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KR20220100104A - 항체 및 사용 방법 - Google Patents

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KR20220100104A
KR20220100104A KR1020227022857A KR20227022857A KR20220100104A KR 20220100104 A KR20220100104 A KR 20220100104A KR 1020227022857 A KR1020227022857 A KR 1020227022857A KR 20227022857 A KR20227022857 A KR 20227022857A KR 20220100104 A KR20220100104 A KR 20220100104A
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KR
South Korea
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antibody
klb
seq
certain embodiments
antibodies
Prior art date
Application number
KR1020227022857A
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English (en)
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용메이 첸
제임스 에른스트
학선 김
주니치로 소노다
크리스토프 스피스
스콧 스타위키
얀 우
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제넨테크, 인크.
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Publication date
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Abstract

본원에 개시된 주제는 KLB 및 FGFR1에 결합하는 항체, 및 이의 사용 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 FGFR1 상에 존재하는 에피토프에 결합하고 KLB 상에 존재하는 에피토프에 결합하는 이중특이적 항체를 포함한다.

Description

항체 및 사용 방법{ANTIBODIES AND METHODS OF USE}
우선권 주장
본 출원은 2013년 12월 23일 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/920,396 및 2014년 11월 18일 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 62/081,435를 우선권 주장하고, 이들은 양쪽 모두 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 포맷으로 전자 제출된 서열 목록을 함유하고, 이는 이에 의해 전문이 참고로 포함된다. 2014년 12월 22일에 생성된 상기 ASCII 사본은 파일명이 00B206.0170_SL.txt이고, 크기가 155,738 바이트이다.
발명의 분야
본 발명은 베타-클로토(Klotho) (KLB), 섬유모세포 성장 인자 수용체 1 (FGFR1), 또는 양쪽 모두에 결합하는 항체, 및 이의 사용 방법에 관한 것이다.
배경
섬유모세포 성장 인자 21 (FGF21) 및 이의 가장 밀접한 유사체인 FGF19는 FGF 수퍼패밀리의 구성원이다. FGF21 신호전달은 FGF-수용체 (FGFR) 아이소형(isoform) 및 막에 결합된 공동수용체 클로토-베타 (KLB)를 필요로 한다 (Ogawa et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(18): 7432-37 (2007); US2010/0184665). FGF19 또한 KLB와 복합체를 이룬 FGFR 아이소형을 통해 신호를 전달하는 것으로 나타났다 (Wu et al. J. Biol. Chem. 282(40): 29069-29072 (2007)). 포유동물 종에 의해 코딩되는 FGFR의 7가지 주요 아이소형 (1b, 2b, 3b, 1c, 2c, 3c, 및 4) 중에서, FGFR1c, 2c 및 3c의 3개의 아이소형만 공동수용체 KLB에 결합되었을 때 FGF19 및 FGF21 양쪽 모두에 의한 신호전달을 변환시킬 수 있고, 공동수용체 KLB는 간, 지방 조직 및 췌장에서 우세하게 발현된다 (Goetz and Mohammadi, Nature reviews. Molecular Cell Biology 14, 166-180 (2013)). 이러한 수용체들 중에서, FGFR1c가 FGF21의 대사 효과를 매개하는 것에서 우세한 역할을 하는 것으로 보인다. 특정 이론에 한정되지 않으면서, 막에 결합된 공동수용체 KLB의 존재 하에 FGFR 아이소형의 동종이량체화를 유도함으로써 FGF21이 작용하는 것으로 여겨진다. 다른 FGF 리간드와 달리, FGF21은 임의의 개별적인 FGFR에 대한 매우 낮은 친화력을 나타낸다. 그러나, C-말단 꼬리 영역을 통해 KLB에 높은 친화력으로 결합하는 것이 FGF21을 FGFR/KLB 복합체에 동원시켜, FGF21이 FGFR 단독에 대한 낮은 친화력에도 불구하고 FGFR과 상호작용하게 허용한다.
FGF21은 동물 질환 모델에서 비만 및 2형 당뇨병을 역전시키는 강력한 질환-변형 단백질 작용제로서 확인되었다 (Kharitonenkov et al. J. Clin. Invest. 115(6): 1627-35 (2005)). 재조합 FGF21이 렙틴-신호전달-결핍 (ob/ob 또는 db/db) 마우스 또는 고-지방 식이 (HFD)가 공급된 마우스에서 간 지질을 감소시키고, 인슐린 감수성을 개선하며, 혈당 제어를 정상화하는 것으로 나타났다. 재조합 FGF21로 매일 처리된 비만 및 당뇨병 리서스 원숭이에서 혈액 글루코스 감소 및 다양한 심혈관 위험 인자의 개선이 또한 관찰되었다. FGF21 및 FGF19는 양쪽 모두 비만 설치류에서 언커플링(uncoupling) 단백질 1 (UCP1)-양성 지방 조직 (갈색 및 베이지색 지방 조직; BAT)의 발열 기능을 활성화시키는 것으로 나타났다 (Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Coskun et al., Endocrinology 149, 6018-6027 (2008); Fisher et al., Genes & Development 26, 271-281 (2012)).
재조합 FGF21 또는 FGF19 유사체의 임상 용도가 대사 질환의 치료를 위해 현재 테스트 중이지만, 치료적 개입을 위한 이들의 개발은 난제인 것으로 증명되었다. 예를 들어, 비-인간 영장류에서 ~2시간인 FGF21의 혈청 반감기는 실용적인 임상 용도용으로 너무 짧고, 혈행 내의 잔류 FGF21 단백질이 단백질분해성 절단에 의해 급속하게 불활성화될 수 있다. 단백질 공학을 통해 이러한 성질을 개선하려는 시도가 이루어졌지만, 이같은 변형은 면역원성 및 기타 변형-특이적 유해 효과를 증가시킬 수 있다. 또 다른 유의한 난점은 만성 FGF21-매개 요법으로부터의 장기 유해 효과의 가능성이다. 예를 들어, FGF21은 성장 호르몬 수용체 신호전달의 억제제인 SOCS2의 유도를 통해 간 성장 호르몬 저항성을 유도하는 것으로 보고되었다 (Inagaki et al., Cell Metab. 8: 77-83 (2008)). 인간에서, 성장 호르몬 저항성 또는 결핍은 아동 및 성인에서 낮은 골 질량과 연관되고, FGF21의 트랜스제닉(transgenic) 과발현 또는 재조합 FGF21로의 마우스의 2주 처리는 골 미네랄 밀도의 극적인 손실에 이른다. FGF21의 골-관련 유해 효과가 이로운 대사 효과로부터 독립될 수 있다는 것이 아직 실연되지 않았다. 또한, FGF19의 트랜스제닉 과생산이 FGF 수용체 (FGFR) 4의 활성화를 통해 간세포 발암에 이를 수 있다 (Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Tomlinson et al., Endocrinology 143, 1741-1747 (2002); French et al., PLoS One 7, e36713 (2012)).
재조합 모노클로날 항체 (Ab)가 강력한 치료 양식으로 작용할 수 있는데, 이들이 우수한 표적 선택성, 약동학 프로파일, 및 제약 작용제에 중요한 기타 성질을 제공할 수 있기 때문이다 (Chan and Carter, Nature reviews. Immunology 10, 301-316 (2010)). 예를 들어, FGFR1c에 대한 항체가 마우스 및 원숭이에서 체중 감소를 유도하는 것으로 보고되었고 (WO2005/037235), FGFR1c의 효능작용 항체-매개 선택적 활성화가 당뇨병 마우스에서 FGF21에 의한 인슐린 감작를 재현하는데 충분하다 (WO2012/158704; Wu et al. Science Translational Med. 3(113): 1-10 (2011)). KLB/FGFR1c 복합체에 결합하는 항체가 활성화제/치료제로서 제안되었다 (US 7,537,903; WO2011/071783; WO2012/158704). 또 다른 이들이 FGFR1c/KLB 복합체를 선택적으로 활성화시키는 2가지 별법적인 접근법, 예컨대 mimAb1로 칭해지는 고친화력 항-KLB 항체 (Foltz et al. Sci. Transl. Med. 4: 162ra153 (2012)) 및 인간 혈청 알부민 (HSA)에 연결된 이중특이적 항-FGFR1/KLB 아비머(Avimer) 폴리펩티드 C3201 (US 8,372,952)를 연구하였다.
글루코스 대사에서의 FGF19 및 FGF21의 유의한 역할을 고려하여, FGF19 또는 FGF21-매개 활성을 조정하는 치료 분자 및 방법의 개발이 관련 기술 분야에서 여전히 요구된다.
개요
본 개시내용은 KLB에 결합하는 항체, FGFR1에 결합하는 항체, 및 KLB 및 FGFR1 양쪽 모두에 결합하는 이중특이적 항체, 및 이의 사용 방법을 제공한다. 본 발명은, 부분적으로, KLB 및 FGFR1 양쪽 모두에 결합하는 이중특이적 항체의 발견을 기초로 하고, 이는 FGFR1c/KLB 수용체 복합체를 선택적으로 활성화시키고, 간에 대한 유의한 영향 및 골 질량 손실 없이, 체중 감소 및 글루코스 및 지질 대사 개선을 포함하는, FGF21-유사 활성으로부터 예상되는 이로운 대사 변화를 유도한다.
특정 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 발명의 단리된 항체는 베타-클로토 (KLB) 및 섬유모세포 성장 인자 수용체 1 (FGFR1) 양쪽 모두에 결합할 수 있고, 여기서 항체는 KLB의 C-말단 도메인에 결합한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 개시내용의 단리된 항체는 KLB 및 FGFR1c 양쪽 모두에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 아미노산 서열 SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (서열식별번호(SEQ ID NO): 142)를 포함하는 KLB의 단편에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 아미노산 서열 KLHAVPAAKTVKFKCP (서열식별번호: 143) 또는 FKPDHRIGGYKVRY (서열식별번호: 144)을 포함하는 FGFR1의 단편 내의 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 KLB/FGFR1c 복합체를 활성화시킨다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 생체 내에서 혈액 글루코스 수준을 감소시킨다. 특정 실시양태에서, 항체는 골 밀도에 유의하게 영향을 미치지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 간에 유의하게 영향을 미치지 않는다. 특정 실시양태에서, 항체는 FGF21이 유도하는 것보다 유의하게 더 낮은 수준으로 간에서 ERK 및 MEK 인산화를 유도한다. 특정 실시양태에서, 항체는 10-8 M 내지 10-13 M의 Kd로 KLB에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 10-8 M 내지 10-13 M의 Kd로 FGFR1 단백질에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 10-8 M 내지 10-13 M의 Kd로 FGFR1c에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 <10 nM의 Kd로 KLB에 결합하고, >300 nM의 Kd로 FGFR1c에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 Kd가 약 10 nM 내지 약 10 μM인 항-FGFR1 아암(arm)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 KLB 상에 존재하는 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 개시내용은 도 3A 및 B에 제시된 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-KLB 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-KLB 항체는 12A11 또는 8C5 항체와 동일한 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-KLB 항체는 KLB의 C-말단 도메인 내의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-KLB 항체는 아미노산 서열 SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (서열식별번호: 142)로 이루어진 KLB의 단편에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 128에 기재된 서열에 대해 95％ 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 130에 기재된 서열에 대해 95％ 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 제1 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 132에 기재된 서열에 대해 95％ 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 134에 기재된 서열에 대해 95％ 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 중쇄 영역 및 경쇄 영역을 포함하고, 중쇄 영역은 서열식별번호: 129에 기재된 서열에 대해 95％ 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 영역은 서열식별번호: 131에 기재된 서열에 대해 95％ 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 제1 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 중쇄 영역 및 경쇄 영역을 포함하고, 중쇄 영역은 서열식별번호: 133에 기재된 서열에 대해 95％ 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하고, 경쇄 영역은 서열식별번호: 135에 기재된 서열에 대해 95％ 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
본 개시내용은 (a) 서열식별번호: 1-15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (b) 서열식별번호: 79-93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 (c) 서열식별번호: 16-31로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항-KLB 항체를 추가로 제공한다.
특정 실시양태에서, 항-KLB 항체는 (a) 서열식별번호: 1-15로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 16-31로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열식별번호: 32-47로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-KLB 항체는 (a) 서열식별번호: 48-62로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열식별번호: 63-78로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 79-93으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-KLB 항체는 (a) 서열식별번호: 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열식별번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열식별번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열식별번호: 75의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열식별번호: 90의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-KLB 항체는 (a) 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열식별번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열식별번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-KLB 항체는 (a) 서열식별번호: 128의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) 서열식별번호: 130의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 129의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열식별번호: 131의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (a) 서열식별번호: 128의 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 95％ 이상인 중쇄 가변 영역; (b) 서열식별번호: 130의 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 95％ 이상인 경쇄 가변 영역; 및 (c) (a)에서와 같은 중쇄 가변 영역 및 (b)에서와 같은 경쇄 가변 영역을 포함하는 항-KLB 항체를 제공한다.
본 개시내용은 FGFR1, 예를 들어, FGFR1c에 결합하는 항체를 추가로 제공한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 개시내용의 항체는 FGFR1에 결합하는 가변 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 아미노산 서열 KLHAVPAAKTVKFKCP (서열식별번호: 143) 또는 FKPDHRIGGYKVRY (서열식별번호: 144)로 이루어진 FGFR1의 단편에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 136의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 137의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열식별번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열식별번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (e) 서열식별번호: 140의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열식별번호: 141의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 132의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 (b) 서열식별번호: 134의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 (a) 서열식별번호: 133의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 (b) 서열식별번호: 135의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 아미노산 서열 KLHAVPAAKTVKFKCP (서열식별번호: 143) 또는 FKPDHRIGGYKVRY (서열식별번호: 144)로 이루어진 FGFR1c의 단편에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 인간, 인간화 또는 키메라 항체이다. 특정 실시양태에서, 항체는 이펙터 기능이 감소되었다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 항체가 생산되도록 본 개시내용의 숙주 세포를 배양하는 것을 포함하는 항체의 생산 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 숙주 세포로부터 항체를 회수하는 것을 추가로 포함한다.
본 개시내용은 하나 이상의 본 발명의 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 제제을 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 제약 제제은 추가적인 치료제를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 의약으로서 사용하기 위한 본 발명의 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 대사 장애, 예를 들어, 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사 증후군 (MetS), 비만, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 비-알콜성 지방 간 질환 (NAFLD), 고지질혈증, 고혈압, 2형 당뇨병, 비-2형 당뇨병, 1형 당뇨병, 잠복성 자가면역 당뇨병 (LAD), 및 소아의 성숙기 발병 당뇨병 (MODY)을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 항체는 2형 당뇨병을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 항체는 비만을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 바르데-비들(Bardet-Biedl) 증후군, 프라더-윌리(Prader-Willi) 증후군, 알스트롬(Alstrom) 증후군, 코헨(Cohen) 증후군, 올브라이트(Albright) 유전성 골형성장애 (가성 부갑상선기능저하증), 카펜터(Carpenter) 증후군, MOMO 증후군, 루빈스타인-테이비(Rubinstein-Taybi) 증후군, 취약 X 증후군 및 보제슨-포스만-레만(Boerjeson-Forssman-Lehman) 증후군을 치료하는데 사용하기 위한 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 KLB/FGFR1 수용체 복합체, 예를 들어, KLB/FGFR1c 수용체 복합체를 활성화시키는데 사용하기 위한 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 대사 장애, 예를 들어, 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사 증후군 (MetS), 비만, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 비-알콜성 지방 간 질환 (NAFLD), 고지질혈증, 고혈압, 2형 당뇨병, 비-2형 당뇨병, 1형 당뇨병, 잠복성 자가면역 당뇨병 (LAD), 및 소아의 성숙기 발병 당뇨병 (MODY), 및 노화 및 관련 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 ALS의 치료를 위한 의약의 제조에서의 본원에 개시된 항체의 용도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 대사 장애는 2형 당뇨병이다. 특정 실시양태에서, 대사 장애는 비만이다. 특정 실시양태에서, 이러한 제작은 KLB/FGFR1c 수용체 복합체를 활성화시키기 위한 의약의 제작이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 하나 이상의 본 개시내용의 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사 증후군 (MetS), 비만, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 비-알콜성 지방 간 질환 (NAFLD), 고지질혈증, 고혈압, 2형 당뇨병, 비-2형 당뇨병, 1형 당뇨병, 잠복성 자가면역 당뇨병 (LAD), 및 소아의 성숙기 발병 당뇨병 (MODY), 및 노화 및 관련 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 ALS로 이루어진 군으로부터 선택된 질환에 걸린 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 질환은 당뇨병, 예를 들어, 2형 당뇨병이다. 특정 실시양태에서, 질환은 비만이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 바르데-비들 증후군, 프라더-윌리 증후군, 알스트롬 증후군, 코헨 증후군, 올브라이트 유전성 골형성장애 (가성 부갑상선기능저하증), 카펜터 증후군, MOMO 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군, 취약 X 증후군 및 보제슨-포스만-레만 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환 및/또는 장애에 걸린 개체를 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 개체에게 추가적인 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 본 개시내용의 항체를 사용하는 방법은 개체에서 간 기능에 영향을 미치지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 유효량의 하나 이상의 본 개시내용의 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 체중 감소를 유도하는 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 유효량의 본 개시내용의 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 KLB-FGFR1c 수용체 복합체를 활성화시키는 방법을 제공한다.
도면의 간단한 설명
도 1A는 항-FGFR1 항체 및 항체 단편의 효능작용 활성을 도시한다.
도 1B는 항-FGFR1 항체들을 사용한 결합 경쟁 실험의 결과를 도시한다.
도 1C는 본원에 개시된 주제의 항-FGFR1 항체에 의한 결합에 중요한 FGFR1 내의 아미노산 잔기를 도시한다. 나타난 순서대로 각각 서열식별번호: 159, 159, 143 및 144가 도 1C에서 개시된다.
도 1D는 본원에 개시된 주제의 항-FGFR1 항체에 의한 결합에 중요한 아미노산 잔기를 결정하기 위한 부위-특이적 돌연변이유발의 결과를 도시한다.
도 1E는 본원에 개시된 주제의 항-FGFR1 항체에 의한 결합에 중요한 아미노산 잔기를 결정하기 위한 부위-특이적 돌연변이유발의 결과를 도시한다.
도 1F는 FGFR1의 공간-채움 모델 상에서 결합에 중요한 잔기를 도시한다.
도 2A는 FGFR1b 및 FGFR1c에 대한 2개의 항-FGFR1 항체의 친화력을 도시한다.
도 2B는 다양한 FGFR에 대한 항-FGFR1 항체의 결합을 도시한다.
도 2C는 L6 세포에서의 GAL-ELK1 (ETS-유사 전사 인자 1)-기반 루시페라제 검정법에서 FGFR1에 대한 특이적 효능제로서 작용한 항-FGFR1 항체를 도시한다.
도 2D는 HEK293 세포에서의 GAL-ELK1-기반 루시페라제 검정법에서 항-FGFR1 항체가 FGFR1에 대한 특이적 효능제로서 작용하였음을 도시한다.
도 2E는 당뇨병 ob/ob 마우스 내로 주사되었을 때 항-FGFR1 항체가 혈액 글루코스 수준을 정상화하였음을 도시한다.
도 3A는 17개의 항-KLB 항체에 대한 경쇄 가변 영역 서열을 도시한다. CDR L1 서열은 순서대로 서열식별번호: 48-62이고; CDR L2 서열은 순서대로 서열식별번호: 63-78이며; CDH L3 서열은 순서대로 서열식별번호: 79-93이다. 경쇄 가변 영역 서열은 순서대로 서열식별번호: 111-127이다.
도 3B는 17개의 항-KLB 항체에 대한 중쇄 가변 영역 서열을 도시한다. 항체들에 대한 CDR H1 서열은, 순서대로 (11F1-8C5), 서열식별번호: 1-15이고; CDR H2 서열은 순서대로 서열식별번호: 16-31이며; CDR H3 서열은 순서대로 서열식별번호: 32-47이다. 항체들에 대한 중쇄 가변 영역 서열은 순서대로 서열식별번호: 94-110이다.
도 4는 hKLB를 발현하는 293 세포에 대한 다양한 항-KLB 항체의 결합을 측정하는 0.8 ㎍/㎖에서의 FACS 플롯에서 관찰된 중앙값 이동을 도시한다.
도 5는 hKLB-ECD-HIS 단백질에 대한 다양한 항-KLB 항체의 상대적인 결합을 도시한다.
도 6A는 본원에 개시된 주제의 항체, 및 신호 활성화를 위한 KLB/FGFR1c 이중특이적 Ab 복합체 형성에 대한 모델을 나타내는 개략도이다.
도 6B는 신호 활성화를 위한 FGFR1c-KLB-FGF21 복합체 형성에 대한 모델을 도시한다.
도 6C는 FGFR1-결핍 HEK293 세포를 사용한 FGF21 및 이중특이적 항체 (BsAb) 17 활성의 GAL-ELK1 루시페라제 검정법을 도시한다. 지시된 수용체를 발현하도록 세포가 형질감염되었다.
도 6D는 1시간 동안 지시된 단백질 (FGF21 (100 nM) 또는 IgG (33 nM))로 처리된 1차 인간 지방세포의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다. 각각의 처리에 대해 샘플은 이중으로 하였다.
도 7A는 GAL-ELK1-기반 루시페라제 검정법에서의 항-FGFR1 및 항-KLB 아암이 있는 다양한 이중특이적 항체에 의한 유도를 도시한다. R1MAb1 아암이 있는 이중특이적 Ab가, 아마도 R1MAb1 Fab의 효능작용 활성으로 인해, 유의한 KLB-비의존적 활성을 나타냈음을 주지한다. R1MAb2 또는 R1MAb3 아암이 있는 이중특이적 Ab로는 이같은 활성이 관찰되지 않았다.
도 7B는 항-FGFR1 및 항-KLB 아암이 있는 다양한 이중특이적 항체에 의한 신호전달의 유도가 FGFR1c 및 KLB 양쪽 모두에 의존적이라는 것을 도시한다.
도 7C는 재조합 hFGFR1c 및 hKLB를 발현하는 세포에서 용량-의존적 방식으로 루시페라제 활성을 유도하였지만, KLB 발현이 없는 세포에서는 그렇지 않은, 항-FGFR1 및 항-KLB 아암이 있는 이중특이적 항체를 도시한다.
도 8A는 항-KLB/항-FGFR1c 이중특이적 항체의 3가지 변이체의 개략도이다. 청색: 인간, 및 적색: 마우스. (1)의 N297에서의 올리고사카라이드 사슬의 대략적인 위치가 ^로 지시된다. 이펙터가 없는 버전 ((2) 및 (3))에서는 N297G 돌연변이로 인해 이러한 올리고사카라이드 사슬이 결여된다. (2)의 별표는 D265A 돌연변이의 대략적인 위치를 지시한다. 놉-대-홀(knob vs hole)의 배향이 또한 제시된다. (1)은 BsAb10을 나타내고; (2)는 BsAb20을 나타내며; (3)은 BsAb17을 나타낸다.
도 8B는 BsAb10 및 이의 유도체, 대조군 IgG 또는 FGF21로 10분 동안 처리된 1차 인간 지방세포에서의 MSD pERK 검정법을 도시한다. 데이터는 평균 ± SEM (N=3)을 나타낸다. bFKB1 (1)은 BsAb10을 나타내고; bFKB1 (2)는 BsAb20을 나타내며; bFKB1 (3)은 BsAb17을 나타낸다.
도 9A는 래트 L6 근육모세포에서의 GAL-ELK1 루시페라제 검정법을 도시한다. 세포를 지시된 수용체에 대한 발현 벡터로 공동-형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 루시페라제 검정법 전에 6시간 동안 다양한 농도의 BsAb10 또는 양성 대조군, FGF21, FGF19 또는 R1MAb1과 함께 인큐베이션하였다.
도 9B는 도 9A에 제시된 것과 유사한 GAL-ELK1 루시페라제 검정법을 도시한다. 형질감염된 L6 세포를 지시된 바와 같은 FGF21 및 BsAb17의 조합물로 처리하였다. N=4.
도 9C는 도 9A에 제시된 것과 유사한 GAL-ELK1 루시페라제 검정법을 도시한다. 형질감염된 L6 세포를 지시된 바와 같은 FGF21 및 BsAb17의 조합물로 처리하였다. N=4.
도 9D는 KLB, FGFR1c 또는 양쪽 모두를 발현하는 세포에 대한 항-FGFR1 항체 및 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체인 BsAB9 및 BsAb10의 결합을 도시한다.
도 10A는 FGFR1c, KLB 또는 양쪽 모두를 발현하는 세포에 대한 항-FGFR1 및 항-KLB 아암이 있는 이중특이적 항체 및 항-FGFR1 항체의 결합을 도시한다.
도 10B는 인간 및 뮤린(murine) KLB/FGFR1의 다양한 조합물을 발현하는 HEK293 세포에 결합하는 것에 대한 BsAb10의 Kd를 도시한다.
도 11은 칩 상에 고정된 FGFR1-ECD-Fc 융합 단백질에 대한 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12.5 nM, 6.25 nM의 BsAb10 또는 미리 형성된 BsAb10/KLB 복합체의 결합 분석을 도시한다. 미리 형성된 BsAb10/KLB 복합체를 생성시키기 위해, BsAb10 및 재조합 KLB-ECD 단백질을 1:1 비로 예비-인큐베이션하였다. 단독 BsAb10보다 BsAb10/KLB 복합체로 해리 속도가 더 느렸지만, FGFR1b는 아니라 FGFR1c가 칩 상에 포착되었을 때만 그러하였다는 것을 주목하고, 이는 3원 복합체의 형성을 지시한다.
도 12A는 TR-FRET 실험 디자인의 개략도이다.
도 12B는 지시된 리간드의 첨가 15분 후의 태그가 없는 KLB와 함께 또는 태그가 없는 KLB 없이 표지된 SNAP-태그 FGFR1c 단백질을 발현하는 COS7 세포 상에서의 TR-FRET 강도를 도시한다. BsAb17, FGF21, FGF1 및 FGF2가 각각 67 nM, 50 nM, 62.5 nM, 12 nM로 사용되었다. 데이터는 665 nm에서의 FRET 강도를 620 nm에서의 공여체 방출로 나눈 것 (FRET 비)를 나타내고, 3회의 독립적인 실험 (N=3)의 평균 ± SEM을 나타낸다. PBS 대조군에 대해 p<0.05 (*), <0.01 (**), <0.0001 (***).
도 13A는 KLB의 어떤 부분이 2개의 항-KLB 항체에 의한 결합에 중요하였는지를 결정하는 실험의 결과를 도시한다. KLB 단백질 구조의 개략도가 상부에서 제시된다. 각각의 막대는 색상이 코딩하는 바와 같이 인간 KLB, 인간 KLA, 토끼 KLB, 래트 KLB, 마우스 KLB, 또는 키메라 구축물을 나타낸다. 오른쪽에, FACS를 기초로 하는, 각각의 구축물을 일시적으로 발현하는 HEK293 세포와 KLBmAb1 및 대조군 KLBmAb2의 결합이 제시된다. KLBmAb1이 토끼 KLB에 결합하지 않지만, 아미노산 34개의 단편 (아미노산 805-838)을 상응하는 인간 서열로 교체하는 것이 결합을 부여한다는 것을 주목한다.
도 13B는 신호 서열이 있는 인간 KLB 단백질의 위치 857-890 절편의 아미노산 서열 (이는 신호 서열을 포함하지 않는 KLB 단백질의 위치 805-838의 아미노산 서열에 상응함), 및 다양한 지시된 종에서의 상응하는 서열을 도시한다. 나타난 순서대로 각각 서열식별번호: 160-164가 도 13B에서 개시된다.
도 14A는 SPR에 의한 BsAb10/KLB 복합체에 대한 FGF21 및 FGF19의 결합을 도시한다. BsAb10이 칩 상에 포착되었고, KLB-ECD 단백질 및 FGF 단백질 (0.2, 0.8, 또는 2 μM)이 순차적으로 주입되었다.
도 14B는 래트 L6 근육모세포에서의 GAL-ELK1 루시페라제 검정법의 결과를 도시한다. 세포를 FGFR4 및 KLB 양쪽 모두에 대한 발현 벡터로 공동-형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 루시페라제 검정법 전에 6시간 동안 다양한 농도의 지시된 단백질과 함께 인큐베이션하였다.
도 14C는 H4IIE 간세포암 세포에서의 ERK 인산화를 모니터링하기 위해 수행된 웨스턴 블롯을 도시한다. BsAb17이 FGFR4/KLB 복합체를 활성화시키는 FGF19의 능력 (도 14B), 또는 H4IIE 간세포암 세포에서 ERK 인산화를 유도하는 FGF19의 능력 (도 14C)을 차단하지 않았음을 주목한다.
