BR112016013960B1

BR112016013960B1 - Anticorpo biespecífico isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, formulação farmacêutica e uso do anticorpo biespecífico isolado ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo

Info

Publication number: BR112016013960B1
Application number: BR112016013960-7A
Authority: BR
Inventors: Yongmei Chen; James Ernst; Hok Seon Kim; Junichiro SONODA; Christoph Spiess; Scott Stawicki; Yan Wu
Original assignee: Genentech, Inc
Priority date: 2013-12-23
Filing date: 2014-12-23
Publication date: 2023-03-14
Also published as: EA036107B1; EA201691321A1; PT3086807T; US20160319038A1; US10246518B2; HUE059701T2; IL277633B; TWI728373B; ES2926375T3; AU2019204128B2; AU2014369872B2; JP2022115981A; KR102329693B1; JP2020125299A; US20150218276A1; CL2016001592A1; EP3086807A1; EP3086807B1; HRP20221088T1; WO2015100366A1

Abstract

ANTICORPO BIESPECÍFICO ISOLADO, ANTICORPO ANTI-BETA- KLOTHO, ANTICORPOS ANTI-KLB, ANTICORPO BIESPECÍFICO ANTI-KLB/ANTI-FGFR1 ISOLADO, ÁCIDO NUCLEICO ISOLADO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA E USO DO ANTICORPO. A matéria em questão atualmente divulgada fornece anticorpos que se ligam a KLB e FGFR1, e métodos de uso dos mesmos. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação inclui um anticorpo biespecífico que se liga a um epítopo presente no FGFR1 e se liga a um epítopo presente em KLB.

Description

REIVINDICAÇÃO DE PRIORIDADE

[001] Esse pedido reivindica prioridade ao pedido provisório de patente US de número de série 61/920.396, depositado em 23 de dezembro de 2013 e pedido provisório de patente US de número de série 62/081.435, depositado em 18 de novembro de 2014, que são integralmente incorporados ao presente pedido como referência.

LISTA DE SEQUÊNCIAS

[002] O atual pedido contém uma Lista de Sequências que foi apresentada eletronicamente no formato ASCII e é integralmente incorporada ao presente pedido como referência. A dita cópia ASCII, criada em 22 de dezembro de 2014, é denominada 00B206.0170_SL.txt e tem 155.738 bytes de tamanho.

CAMPO DA INVENÇÃO

[003] A presente invenção refere-se a anticorpos que se ligam a beta-Klotho (KLB), Receptor 1 do Fator de Crescimento de Fibroblasto (FGFR1), ou ambos, e métodos para usar os mesmos.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[004] O fator de crescimento de fibroblasto 21 (FGF21) e seu homólogo mais próximo FGF19 são membros da superfamília FGF. A sinalização de FGF21 necessita de isoformas do receptor de FGF (FGFR) e correceptor de membrana Klotho-beta (KLB) (Ogawa et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 104(18): 7432-37 (2007); patente US 2010/0184665). FGF19 também mostrou sinalizar através de isoformas de FGFR complexadas com KLB (Wu et al. J. Biol. Chem. 282(40): 29069-29072 (2007)) Das 7 principais isoformas de FGFR codificados por espécies de mamíferos (1b, 2b, 3b, 1c, 2c, 3c e 4), somente três isoformas, FGFR1c, 2c e 3c, podem transduzir sinalização tanto por FGF19 como FGF21 quando ligada pelo correceptor KLB que é predominantemente expresso no fígado, tecido adiposo e pâncreas (Goetz e Mohammadi, Nature reviews. Molecular Cell Biology 14, 166-180 (2013)). Desses receptores, FGFR1c parece desempenhar um papel predominante na mediação do efeito metabólico de FGF21. Sem estar ligado a uma teoria específica, acredita-se que FGF21 aja por indução de homodimerização de isoformas de FGFR na presença do correceptor de membrana KLB. Ao contrário de outros ligantes FGF, FGF21 exibe afinidade muito baixa para qualquer FGFR individual. No entanto, a ligação de alta afinidade para KLB através da região da cauda C-terminal recruta FGF21 para o complexo FGFR/KLB, permitindo que FGF21 interaja com FGFRs apesar da baixa afinidade para FGFRs sozinho.

[005] FGF21 foi identificado como um potente agente de proteína modificadora de doença para reverter a obesidade e o diabetes tipo 2 em modelos de doença animal (Kharitonenkov et al. J. Clin. Invest. 115(6): 1627-35 (2005)) FGF21 recombinante mostrou reduzir lipídeos hepáticos, melhorar a sensibilidade à insulina e normalizar o controle glicêmico em camundongos deficientes na sinalização de leptina (ob/ob ou db/db) ou camundongos alimentados com dieta de alto teor de gorduras (HFD). A redução da glicose no sangue e melhora em vários fatores de risco cardiovasculares também têm sido observadas em macacos rhesus obesos e diabéticos tratados diariamente com FGF21 recombinante. FGF21 e FGF19, ambos mostraram ativar a função termogênica de tecidos adiposos positivos para proteína 1 não acoplada (UCP1) (tecidos adiposos marrom e bege; BAT) em roedores obesos (Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Coskun et al., Endocrinology 149, 60186027 (2008); Fisher et al., Genes & Development 26, 271-281 (2012)).

[006] Embora as aplicações clínicas de FGF21 recombinante ou análogos de FGF21 estejam atualmente sendo testadas para o tratamento de doença metabólica, seu desenvolvimento para intervenção terapêutica provou ser desafiador. Por exemplo, a meia vida no soro de FGF21, aproximadamente 2 horas em primatas não humanos, é muito curta para aplicação clínica prática e a proteína FGF21 restante na circulação pode ser rapidamente inativada por clivagem proteolítica. Esforços têm sido produzidos para melhorar essas propriedades através da elaboração genética de proteínas, mas essas modificações poderiam aumentar a imunogenicidade e outros efeitos adversos específicos da modificação. Outro desafio significativo é a possibilidade de efeitos adversos em longo prazo da terapia mediada por FGF21 crônica. Por exemplo, relatou-se que FGF21 induz resistência ao hormônio de crescimento hepático através da indução de SOCS2, um inibidor de sinalização de receptor do hormônio de crescimento (Inagaki et al., Cell Metab. 8: 77-83 (2008)). Em humanos, a resistência ao hormônio de crescimento ou deficiência está associada com massa óssea baixa em crianças e adultos e a superexpressão de FGF21 transgênico ou duas semanas de tratamento de camundongos com FGF21 recombinante leva a uma dramática perda de densidade mineral óssea. Ainda não foi demonstrado que os efeitos adversos de FGF21 relacionados ao osso possam ser desligados a partir dos efeitos metabólicos benéficos. Além disso, a superprodução transgênica de FGF19 pode levar à carcinogênese hepatocelular através da ativação de Receptor de FGF (FGFR) 4 (Fu et al., Endocrinology 145, 2594-2603 (2004); Tomlinson et al., Endocrinology 143, 1741-1747 (2002); French et al., PLoS One 7, e36713 (2012)).

[007] Anticorpos monoclonais recombinantes (ABS) podem agir como uma modalidade terapêutica poderosa, já que eles podem fornecer excelente seletividade ao alvo, perfil farmacocinético e outras propriedades importantes para um agente farmacêutico (Chan e Carter, Nature reviews. Immunology 10, 301-316 (2010)). Por exemplo, relatou-se que um anticorpo antagonista específico para FGFR1c induz perda óssea em camundongos e macacos (documento WO 2005/037235) e a ativação de FGFR1c seletiva mediada por anticorpo agonístico é suficiente para recapitular a sensibilização de insulina por FGF21 em camundongos diabéticos (documento WO 2012/158704; Wu et al. Science Translational Med. 3(113): 1-10 (2011)) Anticorpos que se ligam ao complexo KLB/FGFR1c foram propostos como agentes ativadores/terapêuticos (patente US 7.537.903; documento WO 2011/071783; documento WO 2012/158704). Outros investigaram duas abordagens alternativas para ativar seletivamente o complexo FGFR1c/KLB, como um anticorpo anti-KLB de alta afinidade denominado mimAb1 (Foltz et al. Sci. Transl. Med. 4: 162ra153 (2012)) e anti-FGFR1 biespecífico/polipeptídeo C3201 Avimer KLB ligado à albumina de soro humano (HSA) (patente US 8.372.952).

[008] Dado o papel significativo para FGF19 e FGF21 no metabolismo da glicose, continua a existir uma necessidade na técnica para o desenvolvimento de moléculas terapêuticas e métodos para modular atividades mediadas por FGF19 ou FGF21.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

[009] A presente divulgação fornece anticorpos que se ligam a KLB, anticorpos que se ligam a FGFR1 e anticorpos biespecíficos que se ligam tanto a KLB como FGFR1, e métodos de uso dos mesmos. A invenção é baseada, em parte, na descoberta de anticorpos biespecíficos que se ligam tanto a KLB como FGFR1, que ativam seletivamente o complexo receptor FGFR1c/KLB e induzem as alterações metabólicas benéficas esperadas a partir da atividade similar a FGF21, incluindo perda de peso e aprimoramento no metabolismo de glicose e lipídeo, sem um impacto significativo sobre o fígado e sem uma perda de massa óssea.

[0010] Em certas realizações, o anticorpo é um anticorpo biespecífico. Por exemplo, e não a título de limitação, um anticorpo isolado da presente invenção pode se ligar tanto ao beta-Klotho (KLB) como Receptor 1 do Fator de Crescimento de Fibroblasto (FGFR1), sendo que o anticorpo se liga ao domínio C-terminal de KLB. Por exemplo, e não a título de limitação, um anticorpo isolado da presente divulgação se liga tanto a KLB como FGFR1c. Em certas realizações, o anticorpo se liga a um fragmento de KLB incluindo sequência de aminoácidos SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (SEQ ID NO: 142). Em certas realizações, o anticorpo se liga a um epítopo dentro de um fragmento de FGFR1, incluindo a sequência de aminoácidos KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 143) ou FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144).

[0011] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação ativa o complexo KLB/FGFR1c. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação reduz os níveis de glicose no sangue in vivo. Em certas realizações, o anticorpo não afeta significativamente a densidade óssea. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação não tem um impacto significativo no fígado. Em certas realizações, o anticorpo induz fosforilação de ERK e MEK no fígado em níveis significativamente mais baixos do que FGF21 induz. Em certas realizações, o anticorpo se liga a KLB com um Kd de 10-8 M a 10-13 M. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode se ligar a uma proteína FGFR1 com um Kd de 10-8 M a 10-13 M. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode se ligar a FGFR1c com um Kd de 10-8 M a 10-13 M. Em certas realizações, o anticorpo se liga a KLB com um Kd < 10 nM e a FGFR1c com um Kd > 300 nM. Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 pode incluir um braço anti-FGFR1 que tem um Kd de cerca de 10 nM a cerca de 10 μM.

[0012] Em certas realizações, é fornecido um anticorpo da presente divulgação se liga a um epítopo presente em KLB. Por exemplo, e não a título de limitação, a presente divulgação fornece um anticorpo anti-KLB que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo mostrado nas Figuras 3A e B. Em certas realizações, um anticorpo anti-KLB da presente divulgação se liga ao mesmo epítopo que o anticorpo 12A11 ou o 8C5. Em certas realizações, o anticorpo anti-KLB se liga a um epítopo dentro do domínio C-terminal de KLB. Em certas realizações, o anticorpo anti-KLB se liga a um fragmento de KLB que consiste na sequência de aminoácidos SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (SEQ ID NO: 142).

[0013] Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 da presente divulgação inclui um primeiro anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que inclui uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, onde a região variável da cadeia pesada inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 128, e a região variável da cadeia leve inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em certas realizações, o segundo anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inclui uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve, onde a região variável da cadeia pesada inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 132, e a região variável da cadeia leve inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 134.

[0014] Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 da presente divulgação inclui um primeiro anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, que inclui uma região da cadeia pesada e uma região da cadeia leve, onde a região da cadeia pesada inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 129, e a região da cadeia leve inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 131. Em certas realizações, o segundo anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inclui uma região da cadeia pesada e uma região da cadeia leve, onde a região da cadeia pesada inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 133, e a região da cadeia leve inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 95% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 135.

[0015] A presente divulgação ainda fornece um anticorpo anti-KLB que inclui: (a) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 1-15, (b) HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 79-93, e (c) HVR-H2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 16-31.

[0016] Em certas realizações, o anticorpo anti-KLB compreende (a) HVR-H1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 1-15, (b) HVR-H2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 16-31, e (c) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 32-47.

[0017] Em certas realizações, o anticorpo anti-KLB ainda compreende (a) HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs: 48-62, (b) HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 63-78, e (c) HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NOs: 79-93.

[0018] Em certas realizações, o anticorpo anti-KLB compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12, (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 28, (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 44, (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 75, e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 90.

[0019] Em certas realizações, o anticorpo anti-KLB compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (f) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, (g) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47, (h) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, (i) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78, e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93.

[0020] Em certas realizações, o anticorpo anti-KLB compreende (a) uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128 e (b) uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 130. Em certas realizações, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 129 e (b) uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 131.

[0021] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um anticorpo anti-KLB que compreende (a) uma região variável da cadeia pesada que tem pelo menos 95% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128; (b) uma região variável da cadeia leve que tem pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 130; e (c) uma região variável da cadeia pesada como em (a) e uma região variável da cadeia leve como em (b).

[0022] A presente divulgação fornece ainda anticorpos que se ligam a FGFR1, por exemplo, FGFR1c. Por exemplo, e não a título de limitação, um anticorpo da presente divulgação compreende um domínio variável que se liga a FGFR1. Em certas realizações, o anticorpo se liga a um fragmento de FGFR1 que consiste na sequência de aminoácidos KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 143) ou FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144). Em certas realizações, o anticorpo compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137, (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 138, (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 139, (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 140, e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 141. Em certas realizações, o anticorpo compreende (a) uma região variável da cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 132 e (b) uma região variável da cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. Em certas realizações, o anticorpo compreende (a) uma cadeia pesada que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 133 e (b) uma cadeia leve que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 135. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação se liga a um fragmento de FGFR1c que consiste na sequência de aminoácidos KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 143) ou FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144).

[0023] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação é um anticorpo monoclonal. Em certas realizações, o anticorpo é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico. Em certas realizações, o anticorpo tem função efetora reduzida.

[0024] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo da presente divulgação. Em certas realizações, a presente divulgação fornece uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico da presente divulgação. Em certas realizações, a presente divulgação fornece um método para produzir um anticorpo que compreende cultivar uma célula hospedeira da presente divulgação de modo que o anticorpo seja produzido. Em certas realizações, esse método ainda compreende recuperar o anticorpo a partir da célula hospedeira.

[0025] A presente divulgação fornece ainda uma formulação farmacêutica que inclui um ou mais anticorpos da invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certas realizações, a formulação farmacêutica compreende um agente terapêutico adicional.

[0026] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um anticorpo da invenção para uso como um medicamento. Em certas realizações, o anticorpo é para uso em tratamento de disfunções metabólicas, por exemplo, síndrome do ovário policístico (PCOS), síndrome metabólica (MetS), obesidade, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), hiperlipidemia, hipertensão, diabetes tipo 2, diabetes não tipo 2, diabetes tipo 1, diabetes autoimune latente (LAD) e diabetes da maturidade com início na juventude (MODY). Em certas realizações, o anticorpo é para uso no tratamento de diabetes tipo 2. Em certas realizações, o anticorpo é para uso no tratamento de obesidade. Em certas realizações, a presente divulgação fornece um anticorpo para uso no tratamento de síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Alstrom, síndrome de Cohen, osteodistrofia hereditária de Albright (pseudohipoparatiroidismo), síndrome de Carpenter, síndrome de MOMO, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome do X-frágil e síndrome de Borjeson-Forssman Lehman. Em certas realizações, a presente divulgação fornece um anticorpo para uso na ativação de um complexo receptor KLB/FGFR1, por exemplo, um complexo receptor KLB/FGFR1c.

[0027] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece o uso de um anticorpo, divulgado no presente pedido, na fabricação de um medicamento para tratamento de disfunções metabólicas, por exemplo, síndrome do ovário policístico (PCOS), síndrome metabólica (MetS), obesidade, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), hiperlipidemia, hipertensão, diabetes tipo 2, diabetes não tipo 2, diabetes tipo 1, diabetes autoimune latente (LAD) e diabetes da maturidade com início na juventude (MODY) e doenças relacionadas com a idade, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e ALS. Em certas realizações, a disfunção metabólica é diabetes tipo 2. Em certas realizações, a disfunção metabólica é obesidade. Em certas realizações, a fabricação é de um medicamento para ativar um complexo receptor KLB/FGFR1c.

[0028] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um método para tratar um indivíduo que tem uma doença selecionada a partir do grupo que consiste em síndrome do ovário policístico (PCOS), síndrome metabólica (MetS), obesidade, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), hiperlipidemia, hipertensão, diabetes tipo 2, diabetes não tipo 2, diabetes tipo 1, diabetes autoimune latente (LAD) e diabetes da maturidade com início na juventude (MODY) e doenças relacionadas com a idade, como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e ALS, cujo método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade de um ou mais anticorpos da presente divulgação. Em certas realizações, a doença é diabetes, por exemplo, diabetes tipo 2. Em certas realizações, a doença é obesidade. Em certas realizações, a presente divulgação fornece um método de tratamento de um indivíduo que tem uma doença e/ou disfunção selecionada a partir do grupo que consiste em síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Alstrom, síndrome de Cohen, osteodistrofia hereditária de Albright (pseudohipoparatiroidismo), síndrome de Carpenter, síndrome de MOMO, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome do X- frágil e síndrome de Borjeson-Forssman Lehman. Em certas realizações, o método ainda inclui administrar um agente terapêutico adicional ao indivíduo. Em certas realizações, um método com o uso de um ou mais anticorpos da presente divulgação não afeta a função do fígado em um indivíduo. Em certas realizações, a presente divulgação fornece um método para induzir a perda de peso que compreende administrar uma quantidade efetiva de um ou mais anticorpos da presente divulgação.

[0029] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um método de ativação de um complexo receptor KLB-FGFR1c em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um anticorpo da presente divulgação.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0030] A Figura 1A representa a atividade agonística de anticorpos anti-FGFR1 e fragmentos de anticorpos.

[0031] A Figura 1B representa os resultados de experimentos de competição de ligação com o uso de anticorpos anti-FGFR1.

[0032] Figura 1C representa os resíduos de aminoácidos em FGFR1 importantes para ligação por anticorpos anti-FGFR1 da matéria em questão atualmente divulgada. A Figura 1C divulga SEQ ID NOs: 159, 159, 143 e 144, respectivamente, em ordem de aparecimento.

[0033] A Figura 1D representa os resultados de mutagênese sítio- específica para determinar resíduos de aminoácidos importantes para ligação por anticorpos anti-FGFR1 da matéria em questão atualmente divulgada.

[0034] A Figura 1E representa os resultados de mutagênese sítio- específica para determinar resíduos de aminoácidos importantes para ligação por anticorpos anti-FGFR1 da matéria em questão atualmente divulgada.

[0035] A Figura 1F representa resíduos importantes para ligação em um modelo de preenchimento de espaço de FGFR1.

[0036] A Figura 2A representa as afinidades de dois anticorpos anti-FGFR1 para FGFR1b e FGFR1c.

[0037] A Figura 2B representa a ligação de um anticorpo anti- FGFR1 a vários FGFRs.

[0038] A Figura 2C representa um anticorpo anti-FGFR1 que atuou como um agonista específico para FGFR1 em GAL-ELK1 (fator de transcrição 1 similar a ETS) baseado no ensaio de luciferase em células L6.

[0039] A Figura 2D representa que um anticorpo anti-FGFR1 atuou como um agonista específico para FGFR1 em GAL-ELK1 baseado no ensaio de luciferase em células HEK293.

[0040] A Figura 2E representa que um anticorpo anti-FGFR1 normalizou os níveis de glicose no sangue quando injetado em camundongos diabéticos ob/ob.

[0041] A Figura 3A representa as sequências de região variável da cadeia leve para 17 anticorpos anti-KLB. As sequências de CDR L1 são, em ordem, SEQ ID NOs: 48-62; as sequências L2 de CDR são, em ordem, SEQ ID NOs: 63-78; e as sequências L3 de CDH são, em ordem, SEQ ID NOs: 79-93. As sequências de região variável da cadeia leve são, em ordem, SEQ ID NOs: 111-127.

[0042] A Figura 3B representa as sequências de região variável da cadeia pesada para 17 anticorpos anti-KLB. As sequências de CDR H1 para os anticorpos são, em ordem (11F1-8C5), SEQ ID NOs: 1-15; as sequências H2 de CDR são, em ordem, SEQ ID NOs: 16-31; as sequências H3 de CDR são, em ordem, SEQ ID NOs: 32-47. As sequências de região variável da cadeia pesada para os anticorpos são, em ordem, SEQ ID NOs: 94-110.

[0043] A Figura 4 representa a mudança mediana observada no gráfico de FACS a 0,8 μg/ml medindo a ligação de vários anticorpos anti-KLB para as células 293 que expressam hKLB.

[0044] A Figura 5 representa a ligação relativa de vários anticorpos anti-KLB para a proteína hKLB-ECD-HIS.

[0045] A Figura 6A é um diagrama esquemático, que representa os anticorpos da matéria em questão atualmente divulgada e um modelo para o complexo de anticorpo biespecífico KLB/FGFR1c para ativação de sinal.

[0046] A Figura 6B representa um modelo para formação de complexo FGFR1c-KLB-FGF21 para ativação de sinal.

[0047] A Figura 6C representa um ensaio de luciferase GAL-ELK1 de FGF21 e da atividade 17 de anticorpo biespecífico (BsAb) com o uso de células HEK293 deficientes em FGFR1. As células foram transfectadas para expressar receptores indicados.

[0048] A Figura 6D representa uma análise Western blot de adipócitos humanos primários tratados com a proteína indicada (FGF21 (100 nM) ou IgG (33 nM)) por 1 h. As amostras foram duplicadas para cada tratamento.

[0049] A Figura 7A representa a indução por vários anticorpos biespecíficos com braços anti-FGFR1 e anti-KLB em um ensaio de luciferase baseado em GAL-ELK1. Nota-se que Abs biespecíficos com braço R1MAb1 exibiram atividade independente de KLB significativa, provavelmente devido à atividade agonística de Fab R1MAb1. Nenhuma dessas atividades foi observada com Abs biespecíficos com braços R1MAb2 ou R1MAb3.

[0050] A Figura 7B representa que a indução de sinalização por vários anticorpos biespecíficos com braços anti-FGFR1 e anti-KLB é dependente em ambos FGFR1c e KLB.

[0051] A Figura 7C representa um anticorpo biespecífico com braços anti-FGFR1 e anti-KLB que induziu atividade da luciferase de uma maneira dose-dependente em células que expressam hFGFR1c e hKLB recombinantes, mas não em células sem expressão de KLB.

[0052] A Figura 8A é uma representação esquemática de três variantes de anticorpos biespecíficos anti-KLB/anti-FGFR1c. Azul: humano, e Red: camundongo. A posição aproximada da cadeia de oligossacarídeo em N297 em (1) é indicada por A. As versões menos efetoras ((2) e (3)) são desprovidas das cadeias de oligossacarídeos devido à mutação N297G. Asteriscos em (2) indicam a posição aproximada da mutação D265A. A orientação de protuberância versus orifício também é mostrada. (1) representa BsAb10; (2) representa BsAb20; e (3) representa BsAb17.

[0053] A Figura 8B representa um ensaio pERK MSD em adipócitos humanos primários tratados com BsAb10 e seus derivados, IgG de controle ou FGF21 por 10 min. Os dados representam as médias ± SEM (N = 3). bFKB1 (1) representa BsAb10; bFKB1 (2) representa BsAb20; e bFKB1 (3) representa BsAb17.

[0054] A Figura 9A representa um ensaio de luciferase GAL-ELK1 em células de mioblasto L6 de rato. As células foram cotransfectadas com um vetor de expressão para os receptores indicados. As células transfectadas foram incubadas com várias concentrações de BsAb10 ou um controle positivo, FGF21, FGF19 ou R1MAb1, por 6h antes de ensaios de luciferase.

[0055] A Figura 9B representa ensaios de luciferase GAL-ELK1 similares conforme mostrado na Figura 9A. Células L6 transfectadas foram tratadas com combinações de FGF21 e BsAb17 conforme indicado. N = 4.

[0056] A Figura 9C representa ensaios de luciferase GAL-ELK1 similares conforme mostrado na Figura 9A. Células L6 transfectadas foram tratadas com combinações de FGF21 e BsAb17 conforme indicado. N = 4.

[0057] A Figura 9C representa a ligação de um anticorpo anti- FGFR1 e dos anticorpos biespecíficos anti-KLB/anti-FGFR1, BsAB9 e BsAb10, a células que expressam KLB, FGFR1c ou ambos.

[0058] A Figura 10A representa a ligação de um anticorpo biespecífico com braços anti-FGFR1 e anti-KLB e um anticorpo anti-FGFR1 a células que expressam FGFR1c, KLB ou ambos.

[0059] A Figura 10B representa a Kd de BsAb10 para ligação a células HEK293 que expressam várias combinações de KLB/FGFR1 humano e murino.

[0060] A Figura 11 representa a análise de ligação de BsAb10 ou complexos pré-formados BsAb10/KLB a 200 nM, 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,25 nM à proteína de fusão FGFR1-ECD-Fc que foi imobilizada no chip. Para gerar complexos BsAb10/KLB pré-formados, BsAb10 e a proteína KLB- ECD recombinante foram pré-incubados na razão 1:1. Nota-se que a taxa de dissociação foi mais lenta com o complexo BsAb10/KLB do que com BsAb10 sozinho, mas apenas quando FGFR1c, mas não FGFR1b, foi capturado sobre o chip, indicando a formação de um complexo ternário.

[0061] A Figura 12A é uma representação esquemática do projeto do experimento TR-FRET.

[0062] A Figura 12B representa a intensidade de TR-FRET em células COS7 que expressam a proteína marcada SNAP FGFR1c com ou sem KLB não marcado em 15 minutos após a adição dos ligantes indicados. BsAb17, FGF21, FGF1 e FGF2 foram usados a 67nM, 50nM, 62,5nM, 12nM, respectivamente. Os dados representam a intensidade de FRET a 665nm dividida pela emissão do doador a 620nm (razão FRET), e médias ± SEM de três experimentos independentes (N = 3). p < 0,05 (*), < 0,01 (**), < 0,0001 (***) versus PBS de controle.

[0063] A Figura 13A representa os resultados de experimentos para determinar qual parte de KLB foi importante para a ligação de dois anticorpos anti-KLB. Uma representação esquemática da estrutura da proteína KLB é mostrada na parte superior. Cada barra representa KLB humana, KLA humana, KLB de coelho, KLB de rato, KLB de camundongo ou constructos quiméricos como codificados por cores. À direita é mostrada, a ligação da KLBmAb1 e KLBmAb2 de controle baseado em FACS com células HEK293 que expressam temporariamente cada constructo. Nota-se que KLBmAb1 não se liga a KLB de coelho, mas a substituição de um fragmento de 34 aminoácidos (aminoácidos 805-838) para a sequência humana correspondente confere ligação.

[0064] A Figura 13B representa a sequência de aminoácidos do segmento da posição 857-890 de uma proteína KLB humana com uma sequência sinal (que corresponde à sequência de aminoácidos nas posições 805-838 de uma proteína KLB que não inclui uma sequência sinal) e as correspondentes sequências em várias espécies indicadas. A Figura 13B divulga SEQ ID NOs: 160-164, respectivamente, em ordem de aparecimento.

[0065] A Figura 14A representa a ligação de FGF21 e FGF19 para o complexo BsAb10/KLB por SPR. BsAb10 foi capturado sobre o chip, e a proteína KLB-ECD e a proteína FGF (a 0,2, 0,8, ou 2 μM) foram injetadas sequencialmente.

[0066] A Figura 14B representa os resultados de um ensaio de luciferase GAL-ELK1 em células de mioblasto L6 de rato. As células foram cotransfectadas com um vetor de expressão tanto para FGFR4 como KLB. Células transfectadas foram incubadas com várias concentrações das proteínas indicadas por 6h antes de ensaios de luciferase.

[0067] A Figura 14C representa um Western blot que foi realizado para monitorar a fosforilação de ERK em células de hepatoma H4IIE. Nota-se que BsAb17 não bloqueou a capacidade de FGF19 para ativar o complexo FGFR4/KLB (Figura 14B), ou para induzir fosforilação de ERK em células de hepatoma H4IIE (Figura 14C).

[0068] A Figura 15A representa níveis de glicose no sangue (dia 7), % de alteração de peso corporal (dia 7) e ingestão diária de comida (dia 03) de camundongos magros C57BL/6 e db/db (n = 7), após uma injeção intraperitoneal (i.p.) única de BsAb17 ou IgG de controle a 3 mg/kg (magro) ou 5 mg/kg (db/db).

[0069] A Figura 15B representa o peso corporal e níveis de glicose no sangue de camundongos com Obesidade Induzida por Dieta (DIO), que receberam injeções i.p. da IgG indicada (BsAb20) a 3 mg/kg no dia 0 e 6 (setas). N = 9.

[0070] A Figura 15C representa os resultados do teste de tolerância à glicose com os mesmos camundongos e anticorpos usados em 15B no dia 14.

[0071] A Figura 15D representa a quantidade de triglicerídeos hepáticos, e marcadores séricos em animais mostrados em 15B-C no dia 17.

[0072] A Figura 15E representa a utilização da glicose do corpo inteiro, medida durante clamps euglicêmicos hiperinsulinêmicos com camundongos DIO 5 dias após uma única injeção i.p. da IgG indicada (BsAb17) a 10 mg/kg (N = 12). O eixo horizontal representa os níveis de insulina no soro. As setas indicam a direção de alterações a partir de estados basais até estimulados por insulina. p < 0,05 (*), < 0,005 (**), < 0,0001 (***) versus controle.

