例如結腸、胃、宮頸部、骨髓、淋巴結等，例如可使用該等組織之活檢樣品。作為生物樣本之例，例如可列舉：血液、血漿、淋巴液、組織液、尿、以及細胞，例如末梢血液細胞、毛母細胞、口腔細胞、鼻腔細胞、腸細胞、陰道內細胞、黏膜細胞、及痰(可包含肺泡細胞或氣肝細胞等)等，較佳為列舉血液或血漿。 測定放射能之能級或存在之方法並無特別限定，可使用業者所已知之任意方法。例如，可進行SPECT/CT等影像分析，亦可使用閃爍計數器等檢測器測定放射能之能級或存在。 基於放射能之能級或存在，確定或檢測受驗體有無罹患癌症之步驟並無特別限定，可使用業者所已知之任意方法。例如於相對於源自已知未罹患癌症之受驗體之例如2個以上、3個以上、4個以上、較佳為5個以上之複數個樣品，供至本發明之方法的源自受驗體之樣品中之放射能能級顯著較高之情形時，可判斷受驗體罹患癌症之可能性較高。 於一態樣中，本發明係關於一種確定受驗體有無罹患癌症之方法，其包含如下步驟： 將本說明書中所記載之IgG結合肽、或IgG結合肽與IgG之複合體投予至受驗體之步驟，且係放射性金屬核種與上述IgG結合肽結合之步驟； 測定於受驗體中，源自放射性金屬核種之放射能之能級或存在之步驟；及 基於放射能之能級或存在，確定受驗體有無罹患癌症之步驟。 於一態樣中，本發明係關於一種檢測受驗體內之抗原或IgG之方法，其包含如下步驟： 將本說明書中所記載之IgG結合肽與IgG之複合體投予至受驗體之步驟，且係放射性金屬核種與上述IgG結合肽結合之步驟； 測定於受驗體中，源自放射性金屬核種之放射能之能級或存在之步驟；及 基於放射能之能級或存在，檢測抗原或IgG之步驟。 本方法較佳為核醫學影像診斷法。藉由本方法，可推測受驗體中之抗原或IgG之分佈狀況及/或體內動態。 於本方法中，投予方法與關於本發明之核醫學影像診斷劑或癌症之診斷劑所記載者相同，因此省略記載。又，測定放射能之能級或存在之步驟、及確定受驗體有無罹患癌症之步驟如上所述，因此省略記載。 於本說明書中，受驗體之生物種類例如可列舉人類及黑猩猩等靈長類，大鼠、小鼠、兔等實驗動物，豬、牛、馬、綿羊、及山羊等家畜動物，以及狗及貓等玩賞動物，較佳為人類。 [實施例] 一面參照下述實施例一面對本發明進一步加以具體說明，但本發明之範圍並不受該等實施例限制。 [實施例1：IgG結合肽與IgG之複合體之X射線晶體結構分析] ＜方法＞ (1)IgG結合肽溶液之製作 藉由利用F-moc法之肽固相合成法，依照常法而製備具有G(HC)DCAYHRGELVWCT(HC)H-NH2 之序列(序列編號31，其中HC為高半胱胺酸，第4個與第14個之2個Cys、第2個與第16個之2個高半胱胺酸分別於分子內形成雙硫鍵)之環狀高半胱胺酸肽。藉由24 μL之100%二甲基亞碸(和光製藥)溶解所製備之IgG結合肽0.8 mg之粉末，製備IgG結合肽溶液。 (2)Fc與IgG結合肽之複合體之製作 於含有10 mM EDTA及1 mM L-半胱胺酸之20 mmol/L磷酸緩衝液(pH值7.0)中，於37℃下使用木瓜酶(羅氏公司製造)將人IgG(中外製藥)之鉸鏈部分切斷。繼而，使用陽離子交換管柱(TSKgel SP5-PW(東曹))，於流速1 mL/min、20 mM 乙酸鈉緩衝液(pH值5.0)中，藉由0～0.3 M NaCl之梯度溶出而對人IgG Fc進行精製。將含有16 mg/mL之人IgG Fc之63 μL之溶液(0.1 M 氯化鈉(和光製藥)、0.04 M 2-𠰌啉乙磺酸(和光製藥)(pH值6.0))與上述(1)中所製作之IgG結合肽溶液2 μL加以混合，製備Fc與IgG結合肽之複合體溶液。 (3)Fc與IgG結合肽之複合體之結晶之製作 Fc與IgG結合肽之複合體之結晶係藉由坐式(sitting drop)蒸氣擴散法而獲得。即，使用結晶化用機器人HydoraII+(Matrix公司製造)，將上述(2)中所製作之Fc與IgG結合肽之複合體溶液0.3 μL及結晶化劑(20% 聚乙二醇3350 (Sigma-Aldrich)、0.2 M碘化鉀(和光製藥)(pH值6.9))0.3 μL於智慧型結晶化板(Veritas公司製造)之S1孔上加以混合，製成結晶化滴劑。作為貯藏溶液，分注70 μL上述結晶化劑。藉由PowerSeal CRISTAL VIEW(Greiner Bio-One公司製造)將板密封後，於20℃之恆溫槽內靜置約2週，而獲得結晶。 (4)Fc與IgG結合肽之複合體之結晶之X射線繞射強度資料之收集 將上述(3)中所獲得之結晶移至穩定化母液(22%聚乙二醇3350、0.2 M碘化鉀、0.1 M氯化鈉、25%甘油(w/v)、0.04 M 2-𠰌啉乙磺酸(pH值6.0))中，於-170℃之氮氣流下進行急速冷凍，藉由振動法測定X射線繞射資料。於X射線之波長為1埃、振動角為1°/幀下實施。其次，使用繞射強度資料處理程式HKL2000(HKL Research公司製造)，以3.0埃之解析度對繞射強度資料進行處理。其結果，結晶之空間群為P21，晶格常數為a＝66.1埃、b＝60.5埃、c＝69.5埃、α＝γ＝90°、β＝101.3°。所獲得之資料之完整性(Completeness)為99.9%、Rmerge為13.8%。 (5)Fc與IgG結合肽之複合體之晶體結構之確定 針對DCAYHRGELVWCT(序列編號33)，利用CCP4(Collaborative Computational Project Number 4)中所含之程式Phaser對上述(4)中所獲得之繞射強度資料嘗試由分子置換法進行位相確定。分子置換法之檢索模型利用於蛋白質資料庫(Protein Data Bank，PDB、URL:http://www.rcsb.org/pdb/)中作為PDB寄存碼(accession code)：1DN2而登錄之Fc部分之模型。其結果，於非對稱單元中成功發現1分子之模型。其次，反覆實施使用CCP4中所含之結構精密化程式Refmac5之結構精密化與使用模型構築程式X-tal view之模型修正，獲得Fc與IgG結合肽(DCAYHRGELVWCT(序列編號33))之複合體之晶體結構。於Fc之肽結合部位觀察到相當於IgG結合肽之電子密度。所確定之晶體結構之準確性之指標即R因子係0.216。進而，根據於精密化之階段未進行計算之相當於全反射之5%之結構因子所計算之Rfree因子為0.317。 (6)交聯結構模型之製作 基於上述X射線結晶分析之結構，於計算科學軟體MOE(Molecular Operating Environment)上製作交聯結構模型。將DCAYHRGELVWCT(序列編號33)之第6個胺基酸置換為Lys後，以將該Lys之ε胺基與抗體Fc之第248個Lys之ε胺基之間連結之形式，對DSG或DSS之交聯結構進行模型化。 ＜結果＞ 如圖1A所示般，認為IgG結合肽結合於和蛋白質A之結合部位重疊之CH2與CH3區域之邊界區域，且以與已報告之IgG結合肽Fc-III(DeLano, W. L. et al., Science, 2000, 287, pp. 1279-1283)類似之形式與IgG結合。IgG結合肽與Fc之特徵性相互作用為如下方面：IgG結合肽之第8個殘基Arg之側鏈之胍基以2.91埃與Fc之Glu380(基於EU編號。下同)之側鏈之羧酸進行鹽鍵結。該Glu380之側鏈於人IgG Fc中，與ys248進行鹽鍵結而形成分子內之鹽鍵之網路，IgG結合肽之Arg8與Fc之Lys248經由與Fc之Glu380之相互作用而靠近。因此，設計將IgG結合肽之第8個殘基Arg置換為Lys，並以與該鹽鍵之網狀結構類似之形式，藉由交聯劑將肽之Lys8與抗體之Lys248之側鏈之胺基進行交聯。