도 15A는 3 mg/kg (마른 마우스) 또는 5 mg/kg (db/db)의 BsAb17 또는 대조군 IgG의 단일 복막내 (i.p.) 주사 후의 마른 C57BL/6 마우스 및 db/db 마우스 (n=7)의 혈액 글루코스 수준 (제7일), ％ 체중 변화 (제7일) 및 일일 음식 섭취 (제0일-제3일)를 도시한다.
도 15B는 제0일 및 제6일 (화살표)에 3 mg/kg의 지시된 IgG (BsAb20)의 복막내 주사가 제공된 식이 유도 비만 (DIO) 마우스의 체중 및 혈액 글루코스 수준을 도시한다. N=9.
도 15C는 제14일의 15B에서 사용된 것과 동일한 마우스 및 항체로의 글루코스 내성 테스트의 결과를 도시한다.
도 15D는 제17일의 15B-C에서 제시된 동물에서의 간 트리글리세리드 및 혈청 마커의 양을 도시한다.
도 15E는 10 mg/kg의 지시된 IgG (BsAb17)의 단일 복막내 주사 5일 후에 DIO 마우스로의 고인슐린혈증-정상 혈당 클램프(hyperinsulinaemic-euglycaemic clamps) 동안 측정된 전신 글루코스 이용을 도시한다 (N=12). 수평축은 혈청 인슐린 수준을 나타낸다. 화살표는 기준선에서 인슐린-자극 상태로의 변화의 방향을 지시한다. 대조군에 대해 p<0.05 (*), <0.005 (**), <0.0001 (***).
도 15F는 10 mg/kg의 지시된 IgG (BsAb17)의 단일 복막내 주사 5일 후에 DIO 마우스로의 고인슐린혈증-정상 혈당 클램프 동안 측정된 내인성 글루코스 생산을 도시한다 (N=12). 수평축은 혈청 인슐린 수준을 나타낸다. 화살표는 기준선에서 인슐린-자극 상태로의 변화의 방향을 지시한다. 대조군에 대해 p<0.05 (*), <0.005 (**), <0.0001 (***).
도 15G는 10 mg/kg의 지시된 IgG (BsAb17)의 단일 복막내 주사 5일 후에 DIO 마우스로의 고인슐린혈증-정상 혈당 클램프 동안 측정된 인슐린-자극 조직 글루코스 섭취를 도시한다 (N=12). 대조군에 대해 p<0.05 (*), <0.005 (**), <0.0001 (***).
도 16A는 마우스 KLB 단백질의 N-말단 아미노산 서열 (서열식별번호: 165)을 나타내고, KO 마우스에서 Klb 대립유전자에 의해 코딩되는 상응하는 아미노산 서열 (서열식별번호: 166)이 제시된다. Klb 유전자에서의 미스센스(missense) 돌연변이는, 적색 문자로 나타난 바와 같이, KO 대립유전자에서 두 번째 아미노산 뒤에서 프레임-이동을 초래한다.
도 16B는 야생형 (+/+) 및 KLB 녹아웃(knockout) (-/-) 마우스의 부고환 백색 지방 조직에서의 KLB 단백질 발현을 나타낸다.
도 16C는 KLB가 BsAb20이 글루코스 대사에 영향을 미치는데 중요하다는 것을 나타낸다. 3 mpk의 BsAb20 또는 대조군 IgG의 4회의 매주 주사가 제공된 DIO 마우스에서의 글루코스 내성 테스트 (GTT). 마지막 주사 3일 후의 제23일에 GTT를 수행하였다. GTT 이전의 20주 동안 마우스에게 HFD를 제공하였다. *p<0.05.
도 16D는 50 mg/kg의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체 또는 R1MAb1 또는 비히클의 복막내 주사 후 제7일의 DIO 마우스에서의 혈청 파라미터를 도시한다. N=6.
도 17은 50 mg/kg의 BsAb17의 복막내 주사 후 제7일의 DIO 마우스의 혈청 내의 FGF23 및 무기 인의 양을 도시한다. N=6. ***p<0.0005.
도 18A는 클램프 실험 동안의 동맥 혈액 글루코스 변동(excursion)의 양을 도시한다. 클램프 실험 5일 전에 DIO 마우스에게 10 mg/kg의 BsAb17 또는 대조군 IgG를 제공하였다.
도 18B는 클램프 실험일의 체중을 도시한다.
도 18C는 클램프 실험 동안의 글루코스 주입률을 도시한다. 대조군에 대해 p<0.05 (*), <0.001 (**).
도 19A는 21-22℃에서 지시된 시점에 10 mg/kg IgG의 단일 복막내 주사가 제공된 DIO 마우스의 에너지 소모 (EE) (왼쪽) 및 호흡 지수 (RQ) (오른쪽)를 도시한다. N=7.
도 19B는 지시된 시점에 10 mg/kg IgG의 단일 복막내 주사가 제공된 마른 마우스의 EE (상부) 및 RQ (하부)를 도시한다. 마우스를 21-22℃에서 유지시킨 후, IgG 주사 6일 후에 우리 온도를 열 중성대(thermoneutrality) (29-30℃)로 변화시켰다. N=6~7.
도 19C는 10 mg/kg의 지시된 IgG의 단일 복막내 주사 40시간 후의 DIO 마우스에서의 조직 플루데옥시글루코스 (FDG) 섭취를 도시한다. N=8. FDG-섭취를 측정하기 전에 철야로 마우스를 금식시켰다.
도 19D는 단일 복막내 주사 (10 mg/kg의 BsAb17 또는 대조군 IgG) 및 수술에 의한 삼투압 펌프 이식 (CL316,243 (0.75 nmol/h) 또는 비히클) 후 제7일에 회수된 ingWAT의 웨스턴 블롯 분석을 도시한다.
도 19E는 30 nM의 지시된 단백질로 48시간 동안 처리된 1차 인간 피하 지방세포에서의 Ucp1 mRNA의 발현을 도시한다. N=3.
도 19F는 10 mg/kg의 BsAb17 또는 대조군 IgG가 제공된 DIO 마우스의 심부 체온을 도시한다. N=7~8.
도 19G는 5일 동안 단일 10 mg/kg의 IgG 및 2 mg/kg/일의 FGF21 b.i.d. 또는 대조군 PBS가 제공된 DIO 마우스의 iBAT에서의 유전자 발현 프로파일을 도시한다. BsAb17와 대조군 사이에서 또는 FGF21과 대조군 사이에서 유의하게 상이한 모든 유전자가 열거되었다.
도 19H는 제0일에 10 mg/kg의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체 또는 대조군 IgG의 단일 복막내 주사 및 수술에 의한 삼투압 펌프 이식 (0.5 nmol/h의 CL-316,243 또는 비히클)이 제공된 마른 마우스의 EE (왼쪽) 및 RQ (오른쪽)를 도시한다. 지시된 24시간 기간 동안의 평균값이 제시된다.
도 20A는 도 19A에 기술된 DIO 마우스의 VO2 (상부), VCO2 (중간) 및 총 활성 카운트의 양을 도시한다. #에 의해 지시된 시점에 측정된 체중값에 의해 VO2 및 VCO2 값이 표준화된다. DIO 마우스에게 10 mg/kg의 BsAb17 또는 대조군 IgG를 제공하였다.
도 20B는 도 19B에 기술된 DIO 마우스의 VO2 (상부), VCO2 (중간) 및 총 활성 카운트의 양을 도시한다. #에 의해 지시된 시점에 측정된 체중값에 의해 VO2 및 VCO2 값이 표준화된다. DIO 마우스에게 10 mg/kg의 BsAb17 또는 대조군 IgG를 제공하였다.
도 21A는 간접 열량측정법에서의 평균 EE 값을 도시한다. 평균 증가의 규모가 그래프 아래에서 제시된다. DIO 21℃: 도 19A에 제시된 실험에서의 IgG 주사 후 D3-D6 동안의 EE의 평균값. 마른 마우스 21℃: 도 19B에 제시된 실험에서의 IgG 주사 후 D3-D6 동안의 EE의 평균값. 30℃로의 전환 후의 마른 마우스: 도 19B에 제시된 실험에서의 IgG 주사 후 D6-D9 (즉, 온도 전환 후 3일) 동안의 EE의 평균값. DIO 30℃: 열 중성대에서 적응된 DIO 마우스에서의 IgG 주사 후 D3-D6 동안의 EE의 평균값.
도 21B는 열 중성대에서의 DIO 마우스에서의 EE 변화를 도시한다. 10 mg/kg의 BsAb17 또는 대조군 IgG의 단일 복막내 주사 (화살표) 전에 2주 동안 DIO 마우스를 열 중성대에 적응시켰다. N=3~4.
도 21C는 수술에 의한 삼투압 펌프 이식 및 약물 주사 후 D3-5 동안의 일반적인 실험실 온도 (21℃)에서의 DIO 마우스에서의 평균 EE 및 RQ를 도시한다. D0에, 마우스에게 10 mg/kg의 BsAb17 또는 대조군 IgG의 복막내 주사를 제공하였다. FGF21 군에게는 D0에 볼루스 2 mg/kg FGF21 복막내 주사를 또한 제공하였다. 또한 D0에 60 ㎍/일의 FGF21 또는 PBS 대조군을 주입하기 위해 각각의 마우스에게 삼투압 펌프를 피하 이식하였다. N=8~9. ** p<0.005.
도 22는 10 mg/kg의 BsAb17 또는 대조군 IgG가 제공된 DIO 마우스들 사이에서 연구 과정에 걸친 심부 체온의 피팅된(fitted) 차이를 나타내도록 다시 플롯팅된 도 19F에서 제시된 데이터를 도시한다. 흑색 선은 추정 차이이고, 청색 선은 차이의 95％ 점 신뢰 구간이다. 제13일 (화살표)에 IgG를 투여하였다. N=7~8.
도 23은 부고환 지방, 서혜부 지방, 및 견갑간 갈색 지방, 및 췌장에서의 유사한 정도의 FGF21 및 BsAb20-유도 ERK 및 MEK 인산화를 도시한다. 10 mg/kg (BsAb20) 또는 1 mg/kg (FGF21)의 마른 C57BL/6 마우스의 복막내 주사 1시간 후 (간, 췌장 및 부고환 백색 지방 조직 (eWAT)) 또는 2시간 후 (iBAT 또는 ingWAT)에 조직을 회수하였다. 총 ERK 및 MEK가 로딩(loading) 대조군으로서의 역할을 한다.
도 24A는 지시된 용량 (mg/kg)의 BsAb17의 단일 복막내 주사가 제공된 DIO 마우스 (N=6)에서의 체중 변화 및 혈청 HMW 아디포넥틴 수준을 도시한다.
도 24B는 지시된 용량 (mg/kg)의 BsAb17의 단일 복막내 주사가 제공된 시노몰구스 원숭이 (N=3)에서의 체중 변화 및 혈청 HMW 아디포넥틴 수준을 도시한다.
도 24C는 10 mg/kg의 지시된 IgG (BsAb17)의 단일 복막내 주사 (화살표)가 제공된 DIO 마우스 (왼쪽: wt 및 오른쪽: adipoq KO)의 EE를 도시한다. N=5~6.
도 24D는 10 mg/kg의 지시된 IgG (BsAb17)의 단일 복막내 주사가 제공된 wt (+/+) 및 adipoq KO (-/-) DIO 마우스에서의 다양한 대사 파라미터를 도시한다. N=6. AUC: GTT 또는 ITT에서의 곡선하 면적 (T=0~2 h). 대조군에 대해 p<0.1 (#), <0.05 (*), <0.005 (**).
도 25는 qPCR을 사용하여 도 19G에서 기술된 마우스로부터 제조된 전체 RNA를 도시한다.
도 26은 마우스 조직에서의 BsAb17에 의한 ERK 인산화의 수준을 도시한다. 10 mg/kg BsAb17 또는 대조군 IgG의 마른 C57BL/6 마우스의 복막내 주사 1시간 후에 조직을 회수하고, 인산화된 ERK에 대해 특이적인 항체를 사용하는 면역조직화학에 적용하였다. 2마리의 동물로부터의 대표적인 영상이 각각의 군에 대해 제시된다. (1) 췌장, (2) 시교차 상핵 (화살표)을 함유하는 관상 뇌 단면, (3) 맨아래구역 (염색된 세포의 삼각형 선집) 및 중심관 (화살표)을 함유하는 관상 뇌 단면, 및 (4) 정중 융기 (화살표)를 함유하는 관상 뇌 단면. BsAb17-유도 신호가 췌장 샘꽈리 세포에서는 명확하였지만, 검사된 뇌 단면 중 어느 것에서도 그렇지 않았다는 것을 주목한다.
도 27은 BsAb20에 의한 HFD-유도 간세포 증식의 정상화를 도시한다. BsAb20 (1 또는 3 mg/kg/주) 또는 대조군 IgG (3 mg/kg/주)로 8주 동안 처리된 DIO 마우스 또는 마른 C57BL/6 마우스 대조군에서의 간 BrdU 혼입. IgG-처리 DIO 마우스에 대해 * p<0.05 (N=5~8).
도 28A는 도 28B에서 제시된 실험의 개략도이다. DIO 마우스에게 지시된 바와 같이 6주 동안 BsAb20 (1 또는 3 mg/kg/주) 또는 대조군 IgG (1 mg/kg/주)를 제공하였다. 마른 C57BL/6 마우스 대조군에게는 처리를 제공하지 않았다.
도 28B는 BsAb20 처리 후의 골 표현형을 도시한다. 대퇴골 및 경골을 절단하여, μCT 분석에 적용하였다. (N=7~8). 3 mg/kg/주 BsAb20 처리로 감소 경향을 나타냈지만 통계적 유의성에는 도달하지 않은 피질골 두께를 제외하고는, 지주골 및 피질골에서의 다양한 골 파라미터에서 음성 효과가 관찰되지 않았음을 주목한다. 칼로리가 제한된 마우스에서 지주골 밀도에서의 효과 없이 피질골 두께의 감소가 보고되었기 때문에 (11), 관찰된 효과는 체중 감소와 관련될 수 있다. 대조군 IgG로 처리된 DIO 마우스에 대해 p<0.001 (***), <0.01 (**), <0.05 (*), <0.1 (#), <0.2 ($). N=7~8.
도 29는 BsAb17 처리 후의 마우스에서의 코르티코스테론 수준을 도시한다. 단두에 의한 안락사 후 자이트게버(Zeitgeber) 시간 (ZT)=3에 혈청 코르티코스테론 수준을 측정하였다. 마른 마우스 대조군 (CTRL)에는 처리를 제공하지 않았다. 양성 대조군으로서 안락사 (ZT=0) 3시간 전에 지질다당류 (LPS)를 1 mg/kg으로 마른 마우스 내로 복막내 주사하였다 (12). 지시된 바와 같이 안락사 5일 전에 IgG를 5 또는 25 mg/kg으로 DIO 마우스 내로 복막내 주사하였다. LPS 군 없이 지시된 통계 분석을 수행하였다. N=12.
도 30은 항-FGFR1 및 항-KLB 아암이 있는 다양한 상이한 이중특이적 항체들의 FGFR1c 또는 FGFR1c 및 KLB를 발현하는 세포에 대한 결합을 나타낸다.
도 31은 ELISA에 의해 FGFR1 단백질에 대한 YW182.5 및 YW182.5 유도체의 결합을 도시한다.
상세한 설명
명확성을 위해, 그리고 비제한적으로, 본원에 개시된 주세의 상세한 설명이 하기의 하위 섹션으로 나뉜다:
I. 정의;
II. 항체;
III. 사용 방법;
IV. 제약 제제; 및
V. 제작품.
I. 정의
본원에서의 목적을 위한 "어셉터 인간 프레임워크"는 하기 정의된 바와 같은 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스(consensus) 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 "유래"된 어셉터 인간 프레임워크는 이와 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 아미노산 변화의 개수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 특정 실시양태에서, VL 어셉터 인간 프레임워크는 서열 면에서 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 동일하다.
"친화력"은 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 이의 결합 파트너 (예를 들어 항원) 사이의 비-공유결합 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용된 바와 같이, "결합 친화력"은 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 간의 1:1 상호작용을 반영하는 본질적인 결합 친화력을 지칭한다. 분자 X의 이의 파트너 Y에 대한 친화력은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표현될 수 있다. 본원에 기술된 것들을 포함하는, 관련 기술 분야에 공지된 통상적인 방법에 의해 친화력을 측정할 수 있다. 결합 친화력을 측정하기 위한 구체적인 설명적 및 예시적 실시양태가 하기에서 기술된다.
"친화력 성숙" 항체는 변경이 없는 모 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역 (HVR) 내에 하나 이상의 변경이 있는 항체를 지칭하고, 이같은 변경은 항원에 대한 항체의 친화력의 개선을 초래한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "클로토-베타", "KLB" 및 "베타-클로토"는, 달리 지시되지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 베타-클로토를 지칭한다. 이러한 용어는 프로세싱되지 않은 "전장" KLB, 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 초래되는 임의 형태의 KLB를 포함한다. 이러한 용어는 KLB의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 또한 포함한다. 신호 서열을 제외한, 본 개시내용의 항체가 표적으로 하는 인간 KLB 아미노산 서열의 비제한적인 예는 하기와 같다:
Figure pat00001
특정 실시양태에서, KLB 단백질은 아미노산 서열
Figure pat00002
의 N-말단 신호 서열을 포함할 수 있다.
"KLB의 C-말단 도메인"이라는 용어는 KLB의 카르복시-말단 글리코시다제-유사 도메인을 지칭한다. 예를 들어, 서열식별번호: 145에서 제시된 예시적인 KLB 단백질의 C-말단 도메인은 하기의 아미노산 서열을 포함한다:
Figure pat00003
"항-KLB 항체" 및 "KLB에 결합하는 항체"라는 용어는 KLB를 표적화하는 것에서 항체가 진단 및/또는 치료 작용제로서 유용하도록 충분한 친화력으로 KLB에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-KLB 단백질에 항-KLB 항체가 결합하는 정도는, 예를 들어, 방사성면역검정법 (RIA)에 의해 측정 시, 항체가 KLB에 결합하는 것의 약 10％ 미만이다. 특정 실시양태에서, KLB에 결합하는 항체는 해리 상수 (Kd)가 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)이다. 특정 실시양태에서, 항-KLB 항체는 상이한 종들로부터의 KLB 사이에서 보존되는 KLB의 에피토프에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-KLB 항체는 단백질의 C-말단 부분에 있는 KLB 상의 에피토프에 결합한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "섬유모세포 성장 인자 수용체 1" 또는 "FGFR1"이라는 용어는, 달리 지시되지 않는 한, 포유동물 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하는 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 천연 FGFR1을 지칭한다. 이러한 용어는 프로세싱되지 않은 "전장" FGFR1, 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 초래되는 임의 형태의 FGFR1을 포함한다. 이러한 용어는 FGFR1의 천연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 또한 포함한다. 인간 FGFR1c 아미노산의 비제한적인 예가 하기에서 제시된다:
Figure pat00004
"항-FGFR1c 항체"라는 용어는 FGFR1c를 표적화하는 것에서 항체가 진단 및/또는 치료 작용제로서 유용하도록 충분한 친화력으로 FGFR1c에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 관련되지 않은 비-FGFR1c 단백질에 항-FGFR1c 항체가 결합하는 정도는, 예를 들어, 방사성면역검정법 (RIA)에 의해 측정 시, 항체가 FGFR1c에 결합하는 것의 약 10％ 미만이다. 특정 실시양태에서, FGFR1c에 결합하는 항체는 해리 상수 (Kd)가 ≤ 1 M, ≤ 100 mM, ≤ 10 mM, ≤ 1 mM, ≤ 100 μM, ≤ 10 μM, ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM이다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된, FGFR1c에 결합하는 항체의 Kd는 10-3 M 이하, 또는 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-FGFR1c 항체는 상이한 종들로부터의 FGFR1c 사이에서 보존되는 FGFR1c의 에피토프에 결합한다.
본원에서의 "항체"라는 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포함하고, 단 이들은 원하는 항원-결합 활성을 나타낸다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부분을 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단일쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
기준 항체와 "결합에 대해 경쟁하는 항체"는 경쟁 검정법에서 기준 항체가 이의 항원에 결합하는 것을 50％ 이상만큼 차단하는 항체를 지칭하고, 역으로, 기준 항체가 경쟁 검정법에서 이러한 항체가 이의 항원에 결합하는 것을 50％ 이상만큼 차단한다. 예시적인 경쟁 검정법이 문헌 ["Antibodies", Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY)]에 기술되어 있다.
"키메라" 항체라는 용어는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분은 특정 공급원 또는 종으로부터 유래된 한편, 나머지 중쇄 및/또는 경쇄는 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체의 "클래스"는 항체의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM의 5가지의 주요 항체 클래스가 있고, 이들 중 몇몇은 서브클래스 (아이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나뉠 수 있다. 면역글로불린의 상이한 클래스들에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 칭해진다.
본원에서 사용된 바와 같은 "세포독성제"라는 용어는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/하거나 세포 사망 또는 파괴를 야기하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는, 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아마이신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 기타 인터칼레이팅제(intercalating agent)); 성장 억제제; 효소 및 이의 단편 예컨대 뉴클레오티드분해성 효소; 항생제; 독소 예컨대 소형 분자 독소 또는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 (이들의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 하기 개시된 다양한 항종양 또는 항암 작용제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
"이펙터 기능"은 항체 아이소타입에 따라 변하는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 C1q 결합 및 보체 의존적 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC); 포식작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화를 포함한다.
작용제, 예를 들어, 제약 제제의 "유효량"은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하는데 필요한 투여량 및 기간으로 이를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, "유효량"은 질환 및/또는 장애의 증상을 완화, 최소화 및/또는 방지할 수 있고/있거나, 생존을 연장할 수 있고/있거나, 질환 및/또는 장애가 재발할 때까지의 기간을 연장할 수 있는 본원에 개시된 항체의 양을 지칭할 수 있다.
본원에서의 "Fc 영역"이라는 용어는 불변 영역의 적어도 일부분을 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 규정하도록 사용된다. 이러한 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230부터 중쇄의 카르복실-말단까지 걸쳐진다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 또는 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 상술되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 번호매김은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기술된 바와 같은 EU 번호매김 시스템 (EU 인덱스로 또한 칭해짐)에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 VH (또는 VL)에서 일반적으로 하기의 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
"전장 항체", "무손상 항체", 및 "전체 항체"라는 용어들은 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 지니거나 또는 본원에서 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 지니는 항체를 지칭하도록 본원에서 상호교환가능하게 사용된다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 바와 같은 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양물"이라는 용어는 외인성 핵산이 도입된 세포를 지칭하고, 이같은 세포의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하고, 이는 1차 형질전환 세포 및 계대 횟수와 관계 없이 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 내용물이 완전히 동일하지 않을 수 있고, 돌연변이를 함유할 수 있다. 원래의 형질전환된 세포에 대해 스크리닝 또는 선별되는 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성이 있는 돌연변이체 자손이 본원에서 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 기타 인간 항체-코딩 서열을 이용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체의 것에 상응하는 아미노산 서열을 보유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 명확하게 제외한다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선집에서 가장 통상적으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열의 선집은 가변 도메인 서열의 하위 군으로부터의 것이다. 일반적으로, 서열의 하위 군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), Vols. 1-3]에서와 같은 하위 군이다. 특정 실시양태에서, VL의 경우에, 하위 군은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 카파 I 하위 군이다. 특정 실시양태에서, VH의 경우에, 하위 군은 상기 문헌 [Kabat et al.]에서와 같은 III 하위 군이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체이다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 하나 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 이러한 가변 도메인에서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부분을 임의적으로 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어, 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화가 진행된 항체를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열 ("상보성 결정 영역" 또는 "CDR") 면에서 초가변성이고/이거나, 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하고/하거나, 항원-접촉 잔기 ("항원 접촉부")를 함유하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인 내의 기타 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 상기 문헌 [Kabat et al.]에 따라 번호가 매겨진다. 일반적으로, 항체는 6개의 HVR을 포함한다: VH 내의 3개 (H1, H2, H3), 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3). 본원에서의 예시적인 HVR은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 발생하는 초가변 루프 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에서 발생하는 CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에서 발생하는 항원 접촉부 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3)를 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합물.
특정 실시양태에서, HVR 잔기는 도 3A 또는 도 3B 또는 본 명세서의 다른 곳에서 확인되는 것들을 포함한다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체를 지칭한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 바와 같은 "개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된" 항체는 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 것이다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정 시, 95％ 또는 99％를 초과하는 순도로 항체가 정제된다. 항체 순도의 평가 방법의 개관을 위해, 예를 들어, 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 이의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 이러한 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포 내에 함유된 핵산 분자를 포함하지만, 이러한 핵산 분자는 염색체 외에 또는 자신의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항체 (특정 항체, 예를 들어, 항-KLB 항체에 대한 언급을 포함함)를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편)을 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 지칭하고, 이는 단일 벡터 또는 별도의 벡터들 내의 이같은 핵산 분자(들), 및 숙주 세포 내의 하나 이상의 위치에 존재하는 이같은 핵산 분자(들)를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 균질한 항체들의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하고, 즉, 집단을 이루는 개별적인 항체들은, 예를 들어 천연 발생 돌연변이를 함유하거나 또는 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체 (이같은 변이체들은 일반적으로 미량으로 존재한다)을 제외하고는, 동일하고/하거나, 같은 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자들 (에피토프들)에 대해 지시된 상이한 항체들을 전형적으로 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 달리, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대해 지시된다. 따라서, 수식어구 "모노클로날"은 항체들의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된다는 항체의 특성을 가리키고, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않아야 한댜. 예를 들어, 본원에 개시된 주제에 따라 사용될 모노클로날 항체를 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 모든 인간 면역글로불린 유전자좌 또는 이의 일부분을 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 모노클로날 항체의 제조를 위한 이같은 방법 및 기타 예시적인 방법이 본원에서 기술된다.
"네이키드(naked) 항체"는 이종성 모이어티(moiety) (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성 표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제 내에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 다양한 구조의 천연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드에 의해 결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 돌턴의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단으로, 각각의 중쇄에는 가변 영역 (VH) (가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로도 칭해짐)에 이어지는 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)이 있다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 각각의 경쇄에는 가변 영역 (VL) (가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로도 칭해짐)에 이어지는 불변 경쇄 (CL) 도메인이 있다. 항체의 경쇄는, 이의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 칭해지는 2가지 유형 중 하나에 할당될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 "포장 삽입물"이라는 용어는 치료 제품의 상업용 포장에 통상적으로 포함된 설명서를 지칭하고, 이는 이같은 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기 및/또는 경고에 관한 정보를 포함한다.
기준 폴리펩티드 서열에 관한 "백분율 (％) 아미노산 서열 동일성"은 서열들을 정렬하고, 필요하다면 갭(gap)을 도입하여, 최대 백분율의 서열 동일성을 달성한 후의 기준 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로 정의되고, 이때 어떠한 보존성 치환도 서열 동일성의 일부로 간주되지 않는다. 백분율 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 목적의 정렬은 관련 기술 분야의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 비교되는 서열들의 전체 길이에 걸쳐 최대의 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 포함하여, 서열을 정렬하기 위한 적합한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원에서의 목적을 위해, 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 ％ 아미노산 서열 동일성 값이 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크 인크(Genentech, Inc.)에 의해 제작되었고, 소스 코드가 사용자 문서와 함께 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 제출되어 미국 저작권 번호 TXU510087 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크 인크 (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)로부터 공개적으로 입수가능하거나, 또는 소스 코드로부터 컴파일링(compiling)될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 포함하는 UNIX 운영 체제 상에서의 사용에 대해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우에, 소정의 아미노산 서열 B에 대한, 소정의 아미노산 서열 B와의 또는 소정의 아미노산 서열 B와 대조된 소정의 아미노산 서열 A의 ％ 아미노산 서열 동일성 (소정의 아미노산 서열 B에 대한, 소정의 아미노산 서열 B와의 또는 소정의 아미노산 서열 B와 대조된 특정 ％ 아미노산 서열 동일성을 지니는 또는 포함하는 소정의 아미노산 서열 A로 별법적으로 표현될 수 있음)은 하기와 같이 계산된다:
100 × 분수 X/Y
[식중, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 이러한 프로그램의 A와 B의 정렬에서 동일한 매치로 채점된 아미노산 잔기의 개수이고, Y는 B 내의 아미노산 잔기의 총 개수이다]. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 ％ 아미노산 서열 동일성이 A에 대한 B의 ％ 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임이 이해될 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 ％ 아미노산 서열 동일성 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞의 단락에서 기술된 바와 같이 수득된다.
