KR20160138403A - 막-기반의 세포 체류 시스템을 이용한 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 방법 - Google Patents

Abstract

본원의 개시 내용은 재조합 단백질, 특히 rFVIII, B-도메인 제거된 rFVIII, rFIX 또는 rFVII/rFVIIa와 같은 응고 단백질의 세포발현을 개선시키기 위한, 세포 관류 배양과 함께 막-기반의 외부 세포 체류 시스템을 사용하는 새로운 용도를 제공한다. 이 시스템을 고 밀도의 세포에 사용하는 경우, 체류 시스템의 운영 중에 발생되는 기계적인 힘, 예를 들어 섬유를 통한 펌핑으로 발생되는 세포 순환으로 인해 보다 균질한 세포 배양이 달성된다.

Description

막-기반의 세포 체류 시스템을 이용한 재조합 단백질의 발현을 증가시키는 방법 {ENHANCEMENT OF RECOMBINANT PROTEIN EXPRESSION USING A MEMBRANE-BASED CELL RETENTION SYSTEM}

관련 출원에 대한 교차-참조

본 출원은 2014년 2월 17일자 미국 특허 출원 61/940,493을 기초로 하며, 이에 대해 우선권을 주장한다.

재조합 단백질은 배치 방식 또는 연속 (관류) 방식으로 운영되는 세포 배양 공정을 이용해 생산되고 있다. 관류 방식은, 배치 운영 방식과 비교해 더 높은 세포 밀도를 유지할 수 있어, 더 높은 용적 수율 (volumetric yield, 생산량/부피/일)을 나타낸다.

관류식 운영은 산업계에서 단일클론 항체, 응고 단백질 등의 혈액 인자들, 효소 및 기타 치료 단백질과 같은 재조합 생물학적 제품을 생산하기 위해 이용되고 있다. 관류 시스템을 이용하는 주된 이유는 생물반응기에 세포를 체류시켜, 생물반응기 용적 당 생산되는 생산물의 양을 현저하게 증가시키기 위함이다. 실험실에서, 그리고 대량 생산용으로 성공적으로 실현된 세포 체류 장치가 몇가지 시판되고 있다. 세포 밀도의 증가는 문헌들을 통해 입증되어 있지만, 외부 세포 체류 막을 이용한 관류 시스템으로 인한 세포 생산성 증가에 대해서는 본 발명자들이 알고 있는 한 보고된 바 없다.

이 분야에서 주목할만한 2가지 참조문헌은 다음과 같다: 1) S. S. Ozturk and D. S. Kompala, Optimization of High cell Density Perfusion Bioreactors, in Cell Culture Technology for Pharmaceutical and Cell-Based Therapies, Edited by Sadettin S. Ozturk and Wei-Shou Hu, CRC Press 2005, Pages 387-416; 및 2) W. M. Woodside, B.D. Bowen, and J. M. Piret, Mammalian Cell Retention Devices for Stirred Perfusion Bioreactors, Cytotechnology, 1998, November; 28(1-3): 163-175.

첫번째 문헌, Ozturk et ai, 2005는, 키모스탯 생물반응기 (chemostat bioreactor)와 비교해 세포 밀도가 높은 관류 생물반응기의 이점과 이러한 생물반응기의 취급 방법을 기술하고 있다. 관류 시스템은 영양분의 연속 유입과 구 배지 (old media)의 배출이 커플링된 것으로서, 세포는 생물반응기내에 전부 또는 일부 체류한다. 관류식 생물반응기의 주된 이점 중 한가지는 높은 단백질 생산율이다. 세포를 관류 생물반응기 내부에, 그리고 외부에 체류시키는, 여러가지 방법들이 존재하고 있다. 비-균질한 배양에 유용한 이러한 시스템들이 상기 문헌에 상세히 기술되어 있는데, 고정 (비-유동)층, 세라믹 매트릭스 고정화, 중공사 반응기, 마이크로앤캡슐레이션 및 마이크로포러스 매트릭스 유동화 시스템 등이 있다. 균질한 배양을 위한 세포 체류 시스템은, 사용되는 현탁 배양물에서 확인되는 균일한 환경으로 인해 생산 규모 확대, 모니터링 및 통제가 상대적으로 용이하기 때문에, 산업계에서는 대개 포유류 세포 배양에 이용하고 있다.

