KR20240164561A - 폴리펩타이드 변종을 분석하기 위한 방법 및 시스템 - Google Patents
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Abstract
분석물 내의 전하 변종을 정량화하는 방법은, 분석물을 포함하는 샘플 완충액을 모세관 내로 도입하는 단계, 등전위 구배를 따라 샘플 완충액 내의 전하 변종을 분리하는 단계, 검출 항체에서 모세관을 인큐베이팅하는 단계, 검출 항체에 상응하는 신호를 기초로 하여 전하 변종의 상대 존재비를 정량화하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 방법은 전기영동도를 생성함을 추가로 포함할 수 있고, 여기서, 전기영동도는 신호가 검출된 등전위 구배를 따른 등전점에 대한 리포터 분자에 의해 생성된 신호의 강도의 플롯을 포함한다.
Description
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2022년 3월 18일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 63/269,595에 대한 우선권을 주장하고, 이는 이의 전문이 참조로서 포함된다.
기술 분야
본 개시는 폴리펩타이드 변종을 분석하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다. 본 개시의 일부 측면은 샘플 내에 전하 변종을 정량화하기 위한 시스템 및 방법에 관한 것이다.
도입
생물약제학적 생성물 (예를 들면, 항체, 항체-약물 접합체, 융합 단백질, 아데노-관련 바이러스 (AAV), 단백질, 조직, 세포, 폴리펩타이드, 또는 생물학적 기원의 기타 치료학적 생성물)은 감염 질환, 유전적 질환, 자가면역 질환, 및 다른 질병을 치료 및 예방하기 위해 점점 더 이용되고 있다. 이들의 생물학적 기원 때문에, 생물약제학적 생성물은 전하 이종성을 포함하는 다차원 이종성을 갖는다. 예를 들면, 다양한 번역 후 변형, 예를 들면, 글리코실화, 산화, 또는 탈아미드화는, 유사한 또는 동일한 제조 조건하에 생물학적으로 생성된 생성물에서 전하 이종성을 야기할 수 있다.
전하 변종을 특성화하고 전하-변종 프로파일을 개발하는 종래 방법은 온전한 단백질 또는 다중-단백질 구조를 이해하는 데에 한계가 있을 수 있다. 그러나, 전하 변종은 폴리펩타이드 또는 단백질 하위-유닛 내에 형성될 수 있고, 더 큰 구조의 특성화는 개별적인 폴리펩타이드 또는 하위-유닛의 전하 변종을 특성화하기 위해 필수적인 세부사항이 부족할 수 있다. 추가로, 전하 변종을 특성화하는 종래 방법은 전하 변종 특성화와 연관된 비용을 증가시키는 시간 및 노동 집약적 크로마토그래피 단계를 포함할 수 있다.
요지
본 개시의 측면은 분석물 내에 전하 변종을 정량화하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 분석물을 모세관 내로 도입하는 단계, 등전위 구배를 따라 샘플 완충액 내에 전하 변종을 분리하는 단계, 검출 항체에서 모세관을 인큐베이팅하는 단계, 및 검출 항체에 상응하는 신호를 기초로 하여 전하 변종의 상대 존재비를 정량화하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 리포터 분자에서 모세관을 인큐베이팅하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 리포터 분자는 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 항체 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 스트렙타비딘을 포함할 수 있다. 상기 방법은 검출 제제를 모세관 내로 도입하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 검출 제제는 루미놀-퍼옥사이드일 수 있다. 상기 방법은 전기영동도를 생성하는 것을 추가로 포함할 수 있고, 여기서, 전기영동도는 등전위 구배를 따른 등전점에 대한 리포터 분자에 의해 생성된 화학발광 신호의 강도의 플롯을 포함하고, 여기서, 화학발광 신호가 검출된다. 검출 항체에 상응하는 신호를 기초로 하여 전하 변종의 상대 존재비를 정량화하는 것은 전하 변종에 상응하는 전기영동도의 피크하 면적의 피크하 면적을 계산하는 것을 포함할 수 있다. 상기 방법은 등전위 구배를 따라 전하 변종을 분리한 후에, 및 검출 항체에서 모세관을 인큐베이팅하기 전에 모세관 내에 전하 변종을 고정시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
또다른 측면에서, 본 개시는 분석물 내에 전하 변종을 정량화하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 분석물 내에 폴리펩타이드를 환원 및 변성시켜 환원 및 변성된 폴리펩타이드를 생성하는 것을 포함할 수 있고, 여기서, 분석물은 표적 폴리펩타이드의 전하 변종을 포함한다. 상기 방법은 환원 및 변성된 폴리펩타이드를 완충액 교환하여 완충액 교환된 샘플을 생성시키는 것을 추가로 포함할 수 있고, 여기서, 완충액 교환된 샘플은 환원 및 변성된 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 방법은 완충액 교환된 샘플을 포함하는 샘플 완충액을 제조함을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 샘플 완충액을 모세관 내로 도입하는 단계, 및 샘플 완충액을 모세관 내로 도입하는 단계를 포함한다. 상기 방법은 등전위 구배를 따라 상기 표적 폴리펩타이드의 전하 변종을 분리하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 모세관 내에 등전위 구배 내 영역에서 표적 폴리펩타이드의 존재비에 상관관계가 있는 신호를 측정하는 것을 포함한다.
샘플 완충액은 우레아, 캐리어 양쪽성전해질(carrier ampholytes), 및 셀룰로스를 포함할 수 있다. 셀룰로스는 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로스일 수 있고, 샘플 완충액은 적어도 대략 1 용적 퍼센트의 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로스를 포함할 수 있다. 샘플 완충액은 적어도 대략 6 M 또는 적어도 대략 8 M의 우레아 농도를 포함할 수 있다. 샘플 완충액은 포름아미드를 포함할 수 있다. 샘플 내에 포름아미드 농도는 대략 30 용적 퍼센트 이하일 수 있다.
또다른 측면에서, 본 개시는 표적 폴리펩타이드의 샘플에 의해 감지된 환경적 스트레스의 수준을 평가하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 생성하는 단계를 포함할 수 있고, 여기서, 전하 변종 프로파일은 다수의 피크를 포함한다. 다수의 피크의 각각의 피크는 표적 폴리펩타이드의 상응하는 전하 변종과 연관되고, 표적 폴리펩타이드의 상응하는 전하 변종의 등전점과 등가인 등전점과 연관되고, 및/또는 표적 폴리펩타이드의 상응하는 전하 변종의 상대 존재비와 연관된 상대 피크 면적을 포함할 수 있다. 상기 방법은 샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 하나 이상의 공지된 전하 변종 프로파일과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 방법은 샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 하나 이상의 공지된 전하 변종 프로파일과 비교함을 기초로 하여, 샘플에 의해 감지된 환경적 스트레스의 수준을 측정함을 포함한다.
환경적 스트레스의 수준은 열 스트레스의 수준, 제조 공정 유지 시간에 기인하는 스트레스의 수준, 또는 동결-해동 주기에 기인하는 스트레스의 수준과 연관될 수 있다. 표적 폴리펩타이드는 항체 또는 아데노-관련 바이러스를 포함할 수 있다. 샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 생성하는 것은 샘플을 모세관 내로 도입하는 단계 및 등전위 구배를 따라 상기 표적 폴리펩타이드의 전하 변종을 분리하는 단계를 포함할 수 있다. 샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 생성하는 것은 검출 항체에서 모세관을 인큐베이팅하는 단계, 리포터 분자에서 모세관을 인큐베이팅하는 단계, 및 전기영동도를 생성하는 단계를 추가로 포함할 수 있고, 여기서, 전기영동도는 신호가 검출된 등전위 구배를 따른 등전점에 대한 리포터 분자에 의해 생성된 신호의 강도의 플롯을 포함한다.
도면의 간단한 설명
본 명세서에 도입되고 이의 부분을 구성하는 동반되는 도면은, 명세서와 함께 다양한 예시적인 실시형태를 예시하고, 개시된 실시형태의 원리를 설명하는 역할을 한다. 본원에 기재된 실시형태 또는 실시예의 임의의 특징 (예를 들면, 조성물, 제형, 방법 등)은 임의의 다른 실시형태 또는 실시예와 조합할 수 있고, 모든 이러한 조합은 본 개시에 포함된다. 또한, 기재된 시스템 및 방법은 임의의 단일 측면에도, 이의 실시형태에도, 이러한 측면 및 실시형태의 임의의 조합 또는 순열에도 한정되지 않는다. 간결하게 하기 위해, 특정 순열 및 조합은 본원에 개별적으로 논의 및/또는 예시되지 않는다.
도 1은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 폴리펩타이드의 전하 변종을 분리 및 정량화하는 예시적인 방법을 흐름도 형태로 도시하고;
도 2는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 폴리펩타이드의 전하 변종을 분리 및 정량화하는 예시적인 방법을 흐름도 형태로 도시하고;
도 3은 본 개시의 측면에 따른 전하 변종의 상대 존재비를 정량화하는 예시적인 방법을 흐름도 형태로 도시하고;
도 4a 및 4b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 4c는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 4d는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 5a 및 5b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 5c는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 5d는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 6a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 6b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 6c는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 7a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 7b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 8a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 8b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 9a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 9b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 9c는 본 개시의 측면에 따른 도 9a 및 9b의 전하 변종 프로파일을 기초로 하여 계산된 상대 피크 면적을 비교하는 플롯을 도시하고;
도 10a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 10b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 11a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 11b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 11c는 도 11a의 전하 변종 프로파일을 기초로 하여 계산된 상대 피크 면적을 비교하는 플롯을 도시하고;
도 11d는 본 개시의 측면에 따른 도 11b의 전하 변종 프로파일을 기초로 하여 계산된 상대 피크 면적을 비교하는 플롯을 도시하고;
도 12a는 본 개시의 측면에 따른 네이티브 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 12b는 본 개시의 측면에 따른 네이티브 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 13a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 13b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 14a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 14b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 15는 본 개시의 측면에 따른 항-바이러스성 단백질 다클론성 항체를 사용하는 웨스턴 블롯을 도시하고;
도 16은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 17은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 18, 19, 20a, 20b, 21a, 21b, 22a, 22b, 23a-23c, 24a-24d, 25a-25d, 및 26a-26d 각각은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 27a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 27b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 28a-28e 각각은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 29는 본 개시의 측면에 따른 도 28a-28e의 전하 변종 프로파일을 기초로 하여 계산된 상대 피크 면적을 비교하는 플롯을 도시하고;
도 30a-30d 각각은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 31은 본 개시의 측면에 따라 도 30a-30d의 전하 변종 프로파일을 기초로 하여 계산된 상대 피크 면적을 비교하는 플롯을 도시하고;
도 32a, 32b, 33a, 33b, 34a, 및 34b 각각은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 35, 36, 및 37은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시한다.
본 명세서에 도입되고 이의 부분을 구성하는 동반되는 도면은, 명세서와 함께 다양한 예시적인 실시형태를 예시하고, 개시된 실시형태의 원리를 설명하는 역할을 한다. 본원에 기재된 실시형태 또는 실시예의 임의의 특징 (예를 들면, 조성물, 제형, 방법 등)은 임의의 다른 실시형태 또는 실시예와 조합할 수 있고, 모든 이러한 조합은 본 개시에 포함된다. 또한, 기재된 시스템 및 방법은 임의의 단일 측면에도, 이의 실시형태에도, 이러한 측면 및 실시형태의 임의의 조합 또는 순열에도 한정되지 않는다. 간결하게 하기 위해, 특정 순열 및 조합은 본원에 개별적으로 논의 및/또는 예시되지 않는다.
도 1은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 폴리펩타이드의 전하 변종을 분리 및 정량화하는 예시적인 방법을 흐름도 형태로 도시하고;
도 2는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 폴리펩타이드의 전하 변종을 분리 및 정량화하는 예시적인 방법을 흐름도 형태로 도시하고;
도 3은 본 개시의 측면에 따른 전하 변종의 상대 존재비를 정량화하는 예시적인 방법을 흐름도 형태로 도시하고;
도 4a 및 4b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 4c는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 4d는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 5a 및 5b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 5c는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 5d는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 6a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 6b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 6c는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 7a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 7b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 8a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 8b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 9a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 9b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 9c는 본 개시의 측면에 따른 도 9a 및 9b의 전하 변종 프로파일을 기초로 하여 계산된 상대 피크 면적을 비교하는 플롯을 도시하고;
도 10a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 10b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 11a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 11b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 11c는 도 11a의 전하 변종 프로파일을 기초로 하여 계산된 상대 피크 면적을 비교하는 플롯을 도시하고;
도 11d는 본 개시의 측면에 따른 도 11b의 전하 변종 프로파일을 기초로 하여 계산된 상대 피크 면적을 비교하는 플롯을 도시하고;
도 12a는 본 개시의 측면에 따른 네이티브 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 12b는 본 개시의 측면에 따른 네이티브 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 13a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 13b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 14a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 14b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 15는 본 개시의 측면에 따른 항-바이러스성 단백질 다클론성 항체를 사용하는 웨스턴 블롯을 도시하고;
도 16은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 17은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 18, 19, 20a, 20b, 21a, 21b, 22a, 22b, 23a-23c, 24a-24d, 25a-25d, 및 26a-26d 각각은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 27a는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 27b는 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 28a-28e 각각은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 29는 본 개시의 측면에 따른 도 28a-28e의 전하 변종 프로파일을 기초로 하여 계산된 상대 피크 면적을 비교하는 플롯을 도시하고;
도 30a-30d 각각은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 31은 본 개시의 측면에 따라 도 30a-30d의 전하 변종 프로파일을 기초로 하여 계산된 상대 피크 면적을 비교하는 플롯을 도시하고;
도 32a, 32b, 33a, 33b, 34a, 및 34b 각각은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시하고;
도 35, 36, 및 37은 본 개시의 측면에 따른 환원 및 변성된 분석물의 전하 변종 프로파일을 도시한다.
상세한 설명
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학적 용도는 본원의 개시가 속하는 당해 기술분야의 숙련가가 통상 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 임의의 적합한 방법 및 물질 (예를 들면, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등함)이 본 개시의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 특정 예시 방법이 본원에 기재된다. 언급된 모든 간행물은 참조로서 본원에 포함된다.
본원에 사용된 용어 "포함한다(comprises)", "포함하는(comprising)", 또는 이의 다른 변형은, 비-배타적 포함을 포함하는 것을 의도하고, 따라서, 요소의 목록을 포함하는 공정, 방법, 물품, 또는 장치는 단지 이들 요소만 포함하지 않고, 이러한 공정, 방법, 물품, 또는 장치에 분명하게 기재되지 않거나 내재하는 다른 요소를 포함할 수 있다. 용어 "예시적인"은 "이상적"인 것 보다는 "예시"의 의미로 사용된다. 용어 "예를 들면" 및 "이와 같은", 및 이의 문법적 등가물, 문구 "및 이에 제한되지 않음"은, 달리 분명하게 기재되지 않는 한, 하기와 같이 이해된다.
본원에 사용된 용어 "약"은 실험 오차로 인해 변동을 고려하기 위한 것이다. 수치 값에 적용되는 경우, 용어 "약"은 달리 상이한 변화가 기재되지 않는 한, 개시된 수치 값에서 +/- 5% 변동을 지시할 수 있다. 본원에 사용된 단수 형태 하나("a", "an"), 및 상기("the")는, 문맥에서 달리 명백하게 나타내지 않는 한, 복수 언급을 포함한다. 추가로, 모든 범위는 종점, 예를 들면, 1 센티미터 (cm) 내지 5 cm를 포함하여 1 cm, 5 cm의 길이, 및 1 cm 및 5 cm 사이의 모든 거리를 포함한다는 것을 이해하여야 한다.
본원에 개시되거나 청구된 모든 수치 값 (모든 개시된 값, 한계, 및 범위를 포함함)이, 달리 상이한 변화가 기재되지 않는 한, 개시된 수치 값으로부터 +/- 5%의 변동을 가질 수 있음을 주의한다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩타이드"는 아미드 결합을 통해 공유 결합된 약 20개 초과의 아미노산을 갖는 임의의 아미노산 중합체를 언급한다. 단백질은 하나 이상의 아미노산 중합체 쇄 (예를 들면, 폴리펩타이드)를 포함한다. 따라서, 폴리펩타이드는 단백질일 수 있고, 단백질은 다중 폴리펩타이드를 포함하여 단일 관능성 생체분자를 형성할 수 있다.