"제약 제제"이라는 용어는 제형 내에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이게 허용하는 형태이고, 제형이 투여될 대상체에게 허용되지 않게 독성인 추가적인 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 방부제를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같은 "치료" (및 치료하다" 또는 "치료하는"과 같은 이의 문법적 변형)는 치료되는 개체의 천연 과정을 변경시키려는 시도의 임상적인 개입을 지칭하고, 예방을 위해 또는 임상 병리 과정 동안에 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환 발생 또는 재발을 방지하는 것, 증상 완화, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이를 방지하는 것, 질환 진행 속도를 감소시키는 것, 질환 상태의 호전 또는 고식, 및 경감 또는 예후 개선을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 질환 발달을 지연시키는데 또는 질환 진행을 느리게 하는데 사용될 수 있다.
"가변 영역" 또는 "가변 도메인"이라는 용어는 항체가 항원에 결합하는 것에서 수반되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 구조가 유사하고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원-결합 특이성을 부여하는데 충분할 수 있다. 또한, 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 각각 스크리닝하기 위해 특정 항원에 결합하는 항체를 이러한 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)]; [Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에서 사용된 바와 같은 "벡터"라는 용어는 자신이 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 이러한 용어는 자가-복제 핵산 구조물로서의 벡터뿐만 아니라 자신이 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 혼입된 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 자신이 작동적으로 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이같은 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
II. 항체
한 측면에서, 본 발명은, 부분적으로, KLB 및 FGFR1c 양쪽 모두에 결합하고, FGFR1c/KLB 수용체 복합체를 선택적으로 활성화시키며, 간에 대한 유의한 영향 및 골 질량 손실 없이, 체중 감소 및 글루코스 및 지질 대사 개선을 포함하는, FGF21-유사 활성으로부터 예상되는 이로운 대사 변화를 유도하는 이중특이적 항체의 발견을 기초로 한다.
특정 실시양태에서, KLB에 결합하는 항체가 제공된다. 본 개시내용은 항-FGFR1 항체, 예를 들어, 항-FGFR1c 항체를 추가로 제공한다. 본 개시내용은 KLB 및 FGFR1 양쪽 모두에 결합하는 이중특이적 항체 (본원에서 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체로 지칭됨)를 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 KLB 및 FGFR1c 양쪽 모두에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 KLB/FGFR1c 복합체에 대한 FGF 리간드, 예를 들어, FGF19 및 FGF21의 결합 및/또는 상호작용을 차단하지 않는 항체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 간, 예를 들어, 간 기능에 대한 유의한 영향이 없다. 특정 이론에 한정되지 않으면서, 본 개시내용의 항체는 간 내의 FGFR1c/KLB 수용체 복합체의 활성화를 초래하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 FGF21 단백질에 의한 간 내의 FGFR/KLB 수용체 복합체의 조정과 비교하여 간 내의 FGFR/KLB 수용체 복합체의 활성을 조정하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 FGFR4/KLB 복합체의 억제를 초래하지 않고/않거나 ALT, AST, ALP 및 GLDH와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 간 효소의 상승을 초래하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 간에서의 MAPK 신호전달 활성화 및/또는 Spry4 및 Dusp6 발현 변경에 이를 수 있는 간 내의 FGFR2c/KLB 복합체 및/또는 FGFR3c/KLB 복합체의 효능제로서 기능하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 FGF21 단백질에 의한 MAPK 신호전달의 활성화와 비교하여 간 내의 MAPK 신호전달의 활성화를 초래하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 간 내의 FGFR4/KLB 복합체의 효능제로서 기능하지 않는다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 어셉터 인간 프레임워크, 예를 들어, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 항체 단편, 예를 들어, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2 단편일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어, 무손상 IgG1 항체, 또는 본원에서 정의된 바와 같은 기타 항체 클래스 또는 아이소타입이다. 특정 실시양태에서, 하기에 상술된 섹션 1-7에서 기술된 바와 같이, 임의의 특색이 단독으로 또는 조합되어 본 개시내용의 항체에 혼입될 수 있다.
본 개시내용의 항체는, 예를 들어, 대사 장애의 진단 또는 치료에 유용하다. 대사 장애의 비제한적인 예는 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사 증후군 (MetS), 비만, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 비-알콜성 지방 간 질환 (NAFLD), 고지질혈증, 고혈압, 2형 당뇨병, 비-2형 당뇨병, 1형 당뇨병, 잠복성 자가면역 당뇨병 (LAD), 소아의 성숙기 발병 당뇨병 (MODY), 및 노화 및 관련 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 ALS를 포함한다.
A. 예시적인 항-KLB 항체
한 측면에서, 본 개시내용은 KLB 단백질에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-KLB 항체는 KLB의 C-말단 도메인에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-KLB 항체는 아미노산 서열 SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (서열식별번호: 142)를 포함하는 KLB의 단편에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항체는 본원에 기술된 항-KLB 항체, 예를 들어, 8C5와 동일한 에피토프에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-KLB 항체는 (a) 서열식별번호: 1-15 중 어느 하나, 예를 들어, 12 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 16-31 중 어느 하나, 예를 들어, 28 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열식별번호: 32-47 중 어느 하나, 예를 들어, 44 또는 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열식별번호: 48-62 중 어느 하나, 예를 들어, 49 또는 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열식별번호: 63-78 중 어느 하나, 예를 들어, 75 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열식별번호: 79-93 중 어느 하나, 예를 들어, 90 또는 93의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열식별번호: 12를 포함하는 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 28을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열식별번호: 44를 포함하는 HVR-H3, (d) 서열식별번호: 49를 포함하는 HVR-L1, (e) 서열식별번호: 75를 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열식별번호: 90을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-KLB 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열식별번호: 15를 포함하는 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 31을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열식별번호: 47을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열식별번호: 62를 포함하는 HVR-L1, (e) 서열식별번호: 78을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열식별번호: 93을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-KLB 항체를 제공한다.
본 개시내용은 서열식별번호: 128의 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％인 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함하는 항-KLB 항체를 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 동일성이 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％인 VH 서열은 기준 서열에 비교하여 치환 (예를 들어, 하기 개시된 바와 같은 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항-KLB 항체는 KLB에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열식별번호: 128에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 별법적으로 또는 추가적으로, 항-KLB 항체는 서열식별번호: 128에서의 VH 서열 (하기 개시된 바와 같은 이러한 서열의 번역-후 변형을 포함함)을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열식별번호: 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열식별번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 서열식별번호: 130의 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％인 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-KLB 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 동일성이 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％인 VL 서열은 기준 서열에 비교하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항-KLB 항체는 KLB에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열식별번호: 130에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 별법적으로 또는 추가적으로, 항-KLB 항체는 서열식별번호: 130에서의 VL 서열 (이러한 서열의 번역-후 변형을 포함함)을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열식별번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열식별번호: 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 93의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다.
본 개시내용은 임의의 상기에서 제공된 실시양태에서와 같은 VH 및 임의의 상기에서 제공된 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-KLB 항체를 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 항체는 각각 서열식별번호: 128 및 서열식별번호: 130에서의 VH 및 VL 서열 (이러한 서열들의 번역-후 변형을 포함함)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-KLB 항체는 아미노산 서열 SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (서열식별번호: 142)로 이루어진 KLB의 단편에 결합한다.
B. 예시적인 항-FGFR1 항체
한 측면에서, 본 개시내용은 FGFR1 단백질에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-FGFR1 항체는 FGFR1c에 결합한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열식별번호: 136을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 137을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열식별번호: 138을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열식별번호: 139를 포함하는 HVR-L1, (e) 서열식별번호: 140을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열식별번호: 141을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-FGFR1 항체를 제공한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-FGFR1 항체는 서열식별번호: 132의 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％인 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 동일성이 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％인 VH 서열은 기준 서열에 비교하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항-FGFR1 항체는 FGFR1에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열식별번호: 132에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 별법적으로 또는 추가적으로, 항-FGFR1 항체는 서열식별번호: 132에서의 VH 서열 (이러한 서열의 번역-후 변형을 포함함)을 포함한다. 특정 실시양태에서, VH는 (a) 서열식별번호: 136의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 137의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열식별번호: 138의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다.
본 개시내용은 서열식별번호: 134의 아미노산 서열에 대한 서열 동일성이 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％인 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-FGFR1 항체를 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 동일성이 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％인 VL 서열은 기준 서열에 비교하여 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 이러한 서열을 포함하는 항-FGFR1 항체는 FGFR1에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열식별번호: 134에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 발생한다. 별법적으로 또는 추가적으로, 항-FGFR1 항체는 서열식별번호: 134에서의 VL 서열 (이러한 서열의 번역-후 변형을 포함함)을 포함한다. 특정 실시양태에서, VL은 (a) 서열식별번호: 139의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (b) 서열식별번호: 140의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열식별번호: 141의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 임의의 상기에서 제공된 실시양태에서와 같은 VH 및 임의의 상기에서 제공된 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-FGFR1 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 항-FGFR1 항체는 각각 서열식별번호: 132 및 서열식별번호: 134에서의 VH 및 VL 서열 (이러한 서열들의 번역-후 변형을 포함함)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 FGFR1 항체는 아미노산 서열 KLHAVPAAKTVKFKCP (서열식별번호: 143) 또는 FKPDHRIGGYKVRY (서열식별번호: 144)로 이루어진 FGFR1c의 단편에 결합한다.
C. 예시적인 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체
본 개시내용은 KLB 및 FGFR1 양쪽 모두에 결합하는 이중특이적 항체 (즉, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체)를 추가로 제공한다. 이중특이적 항체는 2가지 상이한 결합 특이성이 있고, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,922,845 및 5,837,243; 문헌 [Zeilder (1999) J. Immunol. 163:1246-1252]; [Somasundaram (1999) Hum. Antibodies 9:47-54]; [Keler (1997) Cancer Res. 57:4008-4014]를 참조한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본원에 개시된 주제는 KLB 상에 존재하는 제1 에피토프에 대한 1개의 결합 부위 (예를 들어, 항원 결합 부위), 및 FGFR1 상에 존재하는 제2 에피토프에 대한 제2 결합 부위가 있는 이중특이적 항체를 제공한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 개시내용은 1개의 아암이 KLB에 결합하고, 본원에 개시된 항-KLB 항체 서열 중 임의의 것을 포함하며, 제2 아암이 FGFR1에 결합하고, 본원에 개시된 항-FGFR1 항체 서열 중 임의의 것을 포함하는 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 KLB 상에 존재하는 제1 에피토프에 대한 1개의 결합 부위 및 FGFR1c 상에 존재하는 제2 에피토프에 대한 제2 결합 부위가 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 KLB/FGFR1c 복합체 활성을 조정하는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 이중특이적인 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 효능제로서 기능할 수 있고, KLB/FGFR1c 복합체를 활성화시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 KLB/FGFR1c 복합체의 활성을 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％, 99％ 또는 99.9％만큼 증가시키는 항체이다. 특정 실시양태에서, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 KLB/FGFR1c 복합체의 하류 표적, 예를 들어, MAPK 및/또는 ERK의 인산화를 초래하는 항체일 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는KLB/FGFR1c 복합체 활성을 조정하고, KLB/FGFR1c 복합체에 대한 천연 FGF 리간드, 예를 들어, FGF19 및 FGF21의 상호작용 및/또는 결합을 차단하지 않는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 KLB의 부재 하에 FGF 수용체에 대한 천연 FGF 리간드의 결합 및/또는 활성을 차단하지 않는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 개시내용의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 천연 FGF 리간드와 FGFR1/KLA 복합체 및/또는 단독 FGFR1의 상호작용을 차단하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 FGFR1의 부재 하에 KLB에 대한 천연 FGF 리간드의 결합 및/또는 활성을 차단하지 않는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 개시내용의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 천연 FGF 리간드와 FGFR4/KLB 복합체, FGFR2c/KLB 복합체 및/또는 FGFR3c/KLB 복합체의 상호작용을 차단하지 않는다.
특정 실시양태에서, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1c 이중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 중쇄 및 경쇄 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 전장 중쇄는 서열식별번호: 129에 기재된 서열에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 전장 경쇄는 서열식별번호: 131에 기재된 서열에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 전장 중쇄는 서열식별번호: 129에 기재된 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 전장 경쇄는 서열식별번호: 131에 기재된 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1c 이중특이적 항체, 또는 이의 항원-결합 부분은 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 128에 기재된 서열에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 130에 기재된 서열에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 128에 기재된 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 130에 기재된 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 (a) 서열식별번호: 1-15 중 어느 하나, 예를 들어, 12 또는 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열식별번호: 16-31 중 어느 하나, 예를 들어, 28 또는 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열식별번호: 32-47 중 어느 하나, 예를 들어, 44 또는 47의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열식별번호: 48-62 중 어느 하나, 예를 들어, 49 또는 62의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열식별번호: 63-78 중 어느 하나, 예를 들어, 75 또는 78의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열식별번호: 79-93 중 어느 하나, 예를 들어, 90 또는 93의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1c 이중특이적 항체는 (a) 서열식별번호: 12를 포함하는 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 28을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열식별번호: 44를 포함하는 HVR-H3, (d) 서열식별번호: 49를 포함하는 HVR-L1, (e) 서열식별번호: 75를 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열식별번호: 90을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 (a) 서열식별번호: 15를 포함하는 HVR-H1, (b) 서열식별번호: 31을 포함하는 HVR-H2, (c) 서열식별번호: 47을 포함하는 HVR-H3, (d) 서열식별번호: 62를 포함하는 HVR-L1, (e) 서열식별번호: 78을 포함하는 HVR-L2, 및 (f) 서열식별번호: 93을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-KLB 항체를 제공한다.
특정 실시양태에서, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1c 이중특이적 항체는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 도메인은 서열식별번호: 1-15에 기재된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 도메인은 서열식별번호: 16-31에 기재된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR3 도메인은 서열식별번호: 32-47에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역 CDR1 도메인은 서열식별번호: 48-62에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역 CDR2 도메인은 서열식별번호: 63-78에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역 CDR3 도메인은 서열식별번호: 79-93에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1c 이중특이적 항체는 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 CDR1, CDR2, 및 CDR3 도메인을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR1 도메인은 서열식별번호: 1-15에 기재된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR2 도메인은 서열식별번호: 16-31에 기재된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 중쇄 가변 영역 CDR3 도메인은 서열식별번호: 32-47에 기재된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역 CDR1 도메인은 서열식별번호: 48-62에 기재된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역 CDR2 도메인은 서열식별번호: 63-78에 기재된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 경쇄 가변 영역 CDR3 도메인은 서열식별번호: 79-93에 기재된 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1c 이중특이적 항체는 서열식별번호: 15에 기재된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 31에 기재된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR2; 서열식별번호: 47에 기재된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 CDR3; 서열식별번호: 62에 기재된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR1; 서열식별번호: 78에 기재된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 서열식별번호: 93에 기재된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 CDR3.을 포함한다,
특정 실시양태에서, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 제1 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하고, 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부분을 포함하며, 제1 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 KLB 상에 존재하는 에피토프에 결합하고, 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 FGFR1, 예를 들어, FGFR1c 상에 존재하는 에피토프에 결합한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 제1 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있고, 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부분이 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제1 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 128에 기재된 서열에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제1 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 130에 기재된 서열에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 중쇄 가변 영역은 서열식별번호: 132에 기재된 서열에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부분의 경쇄 가변 영역은 서열식별번호: 134에 기재된 서열에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함한다.
특정 실시양태에서, 항-KLB 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체가 본원에서 제공된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열식별번호: 128의 VH 서열 및 서열식별번호: 130의 VL 서열을 포함하는 항-KLB 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 아미노산 서열 SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (서열식별번호: 142)로 이루어진 KLB의 단편에 결합하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체가 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열식별번호: 142에 기재된 서열에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 아미노산 서열을 갖는 KLB의 단편에 결합하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체가 제공된다.
특정 실시양태에서, 항-KLB 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체가 본원에서 제공된다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열식별번호: 129의 전장 중쇄 서열 및 서열식별번호: 131의 전장 경쇄 서열을 포함하는 항-KLB 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체가 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에서 제공된 항-FGFR1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열식별번호: 132의 VH 서열 및 서열식별번호: 134의 VL 서열을 포함하는 항-FGFR1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 아미노산 서열 KLHAVPAAKTVKFKCP (서열식별번호: 143) 또는 FKPDHRIGGYKVRY (서열식별번호: 144)를 포함하는 FGFR1c의 단편에 결합하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체가 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에서 제공된 항-FGFR1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 서열식별번호: 133의 중쇄 서열 및 서열식별번호: 135의 경쇄 서열을 포함하는 항-FGFR1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체가 제공된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 서열식별번호: 143에 기재된 서열에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 아미노산 서열을 갖는 FGFR1c의 단편에 결합한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 서열식별번호: 144에 기재된 서열에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 아미노산 서열을 갖는 FGFR1c의 단편에 결합한다.
특정 실시양태에서, 서열식별번호: 142에 기재된 서열에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 아미노산 서열을 갖는 KLB의 단편에 결합하고, 서열식별번호: 143 또는 144에 기재된 서열에 대해 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 동일한 아미노산 서열을 갖는 FGFR1c의 단편에 결합하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체가 제공된다.
특정 실시양태에서, 서열식별번호: 142에 기재된 아미노산 서열을 갖는 KLB의 단편에 결합하고, 서열식별번호: 143 또는 144에 기재된 아미노산 서열을 갖는 FGFR1c의 단편에 결합하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체가 제공된다.
1. 항체 친화력
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 해리 상수 (Kd)가 ≤ 1 M, ≤ 100 mM, ≤ 10 mM, ≤ 1 mM, ≤ 100 μM, ≤ 10 μM, ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 Kd가 약 10-3 이하, 또는 10-8 M 이하, 예를 들어, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M일 수 있다.
특정 실시양태에서, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 Kd가 약 10 nM 내지 약 10 μM인 항-FGFR1 아암을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 친화력이 낮은 FGFR1 아암이 있는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 KLB의 부재 시에 FGFR1에 단단히 결합하는 것 및 FGF1, FGF2, FGF8 및 FGF23과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 기타 FGF 리간드에 의한 FGFR1의 결합 및/또는 활성화를 방지하는 것으로부터의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체의 위험을 완화시킬 수 있다. 특정 실시양태에서, 친화력이 낮은 FGFR1 아암은, 임상적으로 유의한 부작용을 초래하지 않으면서, 항-FGFR1 하프-놉(half-knob) 항체, 비-공유결합 항-FGFR1 이량체, 공유결합 항-FGFR1 이량체 및 고분자량 종과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 항-FGFR1 불순물이 더 높은 수준으로 존재하는 것을 허용할 수 있다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 약 2％ 고분자량 종 및 1.5％ 항-FGFR1 절반-항체가 불리한 생물학적 효과를 초래하지 않으면서 본 개시내용의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체의 제제 내에 존재할 수 있다.
특정 실시양태에서, 방사성 표지 항원 결합 검정법 (RIA)에 의해 Kd를 측정할 수 있다. 특정 실시양태에서, Fab 버전의 관심 항체 및 이의 항원으로 RIA를 수행할 수 있다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 적정 시리즈의 미표지 항원의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지 항원으로 평형화시킨 후, 결합된 항원을 항-Fab 항체로 코팅된 플레이트로 포획함으로써, 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화력이 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정법에 대한 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰(multi-well) 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 내의 5 ㎍/㎖의 포획용 항-Fab 항체 (캐플 랩스(Cappel Labs))로 철야로 코팅하고, 이어서 PBS 내의 2％ (w/v) 소 혈청 알부민으로 실온 (약 23℃)에서 2 내지 5시간 동안 차단한다. 비-흡착성 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 단계 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]에서의 항-VEGF 항체인 Fab-12의 평가와 일치함). 그 후, 관심 Fab를 철야로 인큐베이션한다; 그러나, 평형에 도달되는 것을 확실히 하기 위해 인큐베이션이 더 긴 기간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속될 수 있다. 그 후, 혼합물을 포획 플레이트에 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 그 후, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 내의 0.1％ 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN)-20®)으로 8회 세정한다. 플레이트가 건조되면, 150 ㎕/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 패커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 카운터 (패커드) 상에서 10분 동안 카운팅한다. 최대 결합의 20％ 이하를 제공하는 각각의 Fab의 농도를 경쟁 결합 검정법에서 사용하기 위해 선택한다.
특정 실시양태에서, 비아코어(BIACORE)® 표면 플라즈몬 공명 검정법을 사용하여 Kd를 측정할 수 있다 . 예를 들어, 그리고 비제한적으로, ~10 반응 단위 (RU)의 고정된 항원 CM5 칩으로 25℃에서 비아코어®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크(Biacore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 검정법이 수행된다. 특정 실시양태에서, 공급업체의 설명서에 따라 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어 인크)을 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)으로 5 ㎍/㎖ (~0.2 μM)로 희석한 후, 5 ㎕/분의 유속으로 주입하여, 약 10 반응 단위 (RU)의 커플링된 단백질을 달성한다. 항원 주입 후, 1 M 에탄올아민을 주입하여 미반응 기를 차단한다. 동역학 측정을 위해, 25℃에서 약 25 ㎕/분의 유속으로 0.05％ 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제가 있는 PBS (PBST) 내의 Fab의 2배 단계 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 주입한다. 회합 및 해리 센서그램(sensorgram)을 동시에 피팅(fitting)함으로써 단순 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어® 이밸류에이션 소프트웨어(BIACORE® Evaluation Software) 버전 3.2)을 이용하여 회합 속도 (kon) 및 해리 속도 (koff)를 계산한다. koff/kon의 비율로서 평형 해리 상수 (Kd)를 계산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 온(on)-속도가 상기 표면 플라즈몬 공명 검정법에 의해 106 M-1s-1을 초과하면, 교반 큐벳이 있는 8000-시리즈 SLM-AMINCO™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic)) 또는 흐름-정지가 장착된 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments))와 같은 분광광도계에서 측정된 바와 같이, 증가하는 농도의 항원의 존재 하에서의 PBS (pH 7.2) 내의 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 밴드-패스(band-pass))의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭(quenching) 기술을 사용하여 온-속도를 결정할 수 있다.
2. 항체 단편
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv, 및 scFv 단편s, 및 하기 기술된 기타 단편을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 항체 단편의 개관을 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 개관을 위해, 예를 들어, 문헌 [Pluckthuen, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 또한 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 디아바디일 수 있다. 디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위가 있는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]; 및 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody)가 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 또한 기술되어 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 단일-도메인 항체일 수 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인 전체 또는 이의 일부분 또는 경쇄 가변 도메인 전체 또는 이의 일부분을 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체 (도만티스 인크(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어, 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조)이다.
본원에 기술된 바와 같은, 무손상 항체의 단백질분해성 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E. coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 항체 단편이 제조될 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체가, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))]에 기술되어 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 토끼, 햄스터, 토끼, 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터의 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가적인 예에서, 키메라 항체는 클래스 또는 서브클래스가 모 항체의 것으로부터 변화된 "클래스 전환" 항체일 수 있다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 키메라 항체는 인간화 항체일 수 있다. 전형적으로, 비-인간 모 항체의 특이성 및 친화력을 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소되도록 비-인간 항체가 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어, CDR (또는 이의 일부분)은 비-인간 항체로부터 유래되고 FR (또는 이의 일부분)은 인간 항체 서열로부터 유래된 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 임의적으로, 인간화 항체는 인간 불변 영역의 적어도 일부분을 또한 포함할 것이다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 항체 특이성 또는 친화력을 복원하거나 개선하기 위해, 인간화 항체 내의 일부 FR 잔기가 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법이, 예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에 개관되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)]; [Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (특이성 결정 영역 (SDR) 그래프팅(grafting)이 기술됨); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("리서피싱(resurfacing)"이 기술됨); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링(shuffling)"이 기술됨); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)] 및 [Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법이 기술됨)에 추가로 기술되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "베스트-핏(best-fit)" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위 군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)]; 및 [Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간의 성숙형 (체세포 돌연변이) 프레임워크 영역 또는 인간의 생식계열 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리를 스크리닝하는 것으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)] 및 [Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
4. 인간 항체
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 인간 항체일 수 있다. 관련 기술 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간 항체가 생산될 수 있다. 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)] 및 [Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 인간 항체가 일반적으로 기술되어 있다.
항원 챌린지에 반응하여 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역이 있는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여함으로써 인간 항체가 제조될 수 있다. 이같은 동물은 전형적으로 인간 면역글로불린 유전자좌 전체 또는 이의 일부분을 함유하고, 이는 내인성 면역글로불린 유전자좌를 교체하거나, 또는 염색체 외부에 존재하거나 동물의 염색체 내로 무작위로 통합된다. 이같은 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 면역글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 개관을 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술이 기술됨); 미국 특허 번호 5,770,429 (휴맵(HUMAB)® 기술이 기술됨); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술이 기술됨), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VELOCIMOUSE)® 기술이 기술됨)을 또한 참조한다. 이같은 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 조합하는 것에 의해, 추가로 변형될 수 있다.
하이브리도마-기반 방법에 의해 인간 항체를 또한 제조할 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기술되어 있다. (예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984)]; [Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)]; 및 [Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체가 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기술되어 있다. 추가적인 방법은, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 생산이 기술됨) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마가 기술됨)에 기술된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)이 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005)] 및 [Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기술되어 있다.
인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리함으로서 인간 항체가 또한 생성될 수 있다. 그 후 이같은 가변 도메인 서열을 원하는 인간 불변 도메인과 조합할 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술이 하기에서 기술된다.
5. 라이브러리-유래 항체
원하는 활성 또는 활성들이 있는 항체에 대해 조합형 라이브러리를 스크리닝함으로써 본 개시내용의 항체를 단리할 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성시키고 이같은 라이브러리를 원하는 결합 특성을 보유하는 항체에 대해 스크리닝하기 위한 다양한 방법이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 이같은 방법이, 예를 들어, 문헌 [Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 개관되어 있고, 예를 들어, 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554]; [Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992)]; [Marks and Bradbury, Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)]; [Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004)]; [Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004)]; [Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004)]; 및 [Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004)]에 추가로 기술되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기술된 바와 같이, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리가 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 개별적으로 클로닝되고, 파지 라이브러리에서 무작위로 조합된 후, 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 전형적으로 파지는 단일쇄 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축하는 것을 필요로 하지 않으면서 면역원에 대한 고-친화력 항체를 제공한다. 별법적으로, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기술된 바와 같이, 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자가 항원에 대한, 그리고 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공하도록 나이브(naive) 레퍼토리를 (예를 들어, 인간으로부터) 클로닝할 수 있다. 특정 실시양태에서, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기술된 바와 같이, 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 줄기 세포로부터 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하고 시험관 내에서의 재배열을 달성하도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 합성에 의해 나이브 라이브러리를 제조할 수도 있다. 인간 항체 파지 라이브러리가 기술된 특허 공보는, 예를 들어: 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 간주된다.
6. 다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체일 수 있다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성이 있는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 KLB 상에 존재하는 에피토프에 대한 것이고, 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 FGFR1 상에 존재하는 에피토프에 대한 것이고, 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 항체는 KLB 상의 에피토프에 결합할 수 있고, FGFR1 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 항체는 KLB 상의 에피토프에 결합할 수 있고, FGFR1c 상의 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체의 제조 기술은 특이성이 상이한 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "놉-인-홀(knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위해 정전기 스티어링(steering) 효과를 조작하는 것 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교시키는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 생산하는 것 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위해 "디아바디" 기술을 사용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하는 것 (예를 들어 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994))] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기술된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조하는 것에 의해 다중특이적 항체를 또한 제조할 수 있다.
"옥토푸스(Octopus) 항체"를 포함하여, 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위가 있는 조작된 항체가 본원에 또한 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
7. 항체 변이체
본원에 개시된 주제는 개시된 항체의 아미노산 서열 변이체를 추가로 제공한다. 예를 들어, 항체의 결합 친화력 및/또는 기타 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다. 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적합한 변형을 도입함으로써 또는 펩티드 합성에 의해 항체의 아미노산 서열 변이체를 제조할 수 있다. 이같은 변형은 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 최종 구축물에 도달하도록 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있고, 단 최종 항체, 즉 변형된 항체는 원하는 특성, 예를 들어, 항원-결합을 보유한다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 하나 이상의 아미노산 치환이 있을 수 있다. 치환성 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환의 비제한적인 예가 표 1에서 "바람직한 치환"이라는 표제 하에 제공된다. 더욱 실질적인 변화의 비제한적인 예가 표 1에서 "예시적 치환"이라는 표제 하에, 그리고 아미노산 측쇄 클래스와 관련하여 하기에 추가로 기술된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환을 관심 항체에 도입할 수 있고, 생성물을 원하는 활성, 예를 들어, 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성 또는 개선된 보체 의존적 세포독성 (CDC) 또는 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC)에 대해 스크리닝할 수 있다.
