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CN112654639B - 用于亲和毛细管电泳的系统和方法 - Google Patents

用于亲和毛细管电泳的系统和方法 Download PDF

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CN112654639B CN201980058396.6A CN201980058396A CN112654639B CN 112654639 B CN112654639 B CN 112654639B CN 201980058396 A CN201980058396 A CN 201980058396A CN 112654639 B CN112654639 B CN 112654639B
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Abstract

本公开的主题涉及在多肽(例如多亚基蛋白)的复杂混合物中筛选一种或多种多肽的组合物、系统和方法。例如，所述主题涉及与亲和毛细管电泳结合使用的配体，以及用于检测包括多特异性抗体(例如双特异性抗体)的多聚体混合物中的多肽的方法和系统。

Description

用于亲和毛细管电泳的系统和方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求于2018年9月10日提交的美国临时专利申请系列第62/729,384号的优先权，该美国临时专利申请的内容全文以引用方式合并于本文。
技术领域
当前公开的主题涉及在多肽的复杂混合物中筛选一种或多种多肽的组合物、系统和方法。特别地，本文公开的主题涉及与亲和毛细管电泳结合使用的配体，以及用于检测包括多特异性抗体(例如双特异性抗体)的多聚体混合物中的多肽的方法和系统。
背景技术
由于双特异性抗体(BsAb)识别两个不同抗原靶的独特能力，近年来引起了广泛的治疗兴趣。尽管关注BsAb的治疗用途，但是其商业生产一直颇具挑战性，因为常规的生产方法会导致不良的副产物并需要复杂的纯化过程。例如，已通过杵臼结构(knob-into-hole)技术生成某些BsAb，从而在重链的CH3结构域中产生互补突变，以形成“突起”(knob)和“孔”(hole)结构。与常规抗体的生产可以依靠相同的重链/轻链亚基的二聚化不同，当使用杵臼结构技术时，将大的氨基酸侧链引入重链之一的CH3结构域并且那些侧链适配至另一条重链的CH3结构域中适当设计的腔中。可以观察到链错配(例如，相同的重链肽的均二聚化或不适当的重链/轻链缔合)，导致产生一组独特的产品相关杂质，包括突起-突起和孔-孔同源二聚体(HD)两种。这些同源二聚体变体可能难以定量，因为它们可能以低水平存在并且具有与预期的BsAb产物和其他BsAb分子变体高度相似的理化特性。
因此，仍然需要从不期望的蛋白产生中纯化和定量靶BsAb的系统和技术。
发明内容
当前公开的主题涉及在多肽的复杂混合物中筛选一种或多种多肽的组合物、系统和方法。特别地，本文公开的主题涉及与亲和毛细管电泳结合使用的配体，以及用于检测包括多特异性抗体(例如双特异性抗体)的多聚体混合物中的多肽的方法和系统。
在某些实施例中，本公开涉及用于在样品中分离多亚基蛋白的系统，该系统包括：a)配体，b)背景电解质缓冲液，c)样品，d)毛细管，e)在毛细管的一端处或毛细管的一端附近的阳极，以及f)在毛细管的另一端处或毛细管的另一端附近的阴极，其中样品与配体混合以形成至少一种配体-蛋白复合物，并在毛细管的阳极端装载至毛细管中，并且其中毛细管填充有与配体混合的背景电解质缓冲液。
在某些实施例中，本公开的系统进一步包括位于毛细管的阴极端附近的检测器，其中该检测器检测210nm至220nm光吸收度或激光诱导荧光。
在某些实施例中，本公开的系统包括样品，其中该样品包含至少一种同源二聚体、至少一种异源二聚体、或其组合。在某些实施例中，本公开的系统包括第一配体-蛋白复合物，其在配体与所述至少一种异源二聚体的第一亚基结合且不与所述至少一种异源二聚体的第二亚基结合时形成。在某些实施例中，本公开的系统包括第二配体-蛋白复合物，其在配体与同源二聚体的至少两个相同的第一或第二亚基结合时形成。在某些实施例中，所述至少一种配体-蛋白复合物配置成在该配体与多亚基蛋白的亚基结合时具有荧光(或其他的可检测的)标记、或改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合。在某些实施例中，第二配体-蛋白复合物与第一配体-蛋白复合物相比具有更低的电泳迁移率。
在某些实施例中，本公开的系统包括配体，其中该配体为多肽或多肽片段。在某些实施例中，该配体为荧光标记的多肽或荧光标记的多肽片段。在某些实施例中，该配体选自由以下项组成的组：人CD3多肽、小鼠CD3多肽、大鼠CD3多肽、兔CD3多肽和食蟹猴CD3多肽。在某些实施例中，通过向配体的非结合区添加一种或多种氨基酸来修饰配体。在某些实施例中，所述一种或多种氨基酸选自由以下项组成的组：谷氨酸、天冬氨酸及其组合。在某些实施例中，添加的一种或多种氨基酸配置成改变配体的电荷和质量。
在某些实施例中，本公开的系统包括样品，其中该样品在低pH值尿素缓冲液中进一步与配体混合。在某些实施例中，本公开涉及方法，该方法进一步包括将高pH值HEPES缓冲液和0.1％PS20混合至样品和配体的混合物。在某些实施例中，本公开的系统包括背景电解质缓冲液，其中该背景电解质缓冲液包括氨基正己酸(EACA)、三亚乙基四胺(TETA)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。在某些实施例中，背景电解质缓冲液包含与上述方法的所述至少一种异源二聚体的第一亚基结合且不与所述至少一种异源二聚体的第二亚基结合的配体。
在某些实施例中，本发明涉及用于在样品中分离多亚基蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(a)产生样品和配体的混合物以形成至少一种配体-蛋白复合物，(b)将混合物施加至毛细管，其中该毛细管填充有与配体混合的背景电解质缓冲液，(c)跨毛细管施加电压，以及(d)使多亚基蛋白和至少一种配体-蛋白复合物移动通过毛细管，其中该配体-蛋白复合物配置成在该配体与多亚基蛋白的亚基结合时具有荧光(或其他的可检测的)标记、改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合，从而在样品中分离多亚基蛋白。
在某些实施例中，本公开涉及用于在样品混合物中分离靶蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(a)产生样品和配体的混合物以形成至少一种配体-蛋白复合物，(b)将混合物施加至毛细管，其中该毛细管填充有与配体混合的背景电解质缓冲液，(c)跨毛细管施加电压，(d)使多亚基蛋白和至少一种配体-蛋白复合物移动通过毛细管，其中该配体-蛋白复合物配置成在该配体与多亚基蛋白的亚基结合时，具有荧光(或其他的可检测的)标记、改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合，以及(e)分离从非靶蛋白分开的靶蛋白。
在某些实施例中，本公开涉及采用毛细管的方法，其中该毛细管包括阴极端、阳极端和检测器。在某些实施例中，毛细管的内径为约50μm。在某些实施例中，毛细管至检测器的距离为约20cm。在某些实施例中，毛细管的总长度约为30cm。在某些实施例中，检测器在毛细管的阴极端附近，并检测210nm至220nm光吸收度或激光诱导荧光。在某些实施例中，电压为30千伏。
在某些实施例中，本公开涉及利用样品的方法，其中该样品包含至少一种同源二聚体、至少一种异源二聚体或其组合，其中所述至少一种异源二聚体包含第一亚基和第二亚基，并且所述至少一种同源二聚体包含至少两个相同的第一或第二亚基。在某些实施例中，所述至少一种异源二聚体包括双特异性抗体。在某些实施例中，所述至少一种同源二聚体包括单克隆抗体。
在某些实施例中，本公开涉及利用配体的方法，其中该配体为肽或肽片段。在某些实施例中，该配体为荧光标记的肽或荧光标记的肽片段。在某些实施例中，该配体选自由以下项组成的组：人CD3肽、小鼠CD3肽、大鼠CD3肽、兔CD3肽和食蟹猴CD3肽。在某些实施例中，该配体配置成通过向该配体的非结合区添加一种或多种氨基酸来修饰。在某些实施例中，所述一种或多种氨基酸选自由以下项组成的组：谷氨酸、天冬氨酸及其组合。在某些实施例中，添加的一种或多种氨基酸配置成改变配体的电荷和质量。
在某些实施例中，本公开涉及方法，其中在配体与所述至少一种异源二聚体的第一亚基结合且不与所述至少一种异源二聚体的第二亚基结合时，形成第一配体-蛋白复合物。在某些实施例中，本公开涉及方法，其中在配体与同源二聚体的至少两个相同的第一或第二亚基结合时，形成第二配体-蛋白复合物。
在某些实施例中，本发明涉及方法，该方法进一步包括将低pH值尿素缓冲液混合至样品和配体的混合物。在某些实施例中，本公开涉及方法，该方法进一步包括将高pH值HEPES缓冲液和0.1％PS20混合至样品和配体的混合物。在某些实施例中，本公开涉及方法，其中背景电解质缓冲液包含氨基正己酸(EACA)、三亚乙基四胺(TETA)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。在某些实施例中，背景电解质缓冲液包含与上述方法的所述至少一种异源二聚体的第一亚基结合且不与所述至少一种异源二聚体的第二亚基结合的配体。