변역-후 변형은 폴리펩타이드의 구조를 변형 또는 변경시킬 수 있다. 예를 들면, 디설파이드 브릿지 (예를 들면, 시스테인 잔기 간의 S-S 결합)는 일부 단백질에서 변역-후 형성될 수 있다. 일부 디설파이드 브릿지는 폴리펩타이드, 면역글로불린, 단백질, 공동-인자, 기질, 등의 적합한 구조, 기능, 및 상호작용에 본질적이다. 디설파이드 결합 형성에 추가하여, 단백질을 다른 변역-후 변형, 예를 들면, 지질 (예를 들면, 미리스토일화, 팔미토일화, 파르네소일화, 게라닐게라닐화, 및 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 앵커 형성), 알킬화 (예를 들면, 메틸화), 아실화, 아미드화, 글리코실화 (예를 들면, 아르기닌, 아스파라긴, 시스테인, 하이드록시리신, 세린, 트레오닌, 티로신, 및/또는 트립토판에서 글리코실 그룹의 첨가), 및 인산화 (즉, 세린, 트레오닌, 티로신, 및/또는 히스티딘에 포스페이트 그룹의 첨가)에 적용할 수 있다. 변역-후 변형은 폴리펩타이드에 의해 참여된 표면-대-표면 상호작용을 측정하는 소수성, 정전기 표면 성질, 또는 기타 성질에 영향을 미칠 수 있다.
본원에 사용된 용어 "단백질"은 생물치료학적 단백질, 연구 또는 요법에 사용되는 재조합 단백질, 트랩 단백질 및 다른 Fc-융합 단백질, 키메라 단백질, 항체, 모노클로날 항체, 사람 항체, 이특이적 항체, 항체 단편, 항체-유사 분자, 나노바디, 재조합 항체 키메라, 사이토킨, 케모킨, 펩타이드 호르몬 등을 포함한다. 관심 대상 단백질 (POI)은 단리, 정제 또는 그렇지 않으면 제조되는 것이 바람직한 임의의 폴리펩타이드 또는 단백질을 포함할 수 있다. POI는 항체를 포함하여 세포에 의해 생성되는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "항체"는, 4개의 폴리펩타이드 쇄: 디설파이드 결합 상호-연결된 2개의 중 (H) 쇄 및 2개의 경 (L) 쇄로 구성된 면역글로불린을 포함한다. 전형적으로, 항체는 100 kDa가 넘는 분자량, 예를 들면, 130 kDa 내지 200 kDa, 예를 들면, 약 140 kDa, 145 kDa, 150 kDa, 155 kDa, 또는 160 kDa의 분자량을 갖는다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에 HCVR 또는 VH로서 축약됨) 및 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에 LCVR 또는 VL로서 축약됨) 및 경쇄 불변 영역을 포함한다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인, CL을 포함한다. VH 및 VL 영역은 추가로 프레임워크 영역 (FR)으로 칭명되는 더 보존적인 영역과 함께 배치된 상보성 결정 영역 (CDR)으로 칭명되는 초가변성의 영역으로 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 하기 순서로 아미노-말단에서 카복시-말단로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3으로 축약될 수 있고; 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3으로 축약될 수 있다).
면역글로불린 G (IgG)로 칭명되는 면역글로불린의 부류는, 예를 들면, 사람 혈청에서 공통이고, 4개의 폴리펩타이드 쇄 - 2개의 경쇄 및 2개의 중쇄를 포함한다. 각각의 경쇄는 하나의 중쇄에 시스틴 디설파이드 결합을 통해 결합되고, 2개의 중쇄는 2개의 시스틴 디설파이드 결합을 통해 서로 결합된다. 다른 부류의 사람 면역글로불린은 IgA, IgM, IgD, 및 IgE를 포함한다. IgG의 경우, 4개의 하위부류가 존재한다: IgG 1, IgG 2, IgG 3, 및 IgG 4. 각각의 하위부류는 이들의 불변 영역에서 상이하고, 결과적으로, 상이한 이펙터 기능을 가질 수 있다. 본원에 기재된 일부 실시형태에서, 생물약제학적 생성물은 IgG를 포함하는 표적 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 실시형태에서, 표적 폴리펩타이드는 IgG 4를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "항체"는 또한 완전한 항체 분자의 항원-결합 단편을 포함한다. 본원에 사용된 용어 항체의 "항원-결합 부분", 항체의 "항원-결합 단편" 등은, 특히 항원에 결합하여 복합물을 형성하는 임의의 천연 발생, 효소적으로 수득가능한, 합성, 또는 유전자 조작된 폴리펩타이드 또는 당단백질을 포함한다. 항체의 항원-결합 단편은, 예를 들면, 임의의 적합한 표준 기술, 예를 들면, 단백질가수분해 소화 또는 항체 가변 및 임의로 불변 도메인을 암호화하는 DNA의 조작 및 발현에 연관된 재조합 유전 공학 기술을 사용하여 완전한 항체 분자로부터 유래될 수 있다. 이러한 DNA는 공지되어 있고/있거나, 예를 들면, 시판 공급원, DNA 라이브러리 (예를 들면, 파지-항체 라이브러리를 포함함)로부터 용이하게 이용가능하거나, 합성될 수 있다. DNA는 서열분석되고, 화학적으로 또는 분자생물학 기술을 사용하여 조작되어, 예를 들면, 하나 이상의 가변 및/또는 불변 도메인을 적합한 배열으로 배열하거나, 코돈을 도입하거나, 시스테인 잔기를 생성하거나, 아미노산 등을 변형, 첨가 또는 결실시킬 수 있다.
생물약제학적 생성물 (예를 들면, 표적 분자, 폴리펩타이드, 항체)는 재조합 세포-기반 생성 시스템, 예를 들면, 곤충 바큘로바이러스 시스템, 효모 시스템 (예를 들면, 피치아 종), 또는 포유동물 시스템 (예를 들면, CHO 세포 및 CHO-K1 세포와 같은 CHO 유도체)을 사용하여 생성할 수 있다. 용어 "세포"는 재조합 핵산 서열을 발현하기 위해 적합한 임의의 세포를 포함한다. 세포는 원핵생물 및 진핵생물의 세포 (단일-세포 또는 다중-세포), 박테리아 세포 (예를 들면, 이. 콜리(E. coli), 바실러스 종(Bacillus spp.), 스트렙토마이세스 종(Streptomyces spp.) 등의 균주), 마이코박테리아 세포, 진균 세포, 효모 세포 (예를 들면, 에스. 세레비시애(S. cerevisiae), 에스. 폼베(S. pombe), 피. 파스토리스(P. pastoris), 피. 메타놀리카(P. methanolica) 등), 식물 세포, 곤충 세포 (예를 들면, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포, 트리코플러시아니(Trichoplusiani) 등), 비-사람 동물 세포, 사람 세포, 또는 세포 융합, 예를 들면, 예를 들면, 하이브리도마 또는 쿼드로마를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 사람, 원숭, 유인원, 햄스터, 래트, 또는 마우스 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 진핵생물일 수 있고, 하기 세포로부터 선택될 수 있다: CHO (예를 들면, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예를 들면, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장 (예를 들면, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들면, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (표피), CV-1, U937, 3T3, L 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, 세르톨리 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종 세포, 종양 세포, 및 상기 언급된 세포로부터 유래된 세포주. 일부 실시형태에서, 세포는 하나 이상의 바이러스성 유전자를 포함할 수 있고, 예를 들면, 바이러스성 유전자를 발현하는 망막 세포 (예를 들면, PER.C6™ 세포)이다.
용어 "표적 분자"는 표적 폴리펩타이드 (예를 들면, 항체, 항체 단편, AAV 입자, 바이러스성 단백질, 또는 기타 단백질 또는 단백질 단편), 또는 약물 생성물 (예를 들면, 아데노-관련 바이러스 (AAV) 또는 치료학적 용도를 위한 기타 분자)에서 생성, 단리, 정제, 및/또는 포함되는 것으로 의도되는 다른 분자를 언급하기 위해 본원에 사용될 수 있다. 본 개시에 따른 방법은 표적 폴리펩타이드를 언급할 수 있지만, 이들은 다른 표적 분자에 적용될 수 있다. AAV는, 예를 들면, 적합한 방법 (예를 들면, 심층여과, 친화성 크로마토그래피 등)에 따라 제조할 수 있고, AAV를 포함하는 혼합물은 본 개시에 따른 방법에 적용될 수 있다. 하기 하나 이상의 본 개시의 방법 전 또는 후, AAV를 포함하는 혼합물은 추가 절차 (예를 들면, 표적 서열을 포함하지 않는 "빈 카세트" 또는 AAV의 제거)에 적용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 분자는 항체, 사람 항체, 사람화 항체, 키메라 항체, 모노클로날 항체, 다중특이적 항체, 이특이적 항체, 항원 결합 항체 단편, 단일 쇄 항체, 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디, Fab 단편 또는 F(ab')2 단편, IgD 항체, IgE 항체, IgM 항체, IgG 항체, IgG1 항체, IgG2 항체, IgG3 항체, 또는 IgG4 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항체는 IgG1 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항체는 IgG2 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항체는 IgG4 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG4 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1 항체이다. 하나의 실시형태에서, 항체는 키메라 IgG2/IgG1/IgG4 항체이다.
일부 실시형태에서, 표적 분자 (예를 들면, 항체)는 항-프로그램된 세포 사멸 1 항체 (예를 들면, 미국 특허 출원 공보 번호 US2015/0203579A1에 기재된 항-PD1 항체), 항-프로그램된 세포 사멸 리간드-1 (예를 들면, 미국 특허 출원 공보 번호 US2015/0203580A1에 기재된 항-PD-L1 항체), 항-Dll4 항체, 항-안지오포에틴-2 항체 (예를 들면, 미국 특허 번호 9,402,898에 기재된 항-ANG2 항체), 항-안지오포에틴-유사 3 항체 (예를 들면, 미국 특허 번호 9,018,356에 기재된 항-AngPtl3 항체), 항-혈소판 유래 성장 인자 수용체 항체 (예를 들면, 미국 특허 번호 9,265,827에 기재된 항-PDGFR 항체), 항-프로락틴 수용체 항체 (예를 들면, 미국 특허 번호 9,302,015에 기재된 항-PRLR 항체), 항-보체 5 항체 (예를 들면, 미국 특허 출원 공보 번호 US2015/0313194A1에 기재된 항-C5 항체), 항-TNF 항체, 항-표피 성장 인자 수용체 항체 (예를 들면, 미국 특허 번호 9,132,192에 기재된 항-EGFR 항체 또는 미국 특허 출원 공보 번호 US2015/0259423A1에 기재된 항-EGFRvIII 항체), 항-프로프로테인 컨버타제 서브틸리신 켁신-9 항체 (예를 들면, 미국 특허 번호 8,062,640 또는 미국 특허 출원 공보 번호 US2014/0044730A1에 기재된 항-PCSK9 항체), 항-성장 및 분화 인자-8 항체 (예를 들면, 미국 특허 번호 8,871,209 또는 9,260,515에 기재된 항-미오스타틴 항체로도 공지된 항-GDF8 항체), 항-글루카곤 수용체 (예를 들면, 미국 특허 출원 공보 번호 US2015/0337045A1 또는 US2016/0075778A1에 기재된 항-GCGR 항체), 항-VEGF 항체, 항-IL1R 항체, 인터류킨 4 수용체 항체 (예를 들면, 미국 특허 출원 공보 번호 US2014/0271681A1 또는 미국 특허 번호 8,735,095 또는 8,945,559에 기재된 항-IL4R 항체), 항-인터류킨 6 수용체 항체 (예를 들면, 미국 특허 번호 7,582,298, 8,043,617 또는 9,173,880에 기재된 항-IL6R 항체), 항-인터류킨 33 (예를 들면, 미국 특허 출원 공보 번호 US2014/0271658A1 또는 US2014/0271642A1에 기재된 항- IL33 항체), 항-호흡 융합체 바이러스 항체 (예를 들면, 미국 특허 출원 공보 번호 US2014/0271653A1에 기재된 항-RSV 항체), 분화 3의 항-클러스터 (예를 들면, 미국 특허 출원 공보 번호 US2014/0088295A1 및 US20150266966A1에, 및 미국 출원 번호 62/222,605에 기재된 항-CD3 항체), 분화 20의 항-클러스터 (예를 들면, 미국 특허 출원 공보 번호 US2014/0088295A1 및 US20150266966A1, 및 미국 특허 번호 7,879,984에 기재된 항-CD20 항체), 분화-48의 항-클러스터 (예를 들면, 미국 특허 번호 9,228,014에 기재된 항-CD48 항체), 항-Fel d1 항체 (예를 들면, 미국 특허 번호 9,079,948에 기재됨), 항-중간 이스트 호흡 신드롬 바이러스 (예를 들면, 항-MERS 항체), 항-에볼라 바이러스 항체 (예를 들면, Regeneron's REGN-EB3), 항-CD19 항체, 항-CD28 항체, 항-IL1 항체, 항-IL2 항체, 항-IL3 항체, 항-IL4 항체, 항-IL5 항체, 항-IL6 항체, 항-IL7 항체, 항-Erb3 항체, 항-Zika 바이러스 항체, 항-림프구 활성화 유전자 3 (예를 들면, 항-LAG3 항체 또는 항-CD223 항체) 및 항-액티빈 A 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 이 단락에서 언급된 각각의 미국 특허 및 미국 특허 공보는 이의 전문이 참조로서 포함된다.
일부 실시형태에서, 표적 분자 (예를 들면, 이특이적 항체)는 항-CD3 x 항-CD20 이특이적 항체, 항-CD3 x 항-뮤신 16 이특이적 항체, 및 항-CD3 x 항-전립샘-특이적 막 항원 이특이적 항체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 표적 분자는 알리로쿠마브, 사릴루마브, 파시누마브, 네스바쿠마브, 두필루마브, 트레보그루마브, 에비나쿠마브, 및 리누쿠마브로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 표적 분자은 Fc 모이어티(moiety) 및 또다른 도메인 (예를 들면, Fc-융합 단백질)를 포함하는 재조합 단백질이다. 일부 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 Fc 모이어티에 결합된 수용체의 하나 이상의 세포외 도메인(들)을 포함하는 수용체 Fc-융합 단백질이다. 일부 실시형태에서, Fc 모이어티는 힌지 영역, 이어서, IgG의 CH2 및 CH3 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 수용체 Fc-융합 단백질은 단일 리간드 또는 다중 리간드에 결합된 2개 이상의 별개의 수용체 쇄를 포함한다. 예를 들면, Fc-융합 단백질은 단백질, 예를 들면 IL-1 트랩 (예를 들면, 릴로나셉트, 이는 hIgG1의 Fc에 융합된 Il-1R1 세포외 영역에 융합된 IL-1RAcP 리간드 결합 영역을 포함하고; 미국 특허 번호 6,927,004를 참조하고, 이의 전문이 참조로서 포함된다), 또는 VEGF 트랩 (예를 들면, 아플리버셉트 또는 지브-아플리버셉트, 이는 hIgG1의 Fc에 융합된 VEGF 수용체 Flk1의 Ig 도메인 3에 융합된 VEGF 수용체 Flt1의 Ig 도메인 2를 포함하고; 미국 특허 번호 7,087,411 및 7,279,159를 참조하고, 이들 둘 다는 이의 전문에 본원에 참조로서 포함된다)이다. 다른 실시형태에서, Fc-융합 단백질은 하나 이상의 하나 이상의 항원-결합 도메인(들), 예를 들면, Fc 모이어티에 결합된 항체의 가변 중쇄 단편 및 가변 경쇄 단편을 포함하는 ScFv-Fc-융합 단백질이다.
