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KR20200068697A - 라만 분광법을 사용하는 세포 배양의 자동 제어 - Google Patents

라만 분광법을 사용하는 세포 배양의 자동 제어 Download PDF

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KR20200068697A
KR20200068697A KR1020207013036A KR20207013036A KR20200068697A KR 20200068697 A KR20200068697 A KR 20200068697A KR 1020207013036 A KR1020207013036 A KR 1020207013036A KR 20207013036 A KR20207013036 A KR 20207013036A KR 20200068697 A KR20200068697 A KR 20200068697A
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South Korea
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bioreactor
cell culture
cell
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KR1020207013036A
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타데우스 웹스터
브라이언 헤이들리
케리 메이슨
콜린 자크
세슈 투말라
루스 크리스틴 롤랜드-존스
요나탄 레빈손
니콜라스 우스
판카지 시나
에이탄 에이브라함
Original Assignee
론자 리미티드
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Abstract

바이오 공정(bioprocess)의 모니터링 및 제어가 제공된다. 본 발명은 글루코스, 락테이트, 글루타메이트, 암모늄, 생존 세포 농도(VCC), 총 세포 농도(TCC) 및 생성물 농도의 변화를 모니터링하기 위해 인라인 라만 프로브를 사용하여 세포주와 무관한 일반 교정 모델의 생성 능력을 제공한다. 상이한 단세포군 항체(mAbs)들을 생성하는 2개의 상이한 CHOK1SV GS-KO™ 세포주를 사용하여 세포 배양물로부터 교정 모델을 개발했다. 교정에 사용되지 않은 독립적인 CHOK1SV GS-KO™ 세포주를 사용하여 검증된 예측 모델을 개발했으며, 최소한의 세포주 의존성으로 세포 배양 과정에서 약간의 예측 오류로 글루코스, 락테이트, 암모늄, VCC 및 TCC의 변화를 측정했다. 이러한 일반 모델의 개발은 임상 제조 환경에서 분광 PAT 기술을 적용할 수 있게 하고, 공정이 일반적인 플랫폼 공정에 기초하여 1회 또는 2회 GMP 제조에서 일반적으로 실시된다.

Description

라만 분광법을 사용하는 세포 배양의 자동 제어
본 발명은, 출원일이 2017년 10월 6일인 미국 가특허출원 제62/569,076호 및 출원일이 2017년 10월 6일인 미국 가특허출원 제62/569,190호에 기초하고, 이들에 대한 우선권을 주장하며, 이들 둘 다는 전문이 인용에 의해 본원에 포함된다.
생물학적 반응 또는 공정이 실험실 규모 또는 산업적 규모로 실시될 수 있는 장치인 생물 반응기(bioreactor)는 생물 약제학적 산업 내에서 널리 사용된다. 생물 반응기는 모든 상이한 유형의 바이오 제품을 생산하는 데 사용될 수 있다. 바이오 제품은 예를 들면, 세포 배양물, 및 음료, 바이오 연료, 바이오 에너지, 생화학 물질, 항생제, 아미노산, 효소, 단세포군 항체, 단량체, 단백질, 식품 배양물, 바이오 중합체, 알콜, 향미제, 향료 및 등을 포함하여 세포 배양물로부터 유도되는 물질을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 세포 배양물이 세포 요법을 위해 성장될 수 있다. 세포 요법은, 생체외에서 조작되거나 변경된 자가 세포, 동종 세포 또는 이종 세포의 투여에 의한 인간에서의 질환 또는 손상의 예방, 치료, 치유 또는 완화이다. 세포 요법의 한 가지 목표는 손상된 조직 또는 기관을 복구, 대치 또는 복원하는 것이다.
세포 배양물은 일반적으로 반응 시간 종료시까지 생물학적 물질이 생물 반응기에 남아있는 배취 공정으로 성장된다. 이러한 공정 중 일부에서, 생물 반응기 내에 함유된 유체 배지는, 상기 유체 매체 내에 함유된 영양물을 보충하기 위해 그리고 가능하게는 공정 동안 생성되는 해로운 부산물을 제거하기 위해 주기적으로 또는 연속적으로 제거 및 재공급될 수 있다.
세포 배양물의 성장 동안, 배지 중의 주요 영양물의 조절은 생산되는 제품의 품질에 직접적인 영향을 미칠 수 있다. 예를 들면, 글루코스와 같은 다양한 탄수화물이 세포 성장을 촉진하기 위해 생물 반응기에 공급된다. 그러나, 최적의 글루코스 수준 미만이 성장을 방해할 수 있거나 억제할 수 있다. 예를 들면, 낮은 글루코스 수준은 세포 배양물을 고갈시켜 폐기물의 적층을 야기할 수 있다. 고갈을 방지하기 위해 단순히 글루코스 수준을 증가시키는 것은, 글루코스 수준의 급격한 변동을 초래할 수도 있으며 또한 세포 성장에 악영향을 미칠 수도 있다. 세포 배양물에 최적의 영양물 및 폐기물 수준을 유지하려는 시도는 예측할 수 없으며, 세포 배양이 지속적으로 모니터링되지 않을 경우 예측할 수 없는 변화가 발생할 수 있다.
역사적으로, 업스트림 바이오 공정은, 오프라인 방법을 사용하여, 범위(예를 들면, pH, 용존 산소 분압(DOT), 온도)가 한정된 연속 실시간 측정으로 선택된 대사물, 세포 성장 및 생성물 농도에 대해 분석한 샘플을 제거하여 모니터링되어 왔다. 오프라인 방법에는 숙련된 작업자가 필요하며, 오프라인 방법은 종종 노동 집약적이며 값비싼 시약 및 샘플을 사용하여 폐기물이 생성된다. 또한, 오프라인 측정은 일반적으로, 비정상적인 공정을 나타낼 수 있는 세포 대사의 이동을 잠재적으로 놓칠 수 있는 드문 간격(예를 들면, 12시간 또는 24시간마다)으로 발생된다. 또한, 생물 반응기에서 제거된 모든 샘플은 오염에 대한 잠재적인 위험을 더한다.
산업계에서의 최근의 공정 개선 노력은, 바이오 공정을 실시간으로 연속 모니터링 및 제어하기 위해 사용될 수 있는 공정 분석 기술을 확인하는 데에 집중되어 왔다. 이러한 옵션은 생물 반응기 공정을 보다 빈번하게 모니터링할 수 있지만, 생물 반응기로부터의 연속적인 샘플 제거를 필요로 하며, 분석을 위한 고가의 시약의 사용도 필요로 한다. 또한, 이러한 시스템의 확장성(scalability) 및 샘플 제거로 인한 증가된 잠재적인 오염 위험에 대한 우려로 인해, 연속 공정 모니터링에는 이러한 옵션이 바람직하지 않다. 상기의 관점에서, 생물 반응기 내에 최적의 조건을 유지하기 위해, 비침습적이고 연속적인 또는 주기적인 조정을 허용하는 세포 배양물의 증식 공정과 같은 생화학적 및 생물 약제학적 공정을 모니터링하기 위한 공정 및 시스템에 대한 요구가 존재한다.
본 발명은 일반적으로, 세포 배양물과 같은 생체 물질을 증식시키기 위한 가공 시스템에 관한 것이다. 예를 들면, 일 양태에서, 본 발명의 가공 시스템은 포유 동물 세포 배양물을 증식시키기 위한 것이다. 다른 양태에서, 본 발명의 시스템 및 방법은 세포 요법을 위한 세포를 증식시키기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 가공된 세포 배양물은 예를 들면, 줄기 세포, T 세포, 및 B 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 종양 침윤 림프구, 단핵구, 거핵구 등을 포함하는 면역 세포를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라, 생물 반응기 내에서의 바이오 공정의 하나 이상의 파라미터를 모니터링하기 위해 라만 분광법이 사용된다. 본 발명에 따른 라만 분광법의 사용은, 오프라인 샘플링과 관련된 단점 없이 바이오 공정에서의 하나 이상의 파라미터를 주기적으로 또는 연속적으로 모니터링할 수 있게 한다. 예를 들면, 라만 분광법은 파라미터의 농도 분석에 필요한 용적 및 분석 시간을 감소시킬 수 있다. 본 발명에 따라, 라만 분광법은 공정 속도의 자동화를 가능하게 하여 공정 강건성(process robustness) 및 공정 제어를 개선시키는 제어 시스템과 결합된다. 예를 들면, 일 양태에서, 제어 시스템은, 바이오 공정 환경을 신중하게 제어된 한계 내로 유지하기 위해 장래의 파라미터 농도를 추정하는 예측 모델을 포함할 수 있다.
예를 들면, 일 양태에서, 본 발명은 세포 배양물을 증식시키는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 세포 배양물 및 생물 반응기를 응집성 광원에 노출시켜 광을 산란시키는 단계를 포함한다. 응집성 광원은 예를 들면, 레이저에 의해 방출된 광 빔을 포함할 수 있다. 일 양태에서, 세포 배양물과 접촉하는 광은 파장이 약 400 내지 약 1,500nm, 예를 들면 약 700 내지 약 850nm일 수 있다.
산란된 광의 강도는 라만 분광법을 사용하여 측정된다. 세포 배양물에서의 적어도 하나의 파라미터의 농도가 측정된 광의 강도에 기초하여 결정된다. 예를 들면, 일 양태에서, 상기 농도는 제어기(controller)에 의해 결정된다. 파라미터의 결정된 농도에 기초하여, 제어기는 파라미터를 사전 설정된 한계 내로 유지하기 위해 생물 반응기에 대한 파라미터 영향 물질의 유동을 선택적으로 증가시키거나 감소시킬 수 있다.
상기 방법에 따라 측정되는 파라미터는 예를 들면, 글루코스 농도, 락테이트 농도, 글루타메이트 농도, 암모늄 농도, 생존 세포 농도, 총 세포 농도, 생성물 농도 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 산란된 광의 강도로부터 적어도 2개, 예를 들면 적어도 3개, 예를 들면 적어도 4개의 상이한 파라미터가 라만 분광법을 사용하여 측정된다. 제어기는 모든 농도 데이터를 수신하고 하나 이상의 파라미터 영향 물질을 제어하도록 구성될 수 있다. 파라미터 영향 물질은, 예를 들면, 하나 이상의 영양물 배지를 포함할 수 있다. 예를 들면, 제어기는, 생물 반응기 내로의 글루코스와 같은 탄수화물의 유동을 증가시킬 수 있다. 다르게는, 제어기는 관류(perfusion)를 사용하는 방법에서 생물 반응기로부터 유체 매질의 배출을 증가시킬 수 있다.
적어도 하나의 파라미터의 농도가 다양한 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 파라미터의 농도는 광 강도 데이터를 제어기 내에 포함된 기준 데이터(reference data)와 비교하여 결정된다. 일 양태에서, 제어기는 예측 모델을 포함할 수 있고, 상기 예측 모델은 결정된 파라미터의 농도에 기초하여 파라미터의 장래의 농도를 추정하고, 계산된 장래의 농도에 기초하여 파라미터를 사전 설정된 한계 내로 유지하기 위해 적어도 하나의 파라미터 영향 물질을 선택적으로 증가시키거나 감소시킬 수 있다.
파라미터의 농도를 결정할 때, 라만 분광법을 사용하여 측정된 산란된 광 강도에 대한 통계 분석이 실시될 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 표준 정규 변량을 측정된 산란된 광 강도에 적용할 수 있다. 표준 정규 변량을 적용한 후, 1차 미분을 적용한 후 디트렌딩(detrending)할 수 있다. 실시된 통계 분석은 최소 제곱 회귀법을 사용하여 모델링될 수 있다. 측정된 산란된 광 강도를 전처리한 후, 모니터링되는 파라미터와 상관되는 스펙트럼 범위를 선택할 수 있다. 측정된 산란된 광 강도의 통계 분석 또는 전처리가 제어기에 의해 실시될 수 있다.
일 양태에서, 세포 배양물은 배취 공정으로 약 2일 내지 약 28일 동안 증식된 후 수확된다. 적어도 하나의 파라미터의 농도는 공정의 처음 12시간 내지 4일 이내에 결정될 수 있다. 이후, 초기 측정 후 파라미터 영향 물질의 유속을 선택적으로 증가시키거나 감소시키기 위해 초기 농도 데이터가 제어기에 의해 사용될 수 있다.
방법 동안, 적어도 하나의 파라미터의 농도가 주기적으로 또는 연속적으로 결정될 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 농도 결정은 적어도 24시간마다, 예를 들면 적어도 16시간마다, 예를 들면 적어도 8시간마다, 예를 들면 적어도 4시간마다, 예를 들면 적어도 2시간마다, 예를 들면 적어도 1시간마다 이루어질 수 있다.
본 발명은 세포 배양물을 증식시키기 위한 시스템에 관한 것이다. 시스템은 세포 배양물을 수용하기 위한 중공 내부를 한정하는 생물 반응기를 포함한다. 생물 반응기는 중공 내부로부터 물질들을 피딩(feeding)하고/피딩하거나 제거하기 위한 복수의 포트(port)를 포함한다. 생물 반응기의 중공 내부에 영양물 배지를 피딩하기 위한 영양물 배지 피드(feed)가 시스템에 포함되며, 생물 반응기 상의 포트들 중 적어도 하나와 유체 통신된다. 시스템은 생물 반응기의 중공 내부와 통신하는 광 운반 장치를 추가로 포함한다. 광 운반 장치는 광을 생물 반응기로 운반하고 광을 생물 반응기를 벗어나도록 운반하기 위한 것이다.
시스템은 광 운반 장치와 통신하는 응집성 광원을 추가로 포함한다. 응집성 광원은 생물 반응기 내의 세포 배양물을 광 빔에 노출시킨다. 응집성 광원은, 예를 들면, 약 400 내지 약 1,500nm의 파장의 광을 방출하도록 구성된 레이저를 포함할 수 있다.
광 운반 장치는 라만 분광계와 통신한다. 라만 분광계는 세포 배양물이 응집성 광원으로부터의 광 빔에 노출된 후 생물 반응기로부터 산란된 광을 수신하기 위한 것이다. 라만 분광계는 생물 반응기 내에 함유된 하나 이상의 파라미터의 농도를 결정하기 위해 산란된 광의 강도를 측정하기 위한 것이다.