[0073] A Figura 15F representa a produção endógena de glicose, medido durante clamps euglicêmicos hiperinsulinêmicos com camungongos DIO 5 dias após uma única injeção i.p. da IgG indicada (BsAb17) a 10 mg/kg (N = 12). O eixo horizontal representa os níveis de insulina no soro. As setas indicam a direção de alterações a partir de estados basais até estimulados por insulina. p < 0,05 (*), < 0,005 (**), < 0,0001 (***) versus controle.

[0074] A Figura 15G representa a absorção de glicose tecidual estimulada por insulina, medida durante clamps euglicêmicos hiperinsulinêmicos com camundongos DIO 5 dias após uma única injeção i.p. da IgG indicada (BsAb17) a 10 mg/kg (N = 12). p < 0,05 (*), < 0,005 (**), < 0,0001 (***) versus controle.

[0075] A Figura 16A mostra a sequência de aminoácidos N- terminal de proteína KLB de camundongo (SEQ ID NO: 165), e a sequência de aminoácidos correspondente codificada pelo alelo Klb nos camundongos KO (SEQ ID NO: 166) são mostradas. Uma mutação missense no gene Klb resulta em uma mudança de quadro após o segundo aminoácido no alelo KO, conforme mostrado com letras vermelhas.

[0076] A Figura 16B mostra a expressão de proteína KLB no tecido adiposo epididimal branco em camundongos selvagens (+/+) e KLB knockout (-/-).

[0077] A Figura 16C mostra que KLB é importante para BsAb20 para afetar o metabolismo da glicose. Teste de tolerância à glicose (GTT) em camundongos DIO, que receberam quatro injeções semanais de BsAb20 ou IgG de controle a 3 mpk. O GTT foi conduzido no dia 23, três dias após a última injeção. Os camundongos estiverem em HFD por 20 semanas antes do GTT. *p < 0,05.

[0078] A Figura 16D representa os parâmetros séricos em camundongos DIO no dia 7 após uma injeção i.p. de um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 ou R1MAb1 a 50 mg/kg ou veículo. N = 6.

[0079] A Figura 17 representa a quantidade de FGF23 e fósforo inorgânico no soro de camundongos DIO no dia 7 após injeção i.p. de BsAb17 a 50 mg/kg. N = 6. ***p < 0,0005.

[0080] A Figura 18A representa a quantidade de excursão de glicose no sangue arterial durante o experimento de clamp. Camundongos DIO receberam BsAb17 ou IgG de controle a 10 mg/kg em 5 dias antes do experimento de clamp.

[0081] A Figura 18B representa o peso corporal no dia do experimento de clamp.

[0082] A Figura 18C representa a taxa de infusão de glicose durante o experimento de clamp. p < 0,05 (*), < 0,001 (**) versus controle.

[0083] A Figura 19A representa o gasto de energia (EE) (esquerda) e quociente respiratório (RQ) (direita) de camundongos DIO que receberam uma única injeção i.p. de 10 mg/kg de IgG na hora indicada a 21 a 22°C. N = 7.

[0084] A Figura 19B representa o EE (superior) e RQ (inferior) de camundongos magros que receberam uma única injeção i.p. de 10 mg/kg de IgG na hora indicada. Os camundongos foram mantidos em 21 a 22°C, em seguida, a temperatura da gaiola foi modificada para termoneutralidade (29 a 30°C) em 6 dias após a injeção de IgG. N = 6 aprox. 7.

[0085] A Figura 19C representa a absorção de fluordesoxiglicose tecidual (FDG) em camundongos DIO em 40 horas após uma única injeção i.p. de IgG indicada a 10 mg/kg. N = 8. Camundongos foram deixados em jejum durante a noite antes da medição de absorção de FDG.

[0086] A Figura 19D representa a análise de Western blot de ingWAT coletada no dia 7 após única injeção i.p. (BsAb17 ou IgG de controle a 10 mg/kg) e implantação cirúrgica de uma bomba osmótica (CL316,243 (0,75 nmol/h) ou veículo).

[0087] A Figura 19E representa a expressão de mRNA UCP1 em adipócitos subcutâneos humanos primários tratados com a proteína indicada em 30 nM por 48 horas. N = 3.

[0088] A Figura 19F representa a temperatura corporal central de camundongos DIO, que receberam 10 mg/kg de BsAb17 ou IgG controle. N = 7 aprox. 8.

[0089] A Figura 19G representa o perfil de expressão gênica em iBAT de camundongos DIO que receberam uma única b.i.d. de 10 mg/kg de IgG e FGF21 a 2 mg/kg/dia ou PBS de controle por 5 dias. Todos os genes que foram significativamente diferentes entre BsAb17 e controle, ou entre FGF21 e controle foram listados.

[0090] A Figura 19H representa o EE (esquerda) e RQ (direita) de camundongos magros que receberam uma única injeção i.p. de um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 ou IgG de controle a 10 mg/kg e implantação cirúrgica de uma bomba osmótica (CL-316243 a 0,5 nmol/h ou veículo) no dia 0. Os valores médios durante as 24h indicadas são mostrados.

[0091] A Figura 20A representa a quantidade de contagens de VO2 (superior), VCO2 (meio) e de atividade total de camundongos DIO descritos na Figura 19A. Valores de VO2 e VCO2 são normalizados por valores de peso corporal medidos em momentos indicados por #. Camundongos DIO receberam 10 mg/kg de BsAb17 ou IgG de controle.

[0092] As Figuras 20B representam a quantidade de contagem VO2 (topo), VCO2 (meio) e de atividade total de camundongos DIO descritos na Figura 19B. Valores de VO2 e VCO2 são normalizados por valores de peso corporal medidos em momentos indicados por #. Camundongos DIO receberam 10 mg/kg de BsAb17 ou IgG de controle.

[0093] A Figura 21A representa o valor médio de EE em calorimetria indireta. A magnitude no aumento médio é mostrada em gráficos. DIO 21°C: Valor médio de EE durante D3-D6 após injeção de IgG no experimento mostrado na Figura 19A. Magros a 21°C: Valor médio de EE durante D3-D6 após injeção de IgG no experimento mostrado na Figura 19B. Magros após a mudança para 30°C: Os valores médios de EE durante D6-D9 após injeção de IgG (isto é, 3 dias após mudança de temperatura) no experimento mostrado na Figura 19B. DIO 30°C: Valor médio de EE durante D3-D6 após injeção de IgG em camundongos DIO aclimatados em termoneutralidade.

[0094] A Figura 21B representa as alterações em EE em camundongos DIO em termoneutralidade. Camundongos DIO foram aclimatados a termoneutralidade por 2 semanas antes de uma única injeção i.p. (seta) de BsAb17 ou IgG de controle a 10 mg/kg. N = 3 aprox. 4.

[0095] A Figura 21C representa o EE médio e RQ em camundongos DIO à temperatura de laboratório normal (21°C) durante D3-5 após a implantação cirúrgica de uma bomba osmótica e injeção de droga. No D0, os camundongos receberam injeção i.p. de BsAb17 ou IgG de controle a 10 mg/kg. O grupo FGF21 também recebeu injeção i.p. de FGF21 de 2 mg/kg em bolus no D0. Cada camundongo também foi implantado subcutaneamente com uma bomba osmótica para infundir FGF21 a 60 μg/dia ou PBS de controle no D0. N = 8 aprox. 9. ** p < 0,005.

[0096] A Figura 22 representa os dados mostrados na Figura 19F replotados para mostrar a diferença ajustada na temperatura corporal central ao longo do curso do estudo, entre camundongos DIO que receberam 10 mg/kg de BsAb17 ou IgG de controle. A linha preta é a diferença estimada e as linhas azuis são os intervalos de confiança em relação aos pontos de 95% da diferença. IgG foi administrada no dia 13 (seta). N = 7 aprox. 8.

[0097] A Figura 23 representa o FGF21 e ERK induzida por BsAb20 e fosforilação de MEK para uma extensão semilar em gordura epididimal, gordura inguinal e gordura marrom interescapular e pâncreas. Os tecidos foram coletados a 1h (fígado, pâncreas e tecido adiposo epididimal branco (eWAT)) ou 2h (iBAT ou ingWAT) após injeção i.p. camundongos C57BL/6 magros a 10 mg/kg (BsAb20) ou 1 mg/kg (FGF21). ERK e MEK total servem como controles de carga.

[0098] A Figura 24A representa as alterações de peso corporal e níveis de adiponectina HMW no soro em camundongos DIO (N = 6) que receberam i.p. única de BsAb17 na dose indicada (mg/kg).

[0099] A Figura 24B representa as alterações de peso corporal e níveis de adiponectina HMW no soro em macacos cinomolgos (N = 3) que receberam uma única injeção i.v. de BsAb17 na dose indicada (mg/kg).

[00100] A Figura 24C representa o EE de camundongos DIO (esquerda: wt e direito: adipoq KO) que recebeu injeção única i.p. de IgG indicada (BsAb17) a 10 mg/kg (seta). N = 5 aprox. 6.

[00101] A Figura 24D representa os diversos parâmetros metabólicos em camundongos wt (+/+) e adipoq KO (-/-) DIO, que receberam única injeção i.p. de IgG indicada (BsAb17) a 10 mg/kg. N = 6. AUC: Área sob a curva em GTT ou ITT (T = 0 a aprox. 2 h). p < 0,1 (#), < 0,05 (*), < 0,005 (**) versus controle.

[00102] A Figura 25 representa o RNA total que foi preparado a partir dos camundongos descritos na Figura 19G com o uso de qPCR.

[00103] A Figura 26 representa o nível de fosforilação de ERK por BsAb17 em tecidos de camundongos. Os tecidos foram coletados 1h após a injeção i.p. de camundongos C57BL/6 magros a 10 mg/kg de BsAb17 ou IgG de controle e submetidos a imunohistoquímica com o uso de um anticorpo específico para ERK fosforilada. Imagens representativas de 2 animais são mostradas para cada grupo. (1) Pâncreas, (2) corte coronal do cérebro contendo núcleos supraquiasmáticos (seta), (3) corte coronal do cérebro contendo área postrema (coleta triangular de células coradas) e o canal central (seta) e (4) corte coronal do cérebro contendo eminência mediana (seta). Nota- se que o sinal induzido por BsAb17 foi aparente nas células acinares pancreáticas, mas não em qualquer um dos cortes de cérebro examinados.

[00104] A Figura 27 representa a normalização de proliferação de hepatócitos induzidos por HFD por BsAb20. Incorporação hepática de BrdU em camundongos DIO tratados com BsAb20 (1 ou 3 mg/kg/semana) ou IgG de controle (3 mg/kg/semana) por 8 semanas ou camundongos magros C57BL/6 de controle. *p < 0,05 versus camundongos DIO tratados com IgG (N = 5 a aprox. 8).

[00105] A Figura 28A é uma representação esquemática do experimento mostrado na Figura 28B. Os camundongos DIO receberam BsAb20 (1 ou 3mg/kg/semana) ou IgG de controle (1 mg/kg/semana) por 6 semanas conforme indicado. Camundongos magros C57BL/6 de controle não receberam tratamento.

[00106] A Figura 28B representa o fenótipo ósseo após o tratamento com BsAb20. O fêmur e a tíbia foram dissecados e submetidos à análise μCT. (N = 7 aprox. 8). Nota-se que nenhum efeito negativo foi observado em vários parâmetros ósseos em ossos trabeculares e corticais com a possível exceção da espessura do osso cortical, que mostrou uma tendência decrescente com 3 mg/kg/semana de tratamento com BsAb20 embora a significância estatística não foi obtida. Uma vez que uma redução na espessura do osso cortical, sem um efeito na densidade óssea trabecular em camundongos com restrição calórica tem sido relatada (11), o efeito observado pode estar relacionado com a perda de peso. p < 0,001 (***), < 0,01 (**),< 0,05 (*),< 0,1 (#), < 0,2 ($) versus camundongos DIO tratados com IgG de controle. N = 7 aprox. 8.

[00107] A Figura 29 representa os níveis de corticosterona em camundongos após tratamento com BsAb17. Níveis de corticosterona no soro foram medidos em tempo de Zeitgeber (ZT) = 3 após eutanásia por decapitação. Os camundongos magros de controle (CTRL) não receberam tratamento. O lipopolissacarídeo (LPS) foi injetado i.p. em camundongos magros em 1 mg/kg 3h antes da eutanásia (ZT = 0) como controle positivo (12). IgG foi injetada i.p. em camundongos DIO a 5 ou 25 mg/kg em 5 dias antes da eutanásia, conforme indicado. A análise estatística indicada foi conduzida sem o grupo LPS. N = 12.

[00108] A Figura 30 mostra a ligação de vários anticorpos biespecíficos diferentes com braços anti-FGFR1 e anti-KLB a células que expressam FGFR1c ou FGFR1c e KLB.

[00109] A Figura 31 representa a ligação de derivados de YW182.5 e YW182.5 para proteínas FGFR1 por ELISA.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00110] Para maior clareza e não a título de limitação a descrição detalhada da matéria em questão atualmente divulgada está dividida nas seguintes subseções: I. Definições; II. Anticorpos; III. Métodos de Uso; IV. Formulações Farmacêuticas; e V. Artigos de Fabricação.

I. DEFINIÇÕES

[00111] Uma “estrutura humana aceitante” para os propósitos no presente pedido é uma estrutura que compreende a sequência de aminoácidos de uma estrutura de domínio variável da cadeia leve (VL) ou uma estrutura de domínio variável da cadeia pesada (VH) derivada a partir de uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura consenso humana, conforme definido abaixo. Uma estrutura humana aceitante “derivada a partir de” uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácidos da mesma ou pode conter alterações na sequência de aminoácidos. Em certas realizações, o número de trocas de aminoácidos é 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em certas realizações, a estrutura humana aceitante VL é idêntica em sequência à sequência de estrutura de imunoglobulina humana VL ou sequência de estrutura consenso humana.

[00112] “Afinidade” refere-se à força da soma total de interações não covalentes entre um único sítio de ligação de uma molécula (por exemplo, um anticorpo) e seu parceiro de ligação (por exemplo, um antígeno). A menos que indicado de outra forma, como usado no presente pedido, “afinidade de ligação” refere-se à afinidade de ligação intrínseca que reflete uma interação 1:1 entre membros de um par de ligação (por exemplo, anticorpo e antígeno). A afinidade de uma molécula X em relação a sua parceira Y pode ser geralmente representada pela constante de dissociação (Kd). A afinidade pode ser medida por métodos comuns conhecidos na técnica, incluindo os descritos no presente pedido. Ilustrativo específico e realizações exemplares para medir afinidade de ligação são descritos a seguir.

[00113] Um anticorpo de “afinidade maturada” refere-se a um anticorpo com uma ou mais alterações em uma ou mais regiões hipervariáveis (HVRs), em comparação a um anticorpo parental que não possui essas alterações, como alterações que resultam em um aprimoramento na afinidade do anticorpo para o antígeno.

[00114] “Klotho-beta”, “KLB” ou “beta-Klotho”, como usado no presente pedido, refere-se a qualquer beta-Klotho nativo de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo engloba KLB não processado “inteiro”, bem como qualquer forma de KLB que resulte do processamento na célula. O termo também engloba variantes de KLB que ocorrem naturalmente, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas. Um exemplo não limitante de uma sequência de aminoácidos KLB humana direcionada por um anticorpo da presente divulgação, excluindo a sequência sinal, é da seguinte forma: FSGDGRAIWSKNPNFTPVNESQLFLYDTFPKNFFWGIGTGALQVEGSWKKDG KGPSIWDHFIHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLEKDLSALDFIGVSFYQFSISWPRLF PDGIVTVANAKGLQYYSTLLDALVLRNIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWKNDT IIDIFNDYATYCFQMFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAV YTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNRSENTMDIFKC QQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEGMRKKLFSVLPIFSEAEKHEMRGTADFFA FSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREALNWIKLEYNNPRILIAENGWFTDSR VKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGL FYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQIIRENGFSLKESTPDVQGQFPCDFSWGVT ESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNI KKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLG ISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLCFQELGDLVKL WITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDRQFRPSQRGAVSL SLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIAS KHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSD RDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALE DDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAK SSIQFYNKVISSRGFPFENSSSRCSQTQENTECTVCLFLVQKKPLIFLGCCFFS TLVLLLSIAIFQRQKRRKFWKAKNLQHIPLKKGKRVVS (SEQ ID NO: 145).

[00115] Em certas realizações, uma proteína KLB pode incluir uma sequência sinal N-terminal que tem a sequência de aminoácidos MKPGCAAGSPGNEWIFFSTDEITTRYRNTMSNGGLQRSVILSALILLRAVTG (SEQ ID NO: 157).

[00116] O termo “domínio C-terminal de KLB” refere-se ao domínio similar à glicosidase carbóxi-terminal de KLB. Por exemplo, o domínio C-terminal da proteína KLB exemplar mostrado na SEQ ID NO: 145 compreende a seguinte sequência de aminoácidos: FPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTR PAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYR CVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHADGWLNPSTAEAFQAYAGLC FQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDRQF RPSQRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDY PAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQ LAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITA SGIDDQALEDDRLRKYYLGKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFG FFTSDFKAKSSIQFYNKVISSRGFPFENSSSR (SEQ ID NO: 155).

[00117] Os termos “anticorpo anti-KLB” e “um anticorpo que se liga ao KLB” referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar ao KLB com afinidade suficiente, de modo que o anticorpo seja útil como um diagnóstico e/ou agente terapêutico no direcionamento de KLB. Em uma realização, o grau de ligação de um anticorpo anti-KLB em relação a uma proteína sem KLB não relacionada é menor que cerca de 10% da ligação do anticorpo em relação a KLB conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas realizações, um anticorpo que se liga a KLB tem uma constante de dissociação (Kd) < 1μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menor, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M). Em certas realizações, um anticorpo anti-KLB se liga a um epítopo de KLB que é conservado entre KLB de diferentes espécies. Em certas realizações, um anticorpo anti-KLB se liga a um epítopo em KLB que está na parte C-terminal da proteína.

[00118] O termo “Receptor 1 do Fator de Crescimento do Fibroblasto” ou “FGFR1”, como usado no presente pedido, refere-se a qualquer FGFR1 nativo de qualquer fonte de vertebrado, incluindo mamíferos, como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo engloba FGFR1 não processado “inteiro”, bem como qualquer forma de FGFR1 que resulta de processamento na célula. O termo também engloba variantes de FGFR1 que ocorrem naturalmente, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas, incluindo FGFR1c. Um exemplo não limitante de um aminoácido FGFR1c humano é mostrado abaixo:

[00119] MWSWKCLLFWAVLVTATLCTARPSPTLPEQAQPWGAP VEVESFLVHPGDLLQLRCRLRDDVQSINWLRDGVQLAESNRTRITGEEVEVQ DSVPADSGLYACVTSSPSGSDTTYFSVNVSDALPSSEDDDDDDDSSSEEKET DNTKPNPVAPYWTSPEKMEKKLHAVPAAKTVKFKCPSSGTPNPTLRWLKNGK EFKPDHRIGGYKVRYATWSIIMDSVVPSDKGNYTCIVENEYGSINHTYQLDVVE RSPHRPILQAGLPANKTVALGSNVEFMCKVYSDPQPHIQWLKHIEVNGSKIGP DNLPYVQILKTAGVNTTDKEMEVLHLRNVSFEDAGEYTCLAGNSIGLSHHSAW LTVLEALEERPAVMTSPLYLEIIIYCTGAFLISCMVGSVIVYKMKSGTKKSDFHS QMAVHKLAKSIPLRRQVTVSADSSASMNSGVLLVRPSRLSSSGTPMLAGVSE YELPEDPRWELPRDRLVLGKPLGEGCFGQVVLAEAIGLDKDKPNRVTKVAVK MLKSDATEKDLSDLISEMEMMKMIGKHKNIINLLGACTQDGPLYVIVEYASKGN LREYLQARRPPGLEYCYNPSHNPEEQLSSKDLVSCAYQVARGMEYLASKKCI HRDLAARNVLVTEDNVMKIADFGLARDIHHIDYYKKTTNGRLPVKWMAPEALF DRIYTHQSDVWSFGVLLWEIFTLGGSPYPGVPVEELFKLLKEGHRMDKPSNC TNELYMMMRDCWHAVPSQRPTFKQLVEDLDRIVALTSNQEYLDLSMPLDQYS PSFPDTRSSTCSSGEDSVFSHEPLPEEPCLPRHPAQLANGG LKRR (SEQ ID NO: 146).

[00120] O termo “anticorpo anti-FGFR1c” refere-se a um anticorpo capaz de se ligar a FGFR1c com afinidade suficiente, de modo que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico em atingir FGFR1c. Em uma realização, o grau de ligação de um anticorpo anti-FGFR1c em relação a uma proteína não FGFR1c não relacionada é menor que cerca de 10% da ligação do anticorpo em relação a FGFR1c conforme medido, por exemplo, por um radioimunoensaio (RIA). Em certas realizações, um anticorpo que se liga a FGFRIc tem uma constante de dissociação (Kd) < 1 M, < 100 mM, < 10 mM, < 1 mM, < 100 μM, < 10 μM, < 1μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM. Em certas realizações, o Kd de um anticorpo que se liga a FGFR1c, divulgado no presente pedido, pode ser 10-3 M ou menor, ou 10-8 M ou menor, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 1013 M. Em certas realizações, um anticorpo anti-FGFR1c se liga a um epítopo de FGFR1c que é conservado entre FGFR1c de diferentes espécies.

[00121] O termo “anticorpo” no presente pedido é usado no sentido mais amplo e engloba várias estruturas de anticorpos, incluindo, mas não se limitando a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que eles exibam a atividade de ligação de antígeno desejada.

[00122] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual se liga o anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv) e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.

[00123] Um “anticorpo que compete por ligação” com um anticorpo de referência, refere-se a um anticorpo que bloqueia a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um teste competitivo em 50% ou mais, e inversamente, o anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais. Um ensaio de competição exemplar é descrito em “Antibodies,” Harlow e Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY).

[00124] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é derivada de uma fonte ou espécie específica, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.

[00125] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas ainda podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de α, δ, ε, Y e μ, respectivamente.

[00126] O termo “agente citotóxico”, como usado no presente pedido, refere-se a uma substância que inibe ou previne uma função celular e/ou causa morte ou destruição das células. Agentes citotóxicos incluem, mas não se limitam a, isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu); agentes quimioterapêuticos ou drogas, por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides da vinca (vincristina, vinblastina, etoposídeo), doxorrubicina, melfalano, mitomicina C, clorambucila, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes); agentes inibidores do crescimento; enzimas e fragmentos dos mesmos como enzimas nucleolíticas; antibióticos; toxinas como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos; e os vários agentes antitumorais ou anticâncer divulgados abaixo.

[00127] “Funções efetoras” referem-se às atividades biológicas atribuíveis à região Fc de um anticorpo, que variam com o isotipo do anticorpo. Exemplos de funções efetoras de anticorpos incluem: ligação C1q e citoxicidade dependente de complemento (CDC), ligação do receptor Fc, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), fagocitose, infrarregulação de receptores de superfície celular (por exemplo, receptor de células B) e ativação de células B.

[00128] Uma “quantidade efetiva” de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade efetiva nas dosagens e por períodos de tempo necessários para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado. Por exemplo, e não a título de limitação, uma “quantidade efetiva” pode se referir a uma quantidade de um anticorpo, divulgado no presente pedido, que é capaz de aliviar, minimizar e/ou prevenir os sintomas da doença e/ou disfunção, prolongar a sobrevida e/ou prolongar o período até que a recidiva da doença e/ou disfunção.

[00129] O termo “região Fc” no presente pedido é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada da imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em certas realizações, uma região Fc da cadeia pesada de IgG humana se estende a partir de Cys226 ou de Pro230 até a terminação carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina C- terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra forma no presente pedido, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante é de acordo com o sistema de numeração EU, também denominado índice EU, conforme descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

[00130] “Região de estrutura” ou “FR” refere-se a resíduos de domínio variável, exceto resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências de HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)- FR4.

[00131] Os termos “anticorpo inteiro”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são usados de forma intercambiável no presente pedido para se referir a um anticorpo que tem uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativo ou que tem cadeias pesadas que contêm uma região Fc conforme definido no presente pedido.

[00132] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem celular hospedeira” e “cultura celular hospedeira” como usados no presente pedido de forma intercambiável, referem-se às células em que o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie dessas células. Células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e a progênie derivada a partir das mesmas sem consideração ao número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica a uma célula parental no conteúdo de ácido nucleico, mas pode conter mutações. Progênies mutantes que têm a mesma função ou atividade biológica como as triadas ou selecionadas para a célula originalmente transformada são incluídas no presente pedido.

[00133] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por uma célula humana ou uma célula humana derivada de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências que codificam anticorpos humanos. Essa definição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígenos não humanos.

[00134] Uma “estrutura consenso humana” é uma estrutura que representa a maioria dos resíduos de aminoácidos que ocorrem comumente em uma seleção de sequências de estrutura de VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de sequências de VL ou VH de imunoglobulina humana é a partir de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Edição, Publicação NIH, 91-3242, Bethesda MD (1991), Volumes 1 a 3. Em certas realizações, para a VL, o subgrupo é subgrupo kappa I, como em Kabat et al., acima. Em certas realizações, para a VH, o subgrupo é subgrupo III como em Kabat et al., acima.

[00135] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico que compreende resíduos de aminoácidos de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em certas realizações, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs correspondem às de um anticorpo não humano e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode opcionalmente compreender pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivada a partir de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido à humanização.

[00136] O termo “região hipervariável” ou “HVR”, como usado no presente pedido, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável do anticorpo que são hipervariáveis na sequência (“regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”) e/ou formam alças estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”) e/ou contêm os resíduos que entram em contato com o antígeno (“contatos de antígeno”). A menos que indicado de outra forma, resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos de FR) são numerados no presente pedido de acordo com Kabat et al., acima. Geralmente, anticorpos compreendem seis HVRs: três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). HVRs exemplares no presente pedido incluem: (a) alças hipervariáveis que ocorrem nos resíduos dos aminoácidos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2), 91 a 96 (L3), 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2), 89 a 97 (L3), 31 a 35b (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) contatos de antígeno que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c a 36 (L1), 46 a 55 (L2), 89 a 96 (L3), 30 a 35b (H1), 47 a 58 (H2) e 93 a 101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); e (d) combinações de (a), (b) e/ou (c), incluindo resíduos de aminoácidos de HVR 46 a 56 (L2), 47 a 56 (L2), 48 a 56 (L2), 49 a 56 (L2), 26 a 35 (H1), 26 a 35b (H1), 49 a 65 (H2), 93 a 102 (H3) e 94 a 102 (H3).

[00137] Em certas realizações, resíduos de HVR compreendem os identificados na Figura 3A ou Figura 3B ou em outro lugar no relatório descritivo.

[00138] Um “imunoconjugado” refere-se a um anticorpo conjugado a uma ou mais moléculas heterólogas incluindo, mas não se limitando a um agente citotóxico.

[00139] Um “indivíduo” ou “sujeito”, como usado no presente pedido de forma intercambiável, é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas realizações, o indivíduo ou sujeito é um humano.

[00140] Um anticorpo “isolado” é aquele que foi separado a partir de um componente de seu ambiente natural. Em certas realizações, um anticorpo é purificado para mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado, por exemplo, por eletroforese (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese por capilaridade) ou cromatografia (por exemplo, troca iônica ou HPLC de fase reversa). Para revisão de métodos para avaliação de pureza de anticorpo consulte, por exemplo, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007).

[00141] Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente de seu ambiente natural. Uma molécula isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida nas células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente fora do cromossomo ou em um local do cromossomo diferente daquele de localização natural no cromossomo.

[00142] “Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo” (incluindo referências a um anticorpo específico, por exemplo, um anticorpo anti-KLB) refere-se a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo (ou fragmentos do mesmo), incluindo molécula(s) de ácido nucleico em um único vetor ou vetores separados, e essa(s) molécula(s) de ácido nucleico(s) se apresenta(m) em um ou mais locais em uma célula hospedeira.

[00143] O termo “anticorpo monoclonal”, como usado no presente pedido, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis variantes de anticorpos, por exemplo, que contêm mutações que ocorrem naturalmente ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, essas variantes geralmente estando presentes em menores quantidades. Ao contrário das preparações de anticorpos policlonais, que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante em um antígeno. Dessa forma, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser interpretado como uma exigência de produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a matéria em questão atualmente divulgada podem ser produzidos por uma variedade de técnicas incluindo, mas não se limitando ao método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição por fago, e métodos que utilizam animais transgênicos contendo tudo ou parte dos loci da imunoglobulina humana, esses métodos e outros métodos exemplares para produção de anticorpos monoclonais são descritos no presente pedido.

[00144] Um “anticorpo nu” refere-se a um anticorpo que não é conjugado a um componente heterólogo (por exemplo, componente citotóxico) ou radiomarcado. O anticorpo nu pode estar presente em uma formulação farmacêutica.

[00145] “Anticorpos nativos” referem-se a moléculas de imunoglobulina que ocorrem naturalmente com estruturas variáveis. Por exemplo, os anticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por bissulfeto. A partir da terminação N até C, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também chamada de domínio variável pesado ou um domínio variável da cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). De maneira similar, a partir da terminação N a C, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também chamada de domínio variável leve ou um domínio variável da cadeia leve, seguido por um domínio constante leve (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída para um dos dois tipos, chamados kappa (K) e lambda (A), com base na sequência de aminoácidos de seu domínio constante.

[00146] O termo “bula”, como usado no presente pedido, refere-se às instruções incluídas como de costume em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia de combinação, contraindicações e/ou advertências referentes ao uso desses produtos terapêuticos.