實際上，以IgG結合肽與人IgG Fc之複合體結構為基礎，製作基於DSG(二丁二醯亞胺基戊二酸酯)或DSS(二丁二醯亞胺基辛二酸酯)之交聯結構之模型，結果認為可不伴隨抗體之主鏈結構之扭曲而亦空間性地導入交聯劑(圖1B)。 [實施例2：標識用肽之製備與特性] ＜方法＞ 胺基經生物素(Biotin)或5/6TAMURA丁二醯亞胺酯(AnaSpec, Inc.)(螢光色素)修飾之胺基(amino)-PEG4化合成肽GPDCAYHXGELVWCTFH(序列編號2)(其中，C末端經醯胺化)係藉由Fmoc固相合成法，依照常法而合成。將保護基去除後，於pH值8.5之水溶液中、氧化條件下形成分子內S-S鍵，使用逆相HPLC，於流速1.0 ml/min下，藉由含有0.1% TFA之10%至60%之乙腈之梯度溶出而對分子內具有S-S鍵之肽進行精製。 將含有精製之IgG結合肽1 mM之DMF溶液100 μL與100 mM之DSS或DSG(Thermo Fisher Scientific公司)之乙腈溶液100 μL加以混合後，於室溫下使其反應一夜。藉由0.1% TFA將反應物稀釋為2.5倍後，注入至Waters公司製造之μ Bondasphere 5C18 100埃(直徑3.9 mm×150 mm)中，藉由含有0.1% TFA之4%至60%之乙腈之梯度進行溶出。關於對所獲得之產物加成交聯劑，於連接有BEH300 C18 (1.7 μm、直徑2.1 mm×50 mm)管柱之LC-質譜儀(Mass spectrometry)(Acquity SQD UPLC system，Waters公司)上，藉由含有0.1%甲酸之4%至60%之乙腈之梯度而進行溶出，並藉由波峰之分子量測定而確認。 所獲得之標識化試劑肽之親和性分析可藉由加入10分之一量之1M Tris-HCl(三羥甲基胺基甲烷鹽酸溶液)(pH值=7.0)並使其反應15 min而將NHS基水解後，利用以下方法而進行。於安裝於BIAcoreT200(GE healthcare)上之CM5感測器晶片上，將0.4M EDC(1-ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimide、1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二醯亞胺)與0.1M sulfo-NHS(sulfo-N-hydroxysuccinimide、磺基-N-羥基丁二醯亞胺)等量混合後，以10 μl/ml之流速，歷時7分鐘注入至感測器晶片上，藉此對感測器晶片進行活化，於pH值4.0(10 mM 乙酸鈉)之條件下，以固定化量成為RU值4000～5000之方式對IgG進行固定化。一面使用HBS-EP緩衝液(0.01M HEPES(Hydroxyethylpiperazine Ethane Sulfonic Acid，羥基乙基哌𠯤乙磺酸)、0.15M NaCl、0.005% Tween 20、3 mM EDTA、pH值 7.0)，一面以50 μl/ml之流速，歷時180秒注入10 nM至2 μM之濃度之肽，藉此監控結合反應，其後，藉由緩衝液清洗600 sec，藉此測定解離反應。結合參數之分析係使用BIAevalution T100軟體而進行。 ＜結果＞ 為了研究交聯結構之導入是否對IgG結合肽之特異性及親和性造成影響，藉由SPR(Surface Plasmon Resonance，表面電漿共振)分析對導入有交聯結構之IgG結合肽對IgG之結合力進行測定(表1)。將第8個殘基之精胺酸置換為離胺酸之IgG結合肽(以下亦稱為I型(R8K))對於人IgG之親和性為131 nM (Kd)，與置換前之IgG結合肽(以下亦稱為I型)相比，親和性降低10倍。於I型(R8K)肽上結合有各交聯劑者中，對於人IgG之親和性於I型(R8K)-DSG-OH中為約330 nM(Kd)，於I型(R8K)-DSS-OH中為約390 nM (Kd)，並未發現因結合交聯劑而造成親和性大幅降低。由於任意之肽均具有以Kd值計為μM以下之親和性，因此認為能夠實現充分之具特異性之標識化。 [表1] [實施例3：藉由IgG結合肽之人IgG-Fc之特異性修飾] ＜方法＞ 藉由與實施例2同樣之方法製備藉由DSS或DSG對於N末端加成有生物素-PEG4之IgG結合肽(I型(R8K))進行修飾而成之標識化試劑肽，使其與人IgG Fc反應，研究人IgG Fc之標識化反應。即，利用逆相管柱對藉由與實施例2同樣之方法與過量之DSS或DSG反應之IgG結合肽(R8K)(含200 pmol/5μL之0.1% TFA)進行精製後，於減壓下去除乙腈，然後加入約1/8之0.5M Na2 HPO4 進行中和，立即以莫耳比10倍量加入至蛋白質樣品(hIgG(中外製藥)、hIgA(Athens Research & Technology)、HSA(Sigma-Aldrich)、或血清(采自健康者之血液))(各40 pmol/5 μL，血清使用經PBS稀釋10倍而得者)中，利用PBS將最終量製成20 μL後，於室溫下放置5分鐘。其後，加入1M Tris-HCl(pH值=7.0)1 μl而使反應停止後，加入4xSDS樣品溶液6.7 μl及2-巰基乙醇1.4 μl(最終為5%)，於95℃、10 min之條件下進行處理後，使用預鑄凝膠SuperSepTM Ace，5～20%(和光製藥)進行SDS-PAGE。使用Hoefer Semiphor TE70 Trans-Blot系統，以35 mA、60分鐘將電泳後之凝膠轉印至PMDF膜之後，利用0.5%BSA進行阻斷。經生物素化肽標識之蛋白質係使用SA(Streptavidin，抗生蛋白鏈菌素)-HRP(Horseradish Peroxidase，山葵過氧化酶)偶聯物(稀釋1000倍，載體實驗室(Vector Laboratories))，並藉由化學發光試劑(ImmunoStar (註冊商標)Basic，和光製藥)進行檢測。 ＜結果＞ 如圖2B所示般，於西方墨點法中，僅於與IgG反應之情形時觀察到被視為複合體之條帶，因此可知與DSG或DSS反應後之IgG結合肽均未與IgA或HAS、血清中之IgG以外之蛋白質結合，而選擇性地與IgG結合。 [實施例4：IgG結合肽對IgG之反應條件之研究] ＜方法＞ (1)反應莫耳比之研究 於96孔微量盤(Nunc(註冊商標)MaxiSorp)之孔中，將含有各蛋白質(IgG(中外製藥)、IgA(Athens Research & Technology)、或Bovine gelatin(和光製藥))(50 ng(0.33 pmol)/μl/孔)之0.1M NaHCO3 溶液加入至培養板中，於室溫下放置一夜，藉此使各蛋白質吸附於培養板之表面，藉由0.5 % BSA進行阻斷後，於各孔中加入與實施例2同樣地製備之經DSG修飾之生物素化IgG結合肽(以莫耳比計為0、1、2、5、10)，經過1小時後，加入1M Tris-HCl (pH值7.0)3 μL而使反應停止。加入經0.5 % BSA稀釋2000倍之SΑ-HRP(載體實驗室(Vector Laboratories))50 μL，於室溫下反應一小時後，藉由0.1% PBST清洗5次，然後於HRP之顯色中使用TMB溶液(Wako Chemicals)，進行5分鐘之顯色反應後，藉由ELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay，酵素免疫吸附法)讀板儀(680型微盤讀取器(Bio-Rad))測定450 nm之吸光度。 (2)反應時間之研究 對於藉由50 ng/50 μL之溶液而於4℃下固定化一夜之hIgG (50 ng)，以莫耳比2加入經DSG修飾之生物素化IgG結合肽，於各反應時間(0～60分鐘)時加入1M Tris-HCl (pH值7.0)3 μL而使反應停止。與(A)同樣地進行結合之檢測。 ＜結果＞ 使用DSS標識化IgG結合肽，藉由ELISA研究與抗體反應之莫耳數及反應時間之不同所產生之反應效率(圖3)。即，使固定化於塑膠培養板上之IgG結合肽之莫耳比由1變化為10，使其與hIgG反應，結果莫耳比約為5時可見飽和，因此可認為若加入莫耳比為5左右之肽試劑，則對於抗體之標識化而言即充分(圖3A)。於未經DSS修飾之生物素化IgG結合(R8K)肽(NO DSS R8K)中可見極弱之結合，認為其係藉由以非共價鍵結合之肽所帶來之結合活性。進而，即使過量地加入標識化IgG結合肽試劑，亦完全未檢測出與其他蛋白質(hIgA、牛明膠(Bovine gelatin)或用作阻斷劑之BSA)之結合。 其次，對於使IgG與IgG結合肽以1：2之莫耳比反應時的反應時間進行研究。其結果，於約15分鐘時可見飽和，因此認為反應於15分鐘時基本上結束(圖3B)。 根據以上之結果顯示：經交聯劑修飾之本發明之IgG結合肽可以短時間且特異性地與IgG結合。 [實施例5：藉由螢光IgG結合肽之Fc之標識化] ＜方法＞ 使IgG (中外製藥)、IgA(Athens Research & Technology)、或BSA(Sigma-Aldrich)(15 μg：以IgG換算為100 pmol)與依照實施例2製備之DSG交聯肽或DSS交聯肽(500 pmol)於200 μL中在室溫下反應60 min，加入1M Tris-HCl (pH值=7.0)10 μL而使反應停止。其後，於SuperdexTM200 10/30GL 直徑1.0 cm×30 cm(GE Healthcare)；流速：0.3 ml/min；電泳緩衝液：PBS pH值 7.4下進行尺寸排除層析，使用螢光檢測器 RF-10A(島津製作所)(激發光：541 nm 螢光: 565 nm)進行測定。 ＜結果＞ 使與DSS或DSG反應後之標識化IgG結合肽，以相對於各蛋白質之莫耳比為1：5於室溫下與蛋白質反應60 min，藉由尺寸排除層析法進行分析。使用任意之標識化IgG結合肽(DSS或DSG)時，與IgG之反應性之特異性均為同等程度，完全未檢測出對hIgA或BSA等其他蛋白質之螢光標識化(圖4)。根據以上可知：使用所製作之任意IgG結合肽時，均可以較高之特異性對人IgG進行螢光標識。 [實施例6：藉由IgG結合肽之Fc之修飾物之分析(pH值為4.5)] ＜方法＞ 添加人IgG(中外製藥)之Fc溶液(20 μM、0.1M乙酸緩衝液pH值4.5)200 μL、與溶解於DMF中之藉由與實施例2同樣之方法經DSG修飾之IgG結合肽(RGNCAYHXGQLVWCTYH(序列編號35)，X為離胺酸)(4 mM)0.5、1.0、2.0、5.0 μL(以莫耳比計為0.5、1.0、2.0、5.0)，快速攪拌後，於室溫下反應15分鐘，添加1M Tris-HCl (pH值7.0)10 μL而使反應停止。將反應物50 μL注入至連接有Shodex IEC SP-825管柱之NGC層析系統(Chromatography system)(Bio-Rad)中，進行自25 mM乙酸緩衝液(pH值4.5)至含有1M NaCl之25 mM乙酸緩衝液(pH值4.5)之梯度溶出，由215 nm之吸光度監控蛋白質之溶出。分取所獲得之各波峰，供至利用LC/MS之分子量測定。 於連接有Waters ACQUITY UPLC BEH C8 (1.7 μm 2.1 mm×100 mm)管柱之Shimadzu LCMS-8030中注入所獲得之波峰之溶出分20 μL後，進行自含有0.1%甲酸之4%乙腈至含有0.1%甲酸之60%乙腈之梯度溶出。進行所溶出之波峰之質譜分析，根據使用分析軟體獲得之來自多價離子波峰之解卷積而計算質量。 ＜結果＞ 使人IgG1-Fc與經DSG修飾之IgG結合肽(4 mM，生物素-PEG4-RGNCAYHXGQLVWCTYH-NH2 ；分子量2760，X為DSG化之離胺酸且2個Cys於分子內形成SS鍵)以莫耳比計為0.5、1.0、2.0、或5.0進行反應，結果如圖5A所示般，出現原來之人IgG1-Fc之溶出位置之波峰(波峰2)與2個波峰3、4(認為波峰1係DSG化之IgG結合肽)。為了鑑定該等之分子種類而進行LCMS(Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，液相色譜-質譜)分析。反應前之IgG1-Fc於離子交換層析圖中，於波峰1處溶出，於LCMS分析中獲得55084之值。進行反應後之2、3、4之波峰之LCMS分析，結果分別獲得55087、57735(55087＋2648)、60384(55087＋5297)之值。據此可知反應後之波峰2係未反應之Fc，波峰3與4係於Fc上分別結合有1個及2個肽者。 圖5B係將以各莫耳比進行反應之情形時之未反應(波峰2)、1個肽之加成物(波峰3)、2個肽之加成物(波峰4)之生成量之變化進行曲線圖化而得者。例如，可知於以莫耳比1：1進行反應之情形時，未反應物亦成為20%以下，於莫耳比為1：2時，未反應物為10%以下，產量極高。又，於過量之莫耳比1：5之情形時，2個肽之加成物之生成比率相對增加，但於離子交換層析圖上並未檢測出加成有2個以上之肽之Fc，因此可知該標識反應極具特異性。 [實施例7：pH值與反應時間對於藉由IgG結合肽之Fc之反應之影響] ＜方法＞ 對於以pH值4.0(25 mM乙酸緩衝液)、pH值5.5(25 mM乙酸緩衝液)、或pH值7.0(PBS)所製備之人IgG之Fc溶液200 μL，添加實施例5中所製備之溶解於DMF中之經DSG修飾之IgG結合肽(4 mM)1.0 μL (以莫耳比計為1.0)，快速攪拌後，於室溫下進行反應。於反應後經過1、5、10、或30分鐘時，添加1M Tris-HCl (pH值7.0)10 μL而使反應停止，將反應物50 μL注入至連接有Shodex IEC SP-825管柱之NGC層析系統(Chromatography system)(Bio-Rad)中，進行自25 mM乙酸緩衝液(pH值4.5)至含有1M NaCl之25 mM乙酸緩衝液(pH值為4.5)之梯度溶出，由215 nm之吸光度監控蛋白質之溶出。基於所獲得之層析圖而計算各波峰之比率。 ＜結果＞ 如圖6所示，可知於所試驗之pH值4.0、pH值5.5、及pH值7.0之任一pH值中，標識化反應均迅速進行，且反應之90%以上於1分鐘以內結束。又，於pH值為4.0時，未反應物之殘留量超過40%而反應產率較低，特別是2個肽之加成物(波峰4)之產量為15%左右，與其他pH值之情形(35～40%)相比而言較低。於pH值為5.5及7.0時，未反應物之產量均低至10%左右，可知效率良好地進行了反應。作為pH值5.5與7.0之差，略有發現波峰4之產量於pH值7.0時變低之傾向。 [實施例8：藉由放射性金屬核種之IgG結合肽之標識及使用其之癌症之檢測1] 1)含有DTPA之IgG結合肽之製作 N末之胺基經DTPΑ-tetra(tBu)ester(Diethylenetriaminepentaacetic acid-tetra(tBu)ester，二伸乙基三胺五乙酸四(第三丁基)酯)(CheMatech公司製造)修飾之胺基PEG4化IgG結合肽GPDCAYHKGELVWCTFH(序列編號37，分子內之2個Cys形成SS鍵，C末端經醯胺化)係藉由Fmoc固相合成法，依照常法而合成。