본 발명에 따라, 시스템은 제어기를 추가로 포함한다. 제어기는 산란된 광의 강도에 관한 정보를 수신하기 위해 라만 분광계와 통신할 수 있다. 제어기는 라만 분광계로부터 하나 이상의 파라미터의 농도를 결정하도록 구성될 수 있다. 제어기는 결정된 파라미터의 농도에 기초하여 영양물 배지 피드를 제어하도록 추가로 구성될 수 있다. 예를 들면, 제어기는 하나 이상의 파라미터의 농도를 사전 설정된 한계 내로 유지하기 위해, 영양물 배지 피드로부터 생물 반응기에 대한 영양물 배지의 유동을 선택적으로 증가시키거나 감소시킬 수 있다.
제어기는 하나 이상의 마이크로 프로세서를 포함할 수 있다. 본원 명세서에서 사용되는 바와 같이, 마이크로 프로세서는 임의의 프로그래밍 가능한 논리 유닛을 포함할 수 있다.
일 양태에서, 제어기는 세포 배양물이 증식되는 동안 장래의 하나 이상의 파라미터의 농도를 추정할 수 있고 예측할 수 있는 예측 모델로 프로그래밍될 수 있다. 제어기는 하나 이상의 파라미터의 결정된 농도에 기초하고 하나 이상의 파라미터의 장래의 예측된 농도에 기초하여 생물 반응기에 대한 영양물 피드를 선택적으로 증가시키거나 감소시키도록 구성될 수 있다.
본 발명의 다른 특징 및 양태가 아래에 보다 상세하게 논의된다.
본 발명의 완전하고 실현가능한 개시는 첨부 도면을 참조하여 본원 명세서의 나머지 부분에서보다 구체적으로 설명된다:
도 1은, 본 발명에 따른 생물 반응기 시스템의 일 양태의 단면도이고;
도 2 내지 도 20은, 하기 실시예들에서 얻어지는 일부 결과들의 도해적 표현이다.
본원 명세서 및 도면들에서의 참조 문자들의 반복된 사용은 본 발명의 동일하거나 유사한 특징적인 구성(feature) 또는 요소(element)를 나타내고자 하는 것이다.
본 논의는 예시적인 양태에 대한 설명일 뿐이며, 본 발명의 보다 더 넓은 측면들을 제한하고자 하는 것으로 의도되지 않는다는 것이 당업자에 의해 이해되어야 한다.
일반적으로, 본 발명은 바이오 제품을 생산하기 위한 공정 및 시스템에 관한 것이다. 예를 들면, 일 양태에서, 본 발명은 생물 반응기 내에서 세포 배양물을 증식시키기 위한 공정 및 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 시스템은, 생물 반응기에서의 하나 이상의 파라미터를 모니터링한 다음, 생물 반응기의 내부 또는 외부로 파라미터 영향 물질의 유동을 자동으로 변경 또는 변화시키기 위해 개방 루프 또는 폐쇄 루프 제어를 사용할 수 있다. 자율 제어는 라만 분광법과 결합되어, 생물 반응기 내에서의 하나 이상의 파라미터의 연속적인 또는 주기적인 비침습적 모니터링을 가능하게 한다. 라만 분광법은, 예를 들면, 약 800 내지 약 2,500nm와 같은 파장 영역 내에서 정보를 연속적으로 모니터링 및 수집할 수 있고, 관찰된 기본 흡수 대역의 오버톤(overtone)에 관한 정보를 수집할 수 있으며, 이는 파라미터의 농도를 결정하는데 사용될 수 있다.
라만 분광법은 성분 특이적 분자 결합의 진동 주파수의 변화를 측정한다. 라만은 보다 전통적인 중간-IR 분광법에 대한 기본(complimentary) 정보를 제공하는 동시에, 물의 간섭에 대한 내성으로 인해 수용액에서 보다 더 많은 활용성을 갖기 때문에, 생물 반응기 적용에 바람직하다.
인라인(inline) 라만 프로브로부터 수집된 라만 스펙트럼은 다변량 분석(MVA)과 결합하여 대사물 및 세포 농도를 모니터링할 수 있다. 라만 분광법은 바이오 공정을 실시간으로 모니터링하는 능력을 제공하여 영양물 피드에 대한 피드백 제어를 구현하여, 제품 품질과 세포 생산성을 향상시킨다.
본 발명에 따라, 인라인 분광법은 예측 모델 제어와 결합될 수 있다. 특히 유리하게는, 본 발명의 방법 및 시스템은 다양한 상이한 생물 반응기 크기 및 다양한 세포주로 스케일링될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라 사용되는 예측 모델은 강건하며, 세포주 의존성이 아닌 플랫폼 공정을 위해 개발되어, 임상 제조 및 상업적인 제조에서 사용될 수 있다. 특히, 바이오 제품 생산 동안 생물 반응기에 포함되는 특정 파라미터는 일반적이므로, 특정 세포주 적용에 의존하지 않는 것으로 밝혀졌다.
도 1을 참조하면, 본 발명에 따른 생물 반응기 시스템의 일 양태가 도시되어 있다. 생물 반응기 시스템은 생물 반응기(10)를 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 시스템 및 방법은 임의의 적합한 생물 반응기를 사용할 수 있다. 생물 반응기는 예를 들면, 발효기, 교반 탱크 반응기, 부착성 생물 반응기, 파동형 생물 반응기, 일회용 생물 반응기 등을 포함할 수 있다. 도 1에 도시된 양태에서, 생물 반응기(10)는 유체 성장 배지 내에 세포 배양물을 수용하기 위한 생물 반응기 용적(12)을 포함하는 중공 용기 또는 컨테이너를 포함한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 생물 반응기 시스템은 이중 임펠러(16 및 18)와 같은 교반기에 결합된 회전 가능한 샤프트(14)를 추가로 포함할 수 있다.
생물 반응기(10)는 다양한 상이한 재료로 제조될 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 생물 반응기(10)는 스테인레스 스틸과 같은 금속으로 제조될 수 있다. 금속 생물 반응기는 일반적으로 재사용되도록 설계되었다.
다르게는, 생물 반응기(10)는 강성 중합체 또는 가요성 중합체 필름으로 제조된 단일 사용 생물 반응기를 포함할 수 있다. 예를 들면, 강성 중합체로 제조되는 경우, 생물 반응기 벽은 독립형(free standing)일 수 있다. 다르게는, 생물 반응기는 액체 불투과성일 수 있고 내부 친수성 표면을 가질 수 있는, 가요성 중합체 필름 또는 형상 정합(shape conforming) 재료로 제조될 수 있다. 일 양태에서, 생물 반응기(10)는 원하는 형상을 갖기 위한 강성 구조, 예를 들면 금속 용기에 삽입되도록 설계된 가요성 중합체 필름으로 제조될 수 있다. 강성 용기 또는 가요성 중합체 필름을 제조하는데 사용될 수 있는 중합체는 폴리올레핀 중합체, 예를 들면, 폴리프로필렌 및 폴리에틸렌을 포함한다. 다르게는, 중합체는 폴리아미드일 수 있다. 또 다른 양태에서, 가요성 중합체 필름은 상이한 중합체 물질들의 다층으로 형성될 수 있다. 일 양태에서, 가요성 중합체 필름은 감마 조사될 수 있다.
생물 반응기(10)는 임의의 적합한 용적을 가질 수 있다. 예를 들면, 생물 반응기(10)의 용적은 0.1mL 내지 약 25,000L 이상일 수 있다. 예를 들면, 생물 반응기(10)의 용적(12)은 약 0.5L 초과, 예를 들면 약 1L 초과, 예를 들면 약 2L 초과, 예를 들면 약 3L 초과, 예를 들면 약 4L 초과, 예를 들면 약 5L 초과, 예를 들면 약 6L 초과, 예를 들면 약 7L 초과, 예를 들면 약 8L 초과, 예를 들면 약 10L 초과, 예를 들면 약 12L 초과, 예를 들면 약 15L 초과, 예를 들면 약 20L 초과, 예를 들면 약 25L 초과, 예를 들면 약 30L 초과, 예를 들면 약 35L 초과, 예를 들면 약 40L 초과, 예를 들면 약 45L 초과일 수 있다. 생물 반응기(10)의 용적은 일반적으로 약 25,000L 미만, 예를 들면 약 15,000L 미만, 예를 들면 약 10,000L 미만, 예를 들면 약 5,000L 미만, 예를 들면 약 1,000L 미만, 예를 들면 약 800L 미만, 예를 들면 약 600L 미만, 예를 들면 약 400L 미만, 예를 들면 약 200L 미만, 예를 들면 약 100L 미만, 예를 들면 약 50L 미만, 예를 들면 약 40L 미만, 예를 들면 약 30L 미만, 예를 들면 약 20L 미만, 예를 들면 약 10L 미만이다. 예를 들면, 일 양태에서, 생물 반응기의 용적은 약 1 내지 약 5L일 수 있다. 다른 양태에서, 생물 반응기의 용적은 약 25 내지 약 75L일 수 있다. 또 다른 양태에서, 생물 반응기의 용적은 약 1,000 내지 약 5,000L일 수 있다.
생물 반응기(10)는 임펠러(16 및 18) 이외에 생물학적 세포의 배양 및 증식을 허용하는 다양한 추가 장비, 예를 들면, 배플(baffle), 스파저(sparger), 기체 공급기, 열교환기 또는 열순환기 포트 등을 포함할 수 있다. 예를 들면, 도 1에 도시된 양태에서, 생물 반응기(10)는 스파저(20) 및 배플(22)을 포함한다. 또한, 생물 반응기 시스템은 압력, 발포, pH, 용존 산소, 용존 이산화탄소 등을 측정 및 모니터링하기 위한 다양한 프로브를 포함할 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 생물 반응기(10)는 임펠러(16 및 18)에 부착된 회전 가능한 샤프트(14)를 포함할 수 있다. 회전 가능한 샤프트(14)는 샤프트(14) 및 임펠러(16 및 18)를 회전시키기 위한 모터(24)에 결합될 수 있다. 임펠러(16 및 18)는 금속 또는 생체 적합성 중합체와 같은 임의의 적합한 재료로 제조될 수 있다. 생물 반응기 시스템에 사용하기에 적합한 임펠러의 예는, 하이드로포일 임펠러, 고-고체성(high-solidity) 피치-블레이드 임펠러, 고-고체성 하이드로포일 임펠러, 러쉬톤 임펠러, 피치-블레이드 임펠러, 온화한 해양-블레이드 임펠러 등을 포함한다. 둘 이상의 임펠러를 포함하는 경우, 임펠러는 회전 가능한 샤프트(14)를 따라 이격될 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 생물 반응기(10)는 복수의 포트도 포함한다. 포트는 유체 및 다른 물질을 추가 및 제거하기 위해 생물 반응기(10)의 내부 및 외부로의 공급 라인 및 피드 라인을 허용할 수 있다. 또한, 하나 이상의 포트가 생물 반응기(10) 내의 상태를 모니터링하기 위해 하나 이상의 프로브에 연결하기 위한 것일 수 있다. 또한, 생물 반응기(10)는 생물 반응기 내의 배양물의 질량을 측정하기 위해 로드 셀과 결합되어(in association with) 배치된다.
도 1에 도시된 양태에서, 생물 반응기(10)는, 생물 반응기로부터 물질을 연속적으로 또는 주기적으로 배출하기 위해 배출물(28)에 연결된 하부 포트(26)를 포함한다. 임의의 적합한 방법을 사용하여 생물 반응기(10)로부터 물질이 배출될 수 있다. 예를 들면, 다른 양태에서, 딥 튜브를 사용하여 생물 반응기의 상부로부터 생물 반응기(10)로부터 배출물이 제거될 수 있다.(??) 또한, 생물 반응기(10)는 포트(30, 32 및 34)와 같은 복수의 상부 포트를 포함한다. 포트(30)는 제1 유체 피드(36)와 유체 통신하고, 포트(32)는 제2 피드(38)와 유체 통신하고, 포트(34)는 제3 피드(40)와 유체 통신한다. 피드(36, 38 및 40)는 영양물 배지와 같은 다양한 상이한 물질을 생물 반응기(10)에 피딩하기 위한 것이다. 본원 명세서에서 사용되는 바와 같이, 영양물 배지는, 바이오 제품의 질량을 증가시킬 수 있는 임의의 유체, 화합물, 분자 또는 물질, 예를 들면 바이오 매스를 생장, 성장 또는 다르게는 첨가하기 위해 유기체가 사용할 수 있는 모든 것을 나타낸다. 예를 들면, 영양물 피드는 호흡 또는 모든 유형의 대사에 사용되는 기체, 예를 들면 산소 또는 이산화탄소를 포함할 수 있다. 다른 영양물 배지는 탄수화물 공급원을 포함할 수 있다. 탄수화물 공급원은 복합 당 및 단순 당, 예를 들면 글루코스, 말토오스, 과당, 갈락토오스 및 이들의 혼합물을 포함한다. 영양물 배지는 아미노산도 포함할 수 있다. 아미노산은 글리신, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 티로신, 시스테인, 리신, 아르기닌, 히스티딘, 아스파르트산 및 글루탐산, 이들의 단일 입체 이성질체 및 이들의 라세미 혼합물을 포함할 수 있다. 용어 "아미노산"은 공지된 비-표준 아미노산, 예를 들면, 4-하이드록시프롤린, ε-N,N,N-트리메틸리신, 3-메틸히스티딘, 5-하이드록시리신, O-포스포세린, γ-카복시글루타메이트, γ-N-아세틸리신, ω-N-메틸아르기닌, N-아세틸세린, N,N,N-트리메틸알라닌, N-포르밀메티오닌, γ-아미노부티르산, 히스타민, 도파민, 티록신, 시트룰린, 오르니틴, β-시아노알라닌, 호모시스테인, 아자세린 및 S-아데노실메티오닌도 나타낸다. 일부 양태에서, 아미노산은 글루타메이트, 글루타민, 리신, 티로신 또는 발린이다.