[00147] “Percentual (%) de identidade de sequência de aminoácidos” em relação a uma sequência de polipeptídeos de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeos de referência, após alinhamento das sequências e introdução de gaps, se necessário, para alcançar o percentual máximo de identidade de sequência, e não considerando qualquer substituição conservativa como parte da identidade de sequência. Alinhamento, para os propósitos de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos, pode ser alcançado de várias maneiras, as quais estão dentro da técnica, por exemplo, com o uso de programas de computação disponíveis publicamente, como os programas de computação BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo das sequências inteiras sendo comparadas. Para os propósitos no presente pedido, no entanto, valores de % de identidade de sequência de aminoácidos são obtidos com o uso do programa de computação de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computação de comparação de sequência ALIGN-2 foi desenvolvido pela Genentech, Inc. e o código fonte foi depositado com a documentação de usuário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob U.S. Copyright Registration n° TXU510087. O programa ALIGN- 2 está publicamente disponível junto à Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte. O programa ALIGN- 2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, inclusive UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.

[00148] Nas situações em que o ALIGN-2 é empregado para comparações de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A para, com ou contra, uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma dada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende certa % de identidade de sequência de aminoácidos a, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada da seguinte forma:

[00149] 100 vezes a fração X/Y

[00150] em que X é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como comparações idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 nesse alinhamento de programa de A e B, e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Considera-se que quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos A em relação a B não é igual à % de identidade de sequência de aminoácidos B em relação a A. A menos que especificamente declarado de outra forma, todos os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos usados no presente pedido são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior, com o uso do programa de computação ALIGN-2.

[00151] O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em tal forma a permitir a atividade biológica de um ingrediente ativo contido nesse para ser efetiva, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação seria administrada.

[00152] Um “veículo farmaceuticamente aceitável”, como usado no presente pedido, refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, exceto um ingrediente ativo, que não é tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não se limita a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.

[00153] Como usado no presente pedido, “tratamento” (e variações gramaticais do mesmo como “tratar” ou “tratando”) refere-se à intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo sendo tratado, e pode ser realizado tanto para profilaxia como durante o curso da patologia clínica. Efeitos desejados de tratamento incluem, mas não se limitam a, prevenção de ocorrência ou recorrência da doença, alívio de sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou alívio do estado da doença e remissão ou prognósticos de melhora. Em certas realizações, os anticorpos da presente divulgação podem ser usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou reduzir a progressão de uma doença.

[00154] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo, geralmente têm estruturas similares, com cada domínio compreendendo quatro regiões de estrutura conservadas (FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Consulte, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman e Co., página 91 (2007)). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados com o uso de um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para selecionar uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Consulte, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).

[00155] O termo “vetor”, como usado no presente pedido, refere- se a uma molécula de ácido nucleico capaz de reproduzir outro ácido nucleico ao qual está ligada. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual este foi introduzido. Certos vetores são capazes de dirigir a expressão de ácidos nucleicos para os quais eles são ligados de maneira funcional. Esses vetores são citados no presente pedido como “vetores de expressão”.

II. ANTICORPOS

[00156] Em um aspecto, a invenção é baseada, em parte, na descoberta de anticorpos biespecíficos que se ligam tanto a KLB como FGFR1c e ativam seletivamente o complexo receptor FGFR1c/KLB e induzem as alterações metabólicas benéficas esperadas a partir da atividade similar a FGF21, incluindo perda de peso, um aprimoramento no metabolismo de glicose e lipídeo, sem um impacto significativo sobre o fígado e sem perda de massa óssea.

[00157] Em certas realizações, são fornecidos anticorpos que se ligam a KLB. A presente divulgação fornece ainda anticorpos anti-FGFR1, por exemplo, anticorpos anti-FGFR1c. A presente divulgação fornece ainda anticorpos biespecíficos que se ligam tanto a KLB como FGFR1 (citado no presente pedido como anticorpos biespecíficos anti-KLB/anti- FGFR1). Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 da presente divulgação se liga tanto a KLB como FGFR1c. Em certas realizações, os anticorpos da presente divulgação incluem anticorpos que não bloqueiam a ligação e/ou interação dos ligantes FGF, por exemplo, FGF19 e FGF21, ao complexo KLB/FGFR1c.

[00158] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação não tem um impacto significativo no fígado, por exemplo, função do fígado. Sem estar limitado a uma teoria particular, um anticorpo da presente divulgação não resulta na ativação do complexo receptor FGFR1c/KLB no fígado. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação não modula a atividade de um complexo receptor FGFR/KLB no fígado em comparação à modulação de um complexo receptor FGFR/KLB no fígado por uma proteína FGF21. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação não resulta na inibição do complexo FGFR4/KLB e/ou não resulta na elevação de enzimas do fígado como, mas não se limitando a, ALT, AST, ALP e GLDH. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação não funciona como um agonista do complexo FGFR2c/KLB e/ou o complexo FGFR3c/KLB no fígado, que pode levar a sinalização MAPK ativado e/ou expressão alterada de Spry4 e Dusp6 no fígado. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação não resulta na ativação de sinalização de MAPK no fígado em comparação à ativação de sinalização de MAPK por uma proteína FGF21. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação não funciona como um agonista do complexo FGFR4/KLB no fígado.

[00159] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode ser humanizado. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação compreende uma estrutura humana aceitante, por exemplo, uma estrutura de imunoglobulina humana ou estrutura consenso humana.

[00160] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode ser um anticorpo monoclonal, incluindo um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode ser um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fv, Fab, Fab’, scFv, diacorpo ou F(ab’)2. Em certas realizações, o anticorpo é um anticorpo inteiro, por exemplo, um anticorpo IgG1 intacto, ou outra classe de anticorpo ou isotipo conforme definido no presente pedido. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode incorporar qualquer uma das características, individualmente ou em combinação, conforme descrito nas Seções 1 a 7 abaixo.

[00161] Anticorpos da presente divulgação são úteis, por exemplo, para o diagnóstico ou tratamento de disfunções metabólicas. Exemplos não limitantes de disfunções metabólicas incluem síndrome do ovário policístico (PCOS), síndrome metabólica (MetS), obesidade, esteato- hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), hiperlipidemia, hipertensão, diabetes tipo 2, diabetes não tipo 2, diabetes tipo 1, diabetes autoimune latente (LAD), diabetes da maturidade com início na juventude (MODY) e envelhecimento e doenças relacionadas como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e ALS.

A. ANTICORPOS ANTI-KLB EXEMPLARES

[00162] Em um aspecto, a presente divulgação fornece anticorpos isolados que se ligam a uma proteína KLB. Em certas realizações, um anticorpo anti-KLB da presente divulgação se liga ao domínio C-terminal de KLB. Em certas realizações, um anticorpo anti-KLB da presente divulgação se liga a um fragmento de KLB que compreende a sequência de aminoácidos SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (SEQ ID NO: 142). Em certas realizações, o anticorpo se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-KLB, por exemplo, 8C5, descrito no presente pedido.

[00163] Em certas realizações, um anticorpo anti-KLB da presente divulgação compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 1-15, por exemplo, 12 ou 15; (b) HVR-H2 que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 16-31, por exemplo, 28 ou 31; (c) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 32-47, por exemplo, 44 ou 47; (d) HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 48-62, por exemplo, 49 ou 62; (e) HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 63-78, por exemplo, 75 ou 78; e (f) HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 79-93, por exemplo, 90 ou 93.

[00164] Em certas realizações, a presente divulgação fornece um anticorpo anti-KLB que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 28; (c) HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 44; (d) HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 49; (e) HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 75; e (f) HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 90. Em certas realizações, a presente divulgação fornece um anticorpo anti-KLB que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 31; (c) HVR-H3 que comprising SEQ ID NO: 47; (d) HVR-L1 que compreende SEQ ID NO 62; (e) HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 78; e (f) HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 93.

[00165] A presente divulgação ainda fornece um anticorpo anti- KLB que compreende uma sequência de domínio variável da cadeia pesada (VH) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 128. Em certas realizações, uma sequência de VH que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas conforme divulgadas acima), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-KLB que compreende essa sequência mantém a capacidade de se ligar a KLB. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 128. Em certas realizações, substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). De maneira alternativa ou adicionalmente, o anticorpo anti-KLB compreende a sequência de VH na SEQ ID NO: 128, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência conforme divulgado abaixo. Em certas realizações, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15, (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31, e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47.

[00166] Em outro aspecto, a presente divulgação fornece um anticorpo anti-KLB, em que o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 130. Em certas realizações, uma sequência de VL que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-KLB que compreende essa sequência mantém a capacidade de se ligar a KLB. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 130. Em certas realizações, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). De maneira alternativa ou adicionalmente, o anticorpo anti- KLB compreende a sequência de VL na SEQ ID NO: 130, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em certas realizações, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir da (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 78; e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 93.

[00167] A presente divulgação ainda fornece um anticorpo anti- KLB, em que o anticorpo compreende uma VH como em qualquer uma das realizações fornecidas acima, e uma VL como em qualquer uma das realizações fornecidas acima. Em certas realizações, o anticorpo compreende as sequências de VH e VL na SEQ ID NO: 128 e SEQ ID NO: 130, respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais dessas sequências.

[00168] Em certas realizações, um anticorpo anti-KLB se liga a um fragmento de KLB que consiste na sequência de aminoácidos SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (SEQ ID NO: 142).

B. ANTICORPOS ANTI-FGFR1 EXEMPLARES

[00169] Em um aspecto, a presente divulgação fornece anticorpos isolados que se ligam a uma proteína FGFR1. Em certas realizações, um anticorpo anti-FGFR1 da presente divulgação se liga a FGFR1c. Em certas realizações, a presente divulgação fornece um anticorpo anti-FGFR1 que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 136; (b) HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 137; (c) HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 138; (d) HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 139; (e) HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 140; e (f) HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 141.

[00170] Em certas realizações, um anticorpo anti-FGFR1 da presente divulgação compreende uma sequência de domínio variável da cadeia pesada (VH) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 132. Em certas realizações, uma sequência de VH que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-FGFR1 que compreende essa sequência mantém a capacidade de se ligar a FGFR1. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 132. Em certas realizações, substituições, inserções ou deleções ocorrem nas regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). De maneira alternativa ou adicionalmente, o anticorpo anti-FGFR1 compreende a sequência de VH na SEQ ID NO: 132, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em certas realizações, a VH compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir de: (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 136, (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 137, e (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 138.

[00171] A presente divulgação ainda fornece um anticorpo anti- FGFR1, em que o anticorpo compreende um domínio variável da cadeia leve (VL) que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência à sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 134. Em certas realizações, uma sequência de VL que tem pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade contém substituições (por exemplo, substituições conservativas), inserções ou deleções relativas à sequência de referência, mas um anticorpo anti-FGFR1 que compreende essa sequência mantém a capacidade de se ligar a FGFR1. Em certas realizações, um total de 1 a 10 aminoácidos foi substituído, inserido e/ou deletado na SEQ ID NO: 134. Em certas realizações, as substituições, inserções ou deleções ocorrem em regiões fora das HVRs (isto é, nas FRs). De maneira alternativa ou adicionalmente, o anticorpo anti- FGFR1 compreende a sequência de VL na SEQ ID NO: 134, incluindo modificações pós-traducionais dessa sequência. Em uma realização específica, a VL compreende uma, duas ou três HVRs selecionadas a partir da (a) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 139; (b) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 140; e (c) HVR- L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 141.

[00172] Em outro aspecto, é fornecido um anticorpo anti-FGFR1, em que o anticorpo compreende um VH como em qualquer uma das realizações fornecidas acima, e um VL como em qualquer uma das realizações fornecidas acima. Em certas realizações, o anticorpo anti-FGFR1 compreende as sequências de VH e VL na SEQ ID NO: 132 e SEQ ID NO: 134, respectivamente, incluindo modificações pós-traducionais dessas sequências.

[00173] Em certas realizações, um anticorpo FGFR1 da presente divulgação se liga a um fragmento de FGFR1c que consiste na sequência de aminoácidos KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 143) ou FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144).

C. ANTICORPOS BIESPECÍFICOS ANTI-KLB/ANTI-FGFR1 EXEMPLARES

[00174] A presente divulgação fornece ainda anticorpos biespecíficos que se ligam tanto a KLB como FGFR1 (isto é, anticorpos biespecíficos anti-KLB/anti- FGFR1). Um anticorpo biespecífico tem duas especificidades de ligação diferentes, consulte, por exemplo, patentes US 5.922.845 e 5.837.243; Zeilder (1999) J. Immunol. 163:1246-1252; Somasundaram (1999) Hum. Antibodies 9:47-54; Keler (1997) Cancer Res. 57:4008-4014). Por exemplo, e não a título de limitação, a matéria em questão atualmente divulgada fornece anticorpos biespecíficos que têm um sítio de ligação (por exemplo, sítio de ligação ao antígeno) para um primeiro epítopo presente em KLB e um segundo sítio de ligação ao antígeno para um segundo epítopo presente em FGFR1. Por exemplo, e não a título de limitação, a presente divulgação fornece um anticorpo onde um braço se liga a KLB e compreende qualquer uma das sequências do anticorpo anti-KLB descrito no presente pedido e o segundo braço se liga a FGFR1 e compreende qualquer uma das sequências do anticorpo anti-FGFR1 descritas no presente pedido. Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 da presente divulgação tem um sítio de ligação para um primeiro epítopo presente em KLB primeiro e um segundo sítio para um segundo epítopo presente em FGFR1c.

[00175] Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 divulgado no presente pedido refere-se a um anticorpo que modula a atividade do complexo KLB/FGFR1c. Por exemplo, o anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 pode funcionar como um agonista e ativar o complexo KLB/FGFR1c. Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 é um anticorpo que aumenta a atividade do complexo KLB/FGFR1c por pelo menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 99% ou 99,9%. Em certas realizações, o anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 pode ser um anticorpo que resulta na fosforilação dos alvos a jusante do complexo KLB/FGFR1c, por exemplo, MAPK e/ou ERK.

[00176] Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 divulgado no presente pedido se refere a um anticorpo que modula atividade do complexo KLB/FGFR1c e não bloqueia a interação e/ou ligação dos ligantes FGF nativos, por exemplo, FGF19 e FGF21, ao complexo KLB/FGFR1c. Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti- FGFR1 divulgado no presente pedido refere-se a um anticorpo que não bloqueia a atividade e/ou ligação dos ligantes FGF nativos a um receptor de FGF na ausência de KLB. Por exemplo, e não a título de limitação, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 da presente divulgação não bloqueia a interação de ligantes FGF nativos com o complexo FGFR4/KLA e/ou FGFR1 sozinho. Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 divulgado no presente pedido refere-se a um anticorpo que não bloqueia a atividade e/ou ligação de ligantes FGF a KLB na ausência de FGFR1. Por exemplo, e não a título de limitação, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 da presente divulgação não bloqueia a interação de ligantes FGF nativos com o complexo FGFR4/KLB, o complexo FGFR2c/KLB e/ou o complexo FGFR3c/KLB.

[00177] Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti- FGFR1c, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, inclui uma região de cadeia pesada e de cadeia leve. Em certas realizações, a cadeia pesada inteira inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 129. Em certas realizações, a cadeia leve inteira inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 131. Em certas realizações, a cadeia pesada inteira inclui aminoácidos que têm uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 129. Em certas realizações, a cadeia leve inteira inclui aminoácidos que têm uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 131.

[00178] Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti- FGFR1c, ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo, inclui uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve. Em certas realizações, a região variável da cadeia pesada inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 128. Em certas realizações, a região variável da cadeia leve inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em certas realizações, a região variável da cadeia pesada inclui aminoácidos que têm uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 128. Em certas realizações, a região variável da cadeia leve inclui aminoácidos que têm uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 130.

[00179] Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1-15, por exemplo, 12 ou 15; (b) HVR-H2 que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 16-31, por exemplo, 28 ou 31; (c) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 32-47, por exemplo, 44 ou 47; (d) HVR-L1 que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 48-62, por exemplo, 49 ou 62; (e) HVR-L2 que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 63-78, por exemplo, 75 ou 78; e (f) HVR-L3 que compreende uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NOs: 79-93, por exemplo, 90 ou 93.

[00180] Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti- FGFR1c compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 12; (b) HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 28; (c) HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 44; (d) HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 49; (e) HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 75; e (f) HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 90. Em certas realizações, a presente divulgação fornece um anticorpo anti-KLB que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende SEQ ID NO: 15; (b) HVR-H2 que compreende SEQ ID NO: 31; (c) HVR-H3 que compreende SEQ ID NO: 47; (d) HVR-L1 que compreende SEQ ID NO: 62; (e) HVR-L2 que compreende SEQ ID NO: 78; e (f) HVR-L3 que compreende SEQ ID NO: 93.

[00181] Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti- FGFR1c, inclui uma região variável da cadeia pesada que compreende os domínios CDR1, CDR2 e CDR3, e uma região variável da cadeia leve que compreende os domínios CDR1, CDR2 e CDR3. Em certas realizações, o domínio CDR1 da região variável da cadeia pesada inclui uma sequência de aminoácidos que tem uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 1-15. Em certas realizações, o domínio CDR2 da região variável da cadeia pesada inclui uma sequência de aminoácidos que tem uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 16-31. Em certas realizações, o domínio CDR3 da região variável da cadeia pesada inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 32-47. Em certas realizações, o domínio CDR1 da região variável da cadeia leve inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 48-62. Em certas realizações, o domínio CDR2 da região variável da cadeia leve inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 63-78. Em certas realizações, o domínio CDR3 da região variável da cadeia leve inclui uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 79-93.

[00182] Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti- FGFR1c, inclui uma região variável da cadeia pesada que compreende os domínios CDR1, CDR2 e CDR3, e uma região variável da cadeia leve que compreende os domínios CDR1, CDR2 e CDR3. Em certas realizações, o domínio CDR1 da região variável da cadeia pesada inclui uma sequência de aminoácidos que tem uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 1-15. Em certas realizações, o domínio CDR2 da região variável da cadeia pesada inclui uma sequência de aminoácidos que tem uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 16-31. Em certas realizações, o domínio CDR3 da região variável da cadeia pesada inclui uma sequência de aminoácidos que tem uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 32-47. Em certas realizações, o domínio CDR1 da região variável da cadeia leve inclui uma sequência de aminoácidos que tem uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 48-62. Em certas realizações, o domínio CDR2 da região variável da cadeia leve inclui uma sequência de aminoácidos que tem uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 63-78. Em certas realizações, o domínio CDR3 da região variável da cadeia leve inclui uma sequência de aminoácidos que tem uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 79-93.

[00183] Em certas realizações, um anti-KLB/anti-FGFR1 anticorpo biespecífico, por exemplo, um anti-KLB/anti-FGFR1c inclui uma CDR1 da região variável da cadeia pesada que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 15; uma CDR2 da região variável da cadeia pesada que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 31; uma CDR3 da região variável da cadeia pesada que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 47; uma CDR1 da região variável da cadeia leve que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 62; uma CDR2 da região variável da cadeia leve que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 78; e uma CDR3 da região variável da cadeia leve que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 93.

[00184] Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 inclui um primeiro anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, e inclui um segundo anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, onde o primeiro anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um epítopo presente em KLB e o segundo anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo se liga a um epítopo presente em FGFR1, por exemplo, FGFR1c. Por exemplo, e não a título de limitação, o primeiro anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, pode incluir uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve; e o segundo anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo pode incluir uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve. Em certas realizações, a região variável da cadeia pesada do primeiro anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 128. Em certas realizações, a região variável da cadeia leve do primeiro anticorpo ou porções de ligação ao antígeno do mesmo inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 130. Em certas realizações, a região variável da cadeia pesada do segundo anticorpo ou porção de ligação ao antígeno do mesmo inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 132. Em certas realizações, a região variável da cadeia leve do segundo anticorpo ou porções de ligação ao antígeno do mesmo inclui aminoácidos que têm uma sequência que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 134.

[00185] Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-FGFR1 é fornecido no presente pedido. Por exemplo, em certas realizações, é fornecido um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-KLB que compreende a sequência de VH de SEQ ID NO: 128 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 130. Em certas realizações, é fornecido um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se liga a um fragmento de KLB que consiste na sequência de aminoácidos SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS (SEQ ID NO: 142).

[00186] Em certas realizações, é fornecido um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 desde que se ligue a um fragmento de KLB que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 142.

[00187] Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-FGFR1 é fornecido no presente pedido. Por exemplo, em certas realizações, é fornecido um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-KLB que compreende a sequência da cadeia pesada inteira de SEQ ID NO: 129 e uma sequência da cadeia leve inteira de SEQ ID NO: 131.

[00188] Em certas realizações, a presente divulgação fornece um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-FGFR1 fornecido no presente pedido. Por exemplo, em certas realizações, é fornecido um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-FGFR1 que compreende a sequência de VH de SEQ ID NO: 132 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 134. Em certas realizações, é fornecido um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se liga a um fragmento de FGFR1c que compreende a sequência de aminoácidos KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 143) ou FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144).

[00189] Em certas realizações, a presente divulgação fornece um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-FGFR1 fornecido no presente pedido. Por exemplo, em certas realizações, é fornecido um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-FGFR1 que compreende a sequência da cadeia pesada de SEQ ID NO: 133 e uma sequência da cadeia leve de SEQ ID NO: 135.

[00190] Em certas realizações, é fornecido um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 da presente divulgação que se liga a um fragmento de FGFR1c que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 143.

[00191] Em certas realizações, é fornecido um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 da presente divulgação que se liga a um fragmento de FGFR1c que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 144.

[00192] Em certas realizações, é fornecido um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 desde que se ligue a um fragmento de KLB que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 142, e se liga a um fragmento de FGFR1c que tem uma sequência de aminoácidos que é pelo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à sequência apresentada na SEQ ID NO: 143 ou 144.

[00193] Em certas realizações, é fornecido um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que se liga a um fragmento de KLB que tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 142 e se liga a um fragmento de FGFR1c que tem a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 143 ou 144.

2. AFINIDADE DE ANTICORPO

[00194] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode ter uma constante de dissociação (Kd) < 1 M, < 100 mM, < 10 mM, < 1 mM, < 100 μM, < 10 μM, < 1μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode ter um Kd de cerca de 10-3 M ou menor, ou 10-8 M ou menor, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M.

[00195] Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 pode incluir um braço anti-FGFR1 que tem um Kd de cerca de 10 nM a cerca de 10 μM. Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 com um braço FGFR1 que tem baixa afinidade pode atenuar o risco do anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 se ligar a FGFR1 firmemente na ausência de KLB e evitar a ligação e/ou ativação de FGFR1 por outros ligantes FGF como, mas não se limitando a FGF1, FGF2, FGF8 e FGF23. Em certas realizações, um braço FGFR1 com uma baixa afinidade pode permitir que a presença de níveis mais altos de impurezas de FGFR1 como, mas não se limitando a anticorpos com meia protuberância anti-FGFR1, dímeros anti-FGFR1 não covalentes, dímeros anti-FGFR1 covalentes e espécies de alto peso molecular, sem resultar em efeitos colaterais clinicamente significativos. Por exemplo, em certas realizações, aproximadamente 2% de espécies de alto peso molecular e 1,5% de meio anticorpo anti-FGFR1 podem estar presentes em uma preparação de um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 da presente divulgação sem resultar em efeitos biológicos adversos.

[00196] Em certas realizações, Kd pode ser medida por um ensaio de ligação de antígeno radiomarcado (RIA). Em certas realizações, um RIA pode ser realizado com uma versão Fab de um anticorpo de interesse e seu antígeno. Por exemplo, e não a título de limitação, uma afinidade de ligação da solução de Fabs para o antígeno é medida por equilíbrio de Fab com uma concentração mínima de antígeno marcado com (125I) na presença de uma série de titulação de antígeno não marcado e então capturando o antígeno ligado com uma placa revestida com anticorpo anti-Fab (consulte, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). Para estabelecer as condições para o ensaio, placas multipoços MICROTITER® (Thermo Scientific) são revestidas durante a noite com 5 μg/mL de um anticorpo anti-Fab de captura (Cappel Labs) em carbonato de sódio 50 mM (pH 9,6), e subsequentemente bloqueadas com albumina de soro bovino 2% (p/v) em PBS por duas a cinco horas à temperatura ambiente (aproximadamente 23°C). Em uma placa não adsorvente (Nunc n° 269620), 100 pM ou 26 pM de [125I]-antígeno são misturados com uma série de diluições de um Fab de interesse (por exemplo, consistente com a avaliação do anticorpo anti-VEGF, Fab-12, em Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)). O Fab de interesse é então incubado durante a noite, no entanto, a incubação pode continuar por um período maior (por exemplo, cerca de 65 horas) para assegurar que o equilíbrio seja alcançado. Posteriormente, as misturas são transferidas para a placa de captura para incubação à temperatura ambiente (por exemplo, por uma hora). A solução é então removida e a placa lavada oito vezes com polissorbato 20 0,1% (TWEEN-20®) em PBS. Quando as placas estiverem secas, é adicionado 150 μL/poço de cintilante (MICROSCINT-20™; Packard) e as placas são contadas em um contador gama TOPCOUNT™ (Packard) por dez minutos. As concentrações de cada Fab que fornecem ligação máxima menor ou igual a 20% são escolhidas para uso em ensaios de ligação competitiva.

[00197] Em certas realizações, Kd pode ser medido com o uso de um ensaio de ressonância plasmônica de superfície BIACORE®. Por exemplo, e não a título de limitação, é realizado um ensaio com o uso de um BIACORE®- 2000 ou um BIACORE®-3000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) a 25°C, com chips CM5 de antígeno imobilizado em aproximadamente 10 unidades de resposta (RU). Em certas realizações, chips biossensor dextrano carboximetilado (CM5, Biacore Inc.) são ativados com hidrocloreto de N-etil-N’- (3-dimetilaminopropil)- carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS), de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,8, a 5 μg/mL (aproximadamente 0,2 μM) antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5 μL/minuto para obter aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, etanolamina 1M é injetada para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições em série de duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com tensoativo (PBST) polissorbato 20 0,05% (TWEEN-20™) a 25°C a uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 μL/min. As taxas de associação (kon) e taxas de dissociação (koff) são calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir um para um simples (Programa de Computação de Avaliação BIACORE® versão 3.2) ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de dissociação em equilíbrio (Kd) pode ser calculada como a razão koff/kon. Consulte, por exemplo, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999). Se a taxa de associação exceder 106 M-1 s-1 pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície acima, então a taxa de associação pode ser determinada pelo uso de uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou diminuição na intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm de bandas de passagem) a 25°C de um anticorpo anti-antígeno 20nM em PBS (forma Fab), pH 7,2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido em um espectrômetro, como um espectrômetro equipado com parada de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrômetro SLM-AMINCO™ série 8000 (ThermoSpectronic) com um cadinho misturador.

2. FRAGMENTOS DE ANTICORPOS

[00198] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação é um fragmento de anticorpo. Fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a, fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv e scFv, e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, consulte Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003). Para uma revisão de fragmentos scFv, consulte, por exemplo, Pluckthün, em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg e Moore eds., (Springer-Verlag, Nova York), páginas 269-315 (1994); consulte também documento WO 93/16185; e patentes US 5.571.894 e 5.587.458. Para discussão de fragmentos Fab e F(ab’)2 que compreendem resíduos de epítopo que se ligam a receptores de resgate e têm meia vida aumentada in vivo, consulte patente US 5.869.046.

[00199] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode ser um diacorpo. Diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Consulte, por exemplo, patente EP 404.097; documento WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); e Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003).

[00200] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode ser um anticorpo com domínio único. Anticorpos com domínio único são fragmentos de anticorpos que compreendem todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas realizações, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; consulte, por exemplo, patente US 6.248.516 B1).

[00201] Fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por várias técnicas incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), conforme descrito no presente pedido.

3. ANTICORPOS QUIMÉRICOS E HUMANIZADOS

[00202] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na patente US 4.816.567; e Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Em certas realizações, um anticorpo quimérico da presente divulgação compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, como um macaco) e uma região constante humana. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico pode ser um anticorpo com “mudança de classe” em que a classe ou a subclasse foi alterada a partir daquela do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.

[00203] Em certas realizações, um anticorpo quimérico da presente divulgação pode ser um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para humanos, embora mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo parental não humano. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis, em que, por exemplo, HVRs, por exemplo, CDRs, (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano, e FRs (ou porções dos mesmos) são derivados de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em certas realizações, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.

[00204] Anticorpos humanizados e métodos para produzir os mesmos são revisados, por exemplo, em Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), e ainda são descritos, por exemplo, em Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86:1002910033 (1989); patentes US 5.821.337, 7.527.791, 6.982.321 e 7.087.409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (que descrevem enxerto de região determinante de especificidade (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (que descrevem “resurfacing”); Dall’Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (que descrevem “embaralhamento de FR”); e Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) e Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (que descrevem a abordagem “seleção guiada” para embaralhamento de FR).

[00205] Regiões de estrutura humanas que podem ser usadas para humanização incluem, mas não se limitam a: regiões de estrutura selecionadas com o uso do método de “melhor ajuste” (consulte, por exemplo, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); regiões de estrutura derivadas a partir da sequência consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis da cadeia leve ou pesada (consulte, por exemplo, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); e Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); regiões de estrutura maduras humanas (mutadas somaticamente) ou regiões de estrutura de linhagem germinativa humana (consulte, por exemplo, Almagro e Fransson, Front. Biosci. 13:16191633 (2008)); e regiões de estrutura derivadas de triagem de bibliotecas de FR (consulte, por exemplo, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) e Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

4. ANTICORPOS HUMANOS

[00206] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode ser um anticorpo humano. Anticorpos humanos podem ser produzidos com o uso de várias técnicas conhecidas. Anticorpos humanos são descritos geralmente em van Dijk e van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) e Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008).

[00207] Os anticorpos humanos podem ser preparados por administração de um imunógeno para um animal transgênico, que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta à estimulação antigênica. Esses animais tipicamente contêm toda ou uma porção dos loci da imunoglobulina humana, que substitui os loci da imunoglobulina endógena, ou que estão presentes fora do cromossomo ou integrados aleatoriamente nos cromossomos do animal. Nesses camundongos transgênicos, os loci de imunoglobulina endógena geralmente foram inativados. Para revisão de métodos para obter anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, consulte Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Consulte, por exemplo, patentes US 6.075.181 e 6.150.584 que descrevem a tecnologia XENOMOUSE™; patente US 5.770.429 que descreve a tecnologia HUMAB®; patente US 7.041.870 que descreve a tecnologia K-M MOUSE®, e publicação de pedido de patente US 2007/0061900, que descreve a tecnologia VELOCIMOUSE®). Regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por esses animais podem ainda ser modificadas, por exemplo, por combinação com uma região constante humana diferente.