在某些实施例中，本公开涉及进一步包括定量样品中靶蛋白的量的方法。
附图说明
图1描绘了示例性双特异性抗体和具有相似理化特性的产物相关杂质(包括半抗体和同源二聚体)，所述特性导致使用传统分析方法难以进行检测。
图2描绘了特异性抗体样品的通过亲和毛细管电泳的理论分离机理。
图3描绘了用于同源二聚体检测的示例性亲和毛细管电泳。当在分离之前将配体与样品混合时，观察到不完整和间断的复合物形成。
图4描绘了将过量配体添加至背景电解质的亲和电泳的示例性性能。
图5A描绘了示例性的修饰的配体，以改善亲和电泳的性能。图5B了具有修饰的配体的亲和电泳的示例性性能。
图6描绘了CD3+E肽的示例性性能。
图7描述了抗CD3同源二聚体的pH依赖性构象异构体。低pH值样品处理促进单一确认并改善信噪比，如本文所述，高pH值处理也可以实现此目的。
图8描绘了通过样品中0.1％PS20随时间推移改善的抗CD3同源二聚体回收率。
图9描绘了示例性的寡聚物相互作用机理。
图10A至图10B描绘了通过加标杂质在抗CD3区进行的间接峰鉴定。图10A描绘了与HEPES缓冲液初始混合后的结果，而图10B描绘了完全转化为高pH值构象后的结果。
图11描绘了通过两个同源二聚体的相互作用的示例性寡聚物形成。
图12描绘了低pH值和尿素引起的示例性寡聚物解离。样品缓冲液的pH为3.5，并包含尿素。尿素和低pH值会阻止抗CD3和抗CD20 HD的相互作用(经SEC确认)。
图13描绘了示例性亲和毛细管电泳分析，其揭示了BsAb参考标准品中的寡聚物。
图14描绘了示例性的低pH值亲和毛细管电泳方法。
图15描绘了与完整质谱法相比的亲和毛细管电泳分析的示例性性能。
具体实施方式
本公开的主题涉及用于在多肽的复杂混合物中筛选一种或多种多肽的组合物、系统和方法。例如但不作为限制，本文公开的主题适用于亲和毛细管电泳(ACE)的方法，以检测多聚体混合物中的靶抗体，包括例如多特异性抗体，诸如双特异性抗体。本公开的主题还涉及用于检测和分离此类靶抗体的配体和电泳系统。本文公开所揭示的电泳方法可以单独使用或可以与本领域已知的常规纯化方法和单元操作进一步组合以实现双特异性抗体的特定纯度水平，例如用于治疗和/或诊断应用。
为了清晰起见而不是为了限制，详细描述分为以下小节：
1.定义
2.用于分离和定量靶多亚基蛋白的配体
3.用于分离和定量靶多亚基蛋白的系统
4.用于分离和定量靶多亚基蛋白的方法
1.定义
除非另外指出，否则本公开的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学及生物化学的常规技术，其在本领域的技术范围内。以下文献中充分解释了此类技术，诸如“Molecular Cloning:A Laboratory Manual”，第2版(Sambrook等人，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait编缉，1984)；“Animal Cell Culture”(R.I.Freshney编缉，1987)；“Methods in Enzymology”(Academic Press,Inc.)；“Handbook of Experimental Immunology”，第4版(D.M.Weir&C.C.Blackwell编缉，Blackwell Science Inc.,1987)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(J.M.Miller&M.P.Calos编缉，1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人编缉，1987)；和“PCR:The Polymerase Chain Reaction”，(Mullis等人编缉，1994)。
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术术语、符号和其他科学术语旨在具有本公开所属领域的技术人员通常理解的含义。在某些情况下，为清晰起见和/或为便于参考，本文定义了具有通常理解含义的术语，并且与现有技术中通常理解的术语定义相比，本文包含的这些定义不一定解释成表示与本领域的通常理解存在明显差异。适当地，除非另有说明，否则通常根据制造商定义的方案和/或参数进行涉及使用市售试剂盒和试剂的程序。因此，在描述本发明的方法、试剂盒和用途之前，应当理解，本公开的主题不限于如此描述的特定方法、方案、细胞系、动物物种或属、构建体和试剂，当然可能有所不同。也应理解，本文中使用的术语仅用于描述特定实施例的目的，并不旨在限制本发明的范围，本公开的范围仅由所附权利要求书限制。
如在本文和所附权利要求书中所用，单数形式“一”、“一个/种”和“该/所述”包括复数指代物，除非上下文另外明确规定。
如本文所用，术语“约”或“大致”可指在如本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，该可接受误差范围将部分地取决于如何测量或确定该值，例如测量系统的局限性。例如，按照给定值的实践，“约”可以意指在1个或多于1个标准偏差内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”可以意指该特定值的可接受误差范围，例如由术语“约”修饰的值的±10％。
术语“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如抗体和抗原)之间的1:1相互作用，尽管在某些情况下该相互作用可以涉及不同的相互作用比，例如，在aCD3同源二聚体的情况下，该相互作用可以是2:1，因为两个抗原结合每个aCD3同源二聚体。分子X对其配偶体Y的亲和力一般可由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量，包括本文所述的那些方法。下文描述用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施例。
本文中的术语“抗体”以最广义使用，并且涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的抗原-结合活性；以及去免疫抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体和/或衍生自任何合适动物源(例如，来自小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、山羊、绵羊、犬、马、牛、猴、猿和/或鸡)的抗体、免疫缀合物、合成抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体和上述任何一者的表位结合片段。
“抗体片段”是指除了完整抗体以外的分子，其包含完整抗体的一部分且结合完整抗体结合的抗原。抗体片段的示例包括但不限于Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；以及由抗体片段形成的多特异性抗体。
“结合目的抗原的抗体”是以足够的亲和力结合该抗原的抗体，使得该抗体可用作测定试剂，例如用作捕获抗体或检测抗体。通常，这种抗体不会与其他多肽发生明显的交叉反应。关于多肽与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性结合至”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶上的表位意指明显不同于非特异性相互作用的结合。特异性结合可通过例如测定靶分子的结合相比于对照分子的结合来测量，该对照分子通常为具有类似结构但不具有结合活性的分子。
术语“抗CD20抗体”是指能够以足够的亲和力结合CD20的抗体，使得该抗体可用作靶向CD20的试剂，例如，用作本文所述测定中的试剂。在某些实施例中，例如通过放射免疫测定(RIA)所测量的，抗CD20抗体与不相关的非CD20蛋白的结合程度小于该抗体与CD20的结合程度的约10％。在某些实施例中，与CD20结合的抗体具有≤1M、≤100mM、≤10mM、≤1mM、≤100μM、≤10μM、≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM的解离常数(Kd)。在某些实施例中，本文公开的与CD20结合的抗体的Kd可以为10-3M或更小、或10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M。在某些实施例中，本文公开的与CD20结合的抗体的Kd可以为10-10M至10-13M。在某些实施例中，抗CD20抗体与CD20的表位结合，该表位在不同物种的CD20中是保守的。
术语“抗CD3抗体”是指能够以足够的亲和力结合CD3的抗体，使得该抗体可用作靶向CD3的试剂，例如，用作本文所述测定中的试剂。在某些实施例中，例如通过放射免疫测定(RIA)所测量的，抗CD3抗体与不相关的非CD3蛋白的结合程度小于该抗体与CD3的结合程度的约10％。在某些实施例中，与CD3结合的抗体具有≤1M、≤100mM、≤10mM、≤1mM、≤100μM、≤10μM、≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM的解离常数(Kd)。在某些实施例中，本文公开的与CD3结合的抗体的Kd可以为10-3M或更小、或10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M。在某些实施例中，本文公开的与CD3结合的抗体的Kd可以为10-10M至10-13M。在某些实施例中，抗CD3抗体与CD3的表位结合，该表位在不同物种的CD3中是保守的。