<표 1>
Figure pat00005
아미노산은 공통적인 측쇄 성질에 따라 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
특정 실시양태에서, 비-보존적 치환은 이러한 클래스 중 하나의 구성원을 또 다른 클래스로 교환하는 것을 수반할 것이다.
특정 실시양태에서, 치환 변이체는 한 유형은 모 항체, 예를 들어, 인간화 또는 인간 항체의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 추가적인 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 성질에서의 변형, 예를 들어, 개선 (예컨대 증가된 친화력, 감소된 면역원성이지만 이에 한정되지 않음)이 있을 것이고/이거나, 모 항체의 특정한 생물학적 성질을 실질적으로 유지할 것이다. 치환 변이체의 비제한적인 예는 친화력 성숙 항체이고, 이는 예를 들어 파지-디스플레이 친화력 성숙 기술 예컨대 본원에 기술된 것을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게, 하나 이상의 HVR 잔기가 돌연변이되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화력)에 대해 스크리닝된다.
특정 실시양태에서, 예를 들어, 항체 친화력을 개선하기 위해, HVR에서 변경 (예를 들어, 치환)이 이루어질 수 있다. 이같은 변경은 HVR "핫스팟(hotspot)", 즉, 체세포 성숙 프로세스 동안 높은 빈도로 돌연변이가 진행되는 코돈에 의해 코딩되는 잔기 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 항원과 접촉하는 잔기에서 이루어질 수 있고, 생성된 변이체 VH 또는 VL이 결합 친화력에 대해 테스트된다. 2차 라이브러리를 구축하고 이로부터 재선택하는 것에 의한 친화력 성숙이, 예를 들어, 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))]에서 기술되었다. 친화력 성숙의 특정 실시양태에서, 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발) 중 임의의 것에 의해 성숙에 대해 선택된 가변 유전자 내로 다양성이 도입될 수 있다. 그 후, 2차 라이브러리가 생성된다. 그 후, 원하는 친화력이 있는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 라이브러리가 스크리닝된다. 다양성을 도입하는 또 다른 방법은 몇몇 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개의 잔기)가 무작위화되는 HVR-지정 접근법을 수반한다. 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여, 항원 결합에서 수반되는 HVR 잔기가 구체적으로 확인될 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실이 이같은 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한 하나 이상의 HVR 내에서 발생할 수 있다. 예를 들어, 결합 친화력을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에서 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이같은 변경은, 예를 들어, HVR 내의 항원 접촉 잔기의 외부일 수 있다. 상기에서 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나 또는 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 확인하기 위한 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기술된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 칭해진다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군 (예를 들어, 하전된 잔기 예컨대 arg, asp, his, lys, 및 glu)이 확인되고, 중성이거나 음성으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 교체되어, 항체와 항원의 상호작용이 영향을 받는지가 결정된다. 최초의 치환에 대한 기능적 민감성이 실증된 아미노산 위치에서 추가적인 치환을 도입할 수 있다. 별법적으로 또는 추가적으로, 항체와 항원 사이의 접촉 지점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조. 이같은 접촉 잔기 및 이웃 잔기가 치환에 대한 후보로서 표적화 또는 제거될 수 있다. 변이체가 원하는 성질을 함유하는지를 결정하기 위해 변이체가 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기부터 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기가 있는 항체를 포함한다. 항체 분자의 기타 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, 항체-지정 효소 전구약물 요법 (ADEPT)) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 대한 항체의 N- 또는 C-말단으로의 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가 또는 감소시키도록 변경될 수 있다. 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경시킴으로써 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실이 편리하게 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 항체가 Fc 영역을 포함하는 경우, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 분지된 2-안테나성 올리고사카라이드를 전형적으로 포함하고, 이는 일반적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연결에 의해 부착된다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 2-안테나성 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 특정한 개선된 성질이 있는 항체 변이체를 생성시키기 위해 본 개시내용의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형이 이루어질 수 있다.
특정 실시양태에서, Fc 영역에 (직접적으로 또는 간접적으로) 부착된 푸코스가 결여된 탄수화물 구조를 지니는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 이같은 항체 내의 푸코스의 양은 약 1％ 내지 약 80％, 약 1％ 내지 약 65％, 약 5％ 내지 약 65％ 또는 약 20％ 내지 약 40％, 및 이들 사이의 값일 수 있다.
특정 실시양태에서, 예를 들어 WO 2008/077546에 기술된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된, Asn 297에 부착된 모든 당 구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고-만노스 구조물)의 합계에 대해 상대적인 Asn297에서의 당 사슬 내의 푸코스의 평균량을 계산함으로써 푸코스의 양을 결정할 수 있다. Asn297은 Fc 영역 내의 대략적인 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 번호매김)에 위치하는 아스파라긴 잔기를 지칭하지만, Asn297은 항체에서의 미미한 서열 변동으로 인해 위치 297의 약 ± 3개의 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294와 위치 300 사이에 위치할 수도 있다. 이같은 푸코실화 변이체는 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (프레스타, 엘(Presta, L.)); US 2004/0093621 (교와 학코 고교 컴패니 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 관한 공개 문헌의 예는 US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; 문헌 [Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004)]; [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]을 포함한다.
단백질 푸코실화가 결핍된 임의의 세포주에서 탈푸코실화 항체가 생산될 수 있다. 이러한 세포주의 비제한적인 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (프레스타, 엘); 및 WO 2004/056312 A1 (아담스(Adams) 등, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자 FUT8이 녹아웃된 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]; [Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
양분된 올리고사카라이드가 있는 항체 변이체, 예를 들어, 항체의 Fc 영역에 부착된 2-안테나성 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 양분된 항체 변이체가 추가로 제공된다. 이같은 항체 변이체는 푸코실화가 감소되고/되거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이같은 항체 변이체의 비제한적인 예가, 예를 들어, WO 2003/011878 (쟝-마레(Jean-Mairet) 등); 미국 특허 번호 6,602,684 (우마나(Umana) 등); 및 US 2005/0123546 (우마나 등)에 기술되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 1개 이상의 갈락토스 잔기가 있는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이같은 항체 변이체는 CDC 기능이 개선될 수 있다. 이같은 항체 변이체가, 예를 들어, WO 1997/30087 (파텔(Patel) 등); WO 1998/58964 (라주, 에스(Raju, S.)); 및 WO 1999/22764 (라주, 에스)에 기술되어 있다.
c) Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입됨으로써, Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 전부가 아니라 일부인 이펙터 기능을 보유하는 항체 변이체를 제공하고, 이는 이러한 변이체를 생체 내에서의 항체 반감기가 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예컨대 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 용도를 위한 바람직한 후보로 만든다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 입증하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정법을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에서 FcγR 결합이 결여되지만 (따라서, ADCC 활성이 결여될 수 있음), FcRn 결합 능력은 유지된다는 것을 확실히 하기 위해 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정법을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만 발현하는 반면, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현이 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 464면의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정법의 비제한적 예가 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)] 참조) 및 문헌 [Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기술되어 있다. 별법적으로, 비-방사성 검정법을 이용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법용 ACTI™ 비-방사성 세포독성 검정법 (셀 테크놀러지 인크(Cell Technology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 CYTOTOX 96® 비-방사성 세포독성 검정법 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이같은 검정법을 위한 유용한 이펙터 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 내츄럴 킬러(Natural Killer) (NK) 세포를 포함한다. 별법적으로 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성을 생체 내에서, 예를 들어, 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결여된다는 것을 입증하기 위해 C1q 결합 검정법을 또한 수행할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정법을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)]; [Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)]; 및 [Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 FcRn 결합 및 생체내 소거/반감기 결정을 수행할 수도 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조). 특정 실시양태에서, 예를 들어, 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에서 기술된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 초래하는 변경이 Fc 영역에서 이루어질 수 있다.
이펙터 기능이 감소된 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상이 치환된 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이같은 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297이 알라닌으로 치환된 소위 "DANA" Fc 돌연변이체를 포함하여 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상이 치환된 Fc 돌연변이체를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대한 결합이 개선 또는 감소된 특정 항체 변이체가 기술되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334 (잔기의 EU 번호매김)에서의 치환이 있는 Fc 영역을 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항체, 예를 들어, 이중특이적 항체의 Fc 영역에서 이루어진 변경은 반감기가 증가되고, 모체 IgG를 태아에 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn) (문헌 [Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)] 및 [Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)])에 대한 결합이 개선된 변이체 항체를 생산할 수 있고, 이는 US2005/0014934A1 (힌톤(Hinton) 등)에 기술되어 있다. 이러한 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환이 있는 Fc 영역을 포함한다. 이같은 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어, Fc 영역 잔기 434의 치환이 있는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 기타 예에 관하여 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 또한 참조한다.
d) 시스테인 조작 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된 시스테인 조작 항체, 예를 들어, "티오MAb"을 생성시키는 것이 바람직할 수 있다. 특정 실시양태에서, 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 발생한다. 이러한 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 놓이고, 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 면역접합체가 생성되도록, 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시키는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기의 잔기 중 임의의 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트(Kabat) 번호매김); 중쇄의 A118 (EU 번호매김); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 번호매김). 예를 들어, 미국 특허 번호 7,521,541에 기술된 바와 같이 시스테인 조작 항체가 생성될 수 있다.
e) 항체 유도체
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 관련 기술 분야에 공지되어 있고 용이하게 입수가능한 추가적인 비-단백질성 모이어티를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적절한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어 글리세롤), 폴리비닐 알코올 및 이의 혼합물을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드는 물에서의 안정성으로 인해 제조에서의 장점이 있을 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 1개를 초과하는 중합체가 부착되는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정 성질 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 치료법에서 사용될 것인지 여부 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는 고려사항을 기초로 결정될 수 있다.
특정 실시양태에서, 방사선에 대한 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비-단백질성 모이어티와 항체의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 이러한 비-단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 특정 실시양태에서, 방사선은 임의 파장의 방사선일 수 있고, 일반적인 세포는 해치지 않는 파장이지만 항체-비-단백질성 모이어티에 인접한 세포는 사망하는 온도로 비-단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
D. 항체 제조 방법
관련 기술 분야의 임의의 이용가능하거나 공지된 기술을 사용하여 본원에 개시된 항체를 제조할 수 있다. 예를 들어, 그러나 비제한적으로, 재조합 방법 및 조성물 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,816,567에 개시된 바와 같음)을 사용하여 항체를 생산할 수 있다. 항체를 생성시키는 상세한 절차가 하기 실시예에서 기술된다.
본원에 개시된 주제는 본원에 개시된 항체를 코딩하는 단리된 핵산을 추가로 제공한다. 예를 들어, 단리된 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열, 예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 코딩할 수 있다. 특정 실시양태에서, 단리된 핵산은 서열식별번호: 128에 기재된 서열을 갖는 중쇄 가변 영역 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열, 및/또는 서열식별번호: 130에 기재된 서열을 갖는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 핵산은 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 발현 벡터 내에 존재할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "벡터"라는 용어는 자신이 연결된 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터의 한 유형은 "플라스미드"이고, 이는 추가적인 DNA 절편이 결찰될 수 있는 원형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 벡터의 또 다른 유형은 추가적인 DNA 절편이 바이러스 게놈 내로 결찰될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 자신이 도입된 숙주 세포 내에서의 자가 복제가 가능하다 (예를 들어, 박테리아 복제 기원이 있는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 기타 벡터 (예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로의 도입 시 숙주 세포의 게놈 내로 통합되고, 이에 의해 숙주 게놈과 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터 (발현 벡터)는 자신이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 (벡터)의 형태이다. 그러나, 개시된 주제는 등가의 기능을 수행하는 기타 형태의 발현 벡터, 예컨대 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-연관 바이러스)를 포함하도록 의도된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체를 코딩하는 핵산 및/또는 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질감염, 전기천공, 미세주입, 핵산 서열을 함유하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터로의 감염, 세포 융합, 염색체-매개 유전자 전달, 마이크로셀(microcell)-매개 유전자 전달, 스페로플라스트(spheroplast) 융합 등을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 세포 내로 핵산을 도입하는 것이 수행될 수 있다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터를 포함할 수 있고, 예를 들어, 이러한 벡터로 형질감염되었다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포, 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
특정 실시양태에서, 항-KLB 항체 또는 항-FGFR1c를 제조하는 방법은 항체를 코딩하는 핵산이 도입된 숙주 세포를 항체 발현에 적절한 조건 하에 배양하는 것 및 임의적으로 숙주 세포 및/또는 숙주 세포 배양 배지로부터 항체를 회수하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 크로마토그래피 기술을 통해 항체가 숙주 세포로부터 회수된다.
본 개시내용의 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어, 상기 기술된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 숙주 세포에서의 추가적인 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입할 수 있다. 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 잇는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의해) 이같은 핵산을 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다.
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적절한 숙주 세포는 본원에 기술된 원핵생물 또는 진핵생물 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않는 경우에, 항체가 박테리아에서 생산될 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523을 참조한다. (이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현이 기술된 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254]을 또한 참조한다.) 발현 후, 항체를 가용성 분획에서 박테리아 페이스트로부터 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물에 더하여, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분적으로 또는 완전히 인간형인 글리코실화 패턴을 지니는 항체의 생산을 초래하는 진균 및 효모 균주를 포함하여, 진핵생물 미생물 예컨대 필라멘트형 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터에 대한 적절한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004)], 및 [Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다. 글리코실화된 항체의 발현을 위한 적절한 숙주 세포가 다세포 생물 (무척추 동물 및 척추동물)로부터 유래될 수도 있다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있는 다수의 배큘로바이러스 균주가 확인되어 있다.
글리코실화된 항체의 발현을 위한 적절한 숙주 세포가 다세포 생물 (무척추 동물 및 척추동물)로부터 또한 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 곤충 세포와 함께, 특히 스포돕테라 프루기페르다 세포의 형질감염을 위해 사용될 수 있는 다수의 배큘로바이러스 균주가 확인되어 있다.
특정 실시양태에서, 식물 세포 배양물이 숙주 세포로서 이용될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디즈(PLANTIBODIES)™ 기술이 기술됨)를 참조한다.
특정 실시양태에서, 척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 현탁액에서 성장하도록 개조된 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 비제한적인 예는 SV40으로 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들어, 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기술된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어, 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기술된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어, 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기술된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 기타 유용한 포유동물 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980))를 포함하는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포; 및 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적절한 특정 포유동물 숙주 세포주의 개관을 위해, 예를 들어, 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 이중특이적 및/또는 다중특이적 항체의 제조 기술은 특이성이 상이한 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)], PCT 특허 출원 번호 WO 93/08829, 및 [Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "놉-인-홀" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위해 정전기 스티어링 효과를 조작하는 것 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교시키는 것 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이적 항체를 생산하는 것 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편을 제조하기 위해 "디아바디" 기술을 사용하는 것 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용하는 것 (예를 들어 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994))] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기술된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조하는 것에 의해 이중특이적 항체를 또한 제조할 수 있다.
화학 기술 (예를 들어, 문헌 [Kranz (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807] 참조), "폴리도마(polydoma)" 기술 (예를 들어, 미국 특허 4,474,893 참조), 또는 재조합 DNA 기술을 사용하여 본 개시내용의 이중특이적 및 다중특이적 분자를 제조할 수도 있다. 관련 기술 분야에 공지되어 있고 본원에 기술된 바와 같은 방법을 사용하여 구성 요소인 결합 특이성, 예를 들어, 제1 에피토프 및 제2 에피토프 결합 특이성을 접합시킴으로써 본원에 개시된 주제의 이중특이적 및 다중특이적 분자를 제조할 수도 있다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 각각의 결합 특이성을 개별적으로 생성시킨 후, 서로 접합시킬 수 있다. 결합 특이성이 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링 또는 가교제를 공유결합 접합에 사용할 수 있다. 가교제의 비제한적인 예는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오)프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Karpovsky (1984) J. Exp. Med. 160:1686]; [Liu (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648] 참조). 기타 방법은 문헌 [Paulus, Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78, 118-132]; [Brennan (1985) Science 229:81-83], [Glennie (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375]에 기술된 것들을 포함한다. 결합 특이성이 항체 (예를 들어, 2개의 인간화 항체)인 경우, 이들은 2개의 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합을 통해 접합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 접합 전에 홀수 개의 술프히드릴 잔기, 예를 들어, 1개를 함유하도록 힌지 영역이 변형될 수 있다.
특정 실시양태에서, 이중특이적 항체의 양쪽 결합 특이성이 동일한 벡터 내에 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 조립될 수 있다. 이러한 방법은 이중특이적 및 다중특이적 분자가 MAb × MAb, MAb × Fab, Fab × F(ab')2 또는 리간드 × Fab 융합 단백질인 경우에 특히 유용하다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 이중특이적 항체는 단일쇄 분자, 예컨대 단일쇄 이중특이적 항체, 1개의 단일쇄 항체 및 결합 결정인자를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자, 또는 2개의 결합 결정인자를 포함하는 단일쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 또한 이중특이적 및 다중특이적 분자는 단일쇄 분자일 수 있거나 또는 2개 이상의 단일쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자의 제조 방법이, 예를 들어, 미국 특허 번호 5,260,203; 미국 특허 번호 5,455,030; 미국 특허 번호 4,881,175; 미국 특허 번호 5,132,405; 미국 특허 번호 5,091,513; 미국 특허 번호 5,476,786; 미국 특허 번호 5,013,653; 미국 특허 번호 5,258,498; 및 미국 특허 번호 5,482,858에 기술되어 있다. "옥토푸스" 항체를 포함하여 3개 이상의 기능성 항원 결합 부위 (예를 들어, 에피토프 결합 부위)가 있는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본 개시내용은 삼중특이적, 예를 들어, 삼중기능성 항체를 추가로 제공한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 개시내용의 삼중특이적 항체는 KLB 상에 존재하는 에피토프, FGFR1 상에 존재하는 에피토프, 및 PCSK9, GCGR, AdipoR, ZnT8, ApoL1, MSTN, InsR 또는 FABP4와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 제3 단백질 상에 존재하는 에피토프 또는 항원에 결합하고/하거나 이와 상호작용할 수 있다.
특정 실시양태에서, 동물 시스템이 본 개시내용의 항체를 생산하는데 사용될 수 있다. 하이브리도마를 제조하기 위한 한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 생산은 잘 확립되어 있는 절차이다. 융합을 위한 면역화된 비장 세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예를 들어, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 절차가 또한 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor New York] 참조).
E. 검정법
관련 기술 분야에 공지되어 있고 본원에서 제공되는 다양한 검정법에 의해 본원에서 제공된 본 개시내용의 항체를 이의 물리적/화학적 성질 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인하거나, 스크리닝하거나 또는 특성화할 수 있다.
1. 결합 검정법 및 기타 검정법
특정 실시양태에서, 공지된 방법, 예컨대 효소-결합 면역흡착 검정법 (ELISA), 방사성 면역검정법 (RIA), 또는 웨스턴 블롯 검정법에 의해 본 개시내용의 항체를 이의 항원 결합 활성에 대해 테스트할 수 있다. 일반적으로 각각의 이러한 검정법은 관심 복합체에 대해 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)를 이용함으로써 특정 관심 대상인 단백질-항체 복합체의 존재를 검출한다. 예를 들어, 항체-KLB 복합체를 인식하고 이에 특이적으로 결합하는 효소-결합 항체 또는 항체 단편을 예를 들어 사용하여 KLB-항체 복합체를 검출할 수 있다. 별법적으로, 다양한 기타 면역검정법 중 임의의 것을 사용하여 복합체를 검출할 수 있다. 예를 들어, 항체를 방사성으로 표지하여 방사성 면역검정법 (RIA)에서 사용할 수 있다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함된 문헌 [Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986] 참조). 가이거 카운터 또는 섬광 카운터를 사용하는 것과 같은 수단에 의해 또는 자가방사선술에 의해 방사성 동위원소를 검출할 수 있다.
특정 실시양태에서, 경쟁 검정법을 사용하여 KLB에 결합하는 것에 대해 본 개시내용의 항-KLB 항체, 예를 들어, 12A11 또는 8C5와 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이같은 경쟁 항체는 12A11 또는 8C5가 결합하는 것과 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 맵핑(mapping)하는 상세한 예시적인 방법이 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에서 제공된다.
경쟁 검정법의 비제한적인 예에서, 고정된 KLB를 KLB에 결합하는 표지된 제1 항체 (예를 들어, 12A11 또는 8C5), 및 KLB에 결합하는 것에 대해 제1 항체와 경쟁하는 능력에 대해 테스트되는 표지되지 않은 제2 항체를 포함하는 용액에서 인큐베이션할 수 있다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액 내에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정된 KLB를 표지된 제1 항체를 포함하지만 표지되지 않은 제2 항체는 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션한다. 제1 항체가 KLB에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에서 인큐베이션한 후, 과량의 결합되지 않은 항체를 제거하고, 고정된 KLB와 회합된 표지의 양을 측정한다. 고정된 KLB와 회합된 표지의 양이 대조군 샘플과 비교하여 테스트 샘플에서 실질적으로 감소되면, 이는 KLB에 결합하는 것에 대해 제2 항체가 제1 항체와 경쟁한다는 것을 가리킨다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
2. 활성 검정법
본 개시내용은 생물학적 활성이 있는 본 개시내용의 항-KLB 항체를 확인하기 위한 검정법을 제공한다. 생물학적 활성은, 예를 들어, KLB/FGFR1c 수용체 복합체를 활성화시키는 것을 포함할 수 있다. 생체 내 및/또는 시험관 내에서 이같은 생물학적 활성이 있는 항체가 또한 제공된다. 특정 실시양태에서, 이러한 검정법은 본 개시내용의 항체를 세포, 예를 들어, KLB를 발현하는 293T 세포에 결합시키고, KLB-FGFR1c 수용체 복합체의 하나 이상의 하류 표적, 예를 들어, ERK의 활성 및/또는 인산화 상태를 분석하는 것을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 검정법은 본 개시내용의 항체를 대상체, 예를 들어, 비-인간 동물에게 투여하고, 항체가 대상체에서의 글루코스 수준에 대해 지니는 효과를 분석하는 것을 포함할 수 있다.
F. 면역접합체
본원에 개시된 주제는 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원에 개시된 항체를 포함하는 면역접합체를 추가로 제공한다. 예를 들어, 개시된 주제의 항체 또는 항원-결합 부분이 하나 이상의 다른 결합 분자, 예컨대 또 다른 항체, 항체 단편, 펩티드 또는 결합 모방체에 (예를 들어, 화학적 커플링, 유전자 융합, 비-공유결합 회합 등에 의해) 기능적으로 연결될 수 있다.
특정 실시양태에서, 면역접합체는 항체가 메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 참조); 오리스타틴 예컨대 모노메틸오리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리키아마이신 또는 이의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 및 5,877,296; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993)]; 및 [Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라사이클린 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (문헌 [Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006)]; [Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006)]; [Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005)]; [Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000)]; [Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002)]; [King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002)]; 및 미국 특허 번호 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀, 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하지만 이에 한정되지 않는 하나 이상의 약물에 접합된 항체-약물 접합체 (ADC)이다.
특정 실시양태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비-결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터의 것), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하지만 이에 한정되지 않는 효소적으로 활성인 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에 기술된 바와 같은 항체를 포함한다.
특정 실시양태에서, 면역접합체는 방사성 접합체를 형성하도록 방사성 원자에 접합된 본원에 기술된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성 접합체의 생산을 위해 이용가능하다. 비제한적인 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사성 접합체가 검출에 사용되는 경우, 이는 섬광조영술 연구용 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로 또한 공지됨)를 위한 스핀 표지, 예컨대 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 불소-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
다양한 이관능성 단백질 커플링제 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대 비스-(p-디아조늄벤조일-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체 및 세포독성제의 접합체가 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기술된 바와 같이 리신 면역독소가 제조될 수 있다. 탄소-14-표지 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 방사성 뉴클레오디드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이팅제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포 내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 광-불안정 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)를 사용할 수 있다.
본원에서의 면역접합체 또는 ADC는 시판되는 (예를 들어, 피어스 바이오테크놀러지 인크(Pierce Biotechnology, Inc.) (미국 일리노이주 록포드)로부터 시판되는) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC, 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하지만 이에 한정되지 않는 가교제 시약으로 제조된 접합체를 명백하게 고려하지만, 이에 한정되지 않는다.
III. 사용 방법
본원에 개시된 주제는 개시된 항체, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1c 이중특이적 항체를 사용하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 본원에 개시된 항체의 치료적 용도에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 개시된 항체의 진단 방법에서의 용도에 관한 것이다.
A. 진단 및 검출 방법
특정 실시양태에서, KLB에 대한 특이성이 있는 본원에 개시된 임의의 항체, 예를 들어, 상기 개시된 항-KLB 항체 및/또는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 생물학적 샘플 내의 KLB의 존재를 검출하는데 유용할 수 있다. 추가적인 측면에서, 본원에 개시된 주제는 본원에 개시된 항-KLB 항체 또는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체를 사용하여 질환을 진단 및/또는 검출하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "검출"이라는 용어는 정량적 및/또는 정성적 검출을 포함한다.
특정한 비제한적 실시양태에서, 생물학적 샘플은 임상 샘플, 하나 이상의 세포, 배양물 내의 세포, 세포 상청액, 세포 용해물 및 조직 샘플을 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 샘플 공급원은 개체로부터의 고형 조직 (예를 들어, 신선하고/하거나 동결되었고/되었거나 보존된 장기, 조직 샘플, 생검 시료, 또는 흡인물로부터의 것) 또는 세포일 수 있다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 간, 예를 들어, 대상체의 간으로부터의 하나 이상의 세포 및/또는 조직을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에서 사용하기 위한 항-KLB 항체가 제공된다. 추가적인 측면에서, 생물학적 샘플 내의 KLB의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법은 생물학적 샘플을 본원에 기술된 바와 같은, KLB 상에 존재하는 에피토프에 결합하는 항체와 이러한 항체가 KLB에 결합하는 것을 허용하는 조건 하에 접촉시키고, 항체와 KLB사이에 복합체가 형성되는지를 검출하는 것을 포함한다. 이같은 방법은 시험관내 또는 생체내 방법, 예를 들어, 면역형광 또는 웨스턴 블롯일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-KLB 항체로의 치료에 적격인 대상체를 선별하는데, 예를 들어, KLB가 환자 선별을 위한 바이오마커인 경우에 항-KLB 항체가 사용된다.
특정 실시양태에서, 개시된 방법에서 사용하기 위한 본 개시내용의 항체, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 간, 예를 들어, 간 기능에 대한 유의한 영향이 없다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 FGF21 단백질에 의한 간 내의 FGFR/KLB 수용체 복합체의 조정과 비교하여 FGFR/KLB 수용체 복합체의 활성을 조정하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 FGFR4/KLB 복합체의 억제를 초래하지 않고/않거나 ALT, AST, ALP 및 GLDH와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 간 효소의 상승을 초래하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 간에서의 MAPK 신호전달 활성화 및/또는 Spry4 및 Dusp6 발현 변경에 이를 수 있는 간 내의 FGFR2c/KLB 복합체 및/또는 FGFR3c/KLB 복합체의 효능제로서 기능하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 FGF21 단백질에 의한 MAPK 신호전달의 활성화와 비교하여 간 내의 MAPK 신호전달의 활성화를 초래하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 간 내의 FGFR4/KLB 복합체의 효능제로서 기능하지 않는다.
특정 실시양태에서, 개시된 방법에서 사용하기 위한 본 개시내용의 항체, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 KLB/FGFR1c 복합체에 대한 FGF 리간드, 예를 들어, FGF19 및 FGF21의 결합 및/또는 상호작용을 차단하지 않는 항체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 KLB/FGFR1c 복합체 활성을 조정하고, KLB/FGFR1c 복합체에 대한 천연 FGF 리간드, 예를 들어, FGF19 및 FGF21의 상호작용 및/또는 결합을 차단하지 않는 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 KLB의 부재 하에 FGF 수용체에 대한 천연 FGF 리간드의 결합 및/또는 활성을 차단하지 않는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 개시내용의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 천연 FGF 리간드와 FGFR1/KLA 복합체 및/또는 단독 FGFR1의 상호작용을 차단하지 않는다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 FGFR1의 부재 하에 KLB에 대한 천연 FGF 리간드의 결합 및/또는 활성을 차단하지 않는 항체를 지칭한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 개시내용의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 천연 FGF 리간드와 FGFR4/KLB 복합체, FGFR2c/KLB 복합체 및/또는 FGFR3c/KLB 복합체의 상호작용을 차단하지 않는다.