[00208] Anticorpos humanos também podem ser fabricados por métodos baseados em hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano de camundongo foram descritas para produção de anticorpos monoclonais humanos. (Consulte, por exemplo, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1987); e Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Anticorpos humanos gerados através de tecnologia de hibridoma de células B humanas também são descritos em Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Métodos adicionais incluem os descritos, por exemplo, na patente US 7.189.826 (que descreve a produção de anticorpos IgM monoclonais humanos de linhagens celulares de hibridomas) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (que descreve hibridomas humano-humano). A tecnologia de hibridoma humano (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers e Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) e Vollmers e Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

[00209] Anticorpos humanos também podem ser gerados por isolamento de sequências de domínio variável de clone de Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição por fago derivadas de humanos. Essas sequências de domínio variável podem então ser combinadas com um domínio constante humano desejado. Técnicas para seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos são descritas abaixo.

5. ANTICORPOS DERIVADOS DE BIBLIOTECAS

[00210] Os anticorpos da presente divulgação podem ser isolados por seleção de bibliotecas combinatórias para anticorpos com a atividade ou atividades desejadas. Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida na técnica para geração de bibliotecas de exibição por fago e seleção dessas bibliotecas para anticorpos que possuem as características de ligação desejadas. Esses métodos são revisados, por exemplo, em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) e ainda descritos, por exemplo, em McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks e Bradbury, em Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); e Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132 (2004).

[00211] Em certos métodos de exibição por fago, repertórios de genes de VH e VL são clonados separadamente por reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fago, que podem ser então selecionados para fago de ligação de antígeno, conforme descrito em Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994). O fago tipicamente exibe fragmentos de anticorpos, tanto como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab. Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos com alta afinidade para o imunógeno sem a necessidade de construção de hibridomas. De maneira alternativo, o repertório virgem pode ser clonado (por exemplo, de humano) para fornecer uma fonte única de anticorpos para uma grande variedade de antígenos não próprios e também próprios sem qualquer imunização, conforme descrito por Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993). Em certas realizações, bibliotecas virgens também podem ser produzidas sinteticamente por clonagem dos segmentos do gene V rearranjados a partir de células-tronco e com o uso de primers de PCR que contêm sequência aleatória para codificar as regiões de CDR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom e Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992). Publicações de patentes que descrevem bibliotecas de fago de anticorpo humano incluem, por exemplo: patente US 5.750.373 e publicações de patentes US 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 e 2009/0002360.

[00212] Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados a partir de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos descritos no presente pedido.

6. ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS

[00213] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode ser um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois epítopos diferentes. Em certas realizações, uma das especificidades de ligação é para um epítopo presente em KLB e a outra é para qualquer outro antígeno. Em certas realizações, uma das especificidades de ligação é para um epítopo presente em FGFR1 e a outra é para qualquer outro antígeno. Em certas realizações, um anticorpo biespecífico da presente divulgação pode se ligar a um epítopo em KLB e pode se ligar a um epítopo em FGFR1. Em certas realizações, um anticorpo biespecífico da presente divulgação pode se ligar a um epítopo em KLB e pode se ligar a um epítopo em FGFR1c. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos inteiros ou fragmentos de anticorpos.

[00214] As técnicas para produção de anticorpos multiespecíficos incluem, mas não se limitam a, coexpressão recombinante de dois pares da cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina que têm especificidades diferentes (consulte, Milstein e Cuello, Nature 305: 537 (1983)), documento WO 93/08829, e Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), e elaboração de “protuberância em orifício” (consulte, por exemplo, patente US 5.731.168). Anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por elaboração de efeitos de direcionamento eletrostático para produção de anticorpo Fc- moléculas heterodiméricas (documento WO 2009/089004A1); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (consulte, por exemplo, patente US 4.676.980, e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); com o uso de zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); com o uso de tecnologia “diacorpo” para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); e com o uso de dímeros Fv de cadeia única (sFv) (consulte, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); e preparando anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

[00215] Anticorpos elaborados geneticamente com três ou mais sítios de ligação ao antígeno funcionais, incluindo “anticorpos polvo”, também são incluídos no presente pedido (consulte, por exemplo, patente US 2006/0025576A1).

7. VARIANTES DE ANTICORPOS

[00216] A matéria em questão atualmente divulgada fornece ainda variantes de sequências de aminoácidos dos anticorpos divulgados. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Sequências de aminoácidos variantes de um anticorpo podem ser preparadas por introdução apropriada de modificações na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo, ou por síntese peptídica. Essas modificações incluem, mas não se limitam a, deleções, inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para se chegar ao constructo final, desde que o anticorpo final, isto é, modificado, possua as características desejadas, por exemplo, ligação ao antígeno.

A) VARIANTES DE SUBSTITUIÇÃO, INSERÇÃO E DELEÇÃO

[00217] Em certas realizações, as variantes de anticorpos podem ter uma ou mais substituições de aminoácidos. Sítios de interesse para mutagênese de substituição incluem as HVRs e FRs. Exemplos não limitantes de substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob o título de “substituições preferenciais”. Exemplos não limitantes de mais alterações substanciais são fornecidos na Tabela 1, sob o título de “substituições exemplares”, e conforme ainda descritas abaixo, em referência às classes de cadeia laterais de aminoácidos. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação ao antígeno retida/aprimorada, imunogenicidade diminuída ou citotoxicidade dependente de complemento aprimorada (CDC) ou citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC). TABELA 1

[00218] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.

[00219] Em certas realizações, substituições não conservativas irão implicar na troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.

[00220] Em certas realizações, um tipo de variante substitucional envolve substituição de um ou mais resíduos da região hipervariável de um anticorpo parental, por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano. Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para mais adiante estudar se terá modificações, por exemplo, aprimoramentos em certas propriedades biológicas como, mas não se limitando a, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida em relação ao anticorpo parental e/ou se terá certas propriedades biológicas substancialmente retidas do anticorpo parental. Um exemplo não limitante de uma variante substitucional é um anticorpo de afinidade maturada, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, com o uso de técnicas de maturação de afinidade com base na exibição por fago conforme essas descritas no presente pedido. Resumidamente, um ou mais resíduos de HVR são mutados e as variantes de anticorpos exibidas em fago e selecionadas para uma atividade biológica específica (por exemplo, afinidade de ligação).

[00221] Em certas realizações, alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para aprimorar a afinidade do anticorpo. Essas alterações podem ser produzidas em “hotspots” de HVR, isto é, resíduos codificados por códons que são submetidos a mutação em alta frequência durante o processo somático de maturação (consulte, por exemplo, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), e/ou resíduos que entram em contato com o antígeno, com o VH ou VL variante resultante sendo testado quanto à afinidade de ligação. Maturação de afinidade por construção e nova seleção a partir de bibliotecas secundárias foram descritas, por exemplo, em Hoogenboom et al. em Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)). Em certas realizações de maturação de afinidade, a diversidade pode ser introduzida nos genes variáveis escolhidos para maturação por qualquer um de uma variedade de métodos (por exemplo, PCR propensa a erro, embaralhamento de cadeia ou mutagênese direcionada por oligonucleotídeo). Uma biblioteca secundária é então criada. A biblioteca é então selecionada para identificar quaisquer variantes de anticorpos com a afinidade desejada. Qualquer método para introduzir diversidade envolve abordagens direcionadas a HVR, na qual diversos resíduos de HVR (por exemplo, 4 a 6 resíduos de uma vez) são randomizados. Resíduos de HVR envolvidos em ligação ao antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, com o uso de mutagênese ou modelagem de varredura de alanina. CDR-H3 e CDR-L3 em particular, são muitas vezes alvo.

[00222] Em certas realizações, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs contanto que essas alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo se ligar ao antígeno. Por exemplo, alterações conservativas (por exemplo, substituições conservativas conforme fornecidas no presente pedido) que não reduzam substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Essas alterações podem, por exemplo, estar fora do antígeno colocando resíduos em contato nas HVRs. Em certas realizações das sequências de VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR tanto é não alterada como contêm não mais que uma, duas ou três substituições de aminoácidos.

[00223] Um método útil para identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que podem ser direcionadas para mutagênese é chamada de “mutagênese de varredura de alanina” conforme descrito por Cunningham e Wells (1989) Science, 244:1081-1085. Nesse método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados como arg, asp, his, lys e glu) são identificados e substituídos por um aminoácido carregado negativamente ou neutro (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Além disso, podem ser introduzidas substituições nas localizações de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. De maneira alternativa ou adicionalmente, uma estrutura cristalina de um complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos para substituição. As variantes podem ser selecionadas para determinar se contêm as propriedades desejadas.

[00224] Inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carbóxi-terminal, variando, de comprimento, de um resíduo a polipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, bem como inserções intrassequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionila N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão à terminação N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, por terapia pró-droga/enzima direcionada por Anticorpo (ADEPT)) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida no soro do anticorpo.

B) VARIANTES DE GLICOSILAÇÃO

[00225] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode ser alterado para aumentar ou diminuir a medida na qual o anticorpo é glicosilado. A adição ou deleção de sítios de glicosilação a um anticorpo pode ser convenientemente realizada por alteração da sequência de aminoácidos, de modo que um ou mais sítios de glicosilação são criados ou removidos.

[00226] Em certas realizações, onde o anticorpo compreende uma região Fc, o carboidrato ligado ao mesmo pode ser alterado. Anticorpos nativos produzidos por células de mamíferos tipicamente compreendem um oligossacarídeo biantenário ramificado que geralmente é ligado por uma ligação N ao Asn297 do domínio CH2 da região Fc. Consulte, por exemplo, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). O oligossacarídeo pode incluir vários carboidratos, por exemplo, manose, N-acetil glicosamina (GlcNAc), galactose e ácido siálico, bem como uma fucose ligada a uma GlcNAc no “tronco” da estrutura do oligossacarídeo biantenário. Em certas realizações, as modificações do oligossacarídeo em um anticorpo da presente divulgação podem ser feitas a fim de criar variantes de anticorpos com certas propriedades aprimoradas.

[00227] Em certas realizações, variantes de anticorpos são fornecidas tendo uma estrutura de carboidrato desprovida de fucose ligada (direta ou indiretamente) a uma região Fc. Por exemplo, a quantidade de fucose nesse anticorpo pode ser de cerca de 1% a cerca de 80%, de cerca de 1% a cerca de 65%, de cerca de 5% a cerca de 65% ou de cerca de 20% a cerca de 40% e valores intermediários.

[00228] Em certas realizações, a quantidade de fucose pode ser determinada calculando a quantidade média de fucose na cadeia de açúcar em Asn297, em relação à soma de todas as glicoestruturas ligadas a Asn297 (por exemplo, estruturas do tipo complexo, alta manose e híbridas) conforme medido por espectrometria de massa MALDI-TOF, conforme descrito no documento WO 2008/077546, por exemplo. Asn297 refere-se ao resíduo de asparagina localizado próximo da posição 297 na região Fc (numeração EU de resíduos da região Fc), no entanto, Asn297 também pode estar localizado a cerca de mais ou menos 3 aminoácidos a montante ou a jusante da posição 297, isto é, entre as posições 294 e 300, devido a menores variações de sequência em anticorpos. Essas variantes de fucosilação podem ter função ADCC aprimorada. Consulte, por exemplo, publicação de patente US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Exemplos de publicações relacionadas a variantes de anticorpos “desfucosilados” ou “deficientes em fucose” incluem: patente US 2003/0157108; documento WO 2000/61739; documento WO 2001/29246; patente US 2003/0115614; patente US 2002/0164328; patente US 2004/0093621; patente US 2004/0132140; patente US 2004/0110704; patente US 2004/0110282; patente US 2004/0109865; documento WO 2003/085119; documento WO 2003/084570; documento WO 2005/035586; documento WO 2005/035778; documento WO 2005/053742; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004).

[00229] Anticorpos desfucosilados podem ser produzidos em qualquer linhagem celular que seja deficiente em fucosilação de proteína. Exemplos não limitantes de linhagens celulares incluem células CHO Lec13 deficientes em fucosilação de proteína (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); pedido de patente US 2003/0157108 A1, Presta, L; e documento WO 2004/056312 A1, Adams et al., especialmente no Exemplo 11) e linhagens celulares knockout, como gene alfa-1,6-fucosiltransferase, FUT8, células CHO knockout (consulte, por exemplo, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); e documento WO 2003/085107).

[00230] Variantes de anticorpos são ainda fornecidas com oligossacarídeos bifurcados, por exemplo, na qual um oligossacarídeo biantenário fixado à região Fc do anticorpo é bifurcado por GlcNAc. Essas variantes de anticorpos podem ter fucosilação reduzida e/ou função ADCC aprimorada. Exemplos não limitantes dessas variantes de anticorpos são descritas, por exemplo, no documento WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); patente US 6.602.684 (Umana et al.); e patente US 2005/0123546 (Umana et al.). Também são fornecidas variantes de anticorpos com pelo menos um resíduo de galactose no oligossacarídeo fixado à região Fc. Essas variantes de anticorpos podem ter função CDC aprimorada. Essas variantes de anticorpos são descritas, por exemplo, no documento WO 1997/30087 (Patel et al.); documento WO 1998/58964 (Raju, S.); e documento WO 1999/22764 (Raju, S.).

c) REGIÕES FC VARIANTES

[00231] Em certas realizações, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas dentro da região Fc de um anticorpo fornecido no presente pedido, através disso gerando uma região Fc variante. A região Fc variante pode compreender uma sequência de região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.

[00232] Em certas realizações, a presente divulgação fornece uma variante de anticorpo que possui algumas, mas não todas as funções efetoras, que o tornam um candidato desejável para aplicações em que a meia vida do anticorpo in vivo é ainda importante para certas funções efetoras (como complemento e ADCC) que são desnecessárias ou deletérias. Ensaios de citotoxicidade in vitro e/ou in vivo podem ser conduzidos para confirmar a redução/depleção de atividades CDC e/ou ADCC. Por exemplo, ensaios de ligação do receptor Fc (FcR) podem ser conduzidos para assegurar que o anticorpo é desprovido de ligação ao FCYR (então provavelmente sendo desprovido de atividade ADCC), mas mantém capacidade de ligação ao FcRn. As células primárias para mediar ADCC, células NK, expressam somente FCYRIII, enquanto que monócitos expressam FCYRI, FCYRII e FCYRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 de Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991). Exemplos não limitantes de ensaios in vitro para avaliar a atividade ADCC de uma molécula de interesse são descritos na patente US 5.500.362 (consulte, por exemplo, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)) e Hellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); patente US 5.821.337 (consulte Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:13511361 (1987)). De maneira alternativa, os métodos de ensaios não radioativos podem ser empregados (consulte, por exemplo, ensaio de citotoxicidade não radioativo para fluxo citométrico ACTITM (Cell Technology, Inc. Mountain View, CA; e ensaio de citotoxicidade não radioativo CYTOTOX 96® (Promega, Madison, WI). Células efetoras úteis para esses ensaios incluem células mononucleares do sangue periférico (PBMC) e células exterminadoras naturais (Natural Killer-NK). De maneira alternativa ou adicionalmente, a atividade de ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal como o divulgado em Clynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998). Ensaios de ligação C1q também podem ser realizados para confirmar se o anticorpo é incapaz de se ligar a C1q e, então, desprovido de atividade CDC. Consulte, por exemplo, ELISA de ligação C1q e C3c nos documentos WO 2006/029879 e WO 2005/100402. Para avaliar ativação de complemento, pode ser realizado um ensaio CDC (consulte, por exemplo, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); e Cragg, M.S. e M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). Ligação ao FcRn e determinações de liberação/meia- vida in vivo também podem ser realizadas com o uso de métodos conhecidos na técnica (consulte, por exemplo, Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)). Em certas realizações, podem ser feitas alterações na região Fc que resultam em ligação C1q alterada (isto é, tanto aprimorada como diminuída) e/ou Citotoxicidade Dependente de Complemento (CDC), por exemplo, conforme descrito na patente US 6.194.551, documento WO 99/51642 e Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000).

[00233] Anticorpos com função efetora reduzida incluem os com substituições de um ou mais resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (patente US 6.737.056). Esses mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições dos aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o também conhecido como mutante Fc “DANA” com substituições dos resíduos 265 e 297 para alanina (patente US 7.332.581).

[00234] São descritas certas variantes de anticorpos com ligação melhorada ou diminuída para FcRs. Consulte, por exemplo, patente US 6.737.056, documento WO 2004/056312 e Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).

[00235] Em certas realizações, uma variante de anticorpo da presente divulgação compreende uma região Fc com uma ou mais substituições de aminoácidos que aprimoram ADCC, por exemplo, substituições nas posições 298, 333 e/ou 334 da região Fc (numeração de resíduos EU).

[00236] Em certas realizações, alteração produzida na região Fc de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo biespecífico, divulgado no presente pedido, pode produzir um anticorpo variante com uma meia-vida aumentada e ligação aprimorada ao receptor Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternas ao feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) e Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)), são descritos na patente US 2005/0014934A1 (Hinton et al.). Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nesse, que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Essas variantes de Fc incluem as com substituições em um ou mais resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição do resíduo 434 da região Fc (patente US 7.371.826).

[00237] Consulte também, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); patente US 5.648.260; patente US 5.624.821; e documento WO 94/29351 referem-se a outros exemplos de variantes de regiões Fc.

D) VARIANTES DE ANTICORPOS ELABORADOS GENETICAMENTE COM CISTEÍNA

[00238] Em certas realizações, pode ser desejável criar anticorpos elaborados geneticamente com cisteína, por exemplo, “thioMAbs”, em que um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em realizações específicas, os resíduos substituídos ocorrem em sítios acessíveis do anticorpo. Mediante a substituição desses resíduos por cisteína, os grupos tióis reativos são, através disso, posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo a outros componentes, como componentes droga ou componentes ligante-droga, para criar um imunoconjugado, conforme ainda descrito no presente pedido. Em certas realizações, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc da cadeia pesada. Anticorpos elaborados geneticamente com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, na patente US 7.521.541.

E) ANTICORPOS DERIVADOS

[00239] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode, ainda, ser modificado para conter componentes não proteináceos adicionais que são conhecidos na técnica e facilmente disponíveis. Os componentes adequados para derivatização do anticorpo incluem, mas não se limitam a, polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não se limitam a, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrana, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1, 3- dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero anidrido etileno/maleico, poliaminoácidos (tanto homopolímeros como copolímeros aleatórios), e dextrana ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e misturas dos mesmos. Propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação, devido a sua estabilidade em água. O polímero pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros ligados ao anticorpo pode variar, e se mais de um polímero estiver ligado, eles podem ter moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímeros usados para derivatização pode ser determinado com base nas considerações que incluem, mas não se limitam a, propriedades específicas ou funções do anticorpo a serem melhoradas, se o anticorpo derivado for usado em uma terapia sob condições definidas, etc.

[00240] Em certas realizações, são fornecidos conjugados de um anticorpo e componentes não proteináceos que podem ser seletivamente aquecidos por exposição à radiação. Em uma realização, o componente não proteináceo é um nanotubo de carbono (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)) Em certas realizações, a radiação pode ter qualquer comprimento de onda e inclui, mas não se limita a, comprimentos de onda que não são prejudiciais às células comuns, mas que aquecem o componente não proteináceo a uma temperatura na qual as células próximas ao componente não proteináceo do anticorpo são destruídas.

D.MÉTODO PARA PRODUÇÃO DE ANTICORPO

[00241] Os anticorpos divulgados no presente pedido podem ser produzidos com o uso de qualquer técnica disponível ou conhecida. Por exemplo, mas não a título de limitação, anticorpos podem ser produzidos com o uso de métodos recombinantes e composições, por exemplo, conforme descrito na patente US 4.816.567. Procedimentos detalhados para gerar anticorpos são descritos nos Exemplos abaixo.

[00242] A matéria em questão atualmente divulgada fornece um ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo divulgado no presente pedido. Por exemplo, o ácido nucleico isolado pode codificar uma sequência de aminoácidos que inclui a VL e/ou uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo, por exemplo, as cadeias leves e/ou pesadas do anticorpo. Em certas realizações, o ácido nucleico isolado pode incluir uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia pesada que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 128, e/ou uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos da região variável da cadeia leve que tem a sequência apresentada na SEQ ID NO: 130.

[00243] Em certas realizações, o ácido nucleico pode estar presente em um ou mais vetores, por exemplo, vetores de expressão. Como usado no presente pedido, o termo “vetor” refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual foi ligado. Um tipo de vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de fita dupla circular na qual segmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, onde segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira na qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos que têm uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos). Outros vetores (por exemplo, vetores não epissomais de mamíferos) são integrados no genoma de uma célula hospedeira por introdução na célula hospedeira e, através disso, são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além disso, certos vetores, vetores de expressão, são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles são ligados de maneira funcional. Em geral, vetores de expressão úteis em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente sob a forma de plasmídeos (vetores). No entanto, a matéria em questão divulgada tem a intenção de incluir essas outras formas de vetores de expressão, como vetores virais (por exemplo, retrovírus defeituoso de replicação, adenovírus e vírus adeno-associado) que atendem funções equivalentes.

[00244] Em certas realizações, o ácido nucleico que codifica um anticorpo da presente divulgação e/ou um ou mais vetores incluindo o ácido nucleico pode ser introduzido em uma célula hospedeira. Em certas realizações, a introdução de um ácido nucleico em uma célula pode ser realizada por qualquer método conhecidos na técnica incluindo, mas não se limitando a, transfecção, eletroporação, microinjeção, infecção com um vetor viral ou bacteriófago que contém as sequências de ácido nucleico, fusão celular, transferência gênica mediada por cromossomo, transferência gênica mediada por microcélula, fusão esferoplástica etc. Em certas realizações, uma célula hospedeira pode incluir, por exemplo, ter sido transformada com: (1) um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e um segundo vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo. Em certas realizações, a célula hospedeira é eucarionte, por exemplo, uma célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NS0, Sp20).

[00245] Em certas realizações, os métodos de produção de um anticorpo anti-KLB ou anti-FGFR1c podem incluir cultivar uma célula hospedeira na qual um ácido nucleico que codifica o anticorpo foi introduzido, sob condições adequadas para expressão do anticorpo e opcionalmente recuperar o anticorpo a partir das células hospedeiras e/ou meio de cultura de célula hospedeira. Em certas realizações, o anticorpo é recuperado a partir da célula hospedeira através de técnicas de cromatografia.

[00246] Para produção recombinante de um anticorpo da presente divulgação, um ácido nucleico que codifica um anticorpo, por exemplo, conforme descrito acima, pode ser isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagem e/ou expressão adicional em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser prontamente isolado e sequenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, com o uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo).

[00247] Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem células procariontes ou eucariontes descritas no presente pedido. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular quando não é necessária glicosilação e função efetora de Fc. Para expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, consulte, por exemplo, patentes US 5.648.237, 5.789.199 e 5.840.523. (Consulte também Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), páginas 245-254, que descreve expressão de fragmentos de anticorpos em E. coli). Após expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e ainda pode ser purificado.

[00248] Além de procariontes, micróbios eucariontes como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam anticorpos, incluindo linhagens de fungos e leveduras, cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcialmente ou totalmente humano. Consulte Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), e Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006). Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados também podem ser derivadas a partir de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas linhagens de baculovírus que podem ser usadas em conjunto com células de inseto, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[00249] Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados também são derivadas a partir de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas linhagens de baculovírus que podem ser usadas em conjunto com células de inseto, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[00250] Em certas realizações, as culturas de células vegetais podem ser utilizadas como células hospedeiras. Consulte, por exemplo, patentes US 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 (que descrevem tecnologia PLANTIBODIESTM para produção de anticorpos em plantas transgênicas).

[00251] Em certas realizações, células de vertebrados também podem também ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, e não a título de limitação, linhagens celulares de mamíferos que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Exemplos não limitantes de linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis são linhagens CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7), linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 conforme descrito, por exemplo, em Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)); células de rim de filhote de hamster (BHK); células de Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de rim canino (MDCK; células de fígado de rato búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982); células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens celulares hospedeiras de mamífero incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR- (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); e linhagens celulares de mieloma, como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de certas linhagens celulares hospedeiras de mamíferos adequadas para produção de anticorpo, consulte, por exemplo, Yazaki e Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), páginas 255-268 (2003).

[00252] Em certas realizações, as técnicas para produção de anticorpos biespecíficos e/ou multiespecíficos incluem, mas não se limitam a, coexpressão recombinante de dois pares da cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina que têm especificidades diferentes (consulte, Milstein e Cuello, Nature 305: 537 (1983)), pedido de patente PCT documento WO 93/08829, e Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)), e elaboração de “protuberância em orifício” (consulte, por exemplo, patente US 5.731.168). Anticorpos biespecíficos também podem ser produzidos por elaboração de efeitos de direcionamento eletrostático para produção de anticorpo Fc-moléculas heterodiméricas (documento WO 2009/089004A1); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (consulte, por exemplo, patente US 4.676.980, e Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); com o uso de zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)); com o uso de tecnologia “diacorpo” para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); e com o uso de dímeros Fv de cadeia única (sFv) (consulte, por exemplo, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); e preparando anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

[00253] Moléculas biespecíficas e multiespecíficas da presente divulgação também podem ser produzidas com o uso de técnicas de química (consulte, por exemplo, Kranz (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5807), técnicas de “polidoma” (consulte, por exemplo, patente US 4.474.893) ou técnicas de DNA recombinante. Moléculas biespecíficas e multiespecíficas da matéria em questão atualmente divulgada também podem ser preparadas por conjugação às especificidades de ligação constituintes, por exemplo, especificidades de ligação a um primeiro e a um segundo epítopo, com o uso de métodos conhecidos na técnica e conforme descrito no presente pedido. Por exemplo, e não a título de limitação, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica e multiespecífica pode ser gerada separadamente e em seguida conjugados a uma outra. Quando a especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou reticulantes pode ser usada para conjugação covalente. Exemplos não limitantes de agentes reticulantes incluem proteína A, carbodiimida, N- succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), N-succinimidil-3-(2-pirididitio)propionato (SPDP) e sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohaxano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (consulte, por exemplo, Karpovsky (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos por Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) n° 78, 118-132; Brennan (1985) Science 229:81-83), Glennie (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Quando as especificidades de ligação são anticorpos (por exemplo, dois anticorpos humanizado), eles podem ser conjugados através de ligação sulfidrila das regiões de dobradiça da terminação C das duas cadeias pesadas. Em certas realizações, a região de dobradiça pode ser modificada de modo a conter um número ímpar de resíduos de sulfidrila, por exemplo, um, antes da conjugação.

[00254] Em certas realizações, ambas as especificidades de ligação de um anticorpo biespecífico podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e montadas na mesma célula hospedeira. Esse método é especialmente útil quando a molécula biespecífica e muliespecífica é um MAb x MAb, MAb x Fab, Fab x F(ab’)2 ou ligante x proteína de fusão Fab. Em certas realizações, um anticorpo biespecífico da presente divulgação pode ser uma molécula de cadeia única, como um anticorpo biespecífico de cadeia única, uma molécula biespecífica de cadeia única que compreende um anticorpo de cadeia ou um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia única que compreende dois determinantes de ligação. Moléculas biespecíficas e muliespecíficas também podem ser moléculas de cadeia única ou podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia única. Métodos para preparar moléculas biespecíficas e multiespecíficas são descritos, por exemplo, na patente US 5.260.203, patente US 5.455.030, patente US 4.881.175, patente US 5.132.405, patente US 5.091.513, patente US 5.476.786, patente US 5.013.653, patente US 5.258.498 e patente US 5.482.858. Anticorpos elaborados geneticamente com três ou mais sítios de ligação ao antígeno funcionais (por exemplo, sítios de ligação ao epítopo) incluindo “anticorpos polvo”, também são incluídos no presente pedido (consulte, por exemplo, patente US 2006/0025576A1).

[00255] A presente divulgação fornece ainda anticorpos triespecíficos, por exemplo, trifuncionais. Por exemplo, e não a título de limitação, um anticorpo triespecífico da presente divulgação pode se ligar e/ou interagir com um epítopo presente em KLB, um epítopo presente em FGFR1 e um epítopo ou antígeno presente em uma terceira proteína como, mas não se limitando a, PCSK9, GCGR, AdipoR, ZnT8, ApoL1, MSTN, InsR ou FABP4.

[00256] Em certas realizações, um sistema animal pode ser usado para produzir um anticorpo da presente divulgação. Um sistema animal para preparar hibridomas é o sistema murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Protocolos de imunização e técnicas para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Parceiros de fusão (por exemplo, células de mieloma murino) e procedimentos de fusão também são conhecidos (consulte, por exemplo, Harlow e Lane (1988), Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor Nova York).

E. ENSAIOS

[00257] Os anticorpos da presente divulgação fornecidos no presente pedido podem ser identificados, selecionados ou caracterizados por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica e fornecidos no presente pedido.

1. ENSAIOS DE LIGAÇÃO E OUTROS ENSAIOS

[00258] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode ser testado quanto a sua atividade de ligação por métodos conhecidos, como ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), um radioimunoensaio (RIA) ou um ensaio Western Blot. Cada um desses ensaios geralmente detecta a presença dos complexos proteína-anticorpo de interesse específico empregando um reagente marcado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos KLB- anticorpo podem ser detectados com o uso de, por exemplo, um anticorpo ligado à enzima ou fragmento de anticorpo que reconhece e especificamente se liga aos complexos anticorpo-KLB. Alternativamente, os complexos podem ser detectados com o uso de qualquer uma de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser marcado radioativamente e usado em um radioimunoensaio (RIA) (consulte, por exemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, que é incorporado ao presente pedido como referência). O isótopo radioactivo pode ser detectado por esses meios como o uso de um contador Geiger ou um contador de cintilação ou por autoradiografia.

