KR20210056364A - 친화성 모세관 전기영동을 위한 시스템 및 방법 - Google Patents
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Abstract
개시된 본원 발명은 폴리펩티드들의 복합 혼합물, 예컨대, 멀티-서브유닛 단백질들에서 적어도 하나의 폴리펩티드 종을 스크리닝하는 조성물, 시스템 및 방법들에 관한 것이다. 예를 들면, 본 발명은 친화성 모세관 전기영동과 관련하여 사용되는 리간드, 및 멀티특이적 항체들, 예컨대, 이중특이적 항체들을 포함하는 다량체의 혼합물에서 폴리펩티드를 검출하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 9월 10일 출원된 미국 가특허 출원 제 62/729,384에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은 그 전문이 참고문헌으로 포함된다.
기술 분야
개시된 본원 발명은 폴리펩티드들의 복합 혼합물에서 하나 이상의 폴리펩티드 종을 스크리닝하는 조성물, 시스템 및 방법들에 관한 것이다. 특히, 본원에 개시된 발명은 친화성 모세관 전기영동과 관련하여 사용되는 리간드, 및 다중특이적 항체들, 예컨대, 이중특이적 항체들을 포함하는 다량체의 혼합물에서 폴리펩티드를 검출하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.
배경
이중특이적 항체 (BsAbs)는 두 개의 서로 다른 항원 표적을 인식하는 독특한 능력으로 인해 최근 몇 년 동안 광범위한 치료적 관심을 끌었다. BsAbs의 치료적 사용에 대한 관심에도 불구하고 기존의 생산 방법은 바람직하지 않은 부산물을 생성하고 복잡한 정제 공정을 필요로 할 수 있었기 때문에 상업적 생산이 어려웠다. 예를 들어, 특정 BsAbs는 놉-인투-홀 기술을 통해 생성되었는데, 이에 의해 중쇄의 CH3 도메인에서 상보적 돌연변이가 만들어져 "놉" 및 "홀" 구조를 형성하였다. 동일한 중쇄/경쇄 서브유닛의 이량체화에 의존 할 수 있는 기존 항체의 생산과는 달리, 노브-인투-홀 기술을 사용하면 큰 아미노산 측쇄는 중쇄들 중 하나의 CH3 도메인에 도입되고 그 측쇄들은 또 다른 중쇄의 CH3 도메인에 적절하게 설계된 공동에 맞게 된다. 사슬 미스페어링 (예컨대, 동일한 중쇄 펩티드의 동종-이량체화 또는 부적절한 중쇄/경쇄 결합)이 관찰될 수 있으며 이는 놉-놉 및 홀-홀 동종이량체 (HD) 종들 모두를 포함하는 독특한 생성물-관련 불순물 세트를 생성한다. 이러한 동종이량체 변이체는 낮은 수준으로 존재할 수 있고 의도한 BsAb 생성물 및 기타 BsAb 분자 변이체와 매우 유사한 물리화학적 특성을 가질 수 있으므로 정량화하기 어려울 수 있다.
따라서, 바람직하지 않은 단백질 생성물로부터 표적 BsAb를 정제하고 정량화하기 위한 시스템 및 기술이 여전히 필요하다.
발명의 요약
개시된 본원 발명은 폴리펩티드들의 복합 혼합물에서 하나 이상의 폴리펩티드 종을 스크리닝하는 조성물, 시스템 및 방법들에 관한 것이다. 특히, 본원에 개시된 발명은 친화성 모세관 전기영동과 관련하여 사용되는 리간드, 및 다중특이적 항체들, 예컨대, 이중특이적 항체들을 포함하는 다량체의 혼합물에서 폴리펩티드를 검출하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 다음을 포함하는, 샘플 내 멀티-서브유닛 단백질을 분리하는 시스템에 관한 것이다: a) 리간드, b) 배경 전해질 완충액, c) 샘플, d) 모세관, e) 모세관의 한 쪽 말단 또는 그 근처의 애노드, 및 f) 모세관의 다른 쪽 말단 또는 그 근처의 캐소드, 이 때 샘플은 리간드와 혼합되어 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 형성하고 모세관의 애노드 끝에서 모세관에 부하되며, 그리고 모세관은 리간드와 혼합된 배경 전해질 완충액으로 채워진다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 시스템은 모세관의 캐소드 말단 근처에 위치하는 검출기를 추가로 포함하고, 이 때 검출기는 210 nm 내지 220 nm 광 흡광도 또는 레이저 유도 형광을 검출한다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 시스템은 샘플을 포함하고, 이 때 샘플은 적어도 하나의 동종이량체, 적어도 하나의 이종이량체, 또는 이들의 조합을 포함한다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 시스템은 제 1 리간드-단백질 복합체를 포함하고, 이는 리간드가 적어도 하나의 이종이량체의 제 1 서브유닛에 결합하고 적어도 하나의 이종이량체의 제 2 서브유닛에 결합하지 않을 때 형성된다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 시스템은 제 2 리간드-단백질 복합체를 포함하고, 이는 리간드가 동종이량체의 적어도 2개의 동일한 제 1 또는 제 2 서브유닛에 결합 할 때 형성된다. 특정 구체예들에서, 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체는 리간드가 멀티-서브유닛 단백질의 서브유닛에 결합 할 때 형광 (또는 기타 검출가능한) 표지, 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성 또는 이들의 조합을 갖도록 구성된다. 특정 구체예들에서, 제 2 리간드-단백질 복합체는 제 1 리간드-단백질 복합체보다 더 낮은 전기영동 이동성을 갖는다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 시스템은 리간드가 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편인 리간드를 포함한다. 특정 구체예들에서, 리간드는 형광 표지된 폴리펩티드 또는 형광 표지된 폴리펩티드 단편이다. 특정 구체예들에서, 리간드는 인간 CD3, 마우스 CD3 폴리펩티드, 랫트 CD3 폴리펩티드, 토끼 CD3 폴리펩티드 및 시노몰구스 원숭이 CD3 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예들에서, 리간드는 리간드의 비-결합 영역에 하나 이상의 아미노산을 첨가함으로써 변형된다. 특정 구체예들에서, 하나 이상의 아미노산은 글루탐산, 아스파르트산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예들에서, 첨가되는 하나 이상의 아미노산은 리간드의 전하 및 질량을 변경하도록 구성된다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 시스템은 저 pH 요소 완충액에서 리간드와 추가로 혼합되어 있는 샘플을 포함한다. 특정 구체예들에서, 본 발명은 고 pH HEPES 완충액과 0.1% PS20을 샘플과 리간드의 혼합물에 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 시스템은 아미노-n-카프로산 (EACA), 트리에틸렌테트라민 (TETA) 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스 (HPMC)를 포함하는 배경 전해질 완충액을 포함한다. 특정 구체예들에서, 배경 전해질 완충액은 상기 방법의 적어도 하나의 이종이량체의 제 1 서브유닛에 결합하고 적어도 하나의 이종이량체의 제 2 서브유닛에 결합하지 않는 리간드를 포함한다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 샘플 내 멀티-서브유닛 단백질을 분리하는 방법에 관한 것이다: (a) 샘플과 리간드의 혼합물을 생성하여 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 형성하는 단계, (b) 혼합물을 모세관에 적용하는 단계, 이 때 모세관은 리간드와 혼합된 배경 전해질 완충액으로 채워지고, (c) 모세관에 전압을 적용하는 단계, 및 (d) 멀티-서브유닛 단백질 및 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 모세관을 통해 이동하도록 하는 단계, 이 때 리간드-단백질 복합체는 리간드가 멀티-서브유닛 단백질의 서브유닛에 결합 할 때 형광 (또는 기타 검출가능한) 표지, 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성 또는 이들의 조합을 갖도록 구성되고, 이로써 샘플 내 멀티-서브유닛 단백질들을 분리한다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 샘플 혼합물에서 표적 단백질을 단리하는 방법에 관한 것이다: (a) 샘플과 리간드의 혼합물을 생성하여 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 형성하는 단계, (b) 혼합물을 모세관에 적용하는 단계, 이 때 모세관은 리간드와 혼합된 배경 전해질 완충액으로 채워지고, (c) 모세관에 전압을 적용하는 단계, (d) 멀티-서브유닛 단백질 및 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 모세관을 통해 이동하게 하는 단계, 이 때 리간드-단백질 복합체는 리간드가 멀티-서브유닛 단백질의 서브유닛에 결합 할 때, 형광 (또는 기타 검출가능한 표지), 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성 또는 이들의 조합을 갖도록 구성되고, 그리고 (e) 비-표적 단백질들로부터 분리된 표적 단백질을 단리하는 단계.
특정 구체예들에서, 본 발명은 캐소드 말단, 애노드 말단 및 검출기를 포함하는 모세관의 사용 방법에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 모세관은 약 50 μm의 내경을 갖는다. 특정 구체예들에서, 모세관은 약 20cm의 검출기까지의 거리를 갖는다. 특정 구체예들에서, 모세관은 약 30cm의 전체 길이를 갖는다. 특정 구체예들에서, 검출기는 모세관의 캐소드 말단 근처에 존재하고 210 nm 내지 220 nm 광 흡광도 또는 레이저 유도 형광을 검출한다. 특정 구체예들에서, 전압은 30 킬로볼트이다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 샘플을 사용하는 방법에 관한 것으로, 이 때 샘플은 적어도 하나의 동종이량체, 적어도 하나의 이종이량체 또는 이들의 조합을 포함하고, 이 때 적어도 하나의 이종이량체는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛을 포함하고, 적어도 하나의 동종이량체는 적어도 2개의 동일한 제 1 또는 제 2 서브유닛을 포함한다. 특정 구체예들에서, 적어도 하나의 이종이량체는 이중특이적 항체를 포함한다. 특정 구체예들에서, 적어도 하나의 동종이량체는 단클론 항체를 포함한다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 리간드의 사용 방법에 관한 것이며, 이 때 리간드는 펩티드 또는 펩티드 단편이다. 특정 구체예들에서, 리간드는 형광 표지된 펩티드 또는 형광 표지된 펩티드 단편이다. 특정 구체예들에서, 리간드는 인간 CD3, 마우스 CD3 펩티드, 랫트 CD3 펩티드, 토끼 CD3 펩티드 및 시노몰구스 원숭이 CD3 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예들에서, 리간드는 리간드의 비-결합 영역에 하나 이상의 아미노산을 첨가함으로써 변형되도록 구성된다. 특정 구체예들에서, 하나 이상의 아미노산은 글루탐산, 아스파르트산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예들에서, 첨가되는 하나 이상의 아미노산은 리간드의 전하 및 질량을 변경하도록 구성된다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 리간드가 적어도 하나의 이종이량체의 제 1 서브유닛에 결합하고 적어도 하나의 이종이량체의 제 2 서브유닛에 결합하지 않을 때 제 1 리간드-단백질 복합체가 형성되는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 본 발명은, 리간드가 동종이량체의 적어도 2개의 동일한 제 1 또는 제 2 서브유닛에 결합 할 때 제 2 리간드-단백질 복합체가 형성되는 방법에 관한 것이다.
특정 구체예들에서, 상기 본 발명은 저 pH 요소 완충액을 샘플과 리간드의 혼합물에 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 본 발명은 고 pH HEPES 완충액과 0.1% PS20을 샘플과 리간드의 혼합물에 혼합하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 본 발명은 배경 전해질 완충액이 아미노-n-카프로산 (EACA), 트리에틸렌테트라민 (TETA) 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스 (HPMC)를 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 배경 전해질 완충액은 상기 방법의 적어도 하나의 이종이량체의 제 1 서브유닛에 결합하고 적어도 하나의 이종이량체의 제 2 서브유닛에 결합하지 않는 리간드를 포함한다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 샘플 내 표적 단백질의 양을 정량화하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 관한 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은 전통적인 분석 방법으로는 검출을 어렵게 하는 유사한 물리화학적 특성을 갖는 예시적인 이중특이적 항체 및 생성물-관련 불순물 (반 항체 및 동종이량체 포함)을 도시한다.
도 2는 친화성 모세관 전기영동에 의한 특정 항체 샘플의 이론적 분리 메커니즘을 도시한다.