특정 실시양태에서, 개시된 방법에서 사용하기 위한 항-KLB 항체, 항-FGFR1c 및/또는 항-KLB/항-FGFR1, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1c 이중특이적 항체가 표지될 수 있다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티, 예컨대 형광, 발색, 전자-조밀, 화학발광, 및 방사성 표지, 뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 표지의 비제한적인 예는 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플로오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예를 들어, 개똥벌레 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456 참조), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, 베타-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 라이소자임, 당류 옥시다제, 예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 과산화수소를 사용하여 염료 전구체를 산화시키는 효소 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제 예컨대 유리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀(spin) 표지, 박테리오파지 표지, 안정적인 유리 라디칼 등을 포함한다.
B. 치료 방법
특정 실시양태에서, 하나 이상의 본원에 개시된 주제의 항체가 대상체에서 질환 및/또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 그러나 비제한적으로, 질환은 대사 장애일 수 있다. 대사 장애의 비제한적인 예는 다낭성 난소 증후군 (PCOS), 대사 증후군 (MetS), 비만, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 비-알콜성 지방 간 질환 (NAFLD), 고지질혈증, 고혈압, 2형 당뇨병, 비-2형 당뇨병, 1형 당뇨병, 잠복성 자가면역 당뇨병 (LAD) 및 소아의 성숙기 발병 당뇨병 (MODY)을 포함한다. 특정 실시양태에서, 대사 장애는 2형 당뇨병이다. 특정 실시양태에서, 대사 장애는 비만이다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 본원에 개시된 주제의 항체가 바르데-비들 증후군, 프라더-윌리 증후군, 알스트롬 증후군, 코헨 증후군, 올브라이트 유전성 골형성장애 (가성 부갑상선기능저하증), 카펜터 증후군, MOMO 증후군, 루빈스타인-테이비 증후군, 취약 X 증후군 및 보제슨-포스만-레만 증후군을 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 본원에 개시된 주제의 항체가 노화 및 관련 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 ALS를 치료하는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 본원에 개시된 주제의 항체가 심장 질환, 뇌졸중, 심장 발작, 고인슐린혈증, 고혈압, 관상 동맥 질환, 비만 또는 두개 고혈압과 직접적으로 관련된 편두통 또는 두통, 울혈성 심부전, 신생물, 이상지질혈증, 빈혈, 담낭 질환, 골관절염, 퇴행성 관절염, 퇴행성 디스크, 퇴행성 관절 질환, 관절 대체, 가속화된 퇴행성 관절 질환, 천식, 반복된 폐렴, 반복된 늑막염, 반복된 기관지염, 폐 제한, 위식도 역류 (gerd), 과도한 안면 및 신체 모발 (다모증), 발진, 만성 피부 감염, 과도한 발한, 빈번한 효모 감염, 스트레스성 요실금, 생리 불순, 호르몬 이상, 다낭성 난소, 불임, 암종 (예를 들어, 유방암, 결장암 및 자궁암), 수면 무호흡, 대뇌 가성 종양, 우울증, 심리적/성적 기능장애, 사회적 차별 및 조기 사망을 치료하는데 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 치료 방법에서 사용하기 위한 항체를 제공한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 개시내용은 유효량의 본원에 개시된 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 대사 장애, 예를 들어, PCOS, MetS, 비만, NASH, NAFLD, 고지질혈증, 고혈압, 2형 당뇨병, 비-2형 당뇨병, 1형 당뇨병, LAD, MODY, 및 노화 및 관련 질환 예컨대 알츠하이머병, 파킨슨병 및 ALS에 걸린 대상체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 항체, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 개체에게 유효량의 항체를 투여하는 것을 포함하는, 상기에서 기술된 질환 또는 장애에 걸린 대상체를 치료하는 방법에서 사용하기 위한 항체, 예를 들어, 항-KLB/FGFR1 이중특이적 항체를 제공한다.
특정 실시양태에서, 이러한 방법은 대상체에게 유효량의 하나 이상의 추가적인 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 추가적인 치료제, 예를 들어, 제2 치료제의 비제한적인 예가 하기에서 기술된다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용은 유효량의 하나 이상의 본 개시내용의 항체, 예를 들어, 항-KLB/FGFR1 이중특이적 항체를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 체중 감소를 유도하는 방법을 추가로 제공한다.
본원에서 상호교환가능하게 사용된 바와 같은 "개체", "환자" 또는 "대상체"는 포유동물을 지칭한다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개, 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
본원에 개시된 주제는, 예를 들어, 대상체에서, KLB/FGFR1c 공동수용체 복합체를 활성화시키는데 사용하기 위한 항체, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체를 추가로 제공한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 항-KLB/항-FGFR1c 이중특이적 항체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 대상체에서 KLB/FGFR1c 공동수용체 복합체를 활성화시키는 방법에서 사용하기 위한 항체, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 대상체에게 유효량의 항체를 투여하여 KLB/FGFR1c 수용체 복합체를 활성화시키는 것을 포함한다.
본 개시내용의 항체는 단독으로 또는 다른 작용제와 조합되어 치료법에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 개시내용의 항체는 하나 이상의 추가적인 치료제와 공동-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 제2/추가적인 치료제는 항당뇨병제, 항비만제, 또는 대사 병태용 의약 (예컨대 항고혈압 의약 및 스타틴이지만, 이에 한정되지 않음)을 포함할 수 있다. 제2/추가적인 치료제의 비제한적인 예는 메트포르민, 피오글리타존, DPP4i, GLP1-유사체, 술포닐우레아, 인슐린, 렙틴-유사체 및 로카세린 (예를 들어, BELVIQ®)을 포함한다.
본 개시내용은 의약의 제작 또는 제조에서의 항체, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체의 용도를 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 의약은 상기 개시된 바와 같은 대사 장애의 치료를 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 비만 치료를 위한 의약의 제조에서의 항체의 용도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용은 2형 당뇨병을 위한 의약의 제조에서의 항체의 용도를 제공한다. 특정 실시양태에서, 이러한 방법은 개체에에 유효량의 하나 이상의 추가적인 치료제 (예를 들어, 상기 기술된 바와 같음)를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 의약은 KLB/FGFR1c 공동수용체 복합체를 활성화시키기 위한 것이다. 특정 실시양태에서, 의약은 개체에게 KLB/FGFR1c 공동수용체 복합체를 활성화시키는데 효과적인 양의 의약을 투여하는 것을 포함하는, 개체에서 KLB/FGFR1c 공동수용체 복합체를 활성화시키는 방법에서 사용될 수 있다.
특정 실시양태에서, 개시된 치료 방법에서 사용하기 위한 항체는 제약 조성물 내에 존재할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 하나 이상의 본 개시내용의 항체를 포함할 수 있다.
추가적으로 또는 별법적으로, 제약 조성물은 제2 치료제를 포함할 수 있다. 하나 이상의 개시된 항체가 또 다른 치료제와 함께 투여되는 경우, 하나 이상의 항체 및 다른 치료제는 임의 순서로 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 언급된 이같은 조합 요법은 조합 투여 (2가지 이상의 치료제가 동일한 제형 또는 분리된 제형 내에 포함됨), 및 분리 투여를 포함하고, 분리 투여의 경우, 본 개시내용의 항체의 투여는 추가적인 치료제 또는 치료제들의 투여 전에, 이의 투여와 동시에, 및/또는 이의 투여 후에 발생할 수 있다. 한 실시양태에서, 본 개시내용의 항체의 투여 및 추가적인 치료제의 투여는 서로 약 1개월 이내, 또는 약 1주일, 2주일 또는 3주일 이내, 또는 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일 또는 6일 이내에 발생한다.
본 개시내용의 항체 (및 임의의 추가적인 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내, 및 국소 치료에 바람직한 경우의 병변내 투여를 포함하여 임의의 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내 또는 피하 투여를 포함한다. 부분적으로 투여가 단기적인지 또는 장기적인지에 따라, 임의의 적절한 경로에 의해, 예를 들어, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 투약될 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여, 및 펄스 주입을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 구상된다.
본 개시내용의 항체는 우수 진료 규범(good medical practice)에 일치하는 방식으로 제형, 투약, 및 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려될 요인은 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별적인 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 일정, 및 의료진에게 공지된 기타 요인을 포함한다. 항체는, 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의적으로는 당해 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제형된다. 이같은 다른 작용제의 유효량은 제형 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 기타 요인에 좌우된다. 일반적으로 이들은 본원에 기술된 것과 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기술된 투여량의 약 1 내지 99％로, 또는 적합한 것으로 실험적/임상적으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 개시내용의 항체의 적합한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 추가적인 치료제와 조합되어 사용되는 경우)은 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 또는 치료 목적으로 투여되는지 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 좌우될 것이다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체는 필요에 따르는 것을 기초로 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 환자에게 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 투여될 수 있다. 예를 들어, 그러나 비제한적으로, 본원에 개시된 바와 같은 항체 및/또는 항체를 함유하는 제약 제제은 대상체에게 하루에 2번, 하루에 1번, 2일에 1번, 3일에 1번, 4일에 1번, 5일에 1번, 6일에 1번, 1주일에 1번, 2주일에 1번, 3주일에 1번, 1개월에 1번, 2개월에 1번, 3개월에 1번, 6개월에 1번 또는 1년에 1번 투여될 수 있다.
특정 실시양태에서, 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어, 1회 이상의 분리된 투여에 의한 것이든 또는 연속 주입에 의한 것이든, 약 1 ㎍/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg-10 mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 전형적인 일일 투여량은 상기 언급된 요인들에 따라 약 1 ㎍/kg 내지 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 특정 실시양태에서, 일일 투여량은 약 100 mg/kg을 초과할 수 있다. 특정 실시양태에서, 1-1000 ㎍/㎖, 일부 방법에서는 25-300 ㎍/㎖의 혈장 항체 농도를 달성하도록 투여량이 조정될 수 있다.
수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우에, 병태에 따라, 질환 증상의 원하는 억제가 발생할 때까지 일반적으로 치료가 지속될 수 있다. 한 예시적인 항체 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 특정 실시양태에서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 별법적으로, 항체가 지속 방출 제형으로서 투여될 수 있고, 이러한 경우에 덜 빈번한 투여가 요구된다. 투여량 및 빈도는 환자 내에서의 항체의 반감기를 기초로 변할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이같은 용량은 간헐적으로, 예를 들어, 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 환자에게 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 제공되도록). 초기의 더 높은 로딩 용량에 이어서 1회 이상의 더 낮은 용량을 투여할 수 있다.
특정 실시양태에서, 이러한 벙법은 대상체를 모니터링하고 치료 효과를 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 요법의 진행을 통상적인 기술 및 검정법에 의해 쉽게 모니터링할 수 있다.
IV. 제약 제제
본원에 개시된 주제는 하나 이상의 본원에 기술된 바와 같은 항체를 제약상 허용되는 담체와 함께 함유하는 제약 제제을 추가로 제공한다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 다수 (예를 들어, 2가지 이상)의 본원에 개시된 주제의 항체 및/또는 이의 항원-결합 부분을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 개시내용의 제약 조성물은 하나 이상의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 원하는 정도의 순도를 지니는 항체를 하나 이상의 임의적인 제약상 허용되는 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 조합함으로써 개시된 제약 제제이 동결건조 제형 또는 수용액의 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 그러나 비제한적으로, 동결건조 항체 제형이 미국 특허 번호 6,267,958에 기술되어 있다. 특정 실시양태에서, 수성 항체 제형은 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기술된 것들을 포함하고, 후자 제형은 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다. 특정 실시양태에서, 항체는 순도가 약 80％ 초과, 약 90％ 초과, 약 91％ 초과, 약 92％ 초과, 약 93％ 초과, 약 94％ 초과, 약 95％ 초과, 약 96％ 초과, 약 97％ 초과, 약 98％ 초과, 약 99％ 초과, 약 99.1％ 초과, 약 99.2％ 초과, 약 99.3％ 초과, 약 99.4％ 초과, 약 99.5％ 초과, 약 99.6％ 초과, 약 99.7％ 초과, 약 99.8％ 초과 또는 약 99.9％ 초과일 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 일반적으로 수용자에게 비독성이고, 완충제 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥사놀, 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기)의 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린; 친수성 중합체 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; 킬레이팅제 예컨대 EDTA; 당 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 카운터 이온 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 본원에서의 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산 작용제 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, 박스터 인터내셔널 인크(Baxter International, Inc.))를 추가로 포함한다. rHuPH20를 포함하는 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법이 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기술되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP가 하나 이상의 추가적인 글리코스아미노글리카나제 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척추 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의한 투여)에 적절할 수 있다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체가 화합물을 불활성화시킬 수 있는 산의 작용 및 기타 천연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질 내에 코팅될 수 있다
본 개시내용의 제약 조성물은 조합 요법으로 또한 투여될 수 있고, 즉 다른 작용제와 조합될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 제약 조성물은 치료되는 특정 적응증에 필요한 바와 같은 하나를 초과하는 활성 성분, 예를 들어, 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성이 있는 것들을 또한 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제약 제제은 제1 치료제에 의해 치료되는 질환과 동일한 질환을 치료하기 위한 제2 활성 성분을 포함할 수 있다. 이같은 활성 성분들은 의도되는 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적절하게 존재한다. 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 본 개시내용의 제형은 치료되는 특정 적응증에 필요한 바와 같은 하나를 초과하는 활성 성분, 바람직하게는 서로 불리하게 영향을 미치지 않는 상보적 활성이 있는 것들을 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 동일한 질환의 치료에 유용한 제2 치료제를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이같은 활성 성분들은 의도되는 목적에 효과적인 양으로 조합되어 적절하게 존재한다.
본 개시내용의 조성물은 관련 기술 분야에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라진다. 이식물, 경피 패치 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함하는 제어 방출 제형과 같이, 활성 화합물이 급속한 방출에 대해 화합물을 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 생체분해성, 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 다가무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리아크릴산을 사용할 수 있다. 이같은 제형의 제조를 위한 다수의 방법이, 예를 들어, 문헌 [Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]에 기술되어 있다. 특정 실시양태에서, 제약 조성물은 미국 식약청의 우수 의약품 제조 기준(Good Manufacturing Practice) (GMP) 조건 하에 제조된다.
개시된 항체를 함유하는 지속-방출 제제를 또한 제조할 수 있다. 지속-방출 제제의 적절한 예는 항체를 함유하는 소수성 고체 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 특정 실시양태에서, 예를 들어 코아세르베이션(coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀션, 나노입자 및 나노캡슐) 내에, 또는 마크로에멀션 내에 활성 성분이 포획될 수 있다. 이같은 기술이 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
특정 경로에 의해 본 개시내용의 항체를 투여하기 위해, 화합물을 이의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나 또는 화합물을 이러한 물질과 공동-투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 화합물이 적합한 담체, 예를 들어, 리포솜, 또는 희석제 내에서 대상체에게 투여될 수 있다. 제약상 허용되는 희석제는 염수 및 수성 완충제 용액을 포함한다. 리포솜은 통상적인 리포솜뿐만 아니라 수중유중수 CGF 에멀션을 포함한다 (Strejan et al.. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).
제약상 허용되는 담체는 무균성 수용액 또는 분산액, 및 무균성 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 무균성 분말을 포함한다. 제약상 활성인 물질을 위해 이같은 매질 및 작용제를 사용하는 것이 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 작용제가 활성 화합물과 비-상용성이지 않는 한, 본 개시내용의 제약 조성물에서의 이의 사용이 구상된다. 보충적인 활성 화합물이 조성물 내로 또한 혼입될 수 있다.
전형적으로 치료 조성물은 무균성이어야 하고, 실질적으로 등장성이어야 하며, 제작 및 보관 조건 하에 안정적이어야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀션, 리포솜, 또는 높은 약물 농도에 적절한 기타 질서 구조물로서 제형될 수 있다. 담체는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이의 적절한 혼합물을 예를 들어 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 코팅물 예컨대 레시틴의 사용, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지, 및 계면활성제의 사용에 의해, 적합한 유동성이 유지될 수 있다. 다수의 경우에, 등장성 작용제, 예를 들어, 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 염화나트륨을 조성물 내에 포함하는 것이 바람직하다. 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 내에 포함시키는 것에 의해 주사 조성물의 장기 흡수가 달성될 수 있다.
필요한 양의 하나 이상의 개시된 항체를 필요하다면 상기 열거된 성분들 중 하나 또는 이의 조합물과 함께 적합한 용매 내에 혼입한 후에 이어지는 멸균 미세여과, 예를 들어, 무균성 여과 막을 통한 여과에 의해 무균성 주사 용액을 제조할 수 있다. 일반적으로, 활성 화합물을 기본적인 분산 매질 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 무균성 비히클 내로 혼입하는 것에 의해 분산액이 제조된다. 무균성 주사 용액의 제조를 위한 무균성 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 활성 성분 + 임의의 추가적인 원하는 성분의 분말이 앞서 무균성-여과된 이의 용액으로부터 산출되는 진공 건조 및 냉동-건조 (동결건조)이다.
관련 기술 분야에 공지된 의료 장치로 치료 조성물이 투여될 수도 있다. 예를 들어, 본 개시내용의 치료 조성물이 무침 피하 주사 장치, 예컨대 미국 특허 번호 5,399,163, 5,383,851, 5,312,335, 5,064,413, 4,941,880, 4,790,824, 또는 4,596,556에 예를 들어 개시된 장치로 투여될 수 있다. 본 개시내용에서 유용한 이식물 및 모듈의 예는 제어된 속도로 의약을 분배하기 위한 이식가능한 미세주입 펌프가 개시된 미국 특허 번호 4,487,603; 피부를 통해 의약을 투여하기 위한 치료 장치가 개시된 미국 특허 번호 4,486,194; 정확한 주입 속도로 의약을 전달하기 위한 의약 주입 펌프가 개시된 미국 특허 번호 4,447,233; 연속적인 약물 전달을 위한 가변성 유동의 이식가능한 주입 기구가 개시된 미국 특허 번호 4,447,224; 다중-챔버 구획이 있는 삼투압 약물 전달 시스템이 개시된 미국 특허 번호 4,439,196; 및 삼투압 약물 전달 시스템이 개시된 미국 특허 번호 4,475,196을 포함한다. 다수의 다른 이같은 이식물, 전달 시스템 및 모듈이 공지되어 있다.
치료 조성물의 경우에, 본 개시내용의 제형은 경구, 비강, 국소 (볼 및 설하 포함), 직장, 질 및/또는 비경구 투여에 적절한 것들을 포함한다. 제형은 단위 투여 형태로 편리하게 제시될 수 있고, 약학 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 단일 투여 형태가 생산되도록 담체 물질과 조합될 수 있는 항체의 양은 치료되는 대상체 및 특정 투여 방식에 따라 달라진다. 단일 투여 형태가 생산되도록 담체 물질과 조합될 수 있는 항체의 양은 일반적으로 치료 효과를 일으키는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100％ 중에서, 이러한 양은 약 0.01％ 내지 약 99％의 활성 성분, 약 0.1％ 내지 약 70％, 또는 약 1％ 내지 약 30％ 범위이다.
본 개시내용의 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여 형태는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물이 무균성 조건 하에 제약상 허용되는 담체, 및 필요할 수 있는 임의의 방부제, 완충제 또는 추진제와 혼합될 수 있다.
"비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여됨"이라는 구절은 일반적으로 주사에 의한, 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복막내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수강내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
이러한 제약 조성물들은 보조제 예컨대 방부제, 습윤화제, 유화제 및 분산제를 또한 함유할 수 있다. 멸균 절차 (상기), 및 다양한 항박테리아 및 항진균 작용제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함 양쪽 모두에 의해 미생물 존재의 방지가 보장될 수 있다. 등장성 작용제, 예컨대 당, 염화나트륨 등을 조성물 내로 포함시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 작용제 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 포함함으로써 주사 제형의 장기 흡수가 달성될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 개시내용의 항체가 제약으로서 인간 및 동물에게 투여되는 경우, 이는 단독으로 또는 약 0.01％ 내지 약 99.5％ (또는 약 0.1 내지 약 90％)의 본원에 기술된 항체를 제약상 허용되는 담체와 함께 함유하는 제약 조성물로서 제공될 수 있다.
V. 제작품
본원에 개시된 주제는 상기 기술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제작품에 또한 관련된다.
특정 실시양태에서, 제작품은 용기, 및 용기 상에 있거나 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적절한 용기의 비제한적인 예는 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 단독 조성물 또는 병태를 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 또 다른 조성물과 조합된 조성물을 보유할 수 있고, 무균성 접근 포트가 있을 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘이 관통가능한 마개가 있는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다).
특정 실시양태에서, 조성물 내의 하나 이상의 활성 작용제가 본원에 개시된 주제의 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택된 병태를 치료하는데 사용된다는 것을 지시할 수 있다.
특정 실시양태에서, 제작품은 (a) 본 개시내용의 항체를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제1 용기; 및 (b) 추가적인 세포독성제 또는 기타 치료제를 포함하는 조성물이 내부에 함유된 제2 용기를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 제작품은 조성물이 특정 병태를 치료하는데 사용될 수 있다는 것을 지시하는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다.
별법적으로 또는 추가적으로, 제작품은 제약상 허용되는 완충제 (예컨대 주사용 정균수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액이지만 이에 한정되지 않음)을 포함하는 추가적인 용기, 예를 들어, 제2 또는 제3 용기를 추가로 포함할 수 있다. 제작품은 기타 완충제, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질을 포함할 수 있다.
하기의 실시예는 단지 본원에 개시된 주제의 실례이고, 어떠한 방식으로도 한정적인 것으로 간주되지 않아야 한다.
실시예
실시예 1: 항-FGFR1 효능제 항체의 특성화
3개의 파지-유래 항-FGFR1 항체인 YW182.2 (본원에서 "R1MAb1"로 또한 지칭됨), YW182.3 (본원에서 "R1MAb2"로 또한 지칭됨), 및 YW182.5 (본원에서 "R1MAb3"으로 또한 지칭됨)이 기존에 기술되었다 (본원에 참고로 포함된 WO 2012/158704). 3개의 항체 각각이 강력한 FGFR1-선택적 효능제로서 작용하고, 마우스에서 인슐린-감작 성질을 나타냈다.
이러한 효능작용 활성을 추가로 이해하기 위해, FGFR1c에 효능작용을 하는 이러한 항체들의 Fab 단편의 능력을 테스트하였다. HEK293 세포를 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM) + 10％ 소 태아 혈청 (FBS)에서 배양하고, FUGENE® HD 형질감염 시약 (로슈(Roche))을 사용하여, 레닐라(Renilla) 루시페라제 (pRL-SV40, 프로메가), FGFR1c, 전사 활성화제 (pFA2-Elk1 또는 pFA2-CREB, 스트라타진(Stratagene)), 및 GAL4 결합 부위에 의해 구동되는 초파리 루시페라제 리포터 (pFR-luc, 스트라타진)를 코딩하는 발현 벡터들로 일시적으로 형질감염시켰다. 다음날, 형질감염된 세포를 추가로 6-8시간 동안 무혈청 배지에서 배양하고, YW182.5 IgG, 및 YW182.2, YW182.3 및 YW182.5 각각을 증가되는 농도에서 테스트하였다. 세포 루시페라제 활성을 듀얼-글로(DUAL-GLO)® 루시페라제 검정법 시스템 (프로메가) 및 인비전® 멀티레이블 리더(ENVISION Multilabel Reader) (퍼킨엘머(PerkinElmer))를 사용하여 결정하였다. 초파리 루시페라제 활성을 공동-발현된 레닐라 루시페라제 활성에 대해 표준화하였다. 놀랍게도, YW182.2 Fab가 효능작용 활성을 나타냈지만, YW182.3 Fab 또는 YW182.5 Fab는 그렇지 않았다 (도 1A).
도 1B는 YW182.2 Fab 및 YW182.3 Fab에 의한 FGFR1 활성화에서의 차이에 대한 기초를 탐구하기 위해 수행된 결합 경쟁 실험을 도시한다. YW182.2를 친화력이 높은 YW182.3에 비교하여, 그리고 친화력이 더 낮은 항-FGFR1 항체인 YW182.5에 비교하여 추가로 특성화하였다. YW182.2 및 YW182.3 양쪽 모두 FGFR1 세포외 도메인 (ECD)에 결합하는 것에 대해 YW182.5와 경쟁하였고, 이는 3개의 항체 모두가 FGFR1의 중첩 영역을 인식한다는 것을 지시한다. 그러나, 도 1B에 나타난 바와 같이, YW182.5의 상대적인 친화력이 YW182.2 및 YW182.3의 것보다 유의하게 더 약했다 (IC50 > 30배).
도 2A는 FGFR1b 및 FGFR1c에 대한 항-FGFR1 항체 YW182.2 및 YW182.3의 결합 친화력을 도시한다. 항-FGFR1 항체의 친화력에서의 차이가 효능작용 활성에서 관찰된 차이를 설명하는지를 평가하기 위해 항-FGFR1 항체의 친화력을 결정하였다. 하기의 변형과 함께 문헌 [Liang et al. J. Mol. Biol. 366(3): 815-29 (2007)]에 기술된 바와 같이 비아코어® T100 기구를 사용하여 FGFR1b 또는 FGFR1c에 대한 Fab의 결합 친화력을 측정하였다. 먼저, 제조사가 기술한 절차에 따라 유리 아미노 기에 대한 직접적인 커플링을 사용하여 마우스 항-인간 Fc 항체를 비아코어 카르복시메틸화 덱스트란 CM5 칩 상에 코팅하였다. 그 후, 약 200 반응 단위 (RU)가 달성되도록 YW182.2 또는 YW182.3을 CM5 바이오센서 칩 상에 포착시켰다. 10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.005％ 계면활성제 P20 (HBS-P 완충제)로 구성된 러닝(running) 완충제를 사용하여 결합 측정을 수행하였다. 25℃에서 30 ㎕/분의 유속으로 2배 희석 시리즈의 FGFR1c ECD-His 단백질을 HBS P 완충제 내의 1.5-50 nM의 범위로 주입하였다. 단순 일-대-일 랭뮤어 결합 모델 (비아코어 이밸류에이션 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 회합 속도 (Kon, 몰/초 당) 및 해리 속도 (Koff, 초 당)를 계산하였다. Koff/Kon의 비율로서 평형 해리 상수 (Kd, 몰 당)를 계산하였다. 도 2A에 나타난 바와 같이, YW182.2 및 YW182.3의 친화력이 매우 유사한 것으로 관찰되었고, 이는 친화력이 2개의 항체의 효능작용 활성 사이의 차이를 설명할 수 없음을 지시한다.
도 2B는 FGFR1과 특이적으로 상호작용하는 YW182.5 (R1MAb3)의 능력을 나타낸다. YW182.2 및 YW182.3과 유사하게, YW182.5가 ELISA에 의해 FGFR1에 대한 특이적 결합을 나타냈다 (도 2B).
도 2C는 GAL-ELK1 (ETS-유사 전사 인자 1)-기반 루시페라제 검정법을 사용하여 L6 세포에서의 다양한 FGFR에 대한 YW182.5의 효능작용 활성을 도시한다. 루시페라제 검정법을 위해, FuGENE HD 형질감염 시약 (프로메가)를 사용하여 HEK293T 또는 래트 L6 세포를 CMV-프로모터 하의 적합한 수용체, 레닐라 루시페라제 (pRL-SV40, 프로메가), GAL-ELK1 전사 활성화제 융합물 (pFA2-ELK1, 애질런트(Agilent)), 및 GAL4 결합 부위에 의해 구동되는 초파리 루시페라제 리포터 (pFR-luc, 애질런트)를 코딩하는 발현 벡터들로 일시적으로 형질감염시켰다. 다음 날, 형질감염된 세포를 다양한 농도의 적합한 단백질 리간드를 함유하는 무혈청 DMEM-기반 배지에서 추가로 6-8시간 동안 배양하였다. 세포 루시페라제 활성을 듀얼-글로 루시페라제 검정법 시스템 (프로메가) 및 인비전 멀티레이블 리더 (퍼킨엘머)를 사용하여 결정하였다. 초파리 루시페라제 활성을 공동-발현된 레닐라 루시페라제 활성에 대해 표준화하였고, 평균 ± SEM으로 나타냈다. YW182.2 및 YW182.3과 유사하게, YW182.5가 L6 세포에서 FGFR1에 대한 특이적 효능제로서 작용하였다 (도 2C).
YW182.5의 효능작용 활성을 상기 기술된 GAL-ELK1-기반 루시페라제 검정법을 사용하여 HEK293 세포에서 추가로 테스트하였다. 도 2D에서 나타난 바와 같이, YW182.5가 HEK293 세포에서의 GAL-ELK1-기반 루시페라제 검정법에서 FGFR1c에 대한 특이적 효능제로서 또한 작용하였다.
