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CN114245869A - 监测细胞培养基的方法 - Google Patents

监测细胞培养基的方法 Download PDF

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CN114245869A
CN114245869A CN202080038389.2A CN202080038389A CN114245869A CN 114245869 A CN114245869 A CN 114245869A CN 202080038389 A CN202080038389 A CN 202080038389A CN 114245869 A CN114245869 A CN 114245869A
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CN
China
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cell culture
culture medium
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Application number
CN202080038389.2A
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P·阿巴迪安
K·阿龙
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Bristol Myers Squibb Co
Original Assignee
Bristol Myers Squibb Co
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Publication date
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Abstract

本公开文本提供了一种使用拉曼光谱法指纹识别和分析细胞培养样品以检测细胞培养基制备错误、降解或可能使其对于细胞培养用途是次优的培养基中的其他变化的方法。

Description

监测细胞培养基的方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2019年5月23日提交的美国临时申请号62/852,230的优先权权益，并且将其通过引用以其整体特此并入。
背景技术
就劳动力损失和生产延迟而言，用于上游生物加工的次优培养基可能会造成数十万美元的损失。当不正确制备时，即当特定组分被意外排除或以错误量添加或当超过其最佳有效期使用时，培养基被认为是次优的。培养基质量是一个重要的性能参数，所述参数通常是在14天的生产生物反应器过程(每天取样和补料，这是时间和资源密集型的)中通过HPLC功能测试(诸如通过氨基酸分析)进行评价的。次优培养基的使用可能会导致效价降低和/或产品属性改变。然而，重要的是具有能够正确测量培养基组成的分析方法，以确保关键组分的物理存在并且经由测量重要的降解标记物来监测有效期。因此，需要开发能够测量培养基状况的成本有效且准确的方法。
发明内容
本公开文本涉及一种监测细胞培养基变化的方法，所述变化可能影响所述细胞培养基在任何环境中使细胞生长的有效性。本公开文本的一方面涉及细胞培养基样品的拉曼(Raman)光谱的测量，以将所述拉曼光谱与所述细胞培养基组分的已知光谱进行比较。本公开文本的方法涉及一种用于使用拉曼光谱法指纹识别细胞培养基和/或鉴定细胞培养基的最佳储存条件的方法，所述方法包括：收集所述细胞培养基的拉曼光谱，所述细胞培养基含有一种或多种组分的混合物，其中将所述细胞培养基的拉曼光谱与和所述一种或多种组分中的每一种相关的一个或多个参考光谱进行比较或与和参考培养基组合物相关的一个或多个参考光谱进行比较。本公开文本的方法还涉及一种用于使用拉曼光谱法鉴定细胞培养基中特定组分的变化率和/或实时监测细胞培养基的变化的方法，所述方法包括：收集所述细胞培养基的拉曼光谱(“收集光谱”)，其中将所述细胞培养基的拉曼光谱与和一种或多种组分中的每一种相关的参考光谱进行比较。
在一些方面，所述参考光谱将没有降解。在一些方面，至少约每一小时、至少约每两小时、至少约每三小时、至少约每四小时、至少约每五小时、至少每六小时、至少每七小时、至少约每八小时、至少约每九小时、至少约每十小时、至少约每11小时、至少约每12小时、至少约每13小时、至少约每14小时、至少约每15小时、至少约每16小时、至少约每17小时、至少约每18小时、至少约每19小时、至少约每20小时、至少约每21小时、至少约每22小时、至少约每23小时或至少约每24小时收集所述细胞培养基的拉曼光谱。
在一些方面，所述拉曼光谱具有至少5个数据点、至少10个数据点、至少15个数据点、至少16个数据点、至少17个数据点、至少18个数据点、至少19个数据点、至少20个数据点、至少21个数据点、至少22个数据点、至少23个数据点、至少24个数据点、至少25个数据点、至少26个数据点、至少27个数据点、至少28个数据点、至少29个数据点、至少30个数据点、至少31个数据点、至少32个数据点、至少33个数据点、至少34个数据点、至少35个数据点、至少36个数据点、至少37个数据点、至少38个数据点、至少39个数据点、至少40个数据点、至少41个数据点、至少42个数据点、至少43个数据点、至少44个数据点、至少45个数据点、至少46个数据点、至少47个数据点、至少48个数据点、至少49个数据点或至少50个数据点的平均值。在一些方面，每10秒、每15秒、每20秒、每25秒、每30秒、每35秒、每40秒、每45秒、每50秒、每55秒或每60秒测量每个数据点。
本公开文本的方法还涉及对从所述样品收集的原始拉曼光谱的分析。在一些方面，所述拉曼光谱通过多变量分析进行分析。在一些方面，所述多变量分析是主成分分析(PCA)。在一些方面，所述PCA产生所述拉曼光谱的PC得分。在一些方面，所述多变量分析是偏最小二乘法分析(PLS)，并且其中所述分析产生校准预测模型。在一些方面，所述方法进一步包括比较所述细胞培养基的收集光谱。在一些方面，所述比较包括所述收集光谱的PC得分与所述参考光谱的参考PC得分的比较。
在一些方面，所述方法进一步包括当所述收集光谱的PC得分与所述参考光谱的参考PC得分相差至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约26、至少约27、至少约28、至少约29或至少约30时，确定所述培养基被降解。在一些方面，所述方法进一步包括当所述收集光谱的PC得分高于所述参考光谱的参考PC得分时，确定所述细胞培养基被降解。在一些方面，所述方法进一步包括当所述收集光谱的PC得分低于所述参考光谱的参考PC得分时，确定所述细胞培养基被降解。
在一些方面，所述细胞培养基被降解，并且与未经降解的培养基相比，所述经降解的细胞培养基使培养中的细胞的活力降低约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。
在一些方面，所述细胞培养基被降解，并且与未经降解的培养基相比，所述经降解的细胞培养基使培养中的细胞的活细胞密度降低约1x106个细胞/mL、约2x106个细胞/mL、约3x106个细胞/mL、约4x106个细胞/mL、约5x106个细胞/mL、约6x106个细胞/mL、约7x106个细胞/mL、约8x106个细胞/mL、约9x106个细胞/mL、约10x106个细胞/mL、约11x106个细胞/mL或约12x106个细胞/mL。
在一些方面，所述细胞培养基被降解，并且与未经降解的培养基相比，所述经降解的细胞培养基使培养中的细胞的抗体产生效价降低约0.1g/L、约0.2g/L、约0.3g/L、约0.4g/L、约0.5g/L、约0.6g/L、约0.7g/L、约0.8g/L、约0.9g/L、约1.0g/L、约1.1g/L、约1.2g/L、约1.3g/L、约1.4g/L、约1.5g/L、约1.6g/L、约1.7g/L、约1.8g/L、约1.9g/L、约2.0g/L、约2.1g/L、约2.2g/L、约2.3g/L、约2.4g/L、约2.5g/L、约2.6g/L、约2.7g/L、约2.8g/L、约2.9g/L或约3.0g/L。
在一些方面，将标记物添加到所述细胞培养基中。在一些方面，所述标记物选自赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、天冬酰胺(Asn)和精氨酸(Arg)。在一些方面，所述标记物是酪氨酸。在一些方面，所述标记物不是葡萄糖。在一些方面，所述标记物不是乳酸盐。在一些方面，所述标记物选自氰钴胺(B12)、叶酸(B9)、烟酰胺(B3)、吡哆醛HCl(B6(AL))和吡哆醇HCl(B6(INE))。
在一些方面，在以下范围内测量所述拉曼光谱：从约500cm-1至约1700cm-1、从约500cm-1至约1800cm-1、从约500cm-1至约1900cm-1、从约500cm-1至约2000cm-1、从约500cm-1至约2100cm-1、从约500cm-1至约2200cm-1、从约500cm-1至约2300cm-1、从约500cm-1至约2400cm-1、从约500cm-1至约2500cm-1、从约500cm-1至约2600cm-1、从约500cm-1至约2700cm-1、从约500cm-1至约2800cm-1、从约500cm-1至约2900cm-1或从约500cm-1至约3000cm-1。在一些方面，在500cm-1至3000cm-1的范围内测量所述拉曼光谱。
在一些方面，所述方法进一步包括当所述收集光谱的PC得分与所述参考光谱的参考PC得分相同或与其相似约10或更少、约9或更少、约8或更少、约7或更少、约6或更少、约5或更少、约4或更少、约3或更少、约2或更少或者约1或更少时，确定所述细胞培养基是稳定的。
在一些方面，确定所述细胞培养基储存约八天、约九天、约十天、约11天、约12天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、约30天、约一个月、约1.5个月、约40天、约50天、约60天、约两个月、约70天、约80天、约90天、约三个月、约100天、约110天、约120天、约4个月、约五个月或约六个月。
本公开文本还涉及一种用于使用能够分析细胞培养基的设备进行拉曼光谱测量的设备。在一些方面，所述设备包含所述细胞培养基中一种或多种组分的混合物，所述设备包括：细胞培养基样品架，用于保持细胞培养基样品；激光源，用于照射由所述细胞培养基样品架保持的所述细胞培养基样品；粒子运动检测器，定位为检测在由所述细胞培养基样品架保持的所述细胞培养基样品的所述细胞培养基中的一种或多种组分的运动；和光谱检测器，定位为接收由所述激光源照射产生的来自所述细胞培养基样品的光谱。
附图说明
图1示出了对应于红外(IR)吸收、瑞利(Rayleigh)散射和拉曼散射(斯托克斯(Stokes)和反斯托克斯)过程的振动能级之间跃迁的能量图。E0和E1(E0+hνm)是电子基态和激发态。ν0和νm是振动基态和激发态。
图2A、图2B和图2C.图2A示出了与补料培养基袋连接并且使用蠕动泵运行通过拉曼的T型连接器的示意图，并且图2B示出了T型连接器设置和连接管的图片。图2C示出了用于离线测量的玻璃小瓶和琥珀色烧杯。将玻璃小瓶用铝箔覆盖，并且将琥珀色烧杯用黑色聚丙烯覆盖以消除光干扰。T型连接器是316L的不锈钢中试规模流通池，具有用于12mm OD探针的3/4英寸卫生法兰入口/出口。
图3示出了PC1得分与实时补料培养基分析的测量次数的关系图。使用拉曼光谱法每3小时进行一次测量。例如，在X轴上，5的测量指示距离初始监测15小时的测量。箭头表示在初始监测后大约90小时，拉曼光谱开始发生变化时的测量。