“结合结构域”是指与靶表位、抗原、配体或受体特异性结合的化合物或分子的一部分。结合结构域包括但不限于抗体(例如，单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人源化抗体和嵌合抗体)、抗体片段或其部分(例如，Fab片段、Fab′2、scFv抗体、SMIP、结构域抗体、双抗体、微抗体、scFv-Fc、亲和体、纳米抗体以及抗体的VH和/或VL结构域)、受体、配体、适体和其他具有已确定结合配偶体的分子。
术语“嵌合”抗体是指这样的抗体，在所述抗体中重链和/或轻链的一部分来源于特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分来源于不同的来源或物种。
除非另外指明，否则如本文所用的术语“分化簇3”或“CD3”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然CD3，所述脊椎动物来源包括诸如灵长类动物(例如，人)和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)，包括，例如，CD3ε、CD3γ、CD3α和CD3β链。
抗体的“类别”是指抗体的重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五大类抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且它们中的一些可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1，以及IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
在整个说明书和权利要求中，词语“包括”或诸如“包含”或“含有”的变体应被理解为暗示包括所陈述的整数或整数组，但不排除任何其他整数或整数组。
术语“相关”或“相关的”是指以任何方式将第一分析或方案的性能和/或结果与第二分析或方案的性能和/或结果进行比较。例如，可以在执行第二方案时使用第一分析或方案的结果，和/或可以使用第一分析或方案的结果来确定是否应该执行第二分析或方案。关于基因表达分析或方案的实施例，可以使用基因表达分析或方案的结果来确定是否应执行特定的治疗方案。
本文使用的术语“检测”包括对靶分子(例如CD20或其加工过的形式)的定性和定量测量。在某些实施例中，检测包括仅鉴定样品中靶分子的存在以及确定靶分子在样品中是否以可检测的水平存在。
如本文所使用，术语“检测手段”是指用于通过信号报告来检测可检测抗体的存在，然后在测定中读出该信号报告的部分或技术。通常，检测手段采用试剂，例如检测剂，其扩增固定的标记，例如捕获在微量滴定板上的标记，例如亲和素、链霉亲和素-HRP或链霉亲和素-β-D-吡喃半乳糖。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C末端区，该C末端区包含恒定区的至少一部分。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在某些实施例中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文另外规定，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，EU编号系统也称为EU索引，如在Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
“框架”或“FR”是指除高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由以下四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。因此，HVR和FR序列通常在VH(或VL)中以如下序列出现：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”及“全抗体”在本文中可互换地用于指代具有基本上类似于天然抗体结构的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“异源多聚体”、“异源多聚体复合物”或“异源多聚体蛋白”是指至少包含第一含铰链多肽和第二含铰链多肽的分子，其中第二含铰链多肽与第一含铰链多肽在氨基酸序列上相差至少一个氨基酸残基。异源多聚体可包含由第一含铰链多肽和第二含铰链多肽形成的“异源二聚体”，或者可形成更高阶的三级结构，其中除了第一含铰链多肽和第二含铰链多肽之外还存在多肽。异源多聚体的多肽可以通过非肽的共价键(例如，二硫键)和/或非共价的相互作用(例如，氢键、离子键、范德华力和/或疏水相互作用)彼此相互作用。
如本文所使用，“异源多聚化结构域”是指对生物分子的改变或添加，以促进异源多聚体形成并阻碍同源多聚体形成。更倾向于形成异源二聚体而非同源二聚体的任何异源二聚化结构域均在目前公开的主题的范围内。说明性示例包括但不限于，例如，美国专利申请20030078385(Arathoon等人，Genentech；描述杵臼结构)；WO2007147901(等人，Novo Nordisk：描述离子相互作用)；WO 2009089004(Kannan等人，Amgen：描述静电转向效应)；美国临时专利申请61/243,105(Christensen等人，Genentech；描述卷曲螺旋(coiled coil))。另参见例如Pack,P.&Plueckthun,A.,Biochemistry 31,1579-1584(1992)，描述亮氨酸拉链，或Pack等人，Bio/Technology 11,1271-1277(1993)，描述螺旋-转-螺旋螺基序。短语“异源多聚化结构域”和“异源二聚体结构域”在本文可互换使用。
如本文可互换使用的术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”与“宿主细胞培养物”是指其中已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的子代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和来源于所述原代转化细胞的子代，不考虑传代次数。子代可能不与亲本细胞的核酸内容物完全一致，而是可能含有突变。本文包括如在原始转化细胞中筛选或选择的具有相同功能或生物活性的突变子代。
“人抗体”是这样的抗体，该抗体具有的氨基酸序列对应于由人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列，或来源于利用人抗体库或其他人抗体编码序列的非人源的抗体的氨基酸序列。人抗体的该定义特别地排除了包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人共有框架”是这样的框架，其表示在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常存在的氨基酸残基。一般而言，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择来自于可变结构域序列的亚组。一般而言，序列的亚组是如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中所述的亚组。在某些实施例中，对于VL，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组κI。在某些实施例中，对于VH，该亚组是如Kabat等人，出处同上中的亚组III。
“人源化”抗体是指这样的嵌合抗体，其包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基。在某些实施例中，人源化抗体将基本上包含所有的至少一个，通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有HVR(例如HVR)对应于非人抗体的HVR，并且所有或基本上所有的FR对应于人抗体的FR。人源化抗体任选地可以包含来源于人抗体的抗体恒定区的至少一部分。“人源化形式”的抗体，例如，非人抗体，是指已经进行过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”是指以下项中的每一种：抗体可变结构域的在序列中高变(本文也称为“互补决定区”或“HVR”)和/或形成结构上限定的环(“高变环”)和/或含有抗原接触残基(“抗原接触点”)的区域。除非另外指明，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据Kabat等人，出处同上编号。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，并且三个在VL中(L1、L2、L3)。本文中的示例性HVR包括：