도 2E는 당뇨병 마우스 모델에서의 혈액 글루코스 수준에 대한 YW182.5의 효과를 나타낸다. 혈액 글루코스 수준을 결정하기 위해, 마우스를 잭슨 래버러토리(Jackson Laboratory)로부터 구입하고, 21℃의 병원체가 없는 동물 시설에서 음식 (랩다이어트(LABDIET)® 5010) 및 물에 자유롭게 접근하게 하면서 표준 12시간 밝음/12시간 어두움 주기 하에 유지시켰다. C57BLKS/J 배경의 db/db 마우스는 암컷이었고, 다른 마우스는 모두 수컷이었다. 고-지방 식이 급식을 위해, 고지방, 고탄수화물 식이 (하란 테크래드(Harlan Teklad) TD.03584, 지방으로부터의 58.4％ 칼로리)를 사용하였다. 코바스 인테그라(COBAS INTEGRA)® 400 화학 분석기 (로슈)에 의해 혈청 무기 포스페이트 및 칼슘 수준을 결정하였다. ELISA (이뮤토픽스(Immutopics))에 의해 혈청 FGF23 수준을 결정하였다. 컨투어(CONTOUR)® 글루코스 측정기 (바이엘(Bayer))에 의해 혈액 글루코스 수준을 결정하였다. 간 지질 분석을 위해, 트리글리세리드 정량 키트 (MBL 인터내셔널(MBL International))를 사용하였다. 비색 검정법에 의해 혈청의 총 콜레스테롤, 트리글리세리드, β-히드록시부티레이트 (써모 DMA(Thermo DMA)) 및 유리 지방산 (로슈)을 결정하였다. ELISA를 사용하여 혈청 인슐린 수준 (크리스탈 켐(Crystal Chem)), 혈청 FGF23 (이뮤토픽스), 혈청 마우스 HMW 아디포넥틴 (알프코(Alpco)) 및 혈청 원숭이 HMW 아디포넥틴 (R&D 시스템즈(R&D systems))을 결정하였다. 방사성 면역검정법 (밴더빌트 호르몬 어세이 & 애널리티컬 서비스 코어(Vanderbilt Hormone Assay & Analytical Services Core))에 의해 코르티코스테론을 측정하였다. 특정 실험에서 7-8개월령에서 사용된 klb-결핍 마우스를 제외하고는, 주사에 사용된 모든 마우스는 약 2-4개월령이었다. YW182.2 및 YW182.3과 유사한 방식으로, 당뇨병 ob/ob 마우스 내로 주사되었을 때 YW182.5가 혈액 글루코스 수준을 정상화하였다 (도 2E).
실시예 2: 항-FGFR1 항체의 에피토프 매핑
FGFR1 ECD는 D1 내지 D3으로 칭해지는 3개의 Ig-유사 도메인으로 이루어진다. 도 1C에 나타난 바와 같이, 2개의 비-중첩 펩티드 (P26: KLHAVPAAKTVKFKCP (서열식별번호: 143) 및 P28: FKPDHRIGGYKVRY (서열식별번호: 144))가 FGFR1의 D2 도메인 내에 존재하고, YW182.2 및 YW182.3 양쪽 모두에 결합하는 것으로 기존에 확인되었다 (본원에 참고로 포함된 WO 2012/158704).
이러한 펩티드 내의 어떤 잔기가 항체 결합을 최고로 담당하는지를 확인하기 위해, 확인된 에피토프 영역 내에 다양한 알라닌 치환이 있는 전장 FGFR1 단백질을 HEK293 세포에서 발현시켰고, 웨스턴 블롯에 의해 항체 결합에 대해 테스트하였다. 도 1D에 나타난 바와 같이, K175, K177, Y205, R208에서의 알라닌 치환이, D1 도메인에 대한 항-FGFR1 (항-D1)에 의해 프로빙(probing)된 바와 같이 발현에는 영향을 미치지 않으면서, YW182.2 및 YW182.5의 결합을 제거하였다. R208A에 의해 YW182.3의 결합이 폐지되었지만, K175, K177, 또는 Y205 치환에 의해서는 그렇지 않았다.
생체 내에서 FGFR1의 알라닌 치환 돌연변이체를 활성화시키는 항체의 능력을 상기 기술된 GAL-ELK1 검정법을 사용하여 테스트하였다. 활성화가 각각의 항-FGFR1 항체에 대한 이러한 돌연변이체들의 결합 성질과 잘 상호관련되는 것으로 발견되었다 (도 1E). 이러한 결과들은 D2 도메인 내의 아미노산들의 유사한 세트가 친화력이 상이하기는 하지만 YW182.2 및 YW182.5 결합에 요구되는 반면, 동일한 영역 내의 아미노산들의 별개의 세트가 YW182.3 결합에 중요하다는 것을 시사한다.
2:2 FGFR ECD/FGF 복합체의 결정 구조가 기존에 기술되었다 (Plotnikov et al. Cell 98(5): 641-50 (1999)). 2:2 이종이량체 FGFR1c ECD/FGF2 구조에서, 1개의 D2 도메인이 또 다른 D2 도메인과 상호작용하고, 각각의 FGF2가 2개의 측면으로부터 양쪽 D2 도메인에 결합하여 D2 이량체를 안정화시킨다 (도 1F). 이러한 구조에서, YW182.2 및 YW182.5 결합에 중요한 알라닌 치환 (K175, K177, Y205, 및 R208)이 D2 이량체 내부에 위치한다. YW182.2 Fab가 효능제로서 작용하기 때문에, 이는 YW182.2 Fab가 측면으로부터 동시에 2개의 D2 도메인에 결합하여 D2 이량체를 안정화시킬 수 있어, 본질적으로 FGF 리간드의 분자 모방체로서 작용한다는 것을 시사한다. 알라닌 치환 분석을 기초로, YW182.5 Fab는 친화력이 YW182.2 Fab보다 훨씬 더 낮다는 것을 제외하고는 유사하게 결합할 수 있다.
실시예 3: 항-KLB 항체의 단리 및 특성화
Balb/c 마우스를 hFGFR1c 및 hKLB 단백질을 안정적으로 발현하는 HEK293 세포로 면역화시켰다. 12주 후 비장을 회수하였고, 하이브리도마가 생성되었다. 항-hKLB 항체를 생산하는 하이브리도마를 면역화에 사용된 HEK293 세포를 사용하여 FACS 분석에 의해 확인하였다. 간략하게, 단독 hKLB, 단독 hFGFR1, 또는 양쪽 모두를 발현하는 293 세포를 FACS 완충제 (PBS 내의 0.5％ BSA) 내의 희석된 하이브리도마 상청액 및 PE-접합 염소 항-마우스 IgG 항체 (잭슨 랩스(Jackson Labs))으로 염색하였다. 염색된 세포를 동일한 FACS 완충제를 사용하여 세정하였다. 염색된 세포를 FACScan (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)) 및 플로우조(FlowJo) FACS 분석 소프트웨어 (트리 스타(Tree Star))에 의해 분석하였다. IgG 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 cDNA를 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 모든 재조합 모노클로날 항체 분자를 일시적으로 형질감염된 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 생산하였고, 통상적인 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
항-KLB 항체를 생산하는 약 20개의 상이한 하이브리도마가 확인되었다. 이러한 항-KLB 항체 중 16개에 대한 CDR 경쇄 및 중쇄 서열이 표 2 및 3에서 제시된다. 이러한 항-KLB 항체 중 16개와 8C5의 경쇄 서열이 도 3A에서 제시된다 (11F1, 6D12, 11D4, 8E1, 46C3, 8H7, 21H3, 25F7, 14E6, 14C6, 24A1, 5F8, 6C1, 12A1, 12B8, 14C10 및 8C5; 각각 서열식별번호: 111-127).
이러한 항-KLB 항체 중 16개와 8C5의 중쇄 서열이 도 3B에서 제시된다 (11F1, 6D12, 11D4, 8E1, 46C3, 8H7, 21H3, 25F7, 14E6, 14C6, 24A1, 5F8, 6C1, 12A1, 12B8, 14C10 및 8C5; 각각 서열식별번호: 94-110).
<표 2>
뮤린 항-KLB 모노클로날 항체에 대한 CDR H 서열
Figure pat00006
Figure pat00007
<표 3>
뮤린 항-KLB 모노클로날 항체에 대한 CDR L 서열
Figure pat00008
Figure pat00009
대부분의 하이브리도마-유래 항-KLB 항체와 1개의 파지-유래 항체 (Ph#5로 지정되고, 재조합 hKLB-ECD-HIS 단백질 (R&D 시스템즈)을 사용하여 파지 패닝(panning)에 의해 수득됨)를 hKLB를 발현하는 293 세포에 대한 항체의 결합을 측정하는 0.8 ㎍/㎖에서의 FACS 플롯에서 관찰된 중앙값 이동을 기초로 정렬하였다 (도 4).
또한, 일부 항체를 ELISA에 의해 정렬하였다. 이러한 실험을 위해, 뮤린 가변 영역 및 hIgG1 불변 영역이 있는 키메라 재조합 IgG인 항-KLB 항체를 사용하여 hKLB-ECD-HIS 단백질에 대한 결합을 측정하였다. FACS 분석에서보다 ELISA 조건 하에 더 잘 결합하는 것으로 나타난 14E6를 제외하고는, 테스트된 항체들의 상대적인 결합이 유사하였다 (도 5).
실시예 4: 항-KLB 항체의 KLB 결합
다양한 항-KLB 항체들 사이의 경쟁을 테스트하기 위해, ELISA를 사용하였다. 일부 실험에서, 6D12, 8C5, 및 11F1에 상응하는 하이브리도마 상청액으로부터 정제된 IgG 항체를 EZ-링크 NHS-PEO 고체상 비오틴화 키트 (피어스(Pierce))를 사용하여 비오틴화시켰다. KLB-ECD-HIS 단백질에 대한 결합을 다양한 농도의 하이브리도마-유래 항-KLB의 존재 하에 HRP-접합 스트렙타비딘을 사용하여 테스트하였다. 일부 실험에서, KLB-ECD-HIS 단백질에 대한 재조합 인간 IgG의 결합을 다양한 농도의 하이브리도마-유래 항-KLB의 존재 하에 HRP-접합 항-인간 IgG (잭슨 이뮤노리서치 인크(Jackson ImmunoResearch Inc.))를 사용하여 테스트하였다.
11F1, 11D4, 8E1 및 46C3 중 어느 것도 결합에 대해 6D12와 경쟁하지 않는 것으로 관찰되었다 (다른 것들은 6D12에 대해 테스트되지 않았다). 항-KLB 항체 14E6 및 12A11는 8C5와 경쟁하지만, 11D4 및 14C10는 그렇지 않고 (다른 것들은 8C5에 대해 테스트되지 않았다), 11D4는 결합에 대해 11F1과 경쟁하지만, 6D12, 8E1, 및 46C3은 그렇지 않다 (다른 것들은 11F1에 대해 테스트되지 않았다).
실시예 5: 항-KLB 항체의 종-교차 교차반응성
개시된 항-KLB 항체들의 종-교차 반응성을 HEK293T 세포 내로 일시적으로 형질감염된 pRK 포유동물 발현 벡터 내로 클로닝된 마우스, 래트, 토끼, 시노몰구스 원숭이 및 리서스 원숭이로부터의 KLB cDNA를 사용하여 FACS 분석에 의해 분석하였다. 발현된 KLB 세포외 도메인 폴리펩티드 서열은 하기와 같았다:
마우스:
Figure pat00010
래트 (+N-말단 FLAG):
Figure pat00011
토끼 (+N-말단 FLAG):
Figure pat00012
시노몰구스 원숭이 (+N-말단 FLAG):
Figure pat00013
리서스 원숭이 (+N-말단 FLAG):
Figure pat00014
표 4에 나타난 바와 같이, 대부분의 항체, 예를 들어, 6D12, 11D4 및 8E1이 토끼, 시노몰구스 원숭이 및 리서스 원숭이로부터의 KLB에 결합하는 것으로 확인되었고, 항-KLB 항체의 약 절반, 예를 들어, 8C5, 14E6 및 14C6이 마우스 및 래트 KLB에 결합하는 것으로 확인되었다.
<표 4>
상이한 종들로부터의 KLB에 대한 뮤린 항-KLB 항체의 결합
Figure pat00015
실시예 6: 항-KLB 항체의 에피토프 맵핑
항-KLB 항체가 인간 알파-클로토 (hKLA)의 세포외 도메인 (ECD)에 결합하는지 여부를 결정하기 위해, 하기의 서열을 지니는 구축물을 사용하였다:
발현된 예상 폴리펩티드 서열 (+ C-말단 (세포내) FLAG):
Figure pat00016
KLA 및 KLB 양쪽 모두 2개의 글리코시다제-유사 도메인 (1개의 N-말단 및 1개의 C-말단)이 있다. 항-KLB 항체가 인식하는 KLB의 영역을 확인하기 위해, hKLB, hKLA, 및 hKLA N-말단 글리코시다제-유사 도메인 및 hKLB c-말단 글리코시다제-유사 도메인을 포함하는 키메라 구축물을 pCMV-Tag4A 포유동물 발현 벡터 (애질런트) 내로 클로닝하였다. 표 5에 나타난 바와 같이, hKLA 및 hKLB의 N- 및 C-말단 도메인은 각각 서열식별번호: 151 및 서열식별번호: 145로부터의 서열에 상응한다. 2개의 단백질 사이의 서열 상동성을 기초로 hKLA 및 hKLB의 N-말단 도메인이 5개의 절편으로 분할되었고, C-말단 도메인이 5개의 절편으로 분할되었다.
<표 5>
KLA 및 KLB의 하위 서열
Figure pat00017
본 개시내용의 항체로 FACS 분석을 수행하였고, 약 절반의 항체가 hKLB의 N-말단 글리코시다제-유사 도메인을 인식하는 것으로 관찰된 반면, 나머지는 C-말단 글리코시다제-유사 도메인을 인식하였다 (표 6). 표 6에 나타난 바와 같이, hKLB의 N-말단 도메인을 인식한 항체 중 2개가 절편 1을 포함하는 도메인의 일부분에 결합한 반면, 나머지는 절편 2-5만 결합에 요구하였다.
<표 6>
뮤린 항-KLB 항체의 결합의 맵핑
Figure pat00018
실시예 7: FGFR1c/KLB 복합체를 특이적으로 활성화시키는 이중특이적 항체의 확인
Fab로서 FGFR1을 활성화시키는 R1MAb의 능력을 기초로, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체가 생성되도록 더 낮은 친화력의 R1MAb의 더 높은 친화력의 항-KLB 항체로의 테더링(tethering)이 혼입된 분자가 생산되었다 (도 6A; WO2012/158704).
특정 이론에 한정되지 않으면서, FGF21-매개 활성화는 C-말단 KLB-결합 꼬리를 통해 FGF21을 FGFR1c/KLB 복합체에 동원시키는 것을 통해 작용하는 것으로 제안되는 한편, FGFR-특이성에 대한 결정인자는 N-말단 영역 내에 있고, 이는 낮은 친화력의 상호작용을 통해 FGFR에 결합할 것이다 (도 6B 참조) (Yie et al. FEBS Lett. 583(1): 19-24 (2009)). 따라서, 이중특이적 항체로서의 높은 친화력의 항-KLB 항체에 대한 친화력이 낮은 R1MAb1의 테더링으로 KLB-의존적 FGFR1 효능제가 산출될 수 있다. 특정 이론에 한정되지 않으면서, 친화력이 낮은 FGFR1 아암을 포함하는 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 KLB의 부재 시에 FGFR1에 단단히 결합하는 것 및 기타 FGF 리간드 (예를 들어, FGF1, FGF2, FGF8 및 FGF23)에 의한 FGFR1의 결합 및/또는 활성화를 방지하는 것으로부터의 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체의 위험을 완화시킬 수 있다. 또한, 친화력이 낮은 FGFR1 아암은, 임상적으로 유의한 부작용을 초래하지 않으면서, 항-FGFR1 하프-놉 항체, 비-공유결합 항-FGFR1 이량체, 공유결합 항-FGFR1 이량체 및 고분자량 종과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 항-FGFR1 불순물이 더 높은 수준으로 존재하는 것을 허용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 일반적으로 bFKB1은 본원에 개시된 여러 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체 중 임의의 것을 지칭한다. 도면들에서 개시된 구체적인 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체에 관한 상세사항이 하기에서 기술된다. HEK293 세포를 상기 기술된 항-FGFR1 (YW182.2 (R1MAb1) 및 YW182.3 (R1MAb2)) 및 항-KLB 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 4개의 발현 벡터의 혼합물로 공동-형질감염시켰다. 이종이량체성 IgG를 컨디셔닝 배지로부터 순차적인 친화력 정제에 의해 정제할 수 있도록 항-FGFR1 및 항-KLB의 중쇄에 각각 플래그(Flag) 펩티드 및 Oct-히스티딘 태그를 부착하였다. 그 후, 부분적으로 정제된 이종이량체성 IgG를 GAL-ELK1-기반 루시페라제 검정법에서 분석하여, KLB-의존적 효능제를 확인하였다. 중쇄 및 경쇄가 잘못 쌍을 이루는 것을 최소화하기 위해, 항-FGFR1은 인간 Fab 불변 영역과 함께 발현되었고, 항-KLB는 마우스 Fab 불변 영역과 함께 발현되었다. 태그가 부착된-이중특이적 IgG를 3개의 항-R1MAb 및 18개의 항-KLB Ab의 28가지 조합을 사용하여 먼저 미정제 형태로 테스트하였다 (표 7).
도 7A는 GAL-ELK1 루시페라제 검정법에서의 YW182.2 (R1MAb1), YW182.3 (R1MAb2) 및 YW182.5 (R1MAb3)와 18C5, 12A11 및 14E6의 특정한 이중특이적 조합에 대한 유도 데이터를 나타낸다. 대부분의 경우에, FGFR1c만 발현하고 KLB는 발현하지 않은 세포와 비교하여 FGFR1c 및 KLB를 공동-발현한 세포에서 이중특이적 항체가 신호전달을 유의하게 더 잘 활성화시킨 것으로 관찰되었다.
이러한 초기 실험에서의 이러한 항체들의 활성을 기초로, 8개의 대표적인 항-KLB Ab (Ph#5, 8C5, 12A11, 14C10, 6D12, 11D4, 6C1, 및 음성 대조군으로서의 14E6)를 사용하여 태그가 부착되지 않은, YW182.5와의 이중특이적 항체를 생산하였다 (추가적인 특성화를 위해 기존에 기술된 놉-홀 기술을 사용함 (상기, 및, 예를 들어, 문헌 [Atwell, et al. FEBS Lett. 583(1): 19-24 (2009)]). 도 8A에 나타난 바와 같이, 인간 IgG1 불변 영역 (야생형, 이펙터 기능 있음 (1)), 및 N297G 돌연변이가 있어 이펙터 기능이 제거된 인간 IgG1 불변 영역 (3), 또는 이중 [D265G/N297G] 돌연변이 (DANG)가 있어 이펙터 기능이 제거된 마우스 불변 영역 (2)이 있는 이중특이적 항체가 생산되었다.
하기 표 7은 놉-인-홀 기술을 사용하여 제조된 다양한 이중특이적 항체를 열거한다.
<표 7>
이중특이적 항-KLB/항-FGFR1 항체
Figure pat00019
사용된 아이소타입 대조군 IgG는 항-돼지풀 (뮤린 IgG2a) 또는 항-인간 Her2 트라스투주맙(trastuzumab) (인간 IgG1)이었다. Fab 단편을 이. 콜라이에서 발현시키고, 통상적인 칼럼 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. 휘닉스 파마슈티컬스(Phoenix Pharmaceuticals)로부터의 요오드화 FGF21 및 사내에서 생산된 미표지 FGF21로 수행된 방사성 리간드 세포 결합 검정법을 제외하고는, 재조합 FGF21은 R&D 시스템즈 (2539-FG/CF)로부터의 것이었다. 각각의 이중특이적 조합 (음성 대조군 제외)이 FGFR1c 및 KLB 양쪽 모두에 의존적인 신호전달을 나타냈다. 특정 조합에 대한 데이터가 도 7B에서 제시된다. 또한, 항-KLB 아암과 YW182.5 (R1MAb3) 아암의 조합이 FGFR1c를 발현하지만 KLB는 발현하지 않는 세포에서 더 낮은 배경 신호전달을 나타냈다.
도 6C에 나타난 바와 같이, 다양한 수용체를 발현하는 FGFR1-결핍 HEK293 세포에서 항-KLB/항-FGFR1c 항체 (BsAb17)의 활성을 테스트하였다. FGFR1-결핍 HEK293T 세포는 가이드 RNA를 사용하는 CRISPR-cas9 방법을 사용하여 생성되었다. 항-KLB/항-FGFR1c 항체가 재조합 hFGFR1c 및 hKLB를 공동-발현하는 세포에서 루시페라제 활성을 유도하는 것으로 관찰되었다 (도 6C).
유사한 결과가 다른 항-KLB/항-FGFR1c 항체에 대해 관찰되었다. 도 7C에 나타난 바와 같이, KLB와 함께 또는 KLB 없이 FGFR1c를 발현하는 HEK293 세포에서의 GAL-ELK1-기반 루시페라제 검정법에서 테스트되었을 때, 항-FGFR1 및 항-KLB 아암의 다수의 이중특이적 항체 조합, 예를 들어, BsAb5, 6, 7, 8, 9, 10이 재조합 hFGFR1c 및 hKLB를 발현하는 세포에서 용량-의존적 방식으로 루시페라제 활성을 유도하였지만, KLB 발현이 없는 세포에서는 그렇지 않았다. 이러한 결과들은 이러한 이중특이적 항체들이 FGF21처럼 KLB-의존적 FGFR 효능제로서 작용한다는 것을 가리킨다.
항-KLB/항-FGFR1c 항체 (BsAb17)와 FGF21의 상승작용을 또한 테스트하였다. 도 9B에 나타난 바와 같이, FGF21의 농도는 점증적으로 증가되고 BsAb17의 농도는 변화되지 않고 유지되었을 때 BsAb17과 FGF21 사이에서 상승작용이 관찰되지 않았다.
또한, 항-KLB/항-FGFR1c 항체 (BsAb17)의 농도는 점증적으로 증가되고 FGF21의 농도는 변화되지 않고 유지되었을 때, BsAb17과 FGF21 사이에서 상승작용이 관찰되지 않았다 (도 9C).
인간, 시노몰구스 원숭이 및 마우스로부터의 KLB, 인간 FGFR1c, 또는 hFGFR1c 및 hKLB 양쪽 모두를 발현하는 HEK293 세포에 대한 이중특이적 항체 중 2개 (BsAb10 및 BsAb9) (및 hFGF21)의 용액 결합 친화력 (Kd)을 방사성 표지 리간드 결합 검정법에 의해 측정하였다. 방사성 리간드 세포 결합 검정법을 위해, KLB 및/또는 FGFR1c를 안정적으로 공동-발현하는 HEK293 세포를 결합 완충제 (DMEM + 1％ 소 혈청 알부민 (BSA), 50 mM HEPES, pH 7.2, 0.1％ 아지드화나트륨 및 350 mM 인간 IgG) 내에 0.2 mL 당 100,000 내지 200,000개의 세포의 밀도로 96웰 플레이트 내에 놓았다. 고정된 농도의 요오드화 FGF21 (휘닉스 파마슈티컬스) 또는 요오드화 BsAb, 및 단계적으로 희석된 농도의 미표지 FGF21 (제넨테크) 또는 미표지 BsAb를 함유하는 50 ㎕의 경쟁 반응 혼합물을 세포에 첨가하였다. 경쟁 반응물과 세포를 2시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 2시간 인큐베이션 후, 경쟁 반응물을 밀리포어 멀티스크린(Millipore Multiscreen) 필터 플레이트로 옮기고, 결합 완충제로 4회 세정하여, 결합된 요오드화 FGF21 또는 항체로부터 유리 FGF21 또는 항체를 분리하였다. 필터를 왈락 위자드(Wallac Wizard) 1470 감마 카운터 (퍼킨엘머 라이프 앤드 애널리티컬 사이언시즈(PerkinElmer Life and Analytical Sciences)) 상에서 카운팅하였다. 문손(Munson) 및 로드바드(Rodbard)의 피팅 알고리즘 (Munson and Rodbard Anal. Biochem. 107, 220-239 (1980))을 사용하여 결합 친화력을 결정하는 뉴 리간드(New Ligand) 소프트웨어 (제넨테크)를 사용하여 결합 데이터를 평가하였다.
표 8에 나타난 바와 같이, 양쪽 항체가 KLB만 발현하는 세포에 대해 (이전에 관찰된 것과 일관된 종-교차 패턴으로) 약간의 양호한 반응성을 나타냈지만, 양쪽 모두 hFGFR1c만 발현하는 세포에 훨씬 더 약하게 결합하였고, hKLB 및 hFGFR1c 양쪽 모두를 발현하는 세포에 더욱 강하게 결합하였다.
<표 8>
상이한 종들로부터의 KLB/FGFR1에 대한 이중특이적 항-KLB 항체의 결합
Figure pat00020
도 9D는 FACS 분석을 사용하여, 2개의 상응하는 항-FGFR1-결합 아암 (YW182.5)이 있는 항체와 비교하여 hKLB, hFGFR1c, 또는 양쪽 모두를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포에 대한 BsAb10 및 BsAb9의 친화력을 나타낸다. 상기에서 지시된 것들에 대해 유사한 결과가 수득되었다 (도 9D).
항-FGFR1 아암으로서의 YW182.5 및 항-KLB 아암으로서의 8C5가 있는 한 이중특이적 항체 BsAb10, 및 BsAb10의 유도체 (BsAb11-20)로 추가적인 실험을 수행하였다. 도 6C에 나타난 바와 같이, 뮤린 수용체가 HEK293 세포에서 발현되었고, 이러한 세포에서 BsAb17가 루시페라제 활성을 또한 유도한 것으로 나타났으며, 이는 이러한 Ab의 종-교차 반응성을 입증한다.
다음으로 BsAb10을 내인성 KLB 및 FGFR이 결여되었지만 hKLB 및 각각의 5가지 hFGFR 아이소형을 발현하도록 형질감염된 래트 L6 근육모세포에서 테스트하였다 (도 9A). BsAb10이 FGFR1c 및 KLB 양쪽 모두를 발현하는 세포에서만 루시페라제 활성을 유도하는 것으로 확인되었고, 이는 BsAb10이 FGFR1c/KLB 복합체에 대한 특이적 효능제로서 작용하지만, 다른 FGFR과 복합체를 형성한 KLB에 대해서는 그렇지 않다는 것을 가리킨다 (도 9A). 세포가 KLB와 FGFR1c, 2c, 또는 3c 중 어느 하나의 조합을 발현했을 때 FGF21이 루시페라제 활성을 유도하였고, KLB와 FGFR4의 조합을 발현한 세포에서 FGF19가 활성을 유도하였음을 실연하도록 FGF21 및 FGF19가 대조군으로서 사용되었다. 휘닉스 파마슈티컬스로부터의 요오드화 FGF21 및 사내에서 생산된 미표지 FGF21로 수행된 방사성 리간드 세포 결합 검정법을 제외하고는, 재조합 FGF21은 R&D 시스템즈 (2539-FG/CF)로부터의 것이었다. 인간 FGFR1b, 1c, 2b, 2c, 3b, 3c, 및 4의 세포외 도메인 (ECD)을 코딩하는 cDNA를 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 클로닝하여 인간 FGFR-인간 Fc 키메라 단백질 또는 His-태그 FGFR 단백질을 생성시켰다.
그러나, 상기 기술된 바와 같이, 뜻밖으로, BsAb10의 모 항-FGFR1c 항체인 R1MAb3 (YW182.5)가, KLB와 상호작용하지 않는 FGFR1의 아이소형인 FGFR1b에 결합한다. 또한, R1MAb3 (YW182.5)이 L6 세포에서의 GAL-ELK1 검정법에서 FGFR1b를 활성화시킬 수 있고, 이는 BsAb10의 활성과 대조적이다 (도 2C 및 2B 참조).
게다가, FGFR1b 및 KLB의 조합이 BsAb10에 의한 활성화를 지지하지 않았다 (도 9A). 특정 이론에 한정되지 않으면서, 이러한 데이터들은 미리 형성된 FGFR1/KLB 복합체의 존재가 BsAb10에 의한 FGFR1의 KLB-의존적 활성화의 필요조건이라는 것을 시사한다.