생물약제학적 생성물 중에서 전하 이종성은 수득한 약물 생성물의 안전성 및 효능에 영향을 줄 수 있고, 생물약제학적 생성물 제조자 및 규제 당국에 의해 모니터링될 수 있다. 예를 들면, 의도된 생물약제학적 생성물의 일부 전하 변종은 의도된 생물약제학적 생성물과 비교하여 상이한 약동학, 생물학적 활성, 및/또는 안정성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 항체의 경우, 일부 이소형 (예를 들면, 전하 변종)은 분해되거나 다른 변화를 겪어서 덜 효과적인 분자를 형성할 수 있다. 부적절한 저장 조건, 장기간 저장 기간, 산화, 또는 기타 환경적 스트레스는 생물약제학적 생성물의 효능에 영향을 줄 수 있고, 샘플 내에 전하 변종의 상대적 집단에 영향을 줄 수 있다.
생물약제학적 생성물의 전하 이종성을 모니터링하여 제조 공정에 걸쳐서 로트 간의 일관성을 보장할 수 있다. 전하 변종을 특성화하고, 전하-변종 프로파일을 개발하는 일부 방법은 온전한 단백질 또는 다중-단백질 구조를 이해하는 것을 제한한다. 그러나, 전하 변종은 폴리펩타이드 또는 단백질 하위-유닛 내에서 형성될 수 있고, 더 큰 구조의 특성화는 개별적인 폴리펩타이드 또는 하위-유닛의 전하 변종을 특성화하기 위해 필수적인 세부사항이 결핍될 수 있다. 예를 들면, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 전하 변종 프로파일은 온전한 항체의 전하 변종 프로파일보다 더 많은 정보를 제공할 수 있다. 또다른 예로서, 개별적인 바이러스성 단백질의 전하 변종 프로파일은 온전한 AAV (예를 들면, 온전한 캡시드 단백질)의 전하 변종 프로파일보다 더 많은 정보를 제공할 수 있다.
모세관 등전점전기영동 (CIEF)을 사용하여 전하 이종성을 특성화하고, 이들의 등전점 (pI)을 기초로 하여 전하 변종을 분리하였다. 적용에 좌우되어, CIEF는 또한 영상화 모세관 등전점전기영동 (iCIEF)으로 언급될 수 있다. 하기 세부사항에 에 추가로 기재된 바와 같이, iCIEF에 의해 생성된 항체 전하 변종 프로파일은 pI에 의해 배열된 피크의 스펙트럼을 포함하고, 우세한 주요 피크, 및 주요 피크의 둘 다의 사이드에서 산성 및 염기성 종에 대한 피크를 포함한다.
2-차원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (2D-PAGE)은 폴리펩타이드 (예를 들면, 단백질 하위-유닛)를 1차원으로 등전점을 기초로 하여 분리할 수 있고, 2차원의 크기를 기초로 하여 폴리펩타이드를 분리할 수 있다. 이러한 2-차원 분리를 사용하여 항체 중쇄 및 경쇄와 연관된 분리된 전하 이종성을 이해하였다. 그러나, 2D-PAGE는 단지 전하 이소형의 정성적 평가를 제공할 수 있고, 이를 이용하여 서로에 비해 개별적인 전하 이소형의 비율을 정량화할 수 없다. 추가로, 2D-PAGE는 시간 및 노동 집약적이고, 스트리킹(streaking)을 야기할 수 있고, 이는 낮은 존재비 이소형의 분석 및 검출의 전체 분해능을 감소시킨다.
2D-PAGE의 한계점을 해결하기 위해, 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 및 iCIEF를 사용하는 방법을 개발하였다. ChromiCE로서 언급된 방법을, 개별적으로 항체의 중쇄 및 경쇄에 상응하는 전하 변종을 검출하고 정량화하기 위해 사용할 수 있다. ChromiCE는 항체를 환원 및 변성시키고, 크기 배제 컬럼 상 환원 및 변성된 항체를 적재하여 중쇄 및 경쇄의 성분을 분리함을 포함한다. 분리된 중쇄 및 경쇄를 개별적으로 등전점전기영동 플랫폼 상에 적재할 수 있고, iCIEF를 사용하여 중쇄 및 경쇄와 연관된 전하 이소형을 확인 및 정량화할 수 있다.
2D-PAGE와 달리, ChromiCE는 정량적 결과를 제공한다. 그러나, ChromiCE로부터 데이터 수집 및 분석은 경쇄 및 중쇄의 시간 집중 분리 때문에 한 주만큼 길게 지속될 수 있다. 추가로, ChromiCE의 SEC 단계에 사용되는 이동상은 샘플을 변경할 수 있고, 뿐만 아니라, 컬럼 수명 및 수반된 기기의 지속에 부정적으로 영향을 줄 수 있는 높은 우레아 농도 (예를 들면, 대략 8M 우레아)를 갖는 완충액을 이용한다.
본 개시의 실시형태는 생물약제학적 생성물의 전하 변종을 확인 및 정량화하기 위한 방법, 예를 들면, 상기 언급된 2D-PAGE의 결점을 해결하는 방법 및 ChromiCE 방법을 포함할 수 있다. 본 개시의 실시형태는 네이티브 폴리펩타이드, 예를 들면, 네이티브 항체 및/또는 네이티브 AAV 입자의 전하 변종을 확인 및 정량화하기 위해 사용할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 본 개시의 실시형태는 환원 및 변성된 폴리펩타이드의 전하 변종을 확인 및 정량화하기 위해 사용할 수 있다. 본 개시의 방법으로 분석될 수 있는 환원 및 변성된 폴리펩타이드는 항체 (예를 들면, 중쇄, 경쇄, F(ab')2 단편, Fc 단편, 또는 기타 폴리펩타이드) 및/또는 환원 및 변성된 AAV 입자 (예를 들면, VP 단백질 또는 기타 폴리펩타이드)를 포함한다. 생물약제학적 생성물의 전하 변종을 확인 및 정량화하기 위한 본 개시의 방법은 iCIEF-웨스턴 방법으로 언급될 수 있다.
본 개시의 방법은 모세관 등전점전기영동을 사용하여 이들의 등전점을 기초로 하여 전하 변종을 분리함을 포함할 수 있다. 본 개시의 방법 (예를 들면, iCIEF-웨스턴 방법)은 크로마토그래피 분리 (예를 들면, SEC 단계)를 포함하지 않는다. 본 개시의 실시형태에 따라서, 폴리펩타이드는 이들의 등전점을 기초로 하여 분리될 후, iCIEF-웨스턴 방법은 단백질의 특이적 부분 및 상기 부분의 전하 변종을 정량화 및 특성화하기 위해 펩타이드-특이적 항체를 이용한다.
일부 실시형태에서, 분석물은 분석물을 본 개시의 방법 (예를 들면, iCIEF-웨스턴 방법)을 통해 프로세싱하기 전에 제조될 필요가 있을 수 있다. 본원에 사용된 "분석물"은 표적 폴리펩타이드 (예를 들면, 항체, AAV 입자, 또는 기타 폴리펩타이드)를 포함하는 샘플, 용액, 혼합물, 약물 생성물, 또는 기타 조성물을 언급할 수 있다. 분석물을 제조하는 것은 분석물을 포함하는 적재 완충액을 제조함을 포함할 수 있다.
적재 완충액은 전하 변종의 분리 및/또는 전하 변종의 확인을 조력하는 하나 이상의 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 적재 완충액은 하나 이상의 캐리어 양쪽성전해질, 하나 이상의 셀룰로스 (예를 들면, 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로스), pI 래더(ladder), 염기 (예를 들면, 우레아), 포름아미드, 글리세롤, 에틸렌, 프로필렌 글리세롤, 물, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적재 완충액은 용해 완충액 (예를 들면, Bicine/CHAPS 용해 완충액)를 포함할 수 있다. 캐리어 양쪽성전해질은 전하 변종의 분리 동안 전기 구배를 생성하는 것을 조력할 수 있다. 캐리어 양쪽성전해질은 상표명 Pharmalytes하에 판매되는 것들, 예를 들면, Pharmalytes (3-10) 및 Pharmalytes (5-8)를 포함할 수 있다. pI 래더는, pI 값을 갖는 분자를 사용하여, CIEF 단계의 결과에 대한 표준화된 마킹을 제공할 수 있다. 캐리어 양쪽성전해질의 pI 래더를 분석물의 이론적 pI를 기초로 하여 선택할 수 있다. 염기, 예를 들면, 우레아의 포함은, 적재 완충액 내 종이 다른 전하 변종으로 전환되는 것을 방지할 수 있다. 적재 완충액 내 염기 (예를 들면, 우레아)의 포함은 분석물 내에 폴리펩타이드 (예를 들면, 변성된 항체 단편 또는 변성 바이러스성 단백질)의 단편의 변성된 상태를 유지하는 것을 조력할 수 있다.
하나의 예시적인 샘플 제조는 적재 완충액 마스터 믹스의 제조, 및 적재 완충액 및 분석물을 포함하는 샘플의 후속적인 제조를 포함한다. 적재 완충액 마스터 믹스의 제조는 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로스를 우레아 용액 (예를 들면, 적어도 6M 우레아를 포함하는 용해 완충액)에 용해시켜 적어도 6M의 우레아 농도를 갖는 1 중량 퍼센트 (wt.%) 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로스 용액을 생성함을 포함할 수 있다. 예를 들면, 1 wt.% 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로스 용액은 대략 8M의 우레아 농도를 포함할 수 있다. 적재 완충액 마스터 믹스를 표 1에 나타낸 비율에 따라 생성할 수 있다.
적재 완충액 마스터 믹스를 제조한 후, iCIEF-웨스턴 분석을 위한 샘플을 제조할 수 있다. 샘플은 분석물, 물, 용해 완충액, 적재 완충액 마스터 믹스, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 샘플은 대략 8M 보다 더 크거나 같은 우레아 농도를 가질 수 있다. 샘플은 대략 1 wt.%의 셀룰로스 (예를 들면, 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로스) 농도를 가질 수 있다. 예시적인 실시형태에서, 샘플을 표 2에 나타낸 비율에 따라 제조할 수 있다.
또다른 예시적인 샘플 제조는 하기 표 3에 나타낸다. 표 3에서 샘플 제조를, 예를 들면, 아데노-관련 바이러스를 포함하는 분석물로 사용할 수 있다.
본원에 기재한 바와 같이, 분석물은 분석되기 전에 환원 및 변성될 수 있다. 환원 및 변성된 분석물을 샘플 완충액의 제조 전에 완충액 교환할 수 있다. 완충액 교환된 분석물은 우레아 (예를 들면, 대략 8M 우레아), 나트륨 포스페이트 (예를 들면, 대략 10 mM 나트륨 포스페이트), 트리스(2-카복시에틸) 포스핀 (TCEP) (예를 들면, 대략 1 mM TCEP), 및/또는 분석물을 포함하는 용액을 포함할 수 있다. 또다른 예시적인 샘플 제조는 일부 완충액 교환된 분석물을 사용하여 표 4에 하기에 나타낸다. 표 4에서 샘플 제조를, 예를 들면, 항체를 포함하는 환원 및 변성된 분석물로 사용될 수 있다.
샘플 제조 및 적재 완충액을 조정하여 폴리펩타이드의 충분한 분리 및 안정성을 가능하게 할 수 있다. 예를 들면, 분석물의 성질 (예를 들면, 폴리펩타이드 농도, 점도, 또는 기타 물리화학적 성질)에 좌우되어, 적재 완충액 및 샘플 제조 조성물을 조정할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, CIEF 분리의 파라미터를 조정하여 샘플의 물리화학적 성질을 수용할 수 있다. 예를 들면, 분석물이 펩타이드의 평균 농도보다 더 큰 경우, 입수한 샘플은 평균 점도보다 더 클 수 있다. 적재 시간 및 CIEF 분리와 연관된 초점을 조정하여 증가된 샘플 점도를 설명할 수 있다. 다른 예로서, 양쪽성전해질 선택, 양쪽성전해질 농도, 샘플 용액 점도, 샘플 분석물 농도를 조정하여 폴리펩타이드 전하 변종의 충분한 분리 및 안정성을 가능하게 할 필요가 있을 수 있다.
본 개시의 방법을 사용하여 환원 및 변성된 폴리펩타이드의 전하 변종을 분리 및 정량화할 수 있다. 분석물을 iCIEF-웨스턴 분석 전에 분석물의 구성성분 폴리펩타이드를 환원 및 변성시키는 용액에서 인큐베이팅할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분석물을 이러한 용액에서 대략적으로 1시간 동안 인큐베이팅할 수 있다. 예를 들면, 분석물을 6M 구아니딘 HCl 및 10 mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀 (TCEP)을 포함하는 용액에서 인큐베이팅하여 분석물의 폴리펩타이드를 환원 및 변성시킬 수 있다. 항체를 포함하는 분석물의 예에서, 항체는 환원 및 변성되어 변성된 경쇄 및 중쇄를 갖는 용액을 야기할 수 있다. 다른 유형의 변성제 및/또는 다른 유형 단백질 소화를 이용하여 표적 분석물의 전하 변종을 추가 특성화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 프로테아제, 예를 들면, IdeS, 파파인, 또는 펩신을 사용하여 표적 폴리펩타이드를 단편으로 소화시킬 수 있다.
이어서, 환원 및 변성된 분석물을 대략 35 mM 내지 대략 50 mM 나트륨 포스페이트, 대략 1 mM 내지 대략 10 mM TCEP, 및 대략 6 M 내지 대략 8 M 우레아를 대략 6.0의 pH에서 포함하는 완충액과 완충액 교환할 수 있다. 이어서, 완충액 교환된 분석물을 대략 10 M 내지 대략 12 M 우레아를 포함하는 적재 완충액 및 용해 완충액과 합할 수 있다. 예를 들면, 완충액 교환된 분석물을 적재 완충액 마스터 믹스 및 용해 완충액과 표 2에 나타낸 비율에 따라 합할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 완충액 교환된 분석물을 표 3 또는 표 4에 나타낸 비율에 따라 다른 샘플 완충액 성분과 합할 수 있다.
샘플을 제조한 후, 샘플을 모세관 내로 적재할 수 있다. 샘플은 병렬로, 예를 들면, 병렬 모세관에서 작동할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플을 웰 플레이트 내로 적재하고, 자동 유체 취급 시스템은 샘플 및 다른 시약을 모세관 내로 운송한다. 전류가 샘플에 적용됨에 따라, 샘플 내에 종 (예를 들면, 샘플 내에 양쪽성전해질, pI 래더, 전하 변종)은 이들의 등전점 (pI)에 따라서, 모세관을 따라 분리될 수 있다. 예를 들면, 21000 μ와트의 전력을 30분 동안 적용할 수 있다. 등전점전기영동 분리의 작동 시간은 샘플의 조성물 (예를 들면, 전도도, 점도, 또는 기타 성질)을 기초로 하여 조정될 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 상이한 샘플 조성물은 전하 변종의 최적 분해능을 성취하기 위해 상이한 초점 시간을 필요로 할 수 있다.
전기 에너지가 모세관에 적용됨에 따라, 샘플을 갖는 종은 등전점에 따른 구배를 형성할 수 있고, 이에 따라, 최저 등전점을 갖는 종은 모세관의 첫번째 말단에 위치하고, 최고 등전점을 갖는 종은 모세관의 두번째 말단에 위치한다. iCIEF 분리를 등전점전기영동 플랫폼, 예를 들면, ProteinSimple이 제작한 PeggySue™ 기기를 사용하여 수행할 수 있다.
샘플 내에 전하 변종을 등전점을 기초로 하여 분리한 후, 특이적 항체를 사용하여 폴리펩타이드를 검출하고, 이들의 상대 존재비를 정량화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 분리된 전하 변종을 모세관 벽 상에 고정할 수 있다. 모세관을 포함하는 매트릭스를 세척하여 과량의 시약을 제거할 수 있다. 검출 항체를 도입하기 전에, 모세관을 포함하는 매트릭스를 차단할 수 있다. 예를 들면, 매트릭스를 소 혈청 알부민 용액 또는 우유에서 적어도 대략 30분 동안 인큐베이팅할 수 있다.