도 3은 동종이량체 검출을 위한 예시적인 친화성 모세관 전기영동을 도시한다. 리간드가 분리에 앞서 샘플과 혼합될 때 불완전한 간헐적 복합체 형성이 관찰되었다.
도 4는 배경 전해질에 과량의 리간드가 첨가된 친화성 전기영동의 예시적 성능을 도시한다.
도 5A는 친화성 전기영동의 성능을 개선하기 위한 예시적인 변형된 리간드를 도시한다. 도 5B는 변형된 리간드를 사용한 친화성 전기영동의 예시적인 성능을 도시한다.
도 6은 CD3 + E 펩티드의 예시적 성능을 도시한다.
도 7은 항-CD3 동종이량체의 pH 의존적 형태 이성질체를 도시한다. 저 pH 샘플 적용은 단일 확인을 유도하고 신호 대 잡음을 개선하는데, 이는 본원에 기재된 바와 같이, 고 pH 적용에 의해서도 구현된다.
도 8은 시간 경과에 따른 샘플에서 0.1% PS20에 의한 개선된 항-CD3 동종이량체 회복을 도시한다.
도 9는 예시적인 올리고머 상호작용 메커니즘을 도시한다.
도 10A-10B는 스파이크된 불순물에 의한 항-CD3 영역 내 간접 피크 식별을 도시한다. 10A는 HEPES 완충액과의 초기 혼합물 이후의 결과를 도시하는 반면, 10B는 고 pH 형태로 완전 전환한 후의 결과를 도시한다.
도 11은 2개의 동종이량체의 상호작용에 의한 예시적인 올리고머 형성을 도시한다.
도 12는 저 pH 및 요소에 의한 예시적인 올리고머 해리를 도시한다. 샘플 완충액은 pH 3.5를 가지며 요소를 포함한다. 요소 및 저 pH는 항-CD3와 항 CD20 Hd들의 상호작용을 방지한다 (SEC로 확인).
도 13은 BsAb 참조 표준에서 올리고머를 나타내는 예시적인 친화성 모세관 전기영동 분석을 도시한다.
도 14는 예시적인 저 pH 친화성 모세관 전기영동법을 도시한다.
도 15는 친화성 모세관 전기영동 분석법의 예시적 성능을 완전한 질량 분석법과 비교하여 도시한다.
도 1은 전통적인 분석 방법으로는 검출을 어렵게 하는 유사한 물리화학적 특성을 갖는 예시적인 이중특이적 항체 및 생성물-관련 불순물 (반 항체 및 동종이량체 포함)을 도시한다.
도 2는 친화성 모세관 전기영동에 의한 특정 항체 샘플의 이론적 분리 메커니즘을 도시한다.
도 3은 동종이량체 검출을 위한 예시적인 친화성 모세관 전기영동을 도시한다. 리간드가 분리에 앞서 샘플과 혼합될 때 불완전한 간헐적 복합체 형성이 관찰되었다.
도 4는 배경 전해질에 과량의 리간드가 첨가된 친화성 전기영동의 예시적 성능을 도시한다.
도 5A는 친화성 전기영동의 성능을 개선하기 위한 예시적인 변형된 리간드를 도시한다. 도 5B는 변형된 리간드를 사용한 친화성 전기영동의 예시적인 성능을 도시한다.
도 6은 CD3 + E 펩티드의 예시적 성능을 도시한다.
도 7은 항-CD3 동종이량체의 pH 의존적 형태 이성질체를 도시한다. 저 pH 샘플 적용은 단일 확인을 유도하고 신호 대 잡음을 개선하는데, 이는 본원에 기재된 바와 같이, 고 pH 적용에 의해서도 구현된다.
도 8은 시간 경과에 따른 샘플에서 0.1% PS20에 의한 개선된 항-CD3 동종이량체 회복을 도시한다.
도 9는 예시적인 올리고머 상호작용 메커니즘을 도시한다.
도 10A-10B는 스파이크된 불순물에 의한 항-CD3 영역 내 간접 피크 식별을 도시한다. 10A는 HEPES 완충액과의 초기 혼합물 이후의 결과를 도시하는 반면, 10B는 고 pH 형태로 완전 전환한 후의 결과를 도시한다.
도 11은 2개의 동종이량체의 상호작용에 의한 예시적인 올리고머 형성을 도시한다.
도 12는 저 pH 및 요소에 의한 예시적인 올리고머 해리를 도시한다. 샘플 완충액은 pH 3.5를 가지며 요소를 포함한다. 요소 및 저 pH는 항-CD3와 항 CD20 Hd들의 상호작용을 방지한다 (SEC로 확인).
도 13은 BsAb 참조 표준에서 올리고머를 나타내는 예시적인 친화성 모세관 전기영동 분석을 도시한다.
도 14는 예시적인 저 pH 친화성 모세관 전기영동법을 도시한다.
도 15는 친화성 모세관 전기영동 분석법의 예시적 성능을 완전한 질량 분석법과 비교하여 도시한다.
상세한 설명
개시된 본원 발명은 폴리펩티드들의 복합 혼합물에서 하나 이상의 폴리펩티드 종을 스크리닝하는 조성물, 시스템 및 방법들에 관한 것이다. 예를 들어, 제한없이, 본원에 개시된 발명은 예를 들어, 이중특이적 항체와 같은 다중특이적 항체를 포함하는 다량체의 혼합물에서 표적 항체를 검출하기 위한 친화성 모세관 전기영동 (ACE) 방법에 적용가능하다. 본원 발명은 또한 이러한 표적 항체를 검출하고 단리하는데 사용되는 리간드 및 전기영동 시스템에 관한 것이다. 본원에 개시된 전기영동 방법은 단독으로 사용될 수 있거나, 예를 들어, 치료 및/또는 진단 적용에 있어서 특정 수준의 이중특이적 항체 순도를 달성하기 위해 당업계에 공지된 통상적인 정제 공정 및 단위 작업과 추가로 조합 될 수 있다.
제한이 아닌 공개의 명확성을 위해 상세한 설명을 다음과 같은 하위섹션으로 나눈다:
1. 정의
2. 표적 멀티-서브유닛 단백질을 단리 및 정량화하는 리간드
3. 표적 멀티-서브유닛 단백질을 단리 및 정량화하는 시스템
4. 표적 멀티-서브유닛 단백질을 단리 및 정량화하는 방법
1.
정의
본 발명의 실시는, 달리 지시되지 않는 한, 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 및 생화학의 통상적인 기술을 사용할 것이며, 이들은 당업자의 기술 범위에 속한다. 이러한 기술은 문헌, 가령, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2nd edition (Sambrook 외., 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (M.J. Gait, ed., 1984); “Animal Cell Culture” (R.I. Freshney, ed., 1987); “Methods in Enzymology” (Academic Press, Inc.); “Handbook of Experimental Immunology”, 4th edition (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (F.M. Ausubel 외., eds., 1987); 및 “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis 외., eds., 1994)에 상세히 설명되어 있다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 용어, 표기법 및 기타 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 것으로 한다. 일부 경우에, 일반적으로 이해되는 의미를 갖는 용어는 명확성을 위해 및/또는 용이한 참조를 위해 본원에서 정의되며, 이러한 정의를 포함시키는 것은 반드시 당업계에서 일반적으로 이해되는 것과 실질적인 차이를 나타내는 것으로 해석되어서는 안된다. 적절한 경우, 상업적으로 구입가능한 키트 및 시약의 사용을 포함하는 절차는 일반적으로 달리 명시되지 않는 한 제조업체가 정의한 프로토콜 및/또는 매개변수에 따라 수행된다. 따라서, 본 방법, 키트 및 용도를 설명하기 전에, 본원 발명이 이렇게 기재된 특정 방법론, 프로토콜, 세포주, 동물 종 또는 속, 구조체 및 시약에 제한되지 않으며, 물론, 변화할 수 있음을 이해하여야 한다. 본 명세서에서 사용되는 용어는 특정 구체예들을 오직 설명하기 위한 것이며, 제한을 하고자 하는 것이 아니므로, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 것임을 또한 이해하여야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는, 단수형 “하나” 및 “그것”은 문맥에서 달리 명확히 언급이 없는 한 복수형을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “약” 또는 “대략”은 해당 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정된 특정 수치에 대해 허용가능한 오차 범위 내에 있음을 의미할 수 있으며, 이는 부분적으로 그 수치가 어떻게 측정 또는 결정되는지, 예컨대, 측정 시스템의 한계에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, “약”은 주어진 값에서 실시 당 1 또는 1 초과의 표준 편차 이내임을 의미할 수 있다. 특정 값이 출원 및 청구범위에 기재된 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 “약”은 용어 “약”에 의해 변형되는 값의 ± 10%와 같이, 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위를 의미 할 수 있다.
용어 “친화성”은 분자의 단일 결합 부위(예를 들어, 항체)와 이의 결합 짝(예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총 강도를 의미한다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 사용되는 “결합 친화도”는 결합 쌍의 구성원 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유한 결합 친화성을 지칭하지만, 특정 내용에서 상호작용은 상이한 상호작용 비율을 포함 할 수 있는데, 예를 들어, aCD3 동종이량체와 관련하여 두 항원이 각각 aCD3 동종이량체에 결합하기 때문에 상호작용은 2:1 일 수 있다. 분자 X의 그 짝 Y에 대한 친화성은 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 나타낼 수 있다. 친화성은 본원에 기재된 것을 포함하여 당업계에 공지된 일반적인 방법에 의해 측정 될 수 있다. 결합 친화성을 측정하기 위한 특정한 예시적이고 전형적인 구체예들은 하기에 기재되어 있다.
본원에서 용어 “항체”는 가장 넓은 의미로 사용되며, 단클론 항체, 다클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편; 뿐만 아니라 탈면역화, 키메라, 인간화 및 인간 항체 및/또는 임의의 적합한 동물 출처 (예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니피그, 토끼, 염소, 양, 개, 말, 소, 원숭이, 유인원 및/또는 닭)로부터 유래한 항체, 면역 접합체, 합성 항체, 단쇄 Fv (scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편, 이황화-결합 Fv (sdFv), 인트라바디 및 상기 중 어느 하나의 에피토프-결합 단편을 포함한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 항체 구조를 포함한다.
항체 단편은 무손상(intact) 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자 (예컨대, scFv); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
관심 항원에 “결합하는 항체”는 항체가 분석 시약, 예를 들어, 포획 항체 또는 검출 항체로서 유용하도록 충분한 친화성으로 항원에 결합하는 항체이다. 일반적으로 이러한 항체는 다른 폴리펩티드와 유의하게 교차 반응하지 않는다. 표적 분자에 대한 폴리펩티드의 결합에 있어서, 특정 폴리펩티드 또는 특정 폴리펩티드 상의 에피토프에 “특이적 결합(specific binding)” 또는 “~에 특이적으로 결합하는(specifically binds to~)” 또는 “~에 특이적(specific for~)”이라는 용어는 측정가능한 수준으로 비-특이적 상호작용과 상이한 결합을 의미한다. 특이적 결합은, 예를 들어, 대조 분자의 결합과 비교하여 표적 분자의 결합을 결정함으로써 측정될 수 있으며, 대조 분자는 일반적으로 결합 활성을 가지지 않는 유사한 구조의 분자이다.
용어 “항-CD20 항체”는 이러한 항체가 CD20을 표적함에 있어서 하나의 제제로서, 예컨대, 본원에 기재된 분석의 제제로서 유용할 정도의 충분한 친화성으로 CD20에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 특정 구체예들에서, 관련없는, 비-CD20 단백질에 항-CD20 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역검정 (RIA)으로 측정한 CD20에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구체예들에서, CD20에 결합하는 항체는 ≤ 1 M, ≤ 100 mM, ≤ 10 mM, ≤ 1 mM, ≤ 100 μM, ≤ 10 μM, ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (Kd)를 가진다. 특정 구체예들에서, 본원에 개시된, CD20에 결합하는 항체의 Kd는, 10-3 M 이하 또는 10-8 M 이하, 예컨대, 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대, 10-9 M 내지 10-13 M 일 수 있다. 특정 구체예들에서, 본원에 개시된, CD20에 결합하는 항체의 Kd는, 10-10 M 내지 10-13 M 일 수 있다. 특정 구체예들에서, 항-CD20 항체는 다른 종들의 CD20 중에서 보존되는 CD20의 에피토프에 결합한다.