영양물 배지는 하나 이상의 비타민도 함유할 수 있다. 영양물 배지에 함유될 수 있는 비타민은 B12와 같은 B군 비타민을 포함한다. 다른 비타민은 비타민 A, 비타민 E, 리보플라빈, 티아민, 비오틴 및 이들의 혼합물을 포함한다. 영양물 배지는 하나 이상의 지방산 및 하나 이상의 지질을 함유할 수도 있다. 예를 들면, 영양물 배지 피드는 콜레스테롤, 스테로이드 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 영양물 배지는 단백질 및 펩티드를 생물 반응기에 공급할 수도 있다. 단백질 및 펩티드는 예를 들면, 알부민, 트랜스페린, 피브로넥틴, 페투인 및 이들의 혼합물을 포함한다. 본 발명 내에서의 성장 배지는 성장 인자 및 성장 억제제, 미량 원소, 무기 염, 가수분해물 및 이들의 혼합물도 포함할 수 있다. 일 양태에서, 성장 배지는 인간 혈청 또는 송아지 혈청과 같은 혈청을 함유할 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 생물 반응기는 다수의 영양물 피드와 통신할 수 있다. 이러한 방식으로, 영양물 배지는 공정 동안 생물 반응기에서 영양물의 농도를 보다 잘 제어하기 위해 단일 영양물만을 함유하는 생물 반응기에 공급될 수 있다. 추가로 또는 다르게는, 상이한 피드 라인은 기체 및 액체를 생물 반응기에 개별적으로 피딩하기 위해 사용될 수 있다.
생물 반응기(10)의 상부 및 하부의 포트 이외에, 생물 반응기는 측벽을 따라 배치된 포트들을 포함할 수 있다. 예를 들면, 도 1에 도시된 생물 반응기(10)는 포트(44 및 46)를 포함한다. 측벽을 따라 배치된 포트는 임의적이다. 예를 들면, 다른 양태에서, 헤드플레이트 포트를 사용하여 생물 반응기(10)의 상부로부터 세포 배양물의 모니터링이 실시될 수 있다.
본 발명에 따라, 포트(46)는, 세포 배양물을 증식하거나 다르게는 바이오 제품을 생성하기 위해 생물 반응기(10)에서 하나 이상의 파라미터의 최적 농도를 유지할 수 있는 파라미터 모니터링 및 제어 시스템과 통신한다. 도 1에 도시된 양태에서, 시스템은 라인 측정을 실시하도록 설계된다. 특히, 세포 배양물이 생물 반응기(10) 내에, 즉, 온라인으로 존재하는 동안 세포 배양에 대해 측정이 이루어진다. 그러나, 다르게는 측정은 라인에서 또는 오프라인에서 실시할 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 생물 반응기(10)는 샘플링 스테이션과 통신할 수 있다. 세포 배양물 샘플이 광 산란 측정을 실시하기 위해 샘플링 스테이션에 피딩될 수 있다. 또 다른 양태에서, 세포 배양물 샘플이 생물 반응기로부터 제거되어 오프라인으로 측정될 수 있다.
도 1에 도시된 양태에서, 포트(46)는 광 운반 장치(50)와 통신한다. 광 운반 장치(50)는 응집성 광원과 같은 광원(52)과 통신한다. 또한, 광 운반 장치(50)는 라만 분광계(54)와 통신한다. 광원(52)은 생물 반응기(10) 내의 세포 배양물을 광 빔에 노출시키기 위한 것이다. 이어서, 광 운반 장치(50)는 생물 반응기(10) 내의 하나 이상의 파라미터의 농도를 결정하기 위해 세포 배양물로부터 반사된 산란된 광을 라만 분광계(54)로 운반하도록 구성된다. 라만 분광계(54) 및/또는 광원(52)은 제어기(60)와 통신할 수 있다. 제어기(60)는, 라만 분광계(54)로부터 수신된 정보 또는 데이터로부터 생물 반응기(10) 내의 하나 이상의 파라미터의 농도를 결정하고, 상기 데이터에 기초하여 하나 이상의 피드(36, 38 또는 40)를 제어할 수 있고/있거나 생물 반응기(10) 내에서 하나 이상의 파라미터를 사전 설정된 농도 한계 내로 유지하기 위해 배출물(28)을 제어할 수 있다.
본 발명에 따른 광원(52)은 제어된 파장 또는 파장 범위를 갖는 응집성 광선을 방출할 수 있다. 광원(52)은 예를 들면, 다양한 필터를 함께 포함하여 레이저, 발광 다이오드 또는 가능하게는 필라멘트 전구를 포함할 수 있다. 광원(52)은 생물 반응기(10)에 존재하는 바이오 물질을 포함하는 다양한 인자에 기초하여 선택될 수 있다. 예를 들면, 광원(52)은 시스템의 기하학적 구조 및 감도에 적용될 수 있고, 반응기 내에 함유된 생체 물질의 스펙트럼 특성에 기초하여 선택될 수 있다. 일 양태에서, 광원(52)은 생물 반응기(10) 내의 세포 배양물의 조사를 위해 단색광을 방출한다. 일 양태에서, 단일 광원(52)이 사용될 수 있다. 그러나, 다르게는, 시스템은 동일한 파장 또는 상이한 파장 모두에서 작동하는 다수의 광원을 포함할 수 있다. 일반적으로, 광원(52)에 의해 방출된 광 빔은 가시광 스펙트럼, IR 스펙트럼 및/또는 NIR 스펙트럼의 파장을 가질 수 있다. 예를 들면, 광의 파장은 일반적으로 약 400nm 초과, 예를 들면 약 500nm 초과, 예를 들면 약 600nm 초과, 예를 들면 약 700nm 초과일 수 있다. 광원(52)에 의해 방출되는 광의 파장은 일반적으로 약 1,500nm 미만, 예를 들면 약 1,200nm 미만, 예를 들면 약 1,000nm 미만, 예를 들면 약 900nm 미만일 수 있다. 일 양태에서, 광원의 파장은 약 700 내지 약 850nm일 수 있다. 하나의 특정 양태에서, 광원은 파장이 785nm인 광 빔을 방출한다. 예를 들면, 파장이 보다 더 긴 광은 라만 산란 방사선의 강도를 감소시킬 수 있다.
광원(52)은 임의로 하나 이상의 렌즈, 빔 스플리터, 회절 격자, 편광 필터, 대역 통과 필터, 또는 생물 반응기 내에서 샘플을 원하는 방식으로 조명하기 위해 선택되는 다른 광학 요소와 결합될 수 있다.
광원(52)은 생물 반응기(10) 내에 함유되는 세포 배양물 상으로 광 빔을 직접 방출할 수 있다. 다르게는, 광원(52)으로부터의 방사선이 하나 이상의 광 운반 장치(50), 예를 들면 광섬유를 통해 샘플 표면으로 운반될 수 있다. 하나 이상의 광섬유는 샘플의 표면을 연속적으로 또는 간헐적으로 조명하는데 사용될 수 있다. 또한, 하나 이상의 광섬유는, 일반적으로 세포 배양물의 동일한 영역을 조명할 수 있거나, 상이한 위치에서 세포 배양물을 조사하도록 배치될 수 있다.
일 양태에서, 생물 반응기 내의 샘플을 조명하는데 사용되는 하나 이상의 광섬유는, 표면으로부터 반사, 방출 또는 산란된 방사선을 수집하는 데 사용되는 하나 이상의 광학 검출 섬유와 함께 묶여있다. 적당한 조명과 검출 광섬유 번들은 샘플 표면의 선택된 영역으로 지향될 수 있다. 각각의 번들 중의 조명 섬유는 광원(52)으로부터 선택된 표면 영역으로 광을 투과시킬 수 있다. 이후, 표면의 해당 영역으로부터 반사, 방출 또는 산란된 광이 탐지 섬유에 의해 수집될 수 있다. 각각의 번들 중의 검출 섬유에 의해 투과된 광은 조합된 방식 또는 별개의 방식으로 원하는 대로 평가될 수 있다.
광 운반 장치(50) 또는 광섬유는 임의로 하나 이상의 렌즈, 빔 스플리터, 회절 격자, 편광 필터, 대역 통과 필터 또는 다른 광학 요소와 결합될 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 광 운반 장치(50)에 의해 수집된 반사 또는 산란된 광은 홀로그램 노치 필터와 통신할 수 있다.
홀로그램 노치 필터 이외에, 조명된 샘플로부터 투과, 반사, 방출 또는 산란된 광은, 광의 투과를 촉진하고 강도를 측정하기 위한 다양한 다른 광학 요소를 포함할 수 있다. 예를 들면, 경로에 포함될 수 있는 다른 광학 요소는 렌즈, 빔 스플리터, 회절 격자, 편광 필터, 대역 통과 필터 등을 포함한다. 예를 들면, 샘플에 의해 산란된 라만-이동된 방사선을 검출하는 경우, 다른 적합한 필터는 차단 필터, 파브리 페로 앵글 튜닝 필터, 음향-광학 조정 가능 필터, 액정 조정 가능 필터, 리오 필터, 에반스 스플릿 소자 액정 조정 가능 필터, 솔크(Solc) 액정 조정 가능 필터, 액정 파브리 페로 조정 가능 필터 등을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 간섭계는 편광 독립적 이미징 간섭계, 미켈슨 간섭계, 사냑 간섭계, 트윈암-그린 간섭계, 마흐-젠더 간섭계, 가변 파브리 페로 간섭계 등을 포함한다. 일반적으로, 샘플 영역으로부터 수신된 라만-이동된 산란된 방사선을 보다 잘 식별하기 위해 임의의 적합한 검출기가 사용될 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같이, 하나 이상의 광섬유를 포함할 수 있는 광 운반 장치(50)가 라만 분광계(54)에 연결된다. 라만 분광계(54)는 검출기를 포함한다. 예를 들면, 산란된 광은, 샘플 표면의 상이한 평가된 영역들로부터 투과된 광이 검출기에 의해 구별될 수 있도록, 맵핑 또는 어드레싱 가능한 방식으로 검출기로 전송될 수 있다. 그렇지 않은 경우, 샘플 표면의 개별 평가 영역들로부터의 광은 검출기 요소의 선형 또는 2차원 어레이를 갖는 검출기의 개별 부분들로 개별적으로 투과될 수 있다.
도 1에 도시된 바와 같은 라만 분광계(54)는 검출기를 포함할 수 있다. 라만 분광법 동안, 산란된 광의 강도가 측정되고 진동, 회전 및 기타 저주파 변화 또는 이동이 관찰된다. 일 양태에서, 샘플 또는 세포 배양물로부터 산란된 광은 광의 비탄성 산란만을 관찰하기 위해 홀로그램 노치 필터와 같은 필터를 통해 공급된다. 이러한 방식으로, 원래 파장으로부터의 광자의 이동을 관찰할 수 있다. 예를 들면, 광의 빔과 세포 배양물 내의 화학적 성분과의 상호 작용으로 인해, 레이저 광자가 업 또는 다운으로 이동한다. 에너지 이동은 시스템의 진동 모드에 대한 정보를 제공하며, 다양한 분자의 존재 및 농도와 같은 다른 파라미터를 핑거프린팅하는 데 사용할 수 있다.
본 발명의 일 양태에서, 라만 분광계(54)는 광자 시프트 및 광자 시프트의 강도를 보다 잘 측정하기 위한 파장 분리기 및 CCD(charge coupled device) 카메라를 포함한다. 이러한 방식으로, 라만 분광계(54)는 생물 반응기(10) 내의 하나 이상의 파라미터를 동시에 검출할 수 있다.
라만 분광법은 본 발명에 따라 사용되는 경우 많은 이점 및 이익을 제공할 수 있다. 예를 들면, 상기 개시한 바와 같이, 라만 분광법은 샘플 내의 특정 분자 결합의 존재에 관한 특정 정보를 제공하기 위해 비탄성광 산란을 처리한다. 이러한 방식으로 다수의 파라미터 또는 구성 요소(component)를 동시에 측정하고 모니터링할 수 있다. 라만 분광법은 특정 파라미터의 존재를 식별할 수 있을뿐만 아니라, 이러한 파라미터의 농도에 관한 정보를 제공할 수도 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 라만 분광법은 생물 반응기(10)로부터 세포 배양물 샘플을 제거 할 필요없이 인 라인으로 사용될 수도 있다. 샘플은 어떠한 희석도 필요하지 않으며, 측정은 물의 존재에 크게 영향을 받지는 않는다. 또한, 측정이 연속적으로 또는 비교적 짧은 시간 간격으로 실시될 수 있다. 예를 들면, 적어도 24시간마다, 예를 들면 적어도 20시간마다, 예를 들면 적어도 15시간마다, 예를 들면 적어도 10시간마다, 예를 들면 적어도 8시간마다, 예를 들면 적어도 4시간마다, 예를 들면 적어도 2시간마다, 예를 들면 적어도 1시간마다, 예를 들면 적어도 30분마다, 예를 들면 적어도 10분마다, 예를 들면 적어도 5분마다 측정이 실시될 수 있다..
라만 분광계(54)로부터의 데이터가 제어기(60)에 공급될 수 있다. 제어기(60) 및/또는 라만 분광계는 생물 반응기(10)에 함유된 세포 배양물의 하나 이상의 파라미터의 농도를 계산할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 방법은 하나 이상의 품질 특성을 모니터링 및 조정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 모니터링 및 제어될 수 있는 하나의 품질 특성은 단백질에 영향을 미치는 당화 프로파일이다. 모니터링 및 변경될 수 있는 또 다른 품질 속성은 제품 중의 불순물의 존재를 나타낼 수 있는 전하 변형 프로파일이다.
본 발명에 따라 다양한 상이한 파라미터가 모니터링될 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 영양물의 농도가 모니터링될 수 있다. 모니터링될 수 있는 영양물의 예는, 예를 들면 글루코스, 글루타민 및/또는 글루타메이트를 포함한다. 다르게는, 모니터링되는 파라미터는 폐기물의 농도와 관련될 수 있다. 본 발명에 따라 모니터링될 수 있는 폐기물은 락테이트 및 암모늄을 포함한다. 또한, 다양한 성장 및 특성을 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 성장 특징 파라미터는 생존 세포 농도 및 총 세포 농도를 포함한다. 최종적으로, 모니터링되는 파라미터는 최종 생성물의 농도를 포함할 수 있다.
본 발명에 따라, 일 양태에서, 제어기(50)는 생물 반응기(10) 내에서 발생할 수 있는 예상 공정 변동을 커버하는 라만 스펙트럼을 수집할 수 있다. 이후, 제어기(60)는 임의의 적합한 방법을 사용하여 하나 이상의 파라미터의 농도를 결정할 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 파라미터의 농도는 수집된 스펙트럼을 오프라인 기준 데이터와 비교하여 측정된다. 제어기(60)는 다변량 소프트웨어를 사용하여 교정 모델을 개발할 수도 있다. 일 양태에서, 제어기는 독립적인 데이터 세트에 기초하여 개발된 적격 예측 모델을 포함할 수도 있다.