图4A和图4B.图4A示出了PC1载荷与实时补料培养基分析的拉曼位移的关系，所述拉曼位移表示在培养基中发生主要变化时的波数。图4B示出了酪氨酸晶体的拉曼光谱。(Freire,P.等人,Raman Spectroscopy of Amino Acid Crystals.Raman Spectroscopyand Applications,2017)。
图5示出了添加到B9基础培养基中的不同磷酸盐水平的PC1得分图。第一个点示出了1.5g/L的磷酸盐水平，并且最后一个点表示具有3g/L磷酸盐的样品。
图6示出了补料/基础培养基强制降解的PC1-PC2平面得分图。
图7示出了表示由于热(H)或光(L)强制降解以及在4℃下的正常老化通过拉曼测试在基础培养基中检测到的变化的PC2得分图。储存时间以周(例如，1W)或月(3M)指示。注意3M时间点未按标度表示。
图8A、图8B和图8C示出了当使用不同老化的基础培养基和新鲜的补料培养基时的产量VCD(图8A)、活力(图8B)和抗体效价(图8C)。
图9示出了由于光(L)和热(H)降解的基础培养基的氨基酸水平的变化。虚线示出了由于光降解的变化趋势，并且实线表示由于热降解的变化。
图10示出了随时间(W表示周或M表示月)由于光(L)和热(H)降解的补料培养基的PC1得分图。
图11A至图11C显示不同老化的补料培养基和新鲜的基础培养基可能影响生产结果。图11A示出了活细胞密度(VCD)。图11B示出了活力。图11C示出了抗体效价(C)结果。
图12A示出了精氨酸的预测模型的校准曲线。图12B示出了用于构建模型的掺入(spiking)实验的第一潜在变体。图12C示出了精氨酸在水中的溶液的拉曼光谱。虚线确认了在LV1图中的主要变化与精氨酸的拉曼位移相关。
图13A-图13H示出了4种氨基酸和4种维生素的浓度的预测模型。拟合线是使用每种化学物质的已知浓度建立的校准曲线(用圆圈表示)的拟合线。菱形示出了Arg(图13A)、Asn(图13B)、His(图13C)、Lys(图13D)、B6(AL)(图13E)、B6(INE)(图13F)、B9(图13G)或B12(图13H)的未知水平的预测水平。1:1线示出了测量值与预测值之间的1:1比率，测量值是最终掺入浓度。预测模型越强，拟合效果和1:1线覆盖越好。
图14A-图14H示出了每种化学物质在每种浓度水平下的回收％。圆圈表示用于构建校准曲线的点，并且菱形是关于Arg(图14A)、Asn(图14B)、Lys(图14C)、His(图14D)、B6(AL)(图14E)、B6(INE)(图14F)、B9(图14G)、B12(图14H)的使用校准曲线的预测浓度。
图15A示出了氨基酸精氨酸、天冬酰胺、组氨酸和赖氨酸的参考光谱。图15B和图15C示出了维生素氰钴胺(B12)、叶酸(B9)、烟酰胺(B3)、吡哆醛HCl(B6(AL))和吡哆醇HCl(B6(INE))的参考光谱。
具体实施方式
本公开文本涉及可以监测培养基组成的实时变化、鉴定培养基制备中的具体错误以及监测培养基稳定性的方法。拉曼光谱法(无标签指纹识别技术的一个例子)可以用于此目的。本公开文本还显示可以构建基于拉曼的模型，以对培养基中的氨基酸和维生素组分定量建模。本公开文本显示拉曼技术可以用作分析测试以替换功能测试并且最小化批量损失的风险。
拉曼是基于通常来自激光源的单色光的非弹性散射的光谱技术，其中光的光子的频率随着与化学键相互作用发生位移。这种位移(称为“拉曼位移”)提供了关于该键的旋转、振动和其他低频转换的有用信息。由于每个分子具有构成其结构的一组独特的化学键，因此拉曼可以用作形成每个分子特有的标志性模式的“指纹识别技术”。图1展示了拉曼散射的原理，并且将其与两种可替代的光谱技术(IR和瑞利)进行比较。
拉曼的一些优点包括无需样品标签或样品制备而使分子留下足迹的能力。这提供了实时测量的手段，这使其成为过程分析技术(PAT)应用的有用技术。
I.术语
术语“和/或”在本文中使用的情况下被视为对两个指定特征或组分中的每一个与或不与另一个的具体公开。因此，如在本文中以短语诸如“A和/或B”使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”(单独)。同样，如以短语诸如“A、B和/或C”使用的术语“和/或”旨在涵盖以下方面中的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。
应理解，无论在哪里在本文中用语言“包括/包含(comprising)”描述方面，还提供了以“由……组成”和/或“基本上由……组成”措辞描述的在其他方面类似的方面。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本公开文本所涉及领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。例如，Concise Dictionary ofBiomedicine and Molecular Biology,Juo,Pei-Show,第2版,2002,CRC Press；TheDictionary of Cell and Molecular Biology,第3版,1999,Academic Press；以及OxfordDictionary Of Biochemistry And Molecular Biology,修订版,2000,OxfordUniversity Press为技术人员提供了本公开文本所用的许多术语的一般解释。
单位、前缀和符号以其国际单位制(SI)认可的形式表示。数值范围包括限定所述范围的数字。本文提供的标题不是对本公开文本的各个方面的限制，所述各个方面可以通过参考作为整体的说明书而获得。因此，通过从整体上参考说明书，更全面地定义下文紧接着定义的术语。
替代方案(例如，“或”)的使用应当理解为意指替代方案之一、两者或其任何组合。如本文所用，不定冠词“一个/一种(a)”或“一个/一种(an)”应当理解为是指任何所列举或枚举的组分中的“一个/一种或多个/多种”。
术语“约”或“基本上由……构成”是指在如通过本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分取决于如何测量或确定所述值或组成，即测量系统的限制。例如，根据本领域的实践，“约”或“基本上由……构成”可以意指在1个或多于1个标准差内。可替代地，“约”或“基本上由……构成”可以意指高达10％的范围。此外，特别是关于生物系统或过程，所述术语可以意指某值的高达一个数量级或高达5倍。当在本申请和权利要求中提供特定值或组成时，除非另外说明，否则应当假定“约”或“基本上由……构成”的含义在该特定值或组成的可接受误差范围内。
如本文所述，除非另外指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所列举范围内的任何整数的值以及在适当时所述值的分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。
如在本文中可互换使用的术语“纯化”、“分开”或“分离”是指从包含目的蛋白和一种或多种杂质的组合物或样品中提高目的蛋白的纯度。通常，通过从组合物中去除(完全或部分)至少一种杂质来提高目的蛋白的纯度。
如本文所用，术语“缓冲液”是指这样的物质，通过其在溶液中的存在而增加必须添加以引起pH单位变化的酸或碱的量。缓冲溶液通过其酸碱共轭组分的作用来抵抗pH的变化。用于与生物试剂一起使用的缓冲溶液通常能够维持恒定的氢离子浓度，使得溶液的pH在生理范围内。传统的缓冲液组分包括但不限于有机和无机盐、酸和碱。
如本文所用，术语“拉曼散射”是指用于观察系统中的振动、旋转和其他低频模式的光谱技术。它依赖于通常来自可见、近红外或近紫外范围内的激光的单色光的非弹性散射或拉曼散射。激光与系统中的分子振动、声子或其他激发相互作用，从而导致激光光子的能量向上或向下发生位移。能量的位移给出了关于系统中振动模式的信息。各种光学过程(光强度相关的线性和非线性过程二者)均与拉曼散射从根本上相关。如本文所用，术语“拉曼散射”包括但不限于“受激拉曼散射”(SRS)、“自发拉曼散射”、“相干反斯托克斯拉曼散射”(CARS)、“表面增强拉曼散射”(SERS)、“针尖增强拉曼散射”(TERS)或“振动光声断层扫描”。
如本文所用，术语“降解”和/或“经降解的”是指组合物按预期有效使用的能力降低。例如，细胞培养基可能会因暴露于热、光、湿度或可能导致培养基的组分的不需要的效果的其他环境条件而被降解。细胞培养物中各种组分的浓度随时间的变化也可能导致细胞培养基降解。还可以使用本公开文本的技术将培养基制备中的错误检测为经降解的细胞培养基。在所有情况下，与未被降解的培养基相比，经降解的细胞培养基在维持细胞培养物的活力和/或生长方面可能不那么有效。与未经降解的培养基相比，经降解的细胞培养基在上游生物制造方面可能不那么有效，因为它可能影响在上游制造期间上游细胞生长和/或蛋白质表达率、细胞计数和/或细胞密度、或总细胞活力。
如本文所用的术语“培养物”、“细胞培养物”和“真核细胞培养物”是指在适合于细胞群存活和/或生长的条件下维持或生长在培养基(参见下文“培养基”的定义)中的表面附着的或悬浮的细胞群。如本领域普通技术人员将清楚的，如本文所用的这些术语可以指代包含细胞群和所述群体悬浮于其中的培养基的组合。
如本文所用的术语“培养基(media)”、“培养基(medium)”、“细胞培养基(cellculture medium)”、“培养基(culture medium)”、“组织培养基(tissue culturemedium)”、“组织培养基(tissue culture media)”和“生长培养基(growth medium)”是指含有可以用于滋养生长中的经培养的宿主细胞的营养物的溶液。通常，这些溶液提供细胞最低限度的生长和/或存活所需的必需和非必需氨基酸、维生素、能源、脂质和微量元素。所述溶液还可以含有增强高于最小速率的生长和/或存活的组分，包括激素和生长因子。将溶液配制成对细胞存活和增殖最佳的pH和盐浓度。培养基还可以是“限定培养基”或“化学限定培养基”--不含组成未知的蛋白质、水解产物或组分的无血清培养基。限定培养基不含动物衍生的组分，并且所有组分均具有已知的化学结构。本领域技术人员理解限定培养基可以包含重组糖蛋白或蛋白质，例如但不限于激素、细胞因子、白细胞介素和其他信号传导分子。
如本文所用的术语“细胞活力”是指培养中的细胞在给定的一组培养条件或实验变化下存活的能力。如本文所用的术语还指代在特定时间存活的细胞相对于在该时间在培养中的活细胞和死细胞的总数的部分。
如本文所用，术语“上游过程”、“上游细胞培养过程”或“上游制造过程”通常是指制造过程中的使微生物或细胞(例如细菌或哺乳动物细胞)在容器(诸如生物反应器)中生长的一个或多个第一步骤。上游加工涉及与接种物开发、培养基开发、蛋白质表达、通过基因工程加工改进接种物以及优化生长动力学相关的所有步骤。
如本文所用的术语“分批培养”或“分批反应器过程”是指培养细胞的方法，其中在培养过程开始时提供最终将用于培养细胞的所有组分，包括培养基(参见下文“培养基”的定义)以及细胞本身。通常在某一点停止分批培养，并且收获并任选地纯化培养基中的细胞和/或组分。
如本文所用的术语“分批补料培养”或“分批补料反应器过程”是指培养细胞的方法，其中在培养过程开始后的某个时间向培养物提供另外的组分。可以使用基础培养基开始分批补料培养。在培养过程开始后的某个时间向培养物提供另外的组分的培养基是补料培养基。通常在某一点停止分批补料培养，并且收获并任选地纯化培养基中的细胞和/或组分。