[00259] Em certas realizações, ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo que compete com um anticorpo anti-KLB da presente divulgação, por exemplo, 12A11 ou 8C5, para ligação a KLB. Em certas realizações, esse anticorpo de competição se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou um conformacional) que é ligado por 12A11 ou 8C5. Métodos exemplares detalhados para mapeamento de um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris (1996) “Epitope Mapping Protocols”, em Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ).

[00260] Em um exemplo não limitante de um ensaio de competição exemplar, o KLB imobilizado pode ser incubado em uma solução que compreende um primeiro anticorpo marcado que se liga a KLB (por exemplo, 12A11 ou 8C5) e um segundo anticorpo não marcado que é testado quanto à sua capacidade em competir com o primeiro anticorpo para ligação a KLB. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como um controle, o KLB imobilizado é incubado em uma solução que compreende o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após incubação sob condições que permitem ligação do primeiro anticorpo a KLB, o excesso de anticorpo não ligado é removido e a quantidade de marcador associado a KLB imobilizado é medida. Se a quantidade de marcador associado a KLB imobilizado é substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra de controle, então isso indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo quanto a ligação a KLB. Consulte Harlow e Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, capítulo 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).

2. ENSAIOS DE ATIVIDADE

[00261] A presente divulgação fornece ensaios para identificar anticorpos anti-KLB dos mesmos que têm atividade biológica. Atividade biológica pode incluir, por exemplo, ativar um complexo receptor KLB/FGFR1c. Também são fornecidos anticorpos que têm essa atividade biológica in vivo e/ou in vitro. Em certas realizações, a ensaios podem incluir anticorpos de ligação da presente divulgação às células, por exemplo, células 293T que expressam KLB e analisar a atividade e/ou estados de fosforilação de um ou mais alvos a jusante do complexo receptor KLB-FGFR1c, por exemplo, ERK. Em certas realizações, o ensaio pode incluir a administração de um anticorpo da presente divulgação a um sujeito, por exemplo, um animal não-humano, e analisar o efeito que o anticorpo tem sobre o nível de glicose no sujeito.

F. IMUNOCONJUGADOS

[00262] A matéria em questão atualmente divulgada ainda fornece imunoconjugados que compreendem um anticorpo, divulgado no presente pedido, conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, como agentes quimioterapêuticos ou drogas, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos das mesmas), ou isótopos radioativos. Por exemplo, um anticorpo ou porção de ligação ao antígeno da matéria em questão divulgada pode ser ligado de maneira funcional (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente ou de outra forma) a uma ou mais outras moléculas, como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação.

[00263] Em certas realizações, um imunoconjugado é um conjugado anticorpo-droga (ADC), no qual um anticorpo é conjugado a uma ou mais drogas incluindo, mas não se limitando a, um maitansinoide (consulte patentes US 5.208.020, 5.416.064 e patente europeia EP 0 425 235); uma auristatina como componentes droga monometilauristatina DE e DF (MMAE e MMAF) (consulte patentes US 5.635.483 e 5.780.588 e 7.498.298); uma dolastatina; uma caliqueamicina ou derivados das mesmas (consulte patentes US 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 e 5.877.296; Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); e Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)); uma antraciclina, como daunomicina ou doxorrubicina (consulte Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); e patente US 6.630.579); metotrexato; vindesina; um taxano como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel; um tricoteceno; e CC1065.

[00264] Em certas realizações, um imunoconjugado compreende um anticorpo, conforme descrito no presente pedido, conjugado a uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento da mesma, incluindo, mas não se limitando a, cadeia A de difteria, fragmentos ativos não ligantes de toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas da diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAP-S), inibidor de carantia momordica, curcina, crotina, inibidor Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.

[00265] Em certas realizações, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente pedido, conjugado a um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos não limitantes incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o radioconjugado é usado para detecção, esse pode incluir um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, tc99m ou I123, ou um marcador de spin para formação de imagem por ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como imagem por ressonância magnética, mri), como novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.

[00266] Conjugados de um anticorpo e agentes citotóxicos podem ser produzidos com o uso de uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionais (como dimetil adipimidato HCl), ésteres ativos (como disuccinimidil suberato), aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis-azido (como bis-(p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)- etilenediamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato) e compostos de flúor bis-ativo (como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). O ácido triamino penta-acético 1-isotiocianatobenzil- 3-metildietileno marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Consulte documento WO 94/11026. O ligante pode ser um “ligante clivável” que facilita a liberação de uma droga citotóxica na célula. Por exemplo, um ligante instável ácido, ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetil ou ligante que contém bissulfeto (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); patente US 5.208.020) pode ser usado.

[00267] Os imunoconjugados ou ADCs no presente pedido contemplam expressamente, mas não se limitam a, esses conjugados preparados com reagentes reticulantes incluindo, mas não se limitando a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4- vinilsulfona)benzoato) que são comercialmente disponíveis (por exemplo, junto à Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., E.U.A).

III. MÉTODOS DE USO

[00268] A matéria em questão atualmente divulgada fornece ainda métodos para uso dos anticorpos divulgados, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1c. Em certas realizações, os métodos são direcionados para usos terapêuticos dos anticorpos atualmente divulgados. Em certas realizações, os métodos são direcionados para o uso dos anticorpos divulgados nos métodos de diagnóstico.

A. MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO E DETECÇÃO

[00269] Em certas realizações, qualquer anticorpo divulgado no presente pedido que tem especificidade para KLB, por exemplo, um anticorpo anti-KLB e/ou um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 divulgado acima, pode ser útil para detectar a presença de KLB em uma amostra biológica. Em um aspecto adicional, a matéria em questão atualmente divulgada fornece métodos para diagnosticar e/ou detectar uma doença com o uso de um anticorpo anti-KLB ou um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, divulgado no presente pedido. O termo “detecção”, como usado no presente pedido, engloba detecção quantitativa e/ou qualitativa.

[00270] Em certas realizações não limitantes, uma amostra biológica inclui, mas não se limita a, uma amostra clínica, uma ou mais células, células em cultura, sobrenadantes celulares, lisados celulares e amostras de tecido. A fonte da amostra pode ser tecido sólido (por exemplo, de uma amostra de tecido fresco, congelado e/ou de órgão preservado, biópsia ou de aspiração) ou células do indivíduo. Em certas realizações, uma amostra biológica pode incluir uma ou mais células e/ou tecido de fígado, por exemplo, do fígado de um sujeito.

[00271] Em certas realizações, é fornecido um anticorpo anti-KLB para uso em um método para diagnóstico ou detecção. Em um aspecto adicional, é fornecido um método para detectar a presença de KLB em uma amostra biológica. Em certas realizações, o método de diagnóstico ou detecção inclui colocar uma amostra biológica em contato com um anticorpo que se liga um epítopo presente em KLB, conforme descrito no presente pedido, sob condições permissivas para ligação do anticorpo a KLB e detectar se um complexo é formado entre o anticorpo e KLB. Esse método pode ser um método in vitro ou in vivo, por exemplo, imunofluorescência ou Western blot. Em certas realizações, um anticorpo anti-KLB é usado para selecionar sujeitos elegíveis para terapia com um anticorpo anti-KLB, por exemplo, onde KLB é um biomarcador para seleção de pacientes.

[00272] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 para uso nos métodos divulgados não tem um impacto significativo sobre o fígado, por exemplo, função do fígado. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação não modula a atividade de um complexo receptor FGFR/KLB no fígado em comparação à modulação de um complexo receptor FGFR/KLB no fígado por uma proteína FGF21. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação não resulta na inibição do complexo FGFR4/KLB e/ou não resulta na elevação de enzimas do fígado como, mas não se limitando a, ALT, AST, ALP e GLDH. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação não funciona como um agonista do complexo FGFR2c/KLB e/ou o complexo FGFR3c/KLB no fígado, que pode levar a sinalização MAPK ativado e/ou expressão alterada de Spry4 e Dusp6 no fígado. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação não resulta na ativação de sinalização de MAPK no fígado em comparação à ativação de sinalização de MAPK por uma proteína FGF21. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação não funciona como um agonista do complexo FGFR4/KLB no fígado.

[00273] Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, para uso na nos métodos divulgados incluem anticorpos que não bloqueiam ligação e/ou interação dos ligantes FGF, por exemplo, FGF19 e FGF21 ao complexo KLB/FGFR1c. Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti- FGFR1 divulgado no presente pedido se refere a um anticorpo que modula atividade do complexo KLB/FGFR1c e não bloqueia a interação e/ou ligação dos ligantes FGF nativos, por exemplo, FGF19 e FGF21, ao complexo KLB/FGFR1c. Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti- FGFR1 divulgado no presente pedido refere-se a um anticorpo que não bloqueia a ligação e/ou atividade dos ligantes FGF nativos a um receptor de FGF na ausência de KLB. Por exemplo, e não a título de limitação, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 da presente divulgação não bloqueia a interação de ligantes FGF nativos com o complexo FGFR4/KLA ou FGFR1 sozinho. Em certas realizações, um anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 divulgado no presente pedido refere-se a um anticorpo que não bloqueia a ligação e/ou atividade de ligantes FGF a KLB na ausência de FGFR1. Por exemplo, e não a título de limitação, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 da presente divulgação não bloqueia a interação de ligantes FGF nativos com o complexo FGFR4/KLB, o complexo FGFR2c/KLB e/ou o complexo FGFR3c/KLB.

[00274] Em certas realizações, anticorpos anti-KLB, anti-FGFR1c e/ou anti-KLB/anti-FGFR1, por exemplo, anti-KLB/anti-FGFR1c, anticorpos biespecíficos para uso nos métodos divulgados podem ser marcados. Os marcadores incluem, mas não se limitam a, marcadores ou componentes que são detectados diretamente, como marcadores fluorescentes, cromofóricos, eletrodensos, quimioluminescentes e radioativos, bem como componentes, como enzimas ou ligantes, que são detectados indiretamente, por exemplo, através de uma reação enzimática ou interação molecular. Exemplos não limitantes de marcadores incluem os radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H e 131I, fluoróforos como os quelatos de terras raras ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, umbeliferona, luciferases, por exemplo, luciferase de vagalume e luciferase bacteriana (consulte patente US 4.737.456), luciferina, 2,3-desidroftalazinedionas, peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarídeos oxidases, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas como uricase e xantina oxidase, acopladas com uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um corante precursor como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de spin, marcadores bacteriófagos, radicais livres estáveis e similares.

B. MÉTODOS TERAPÊUTICOS

[00275] Em certas realizações, um ou mais anticorpos da matéria em questão atualmente divulgada podem ser usados para tratar uma doença e/ou disfunção em um sujeito. Por exemplo, mas não a título de limitação, a doença pode ser uma disfunção metabólica. Exemplos não limitante de disfunções metabólicas incluem síndrome do ovário policístico (PCOS), síndrome metabólica (MetS), obesidade, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), hiperlipidemia, hipertensão, diabetes tipo 2, diabetes não tipo 2, diabetes tipo 1, diabetes autoimune latente (LAD), e diabetes da maturidade com início na juventude (MODY). Em certas realizações, a disfunção metabólica é diabetes tipo 2. Em certas realizações, a disfunção metabólica é obesidade.

[00276] Em certas realizações, um ou mais anticorpos da matéria em questão atualmente divulgada podem ser usados para tratar síndrome de Bardet-Biedl, síndrome de Prader-Willi, síndrome de Alstrom, síndrome de Cohen, osteodistrofia hereditária de Albright (pseudohipoparatiroidismo), síndrome de Carpenter, síndrome de MOMO, síndrome de Rubinstein-Taybi, síndrome do X-frágil e síndrome de Borjeson-Forssman Lehman. Em certas realizações, um ou mais anticorpos da matéria em questão atualmente divulgada podem ser usados para tratar o envelhecimento e doenças relacionadas como doença de Alzheimer, doença de Parkinson e ALS.

[00277] Em certas realizações, um ou mais anticorpos da matéria em questão atualmente divulgada podem ser usados para tratar doença cardíaca, acidente vascular cerebral, ataques cardíacos, hiperinsulinemia, pressão arterial elevada, doença arterial coronária, enxaquecas ou dores de cabeça diretamente relacionadas à obesidade ou hipertensão craniana, insuficiência cardíaca congestiva, neoplasia, dislipidemia, anemia, doença da vesícula biliar, osteoartrite, artrite degenerativa, disco degenerativo, doença da articulação degenerativa, substituição de articulação, doença de articulação degenerativa acelerada, asma, pneumonia de repetição, pleurisia de repetição, bronquite de repetição, restrição pulmonar, reflexo gastroesofágico (GERD), excesso facial e pelos do corpo (hirsutismo), eczemas, infecções cutâneas crônicas, excesso de sudorese, infecções frequentes por levedura, incontinência urinária de estresse, irregularidade menstrual, anormalidades hormonais, ovários policísticos, infertilidade, carcinoma (por exemplo, mama, cólon e câncer uterino), apneia do sono, pseudotumor cerebral, depressão, disfunção psicológica/ sexual, discriminação social e a morte prematura de.

[00278] Em certas realizações, a presente divulgação fornece um anticorpo para uso em um método de tratamento. Por exemplo, e não a título de limitação, a presente divulgação fornece um anticorpo, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, para uso em um método para tratar um sujeito que tem uma disfunção metabólica, por exemplo, PCOS, MetS, obesidade, NASH, NAFLD, hiperlipidemia, hipertensão, diabetes tipo 2, diabetes não tipo 2, LAD, MODY, e envelhecimento e doenças relacionadas como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson e ALS, que Inclui administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um anticorpo divulgado no presente pedido. Em certas realizações, a presente divulgação fornece um anticorpo, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/FGFR1, para uso em um método para tratar um sujeito que tem uma doença ou disfunção descrita acima, que inclui administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva do anticorpo.

[00279] Em certas realizações, o método pode ainda incluir administrar ao sujeito uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional. Exemplos não limitantes de agentes terapêuticos adicionais, por exemplo, um segundo agente terapêutico, são descritos abaixo.

[00280] Em certas realizações, a presente divulgação fornece ainda um método para induzir a perda de peso que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade efetiva de um ou mais anticorpos da presente divulgação, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/FGFR1.

[00281] Um “indivíduo”, “paciente” ou “sujeito”, como usado no presente pedido, refere-se a um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas realizações, o indivíduo ou sujeito é um humano.

[00282] A matéria em questão atualmente divulgada fornece ainda um anticorpo, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, para uso na ativação de um complexo correceptor KLB/FGFR1c, por exemplo, em um sujeito. Por exemplo, e não a título de limitação, o anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 pode ser um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti- FGFR1c. Em certas realizações, a presente divulgação fornece um anticorpo, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, para uso em um método de ativação de um complexo correceptor KLB/FGFR1c, por exemplo, em um sujeito. Em certas realizações, o método inclui administrar ao sujeito uma quantidade efetiva do anticorpo para ativar um complexo receptor KLB/FGFR1c.

[00283] Anticorpos da presente divulgação podem ser usados tanto sozinhos como em combinação com outros agentes em uma terapia. Por exemplo, e não a título de limitação, um anticorpo da presente divulgação pode ser coadministrado com pelo menos um agente terapêutico adicional. Em certas realizações, o segundo/agente terapêutico adicional pode incluir um agente anti-diabético, um agente anti-obesidade ou uma medicação para condições metabólicas como, mas não se limitando a, medicações anti- hipertensivas e estatinas. Exemplos não limitantes de um segundo/agente terapêutico adicional incluem metformina, pioglitazona, DPP4i, análogos de GLP1, sulfonilureia, insulina, análogos de leptina e lorcaserina (por exemplo, BELVIQ®).

[00284] A presente divulgação fornece ainda o uso de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 na fabricação ou preparação de um medicamento. Em certas realizações, o medicamento é para tratamento de uma disfunção metabólica, conforme divulgado acima. Em certas realizações, a presente divulgação fornece o uso de um anticorpo na fabricação de um medicamento para o tratamento da obesidade. Em certas realizações, a presente divulgação fornece o uso de um anticorpo na fabricação de um medicamento para o tratamento de diabetes tipo 2. Em certas realizações, o método ainda compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, conforme descrito no presente pedido. Em certas realizações, o medicamento é para ativar um complexo correceptor KLB/FGFR1c. Em certas realizações, o medicamento pode ser usado em um método para ativar um complexo correceptor KLB/FGFR1c em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade do medicamento efetivo para ativar um complexo receptor KLB/FGFR1c.

[00285] Em certas realizações, um anticorpo para uso nos métodos terapêuticos divulgados pode estar presente em uma composição farmacêutica. Em certas realizações, a composição farmacêutica pode incluir um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certas realizações, a composição farmacêutica pode incluir um ou mais dos anticorpos da presente divulgação.

[00286] Adicionalmente ou alternativamente, a composição farmacêutica pode incluir um segundo agente terapêutico. Quando um ou mais dos anticorpos divulgados são administrados com outro agente terapêutico, um ou mais anticorpos e outros agentes terapêuticos podem ser administrados em qualquer ordem ou simultaneamente. Essas terapias de combinações apontadas acima englobam administração combinada (quando dois ou mais agentes terapêuticos estão incluídos na mesma formulação ou separados), e administração separada, nesse caso, a administração do anticorpo da presente divulgação pode ocorrer antes, simultaneamente e/ou após a administração do agente ou agentes terapêuticos adicionais. Em uma realização, a administração de um anticorpo da presente divulgação e administração de um agente terapêutico adicional ocorrem dentro de cerca de um mês, ou dentro de cerca de uma, duas ou três semanas, ou dentro de cerca de um, dois, três, quatro, cinco ou seis dias, uma da outra.

[00287] Um anticorpo da presente divulgação (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por quaisquer meios adequados, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal, e se desejado, para tratamento local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração por via intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer rota adequada, por exemplo, por injeções, como injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte, se a administração é breve ou contínua. Várias programações de dosagem incluindo, mas não se limitando a, administrações únicas ou múltiplas durante vários pontos no tempo, administração em bolus e infusão de pulso são contempladas no presente pedido.

[00288] Anticorpos da presente divulgação seriam formulados, dosados e administrados de um modo consistente com as boas práticas médicas. Os fatores para consideração nesse contexto incluem a disfunção específica a ser tratada, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica de cada paciente, a causa da disfunção, o local de distribuição do agente, o método de administração, a programação de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos especialistas. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar a disfunção em questão. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de disfunção ou tratamento e dos outros fatores discutidos acima. Esses são geralmente usados nas mesmas dosagens e com rotas de administração conforme descritas no presente pedido, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente pedido, ou em qualquer dosagem e por qualquer rota que seja empiricamente/clinicamente determinada a ser apropriada.

[00289] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da presente divulgação (quando usado sozinho ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, da severidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapias prévias, o histórico clínico do paciente e a resposta ao anticorpo, e do diagnóstico do médico. Em certas realizações, um anticorpo da presente divulgação pode ser administrado com base na necessidade. Em certas realizações, o anticorpo pode ser administrado ao paciente de uma vez ou ao longo de uma série de tratamentos. Por exemplo, mas não a título de limitação, o anticorpo e/ou formulação farmacêutica que contém um anticorpo, conforme divulgado no presente pedido, podem ser administrados a um sujeito duas vezes por dia, uma vez por dia, uma vez a cada dois dias, uma vez a cada três dias, uma vez a cada quatro dias, uma vez a cada cinco dias, uma vez a cada seis dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, uma vez a cada seis meses ou uma vez por ano.

[00290] Em certas realizações, dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,1 mg/kg a 10 mg/kg) de anticorpo pode ser uma dosagem candidata inicial para administrar ao paciente, por exemplo, tanto por uma ou mais administrações separadas como por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Em certas realizações, a dose diária pode ser maior que cerca de 100 mg/kg. Em certas realizações, a dosagem pode ser ajustada para obter uma concentração de anticorpos no plasma de 1 a 1000 μg/mL e em alguns métodos 25 a 300 μg/mL.

[00291] Para administrações repetidas no decorrer de vários dias ou mais tempo, dependendo da condição, o tratamento geralmente poderia ser mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo seria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Em certas realizações, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administradas ao paciente. Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, no caso em que a administração menos frequente é necessária. A dosagem e a frequência podem variar com base na meia-vida do anticorpo no paciente. Em certas realizações, essas doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, de modo que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Pode ser administrada uma dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas.

[00292] Em certas realizações, o método pode ainda incluir o monitoramento do sujeito e determinar a eficácia do tratamento. Por exemplo, o progresso dessa terapia pode ser facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.

IV. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS

[00293] A matéria em questão atualmente divulgada fornece ainda formulações farmacêuticas contendo um ou mais anticorpos, conforme descrito no presente pedido, com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em certas realizações, as composições farmacêuticas podem incluir uma combinação de múltiplos anticorpos (por exemplo, dois ou mais) e/ou porções de ligação ao antígeno dos mesmos da matéria em questão atualmente divulgada. Em certas realizações, uma composição farmacêutica da presente divulgação pode incluir um ou mais anticorpos biespecíficos anti-KLB/anti-FGFR1.

[00294] Em certas realizações, as formulações farmacêuticas divulgadas podem ser preparadas combinando um anticorpo que tem o grau desejado de pureza com um ou mais veículos opcionais farmaceuticamente aceitáveis (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. Ed. (1980)), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Por exemplo, mas não a título de limitação, formulações de anticorpos liofilizadas são descritas na patente US 6.267.958. Em certas realizações, as formulações de anticorpos aquosas podem incluir as descritas na patente US 6.171.586 e no documento WO 2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão acetato de histidina. Em certas realizações, o anticorpo pode ter uma pureza maior que cerca de 80%, maior que cerca de 90%, maior que cerca de 91%, maior que cerca de 92%, maior que cerca de 93%, maior que cerca de 94%, maior que cerca de 95%, maior que cerca de 96%, maior que cerca de 97%, maior que cerca de 98%, maior que cerca de 99%, maior que cerca de 99,1%, maior que cerca de 99,2%, maior que cerca de 99,3%, maior que cerca de 99,4%, maior que cerca de 99,5%, maior que cerca de 99,6%, maior que cerca de 99,7%, maior que cerca de 99,8% ou maior que cerca de 99,9%.

[00295] Veículos farmaceuticamente aceitáveis geralmente são não tóxicos para receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem, mas não se limitam a: tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, butila ou álcool benzílico, alcila parabenos, como metila ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3- pentanol e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; formação de sais de contra íons como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos como polietileno glicol (PEG). Veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplares no presente pedido ainda incluem agentes de dispersão de drogas intersticiais como glicoproteínas hialuronidase neutra ativa solúvel (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas hialuronidase PH-20 solúvel humana, como rHuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplares e métodos de uso, incluindo rHuPH20, são descritos nas publicações de patentes US 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais como condroitinases.

[00296] O veículo pode ser adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da rota de administração, o composto ativo, isto é, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

[00297] Composições farmacêuticas da presente divulgação também podem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Em certas realizações, composições farmacêuticas divulgadas no presente pedido também podem conter mais ingredientes ativos conforme necessário para a indicação específica sendo tratada, por exemplo, aqueles com atividades complementares que não afetam contrariamente um ao outro. Em certas realizações, a formulação farmacêutica pode incluir um segundo ingrediente ativo para tratar a mesma doença tratada pelo primeiro terapêutico. Esses ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são efetivas para o propósito pretendido. Por exemplo, e não a título de limitação, a formulação da presente divulgação também pode conter mais de um ingrediente ativo conforme necessário para a indicação específica a ser tratada, preferencialmente aquelas com atividades complementares que não afetem contrariamente uma a outra. Por exemplo, pode ser desejável fornecer ainda um segundo terapêutico útil para tratamento da mesma doença. Esses ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são efetivas para o propósito pretendido.

[00298] Uma composição da presente divulgação pode ser administrada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica. A rota e/ou modo de administração variam dependendo dos resultados desejados. Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegem o composto contra liberação rápida, como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de distribuição de microencapsulados. Podem ser usados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido poliláctico. Muitos métodos para a preparação dessas formulações são descritos por exemplo, em Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova York, 1978. Em certas realizações, as composições farmacêuticas são fabricadas sob condições de Boas Práticas de Fabricação (BPF) da U.S. Food and Drug Administration.

[00299] Preparações de liberação sustentada que contêm um anticorpo divulgado também podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, cujas matrizes estão sob a forma de artigos modelados, por exemplo, filmes ou microcápsulas. Em certas realizações, os ingredientes ativos podem ser encapsulados em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de droga coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são divulgadas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. Ed. (1980).

[00300] Para administrar um anticorpo da presente divulgação por certas rotas de administração, pode ser necessário revestir o composto ou coadministrar o composto com um material que evite sua inativação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um sujeito em um veículo adequado, por exemplo, lipossomos ou um diluente. Os diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções tampão salinas e aquosas. Lipossomos incluem emulsões água em óleo em água CGF, bem como lipossomos convencionais (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7:27).

[00301] Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós-estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersões. O uso desses meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, o uso do mesmo nas composições farmacêuticas da presente divulgação é contemplado. Os compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.

[00302] Composições terapêuticas devem ser tipicamente estéreis, substancialmente isotônicas e estáveis sob condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossomo ou outras estruturas ordenadas úteis para alta concentração da droga. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propilenoglicol e polietileno glicol liquído, e similares) e misturas adequadas dos mesmos. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento como lecitina, pela manutenção do tamanho da partícula exigida no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Em muitos casos, é preferencial incluir na composição agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser produzida pela inclusão de um agente na composição que atrasa a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

[00303] Soluções estéreis injetáveis podem ser preparadas por incorporação de um ou mais anticorpos divulgados na quantidade necessária em um solvente apropriado com uma ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme necessário, seguido por esterilização, microfiltração, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis. Geralmente, dispersões são preparadas por incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e o necessário de outros ingredientes daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferenciais de preparação são secagem a vácuo ou criodessecação (liofilização) que produzem um pó de ingrediente ativo e mais qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada-filtrada da mesma.

[00304] Composições terapêuticas também podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, uma composição terapêutica da presente divulgação pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmica sem agulha, como dispositivos divulgados, por exemplo, nas patentes US 5.399.163, 5.383.851, 5.312.335, 5.064.413, 4.941.880, 4.790.824, ou 4.596.556. Exemplos de implantes e módulos úteis na presente divulgação incluem: patente US 4.487.603, que divulga uma bomba de microinfusão implantável para dispensação de medicação a uma taxa controlada; patente US 4.486.194, que divulga um dispositivo terapêutico para administrar medicação através da pele; patente US 4.447.233, que divulga uma bomba de infusão de medicação para a distribuição de medicação a uma taxa de infusão precisa; patente US 4.447.224, que divulga um aparelho para infusão implantável de fluxo variável para distribuição contínua de droga; patente US 4.439.196, que divulga um sistema osmótico de distribuição de droga que tem compartimentos multicâmaras; e patente US 4.475.196, que divulga um sistema osmótico de distribuição de droga. Muitos outros desses implantes, sistemas de distribuição e módulos são conhecidos.

[00305] Para as composições terapêuticas, formulações da presente divulgação incluem aquelas adequadas para administração oral, nasal, tópica (incluindo bucal e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral. As formulações podem ser apresentadas de maneira conveniente em dosagem unitária e podem ser preparadas por quaisquer métodos conhecidos na técnica farmacêutica. A quantidade de anticorpo, que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem única, varia dependendo do sujeito sendo tratado, e o modo de administração específico. A quantidade do anticorpo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma única forma de dosagem geralmente será aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, fora de um percentual de cem, essa quantidade varia de cerca de 0,01 por cento a cerca de noventa e nove por cento de ingrediente ativo, de cerca de 0,1 por cento a cerca de 70 por cento, ou de cerca de 1 por cento a cerca de 30 por cento.

[00306] Formas de dosagem para a administração tópica ou transdérmica de composições da presente divulgação incluem pós, sprays, pomadas, pastas, cremes, loções, géis, soluções, emplastros e inalantes. O composto ativo pode ser misturado sob condições estéreis com um veículo farmaceuticamente aceitável, e com quaisquer conservantes, tampões ou propulsores que podem ser necessários.

[00307] As frases “administração parenteral” e “parentalmente administrada” significam modos de administração, exceto administração enteral e tópica, geralmente por injeção e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinhal, epidural e intrasternal.

[00308] Essas composições farmacêuticas também podem conter adjuvantes como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microrganismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização, acima e pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e similares. Também pode ser desejável incluir agentes isotônicos, como açúcares, cloreto de sódio e similares nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser trazida pela inclusão de agentes que retardam a absorção, como monoesterato de alumínio e gelatina.

[00309] Em certas realizações, quando os anticorpos da presente divulgação são administrados como farmacêuticos, para humanos e animais, eles podem ser administrados sozinhos ou como uma composição farmacêutica contendo, por exemplo, de cerca de 0,01% a cerca de 99,5% (ou cerca de 0,1 acerca de 90%) de um anticorpo, descrita no presente pedido, em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

V. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

[00310] A matéria em questão atualmente divulgada refere-se ainda a artigos de fabricação que contêm materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico das disfunções descritas acima.

[00311] Em certas realizações, o artigo de fabricação inclui um recipiente e um rótulo, ou uma bula associada ao recipiente. Exemplos não limitantes de recipientes adequados incluem garrafas, frascos, siringas, bolsas para solução IV, etc. Os recipientes podem ser fabricados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente pode conter uma composição que é por si mesma ou combinada com outra composição, eficaz para tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa perfurável para uma agulha de injeção hipodérmica).

[00312] Em certas realizações, pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da matéria em questão atualmente divulgada. O rótulo ou bula indicam podem indicar que a composição é usada para tratar a condição recomendada.

[00313] Em certas realizações, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um anticorpo da presente divulgação; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um agente citotóxico adicional ou de outro modo um agente terapêutico. Em certas realizações, o artigo de fabricação pode, além disso, compreender uma bula indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição específica.

[00314] De maneira alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode, ainda, compreender um recipiente adicional, por exemplo, um segundo ou terceiro recipiente, incluindo um tampão farmaceuticamente aceitável, como, mas não se limitando a, água bacteriostática para injeção (BWFI), fosfato tamponado salino, solução de Ringer e solução de dextrose. O artigo de fabricação pode incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.