일 양태에서, 제어기에 의해 수집된 라만 스펙트럼은 파라미터의 농도를 결정하기 전에 다양한 통계 분석 또는 전처리될 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 산란 효과를 제거하기 위해, 표준 정규 변량을 라만 스펙트럼에 적용할 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 표준 정규 변량은 확률 밀도 함수를 생성하기 위해 평균 및 표준 편차를 계산할 수 있다. 예를 들면, 하나의 특정 양태에서, 표준 정규 변량은 분산이 1인 기대 값 0을 포함할 수 있다.
일 양태에서, 표준 정규 변량은 1차 미분 적용 및 디트렌딩의 적용과 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 디트렌딩을 사용하여 형광으로 인한 상향 기저선 추세를 감소시킬 수 있다. 표준 정규 변량을 적용하고, 디트렌딩하고, 1차 미분을 적용한 후, 관심 파라미터와 상관되는 스펙트럼 범위를 선택할 수 있다. 일 양태에서, 처리된 스펙트럼은 부분 최소 제곱 회귀를 사용하여 모델링될 수 있다.
제어기(60)는 하나 이상의 프로그램 가능한 장치 또는 마이크로 프로세서를 포함할 수 있다. 도 1에 도시된 바와 같이, 제어기(60)는 하나 이상의 피드(36, 38 및 40) 및 하나 이상의 배출물(28)과 통신될 수 있다. 제어기는 하나 이상의 파라미터의 농도에 기초하여 생물 반응기(10)로의 재료 및 물질의 유동을 증가시키거나 감소시키도록 구성될 수 있다. 예를 들면, 제어기(60)는 라만 분광계(54)로부터 수신되는 신호를 분석할 수 있고, 하나 이상의 입력 및/또는 출력 장치를 제어할 수 있는 출력 신호를 생성할 수 있다.
일 양태에서, 제어기(60)는 라만 스펙트럼을 사용하여 측정된 파라미터의 농도에 기초하여, 생물 반응기(10)의 내부로 또는 외부로 파라미터 영향 물질의 유동을 선택적으로 증가시키거나 감소시키도록 구성될 수 있다. 이러한 방식으로, 제어기(60)는 파라미터의 농도를 사전 설정된 한계 내로 유지할 수 있다. 제어기(60)는 개방 루프 제어 시스템에서 동작할 수 있거나 폐쇄 루프 제어 시스템에서 동작할 수 있으며, 입력 및/또는 출력 장치에 대한 조정이 자동으로 완료된다.
일 양태에서, 제어기(60)는 생물 반응기(10) 내의 적어도 2개의 파라미터를 모니터링한다. 예를 들면, 제어기(60)는 적어도 3개의 파라미터, 예를 들면 적어도 4개의 파라미터, 예를 들면 적어도 5개의 파라미터를 모니터링할 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 제어기(60)는 약 2 내지 약 10개의 파라미터, 예를 들면 약 2 내지 약 6개의 파라미터를 모니터링할 수 있다.
일 양태에서, 제어기는, 공정의 개시부터 공정의 종료까지 생물 반응기 내에 최적의 조건이 유지되는 것을 보장하기 위해 하나 이상의 파라미터의 장래의 농도를 예측할 수 있는 예측 모델로 프로그래밍될 수 있다. 예를 들면 제어기(60)를 연속 모니터링과 조합하여 예측 모델로 프로그래밍하면, 매우 복잡한 해결책에 대한 잠재적 피드백 제어를 제공한다. 예를 들면, 특히 둘 이상의 파라미터를 모니터링하는 것과 함께 예측 모델을 사용하면, 세포 배양물의 전체 증식 과정 동안 가능한 한 많은 변동성을 포착할 수 있다.
예측 모델은 가능한 한 많은 공정을 포함하는 원하는 파라미터 및 관련 라만 스펙트럼의 농도를 함유하는 실험 접근법의 설계를 사용하여 생성될 수 있다. 다양한 농도에서 파라미터를 스파이킹(spike)하고 결과 스펙트럼을 측정하여 추가의 개선이 이루어질 수 있다. 또한, 존재할 수 있는 상관 관계를 강제로 해제하여 예측 모델의 추가의 개선이 달성될 수 있다. 교정 모델에 이러한 데이터 포인트의 포함은 장래의 데이터 세트에 대한 모델의 예측 능력을 향상시킨다. 라만 스펙트럼의 교정 및 예측 모델이 개발되면, 이들은 공정 모니터링 및 생물 반응기 내에서의 피드백 제어에 사용할 수 있다. 특히 유리한 점은, 본 발명의 방법은, 예측 모델이, 많은 상이한 세포 배양물들에 대하여 그리고 많은 상이한 유형의 생물 반응기들에서 사용될 수 있게 한다.
일 양태에서, 생물 반응기(10)는 배취 공정에서 세포 배양물을 성장시키기 위한 것이다. 다르게는, 생물 반응기(10)는 관류 공정에서 작동될 수 있으며, 여기서 유체는 연속적으로 제거되고 보충된다. 세포 배양물이 증식되는 시간은 다양한 인자에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 예를 들면, 세포 배양물은 약 6 내지 약 30일, 예를 들면 약 8 내지 약 20일의 시간 기간 동안 증식될 수 있다. 일 양태에서, 하나 이상의 파라미터의 농도 측정은 세포 성장의 초기 단계에서 얻을 수 있다. 예를 들면, 첫 1 내지 6일 동안, 예를 들면 첫 2 내지 4일 동안 상이한 파라미터에 대해 라만 스펙트럼을 얻을 수 있다. 제어기(60)는 이러한 정보를 수신하고, 각각의 모니터링되는 파라미터의 장래의 농도를 예측하는 예측 데이터의 구축을 개시할 수 있다. 일정 기간 동안 정보를 수신한 후, 제어기(60)는 생물 반응기(10)로부터 공급 또는 회수될 수 있는 파라미터 영향 물질을 선택적으로 증가시키거나 감소시킬 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 제어기(60)는 데이터를 수신한지 2 내지 4일 후 그리고 파라미터의 농도가 예측 모델에 얼마나 부합하는지에 기초하여 생물 반응기에 대한 선택적 조정을 개시할 수 있다.
예를 들면, 일 양태에서, 시스템은 락테이트 농도와 같은 적어도 하나의 다른 파라미터와 함께 글루코스 농도를 모니터링하도록 구성될 수 있다. 파라미터 둘 다의 모니터링된 농도에 기초하여, 제어기(60)는 생물 반응기(10) 내로의 하나 이상의 영양물 배지의 유동을 자동으로 조정할 수 있다. 영양물 배지는 예를 들면 글루코스를 함유할 수 있다. 이러한 방식으로, 글루코스 농도는, 락테이트 농도를 사전 설정된 파라미터 내로 유지하는 것과 함께 사전 설정된 파라미터 내로 유지될 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 락테이트 수준의 변동을 최소화하고 락테이트 수준을 원하는 설정점 미만으로 유지하도록 글루코스 수준이 유지된다.
다른 양태에서, 제어기는, 연속 관류 생물 반응기에서 유출물 속도를 제어하여 파라미터 수준을 원하는 설정점 미만으로 유지하기 위해, 예를 들면 락테이트 수준을 원하는 설정점 미만으로 유지하기 위해 사용될 수 있다.
라만 분광법을 통해 하나 이상의 파라미터를 모니터링하는 것 이외에, 제어기는 다양한 다른 공정 조건을 제어할 수 있다. 예를 들면, 제어기는 열 순환기, 로드 셀, 제어 펌프와 통신될 수 있고 이들을 제어할 수 있으며, 다양한 센서 및 프로브로부터 정보를 수신할 수 있다. 예를 들면, 제어기는 pH, 산소 분압, 용존 이산화탄소, 온도, 진탕 조건, 알칼리 상태, 압력, 발포 수준 등을 제어 및/또는 모니터링할 수 있다. 예를 들면, pH 프로브로부터의 pH 측정치에 기초하여, 제어기는 산 또는 알칼리의 필요한 양을 첨가하여 pH 수준을 조절하도록 구성될 수 있다. 제어기는 pH를 감소시키기 위해 이산화탄소 기체 공급원을 사용할 수도 있다. 유사하게는, 제어기는 온도 정보를 수신할 수 있고, 온도를 증가시키거나 감소시키기 위해 생물 반응기를 둘러싸는 워터 재킷으로 공급되는 유체를 제어할 수 있다.
많은 상이한 세포 배양물들이 본 발명의 방법을 사용하여 유지되거나 증식될 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 생물 반응기는 포유 동물 세포를 함유할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 방법이 세포 요법을 위한 세포를 수확하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 일 양태에서, 생물 반응기는 줄기 세포, T 세포, 면역 세포 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 방법을 통해, 세포 배양물은 우수한 제품 특성을 포함하여 성장될 수 있다. 예를 들면, 세포 배양물은 우수한 생존력 특성을 포함하여 성장될 수 있다. 예를 들면, 생존 세포 수를 총 세포 수로 나누어 생존율(viability)을 측정할 수 있으며, 생존 세포 수 및 총 세포 수 둘 다는 라만 스펙트럼을 사용하여 측정될 수 있는 2개의 파라미터이다. 본 발명에 따르면, 약 0.6 초과, 예를 들면 약 0.7 초과, 예를 들면 약 0.8 초과, 예를 들면 약 0.9 초과의 상기 기재된 생존율을 갖는 세포 배양물이 본원 명세서에 따라 성장될 수 있다. 실제로, 생존율은 약 0.94 초과, 예를 들면 약 0.96 초과, 예를 들면 약 0.98 초과일 수 있다.
본 발명은 하기 실시예들을 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
실시예 1
상이한 단세포군 항체(mAbs)를 생성하는 3개의 상이한 CHOK1SV GS-KO™ 세포주를 본 연구 동안 사용했다. 교정 모델 개발에는 2개의 세포주를 사용했고, 나머지 세포주는 모델 검증에 사용했다. 모든 세포주를 플랫폼 배지에서 배양하고 15일 기간 동안 피딩했다. 교정 모델에 대한 모든 세포 배양을 5L 작동 용적을 갖는 4개의 교반 탱크 반응기(STR)에서 실시했다. 각각의 교정 세포 배양물은
Figure pct00001
3g/L의 목표 잔류 글루코스 농도에서 작동하는 2개의 대조군을 가졌다. 글루코스의 작동 범위를 확장하기 위해, 2개의 STR을
Figure pct00002
1g/L의 추가 초기 글루코스로 작동하고, 1g/L의 목표 잔류 글루코스 농도로 유지시켰다. 또한, 플랫폼 공정에 대한 예상 범위를 벗어난 대사물 및 세포 농도를 설명하기 위해, 5L의 작업 용적을 갖는 4개의 STR에서 1라운드의 비정상 세포 배양 데이터가 포함되었다. 모델 검증을 위해 2개의 STR이 5L 작업 용적으로 작동된 반면, 1개의 STR은 10L의 작동 용적으로 작동되어 모델 확장성을 평가했다.
오프라인 분석
배양 동안, 대사물 및 세포 성장을 분석하기 위해 오프라인 샘플(
Figure pct00003
20mL)을 각 배양물로부터 매일 2회 채취했다. 글루코스, 락테이트, 글루타메이트 및 암모늄의 오프라인 분석을 NOVA Bioprofile 400(NOVA Biomedical)을 사용하여 실시했다. Vi-Cell XR(Beckman Coulter)을 사용하여 VCC(생존 세포 농도) 및 TCC(총 세포 농도)의 오프라인 분석을 실시했다. 배양 실시 4일 후부터, 생성물 농도 분석을 위해 세포 배양 상청액으로부터 1일 2회 분취량(
Figure pct00004
2mL)을 저장했다. 생성물 농도를 단백질 A HPLC를 통해 분석했다.
인라인 라만 스펙트럼을 Kaiser Optical System, Inc.의 RAMANRXN2TM(RXN2) 시스템을 사용하여 4개의 420mm 생체 광학 프로브(생물 반응기당 1개의 프로브)를 사용하는 785nm 레이저로 수집했다. 라만 스펙트럼은
Figure pct00005
12.5분의 총 분석 시간 동안 5초 노출 시간으로 150scan으로 생성되었다. 교정 세트를 구축하는데 사용되는 세포 배양물의 경우, 인라인 라만 스펙트럼을 각각의 생물 반응기로부터 1일 2회 수집하여, 오프라인 샘플의 측정과 일치시켰다. 4개의 프로브 모두로부터의 인라인 라만 스펙트럼의 총 수집 시간은
Figure pct00006
1시간이었다.
모델 검증을 위해, 인라인 라만 스펙트럼을 3시간마다 수집하고 오프라인 측정과 비교했다. 인증 실행 중 오프라인 샘플링 사이에 수집된 추가의 스펙트럼이 시간이 지남에 따라 측정된 파라미터를 트렌딩하고, SIMCA v13.0.3으로 가져오기 전에, 개발된 모델의 이의 각각의 오프라인 측정과 일치하는 위치를 모니터링하는 기능에 대한 추가의 이해를 제공했다. 지문 영역 외부의 다음 영역(대부분의 모델의 경우 <500cm-1 및 >1,700cm-1)을 제거하여, 결과 모델에서 이러한 신호에 부적절한 중량이 부여되지 않게 했다(도 2a). 이러한 노이즈 영역에 남겨지는 경우, 라만 영역의 영향이 대사물 농도의 변화(예를 들면, 잔류 글루코스 농도)와 상관되어 모델 강건성을 방해한다. 스펙트럼 트리밍 후, 상이한 스펙트럼 전처리 조합이 적용되었고, PLS 모델이 구성되었다. 상이한 세포 배양 런(run)들로부터의 원 스펙트럼(raw spectrum)은 실험 과정에 걸쳐 기저선 이동을 나타냈고, 이는 제1 미분 필터의 적용에 의해 감소되었다(도 2b). 또한, 본 연구의 모든 파라미터에 대해 가장 적합한 모델을 생성하기 위해 미분 필터가 필요했다. 사용되는 실제 스펙트럼 전처리는 파라미터에 의존적이라는 점에 유의해야 한다. 결과 모델 통계를 비교하고 RMSEE/RMSECV가 가장 낮은 모델을 검증 세트 모니터링에 사용하도록 저장했다.