如本文所用，“灌注”或“灌注培养”或“灌注反应器过程”是指生理营养液的连续流以稳定的速率穿过或经过细胞群。由于灌注系统通常涉及将细胞保留在培养单元内，因此灌注培养典型地具有相对较高的细胞密度，但是培养条件难以维持和控制。另外，由于使细胞生长到高密度并且在高密度下保留在培养单元内，因此生长速率通常会随时间持续降低，从而导致细胞生长的后期指数期或甚至静止期。这种连续培养策略通常包括在连续细胞培养系统中在生产阶段期间培养哺乳动物细胞(例如，非贴壁依赖性细胞)，表达目的多肽和/或病毒。“非贴壁依赖性细胞”意指在繁殖期间细胞在整个培养主体中悬浮地自由繁殖，而不是附着或固定到固体基质上。连续细胞培养系统可以包括类似于在灌注系统中使用的细胞保留装置，但是其允许连续去除大部分细胞，使得与灌注培养相比，保留更小百分比的细胞。“细胞保留装置”意指能够在细胞培养期间将细胞、特别是非贴壁依赖性细胞保留在特定位置的任何结构。非限制性例子包括可以将非贴壁依赖性细胞保留在生物反应器内的微载体、细网旋转过滤器、中空纤维、平板膜过滤器、沉降管、超声细胞保留装置等。目的多肽和/或病毒(例如，重组多肽和/或重组病毒)可以从细胞培养系统中(例如，从由细胞培养系统中取出的培养基中)回收。
在一些方面，术语“抗体”是指包含由二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的蛋白质。每条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(在本文中缩写为CH)组成。在一些抗体(例如，天然存在的IgG抗体)中，重链恒定区由铰链和三个结构域CH1、CH2和CH3组成。在一些抗体(例如，天然存在的IgG抗体)中，每条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域(在本文中缩写为CL)组成。VH和VL区可以进一步细分为具有高变性的区域，称为互补决定区(CDR)，散布有更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR构成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。重链可以具有或不具有C末端赖氨酸。术语“抗体”可以包括双特异性抗体或多特异性抗体。
在一些方面，如本文所用的“IgG抗体”(例如，人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体)具有天然存在的IgG抗体的结构，即，它具有与相同亚类的天然存在的IgG抗体相同数量的重链和轻链和二硫键。例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体可以由两条重链(HC)和两条轻链(LC)组成，其中两条HC和LC分别通过在天然存在的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4抗体中存在的相同数量和位置的二硫桥连接(除非抗体已经突变以修饰二硫桥)。
免疫球蛋白可以来自任何通常已知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG同种型在某些物种中分为以下亚类：人中的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及小鼠中的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3。免疫球蛋白(例如，IgG1)以若干种同种异型存在，它们彼此最多有几个氨基酸的差异。举例来说，“抗体”包括天然存在的抗体和非天然存在的抗体；单克隆抗体和多克隆抗体；嵌合抗体和人源化抗体；人抗体和非人抗体；以及全合成抗体。
如本文所用，术语抗体的“抗原结合部分”是指抗体中保留与抗原特异性结合的能力的一个或多个片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段执行。涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的例子包括(i)Fab片段(来自木瓜蛋白酶切割的片段)或由VL、VH、LC和CH1结构域组成的类似的单价片段；(ii)F(ab')2片段(来自胃蛋白酶切割的片段)或包含由铰链区的二硫桥连接的两个Fab片段的类似的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)dAb片段(Ward等人,(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；(vi)经分离的互补决定区(CDR)；以及(vii)可以任选地通过合成接头连接的两个或更多个经分离的CDR的组合。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但它们可以使用重组方法通过合成接头来连接，从而使得它们能够成为单条蛋白质链，在其中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等人(1988)Science 242:423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。此类单链抗体也旨在涵盖在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式筛选所述片段的效用。抗原结合部分可以通过重组DNA技术或通过完整的免疫球蛋白的酶促或化学切割来产生。
如本文所用，术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如(a)从对于人免疫球蛋白基因而言是转基因或转染色体的动物(例如，小鼠)或者由其制备的杂交瘤分离的抗体，(b)从转化用于表达抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体，(c)从重组的组合人抗体文库分离的抗体，和(d)通过涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接到其他DNA序列的任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体。
如本文所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体种类(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE抗体)。
氨基酸在本文中由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生化命名委员会推荐的单字母符号来提及。同样，核苷酸由其普遍接受的单字母代码来提及。
如本文所用，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”或“蛋白质”或“产物”或“产物蛋白”或“氨基酸残基序列”可互换使用。术语“多肽”是指两个或更多个氨基酸的任何一条或多条链，并且不涉及产物的具体长度。如本文所用，术语“蛋白质”旨在涵盖由一种或多种多肽组成的分子，所述多肽在一些情况下可以通过除酰胺键以外的键缔合。另一方面，蛋白质也可以是单条多肽链。在后一种情况下，单条多肽链在一些情况下可以包含两个或更多个多肽亚基，其融合在一起以形成蛋白质。术语“多肽”和“蛋白质”还指代表达后修饰的产物，所述表达后修饰包括但不限于糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、通过已知的保护/阻断基团衍生化、蛋白水解切割或通过非天然存在的氨基酸修饰。多肽或蛋白质可以衍生自天然生物来源或通过重组技术产生，但是不一定从指定的核酸序列翻译。它可以以任何方式(包括通过化学合成)产生。
如本文所用的术语“多核苷酸”或“核苷酸”旨在涵盖包含单个核酸以及多个核酸，并且是指经分离的核酸分子或构建体，例如信使RNA(mRNA)、互补DNA(cDNA)或质粒DNA(pDNA)。在某些方面，多核苷酸包含常规磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键，诸如见于肽核酸(PNA)中)。
术语“核酸”是指存在于多核苷酸中的任何一个或多个核酸区段，例如DNA、cDNA或RNA片段。当应用于核酸或多核苷酸时，术语“经分离的”是指已经从其天然环境中取出的核酸分子DNA或RNA，例如，出于本公开文本的目的，认为包含在载体中的编码抗原结合蛋白的重组多核苷酸是经分离的。经分离的多核苷酸的进一步的例子包括在异源宿主细胞中维持或从溶液中的其他多核苷酸纯化(部分或基本)的重组多核苷酸。经分离的RNA分子包括本公开文本的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本公开文本的经分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以包括调节元件，诸如启动子、增强子、核糖体结合位点或转录终止信号。
II.监测培养基的方法
本公开文本提供了使用拉曼光谱法分析细胞培养基降解的高度有效的方法，所述方法通过比较从测试细胞培养基获得的拉曼光谱，并且将其与未被降解的细胞培养基的一种或多种已知组分的拉曼光谱进行比较。相应的拉曼光谱可以从培养基本身或其一种或多种组分获得。例如，可以在细胞培养基的单一组分(诸如酪氨酸或其他氨基酸)上获得一个或多个拉曼光谱。可替代地或另外地，可以从待测试降解的细胞培养基样品获得一个或多个拉曼光谱。以这种方式，可以在细胞培养基制剂中检测沉淀物或其他降解元素。
本公开文本的方法包括控制拉曼光谱仪收集样品内目标体积的拉曼光谱，从而收集目标细胞培养基的拉曼光谱。所述方法进一步包括获得与细胞培养基的已知组分唯一相关的参考光谱。参考光谱包含一种或多种细胞培养基组分的至少一个光谱测量值。此外，所述方法还包括使用加工装置将参考光谱与收集光谱进行比较，以及基于参考光谱与收集光谱的比较来鉴定在收集光谱内是否存在至少一种不需要的分子组合物。在这点上，所述方法又进一步包括基于对所收集的拉曼光谱的分析(其中在收集光谱内鉴定至少一种不需要的分子组合物)提供关于细胞培养基降解是否已经发生的指示，以及在所收集的拉曼光谱中检测到降解的情况下，停止制造过程和/或在制造过程期间在使用前将经降解的培养基丢弃。可以通过基于对收集光谱与没有降解的细胞培养基组合物的参考光谱之间计算的差异光谱的分析鉴定不需要的分子或沉淀物来鉴定不需要的分子组合物。
根据本公开文本的进一步的方面，检测制造过程中的降解的系统包括光学成像系统和处理器。光学成像系统实施拉曼光谱仪，所述拉曼光谱仪被控制以将激光引导至样品区域内的目标体积，从而收集细胞培养基的拉曼光谱。将处理器与光学成像系统耦合。以这种方式，处理器执行程序代码以接收拉曼光谱，并且访问描述已知组分的参考光谱。参考光谱包含一种或多种细胞培养基组分的光谱测量值。处理器进一步执行程序代码以将参考光谱与收集光谱进行比较，并且基于参考光谱与收集光谱的比较来鉴定在收集光谱内是否存在至少一种不需要的分子组合物。另外，处理器执行程序代码以基于在收集光谱内是否鉴定到至少一种不需要的分子组合物提供关于在所收集的拉曼光谱中是否存在降解的指示，并且在所收集的拉曼光谱中检测到降解的情况下，停止制造过程和/或在制造过程期间在使用前将经降解的培养基丢弃。计算单元可以被配置为通过对施用至少一种物质之前获得的拉曼光谱和施用至少一种物质之后获得的拉曼光谱的统计学评价的手段来确定生物对象与至少一种物质的反应。统计学评价可以包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法分析(PLS)、聚类分析和/或线性判别分析(LDA)。在一些方面，统计学评价可以包括PCA。