(a)在氨基酸残基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)处发生的高变环(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)在氨基酸残基24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)处发生的HVR(Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；
(c)在氨基酸残基27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)处发生的抗原接触点(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；以及
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括HVR氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
“免疫缀合物”是指与一种或多种异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
“分离的”抗体为已从其自然环境的组分中分离的抗体。在某些实施例中，通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)测定，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评定抗体纯度的方法的综述，请参见例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。
如本文可互换使用的“个体”或“受试者”为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛、绵羊、猫、犬和马)、灵长类动物(例如人和非人灵长类动物，诸如猴)、兔以及啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。在某些实施例中，该个体或受试者为人。
“分离的”核酸是指已从其天然环境的组分中分开的核酸分子。分离的核酸包括这样的核酸分子，其包含在通常含有所述核酸分子的细胞中，但所述核酸分子存在于染色体外或与其天然染色体位置不同的染色体位置处。
术语“编码抗体的分离的核酸”(包括对特异性抗体的参考)是指编码抗体重链和轻链(或其片段)的一个或多个核酸分子，包括在单一载体或单独的载体中的此类核酸分子，以及存在于宿主细胞中一个或多个位置的此类核酸分子。
如本文所使用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能的变异抗体(例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的生产过程中产生，此类变体通常以少量存在)之外，包含所述群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂中的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体获得的，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据目前公开的主题所使用的单克隆抗体可通过多种技术制备，包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法，以及利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，在本文中描述了用于制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
术语“多特异性”和“双特异性”是指抗原结合分子能够与至少两种不同的抗原决定簇特异性结合。通常，双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点中的每个抗原结合位点对不同的抗原决定簇具有特异性。在某些实施例中，双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原决定簇，特别是在两种独特细胞上表达的两种抗原决定簇。在一个实施例中，双特异性抗体为T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体，其包含与CD3结合的第一抗原结合位点和与细胞表面抗原结合的第二抗原结合位点。在一些实施例中，细胞表面抗原为肿瘤抗原，例如CD20、FcRH5、HER2、CEA、LYPD1、LY6G6D、PMEL17、LY6E、CD19、CD33、CD22、CD79A、CD79B、EDAR、GFRA1、MRP4、RET、Steap1、TenB2等。参见WO/2015/095392。TDB通过CD3结合臂接合并活化T细胞，并且任何抗CD3同源二聚体(CD3 HD)杂质的存在都可能通过TCR的二价接合和二聚作用潜在地触发不良的脱靶T细胞活化。在某些实施例中，双特异性抗体包含小于2％、1％、0.5％、0.25％、0.1％、0.05％或0.01％的同源二聚体。在非限制性实施例中，双特异性抗体为TDB抗体，并且同源二聚体为CD3同源二聚体。
除非另外指明，否则如本文所使用的术语“蛋白”是指来自任何脊椎动物来源的任何天然蛋白，该脊椎动物来源包括哺乳动物诸如灵长类动物(例如人)和啮齿动物(例如小鼠和大鼠)。该术语包括“全长”的未加工蛋白，以及通过细胞中加工产生的任何形式的蛋白。该术语还涵盖天然存在的蛋白变体，例如剪接变体或等位基因变体。
如本文所使用，“纯化的”蛋白或多肽(例如抗体)是指已经提高纯度的多肽，使得其以比存在于自身天然环境中和/或在实验室条件下初始合成和/或扩增时更纯的形式存在。纯度是相对术语并且不一定意指绝对纯度。
如本文所使用的术语“多肽”是指任何长度的氨基酸聚合物。聚合物可为线性或分支的，其可包含经过修饰的氨基酸，并且其可间插有非氨基酸。这些术语还涵盖已被天然修饰或通过介入修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记组分缀合。在定义内还包括例如含有氨基酸(包括例如非天然氨基酸等)的一种或多种类似物以及本领域中已知的其他修饰的多肽。如本文所使用的术语“多肽”和“蛋白”具体包括抗体。
如本文所使用，“样品”是指大量材料的一小部分。在某些实施例中，样品包括但不限于培养中的细胞、细胞上清液、细胞裂解物、血清、血浆、生物流体(例如血液、血浆、血清、粪便、尿液、淋巴液、腹水、导管冲洗液、唾液和脑脊液)和组织样品。样品的来源可以是固体组织(例如，来自新鲜、冷冻和/或保存的器官、组织样品、活体组织切片或抽吸物)、血液或任何血液成分、体液(例如尿液、淋巴液、脑脊髓液、羊水、腹膜液或间质液)或来自个体的细胞，包括循环细胞。
当涉及两种或更多种组分的混合物时，“混合物”是指混合物中的每种组分在通过一种或多种分析测定评估的混合物中基本上保持其物理和化学稳定性。用于此目的的示例性分析测定包括：颜色、外观和澄清度(CAC)、浓度和浊度分析、微粒分析、尺寸排阻色谱(SEC)、离子交换色谱(IEC)、毛细管区带电泳(CZE)、成像毛细管等电聚焦(iCIEF)和效价测定。在一个实施例中，已表明混合物在5℃或30℃下稳定至多约8小时、或至多约12小时、或至多约24小时。在另一实施例中，已表明混合物在5℃或30℃下稳定至少约8小时、或至少约12小时、或至少约24小时。
如本文所使用，术语“亚基”是指多聚体的组分(例如，同源二聚体和异源二聚体)。该亚基可以是多肽，其可以是从三个氨基酸至数千个氨基酸的任何大小。
术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链的参与抗体与抗原结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为VH和VL)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守框架区(FR)和三个高变区(HVR)。(参见例如Kindt等人，KubyImmunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91页(2007))。单个VH或VL结构域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合特定抗原的抗体可分别使用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域来进行分离，以筛选互补VL或VH结构域的文库。参见例如Portolano等人，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用的术语“价”表示在抗原结合分子中存在指定数目的抗原结合位点。因此，术语“与抗原单价结合”表示在抗原结合分子中存在对抗原具有特异性的一个(并且不超过一个)抗原结合位点。
如本文所使用，“治疗”是指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，并且可以在临床病理学的进程之前或期间执行。理想的治疗效果包括预防疾病或其病状或症状的发生或复发，减轻疾病的病状或症状，减轻疾病的任何直接或间接病理后果，减慢疾病进展的速度，改善或减轻疾病状态，并达到缓解或改善预后的目的。在某些实施例中，本公开的方法和组合物可用于尝试延缓疾病或疾患的发展。