용어 “항-CD3 항체”는 이러한 항체가 CD3를 표적함에 있어서 하나의 제제로서, 예컨대, 본원에 기재된 분석의 제제로서 유용할 정도의 충분한 친화성으로 CD3에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 특정 구체예들에서, 관련없는, 비-CD3 단백질에 항-CD3 항체의 결합 정도는, 예를 들면, 방사면역검정 (RIA)으로 측정한 CD3에 대한 항체 결합의 약 10% 미만이다. 특정 구체예들에서, CD3에 결합하는 항체는 ≤ 1 M, ≤ 100 mM, ≤ 10 mM, ≤ 1 mM, ≤ 100 μM, ≤ 10 μM, ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM 또는 ≤ 0.001 nM의 해리 상수 (Kd)를 가진다. 특정 구체예들에서, 본원에 개시된, CD3에 결합하는 항체의 Kd는, 10-3 M 이하 또는 10-8 M 이하, 예컨대, 10-8 M 내지 10-13 M, 예컨대, 10-9 M 내지 10-13 M 일 수 있다. 특정 구체예들에서, 본원에 개시된, CD3에 결합하는 항체의 Kd는, 10-10 M 내지 10-13 M 일 수 있다. 특정 구체예들에서, 항-CD3 항체는 다른 종들의 CD3 중에서 보존되는 CD3의 에피토프에 결합한다.
“결합 도메인”은 표적 에피토프, 항원, 리간드, 또는 수용체에 특이적으로 결합하는 화합물 또는 분자의 일부를 의미한다. 결합 도메인은 항체 (예를 들어, 단클론, 다클론, 재조합, 인간화 및 키메라 항체), 항체 단편 또는 이의 일부 (예를 들어, Fab 단편, Fab'2, scFv 항체, SMIP, 도메인 항체, 디아바디, 미니바디, scFv-Fc, 아피바디, 나노바디 및 항체의 VH 및/또는 VL 도메인), 수용체, 리간드, 압타머 및 확인된 결합 짝을 갖는 기타 분자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
용어 “키메라” 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종으로부터 유래되지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 잔부는 상이한 출처 또는 종들로부터 유래한 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “분화 클러스터” 또는 “CD3”는, 달리 지시가 없는 한, 영장류 (예컨대, 인간) 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 랫트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 공급원으로부터의 임의의 고유 CD3를 지칭하며, 예를 들어, CD3εCD3γα, 및 CD3β사슬을 포함한다.
항체의 분류는 그 중쇄가 갖는 불변 영역 또는 불변 영역의 유형을 말한다. 항체에는 5 가지 주요 분류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들중 몇몇은 하위분류(아이소형), 예컨대, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가 세분될 수 있다. 면역글로불린의 상이한 분류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 a, d, e, g, 및 m로 불린다.
본 명세서 및 청구범위 전반에 걸쳐, “포함한다(comprise)”라는 단어 또는 “포함하는(comprises)” 또는 “포함하는(comprising)”과 같은 변형은 명시된 정수 또는 정수 그룹을 포함하지만, 다른 정수 또는 정수 그룹을 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다.
용어 “상관시키다” 또는 “상관시키는 것”은 제 1 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과를 제 2 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과와 어떤 식 으로든 비교하는 것을 의미한다. 예를 들어, 두 번째 프로토콜을 수행할 때 첫 번째 분석 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있고 및/또는 두 번째 분석 또는 프로토콜을 수행해야 하는지 여부를 결정하기 위해 첫 번째 분석 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있다. 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 구체예와 관련하여, 특정 치료 요법이 수행되어야하는지 여부를 결정하기 위해 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 결과를 사용할 수 있다.
용어 “검출”은 표적 분자, 예를 들어, CD20 또는 이의 가공된 형태의 정성적 및 정량적 측정을 모두 포함하기 위해 본원에서 사용된다. 특정 구체예들에서, 검출은 단순히 샘플 내 표적 분자의 존재를 식별하는 것, 뿐만 아니라 표적 분자가 검출가능한 수준으로 샘플 내 존재하는지 여부를 결정하는 것을 포함한다.
본원에서 사용되는 용어 “검출 수단”은, 차후 분석에서 판독되는 신호 기록을 통해 검출가능한 항체의 존재를 검출하는데 사용되는 모이어티 또는 기술을 지칭한다. 전형적으로, 검출 수단은 부동화된 표지, 가령, 마이크로타이터 플레이트에 포획되는 표지를 증폭시키는 시약, 예컨대, 검출제, 예컨대, 아비딘, 스트렙타비딘-HRP 또는 스트렙타비딘-β-D-갈락토피라노스를 사용한다.
본원에서 용어 “Fc 영역”은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는데 사용된다. 상기 용어는 고유 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 특정 구체예들에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226, 또는 Pro230으로부터 카르복실-말단까지 이어진다. 그러나, Fc 영역의 C 말단 리신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 명시적으로 다른 언급이 없는 한, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 EU 넘버링 체계, Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 소위 EU 색인에 따른다.
“프레임워크” 또는 “FR”은 초가변 영역(HVR) 잔기 이외의 가변 도메인 잔기를 의미한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인들로 구성된다: FR1, FR2, FR3, 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열들은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 다음의 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 “전장 항체”, “무손상 항체”, 및 “전체 항체”는 본 명세서에서 호환적으로 사용되며, 고유한 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본 명세서에서 정의된 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
“이종다량체”, “이종다량체 복합체”, 또는 “이종다량체 단백질”은 적어도 제 1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제 2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함하는 분자를 지칭하며, 이 때 제 2 힌지-함유 폴리펩티드는 아미노산 서열에 있어서 제 1 힌지-함유 폴리펩티드와 적어도 하나의 아미노산 잔기만큼 상이하다. 상기 이종이량체는 제 1 및 제 2 힌지-함유 폴리펩티드에 의해 형성된 “이종이량체”를 포함하거나, 또는 제 1 및 제 2 힌지-함유 폴리펩티드 이외의 폴리펩티드들이 존재하는 보다 고차인 3차 구조를 형성할 수 있다. 이종다량체의 폴리펩티드는 비-펩티드, 공유 결합 (예컨대, 이황화 결합) 및/또는 비공유 상호작용 (예컨대, 수소 결합, 이온 결합, 반데르발스 힘 및/또는 소수성 상호작용)에 의해 서로와 상호작용할 수 있다.
본원에 사용된 “이종다량체화 도메인”은 이종다량체 형성을 촉진하고 동종다량체 형성을 방해하기 위한, 생물학적 분자에 대한 변경 또는 추가를 의미한다. 동종이량체보다 이종이량체를 형성하는 것을 매우 선호하는 임의의 이종이량체화 도메인은 본원에 개시된 발명의 범위에 속한다. 예시적인 예는 예를 들어, 미국 특허 출원 20030078385 (Arathoon 외.-Genentech; 놉 인투 홀 기재); WO2007147901 (Kjæ외.-Novo Nordisk: 이온성 상호작용 기재); WO 2009089004 (Kannan 외.-Amgen: 정전기 조향 효과 기재); 미국 가특허출원 61/243,105 (Christensen 외.-Genentech; 코일형 코일 기재)를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 예를 들어, 류신 지퍼를 기재한 Pack, P. & Plueckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992) 또는 나선-회전-나선 모티프를 기재한 Pack 외., Bio/Technology 11, 1271-1277 (1993)을 참고하라. 어구 “이종다량체화 도메인” 및 “이종이량체화 도메인”은 본원에서 상호교환적으로 사용된다.
본원에서 호환적으로 사용되는 용어 “숙주 세포”, “숙주 세포주”, 및 “숙주 세포 배양물”은 외인성 핵산이 도입되어 있는 세포를 지칭하고 이러한 세포들의 자손을 포함한다. 숙주 세포들은 “형질전환체 (transformants)”와 “형질전환된 (transformed) 세포들”이 포함되는데, 이들은 계대의 수와 무관하게, 1차 형질전환된 세포와 이로부터 유도된 자손을 포함한다. 후대는 핵산 함량에 있어서 부모계 세포와 완벽하게 동일하지는 않고, 돌연변이를 포함할 수 있다. 원래 형질전환된 세포에 대하여 선별된 또는 선택된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 보유한 돌연변이 자손이 본 명세서에 포함된다.
“인간 항체”는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하여 비-인간 출처로부터 유도된 항체의 아미노산 서열에 대응하는 아미노산 서열을 보유하는 항체이다. 인간 항체의 정의에서 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외한다.
“인간 공통 프레임워크”는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 공통으로 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열들은 가변 도메인 서열들의 한 하위그룹으로부터 유래한다. 일반적으로, 서열의 하위그룹은 Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH 간행물 91-3242, Bethesda MD (1991), Vols. 1-3에 제시된 바와 같은 하위그룹이다. 특정 구체예들에서, 상기 VL의 경우, 상기 하위그룹은 상기 Kabat 외의 문헌에 제시된 하위그룹 카파 I이다. 특정 구체예들에서, 상기 VH의 경우, 상기 하위그룹은 상기 Kabat 외의 문헌에 제시된 하위그룹 카파 III이다.
“인간화된” 항체는 비인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 구체예들에 있어서, 인간화된 항체는 실질적으로 최소한 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 이때 HVR들 (가령, HVRs)의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비-인간 항체에 대응하며, FRs의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화된 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 최소한 일부를 포함할 수 있다. 항체의 “인간화된 형태”, 가령, 비-인간 항체는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “초가변 영역” 또는 “HVR”은 서열에서 초가변인 (본원에서 “상보성 결정 영역” 또는 “HVR”으로도 지칭됨) 및/또는 구조적으로 정의된 루프 (“초가변 루프”)를 형성하고 및/또는 항원- 함유 잔기들 (“항원 접촉부”)을 함유하는 항체 가변 도메인의 각 영역을 지칭한다. 달리 언급이 없는 한, HVR 잔기들 및 가변 도메인 내 다른 잔기들 (예컨대, FR 잔기)은 상기 Kabat 외의 문헌에 기재된 바에 따라 본 명세서에서 넘버링된다. 일반적으로, 항체들은 6개의 HVR: VH에 3개 (H1, H2, H3), 및 VL에 3개 (L1, L2, L3)를 포함한다. 본 발명의 예시적인 HVR는 다음을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 나타나는 초가변 루프 (Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에서 나타나는 HVR (Kabat 외, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에서 나타나는 항원 접촉부 (MacCallum 외 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 및
(d) HVR 아미노산 잔기 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (H2), 93-102 (H3), 및 94-102 (H3)을 포함하는, (a), (b), 및/또는 (c)의 조합.
“면역접합체”는, 비제한적으로 세포독성제를 포함한, 하나 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체를 지칭한다.
“단리된 항체”는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 항체다. 특정 구체예들에 있어서, 항체는 예를 들면, 전기영동의 (예로써, SDS-PAGE, 등전초점조절 (IEF), 모세관전기이동) 또는 크로마토그래프 (예로써, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 측정되었을 때 95% 또는 99% 순도이상으로 정제된다. 항체 순도의 평가 방법에 대한 검토는 예로써, Flatman 외, J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)를 참고한다.
본원에서 호환적으로 사용되는 “개체” 또는 “대상체”는 포유동물이다. 포유동물에는 가축 (예컨대, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예컨대, 인간 및 비인간 영장류, 가령, 원숭이), 토끼 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 랫트)가 포함되나 이에 제한되지 않는다. 특정 구체예들에서, 개체, 또는 대상체는 인간이다.
“단리된 핵산”은 항체는 이의 자연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 보통 포함하는 세포 안에 있는 핵산 분자를 포함하지만, 상기 핵산 분자는 자연 염색체 위치와는 상이한 염색체 위치에 존재하거나 또는 염색체외부에 존재한다.