本公开文本的方法还可用于监测添加到具有已知拉曼光谱的细胞培养基中的标记物。在一些方面，所添加的标记物是一种或多种氨基酸。在一些方面，所添加的标记物是选自以下的一种或多种氨基酸：赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、天冬酰胺(Asn)、精氨酸(Arg)、丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。在一些方面，所添加的标记物是选自以下的一种或多种氨基酸：赖氨酸(Lys)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。在其他方面，所述标记物是赖氨酸、组氨酸、天冬酰胺或精氨酸。在一些方面，所述标记物选自赖氨酸(Lys)和天冬酰胺(Asn)。在其他方面，所述标记物是酪氨酸。在一些方面，所述标记物是赖氨酸。在一些方面，所述标记物是组氨酸。在其他方面，所述标记物是天冬酰胺。在其他方面，所述标记物是精氨酸。在一些方面，所述氨基酸标记物没有荧光活性。在一些方面，所添加的标记物是维生素。在一些方面，所述标记物是选自以下的一种或多种维生素：氰钴胺(B12)、叶酸(B9)、烟酰胺(B3)、吡哆醛HCl(B6(AL))和吡哆醇HCl(B6(INE))。在一些方面，所述标记物是B12。在一些方面，所述标记物是B9。在一些方面，所述标记物是B3。在一些方面，所述标记物是吡哆醛HCl(B6(AL))。在一些方面，所述标记物是吡哆醇HCl(B6(INE))。
细胞培养基可以包含展现荧光的材料，所述荧光倾向于掩蔽拉曼光谱信号。荧光通常与激发波长无关。当在两个略有不同的波长下获得光谱时，每个光谱中的荧光应当大致相同，但是拉曼峰应当随激发波长发生位移。因此，可以分解光谱(例如，通过主成分分析)，以产生不含荧光的光谱。
本公开文本还涉及监测细胞培养基变化的方法，所述变化可能影响细胞培养基在任何环境中使细胞生长的有效性。本公开文本的一方面涉及细胞培养基样品的拉曼光谱的测量，以将拉曼光谱与细胞培养基组分的已知光谱进行比较。本公开文本的方法涉及用于使用拉曼光谱法指纹识别细胞培养基和/或鉴定细胞培养基的最佳储存条件的方法，所述方法包括：收集细胞培养基的拉曼光谱，细胞培养基含有一种或多种组分的混合物，其中将细胞培养基的拉曼光谱与和所述一种或多种组分中的每一种相关的一个或多个参考光谱进行比较或与和参考培养基组合物相关的参考光谱进行比较。本公开文本的方法还涉及用于鉴定所储存的细胞培养基中特定组分的变化率和/或监测所储存的细胞培养基的变化的方法，所述方法包括：收集细胞培养基的拉曼光谱(“收集光谱”)，其中将细胞培养基的拉曼光谱与和一种或多种组分中的每一种相关的参考光谱进行比较。
在一些方面，参考光谱将没有降解。在一些方面，至少约每一小时、至少约每两小时、至少约每三小时、至少约每四小时、至少约每五小时、至少每六小时、至少每七小时、至少约每八小时、至少约每九小时、至少约每十小时、至少约每11小时、至少约每12小时、至少约每13小时、至少约每14小时、至少约每15小时、至少约每16小时、至少约每17小时、至少约每18小时、至少约每19小时、至少约每20小时、至少约每21小时、至少约每22小时、至少约每23小时或至少约每24小时收集细胞培养基的拉曼光谱。在一些方面，至少约每25小时、至少约每26小时、至少约每27小时、至少约每28小时、至少约每29小时、至少约每30小时、至少约每31小时、至少约每32小时、至少约每33小时、至少约每34小时、至少约每35小时、至少约每36小时、至少约每37小时、或至少约每38小时、至少约每39小时、至少约每40小时、至少约每41小时、至少约每42小时、至少约每43小时、至少约每44小时、至少约每45小时、至少约每46小时、至少约每47小时、至少约每48小时、至少约每49小时或至少约每50小时收集细胞培养基的拉曼光谱。在一些方面，约每三小时收集细胞培养基的拉曼光谱。在一些方面，在约两小时与约三小时之间、在一小时与四小时之间、在一小时与三小时之间或在两小时与四小时之间收集细胞培养基的拉曼光谱。在一些方面，约每三小时收集细胞培养基的拉曼光谱。
在一些方面，所述拉曼光谱是至少5个数据点、至少10个数据点、至少15个数据点、至少16个数据点、至少17个数据点、至少18个数据点、至少19个数据点、至少20个数据点、至少21个数据点、至少22个数据点、至少23个数据点、至少24个数据点、至少25个数据点、至少26个数据点、至少27个数据点、至少28个数据点、至少29个数据点、至少30个数据点、至少31个数据点、至少32个数据点、至少33个数据点、至少34个数据点、至少35个数据点、至少36个数据点、至少37个数据点、至少38个数据点、至少39个数据点、至少40个数据点、至少41个数据点、至少42个数据点、至少43个数据点、至少44个数据点、至少45个数据点、至少46个数据点、至少47个数据点、至少48个数据点、至少49个数据点或至少50个数据点的平均值。在一些方面，所述拉曼光谱是至少51个数据点、至少52个数据点、至少53个数据点、至少54个数据点、至少55个数据点、至少56个数据点、至少57个数据点、至少58个数据点、至少59个数据点、至少60个数据点、至少61个数据点、至少62个数据点、至少63个数据点、至少64个数据点、至少65个数据点、至少66个数据点、至少67个数据点、至少68个数据点、至少69个数据点、至少70个数据点、至少71个数据点、至少72个数据点、至少73个数据点、至少74个数据点、至少75个数据点、至少76个数据点、至少77个数据点、至少78个数据点、至少79个数据点、至少80个数据点、至少81个数据点、至少82个数据点、至少83个数据点、至少84个数据点、至少85个数据点、至少86个数据点、至少87个数据点、至少88个数据点、至少89个数据点、至少90个数据点、至少91个数据点、或至少92个数据点、至少93个数据点、至少94个数据点、至少95个数据点、至少96个数据点、至少97个数据点、至少98个数据点、至少99个数据点或至少100个数据点的平均值。在一些方面，细胞培养基的拉曼光谱是35个数据点的平均值。
在一些方面，每10秒、每15秒、每20秒、每25秒、每30秒、每35秒、每40秒、每45秒、每50秒、每55秒或每60秒测量每个数据点。在一些方面，每65秒、每70秒、每75秒、每80秒、每85秒、每90秒、每95秒、每100秒、每105秒、每110秒、每115秒或每120秒测量每个数据点。
本公开文本的方法还涉及对从所述样品收集的原始拉曼光谱的分析。在一些方面，所述拉曼光谱通过多变量分析进行分析。在一些方面，所述多变量分析是主成分分析(PCA)。在一些方面，所述PCA产生拉曼光谱的PC得分。在一些方面，所述多变量分析是偏最小二乘法分析(PLS)，并且其中所述分析产生校准预测模型。在一些方面，所述方法进一步包括比较细胞培养基的收集光谱。在一些方面，所述比较包括收集光谱的PC得分与参考光谱的参考PC得分的比较。
在一些方面，所述分析是基于预测模型的。本领域熟知的可用作模型或可用于设计预测模型的已建立的统计算法和方法可以包括但不限于：偏最小二乘法(PLS)分析、标准正态变量(SNV)分析、变量分析(ANOVA)；贝叶斯网络；增强和自适应增强；自举汇聚(或装袋)算法；决策树分类技术，诸如分类回归树(CART)、增强CART、随机森林(RF)、递归分区树(RPART)等；Curds和Whey(CW)；Curds和Whey-Lasso；降维方法，诸如主成分分析(PCA)和因子旋转或因子分析；判别分析，包括线性判别分析(LDA)、Eigengene线性判别分析(ELDA)和二次判别分析；判别函数分析(DFA)；因子旋转或因子分析；遗传算法；隐马尔可夫模型；基于核的机器算法，诸如核密度估计、核偏最小二乘算法、核匹配追踪算法、核Fisher判别分析算法和核主成分分析算法；线性回归和广义线性模型，包括或利用前向线性逐步回归、Lasso(或LASSO)收缩和选择方法、和弹性网络正则化和选择方法；glmnet(Lasso和弹性网络正则化广义线性模型)；逻辑斯蒂回归(LogReg)；元学习算法；用于分类或回归的最近邻方法，例如k最近邻(KNN)；非线性回归或分类算法；神经网络；偏最小二乘法；基于规则的分类器；质心收缩(SC)；切片逆回归；产品模型数据交换标准应用解释构件(StepAIC)；超主成分(SPC)回归；以及支持向量机(SVM)和递归支持向量机(RSVM)等。另外地，本领域已知的聚类算法可以用于确定受试子组。
可以采用多变量统计手段，诸如经由目的分析物的固有拉曼光谱的主成分分析(PCA)。具体而言，光谱数据集的线性多变量模型可以通过建立主成分向量(PC)来构建，这将提供数据集中统计学上最显著的变化，并且降低样本矩阵的维数。这种方法涉及为所收集的每个光谱的PC分配得分，然后将光谱绘制为二维图中的单个数据点。所述图将揭示类似的光谱的簇，因此可以对单独的生物种类(分析物和干扰分子)进行分类和区分，甚至是密切相关的种类。
本公开文本的方法需要一个或多个参考拉曼光谱的知识。所述一个或多个参考光谱可以基于一个或多个参考样品产生。每个参考样品可以包括一种或多种基础(生化)组分。处理器可以被配置为基于所述一个或多个拉曼光谱产生一个或多个重建的拉曼图像。处理器可以被配置为基于参考拉曼光谱去除荧光背景。
在一些方面，所述方法进一步包括当收集光谱的PC得分与参考光谱的参考PC得分相差至少约10、至少约11、至少约12、至少约13、至少约14、至少约15、至少约16、至少约17、至少约18、至少约19、至少约20、至少约21、至少约22、至少约23、至少约24、至少约25、至少约26、至少约27、至少约28、至少约29或至少约30时，确定培养基被降解。在一些方面，所述方法进一步包括当收集光谱的PC得分高于参考光谱的参考PC得分时，确定细胞培养基被降解。在一些方面，所述方法进一步包括当收集光谱的PC得分低于参考光谱的参考PC得分时，确定细胞培养基被降解。
在一些方面，细胞培养基未被降解，并且与经降解的培养基相比，未经降解的细胞培养基使培养中的细胞的活力改善约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％、约21％、约22％、约23％、约24％、约25％、约26％、约27％、约28％、约29％、约30％。
在一些方面，细胞培养基未被降解，并且与经降解的培养基相比，未经降解的细胞培养基使培养中的细胞的活细胞密度改善约1x106个细胞/mL、约2x106个细胞/mL、约3x106个细胞/mL、约4x106个细胞/mL、约5x106个细胞/mL、约6x106个细胞/mL、约7x106个细胞/mL、约8x106个细胞/mL、约9x106个细胞/mL、约10x106个细胞/mL、约11x106个细胞/mL、约12x106个细胞/mL、约13x106个细胞/mL、约14x106个细胞/mL、约15x106个细胞/mL、约16x106个细胞/mL、约17x106个细胞/mL、约18x106个细胞/mL、约19x106个细胞/mL、约20x106个细胞/mL、约21x106个细胞/mL、约22x106个细胞/mL、约23x106个细胞/mL、约24x106个细胞/mL、约25x106个细胞/mL、约26x106个细胞/mL、约27x106个细胞/mL、约28x106个细胞/mL、约29x106个细胞/mL或约30x106个细胞/mL。
在一些方面，细胞培养基未被降解，并且与经降解的培养基相比，未经降解的细胞培养基使培养中的细胞的抗体产生效价改善约0.1g/L、约0.2g/L、约0.3g/L、约0.4g/L、约0.5g/L、约0.6g/L、约0.7g/L、约0.8g/L、约0.9g/L、约1.0g/L、约1.1g/L、约1.2g/L、约1.3g/L、约1.4g/L、约1.5g/L、约1.6g/L、约1.7g/L、约1.8g/L、约1.9g/L、约2.0g/L、约2.1g/L、约2.2g/L、约2.3g/L、约2.4g/L、约2.5g/L、约2.6g/L、约2.7g/L、约2.8g/L、约2.9g/L、约3.0g/L、约3.1g/L、约3.2g/L、约3.3g/L、约3.4g/L、约3.5g/L、约3.6g/L、约3.7g/L、约3.8g/L、约3.9g/L、约4.0g/L、约4.1g/L、约4.2g/L、约4.3g/L、约4.4g/L、约4.5g/L、约4.6g/L、约4.7g/L、约4.8g/L、约4.9g/L、约5.0g/L、约5.1g/L、约5.2g/L、约5.3g/L、约5.4g/L、约5.5g/L、约5.6g/L、约5.7g/L、约5.8g/L、约5.9g/L或约6.0g/L。