차단 후, 매트릭스를 세척할 수 있고, 검출 항체를 첨가할 수 있다. 상기 기재한 바와 같이, 폴리펩타이드가 환원 및 변성된 후, 폴리펩타이드의 단편의 전하 변종을 개별적으로 특이적 검출 항체로 정량화할 수 있다. 항체의 iCIEF-웨스턴 분석의 예에서, 특이적 항-사람 FC 항체를 중쇄 전하 변종을 검출하고 정량화하기 위해 사용할 수 있고, 항-사람 카파 항체를 경쇄 전하 변종을 검출하고 정량화하기 위해 사용할 수 있다. AAV 입자의 iCIEF-웨스턴 분석에서, 특이적 항-VP 단백질을 바이러스성 단백질 변종을 검출하고 정량화하기 위해 사용할 수 있다. 특이적 검출 항체에서 인큐베이션은 일차 인큐베이션으로 언급될 수 있다. 매트릭스를 하나 이상의 폴리펩타이드에 특이적인 항체에서 적어도 대략 60분 동안 인큐베이팅할 수 있다. 일부 예에서, 예를 들면, 항-사람 FC 단백질 항체 및 항-사람 카파 단백질 항체를 항체의 중쇄 및 경쇄의 검출에 사용하고, 적합한 검출 항체 농도는 대략 1 μg/mL 내지 대략 10 μg/mL일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적합한 검출 항체 농도는 대략적으로 2 μg/mL 내지 400 μg/mL일 수 있다.
다른 유형의 특이적 검출을 사용하여 폴리펩타이드의 전하 변종을 추가로 특성화할 수 있다. 예를 들면, 검출 항체에서 매트릭스를 인큐베이팅하는 대신에, 매트릭스를 표적 폴리펩타이드에 특이적 결합 능력을 갖는 항원에서 인큐베이팅할 수 있다.
일차 인큐베이션 후, 매트릭스를 세척하고, 이차 인큐베이션이 발생할 수 있다. 이차 인큐베이션 단계는 적어도 대략 120분 지속될 수 있다. 이차 인큐베이션은 하나 이상의 리포터 분자를 검출 항체에 결합시킨다. 리포터 분자는 전하 변종을 정량화하기 위해 사용할 수 있는 검출가능한 신호 (예를 들면, 화학발광 신호)를 생성할 수 있다. 검출가능한 신호의 강도를 리포터 분자의 농도 또는 존재비와 상관관계가 있을 수 있다. 검출 항체의 특이성으로 인해, 리포터 분자의 농도 또는 존재비 (예를 들면, 및 입수한 신호의 강도)는 표적 전하 변종의 농도 또는 존재비와 상관관계가 있다.
이차 인큐베이션 후, 매트릭스를 세척할 수 있고, 하나 이상의 리포팅 제제를 모세관 내로 도입할 수 있다. 리포팅 제제는 리포터 분자와 상호작용하여 각각의 전하 변종에 상응하는 검출가능한 신호를 생성할 수 있다. 샘플 내에 종은 이들의 등전점을 기초로 하여 이미 분리되었기 때문에, 리포팅 제제의 리포터 분자와의 상호작용으로부터 각각의 신호의 위치는 어느 전하 변종이 신호에 상응하는지를 지시한다. 검출가능한 신호의 강도를 당해 위치에서 상응하는 전하 변종의 상대 존재비에 상응할 수 있다. 검출가능한 신호의 강도를 신호의 위치에서 등전점에 대해 플롯팅하여 전기영동도를 생성할 수 있다.
전기영동도의 피크 면적을 가우스 분포 알고리즘으로 계산할 수 있다. 전기영동도의 모든 피크하에 총 면적으로 나눈 개별적인 피크의 면적은, 개별적인 피크에 상응하는 전하 변종의 상대 존재비에 상응할 수 있다. 전기영동도를 프로세서 및/또는 소프트웨어, 예를 들면, Compass 소프트웨어 (예를 들면, 버젼 4.0.0)의 도움으로 분석할 수 있다. 전하 변종 프로파일은 전기영동도, 전기영동도로부터 정량화된 전하 변종의 상대 존재비 및/또는 전하 변종의 등전점를 언급한다. 피크 면적의 계산을 통해 전하 변종의 전기영동도 및 정량화의 추가 예는 하기에 기재된다.
하나 이상의 실시형태에서, 예시적인 검출 식은 리포터 분자로서 스트렙타비딘에 접합된 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)를 사용한다. 예를 들면, 검출 항체에서 일차 인큐베이션 후, 매트릭스를 세척하고, 스트렙타비딘에 접합된 HRP를 포함하는 혼합물 중에서 인큐베이팅할 수 있다. 스트렙타비딘은 우선적으로 검출 항체의 비오틴에 결합할 수 있고, HRP는 루미놀-퍼옥사이드가 도입되는 경우 화학발광 반응을 야기할 수 있다. 이차 인큐베이션, 및 후속적인 세척 후, 루미놀-퍼옥사이드를 모세관 내로 주입되고, 이에 의해 루미놀-퍼옥사이드의 HRP와의 상호작용으로부터 화학발광 신호를 생성할 수 있다.
각각의 샘플의 이소형이 검출 전에 pI 구배로 분리되기 때문에, 피크의 측정된 화학발광 (예를 들면, HRP 접합체와의 검출 항체에 대해 425 nm에서)은 피크로 나타내는 이소형의 상대 존재비와 상관관계가 있다. 측정된 화학발광 신호를 기초로 하여 생성된 전기영동도는 각각의 분석된 폴리펩타이드의 전하 변종을 확인하고, 이들 전하 변종의 상대 존재비를 정량화하기 위해 사용할 수 있다.
iCIEF-웨스턴 프로토콜을 개발하는 경우, 수개의 조건은 샘플의 성질을 기초로 하여 조정되어야 할 수 있다. 예를 들면, 검출 항체의 농도는 신호-대-노이즈 비를 개선하기 위해 조정될 필요가 있을 수 있다. 적합한 검출 항체 농도의 측정시, 어플리케이션 특이적 인자, 예를 들면, 표적 폴리펩타이드 농도, 전하 변종의 범위, 검출 항체의 결합 친화도가 고려된다.
일부 iCIEF-웨스턴 방법이 항체 및 항체의 부분의 정황에서 상기에 기재되지만, 이들은 임의의 단백질성 생물약제학적 생성물의 전하 변종 프로파일을 특성화하기 위해 사용될 수 있다. 하나의 실시형태에서, iCIEF-웨스턴 검정은 아데노-관련 바이러스 (AAV)에 의해 생성된 하나 이상의 단백질의 전하 변종 프로파일을 특성화하기 위해 사용될 수 있다.
당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 바와 같이, 아데노-관련 바이러스 (AAV)를 교정 유전자를 표적 유기체의 세포 또는 조직 내로 전달하기 위해 사용할 수 있다. 예를 들면, 치료학적 유전자는 헬퍼 바이러스의 도움으로 AAV 게놈 내로 삽입될 수 있고, AAV는 치료학적 유전자를 하나 이상의 표적 세포에 전달할 수 있다. AAV는 비-병원성 및 비-독성이다. 상이한 AAV 혈청형을 적용에 좌우되어 사용할 수 있다. 각각의 AAV 혈청형은 세포의 상이한 유형에 대해 상이한 세포-형질도입 효율을 가질 수 있고, 일부 AAV 혈청형을 표적 특정 기관계, 기관, 및/또는 조직에 대해 더 적합하게 만든다. 예를 들면, AAVrh10 및 AAV2는 뇌 조직에 대해 최고 세포-형질도입 효율을 갖고; AAV2 및 AAV4는 눈 조직에 대해 최고 세포-형질도입 효율을 갖고; AAV6 및 AAV1은 폐 조직에 대해 최고 세포-형질도입 효율을 갖고; AAV1 및 AAV8은 근육 조직에 대한 최고 세포-형질도입 효율을 갖고; AAV8, AAV5, 및 AAV9는 간 조직에 대한 최고 세포-형질도입 효율을 갖고; 및 AAV9 및 AAVrh10은 최고 시스템 세포-형질도입 효율을 갖는다.
종종 VP1, VP2, 및 VP3으로서 언급되는 3개의 주요 AAV 캡시드 단백질이 존재한다. AAV 캡시드 단백질의 서열은 AAV 혈청형 사이에서 가변적일 수 있다. 따라서, 하나의 AAV 혈청형에 의해 생성된 폴리펩타이드의 전하 변종의 분석시 사용하기 위해 적합한 검출 항체는 기타 혈청형에 대해 적합하지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시의 방법은 AAV 캡시드 단백질에 특이적인 검출 항체를 개발함을 포함한다. 예를 들면, 본 개시의 방법은 특이적 AAV 혈청형의 캡시드 단백질에 결합된 래빗 다클론성 항체를 개발함을 포함할 수 있다.
일부 경우, VP2 서열은 VP3 서열을 포함하고, VP1 서열은 VP2 서열을 포함한다. 달리 기재된 경우, VP3에 특이적인 검출 항체는 또한 VP1 및 VP2에 결합될 수 있고, VP2에 특이적인 검출 항체는 또한 VP1에 결합될 수 있다. 예를 들면, VP2 및 VP3에 의해 공유되지 않은 VP1 서열의 부분으로부터 하나 이상의 재조합 펩타이드를 래빗 항원으로서 사용하여 VP1-특이적 다클론성 항체를 생성할 수 있고; VP3에 의해 공유되지 않은 VP2 서열의 부분으로부터 하나 이상의 재조합 펩타이드는 래빗 항원으로서 사용하여 VP2 및 VP1에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체를 생성할 수 있고; VP3으로부터 하나 이상의 재조합 펩타이드를 래빗 항원으로서 사용하여 VP3, VP2, 및 VP1에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체를 생성할 수 있다. 이러한 검출 항체를 이용하는 방법은 또한 각각의 검출 항체에 의해 생성된 상대적 전기영동도를 비교하여 AAV 캡시드 단백질의 전하 변종을 정량화할 수 있다. AAV 캡시드 단백질의 iCIEF-웨스턴 분석의 추가 예는 하기에 기재되어 있다 (예를 들면, 실시예 12-25).
본원에 기재한 바와 같이, 본 개시의 방법 (예를 들면, iCIEF-웨스턴 방법)을 사용하여 샘플 내에 표적 폴리펩타이드의 전하 변종 프로파일을 생성할 수 있다. 생성된 전하 변종 프로파일을 사용하여 iCIEF-웨스턴 방법을 입증하고, 로트의 제조 조건을 입증하고, 생물약제학적 생성물의 안정성에 미치는 제조 또는 저장 조건의 영향을 평가할 수 있다.
예를 들면, 전하 변종은 동일한 생물약제학적 생성물의 2개의 상이한 로트에 대해 정량화할 수 있다. 전하 변종의 상대적 집단을 정량화하고 이들이 공지된 이론적인 전하 변종 프로파일과 일치하는지를 증명하는 것은, iCIEF-웨스턴을 통해 개발된 정량화 방법을 입증하기 위해 사용할 수 있다.
추가로, 상이한 로트의 전하 변종 프로파일을 비교하여 로트가 제조되는 공정 조건을 측정, 확인, 또는 입증할 수 있다. 입증된 제조 및 환경 조건하에 첫번째 로트로부터 항체의 전하 프로파일이 공지되어 있는 경우, 신규 제조된 로트의 전하 변종 프로파일와 비교하여 로트가 과량의 열적 또는 환경적 스트레스에 적용되지 않음을 확인할 수 있다. 추가로, 제조 조건 또는 장비에 대한 변화를 수행하는 경우, 신규 조건하에 제작된 로트의 전하 변종 프로파일을 입증된 조건하에 제작된 로트의 전하 변종 프로파일과 비교하여 제조 조건 및/또는 장비의 변화의 효능을 평가한다.
도 1에 관하여, 분석물 내 네이티브 폴리펩타이드의 전하 변종을 분리 및 정량화하는 예시적인 방법 (100)에 대한 흐름도를 나타낸다. 상기 방법 (100)은 분석물을 포함하는 샘플 완충액을 제조하는 것을 포함할 수 있다 (단계 101). 샘플 완충액은 하나 이상의 캐리어 양쪽성전해질, 하나 이상의 셀룰로스 (예를 들면, 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로스), pI 래더, 염기 (예를 들면, 우레아), 물, 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 샘플 완충액을 표 1 및 2에 나타낸 비율에 따라 제조한다. 추가로 또는 대안적으로, 샘플 완충액을 표 3 또는 표 4에 나타낸 비율에 따라 제조할 수 있다. 방법 (100)은 모세관 등전점전기영동을 사용하여 샘플 완충액 내에 전하 변종을 분리함을 포함할 수 있다 (단계 102). 예를 들면, 샘플 완충액은 모세관 내로 적재되고, 등전점전기영동 플랫폼를 사용하여 분리될 수 있다.
네이티브 폴리펩타이드 (예를 들면, 항체, AAV 입자, 또는 기타 폴리펩타이드)의 전하 변종을 분리한 후, 방법 (100)은 검출 항체의 존재하에 분리된 전하 변종을 인큐베이팅함을 포함할 수 있다 (단계 103). 검출 항체는 분석물 내 하나 이상의 표적 폴리펩타이드 또는 표적 아미노산 서열에 특이적일 수 있다. 검출 항체를 표적 폴리펩타이드의 전하 변종에 접합한 후, 각각의 전하 변종의 상대 존재비를 검출 항체에 상응하는 신호를 기초로 하여 정량화할 수 있다 (단계 104).
도 2에 관하여, 분석물 내에서 환원 및 변성된 폴리펩타이드의 전하 변종을 분리 및 정량화하는 예시적인 방법 (150)에 대한 흐름도를 나타낸다. 상기 방법 (150)은 분석물 내에 폴리펩타이드를 환원 및 변성시킴을 포함할 수 있다 (단계 151). 예를 들면, 분석물을 6M 구아니딘 HCl 및 10 mM 트리스(2-카복시에틸)포스핀 (TCEP)을 포함하는 용액에서 인큐베이팅하여 분석물의 폴리펩타이드를 환원 및 변성시킬 수 있다. 방법 (150)은 분석물을 포함하는 샘플 완충액을 제조함을 포함할 수 있다 (단계 152). 환원 및 변성된 샘플은 8M 우레아, 35 mM 나트륨 포스페이트, 및 1 mM TCEP를 포함하는 완충액 내로 완충액 교환될 수 있다. 이어서, 샘플 완충액을 표 1 및 2에 나타낸 비율에 따라서 완충액 교환된 샘플을 사용하여 제조할 수 있다. 추가로 또는 대안적으로, 샘플 완충액을 표 3 또는 표 4에 나타낸 비율에 따라 제조할 수 있다.
방법 (150)은 샘플 완충액 내에 전하 변종을 모세관 등전점전기영동을 사용하여 분리함을 포함할 수 있다 (단계 153). 예를 들면, 샘플 완충액을 모세관 내로 적재하고, 등전점전기영동 플랫폼을 사용하여 분리할 수 있다. 환원 및 변성된 폴리펩타이드 (예를 들면, 항체 중쇄, 항체 경쇄, 바이러스성 단백질, 또는 기타 폴리펩타이드)의 전하 변종을 분리한 후, 방법 (150)은 검출 항체의 존재하에 분리된 전하 변종을 인큐베이팅함을 포함할 수 있다 (단계 154). 검출 항체를 분석물 내에 하나 이상의 표적 폴리펩타이드 또는 표적 아미노산 서열에 특이적일 수 있다. 검출 항체를 표적 폴리펩타이드의 전하 변종에 접합한 후, 각각의 전하 변종의 상대 존재비를 검출 항체에 상응하는 신호를 기초로 하여 정량화할 수 있다 (단계 155).
본원에 기재한 바와 같이, 폴리펩타이드의 전하 변종을 분리 및 정량화하는 방법 (예를 들면, 방법 (100, 150))은 검출 항체에 상응하는 신호를 기초로 하여 전하 변종의 상대 존재비를 정량화함을 포함할 수 있다. 도 3에 관하여, 검출 항체에 상응하는 신호를 기초로 하여 전하 변종의 상대 존재비를 정량화하는 예시적인 방법 (200)의 흐름도를 나타낸다.
방법 (200)은 모세관 내에 분리된 전하 변종을 고정함을 포함할 수 있다 (단계 201). 예를 들면, 전하 변종을 모세관 내에 등전위 구배를 따라 분리한 후, 전하 변종은 모세관의 벽에 비가역 고정될 수 있다. 상기 방법은 차단 완충액에서 고정된 전하 변종을 인큐베이팅함을 포함할 수 있다 (단계 202). 일부 실시형태에서, 모세관 (예를 들면, 모세관을 포함하는 매트릭스)을 고정된 전하 변종을 차단 완충액에서 인큐베이팅하기 전에 세척할 수 있다.