[00315] Os exemplos a seguir são meramente ilustrativos da matéria em questão atualmente divulgada e não devem ser considerados como limitações de forma alguma.

EXEMPLOS EXEMPLO 1 CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS AGONISTAS ANTI-FGFR1

[00316] Foram anteriormente descritos três fagos derivados de anticorpos anti-FGFR1, YW182.2 (também citado no presente pedido como “R1MAb1”), YW182.3 (também citado no presente pedido como “R1MAb2”), e YW182.5 (também citado no presente pedido como “R1MAb3”) (documento WO 2012/158704, incorporado ao presente pedido como referência)). Cada um dos três anticorpos atua como um agonista seletivo para FGFR1 potente e exibiu propriedades sensibilizantes à insulina em camundongos.

[00317] Para compreender mais essa atividade agonística, a capacidade dos fragmentos Fab desses anticorpos para tornar agonista o FGFR1 foi testada. Células HEK293 foram cultivadas em meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) + soro bovino fetal 10% (FBS), e transfectadas de forma temporária com vetores de expressão que codificam luciferase de Renilla (pRL-SV40, Promega), FGFR1c, um ativador transcricional (pFA2-Elk1 ou pFA2-CREB, Stratagene), e uma luciferase repórter de vagalume dirigida por sítios de ligação GAL4 (pFR-luc, Stratagene), com o uso de Reagente de Transfecção FUGENE® HD (Roche). No dia seguinte, as células transfectadas foram cultivadas por 6 a 8 horas adicionais em meio livre de soro e IgG YW182.5 e cada um das YW182.2, YW182.3 e YW182.5 foram testadas em concentrações crescentes. A atividade da luciferase celular foi determinada com o uso do DUAL-GLO® Luciferase Assay System (Promega) e do ENVISION® Multilabel Reader (PerkinElmer). A atividade da luciferase de vagalume foi normalizada para a atividade da luciferase de Renilla coexpressa. De forma surpreendente, YW182.2 Fab, mas não Fab YW182.3 ou Fab YW182.5, exibiu atividade agonística (Figura 1A).

[00318] A Figura 1B representa os experimentos de competição de ligação que foram realizados para explorar a base para a diferença na ativação de FGFR1 por um Fab YW182.2 e um Fab YW182.3. YW182.2 foi ainda caracterizado em comparação a YW182.3, que tem afinidade mais alta, e em comparação ao anticorpo anti-FGFR1 de afinidade menor, YW182.5. Tanto YW182.2 como YW182.3 competiram com YW182.5 para a ligação ao domínio extracelular de FGFR1 (ECD), indicando que todos os 3 anticorpos reconhecem uma região de sobreposição de FGFR1. No entanto, conforme mostrado na Figura 1B, a afinidade relativa de YW182.5 foi significativamente mais fraca (IC50 > 30 vezes) do que de YW182.2 e YW182.3.

[00319] A Figura 2A representa as afinidades de ligação dos anticorpos anti-FGFR1, YW182.2 e YW182.3, para FGFR1b e FGFR1c. A afinidade dos anticorpos anti-FGFR1 foi determinada para avaliar se diferenças na afinidade dos anticorpos anti-FGFR1 explicam as diferenças observadas na atividade agonística. As afinidades de ligação dos Fabs para FGFR1b ou FGFR1c com o uso de um instrumento BIACORE® T100 foi realizada conforme descrito em Liang et al. J. Mol. Biol. 366(3): 815-29 (2007), com as seguintes modificações. O anticorpo anti-Fc humano de camundongo foi primeiro revestido em um chip CM5 de dextrano carboximetilado BIAcore com o uso de acoplamento direto a grupos amino seguindo um procedimento descrito pelo fabricante. YW182.2 ou YW182.3 foi então capturado em chips biossensor CM5 para atingir aproximadamente 200 unidades de resposta (RU). Foram executadas medições de ligação com o uso de um tampão de corrida de HEPES 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, surfactante P20 0,005% (tampão de HBS-P). Uma diluição em série de 2 vezes de proteína ECD-His FGFR1c foi injetada em uma faixa de 1.5 a 50 nM em tampão HBS P a uma taxa de fluxo de 30 μL/minuto a 25°C. Taxas de associação (Kon, por mol/s) e taxas de dissociação (Koff, por s) foram calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir um para um simples (programa de computação Evaluation Biacore versão 3.2). O equilíbrio da constante de dissociação (Kd, por mol) foi calculado como a razão de Koff / Kon. Conforme mostrado na Figura 2A, as afinidades de YW182.2 e YW182.3 foram observadas como sendo muito similares, indicando que a afinidade não poderia explicar a diferença entre as atividades agonísticas dos dois anticorpos.

[00320] A Figura 2B mostra a capacidade de YW182.5 (R1MAb3) para interagir especificamente com FGFR1. De forma similar, YW182.2 e YW182.3, YW182.5 mostraram ligação específica a FGFR1 por ELISA (Figura 2B).

[00321] A Figura 2C representa a atividade agonística de YW182.5 para vários FGFRs nas células L6 com o uso de um GAL-ELK1 (fator de transcrição1 similar ao ETS) com base no ensaio de luciferase Para o ensaio de luciferase, HEK293T ou células L6 de rato foram transfectados temporariamente com vetores de expressão que codificam receptores apropriados sob o promotor CMV, luciferase de Renilla (pRL-SV40, Promega), fusão de ativador transcricional GAL-ELK1 (pFA2-ELK1, Agilent) e uma luciferase repórter de vagalume dirigida por sítios de ligação GAL4 (pFR-luc, Agilent), com o uso do Reagente de Transfecção FuGENE HD (Promega). No dia seguinte, as células transfectadas foram cultivadas por 6 as 8 horas adicionais em meio baseado em DMEM livre de soro contendo ligantes proteicos apropriados em várias concentrações. A atividade da luciferase celular foi determinada com o uso do Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega) e do EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer). A atividade da luciferase de vagalume foi normalizada para a atividade da luciferase de Renilla coexpressa e mostrada como média ± SEM. Similar ao YW182.2 e YW182.3, YW182.5 atuou como um agonista específico para FGFR1 nas células L6 (Figura 2C).

[00322] A atividade agonística de YW182.5 foi ainda testada em células HEK293 com o uso do ensaio de luciferase baseado em GAL-ELK1 descrito acima. Conforme mostrado na Figura 2D, YW182.5 também atuou como um agonista específico para FGFR1c no ensaio de luciferase baseado em GAL-ELK1 nas células HEK293.

[00323] A Figura 2E mostra o efeito de YW182.5 nos níveis de glicose no sangue em um modelo de camundongo diabético. Para determinar os níveis de glicose no sangue, os camundongos foram adquiridos junto ao Jackson Laboratory e mantidos em um biotério livre de patógenos a 21°C sob um ciclo padrão de 12 h luz/12 h escuro com acesso à comida (LABDIET® 5010) e água à vontade. Os camundongos db/db de antecedente C57BLKS/J eram fêmeas e os outros camundongos eram todos machos. Para alimentação com dieta rica em gordura, uma dieta rica em carboidratos (Harlan Teklad TD.03584, 58,4% de calorias de gordura) foi usada. Os níveis de fosfato inorgânico e cálcio foram determinados por COBAS INTEGRA® 400 Chemistry Analyzer (Roche). Os níveis de FGF23 de soro foram determinados por ELISA (Immutopics). Os níveis de glicose no sangue foram determinados pelo medidor de glicose CONTOUR® (Bayer). Para a análise lipídica hepática, o kit de quantificação de triglicerídeos (MBL International) foi usado. O colesterol total do soro, triglicerídeos, β-hidroxibutirato (Thermo DMA) e ácidos graxos livres (Roche) foram determinados por ensaios colorimétricos. O ELISA foi usado para determinar os níveis de insulina no soro (Crystal Chem), FGF23 no soro (Immunotopics), adiponectina HMW de camundongo no soro (Alpco) e adiponectina HMW de macaco no soro (R&D systems). A corticosterona foi medida por radioimunoensaio (Vanderbilt Hormone Assay & Analytical Services Core). Todos os camundongos usados para injeção tinham por volta de 2 a 4 meses de idade, exceto camundongos deficientes em klb, que foram usados em determinados experimentos em 7 a 8 meses de idade. De uma forma similar a YW182.2 e YW182.3, os níveis de glicose no sangue normalizaram YW182.5 quando injetados em camundongos diabéticos ob/ob (Figura 2E).

EXEMPLO 2 MAPEAMENTO DE EPÍTOPO DE ANTICORPOS ANTI-FGFR1

[00324] O FGFR1 ECD consiste em três domínios similares a lg denominados D1 a D3. Conforme mostrado na Figura 1C, dois peptídeos sem sobreposição (P26: KLHAVPAAKTVKFKCP (SEQ ID NO: 143) e P28: FKPDHRIGGYKVRY (SEQ ID NO: 144) estão presentes dentro do domínio D2 de FGFR1 e foram anteriormente identificados que se ligam a ambos YW182.2 e YW182.3 (documento WO 2012/158704, incorporado ao presente pedido como referência).

[00325] Para identificar quais resíduos nesses peptídeos são mais responsáveis pela ligação do anticorpo, proteínas FGFR1 inteiras com várias substituições de alanina dentro das regiões de epítopo identificadas foram expressas em células HEK293 e testadas quanto à ligação de anticorpos por Western blot. Conforme mostrado na Figura 1D, a substituição da alanina em K175, K177, Y205, R208, eliminou a ligação de YW182.2 e YW182.5, sem afetar a expressão conforme sondado pelo anti-FGFR1 contra o domínio D1 (anti-D1). A ligação de YW182.3 foi eliminada por R208A, mas não pelas substituições K175, K177 ou Y205.

[00326] A capacidade dos anticorpos para ativar os mutantes de substituição da alanina de FGFR1 in vivo foi testada com o uso do ensaio GAL- ELK1 descrito acima. Descobriu-se que a ativação foi bem correlacionada com as propriedades de ligação desses mutantes para cada anticorpo anti-FGFR1 (Figura 1E). Esses resultados sugerem que um conjunto similar de aminoácidos dentro do domínio D1 são necessários para a ligação de YW182.2 e YW182.5 com uma afinidade, embora diferente, enquanto que um conjunto distinto de aminoácidos na mesma região é importante para ligação de YW182.3.

[00327] As estruturas cristalinas do complexo 2:2 FGFR ECD/FGF foram descritas anteriormente (Plotnikov et al. Cell 98(5): 641-50 (1999)). Nas estruturas FGFR1c ECD/FGF2 homodiméricas 2:2, um domínio D2 interage com outro domínio D2, com cada FGF2 se ligando a ambos os domínios D2 de ambos os lados para estabilizar o dímero D2 (Figura 1F). Nessas estruturas, as substituições de alanina importantes para ligação de YW182.2 e YW182.5 (K175, K177, Y205 e R208) estão situados dentro do dímero D2. Visto que Fab YW182.2 atua como um agonista, sugere-se que YW182.2 Fab pode se ligar simultaneamente aos dois domínios D2 da lateral para estabilizar o dímero D2, atuando essencialmente como um mimético molecular de ligantes FGF. Com base na análise de substituição de alanina, Fab YW182.5 Fab pode se ligar de forma similar, exceto que a afinidade é muito menor do que Fab YW182.2.

EXEMPLO 3 ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-KLB

[00328] Camundongos Balb/c foram imunizados com células HEK293 que expressam de forma estável proteína hFGFR1 e hKLB. Baços foram coletados após 12 semanas e hibridomas foram gerados. Hibridomas que produzem anticorpos anti-hKLB foram identificados por análise FACS com o uso de células HEK293 usadas para imunização. Resumidamente, células 293 que expressam hKLB sozinho, hFGFR1 sozinho, ou ambos, foram corados com sobrenadante de hibridoma diluído e o anticorpo lgG anti-camundongo de cabra conjugado com PE (Jackson Labs) e tampão FACS (BSA 0,5% em PBS). O mesmo tampão FACS foi usado para lavar as células coradas. As células coradas foram analisadas por programa de computação de análise FACScan (Becton Dickinson) e FlowJo FACS (Three Star). cDNA que codifica a cadeia pesada e a cadeia leve de lgG foi clonado em vetores de expressão. Todas as moléculas de anticorpo monoclonal recombinante foram produzidas em células de ovário de hamster chinês (CHO) transfectadas temporariamente e purificadas com o uso de cromatografia de coluna convencional.

[00329] Aproximadamente 20 diferentes hibridomas que produzem anticorpos anti-KLB foram identificados. As sequências de cadeia leve e cadeia pesada CDR para 16 desses anticorpos anti-KLB são mostradas nas Tabelas 2 e 3. As sequências de cadeia leve de 16 desses anticorpos anti- KLB junto com 8C5 são mostradas na Figura 3A (11F1, 6D12, 11D4, 8E1, 46C3, 8H7, 21H3, 25F7, 14E6, 14C6, 24A1, 5F8, 6C1, 12A1, 12B8, 14C10 e 8C5; SEQ ID NOs: 111-127, respectivamente).

[00330] As sequências de cadeia pesada de 16 desses anticorpos anti-KLB junto com 8C5 são mostradas na Figura 3B (11F1, 6D12, 11D4, 8E1, 46C3, 8H7, 21H3, 25F7, 14E6, 14C6, 24A1, 5F8, 6C1, 12A1, 12B8, 14C10 e 8C5; SEQ ID NOs: 94-110, respectivamente). TABELA 2 SEQUÊNCIAS H DE CDR PARA ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-KLB MURINOS

TABELA 3 SEQUÊNCIAS L DE CDR PARA ANTICORPOS MONOCLONAIS ANTI-KLB MURINOS

[00331] A maioria dos anticorpos anti-KLB derivados de hibridoma juntamente com um anticorpo derivado de fago (designado Ph#5, que foi obtido por panning de fago com o uso de proteína hKLB-ECD-HIS recombinante (R&D Systems)) foram classificados com base na mudança de mediana observada no gráfico de FACS em 0,8 μg/mL medindo a ligação dos anticorpos a 293 células que expressam hKLB (Figura 4).

[00332] Além disso, alguns dos anticorpos foram classificados por ELISA. Para esses experimentos, anticorpos anti-KLB que eram IgG recombinante quimérica com regiões variáveis murinas e regiões constantes hIgG1 foram usados para medir a ligação à proteína hKLB-ECD-HIS. A ligação relativa dos anticorpos testados foi similar exceto para 14E6, que pareceu ligar- se melhor sob as condições de ELISA do que na análise de FACS (Figura 5).

EXEMPLO 4 LIGAÇÃO A KLB DE ANTICORPOS ANTI-KLB

[00333] Para testar competição entre vários anticorpos anti-KLB, foi usado ELISA. Em alguns experimentos, anticorpos IgG purificados a partir de sobrenadantes de hibridoma que correspondem a 6D12, 8C5 e 11F1 foram biotinilados com o uso do Kit EZ-link NHS-PEO Solid Phase Biotinylation (Pierce). Ligação a proteína KLB-ECD-HIS foi testada com o uso de estreptavidina conjugada a HRP na presença de várias concentrações de anti- KLB derivado de hibridoma. Em alguns experimentos, a ligação de IgG humana recombinante à proteína KLB-ECD-HIS foi testada com o uso de IgG antihumana conjugada a HRP (Jackson ImmunoResearch Inc.) na presença de várias concentrações de anti-KLB derivado de hibridoma. Observou-se que nenhum dos 11F1, 11D4, 8E1 e 46C3 compete com 6D12 quanto a ligação (não foram testados outros contra 6D12). Anticorpos anti-KLB 14E6 e 12A11 competem quanto a ligação com 8C5, mas 11D4 e 14C10 não (não foram testados outros contra 8C5) e 11D4 compete quanto a ligação com 11F1, mas 6D12, 8E1 e 46C3 (não foram testados outros contra 11F1).

EXEMPLO 5 REATIVIDADE CRUZADA DE ESPÉCIES CRUZADAS DE ANTICORPOS ANTI-KLB

[00334] A reatividade cruzada de espécies dos anticorpos anti- KLB divulgados foi analisada por análise de FACS com o uso de cDNA de KLB de camundongo, rato, coelho, macaco cinomolgos e macacos rhesus clonado em vetores de expressão de mamíferos pRK temporariamente transfectados em células HEK293T. As sequências de polipeptídeos de domínio extracelular de KLB que foram expressas são da seguinte forma:

CAMUNDONGO

[00335] FSGDGKAIWDKKQYVSPVNPSQLFLYDTFPKNFSWGVGT GAFQVEGSWKTDGRGPSIWDRYVYSHLRGVNGTDRSTDSYIFLEKDLLALDFLG VSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAQGLRYYRALLDSLVLRNIEPIVTLYHWDLPLT LQEEYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAWHGFGTGMH APGEKGNLTAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSITLGSHWIEPNR TDNMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTGAMIPEFSEAEKEEVRG TADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLNWIKLEYDDPQILISENGWF TDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFDEIRVFGYTAWTLLDGFEWQDAYTTRR GLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYKQIIQDNGFPLKESTPDMKGRFPCDFSWGVT ESVLKPEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGNRLLYRVEGVRLKTRPSQCTDYVSIKKR VEMLAKMKVTHYQFALDWTSILPTGNLSKVNRQVLRYYRCVVSEGLKLGVFPMV TLYHPTHSHLGLPLPLLSSGGWLNMNTAKAFQDYAELCFRELGDLVKLWITINEP NRLSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGAVSLSLHCDWA EPANPFVDSHWKAAERFLQFEIAWFADPLFKTGDYPSVMKEYIASKNQRGLSSS VLPRFTAKESRLVKGTVDFYALNHFTTRFVIHKQLNTNRSVADRDVQFLQDITRLS SPSRLAVTPWGVRKLLAWIRRNYRDRDIYITANGIDDLALEDDQIRKYYLEKYVQE ALKAYLIDKVKIKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFRAKSSVQFYSKLISSSGLPAE NRSPACGQPAEDTDCTICSFLV (SEQ ID NO: 158).

RATO (+N-TER FLAG)

[00336] DYKDDDDKLEFSGDGKAIWDKKQYVSPVNPGQLFLYDTF PKNFSWGVGTGAFQVEGSWKADGRGPSIWDRYVDSHLRGVNSTDRSTDSYVF LEKDLLALDFLGVSFYQFSISWPRLFPNGTVAAVNAKGLQYYRALLDSLVLRNIEPI VTLYHWDLPLTLQEEYGGWKNATMIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLV AWHGFGTGMHAPGEKGNLTAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYDKNFRPHQKGWLSI TLGSHWIEPNRTENMEDVINCQHSMSSVLGWFANPIHGDGDYPEFMKTSSVIPE FSEAEKEEVRGTADFFAFSFGPNNFRPSNTVVKMGQNVSLNLRQVLNWIKLEYD NPRILISENGWFTDSYIKTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIKFDEIQVFGYTAWTLLDG FEWQDAYTTRRGLFYVDFNSEQKERKPKSSAHYYKQIIQDNGFPLQESTPDMKG QFPCDFSWGVTESVLKPEFTVSSPQFTDPHLYVWNVTGNRLLYRVEGVRLKTRP SQCTDYVSIKKRVEMLAKMKVTHYQFALDWTSILPTGNLSKINRQVLRYYRCVVS EGLKLGISPMVTLYHPTHSHLGLPMPLLSSGGWLNTNTAKAFQDYAGLCFKELGD LVKLWITINEPNRLSDMYNRTSNDTYRAAHNLMIAHAQVWHLYDRQYRPVQHGA VSLSLHSDWAEPANPYVESHWKAAERFLQFEIAWFADPLFKTGDYPLAMKEYIAS KKQRGLSSSVLPRFTLKESRLVKGTIDFYALNHFTTRFVIHKQLNTNCSVADRDVQ FLQDITRLSSPSRLAVTPWGMRKLLGWIRRNYRDMDIYVTANGIDDLALEDDQIRK YYLEKYVQEALKAYLIDKVKIKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSVQFYSKL ISSSGFSSENRSPACGQPPEDTECAICSFLT (SEQ ID NO: 147).

COELHO (+N-TER FLAG)

[00337] DYKDDDDKLDFPGDGRAVWSQNPNLSPVNESQLFLYDTF PKNFFWGVGTGAFQVEGSWKKDGKGLSVWDHFIATHLNVSSRDGSSDSYIFLEK DLSALDFLGVSFYQFSISWPRLFPDGTVAVANAKGLQYYNRLLDSLLLRNIEPVVT LYHWDLPWALQEKYGGWKNETLIDLFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVA WHGYGTGLHAPGEKGNVAAVYTVGHNLLKAHSKVWHNYNRNFRPHQKGWLSIT LGSHWIEPNRAESIVDILKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEVMTKKLLSVLPA FSEAEKNEVRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLRQVLNWIKLEYG NPRILIAENGWFTDSYVQTEDTTAIYMMKNFLNQVLQAIRLDGVRVFGYTAWSLLD GFEWQDAYNTRRGLFYVDFNSEQRERRPKSSAHYYKQVIGENGFTLREATPDLQ GQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPHLYVWNATGNRMLHRVEGVRLKT RPAQCTDFITIKKQLEMLARMKVTHFRFALDWASVLPTGNLSEVNRQALRYYRCV VTEGLKLNISPMVTLYYPTHAHLGLPAPLLHSGGWLDPSTAKAFRDYAGLCFREL GDLVKLWITINEPNRLSDVYNRTSNDTYQAAHNLLIAHAIVWHLYDRQYRPSQRG ALSLSLHSDWAEPANPYVASHWQAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPVAMREYIA SKTRRGLSSSVLPRFSDAERRLVKGAADFYALNHFTTRFVMHEQQNGSRYDSDR DVQFLQDITRLASPSRLAVMPWGEGKLLRWMRNNYGDLDVYITANGIDDQALQN DQLRQYYLEKYVQEALKAYLIDKIKIKGYYAFKLTEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQ FYNKLITSNGFPSENGGPRCNQTQGNPECTVCLLLL (SEQ ID NO: 148).

MACACO CINOMOLGOS (+N-TER FLAG)

[00338] DYKDDDDKLEFSGDGRAVWSKNPNFTPVNESQLFLYDTF PKNFFWGVGTGALQVEGSWKKDGKGPSIWDHFVHTHLKNVSSTNGSSDSYIFLE KDLSALDFIGVSFYQFSISWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYNTLLDSLVLRNIEPIVTL YHWDLPLALQEKYGGWKNDTIIDIFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIHNPYLVAWH GYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPHQKGWLSITLG SHWIEPNRSENTMDILKCQQSMVSVLGWFASPIHGDGDYPEGMKKKLLSILPLFS EAEKNEVRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNLREALNWIKLEYNNP RILIAENGWFTDSHVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLDEIRVFGYTAWSLLDGF EWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQIIRENGFSLKEATPDVQGQF PCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPYLYVWNATGNRLLHRVEGVRLKTRPA QCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASVLPTGNLSAVNRQALRYYRCVVS EGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHAGGWLNPSTVEAFQAYAGLCFQELGD LVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAAHNLLVAHALAWRLYDRQFRPSQRGAV SLSLHADWAEPANPYADSHWRAAERFLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIAS KHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGTVDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDI QFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLR KYYLEKYLQEVLKAYLIDKVRIKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNK MISSSGFPSENSSSRCSQTQKNTECTVCLFLA (SEQ ID NO: 149).

MACACO RHESUS (+N-TER FLAG)

[00339] DYKDDDDKLEFSGDGRAVWSKNPNFTPVNESQLFLYD TFPKNFFWGVGTGALQVEGSWKKDGKGPSIWDHFVHTHLKNVSSTNGSSDS YIFLEKDLSALDFIGVSFYQFSISWPRLFPDGIVTVANAKGLQYYNALLDSLVLR NIEPIVTLYHWDLPLALQEKYGGWKNDTIIDIFNDYATYCFQTFGDRVKYWITIH NPYLVAWHGYGTGMHAPGEKGNLAAVYTVGHNLIKAHSKVWHNYNTHFRPH QKGWLSITLGSHWIEPNRSENTMDILKCQQSMVSVLGWFANPIHGDGDYPEG MKKKLLSILPLFSEAEKNEVRGTADFFAFSFGPNNFKPLNTMAKMGQNVSLNL REALNWIKLEYNNPQILIAENGWFTDSHVKTEDTTAIYMMKNFLSQVLQAIRLD EIRVFGYTAWSLLDGFEWQDAYTIRRGLFYVDFNSKQKERKPKSSAHYYKQII RENGFSLKEATPDVQGQFPCDFSWGVTESVLKPESVASSPQFSDPYLYVWN ATGNRLLHRVEGVRLKTRPAQCTDFVNIKKQLEMLARMKVTHYRFALDWASV LPTGNLSAVNRQALRYYRCVVSEGLKLGISAMVTLYYPTHAHLGLPEPLLHAG GWLNPSTVEAFQAYAGLCFQELGDLVKLWITINEPNRLSDIYNRSGNDTYGAA HNLLVAHALAWRLYDRQFRPSQRGAVSLSLHADWAEPANPYADSHWRAAER FLQFEIAWFAEPLFKTGDYPAAMREYIASKHRRGLSSSALPRLTEAERRLLKGT VDFCALNHFTTRFVMHEQLAGSRYDSDRDIQFLQDITRLSSPTRLAVIPWGVR KLLRWVRRNYGDMDIYITASGIDDQALEDDRLRKYYLEKYLQEVLKAYLIDKVR IKGYYAFKLAEEKSKPRFGFFTSDFKAKSSIQFYNKMISSSGFPSENSSSRCSQ TQKNTECTVCLFLV (SEQ ID NO: 150).

[00340] Conforme mostrado na Tabela 4, descobriu-se que a maioria dos anticorpos, por exemplo, 6D12, 11D4 e 8E1, se ligam a KLB de coelho, macaco cinomolgos e macaco rhesus e descobriu-se que cerca da metade dos anticorpos anti-KLB, por exemplo, 8C5, 14E6 e 14C6, se ligam a KLB de camundongo e rato. TABELA 4 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-KLB MURINOS A KLB DE DIFERENTES ESPÉCIES

EXEMPLO 6 MAPEAMENTO DE EPÍTOPO DE ANTICORPOS ANTI-KLB

[00341] Para determinar se os anticorpos anti-KLB não se ligam ao domínio extracelular (ECD) de alfa-Klotho humano (hKLA), foi usado um construto que tem a seguinte sequência:

SEQUÊNCIA DE POLIPEPTÍDEOS PREVISTA (COM C-TERMINAL (INTRACELULAR) FLAG)

[00342] EPGDGAQTWARFSRPPAPEAAGLFQGTFPDGFLWAVG SAAYQTEGGWQQHGKGASIWDTFTHHPLAPPGDSRNASLPLGAPSPLQPAT GDVASDSYNNVFRDTEALRELGVTHYRFSISWARVLPNGSAGVPNREGLRYY RRLLERLRELGVQPVVTLYHWDLPQRLQDAYGGWANRALADHFRDYAELCF RHFGGQVKYWITIDNPYVVAWHGYATGRLAPGIRGSPRLGYLVAHNLLLAHAK VWHLYNTSFRPTQGGQVSIALSSHWINPRRMTDHSIKECQKSLDFVLGWFAK PVFIDGDYPESMKNNLSSILPDFTESEKKFIKGTADFFALCFGPTLSFQLLDPH MKFRQLESPNLRQLLSWIDLEFNHPQIFIVENGWFVSGTTKRDDAKYMYYLKK FIMETLKAIKLDGVDVIGYTAWSLMDGFEWHRGYSIRRGLFYVDFLSQDKMLL PKSSALFYQKLIEKNGFPPLPENQPLEGTFPCDFAWGVVDNYIQVDTTLSQFT DLNVYLWDVHHSKRLIKVDGVVTKKRKSYCVDFAAIQPQIALLQEMHVTHFRF SLDWALILPLGNQSQVNHTILQYYRCMASELVRVNITPVVALWQPMAPNQGLP RLLARQGAWENPYTALAFAEYARLCFQELGHHVKLWITMNEPYTRNMTYSAG HNLLKAHALAWHVYNEKFRHAQNGKISIALQADWIEPACPFSQKDKEVAERVL EFDIGWLAEPIFGSGDYPWVMRDWLNQRNNFLLPYFTEDEKKLIQGTFDFLAL SHYTTILVDSEKEDPIKYNDYLEVQEMTDITWLNSPSQVAVVPWGLRKVLNWL KFKYGDLPMYIISNGIDDGLHAEDDQLRVYYMQNYINEALKAHILDGINLCGYF AYSFNDRTAPRFGLYRYAADQFEPKASMKHYRKIIDSNGFPGPETLERFCPEE FTVCTECSFFHTRKSLLAFIAFLFFASIISLSLIFYYSKKGRRSYKLEDYKDDDDK (SEQ ID NO: 151).

[00343] Tanto KLA como KLB têm dois domínios similares à glicosidase, um N-terminal e um C-terminal. Para identificar a região de KLB reconhecida pelos anticorpos anti-KLB, hKLB, hKLA e um construto quimérico que compreende o domínio similar à glicosidase N-terminal de hKLA e o domínio similar à glicosidase C-terminal de hKLB foram clonados em um vetor de expressão de mamíferos pCMV-Tag4A (Agilent). Os domínios N- e C- terminal de hKLA e hKLB correspondem às sequências de SEQ ID NO: 151 e SEQ ID NO: 145, respectivamente, conforme mostrado na Tabela 5. Os domínios N-terminal de hKLA e hKLB foram divididos em 5 segmentos e o terminal C- domínios foram divididos em 5 segmentos com base na homologia de sequência entre duas proteínas. TABELA 5 SUBSEQUÊNCIA DE KLA E KLB

[00344] Foi realizada uma análise FACS com os anticorpos da presente divulgação e cerca de metade dos anticorpos foram observados para reconhecer o domínio similar à glicosidase N-terminal de hKLB, enquanto que outros reconhecem o domínio similar à glicosidase C-terminal (Tabela 6). Conforme mostrado na Tabela 6, dois dos anticorpos reconheceram o domínio N-terminal de hKLB ligada a uma porção do domínio que compreende o segmento 1, enquanto que os outros reconheceram somente 2 a 5 segmentos para ligação. TABELA 6 MAPEAMENTO DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-KLB MURINOS

EXEMPLO 7 IDENTIFICAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS QUE ATIVAM ESPECIFICAMENTE O COMPLEXO FGFRIC/KLB

[00345] Com base na capacidade do R1MAbs ativar FGFR1 como um Fab, a molécula que incorpora a ligação de um R1MAb de afinidade menor a um anticorpo anti-KLB de afinidade maior foi produzida para gerar um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 (Figura 6A; documento WO 2012/158704).