용어 “항체를 인코드하는 단리된 핵산” (특이적 항체에 대한 지칭 포함)은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 이의 단편들)을 인코드하는 하나 또는 그 이상의 핵산 분자들을 지칭하며, 단일 벡터 또는 별도의 벡터 안에 있는 이러한 핵산 분자(들), 그리고 숙주 세포내 하나 또는 그 이상의 위치에 존재하는 핵산 분자(들)이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 “단클론 항체”는 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 획득된 항체를 말하는데, 가령, 개별 항체는 동일한 집단 및/또는 같은 에피토프에 결합하는 집단을 포함하는데, 다만, 변이체 항체, 가령, 자연 발생적 돌연변이 또는 단클론 항체 제재를 만드는 동안 발생되는 돌연변이를 가진 변이체 항체 가능성이 있으며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량으로 존재한다. 상이한 결정부위(에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 통상적으로 포함하는 다클론 항체 제제와 대조적으로, 단클론 항체 제제의 각각의 단클론 항체는 항원 상의 단일 결정부위에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 “단클론(monoclonal)”은 실질적으로 동질성 항체 집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들면, 본원에 개시된 발명에 따라 사용될 단클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법 그리고 인간 면역 글로불린 좌위의 전부 또는 일부를 포함하는 유전자삽입 동물을 이용하는 방법들을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않음) 다양한 기술에 의해 제조 될 수 있으며, 이러한 방법 및 단클론 항체를 제조하는 다른 예시적인 방법이 본 명세서에 기재되어 있다.
용어 “다중특이적” 및 “이중특이적”은 항원 결합 분자가 적어도 2개의 별개의 항원 결정인자에 특이적으로 결합 할 수 있음을 의미한다. 전형적으로, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원 결합 부위를 포함하며, 이들 각각은 상이한 항원 결정인자에 대해 특이적이다. 특정 구체예들에서, 이중특이적 항원 결합 분자는 2개의 항원결정인자, 특히, 2개의 별개 세포에서 발현되는 2개의 항원결정인자에 동시에 결합 할 수 있다. 한 구체예에서, 이중특이적 항체는 CD3에 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 세포 표면 항원에 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함하는 T-세포 의존성 이중특이적 (TDB) 항체이다. 일부 구체예들에서, 세포 표면 항원은 종양 항원, 예를 들어, CD20, FcRH5, HER2, CEA, LYPD1, LY6G6D, PMEL17, LY6E, CD19, CD33, CD22, CD79A, CD79B, EDAR, GFRA1, MRP4, RET, Steap1, TenB2 등이다. WO/2015/095392를 참고하라. TDB는 CD3 결합 아암을 통해 T 세포에 결합하여 이를 활성화시키며, 항-CD3 동종이량체 (CD3 HD) 불순물의 존재는 잠재적으로 TCR의 2가 결합 및 이량체화를 통해 바람직하지 않은 오프 타겟 T 세포 활성화를 유발할 수 있다. 특정 구체예들에서, 이중특이적 항체는 2%, 1%, 0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 미만의 동종이량체를 포함한다. 비 제한적 구체예에서, 이중특이적 항체는 TDB 항체이고 동종이량체는 CD3 동종이량체이다.
본원에서 사용되는 용어 “단백질”은, 달리 지시가 없는 한, 영장류 (예컨대, 인간) 및 설치류 (예컨대, 마우스 및 랫트)와 같은 포유동물을 포함한 임의의 척추동물 출처의 임의의 고유 단백질을 지칭한다. 상기 용어는 프로세스되지 않은 “전장” 단백질, 뿐만 아니라 세포 내 프로세스로부터 생긴 임의의 형태의 단백질을 포괄한다. 상기 용어는 또한 단백질의 자연 발생 변이체, 예컨대, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포함한다.
본원에 사용된 “정제된” 단백질 또는 폴리펩티드 (예컨대, 항체)는 순도가 증가되어 자연 환경에서 및/또는 실험실 조건에서 처음 합성되어 증폭될 때 존재하는 것보다 더 순수한 형태로 존재하는 폴리펩티드를 지칭한다. 순도는 상대적인 용어이며 반드시 절대 순도를 의미하지는 않는다.
본원에서 사용된 용어 “폴리펩티드”는 임의의 길이의 아미노산 중합체를 지칭한다. 상기 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 불연속성을 가질 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함하는데; 예를 들어, 이황화물 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 라벨링 성분과의 접합(conjugation)과 같은 임의의 다른 조작 또는 변형을 포함할 수 있다. 또한 상기 정의에는 하나 또는 그 이상의 아미노산 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함함), 뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변형물도 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. 본원에 사용된 용어 “폴리펩티드” 및 “단백질”은 구체적으로 항체를 포함한다.
본원에서 사용된 “샘플”은 더 많은 양의 재료의 작은 부분을 지칭한다. 특정 구체예에서, 샘플은 배양된 세포, 세포 상청액, 세포 용해물, 혈청, 혈장, 생물학적 유체 (예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 대변, 소변, 림프액, 복수, 도관 세척, 타액 및 뇌척수액 및 조직 샘플)을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 샘플의 출처는 고형 조직 (예컨대, 냉장, 냉동 및/또는 보존된 장기, 조직 시료, 생검 또는 흡인물), 혈액 또는 혈액 성분, 체액 (가령, 예컨대, 소변, 림프액, 뇌척수액, 양수, 복막 액 또는 간질액) 또는 순환 세포를 포함한 개체의 세포일 수 있다.
둘 이상의 성분의 혼합물을 지칭할 때 “혼합물”은 혼합물의 각 성분을 하나 이상의 분석 검정으로 평가시 혼합물에서 본질적으로 물리적 및 화학적 안정성을 유지한다는 것을 의미한다. 이러한 목적을 위한 예시적인 분석 검정법에는 색상, 외관 및 선명도 (CAC), 농도 및 탁도 분석, 입자 분석, 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 이온 교환 크로마토그래피 (IEC), 모세관 영역 전기영동 (CZE), 이미지 모세관 등전점 포커싱 (iCIEF) 및 효능 분석이 포함된다. 한 구체예에서, 혼합물은 5°C 또는 30°C에서 최대 약 8 시간, 또는 최대 약 12 시간, 또는 최대 약 24 시간 동안 안정한 것으로 나타났다. 또 다른 구체예에서, 혼합물은 5°C 또는 30°C에서 적어도 약 8 시간, 또는 적어도 약 12 시간, 또는 적어도 약 24 시간 동안 안정한 것으로 나타났다.
본원에서 사용되는 용어 “서브유닛”은 다량체의 구성요소 (예를 들어, 동종이량체 및 이종이량체)을 지칭한다. 서브유닛은 3개의 아미노산에서 수천 개의 아미노산 길이에 이르는 모든 크기의 폴리펩티드 일 수 있다.
“가변 영역” 또는 “가변 도메인”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 말한다. 고유 항체의 중쇄와 경쇄 (차례로 VH 및 VL)의 가변 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FRs)과 3개의 초가변 영역 (HVR들)을 포함한다. (예컨대, Kindt 외. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007).참고) 단일 VH 또는 VL 도메인은 충분히 항원-결합 특이성을 부여할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크린하기 위하여 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 예컨대, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 외, Nature 352:624-628 (1991)을 참고하라.
본원에서 사용되는 용어 “~가”는 항원 결합 분자에서 특정 수의 항원 결합부위의 존재를 나타낸다. 이에 따라, 용어 “항원에 대한 1가 결합”은 항원 결합 분자에서 항원에 특이적인 하나 (및 하나 이하)의 항원 결합 부위의 존재를 나타낸다.
본 명세서에서 이용된 바와 같이, “치료(treatment)”는 치료될 개체의 자연적인 과정을 변경시키려는 시도에 있어서의 임상적 중재과정을 지칭하며, 임상적 병리학 과정에 앞서 또는 과정 중에 실행될 수 있다. 바람직한 치료 효과에는 질병 또는 이의 병태 또는 증상의 발생 또는 재발 방지, 해당 질병의 병태 또는 증상 완화, 해당 질병의 직접 또는 간접 병리학적 결과 감소, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 완화, 및 관해 또는 개선된 예후 달성이 포함된다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 질병 또는 장애 발달을 지연시키고자 하는 시도에서 유용하다.
제제의 “유효량”은 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 일으키는데 필요한 양을 지칭한다.
2.
표적 멀티-서브유닛 단백질을 단리 및 정량화하는 리간드
본원 발명은, 특정 구체예들에서, 하나 이상의 분석 검정법에 사용될 수 있는 리간드에 관한 것이다. 본원 발명의 분석 검정법은 특정 구체예에서 표적 단백질을 분별, 단리 및/또는 정량화 할 수 있다. 예시적인 분석 검정법에는 이온 교환 크로마토그래피 (IEC), 모세관 영역 전기영동 (CZE), 이미지 모세관 등전점 포커싱 (iCIEF) 및 친화성 모세관 전기영동 (ACE)가 포함된다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 리간드는 표적 단백질에 결합 할 수 있다 (본 명세서에서 표적 단백질에 결합하거나 이에 의해 결합되는 것을 지칭하기 위해 사용됨). 예를 들어, 리간드는 표적 단백질이 본래 형태 일 때, 부분적 언폴딩 또는 완전 언폴딩 상태일 때 표적 단백질에 결합 할 수 있다. 본 발명에 따르면, 리간드는 표적 단백질의 인지된 기능 영역, 예를 들어, 효소의 활성 부위, 항체의 항원 결합 부위, 수용체의 호르몬 결합 부위, 또는 보조인자-결합 부위에 결합하는 제제에 한정되지 않는다. 특정 구체예들에서, 리간드는 표적 단백질의 구조적 도메인뿐만 아니라 표면 또는 내부 서열에 결합하는 제제일 수 있다. 더욱이, 리간드는 표적 단백질의 하나 이상의 서브유닛 (예를 들어, 제 1 서브유닛 또는 제 2 서브유닛, 또는 둘 모두)에 결합 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 리간드는 상기 기재된 방식으로 표적 단백질에 결합하는 능력을 넘어서 그 자체로 명백한 생물학적 기능을 갖지 않을 수있는 제제를 포함한다.
특정 구체예들에서 리간드는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드 단편이다. 특정 구체예들에서, 리간드는 표적 단백질 (예컨대, 항체)에 의해 결합된 에피토프를 포함한다.
특정 구체예들에서, 리간드는 비변형 리간드와 비교하여 형광 (또는 기타 검출가능한) 표지, 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성 또는 이들의 조합을 갖도록 구성된다. 특정 구체예들에서, 리간드는 형광 표지된 폴리펩티드 또는 형광 표지된 폴리펩티드 단편이다. 특정 구체예들에서, 리간드는 리간드의 비-결합 영역에 하나 이상의 아미노산을 첨가함으로써 변형된다. 특정 구체예들에서, 하나 이상의 아미노산은 글루탐산, 아스파르트산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예들에서, 첨가되는 하나 이상의 아미노산은 리간드의 전하 및 질량을 변경하도록 구성된다.
특정 구체예들에서, 리간드는 인간 CD3, 마우스 CD3 폴리펩티드, 랫트 CD3 폴리펩티드, 토끼 CD3 폴리펩티드 및 시노몰구스 원숭이 CD3 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 특정 구체예들에서, 리간드는 CD3 펩티드이다. 특정 구체예들에서, 리간드는 다음 서열을 갖는 CD3 펩티드이다: Pyr DGNEEMGGITQTPYKE 산. 일부 구체예에서, CD3 펩티드는 다음 서열을 가질 수 있다: Pyr DGNEEMGGITQTPYKD 산, Pyr DGNEEMGGITQTPYKDD 산, 또는 Pyr DGNEEMGGITQTPYKDDD 산. 비 제한적 구체예에서, 리간드는 표적 동종이량체에 의해 인식 될 수 있는 임의의 리간드를 포함 할 수 있다.