실시예 8: BsAb10, 및 이의 유도체가 FGF21의 분자 모방체로서 작용한다
BsAb10 및 이의 유도체 (BsAb11-20) 및 FGF21의 추가적인 특성화에서 일부 유사성 및 차이가 밝혀졌다. MAPK 신호전달 중간체의 인산화 수준을 결정하기 위해, 세포를 FBS, L-글루타민 및 GA-1000을 함유하는 지방세포 전구체 기저 배지-2에서 성장시켰다. 전면 성장에 도달하면, 피하 지방세포 전구체 (론자(Lonza)로부터 취득함)를 덱사메타손, 인도메타신, 및 3-이소부틸-1-메틸크산틴 (IBMX)을 함유하는 성장 배지에서 분화시켰다. 유전자 발현 분석을 위해, 세포를 14일 동안 분화시킨 후, 추가적인 48시간 동안 지시된 효능제와 함께 추가로 배양하였다. MAPK 신호전달 분석을 위해, 세포를 10일 동안 배양하고, 무혈청 배지에서 3시간 동안 성장시킨 후, 추가적인 1시간 동안 지시된 효능제와 함께 추가로 배양하였다.
도 6D에 나타난 바와 같이, 웨스턴 블롯에 의해 결정 시, FGF21의 항-당뇨병 활성에 대한 관련된 세포 유형을 나타내는 1차 인간 지방세포에서 BsAb10, BsAb17, BsAb20, 및 FGF21이 MAPK 신호전달 중간체 예컨대 MEK 및 ERK의 인산화를 유도하는 유사한 활성을 나타냈다. 웨스턴 블롯 분석에 사용된 항체는 셀 시그널링 테크놀러지(Cell Signaling Technology)로부터의 것이거나 (pFRS2a (T196) (#3864), pMEK1/2 (S217/221) (#9154), pERK1/2 (T202/204)(#4370), ERK1/2 (#4695), HSP90 (#4874), β-액틴 (#5125)), 앱캠(abcam)으로부터의 것이거나 (UCP1 (ab10983)), 또는 R&D 시스템즈로부터의 것이었다 (KLB (AF2619)).
도 8B에 나타난 바와 같이, pERK 수준의 배수 변화로서 표현되는 ERK 인산화의 증가가 BsAb10, BsAb17, BsAb20 또는 FGF21로 처리된 1차 인간 지방세포에서 관찰되었다.
또한, BsAb10의 친화력 프로파일이 FGF21의 것과 유사하였다. FACS로 테스트하였을 때, FGFR1c의 공동발현 여부와 관계 없이, BsAb10이 hKLB를 발현하는 세포에 대한 강한 결합을 나타냈다 (도 10A). 다소 뜻밖으로, 세포가 FGFR1c를 발현하지만 KLB는 발현하지 않았을 때 BsAb10의 결합이 거의 관찰되지 않았고, 이는 YW182.5 아암의 1가 친화력이 극도로 낮다는 것을 가리킨다 (도 10A).
도 10B에 나타난 바와 같이, 방사성 표지-리간드 검정법은 FGFR1c 및 KLB 양쪽 모두를 발현하는 세포에 대한 BsAb10의 해리 상수 (Kd)가 2.3 nM이고, 유사한 검정법 포맷으로 hFGF21에 대해 관찰된 5.3 nM에 근접한다는 것을 가리켰다. 이러한 값들은 HEK293 세포에서의 GAL-ELK1 검정법에서의 이러한 분자들의 관찰된 EC50 (BsAb10 및 FGF21에 대해 각각 3.2 nM 및 4.7 nM)에 근접하였다. 단독 인간 KLB 또는 단독 마우스 KLB를 발현하는 세포의 경우, Kd는 각각 6.6 nM 및 15.5 nM이었다.
FGFR1에 대한 친화력이 이렇게 낮기 때문에, 방사성 표지 리간드 검정법은 FGFR1c만 발현하는 세포에 대한 BsAb10의 Kd를 신뢰할 수 있게 결정할 수 없지만, 이는 도 3B에 나타난 바와 같이 > 300 nM인 것으로 추정되었다. 유사한 이유로, FGFR1에 대한 BsAb10의 결합 동역학이 SPR에 의해 의해 신뢰할 수 있게 결정될 수 없었다.
추가로, FGFR1c-ECD와 KLB-ECD 단백질 사이의 상호작용이 FGF21에 대해 기존에 관찰된 바와 같이 BsAb10에 의해 안정화되었고, 이는 BsAb10이 FGFR1c-선택적 FGF-21 모방체로서 작용한다는 생각과 일치한다 (도 11) (Yie et al., Chemical Biology; Drug Design 79, 398-410 (2012)). 25℃에서 프로테온(PROTEON)™ XPR36 (바이오-래드 래버러토리즈(Bio-Rad Laboratories)) 기구 상에서 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 측정에 의해 FGFR1/KLB/ BsAb10 상호작용을 연구하였다. 제조사가 기술한 바와 같이 표준 아민 커플링 절차를 사용하여 pH 4.5의 FGFR1-HIS 단백질 (20 ㎍/㎖)을 활성화된 프로테온™ GLC 센서 칩 상에 표면 밀도 (1000 RU)로 고정하였다. BsAb10 및/또는 BsAb10과 KLB-ECD의 1:1 혼합물을 0.005％ v/v 트윈®-20, 0.3 M NaCl (pH 7.4)을 함유하는 PBS 내의 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 또는 200 nM로 80 ㎕/분의 유속으로 주입하고, 회합 및 해리 단계에 대한 센서그램을 기록하였다. 분석물을 300초 동안 주입하고, 600초 동안 해리되게 하였다. 데이터를 인터스팟(interspot)으로 레퍼런싱하고, 프로세싱하고, 해리 상수를 프로테온™ 매니저(PROTEON™ Manager) 소프트웨어 (버전 3.0, 바이오-래드)로 측정하였다. BsAb10에 의한 FGFR1c/KLB 복합체의 활성화는 FGFR1c-ECD, KLB-ECD 및 BsAb10에 의한 3원 복합체 형성을 시사하였다.
도 11에 나타난 바와 같이, BsAb10이 재조합 KLB-ECD 및 FGF21 또는 FGF19와 3원 복합체를 형성하였음이 또한 관찰되었다. BsAb10/KLB/FGF 상호작용을 25℃에서 옥텟(Octet) RED (포르테바이오(ForteBio)) 기구 상에서 바이오-레이어 간섭법 (BLI) 측정에 의해 연구하였다. 제조사가 기술한 바와 같이 pH 4.5의 BsAb10 (20 ㎍/㎖)을 활성화된 아민 반응성 바이오센서 팁 상에 고정하였다. 0.005％ v/v 트윈®-20, 0.3 M NaCl (pH 7.4)을 함유하는 PBS 내의 KLB-ECD (20 ㎍/㎖)를 동일한 바이오센서 칩 상에 포착시키고, 동일한 완충제 내의 0, 0.2, 0.8, 또는 2 μM의 FGF21 (R&D 시스템즈)로 측정하였다. 정성적 데이터를 데이터 획득 소프트웨어 (포르테바이오)로 프로세싱하였다.
도 12A는 수행된 세포-표면 시간-분해형 형광 공명 에너지 전달 (TR-FRET) 실험의 개략도를 나타낸다. TR-FRET를 위해, COS7 세포를 SNAP 태그가 부착된 FGFR1 및 태그가 부착되지 않은 KLB를 발현하도록 공동-형질감염시키고, 바닥이 백색인 96웰 플레이트 (코스타(Costar))에 웰 당 100,000개의 세포로 시딩하였다. 형질감염 24시간 후에, 형질감염된 세포를 37℃, 5％ CO2에서 1시간 동안 100 nM의 공여체-접합 벤질구아닌 SNAP-루미(Lumi)4-Tb (시스바이오(Cisbio)) 및 1 μM의 수용체-접합 벤질-구아닌 SNAP알렉사(Alexa)647 (NEB)로 표지시켰다. 3회의 세정 후, 루미4-Tb 방출 및 TR-FRET 신호를 리간드 첨가 후 t=0 및 t=15분에 사파이어(Safire)2 플레이트 판독기 (테칸(Tecan))를 사용하여 343 nm에서의 레이저 여기에 이어진 60 μs 지연 후에 400 μs 동안 각각 620 nm 및 665 nm에서 기록하였다. 동일한 플레이트 판독기를 사용하여 알렉사647의 방출 신호를 640 nm에서의 여기 후 682 nm에서 검출하였다. 그 후, FRET 강도를 하기와 같이 계산하였다: (SNAP-공여체 및 SNAP-수용체로 표지된 세포로부터의 665 nm에서의 신호) - (SNAP-공여체 및 비-표지 SNAP로 표지된 동일한 뱃치(batch)의 형질감염된 세포로부터의 665 nm에서의 신호).
도 12B에 나타난 바와 같이, TR-FRET 실험은 BsAb17 및 FGF21 양쪽 모두가 KLB가 또한 세포 내에 존재할 때 FGFR1c-ECD의 이량체화를 강화한다는 것을 시사하였다. 결과는 FRET 비: FRET 강도를 620 nm에서의 공여체 방출로 나눈 것으로서 제시되었다.
또한, BsAb10은 KLB-ECD의 C-말단 절반에 결합하는 반면, FGF21 및 FGF19는 N-말단 절반 내의 KLB 상의 동일한 부위에 결합하는 것으로 생각되었고 (Goetz et al. Mol. Cell. Biol. 32(10): 1944-54 (2012); Foltz et al. Sci. Transl. Med. 4: 162ra153 (2012)), 이는 KLB 상의 BsAb10의 에피토프가 FGF21 및 FGF19 결합 부위와 별개여야 한다는 것을 시사한다. BsAb10에 대한 KLB 에피토프를 맵핑하기 위해, HEK293 세포에 발현된 일련의 키메라 항원에 대한 8C5 (BsAb10의 KLB-결합 아암)의 결합. 각각의 키메라는 인간 KLB 및 인간 클로토 알파 (KLA) 단백질 (인간 KLB 단백질에 대해 50％ 동일성) 또는 토끼 KLB (인간 KLB에 대해 86％ 동일성)을 융합함으로써 구축되었다. 도 13A에 요약된 바와 같이, 8C5는 KLB의 C-말단 도메인에 결합하고, 특히 KLB의 C-말단 도메인 내의 34개의 아미노산 (SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS; 서열식별번호: 142)을 함유하는 영역에서 결합한다.
도 13B에 나타난 바와 같이, 서열식별번호: 142의 아미노산 서열은 신호 서열, 예를 들어, 서열식별번호: 157에 기재된 서열을 갖는 아미노산 52개의 서열을 포함하는 KLB 단백질의 아미노산 857-890에 상응할 수 있거나, 또는 신호 서열을 포함하지 않는 KLB 단백질의 아미노산 805-838을 지칭할 수 있다.
FGF21과 BsAb10 및 이의 유도체 사이의 하류 작용에서의 유사성에도 불구하고, KLB 상의 BsAb10의 에피토프는 FGF21 및 FGF19 결합 부위와 별개이다 (도 14A).
도 14B는 FGFR4 및 KLB로 공동-형질감염되고, 단독 FGF19로 또는 항-KLB/항-FGFR1c 항체 (BsAb17)와 조합된 FGF19로 처리된 래트 L6 근육모세포에서 수행된 GAL-ELK1 루시페라제 검정법의 결과를 나타낸다. 도 14B에 나타난 바와 같이, BsAb17 예비처리는 FGFR4/KLB 복합체를 발현하는 L6 세포에서 FGF19-활성을 또한 차단하지 않았다.
추가적으로, 그리고 도 14C에 나타난 바와 같이, BsAb17 예비처리는 FGFR4 및 KLB를 발현하는 H4IIE 간세포암 세포에서 FGF19-활성을 차단하지 않았다. BsAb17의 존재 하에, FGF19가 여전히 FGFR4/KLB 복합체를 활성화시켜 ERK의 인산화를 유도할 수 있었다 (도 14C). 이러한 데이터들은 개시된 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체, 예를 들어, 항-KLB/항-FGFR1c 이중특이적 항체가 FGF19 또는 FGF21과 KLB/FGFR1c 복합체의 상호작용을 방해하지 않는다는 것을 가리킨다.
실시예 9: BsAb10, 및 이의 유도체가 생체 내에서 장기 작용 FGF21 모방체로서 작용한다
상기 기술된 바와 같은 뮤린 수용체 복합체와 BsAb10 및 이의 유도체의 교차-반응성 (예를 들어, 도 6C 및 10B 참조)은 이의 생체내 활성을 마우스 모델에서 테스트하는 것을 허용하였다. IgG 이펙터 기능으로부터의 잠재적인 독성을 피하기 위해, 이중 돌연변이 [D265A/N297G]를 Fc 영역에서 BsAb20에 도입하였고, 이는 FcgR에 결합하는 것 및 면역 이펙터 세포의 동원을 폐지한다. 또한, IgG 이펙터 기능으로부터의 잠재적인 독성을 피하기 위해, N297G를 Fc 영역에서 BsAb17에 도입하였고, 이는 FcgR에 결합하는 것 및 면역 이펙터 세포의 동원을 폐지한다.
도 15A에 나타난 바와 같이, 5 mg/kg으로 당뇨병 db/db 마우스 내로 복막내 주사되었을 때, BsAb17이 음식 섭취 또는 체중에 영향을 미치지 않으면서 혈액 글루코스 수준을 유사한 정도로 감소시켰다. BsAb17로 처리된 마른 C57BL/6 마우스가 혈액 글루코스 감소를 나타냈지만, 독성 저혈당이 달성되지 않았다 (도 15A).
또한, 고지방 식이가 급식된 C57BL/6 마우스 (식이 유도 비만, DIO)에게 제0일 및 제6일에 3 mg/kg의 BsAb17을 주사하였을 때, 체중 및 혈액 글루코스의 유의한 감소가 관찰되었다 (도 15B). 고지방 식이 급식을 위해, 고지방, 고탄수화물 식이 (하란 테크래드 TD.03584, 지방으로부터의 58.4％ 칼로리)를 사용하였다.
도 15C에 나타난 바와 같이, 3 mg/kg의 BsAb17을 주사한 고지방 식이-급식 C57BL/6 마우스 (식이 유도 비만, DIO)에서 글루코스 내성의 개선이 관찰되었다.
3 mg/kg의 BsAb17을 주사한 고지방 식이-급식 C57BL/6 마우스 (식이 유도 비만, DIO)에서 간 트리글리세리드, 혈청 인슐린, 유리 지방산, 트리글리세리드 및 총 콜레스테롤의 감소가 또한 관찰되었다 (도 15D). 유사한 결과가 기존에 FGF21 주사로 관찰되었다.
항-KLB/항-FGFR1c 이중특이적 항체로의 처리 시에 관찰된 글루코스 내성의 개선이 기능성 KLB를 요구하는지를 결정하기 위해, klb 이종접합 마우스 및 동종접합 klb 결핍 마우스에서 별도의 실험을 수행하였다. klb-결핍 (KO) 마우스를 생성시키기 위해, Klb-특이적 아연 손가락 뉴클레아제 (ZFN) 쌍을 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터 수득하고, 확립된 방법에 따라 전핵(pronuclear) 미세주입에 사용하였다. ZFN 쌍은 마우스 게놈 내의 하기의 Klb 서열 (소문자의 절단 부위)을 표적으로 하고, KO 마우스에서는 1 bp 결실 (볼드체의 g)이 결여되어 프레임 이동을 야기한다: GTTACCGGCTTCtccggaGACGGGAAAGCAATATGG (서열식별번호: 156). 도 16A는 마우스 KLB 단백질의 N-말단 아미노산 서열 및 klb 결핍 마우스에서 klb 대립유전자에 의해 코딩되는 상응하는 아미노산 서열을 나타낸다.
도 16B는 klb 결핍 마우스에서의 KLB 단백질 발현의 결여를 입증하도록 수행된 웨스턴 블롯의 결과를 나타낸다.
도 16C에 나타난 바와 같이, BsAb20이 글루코스 내성 테스트 (GTT)에 의해 측정했을 때 klb 이종접합 마우스에서 글루코스 내성을 개선하였지만, 동종접합 klb 결핍 마우스에서는 그렇지 않았고, 이는 글루코스 내성의 개선이 기능성 KLB를 요구한다는 것을 가리킨다. 글루코스 내성 테스트 (GTT)를 위해, 마우스를 철야로 금식시키고, 2 g/kg의 글루코스 용액을 복막내 주사하였다.
또한, 혈청 FGF23 및 인 수준을 변경시키는 항-FGFR1 R1MAb1 (문헌 [Wu et al., Sci Transl Med 3, 113ra126 (2011)] 및 [Wu et al., PLoS One 8, e57322 (2013)])과 달리, 항-KLB/항-FGFR1 이중특이적 항체는 이러한 혈청 파라미터들에 영향을 미치지 않았고, 이는 KLB-비의존적 FGFR1 효능작용 활성의 부재를 가리킨다 (도 16D).
도 17에 나타난 바와 같이, BsAb17은 KLB-비의존적 FGFR1의 민감한 마커인 혈청 FGF23 또는 인 수준에 영향을 미치지 않았다. BsAb17로 처리된 마우스에서의 인슐린 작용을 고인슐린혈증-정상 혈당 클램프에 의해 측정하였다. 간략하게, 마우스를 이소플루란으로 마취하고, 왼쪽 총동경맥 및 오른쪽 경정맥에 각각 샘플 수집 및 주입을 위해 카테터를 삽입하였다. 카테터의 속박되지 않은 끝부분을 피부 아래에서 목 뒷부분으로 통과시키고, 여기에서 카테터의 늘어진 끝부분을 마이크로-레나탄(MICRO-RENATHANE)® (외경 0.033)으로 제조된 튜빙에 부착하였다. 수술 후 동물들을 개별적으로 거주시키고, 체중을 매일 기록하였다. 모든 대사 실험이 5일의 수술후 회복 기간 후에 수행되었고, 기존에 기술되었다. 의식이 있는 구속되지 않은 마우스를 짚이 깔린 1-L 플라스틱 컨테이너 내에 놓고, 7:00 am (t=-300분)에 금식시켰다. 동시의 경정맥 주입 및 동맥혈 샘플 수집을 허용하도록 마우스를 즉각적으로 듀얼 채널 스테인레스 스틸 스위블(Dual Channel Stainless Steel Swivel) (인스테크 래버러토리즈(Instech Laboratories))에 연결시켰다. 마우스를 만지지 않았고, 자유롭게 이동하도록 허용하여, 스트레스를 없앴다. 클램프를 시작하기 2시간 전에, 5 μCi 볼루스의 [3-3H]-D-글루코스를 경정맥 내로 제공한 후 (t=-120분), 0.05 μCi/분의 속도의 일정한 주입이 이어졌다. 2시간의 평형 기간 후, t=0분 (즉, 5시간 금식)에, 혈액 글루코스, [3-3H]-D-글루코스, 적혈구 용적률 및 혈장 인슐린의 측정을 위해 기준선 동맥혈 샘플을 채혈하였다. 그 후, 145분 고인슐린혈증-정상 혈당 (4 mU/kg/분) 클램프를 시작하였다. [3-3H]-D-글루코스를 정상 혈당을 유지하도록 사용된 가변성 글루코스 주입물에 첨가하고, 동맥 글루코스 특이적 활성을 일정 수준으로 클램핑하도록 [3-3H]-D-글루코스의 일정한 주입을 중단하였다. C57Bl/6J 배경의 도너 마우스로부터의 적혈구를 동일한 부피의 0.9％ 헤파린처리 염수로 세정 및 재구성하고 (적혈구 용적률 ~50％), 연구 동안 제거된 혈액을 교체하기 위해 연구 기간 동안 4 ㎕/분의 속도로 주입하였다. 10분마다 동맥혈 샘플을 취하여 혈액 글루코스 수준을 결정하였다. t=80분, 90분, 100분 및 120분에, 혈액 샘플을 취하여 [3-3H]-D-글루코스를 결정하였다. t=120분에, 13 μCi 볼루스의 2-데옥시 [14C] 글루코스 ([2-14C]DG)를 경정맥 카테터 내로 투여하였다. t=122분, 125분, 130분, 135분 및 145분에, 동맥혈의 샘플을 수집하여 혈액 글루코스, 혈장 [3-3H]-D-글루코스 및 [2-14C]DG를 결정하였다. 100분 및 120분에 동맥 인슐린 농도를 측정하였다. 그 후, t=145분에, 마우스를 마취하였다. 가자미근, 장딴지근, 백색 표재 외측광근 (네갈래근), 간, 심장, 부고환 및 피하 백색 지방 조직, 갈색 지방 조직 및 뇌를 절제하고, 즉각적으로 액체 질소에서 냉동시키고, 추후의 조직 분석까지 -70℃에서 보관하였다. 린코 래트 라디오이뮤노어세이(Linco Rat Radioimmunoassay) 키트 (린코리서치(LincoResearch))를 사용하여 면역반응성 인슐린을 검정하였다.
[3-3H]-D-글루코스를 측정하기 위해, 혈장 샘플에서 수산화바륨 (Ba(OH)2) 및 황산아연 (ZnSO4)으로 단백질을 제거하고, 건조시키고, 액체 섬광 카운팅을 사용하여 방사성을 결정하였다. 절제된 조직에서 과염소산으로 단백질을 제거한 후, ~7.5의 pH로 중화시켰다. 샘플의 일부는 카운팅하고 ([2-14C]DG 및 [2-14C]DG-G포스페이트 ([2-14C]DGP)), 일부는 Ba(OH)2 및 ZnSO4로 처리하고, 상청액을 카운팅하였다 ([2-14C]DG). [2-14C]DG 및 [2-14C]DG-포스페이트 ([2-14C]DGP) 방사성 수준을 액체 섬광 카운팅을 사용하여 결정하였다. 분포 부피 (130 ml/kg)를 가정하여 비-정상 상태 등식을 사용하여 글루코스 유동률을 평가하였다. [2-14C]DG의 조직-특이적 소거 (Kg) 및 글루코스 섭취 지수 (Rg)를 기존에 기술된 바와 같이 계산하였다 (Kraegen, E.W. et al., Am. J. Physiol. 248, E353-362 (1985)): Kg=[2-14C]DGP조직/AUC [2-14C]DG혈장, Rg=Kg × [글루코스]혈장 [식 중, [2-14C]DGP조직은 조직에서의 [2-14C]DGP 방사성 (dpm/g)이고, AUC [2-14C]DG혈장은 혈장 [2-14C]DG 소멸 곡선의 곡선하 면적 (dpm/mL/분)이고, [글루코스]혈장은 실험 기간 (t=102-125분) 동안의 평균 혈액 글루코스 (㎍/㎕)이다]. 데이터는 평균 ± SEM로 제시된다.
10 mg/kg의 BsAb17의 단일 주사 후에 측정된 전신 글루코스 이용을 도시하는 도 15E에 나타난 바와 같이, BsAb17이 인슐린 자극 전신 글루코스 이용률을 개선하였다.
또한, 그리고 도 15F에 나타난 바와 같이, 10 mg/kg의 BsAb17의 단일 주사 후에 BsAb17이 내인성 글루코스 생산율의 인슐린 억제를 개선하였다. 이러한 결과들은 클램프 5일 전의 DIO 마우스에서의 10 mg/kg의 BsAb17의 단일 주사가 공복 글루코스 및 인슐린 농도를 현저하게 저하시켰음을 가리킨다.
인슐린-자극 기간 말기의 조직 글루코스 섭취 (Rg)가 심장, 골격근, 백색 지방 조직 (WAT) 및 견갑간 BAT 조직 (iBAT)에서 강화되었고, 이는 BsAb17에 의한 전신 인슐린 감작를 가리킨다 (도 15G).
클램프 실험 동안의 동맥 혈액 글루코스 변동의 양을 결정하였다. 도 18A에 나타난 바와 같이, 고인슐린혈증-정상 혈당 클램프 실험 동안 BsAb17을 주사한 마우스와 대조군 IgG를 주사한 마우스 사이에서 동맥 혈액 글루코스 변동량이 상이하였다.
BsAb17을 주사한 마우스와 대조군 IgG를 주사한 마우스 사이에서의 체중 차이를 또한 결정하였다. 도 18B에 나타난 바와 같이, 글루코스 및 인슐린 농도에서 관찰된 차이가 명백한 체중 감소가 없었다.
BsAb17 주사 후에 정상 상태 글루코스 주입률을 또한 분석하였다. 도 18C에 나타난 바와 같이, 정상 상태 글루코스 주입률이 BsAb17 주사 후에 64％만큼 증가되었다. 이러한 결과들은 BsAb17이 체중 감소가 명백해지기도 전에 DIO 마우스에서 전신 인슐린 민감도를 개선하였음을 실연한다.
약리학적 용량의 FGF19 또는 FGF21로의 이전의 연구는 증가된 에너지 소모 (EE)를 나타냈고 (Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Coskun et al., Endocrinology 149, 6018-6027 (2008); Wu et al., PLoS One 8, e57322 (2013); Lin et al., Cell Metab 17, 779-789 (2013)), 따라서 유사한 효과가 관찰될 것으로 추론되었다. 하기의 등식을 사용하여 EE 및 호흡 지수 (RQ)를 계산하였다. EE=VO2X(3.815+1.232×RQ) [식 중, (RQ=VCO2/VO2)]. 실제로, 일반적인 실온 (21℃)에서의 DIO 마우스 또는 마른 마우스 내로의 단일 BsAb17 주사가 활성 카운트에서의 유의한 변화 없이 주사 동물 당 O2 소비 (VO2), CO2 생산 (VCO2), 및 EE에서의 유의한 증가에 이르렀다 (도 19A). 예상 밖으로, EE에서의 관찰된 15-46％ 증가는 호흡 지수 (RQ=VCO2/VO2)에서의 유의한 변화를 동반하지 않았다 (도 19A).
FGF21을 DIO 마우스 내로 지속적으로 주입하는 것에 의해 RQ에서 변화가 없으면서 EE에서의 유사한 변화가 도출되었다 (도 21C)
도 20A는 일반적인 실온에서 단일 BsAb17 주사로 처리된 DIO 마우스의 VO2, VCO2 및 총 활성 카운트의 양을 나타낸다.
도 19B에 나타난 바와 같이, 우리 온도가 열 중성대 (29-30℃)로 상승되었을 때 EE에서의 증가가 지속되었고, 이는 갈색 지방 활성화의 BsAb17-유도가 교감 신경계로부터의 적응성 발열 입력에 의존적이지 않다는 것을 시사한다.
도 20B는 일반적인 실온에서 단일 BsAb17 주사로 처리된 후 온도가 열 중성대로 변화된 DIO 마우스의 VO2, VCO2 및 총 활성 카운트의 양을 나타낸다.
열 중성대 온도 (29-30℃)에서 적응된 DIO 마우스를 2주 동안 테스트했을 때 EE 증가가 또한 명백하였다 (도 21B).
평균 EE 값을 나타내는 도 21A에서 요약된 바와 같이, 일반적인 실온에서의 마른 마우스 및 DIO 마우스, 및 열 중성대 실온에서 적응된 마른 마우스 및 DIO 마우스에서 EE 변화가 관찰되었다.
대조적으로, β3-특이적 아드레날린 수용체 효능제 CL-316,243의 지속적인 주입이 급성 EE 증가 및 RQ 감소를 유도하였다 (도 19H). 피하 이식된 삼투압 미니-펌프 (알젯(Alzet) 2001)를 사용하여 FGF21 또는 CL-316,243의 지속적인 주입을 수행하였다. 따라서, BsAb17- 및 FGF21-유도 EE가 강건하지만, 지질 산화 및 RQ 감소의 촉진을 동반하는 다른 이전에 기술된 BAT 활성화 메커니즘, 예컨대 교감신경모방체(sympathomimetic) (노르에피네프린 또는 β3-특이적 아드레날린 수용체 효능제 CL-316,243), 심장 나트륨뇨배설촉진 펩티드, 또는 인터루킨-4의 투여 (문헌 [Gerhart-Hines et al., Mol. Cell 44, 851-863 (2011)]; [Mattsson et al., American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 299, E374-383 (2010)]; [Nguyen et al., Nature 480, 104-108 (2011)]; [Birkenfeld et al. Diabetes 57, 3199-3204 (2008)]; [Bordicchia et al., J. Clin. Invest. 122, 1022-1036 (2012)]; 및 [de Souzaet al., Diabetes 46, 1257-1263 (1997)])보다 더욱 선택적인 것으로 보인다.
특정 이론에 한정되지 않으면서, 여러 계통의 증거가 BsAb17의 대사 작용에서의 BAT 활성화의 우세한 역할을 시사하였다. 첫째로, 도 19C에 나타난 바와 같이, BsAb17 주사가 특이적으로 iBAT 내로 18F-플루데옥시글루코스 (FDG)가 섭취되는 것을 증가시켰다.