於去保護後，將精製之DTPΑ-IgG結合肽溶解於DMSO 20 μL(19 mM)中。於肽溶液中加入溶解於乙腈中之DSG (500 mM)20 μL與吡啶0.2 μL(最終濃度0.5%)，於50℃下使其反應3小時。將總量稀釋為含有0.1%TFA之15%乙腈10 ml，將離心後之上清液注入至InertSustain(註冊商標)C18管柱(7.6 mm 1×250 mm，GL Science)中，以含有0.1% TFA之自15%至80%之乙腈之梯度進行溶出。進行溶出物之質量分析，回收目標物(DSG修飾DTPΑ-PEG4化IgG結合肽)後將溶劑去除，其後進行冷凍乾燥。 2)使含有DTPA之IgG結合肽與曲妥珠單抗結合而成之放射性核種標識抗體「DTPA修飾曲妥珠單抗」之製作 將使上述1)中所製備之DSG修飾DTPΑ-PEG4化IgG結合肽以5.0 mM之濃度溶解於DMSO中而成之溶液1.36 μL、與溶解於10 mM乙酸緩衝液(pH值為5.5)中之6.8 μM之抗人HER2抗體(曲妥珠單抗)(中外製藥)1 mL加以混合，於室溫下進行30分鐘反應(肽與抗體之莫耳比＝1：1)。以上述方式製備之DTPA修飾人類抗體(抗體藥物複合體，ADC)係於陰離子交換管柱Shodex QA825(8.0 mm×75 mm，Shodex)中，藉由含有10 mM三羥甲基胺基甲烷鹽酸緩衝液(pH值7.0)之自0M至0.5M之NaCl之梯度溶出而進行精製。於分取未反應之抗體以外之2個波峰(波峰A、B)後，於Vivaspin (10000 Da截留、Sartorius)上，以3000 g進行離心，藉此進行脫鹽濃縮。所獲得之樣品係藉由MALDI(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization，基質輔助雷射脫附游離)-TOF(Time of Flight，飛行時間)-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG(Bruker Daltonics)測定質量，波峰A與原來之抗人HER2抗體相比增加2716(理論值為2722)，波峰B與原來之抗人HER2抗體相比增加5398(理論值為5444)，因此確認加成有DTPA之DTPΑ-PEG4化IgG結合肽分別導入有1個(抗HER2抗體-DTPA*1)、及2個(抗HER2抗體-DTPA*2)。 3)DTPA修飾曲妥珠單抗之111 In標識、及[111 In]標識DTPA修飾曲妥珠單抗之放射化學純度之確認 藉由微量吸管準確地量取上述2)中所製備之DTPA修飾曲妥珠單抗，放入至容量1.5 mL之微量離心(Eppendorf)管中。於其中加入含有10 mM檸檬酸之0.15M乙酸-氨緩衝液(pH值5.5)。藉由Myjector抽取DTPA修飾曲妥珠單抗溶液總量，放入至15 mL容量之無色玻璃製小瓶中。藉由Myjector抽取與DTPA修飾曲妥珠單抗溶液總量相同量之[111 In]Cl3 溶液，放入至無色玻璃製小瓶中，並充分進行混合。再者，以DTPA修飾曲妥珠單抗相對於[111 In]的莫耳數成為20～100倍之方式進行製備。於室溫下使其反應30分鐘。於反應結束後，藉由放射性同位素劑量校準器測定放射能量。 分別以5 mL微量吸管準確量取1M檸檬酸溶液及1M檸檬酸三鈉溶液，移至100 mL定量瓶中。加入純水而準確地製成100 mL。以微量吸管準確地量取1%EDTA溶液1 mL，移至步驟1之100 mL定量瓶中，進行充分混合。將其作為展開溶劑(用時製備)。於展開容器中，加入展開溶劑直至距容器底部1 cm左右。以微量吸管準確地量取受驗物質3 μL，將濾紙之下端2 cm作為原點，滴加至原點。於滴加後立即使其乾燥。將溶劑前沿設為距原點10 cm，以使下端浸漬於展開溶劑中之方式放入至展開溶劑中。於到達溶劑前沿上端之後立即使其乾燥。藉由放射薄層層析分析儀測定殘留於濾紙上之放射能(條件 計數時間(Counting time)：20 min、能量範圍(Energy Range)：125～285 keV、合併(Binning)：2)，根據原點之峰面積之比率，算出[111 In]標識DTPA修飾曲妥珠單抗之放射化學純度[%]。 於表2中表示使用DTPA結合肽對於一分子曲妥珠單抗之修飾數不同之2種DTPA修飾曲妥珠單抗實施標識研究的結果。如表1所示，對於所有DTPA修飾曲妥珠單抗均可藉由111 In進行標識。 [表2] 4)111 In標識曲妥珠單抗之HER2結合能力及特異性之評價 使用Trypsin-EDTA混合液而回收HER2高表現細胞株SK-OV-3(人源卵巢癌細胞)及HER2低表現細胞株MDΑ-MB-231(人源乳癌細胞)(均自美國菌種保存中心(American Type Culture Collection)獲得)，製作藉由無血清培養基製備為1.5×107 個/mL之細胞懸浮液。以微量吸管準確地量取細胞懸浮液200 μL，放入至容量1.5 mL之微管中進行冰浴冷卻。再者，將樣品數分別設為3。 藉由無血清培養基將上述3)中所製備之111 In標識曲妥珠單抗進行稀釋，以放射能濃度成為10～200 kBq/mL之方式進行製備。 以微量吸管準確地量取製備放射能濃度之含有111 In標識曲妥珠單抗之無血清培養基500 μL，加入至含細胞懸浮液之微管中，與細胞懸浮液充分混合。使其於冰上反應1小時。反應結束後，為了對未經由HER2而非特異性地附著於各細胞之111 In標識曲妥珠單抗加以清洗，而進行離心分離(離心加速度：5000 g、溫度：4℃、時間：5分鐘)，利用微量吸管將上清液去除。其後，加入冷磷酸緩衝液1 mL而進行再懸浮，進行離心分離(離心加速度：5000 g、溫度：4℃、時間：5分鐘)。反覆進行3次該清洗操作。以最終僅殘留顆粒之方式利用微量吸管將上清液完全去除。 以微量吸管準確地量取含有111 In標識曲妥珠單抗之無血清培養基500 μL，加入至容量1.5 mL之塑膠管中。再者，準備僅塑膠管作為空白組(用於測定用來計算下述計算式之淨值(net value)的背景值)。又，將樣品數分別設為3。使用藉由自動井式伽瑪計數器(測定條件：能量範圍：111～252 keV、預設時間：60秒)測定各樣品之放射能量所得之測定值，根據以下之計算式算出[111 In]標識曲妥珠單抗對於各細胞之結合率(%)。 [數1]※計數值均表示淨值(自測定值減去背景值並進行衰減修正而得者)。 將結果表示於表3中。確認出所有之[111 In]標識曲妥珠單抗均具有對HER2之結合能力及特異性。 [表3] 5)藉由SPECT成像分析之[111 In]標識曲妥珠單抗之腫瘤內HER2結合能力及特異性之確認 製作於小鼠(BALB/c，nu/nu，19週齡，♀，各1例)之左右下肢移植有SK-OV-3(HER2高表現細胞株)及MDΑ-MB-231(HER2低表現細胞株)之帶癌模型，進行SPECT/CT成像。於SPECT成像中使用2種[111 In]標識曲妥珠單抗(對於1分子曲妥珠單抗修飾有1分子或2分子DTPA結合肽者)。 (111 In標識曲妥珠單抗之製備)111 In標識曲妥珠單抗係藉由上述「3)DTPA修飾曲妥珠單抗之111 In標識、及[111 In]標識DTPA修飾曲妥珠單抗之放射化學純度之確認」中所記載之方法而製備，並將藉由超過濾法進行了精製者用於以下之實驗。再者，將於1分子抗體內具有1分子DTPA者記為[111 In]標識曲妥珠單抗-1，將於1分子抗體內具有2分子DTPA者記為[111 In]標識曲妥珠單抗-2。 (帶癌模型之製作) 製作於BALB/c nu/nu裸小鼠之左下肢移植有HER2高表現細胞株SK-OV-3，於右下肢移植有HER2低表現細胞株MDΑ-MB-231的帶癌模型。再者，各細胞移植於同一個體中。裸小鼠係自Japan SLC股份有限公司購入，使用6隻6週齡之雌鼠。於成像實施日當天測定各腫瘤體積，選出2例具有適於成像實驗之腫瘤體積之模型。又，該等小鼠所使用之各癌細胞係分別使用自美國菌種保存中心獲得者。 (SPECT/CT攝像) (SPECT攝像) 於移植後13週，自模型尾靜脈投予[111 In]標識曲妥珠單抗-1溶液(3.83 MBq)或[111 In]標識曲妥珠單抗-2 (2.64 MBq)溶液。自投予後4小時以後利用SPECT/CT相機(產品名：FX3000 Pre-Clinical Imaging System)實施拍攝。以後，於投予後24小時、48小時之時間點實施拍攝。 (CT攝像) CT攝像係為了確認各腫瘤組織同時容納於SPECT攝像之視野內而於SPECT攝像之前實施。利用異氟醚進行麻醉導入，於維持麻醉之狀態下安置於動物床上。將該模型放入CT裝置內而照射X射線，以腫瘤成為視野中心之方式實施定位。CT攝像係於以下所示之攝影條件下實施，從而獲得腫瘤之CT影像(raw檔案)。 投影計數(Project count)：200視圖 平均幀數(Frames averaged)：1幀/視圖 檢測合併(Detector binning)：2×2 X射線管電流(X-ray tube current)：預設(150 μA) X射線管電壓(X-ray tube voltage)：60 kV 曝光時間(Exposure time)：230 ms 放大率(Magnification)：1.8 藉由Trifoil Console對所獲得之raw檔案進行再構成(再構成條件：Half Res)，藉由影像顯示軟體對再構成影像進行進一步轉換而製作DICOM檔案，將該等檔案利用影像分析軟體(產品名PMOD 3.6)進行讀取而顯示影像，用於以後之分析中。 (SPECT/CT影像分析) 於投予[111 In]標識曲妥珠單抗-1溶液或[111 In]標識曲妥珠單抗-2溶液後之各時間點製作SPECT及CT之融合影像，並以冠狀面表示。 於表4中記載活體內(in vivo)實驗中所使用之模型之詳細情況、及所投予之[111 In]標識曲妥珠單抗-1、[111 In]標識曲妥珠單抗-2之資訊。 [表4] 將SPECT之拍攝條件示於表5，將影像再構成條件示於表6。 [表5] [表6] 於SPECT/CT攝像後製作SPECT及CT之融合影像，並以冠狀面表示。將經投予[111 In]標識曲妥珠單抗-1及[111 In]標識曲妥珠單抗-2之SPECT/CT攝像之結果示於圖7、8及9中。 於將[111 In]標識曲妥珠單抗-1及[111 In]標識曲妥珠單抗-2分別投予6小時及投予後4小時之時進行拍攝，將所拍攝之SPECT/CT影像作為含有腫瘤之切片影像而示於圖7。雖然發現[111 In]標識曲妥珠單抗-1及[111 In]標識曲妥珠單抗-2向HER2高表現腫瘤組織集聚，但於HER2低表現腫瘤組織中並未發現集聚。再者，雖然發現[111 In]標識曲妥珠單抗-1非特異性地集聚於尾部，但其原因在於：於投予時，一部分溶液漏出至血管外。 將[111 In]標識曲妥珠單抗-1及[111 In]標識曲妥珠單抗-2之投予後24小時、48小時之SPECT/CT影像作為含有腫瘤之切片影像而示於圖8。SPECT影像係以[111 In]標識曲妥珠單抗-1之投予後24小時之時間點的拍攝時刻為基準而實施衰減修正，並與標度值一同表示。雖然發現[111 In]標識曲妥珠單抗-1及[111 In]標識曲妥珠單抗-2向HER2高表現腫瘤組織之集聚，但於HER2低表現腫瘤組織中並未發現集聚。又，於任意之時間點均係[111 In]標識曲妥珠單抗-1向HER2高表現腫瘤組織之集聚高於[111 In]標識曲妥珠單抗-2。 於將[111 In]標識曲妥珠單抗-1及[111 In]標識曲妥珠單抗-2分別投予後6小時及投予後4小時之時進行拍攝，將所拍攝之SPECT/CT影像作為含有肝臟之切片影像而示於圖9。關於投予早期之向肝臟之集聚，[111 In]標識曲妥珠單抗-2高於[111 In]標識曲妥珠單抗-1。再者，肝臟之位置係藉由上部為胸腔而判斷。 [實施例9：藉由二氯丙酮之具有SS交聯結構之IgG結合肽之製備] 於肽合成顆粒(Rink-amide-Chemmatrix resin，Biotage)上，藉由Fmoc固相合成法，依照常法合成N末乙醯化RRC(Acm保護)-PEG4化合成肽GPDCAYHXGELVWCTFH(序列編號2，X為離胺酸，C末端經醯胺化)。於自樹脂切出肽並進行去保護之後，獲得肽(圖10、a)。將所獲得之肽65 mg(15.6 μmol)溶解於含有6 M Gn・HCl之磷酸緩衝液(pH值=7.3)5 mL中，於其中加入溶解於乙腈120 μL中之1,3-二氯-2-丙酮(2.9 mg，23.4 μmol，1.5當量莫耳)，於室溫下進行攪拌。1小時後，藉由HPLC分析確認反應結束，直接藉由HPLC對反應溶液進行精製，藉此獲得環化肽(圖10、b，33 mg，7.8 μmol，產率50%)。對於該環化肽，添加懸浮於90%乙酸水溶液(8.8 mL)中之乙酸銀(30.8 mg, 184.5 μmol)，於室溫下、遮光下攪拌5小時。加入二硫蘇糖醇(DTT；352 mg，2.3 mmol)，藉由離心分離將所生成之沈澱去除，藉由HPLC對所獲得之上清液進行精製，藉此獲得環化肽(圖10、c，20.5 mg，5.2 μmol，產率67%)。 [實施例10：藉由放射性金屬核種之IgG結合肽之標識及使用其之癌症之檢測2] ＜方法＞ 1)含有去鐵胺之IgG結合肽之製作 N末之胺基經去鐵胺-四(第三丁基)酯(tetra(tBu)ester)(CheMatech公司製造)修飾之胺基PEG4化IgG結合肽GPDCAYHKGELVWCTFH(序列編號37，分子內之2個Cys形成SS鍵，C末端經醯胺化)係藉由Fmoc固相合成法，依照常法而合成。於去保護後，將精製之去鐵胺-IgG結合肽溶解於DMSO 40 μL(18 mM)中。於肽溶液中加入溶解於乙腈中之DSG(500 mM)40 μL與吡啶0.5 μL(最終濃度0.6%)，於50℃下反應3小時。將總量稀釋為含有0.1%TFA之15%乙腈10 ml，將離心後之上清液注入至InertSustain(註冊商標)C18管柱(6.0×250 mm，GL Science)中，以含有0.1% TFA之自10%至66%之乙腈之梯度進行溶出。進行溶出物之質量分析，回收目標物(DSG修飾去鐵胺-PEG4化IgG結合肽)後，將溶劑去除，其後進行冷凍乾燥。 2)使含有去鐵胺之IgG結合肽與曲妥珠單抗結合而成之放射性核種標識抗體「去鐵胺修飾曲妥珠單抗」之製作 將上述1)中製備之DSG修飾去鐵胺-PEG4化IgG結合肽以13 mM之濃度溶解於DMSO中而成之溶液10 μL、與溶解於10 mM乙酸緩衝液(pH值5.5)中之22 μM之抗人HER2抗體(曲妥珠單抗)(中外製藥)1 mL加以混合，於室溫下進行2小時反應(肽與抗體之莫耳比＝6：1)。以上述方式製備之去鐵胺修飾人類抗體(抗體藥物複合體，ADC)係於陰離子交換管柱QΑ-825(8.0 mm×75 mm，Shodex)中，藉由含有10 mM三羥甲基胺基甲烷-鹽酸緩衝液(pH值7.0)之自0 M至0.5 M之NaCl之梯度溶出而進行精製。於分取未反應之抗體以外之2個波峰(波峰A、B)後，於Vivaspin(註冊商標)(10000 Da截留，Sartorius)上，以3000 g進行離心，藉此進行脫鹽濃縮。