[00346] Sem estar ligado a uma teoria em particular, a ativação mediada por FGF21 é proposta para operar através do recrutamento do FGF21 ao completo FGFR1c/KLB através da cauda de ligação a KLB C-terminal, enquanto que os determinantes para a especificidade de FGFR residem na região N-terminal, que provavelmente se ligam a FGFR através de interação de baixa afinidade (consulte Figura 6b) (Yie et al. FEBS Lett. 583(1): 19-24 (2009)). Portanto, a ligação de um R1Mab1 de afinidade reduzida a um anticorpo anti-KLB de afinidade alta como um anticorpo biespecífico pode produzir um agonista FGFR1 dependente de KLB. Sem estar ligado a uma teoria em particular, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 que inclui um braço FGFR1 que tem baixa afinidade pode atenuar o risco do anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1 se ligar a FGFR1 firmemente na ausência de KLB e evitar a ligação e/ou ativação de FGFR1 por outros ligantes FGF (por exemplo, FGF1, FGF2, FGF8 e FGF23). Além disso, um braço FGFR1 com uma baixa afinidade pode permitir que a presença de níveis mais altos de impurezas de FGFR1 como, mas não se limitando a anticorpos com meia protuberância anti-FGFR1, dímeros anti-FGFR1 não covalentes, dímeros anti- FGFR1 covalentes e espécies de alto peso molecular, sem resultar em efeitos colaterais clinicamente significativos.

[00347] Como usado no presente pedido, bFKB1, no geral, refere- se a qualquer um dos vários anticorpos biespecíficos anti-KLB/anti-FGFR1 divulgados no presente pedido. Os detalhes sobre os anticorpos biespecíficos anti-KLB/anti-FGFR1 específicos divulgados nas Figuras estão descritos abaixo. Células HEK293 foram cotransfectadas com uma mistura de quatro vetores de expressão que codificam as cadeias pesadas e leves de anti- FGFR1 (YW182.2 (R1MAb1) e YW182.3 (R1MAb2)) e os anticorpos anti-KLB descritos no acima. A cadeia pesada de anti-FGFR1 e anti-KB foram respectivamente marcadas com o peptídeo Flag e Oct-histidina, de modo que lgG heterodimérica pode ser purificada por purificação de afinidade sequencial a partir do meio condicionado. lgG heterodimérica purificada parcialmente foi então analisado em um ensaio de luciferase baseado em GAL-ELK1 para identificar os agonistas dependentes de KLB. Para minimizar o despareamento das cadeias pesadas e leves, o anti-FGFR1 foi expresso com região constante Fab humana e o anti-KLB foi expresso com região constante Fab de camundongo. lgGs biespecíficas marcadas foram testadas inicialmente em uma forma bruta com o uso de 28 combinações de 3 anti-R1MAbs e 18 Abs anti-KLB (Tabela 7).

[00348] A Figura 7A mostra os dados de indução para determinadas combinações biespecíficas de YW182.2 (R1MAb1), YW182.3 (R1MAb2) e YW182.5 (R1MAb3) com 18C5, 12A11 e 14E6 em um ensaio de luciferase GAL-ELK1. Na maioria dos casos, foi observado que os anticorpos biespecíficos ativaram sinalização significativamente melhor entre as células que coexpressaram FGFR1c e KLB, em comparação com células que expressaram apenas FGFR1c, mas não KLB.

[00349] Com base na atividade desses anticorpos nos experimentos iniciais, 8 Abs anti-KLB representativos (Ph#5, 8C5, 12A11, 14C10, 6D12, 11D4, 6C1 e, como um controle negativo, 14E6), foram usados para produzir anticorpos biespecíficos não marcados com YW182.5 (com o uso de uma tecnologia de protuberância em orifício descrita anteriormente para caracterização posterior (acima, e, por exemplo, Atwell, et al. FEBS Lett. 583(1): 19-24 (2009)). Conforme mostrado na Figura 8A, anticorpos biespecíficos foram produzidos com região constante IgG1 humana (tipo selvagem, com função efetora (1)) e com região constante lgG1 humana com mutação N297G para eliminar a função efetora (3), ou região constante de camundongo com mutações [D265G/N297G] duplas (DANG) para eliminar a função efetora (2).

[00350] A Tabela 7 abaixo lista vários anticorpos biespecíficos que foram produzidos com o uso da tecnologia de protuberância em orifício. TABELA 7 ANTICORPOS ANTI-KLB/ANTI-FGFRI BIESPECÍFICOS

[00351] lgG de controle de isotipo usada era tanto anti-tasneira (lgG2a murina) ou o trastuzumabe Her2 anti-humano (lgG1 humana). Os fragmentos Fab foram expressos em E. coli e purificados com o uso de cromatografia em coluna convencional. FGF21 recombinante era de sistemas R&D (2539-FG/CF), exceto para ensaio de ligação celular radioligante, que foi realizado com FGF21 iodado da Phoenix Pharmaceuticals e produziu internamente FGF21 sem marcação. Cada uma das combinações biespecíficas (exceto para o controle negativo) mostraram sinalização dependente tanto para FGFR1c como KLB. Os dados para certas combinações são mostrados na Figura 7B. Além disso, a combinação dos braços anti-KLB com o braço YW182.5 (R1MAb3) mostrou sinalização de fundo menor nas células que expressaram FGFR1c, mas não KLB.

[00352] Conforme mostrado na Figura 6C, a atividade de um anticorpo anti-KLB/anti-FGFR1 (BsAb17) foi testada em células HEK293 deficientes de FGFR que expressam vários receptores. Células HEK293T deficientes de FGFR1 foram geradas com o uso do método CRISPR-cas9 com o uso de RNAs guias. O anticorpo anti-KLB/anti-FGFR1c foi observado para induzir atividade de luciferase em células que coexpressam hFGFR1c e hKLB recombinante (Figura 6C).

[00353] Resultados similares foram observados para outros anticorpos anti-KLB/anti-FGFR1c. Conforme mostrado na Figura 7C, quando testado em um ensaio de luciferase baseado em GAL-ELK1 em células HEK293 que expressam FGFR1c com ou sem KLB, combinações múltiplas de anticorpo biespecífico dos braços anti-FGFR1 e anti-KLB , por exemplo, BsAb 5, 6, 7, 8, 9, 10, induziram atividade de luciferase de uma forma dependente da dose em células que expressam hFGFR1c e hKLB recombinante, mas não em células sem expressão de KLB. Esses resultados indicam que esses anticorpos biespecíficos atuam como agonistas de FGFR dependente de KLB, assim como FGF21.

[00354] A sinergia de um anticorpo anti-KLB/anti-FGFR1c (BsAb17) com FGF21 também foi testada. Conforme mostrado na Figura 9B, nenhuma sinergia entre BsAb17 e FGF21 foi observada quando a concentração de FGF21 foi aumentada gradativamente e a concentração de BsAb17 permaneceu inalterada.

[00355] Além disso, como a concentração do anticorpo anti- KLB/anti-FGFR1c (BsAb17) foi aumentada gradativamente e a concentração de FGF21 permaneceu inalterada, nenhuma sinergia entre BsAb17 e FGF21 foi observada (Figura 9C).

[00356] A afinidade de ligação da solução (Kd) de dois dos anticorpos biespecíficos, BsAb10 e BsAb9, (junto com hFGF21) para células HEK293 que expressam KLB de humano, macaco cinomolgo e camundongo, FGFR1c humano, ou tanto hFGFR1c como hKLB foi medida por um ensaio de ligação de ligante radiomarcado. Para o ensaio de ligação celular de radioligante, células HEK293 que coexpressam de forma estável KLB e/ou FGFR1c, foram colocadas em uma placa de 96 poços em uma densidade de 100.000 a 200.000 células por 0,2 L em tampão de ligação (DMEM com albumina de soro bovino 1% (BSA), HEPES 50 mM, pH 7,2, azida de sódio 0,1% e lgG humana 350 mM). As misturas de reação de competição de 50 μL contendo uma concentração fixa de FGF21 iodado (Phoenix Pharmaceuticals) ou BsAb iodado, e concentrações diluídas em série de FGF21 não marcado (Genentech) ou BsAb não marcado foram adiconadas às células. Reações de competição com células foram incubadas por 2 h à temperatura ambiente. Após 2 h de incubação, as reações de competição foram transferidas para uma placa de filtro Millipore Multiscreen e lavadas quatro vezes com tampão de ligação para separar o FGF21 ou anticorpo iodado livre do ligado. Os filtros foram contados em um contador gama Wallac Wizard 1470 (PerkinElmer Life e Analytical Sciences). Os dados de ligação foram avaliados com o uso do programa de computação New Ligand (Genentech), que usa o algoritmo de ajuste de Munson e Rodbard (Munson e Rodbard Anal. Biochem. 107, 220-239 (1980)) para determinar a afinidade de ligação.

[00357] Conforme mostrado na Tabela 8, ambos os anticorpos exibiram alguma reatividade boa para células que expressam apenas KLB (em um padrão de amostra cruzada consistente com o observado anteriormente), mas ambos se ligaram de forma mais fraca às células que expressam apenas hFGFR1c e de forma mais forte às células tanto hKLB como hFGFR1c. TABELA 8 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-KLB BIESPECÍFICOS A KLB/FGFR1 DE ESPÉCIES DIFERENTES

[00358] A Figura 9D mostra a afinidade de BsAb10 e BsAb9 para células HEK293 que expressam de forma estável hKLB, hFGFR1c, ou ambos, em comparação a um anticorpo com dois braços de ligação anti-FGFR1 correspondentes (YW182.5) com o uso de análise FACS. Resultados similares foram obtidos para aqueles indicados acima (Figura 9D).

[00359] Mais experimentos foram conduzidos com um anticorpo biespecífico, BsAb10, que tem YW182.5 como o braço anti-FGFR1 e 8C5 como o braço anti-KLB, e deriva de BsAb10 (BsAb11-20). Conforme mostrado na Figura 6C, receptores murinos foram expressos em células HEK293 e mostraram que BsAb17 também induziu atividade de luciferase nessas células, confirmando a reatividade cruzada das espécies desse Ab.

[00360] BsAb10 foi a seguir testado em células de mioblasto L6 de rato desprovidas de KLB e FGFRs endógenos, mas transfectados para expressar hKLB e cada uma das 5 isoformas de hFGFR (Figura 9A). Descobriu-se que BsAb10 induz atividade de luciferase apenas em células que expressam tanto FGFR1c como KLB, indicando que BsAb10 atua como um agonista específico para o complexo FGFR1c/KLB, mas não KLB no complexo com outros FGFRs (Figura 9A). FGF21 e FGF19 foram usados como controles para demonstrar que FGF21 induziu atividade de luciferase quando células expressaram uma combinação de KLB e qualquer um dentre FGFR1c, 2c ou 3c, e FGF19 induziu atividade em células que expressaram uma combinação de KLB e FGFR4. O FGF21 recombinante era de sistemas R&D (2539-FG/CF), exceto para o ensaio de ligação celular radioligante, que foi realizado com FGF21 iodado da Phoenix Pharmaceuticals e FGF21 sem marcação produzido internamente. cDNAs que codificam o domínio extracelular (ECD) de FGFR1b, 1c, 2b, 2c, 3b, 3c e 4 humano foram clonados no vetor de expressão contendo o promotor do citomegalovírus (CMV) para gerar proteína quiméricas Fc humanas-FGFR-humano ou proteínas FGFR marcadas com His.

[00361] No entanto, conforme descrito acima, o anticorpo anti- FGFR1c parental, R1MAb3 (YW182.5) de BsAb10 pode, de forma surpreendente, se ligar a FGFR1b, uma isoforma de FGFR1 que não interage com KLB. Além disso, R1MAb3 (YW182.5) pode ativar FGFR1b no ensaio GAL-ELK1 nas células L6, que está em contraste com a atividade de BsAb10 (consulte Figuras 2C e 2B).

[00362] Além disso, uma combinação de FGFR1b e KLB não suportou ativação por BsAb10 (Figura 9A). Sem estar ligado a uma teoria em particular, estes dados sugerem que a presença do complexo FGFR1/KLB pré-formado é um pré-requisito para a ativação deFGFR1 dependente de KLB por BsAb10.

EXEMPLO 8 BSAB10 E SEUS DERIVADOS ATUAM COMO MIMÉTICOS MOLECULARES DE FGF21

[00363] Caracterizações adicionais de BsAb10 e seus derivados (BsAb11-20) e FGF21 revelaram algumas similaridades e diferenças. Para determinar o nível de fosforilação dos intermediários da sinalização MAPK, células foram cultivada em meio basal de pré-adipócito 2 contendo FBS, L- glutamina e GA-1000. Uma vez confluentes, pré-adipócitos subcutâneos (adquiridos junto à Lonza) foram diferenciados em meio de cultura contendo dexametasona, indometacina e 3-metóxi-1-metilxantina (IBMX). Para análise de expressão gênica, células foram diferenciadas por 14 dias e, em seguida, cultivadas por 48 h adicionais com agonistas indicados. Para análise de sinalização MAPK, células foram diferenciados por dez dias, cultivada em meio livre de soro por 3 h e, em seguida, ainda cultivadas por 1 h adicional com agonistas indicados.

[00364] Conforme mostrado na Figura 6D, BsAb10, BsAb17, BsAb20, e FGF21 mostraram uma atividade comparável para induzir fosforilação dos intermediários da sinalização MAPK como MEK e ERK em adipócitos humanos primários, que representam o tipo celular relevante para a atividade antidiabética de FGF21, conforme determinado por Western blot. Anticorpos usados para a análise Western blot eram da Cell Signaling Technology: pFRS2a (T196) (#3864), pMEK1/2 (S217/221) (#9154), pERK1/2 (T202/204) (#4370), ERK1/2 (#4695), HSP90 (#4874), β-Actina (#5125), da Abcam: UCP1 (ab10983) ou da R&D Systems: KLB (AF2619).

[00365] Conforme mostrado na Figura 8B, um aumento na fosforilação de ERK, representado como uma razão de mudança nos níveis de pERK, foi observado em adipócitos humanos primários tratados com BsAb10, BsAb17, BsAb20 ou FGF21.

[00366] Além disso, o perfil de afinidade de BsAb10 assemelha-se ao do FGF21. Quando testados por FACS, BsAb10 mostrou forte ligação às células que expressam hKLB, sendo ou não FGFR1c coexpresso (Figura 10A). De certa forma surpreendente, muito pouca ligação de BsAb10 foi observada quando as células expressaram FGFR1c, mas não KLB, indicando que a afinidade monovalente do braço YW182.5 é extremamente baixa (Figura 10A).

[00367] Conforme mostrado na Figura 10B, um ensaio de ligante radiomarcado indicou que a constante de dissociação (Kd) de BsAb10 para células que expressam tanto FGFR1c como KLB é 2,3 nM, próximo de 5,3 nM observado para hFGF21 em um formato de ensaio similar. Esses valores foram próximos ao EC50 observado dessas moléculas no ensaio GAL-ELK1 em células HEK293 (3,2 nM e 4,7 nM, respectivamente para BsAb10 e FGF21). Quando as células que expressam KLB humano sozinho ou KLB de camundongo sozinho, o Kd foi 6,6 nM e 15,5 nM, respectivamente.

[00368] Visto que a afinidade para FGFR1 foi tão baixa, o ensaio de ligante radiomarcador não pode determinar de forma confiável o Kd de BsAb10 para as células que expressam apenas FGFR1c, mas ela foi estimada como sendo > 300 nM, conforme mostrado na Figura 3B. Devido a um motivo similar, a cinética da ligação de BsAb10 para FGFR1 não pode ser determinada de forma confiável nem por SPR.

[00369] Além disso, a interação entre as proteínas FGFR1c-ECD e KLB-ECD foi estabilizada por BsAb10 conforme observado anteriormente para FGF21, consistente com a notação que BsAb10 atua como um mimético FGF-21 seletivo para FGFR1c (Figura 11) (Yie et al., Chemical Biology; Drug Design 79, 398 a 410 (2012)). A interação FGFR1/KLB/ BsAb10 foi estudada por medições de ressonância plasmônica de superfície (SPR) em um instrumento PROTEON™ XPR36 (Bio-Rad Laboratories) a 25°C. A proteína FGFR1-HIS (20μg/mL) a pH 4,5 foi imobilizada na densidade de superfície (1000 RU) sobre um chip sensor PROTEON™ GLC com o uso de procedimentos de acoplamento de amina padrão, conforme descrito pelo fabricante. BsAb10 e/ou misturas 1:1 de BsAb10 e KLB-ECD foram injetadas a 6,25 nM, 12,5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM ou 200 nM em PBS que contendo TWEEN®-20 0,005% v/v, NaCl 0,3 M (pH 7,4) em uma vazão de 80 μL/min, e sensorgramas para as fases de associação e desassociação foram registrados. Analitos foram injetados por 300 s e permitiu-se que se dissociassem por 600 s. Os dados foram referenciados com pontos intermediários, processados e as constantes de dissociação medidas com o programa de computação PROTEON™ Manager (versão 3.0, Bio-Rad). A ativação do complexo FGFR1c/KLB por BsAb10 sugeriu uma formação de complexo ternário por FGFR1c-ECD, KLB-ECD e BsAb10.

[00370] Conforme mostrado na Figura 11, também foi observado que BsAb10 formou um complexo ternário com KLB-ECD recombinante e FGF21 ou FGF19. A interação BsAb10/KLB/FGF foi estudada por medições de interferometria com biocamada em um instrumento Octet RED (ForteBio) a 25°C. BsAb10 (20 μg/mL) em pH 4,5 foi imobilizado em pontas de biossensor reativo de amina ativada, conforme descrito pelo fabricante. KLB-ECD (20 μg/mL) em PBS contendo TWEEN®-20 0,005% v/v, NaCl 0,3 M (pH 7.4) foi capturado nas mesmas pontas de biossensor e medido com FGF21 (R&D Systems) a 0, 0,2, 0,8, ou 2 μM no mesmo tampão. Os dados qualitativos foram processados com o programa de computação de aquisição de dados (ForteBio).

[00371] A Figura 12A mostra um esquemático de um experimento de transferência de energia por ressonância fluorescente determinada por tempo da superfície celular (TR-FRET) que foi realizado. Para a TR-FRET, células COS7 foram cotransfectadas para expressarem FGFR1 marcado por SNAP e KLB não marcado e semeadas em uma placa de 96 poços de fundo branco (Costar) a 100.000 células por poço. As células transfectadas foram marcadas 24 h após a transfecção com 100 nM de benzilguanina SNAP-Lumi4- Tb (Cisbio) conjugada ao doador e 1 μM de benzilguanina SNAPAlexa647 (NEB) conjugada ao receptor por 1 h a 37°C, CO2 5%. Após três lavagens, a emissão Lumi4-Tb e o sinal TR-FRET foram registrados a 620 nm e 665 nm, respectivamente, por 400 μs após um atraso de 60 μs, seguido por excitação a laser a 343 nm com o uso de um leitor de placas Safire2 (Tecan) a t = 0 e t = 15 min após adição do ligante. O sinal de emissão do Alexa647 foi detectado a 682 nm após a excitação a 640 nm com o uso do mesmo leitor de placas. A intensidade FRET foi calculada como: (sinal a 665 nm de células marcadas com doador de SNAP e receptor de SNAP) - (sinal a 665 nm do mesmo lote de células transfectadas marcadas com doador de SNAP e SNAP não marcadas).

[00372] Conforme mostrado na Figura 12B, o experimento TR- FET sugeriu que tanto BsAb 17 como FGF21 melhoram a dimerização de FGFR1c-ECD quando KLB também está presente na célula. Os resultados foram mostrados como razão FRET: A intensidade FRET dividida pela emissão do doador a 620 nm.

[00373] Além disso, BsAb10 liga-se à metade C-terminal de KLB- EC, enquanto que se acredita que FGF21 e FGF19 se liguem ao mesmo sítio em KLB na metade N-terminal (Goetz et al. Mol. Cell. Biol. 32(10): 1944-54 (2012); Foltz et al. Sci. Transl. Med. 4: 162ra153 (2012)), que sugerem que o epítopo de BsAb10 em KLB deve ser distinto do sítio de ligação de FGF21 e FGF19. Para mapear o epítopo de KLB para BsAb10, efetuou-se a ligação de 8C5 (braço de ligação do KLB de BsAb10) a vários antígenos quiméricos expressos nas células HEK293. Cada quimera foi construída pela fusão de KLB humano e proteína Klotho alpha (KLA) (50% de identidade para proteínas KLB humanas) ou KLB de coelho (86% de identidade para KLB humana). Conforme resumido na Figura13A, 8C5 se liga ao domíno C-terminal de KLB, em particular, na região que contém 34 aminoácidos no domínio C-terminal de KLB (SSPTRLAVIPWGVRKLLRWVRRNYGDMDIYITAS; SEQ ID NO: 142).

[00374] Conforme mostrado na Figura 13B, a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 142 pode corresponder aos aminoácidos 857 a 890 de uma proteina KLB que inclui uma sequência sinal, por exemplo, como uma sequência de 52 aminoácidos que tem uma sequência apresentada na SEQ ID NO: 157, ou pode se referir aos aminoácidos 805 a 838 de uma proteína KLB que não inclui uma sequência sinal.

[00375] Apesar da similaridade entre FGF21 e BsAb10 e seus derivados na ação a jusante, o epítopo de BsAb10 em KLB é distinto do sítio de ligação FGF21 e FGF19 (Figura 14A).

[00376] A Figura 14B mostra os resultados de um ensaio de luciferase GAL-ELK1 realizado em células de mioblasto L6 de rato cotransfectadas com FGFR4 e KLB e tratadas com FGF19 sozinho ou em combinação com um anticorpo anti-KLB/anti-FGFR1c (BsAb17). Conforme mostrado na Figura 14B, o pré-tratamento de BsAb17 também não bloqueou a atividade de FGF19 nas células L6 que expressam o complexo FGFR4/KLB.

[00377] Adicionalmente, e conforme mostrado na Figura 14C, o pré-tratamento de BsAb17 também não bloqueou a atividade de FGF19 nas células de hepatoma H4IIE que expressam FGFR4 e KLB. Na presença de BsAb17, FGF19 ainda foi capaz de ativar o complexo FGFR4/KLB para induzir fosforilação de ERK (Figura 14C). Esses dados indicam que o anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1divulgado, por exemplo, um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1c não interfere na interação de FGF19 ou FGF21 com o complexo KLB/FGFR1c.

EXEMPLO 9 BSAB10 E SEUS DERIVADOS, ATUAM COMO UM MIMÉTICO FGF21 DE LONGA AÇÃO IN VIVO

[00378] A reatividade cruzada de BsAb10 e seus derivados com o complexo receptor murino conforme descrito acima (consulte, por exemplo, Figuras 6C e 10B) permitiu o teste de sua atividade in vivo em modelos de camundongos. Para evitar toxicidade em potencial da função efetora lgG, uma mutação dupla [D265A/N297G] foi introduzida no BsAb20 na região Fc que abole a ligação para FcgRs e o recrutamento de células efetoras imunes. Além disso, para evitar toxicidade em potencial da função efetora de lgG, N297G foi introduzida em BsAb17 na região Fc que elimina a ligação a FcgRs e o recrutamento de células efetoras imunes.

[00379] Conforme mostrado na Figura 15A, quando i.p. injetada em camundongos db/db diabéticos a 5 mg/kg, BsAb17 reduziu os níveis de glicose no sangue em uma extensão similar, sem afetar a ingestão de alimento ou o peso corporal. Camundongos C57Bl/6 magros tratados com BsAb167 demonstraram glicose sanguínea reduzida, mas não atingiu hipoglicemia tóxica (Fig. 15A).

[00380] Além disto, quando camundongos C57BL/6 alimentados com dieta rica em gordura (Obesidade Induzida por Dieta, DIO) foram injetados com BsAb17 a 3 mg/kg no dia 0 e 6, reduções significativas na perda de peso e na glicose sanguínea (Fig. 15B). Para alimentação com dieta rica em gordura, uma dieta rica em carboidratos (Harlan Teklad TD.03584, 58,4% de calorias de gordura) foi usada.

[00381] Conforme mostrado na Figura 15C, um aprimoramento na tolerância à glicose foi observado nos camundongos C57BL/6 alimentados com dieta com alto teor de gordura (Obesidade Induzida por Dieta, DIO) que foram injetados com BsAb17 a 3 mg/kg.

[00382] Reduções no triglicéride hepático, insulina do soro, ácidos graxos livres, triglicérides e colesterol total também foram observadas nos camundongos C57BL/6 alimentados com dieta rica em gordura (Obesidade Induzida por Dieta) que foram injetados com BsAb17 a 3 mg/kg (Fig. 15D). Resultados similares foram observados anteriormente com injeções de FGF21.

[00383] Um experimento separado foi realizado em camundongos heterozigóticos klb e camundongos deficientes de klb homozigóticos para determinar se o aprimoramento na tolerância à glicose observado no tratamento com um anticorpo biespecífico anti-KLB/anti-FGFR1c exige KLB. Para gerar camundongos com deficiência de klb (KO), um par de Nuclease de Dedo de Zinco (ZFN) específico do Klb foi obtido da Sigma-Aldrich e usado para microinjeção pró-nuclear de acordo com os métodos estabelecidos. O par ZFN direciona a seguinte sequência Klb no genoma de camundongos (sítio de corte em letras minúsculas) e o camundongo KO desprovido de uma deleção de bp (g em negrito), causando uma mudança de quadro: GTTACCGGCTTCtccggaGACGGGAAAGCAATATGG (SEQ ID NO: 156). A Figura 16A mostra a sequência de aminoácidos do N-terminal da proteína KLB de camundongo e a sequência de aminoácidos correspondente codificada pelo alelo klb em camundongos deficientes de klb.

[00384] A Figura 16B mostra os resultados de um western blot que foi realizado para confirmar a falta da expressão da proteína KLB em camundongos com deficiência de klb.

[00385] Conforme mostrado na Figura 16C, BsAb20 aprimorou a tolerância à glicose em camundongos heterozigotos klb, conforme medido pelo teste de tolerância à glicose (GTT), mas não em camundongos homozigotos com deficiência de klb, indicando que os aprimoramentos na tolerância à glicose necessitam de KLB funcional. Para o teste de tolerância à glicose (GTT), os camundogos foram colocados em jejum durante a noite e injetados i.p. com 2g/kg de solução de glicose.

[00386] Além disso, diferente do anti-FGFR1 R1MAb1, que altera os níveis de FGF32 e fósforo no soro (Wu et al., Sci Transl Med 3, 113ra126 (2011) e Wu et al., PLoS One 8, e57322 (2013)), o anticorpo biespecífico anti- KLB/anti-FGFR1 não afetou esses parâmetros no soro, indicando a ausência de atividade agonística de FGFR1 independente de KLB (Figura 16D).

[00387] Conforme mostrado na Figura 17, BsAb17 não alterou os níveis de FGF23 ou fósforo do soro, que são marcadores sensíveis de FGFR1 independente de KLB. A ação da insulina em camundongos tratados com BsAb17 foi medida por clamp euglicêmico hiperinsulinêmico. Resumidamente, camundongos foram anestesiados com isoflurano e a artéria carótida comum esquerda e a veia jugular direita foram cateterizadas para amostragem e infusão, respectivamente. As extremidades livres dos cateteres foram tuneladas sob a pele atrás do pescoço, onde as extremidades soltas dos cateteres foram fixadas a um tubo produzido em MICRO-RENATHANE® (0,033 de diâmetro externo). Os animais foram alojados individualmente após a cirurgia e o peso corporal foi registrado diariamente. Todos os experimentos metabólicos foram realizados após um período de recuperação pós-operatório de 5 dias e foram previamente descritos. Camundongos conscientes, sem restrição, foram colocados em um recipiente plástico de 1 L com leito e deixados em jejum às 7:00 (t = 300 min). Os camundongos foram conectados imediatamente a um Dual Channel Stainless Steel Swivel (Instech Laboratories) para permitir infusão na veia jugular e amostragem de sangue arterial simultâneos. Os camundongos não foram manuseados e permitu-se que se movessem livremente para eliminar o estresse. 2 h antes do início do clamp, um bolus de 5 μCi de [3-3H]-D-glicose foi ministrado na veia jugular (t =- 120 min), seguido por uma infusão constante a uma taxa de 0,05 μCi/min. Após um período de equilíbrio de 2 h a t = 0 min (por exemplo, 5 h de jejum), uma amostra de sangue arterial de referência foi tomada para a medição de glicose no sangue, [3-3H]-D-glicose, hematócrito e insulina plasmática. Um clamp euglicêmico hiperinsulinêmico de 145 min (4 mU/kg/min) foi então iniciado. A [3-3H]-D-glicose foi adicionada na infusão de glicose variável para manter a euglicemia e a infusão constante de [3-3H]-D-glicose foi suspensa, assim como a atividade específica de glicose arterial do clamp em um nível constante. Hemácias de um camundongo doador em um antecedente C57BI/6J foram lavadas e reconstituídas em um volume igual de solução heparinizada 0,9% (hematócrito aproximadamente 50%) e infundido a uma taxa de 4 μL/min pela duração do estudo para substituir o sangue removido durante o estudo. Amostras de sangue arterial foram tomadas a cada dez minutos para determinar os níveis de glicose no sangue. Em t = 80, 90, 100 e 120 min, amostras de sangue foram tomadas para determinar a [3-3H]-D-glicose. Em t = 120 min, um bolus de 13 μCi de 2-desóxi [14C] glicose ([2-14C]DG) foi administrado no cateter da veia jugular. Em t = 122, 125, 130, 135 e 145 min, o sangue arterial foi amostrado para determinar a glicose no sangue, [3-3H]-D- glicose e [2-14C]DG no plasma. A concentração de insulina arterial foi medida a 100 e 120 min. Em t = 145 min, os camundongos foram então anestesiados. O sóleo, o gastrocnêmio, o vasto lateral superficial branco (quad), o fígado, coração, tecido adiposo branco epididimal e subcutâneo, tecido adiposo marrom e o cérebro foram removidos, congelados imediatamente em nitrogênio líquido e armazenados a -70°C até a análise tecidual futura. A insulina imunorreativa foi analisada com o uso de um kit Linco Rat Radioimmunoassay (LincoResearch).