특정 구체예들에서, 표적 단백질은 멀티-서브유닛 단백질을 포함 할 수 있다. 서브유닛은 임의의 하나 이상의 분자간 결합 (예를 들어, 공유 및 비공유 결합)을 통해 함께 결합되어 멀티-서브유닛 단백질을 형성 할 수 있다. 비 제한적 구체예에서, 멀티-서브유닛 단백질은 항체 일 수 있다. 예시적인 멀티-서브유닛 단백질은 단클론 항체, 면역 접합체, 합성 항체, 단쇄 Fv (scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F (ab') 단편, F(ab')2 단편, 이황화-결합 Fv, 인트라바디, 및 상기 중 어느 하나의 에피토프 결합 단편을 포함 할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 효현제, 길항제 및 중화 항체, 뿐만 아니라 탈면역화, 키메라, 인간화 및 인간 항체 및/또는 임의의 적합한 동물 출처 (예를 들어, 마우스, 랫트, 햄스터, 기니 피그, 토끼, 염소, 양, 개, 말, 소, 원숭이, 유인원 및/또는 닭)으로부터 유래된 항체를 포함 할 수 있다.
특정 구체예들에서, 멀티-서브유닛 단백질은 이종이량체 단백질 일 수 있다. 이종이량체 단백질은 적어도 제 1 힌지-함유 폴리펩티드 및 제 2 힌지-함유 폴리펩티드를 포함할 수 있으며, 이 때 제 2 힌지-함유 폴리펩티드는 아미노산 서열에 있어서 제 1 힌지-함유 폴리펩티드와 적어도 하나의 아미노산 잔기만큼 상이하다. 상기 이종이량체는 제 1 및 제 2 힌지-함유 폴리펩티드에 의해 형성될 수 있거나, 또는 제 1 및 제 2 힌지-함유 폴리펩티드 이외의 폴리펩티드들이 존재하는 보다 고차인 3차 구조를 형성할 수 있다. 이종다량체의 폴리펩티드는 비-펩티드, 공유 결합 (예컨대, 이황화 결합) 및/또는 비공유 상호작용 (예컨대, 수소 결합, 이온 결합, 반데르발스 힘 및/또는 소수성 상호작용)에 의해 서로와 상호작용할 수 있다. 특히, 이종이량체 단백질은 이중특이적 항체 일 수 있으며, 이는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 그리고 특정 구체예에서 적어도 2개 이상의 상이한 항체로부터의 도메인으로 구성 될 수 있다. 비 제한적 구체예에서, 이중특이적 항체는 2개의 상이한 중쇄 (각각 상이한 항체로부터 유래됨) 및 2개의 상이한 경쇄 (각각 상이한 항체로부터 유래됨)를 포함 할 수 있으며 및/또는 각각 둘 이상의 상이한 항체로부터의 단편들을 포함하는 중쇄 및 경쇄를 포함 할 수 있다. 더욱이, 이중특이적 항체는 탈면역화, 뮤린, 키메라, 인간화 및 인간 항체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄, 뿐만 아니라 탈면역화, 뮤린, 키메라, 인간화, 인간 항체 및 이의 단편 (예를 들어, 이의 가변 및/또는 불변 도메인)으로부터의 조합 중쇄 및/또는 경쇄를 포함 할 수 있다. 본 발명의 이중특이적 항체는 또한 항체의 에피토프 결합 단편 (예를 들어, 단쇄 Fv (scFv), 단쇄 항체, Fab 단편, F(ab') 단편, F(ab')2 단편 및 이황화 결합 Fv (sdFv), 그러나 이에 제한되는 것은 아님), 특히, 하나 이상의 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인에 연결된 결합 단편, 예를 들어, 중쇄 CH1/CH2/CH3 도메인에 연결된 scFv를 포함할 수 있다. 일부 구체예들에서, 본 발명의 이중특이적 항체는 Fc 도메인을 포함한다. 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, Fc 도메인의 존재는 이중특이적 항체를 Fc 결합 모이어티를 사용하여 정제 할 수 있게 한다. 당업계에 잘 알려진 바와 같이, 중쇄의 CH1-힌지-CH2-CH3 도메인의 특정 구조 및 아미노산 서열은 면역글로불린 유형 및 하위분류를 결정한다. 본 발명의 이중특이적 항체는 특정 중쇄 구조 또는 아미노산 서열에 어떠한 방식으로도 제한되지 않으며; 따라서, 본 발명의 이중특이적 항체는 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 분류 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 하위분류 일 수 있다.
특정 구체예들에서, 멀티-서브유닛 단백질은 동종이량체 단백질을 포함 할 수 있다. 동종이량체 단백질은 동일하거나 기능적으로 균등한 적어도 2개의 폴리펩티드 사슬을 가질 수 있다. 예를 들어, CD20 또는 CD3 단클론 항체는 두 개의 동일한 중쇄 및 경쇄를 포함 할 수 있다. 특정 구체예에서, 리간드는 멀티-서브유닛 단백질에 결합하여 리간드-단백질 복합체를 형성 할 수 있다. 이러한 리간드는 Fc 도메인, 카파 도메인 또는 람다 도메인과 같은 멀티-서브유닛 분자의 결합 도메인에 대한 특이성을 가질 수 있다. 리간드-단백질 복합체는 멀티-서브유닛 단백질과 비교하여 적어도 하나의 변경된 특성을 가질 수 있다. 일부 구체예에서, 변경된 특성은 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성 및 이들의 조합을 포함 할 수 있다.
3.
표적 멀티-서브유닛 단백질의 단리 및 정량화 시스템
본 발명은 특정 구체예들에서 샘플에서 단백질, 예를 들어, 멀티-서브유닛 단백질을 분리하는 시스템에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 시스템은 다음을 포함한다: a) 리간드, b) 배경 전해질 완충액, c) 샘플, d) 모세관, e) 모세관의 한쪽 말단 또는 그 근처의 애노드, 및 f) 모세관의 다른 쪽 말단 또는 그 근처의 캐소드. 특정 구체예들에서, 상기 시스템은 리간드와 혼합되어 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 형성하는 샘플을 포함할 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 시스템은 모세관의 애노드 말단에서 모세관에 부하되는 이러한 리간드-단백질 복합체를 포함한다. 특정 구체예들에서, 시스템은 모세관이 리간드와 혼합되어 있는 배경 전해질 완충액으로 채워져있는 모세관들을 포함한다.
특정 구체예들에서 본 발명의 시스템은 모세관의 캐소드 말단 근처에 위치한 검출기를 추가로 포함한다. 예를 들면, 제한없이, 검출기는 210 nm 내지 280 nm의 광 흡광도 또는 레이저 유도 형광을 검출할 것이다. 비 제한적 구체예들에서, 검출기는 형광 검출기 및/또는 화학발광 검출기를 포함 할 수 있다. 형광 검출기는 형광 태그로 태그된 리간드를 검출 할 수 있다. 형광 검출기는 형광 태그로 태그된 항체를 검출 할 수 있다.
상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 시스템은 또한 샘플을 포함한다 (또는 샘플을 수용하도록 구성된다). 특정 구체예들에서, 샘플은 적어도 하나의 동종이량체, 적어도 하나의 이종이량체, 또는 이의 조합을 포함한다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 시스템은, 리간드가 적어도 하나의 이종이량체의 제 1 서브유닛에 결합하고 적어도 하나의 이종이량체의 제 2 서브유닛에 결합하지 않을 때 형성되는 제 1 리간드-단백질 복합체를 포함한다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 시스템은, 리간드가 동종이량체의 적어도 2개의 동일한 제 1 또는 제 2 서브유닛에 결합 할 때 형성되는 제 2 리간드-단백질 복합체를 포함한다. 특정 구체예들에서, 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체는 리간드가 멀티-서브유닛 단백질의 서브유닛에 결합 할 때 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성 또는 이들의 조합을 갖도록 구성된다. 특정 구체예들에서, 제 2 리간드-단백질 복합체는 제 1 리간드-단백질 복합체보다 더 낮은 전기영동 이동성을 가질 수 있고 또는 그 역일 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 시스템은 아미노-n-카프로산 (EACA), 트리에틸렌테트라민 (TETA) 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스 (HPMC)를 포함하는 배경 전해질 완충액을 포함한다. 비-제한적 구체예들에서, 본 발명의 시스템은 모세관 전기영동 완충액을 포함한다. 예를 들면, 모세관 전기영동 완충액은 포스페이트, 포르메이트, 시트레이트, 아세테이트, 피페라진-N,N′-비스(2-에탄설포닉 애시드) (PIPES), 포스페이트, 트리신, 피틱 (phytic), 보레이트/보릭 애시드, 트리스, 2-(N-모르폴리노)에탄설포닉 애시드 (MES), 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설포닉 애시드 (HEPES), 3-(N-모르폴리노)프로판설포닉 애시드 (MOPS), N-시클로헥실-3-아미노프로판설포닉 애시드 (CAPS), 글리신, 및 비신을 포함한다. 모세관 및 마이크로칩 전기영동 및 관련 마이크로기술에 관한 핸드북, 3판 25페이지의 표 1.3 “commonly used CE buffers and their associated properties”를 참고하라. 일부 구체예들에서, 본 발명의 시스템은 모세관 전기영동 첨가제를 포함한다. 예를 들어, 모세관 전기영동 첨가제는 메틸 셀룰로오스, 소듐 도데실 설페이트 (SDS), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)/폴리에틸렌 옥사이드 (PEO) 및/또는 아세토니트릴을 포함한다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 시스템은 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.25%, 0.1%, 0.05%, 또는 0.01% 미만의 동종이량체를 포함하는 이중특이적 항체를 포함하는 조성물을 포함한다. 비 제한적 구체예들에서, 이중특이적 항체는 T-세포 의존성 이중특이적 (TDB) 항체이고, 동종이량체는 CD3 동종이량체이다. 일부 구체예들에서, TDB 항체는 CD3에 결합하는 제 1 항원 결합 부위 및 세포 표면 항원에 결합하는 제 2 항원 결합 부위를 포함한다. TDB는 CD3 결합 아암을 통해 T 세포에 결합하여 이를 활성화시키며, 항-CD3 동종이량체 (CD3 HD) 불순물의 존재는 잠재적으로 TCR의 2가 결합 및 이량체화를 통해 바람직하지 않은 오프 타겟 T 세포 활성화를 유발할 수 있다.
4.
표적 멀티-서브유닛 단백질을 단리 및 정량화하는 방법
본 발명은 특정 구체예들에서 샘플에서 단백질, 예를 들어, 멀티-서브유닛 단백질을 분리하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 다음 단계들을 포함한다: (a) 적어도 하나의 단백질 및 리간드를 포함하는 샘플의 혼합물을 생성하여 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 형성하는 단계, (b) 모세관에 상기 혼합물을 적용하는 단계, 이 때 모세관은 상기 리간드와 혼합된 배경 전해질 완충액으로 채워지고, (c) 모세관에 전압을 적용하는 단계, 및 (d) 단백질 (예컨대, 멀티-서브유닛 단백질) 및 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 모세관을 통해 이동하게 하는 단계. 특정 구체예들에서, 리간드-단백질 복합체는 리간드 결합시 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성, 또는 이들의 조합을 갖도록 구성된다. 특정 구체예들에서, 이러한 변경은 샘플 내 단백질의 분리를 용이하게 한다.
본 발명은, 특정 구체예들에서, 다음 단계들을 포함하는 샘플 혼합물 내 표적 단백질을 단리하는 방법에 관한 것이다: (a) 단백질 및 리간드를 포함하는 샘플의 혼합물을 생성하여 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 형성하는 단계, (b) 모세관에 상기 혼합물을 적용하는 단계, 이 때 모세관은 상기 리간드와 혼합된 배경 전해질 완충액으로 채워지고, (c) 모세관에 전압을 적용하는 단계, 및 (d) 단백질 및 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 모세관을 통해 이동하게 하는 단계. 특정 구체예들에서, 리간드-단백질 복합체는 단백질에 대한 리간드 결합시 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성, 또는 이들의 조합을 갖도록 구성된다. 특정 구체예들에서, 상기 방법은 샘플 내 존재하는 비-표적 단백질로부터 분리되어있는, 표적 단백질을 단리하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 방법은 캐소드 말단, 애노드 말단 및 검출기를 포함하는 모세관을 사용한다. 특정 구체예들에서, 검출기는 모세관의 캐소드 말단 근처에 존재하고 210 nm 내지 280 nm 광 흡광도 또는 레이저 유도 형광을 검출한다. 특정 구체예들에서, 전압은 최대 30 킬로볼트 일 수 있다. 비 제한적 구체예들에서, 모세관의 길이을 증가시켜, 샘플 내 표적 분자의 분리를 개선할 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 분석될 샘플이 적어도 하나의 동종이량체, 적어도 하나의 이종이량체, 또는 이들의 조합을 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 적어도 하나의 이종이량체는 제 1 서브유닛 및 별도의 제 2 서브유닛을 포함한다. 특정 구체예들에서, 적어도 하나의 동종이량체는 적어도 2개의 동일한 제 1 또는 제 2 서브유닛을 포함한다. 특정 구체예들에서, 적어도 하나의 이종이량체는 이중특이적 항체이다. 특정 구체예들에서, 적어도 하나의 동종이량체는 단클론 항체이다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 리간드가 상기 방법의 적어도 하나의 이종이량체의 제 1 서브유닛에 결합하고 리간드가 적어도 하나의 이종이량체의 제 2 서브유닛에 결합하지 않는 경우에 제 1 리간드-단백질 복합체가 형성되는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 상기 본 발명은, 상기 리간드가 동종이량체의 적어도 2개의 동일한 제 1 또는 제 2 서브유닛에 결합 할 때 제 2 리간드-단백질 복합체가 형성되는 방법에 관한 것이다.