药剂的“有效量”是指在药剂所施用至的细胞或组织中导致生理变化所必需的量。
2.用于分离和定量靶多亚基蛋白的配体
在某些实施例中，本公开的主题涉及可用于一种或多种分析测定中的配体。在某些实施例中，本公开的分析测定可以分开、分离和/或定量靶蛋白。示例性分析测定可包括：离子交换色谱(IEC)、毛细管区带电泳(CZE)、成像毛细管等电聚焦(iCIEF)和亲和毛细管电泳(ACE)测定。
在某些实施例中，本公开的配体能够与靶蛋白结合(在本文中用于表示与靶蛋白结合或被靶蛋白结合)。例如，当靶蛋白处于其天然构象，当其部分地未折叠或完全未折叠时，配体可以结合靶蛋白。根据本公开，配体不限于结合靶蛋白的公认功能区的试剂，例如，酶的活性位点、抗体的抗原结合位点、受体的激素结合位点或辅因子结合位点。在某些实施例中，配体可以是与靶蛋白的表面或内部序列以及构象域结合的试剂。此外，配体可以与靶蛋白的一个或多个亚基(例如，第一亚基或第二亚基，或两者)结合。因此，本公开的配体包括其中或其本身可不具有明显生物学功能的试剂，除它们以上述方式与靶蛋白结合的能力之外。
在某些实施例中，配体为多肽或多肽片段。在某些实施例中，配体包含被靶蛋白(例如抗体)结合的表位。
在某些实施例中，与未改变的配体相比，配体配置成具有荧光(或其他的可检测的)标记、改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合。在某些实施例中，该配体为荧光标记的多肽或荧光标记的多肽片段。在某些实施例中，通过向配体的非结合区添加一种或多种氨基酸来修饰配体。在某些实施例中，所述一种或多种氨基酸选自由以下项组成的组：谷氨酸、天冬氨酸及其组合。在某些实施例中，添加的一种或多种氨基酸配置成改变配体的电荷和质量。
在某些实施例中，该配体选自由以下项组成的组：人CD3多肽、小鼠CD3多肽、大鼠CD3多肽、兔CD3多肽和食蟹猴CD3多肽。在某些实施例中，配体为CD3肽。在某些实施例中，配体为具有以下序列的CD3肽：Pyr DGNEEMGGITQTPYKE acid。在一些实施例中，CD3肽可具有以下序列：Pyr DGNEEMGGITQTPYKD acid、Pyr DGNEEMGGITQTPYKDD acid或PyrDGNEEMGGITQTPYKDDD acid。在非限制性实施例中，配体可包括可以被靶同源二聚体识别的任何配体。
在某些实施例中，靶蛋白可包括多亚基蛋白。亚基可通过任何一个或多个分子间键(例如，共价键和非共价键)结合在一起以形成多亚基蛋白。在非限制性实施例中，多亚基蛋白可以为抗体。示例性多亚基蛋白可包括单克隆抗体、免疫缀合物、合成抗体、单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体和上述任何一者的表位结合片段。在一些实施例中，抗体可包括激动剂、拮抗剂和中和抗体，以及去免疫抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体和/或衍生自任何合适动物源(例如，来自小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、山羊、绵羊、犬、马、牛、猴、猿和/或鸡)的抗体。
在某些实施例中，多亚基蛋白可以为异源二聚体蛋白。异源二聚体蛋白可包含至少第一含铰链多肽和第二含铰链多肽，其中第二含铰链多肽与第一含铰链多肽在氨基酸序列上相差至少一个氨基酸残基。异源二聚体可由第一含铰链多肽和第二含铰链多肽形成，或者可形成更高阶的三级结构，其中除了第一含铰链多肽和第二含铰链多肽之外还存在多肽。异源多聚体的多肽可以通过非肽的共价键(例如，二硫键)和/或非共价的相互作用(例如，氢键、离子键、范德华力和/或疏水相互作用)彼此相互作用。特别地，异源二聚体蛋白可以为双特异性抗体，如本领域技术人员所理解的并且在某些实施例中，其可以包含来自至少两种或更多种不同抗体的结构域。在非限制性实施例中，双特异性抗体可包含两条不同的重链(各自衍生自不同的抗体)和两条不同的轻链(各自衍生自不同的抗体)，和/或可包含重链和轻链，其各自包含来自两种或多种不同抗体的片段。此外，双特异性抗体可包含来自去免疫抗体、鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体的重链和/或轻链，以及来自去免疫抗体、鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体及其片段(例如其可变和/或恒定域)的重链和/或轻链的组合。本公开的双特异性抗体还可包含抗体的表位结合片段(例如但不限于单链Fv(scFv)、单链抗体、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab′)2片段和二硫键连接的Fv(sdFv))，特别是连接至一个或多个重链或轻链恒定域，例如与重链CH1/CH2/CH3结构域连接的scFv。在一些实施例中，本公开的双特异性抗体包含Fc结构域。如本领域技术人员所理解的，Fc结构域的存在使得双特异性抗体适于使用Fc结合部分进行纯化。如本领域所公知的，重链的CH1-铰链-CH2-CH3结构域的特定结构和氨基酸序列决定免疫球蛋白的类型和亚类。本公开的双特异性抗体不以任何方式限于特定的重链结构或氨基酸序列；因此，本公开的双特异性抗体可以是任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
在某些实施例中，多亚基蛋白可包括同源二聚体蛋白。同源二聚体蛋白可具有至少两条相同或功能上等效的多肽链。例如，CD20或CD3单克隆抗体可包括两条相同的重链和轻链。在某些实施例中，配体可与多亚基蛋白结合以形成配体-蛋白复合物。配体可对多亚基分子的结合结构域具有特异性，例如Fc结构域、κ结构域或λ结构域。与多亚基蛋白相比，配体-蛋白复合物可具有至少一种改变的性质。在一些实施例中，改变的性质可包括电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率及其组合。
3.用于分离和定量靶多亚基蛋白的系统
在某些实施例中，本公开涉及用于在样品中分离蛋白例如多亚基蛋白的系统。在某些实施例中，该系统包括：a)配体，b)背景电解质缓冲液，c)样品，d)毛细管，e)在毛细管的一端处或毛细管的一端附近的阳极，以及f)在毛细管的另一端处或毛细管的另一端附近的阴极。在某些实施例中，该系统将包括与配体混合以形成至少一种配体-蛋白复合物的样品。在某些实施例中，该系统包括在毛细管的阳极端装载至毛细管中的这类配体-蛋白复合物。在某些实施例中，该系统包括毛细管，其中该毛细管填充有已与配体混合的背景电解质缓冲液。
在某些实施例中，本公开的系统进一步包括位于毛细管的阴极端附近的检测器。例如但不作为限制，检测器将检测210nm至280nm光吸收度或激光诱导荧光。在非限制性实施例中，检测器可包括荧光检测器和/或化学发光检测器。荧光检测器可检测标记有荧光标签的配体。荧光检测器可检测标记有荧光标签的抗体。
如上所述，本公开的系统还包括样品(或配置成接收样品)。在某些实施例中，该样品包含至少一种同源二聚体、至少一种异源二聚体或其组合。在某些实施例中，本公开的系统包括第一配体-蛋白复合物，其在配体与所述至少一种异源二聚体的第一亚基结合且不与所述至少一种异源二聚体的第二亚基结合时形成。在某些实施例中，本公开的系统包括第二配体-蛋白复合物，其在配体与同源二聚体的至少两个相同的第一或第二亚基结合时形成。在某些实施例中，所述至少一种配体-蛋白复合物配置成在该配体与多亚基蛋白的亚基结合时具有改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合。在某些实施例中，第二配体-蛋白复合物与第一配体-蛋白复合物相比可具有更低的电泳迁移率，反之亦然。
在某些实施例中，本公开的系统包括背景电解质缓冲液，其中该背景电解质缓冲液包括氨基正己酸(EACA)、三亚乙基四胺(TETA)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。在非限制性实施例中，本公开的系统包括毛细管电泳缓冲液。例如，毛细管电泳缓冲液包括磷酸盐、甲酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、哌嗪-N,N'-双(2-乙磺酸)(PIPES)、磷酸盐、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、植酸、硼酸盐/硼酸、三羟甲基氨基甲烷、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)、N-环己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)、甘氨酸和N-二(羟乙基)甘氨酸(bicine)。参见Handbook of capillary andmicrochip electrophoresis and associated microtechniques，第3版，表1.3“commonlyused CE buffers and their associated properties”，第25页。在一些实施例中，本公开的系统包括毛细管电泳添加剂。例如，毛细管电泳添加剂包括甲基纤维素、十二烷基硫酸钠(SDS)、聚乙二醇(PEG)/聚环氧乙烷(PEO)和/或乙腈。在某些实施例中，本公开的系统包括组合物，该组合物包含双特异性抗体，所述双特异性抗体包含少于5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.25％、0.1％、0.05％或0.01％的同源二聚体。在非限制性实施例中，双特异性抗体为T细胞依赖性双特异性(TDB)抗体，并且同源二聚体为CD3同源二聚体。在一些实施例中，TDB抗体包含与CD3结合的第一抗原结合位点和与细胞表面抗原结合的第二抗原结合位点。TDB通过CD3结合臂接合并活化T细胞，并且任何抗CD3同源二聚体(CD3 HD)杂质的存在都可能通过TCR的二价接合和二聚作用潜在地触发不良的脱靶T细胞活化。