방법 (200)은 검출 항체에서 고정된 전하 변종을 인큐베이팅함을 추가로 포함할 수 있다 (단계 203). 검출 항체에서 고정된 전하 변종을 인큐베이팅하는 것은 일차 인큐베이션으로 언급될 수 있다. 일부 실시형태에서, 모세관 (예를 들면, 모세관을 포함하는 매트릭스)을 차단 완충액의 제거 후에 및 일차 인큐베이션 전에 세척할 수 있다. 본원에 기재한 바와 같이, 하나 이상의 검출 항체를 하나 이상의 폴리펩타이드 (예를 들면, 표적 폴리펩타이드)에 특이적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 바이오티닐화 염소 항-사람 IgG Fc 특이적 다클론성 항체 (pAb)를 항체 중쇄를 검출하기 위해 사용할 수 있고, 바이오티닐화 염소 항-사람 카파 pAb를 항체 경쇄를 검출하기 위해 사용할 수 있다. 다른 예에서, 특정 바이러스성 단백질 또는 단백질 하위-유닛에 특이적으로 결합하는 항체를 검출 항체로서 사용할 수 있다. 일차 인큐베이션 동안, 검출 항체는 표적 폴리펩타이드에 접합될 수 있다.
방법 (200)은 리포터 분자에서 검출 항체에 접합된 고정된 전하 변종을 인큐베이팅하는 것을 포함할 수 있다 (단계 204). 리포터 분자에서 인큐베이션은 이차 인큐베이션로 언급될 수 있다. 일부 실시형태에서, 모세관 (예를 들면, 모세관을 포함하는 매트릭스)을 일차 인큐베이션 및 이차 인큐베이션 사이에 세척할 수 있다. 리포터 분자를 우선적으로 검출 항체에 결합할 수 있다. 추가로, 리포터 분자는 신호 (예를 들면, 생물발광 또는 화학발광 신호)를 생성할 수 있는 관능적 그룹 또는 하위-유닛을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 신호를 생성할 수 있는 관능적 그룹 또는 하위-유닛은 외부 자극 (예를 들면, 화학적 또는 물리적 자극)에 응답하여 신호를 생성할 수 있다.
방법 (200)은 검출 제제를 모세관 내로 도입함을 추가로 포함할 수 있다 (단계 205). 일부 예에서, 리포터 분자는 단지 검출 제제의 존재하에 신호를 생성한다. 스트렙타비딘에 접합된 HRP를 포함하는 리포터 분자의 예에서, 신호는 단지 HRP가 루미놀-퍼옥사이드에 노출된 경우 생성된다. 방법 (200)은 검출 제제 및 리포터 분자의 상호작용에 의해 생성된 신호를 기초로 하여, 각각의 전하 변종에 상응하는 등전점 및 각각의 전하 변종에 상응하는 피크 면적을 계산함을 추가로 포함할 수 있다 (단계 206).
일부 실시형태에서, 방법 (200)은 계산된 피크 면적을 기초로 하여, 각각의 전하 변종의 상대 존재비를 측정함을 추가로 포함할 수 있다 (단계 207). 예를 들면, 각각의 전하 변종에 상응하는 피크 면적을 모든 피크 면적의 합으로 나누어 각각의 전하 변종의 상대 존재비를 측정할 수 있다.
실시예
본원에 기재된 실시예에서, 달리 언급하지 않는 한, 모노클로날 항체는 IgG1 및 IgG4를 포함하고/하거나, CHO 세포로부터 유래될 수 있다.
폴리펩타이드가 환원 및 변성된 예에서, 달리 언급하지 않는 경우, 폴리펩타이드는 6M GuHCl 및 10 mM TCEP의 존재하에 1시간 동안 실온에서 환원 및 변성되었다. 이어서, 환원 및 변성된 샘플을 8M 우레아, 35 mM 나트륨 포스페이트, 및 1 mM TCEP를 포함하는 완충액으로 완충액 교환하였다.
본원에 기재된 각각의 실시예에서, 달리 언급하지 않는 한, iCIEF-웨스턴 분석물은 표 1 및 2에 나타낸 비율에 따라 용해 완충액, 캐리어 양쪽성전해질, pI 래더, 및 하이드록실 프로필 메틸셀룰로스로 제조된 샘플 완충액에 포함되었다. 환원 및 변성된 폴리펩타이드를 포함하는 실시예에 대해, 완충액 교환된 샘플은 표 1 및 2에 나타낸 비율에 따라 용해 완충액, 캐리어 양쪽성전해질, pI 래더, 및 하이드록실 프로필 메틸셀룰로스로 제조된 샘플 완충액에 포함되었다. 샘플 완충액, 검출 항체, 리포터 분자, 및 루미놀-퍼옥사이드 믹스를 384-웰 플레이트에 적재하고, 이어서, iCIEF 기기의 모세관 내로 자동으로 주입하였다. 본원에 기재된 실시예에서, iCIEF 분리 및 분석을 ProteinSimple이 제작한 PeggySue™ 기기를 사용하여 수행하였다. 샘플을 21000 μ와트를 30분 동안 적용하여 전기영동하였다.
실시예 1
상기 기재한 바와 같이, 분석물의 전하 변종 프로파일을 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 생성할 수 있다. 분석물 (예를 들면, 생물약제학적 생성물의 제조 로트)에 대한 전하 변종 프로파일을 분석물의 공지된 전하 변종 프로파일과 비교하여 iCIEF-웨스턴 방법을 입증할 수 있다.
전하 변종 프로파일을 ChromiCE를 사용하여 항체 1의 단일 제조 로트로부터 환원 및 변성된 항체에 대해 생성하고, 도 4a 및 4b에 나타낸다. 상기 기재한 바와 같이, ChromiCE는 중쇄 및 경쇄 항체를 분리하기 위한 크로마토그래피 단계를 필요로 한다. 중쇄 항체의 전기영동도를 도 4a에 나타내고, 경쇄 항체의 전기영동도를 도 4b에 나타낸다. ChromiCE를 사용하여 생성된 전기영동도는 또한, 샘플 완충액에 포함된 등전점 마커에 상응하는, 5.85 및 8.40의 등전점에서 피크를 나타낸다.
전하 변종 프로파일을 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 항체 1의 동일한 제조 로트로부터 환원 및 변성된 항체에 대해 생성하고, 도 4c에 나타낸다. 바이오티닐화 염소 항-사람 IgG Fc 특이적 다클론성 항체 (pAb)를 환원 및 변성된 항체의 중쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. 바이오티닐화 염소 항-사람 카파 pAb를 환원 및 변성된 항체의 경쇄를 위한 검출 항체로서 사용하였다. HRP에 접합된 스트렙타비딘을 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 도 4c에서, Fc pAb로부터 검출된 신호 (예를 들면, 중쇄 전하 변종에 상응하는 신호)를 실선으로서 나타내고, 카파 pAb로부터 검출된 신호 (예를 들면, 경쇄 전하 변종에 상응하는 신호)를 파선으로서 나타낸다.
iCIEF-웨스턴을 사용하여 생성된 전기영동도 (도 4c)는 동일한 피크 (예를 들면, 피크 301, 302, 303, 304, 305, 311, 및 312)를 ChromiCE를 사용하여 생성된 전기영동도와 동일한 위치에서 포함한다 (도 4a 및 4b).
도 4d에 관하여, 전하 변종 프로파일을 iCIEF-웨스턴을 사용하여 항체 1의 동일한 제조 로트로부터 환원 및 변성된 항체에 대해 생성하였다. 항-사람 H+L 항체를 분석물 항체의 특정 부분에 특이성이 없는 검출 항체로서 사용하였다. 도 4d에서 볼 수 있는 바와 같이, 중쇄 전하 변종에 대한 피크 (피크 301)는 경쇄 전하 변종에 대한 피크 (피크 312)와 중첩된다. iCIEF-웨스턴 방법에서 다중 검출 항체를 사용하는 것은 피크의 검출능력을 개선시킬 수 있다. 추가로, 다중 검출 항체의 사용은 인접 피크의 분해능을 개선시킬 수 있다.
실시예 2
전하 변종 프로파일을 ChromiCE를 사용하여 항체 2의 단일 제조 로트로부터 환원 및 변성된 항체에 대해 생성하고, 도 5a 및 5b에 나타낸다. 중쇄 항체의 전기영동도를 도 5a에 나타내고, 경쇄 항체의 전기영동도를 도 5b에 나타낸다. ChromiCE를 사용하여 생성된 전기영동도는 또한, 샘플 완충액에 포함된 등전점 마커에 상응하는, 4.65 및 8.40의 등전점에서 피크를 나타낸다.
전하 변종 프로파일을 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 항체 2의 동일한 제조 로트로부터 환원 및 변성된 항체에 대해 생성하고, 도 5c에 나타낸다. 바이오티닐화 염소 항-사람 IgG Fc 특이적 pAb를 환원 및 변성된 항체의 중쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. 바이오티닐화 염소 항-사람 카파 pAb를 환원 및 변성된 항체의 경쇄를 위한 검출 항체로서 사용하였다. HRP에 접합된 스트렙타비딘을 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 도 5c에서, Fc pAb로부터 검출된 신호 (예를 들면, 중쇄 전하 변종에 상응하는 신호)를 실선으로서 나타내고, 카파 pAb로부터 검출된 신호 (예를 들면, 경쇄 전하 변종에 상응하는 신호)를 파선으로서 나타낸다.
iCIEF-웨스턴을 사용하여 생성된 전기영동도 (도 5c)는 동일한 피크 (예를 들면, 피크 321, 322, 323, 324, 325, 331, 332, 및 333)를 ChromiCE를 사용하여 생성된 전기영동도와 동일한 위치에서 포함한다 (도 5a 및 5b).
도 5d에 관하여, 전하 변종 프로파일을 iCIEF-웨스턴을 사용하여 항체 2의 동일한 제조 로트로부터 환원 및 변성된 항체에 대해 생성하였다. 항-사람 H+L 항체를 분석물 항체의 특정 부분에 특이성이 없는 검출 항체로서 사용하였다. 도 5d에서 볼 수 있는 바와 같이, 분석물의 일부 공지된 피크 (예를 들면, 피크 333 및 321)는 검출되지 않았다. iCIEF-웨스턴 방법에서 다중 검출 항체를 사용하여 피크의 검출능력을 개선시킬 수 있다. 추가로, 다중 검출 항체의 사용은 인접 피크의 분해능을 개선시킬 수 있다.
실시예 3
전하 변종 프로파일을 ChromiCE를 사용하여 항체 3의 단일 제조 로트로부터 환원 및 변성된 항체에 대해 생성하고, 도 6a 및 6b에 나타낸다. ChromiCE 분석을 삼중으로 작동시키고, 각 작동의 전기영동도를 서로 부과한다. 중쇄 항체의 전기영동도를 도 6a에 나타내고, 경쇄 항체의 전기영동도를 도 6b에 나타낸다. ChromiCE를 사용하여 생성된 전기영동도는 또한, 샘플 완충액에 포함된 등전점 마커에 상응하는, 대략 5.85 및 대략 9.25의 등전점에서 피크를 나타낸다.
전하 변종 프로파일을 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 항체 3의 동일한 제조 로트로부터 환원 및 변성된 항체에 대해 생성하고, 도 6c에 나타낸다. 바이오티닐화 염소 항-사람 IgG Fc 특이적 pAb를 환원 및 변성된 항체의 중쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. 바이오티닐화 염소 항-사람 카파 pAb를 환원 및 변성된 항체의 경쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. HRP에 접합된 스트렙타비딘을 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 도 6c에서, Fc pAb로부터 검출된 신호 (예를 들면, 중쇄 전하 변종에 상응하는 신호)를 실선으로서 나타내고, 카파 pAb로부터 검출된 신호 (예를 들면, 경쇄 전하 변종에 상응하는 신호)를 파선으로서 나타낸다.
iCIEF-웨스턴을 사용하여 생성된 전기영동도 (도 6c)는 동일한 피크 (예를 들면, 피크 341, 342, 343, 344, 345, 346, 351, 352, 353, 및 354)를 ChromiCE를 사용하여 생성된 전기영동도와 동일한 위치에서 포함한다 (도 6a 및 6b).
실시예 4
상기 언급된 환원 및 변성 방법과 대조적으로, 분석물 내에 폴리펩타이드 (예를 들면, 항체)는 프로테아제 (예를 들면, IdeS)에 의해 소화될 수 있다. IdeS는 항체는 F(ab')2 및 Fc 단편으로 개열된다. 실시예 3에서 사용되는 동일한 제조 로트로부터 항체 3을 포함하는 분석물은, IdeS를 사용하여 소화된다. F(ab')2 및 Fc 단편의 전하 변종 프로파일을 ChromiCE를 사용하여 생성하고, 도 7a에 나타낸다. 피크 361, 362, 363, 364, 365, 및 366은 Fc 단편의 전하 변종에 상응한다. 피크 371, 372, 373, 및 374는 F(ab')2 단편의 전하 변종에 상응한다. Fc 단편이 일반적으로 F(ab')2 단편보다 더 낮은 등전점을 갖기 때문에, Fc 단편에 상응하는 피크는 F(ab')2 단편에 상응하는 피크와 중첩되지 않는다. ChromiCE를 사용하여 생성된 전기영동도는 또한, 샘플 완충액에 포함된 등전점 마커에 상응하는, 5.85 및 9.50의 등전점에서 피크를 나타낸다.
F(ab')2 및 Fc 단편의 전하 변종 프로파일을 또한 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 생성하고, 도 7b에 나타낸다. 항-사람 H+L 항체를 분석물 항체의 특정 부분에 특이성이 없는 검출 항체로서 사용하였다. 도 7b에서, Fc 단편으로부터 검출된 신호를 실선으로서 나타내고, F(ab')2 단편으로부터 검출된 신호를 파선으로서 나타낸다. iCIEF-웨스턴을 사용하여 생성된 전기영동도 (도 7b)는 동일한 피크 (예를 들면, 피크 361, 362, 363, 364, 365, 366, 371, 372, 373, 및 374)를 ChromiCE를 사용하여 생성된 전기영동도와 동일한 위치에서 포함한다 (도 7a).
실시예 5
전하 변종 프로파일을 ChromiCE를 사용하여 항체 4의 2개의 제조 로트 (로트 A 및 B)로부터 환원 및 변성된 항체에 대해 생성하고, 도 8a에 나타낸다. 단지 중쇄 항체의 전기영동도만을 나타낸다. ChromiCE를 사용하여 생성된 전기영동도는 또한, 샘플 완충액에 포함된 등전점 마커에 상응하는, 6.14 및 9.22의 등전점에서 피크를 나타낸다.
전하 변종 프로파일을 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 제조 로트 A 및 B로부터 환원 및 변성된 항체에 대해 생성하고, 도 8b에 나타낸다. 바이오티닐화 염소 항-사람 IgG Fc 특이적 pAb를 환원 및 변성된 항체의 중쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. HRP에 접합된 스트렙타비딘을 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 도 8b에서, 로트 A에 상응하는 전기영동도는 파선으로 나타내고, 로트 B에 상응하는 전기영동도는 실선으로 나타낸다.
iCIEF-웨스턴을 사용하여 생성된 전기영동도 (도 8b)는 동일한 피크 (예를 들면, 피크 381, 382, 383, 384, 385, 및 386)를 ChromiCE를 사용하여 생성된 전기영동도와 동일한 위치에서 포함한다 (도 8a). 추가로, iCIEF-웨스턴을 사용하여 생성된 전기영동도는 ChromiCE를 사용하여 생성되는 전기영동도보다 더 우수한 분해능을 갖는다. 추가로, iCIEF-웨스턴을 사용하여, 중쇄의 전하 변종을 크로마토그래피 단계를 사용하지 않고 특성화하였다. 이론으로 제한하지 않고, ChromiCE와 연관된 더 열악한 중쇄 분해능은 크기-배제 크로마토그래피 (SEC) 완충액 중 고 농도의 우레아로부터 분석물의 분해 및 SEC 단계의 긴 공정 시간에 기인할 수 있다.