在一些方面，具有可以经由本公开文本的方法分析的已知参考光谱的标记物存在于在细胞培养组合物中。本公开文本的方法还可以用于经由添加已知组分作为标记物来检测组合物的降解。在一些方面，将标记物添加到细胞培养基中。在一些方面，所述标记物选自赖氨酸、组氨酸、天冬酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、缬氨酸和精氨酸。在一些方面，所述标记物是酪氨酸。在其他方面，所述标记物是糖。在一些方面，所述标记物选自果糖、麦芽糖、己糖、阿拉伯糖或蔗糖。在一些方面，所述标记物不是葡萄糖。在一些方面，所述标记物不是乳酸盐。在一些方面，所述标记物是维生素。在一些方面，所述维生素选自维生素A、维生素C、维生素D、维生素E、维生素K、维生素B6、维生素B12、叶酸、硫胺素、核黄素、烟酸、泛酸、生物素和叶酸。在一些方面，所述标记物是选自氰钴胺(B12)、叶酸(B9)、烟酰胺(B3)、吡哆醛HCl(B6(AL))和吡哆醇HCl(B6(INE))的维生素。
在一些方面，在以下范围内测量拉曼光谱：从约500cm-1至约1700cm-1、从约500cm-1至约1800cm-1、从约500cm-1至约1900cm-1、从约500cm-1至约2000cm-1、从约500cm-1至约2100cm-1、从约500cm-1至约2200cm-1、从约500cm-1至约2300cm-1、从约500cm-1至约2400cm-1、从约500cm-1至约2500cm-1、从约500cm-1至约2600cm-1、从约500cm-1至约2700cm-1、从约500cm-1至约2800cm-1、从约500cm-1至约2900cm-1或从约500cm-1至约3000cm-1。在一些方面，在500cm-1至3000cm-1的范围内测量拉曼光谱。
在一些方面，在以下范围内测量拉曼光谱：从约500cm-1至约3000cm-1、从约600cm-1至约3000cm-1、从约600cm-1至约2900cm-1、从约700cm-1至约2900cm-1、从约700cm-1至约2800cm-1、从约800cm-1至约2800cm-1、从约800cm-1至约2700cm-1、从约900cm-1至约2700cm-1、从约900cm-1至约2600cm-1、从约1000cm-1至约2600cm-1、从约1000cm-1至约2500cm-1、从约1100cm-1至约2500cm-1、从约1100cm-1至约2400cm-1、或从约1200cm-1至约2400cm-1、从约1200cm-1至约2300cm-1、从约1300cm-1至约2300cm-1、从约1300cm-1至约2200cm-1、从约1400cm-1至约2200cm-1、从约1400cm-1至约2100cm-1、从约1500cm-1至约2100cm-1、从约1500cm-1至约2000cm-1、从约1600cm-1至约2000cm-1、从约1600cm-1至约1900cm-1、从约1700cm-1至约1900cm-1或从约1800cm-1至约1900cm-1。
在一些方面，所述方法进一步包括当收集光谱的PC得分与参考光谱的参考PC得分相同或与其相似约20或更少、约19或更少、约18或更少、约17或更少、约16或更少、约15或更少、约14或更少、约13或更少、约12或更少、约11或更少、约10或更少、约9或更少、约8或更少、约7或更少、约6或更少、约5或更少、约4或更少、约3或更少、约2或更少或者约1或更少时，确定细胞培养基是稳定的。
在一些方面，确定细胞培养基储存约八天、约九天、约十天、约11天、约12天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、约30天、约一个月、约1.5个月、约40天、约50天、约60天、约两个月、约70天、约80天、约90天、约三个月、约100天、约110天、约120天、约4个月、约五个月或约六个月。在一些方面，确定细胞培养基储存约12个月、约18个月、约24个月、约30个月、约36个月、约42个月、约48个月、约54个月或约60个月。
本公开文本的方法进一步包括在制造过程期间监测细胞培养。在一些方面，所述方法进一步包括监测上游细胞培养过程。在一些方面，所述上游细胞培养过程包括分批反应器过程。在一些方面，所述上游细胞培养过程包括灌注反应器过程。在其他方面，所述上游细胞培养过程包括分批补料反应器过程。
在哺乳动物细胞培养中，所述细胞培养基可以包含多达约100种化合物和更多的化合物。例如，碳水化合物(例如用于通过分解代谢反应产生能量或作为回补反应的结构单元)、氨基酸(例如细胞蛋白的结构单元和在治疗性蛋白产生的情况下的产物)、脂质和/或脂肪酸(例如用于细胞膜合成)、DNA和RNA(例如用于生长以及细胞有丝分裂和减数分裂)、维生素(例如作为酶促反应的辅因子)、微量元素、不同的盐、生长因子、载体、转运蛋白等。需要这些组分或化合物组以在技术培养环境中满足哺乳动物细胞的复杂的营养需求。在一些方面，用于本公开文本的培养基包括公开了所有组分和所有浓度的经典细胞培养基，例如DMEM(杜氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium))。此类细胞培养基的开发可追溯到20世纪50年代后期，并且在学术文献中进行了全面的描述。另一个例子是在20世纪70年代开发的汉氏F12(Ham's F12)(汉氏营养混合物F12)；或20世纪70年代和20世纪80年代开发的这样的经典细胞培养基的混合物/改良物，诸如DMEM:F12(杜氏改良伊格尔培养基/汉氏营养混合物F12)。可用于本公开文本的另一种培养基包括RPMI。RPMI是在Roswell Park Memorial Institute(因此首字母缩略词为RPMI)由Moore等人在20世纪70年代开发的。将不同的变体用于动物细胞培养中，例如RPMI-1640。尽管这些经典培养基中有许多是在几十年前开发的，但这些配方仍然构成了当今发生的大部分细胞培养研究的基础，并且对于具有完全已知组成和每种化合物的完全已知浓度的培养基代表了动物细胞培养的现有技术水平。所有这些培养基均是可商购的并且可以从供应商(例如，从Sigma-Aldrich)获得。
在其他方面，可用于本公开文本的细胞培养基包括商业细胞培养基，例如由基础培养基(ActiCHO P)和补料培养基(ActiCHO补料A+B)组成的可商购的培养基ActiCHO(PAA)，所述补料培养基是根据供应商限定化学限定的(仅单一化学物质，不含动物衍生的物质、生长因子、肽和蛋白胨)。这两种补料培养基由浓缩氨基酸、维生素、盐、微量元素和碳源(补料A)和以浓缩形式选择的氨基酸(补料B)组成。在一些方面，培养基包括Ex-Cell CDCHO(SAFC Biosciences)。此培养基是无动物组分的、根据SAFC化学限定的、无血清的，并且配方也是专有的。在其他方面，培养基包括CD CHO(Life technologies)。此培养基是无蛋白质的、无血清的、和根据Life technologies化学限定的。它不含有动物、植物或合成来源的蛋白质/肽或未限定的裂解物/水解产物。此CD CHO基础培养基可以与称为高效补料A、B和C的补料培养基组合。所述补料培养基是无动物来源的，并且以更高的浓度含有组分。所述补料培养基是化学限定的。不使用蛋白质、脂质、生长因子、水解产物和组成未知的组分。它含有碳源、浓缩氨基酸、维生素和微量元素。可以通过Thermo Fisher获得可商购的另一种补料培养基，称为Cell Boost 1-6。它是根据Thermo Fisher化学限定的、无蛋白质的和无动物衍生的组分的。Cell Boost 1和2含有氨基酸、维生素和葡萄糖。Cell Boost 3含有氨基酸、维生素、葡萄糖和微量元素。Cell Boost 4含有氨基酸、维生素、葡萄糖、微量元素和生长因子。并且Cell Boost 5和6含有氨基酸、维生素、葡萄糖、微量元素、生长因子、脂质和胆固醇。氨基酸
氨基酸对于蛋白质合成(对于细胞蛋白和对于在重组蛋白或蛋白质衍生的物质的情况下的产物的产生二者)具有重要作用。例如，通过细胞机器由单个氨基酸分子合成蛋白质，以形成较大的蛋白质或蛋白质复合物。在哺乳动物细胞培养中，需要为细胞培养基提供必需氨基酸，因为哺乳动物细胞不能由其他前体和结构单元合成必需氨基酸。氨基酸在生物化学上也是重要的，因为这些分子具有两个官能团(氨基和酸性基团)，这使得它们能够与其他生物分子相互作用。由于这些原因，含有氨基酸的细胞培养基通常还补充有各种(限定的和未限定的)来自不同来源的(动物衍生的、植物衍生的或化学限定的)小肽、水解产物、蛋白质和蛋白质混合物。因此，根据本公开文本，一种或多种氨基酸可以用作拉曼光谱法的标记物。
可用于本公开文本的一种或多种氨基酸包括由通用遗传密码编码的二十种天然氨基酸，通常为L型(即，L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸、L-组氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸和L-缬氨酸)。在其他方面，用于本公开文本的所述一种或多种氨基酸包括非天然存在的氨基酸。氨基酸(例如，谷氨酰胺和/或酪氨酸)可以作为具有增加的稳定性和/或溶解度的二肽提供，所述二肽例如含有L-丙氨酸(L-ala-x)或L-甘氨酸延伸(L-gly-x)，诸如甘氨酰-谷氨酰胺和丙氨酰-谷氨酰胺。进一步地，半胱氨酸也可以作为L-胱氨酸提供。如本文所用的术语“氨基酸”涵盖其所有不同的盐，诸如(但不限于)L-精氨酸单盐酸盐、L-天冬酰胺一水合物、L-半胱氨酸盐酸盐一水合物、L-胱氨酸二盐酸盐、L-组氨酸单盐酸盐二水合物、L-赖氨酸单盐酸盐和羟基L-脯氨酸L-酪氨酸二钠脱水物。氨基酸的确切形式对于本公开文本并不重要，除非诸如溶解度、摩尔渗透压浓度、稳定性、纯度等特征受到损害。在一些方面，将L-精氨酸作为L-精氨酸x HCI使用，将L-天冬酰胺作为L-天冬酰胺x H20使用，将L-半胱氨酸作为L-半胱氨酸x HCI x H20使用，将L-胱氨酸作为L-胱氨酸x 2HCI使用，将L-组氨酸作为L-组氨酸x HCI x H20使用，并且将L-酪氨酸作为L-酪氨酸x 2Na x 2H20使用，其中可以彼此独立或一起或其任何组合选择每种氨基酸形式。还涵盖包含相关氨基酸中的一种或两种的二肽。例如，L-谷氨酰胺通常以二肽(诸如L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)的形式添加到细胞培养基中，以改善稳定性并且减少在储存时或在长期培养期间积累的铵。
在一些方面，使用本发明方法来产生一种或多种多肽。在一些方面，所述多肽包括抗体或其抗原结合部分。在其他方面，所述多肽包括由免疫球蛋白组分(例如Fc组分)和生长因子(例如白细胞介素)组成的融合蛋白、抗体或任何抗体衍生的分子形式或抗体片段。
在其他方面，所述多肽包括天然存在的蛋白质。在其他方面，所述多肽包括蛋白质、多肽、其片段、肽、融合蛋白，所有这些均可以在选定的宿主细胞中表达，例如重组蛋白，即由分子克隆产生的重组DNA编码的蛋白质。此类多肽可以是抗体、酶、细胞因子、淋巴因子、粘附分子、受体及其衍生物或片段、以及可以充当激动剂或拮抗剂和/或具有治疗或诊断用途或可以用作研究试剂的任何其他多肽。在一些方面，所述多肽是分泌蛋白或蛋白质片段，例如抗体或抗体片段或Fc融合蛋白。
在一些方面，所述多肽由经培养的细胞产生。在一些方面，所述细胞是原核细胞。在细菌系统中，可以根据要表达的蛋白质分子的预期用途有利地选择许多表达载体。例如，当要生产大量这样的蛋白质时，为了产生蛋白质分子的药物组合物，指导容易纯化的高水平蛋白质产物的表达的载体可能是合乎需要的。