4.用于分离和定量靶多亚基蛋白的方法
在某些实施例中，本公开涉及用于在样品中分离蛋白例如多亚基蛋白的方法。在某些实施例中，该方法包括以下步骤：(a)产生样品和配体的混合物以形成至少一种配体-蛋白复合物，该样品包含至少一种蛋白，(b)将混合物施加至毛细管，其中该毛细管填充有与配体混合的背景电解质缓冲液，(c)跨毛细管施加电压，以及(d)使蛋白(例如，多亚基蛋白)和至少一种配体-蛋白复合物移动通过毛细管。在某些实施例中，配体-蛋白复合物配置成在配体结合后具有改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合。在某些实施例中，这种改变促进样品中蛋白的分离。
在某些实施例中，本公开涉及用于在样品混合物中分离靶蛋白的方法，该方法包括以下步骤：(a)产生样品和配体的混合物以形成至少一种配体-蛋白复合物，该样品包含蛋白，(b)将混合物施加至毛细管，其中该毛细管填充有与配体混合的背景电解质缓冲液，(c)跨毛细管施加电压，(d)使蛋白和至少一种配体-蛋白复合物移动通过毛细管。在某些实施例中，配体-蛋白复合物配置成在配体与蛋白结合时具有改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合。在某些实施例中，该方法进一步包括分离已经从存在于样品中的非靶蛋白分开的靶蛋白。
在某些实施例中，本公开的方法采用毛细管，其中该毛细管包括阴极端、阳极端和检测器。在某些实施例中，检测器在毛细管的阴极端附近，并检测210nm至280nm光吸收度或激光诱导荧光。在某些实施例中，电压可高达30千伏。在非限制性实施例中，毛细管的长度可以增加以改善样品中靶分子的分离。
在某些实施例中，本公开涉及方法，其中待分析的样品包含至少一种同源二聚体、至少一种异源二聚体或其组合。在某些实施例中，所述至少一种异源二聚体包含第一亚基和不同的第二亚基。在某些实施例中，所述至少一种同源二聚体包含至少两个相同的第一亚基或第二亚基。在某些实施例中，所述至少一种异源二聚体为双特异性抗体。在某些实施例中，所述至少一种同源二聚体为单克隆抗体。
在某些实施例中，本公开涉及方法，其中在配体与上述方法的所述至少一种异源二聚体的第一亚基结合并且该配体不与所述至少一种异源二聚体的第二亚基结合时，形成第一配体-蛋白复合物。在某些实施例中，本公开涉及方法，其中在上述配体与同源二聚体的至少两个相同的第一亚基或第二亚基结合时，形成第二配体-蛋白复合物。
在某些实施例中，本公开涉及方法，其中背景电解质缓冲液包含氨基正己酸(EACA)、三亚乙基四胺(TETA)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。在某些实施例中，背景电解质缓冲液包含与上述方法的所述至少一种异源二聚体的第一亚基结合且不与所述至少一种异源二聚体的第二亚基结合的配体。
在某些实施例中，本公开的方法可包括使用特定的缓冲液和/或其他步骤以最大程度地减少不期望的蛋白寡聚化。例如但不作为限制，正在分析的样品中存在的某些蛋白，例如下面实施例中描述的抗CD3和抗CD20同源二聚体物质，可形成高分子量寡聚物物质。在某些实施例中，此类寡聚物物质可与目的蛋白共迁移或以其他方式阻碍测定的效用。在某些实施例中，例如，当期望测量溶液中的所有同源二聚体时，可以在分离之前将此类寡聚物物质解离。在某些实施例中，这可以通过在低pH值缓冲液或高pH值缓冲液中制备样品来实现。在非限制性实施例中，可以在分离之前将尿素加入溶液中以解离高分子量寡聚物物质。在一些实施例中，溶液(例如，背景缓冲液、毛细管电泳缓冲液和/或毛细管电泳添加剂)的浓度可以增加以最大程度地减少不期望的蛋白寡聚化。已经证明这些条件足以解离寡聚物，还足够温和以维持配体-蛋白复合物的形成，而不会使蛋白例如BsAb的结构变性。
在某些实施例中，本公开的方法可包括使用特定的缓冲液和/或其他步骤以最大程度地减少目的蛋白的不期望的带电变体。例如但不作为限制，正在分析的样品中存在的某些蛋白，例如下面实施例中所述的抗CD3HD，可表现出电荷变化。在某些实施例中，这种电荷变化是pH依赖性的。在某些实施例中，某些缓冲液的使用可以诱导构象变化，其导致流体动力学大小的可观察到的差异。因此，在某些实施例中，期望在缓冲液中制备样品，以使最大程度地减少这种电荷变化或构象变化。例如但不作为限制，在某些实施例中，可以采用pH3.5的缓冲液促使蛋白物质形成单一的低pH状态。在某些实施例中，这是期望的，因为它可以改善信噪比，从而降低测定的定量限。然而，在某些实施例中，可以采用pH 7.5的HEPES缓冲液，例如pH 7.5的10mM HEPES缓冲液与0.1％PS20的组合，促使蛋白物质形成单一状态。在某些实施例中，这是期望的，因为它可以改善信噪比，从而降低测定的定量限。
在某些实施例中，本公开的方法可包括使用特定的缓冲液和/或其他步骤以最大程度地减少蛋白表面吸附。例如但不作为限制，正在分析的样品中存在的某些蛋白，例如下面实施例中所述的抗CD3 HD，可表现出不期望的表面吸附。这种表面吸附，例如到小瓶壁的吸附，可能导致抗CD3同源二聚体峰面积的较低回收率。为了控制这种吸附并改善回收率，本公开的方法可以在样品中包括去污剂，例如约0.1％至约0.4％的聚山梨酯20(PS20)。在某些实施例中，本发明的方法可包括表面活性剂，其中该表面活性剂可包含吐温80、泊洛沙姆188(p188)、曲拉通(triton)、SDS、Brij、PEO/PEG和/或甘油。在非限制性实施例中，本公开的方法可包括离液剂，例如蔗糖、盐酸胍和/或环糊精(例如，各种同种型)。
在某些实施例中，本公开涉及方法，该方法进一步包括在样品中定量靶蛋白的量。
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除了所描绘和要求保护的各种实施例之外，所公开的主题还涉及具有本文所公开和要求保护的特征的其他组合的其他实施例。这样，本文所呈现的特征可以在所公开的主题的范围内以其他方式彼此组合，使得所公开的主题包括本文所公开的特征的任何合适的组合。出于图示和描述的目的，已经呈现了所公开主题的具体实施例的前文描述。其并不旨在穷举或将所公开的主题限制为所公开的那些实施例。
对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离所公开主题的精神或范围的情况下，可以对所公开主题的组成和方法进行各种修改和变化。因此，其意图为，所公开的主题包括在所附权利要求及其等同内容的范围内的修改和变化。
本文引用了各种出版物、专利和专利申请，其内容通过引用整体合并于本文。
本公开的实施例
以下是本公开的非限制性实施例。
1.一种用于在样品中分离多亚基蛋白的系统，其包括：a)配体，b)背景电解质缓冲液，c)样品，d)毛细管，e)在毛细管的一端处或毛细管的一端附近的阳极，以及f)在毛细管的另一端处或毛细管的另一端附近的阴极，其中样品与配体混合以形成至少一种配体-蛋白复合物，并在毛细管的阳极端装载至毛细管中，并且其中毛细管填充有与配体混合的背景电解质缓冲液。
2.根据实施例1所述的系统，其进一步包括位于所述毛细管的阴极端附近的检测器，其中所述检测器检测210nm至220nm光吸收度或激光诱导荧光。
3.根据实施例1至2中任一项所述的系统，其中所述样品包含至少一种同源二聚体、至少一种异源二聚体或其组合。
4.根据实施例1至3中任一项所述的系统，其中在所述配体与所述至少一种异源二聚体的第一亚基结合且不与所述至少一种异源二聚体的第二亚基结合时，形成第一配体-蛋白复合物。
5.根据实施例1至4中任一项所述的系统，其中在所述配体与同源二聚体的至少两个相同的第一亚基或第二亚基结合时，形成第二配体-蛋白复合物。
6.根据实施例1至5中任一项所述的系统，其中所述至少一种配体-蛋白复合物配置成在所述配体与多亚基蛋白的亚基结合时具有改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合。
7.根据实施例1至6中任一项所述的系统，其中所述第二配体-蛋白复合物与所述第一配体-蛋白复合物相比具有更低的电泳迁移率。
8.根据实施例1至7中任一项所述的系统，其中所述配体为肽或肽片段。
9.根据实施例1至8中任一项所述的系统，其中所述配体为荧光标记的肽或荧光标记的肽片段。
10.根据实施例1至9中任一项所述的系统，其中所述配体选自由以下项组成的组：人CD3肽、小鼠CD3肽、大鼠CD3肽、兔CD3肽和食蟹猴CD3肽。
11.根据实施例1至10中任一项所述的系统，其中通过向所述配体的非结合区添加一种或多种氨基酸来修饰所述配体。
12.根据实施例11所述的系统，其中所述一种或多种氨基酸选自由以下项组成的组：谷氨酸、天冬氨酸及其组合。
13.根据实施例11至12中任一项所述的系统，其中添加的一种或多种氨基酸配置成改变所述配体的电荷和质量。
14.根据实施例11至13中任一项所述的系统，其中所述样品在以下物质中进一步与所述配体混合：(A)低pH值尿素缓冲液；或(B)高pH值HEPES缓冲液与0.1％聚山梨酯20的组合。