所獲得之樣品係藉由MALDI-TOF-MAS autoflex speed TOF/TOF-KG(Bruker Daltonics)測定質量，波峰A與原來之抗人HER2抗體相比增加2716(理論值為2722)，波峰B與原來之抗人HER2抗體相比增加5398(理論值為5444)，因此確認加成有去鐵胺之去鐵胺-PEG4化IgG結合肽分別於曲妥珠單抗中導入有1分子或2分子。 3)去鐵胺修飾曲妥珠單抗之89 Zr標識及精製 將89 Zr以成為200 MBq/200 μL之方式溶解於1M草酸溶液中。於微管中加入200 μL之89 Zr-草酸溶液、90 μL之2M碳酸鈉，於室溫下放置3分鐘。於放置3分鐘後之微管中，一面攪拌一面加入1030 μL之含有5 mg/mL龍膽酸之0.5M HEPES緩衝液(pH值7.1～7.3)。於該溶液650 μL中加入上述2)中所製備之去鐵胺修飾曲妥珠單抗(1價或2價)300 μL並進行混合，藉由pH值試紙確認反應小瓶中之反應液之pH值為pH值6.8～7.2。於確認pH值後，於室溫下反應1小時。其後，藉由20 mL之含有5 mg/mL龍膽酸之0.25 M乙酸鈉(pH值5.4～5.6)對PD-10管柱進行溶劑交換後，將89 Zr標識溶液供至PD-10管柱(GE Healthcare)。加入1.5 mL之含有5 mg/mL龍膽酸之0.25 M乙酸鈉(pH值5.4～5.6)，將溶出液廢棄。加入2 mL之含有5 mg/mL龍膽酸之0.25M乙酸鈉(pH值5.4～5.6)，每次0.2 mL地分取溶出液。收集含有放射能之區分，利用超過濾用離心管柱(Amicon Ultra，Merck Millipore公司製造)進行濃縮操作。使用逆相修飾矽膠薄層層析(TLC)板、TLC矽膠 60 RP-18 F254s(Merck Millipore)，將50 mM EDTA (pH值5.0)作為展開溶劑而展開89 Zr標識溶液。將展開後之TLC板暴露於成像板(FujiFilm)上，藉由螢光影像分析儀(FLA-7000，GE Healthcare公司製造)獲得自動放射照片。根據所獲得之自動放射照片之原點之峰面積之比率，算出[89 Zr]標識曲妥珠單抗(1價或2價)之放射化學純度[%]。 4)89 Zr標識曲妥珠單抗之投予及PET成像 製作於小鼠(BALB/c-nu/nu，♀，13週齡)之左右下肢移植有SK-OV-3(HER2高表現細胞株)及MDΑ-MB-231(HER2低表現細胞株)(均自美國菌種保存中心獲得)之帶癌模型，進行PET成像。於PET成像時使用依照上述3)製備之2種[89 Zr]標識曲妥珠單抗(對於1分子曲妥珠單抗，修飾有1分子或2分子去鐵胺結合肽者)。再者，將1分子抗體內具有1分子去鐵胺者記為[89 Zr]標識曲妥珠單抗-1，將1分子抗體內具有2分子去鐵胺者記為[89 Zr]標識曲妥珠單抗-2。 自模型尾靜脈投予[89 Zr]標識曲妥珠單抗-1溶液或[89 Zr]標識曲妥珠單抗-2溶液。自投予後6小時以後，藉由PET相機(產品名：Clairvivo(註冊商標)PET)實施拍攝。其後，於投予後24小時及48小時之時間點實施拍攝。於PET影像之再構成法中使用3D-DRAMA法。 於表7中彙總活體內(in vivo)實驗中所使用之模型之詳細情況、及所投予之[89 Zr]標識曲妥珠單抗-1、[89 Zr]標識曲妥珠單抗-2之資訊。 [表7] 於表8中表示各時間點之拍攝時間。於各時間點之拍攝時間設定中考慮各標識物之投予量及放射能之衰減。 [表8] ＜結果＞ 於將[89 Zr]標識曲妥珠單抗-1及[89 Zr]標識曲妥珠單抗-2分別投予後6、24及48小時之時進行拍攝，將所拍攝之PET影像作為含有腫瘤之切片影像而示於圖11。如圖11所示，發現[89 Zr]標識曲妥珠單抗-1及[89 Zr]標識曲妥珠單抗-2對HER2高表現腫瘤組織之集聚高於HER2低表現腫瘤組織。 本發明之IgG結合肽可容易地與放射性金屬核種結合，因此，藉由放射性金屬核種，可特異性且簡便地、且無損其功能地標識IgG。經放射性金屬核種標識之IgG可用於癌症之診斷。 本說明書中所引用之所有刊物、專利及專利申請可直接藉由引用而併入至本說明書中。
圖1(A)係表示IgG結合肽(C35A-3/15：DCAYHRGELVWCT(序列編號33))與人IgG Fc之複合體之結構。IgG結合肽係由空間填充模型表示，IgG Fc係由帶狀模型表示，Fc之糖鏈係由線模型表示。圖1(B)表示經DSG修飾之IgG結合肽(C35A-3/15(R8K)：DCAYHKGELVWCT(序列編號34))與IgG Fc之交聯結構之模型。肽之主鏈係由帶狀模型表示。肽-Lys8表示C35A-3/15(R8K)之第6個離胺酸殘基，肽-Tyr6-Gly9表示C35A-3/15(R8K)之第4個酪胺酸殘基至第7個甘胺酸殘基。又，Fc-Lys248係表示依照EU編號之Fc之Lys248，Fc-Pro247-Asp249係表示依照EU編號之Fc之Pro247至Asp249。 圖2表示標識化IgG結合肽與各種蛋白質之混合物之SDS-PAGE(A)及西方墨點法(B)之結果。圖中，DSG表示將與DSG(二丁二醯亞胺基戊二酸酯)反應後之IgG結合肽供至試驗，DSS表示將與DSS(二丁二醯亞胺基辛二酸酯)反應後之IgG結合肽供至試驗。又，圖中，hIgG表示人IgG，hIgA表示人IgA，HSA表示人血清白蛋白。 圖3表示標識化IgG結合肽與IgG之反應中的反應莫耳比(A)及反應時間(B)之基於ELISA之研究結果。DSS R8K 0 min係於IgG之10倍莫耳比之標識化IgG結合肽中加入Tris-HCl (pH值7.0)而將NHS基阻斷後添加至孔者。No DSS R8K表示使用未結合DSS之生物素化IgG結合(R8K)肽，no pep表示未加入肽之對照組。 圖4表示使用尺寸排除層析法測定標識化IgG結合肽對各蛋白質(hIgA、hIgG、BSA(牛血清白蛋白))之反應性之結果。(A)表示測定經DSS修飾之IgG結合肽之反應性之結果，(B)表示測定經DSG修飾之IgG結合肽之反應性之結果。 圖5(A)表示加入相對於人IgG以莫耳比計為0.5、1.0、2.0、或5.0之人IgG之Fc溶液、及溶解於DMF中之經DSG修飾之IgG結合肽，進行攪拌後，於室溫下使其反應後之液相層析法之結果。圖5(B)係表示以各莫耳比使人IgG與經DSG修飾之IgG結合肽反應之情形時的未反應(波峰2)、1個肽之加成物(波峰3)、及2個肽之加成物(波峰4)之生成量之變化者。 圖6係表示對於以pH值4.0(A)、pH值5.5(B)、或pH值7.0(C)製備之人IgG之Fc溶液，加入以莫耳比計為1.0之溶解於DMF中之經DSG修飾之IgG結合肽，於攪拌後，於室溫下使其反應，反應之1、5、10、或30分鐘後的未反應(波峰2)、1個肽之加成物(波峰3)、及2個肽之加成物(波峰4)之生成量之變化者。 圖7表示投予[111 In]標識曲妥珠單抗-1經過6小時後之包含腫瘤部位之SPECT/CT影像(A)及CT影像(B)、以及投予[111 In]標識曲妥珠單抗-2經過4小時後之包含腫瘤部位之SPECT/CT影像(C)。 圖8表示投予[111 In]標識曲妥珠單抗-1經過24小時後(A)及48小時後(B)之包含腫瘤部位之SPECT/CT影像、以及投予[111 In]標識曲妥珠單抗-2經過24小時後(C)及48小時後(D)之包含腫瘤部位之SPECT/CT影像。 圖9表示投予[111 In]標識曲妥珠單抗-1經過6小時後(A)、及投予[111 In]標識曲妥珠單抗-2經過4小時後(B)之包含肝臟之SPECT/CT影像。 圖10表示實施例9中所製備之藉由二氯丙酮之具有SS交聯結構之IgG結合肽之合成流程。 圖11表示投予[89 Zr]標識曲妥珠單抗-1或2經過6小時後、24小時後、及48小時之包含腫瘤部位之PET影像。實線箭頭表示HER2高表現腫瘤組織，虛線箭頭表示HER2低表現腫瘤組織。