특정 구체예들에서, 상기 본 발명은 배경 전해질 완충액이 아미노-n-카프로산 (EACA), 트리에틸렌테트라민 (TETA) 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스 (HPMC)를 포함하는 방법에 관한 것이다. 특정 구체예들에서, 배경 전해질 완충액은 상기 방법의 적어도 하나의 이종이량체의 제 1 서브유닛에 결합하고 적어도 하나의 이종이량체의 제 2 서브유닛에 결합하지 않는 리간드를 포함한다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 방법은 바람직하지 않은 단백질 올리고머화를 최소화하기 위한 특정 완충제 및/또는 다른 단계들의 사용을 포함 할 수 있다. 제한이 아니라 예를 들어, 분석 중인 샘플에 존재하는 특정 단백질, 예컨대, 아래 실시예에 설명된 항-CD3 및 항-CD20 동종이량체 종은 고분자량 올리고머 종을 형성 할 수 있다. 특정 구체예들에서, 이러한 올리고머 종은 관심 단백질과 함께 이동하거나 그렇지 않으면 분석 유용성에 방해가 될 수 있다. 특정 구체예들에서, 예컨대, 용액에서 모든 동종이량체를 측정하는 것이 바람직한 경우, 이러한 올리고머 종은 분리 전에 해리 될 수 있다. 이는, 특정 구체예들에서, 저 pH 완총액 또는 고 pH 완충액에서 샘플을 준비함으로써 구현될 수 있다. 비 제한적인 구체예에서, 분리 전에 고 분자량 올리고머 종을 해리시키기 위해 요소를 용액에 첨가 할 수 있다. 일부 구체예에서, 용액 (예를 들어, 배경 완충액, 모세관 전기영동 완충액 및/또는 모세관 전기영동 첨가제)의 농도는 바람직하지 않은 단백질 올리고머화를 최소화하기 위해 증가 할 수 있다. 이러한 조건은 올리고머를 해리하기에 충분하지만 단백질, 예를 들어, BsAb 구조를 변성시키지 않으면서 리간드-단백질 복합체 형성을 유지하기에 충분히 온화한 것으로 나타났다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 방법은 바람직하지 않은 관심 단백질의 하전된 변이체들을 최소화하기 위한 특정 완충제 및/또는 다른 단계들의 사용을 포함 할 수 있다. 제한이 아니라 예를 들면, 분석중인 샘플에 존재하는 특정 단백질, 예를 들어, 아래 실시예에 설명된 항-CD3 HD는 전하 변화를 나타낼 수 있다. 특정 구체예들에서, 이러한 전하 변화는 pH 의존적이다. 특정 구체예들에서, 특정 완충액의 사용은 유체역학적 크기에서 관찰가능한 차이를 초래하는 입체형태 변화를 유도 할 수 있다. 따라서, 특정 구체예들에서, 완충액에서 샘플을 준비하는 것이 바람직하며, 이는 이러한 전하 변화 또는 입체형태 변화를 최소화할 것이다. 제한이 아니라 예를 들면, 특정 구체예들에서, pH 3.5 완충액을 사용하여 단백질 종을 단일, 저-pH 상태로 유도 할 수 있다. 특정 구체예들에서, 이것은 신호 대 잡음비를 개선하여 분석의 정량 한계를 낮출 수 있기 때문에 바람직하다. 그러나, 특정 구체예들에서, pH 7.5 HEPES 완충제, 예를 들어, 0.1% PS20과 함께 pH 7.5의 10 mM HEPE 완충액을 사용하여 단백질 종을 단일 상태로 유도 할 수 있다. 특정 구체예들에서, 이것은 신호 대 잡음비를 개선하여 분석의 정량 한계를 낮출 수 있기 때문에 바람직하다.
특정 구체예들에서, 본 발명의 방법은 바람직하지 않은 단백질-표면 흡수를 최소화하기 위한 특정 완충제 및/또는 다른 단계들의 사용을 포함 할 수 있다. 제한이 아니라 예를 들면, 분석중인 샘플에 존재하는 특정 단백질, 예를 들어, 아래 실시예에 설명된 항-CD3 HD는 바람직하지 않은 표면 흡수를 나타낼 수 있다. 예를 들어, 바이얼 벽에 대한 이러한 표면 흡수는 항-CD3 동종이량체 피크 면적의 회수율을 낮출 수 있다. 이러한 흡착을 제어하고 회수를 개선하기 위해, 본 발명의 방법은 샘플에 세제, 예를 들어, 약 0.1% 내지 약 0.4% 폴리소르베이트 20 (PS20)을 포함 할 수 있다. 특정 구체예들에서, 본 발명의 방법은 계면 활성제를 포함 할 수 있으며 이 때 계면활성제는 트윈 80, 폴록사머 188 (p188), 트리톤, SDS, Brij, PEO/PEG 및/또는 글리세롤을 포함 할 수 있다. 비 제한적 구체예들에서, 본 발명의 방법은 수크로스, 구아니딘 HCl 및/또는 시클로덱스트린 (예를 들어, 다양한 아이소형)과 같은 카오트로프를 포함 할 수 있다.
특정 구체예들에서, 본 발명은 샘플 내 표적 단백질의 양을 정량화하는 단계를 추가로 포함하는 방법에 관한 것이다.
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설명된 그리고 청구범위에 기재된 다양한 구체예들 이외에도, 본원 발명은 또한 본원에 개시되고 본원 청구범위에 기재된 특징들의 그 외 조합들을 가지는 다른 구체예들에 관한 것이다. 이와 같이, 본원에 제시된 특징들은 개시된 발명이 본원에 개시된 특징들의 임의의 적절한 조합을 포함하도록 개시된 발명의 범위 내에서 다른 방식으로 서로 결합 될 수 있다. 개시된 발명의 특정 구체예들에 대한 전술한 설명은 예시 및 설명의 목적으로 제시되었다. 이는 개시된 발명을 개시된 구체예들에 모두 망라하거나 제한하려는 의도가 아니다.
개시된 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않으면서 개시된 발명의 조성물 및 방법에서 다양한 수정 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 당업자에게 명백 할 것이다. 따라서, 개시된 발명은 첨부된 청구범위 및 그 균등물의 범위에 속하는 수정 및 변형을 포함하고자 한다.
다양한 간행물, 특허들 및 특허 출원들이 본 출원에서 언급되어 있으며, 이들의 내용은 본 출원에 온전히 참고문헌으로 포함된다.
발명의 구체예
다음은 본 발명의 비-제한적 구체예들이다.
1. 다음을 포함하는, 샘플 내 멀티-서브유닛 단백질을 분리하는 시스템: a) 리간드, b) 배경 전해질 완충액, c) 샘플, d) 모세관, e) 모세관의 한 쪽 말단 또는 그 근처의 애노드, 및 f) 모세관의 다른 쪽 말단 또는 그 근처의 캐소드, 이 때 샘플은 리간드와 혼합되어 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 형성하고 모세관의 애노드 끝에서 모세관에 부하되며, 그리고 모세관은 리간드와 혼합된 배경 전해질 완충액으로 채워짐.
2. 구체예 1에 있어서, 모세관의 캐소드 말단 근처에 위치하는 검출기를 추가로 포함하고, 이 때 검출기는 210 nm 내지 220 nm 광 흡광도 또는 레이저 유도 형광을 검출함을 특징으로 하는 시스템.
3. 구체예 1-2 중 어느 하나에 있어서, 샘플은 적어도 하나의 동종이량체, 적어도 하나의 이종이량체, 또는 이들의 조합을 포함함을 특징으로 하는 시스템.
4. 구체예 1-3 중 어느 하나에 있어서, 리간드가 적어도 하나의 이종이량체의 제 1 서브유닛에 결합하고 적어도 하나의 이종이량체의 제 2 서브유닛에 결합하지 않을 때 제 1 리간드-단백질 복합체가 형성됨을 특징으로 하는 시스템.
5. 구체예 1-4 중 어느 하나에 있어서, 리간드가 동종이량체의 적어도 2개의 동일한 제 1 또는 제 2 서브유닛에 결합 할 때 제 2 리간드-단백질 복합체가 형성됨을 특징으로 하는 시스템.
6. 구체예 1-5 중 어느 하나에 있어서, 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체는 리간드가 멀티-서브유닛 단백질의 서브유닛에 결합 할 때 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성 또는 이들의 조합을 갖도록 구성됨을 특징으로 하는 시스템.
7. 구체예 1-6 중 어느 하나에 있어서, 제 2 리간드-단백질 복합체는 제 1 리간드-단백질 복합체보다 더 낮은 전기영동 이동성을 가짐을 특징으로 하는 시스템.
8. 구체예 1-7 중 어느 하나에 있어서, 리간드는 펩티드 또는 펩티드 단편임을 특징으로 하는 시스템.
9. 구체예 1-8 중 어느 하나에 있어서, 리간드는 형광 표지된 펩티드 또는 형광 표지된 펩티드 단편임을 특징으로 하는 시스템.
10. 구체예 1-9 중 어느 하나에 있어서, 리간드는 인간 CD3 펩티드, 마우스 CD3 펩티드, 랫트 CD3 펩티드, 토끼 CD3 펩티드 및 시노몰구스 원숭이 CD3 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 시스템.
11. 구체예 1-10 중 어느 하나에 있어서, 리간드는 리간드의 비 결합 영역에 하나 이상의 아미노산을 첨가함으로써 변형됨을 특징으로 하는 시스템.
12. 구체예 11에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 글루탐산, 아스파르트산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 시스템.
13. 구체예 11-12 중 어느 하나에 있어서, 첨가되는 하나 이상의 아미노산은 리간드의 전하 및 질량을 변경하도록 구성됨을 특징으로 하는 시스템.
14. 구체예 11-13 중 어느 하나에 있어서, 샘플은 하기에서 리간드와 추가로 혼합됨을 특징으로 하는 시스템: (A) 낮은 pH 요소 완충액; 또는 (B) 0.1% 폴리소르베이트 20과 조합된 고 pH HEPES 완충액.
15. 구체예 11-14 중 어느 하나에 있어서, 배경 전해질 완충액은 아미노-n-카프로산 (EACA), 트리에틸렌테트라민 (TETA) 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스 (HPMC)를 포함함을 특징으로 하는 시스템.
16. 다음 단계를 포함하는, 샘플 내 멀티-서브유닛 단백질을 분리하는 방법: (a) 샘플과 리간드의 혼합물을 생성하여 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 형성하는 단계, (b) 혼합물을 모세관에 적용하는 단계, 이 때 모세관은 리간드와 혼합된 배경 전해질 완충액으로 채워지고, (c) 모세관에 전압을 적용하는 단계, 및 (d) 멀티-서브유닛 단백질 및 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 모세관을 통해 이동하도록 하는 단계, 이 때 리간드-단백질 복합체는 리간드가 멀티-서브유닛 단백질의 서브유닛에 결합 할 때 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성 또는 이들의 조합을 갖도록 구성되고, 이로써 샘플 내 멀티-서브유닛 단백질들을 분리함.