15.根据实施例11至14中任一项所述的系统，其中所述背景电解质缓冲液包含氨基正己酸(EACA)、三亚乙基四胺(TETA)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
16.一种用于在样品中分离多亚基蛋白的方法，其包括以下步骤：(a)产生样品和配体的混合物以形成至少一种配体-蛋白复合物，(b)将混合物施加至毛细管，其中所述毛细管填充有与配体混合的背景电解质缓冲液，(c)跨毛细管施加电压，以及(d)使多亚基蛋白和所述至少一种配体-蛋白复合物移动通过毛细管，其中所述配体-蛋白复合物配置成在所述配体与多亚基蛋白的亚基结合时具有改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合，从而在样品中分离多亚基蛋白。
17.一种用于在样品混合物中分离靶蛋白的方法，其包括以下步骤：(a)产生样品和配体的混合物以形成至少一种配体-蛋白复合物，(b)将混合物施加至毛细管，其中所述毛细管填充有与配体混合的背景电解质缓冲液，(c)跨毛细管施加电压，(d)使多亚基蛋白和所述至少一种配体-蛋白复合物移动通过毛细管，其中所述配体-蛋白复合物配置成在所述配体与多亚基蛋白的亚基结合时，具有改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合，以及(e)分离从非靶蛋白分开的靶蛋白。
18.根据实施例16或实施例17所述的方法，其中所述毛细管包括阴极端、阳极端和检测器。
19.根据实施例18所述的方法，其中所述检测器在所述毛细管的阴极端附近，并且检测210nm至220nm光吸收度或激光诱导荧光。
20.根据实施例16至19中任一项所述的方法，其中所述电压为30千伏。
21.根据实施例16至20中任一项所述的方法，其中所述样品包含至少一种同源二聚体、至少一种异源二聚体或其组合，其中所述至少一种异源二聚体包含第一亚基和第二亚基，并且所述至少一种同源二聚体包含至少两个相同的第一亚基或第二亚基。
22.根据实施例21所述的方法，其中所述至少一种异源二聚体包含双特异性抗体。
23.根据实施例21所述的方法，其中所述至少一种同源二聚体包含单克隆抗体。
24.根据实施例16至23中任一项所述的方法，其中所述配体为肽或肽片段。
25.根据实施例16至24中任一项所述的方法，其中所述配体为荧光标记的肽或荧光标记的肽片段。
26.根据实施例16至24中任一项所述的方法，其中所述配体选自由以下项组成的组：人CD3肽、小鼠CD3肽、大鼠CD3肽、兔CD3肽和食蟹猴CD3肽。
27.根据实施例16至24中任一项所述的方法，所述配体配置成通过向所述配体的非结合区添加一种或多种氨基酸来修饰。
28.根据实施例27所述的方法，其中所述一种或多种氨基酸选自由以下项组成的组：谷氨酸、天冬氨酸及其组合。
29.根据实施例27至28中任一项所述的方法，其中添加的一种或多种氨基酸配置成改变所述配体的电荷和质量。
30.根据实施例16至29中任一项所述的方法，其中在所述配体与所述至少一种异源二聚体的第一亚基结合且不与所述至少一种异源二聚体的第二亚基结合时，形成第一配体-蛋白复合物。
31.根据实施例16至30中任一项所述的方法，其中在所述配体与同源二聚体的至少两个相同的第一亚基或第二亚基结合时，形成第二配体-蛋白复合物。
32.根据实施例16至31中任一项所述的方法，其进一步包括：(A)将低pH值尿素缓冲液混合至所述样品和所述配体的混合物；或(B)将高pH值HEPES缓冲液与0.1％聚山梨酯20的组合混合至所述样品和所述配体的混合物。
33.根据实施例16至32中任一项所述的方法，其中所述背景电解质缓冲液包含氨基正己酸(EACA)、三亚乙基四胺(TETA)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
34.根据实施例16至33中任一项所述的方法，其进一步包括在所述样品中定量所述靶蛋白的量。
35.一种包含结合区的亲和毛细管电泳配体，其中所述结合区结合目的蛋白和修饰或是被目的蛋白和修饰结合，其中所述修饰促进所述目的蛋白的分离。
36.根据实施例35所述的配体，其中所述目的蛋白为同源二聚体。
37.根据实施例35所述的配体，其中所述目的蛋白为异源二聚体。
38.根据实施例35所述的配体，其中所述结合区为多肽。
39.根据实施例35所述的配体，其中所述结合区为小分子。
40.根据实施例35所述的配体，其中所述修饰为向所述配体添加荧光标记或添加一种或多种氨基酸。
41.根据实施例35所述的配体，其中在所述配体与所述靶蛋白结合时，所述修饰提供荧光标记、改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合。
实例
以下实例仅是对目前公开的主题的说明，并且不应以任何方式视为限制。
实例1：用于检测双特异性产物中的同源二聚体的高特异性亲和毛细管电泳(ACE)方法
在此实例中，使用毛细管区带电泳(CZE)，利用BsAb靶对抗原的特异性和亲和力实现基于电泳迁移率的差异的分离。
材料和方法
制备蛋白样品，使得最终样品含有3g/L的蛋白、50mM甲酸盐、2M尿素、0.1％PS20和50μM CD3肽，pH 3.5(“低pH值制备”)，或者3g/L蛋白、10mM HEPES、0.1％PS20和50μM CD3肽，pH 7.5(“高pH值制备”)。
使用配备有UV检测器和214nm滤光片的Sciex PA800 Plus仪器，通过CZE分离蛋白。所述分离使用带有20/30cm卡盒(毛细管长度至检测器的长度/总长度)的毛细管卡盒进行。毛细管本身是内径为50μm的裸熔融石英毛细管。
除了本文概述的以外，根据常规的CZE工艺策略分离样品。简而言之，使用压力注射在0.5psi下注射样品20秒。通过施加30kV电压30分钟来分离样品。背景电解质包含pH值为5.7的400mM氨基正己酸(EACA)缓冲液和2mM三亚乙基四胺(TETA)、0.5％羟丙基甲基纤维素(HPMC)和50μM CD3肽。
结果
CZE方法的性能：在传统的毛细管区带电泳中，在施加的电场的影响下基于速度差异进行物质迁移和分离。由于同源二聚体和双特异性物质(图1)在电荷和流体动力学大小特性上高度相似，因此通过这些CZE方法分离这些物种可能不够(图2和图3)。
具有CD3肽的ACE：应用亲和CZE原理，将CD3肽添加至样品混合物，以实现这些物质之间的额外分离(图2)。当在分离之前将肽与样品混合时，由于电荷或流体动力学大小或两者的组合的明显变化，CD3结合物质的迁移时间发生了变化。但是，所得的分离曲线显示出不良的峰形，这与不完全结合相一致。这也可能是因为抗CD3-CD3肽复合物的解离常数较高。
为了改善峰形并促使CD3肽完全持久的结合，所述肽包含在样品以及背景电解质中(以50μM的浓度)(图4)。
修饰CD3肽：如图4所示，CD3肽的使用导致抗CD3 HD和双特异性抗体之间的分离。但是，这些物质尚未得到完全(或基线)分解。由于需要对CD3同源二聚体进行低水平、准确的定量，因此需要在这两个物质之间进行进一步分解。为了实现这一点，通过将各种低等电点(pI)氨基酸(例如谷氨酸和天冬氨酸)添加至所述肽的非结合N末端来修饰CD3肽。该过程有效地增加了肽的电荷和质量，并最终改变了结合的肽-抗体复合物的电荷和质量。
CD3肽使用几个氨基酸标签修饰，包括添加一个谷氨酸以及一个、两个和三个天冬氨酸(图5A)。然后将这些肽用于ACE分离，如图5B所示。CD3肽的电荷和质量贡献越大，物质之间的分离度越大。但是，这些修饰的CD3肽在同源二聚体和双特异性物质的带电变体内也提供了更大的分离度。同源二聚体的不同带电变体内分离度的提高降低了同源二聚体峰的总信噪比，使该区域的整合更具挑战性，并最终降低了测定的灵敏度和定量限。这样，对肽的修饰提供了在实现足够的分离度以最大程度地减少双特异性干扰与最大程度地增加抗CD3同源二聚体物质的信号之间的平衡。例如但不限于，一种谷氨酸标签(即，CD3-E)在抗-CD20与抗-CD3物质之间提供了足够的分离度，而没有损害灵敏度，因此选择用于该测定(图6)。
低pH值和尿素样品处理：据发现，当溶液中同时存在抗CD3和抗CD20同源二聚体物质时，会形成高分子量寡聚物(图9)。该寡聚物与BsAb共同迁移，并且无法通过这种亲和测定以可定量的方式检测到。具体而言，当将aCD20 HD加标到样品中时，通过aCD3 HD的消失间接检测到高分子量寡聚物物质。因为高分子量寡聚物和BsAb共同迁移，所以在存在BsAb的情况下无法定量高分子量寡聚物物种。为了测量溶液中所有同源二聚体物质，分离前需要将这些寡聚物解离。这是通过在具有2M尿素的低pH值缓冲液中制备样品来完成的。这些条件经证明可解离寡聚物，但足够温和以维持肽-抗体复合物的形成且不会使BsAb结构变性。
另外，抗CD3 HD的带电变体经证明为pH依赖性的。BsAb的电荷(和相关的电荷变体)可以具有随pH的函数而变的不同总电荷状态和电荷分布。高和低pH值条件之间的总电荷状态(例如，电荷总数)和电荷位置(例如，电荷块、掩埋、溶剂暴露)可以是不同的。通过在pH 3.5缓冲液中制备样品，促使物质形成单一的低pH构象。这改善了信噪比，从而降低了测定的定量限(图7)。
样品基质中的高pH值和0.1％PS20可改善aCD3 HD的回收率：抗CD3 HD经证明可随着时间的推移吸附到小瓶，导致抗CD3同源二聚体峰面积的较低回收率。为了控制吸附并提高抗CD3-HD的回收率，将0.1％的聚山梨酯20(PS20)添加至样品基质。(图8)。