스핀 필터 (생물반응기 내부) 및 외부 여과, 예컨대 ATF (alternating tangential flow), 세포 침전 (수직 침강 및 경사 침강 포함), 원심분리, 초음파 분리 및 하이드로사이클론 (hydro cyclone)을 포함하여, 포유류 세포 배양에 사용되는 다수의 세포 체류 장치들이 논의되어 있다.

평판 카트리지와 중공사 카트리지 둘다 외부 여과에 사용되고 있다. 장치의 막힘 현상이 문제일 수 있지만, 막힘 현상으로 흐름이 허용치 미만으로 느려지면, 일반적으로 5 - 7일마다, 외부 필터를 교체할 수 있다.

상기한 2번째 참조 문헌인 Woodside et al., 1998, Cytology 역시 교반형 관류 생물반응기에 대한 포유류 세포 체류 장치를 기술하고 있다. Woodside는, 관류 반응기 설계 및 작동에 있어 중대한 문제로 세포 체류 장치의 신뢰성을 지적하고 있는데, 그 이유는 세포 배양 시스템에서의 변동이 거대 치료 단백질의 번역 후 수정에 비-일관성을 야기하며, 그로 인해 해당 관청으로부터 단백질 시판 허가를 받기 위해서는 일관된 처리 성능과 제품 품질을 입증해야 하기 때문이다.

중공사 카트리지와 평판 카트리지는 십자류 필터 (cross-flow filter) 타입이다. 사용시, 생물반응기의 현탁물이 외부 카트리지로 펌핑되고, 막을 통과하면서 현탁물은 농축된다. 농축된 현탁물 스트림은 반응기로 재순환되고, 무-세포성 투과물은 유출 스트림이 된다 (Woodside, pgs. 164-166).

이러한 방법과 관련된 전술한 참조문헌 외에도, 본 발명자들은 3개의 참조문험에 주목한다. 1) US2009/0263866, Novo Nordisk, Inc. 사의 미국 특허 출원, 2) WO2011/012727, Baxter Healthcare SA 및 Baxter International Inc. 공동 출원의 국제 출원, 및 3) 스웨덴 FSACT 2001에서 WAVE BioTech 사의 발표 내용.

USSN'866은 포유류 세포에서 재조합 FVII를 공업적인 규모로 무-혈청 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 출원은 배치, 피드 배치 및 관류 등의 다양한 세포 배양 방법들을 개략적으로 설명하고 있다. 배양 바셀내에 사용하기 위한 것으로, 외부 장착 헤드 (settling head), 내부 장착 헤드, 연속 원심분리, 내부 또는 외부 스핀 필터, 외부 필터 또는 중공사 카트리지, 초음파 세포 분해 장치 및 배양 바셀 내측의 긴 파이프를 비롯하여, 다수의 세포 체류 장치들이 제시되어 있다 (페이지 7, 0106-0113). 사용되는 세포주는 CHO이었다. 이 출원은 세포 체류 시스템으로서 마이크로캐리어의 용도에 주로 집중하고 있다.

WO'725는 대상 폴리펩타이드 또는 바이러스를 연속 세포 배양으로 생산하는 방법에 관한 것이다. 이 출원에는, 관류 개방 시스템과 키모스탯 개방 시스템의 장점을 결합한 '키모스탯-유사' 연속 세포 배양 시스템이 기술되어 있다. 이 하이브리드 시스템은 포유류 세포 배양에 사용된다. 언급된 세포 체류 시스템은 마크로포러스 마이크로캐리어, 예를 들어 셀룰로스-계 입자 (cellulose-based particle)이다.

특히 대상이 되는 폴리펩타이드는 프롬보스폰딘 타입 1 모티프 13 (ADAMTS 13) 단백질을 가진, 디스인테그린-유사 (disintegrin-like) 및 메탈로펩티다제이다.