모델 교정
5L STR에서의 플랫폼 공정을 사용하는 12회의 세포 배양 런으로부터의 오프라인 데이터를 각각의 라만 스펙트럼과 조합하고, 글루코스, 글루타메이트, 락테이트, 암모늄, 생존 세포 농도(VCC), 총 세포 농도(TCC) 및 생성물 농도(표 1)에 대한 교정 모델을 생성하는데 사용했다. 일반적으로 모델은 모든 파라미터에 대해 R2Y >0.90인 낮은 RMSEE/RMSECV 값을 갖는다. 또한, 모든 모델은 암모늄을 제외한 잠복 변수(LV)의 수가 상대적으로 낮다. 암모늄 모델에 대한 높은 LV 수는, 모델이 암모늄 파라미터에 대해 오버 핏(over fit)임을 나타낼 수 있다(R2cv = 0.89). 모델의 구축에서, 플랫폼 공정의 정상 작동 조건 이외의 범위를 포괄하는 오프라인 데이터 및 스펙트럼을 수집했다. 이는 모델이 외삽해야 하는 상황이 발생되는 것을 피하기 위해 실시되었다. 예측된 글루코스, 글루타메이트, 락테이트, 암모늄, VCC, TCC 및 생성물 농도 대 각각의 오프라인 기준 방법에 대한 교정 모델 플롯은, 일반적으로 모든 모델이 측정된 값과 매우 관련되어 있는 것을 나타낸다(도 3).
Figure pct00007
모델 검증 및 확장성
교정 모델에 포함되지 않은 세포주를 사용하여 모델을 검증했다. 모든 검증 런을 플랫폼 공정에 대한 정상 작동 조건 하에 실시했다. 개발된 모델의 잠재적인 확장성을 조사하기 위해, 10L 배양도 실시했다. 세 가지 모든 검증 런에 대한 결과 예측 대 오프라인 기준 방법 프로파일이 도 4에 도시되어 있다. 예측 값에 대한 오차 막대는 ±각 배양 런에 대한 RMSEP이다. 오프라인 기준 방법에 대한 오차 막대는 ±공급처가 규정한 정밀도이다. 모든 모델은 상대적으로 낮은 RMSEP 값으로 원하는 파라미터의 변화를 모니터링할 수 있었다(표 2).
Figure pct00008
글루코스에 대해 개발된 예측 모델은, 0.44g/L의 평균 RMSEP 대 5.18g/L의 평균 공정 글루코스 농도로 3개 세포 배양물 전체에 대한 글루코스 농도의 만족스러운 예측을 확인했다. 중요하게는, 개발된 모델은 배양물이 농축 글루코스 피드가 피딩됨에 따라 잔류 글루코스 농도의 변화를 모니터링할 수 있었다(도 4a). CHO 세포 배양물에 조심스럽게 글루코스를 피딩하면 생성물 품질이 향상되는 것으로 확인되었다. 인라인 라만 모니터링을 통해 이루어질 수 있는 잔류 글루코스 제어를 통해, 당화 백분율을 약 절반으로 감소시킬 수 있다.
락테이트에 대한 예측 모델은, 0.23g/L의 평균 RMSEP 대 0.81g/L의 평균 공정 락테이트 농도로 3개 배양물 전체에 대한 락테이트 농도 변화를 만족스럽게 모니터링했다. 락테이트에 대한 약간의 초과 예측(over prediction)이 하나의 배양의 종료 즈음에 관찰되었다(도 4ci). 이는, 측정된 값이, 기본값이 0g/L인 오프라인 기준 방법의 하위 범위보다 낮기 때문일 수 있다. 중요하게는, 플랫폼 공정의 경우 예상 범위를 벗어난 락테이트 농도의 이동을 측정할 수 있다는 것이다(도 4cii). 이는 상기 공정에서 일반적으로 관찰되는 것(표 1)의 범위를 매우 벗어난 락테이트 농도 범위를 갖는 교정 데이터세트를 사용하기 때문이다. PLS 모델은 데이터를 추정할 수 없으므로, 교정 동안 모든 잠재적인 일탈(excursion)을 포함되게 하면 비전형적인 배양 성능에 대한 모델의 강건성을 높이는 데 도움이 된다(도 4cii).
암모늄에 대해 개발된 예측 모델은, 0.03g/L의 평균 RMSEP 대 0.09g/L의 평균 공정 암모늄 농도로 모든 배양물에서의 암모늄 농도 변화를 모니터링할 수 있었다. 런의 종료 즈음에 하나의 세포 배양에서 약간의 미달 예측(under prediction)이 관찰되었다(도 4dii). 이는 <0.2g/L인 교정 배양물 중 암모늄의 농도 범위가 상기 모델이 이러한 값을 추정하게 하기 때문이다(표 1, 도 4d). 보다 더 넓은 범위의 암모늄 농도를 포괄하는 보다 더 많은 오프라인 기준 측정의 포함은, 암모늄 농도의 변화를 모니터링할 수 있는 향상된 기능을 갖춘, 모델이 보다 강건해지게 한다.
VCC 및 TCC에 대해 개발된 예측 모델은 1.90x106 및 1.85x106 cells/mL의 평균 RMSEP 대 1.80x106 및 1.86x106 cells/mL의 평균 공정 값으로 3개의 전체 검증 배양물의 변화를 모니터링할 수 있었다. 중요하게는, 모델은 대부분의 검증 배양물에 대한 오프라인 기준 방법의 오류 내에서 VCC 및 TCC를 예측할 수 있었다. 고정 성장기 동안 예측된 VCC와 측정된 VCC 사이의 불일치는, 이러한 높은 세포 농도에서 Vi Cell XR 분석을 위한 샘플 준비와 관련된 희석 오차의 결과일 수 있다. 이러한 오류에도 불구하고, VCC에 대하여 개발된 모델은 피딩-배취 및 관류 세포 배양물에 대한 영양물 피드의 온라인 제어를 제공하는데 적합하며, 상기 영양물 피드는 기존에는 일일 VCC 측정에 기초하고 인라인 커패시턴스 프로브를 사용하여 조정되어 왔다. 커패시턴스 기초 예측이 효과적인 것으로 나타났지만, 엔지니어링 제약은 일반적인 GMP 생물 반응기 용기에서 사용 가능한 프로브 포트의 수를 제한한다. 이러한 경우, 영양물 피드의 피드백을 제어하기 위한 여러 파라미터를 모니터링하기 위해 단일 프로브를 사용하는 것이 바람직하며, 인라인 라만 프로브는 분명한 이점을 제공한다.
글루타메이트에 대해 개발된 예측 모델은 1.61mM의 평균 RMSEP 대 1.64mM의 평균 공정 글루타메이트 농도로 검증 배양물에 대한 변화를 모니터링했다(도 4b). 글루타메이트 모델에서의 오류는 NOVA Bioprofile 400의 글루타메이트 검출과 관련된 측정 오류로 인한 것일 수 있다. 인라인 라만 스펙트럼으로 강건한 PLS 모델을 구축하기 위해 오프라인 기준 방법에 의한 정확한 측정이 필요할 수 있다. 이와 같이, 상기 성분에 대해 보다 정확한 기준 방법을 사용하여 글루타메이트 모델을 개선할 수 있다.
생성물 농도에 대해 개발된 예측 모델은 0.98g/L의 평균 RMSEP 대 1.74g/L의 공정 평균 생성물 농도였다(도 4). 생성물 농도 예측에서의 오류는 모델 개발에 사용된 세포 배양 초기 시점의 데이터 부족으로 인한 것일 수 있다. 세포 배양의 개시에서, 상기 모델은 생성물이 거의 존재하지 않을 것으로 예상될 때 상당한 양의 생성물의 존재를 예측했다(도 4g). 이러한 차이는 교정 모델이 배양 4일째 전에 오프라인 생성물 농도 데이터를 포함하지 않는다는 사실때문일 수 있다. 이러한 데이터를 포함하면 개선된 예측 모델을 개발할 수 있다. 배양 후반부의 예측 오류는, 라만 스펙트럼으로 구축된 모델이 생성물 농도의 변화를 직접 측정하는 것은 아니지만, 상기 파라미터와 관련된 다른 요인에 기초하여 생성물 농도를 추정하는 것을 나타내는 것일 수 있다. 예를 들면, 생성물 농도는 시간 및 VCC와 상관 관계가 있지만, 이러한 상관 관계는 세포주와 생성물에 따라 크게 다르다. 모델이 시간 및 VCC와의 상관 관계로 생성물 농도를 추정하는 경우, 교정 모델에 포함되지 않은 세포주에 대해 이후 시점에서의 생성물 농도를 예측하는 경우 모델이 약간 벗어난 이유를 설명하는 데 도움이 될 수 있다(도 4g). 또한, 상이한 mAb는 상이한 라만 신호를 얻을 수 있는 상이한 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이는 개발된 모델의 세포 배양 동안 상이한 mAbs 농도를 예측하는 능력에 영향을 미칠 수 있다.
4개의 상이한 라만 프로브로부터의 인라인 라만 스펙트럼을 사용하여, 공정 대사물, 세포 성장 및 생성물 농도의 예상되는 변화를 포함하여, 플랫폼 배지상에서 배양된 2개의 CHOK1SV GS-KO™ 세포주의 오프라인 기준 측정으로부터 교정 모델을 생성했다. 교정 모델은 상이한 규모에서의 3라운드의 검증 세포 배양에 대한 오프라인 기준 방법의 오차 내에서 글루코스, 락테이트, 암모늄, 생존 세포 농도 및 총 세포 농도의 농도를 예측할 수 있었다. 또한, 이러한 일반 모델들은 이러한 공정 파라미터에 사용된 CHOK1SV GS-KO™ 세포주와 무관한 것으로 밝혀졌다. 글루타메이트 및 생성물 농도에 대한 강건한 모델이 작은 변화로 만족스럽게 만들어질 수 있다. 보다 민감한 오프라인 방법 및 보다 더 많은 데이터의 포함이 글루타메이트 농도 및 생성물 농도 각각에 대한 모델을 개선할 수 있다.
본 발명의 공정을 통해, 영양물 피드의 피드백 제어가 품질 결과를 개선하기 위한 세포 배양물의 신중한 모니터링 및 자동 조정을 가능하게 한다. 도 5를 참조하면, 시간에 따른 글루코스 농도가 도시되어 있다. 도시된 바와 같이, 본 발명의 공정은, 특히 일일 측정에 기초하여 글루코스의 피딩 속도를 단순히 조정하는 종래의 시스템과 비교하여, 신중하게 제어된 한계 내에서 글루코스 수준을 유지할 수 있다. 도 5에 도시된 바와 같이, 라만 신호로부터의 글루코스 피딩의 지속적인 조정은 대부분의 배양에 대한 표적 인근에 보다 일관된 글루코스 프로파일을 야기한다.
본 발명에 따른 생존 세포 농도에 관련된(tie) 복합 영양물 피드의 제어도 도 6에 도시되어 있다.
본 발명의 시스템 및 공정에 관한 추가 정보 및 예시도 첨부된다.
일반 모델의 개발은 산업적인 플랫폼 공정에서 주요 배양 대사물을 측정하기 위해 라만 분광법을 적용할 수 있는 것을 입증한다. 또한, 이러한 모델은 공정이 GMP 규모로 1회 또는 2회만 런되는 임상 제조 작업에서 자동화된 공정 제어의 잠재력을 실현하는 데 도움이 될 수 있다. 마지막으로, 개발된 모델을 사용하여 강조 표시된 파라미터를 성공적으로 모니터링하면, 영양물 피드를 지속적으로 모니터링 및 제어하기 위해 인라인 라만 프로브를 사용하여, 임상 제조 규모 및 상업 제조 규모 둘 다에서 보다 강건하고 일관된 공정을 제공할 수 있다.
실시예 2
인간 중간엽 줄기 세포(MSC)를 마이크로 캐리어를 포함하는 교반 탱크 생물 반응기에서 배양했다. 배양 기간은 총 8일이었다. 처음 4일 동안, 세포를 2g/L의 글루코스 농도로 MSC 배지에서 배양했다. 배양 4일에서 시작하여 8일까지, 오래된 배지를 4g/L의 글루코스 농도의 새로운 MSC 배지로 대체하여 연속 관류를 개시했다. 상기 8일 동안에 걸쳐, 생물 반응기로부터 샘플을 주기적으로 채취하고, Nova BioProfile Flex 기구를 사용하여 새로운 샘플로부터 글루코스, 락테이트 및 암모늄 농도를 측정했다. Kaiser Optical System, Inc.의 RamanRXN2™ 시스템을 사용하여, 모델링에 사용된 420 내지 2,465cm-1의 특정 스펙트럼 범위를 통한 785nm 레이저 스캐닝으로 인라인 라만 스펙트럼을 수집했다.
모델 교정:
3.5L의 배양물을 함유하는 4개의 5L 생물 반응기를 모델 교정에 대하여 런했다. 라만 기구는 10초의 노출 시간을 사용했고, 각 측정에 대해 75개의 축적물을 수집했다. 측정은 30분마다 실시했다. 4회의 런으로 총 47개의 샘플(N = 47)을 Nova에서 측정했다.
전처리를, 표준 정상 변량(SNV)을 적용하는 단계, 디트렌딩하는 단계, 제1 미분을 적용하는 단계, 관심있는 분자와 상관하는 스펙트럼 범위를 선택하는 단계의 4개의 단계에 의해 실시했다. 도 7 내지 10은 검증 런들 중 하나에 적용되는 이러한 전처리 단계를 도시한다. 도 7은 원래의 처리되지 않은 스펙트럼을 도시한다. 도 8은 도 7과 동일하지만 SNV를 적용한 후의 스펙트럼을 도시한다. 도 9는 SNV 및 디트렌딩 후의 동일한 스펙트럼을 도시한다. 도 10은 SNV, 디트렌딩 및 1차 미분 적용 후의 동일한 스펙트럼을 도시한다.
이후, 처리된 스펙트럼을 부분 최소 제곱 회귀(PLS-R)를 사용하여 모델링했다. 표 1은 결과 모델의 통계를 요약한다. 값이 0이기 때문에 17개의 암모늄 샘플만이 PLS-R 모델에 포함되었다.