通过加标杂质在抗CD3区中间接鉴定峰(图10A至图10B)。使用pH 7.5和0.1％PS20的10mM HEPES样品缓冲液，可以观察到BsAb、aB半mAb和同源二聚体之间的分离度提高(图10A)，包括在允许完全转化为高pH值构象的时间之后(图10B)。
在ACE和尺寸排阻色谱(SEC)中观察到通过两个同源二聚体相互作用形成寡聚物。例如，ACE显示抗CD3和抗CD20 HD可以相互作用并形成与BsAb共同迁移的新峰(图11)。近峰的“HD复合物”或“寡聚物”与ACE中的BsAb共同迁移，但通过SEC以高分子量形式迁移。因此，通过SEC，它们不会与BsAb共同迁移，而是在BsAb之前与其他高分子量形式或聚集体一起迁移。然而，通过SEC，HD复合物无法与其他BsAb相关的聚集体区分开。低pH值和尿素防止此类相互作用。例如，通过低pH值(例如，pH 3.5)和尿素防止和解离了抗CD3和抗CD20 HD的相互作用(图12)。低pH值处理揭示一种同源二聚体，该同源二聚体之前是寡聚的，并且通过其他方法无法检测到(图13)。
此外，可以进行各种修饰以改善亲和毛细管电泳的性能。例如，如图14所示，在有/无样品修饰(例如pH值调节、ps20处理、添加配体、尿素处理等)的情况下，背景缓冲液的浓度可以增加。图14描述了示例性的低pH值亲和毛细管电泳法。所公开的系统和方法提供了ACE的改进性能(图15)。

Claims (37)

1.一种用于在样品中分离多亚基蛋白的系统，其包括：
a)配体，所述配体具有对所述配体的非结合区添加谷氨酸或天冬氨酸的修饰，
b)背景电解质缓冲液，
c)包含多亚基蛋白的所述样品，
d)毛细管，
e)在所述毛细管的一端处或所述毛细管的一端附近的阳极，和
f)在所述毛细管的另一端处或所述毛细管的另一端附近的阴极，其中所述样品与所述配体混合以形成至少一种包含结合至所述多亚基蛋白的所述配体的配体-蛋白复合物并在所述毛细管的阳极端装载至所述毛细管中，并且
其中所述毛细管填充有与所述配体混合的所述背景电解质缓冲液。
2.根据权利要求1所述的系统，其进一步包括位于所述毛细管的阴极端附近的检测器，其中所述检测器检测210nm至220nm光吸收度或激光诱导荧光。
3.根据权利要求1所述的系统，其中所述样品包含所述多亚基蛋白的至少一种同源二聚体、所述多亚基蛋白的至少一种异源二聚体或其组合。
4.根据权利要求3所述的系统，其中在所述配体与所述至少一种异源二聚体的第一亚基结合且不与所述至少一种异源二聚体的第二亚基结合时，形成第一配体-蛋白复合物。
5.根据权利要求3所述的系统，其中在所述配体与所述同源二聚体的至少两个相同的第一亚基或第二亚基结合时，形成第二配体-蛋白复合物。
6.根据权利要求1所述的系统，其中所述至少一种配体-蛋白复合物配置成在所述配体与所述多亚基蛋白的一个或多个亚基结合时，具有改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合。
7.根据权利要求3所述的系统，
其中在所述配体与所述至少一种异源二聚体的第一亚基结合且不与所述至少一种异源二聚体的第二亚基结合时，形成第一配体-蛋白复合物，
其中在所述配体与所述同源二聚体的至少两个相同的第一亚基或第二亚基结合时，形成第二配体-蛋白复合物，且
其中所述第二配体-蛋白复合物与所述第一配体-蛋白复合物相比具有更低的电泳迁移率。
8.根据权利要求1所述的系统，其中所述配体为肽或肽片段。
9.根据权利要求1所述的系统，其中所述配体为荧光标记的肽或荧光标记的肽片段。
10.根据权利要求1所述的系统，其中所述配体选自由以下项组成的组：人CD3肽、小鼠CD3肽、大鼠CD3肽、兔CD3肽和食蟹猴CD3
肽。
11.根据权利要求1所述的系统，其中所述谷氨酸或所述天冬氨酸配置成改变所述配体的电荷和质量。
12.根据权利要求1所述的系统，其中所述样品在以下物质中进一步与所述配体混合：(A)低pH值尿素缓冲液；或(B)高pH值HEPES缓冲液与0.1％聚山梨酯20的组合。
13.根据权利要求1所述的系统，其中所述背景电解质缓冲液包含氨基正己酸(EACA)、三亚乙基四胺(TETA)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
14.一种用于在样品中分离多亚基蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a)产生所述样品和配体的混合物以形成至少一种配体-蛋白复合物，所述配体具有对所述配体的非结合区添加谷氨酸或天冬氨酸的修饰，
(b)将所述混合物施加至毛细管，其中所述毛细管填充有与所述配体混合的背景电解质缓冲液，
(c)跨所述毛细管施加电压，以及
(d)使所述多亚基蛋白和所述至少一种配体-蛋白复合物移动通过所述毛细管，
其中所述配体-蛋白复合物配置成在所述配体与所述多亚基蛋白的亚基结合时具有改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合，从而在所述样品中分离所述多亚基蛋白。
15.一种用于在样品中分离多亚基蛋白的方法，其包括以下步骤：
(a)产生所述样品和配体的混合物以形成至少一种配体-蛋白复合物，所述配体具有对所述配体的非结合区添加谷氨酸或天冬氨酸的修饰，
(b)将所述混合物施加至毛细管，其中所述毛细管填充有与所述配体混合的背景电解质缓冲液，
(c)跨所述毛细管施加电压，
(d)使所述多亚基蛋白和所述至少一种配体-蛋白复合物移动通过所述毛细管，其中所述配体-蛋白复合物配置成在所述配体与所述多亚基蛋白的亚基结合时，具有改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合，以及
(e)分离从非靶蛋白分开的所述多亚基蛋白。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述毛细管包括阴极端、阳极端和检测器。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述检测器在所述毛细管的所述阴极端附近，并且检测210nm至220nm光吸收度或激光诱导荧光。
18.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述电压为30千伏。
19.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述样品包含所述多亚基蛋白的至少一种同源二聚体、所述多亚基蛋白的至少一种异源二聚体或其组合，其中所述至少一种异源二聚体包含第一亚基和第二亚基，并且所述至少一种同源二聚体包含至少两个相同的第一亚基或第二亚基。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种异源二聚体包含双特异性抗体。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述至少一种同源二聚体包含单克隆抗体。
22.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述配体为肽或肽片段。
23.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述配体为荧光标记的肽或荧光标记的肽片段。
24.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述配体选自由以下项组成的组：人CD3肽、小鼠CD3肽、大鼠CD3肽、兔CD3肽和食蟹猴CD3肽。
25.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述谷氨酸或所述天冬氨酸配置成改变所述配体的电荷和质量。
26.根据权利要求19所述的方法，其中在所述配体与所述至少一种异源二聚体的第一亚基结合且不与所述至少一种异源二聚体的第二亚基结合时，形成第一配体-蛋白复合物。
27.根据权利要求19所述的方法，其中在所述配体与所述同源二聚体的至少两个相同的第一亚基或第二亚基结合时，形成第二配体-蛋白复合物。
28.根据权利要求14或15所述的方法，其进一步包括：(A)将低pH值尿素缓冲液混合至所述样品和所述配体的混合物；或(B)将高pH值HEPES缓冲液与0.1％聚山梨酯20的组合混合至所述样品和所述配体的混合物。
29.根据权利要求14或15所述的方法，其中所述背景电解质缓冲液包含氨基正己酸(EACA)、三亚乙基四胺(TETA)和羟丙基甲基纤维素(HPMC)。
30.根据权利要求14或15所述的方法，其进一步包括在所述样品中定量所述多亚基蛋白的量。
31.一种包含(a)结合区和(b)修饰的亲和毛细管电泳配体，其中所述结合区结合目的蛋白或是被目的蛋白结合，其中所述修饰是对所述配体的非结合区添加谷氨酸或天冬氨酸，其中所述修饰促进所述目的蛋白的分离。
32.根据权利要求31所述的配体，其中所述目的蛋白为同源二聚体。
33.根据权利要求31所述的配体，其中所述目的蛋白为异源二聚体。
34.根据权利要求31所述的配体，其中所述结合区为多肽。
35.根据权利要求31所述的配体，其中所述结合区为小分子。
36.根据权利要求31所述的配体，其中所述修饰为向所述配体进一步添加荧光标记。
37.根据权利要求31所述的配体，其中在所述配体与所述目的蛋白结合时，所述修饰提供荧光标记或改变的电荷、质量、流体动力学大小、电泳迁移率或其组合。
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