17. 다음 단계를 포함하는, 샘플 혼합물에서 표적 단백질을 단리하는 방법: (a) 샘플과 리간드의 혼합물을 생성하여 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 형성하는 단계, (b) 혼합물을 모세관에 적용하는 단계, 이 때 모세관은 리간드와 혼합된 배경 전해질 완충액으로 채워지고, (c) 모세관에 전압을 적용하는 단계, (d) 멀티-서브유닛 단백질 및 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 모세관을 통해 이동하게 하는 단계, 이 때 리간드-단백질 복합체는 리간드가 멀티-서브유닛 단백질의 서브유닛에 결합 할 때, 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성 또는 이들의 조합을 갖도록 구성되고, 그리고 (e) 비-표적 단백질들로부터 분리된 표적 단백질을 단리하는 단계.
18. 구체예 16 또는 17에 있어서, 모세관은 캐소드 말단, 애노드 말단 및 검출기를 포함함을 특징으로 하는 방법.
19. 구체예 18에 있어서, 검출기는 모세관의 캐소드 말단 근처에 존재하고 210 nm 내지 220 nm 광 흡광도 또는 레이저 유도 형광을 검출함을 특징으로 하는 방법.
20. 구체예 16-19 중 어느 하나에 있어서, 전압은 30 킬로볼트임을 특징으로 하는 방법.
21. 구체예 16-20 중 어느 하나에 있어서, 샘플은 적어도 하나의 동종이량체, 적어도 하나의 이종이량체 또는 이들의 조합을 포함하고, 이 때 적어도 하나의 이종이량체는 제 1 서브유닛 및 제 2 서브유닛을 포함하고, 적어도 하나의 동종이량체는 적어도 2개의 동일한 제 1 또는 제 2 서브유닛을 포함함을 특징으로 하는 방법.
22. 구체예 21에 있어서, 적어도 하나의 이종이량체는 이중특이적 항체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
23. 구체예 21에 있어서, 적어도 하나의 동종이량체는 단클론 항체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
24. 구체예 16-23 중 어느 하나에 있어서, 리간드는 펩티드 또는 펩티드 단편임을 특징으로 하는 방법.
25. 구체예 16-24 중 어느 하나에 있어서, 리간드는 형광 표지된 펩티드 또는 형광 표지된 펩티드 단편임을 특징으로 하는 방법.
26. 구체예 16-24 중 어느 하나에 있어서, 리간드는 인간 CD3 펩티드, 마우스 CD3 펩티드, 랫트 CD3 펩티드, 토끼 CD3 펩티드 및 시노몰구스 원숭이 CD3 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
27. 구체예 16-24 중 어느 하나에 있어서, 리간드는 리간드의 비 결합 영역에 하나 이상의 아미노산을 첨가함으로써 변형되도록 구성됨을 특징으로 하는 방법.
28. 구체예 27에 있어서, 하나 이상의 아미노산은 글루탐산, 아스파르트산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
29. 구체예 27-28 중 어느 하나에 있어서, 첨가되는 하나 이상의 아미노산은 리간드의 전하 및 질량을 변경하도록 구성됨을 특징으로 하는 방법.
30. 구체예 16-29 중 어느 하나에 있어서, 리간드가 적어도 하나의 이종이량체의 제 1 서브유닛에 결합하고 적어도 하나의 이종이량체의 제 2 서브유닛에 결합하지 않을 때 제 1 리간드-단백질 복합체가 형성됨을 특징으로 하는 방법.
31. 구체예 16-30 중 어느 하나에 있어서, 리간드가 동종이량체의 적어도 2개의 동일한 제 1 또는 제 2 서브유닛에 결합 할 때 제 2 리간드-단백질 복합체가 형성됨을 특징으로 하는 방법.
32. 구체예 16-31 중 어느 하나에 있어서, 다음을 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법: (A) 저 pH 요소 완충액을 샘플과 리간드의 혼합물에 혼합하는 단계; 또는 (B) 0.1% 폴리소르베이트 20과 조합된 고 pH HEPES 완충액을 샘플과 리간드의 혼합물에 혼합하는 단계.
33. 구체예 16-32 중 어느 하나에 있어서, 배경 전해질 완충액은 아미노-n-카프로산 (EACA), 트리에틸렌테트라민 (TETA) 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스 (HPMC)를 포함함을 특징으로 하는 방법.
34. 구체예 16-33 중 어느 하나에 있어서, 샘플 내 표적 단백질의 양을 정량화하는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는 방법.
35. 결합 영역을 포함하는 친화성 모세관 전기영동 리간드로서, 이 때 상기 결합 영역은 관심 단백질 및 변형과 결합하거나 이에 의해 결합되며, 이 때 상기 변형은 관심 단백질의 단리를 용이하게 하는, 친화성 모세관 전기영동 리간드.
36. 구체예 35에 있어서, 관심 단백질은 동종이량체임을 특징으로 하는 리간드.
37. 구체예 35에 있어서, 관심 단백질은 이종이량체임을 특징으로 하는 리간드.
38. 구체예 35에 있어서, 결합 영역은 폴리펩티드임을 특징으로 하는 리간드.
39. 구체예 35에 있어서, 결합 영역은 소분자임을 특징으로 하는 리간드.
40. 구체예 35에 있어서, 변형은 리간드에 대한 형광 라벨의 첨가 또는 하나 이상의 아미노산의 첨가임을 특징으로 하는 리간드.
41. 구체예 35에 있어서, 변형은 리간드가 표적 단백질에 결합 할 때 형광 라벨 또는 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성 또는 이들의 조합을 제공함을 특징으로 하는 리간드.
실시예
다음 실시예는 단순히 본원에 개시된 발명에 관한 예시일 뿐이며 어떠한 방식으로든 제한으로 간주되어서는 안된다.
실시예 1: 이중특이적 생성물에서 동종이량체를 검출하기 위한 고 특이성 친화성 모세관 전기영동 (ACE) 법
본 실시예에서 항원에 대한 BsAb 표적의 특이성과 친화성을 이용하여 전기영동 이동성의 차이에 기반한 모세관 영역 전기영동 (CZE)을 사용한 분리를 구현하였다.
재료 및 방법
최종 샘플이 3 g/L의 단백질, 50 mM 포르메이트, 2M 요소, 0.1% PS20, 및 50 μM CD3 펩티드, pH 3.5 (“저 pH 프렙”), 또는 3 g/L의 단백질, 10mM HEPES, 0.1% PS20, 및 50 μM CD3 펩티드, pH 7.5 (“고 pH 프렙”)을 함유하도록 단백질 샘플을 제조하였다.
단백질은 UV 검출기와 214 nm 필터를 구비한 Sciex PA800 Plus 장치를 사용하여 CZE에 의해 분리되었다. 분리는 20/30 cm (검출기까지의 모세관 길이/전체 길이) 카트리지가 있는 모세관 카트리지를 사용하여 수행되었다. 모세관 자체는 내경이 50 μm인 베어-융합 실리카 모세관이었다.
샘플은 여기에 개략적으로 설명된 것을 제외하고는 전통적인 CZE 공정 전략에 따라 분리되었다. 간단히 말해, 0.5psi에서 20초 동안 가압 주입을 사용하여 샘플을 주입한다. 30분 동안 30kV의 전압을 적용하여 샘플을 분리한다. 배경 전해질은 2 mM 트리에틸렌 테트라민(TETA), 0.5% 하이드록시프로필메틸셀룰로오스 (HPMC), 및 50 μM CD3 펩티드가 있는 pH 5.7의 400 mM 아미노-n-카프로익 애시드 (EACA) 완충액을 함유한다.
결과
CZE 방법의 성능: 고전적인 모세관 영역 전기영동에서 해당 종들은 적용된 전기장의 영향하에 속도 차이에 따라 이동 및 분리된다. 동종이량체 및 이중특이적 종들 (도 1)은 전하 및 유체역학적 크기 특성 모두에 있어서 매우 유사하기 때문에 이러한 CZE 방법으로 이러한 종들을 분리하는 것은 불충분 할 수 있다 (도 2 및 3).
CD3 펩티드를 이용한 ACE: 친화성 CZE의 원리를 적용하여, CD3 펩티드를 샘플 혼합물에 추가하여 이들 종들 간의 추가 분리를 구현하였다 (도 2). 분리 전에 펩티드가 샘플과 혼합되었을 때, CD3 결합 종들의 이동 시간은 전하 또는 유체역학적 크기 또는 이들 두 가지의 조합의 명백한 변화로 인해 변화하였다. 그러나, 결과적인 분리 프로파일은 불완전한 결합과 일치하는 불량한 피크 모양을 보여준다. 이것은 또한 항-CD3-CD3 펩티드 복합체에 대한 더 높은 해리 상수 때문 일 수 있다.
피크 모양을 개선하고 CD3 펩타이드의 완전하고 지속적인 결합을 유도하기 위해 펩티드는 50 μM 농도에서 샘플과 배경 전해질 모두에 포함되었다 (도 4).
CD3 펩티드 변형: 도 4에서 보는 바와 같이, CD3 펩티드를 사용하여 항-CD3 HD와 이중특이적 항체를 분리하였다. 그러나 이들 종들은 완전히 (또는 기준선) 분리되지 않았다. 낮은 수준의 정확한 항-CD3 동종이량체의 정량이 필요했기 때문에, 두 종들 간의 추가 분해가 수행되었다. 이를 구현하기 위해, CD3 펩티드는 펩티드의 비-결합 N-말단에 다양한 저-등전점 (pI) 아미노산 (예컨대, 글루탐산 및 아스파르트산)을 첨가하여 변형되었다. 이 과정은 펩티드에 전하와 질량을 효과적으로 추가하고, 궁극적으로 결합된 펩티드-항체 복합체의 전하와 질량을 변화시킨다.
CD3 펩티드는 하나의 글루탐산과 1, 2, 3 개의 아스파르트산의 첨가를 비롯하여 여러 아미노산 태그를 사용하여 변형되었다 (도 5A). 그 후 이들 펩티드들을 도 5B에 도시된 ACE 분리에 사용하였다. CD3 펩티드의 전하와 질량 기여도가 클수록 종들 간의 분해능이 높아진다. 그러나 이러한 변형된 CD3 펩티드는 또한 동종이량체 및 이중특이적 종들의 하전된 변이체 내에서 더 우수한 분리를 제공했다. 동종이량체의 상이한 하전 변이체들 내에서 이렇게 증가된 분해능은 동종이량체 피크의 전체 신호 대 잡음비를 감소시켜, 이 영역의 통합을 더욱 어렵게 만들고 궁극적으로 분석의 감도 및 정량 한계를 감소시킨다. 이와 같이, 펩티드에 대한 변형은 이중특이성에 대한 간섭을 최소화하기에 충분한 분해능을 달성하는 것과 항-CD3 동종이량체 종의 신호를 최대화하는 것 사이에 균형을 제공했다. 제한이 아닌 예로서, 하나의 글루탐산 태그 (즉, CD3-E)는 민감도를 손상시키지 않고 항-CD20 및 항-CD3 종들 사이의 적절한 분리를 제공하였다 (도 6).
낮은 pH 및 요소 샘플 적용 : 항-CD3 및 항-CD20 동종이량체 종은 용액에 함께 존재할 때 고 분자량 올리고머종을 형성하는 것으로 밝혀졌다 (도 9). 이 올리고머는 BsAb와 함께 이동하였으며 이러한 친화성 분석에 의해 정량적인 방식으로 검출될 수 없었다. 구체적으로, 고분자량 올리고머는 aCD20 HD가 샘플에 스파이크될 때 aCD3 HD의 소멸을 통해 간적접으로 검출되었다. 고 분자량 올리고머와 BsAb가 함께 이동하였기 때문에, 고 분자량 올리고머 종들은 BsAb의 존재시 정량되지 않았다. 용액의 모든 동종이량체 종을 측정하려면 이러한 올리고머를 분리하기 전에 해리시킬 필요가 있다. 이는 2M 요소가 있는 저 pH 완충액에서 샘플을 준비하여 수행되었다. 이러한 조건은 BsAb 구조를 변성시키지 않고 올리고머를 해리하고 펩티드-항체 복합체 형성을 유지하기에 충분히 온화한 것으로 나타났다.