Figure pct00009
도 11 내지 13은 3개의 모델링된 분자 각각에 대한 모델에서 각각의 추가의 인자(잠재 변수)에 의해 설명되는 Y 편차의 증가 백분율을 도시한다. 도 14 내지 16은 3개의 모델링된 분자 각각에 대한 호텔링 T2 타원을 도시하며, 이는 교정 세트의 어떤 점이 95% 신뢰 구간 내부 대 외부에 있는지를 시각화한다.
이들 통계로부터의 결론은, 모델이, 공정에서 측정하고자 하는 농도 범위에 비해 상대적으로 작은 오차 내에서 글루코스, 락테이트 및 암모늄에 적합하다는 것이다.
모델 검증:
2 내지 3L 범위의 작업 용적을 갖는 7개의 3L 생물 반응기를 모델 검증에 대하여 런했다. 각각의 생물 반응기 런에서 평균 7개의 샘플을 취하여 총 50개의 샘플을 얻었다. 소수의 샘플은 락테이트 및 암모늄에 대한 기준 값이 누락되었다. 이는 특정 샘플에 대한 Nova의 기술적 문제 및 일부 0값 때문이었다. 검증 런에 대한 MSC 공정은 약간의 작은 예외를 제외하고는 교정에 사용된 공정와 대체로 동일하다: 상이한 배지 로트를 사용했으며, 검증 런을 젠타마이신을 사용하여 실시했으며, 검증 런이 공정의 일부 동안 소포제 첨가를 포함한다. 젠타마이신의 존재로 인해 라만 스펙트럼의 차이가 있었으며, 이는 화학량론에 의해 교정되었다.
표 2는 검증 런으로부터의 통계를 나타낸다. 7회 런 중 6회에서, 교정 통계에 의한 범위 예측 내에서 글루코스가 예측되었고, 7회째 런에서 RMSEP 값은 0.33으로, 0.29의 RMSECV보다 약간 높았다. 7회 런 중 6회에서, 교정 통계에 의한 범위 예측 내에서 락테이트가 예측되었고, 7회째 런에서 RMSEP 값은 0.19로, 0.17의 RMSECV보다 약간 높았다. 7회 런 모두에서, 암모늄은 1회째 런을 제외하고는 여전히 0.5g/L의 실제 값 내에 존재하지만 교정 통계에 의한 범위 예측을 벗어난 것으로 예측되었다. 이는 교정 세트에서의 보다 더 적은 수의 암모늄 샘플로 인한 것이었다. 세 가지 분자 모두에 대한 7회의 런 모두에 대한 예측 플롯은 도 17 내지 19에서 확인할 있다.
Figure pct00010
Figure pct00011
자동화된 라만-구동 제어:
자동화된 라만-구동 제어를 시험하기 위해 1회의 런을 실시했다. 측정 빈도를 증가시켜, 10분마다의 측정이 되었다. 이러한 런을 실시하기 전에, 라만 시스템을 생물 반응기 제어기에 통합하여, 라만을 통해 측정된 임의의 분자에 대한 설정점을 정의할 수 있었다.
상기 런에서, 이를 설명하기 위해 글루코스를 선택했다. MSC를 처음에 2g/L 글루코스에서 배양했다(도 20). 4일째에, 설정점을 4g/L로 정의하여 글루코스 농도를 수정했다. 제어기를 농축 글루코스 피드에 연결했으며, 이는 맞춤형 피드백 기능을 통해 자동으로 생물 반응기 내로 펌핑되었으며, 펌프 활성은 도 20에 적색 스파이크로 표시한다. 남은 4일의 배양 동안 설정점을 유지하기 위해 글루코스를 자동으로 피딩했다.
본원 명세서에 기재된 장치, 설비 및 방법은 원핵 생물 세포주 및/또는 진핵 생물 세포주를 포함하는 임의의 원하는 세포주를 배양하는데 적합하다. 또한, 양태들에서, 장치, 설비 및 방법은 현탁 세포 또는 고정-의존성(접착성) 세포를 배양하기에 적합하고, 약제 제품 및 생약제 제품, 예를 들면, 폴리펩티드 제품, 핵산 제품(예를 들면, DNA 또는 RNA), 또는 예를 들면 세포 치료 및/또는 바이러스 치료에 사용되는 세포 및/또는 바이러스의 생산을 위해 구성되는 생산 작업에 적합하다.
양태들에서, 세포는 재조합 치료 또는 진단 제품과 같은 제품을 발현하거나 생산한다. 하기에 보다 상세하게 개시되는 바와 같이, 세포에 의해 생성되는 생성물의 예는, 항체 분자(예를 들면, 단세포군 항체, 이중 특이적 항체), 항체 모방체(항원에 특이적으로 결합하지만 항체와는 구조적으로 관련되지 않은 폴리펩타이드 분자, 예를 들면, 예를 들면 DARPin, 어피바디(affibody), 아드넥틴 또는 IgNAR), 융합 단백질(예를 들면, Fc 융합 단백질, 키메라 사이토카인), 다른 재조합 단백질(예를 들면, 당화 단백질, 효소, 호르몬), 바이러스 치료제(예를 들면, 항암 종양 용해제, 유전자 요법 및 바이러스 면역 요법을 위한 바이러스 벡터), 세포 치료제(예를 들면, 다능성 줄기 세포, 중간엽 줄기 세포 및 성체 줄기 세포), 백신 또는 지질 캡슐화 입자(예를 들면, 엑소좀, 바이러스 유사 입자), RNA(예를 들면, siRNA) 또는 DNA(예를 들면, 플라스미드 DNA), 항생제 또는 아미노산을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 양태들에서, 장치, 설비 및 방법은 바이오시 밀러(biosimilar)를 생산하는데 사용될 수 있다.
언급된 바와 같이, 양태들에서, 장치, 설비 및 방법은, 진핵 세포, 예를 들면 포유 동물 세포 또는 하위(lower) 진핵 세포, 예를 들면 효모 세포 또는 사상 진균 세포, 또는 원핵 세포, 예를 들면 그람-양성 세포 또는 그람-음성 세포 및/또는 진핵 세포 또는 원핵 세포의 생성물, 예를 들면, 대규모 방식으로 진색 세포에 의해 합성된 단백질, 펩티드, 항생제, 아미노산, 핵산(예를 들면 DNA 또는 RNA)을 생성하게 한다. 본원 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 장치, 설비 및 방법은 벤치 규모, 파일럿 규모 및 전체 생산 규모 용량을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 원하는 용적 또는 생산 능력을 포함할 수 있다.
또한, 본원 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 장치, 설비 및 방법은, 교반 탱크, 에어 리프트, 섬유, 마이크로 섬유, 중공 섬유, 세라믹 매트릭스, 유동층(fluidized bed), 고정층(fixed bed) 및/또는 분류층(spouted bed) 생물 반응기를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 적합한 반응기(들)를 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 "반응기"는 발효기 또는 발효 유닛, 또는 임의의 다른 반응 용기를 포함할 수 있으며, 용어 "반응기"는 "발효기"와 상호교환적으로 사용된다. 예를 들면, 일부 양태에서, 예시적인 생물 반응기 유닛은 다음 중 하나 이상 또는 이들 모두를 실시할 수 있다: 영양물 및/또는 탄소 공급원 피딩, 적합한 기체(예를 들면, 산소)의 주입, 발효 또는 세포 배양 배지 유동의 유입 및 유출, 기체상 및 액체상의 분리, 온도 유지, 산소 및 CO2 수준 유지, pH 수준 유지, 진탕(예를 들면, 교반) 및/또는 세척/살균. 발효 유닛과 같은 예시적인 반응기 유닛은 유닛 내에 다수의 반응기를 포함할 수 있으며, 예를 들면 상기 유닛은 각각의 유닛에 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100개 이상의 생물 반응기를 가질 수 있고/있거나 설비는 시설 내에 단일 또는 다수의 반응기를 갖는 다수의 유닛을 포함할 수 있다. 다양한 양태에서, 생물 반응기는 배취, 반 피딩-배취, 피딩-배취, 관류 및/또는 연속 발효 공정에 적합할 수 있다. 임의의 적합한 반응기 직경이 사용될 수 있다. 양태들에서, 생물 반응기는 용적이 약 100mL 내지 약 50,000L일 수 있다. 비제한적인 예는, 100mL, 250mL, 500mL, 750mL, 1L, 2L, 3L, 4L, 5L, 6L, 7L, 8L, 9L, 10L, 15L, 20L, 25L, 30L, 40L, 50L, 60L, 70L, 80L, 90L, 100L, 150L, 200L, 250L, 300L, 350L, 400L, 450L, 500L, 550L, 600L, 650L, 700L, 750L, 800L, 850L, 900L, 950L, 1,000L, 1,500L, 2,000L, 2,500L, 3,000L, 3,500L, 4,000L, 4,500L, 5,000L, 6,000L, 7,000L, 8,000L, 9,000L, 10,000L, 15,000L, 20,000L 및/또는 50,000L의 용적을 포함한다. 또한, 적합한 반응기는 다중 사용, 단일 사용, 일회용 또는 비-일회용일 수 있으며, 금속 합금을 포함하는 임의의 적절한 재료, 예를 들면 스테인레스 스틸(예를 들면, 316L 또는 임의의 기타 적합한 스테인레스 스틸) 및 인코넬, 플라스틱 및/또는 유리로 형성될 수 있다.
본원 명세서에서 달리 언급되지 않는 한, 양태들에서, 본원 명세서에 개시된 장치, 설비 및 방법은 달리 언급되지 않은 임의의 적합한 유닛 작업 및/또는 장비, 예를 들면 분리, 정제 및 이러한 생성물들의 단리를 위한 작업 및/또는 장비를 포함할 수도 있다. 임의의 적합한 설비 및 환경, 예를 들면 전통적인 스틱-빌드 설비, 모듈식, 이동식 및 임시 설비, 또는 임의의 다른 적합한 구조, 설비 및/또는 레이아웃이 사용될 수 있다. 예를 들면, 일부 양태에서 모듈식 클린 룸이 사용될 수 있다. 추가로 그리고 달리 언급되지 않는 한, 본원 명세서에 개시된 장치, 시스템 및 방법이 단일 위치 또는 설비에서 하우징 및/또는 실시될 수 있거나, 또는 다르게는 개별 또는 다수의 위치 및/또는 설비에서 하우징 및/또는 실시될 수 있다.
비제한적 예로서 비제한적으로, 미국 공개공보 제2013/0280797호; 제2012/0077429호; 제2011/0280797호; 제2009/0305626호; 및 미국 특허 제8,298,054호; 제7,629,167호 및 제5,656,491호가 적절할 수 있는 예시적 설비, 장비 및/또는 시스템을 설명하며, 상기 문헌들은 그 전문이 인용에 의해 본원에 포함된다.
양태들에서, 세포는 진핵 세포, 예를 들면 포유 동물 세포이다. 포유 동물 세포는 예를 들면 인간 또는 설치류 또는 소 세포주 또는 세포 주(cell strain)일 수 있다. 이러한 세포, 세포주 또는 세포 주의 예는, 예를 들면, 마우스 골수종(NSO)-세포주, 차이니즈 햄스터 난소(CHO)-세포주, HT1080, H9, HepG2, MCF7, MDBK Jurkat, NIH3T3, PC12, BHK(베이비 햄스터 신장 세포), VERO, SP2/0, YB2/0, Y0, C127, L 세포, COS, 예를 들면, COS1 및 COS7, QC1-3, HEK-293, VERO, PER.C6, HeLA, EB1, EB2, EB3, 종양 용해성 또는 하이브리도마-세포주이다. 바람직하게는, 포유 동물 세포는 CHO-세포주이다. 일 양태에서, 세포는 CHO 세포이다. 일 양태에서, 세포는 CHO-K1 세포, CHO-K1 SV 세포, DG44 CHO 세포, DUXB11 CHO 세포, CHOS, CHO GS 녹아웃 세포, CHO FUT8 GS 녹아웃 세포, CHOZN 또는 CHO 유래 세포이다. CHO GS 녹아웃 세포(예를 들면, GSKO 세포)은 예를 들면, CHO-K1 SV GS 녹아웃 세포이다. CHO FUT8 녹아웃 세포는 예를 들면, Potelligent® CHOK1 SV(Lonza Biologics, Inc.)이다. 진핵 세포는 조류 세포, 세포주 또는 세포 주, 예를 들면 EBx® 세포, EB14, EB24, EB26, EB66 또는 EBvl3일 수도 있다.
일 양태에서, 진핵 세포는 줄기 세포이다. 줄기 세포는 예를 들면, 배아 줄기 세포(ESC), 성체 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포(iPSC), 조직 특이적 줄기 세포(예를 들면, 조혈 줄기 세포) 및 중간엽 줄기 세포(MSC)를 포함하는 다능성 줄기 세포일 수 있다.
일 양태에서, 세포는 세포 요법을 위한 것이다.
일 양태에서, 세포는 T 세포 또는 면역 세포를 포함할 수 있다. 예를 들면, 세포는 B 세포, 자연 살해 세포, 수지상 세포, 종양 침윤 림프구, 단핵구, 거핵구 등을 포함할 수 있다.
일 양태에서, 세포는 본원 명세서에 기재된 임의의 세포의 분화된 형태이다. 일 양태에서, 세포는 배양에서의 임의의 1차 세포로부터 유래된 세포이다.
양태들에서, 세포는 간세포, 예를 들면 인간 간세포, 동물 간세포 또는 비-실질 세포이다. 예를 들면, 세포는 부착 가능한(plateable) 대사 검증된 인간 간세포, 부착 가능한 유도 검증된 인간 간세포, 부착 가능한 Qualyst Transporter CertifiedTM 인간 간세포, 현탁액 검증된 인간 간세포(10-공여자 및 20-공여자 풀링된 간세포 포함), 인간 간 쿠퍼 세포, 인간 간 성상 세포, 개 간세포(단일 및 풀링된 비글 간세포 포함), 마우스 간세포(CD-1 및 C57BI/6 간세포 포함), 래트 간세포(Sprague-Dawley, Wistar Han and Wistar 간세포 포함), 원숭이 간세포(시노몰구스 또는 레서스 원숭이 간세포 포함), 고양이 간세포(국내 숏헤어 간세포 포함) 및 토끼 간세포(뉴질랜드 백색 간세포 포함)일 수 있다. 예시적인 간세포는 미국 노스캐롤라이나주 27709 6 데이비스 드라이브 리서치 트라이앵글 파크 소재의 트라이앵글 리서치 랩스 엘엘씨(Triangle Research Labs, LLC)로부터 상업적으로 입수가능하다.