<110> 國立大學法人鹿兒島大學(Kagoshima University)
<120> 藉由IgG結合肽之部位特異性RI標識抗體
<130> PH-6993-TW
<150> JP 2016-117395
<151> 2016-06-13
<150> JP 2016-227025
<151> 2016-11-22
<160> 37
<170> PatentIn第3.5版
<210> 1
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<213> 人工
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<221> 未歸類特徵
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<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
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<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
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<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 14
Figure 106119410-A0305-02-0067-14
<210> 15
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 15
Figure 106119410-A0305-02-0067-15
<210> 16
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 16
Figure 106119410-A0305-02-0068-16
<210> 17
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 17
Figure 106119410-A0305-02-0068-17
<210> 18
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 18
Figure 106119410-A0305-02-0069-18
<210> 19
<211 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 19
Figure 106119410-A0305-02-0069-19
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 20
Figure 106119410-A0305-02-0070-20
<210> 21
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 21
Figure 106119410-A0305-02-0070-21
<210> 22
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 22
Figure 106119410-A0305-02-0071-22
<210> 23
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 23
Figure 106119410-A0305-02-0071-23
<210> 24
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 24
Figure 106119410-A0305-02-0072-24
<210> 25
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 25
Figure 106119410-A0305-02-0072-25
<210> 26
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 26
Figure 106119410-A0305-02-0073-26
<210> 27
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 27
Figure 106119410-A0305-02-0073-27
<210> 28
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 28
Figure 106119410-A0305-02-0074-28
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 29
Figure 106119410-A0305-02-0074-29
<210> 30
<211> 110
<212> PRT
<213> 現代人
<400> 30
Figure 106119410-A0305-02-0075-30
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為高半胱胺酸
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為高半胱胺酸
<400> 31
Figure 106119410-A0305-02-0076-31
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 32
Figure 106119410-A0305-02-0076-32
Figure 106119410-A0305-02-0077-33
<210> 33
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<400> 33
Figure 106119410-A0305-02-0077-34
<210> 34
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<400> 34
Figure 106119410-A0305-02-0077-35
<210> 35
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基丙酸
<400> 35
Figure 106119410-A0305-02-0078-36
<210> 36
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為高半胱胺酸
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為離胺酸、半胱胺酸、天冬胺酸、麩胺酸、2-胺基辛二酸、 或二胺基內酸
<220>
<221> 未歸類特徵
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為高半胱胺酸
<400> 36