在其他方面，所述细胞是真核细胞。在一些方面，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些方面，所述细胞选自中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、HEK293细胞、小鼠骨髓瘤(NS0)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、猴肾成纤维细胞(COS-7)、马-达二氏牛肾细胞(Madin-Darby bovine kidneycell，MDBK)及其任何组合。在一方面，所述细胞是中国仓鼠卵巢细胞。在一些方面，所述细胞是昆虫细胞，例如草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞。
在其他方面，所述细胞是哺乳动物细胞。此类哺乳动物细胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、MDCK、HEK 293、NIH 3T3、W138、BT483、Hs578T、HTB2、BT2O和T47D、NS0、CRL7O3O、COS(例如，COS1或COS)、PER.C6、VERO、HsS78Bst、HEK-293T、HepG2、SP210、R1.1、B-W、L-M、BSC1、BSC40、YB/20、BMT10和HsS78Bst细胞。
在一些方面，所述哺乳动物细胞是CHO细胞。在一些方面，所述CHO细胞是CHO-DG44、CHOZN、CHO/dhfr-、CHOK1SV GS-KO或CHO-S。在一些方面，所述CHO细胞是CHO-DG4。在一些方面，所述CHO细胞是CHOZN。
本文公开的其他合适的CHO细胞系包括CHO-K(例如，CHO K1)、CHO pro3-、CHOP12、CHO-K1/SF、DUXB11、CHO DUKX、PA-DUKX、CHO pro5、DUK-BII或其衍生物。
在一些方面，由根据本公开文本的培养基产生的蛋白质是融合蛋白。“融合”或“融合”蛋白包含与第二氨基酸序列框内连接的第一氨基酸序列，所述第一氨基酸序列在自然界中并非天然地与所述第二氨基酸序列连接。通常存在于分开的蛋白质中的氨基酸序列可以在融合多肽中聚在一起，或者通常存在于相同蛋白质中的氨基酸序列可以以新的排列方式放置在融合多肽中。例如，通过化学合成或通过产生和翻译多核苷酸来产生融合蛋白，在所述多核苷酸中肽区以所需的关系被编码。融合蛋白可以进一步包含通过共价非肽键或非共价键与第一氨基酸序列缔合的第二氨基酸序列。在转录/翻译后，获得了单一蛋白质。以这种方式，可以将多种蛋白质或其片段掺入单一多肽中。“可操作地连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，两个多肽之间的可操作的连接将两个多肽框内融合在一起以产生单一多肽融合蛋白。在一个特定方面，所述融合蛋白进一步包含第三多肽，如下文进一步详细讨论的，所述第三多肽可以包括接头序列。
在一些方面，由根据本公开文本的培养基产生的蛋白质是抗体。抗体可以包括例如单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、杂缀合抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fvs(scFv)、驼源化抗体、亲和体、Fab片段、F(ab’)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、抗独特型(抗Id)抗体(包括例如抗抗Id抗体)和上述任一种的抗原结合片段。在某些方面，本文所述的抗体是指多克隆抗体群。抗体可以属于免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)、任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1或IgA2)或任何亚类(例如，IgG2a或IgG2b)。在某些方面，本文所述的抗体是IgG抗体，或其类别(例如，人IgG1或IgG4)或亚类。在一个具体方面，所述抗体是人源化单克隆抗体。在另一个具体方面，所述抗体是人单克隆抗体，优选地作为免疫球蛋白。在某些方面，本文所述的抗体是IgG1或IgG4抗体。
在一些方面，本文所述的蛋白质是“抗原结合结构域”、“抗原结合区”、“抗原结合片段”和类似术语，它们是指包含赋予抗体分子对抗原的特异性的氨基酸残基(例如，互补决定区(CDR))的抗体分子的一部分。抗原结合区可以衍生自任何动物物种，诸如啮齿动物(例如，小鼠、大鼠或仓鼠)和人。
在一些方面，所述蛋白质是抗LAG3抗体、抗CTLA-4抗体、抗TIM3抗体、抗NKG2a抗体、抗ICOS抗体、抗CD137抗体、抗KIR抗体、抗TGFβ抗体、抗IL-10抗体、抗B7-H4抗体、抗Fas配体抗体、抗间皮素抗体、抗CD27抗体、抗GITR抗体、抗CXCR4抗体、抗CD73抗体、抗TIGIT抗体、抗OX40抗体、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗IL8抗体或其任何组合。在一些方面，所述蛋白质是阿巴西普NGP。在其他方面，所述蛋白质是贝拉西普NGP。
在一些方面，所述蛋白质是抗GITR(糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体家族相关基因)抗体。在一些方面，抗GITR抗体具有6C8的CDR序列，例如具有6C8的CDR的人源化抗体，如例如WO 2006/105021中所述；包含WO 2011/028683中所述的抗GITR抗体的CDR的抗体；包含JP2008278814中所述的抗GITR抗体的CDR的抗体；包含WO 2015/031667、WO 2015/187835、WO 2015/184099、WO 2016/054638、WO 2016/057841、WO 2016/057846、WO 2018/013818中所述的抗GITR抗体的CDR的抗体；或本文所述或提及的其他抗GITR抗体，将所有这些均以其整体并入本文。
在其他方面，所述蛋白质是抗LAG3抗体。淋巴细胞激活基因3(也称为LAG-3)是在人中由LAG3基因编码的蛋白质。LAG3在1990年被发现并且是对T细胞功能具有多种生物学效应的细胞表面分子。它是免疫检查点受体，并且因此是制药公司寻求开发用于癌症和自身免疫性障碍的新型治疗的各种药物开发项目的靶标。以可溶形式，它本身也正在被开发为癌症药物。抗LAG3抗体的例子包括但不限于WO 2017/087901 A2、WO 2016/028672 A1、WO2017/106129 A1、WO 2017/198741 A1、US 2017/0097333 A1、US 2017/0290914 A1和US2017/0267759 A1中的抗体，将所有这些以其整体并入本文。
在一些方面，所述蛋白质是抗CXCR4抗体。CXCR4是与G1偶联的7次跨膜蛋白。CXCR4在造血来源的细胞上广泛表达，并且是针对人免疫缺陷病毒1(HIV-1)的与CD4+的主要共受体。参见Feng,Y.,Broeder,C.C.,Kennedy,P.E.和Berger,E.A.(1996)Science 272,872-877。抗CXCR4抗体的例子包括但不限于WO 2009/140124 A1、US 2014/0286936 A1、WO2010/125162 A1、WO 2012/047339 A2、WO 2013/013025 A2、WO 2015/069874 A1、WO 2008/142303 A2、WO 2011/121040 A1、WO 2011/154580 A1、WO 2013/071068 A2和WO 2012/175576 A1中的抗体，将所有这些以其整体并入本文。
在一些方面，所述蛋白质是抗CD73(外5′-核苷酸酶)抗体。在一些方面，抗CD73抗体抑制腺苷的形成。AMP降解为腺苷导致在肿瘤微环境内产生促进癌症的发生和进展的受免疫抑制和促血管生成的微环境。抗CD73抗体的例子包括但不限于WO 2017/100670 A1、WO2018/013611 A1、WO 2017/152085 A1和WO 2016/075176 A1中的抗体，将所有这些以其整体并入本文。
在一些方面，所述蛋白质是抗TIGIT(具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体)抗体。TIGIT是免疫球蛋白的PVR(脊髓灰质炎病毒受体)家族的成员。TIGIT在几类T细胞(包括滤泡B辅助T细胞(TFH))上表达。已经显示所述蛋白质以高亲和力结合PVR；这种结合被认为有助于TFH与树突细胞之间的相互作用，以调节T细胞依赖性B细胞反应。抗TIGIT抗体的例子包括但不限于WO 2016/028656 A1、WO 2017/030823 A2、WO 2017/053748 A2、WO 2018/033798 A1、WO 2017/059095 A1和WO 2016/011264 A1中的抗体，将所有这些以其整体并入本文。
在一些方面，所述蛋白质是抗OX40(即，CD134)抗体。OX40是肿瘤坏死因子(TNF)配体家族的细胞因子。OX40在T细胞抗原呈递细胞(APC)相互作用中起作用，并且介导经激活的T细胞与内皮细胞的粘附。抗OX40抗体的例子包括但不限于WO 2018/031490 A2、WO2015/153513 A1、WO 2017/021912 A1、WO 2017/050729 A1、WO 2017/096182 A1、WO 2017/134292 A1、WO 2013/038191 A2、WO 2017/096281 A1、WO 2013/028231 A1、WO 2016/057667 A1、WO 2014/148895 A1、WO 2016/200836 A1、WO 2016/100929 A1、WO 2015/153514 A1、WO 2016/002820 A1和WO 2016/200835 A1，将所有这些以其整体并入本文。
在一些方面，所述蛋白质是抗IL8抗体。IL-8是吸引嗜中性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞，但是不吸引单核细胞的趋化因子。它还参与嗜中性粒细胞激活。它响应于炎症刺激而从几种细胞类型中释放。
在一些方面，所述蛋白质是阿巴西普(作为
Figure BDA0003369860720000271
市售)。阿巴西普(在本文中也缩写为Aba)是用于通过干扰T细胞的免疫活性来治疗自身免疫性疾病(像类风湿性关节炎)的药物。阿巴西普是由与CTLA-4的细胞外结构域融合的免疫球蛋白IgG1的Fc区构成的融合蛋白。为了激活T细胞并且产生免疫反应，抗原呈递细胞必须向T细胞呈递两种信号。这些信号之一是与抗原组合的主要组织相容性复合物(MHC)，并且另一种信号是CD80或CD86分子(也称为B7-1和B7-2)。
在一些方面，所述蛋白质是贝拉西普(商品名
Figure BDA0003369860720000272
)。贝拉西普是由与CTLA-4的细胞外结构域连接的人IgG1免疫球蛋白的Fc片段构成的融合蛋白，所述CTLA-4是调节T细胞共刺激的关键分子，从而选择性阻断T细胞激活过程。它旨在提供延长的嫁接物和移植物存活时间，同时限制由标准免疫抑制方案(诸如钙调磷酸酶抑制剂)产生的毒性。它与阿巴西普
Figure BDA0003369860720000281
只有2个氨基酸的差异。
本公开文本还涉及用于使用能够分析细胞培养基的设备进行拉曼光谱测量的设备。在一些方面，所述设备包含细胞培养基中一种或多种组分的混合物，所述设备包括：细胞培养基样品架，用于保持细胞培养基样品；激光源，用于照射由细胞培养基样品架保持的细胞培养基样品；粒子运动检测器，定位为检测在由细胞培养基样品架保持的细胞培养基样品的细胞培养基中的一种或多种组分的运动；和光谱检测器，定位为接收由激光源照射产生的来自细胞培养基样品的光谱。