추가로, 항-CD3 HD의 하전된 변이체는 pH 의존적인 것으로 나타났다. BsAb의 전하 (및 관련 전하 변이체)는 pH 함수에 따라 전체 전하 상태와 전하 분포가 다를 수 있다. 전체 전하 상태 (예컨대, 총 전하 수) 및 전하 위치 (예컨대, 전하 패치, 매립된, 용매 노출된)는 고 및 저 pH 조건 간에 상이할 수 있다. pH 3.5 완충액에서 샘플을 준비함으로써 종들은 단일 저-pH 형태로 유도된다. 이는 신호 대 잡음비를 개선하여, 분석의 정량 한계를 낮춘다 (도 7).
aCD3 HD 회수를 개선하기 위한 샘플 매트릭스 내 고 pH 및 0.1% PS20: 항-CD3 HD는 시간이 지남에 따라 바이얼에 흡착되어 항-CD3 동종이량체 피크 영역의 회수율을 낮추는 것으로 나타났다. 흡착을 제어하고 항-CD3-HD의 회수를 개선하기 위해 0.1% 폴리소르베이트 20 (PS20)을 샘플 매트릭스에 첨가했다. (도 8).
스파이크된 불순물을 통한 항-CD3 영역의 간접 피크 식별 (도 10A-10B). pH 7.5의 10 mM HEPES 샘플 완충액 및 0.1% PS20을 이용시, BsAb, aB 반 mAb 및 동종이량체 사이에 개선된 분해능이 관찰되었으며 (도 10A), 고 pH 형태로의 완전한 전환 시간을 허용한 후에도 그러하였다 (도 10B).
두 동종이량체의 상호작용에 의한 올리고머 형성이 ACE 및 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에서 관찰되었다. 예를 들어, ACE는 항-CD3 및 항-CD20 HD가 상호작용하여 BsAb와 함께 이동하는 새로운 피크를 형성 할 수 있음을 보여주었다 (도 11). 근처의 피크들, “HD 복합체” 또는 “올리고머”는 ACE에서 BsAb와 함께 이동하지만 SEC에 의해 고 분자량 형태로 이동한다. 따라서 SEC에 의해 이들은 BsAb와 함께 이동하지 않고 다른 고 분자량 형태 또는 응집체와 함께 BsAb보다 먼저 이동한다. 그러나 SEC에 의하면 HD 복합체는 다른 BsAb 관련 응집체와 구별되지 않는다. 이러한 상호작용은 저 pH와 요소에 의해 방지되었다. 예를 들어, 항-CD3 및 항-CD20 HD의 상호작용은 저 pH (예컨대, pH 3.5) 및 요소에 의해 방지되고 해리되었다 (도 12). 사전에 올리고머화되었고 다른 방법으로는 검출 할 수 없었던 동종이량체가 저 pH 적용에 의해 나타났다 (도 13).
또한, 친화성 모세관 전기영동의 성능을 개선하기 위한 다양한 변형이 수행 될 수 있다. 예를 들어, 도 14에서 보는 바와 같이, 배경 완충액의 농도는 샘플 변형 (예컨대, pH 조정, ps20 적용, 리간드 추가, 요소 적용 등) 시/없이 증가 할 수 있다. 도 14는 예시적인 저 pH 친화성 모세관 전기영동법을 도시한다. 개시된 시스템 및 방법들은 개선된 ACE 성능을 제공하였다 (도 15).
Claims (41)
- a) 리간드,
b) 배경 전해질 완충액,
c) 샘플,
d) 모세관,
e) 모세관의 한쪽 말단 또는 그 근처의 애노드, 및
f) 모세관의 다른쪽 말단 또는 그 근처의 캐소드
를 포함하는, 샘플 내 멀티-서브유닛 단백질을 분리하는 시스템이며,
샘플은 리간드와 혼합되어 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 형성하고 모세관의 애노드 말단에서 모세관에 부하(load)되며,
모세관은 리간드와 혼합된 배경 전해질 완충액으로 채워지는 것인
시스템. - 청구항 1에 있어서,
모세관의 캐소드 말단 근처에 위치하는 검출기
를 추가로 포함하고,
상기 검출기는 210 nm 내지 220 nm 광 흡광도 또는 레이저 유도 형광을 검출하는 것인 시스템. - 청구항 1 또는 2에 있어서, 샘플이 적어도 하나의 동종이량체, 적어도 하나의 이종이량체, 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 시스템.
- 청구항 1-3 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 적어도 하나의 이종이량체의 제1 서브유닛에 결합하고 적어도 하나의 이종이량체의 제2 서브유닛에 결합하지 않을 때, 제1 리간드-단백질 복합체가 형성되는 것인 시스템.
- 청구항 1-4 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 동종이량체의 적어도 2개의 동일한 제1 또는 제2 서브유닛에 결합할 때, 제2 리간드-단백질 복합체가 형성되는 것인 시스템.
- 청구항 1-5 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 멀티-서브유닛 단백질의 서브유닛에 결합할 때, 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체가, 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성 또는 이들의 조합을 갖도록 구성되는 것인 시스템.
- 청구항 1-6 중 어느 한 항에 있어서, 제2 리간드-단백질 복합체가 제1 리간드-단백질 복합체보다 더 낮은 전기영동 이동성을 갖는 것인 시스템.
- 청구항 1-7 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 펩티드 또는 펩티드 단편인 시스템.
- 청구항 1-8 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 형광 표지된 펩티드 또는 형광 표지된 펩티드 단편인 시스템.
- 청구항 1-9 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 인간 CD3 펩티드, 마우스 CD3 펩티드, 랫트 CD3 펩티드, 토끼 CD3 펩티드 및 시노몰구스 원숭이 CD3 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
- 청구항 1-10 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 리간드의 비-결합 영역에 하나 이상의 아미노산을 부가함으로써 변형되는 것인 시스템.
- 청구항 11에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 글루탐산, 아스파르트산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
- 청구항 11 또는 12에 있어서, 부가되는 하나 이상의 아미노산이 리간드의 전하 및 질량을 변경하도록 구성되는 것인 시스템.
- 청구항 11-13 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이
(A) 저 pH 요소 완충액; 또는
(B) 0.1% 폴리소르베이트 20과 조합된 고 pH HEPES 완충액
에서 리간드와 추가로 혼합되는 것인 시스템. - 청구항 11-14 중 어느 한 항에 있어서, 배경 전해질 완충액이 아미노-n-카프로산 (EACA), 트리에틸렌테트라민 (TETA) 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스 (HPMC)를 포함하는 것인 시스템.
- 샘플 내 멀티-서브유닛 단백질을 분리하는 방법이며,
(a) 샘플과 리간드의 혼합물을 생성하여 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 형성하는 단계,
(b) 상기 혼합물을 모세관에 적용하는 단계이며, 상기 모세관은 리간드와 혼합된 배경 전해질 완충액으로 채워지는 것인 단계,
(c) 상기 모세관에 전압을 적용하는 단계, 및
(d) 멀티-서브유닛 단백질 및 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체가 모세관을 통해 이동하도록 하는 단계
를 포함하고,
리간드가 멀티-서브유닛 단백질의 서브유닛에 결합할 때, 상기 리간드-단백질 복합체가, 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성 또는 이들의 조합을 갖도록 구성되고, 이로써 샘플 내 멀티-서브유닛 단백질들을 분리하는 것인 방법. - 샘플 혼합물에서 표적 단백질을 단리하는 방법이며,
(a) 샘플과 리간드의 혼합물을 생성하여 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체를 형성하는 단계,
(b) 상기 혼합물을 모세관에 적용하는 단계이며, 상기 모세관은 리간드와 혼합된 배경 전해질 완충액으로 채워지는 것인 단계,
(c) 상기 모세관에 전압을 적용하는 단계,
(d) 멀티-서브유닛 단백질 및 적어도 하나의 리간드-단백질 복합체가 모세관을 통해 이동하도록 하는 단계이며, 리간드가 멀티-서브유닛 단백질의 서브유닛에 결합할 때, 상기 리간드-단백질 복합체가, 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성 또는 이들의 조합을 갖도록 구성되는 것인 단계, 및
(e) 비-표적 단백질들로부터 분리된 표적 단백질을 단리하는 단계
를 포함하는 방법. - 청구항 16 또는 17에 있어서, 모세관이 캐소드 말단, 애노드 말단 및 검출기를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 18에 있어서, 검출기가 모세관의 캐소드 말단 근처에 존재하고 210 nm 내지 220 nm 광 흡광도 또는 레이저 유도 형광을 검출하는 것인 방법.
- 청구항 16-19 중 어느 한 항에 있어서, 전압이 30 킬로볼트인 방법.
- 청구항 16-20 중 어느 한 항에 있어서, 샘플이 적어도 하나의 동종이량체, 적어도 하나의 이종이량체 또는 이들의 조합을 포함하고,
적어도 하나의 이종이량체는 제1 서브유닛 및 제2 서브유닛을 포함하고,
적어도 하나의 동종이량체는 적어도 2개의 동일한 제1 또는 제2 서브유닛을 포함하는 것인
방법. - 청구항 21에 있어서, 적어도 하나의 이종이량체가 이중특이적 항체를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 21에 있어서, 적어도 하나의 동종이량체가 단클론 항체를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 16-23 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 펩티드 또는 펩티드 단편인 방법.
- 청구항 16-24 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 형광 표지된 펩티드 또는 형광 표지된 펩티드 단편인 방법.
- 청구항 16-24 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 인간 CD3 펩티드, 마우스 CD3 펩티드, 랫트 CD3 펩티드, 토끼 CD3 펩티드 및 시노몰구스 원숭이 CD3 펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 청구항 16-24 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 리간드의 비-결합 영역에 하나 이상의 아미노산을 부가함으로써 변형되도록 구성되는 것인 방법.
- 청구항 27에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 글루탐산, 아스파르트산 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 청구항 27 또는 28에 있어서, 부가되는 하나 이상의 아미노산이 리간드의 전하 및 질량을 변경하도록 구성되는 것인 방법.
- 청구항 16-29 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 적어도 하나의 이종이량체의 제1 서브유닛에 결합하고 적어도 하나의 이종이량체의 제2 서브유닛에 결합하지 않을 때, 제1 리간드-단백질 복합체가 형성되는 것인 방법.
- 청구항 16-30 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 동종이량체의 적어도 2개의 동일한 제1 또는 제2 서브유닛에 결합할 때, 제2 리간드-단백질 복합체가 형성되는 것인 방법.
- 청구항 16-31 중 어느 한 항에 있어서,
(A) 저 pH 요소 완충액을 샘플과 리간드의 혼합물에 혼합하는 단계; 또는
(B) 0.1% 폴리소르베이트 20과 조합된 고 pH HEPES 완충액을 샘플과 리간드의 혼합물에 혼합하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 청구항 16-32 중 어느 한 항에 있어서, 배경 전해질 완충액이 아미노-n-카프로산 (EACA), 트리에틸렌테트라민 (TETA) 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로오스 (HPMC)를 포함하는 것인 방법.
- 청구항 16-33 중 어느 한 항에 있어서,
샘플 내 표적 단백질의 양을 정량화하는 단계
를 추가로 포함하는 방법. - 결합 영역 및 변형을 포함하며,
상기 결합 영역은 관심 단백질과 결합하거나 이에 의해 결합되며,
상기 변형은 관심 단백질의 단리를 용이하게 하는 것인,
친화성 모세관 전기영동 리간드. - 청구항 35에 있어서, 관심 단백질이 동종이량체인 리간드.
- 청구항 35에 있어서, 관심 단백질이 이종이량체인 리간드.
- 청구항 35에 있어서, 결합 영역이 폴리펩티드인 리간드.
- 청구항 35에 있어서, 결합 영역이 소분자인 리간드.
- 청구항 35에 있어서, 변형이 리간드에 대한 형광 라벨의 부가 또는 하나 이상의 아미노산의 부가인 리간드.
- 청구항 35에 있어서, 리간드가 표적 단백질에 결합할 때, 변형이 형광 라벨 또는 변경된 전하, 질량, 유체역학적 크기, 전기영동 이동성 또는 이들의 조합을 제공하는 것인 리간드.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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