WAVE 바이오테크의 발표 내용에는 일회용 생물반응기에서의 세포 관류 배양이 언급되어 있는데, 특히 "새로운 컨셉 - 부유성 필터 (floating filter)"에 관한 것이다. 이 부유성 관류 필터는 Wave Bioreactor® 안에서 물결의 이동에 따라 움직이다.

이들 참조문헌들 모두, 세포 밀도를 높여 보다 높은 용적 생산성을 달성하기 위해, 주요 관심사는 관류의 사용이었다. 또한, 양호한 제품 품질과 균일성 측면에서 관류의 이점이 기술되어 있다. 본 발명의 효용성은 세포 생산성을 높이는 것이며, 이는 세포 관류 배양 시스템과 조합하여 외부 막-기반의 세포 체류 시스템을 채택 및 운영함으로써 달성되었다.

본 발명은 관류 생물반응기와 함께 외부 막-기반의 세포 체류 시스템을 사용하는 것을 포함하는, 포유류 세포의 세포발현을 높이는 방법을 제공한다. 바람직한 포유류 세포는 CHO, BHK 및 인간 세포이다. 재조합 단백질은 막-기반의 세포 체류 시스템을 이용하여 발현시키기에 특히 적합한 후보물질이다. 본 시스템은, 재조합 Factor IX (rFIX), 재조합 Factor VIII (rFVIII), B-도메인 제거된 재조합 VIII (BDD rFVIII), 재조합 Factor FVII 및 재조합 Factor VIIa (rFVII/rFVIIa)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 응고 단백질을 생산하기 위해, 관류 세포 배양과 함께 사용가능하다. 본 방법은 일회용 생물반응기와 일회용 외부 막-기반의 세포 체류 시스템을 포함하는 일회용 관류 시스템을 이용함으로써, 최적화될 수 있다. 바람직한 막-기반의 세포 체류 시스템은 중공사로 구성된다.

도 1은 x-축에 일(수)와 y-축에 BDD rFVIII 생산물에 대한 상대적인 (표준화된) 역가를 나타낸 것이다.
도 2는 x-축에 일(수)와 y-축에 비생산성 (specific productivity) (표준화됨)을 나타낸 것이다.

막 시스템은 Refine Technologies (Pine Brook, NJ) 사로부터 입수하였다. 각 도면에서 ■는 종래의 비-막형 세포 체류 시스템, 즉 Applikon (Foster City, CA) 사로부터 입수한 BioSep의 결과를 나타낸다. 각 도면에서 ○는 Refine Technologies (Pine Brook, NJ.) 사로부터 입수한 막-기반의 세포 체류 시스템의 결과를 나타낸다. 생물반응기는 B-도메인-제거된 rFVIII인 대상 재조합 단백질을 생산할 수 있는 CHO 세포주에 대해 동일한 조건에서 운영되었다.

본 데이타는, 2012년에, 막-기반의 체류 시스템을 사용하여 그 성능을 종래의 비-막형 세포 체류 시스템과 비교하여 수득하였다. 도면들에 따르면, 막-기반의 체류 시스템은 세포의 역가와 비생산성을 명확하게 2배 증가시켰다. 이들 생물반응기는 동일 세포, 배지를 이용하여 운영하였고, 동일한 pH, 온도 등을 이용해 가동하였다.

세포 생산성 (생산물의 양/세포/일)은 세포의 고유 특성으로, 운영 방식에 따른 변동은 예상되지 않는다. 본원에서, 본 발명자들은 직접적으로 세포 환경과 세포의 생리학적 상태를 생물반응기 안에서 제어함으로써, 세포로부터 단백질 발현에 실제적으로 영향을 미칠 수 있는, 세포 관류 배양 시스템을 제공한다. 본 발명은, 세포 뿐만 아니라 배양 중에 발생하는 세포-유래 인자들을 체류시키는 외부 세포 체류 막을 관류 시스템과 조합 사용함으로써, 세포 생산성을, 특히 포유류 세포에서 세포 생산성을 향상시킨다. 본 발명은 CHO, BHK 및 인간 세포주와 같은 수많은 포유류 세포 배양, 특히 CHO에 적용가능하며, 다수의 재조합 단백질들, 예를 들어, 재조합 Factor IX (rFIX), 재조합 Factor VIII (rFVIII), B-도메인 제거된 재조합 FVIII (BDD rFVIII), 재조합 Factor VII 및 재조합 Factor VIIa (rFVII/rFVIIa)의 발현에 적용가능하다. 세포 체류 막은 플랫 멤브레인 (flat membrane)일 수 있으며, 바람직하게는 중공사막일 수 있다.