在以下小节中进一步详细描述了本公开文本的各个方面。通过以下实施例进一步说明本公开文本，所述实施例不应当被视为进一步限制。将本申请通篇引用的所有参考文献的内容通过引用明确并入本文。
实施例
在一系列研究中评价了特定拉曼技术对培养基组成以及这种组成的变化率“指纹识别”的能力。结果显示，此技术可以检测由于培养基制备引起的错误、监测培养基随着时间的推移而发生的变化、以及检测由于不同的降解模式(光与热)引起的变化。还在生产生物反应器运行中测试了经受降解条件的培养基，以提供拉曼检测降解的功能确认。建立拉曼模型以定量监测培养基中的特定氨基酸和维生素，并且针对已知浓度评价模型的准确性。基于以下实施例，拉曼可以用作监测培养基变化的分析工具，并且基于拉曼的模型可以预测培养基中每种组分的水平。
实施例1
设备设置
拉曼能够从在线或离线提供的样品中提供测量。对于在线测量，我们使用了不锈钢T型连接器(图2A和图2B)。为了防止污染，首先将带有连接管(在底侧)和拉曼探针(在顶端)的T型连接器装置进行高压灭菌，并且然后按照无菌管连接程序与袋连接。使用蠕动泵使培养基运行通过连接器，并且以可调节的时间增量收集数据。在离线测量期间，使用20mL玻璃小瓶或200mL烧杯收集培养基。两种容器均被覆盖以消除拉曼散射的光干扰(图3)。评价了补料培养基和基础培养基二者。基础培养基是在过程中接种时的培养基。补料培养基含有更高浓度的许多组分，并且在整个生产过程中添加到培养物中。
优化曝光条件以从经12分钟收集的35个数据点(每20秒一个数据点)得到平均拉曼结果。平均化的数据在合理的时间量内在未使信号饱和的情况下提供了最佳分辨率。通过多变量分析对每次测量的拉曼光谱进行分析。
多变量分析是一种用于同时解释多个变量的技术。主成分分析(PCA)是可以有助于将大变量集缩小到含有所需信息的较小变量集的基于多变量的技术。在PCA中，在原始拉曼光谱占据的相同数据空间中生成称为主成分(PC)的正交变量，形成原始变量(即波数)的线性组合。第一个PC值尽可能多地解释了数据中的可变性，并且每个后续值均尽可能多地解释了剩余的可变性。PC得分可以显示哪些光谱相似或不同，即，如果两次测量的拉曼光谱相似，则PC得分将集合在一起，如果不同，则测量将发散。PC载荷图揭示了每个波数对特定PC的贡献，并且说明一种或多种主要差异的来源。所有的计算均使用由Matlab(v.8.6.2)补充的PLS_Toolbox进行。
首先将原始拉曼数据在进行PCA之前进行预处理以减少或消除数据中不相关和系统的变化。主要需要预处理以偏移基线并且去除背景噪声，即对数据进行归一化以消除潜在的缩放或增益效应并且进行变量中心化。在此研究中，使用以下预加工步骤获得最佳PCA结果：使用Savitzky-Golay算法以去除基线获得光谱的一阶导数，使用采用15的滤波器宽度拟合的二阶多项式；使用标准正态变量(SNV)对光谱进行归一化；并且将数据进行均值中心化以将差异与整个原始数据矩阵进行比较。
实施例2
对由于沉淀引起的培养基的变化的实时监测
使用上述和图2所示的设备，将概述的拉曼技术用于实时监测补料培养基。如上所述进行设置。使用上述方法每3小时获得一次拉曼测量值，并且如上所述通过将PCA应用于原始拉曼光谱来监测经四天的培养基的变化。
在此实验中，选择用于分析的区域是500-3000cm-1，因为这是与评价补料培养基组分中的变化最相关的范围。将从百分比变化图确定的PC检查用于研究拉曼数据光谱特征中的变化。数据显示所有光谱变化的>99％可以由PC1解释。图3中示出了解释光谱变化为99.15％的第一个主成分PC1，在所述图中捕获了每次测量期间的变化。到第30次测量(大约90小时(箭头所指))，PC1得分是相似的，这意味着样品在前90小时内没有变化，并且此后培养基在这个时间点开始发生物理变化，导致PC1得分出现偏离。为了更好地理解化学变化的来源，将PC1载荷值与拉曼位移的关系作图(图4)。PC1载荷图揭示了哪个波数时发生主要变化，即PC1得分(y轴)急剧变化的X截距。在图4A和图4B中标出相应的波数。根据以前的经验，假设这种变化是由于L-酪氨酸沉淀造成的。图4B示出了如在825、984、1179、1200、1326、1613、2931、2967和3062cm-1处发生的酪氨酸晶体的主要拉曼位移，这与在PC1载荷图(图4A)上观察到的拉曼位移精确匹配。因此，这种拉曼技术能够通过精确和明确鉴定酪氨酸来正确鉴定培养基变化的来源。我们预计任何从培养基中沉淀出来的氨基酸均可以通过这种技术以类似的效率进行监测。检查了这种拉曼技术检测培养基制备错误的能力。磷酸钠是生长培养基的重要组分，然而，如果添加太多或太少，所得的培养基可能对细胞生长有害。因此，具备在使用前确认磷酸盐浓度的能力是至关重要的。在本实施例中，在正常水平1.5g/L下测量培养基中磷酸钠的量，并且与正常水平的两倍(3g/L)进行比较。
通过这种拉曼技术监测包括1.5g/L磷酸钠的培养基、包括3g/L磷酸钠的培养基以及这两种溶液的混合物(以产生1.5、2.25、2.6和3g/L的浓度)，并且使用PCA方法对数据进行评价。磷酸钠在约1000cm-1处具有主要拉曼位移，并且因此选择用于分析的区域是700-1200cm-1。数据显示，前两个PC捕获了>93％的所有光谱变化。如图5所示，第一个主成分(PC1)能够准确测量添加到两种培养基中的磷酸盐的相对量。具体而言，显示磷酸钠的水平与PC1得分间接相关。一式三份运行1.5和3.0g/L样品，以显示所述技术是可重现的。重要的是，数据显示在给定相应的适当测量标准品的情况下，此技术能够区分低至0.4g/L的磷酸钠水平的变化。考虑到每次拉曼测量需要大约12分钟，从时间和成本的角度来看，发现错误所需的工作比在批次失败时发现错误要有利得多。
实施例3
监测培养基稳定性
培养基有效期是达到最佳增长率和实现预期产品属性的关键工艺参数，这通常在时间和资源密集型功能测试中确定。基础培养基和补料培养基的储存条件分别为2℃-8℃和室温，避光。为了检查所述技术识别稳定性标记物的能力，将从在标准条件下储存的基础培养基和补料培养基中收集的拉曼数据与暴露于光(10KLux)或热(36℃)两周和四周的培养基进行比较。还比较了新鲜制备的培养基和老化的(在标准储存条件下3个月)培养基，以观察这种拉曼技术是否可以在不太极端的环境下鉴定培养基差异。
如前所述，用拉曼光谱法监测所有培养基样品并且使用PCA进行评价。在此评价中，首先将数据按PC得分进行分组以将基础培养基和补料培养基进行区分，然后通过PCA进行评价以进一步解析更细微的变化。前两个PC得分表示绝大多数的变化。图6示出了PC1-PC2平面，其中PC1捕获了约96％的主要变化，并且PC2捕获了约3％的主要变化。PC1将基础培养基与补料培养基分开，其中基础培养基具有正得分，并且补料培养基具有负得分(图6)。在每个PC1集群内，将样品通过它们的降解模式和沿PC2轴的降解程度进行区分。将来自基础培养基和补料培养基的样品分别用PCA进一步处理。对于基础培养基，数据显示两个PC得分占所有光谱变化的>80％，因此这两个得分被继续使用。在图7中将在各种条件(4℃、36℃、光暴露等)下占代表性变化的约19％的PC2得分与培养基降解时间的关系作图。在此分析中，在相似的时间点，与光暴露相比，高热引起基础培养基更多的变化。数据还表明，在2℃-8℃的标准条件下储存长达3个月不会引起变化。
为了将拉曼分析与对工艺性能的影响相关联，在生产运行中使用新鲜的基础培养基和经降解的基础培养基，以观察通过拉曼观察到的PC趋势是否可以预测性能。
生产设置如下：在14天的生产运行中，使用15mL AMBR微型生物反应器以使产生单克隆抗体的CHO细胞系生长。为了评价基础培养基的效果，使用不同经降解的基础培养基用于细胞生产，并且每天一次将细胞用新鲜补料培养基进行补料。将AMBR系统连接到BeckmanCoulter的Vi-CELL细胞活力分析仪上，所述细胞活力分析仪在AMBR生产运行过程中监测细胞活力和活细胞密度(VCD)。用Roche的CEDEX HT测量抗体效价。活力％、VCD和效价是细胞生产评价的三个主要特征。
来自Ambr15基础降解研究的细胞生长参数结果呈现在图8A-图8C中。在2℃-8℃下储存的新鲜基础培养基和3个月老化的基础培养基中的细胞活力和密度非常相似，但是当使用因热或光降解的基础培养基时，观察到与新鲜培养基对照相比存在很大差异。在评价效价时观察到类似的结果，但与2周光暴露相比，4周的加热对细胞生长产生逐渐变差的影响，这与我们相比于拉曼数据时的预期相反。这种差异可以通过注意到由不同的机制进行光和热降解来解释，因此不一定会降低相同的培养基组分。无论组分是什么，拉曼均能捕获样品中的变化，而生产结果示出了经降解的组分对细胞的影响。此数据表明一种或多种组分通过热(而不是光)降解对细胞的影响更大。
为了进一步了解这些变化，使用反相HPLC技术测量了每种经降解的培养基的氨基酸含量。结果显示，Cys、Met、Trp和His是受降解影响最大的培养基中包含的氨基酸，Met、Trp和His在2周的光降解下大部分被降解，而Cys没有由于光作用发生变化。在另一方面，Cys是唯一由于热而降解的氨基酸，而其他氨基酸没有受到显著影响。图8A-图8C分别代表在光或热暴露2周和4周期间在基础培养基中这四种氨基酸水平的变化。半胱氨酸形式会影响培养基的pH，并且它是一种必需的培养基组分。因此，在图8A-图8C中观察到由于热导致的Cys降解影响了细胞生长和生产特性，而在另一方面Met、Trp和His对细胞生长没有显著影响。
还通过iCIEF评估了基础培养基降解对蛋白质质量的影响。iCIEF结果显示，在光降解(对于其他条件则不是这种情况)时，随着Met、Trp和His的降解，基本电荷变体增加。拉曼光谱法能够检测对工艺性能和产品质量二者均很重要的培养基降解。
补料培养基的变化也由PCA单独处理。补料培养基数据中超过95％的所有光谱变化均由两个PC解释。图10中的PC1得分图表示在室温下1周热降解、2周光降解和3个月老化的补料培养基样品(补料培养基的典型储存期限为约3周)。结果显示，随着补料培养基的降解，得分向PC1轴的负侧移动。比较来自新鲜培养基样品的PC1得分变化显示，与应力条件相比，在室温下的3个月期间观察到更多的降解。2周的光暴露使所述组的降解最少。
使用15mL AMBR生物反应器选择相同的样品进行生产运行，其中使用新鲜的基础培养基和新鲜与老化的补料培养基进行14天的运行。图11A-图11C中呈现了三个主要的生产结果。当使用新鲜的补料培养基时，VCD和IgG结果显示更高的峰值VCD和更高的IgG浓度，而在光、室温或加热下降解的补料培养基导致类似的VCD，但是不影响IgG效价。在整个14天的生产期间使用新鲜的补料培养基时，活力％保持在高于96％，然而当使用经降解的补料培养基时，活力在第10天时开始下降。3个月老化的补料培养基和1周加热的补料培养基具有约为89％的最低的活力，而2周光暴露的补料培养基具有约92％的活力。这些结果与通过拉曼观察到的变化和随后的基于PCA的数据评价一致。
实施例4
开发用于培养基组分的定量分析的模型
在前面的部分中，讨论了拉曼监测由于培养基制备错误或降解引起的培养基变化的能力。以下研究致力于扩展这种拉曼技术的定量应用，以鉴定培养基特定组分的变化率。
对于此研究选择了四种氨基酸，赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、天冬酰胺(Asn)和精氨酸(Arg)，因为它们容易溶解在培养基中。注意Lys、Asn和Arg不具有荧光活性，因此可能只能通过技术(像拉曼)与其他方法(像激发发射光谱法)直接检测。评价的维生素包括氰钴胺(B12)、叶酸(B9)、烟酰胺(B3)、吡哆醛HCl(B6(AL))和吡哆醇HCl(B6(INE))。
每次测量的拉曼光谱均通过偏最小二乘法(PLS)分析进行处理。PLS仅鉴定如下因素(即“潜在变量”或LV)，所述因素解释与进行预测相关的输入数据的变化。这与PCA形成对比，在后者中PC仅根据它们所代表的相对变化量来选择。