실시예 6
전하 변종 프로파일을 ChromiCE를 사용하여 항체 5의 단일 제조 로트로부터 환원 및 변성된 항체의 중쇄에 대해 생성하고, 도 9a에 나타낸다. ChromiCE를 사용하여 생성된 전기영동도는 또한, 샘플 완충액에 포함된 등전점 마커에 상응하는, 대략 5.85 및 대략 8.4의 등전점에서 피크를 나타낸다.
전하 변종 프로파일을 iCIEF-웨스턴을 사용하여 항체 5의 동일한 제조 로트로부터 환원 및 변성된 항체의 중쇄에 대해 생성하고, 도 9b에 나타낸다. 바이오티닐화 염소 항-사람 IgG Fc 특이적 pAb를 환원 및 변성된 항체의 중쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. HRP에 접합된 스트렙타비딘을 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다.
iCIEF-웨스턴을 사용하여 생성된 전기영동도 (도 9b)는 동일한 피크 (예를 들면, 피크 391, 392, 393, 394, 및 395)를 ChromiCE를 사용하여 생성된 전기영동도와 동일한 위치에서 포함한다 (도 9a). 피크 393은 항체 5의 중쇄의 우세한 종에 상응하고; 피크 391 및 392는 항체 5의 중쇄의 산성 변종에 상응하고; 피크 394 및 395는 항체 5의 중쇄의 염기성 변종에 상응한다.
각각의 피크에 대한 피크 면적을 또한 ChromiCE를 사용하여 생성된 전기영동도 (도 9a) 및 iCIEF-웨스턴을 사용하여 생성된 전기영동도 (도 9b)에 대해 계산할 수 있다. 피크 면적을 모든 피크하 총 면적의 백분율로서 플롯팅하고, 도 9c에 나타낸다. ChromiCE 전기영동도를 기초로 하여 계산된 피크 면적을 정사각형 및 파선으로 나타내고, iCIEF-웨스턴 전기영동도를 기초로 하여 계산된 피크 면적을 원형 및 실선으로 나타낸다. 도 9c에 나타낸 바와 같이, ChromiCE 전기영동도를 기초로 하여 계산된 피크 면적 (도 9a)은 iCIEF-웨스턴 전기영동도 를 기초로 하여 계산된 피크 면적 (도 9b)와 유사하다.
실시예 7
항체의 첫번째 로트에 대해 iCIEF-웨스턴을 통해 생성된 전하 변종 프로파일을 항체의 공지된 전하 변종 프로파일, 또는 두번째 로트에 대한 전하 변종 프로파일과 비교할 수 있다. 항체의 첫번째 로트의 전하 변종 프로파일의 비교는 항체의 첫번째 로트가 생성되는 공정 조건을 입증할 수 있다.
항체 6의 첫번째 로트 (로트 A)로부터 환원 및 변성된 항체의 전하 변종 프로파일을 항체 6의 두번째 로트 (로트 B)로부터 환원 및 변성된 항체의 전하 변종 프로파일과 비교하였다. 바이오티닐화 염소 항-사람 IgG Fc 특이적 pAb를 환원 및 변성된 항체의 중쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. 바이오티닐화 염소 항-사람 카파 pAb를 환원 및 변성된 항체의 경쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. HRP에 접합된 스트렙타비딘을 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다.
중쇄 전하 변종을 포함하는 Fc pAb를 기초로 하여 생성된 전기영동도를 도 10a에 나타내고, 경쇄 전하 변종을 포함하는 카파 pAb를 기초로 하여 생성된 전기영동도를 도 10b에 나타낸다. 로트 A의 전하 변종 프로파일을 회색 선으로 나타내고, 로트 B의 전하 변종 프로파일을 흑색 선으로 나타낸다. 또한 도 10a 및 10b에 관하여, 로트 A의 전하 변종 프로파일은 로트 B의 전하 변종 프로파일과 동일하다. 예를 들면, 로트 A에 대한 전기영동도는 로트 B에 대한 전기영동도 (예를 들면, 피크 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 411, 412, 및 413)와 동일한 피크를 포함한다. 추가로, 로트 A에 대한 피크 면적은 로트 B와 비교하여, 각각의 전하 변종의 비율이 로트 A 및 B 간에 동일함을 보장할 수 있다.
실시예 8
항체 7의 첫번째 로트 (로트 A)로부터 환원 및 변성된 항체의 전하 변종 프로파일을 항체 7의 두번째 로트 (로트 B)로부터 환원 및 변성된 항체의 전하 변종 프로파일과 비교하였다. 바이오티닐화 염소 항-사람 IgG Fc 특이적 pAb를 환원 및 변성된 항체의 중쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. 바이오티닐화 염소 항-사람 카파 pAb를 환원 및 변성된 항체의 경쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. HRP에 접합된 스트렙타비딘을 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다.
중쇄 전하 변종을 포함하는 Fc pAb를 기초로 하여 생성된 전기영동도를 도 11a에 나타내고, 경쇄 전하 변종을 포함하는 카파 pAb를 기초로 하여 생성된 전기영동도를 도 11b에 나타낸다. 로트 A의 전하 변종 프로파일을 회색 선으로 나타내고, 로트 B의 전하 변종 프로파일을 흑색 선으로 나타낸다. 또한 도 10a 및 10b에 관하여, 로트 A의 전하 변종 프로파일은 로트 B의 전하 변종 프로파일과 동일하다. 예를 들면, 로트 A에 대한 전기영동도는 로트 B에 대한 전기영동도와 동일한 피크를 포함한다 (예를 들면, 피크 421, 422, 423, 424, 425, 431, 및 432).
추가로, 로트 A에 대한 피크 면적을 로트 B와 비교하여, 각각의 전하 변종의 비율이 로트 A 및 B 간에 동일하다는 것을 보장할 수 있다. 로트 A 및 B의 중쇄 전하 변종에 대한 상대 피크 면적을 도 11c에 나타낸다. 로트 A 및 B의 경쇄 전하 변종에 대한 상대 피크 면적을 도 11d에 나타낸다.
실시예 9
항체 8의 첫번째 로트 (로트 A)로부터 네이티브 항체의 전하 변종 프로파일을 항체 8의 두번째 로트 (로트 B)로부터 네이티브 항체의 전하 변종 프로파일와 비교하였다. 로트 A에 열 스트레스를 적용하였다. 특히, 로트 A를 40℃에서 3개월 동안 저장하였다. 바이오티닐화 염소 항-사람 IgG Fc 특이적 pAb를 환원 및 변성된 항체의 중쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. 바이오티닐화 염소 항-사람 카파 pAb를 환원 및 변성된 항체의 경쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. HRP에 접합된 스트렙타비딘을 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다.
Fc pAb (중쇄 검출)을 기반으로 하는 전기영동도를 도 12a에 나타내고, 카파 pAB 검출을 기반으로 하는 전기영동도를 도 12b에 나타낸다. 도 12a 및 12b 둘 다에 대해, 로트 A (열 스트레스받은 로트)의 전기영동도를 회색 선으로 나타내고, 로트 B (비-열 스트레스받은 로트)의 전기영동도를 흑색 선으로 나타낸다. 네이티브 항체의 전하 변종 프로파일로부터, 전하 변종의 상대적 비율이 열 스트레스받은 로트 및 비-열 스트레스받은 로트 사이에 상이한 것은 명백하다. 그러나, 피크의 기준선 분리가 없고, 개별적인 이소형은 신뢰할 수 있게 정량화되지 않을 수 있다.
항체 8의 로트 A로부터 환원 및 변성된 항체의 전하 변종 프로파일을 항체 8의 로트 B로부터 환원 및 변성된 항체의 전하 변종 프로파일과 비교하였다. 바이오티닐화 염소 항-사람 IgG Fc 특이적 pAb를 환원 및 변성된 항체의 중쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. 바이오티닐화 염소 항-사람 카파 pAb를 환원 및 변성된 항체의 경쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. HRP에 접합된 스트렙타비딘을 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다.
Fc pAb (중쇄 검출)을 기반으로 하는 전기영동도를 도 13a에 나타내고, 카파 pAB (경쇄 검출)을 기반으로 하는 전기영동도를 도 13b에 나타낸다. 도 13a 및 13b 둘 다에 대해, 로트 A (열 스트레스받은 로트)의 전기영동도를 회색 선으로 나타내고, 로트 B (비-열 스트레스받은 로트)의 전기영동도를 흑색 선으로 나타낸다.
해리되는 경우, 중쇄 및 경쇄의 등전점은 온전한 항체의 등전점과 상이하다. 결과적으로, iCIEF-웨스턴 방법은 기준선 분해능을 갖는 전하 변종 프로파일을 생성하고, 경쇄 및 중쇄의 개별적인 전하 이소형을 정량화할 수 있었다.
도 13a에 관하여, 피크 442는 항체 8의 중쇄의 주요 전하 변종에 상응하고, 피크 441은 중쇄의 산성 전하 변종에 상응하고, 피크 443은 중쇄의 염기성 전하 변종에 상응한다. 도 13b에 관하여, 피크 452는 항체 8의 경쇄의 주요 전하 변종에 상응하고, 피크 451은 항체 8의 경쇄의 산성 전하 변종에 상응한다. 피크 면적을 로트 A (열 스트레스받음) 및 로트 B (비-열 스트레스받음)에 대한 전기영동도를 기초로 하여 계산하고, 표 5에 요약한다. 각 피크의 면적을 적분하고, 전체 피크의 총 면적으로 나누어 각각의 피크에 상응하는 (예를 들면, 각각의 검출된 전하 변종에 상응하는) 상대 피크 면적을 측정한다.
열 스트레스받은 로트는, 비-열 스트레스받은 로트에 비해, 경쇄 및 중쇄 둘 다에 대해 주요 이소형의 더 낮은 상대 존재비 및 산성 이소형의 증가된 존재비를 갖는다. 전하 변종 프로파일을 항체의 미공지 로트에 대해 생성하고, 열 스트레스받은 로트 및 비-열 스트레스받은 로트의 전하 변종 프로파일과 비교할 수 있다. 전하 변종 프로파일의 비교는 미공지 로트가 열 스트레스 또는 기타 바람직하지 않은 저장 조건에 적용되었는지 여부를 알아낼 수 있다.
실시예 10
폴리펩타이드의 전하 변종을 특성화하기 위해 iCIEF-웨스턴 방법의 개발시, 검출 항체의 농도를 조정하기 위해 유용할 수 있다. 표적 폴리펩타이드 및 검출 항체의 각각의 조합은 일차 인큐베이션 단계 동안 상이한 농도의 검출 항체를 필요로 할 수 있다. iCIEF-웨스턴 분석을 상이한 농도의 검출 항체로 수행하여 검출 항체의 적합한 농도를 측정할 수 있다.
전하 변종 프로파일을 상이한 농도의 검출 항체로 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 항체 9를 포함하는 환원 및 변성된 분석물에 대해 생성하고, 도 14a 및 14b에 나타낸다. 도 14a에 나타낸 전하 변종 프로파일을 생성하기 위해 사용된 방법은 대략 100 μg/mL의 항체 농도에서 검출 항체에서 일차 인큐베이션을 포함하였다. 도 14b에 나타낸 전하 변종 프로파일을 생성하기 위해 사용된 방법은 대략적으로 2.5 μg/mL의 항체 농도에서 검출 항체에서 일차 인큐베이션을 포함하였다. 바이오티닐화 염소 항-사람 IgG Fc 특이적 pAb를 환원 및 변성된 항체의 중쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. 바이오티닐화 염소 항-사람 카파 pAb를 환원 및 변성된 항체의 경쇄에 대한 검출 항체로서 사용하였다. HRP에 접합된 스트렙타비딘을 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 도 14a 및 14b에서, Fc pAb로부터 검출된 신호 (예를 들면, 중쇄 전하 변종에 상응하는 신호)를 실선으로서 나타내고, 카파 pAb로부터 검출된 신호 (예를 들면, 경쇄 전하 변종에 상응하는 신호)를 파선으로서 나타낸다.
도 14a에 관하여, 검출 항체의 과량의 농도로 수행된 iCIEF-웨스턴 분석은 과량의 기준선 노이즈, 잘못된 피크의 검출, 열악한 분해능, 및/또는 편향된 또는 비대칭 피크를 야기할 수 있다. 도 14b에 관하여, 검출 항체의 적합한 농도로 수행된 iCIEF-웨스턴 분석은 제한된 배경 노이즈, 및 기준선에 대해 분해된 분리된 피크를 갖는 일치하는 기준선을 포함할 수 있다. 검출 항체 농도를 조정하는 것은 기준선 노이즈를 감소시키고, 따라서 측정된 신호-대-노이즈 비를 증가시킬 수 있고, 동적 범위로 낮은 존재비 전하 변종의 개선된 검출을 수행한다.
실시예 11
iCIEF-웨스턴으로 VP 단백질을 적합하게 특성화하기 위해, VP 단백질 특이적 항체를 개발할 수 있다. 항체를 AAV8 혈청형 AAV에 대해 VP 단백질에 대한 특이성을 갖도록 개발하였다. VP2 및 VP3에 의해 공유되지 않은 VP1 서열의 부분으로부터 재조합 부분을 래빗 항원로서 사용하여 VP1-특이적 다클론성 항체를 생성하였다. VP3에 의해 공유되지 않은 VP2 서열의 부분으로부터 2개의 재조합 펩타이드를 래빗 항원으로서 사용하여 VP2 및 VP1에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체를 생성하였다. VP3로부터 재조합 펩타이드를 래빗 항원로서 사용하하여 VP3, VP2, 및 VP1에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체를 생성하였다. 약칭으로, VP3, VP2, 및 VP1에 특이성을 갖고 결합되는 다클론성 항체는 항-VP3/VP2/VP1 항체로 언급될 수 있고, VP2 및 VP1에 특이성을 갖고 결합되는 다클론성 항체는 항-VP2/VP1 항체로 언급될 수 있고, VP1에 특이성을 갖고 결합되는 다클론성 항체는 항-VP1 항체로 언급될 수 있다.
웨스턴 블롯을 사용하여, 개발된 항-VP3/VP2/VP1 항체, 항-VP2/VP1 항체, 및 항-VP1 항체 다클론성 항체가 이들의 의도된 표적에 결합된다는 것을 확인하였다. 웨스턴 블롯의 결과를 도 15에 나타낸다. 가장 왼쪽 블롯 (A)은 항-VP1 항체를 일차 항체로서 사용하고, 중간 블롯 (B)은 항-VP1/VP2 항체를 일차 항체로서 사용하고, 가장 오른쪽 블롯 (c)은 항-VP1/VP2/VP3 항체를 일차 항체로서 사용하였다. 참조 래더에서 밴드(bands)의 분자량은 킬로달톤 (kDa)으로 도 15의 왼쪽에 나타낸다. VP1, VP2, 및 VP3 단백질에 상응하는 밴드를 도 15의 오른쪽에 표시한다. 항-VP1 pAb는 VP1에만 결합되고, 항-VP1/VP2 pAb는 VP1 및 VP2에 결합되고, 항-VP1/VP2/VP3 항체는 VP1, VP2, 및 VP3에 결합된다.
실시예 12
실시예 11에 기재된 모든 3개의 VP 단백질 특이적 래빗 항체를 사용하여, VP1, VP2, 및 VP3의 전하 변종을 확인하고, iCIEF-웨스턴을 사용하여 정량화할 수 있다. 예를 들면, 항-VP3/VP2/VP1 항체가 VP1, VP2, 및 VP3에 결합하지만, 항-VP3/VP2/VP1 항체에 의해 생성되는 화학발광 프로파일을 다른 항체에 의해 생성되는 프로파일과 비교하여, 어느 피크가 VP1 전하 변종, VP2 전하 변종, 및 VP3 전하 변종에 상응하는지는 측정할 수 있다.