일 양태에서, 진핵 세포는 하위 진핵 세포, 예를 들면, 효모 세포(예를 들면, 피키아속(예를 들면, 피키아 파스토리스, 피키아 메탄올리카, 피키아 클루이베리 및 피키아 안구스타), 코마가타엘라속(예를 들면, 코마가타엘라 파스토리스, 코마가타엘라 슈도파스토리스 또는 코마가타엘라 파피), 사카로마이세스속(예를 들면, 사카로마이세스 세레비사에, 세레비시아에, 사카로마이세스 클루이베리, 사카로마이세스 우바룸), 클루이베로마이세스속(예를 들면, 클루이베로마이세스 락티스, 클루이베로마이세스 막시아누스), 칸디다속(예를 들면, 칸디다 우틸리스, 칸디다 카카오이, 칸디다 보이디니), 게오트리춤속(예를 들면, 게오트리움 페르멘탄스), 한세눌라 폴리모르파, 야로위아 일포일티카 또는 스키조사카로마이세스 폼베이다. 피키아 파스토리스종이 바람직하다. 피키아 파스토리스 주의 예는 X33, GS115, KM71, KM71H 및 CBS7435이다.
일 양태에서, 진핵 세포는 진균 세포(예를 들면, 아스페르길루스(예를 들면, A. nigera, A. fumigatus, A. orzyae, A. nidula), 아크레모니움(A. thermophilum), 카에토미움(예를 들면, C. thermophilum), 크리소스포리움(예를 들면, C. thermophile), 코르디셉스(예를 들면, C. militaris), 코리나스쿠스, 스테노마이세스, 후사리움(예를 들면, F. oxysporum), 글로메렐라(예를 들면, G. graminicola), 하이포크레아(예를 들면, H. jecorina), 마그나포르테(예를 들면, M. orzyae), 마이셀리오프토라(예를 들면, M. thermophile), 넥트리아(예를 들면, N. heamatococca), 네우로스포라(예를 들면, N. crassa), 페니실리움, 스포로트리춤(예를 들면, S. thermophile), 티엘라비아(예를 들면, T. terrestris, T. heterothallica), 트리코데르마(T. reesei 등) 또는 베르티실리움(예를 들면, V. 달리아))이다.
일 양태에서, 진핵 세포는 곤충 세포(예를 들면, Sf9, Mimic™ Sf9, Sf21, High FiveTM(BT1-TN-5B1-4) 또는 BT1-Ea88 세포), 조류 세포(예를 들면, 암포라, 바실라리오피세아에, 두날리엘라, 클로렐라, 클라미도모나스, 시아노피타(시아노박테리아), 난노클로롭시스, 스피룰리나 또는 오크로모나스) 또는 식물 세포(예를 들면, 단일 자엽 식물(예를 들면, 옥수수, 쌀, 밀 또는 강아지풀) 또는 쌍떡잎 식물(예를 들면, 카사바, 감자, 대두, 토마토, 담배, 알팔파, 피스코미트렐라 파텐스 또는 아라비돕시스)로부터의 세포)이다.
일 양태에서, 세포는 박테리아 또는 원핵 세포이다.
양태들에서, 원핵 세포는 그람 양성 세포, 예를 들면 바실루스, 스트렙토마이세스, 스트렙토코쿠스, 스타필로코쿠스 또는 락토바실루스이다. 사용될 수 있는 바실러스는 예를 들면, B. subtilis, B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. natto 또는 B. megaterium이다. 양태들에서, 세포는 B. subtilis, 예를 들면 B. subtilis 3NA 및 B. subtilis 168이다. 바실루스는 예를 들면, 미국 오하이오주 43210-1214 콜럼버스 웨스트 12스 애브뉴 484 바이오로지컬 사이언스 556 소재의 바실루스 유전자 스톡 센터로부터 입수가능하다.
일 양태에서, 원핵 세포는 그람 음성 세포, 예를 들면 살모넬라종 또는 대장균, 예를 들면 TG1, TG2, W3110, DH1, DHB4, DH5a, HMS 174, HMS174(DE3), NM533, C600, HB101, JM109, MC4100, XL1-Blue 및 오리가미, 및 예를 들면 BL-21 또는 BL21(DE3)과 같은 대장균 B-주이며, 이들은 모두 상업적으로 입수가능하다.
적합한 숙주 세포는 예를 들면, DSMZ(독일 브라운슈바이크 소재의 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH) 또는 American Type Culture Collection(ATCC)과 같은 배양 컬렉션으로부터 상업적으로 입수가능하다.
양태들에서, 배양된 세포는 치료 용도의 단백질, 예를 들면, 항체, 예를 들면 단세포군 항체 및/또는 재조합 단백질을 생산하기 위해 사용된다. 양태들에서, 배양된 세포는 펩티드, 아미노산, 지방산 또는 다른 유용한 생화학적 중간체 또는 대사물을 생성한다. 예를 들면, 양태들에서, 약 4,000 내지 약 140,000dalton 초과의 분자량을 갖는 분자가 생성될 수 있다. 양태들에서, 이들 분자는 다양한 복잡성을 가질 수 있고, 당화를 포함하는 번역후 변형을 포함할 수 있다.
양태들에서, 단백질은 예를 들면, BOTOX, Myobloc, Neurobloc, Dysport(또는 보툴리눔 신경독소의 다른 혈청형), 알글루코시다제 알파, 답토마이신, YH-16, 코리오고나도트로핀알파, 필그라스팀, 세트로렐릭스, 인터루킨-2, 알데스류킨, 테셀률린, 데닐류킨 디프티톡스, 인터페론 알파-n3(주사), 인터페론 알파-nl, DL-8234, 인터페론, 선토리(감마-1a), 인터페론 감마, 티모신 알파 1, 타소네르민, DigiFab, ViperaTAb, EchiTAb, CroFab, 네시리티드, 아바타셉트, 알레파셉트, Rebif, 엡토테르민알파, 테리파라티드(골다공증), 칼시토닌 주사 가능(골 질환), 칼시토닌(코, 골다공증), 에타네르셉트, 헤모글로빈 글루타메르 250(소), 드로트레코긴 알파, 콜라게나제, 카르페리티드, 재조합 인간 표피 성장 인자(국소 겔, 상처 치유), DWP401, 다르베포에틴 알파, 에포에틴 오메가, 에포에틴 베타, 에포에틴 알파, 데시루딘, 레피루딘, 비발리루딘, 노나코그 알파, 모노닌, 엡타코그 알파(활성화), 재조합 인자 VIII+VWF, 리콤비네이트, 재조합 인자 VIII, 인자 VIII(재조합), 알프나메이트, 옥토코그 알파, 인자 VIII, 팔리페르민, 인디키나제, 테넥테플라제, 알테플라제, 파미테플라제, 레테플라제, 나테플라제, 몬테플라제, 폴리트로핀 알파, rFSH, hpFSH, 마이카펀진, 페그필그라스팀, 레노그라스팀, 나르토그라스팀, 세르모렐린, 글루카곤, 엑세나타이드, 프람린타이드, 이니글루세라제, 갈설파제, 류코트로핀, 몰그라모스티른, 트립토렐린 아세테이트, 히스트렐린(피하 임플란트, Hydron), 데슬로렐린, 히스트렐린, 나파렐린, 류프롤라이드 지속 방출 데포(depot)(ATRIGEL), 류프롤라이드 임플란트(DUROS), 고세렐린, 에우트로핀, KP-102 프로그램, 소마트로핀, 메카세르민(성장 실패), 엔파비르티드, Org-33408, 인슐린 글라진, 인슐린 글루리신, 인슐린(흡입), 인슐린 리스프로, 인슐린 데테르니르, 인슐린(볼, RapidMist), 메카세민 린파베이트, 아나킨라, 셀몰류킨, 99 mTc-압시티드 주사, 미엘로피드, 베타세론, 글라티라메르 아세테이트, Gepon, 사르그라모스팀, 오프렐베킨, 인간 백혈구 유래 알파 인터페론, Bilive, 인슐린(재조합), 재조합 인간 인슐린, 인슐린 아스파르트, 메카제닌, 로페론-A, 인터페론-알파 2, 알파페론, 인터페론 알파콘-1, 인터페론 알파, 아보넥스의 재조합 인간 황체 형성 호르몬, 도르나제 알파, 트라페민, 지코노타이드, 탈티렐린, 디보테르민알파, 아토시반, 베카플러민, 에피피바타이드, 제마이라, CTC-111, Shanvac-B, HPV 백신(4가), 옥트레오타이드, 란레오타이드, 안체스티른, 아갈시다제 베타, 아갈시다제 알파, 라로니다제, 프레자티드 구리 아세테이트(국소 겔), 라스부리카제, 라니비주맙, 액티뮨, PEG-인트론, 트리코민, 재조합 집 먼지 진드기 알레르기 탈감작 주사, 재조합 인간 부갑상선 호르몬(PTH) 1-84(sc, 골다공증), 에포에틴 델타, 형질 전환 항트롬빈 III, 그랜디트로핀, 비트라제, 재조합 인슐린, 인터페론-알파(경구 로젠지), GEM-21S, 바프레오타이드, 이두르설파제, 옴나파트릴라트, 재조합 혈청 알부민, 세르톨리주맙 페골, 글루카피다제, 인간 재조합 C1 에스테라제 억제제(혈관 부종), 라노테플라제, 재조합 인간 성장 호르몬, 엔푸비르티드(바늘 없는 주사, Biojector 2000), VGV-1, 인터페론(알파), 루시낙탄트, 아빕타딜(흡입, 폐 질환), 이카티반트, 에칼란티드, 오미가난, 아우로그랍, 펙시가난 아세테이트, ADI-PEG-20, LDI-200, 데가릴릭스, 신트레델린베수도톡스, Favld, MDX-1379, ISAtx-247, 리라글루티드, 테리파라티드(골다공증), 티파코긴, AA4500, T4N5 리포좀 로션, 카투막소맙, DWP413, ART-123, 크리살린, 데스모테플라제, 아메디플라제, 코리폴리트로핀 알파, TH-9507, 테두글루티드, Diamyd, DWP-412, 성장 호르몬(지속 방출 주사), 재조합 G-CSF, 인슐린(흡입, AIR), 인슐린(흡입, Technosphere), 인슐린(흡입, AERx), RGN-303, DiaPep277, 인터페론 베타(C형 간염 바이러스 감염(HCV)), 인터페론 알파-n3(경구), 벨라타셉트, 경피 인슐린 패치, AMG-531, MBP-8298, 세레셉트, 오페베칸, AIDSVAX, GV-1001, 림포스칸, 란피르나제, 리폭시산, 루수풀티드, MP52(베타-인산삼칼슘 캐리어, 골 재생성), 흑색종 백신, 시풀류셀-T, CTP-37, 인세지아, 비테스펜, 인간 트롬빈(냉동, 수술 출혈), 트롬빈, TransMID, 알피멥라제, 푸리카제, 테를리프레신(정맥내, 간장 증후군), EUR-1008M, 재조합 FGF-I(주사 가능, 혈관 질환), BDM-E, 로티갑티드, ETC-216, P-113, MBI-594AN, 두라마이신(흡입, 낭포성 섬유증), SCV-07, OPI-45, 엔도스타틴, 안지오스타틴, ABT-510, 보우먼 버크 억제제 농축물, XMP-629, 99 mTc-하이닉-아넥신 V, 카할라라이드 F, CTCE-9908, 테베렐릭스(서방출), 오자렐릭스, 로니뎁신, BAY-504798, 인터루킨 4, PRX-321, 펩스칸, 이브옥타데킨, 락토페린, TRU-015, IL-21, ATN-161, 실렌지타이드, 알부페론, 비파식스, IRX-2, 오메가 인터페론, PCK-3145, CAP-232, 파시레오타이드, huN901-DMI, 난소 암 면역 치료 백신, SB-249553, Oncovax-CL, OncoVax-P, BLP-25, CerVax-16, 다중 에피토프 펩티드 흑색종 백신(MART-1, gp100, 티로시나제), 네미피타이드, rAAT(흡입), rAAT(피부과), CGRP(흡입, 천식), 페그수네르셉트, 티모신 베타 4, 플리타이뎁신, GTP-200, 라모플라닌, GRASPA, OBI-1, AC-100, 연어 칼시토닌(경구, Eligen), 칼시토닌(경구, 골다공증), 엑사모렐린, 카프로모렐린, 카데바, 벨라페르민, 131I-TM-601, KK-220, T-10, 울라리타이드, 데펠레스타트, 헤마타이드, 크리살린(국소), rNAPc2, 재조합 인자 V111(PEG화 리포좀), bFGF, PEG화 재조합 스타필로키나제 변이체, V-10153, SonoLysis Prolyse, NeuroVax, CZEN-002, 섬 세포 신생 요법, rGLP-1, BIM-51077, LY-548806, 엑세나타이드(제어 방출, Medisorb), AVE-0010, GA-GCB, 아보렐린, ACM-9604, 리나클로티드 아세테이트, CETi-1, Hemospan, VAL(주사 가능), 속효성 인슐린(주사 가능, Viadel), 비강내 인슐린, 인슐린(흡입), 인슐린(경구, Eligen), 재조합 메티오닐 인간 렙틴, 피트라킨라(피하 주사, 습진), 피트라킨라(흡입 건조 분말, 천식), 멀티킨, RG-1068, MM-093, NBI-6024, AT-001, PI-0824, Org-39141, Cpn10(자가 면역 질환/염증), 탈락토페린(국소), rEV-131(안과), rEV-131(호흡기 질환), 경구 재조합 인간 인슐린(당뇨병), RPI-78M, 오프렐베킨(경구), CYT-99007, CTLA4-Ig, DTY-001, 발라테그라스트, 인터페론 알파-n3(국소), IRX-3, RDP-58, 타우페론, 담즙 염 자극 리파제, 메리스파제, 알라린 포스파타제, EP-2104R, 멜라노탄-II, 브레멜라노타이드, ATL-104, 재조합 인간 마이크로플라스민, AX-200, SEMAX, ACV-1, Xen-2174, CJC-1008, 디노르핀 A, SI-6603, LAB GHRH, AER-002, BGC-728, 말라리아 백신(비로좀, PeviPRO), ALTU-135, 파르보바이러스 B19 백신, 인플루엔자 백신(재조합 뉴라미니다제), 말라리아/HBV 백신, 탄저병 백신, Vacc-5q, Vacc-4x, HIV 백신(경구), HPV 백신, Tat Toxoid, YSPSL, CHS-13340, PTH(1-34) 리포좀 크림(Novasome), Ostabolin-C, PTH 유사체(국소, 건선), MBRI-93.02, MTB72F 백신(결핵), MVA-Ag85A 백신(결핵), FARA04, BA-210, 재조합 흑사병 FIV 백신, AG-702, OxSODrol, rBetV1, Der-p1/Der-p2/Der-p7 알레르기 항원 표적 백신(먼지 진드기 알레르기), PR1 펩티드 항원(백혈병), 돌연변이 ras 백신, HPV-16 E7 리포펩티드 백신, 미로 백신(선암종), CML 백신, WT1-펩티드 백신(암), IDD-5, CDX-110, 펜트리, Norelin, CytoFab, P-9808, VT-111, icrocaptide, 텔베르민(피부과, 당뇨병성 족부 궤양), 루핀트리비르, 레티큘로스, rGRF, HA, 알파-갈락토시다제 A, ACE-011, ALTU-140, CGX-1160, 안지오텐신 치료 백신, D-4F, ETC-642, APP-018, rhMBL, SCV-07(경구, 결핵), DRF-7295, ABT-828, ErbB2-특이적 면역 독소(항암), DT3SSIL-3, TST-10088, PRO-1762, 콤보톡스, 콜레시스토키닌-B/가스트린 수용체 결합 펩티드, 111In-hEGF, AE-37, 트라스니주맙-DM1, 길항제 