在每个实验中，将不同浓度的上述每种化学物质掺入补料培养基中，然后通过拉曼进行评价。然后将数据通过PLS处理以建立校准预测模型。例如，图12A示出了使用PLS分析基于LV1的精氨酸预测校准模型，并且图12B揭示了与制作预测模型相关的主要变化相关的波数。图12C示出了精氨酸溶液的拉曼光谱，虚线箭头将精氨酸特异性的主要拉曼位移(图12C)与建立模型所采用的波长(图12B)对齐，确认模型是基于精氨酸水平的变化建立的。可以以这种方式为每种化学物质提供独特的特征，并且采用相同的方法为本研究中的四种氨基酸和四种维生素中的每一种建立预测模型。
为了测试每种预测模型的准确性，首先使用模型来预测相关化学物质的已知浓度。然后将预测水平与理论水平进行比较，以评价模型对于每种测试的培养基组分的准确性。图13A-图13H示出了对于每种测试的培养基组分的预测模型，其中拟合线是使用已知浓度的每种化学物质建立的校准曲线的拟合线。点示出了用于建立预测模型的浓度水平。1:1线示出了测量值与预测值之间的比率为1:1，因此预测模型越强，拟合效果和1:1线覆盖越好。图13A-图13H中的菱形示出了在此研究中，对未知样品中每种氨基酸和维生素的预测水平。作为表示与理论相比的实验结果的准确性的另一种方式，图14A-图14H示出了对于每种化学物质的回收％。在这里，圆圈表示用于建立校准曲线的点，并且菱形是使用校准曲线预测的浓度。使用公式1计算回收％：
公式1：
Figure BDA0003369860720000341
虚线示出了80％至120％的回收率边界。总体而言，实验值与理论值紧密匹配，其中通常回收率为理论值的90％-110％。
实施例5
参考光谱的产生
进行了可用于拉曼分析的氨基酸和维生素参考光谱的产生，并且在图15A-图15C中可见。影响拉曼光谱测量的最佳曝光条件的三个因素是分辨率、信号饱和度和合理的光谱收集时间。可以通过增加采集次数和每次采集的曝光长度来改善分辨率，然而增加这些值将增加测量周期并且可能导致信号饱和。最初评价了三个条件，第一个条件由以每次20s持续总共大约11min共同添加35个光谱采集组成，第二个条件由以每次40s持续总共大约22min共同添加35个光谱采集组成，以及第三个条件由以每次75s持续总共大约12min共同添加10个光谱采集组成。与第一个条件相比，第三个条件在几种情况下导致过度曝光，而第二个条件没有导致信号分辨率的任何改善。最终，选择第一个条件作为拉曼光谱收集的方法。

Claims (30)

1.一种用于使用拉曼光谱法指纹识别细胞培养基和/或鉴定细胞培养基的最佳储存条件的方法，所述方法包括：收集所述细胞培养基的拉曼光谱，所述细胞培养基含有一种或多种组分的混合物，其中将所述细胞培养基的拉曼光谱与和所述一种或多种组分中的每一种相关的一个或多个参考光谱进行比较或与和参考培养基组合物相关的参考光谱进行比较。
2.一种用于使用拉曼光谱法鉴定细胞培养基中特定组分的变化率和/或实时监测细胞培养基的变化的方法，所述方法包括：收集所述细胞培养基的拉曼光谱(“收集光谱”)，其中将所述细胞培养基的拉曼光谱与和一种或多种组分中的每一种相关的参考光谱进行比较。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述参考光谱将没有降解。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中约每一小时、约每两小时、约每三小时、约每四小时、约每五小时、约每六小时、约每七小时、约每八小时、约每九小时、约每十小时、约每11小时、约每12小时、约每13小时、约每14小时、约每15小时、约每16小时、约每17小时、约每18小时、约每19小时、约每20小时、约每21小时、约每22小时、约每23小时或约每24小时收集所述细胞培养基的拉曼光谱。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述拉曼光谱是至少5个数据点、至少10个数据点、至少15个数据点、至少16个数据点、至少17个数据点、至少18个数据点、至少19个数据点、至少20个数据点、至少21个数据点、至少22个数据点、至少23个数据点、至少24个数据点、至少25个数据点、至少26个数据点、至少27个数据点、至少28个数据点、至少29个数据点、至少30个数据点、至少31个数据点、至少32个数据点、至少33个数据点、至少34个数据点、至少35个数据点、至少36个数据点、至少37个数据点、至少38个数据点、至少39个数据点、至少40个数据点、至少41个数据点、至少42个数据点、至少43个数据点、至少44个数据点、至少45个数据点、至少46个数据点、至少47个数据点、至少48个数据点、至少49个数据点或至少50个数据点的平均值。
6.根据权利要求5所述的方法，其中每10秒、每15秒、每20秒、每25秒、每30秒、每35秒、每40秒、每45秒、每50秒、每55秒或每60秒测量每个数据点。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述拉曼光谱通过多变量分析进行分析。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述多变量分析是主成分分析(PCA)。
9.根据权利要求7所述的方法，其中所述PCA产生所述拉曼光谱的PC得分。
10.根据权利要求7所述的方法，其中所述多变量分析是偏最小二乘法分析(PLS)，并且其中所述分析产生校准预测模型。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，所述方法进一步包括比较所述细胞培养基的收集光谱。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述比较包括所述收集光谱的PC得分与所述参考光谱的参考PC得分的比较。
13.根据权利要求11或12所述的方法，所述方法进一步包括当所述收集光谱的PC得分与所述参考光谱的参考PC得分不同时，确定所述细胞培养基被降解。
14.根据权利要求11或12所述的方法，所述方法进一步包括当所述收集光谱的PC得分高于所述参考光谱的参考PC得分时，确定所述细胞培养基被降解。
15.根据权利要求11或12所述的方法，所述方法进一步包括当所述收集光谱的PC得分低于所述参考光谱的参考PC得分时，确定所述细胞培养基被降解。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基被降解，并且与未经降解的培养基相比，所述经降解的细胞培养基使培养中的多个细胞的活力降低约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基被降解，并且与未经降解的培养基相比，所述经降解的细胞培养基使培养中的细胞的活细胞密度降低约1x106个细胞/mL、约2x106个细胞/mL、约3x106个细胞/mL、约4x106个细胞/mL、约5x106个细胞/mL、约6x106个细胞/mL、约7x106个细胞/mL、约8x106个细胞/mL、约9x106个细胞/mL、约10x106个细胞/mL、约11x106个细胞/mL或约12x106个细胞/mL。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的方法，其中所述细胞培养基被降解，并且与未经降解的培养基相比，所述经降解的细胞培养基使培养中的细胞的抗体产生效价降低约0.1g/L、约0.2g/L、约0.3g/L、约0.4g/L、约0.5g/L、约0.6g/L、约0.7g/L、约0.8g/L、约0.9g/L、约1.0g/L、约1.1g/L、约1.2g/L、约1.3g/L、约1.4g/L、约1.5g/L、约1.6g/L、约1.7g/L、约1.8g/L、约1.9g/L、约2.0g/L、约2.1g/L、约2.2g/L、约2.3g/L、约2.4g/L、约2.5g/L、约2.6g/L、约2.7g/L、约2.8g/L、约2.9g/L或约3.0g/L。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中将所述一个或多个参考光谱的标记物添加到所述细胞培养基中。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述标记物不是葡萄糖。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述标记物不是乳酸盐。
22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述标记物是氨基酸或维生素。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述标记物选自赖氨酸(Lys)、天冬酰胺(Asn)、丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酸(Glu)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)或缬氨酸(Val)。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述标记物是酪氨酸。
25.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述标记物选自氰钴胺(B12)、叶酸(B9)、烟酰胺(B3)、吡哆醛HCl(B6(AL))和吡哆醇HCl(B6(INE))。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中在以下范围内测量所述拉曼光谱：从约500cm-1至约1700cm-1、从约500cm-1至约1800cm-1、从约500cm-1至约1900cm-1、从约500cm-1至约2000cm-1、从约500cm-1至约2100cm-1、从约500cm-1至约2200cm-1、从约500cm-1至约2300cm-1、从约500cm-1至约2400cm-1、从约500cm-1至约2500cm-1、从约500cm-1至约2600cm-1、从约500cm-1至约2700cm-1、从约500cm-1至约2800cm-1、从约500cm-1至约2900cm-1或从约500cm-1至约3000cm-1。
27.根据权利要求26中任一项所述的方法，其中在500cm-1至3000cm-1的范围内测量所述拉曼光谱。
28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，所述方法包括当所述收集光谱的PC得分与所述参考光谱的参考PC得分相同或与其相似约10或更少、约9或更少、约8或更少、约7或更少、约6或更少、约5或更少、约4或更少、约3或更少、约2或更少或者约1或更少时，确定所述细胞培养基是稳定的。
29.根据权利要求1-28所述的方法，其中确定所述细胞培养基储存约八天、约九天、约十天、约11天、约12天、约15天、约16天、约17天、约18天、约19天、约20天、约21天、约22天、约23天、约24天、约25天、约26天、约27天、约28天、约29天、约30天、约一个月、约1.5个月、约40天、约50天、约60天、约两个月、约70天、约80天、约90天、约三个月、约100天、约110天、约120天、约4个月、约五个月或约六个月。
30.一种用于对细胞培养基样品进行光谱研究的设备，所述细胞培养基样品包含细胞培养基中一种或多种组分的混合物，所述设备包括：细胞培养基样品架，用于保持所述细胞培养基样品；激光源，用于照射由所述细胞培养基样品架保持的所述细胞培养基样品；粒子运动检测器，定位为检测在由所述细胞培养基样品架保持的所述细胞培养基样品的所述细胞培养基中的一种或多种组分的运动；和光谱检测器，定位为接收由所述激光源照射产生的来自所述细胞培养基样品的光谱。
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