도 16에 관하여, AAV8 혈청형 AAV를 포함하는 환원 및 변성된 분석물에 대한 전하 변종 프로파일은 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 생성되었다. 실시예 11에 기재된 래빗 다클론성 항체를 검출 항체로서 사용하였다. HRP에 접합된 항-래빗 항체를 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 라인 461은 항-VP1을 검출 항체로서 사용하여 생성된 전기영동도를 나타내고, 라인 462는 항-VP1/VP2를 검출 항체로서 사용하여 생성된 전기영동도를 나타내고, 라인 463은 항-VP1/VP2/VP3을 검출 항체로서 사용하여 생성된 전기영동도를 나타낸다. 항-VP3/VP2/VP1 항체 (라인 463)로부터 생성된 프로파일을 항-VP3/VP2 항체 (라인 462) 및 항-VP1 항체 (라인 461)로부터 생성된 프로파일과 비교하여, 어느 피크가 VP1과 연관되는지, 어느 피크가 VP2와 연관되는지, 어느 피크가 VP3과 연관되는지를 결정할 수 있다. 도 16에 나타낸 바와 같이, VP1와 연관된 5개의 전하 변종 피크, VP3과 연관된 3개의 전하 변종 피크, 및 VP3과 연관된 3개의 전하 변종 피크가 존재한다.
각각의 분석물 폴리펩타이드의 이론적인 pI는 또한 화학발광 피크의 VP 단백질 전하 변종과의 연관성을 조력할 수 있다. 예를 들면, AAV8 혈청형 AAV로부터 VP 단백질에 대해: VP1의 주요 전하 변종은 6.01의 등전점을 갖고, VP2의 주요 전하 변종은 6.87의 등전점을 갖고, VP3의 주요 전하 변종은 6.31의 등전점을 갖는다.
실시예 13
상기 기재된 바와 같이, 상이한 AAV 혈청형의 바이러스성 단백질은 상이한 서열을 갖는다. 이에 따라, 하나의 AAV 혈청형과 함께 사용하기 위해 설계된 항체는 상이한 AAV 혈청형에 효과적으로 작동하지 않을 수 있다. 실시예 11 및 12에 관련하여 상기한 항-VP1 pAb, 항-VP1/VP2 pAb, 및 항-VP1/VP2/VP3 pAb는 AAV8 혈청형 AAV와 함께 사용하기 위해 개발되었다. 시판되는 항-VP 항체, 예를 들면, AAV2 혈청형 AAV에 대해 이용가능한 것들은, 실시예 11 및 12에 기재된 항-VP 항체와 비교하여, AAV8 혈청형 AAV로부터 바이러스성 단백질의 특성화에 덜 효과적일 수 있다.
도 17에 관하여, AAV8 혈청형 AAV를 포함하는 환원 및 변성된 분석물에 대한 전하 변종 프로파일은 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 생성되었다. 전하 변종 프로파일 표지화된 463은 검출 항체로서 실시예 11 및 12에 대해 상기한 항-VP1 pAb, 항-VP1/VP2 pAb, 및 항-VP1/VP2/VP3 pAb를 사용하여 생성되었다. HRP에 접합된 항-래빗 항체를 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 전하 변종 프로파일 표지화된 464는 AAV2 혈청형 AAV를 위해 설계된 시판되는 항-VP 항체를 사용하여 생성되었다.
도 17에 나타낸 바와 같이, AAV8 혈청형 AAV와 함께 사용하기 위해 개발된 pAb는 더 큰 민감도를 갖고, 시판되는 항체에 의해 검출된 10개의 피크 (예를 들면, 피크 474a-474j)와 비교하여 15개의 피크 (예를 들면, 피크 473a-473o)를 검출하였다.
실시예 14
항체를 AAV1 혈청형 AAV에 대한 VP 단백질에 대해 특이성을 갖도록 개발하였다. VP2 서열의 부분으로부터 2개의 재조합 펩타이드를 래빗 항원으로서 사용하여 AAV1 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체를 생성하였다.
AAV1 혈청형 AAV를 포함하는 환원 및 변성된 분석물에 대한 전하 변종 프로파일은 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 생성되고, 도 18에 나타낸다. AAV1 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체를 검출 항체로서 사용하였다. HRP에 접합된 항-래빗 항체를 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 도 18에 나타낸 바와 같이, AAV1 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체를 AAV1 혈청형 분석물에서 폴리펩타이드를 검출하였다.
실시예 15
항체를 AAV5 혈청형 AAV에 대해 VP 단백질에 대한 특이성을 갖도록 개발하였다. VP2 서열의 부분으로부터 2개의 재조합 펩타이드를 래빗 항원으로서 사용하여 AAV5 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체를 생성하였다.
AAV5 혈청형 AAV를 포함하는 환원 및 변성된 분석물에 대한 전하 변종 프로파일은 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 생성되고, 도 19에 나타낸다. AAV5 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체를 검출 항체로서 사용하였다. HRP에 접합된 항-래빗 항체를 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 도 19에 나타낸 바와 같이, AAV5 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체는 AAV5 혈청형 분석물에서 폴리펩타이드를 검출하였다.
실시예 16
AAV8 혈청형 AAV를 포함하는 환원 및 변성된 분석물에 대한 전하 변종 프로파일은 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 생성되고, 도 20a 및 20b에 나타낸다. 도 20a에 나타낸 전하 변종 프로파일은 검출 항체로서 AAV1 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체를 사용하여 생성되었다. 도 20b에 나타낸 전하 변종 프로파일은 검출 항체로서 AAV5 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체를 사용하여 생성되었다. 도 20a 및 20b 둘 다에 대해, HRP에 접합된 항-래빗 항체를 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다.
도 20a에 관하여, 전하 변종 피크를 검출하고, 이는 AAV1 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체가 AAV8 혈청형 바이러스성 단백질에 대해 약간 민감도를 갖는다는 것을 지시한다. 도 20b에 관하여, 전하 변종 피크를 검출하지 못하였고, 이는 AAV5 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체가 AAV8 혈청형 바이러스성 단백질을 검출할 수 없음을 지시한다.
실시예 17
전하 변종 프로파일은 AAV1 혈청형 AAV를 포함하는 환원 및 변성된 분석물에 대해 생성되고, 도 21a 및 21b에 나타낸다. 도 21a에 나타낸 전하 변종 프로파일은 검출 항체로서 AAV8 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체 (예를 들면, 실시예 11 및 12에 기재된 항-VP1/VP2 항체)를 사용하여 생성되었다. 도 21b에 나타낸 전하 변종 프로파일은 검출 항체로서 AAV1 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체를 사용하여 생성되었다. 도 21a 및 21b 둘 다에 대해, HRP에 접합된 항-래빗 항체를 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 도 21a 및 21b에서 전하 변종 프로파일을 비교하여 알 수 있는 바와 같이, AAV8 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체는 AAV1 혈청형 VP2 단백질을 검출할 수 없었다.
실시예 18
전하 변종 프로파일은 AAV1 혈청형 AAV를 포함하는 환원 및 변성된 분석물에 대해 생성되고, 도 22a 및 22b에 나타낸다. 도 22a에 나타낸 전하 변종 프로파일은 검출 항체로서 AAV8 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체 (예를 들면, 실시예 11 및 12에 기재된 항-VP1/VP2 항체)를 사용하여 생성되었다. 도 22b에 나타낸 전하 변종 프로파일은 검출 항체로서 AAV5 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체를 사용하여 생성되었다. 도 22a 및 22b 둘 다에 대해, HRP에 접합된 항-래빗 항체를 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 도 22a 및 22b에서 전하 변종 프로파일을 비교하여 알 수 있는 바와 같이, AAV8 혈청형 VP2에 대한 특이성을 갖는 다클론성 항체는 AAV5 혈청형 VP2 단백질을 검출할 수 없었다.
실시예 19
상기 기재한 바와 같이, 생물약제학적 생성물의 로트의 전하 변종 프로파일은 생성되어 로트에 의해 감지된 환경적 스트레스를 특성화할 수 있다. 예를 들면, 열 스트레스받은 로트 및 비-열 스트레스받은 로트의 전하 변종 프로파일을 생성할 수 있다. 이어서, 미공지 로트의 전하 변종 프로파일을 공지된 전하 변종 프로파일과 비교하여 미공지 로트가 허용되지 않는 수준의 스트레스하에 있는지 여부를 결정할 수 있다.
전하 변종 프로파일을 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 AAV8 혈청형 AAV를 포함하는 생물약제학적 생성물의 3개의 로트에 대해 생성하였다. 실시예 11 및 12에 기재된 항-VP1 pAb를 검출 항체로서 사용하고, HRP에 접합된 항-래빗 항체를 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 첫번째 로트 (로트 A)를 열 스트레스하에 적용하지 않고, 두번째 로트 (로트 B)를 40℃에서 1주일 동안 동안 저장하고, 세번째 로트 (로트 C)를 40℃에서 2주 동안 저장하였다.
로트 A의 전하 변종 프로파일을 도 23a에 나타내고, 로트 B의 전하 변종 프로파일을 도 23b에 나타내고, 로트 C의 전하 변종 프로파일을 도 23c에 나타낸다. 도 23a-23c에서 볼 수 있는 바와 같이, AAV가 더 큰 열 스트레스를 받을 수록, 전하 변종 프로파일에서 산성 이동이 존재한다.
실시예 20
전하 변종 프로파일을 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 AAV8 혈청형 AAV를 포함하는 생물약제학적 생성물의 4개의 로트에 대해 생성하였다. 실시예 11 및 12에 기재된 항-VP1 pAb, 항-VP1/VP2 pAb, 및 항-VP1/VP2/VP3 pAb를 검출 항체로서 사용하고, HRP에 접합된 항-래빗 항체를 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 항-VP1 pAb를 검출 항체로서 사용하여 생성된 전하 변종 프로파일을 도 24a-24d에 나타내고, 항-VP1/VP2 pAb를 검출 항체로서 사용하여 생성된 전하 변종 프로파일을 도 25a-25d에 나타내고, 항-VP1/VP2/VP3 pAb를 검출 항체로서 사용하여 생성된 전하 변종 프로파일을 도 26a-26d에 나타낸다.
첫번째 로트 (로트 A)를 열 스트레스하에 적용하지 않고, 두번째 로트 (로트 B)를 40℃에서 15일 동안 저장하고, 세번째 로트 (로트 C)를 40℃에서 1개월 동안 저장하고, 네번째 로트 (로트 D)를 40℃에서 2개월 동안 저장하였다. 로트 A의 전하 변종 프로파일을 도 24a, 25a, 및 26a에 나타내고; 로트 B의 전하 변종 프로파일을 도 24b, 25b, 및 26b에 나타내고; 로트 C의 전하 변종 프로파일을 도 24c, 25c, 및 26c에 나타내고; 로트 D의 전하 변종 프로파일을 도 24d, 25d, 및 26d에 나타낸다. 도 24a-26d에서 볼 수 있는 바와 같이, AAV가 더 많은 열 스트레스를 받게 됨에 따라, 전하 변종 프로파일에서 산성 이동이 존재한다. 추가로, VP1 전하 변종에 상응하는 일부 피크는 열 스트레스하에 감소하지 않는 것으로 나타난다.
실시예 21
상기 기재한 바와 같이, 항-VP pAb의 조합의 사용은 단일 바이러스성 단백질의 전하 변종을 검출할 수 있게 한다. 일부 실시형태에서, 단일 바이러스성 단백질의 전하 변종 프로파일을 모니터링하는 것은, 모든 바이러스성 단백질의 전하 변종 프로파일의 모니터링과 비교하여, 생물약제학적 생성물의 로트의 환경적 스트레스의 측정시 더 유용할 수 있다.
도 27a에 관하여, 전하 변종 프로파일을 환원 및 변성된 AAV를 포함하는 분석물의 4개의 로트에 대해 생성하였다. 첫번째 로트 (로트 A)를 열 스트레스하에 적용하지 않고, 두번째 로트 (로트 B)를 40℃에서 15일 동안 저장하고, 세번째 로트 (로트 C)를 40℃에서 1개월 동안 저장하고, 네번째 로트 (로트 D)를 40℃에서 2개월 동안 저장하였다. 실시예 11 및 12에 기재된 항-VP1/VP2/VP3 pAb를 검출 항체로서 사용하고, HRP에 접합된 항-래빗 항체를 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 로트 A의 전하 변종 프로파일을 라인 465로 나타내고, 로트 B의 전하 변종 프로파일을 라인 466으로 나타내고, 로트 C의 전하 변종 프로파일을 라인 467로 나타내고, 로트 D의 전하 변종 프로파일을 라인 468로 나타낸다.
또한 도 27a에 관하여, AAV에 더 큰 열 스트레스를 적용함에 따라 전하 변종 프로파일에서 산성 이동이 존재한다. 예를 들면, 열 스트레스의 수준이 증가함에 따라 피크 488의 높이 (예를 들면, 및 면적)이 감소하고, 열 스트레스의 수준이 증가함에 따라 피크 487의 높이가 증가한다. 일부 경우, 도 27a에 나타낸 데이터를 기초로 하여, 피크 488 및 487의 상대 피크 면적을 사용하여 미공지 로트의 환경적 스트레스의 수준을 측정할 수 있다.
도 27b에 관하여, 전하 변종 프로파일을 환원 및 변성된 AAV를 포함하는 분석물의 로트 A, B, C, 및 D에 대해 생성하였다. 실시예 11 및 12에 기재된 항-VP1 pAb를 검출 항체로서 사용하고, HRP에 접합된 항-래빗 항체를 리포터 분자로서 사용하고, 루미놀-퍼옥사이드를 리포팅 제제로서 사용하였다. 로트 A의 전하 변종 프로파일을 라인 465로 나타내고, 로트 B의 전하 변종 프로파일을 라인 466으로 나타내고, 로트 C의 전하 변종 프로파일을 라인 467로 나타내고, 로트 D의 전하 변종 프로파일을 라인 468로 나타낸다. 도 27b에 나타낸 전하 변종 프로파일은 도 27a에 나타낸 동일한 산성 이동을 나타낸다.
실시예 22
열 스트레스 이외에, iCIEF-방법을 사용하여 생성된 전하 변종 프로파일을 폴리펩타이드를 포함하는 생물약제학적 생성물의 효능에 미치는 다른 제조 또는 저장 조건의 효과를 평가하기 위해 사용할 수 있다.
AAV를 포함하는 생물약제학적 생성물을 포함하는 환원 및 변성된 분석물의 5개의 상이한 로트의 전하 변종 프로파일을 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 생성하였다. 첫번째 로트 (로트 A)에 제조 동안 유지 시간을 적용하지 않고, 두번째 로트 (로트 B)에 제조 동안 8시간 공정 유지 시간을 적용하고, 세번째 로트 (로트 C)에 24시간 공정 유지 시간을 제조 동안 적용하고, 네번째 로트 (로트 D)에 48시간 유지 시간을 제조 동안 적용하고, 다섯번째 로트 (로트 E)에 72시간 유지 시간을 제조 동안 적용하였다. 로트 A에 대한 전하 변종 프로파일을 도 28a에 나타내고, 로트 B에 대한 전하 변종 프로파일을 도 28b에 나타내고, 로트 C에 대한 전하 변종 프로파일을 도 28c에 나타내고, 로트 D에 대한 전하 변종 프로파일을 도 28d에 나타내고, 로트 E에 대한 전하 변종 프로파일을 도 28e에 나타낸다. 피크 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 및 512 각각은 상이한 전하 변종에 상응하고, 도 28a-28e에서 표지화된다.
상대 피크 면적을 각각의 전하 변종 프로파일의 각각의 피크에 대해 계산하였다. 계산된 상대 피크 면적을 도 29에 요약한다.
실시예 23
AAV를 포함하는 생물약제학적 생성물을 포함하는 환원 및 변성된 분석물의 4개의 상이한 로트의 전하 변종 프로파일을 iCIEF-웨스턴 방법을 사용하여 생성하였다. 첫번째 로트 (로트 A)를 1회의 동결-해동 주기 (예를 들면, 생물약제학적 생성물을 동결하고, 이어서, 해동하였다)에 적용하고, 두번째 로트 (로트 B)를 1회의 동결-해동 주기에 적용하고, 4℃에서 7일 동안 유지하고, 세번째 로트 (로트 C)를 3개의 동결-해동 주기에 적용하고, 네번째 로트 (로트 D)를 5개의 동결-해동 주기에 적용하였다. 로트 A에 대한 전하 변종 프로파일을 도 30a에 나타내고, 로트 B에 대한 전하 변종 프로파일을 도 30b에 나타내고, 로트 C에 대한 전하 변종 프로파일을 도 30c에 나타내고, 로트 D에 대한 전하 변종 프로파일을 도 30d에 나타낸다. 피크 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 및 532 각각은 상이한 전하 변종에 상응하고, 도 30a-30d에서 표지화된다.