G, IL-12(재조합), PM-02734, IMP-321, rhIGF-BP3, BLX-883, CUV-1647(국소), L-19 기반 방사선 면역 치료제(암), Re-188-P-2045, AMG-386, DC/1540/KLH 백신(암), VX-001, AVE-9633, AC-9301, NY-ESO-1 백신(펩티드), NA17.A2 펩티드, 흑색종 백신(펄스 항원 치료제), 전립선 암 백신, CBP-501, 재조합 인간 락토페린(안구 건조), FX-06, AP-214, WAP-8294A(주사 가능), ACP-HIP, SUN-11031, 펩티드 YY [3-36](비만, 비강내), FGLL, 아타시셉트, BR3-Fc, BN-003, BA-058, 인간 부갑상선 호르몬 1-34(비강, 골다공증), F-18-CCR1, AT-1100(복강 질환/당뇨병), JPD-003, PTH(7-34) 리포좀 크림(Novasome), 두라마이신(안과, 안구 건조), CAB-2, CTCE-0214, 글리코PEG화 에리트로포이에틴, EPO-Fc, CNTO-528, AMG-114, JR-013, 인자 XIII, 아미노칸딘, PN-951, 716155, SUN-E7001, TH-0318, BAY-73-7977, 테베렐릭스(즉시 방출), EP-51216, hGH(제어 방출, Biosphere), OGP-I, 시푸비르타이드, TV4710, ALG-889, Org-41259, rhCC10, F-991, 티모펜틴(폐 질환), r(m)CRP, 간 선택성 인슐린, 서발린, L19-IL-2 융합 단백질, 엘라핀, NMK-150, ALTU-139, EN-122004, rhTPO, 트롬보포이에틴 수용체 작용제(혈소판 감소 장애), AL-108, AL-208, 신경 성장 인자 길항제(통증), SLV-317, CGX-1007, INNO-105, 경구 테리파라티드(Eligen), GEM-OS1, AC-162352, PRX-302, LFn-p24 융합 백신(Therapore), EP-1043, S 폐렴 소아 백신, 말라리아 백신, 수막염균 그룹 B 백신, 신생아 그룹 B 연쇄상구균 백신, 탄저균 백신, HCV 백신(gpE1+gpE2+MF-59), 중이염 요법, HCV 백신(핵 항원+ISCOMATRIX), hPTH(1-34)(경피, ViaDerm), 768974, SYN-101, PGN-0052, 아비스쿰닌, BIM-23190, 결핵 백신, 다중-에피토프 티로시나제 펩티드, 암 백신, 엔카스팀, APC-8024, GI-5005, ACC-001, TTS-CD3, 혈관-표적화 TNF(고형 종양), 데스모프레신(협측 제어 방출), 오너셉트 및 TP-9201이다.
일부 양태에서, 폴리펩티드는 아달리무맙(HUMIRA), 인플릭시맙(REMICADE™), 리툭시맙(RITUXAN™/MAB THERA™) 에타너셉트(ENBREL™), 베바시주맙(AVASTIN™), 트라스투주맙(HERCEPTIN™), 페그릴그라스팀(NEULASTA™), 또는 바이오시밀러 및 바이오베터(biobetter)를 포함하는 임의의 다른 적합한 폴리펩티드이다.
다른 적합한 폴리펩티드는 하기에 그리고 US2016/0097074의 표 1에 열거된 것들이다.
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
양태들에서, 폴리펩티드는 표 2에 나타낸 바와 같은 호르몬, 혈액 클로팅(clotting)/응고 인자, 사이토카인/성장 인자, 항체 분자, 융합 단백질, 단백질 백신 또는 펩티드이다.
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
양태들에서, 단백질은 다중 특이적 단백질, 예를 들면 표 3에 나타낸 바와 같은 이중 특이적 항체이다.
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
본 발명에 대한 이러한 및 다른 개질 및 변형은 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 당업자에 의해 실시될 수 있으며, 이는 첨부된 청구범위에 보다 구체적으로 명시되어 있다. 또한, 다양한 양태들의 측면이 전체적으로 또는 부분적으로 모두 상호교환될 수 있는 것을 이해해야 한다. 또한, 당업자는, 상기 개시 한 설명이 단지 예시일 뿐이며, 본 발명을 제한하여 첨부된 청구범위에 추가로 기술하고자 하는 것이 아닌 것을 이해할 것이다.

Claims (31)

  1. 세포 배양물을 증식시키기 위한 방법으로서,
    생물 반응기(bioreactor) 내의 세포 배양물을 응집성 광원에 대해 노출시켜 광을 산란시키는 단계;
    라만 분광법을 사용하여 상기 산란된 광의 강도를 측정하는 단계;
    상기 측정된 산란된 광의 강도에 기초하여, 제어기(controller)를 사용하여 상기 세포 배양물 중의 파라미터의 농도를 결정(determine)하고, 상기 파라미터를 사전 설정된 한계 내로 유지하기 위해, 상기 결정된 파라미터의 농도에 기초하여, 상기 제어기가 상기 생물 반응기에 대한 파라미터 영향 물질(parameter influencing substance)의 유동을 선택적으로 증가시키거나 감소시키는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 파라미터의 농도가, 광 강도 데이터를 기준 데이터와 비교하여 결정되는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제어기가 예측 모델을 포함하며, 상기 예측 모델이, 상기 결정된 파라미터의 농도에 기초하여 상기 파라미터의 장래의 농도를 추정하고, 계산된 장래의 농도에 기초하여 상기 파라미터를 사전 설정된 한계 내로 유지하기 위해, 상기 생물 반응기에 대한 상기 파라미터 영향 물질의 유동을 선택적으로 증가시키거나 감소시키는, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파라미터가 글루코스, 락테이트, 글루타메이트, 암모늄, 생존 세포 농도, 총 세포 농도 또는 생성물 농도를 포함하는, 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 2개의 상이한 파라미터들의 농도가, 상기 측정된 산란된 광 강도에 기초하여 상기 제어기에 의해 세포 배양물 중에서 결정되고, 상기 적어도 2개의 파라미터를 사전 설정된 한계 내로 유지하기 위해, 상기 생물 반응기에 대한 하나 이상의 파라미터 영향 물질의 유동을 선택적으로 증가시키거나 감소시키는, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 적어도 2개의 상이한 파라미터가 글루코스, 락테이트, 글루타메이트, 암모늄, 생존 세포 농도, 총 세포 농도 또는 생성물 농도를 포함하는 그룹으로부터 선택되는 2개의 파라미터를 포함하는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파라미터 영향 물질이 영양물 배지를 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 영양물 배지가 탄수화물 공급원, 아미노산, 비타민, 지질, 단백질, 펩티드 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물이 포유 동물 세포를 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물이 줄기 세포를 포함하는, 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물이 T 세포 또는 면역 세포를 포함하는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 측정된 산란된 광 강도의 통계 분석을 실시하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 통계 분석은 표준 정규 변량을 적용하는 단계, 1차 미분을 적용하는 단계 및 상기 파라미터와 상관하는 스펙트럼 범위를 선택하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 표준 정규 변량을 적용한 후, 디트렌딩(detrending)하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 실시된 통계 분석이 최소 제곱 회귀법을 사용하여 모델링되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물이 배취 공정으로 약 2일 내지 약 28일 동안 증식된 후 수확되는, 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 파라미터의 농도는 상기 제어기가 상기 생물 반응기에 대한 파라미터 영향 물질의 유동을 선택적으로 증가시키거나 감소시키기 약 4일 전 내지 약 12시간 전 동안 결정되는, 방법.
  17. 제3항에 있어서, 상기 파라미터의 농도는 상기 제어기가 상기 파라미터의 장래의 농도를 추정하기 약 4일 전 내지 약 12시간 전 동안 결정되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파라미터의 농도를 결정하기 위해, 상기 세포 배양물이 응집성 광원에 4시간마다 적어도 1회 노출되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파라미터의 농도를 결정하기 위해, 상기 세포 배양물이 응집성 광원에 1시간마다 적어도 1회 노출되는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 응집성 광원이 레이저를 포함하고, 상기 레이저는 약 400 내지 약 1,500nm, 예를 들면, 약 700 내지 약 850nm의 파장의 광을 방출하는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물이 인 라인(in line)으로 응집성 광원에 노출되는, 방법.
  22. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 배양물이 앳 라인(at line)으로 응집성 광원에 노출되는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어기는, 상기 파라미터 영향 물질의 유동을 선택적으로 증가시키거나 감소시키기 위한 제어 모델로 프로그래밍되고, 상기 제어 모듈은, 상이한 유형의 세포들을 함유하는 상이한 세포 배양물들 내에서 상기 파라미터를 사전 설정된 한계들 내로 유지할 수 있는, 방법.
  24. 제3항에 있어서, 상기 예측 모델은, 기준 시험(reference testing) 동안 적어도 하나의 파라미터에서의 상관 관계를 파괴함에 의해 생성되는, 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법으로부터 생성되는 세포 배양물이, 생존 세포 수를 총 세포 수로 나누어 결정되는 생존율을 약 0.8 초과, 예를 들면, 약 0.9 초과로 갖는, 방법.
  26. 세포 배양물을 증식시키기 위한 시스템으로서,
    세포 배양물을 수용하기 위한 중공 내부를 한정하는 생물 반응기로서, 상기 생물 반응기가 상기 중공 재료로부터 물질들을 피딩(feeding)하고/피딩하거나 제거하기 위한 복수의 포트(port)를 포함하는, 상기 생물 반응기;
    상기 생물 반응기의 상기 중공 내부에 영양물 배지를 피딩하기 위한 영양물 배지 피드(feed)로서, 상기 생물 반응기 상의 상기 포트들 중 적어도 하나와 유체 통신하는, 상기 영양물 배지 피드;
    상기 생물 반응기의 상기 중공 내부와 통신하는 광 운반 장치로서, 광을 상기 생물 반응기로 운반하고 또한 광을 상기 생물 반응기를 벗어나도록 운반하는, 상기 광 운반 장치;
    상기 생물 반응기 중의 세포 배양물을 광 빔에 노출시키기 위해 상기 광 운반 장치와 통신하는 응집성 광원;
    상기 생물 반응기 중의 세포 배양물이 상기 응집성 광원에 의해 광 빔에 노출된 후, 상기 생물 반응기의 상기 중공 내부로부터 산란 광을 수신하기 위해 상기 광 운반 장치와 통신하는 라만 분광계로서, 상기 라만 분광계가 상기 산란된 광의 강도를 측정하도록 구성된, 상기 라만 분광계; 및
    상기 라만 분광계 및 상기 영양물 배지 피드와 통신하는 제어기로서, 상기 제어기가, 상기 라만 분광계로부터 수신된 광 강도 데이터에 기초하여 상기 생물 반응기의 상기 중공 내부에 함유된 세포 배양물의 파라미터의 농도를 결정하도록 구성되고, 또한 상기 제어기가, 상기 파라미터의 결정된 농도에 기초하여, 상기 파라미터를 사전 설정된 한계 내로 유지하기 위해 상기 생물 반응기 내로의 영양물 배지의 유동을 선택적으로 증가시키거나 감소시키기 위해 상기 영양물 배지 피드를 제어하도록 구성된, 상기 제어기를 포함하는, 시스템.
  27. 제26항에 있어서, 상기 응집성 광원이, 약 400 내지 약 1,500nm, 예를 들면 약 700 내지 약 850nm의 파장의 광 빔을 방출하도록 구성된 레이저를 포함하는, 시스템.
  28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 상기 제어기가 하나 이상의 마이크로 프로세서를 포함하는, 시스템.
  29. 제26항, 제27항 또는 제28항에 있어서, 상기 제어기가 예측 모델을 포함하고, 상기 예측 모델은, 상기 파라미터의 결정된 농도에 기초하여 상기 파라미터의 피쳐 농도(feature concentration)를 추정하고, 계산된 피쳐 농도에 기초하여 상기 파라미터를 사전 설정된 한계 내로 유지하기 위해 상기 생물 반응기에 영양물 배지의 유동을 선택적으로 증가시키거나 감소시키기 위해 상기 영양물 배지 피드를 제어하는, 시스템.
  30. 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 파라미터가 글루코스, 락테이트, 글루타메이트, 암모늄, 생존 세포 농도, 총 세포 농도, 생성물 농도 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 시스템.
  31. 제26항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제어기가 상기 광 강도 데이터를 전처리하도록 구성되고, 상기 광 강도 데이터는, 표준 정규 변량을 적용하고, 1차 미분을 적용하고, 디트렌딩하고, 상기 파라미터와 상관하는 특별한 범위를 선택하는 단계에 의해 처리되는, 시스템.
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