둘째로, 단일 BsAb17 주사가 지방 조직 갈색화의 지표인 서혜부 WAT (ingWAT)에서의 UCP1 단백질 발현을 유도하였다 (도 19D).
도 19E에 나타난 바와 같이, UCP1 발현의 유도가 FGF21 또는 BsAb17로 처리된 배양된 1차 지방세포에서 또한 관찰되었고, 이는 성숙 지방세포에 대한 직접적인 작용을 가리킨다. UCP1 발현을 결정하기 위해, 전체 RNA를 수퍼스크립트® 빌로(SUPERSCRIPT® VILO) cDNA 합성 키트 (ABI)를 사용하여 cDNA를 합성하는데 사용하였다. qPCR을 위해, 샘플을 ViiA 7 실시간 PCR 기구 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems))에서 삼중으로 러닝시켰다. 사용된 어플라이드 바이오시스템즈의 미리 디자인된 택맨(TAQMAN)® 유전자 발현 검정법 프로브는 UCP1 (Hs01027785_m1)이었다. 각각의 샘플에 대해, mRNA 과다를 TBP (Hs00427620_m1) 및 SDHA (Hs00188166_m1) 전사체의 양에 대해 표준화하였다.
셋째로, 원격측정법 시스템을 사용하여, 휴식기의 심부 체온의 증가가 단일 BsAb17 주사 후에 관찰되었고, 이는 ≥26일 동안 지속된 후 점진적으로 기준선으로 되돌아갔다 (도 19F).
도 22는 대조군 IgG로 처리된 마우스와 비교하여 단일 BsAb17 주사 후에 마우스에서 관찰된 심부 체온에서의 차이를 나타낸다. 수술에 의해 복강 내로 이식된 TA-F10 트랜스미터 (데이터 사이언시즈 인터내셔날(Data Sciences International), DSI)를 사용하여 심부 체온을 모니터링하였다. 수술에서 회복된 후, 마우스를 체중 및 심부 체온을 기초로 하는 군으로 무작위화하였다. DSI의 이식성 원격측정법 시스템을 사용하여 심부 체온 및 활성을 모니터링하였다.
BsAb17, FGF21 또는 대조군 IgG의 단일 주사가 제공된 DIO 마우스의 iBAT에서 유전자 발현 프로파일을 분석하였다. 도 19G에 나타난 바와 같이, 단일 BsAb17 주사가 FGF21의 일일 2회 주사와 유사한 iBAT에서의 유전자 발현 변화를 유도하였다.
마지막으로, C57BL/6 마우스 내로 주사되었을 때, FGF21 및 BsAb20 양쪽 모두 iBAT 및 ingWAT를 포함하는 다양한 지방 조직에서 ERK 및 MEK 인산화를 유도하였다 (도 23).
기존의 연구에서, 아디포넥틴이 FGF21의 완전한 작용에 기여하는 것으로 제안되었다 (Lin et al., Cell Metab 17, 779-789 (2013); Holland et al., Cell Metab 17, 790-797 (2013)). 실제로, DIO 마우스 내로의 BsAb17의 단일 주사가, 연관된 체중 감소와 함께, 혈청 고분자량 (HMW) 아디포넥틴 수준의 증가에 이르렀다 (도 24A).
유사하게, 마른 시노몰구스 원숭이 내로의 BsAb17의 단일 주사 (도 24B)가, 관련된 체중 감소와 함께, 혈청 고분자량 (HMW) 아디포넥틴 수준의 증가에 이르렀다.
도 24C에 나타난 바와 같이, BsAb17의 단일 주사 시, HFD 중인 아디포넥틴 (Adipoq) KO 마우스가 EE를 상승시키는 것에서 강건한 반응을 나타냈다 (wt 마우스에서의 20.9％에 대비하여 25.3％ 증가).
또한, BsAb17의 단일 주사 시, HFD 중인 아디포넥틴 (Adipoq) KO 마우스가 감소된 체중 및 간 트리글리세리드 수준을 나타냈다 (도 24D). 그러나, 글루코스 내성, 인슐린 내성에서의 반응, 혈청 인슐린 및 다양한 지질에서의 변화가 모두 KO 마우스에서 다소 둔해졌고 (도 24D), 이는 BsAb17이 부분적으로 아디포넥틴 기능을 통해 전신 영양소 대사를 조절하는 것에서 FGF21 모방체로서 작용한다는 개념과 일치한다. 인슐린 내성을 결정하기 위해, 마우스를 4시간 동안 금식시키고, 1 U/kg 인간 인슐린 용액 (휴물린 알(Humulin R), 일라이 릴리 앤드 컴패니(Eli Lilly and Company))을 복막내 주사하였다.
BsAb10의 증가된 수용체 선택성 (도 9A 참조) 및 IgG 분자의 기존에 기술된 낮은 뇌 투과 (Yu et al., Sci Transl Med 3, 84ra44 (2011))로 FGF21/19와 비교하여 BsAb10 및 이의 유도체의 변경된 안전성 프로파일이 예측된다. 간에서의 FGFR1의 낮은 발현 수준과 일관되게, FGF21이 간에서 고전적인 FGFR 표적 유전자인 Spry4 및 Dusp6의 mRNA 발현을 유도하였지만, BsAb17은 그렇지 않았다 (도 25).
BsAb17 또는 BsAb20는 또한 다양한 지방 조직 및 췌장 샘꽈리세포에서 증가된 포스포-ERK 신호를 초래하였지만, 간에서는 그렇지 않았다 (도 23).
도 26은, 면역조직화학에 의해 결정 시, 뇌실주위 기관을 포함하는 다양한 뇌 분절에서 BsAb17이 또한 ERK의 인산화를 유도하지 않는다는 것을 나타낸다.
또한, FGF19-유사 활성에 대해 예상되는 것과 반대로, 8주 동안의 DIO 마우스의 장기 BsAb20 처리가 간 내의 BrdU+ 세포의 개수를 마른 C57BL/6 마우스의 수준으로 감소시켰다 (도 27). 간 BrdU 혼입을 위해, 안락사 2시간 전에 100 mg/kg BrdU (BD 바이오사이언시즈(BD Biosciences))를 마우스에게 복막 내로 주사하였다. 항-BrdU 염색을 문헌 [Nicholes, K., et al. Am. J. Pathol. 160, 2295-2307 (2002)]에 기술된 바와 같이 수행하고, 아리올(Ariol) 자동 영상 분석 시스템을 사용하여 BrdU 양성 간세포를 계수하였다.
항-KLB/항-FGFR1c 항체로 처리된 마우스의 골 분석을 수행하였다. 도 28A는 이러한 분석의 개략도를 나타낸다. 골 분석을 수행하기 위해, 70 keV의 x-선 튜브 에너지 수준 및 114 마이크로암페어의 전류로 작동되는 스캔코 메디컬(SCANCO Medical) (스위스 바셀도르프) μCT40 마이크로-영상화 시스템에 의해 대퇴골 샘플을 영상화하였다. 12 ㎛의 등방성 복셀 크기로 인접한 축면 영상 슬라이스들을 수득하였다. 대퇴골 내의 지주골의 형태측정 분석을 스캔코 메디컬 (스위스 바셀도르프) μCT40 평가 소프트웨어로 수행하였다. 반자동 윤곽화를 사용하여, 근위 대퇴골 성장판에 대해 등쪽인 2차 지주골을 포함하고 1차 지주골에 대해 1.5 mm 원위로 확장된 관심 부피 (VOI)를 한정하였다. VOI 경계를 피질골의 내부 경계 내에 놓음으로서 피질골을 배제하였다. 영상 분절화 전에, 제한된 3차원 (3D) 가우시안 저역 통과 필터를 노이즈 억제를 위해 영상 데이터에 적용하였다 (필터 시그마=0.5, 필터 서포트=1). 전역 임계치 (0.36 gHA/cm3)를 적용하여 "이진화"된 지주 구조를 VOI로부터 추출하였다. 샘플들의 대표적인 서브세트로부터의 분할 결과의 시각 검사에 의해 지주 분할 임계치를 선택하였다. 직접적인 3D 형태측정 분석에 의해 지주 구조 특성을 정량하였다. 이전의 연구들은 미세전산화 단층촬영에 의한 지주골의 형태측정 분석이 조직형태측정에 의해 이루어진 유사한 추정치와 잘 상호관련된다는 것을 나타냈다.
도 28B에 나타난 바와 같이, 6주 동안의 DIO 마우스의 장기 BsAb20 처리가 미세전산화 단층촬영을 기초로 하는 경골 지주골 및 대퇴골 피질골에서의 다양한 골 파라미터에서의 어떠한 음성 신호도 없이 대사 파라미터에서의 예상된 변화를 초래하였다.
도 29에 나타난 바와 같이, DIO 마우스 내로의 BsAb17 주사가 혈청 코르티코스테론 수준을 대조군보다 높게 증가시키지 않았다. 현대 사회에서 통상적인 만성 양성 에너지 균형이 유행병 비만, 및 인슐린 저항성, 고인슐린혈증, 글루코스 불내성, 고지질혈증 및 지방간을 특징으로 하는 연관된 대사 교란을 일으키고 있고, 이는 종종 중증 질병 예컨대 2형 당뇨병, 간경변, 뇌졸중 및 심장 질환에 이른다. 2009년에, 성인 내의 UCP1-양성 BAT의 존재, 및 열 소실을 통해 EE를 구동시키는 것에서의 이의 기능적 유의성이 보고되어, 비만 및 관련 대사 질환의 치료를 위한 BAT의 치료적 유도 및 활성화에서 굉장한 관심이 불타오르게 하였다 (Yoneshiro and Saito, Ann. Med., 1-9 (2014)).
그러나, 대부분의 공지된 BAT-활성화 메커니즘은 백색 지방 조직 지방분해를 또한 유도하고, 이는 심혈관 결과에 음성적으로 영향을 미칠 수 있다 (Dong et al., Cell Metab. 18, 118-129 (2013)). 흥미롭게, BAT 이식이 EE를 증가시키고, RQ 변화 없이 체중 감소를 유도한다 (Stanford et al., J. Clin. Invest. 123, 215-223 (2013)). 이와 관련하여, FGF21 및 본원에 기술된 항-FGFR1/KLB 효능제 항체가 비-특이적 교감신경활성화보다는, RQ를 변화시키지 않으면서 BAT에서 발열 반응을 선택적으로 유도하여 BAT 이식을 모방하는 독특한 접근법을 제시한다. 또한, 마우스에서 관찰된 것을 기초로, FGF21 또는 FGF19 유사체에 의한 더욱 광범위한 FGFR/KLB 복합체 활성화와 대조적으로, FGFR1c/KLB 복합체의 항체-매개 활성화가 항-비만 및 항-당뇨병 요법을 위한 더욱 안전하고 더욱 효율적인 수단을 제공할 수 있는 것으로 구상된다.
실시예 10: 항-KLB 항체 8C5의 인간화
8C5의 뮤린 경쇄 CDR을 인간 카파2 및 카파4 경쇄 프레임워크 내로 그래프팅하였다. 1차 그래프팅에 더하여, 경쇄의 위치 4가 류신으로 전환되도록 ("M4L"로 지정됨), 각각에서 점 돌연변이를 또한 생성시켰다. 분석을 수행하여, 최상품을 발현하고 유의한 응집을 나타내지 않은 것들을 확인하였다. 유사하게, 중쇄 CDR을 인간 H1, H2, H3 및 H4 IgG1 중쇄 프레임워크 내로 그래프팅하였다. 중쇄 골격 내의 다양한 잔기를 하기와 같이 돌연변이시켰다: H1의 경우, 하기의 변화를 도입하였다: K71R, N73T 및 V78A (모체는 "KNV"로 지정되고, 구축물은 "RTA"로 지정됨); H2의 경우, 하기의 변화를 도입하였다: N73T (모체는 "KNV"로 지정되고, 구축물은 "KTV"로 지정됨); H3의 경우, 하기의 변화를 도입하였다: K71R 및 V78L (모체는 "KNV"로 지정되고, 구축물은 "RNL"로 지정됨); H4의 경우, 하기의 변화를 도입하였다: K71V, N73T, 및 V78F (모체는 "KNV"로 지정되고, 구축물은 "VTF"로 지정됨).
4개의 경쇄 및 8개의 중쇄의 모든 쌍을 이룬 조합을 기초로 하는 항체 (총 32개의 항체)를 생산하고, 발현 수준 및 친화력을 테스트하였다. 이러한 실험을 기초로, 8C5에서 유래된 경쇄 K4.M4L 및 중쇄 H3.KNV가 발현 수준 및 원하는 친화력의 최상의 조합을 나타냈다.
8C5.K4.M4L.H3.KNV 가변 영역 및 전장 항체의 서열은 하기와 같다:
8C5.K4.M4L.H3.KNV 중쇄 가변 영역
Figure pat00021
8C5.K4.M4L.H3.KNV 전장 중쇄
Figure pat00022
8C5.K4.M4L.H3.KNV 경쇄 가변 영역
Figure pat00023
8C5.K4.M4L.H3.KNV 전장 경쇄
Figure pat00024
실시예 11: YW182.3과 YW182.5 사이의 항-FGFR1 항체 하이브리드의 생성
항-FGFR1 아암의 부재 하에 KLB/FGFR1c 복합체를 활성화시키지 않은 항-FGFR1 아암인 YW182.5는 8C5와 조합되었을 때 양호한 결과를 제공하는 것으로 발견되었고, 산화에 대해 감수성인 중쇄의 위치 33의 트립토판이 있다. YW182.5와 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 보이는 YW182.2 또한 중쇄의 위치 33에 이같은 트립토판이 있다. 이러한 문제를 방지하기 위해 이러한 위치에서 몇몇 돌연변이가 도입되었다: YW182.5의 경우, W33Y, W33H, W33F 및 W33L이 도입되었고, YW182.2의 경우, W33Y 및 W33F가 도입되었다. 뜻밖으로, 도입된 돌연변이들이 2개의 항체에서 효과가 상이하였다. YW182.2의 경우, 돌연변이가 FGFR1에 대한 친화력 또는 효능작용 활성에 인지할 수 있게 영향을 미치지 않은 것이 관찰된 반면, YW182.5의 경우에는, 돌연변이가 FGFR1에 대한 친화력 및 효능작용 활성을 크게 감소시켰다 (예를 들어, 도 31 참조). 따라서, W33Y 돌연변이가 있지만, 친화력이 YW182.5 항체의 것에 더 가까운 항체를 확인하기 위해 2가지 접근법을 사용하여 실험을 수행하였다.
한 접근법에서, YW182.2 W33Y에 대해, CDR3에 걸친 중쇄 서열 알라닌 스캐닝을 수행하여 위치 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a 및 100b를 알라닌으로 돌연변이시켰다. 생성된 항체의 친화력을 분석하였고, YW182.2 W33Y 모체의 매우 높은 친화력을 유지한 것들을 확인하였다 (표 9).
<표 9>
YW182.2 유도체의 친화력
Figure pat00025
두 번째 접근법에서, YW182.2 W33Y 항체 (친화력이 매우 높음) 및 YW182.5 W33Y 항체 (거의 결합하지 않음)로부터의 CDR을 짜맞추었다. YW182.2 W33Y 및 YW182.5 W33Y 항체는 경쇄 내의 CDR 서열이 동일하고 (CDR-L1, RASQDVSTAVA (서열식별번호: 139); CDR-L2, SASFLYS (서열식별번호: 140); 및 CDR-L3 QQSYTTPPT (서열식별번호: 141)), CDR-H1 내에 단일 아미노산 차이가 있으며 (YW182.2 W33Y CDR-H1, STYIS (서열식별번호: 152) 및 YW182.5 W33Y CDR-H1, SNYIS (서열식별번호: 136)), CDR-H2 내이거나 또는 CDR-H2에 인접한 3개의 아미노산 차이가 있고 (YW182.2 W33Y CDR-H2, EIDPYDGDTYYADSVKG (서열식별번호: 137) 및 YW182.5 W33Y, EIDPYDGATDYADSVKG (서열식별번호: 153)), CDR-H3 서열이 매우 상이하다 (YW182.2 W33Y, EHFDAWVHYYVMDY (서열식별번호: 154) 및 YW182.5 W33Y GTDVMDY (서열식별번호: 138)). YW182.5 W33Y 및 YW182.2 W33Y로부터의 중쇄 CDR의 모든 가능한 조합을 기초로 하는 중쇄가 있는 항체 (2개의 모 항체를 포함하는 8개)를 구축하고 테스트하였다. 대부분의 항체가 친화력이 서로 유사하였지만, 뜻밖으로, 1개의 조합에서 모 YW182.5 항체와 거의 동일한 결합이 실연되었다. 이러한 항체는 CDR-H1 및 CDR-H3은 YW182.5 W33Y로부터 것이지만, CDR-H2는 YW182.2 W33Y로부터의 것이다. 이러한 항체는 YW182.5 서열에서의 하기의 변화를 나타내도록 "YW182.5 YGDY"로 지정되었다: W33Y, A49G, A56D, 및 D58Y.
YW182.5 YGDY 항체의 서열은 하기와 같다:
YW182.5_YGDY 중쇄 가변 영역
Figure pat00026
YW182.5_YGDY 전체 중쇄
Figure pat00027
YW182.5_YGDY 경쇄 가변 영역
Figure pat00028
YW182.5_YGDY 전체 경쇄
Figure pat00029
실시예 12: 인간화 8C5 및 항-FGFR1 변이체가 있는 이중특이적 항체의 테스트
8C5.K4H3.M4L.KNV 및 상이한 항-FGFR1 아암들의 다양한 이중특이적 항체 조합을 KLB와 함께 또는 KLB 없이 FGFR1c를 발현하는 HEK293 세포에서의 GAL-ELK1-기반 루시페라제 검정법에서 테스트하였다. 앞서 관찰된 바와 같이, 각각의 이중특이적 항체 조합이 재조합 hFGFR1c 및 hKLB를 발현하는 세포에서 용량-의존적 방식으로 루시페라제 활성을 유도하였지만, KLB 발현이 없는 세포에서는 그렇지 않았다 (도 30). 이러한 데이터들은 이러한 변형된 변이체들이 모 항체, 예를 들어, BsAb13의 장점을 유지한다는 것을 입증한다. 인간화 8C5 아암 (8C5.K4.M4L.H3.KNV) 및 YW182.5_YGDY 아암이 있는 항-KLB/항-FGFR1 항체의 HEK293 세포의 표면 상의 인간, 시노몰구스 원숭이 및 마우스 KLB/FGFR1c 복합체에 대한 결합 친화력이 표 10에서 제시된다.
<표 10>
결합 친화력
Figure pat00030
서술 및 청구된 다양한 실시양태에 더하여, 개시된 주제는 본원에서 개시 및 청구된 특색들의 다른 조합이 있는 다른 실시양태에 또한 지시된다. 따라서, 개시된 주제가 본원에 개시된 특색들의 임의의 적절한 조합을 포함하도록, 본원에서 제시된 특정 특색은 개시된 주제의 범주 내에서 다른 방식으로 서로 조합될 수 있다. 개시된 주제의 구체적인 실시양태가 상기에서 기술된 것은 설명 및 기술의 목적을 위해 제시되었다. 포괄적이거나 또는 개시된 주제를 이러한 개시된 실시양태에 한정하는 것이 의도되지 않는다.
개시된 주제의 취지 또는 범주를 벗어나지 않으면서 개시된 주제의 조성물 및 방법에서 다양한 변형 및 변경이 이루어질 수 있다는 것이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 따라서, 개시된 주제가 첨부된 청구항 및 이의 등가물의 범주 내에 속하는 변형 및 변경을 포함하는 것이 의도된다.
다양한 간행물, 특허 및 특허 출원이 본원에서 인용되고, 이의 내용은 이에 의해 전문이 참고로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <120> ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> 00B206.0170 <140> <141> <150> 62/081,435 <151> 2014-11-18 <150> 61/920,396 <151> 2013-12-23 <160> 166 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 1 Ser Tyr Gly Ile Ser 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 2 Asp Tyr Tyr Met Asn 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 3 Asn Tyr Gly Val Ser 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 4 Asp Thr Tyr Met Asn 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of 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Arg 645 650 655 Ala Ala His Asn Leu Met Ile Ala His Ala Gln Val Trp His Leu Tyr 660 665 670 Asp Arg Gln Tyr Arg Pro Val Gln His Gly Ala Val Ser Leu Ser Leu 675 680 685 His Cys Asp Trp Ala Glu Pro Ala Asn Pro Phe Val Asp Ser His Trp 690 695 700 Lys Ala Ala Glu Arg Phe Leu Gln Phe Glu Ile Ala Trp Phe Ala Asp 705 710 715 720 Pro Leu Phe Lys Thr Gly Asp Tyr Pro Ser Val Met Lys Glu Tyr Ile 725 730 735 Ala Ser Lys Asn Gln Arg Gly Leu Ser Ser Ser Val Leu Pro Arg Phe 740 745 750 Thr Ala Lys Glu Ser Arg Leu Val Lys Gly Thr Val Asp Phe Tyr Ala 755 760 765 Leu Asn His Phe Thr Thr Arg Phe Val Ile His Lys Gln Leu Asn Thr 770 775 780 Asn Arg Ser Val Ala Asp Arg Asp Val Gln Phe Leu Gln Asp Ile Thr 785 790 795 800 Arg Leu Ser Ser Pro Ser Arg Leu Ala Val Thr Pro Trp Gly Val Arg 805 810 815 Lys Leu Leu Ala Trp Ile Arg Arg Asn Tyr Arg Asp Arg Asp Ile Tyr 820 825 830 Ile Thr Ala Asn Gly Ile Asp Asp Leu Ala Leu Glu Asp Asp Gln Ile 835 840 845 Arg Lys Tyr Tyr Leu Glu Lys Tyr Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala Tyr 850 855 860 Leu Ile Asp Lys Val Lys Ile Lys Gly Tyr Tyr Ala Phe Lys Leu Thr 865 870 875 880 Glu Glu Lys Ser Lys Pro Arg Phe Gly Phe Phe Thr Ser Asp Phe Arg 885 890 895 Ala Lys Ser Ser Val Gln Phe Tyr Ser Lys Leu Ile Ser Ser Ser Gly 900 905 910 Leu Pro Ala Glu Asn Arg Ser Pro Ala Cys Gly Gln Pro Ala Glu Asp 915 920 925 Thr Asp Cys Thr Ile Cys Ser Phe Leu Val 930 935 <210> 159 <211> 53 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 159 Met Glu Lys Lys Leu His Ala Val Pro Ala Ala Lys Thr Val Lys Phe 1 5 10 15 Lys Cys Pro Ser Ser Gly Thr Pro Asn Pro Thr Leu Arg Trp Leu Lys 20 25 30 Asn Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg Ile Gly Gly Tyr Lys Val 35 40 45 Arg Tyr Ala Thr Trp 50 <210> 160 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 160 Ser Ser Pro Thr Arg Leu Ala Val Ile Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Trp Val Arg Arg Asn Tyr Gly Asp Met Asp Ile Tyr Ile Thr 20 25 30 Ala Ser <210> 161 <211> 34 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <400> 161 Ser Ser Pro Thr Arg Leu Ala Val Ile Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Trp Val Arg Arg Asn Tyr Gly Asp Met Asp Ile Tyr Ile Thr 20 25 30 Ala Ser <210> 162 <211> 34 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 162 Ser Ser Pro Ser Arg Leu Ala Val Thr Pro Trp Gly Met Arg Lys Leu 1 5 10 15 Leu Gly Trp Ile Arg Arg Asn Tyr Arg Asp Met Asp Ile Tyr Val Thr 20 25 30 Ala Asn <210> 163 <211> 34 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 163 Ser Ser Pro Ser Arg Leu Ala Val Thr Pro Trp Gly Val Arg Lys Leu 1 5 10 15 Leu Ala Trp Ile Arg Arg Asn Tyr Arg Asp Arg Asp Ile Tyr Ile Thr 20 25 30 Ala Asn <210> 164 <211> 34 <212> PRT <213> Unknown <220> <221> source <223> /note="Description of Unknown: Rabbit polypeptide" <400> 164 Ala Ser Pro Ser Arg Leu Ala Val Met Pro Trp Gly Glu Gly Lys Leu 1 5 10 15 Leu Arg Trp Met Arg Asn Asn Tyr Gly Asp Leu Asp Val Tyr Ile Thr 20 25 30 Ala Asn <210> 165 <211> 17 <212> PRT <213> Mus sp. <400> 165 Phe Ser Gly Asp Gly Lys Ala Ile Trp Asp Lys Lys Gln Tyr Val Ser 1 5 10 15 Pro <210> 166 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 166 Phe Ser Glu Thr Gly Lys Gln Tyr Gly Ile Lys Asn Ser Thr 1 5 10

Claims (26)

  1. 베타-클로토(Klotho) (KLB) 및 섬유모세포 성장 인자 수용체 1 (FGFR1)에 결합하며, KLB의 C-말단 도메인에 결합하는 단리된 이중특이적 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  2. 제1항에 있어서, 서열 142에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 KLB의 단편에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  3. 제1항에 있어서, 서열 143 또는 서열 144에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 FGFR1c의 단편 내의 FGFR1 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  4. 제1항에 있어서, 생체내 혈액 글루코스 수준을 감소시키는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  5. 제1항에 있어서, 골 밀도에 유의하게 영향을 미치지 않는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  6. 제1항에 있어서, 간에 유의하게 영향을 미치지 않는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  7. 제1항에 있어서, FGF21이 유도하는 것보다 유의하게 더 낮은 수준으로 간에서 ERK 및 MEK 인산화를 유도하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  8. 제1항에 있어서, KLB에 10-8 M 내지 10-13 M의 Kd로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  9. 제1항에 있어서, 10 nM 내지 10 μM의 Kd로 FGFR1c에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  10. 제1항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  11. 제1항에 있어서, 인간, 인간화 또는 키메라 항체인 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  12. 제1항에 있어서,
    서열 128에 기재된 서열에 대해 95% 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
    서열 130에 기재된 서열에 대해 95% 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  13. 제1항에 있어서, 12A11 또는 8C5 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  14. 제2항에 있어서, 아미노산 서열 SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (서열 142)로 이루어진 KLB의 단편 내의 KLB 에피토프에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  15. 제3항에 있어서, 아미노산 서열 KLHAVPAAKTVKFKCP (서열 143) 또는 FKPDHRIGGYKVRY (서열 144)로 이루어진 FGFR1c의 단편에 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  16. 제1항에 있어서,
    (a) 서열 128에 기재된 서열에 대해 95% 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
    서열 130에 기재된 서열에 대해 95% 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제1 항체 또는 이의 항원 결합 부분; 및
    (b) 서열 132에 기재된 서열에 대해 95% 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄 가변 영역 및
    서열 134에 기재된 서열에 대해 95% 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는, 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부분
    을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  17. 제1항에 있어서,
    (a) 서열 129에 기재된 서열에 대해 95% 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄 영역 및
    서열 131에 기재된 서열에 95% 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는, 제1 항체 또는 이의 항원 결합 부분; 및
    (b) 서열 133에 기재된 서열에 95% 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 중쇄 영역 및
    서열 135에 기재된 서열에 95% 이상 동일한 서열을 갖는 아미노산을 포함하는 경쇄 영역을 포함하는, 제2 항체 또는 이의 항원 결합 부분
    을 포함하는 항체 또는 이의 항원-결합 부분.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는, 대사 장애의 치료를 위한 제약 조성물로서, 대사 장애는 비만, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 비-알콜성 지방 간 질환 (NAFLD), 2형 당뇨병, 비-2형 당뇨병, 1형 당뇨병, 잠복성 자가면역 당뇨병 (LAD), 및 소아의 성숙기 발병 당뇨병 (MODY)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 대사 장애가 당뇨병인 제약 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 대사 장애가 2형 당뇨병인 제약 조성물.
  21. 제18항에 있어서, 대사 장애가 비-알콜성 지방간염 (NASH)인 제약 조성물.
  22. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 하나 이상의 항체 또는 이의 항원-결합 부분을 포함하는, 비만, 비-알콜성 지방간염 (NASH), 비-알콜성 지방 간 질환 (NAFLD), 2형 당뇨병, 비-2형 당뇨병, 1형 당뇨병, 잠복성 자가면역 당뇨병 (LAD), 및 소아의 성숙기 발병 당뇨병 (MODY)으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환에 걸린 개체를 치료하기 위한 제약 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 질환이 당뇨병인 제약 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 질환이 2형 당뇨병인 제약 조성물.
  25. 제22항에 있어서, 질환이 비-알콜성 지방간염 (NASH)인 제약 조성물.
  26. 제22항에 있어서, 추가적인 치료제를 추가로 포함하는 제약 조성물.
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