상대 피크 면적을 각각의 전하 변종 프로파일의 각각의 피크에 대해 계산하였다. 계산된 상대 피크 면적을 도 31에 요약한다.
실시예 24
빈 캡시드 AAV를 포함하는 분석물에 대한 전하 변종 프로파일을 2개의 상이한 iCIEF-웨스턴 방법에 따라 제조하였다. 첫번째 iCIEF-웨스턴 방법은 비교적 적은 양의 우레아를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 32a에 나타낸다. 두번째 iCIEF-웨스턴 방법은 적어도 6M 우레아를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 32b에 나타낸다.
부분적으로 완전한 캡시드 AAV를 포함하는 분석물에 대한 전하 변종 프로파일을 2개의 상이한 iCIEF-웨스턴 방법에 따라 제조하였다. 첫번째 iCIEF-웨스턴 방법은 비교적 적은 양의 우레아를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 33a에 나타낸다. 두번째 iCIEF-웨스턴 방법은 적어도 6M 우레아를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 33b에 나타낸다.
완전한 캡시드 AAV를 포함하는 분석물에 대한 전하 변종 프로파일을 2개의 상이한 iCIEF-웨스턴 방법에 따라 제조하였다. 첫번째 iCIEF-웨스턴 방법은 비교적 적은 양의 우레아를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 34a에 나타낸다. 두번째 iCIEF-웨스턴 방법은 적어도 6M 우레아를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 34b에 나타낸다.
도 32a, 33a, 및 34a의 전하 변종 프로파일을 도 32b, 33b, 34b의 전하 변종 프로파일과 비교하여, 더 적은 기준선 노이즈를 관찰하고, 따라서, 더 우수한 신호-대-노이즈 비는 더 높은 우레아 농도를 포함하는 샘플 완충액을 사용하여 성취한다.
실시예 25
빈 캡시드 AAV를 포함하는 분석물에 대한 전하 변종 프로파일을 3개의 상이한 iCIEF-웨스턴 방법에 따라 제조하였다. 첫번째 iCIEF-웨스턴 방법은 대략 4.3 M 우레아 및 대략 30 vol.% 포름아미드를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 35에서 라인 541로 나타낸다. 두번째 iCIEF-웨스턴 방법은 대략 5.6 M 우레아 및 대략 15 vol.% 포름아미드를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 35에서 라인 542로 나타낸다. 세번째 iCIEF-웨스턴 방법은 대략 7.3 M 우레아 및 대략 0 vol.% 포름아미드를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 35에서 라인 543으로 나타낸다.
부분적으로 완전한 캡시드 AAV를 포함하는 분석물에 대한 전하 변종 프로파일을 3개의 상이한 iCIEF-웨스턴 방법에 따라 제조하였다. 첫번째 iCIEF-웨스턴 방법은 대략 4.3 M 우레아 및 대략 30 vol.% 포름아미드를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 36에서 라인 544로 나타낸다. 두번째 iCIEF-웨스턴 방법은 대략 5.6 M 우레아 및 대략 15 vol.% 포름아미드를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 36에서 라인 545로 나타낸다. 세번째 iCIEF-웨스턴 방법은 대략 7.3 M 우레아 및 대략 0 vol.% 포름아미드를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 36에서 라인 546로 나타낸다.
완전한 캡시드 AAV를 포함하는 분석물에 대한 전하 변종 프로파일을 3개의 상이한 iCIEF-웨스턴 방법에 따라 제조하였다. 첫번째 iCIEF-웨스턴 방법은 대략 4.3 M 우레아 및 대략 30 vol.% 포름아미드를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 37에서 라인 547로 나타낸다. 두번째 iCIEF-웨스턴 방법은 대략 5.6 M 우레아 및 대략 15 vol.% 포름아미드를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 37에서 라인 548로 나타낸다. 세번째 iCIEF-웨스턴 방법은 대략 7.3 M 우레아 및 대략 0 vol.% 포름아미드를 포함하는 샘플 완충액을 포함하고, 당해 방법으로부터 생성된 전하 변종 프로파일을 도 37에서 라인 549로 나타낸다.
도 35-37의 전하 변종 프로파일을 비교하여, 더 적은 기준선 노이즈를 관찰하고, 따라서, 더 우수한 신호-대-노이즈 비를 우레아의 존재하에 포름아미드를 포함하는 샘플 완충액을 사용하여 성취한다.
본 개시는 하기 비-제한적인 항목으로 추가로 기재한다.
항목 1. 분석물 내에 전하 변종을 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은:
분석물을 모세관 내로 도입하는 단계;
등전위 구배를 따라 샘플 완충액 내의 전하 변종을 분리하는 단계;
검출 항체에서 모세관을 인큐베이팅하는 단계; 및
검출 항체에 상응하는 신호를 기초로 하여 전하 변종의 상대 존재비를 정량화하는 단계
를 포함한다.
항목 2. 항목 1의 방법으로서, 리포터 분자에서 모세관을 인큐베이팅하는 것을 추가로 포함한다.
항목 3. 항목 2의 방법으로서, 여기서, 리포터 분자는 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 항체 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 스트렙타비딘을 포함한다.
항목 4. 항목 2의 방법으로서, 모세관 내로 검출 제제를 도입하는 것을 추가로 포함한다.
항목 5. 항목 4의 방법으로서, 여기서, 검출 제제는 루미놀-퍼옥사이드이다.
항목 6. 항목 2의 방법으로서, 전기영동도를 생성하는 것을 추가로 포함하고, 여기서, 전기영동도는 등전위 구배를 따른 등전점에 대한 리포터 분자에 의해 생성된 화학발광 신호의 강도의 플롯을 포함하고, 여기서, 화학발광 신호가 검출된다.
항목 7. 항목 6의 방법으로서, 여기서, 검출 항체에 상응하는 신호를 기초로 하여 전하 변종의 상대 존재비를 정량화하는 것은 전하 변종에 상응하는 전기영동도의 피크하 면적을 계산하는 것을 포함한다.
항목 8. 항목 1의 방법으로서, 등전위 구배를 따라 전하 변종을 분리한 후에, 및 검출 항체에서 모세관을 인큐베이팅하기 전에, 모세관 내에 전하 변종을 고정시킴을 추가로 포함한다.
항목 9. 분석물 내에 전하 변종을 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은:
분석물 내에 폴리펩타이드를 환원 및 변성시켜 환원 및 변성된 폴리펩타이드를 생성하는 단계로서, 여기서, 분석물은 표적 폴리펩타이드의 전하 변종을 포함하는, 또는;
환원 및 변성된 폴리펩타이드를 완충액 교환하여 완충액 교환된 샘플을 생성시키는 단계로서, 여기서, 완충액 교환된 샘플은 환원 및 변성된 폴리펩타이드를 포함하고;
완충액 교환된 샘플을 포함하는 샘플 완충액을 제조하는 단계;
샘플 완충액을 모세관 내로 도입하는 단계;
등전위 구배를 따라 표적 폴리펩타이드의 전하 변종을 분리하는 단계; 및
모세관 내에 등전위 구배 내 영역에서 표적 폴리펩타이드의 존재비에 상관관계가 있는 신호를 측정하는 단계
를 포함한다.
항목 10. 항목 9의 방법으로서, 여기서, 샘플 완충액은 우레아, 캐리어 양쪽성전해질, 및 셀룰로스를 포함한다.
항목 11. 항목 10의 방법으로서, 여기서, 셀룰로스는 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로스이고, 샘플 완충액은 적어도 대략 1 용적 퍼센트의 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로스를 포함한다.
항목 12. 항목 10의 방법으로서, 여기서, 샘플 완충액은 적어도 대략 6 M의 우레아 농도를 포함한다.
항목 13. 항목 12의 방법으로서, 여기서, 샘플 완충액의 우레아 농도는 적어도 대략 8 M이다.
항목 14. 항목 9의 방법으로서, 여기서, 샘플 완충액은 포름아미드를 포함한다.
항목 15. 항목 14의 방법으로서, 여기서, 샘플 내의 포름아미드 농도는 대략 30 용적 퍼센트 이하이다.
항목 16. 표적 폴리펩타이드의 샘플에 의해 감지된 환경적 스트레스의 수준을 평가하는 방법으로서, 상기 방법은:
샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 생성하는 단계로서, 여기서, 전하 변종 프로파일은 다수의 피크를 포함하고, 여기서, 각각의 피크는:
표적 폴리펩타이드의 상응하는 전하 변종와 연관되고;
표적 폴리펩타이드의 상응하는 전하 변종의 등전점과 등가인 등전점와 연관되고;
표적 폴리펩타이드의 상응하는 전하 변종의 상대 존재비와 연관된 상대 피크 면적을 포함하고;
샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 하나 이상의 공지된 전하 변종 프로파일과 비교하는 단계; 및
샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 하나 이상의 공지된 전하 변종 프로파일과 비교함을 기초로 하여, 샘플에 의해 감지된 환경적 스트레스의 수준을 측정하는 단계
를 포함한다.
항목 17. 항목 16의 방법으로서, 여기서, 환경적 스트레스의 수준은 열 스트레스의 수준, 제조 공정 유지 시간에 기인하는 스트레스의 수준, 또는 동결-해동 주기에 기인하는 스트레스의 수준과 연관된다.
항목 18. 항목 16의 방법으로서, 여기서, 표적 폴리펩타이드는 항체 또는 아데노-관련 바이러스를 포함한다.
항목 19. 항목 16의 방법으로서, 여기서, 샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 생성하는 것은:
샘플을 모세관 내로 도입하는 단계; 및
등전위 구배를 따라 표적 폴리펩타이드의 전하 변종을 분리하는 단계.
항목 20. 항목 19의 방법으로서, 여기서, 샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 생성하는 것이:
검출 항체에서 모세관을 인큐베이팅하는 단계;
리포터 분자에서 모세관을 인큐베이팅하는 단계; 및
전기영동도를 생성하는 단계로서, 여기서, 전기영동도는 신호가 검출된 등전위 구배를 따른 등전점에 대한 리포터 분자에 의해 생성된 신호의 강도의 플롯을 포함하는 단계
를 추가로 포함한다.
당해 기술분야의 숙련가는 본 개시내용을 기초로 하는 개념이 수개의 본 개시의 목적을 수행하기 위해 다른 방법 및 시스템을 설계하기 위한 기반으로서 용이하게 사용될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 이에 따라, 청구범위는 상기 기재에 의해 제한되는 것으로 고려되지 않아야 한다.
Claims (20)
- 분석물 내에 전하 변종을 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은:
상기 분석물을 모세관 내로 도입하는 단계;
등전위 구배를 따라 상기 샘플 완충액 내의 전하 변종을 분리하는 단계;
검출 항체에서 상기 모세관을 인큐베이팅하는 단계; 및
상기 검출 항체에 상응하는 신호를 기초로 하여 전하 변종의 상대 존재비(relative abundance)를 정량화하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서, 리포터 분자에서 상기 모세관을 인큐베이팅하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제2항에 있어서, 상기 리포터 분자가 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 항체 또는 서양고추냉이 퍼옥시다제에 접합된 스트렙타비딘을 포함하는, 방법.
- 제2항에 있어서, 검출 제제를 상기 모세관 내로 도입하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 검출 제제가 루미놀-퍼옥사이드인, 방법.
- 제2항에 있어서, 전기영동도를 생성하는 것을 추가로 포함하고, 여기서, 상기 전기영동도는 등전위 구배를 따른 등전점에 대한 상기 리포터 분자에 의해 생성된 화학발광 신호의 강도의 플롯을 포함하고, 여기서, 상기 화학발광 신호가 검출되는, 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 검출 항체에 상응하는 신호를 기초로 하여, 상기 전하 변종의 상대 존재비를 정량화하는 것이, 상기 전하 변종에 상응하는 상기 전기영동도의 피크하 면적을 계산함을 포함하는, 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 등전위 구배를 따라 전하 변종을 분리한 후에, 및 상기 검출 항체에서 모세관을 인큐베이팅하기 전에,
상기 모세관 내에 전하 변종을 고정시키는 것을 추가로 포함하는, 방법. - 분석물 내에 전하 변종을 정량화하는 방법으로서, 상기 방법은:
상기 분석물 내에 폴리펩타이드를 환원 및 변성시켜 환원 및 변성된 폴리펩타이드를 생성하는 단계로서, 여기서, 상기 분석물은 표적 폴리펩타이드의 전하 변종을 포함하는, 단계;
상기 환원 및 변성된 폴리펩타이드를 완충액 교환하여 완충액 교환된 샘플을 생성하는 단계로서, 여기서, 상기 완충액 교환된 샘플은 상기 환원 및 변성된 폴리펩타이드를 포함하는, 단계;
상기 완충액 교환된 샘플을 포함하는 샘플 완충액을 제조하는 단계;
상기 샘플 완충액을 모세관 내로 도입하는 단계;
등전위 구배를 따라 상기 표적 폴리펩타이드의 전하 변종을 분리하는 단계; 및
상기 모세관 내에 등전위 구배 내 영역에서 상기 표적 폴리펩타이드의 존재비에 상관관계가 있는 신호를 측정하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제9항에 있어서, 상기 샘플 완충액이 우레아, 캐리어 양쪽성전해질, 및 셀룰로스를 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 셀룰로스가 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로스이고, 상기 샘플 완충액이 적어도 대략 1 용적 퍼센트의 하이드록실 프로필 메틸 셀룰로스를 포함하는, 방법.
- 제10항에 있어서, 상기 샘플 완충액이 적어도 대략 6 M의 우레아 농도를 포함하는, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 샘플 완충액의 우레아 농도가 적어도 대략 8 M인, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 샘플 완충액이 포름아미드를 포함하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 샘플 내 포름아미드 농도가 대략 30 용적 퍼센트 이하인, 방법.
- 표적 폴리펩타이드의 샘플에 의해 감지된 환경적 스트레스의 수준을 평가하는 방법으로서, 상기 방법은:
상기 샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 생성하는 단계로서, 여기서, 상기 전하 변종 프로파일은 다수의 피크를 포함하고, 여기서, 각각의 피크는:
상기 표적 폴리펩타이드의 상응하는 전하 변종과 연관되고;
상기 표적 폴리펩타이드의 상응하는 전하 변종의 등전점과 등가인 등전점과 연관되고;
상기 표적 폴리펩타이드의 상응하는 전하 변종의 상대 존재비와 연관된 상대 피크 면적을 포함하는, 단계;
상기 샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 하나 이상의 공지된 전하 변종 프로파일과 비교하는 단계; 및
상기 샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 하나 이상의 공지된 전하 변종 프로파일과 비교함을 기초로 하여, 상기 샘플에 의해 감지된 환경적 스트레스의 수준을 측정하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제16항에 있어서, 상기 환경적 스트레스의 수준이 열 스트레스의 수준, 제조 공정 유지 시간에 기인하는 스트레스의 수준, 또는 동결-해동 주기에 기인하는 스트레스의 수준과 연관되는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 표적 폴리펩타이드가 항체 또는 아데노-관련 바이러스를 포함하는, 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 생성하는 것이:
상기 샘플을 모세관 내로 도입하는 단계; 및
등전위 구배를 따라 상기 표적 폴리펩타이드의 전하 변종을 분리하는 단계
를 포함하는, 방법. - 제19항에 있어서, 상기 샘플에 대한 전하 변종 프로파일을 생성하는 것이:
검출 항체에서 상기 모세관을 인큐베이팅하는 단계;
리포터 분자에서 상기 모세관을 인큐베이팅하는 단계; 및
전기영동도를 생성하는 단계로서, 여기서, 상기 전기영동도는 신호가 검출된 상기 등전위 구배를 따른 등전점에 대한 상기 리포터 분자에 의해 생성된 신호의 강도의 플롯을 포함하는, 단계
를 추가로 포함하는, 방법.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US63/269,595 | 2022-03-18 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20240164561A true KR20240164561A (ko) | 2024-11-19 |
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