[00388] Para medir a [3-3H]-D-glicose, amostras de plasma foram desproteinizadas com hidróxido de bário (Ba(OH)2) e sulfato de zinco (ZnSO4), secas e a radioatividade foi determinada com o uso de contagem de cintilação líquida. Os tecidos removidos foram desproteinizados com ácido perclórico e então neutralizados para um pH de aproximadamente 7,5. Uma parte da amostra foi contada ([2-14C]DG e [2-14C]DG-Gfosfato ([2-14C]DGP) e uma parte foi tratada com Ba(OH)2 e ZnSO4 e o sobrenadante foi contado ([2-14C]DG). Tanto os níveis radioativos de [2-14C]DG como [2-14C]DG-fosfato ([2-14C]DGP) foram determinados com o uso de contagem de cintilação líquida. As taxas de fluxo de glicose foram analisadas com o uso de equações de equilíbrio de estado não estacionário assumindo um volume de distribuição (130 mL/kg). A depuração específica de tecido (Kg) de [2-14C]DG e um índice de absorção de glicose (Rg) foram calculados conforme descrito anteriormente (Kraegen, E.W. et al., Am. J. Physiol. 248, E353-362 (1985)): Kg=[2-14C]DGPtecido/AUC [2- 14C]DGplasma, Rg=Kg x [glicose]plasma, onde [2-14C]DGPtecido é a radioatividade [2- 14C]DGP (dpm/g) no tecido, AUC [2-14C]DGplasma é a área sob a curva de desaparecimento [2-14C]DG de plasma (dpm/mL/min) e [glicose]plasma é a glicose média no sangue (μg/μL) durante o período experimental (t = 102 a 125 min). Os dados são apresentados como a média ± SEM.

[00389] Conforme mostrado na Figura 15E, que representa a utilização de glicose no corpo inteiro medida após uma única injeção de BsAb17 a 10 mg/kg, BsAb17 aprimorou as taxas da utilização de glicose no corpo inteiro estimulada por insulina.

[00390] Além disso, e conforme mostrado na Figura 15F, BsAb17 aprimorou a supressão de insulina das taxas de produção de glicose endógena após uma única injeção de BsAb17 a 10 mg/kg. Esses resultados indicam que uma única injeção de 10 mg/kg de BsAb17 em camundongos DIO 5 dias antes do clamp reduziram consideravelmente as concentrações de glicose e insulina em jejum.

[00391] A absorção de glicose tecidual (Rg) ao final do período estimulado pela insulina foi melhorada no coração, musculatura esquelética, tecidos adiposos brancos (WAT) e tecido interescapular BAT (iBAT), indicando sensibilização no corpo inteiro à insulina por BsAb17 (Figura 15G).

[00392] A quantidade de excursão de glicose do sangue arterial foi determinada durante o experimento de clamp. Conforme mostrado na Figura 18A, a quantidade de excursão de glicose no sangue arterial foi diferente entre camundongos injetados com BsAb17 versus camundongos injetados com lgG de controle durante o experimento de clamp euglicêmico hiperinsulinêmico.

[00393] A diferença de peso entre camundongos injetados com BsAb17 versus camundongos injetados com lgG de controle também foi observada. Conforme mostrado na Figura 18B, as alterações observadas nas concentrações de glicose e insulina foram sem uma perda aparente de peso.

[00394] A taxa de infusão de glicose em estado estacionário também foi analisada após uma injeção com BsAb17. Conforme mostrado na Figura 18C, a taxa de infusão de glicose em estado estacionário aumentou em 64% após uma injeção de BsAb17. Esses resultados demonstram que o BsAb17 aprimorou a sensibilidade à insulina do corpo inteiro em camundongos DIO, mesmo antes da perda de peso se tornar aparente.

[00395] Estudos anteriores com doses farmacológicas de FGF19 ou FGF21 mostraram um gasto energético (EE) aumentado (Fu et al., Endocrinology 145, 2594 a 2603 (2004); Coskun et al., Endocrinology 149, 6018 a 6027 (2008); Wu et al., PLoS One 8, e57322 (2013); Lin et al., Cell Metab 17, 779 a 789 (2013)), dessa forma foi ponderado que um efeito similar poderia ser observado. As equações a seguir foram usadas para calcular o EE e o quociente respiratório (RQ). EE = VO2 X (3,815 + 1,232 x RQ), onde (RQ = VCO2/VO2). De fato, a injeção única de BsAb17 em camundongos DIO ou magros em uma temperatura ambiente normal (21°C) levou ao aumento significativo no consumo de O2 (VO2), na produção de CO2 (VCO2), e no EE por animal injetado sem alteração significativa na contagem da atividade (Figura 19A). De maneira inesperada, o aumento de 15 a 46% observado no EE não foi acompanhado por alterações significativas nos quocientes respiratórios (RQ=VCO2/VO2) (Figura 19A).

[00396] Um aumento similar no EE sem alteração no RQ foi obtido por infusão contínua de FGF21 nos camundongos DIO (Figura 21C).

[00397] A Figura 20A mostra a quantidade de VO2, VCO2 e as contagens da atividade total de camundongos DIO tratados com uma única injeção de BsAb17 à temperatura ambiente normal.

[00398] Conforme mostrado na Figura 19B, o aumento no EE foi sustentado quando a temperatura da gaiola foi elevada para a neutralidade térmica (29 a 30°C), sugerindo que a indução por BsAb17 de ativação da gordura marrom não depende da entrada termogênica adaptável a partir do sistema nervoso simpático.

[00399] A Figura 20B mostra a quantidade de VO2, VCO2 e as contagens da atividade total de camundongos DIO tratados com uma única injeção de BsAb17 a temperatura ambiente normal, seguido por uma mudança na temperatura para a neutralidade térmica.

[00400] Um aumento no EE também foi evidente quando os camundongos DIO aclimatados à temperatura ambiente de neutralidade térmica (29 a 30°C) foram testados por duas semanas (Figura 21B).

[00401] Conforme resumido na Figura 21A, que mostra os valores médios do EE, alterações no EE foram observadas em camundongos magros e DIO à temperatura ambiente normal e em camundongos magros e DIO aclimatados à temperatura ambiente de neutralidade térmica.

[00402] Ao contrário, uma infusão contínua com agonista CL- 316,243 adrenoceptor específico de β3 induziu um aumento agudo no EE e uma redução no RQ, conforme antecipado (Figura 19H). A infusão contínua de FGF21 ou CL316,243 foi realizada com o uso de uma minibomba osmótica (Alzet 2001) que foi implantada por via subcutânea. Dessa forma, o EE induzido por BsAb17 e FGF21 é robusto, mas aparenta ser mais seletivo do que outros mecanismos de ativação do BAT descritos anteriormente, como a administração de simpatomiméticos (norepinefrina ou agonistra adrenoceptor CL316,243 específico para β3), peptídeos natriuréticos cardíacos ou Interleucina-4, que acompanharam a promoração de oxidação lipídica e redução no RQ (Gerhart-Hines et al., Mol. Cell 44, 851-863 (2011); Mattsson et al., American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 299, E374- 383 (2010); Nguyen et al., Nature 480, 104-108 (2011); Birkenfeld et al. Diabetes 57, 3199-3204 (2008); Bordicchia et al., J. Clin. Invest. 122, 10221036 (2012); e de Souzaet al., Diabetes 46, 1257-1263 (1997)).

[00403] Sem estar ligado a uma teoria em particular, várias linhagens de evidência sugeriram o papel dominante da ativação de BAT na ação metabólica de BsAb17. Primeiro, conforme mostrado na Figura 19C, a injeção de BsAb17 aumentou a absorção de 18F-Fludesoxiglicose (FDG) especificamente no iBAT.

[00404] Segundo, uma única injeção de BsAb17 induziu a expressão de proteína UCP1 no WAT inguinal (ingWAT), que é um indicativo de acastanhamento do tecido adiposo (Figura 19D).

[00405] Conforme mostrado na Figura 19E, a indução de expressão de UCP1 também foi observada em adipócitos de cultura primária tratados com FGF21 ou BsAb17 indicando uma ação direta sobre adipócitos maduros. Para determinar a expressão de UCP1, o RNA total foi usado para sintetizar o cDNA com o uso do Kit SUPERSCRIPT® VILO cDNA Synthesis (ABI). Para qPCR, amostras foram corridas em triplicata no instrumento de PCR em tempo real ViiA 7 (Applied Biosystems). A sonda de Ensaio de Expressão Gênica TAQMAN® pré-projetada pela Applied Biosystems usada foi UCP1 (Hs01027785_m1). Para cada amostra, a abundância de mRNA foi normalizada para a quantidade de transcritos de TBP (Hs00427620_m1) e SDHA (Hs00188166_m1).

[00406] Terceiro, com o uso de um sistema de telemetria, um aumento na temperatura corporal em descanso foi observado após a injeção única de BsAb17, que durou > 26 dias antes de retornar gradualmente ao nível basal (Figura 19F).

[00407] A Figura 22 mostra as diferenças na temperatura corporal central que foi observada em camundongos após uma injeção única de BsAb17, em comparação a camundongos tratados com lgG de controle. As temperaturas corporais centrais foram monitoradas com o uso de um transmissor TA-F10 (Data Sciences International, DSI), que foi implantado cirurgicamente na cavidade peritoneal. Após recuperação da cirurgia, os camundongos foram randomizados em grupos com base no peso corporal e na temperatura corporal central. A temperatura corporal central e a atividade foram monitoradas com o uso do Sistema de Telemetria Implantável DSI.

[00408] Os perfis de expressão gênica foram analisados no iBAT de camundongos DIO que receberam uma injeção única de BsAb17, FGF21 ou lgG de controle. Conforme mostrado na Figura 19G, a injeção única de BsAb17 reduziu as alterações na expressão gênica no iBAT que se assemelha a injeções duas vezes ao dia com FGF21.

[00409] Por fim, quando injetados em camundongos C57BL/6, tanto FGF21 como BsAb20 induziram fosforilação de ERK e MEK em diversos tecidos adiposos, incluindo iBAT e ingWAT (Figura 23).

[00410] Em estudos anteriores, a adiponectima foi sugerida como contribuinte para a ação total de FGF21 (Lin et al., Cell Metab 17, 779 a789 (2013); Holland et al., Cell Metab 17, 790 a 797 (2013)). De fato, a injeção única de BsAb17 nos camundongos DIO levou a um aumento nos níveis de adiponectina de alto peso molecular (HMW) no soro, com perda de peso associada (Figura 24A).

[00411] De maneira similar, a injeção única de BsAb17 nos macacos cinomolgos (Figura 24B) levou a um aumento nos níveis de adiponectina de alto peso molecular (HMW) no soro, com perda de peso associada.

[00412] Conforme mostrado na Figura 24C, na injeção única de BsAb17, a adiponectina (Adipoq) de camundongos KO em HFD exibiu uma resposta robusta na elevação de EE (25,3% de aumento versus 20,9% de aumento no peso dos camundongos).

[00413] Além disso, na injeção única de BsAb17, a adiponectina (Adipoq) de camundongos KO em HFD exibiu peso corporal e níveis de triglicérides hepáticos reduzidos (Figura 24D). No entanto, a resposta na tolerância à glicose, tolerância à insulina, alterações na insulina no soro e diversos lipídeos foram todas de alguma forma brandas nos camundongos KO (Figura 24D), consistentes com a ideia de que o BsAb17 atua como um mimético de FGF21 na regulação inteira do metabolismo corporal de nutrientes em parte através da função da adiponectina. Para determinar a tolerância à insulina, os camundongos foram deixados em jejum por 4 h e injetados por via intraperitonial com 1 U/kg de solução de insulina humana (Humulin R, Eli Lilly and Company).

[00414] A seletividade elevada do receptor de BsAb10 (consulte Figura 9A) e a baixa penetração cerebral de moléculas de IgG anteriormente descrita (Yu et al., Sci Transl Med 3, 84ra44 (2011)) previram um perfil de segurança alterado de BsAb10 e seus derivados, em comparação com FGF21/19. Consistente com o baixo nível de expressão de FGFR1 no fígado, FGF21, mas não BsAb17, induziu a expressão de mRNA dos genes alvo FGFR clássicos Spry4 e Dusp6 no fígado (Figura 25).

[00415] BsAb17 ou BsAb20 também resultou em um sinal fosfo- ERK aumentado em vários tecidos adiposos e células pancreáticas acinares, mas não no fígado (Figura 23).

[00416] A Figura 26 mostra que BsAb17 também não aumentou a fosforilação de ERK em diversos cortes cerebrais, incluindo órgãos circunventriculares, conforme determinado por imuno-histoquímica.

[00417] Além disso, o tratamento BsAb20 crônico de camundongos DIO por 8 semanas reduziu o número de células BrdU+ no fígado ao nível de camundongos C57BL/6 magros, o oposto do que foi esperado para atividade similar a FGF19 (Figura 27). Para a incorporação de BrdU hepático, camundongos foram injetados de forma intraperitonial com 100 mg/kg de BrDU (BD Biosciences) a 2 h antes da eutanásia. A coloração Anti- BrdU foi realizada conforme descrito (Nicholes, K., et al. Am. J. Pathol. 160, 2295 a 2307 (2002)) e os hepatócitos positivos para BrDU foram contados com o uso de um sistema de análise de imagens automatizado Ariol.

[00418] A análise óssea dos camundongos que foram tratados com um anticorpo anti-KLB/anti-FGFR1c foi realizada. A Figura 28A mostra uma representação esquemática da análise. Para realizar a análise óssea, amostras do fêmur foram analisadas por imagem em um sistema de microanálise por imagem SCANCO Medical (Basserdorf, Suíça) μCT40 operando com um nível de energia do tubo de raios X a 70 keV e uma corrente de 114 microamperes. Fatias de imagem axial contínuas foram obtidas com um tamanho de voxel isotrópico de 12 μm. A análise morfométrica do osso trabecular dentro do fêmur foi realizada com o programa de computação de avaliação SCANCO Medical (Basserdorf, Suíça) μCT40. O contorno semi- automatizado foi usado para definir um volume de interesse (VOI), compreendendo a dorsal óssea trabecular secundária até a placa de crescimento do fêmur proximal e se estendendo 1,5 mm distal até o osso trabecular primário. O osso cortical foi excluído por colocação de bordas do VOI dentro da borda interna do osso cortical. Antes da segmentação da imagem, um filtro passa-baixo Gaussiano tridimensional (3D) restrito foi aplicado aos dados da imagem para supressão de ruído (sigma do filtro = 0,5, suporte do filtro = 1). Um limite global (0,36 gHA/cm3) foi aplicado para extrair uma estrutura trabecular “binarizada” do VOI. O limite de segmentação trabecular foi escolhido por inspeção visual dos resultados da segmentação a partir de um subconjunto representativo de amostras. As características estruturais trabeculares foram quantificadas por análise morfométrica 3D direta. Os estudos anteriores demonstraram que a análise morfométrica do osso trabecular por tomografia microcomputadorizada é bem correlacionada com estimativas similares feitas por histomorfometria.

[00419] Conforme mostrado na Figura 28B, o tratamento com BsAb20 crônico de camundongos DIO por 6 semanas resultou nas alterações esperadas nos parâmetros metabólicos sem nenhum sinal negativo em diversos parâmetros ósseos nos ossos na trabecular tibial e na cortical femoral com base em tomografia microcomputadorizada.

[00420] Conforme mostrado na Figura 29, a injeção de BsAb17 nos camundongos DIO não aumentou os níveis de corticosterona do soro acima do controle. O equilíbrio de energia positiva crônica comum na sociedade moderna conduziu à obesidade pandêmica e aos desarranjos metabólicos associados, caracterizados por resistência à insulina, hiperinsulinemia, intolerância à glicose, hiperlipidemia e esteatose hepática, que com frequência levam a doenças graves, como diabetes tipo 2, cirrose, acidente vascular cerebral e doenças cardíacas. Em 2009, a presença de BAT positiva para UCP-1 e humanos adultos e sua significância funcional na condição EE através da dissipação de calor foram relatadas, iniciando um interesse imenso na indução e ativação terapêutica de BAT para o tratamento de obesidade e doenças metabólicas relacionadas (Yoneshiro e Saito, Ann. Med., 1-9 (2014)).

[00421] No entanto, a maioria dos mecanismos de ativação de BAT conhecidos também induziu a lipólise do tecido adiposo branco, que pode ter um impacto negativo nos desfechos cardiovasculares (Dong et al., Cell Metab. 18, 118-129 (2013)). De importância, o transplante BAT aumenta EE e induz perda de peso sem alteração em RQ (Stanford et al., J. Clin. Invest. 123, 215-223 (2013)). Nesse aspecto, FGF21 e o anticorpo agonista FGFR1/KLB descrito no presente pedido apresenta uma abordagem única para induzir de forma seletiva a resposta termogênica no BAT sem alterar RQ, imitando assim o transplante BAT, ao invés de ativação simpática não específica. Além disso, com base no que foi observado em camundongos, é previsto que a ativação mediada pelo anticorpo do completo FGFR1c/KLB pode fornecer uma maneira mais segura e eficiente para terapia antiobesidade e antidiabética, em oposição à ativação do complexo FGFR/KLB mais ampla pelos análogos FGF21 ou FGF19.

EXEMPLO 10 HUMANIZAÇÃO DE ANTICORPO 8C5 ANTI-KLB

[00422] As CDRs da cadeia leve murina de 8C5 foram enxertadas nas estruturas da cadeia leve Kappa 2 e Kappa24 humanas. Além do enxerto principal, pontos de mutação também foram gerados em cada uma, de modo que a posição 4 da cadeia leve foi convertida para uma leucina (designada “M4L”). Foi realizada uma análise para identificar aqueles que expressaram a melhor e aqueles que não mostraram agregação significativa. De maneira similar, as CDRs de cadeia pesada foram enxertadas em estruturas de cadeia pesada H1, H2, H3 e H4 IgG1. Diversos resíduos nas cadeias principais pesadas foram mutados da seguinte forma: para H1 as alterações a seguir foram introduzidas: K71R, N73T e V78A (anteriormente designados como “KNV” e o construto designado como “RTA”); para H2, a alteração a seguir foi introduzida: N73T (anteriormente designado como “KNV” e o construto designado como “KTV”); para H3, as alterações a seguir foram introduzidas: K71R e V78L (anteriormente designados como “KNV” e o construto designado como “RNL”); para H4, as alterações a seguir foram introduzidas: K71V, N73T, e V78F (anteriormente designados como “KNV” e o construto designado como “VTF”).

[00423] Anticorpos com base em todas combinações de pareamento de 4 cadeias leves e 8 cadeias pesadas (para um total de 32 anticorpos) foram produzidos e os níveis de expressão e afinidade foram testados. Com base nesses experimentos, o 8C5 derivou a cadeia leve K4.M4L e a cadeia pesada H3.KNV exibiu a melhor combinação de nível de expressão e afinidade desejada.

[00424] As sequências das regiões variáveis 8C5.K4.M4L.H3.KNV e anticorpos inteiros são da seguinte forma:

REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA 8C5.K4.M4L.H3.KNV

[00425] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDFSLTTYGVHW VRQAPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCARDYGSTYVDAIDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 128)

CADEIA PESADA INTEIRA 8C5.K4.M4L.H3.KNV

[00426] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDFSLTTYGVHW VRQAPGKGLEWLGVIWSGGSTDYNAAFISRLTISKDNSKNTVYLQMNSLRA EDTAVYYCARDYGSTYVDAIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKS TSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSS VVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTI SKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQ PENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHY TQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 129)

REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE DE 8C5.K4.M4L.H3.KNV

[00427] DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVESYGNRYM TWYQQKPGQPPKLLIYRAANLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA VYYCQQSNEDPWTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 130)

CADEIA LEVE INTEIRA 8C5.K4.M4L.H3.KNV

[00428] DIVLTQSPDSLAVSLGERATINCRASESVESYGNRYM TWYQQKPGQPPKLLIYRAANLQSGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVA VYYCQQSNEDPWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCL LNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 131)

EXEMPLO 11 GERAÇÃO DE UM ANTICORPO ANTI-FGFR1 HÍBRIDO ENTRE YW182.3 E YW182.5

[00429] YW182.5, que foi o braço anti-FGFR1 que não ativa o complexo KLB/FGFR1c na ausência de um braço anti-FGFR1, foi descoberto para dar bons resultados quando combinado com 8C5, e tem um triptofano como posição 33 da cadeia pesada que é suscetível à oxidação. YW182.2, que aparece para se ligar ao mesmo epítopo como YW182.5, também tem esse triptofano na posição 33 da cadeia pesada. Várias mutações foram introduzidas a essa posição para se livrar desse problema: para YW182.5 foram introduzidas W33Y, W33H, W33F e W33L e para YW182.2 foram introduzidas W33Y e W33F. Surpreendentemente, as mutações introduzidas tinham efeitos diferentes nos dois anticorpos. No caso de YW182.2, observou-se que as mutações não afetaram significativamente a afinidade ou atividade agonística para FGFR1, enquanto que para YW182.5 as mutações diminuíram consideravelmente a afinidade e atividade agonística para FGFR1 (consulte, por exemplo, Figura 31). Portanto, experimentos foram realizados para identificar um anticorpo com as mutações W33Y, mas com uma afinidade mais próxima do que a do anticorpo YW182.5 com o uso de duas abordagens.

[00430] Em uma abordagem, para a YW182.2 foi realizada varredura de alanina da sequência da cadeia pesada W33Y através de CDR3, mutando posições 95, 96, 97, 98, 99, 100, 100a e 100b para alanina. A afinidade dos anticorpos resultantes foi analisada e aquelas que mantiveram a afinidade muito alta do parental W33Y YW182.2 foram identificadas (Tabela 9). TABELA 9 AFINIDADE DE DERIVADOS DE YW182.2

[00431] Em uma segunda abordagem, CDRs do anticorpo YW182.2 W33Y (com afinidade muito alta) e o anticorpo YW182.5 W33Y (com quase nenhuma ligação) foram misturados e combinados. Os anticorpos YW182.2 W33Y e YW182.5 W33Y têm sequências de CDR idênticas na cadeia leve (CDR-L1, RASQDVSTAVA (SEQ ID NO: 139); CDR-L2, SASFLYS (SEQ ID NO: 140); e CDR-L3 QQSYTTPPT (SEQ ID NO: 141) uma única diferença de aminoácido na CDR-H1 (YW182.2 W33Y CDR-H1, STYIS (SEQ ID NO: 152) e YW182.5 W33Y CDR-H1, SNYIS (SEQ ID NO: 136)); três diferenças de aminoácido na ou adjacente a CDR-H2 (YW182.2 W33Y CDR-H2, EIDPYDGDTYYADSVKG (SEQ ID NO: 137 e YW182.5 W33Y, EIDPYDGATDYADSVKG (SEQ ID NO: 153)); e muitas diferenças de sequências de CDR-H3 (YW182.2 W33Y, EHFDAWVHYYVMDY (SEQ ID NO: 154) e YW182.5 W33Y GTDVMDY (SEQ ID NO: 138). Anticorpos com cadeias pesadas baseadas em todas as possíveis combinações de CDRs da cadeia pesada de YW182.5 W33Y e YW182.2 W33Y (oito incluindo os dois anticorpos parentais) foram construídos e testados. A maioria dos anticorpos tinham afinidade similar a um ou a outro, mas, surpreendentemente, uma combinação demonstrou a ligação que foi quase idêntica ao anticorpo YW182.5 parental. Esse anticorpo tem a CDR-H1 e CDR-H3 de YW182.5 W33Y, mas a CDR-H2 de YW182.2 W33Y. Esse anticorpo foi projetado como “YW182.5 YGDY” para representar as seguintes alterações na sequência YW182.5: W33Y, A49G, A56D e D58Y.

[00432] As sequências do anticorpo YGDY YW182.5 são da seguinte forma:

REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA PESADA YW182.5 YGDY

[00433] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSNYISWVRQ APGKGLEWVGEIDPYDGDTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAV YYCATGTDVMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 132).

CADEIA PESADA INTEIRA YW182.5 YGDY

[00434] EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFTSNYISWVRQ APGKGLEWVGEIDPYDGDTYYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAV YYCATGTDVMDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVK DYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICN VNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISR TPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTV LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR WQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 133).

REGIÃO VARIÁVEL DA CADEIA LEVE DE YW182.5 YGDY

[00435] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQK PGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTT PPTFGQGTKVEIK (SEQ ID NO: 134).

CADEIA LEVE INTEIRA YW182.5 YGDY

[00436] DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQK PGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYTT PPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQW KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLS SPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 135)

EXEMPLO 12 VERIFICAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS COM VARIANTES 8C5 E ANTI-FGFR1 HUMANIZADAS

[00437] Várias combinações de anticorpos biespecíficos de 8C5.K4H3.M4L.KNV e diferentes braços anti-FGFR1 foram testados no ensaio de luciferase baseado em GAL-ELK1o em células HEK293 que expressam FGFR1c com ou sem KLB. Conforme anteriormente observado, cada combinação de anticorpo biespecífico induziu atividade de luciferase de maneira dose-dependente em células que expressam hFGFR e hKLB recombinante, mas não em células sem expressão de KLB (Figura 30). Esses dados confirmam que essas variantes modificadas mantêm as vantagens dos anticorpos parentais, por exemplo, BsAb13. A afinidade de ligação de um anticorpo anti-KLB/anti-FGFR1 que tem um braço 8C5 humanizado (8C5.K4.M4L.H3.KNV) e um braço YW182.5_YGDY para complexos KLB/FGFR1c de humanos, macaco cinomolgos e camundongo na superfície de células HEK293 são mostradas na Tabela 10. TABELA 10 AFINIDADES DE LIGAÇÃO

[00438] Em adição a várias realizações representadas e reivindicadas, a matéria em questão divulgada também é direcionada a outras realizações que têm outras combinações das características divulgadas e reivindicadas no presente pedido. Como tal, os recursos específicos apresentados no presente pedido podem ser combinados uns com os outros de outras maneiras dentro do escopo da matéria em questão divulgada de modo que a matéria em questão divulgada inclui qualquer combinação adequada das características divulgadas no presente pedido. A descrição anteriormente mencionada de realizações específicas da matéria em questão divulgada foi apresentada para propósitos de ilustração e descrição. Não se pretende ser exaustiva ou limitar a matéria em questão divulgada às realizações divulgadas.

[00439] Ficará evidente para os técnicos no assunto que várias modificações e variações podem ser feitas em composições e métodos da matéria em questão divulgada sem se afastar do espírito ou do escopo da matéria em questão divulgada. Dessa forma, pretende-se que a matéria em questão divulgada inclua modificações e variações que estão dentro do escopo das reivindicações anexas e seus equivalentes.

[00440] Várias publicações, patentes e pedidos de patentes são citados no presente pedido, cujos conteúdos são integralmente incorporados ao presente pedido como referência.

Claims

1. ANTICORPO BIESPECÍFICO ISOLADO OU UMA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, caracterizado por se ligar ao beta-Klotho (KLB) e Receptor 1c do Fator de Crescimento de Fibroblasto (FGFR1c), em que o anticorpo biespecífico ou porção de ligação ao antígeno do mesmo, compreende: (a) um primeiro braço compreendo: um domínio CDR1 da região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 15, um domínio CDR2 da região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 31, um domínio CDR3 da região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 47, um domínio CDR1 da região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 62, um domínio CDR2 da região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 78, e um domínio CDR3 da região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 93, e (b) um segundo braço compreendo: um domínio CDR1 da região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 136, um domínio CDR2 da região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentadana SEQ ID NO: 137, um domínio CDR3 da região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 138, um domínio CDR1 da região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 139, um domínio CDR2 da região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 140, e um domínio CDR3 da região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 141.

2. ANTICORPO BIESPECÍFICO ISOLADO OU UMA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo anticorpo biespecífico ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo ser um anticorpo monoclonal ou ser um anticorpo humano, humanizado ou quimérico.

3. ANTICORPO BIESPECÍFICO ISOLADO OU UMA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo primeiro braço compreender: (a) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 128 e (b) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada da SEQ ID NO: 130.

4. ANTICORPO BIESPECÍFICO ISOLADO OU UMA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo primeiro braço compreender: (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 129 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 131.

5. ANTICORPO BIESPECÍFICO ISOLADO OU UMA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo segundo braço compreender: (a) uma região variável da cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 132 e (b) uma região variável da cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 134.

6. ANTICORPO BIESPECÍFICO ISOLADO OU UMA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo segundo braço compreender: (a) uma cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 133 e (b) uma cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO: 135.

7. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender um ou mais anticorpos biespecíficos ou uma porção de ligação ao antígeno dos mesmos, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

8. FORMULAÇÃO, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por ainda compreender um agente terapêutico adicional.

9. USO DO ANTICORPO BIESPECÍFICO OU UMA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por ser para a fabricação de um medicamento para tratar de uma disfunção metabólica selecionada do grupo que consiste em síndrome metabólica (MetS), obesidade, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), diabetes tipo 2, diabetes não tipo 2, diabetes tipo 1, diabetes autoimune latente (LAD), e diabetes da maturidade com início na juventude (MODY).

10. USO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela disfunção metabólica ser diabetes.

11. USO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela disfunção metabólica ser diabetes tipo 2.

12. USO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pela disfunção metabólica ser NASH.

13. ANTICORPO BIESPECÍFICO OU UMA PORÇÃO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo anticorpo ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo ativar o complexo KLB-FGFR1c.