Figure 106119410-A0305-02-0079-37
<210> 37
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> IgG結合肽
<400> 37
Figure 106119410-A0305-02-0079-38

Claims (26)

  1. 一種肽，其特徵在於包含下述式III所表示之由13~17個胺基酸殘基所組成之胺基酸序列：(X1-3)-C-A-Y-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-(X1-3) (III)(式中，X分別獨立為半胱胺酸以外之任意胺基酸殘基，C為半胱胺酸殘基，H為組胺酸殘基，Xaa1為離胺酸殘基，G為甘胺酸殘基，Xaa2為麩胺酸殘基，L為白胺酸殘基，V為纈胺酸殘基，W為色胺酸殘基，A為丙胺酸殘基，且Y為酪胺酸殘基)，該肽之特徵在於經由被Xaa1修飾之交聯劑而可與人IgG結合，且配位基係連結於上述胺基酸序列之N末端，該配位基係可與放射性金屬核種結合。
  2. 如請求項1之肽，其係經由上述配位基而經放射性金屬核種標識。
  3. 如請求項1或2之肽，其中放射性金屬核種係選自由111In、89Zr、 64Cu、67/68Ga、及99mTc所組成之群。
  4. 如請求項1或2之肽，其中上述配位基係螯合劑。
  5. 如請求項4之肽，其中上述螯合劑係選自由二伸乙基三胺五乙酸(DTPA)、去鐵胺(deferoxamine)、1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、1,4,7-三氮雜環壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、及乙二胺四乙酸(EDTA)所組成之群。
  6. 如請求項1或2之肽，其中放射性金屬核種與配位基之組合係選自由111In與DTPA、89Zr與去鐵胺、及64Cu與DOTA或NOTA所組成之群。
  7. 如請求項1或2之肽，其中設為17個胺基酸殘基之情形時，自N末端起第1~3、15~17個之各胺基酸殘基係第1個胺基酸殘基=S、G、F、R、或無第2個胺基酸殘基=D、G、A、S、P、高半胱胺酸、或無第3個胺基酸殘基=S、D、T、N、E或R、第15個胺基酸殘基=S、T或D、第16個胺基酸殘基=H、G、Y、T、N、D、F、高半胱胺酸、或無、第17個胺基酸殘基=Y、F、H、M、或無。
  8. 如請求項1或2之肽，其包含以下之1)~14)之任一胺基酸序列，其中Xaa1為離胺酸殘基，於以下之14)中，Xaa7為高半胱胺酸： 1)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(序列編號1)2)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號2)3)RCAYH(Xaa1)GELVWCS(序列編號3)4)GPRCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(序列編號4)5)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號5)6)GDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號6)7)GPSCAYH(Xaa1)GELVWCTFH(序列編號7)8)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCSFH(序列編號8)9)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTHH(序列編號9)10)GPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列編號10)11)SPDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列編號11)12)SDDCAYH(Xaa1)GELVWCTFY(序列編號12)13)RGNCAYH(Xaa1)GQLVWCTYH(序列編號13)14)G(Xaa7)DCAYH(Xaa1)GELVWCT(Xaa7)H(序列編號36)。
  9. 如請求項1或2之肽，其包含下述式IV：D-C-(Xaa3)-(Xaa4)-H-(Xaa1)-G-(Xaa2)-L-V-W-C-T (IV)(式中，D為天冬胺酸殘基，C為半胱胺酸殘基，H為組胺酸殘基，Xaa1為離胺酸殘基，G為甘胺酸殘基， Xaa2為麩胺酸殘基，L為白胺酸殘基，V為纈胺酸殘基，W為色胺酸殘基，T為蘇胺酸殘基，Xaa3為丙胺酸殘基，且Xaa4為酪胺酸殘基)所表示之含有13個胺基酸殘基之胺基酸序列。
  10. 如請求項1或2之肽，其中肽於外側之2個半胱胺酸(C)殘基之間形成雙硫鍵，或肽之外側之2個半胱胺酸殘基中之硫基藉由以下之式：
    Figure 106119410-A0305-02-0083-39
     所表示之連接子連結。
  11. 如請求項1或2之肽，其中N末端經PEG化及/或C末端經醯胺化。
  12. 如請求項1或2之肽，其中Xaa1經交聯劑修飾。
  13. 如請求項12之肽，其中上述交聯劑係選自由DSG(二丁二醯亞胺基戊二酸酯)、DSS(二丁二醯亞胺基辛二酸酯)、DMA(己二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DMP(庚二亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、DMS(辛二亞胺酸二甲酯二鹽 酸鹽)、DTBP(3,3'-二硫代雙丙亞胺酸二甲酯二鹽酸鹽)、及DSP(二硫代雙丁二醯亞胺基丙酸)所組成之群。
  14. 如請求項13之肽，其中上述交聯劑係DSG(二丁二醯亞胺基戊二酸酯)或DSS(二丁二醯亞胺基辛二酸酯)。
  15. 如請求項1或2之肽，其包含GPDCAYHKGELVWCTFH(序列編號37，分子內之2個Cys(C)形成SS鍵)之胺基酸序列。
  16. 一種複合體，其係肽與IgG之複合體，且Xaa1經交聯劑修飾，且係藉由如請求項12至14中任一項之肽與IgG之交聯反應而形成。
  17. 如請求項16之複合體，其中上述肽為如請求項8之肽。
  18. 如請求項17之複合體，其中上述配位基為DOTA。
  19. 如請求項18之複合體，其中藉由經由上述配位基之上述放射性金屬核種進行之上述肽之N末端之修飾係藉由疊氮基與二苯并環辛炔(dibenzocyclooctyne)之反應而進行者。
  20. 如請求項19之複合體，其中上述肽之N末端係藉由1~50分子之聚乙二醇(PEG)而進行PEG化。
  21. 如請求項20之複合體，其中對於一分子IgG之上述肽之修飾數為1。
  22. 如請求項20之複合體，其中對於一分子IgG之上述肽之修飾數為2。
  23. 如請求項21之複合體，其中上述IgG為抗HER2人類IgG抗體。
  24. 如請求項22之複合體，其中上述IgG為抗HER2人類IgG抗體。
  25. 一種核醫學影像診斷劑或癌症之診斷劑，其包含於肽上結合有放射性金屬核種的如請求項2之肽或如請求項16之複合體。
  26. 一種如請求項2之肽或如請求項16之複合體之用途，其係用於製造確定受驗體有無罹患癌症之診斷劑。
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