재조합 단백질의 세포 배양에 있어 막-기반의 세포 체류 시스템의 사용은 2011년에 기업 파트너와의 논의 도중에 떠올랐다. 일부 전문가들은 이 아이디어를 무시하였지만, 다른 (비-막형) 세포 체류 시스템과 비교 테스트를 통해, 생산성이 50% 이상, 최대 100% (더블)까지 현저하게 향상되는 것으로 입증되었다.

바람직한 구현예에서, 생물반응기와 세포 체류 막 시스템 둘다 일회용 물질로 제조되어, 한번 사용되며, 세척이 필요하지 않으며, 스팀 처리 및 경질 파이프 시스템이 요구되지 않는다. 바람직한 세포 체류 막은 생물반응기의 외부에 위치하며, 중공사로 구성된다.

생물반응기로서 사용될 수 있는 적절한 일회용 용기는 GE Healthcare 사의 상품명 Wave 또는 Xcellerex, ThermoFisher 사의 상품명 Hyclone SUB 및 Sartorius 사의 상품명 Biostat STR 등의, 여러 상업적인 제조사로부터 구입할 수 있다.

외부 세포 체류 카트리지에 사용하기 위한 평판 세포막과 중공사막은, GE Healthcare (Boston, MA), Spectrum Labs (Rancho Dominguez, CA), Refine Technologies (Pine Brook, NJ) 또는 Pall Corporation (Port Washington, NY)로부터 구입할 수 있다.

실시예

관류 생물반응기 2 세트를 동일 조건 (pH, 온도, 세포 밀도, 용존 산소, 용적 유속, 배지, 세포주 등) 하에 운영하였으며, 하나에는 막-기반의 관류 시스템 (Bioreactor run 3D53)을 다른 하나에는 비-막형 시스템 (Bioreactor run 3D51)이 사용되었다. 이들 생물반응기내 세포 밀도는 동일 수준에서 통제하였으며, 생물반응기에서 생산성을 매일 체크하여 역가 (생산물 농도)를 측정하였다. 세포 밀도와 생물반응기 생산성을 기초로, 세포 비(세포)생산성을 계산하였다.

막 시스템은 Refine Technologies (Pine Brook, NJ) 사로부터 입수하였다. 종래의 비-막형 시스템, BIOSEP는 Applikon (Foster City, CA) 사로부터 입수하였다.

도면들에 따르면, 막-기반의 체류 시스템은 세포의 역가와 비생산성을 명확하게 2배 증가시킨다. 도 2 및 2에서 ■는 종래의 비-막형 세포 체류 시스템인 Applikon (Foster City, CA) 사로부터 입수한 BioSep의 결과를 나타낸 것이다. 각 도면에서 ○는 Refine Technologies (Pine Brook, NJ.) 사에서 입수한 막-기반의 세포 체류 시스템의 결과를 나타낸 것이다.

전술한 내용을 감안하여, 당해 기술 분야의 당업자들은 수많은 변형들을 가할 수 있을 것으로 생각된다. 따라서, 전술한 설명과 실시예는 단순 예로서 해석되어야 하며, 본 발명의 범위는 후술하는 청구항으로만 한정되어야 하는 것으로 의도된다.

Claims (9)

1. 세포 관류 배양 (perfusion cell culture)과 함께 막-기반의 외부 세포 체류 시스템 (membrande-based external cell retention system)을 사용하는 것을 포함하는 포유류 세포의 세포발현을 높이는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 포유류 세포의 세포발현을 높이는 방법은 재조합 단백질을 생산하는데 사용되는, 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 발현되는 재조합 단백질이 응고 단백질인, 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 발현되는 응고 단백질이 재조합 Factor IX, 재조합 FVIII, B-도메인-제거된 재조합 Factor FVIII, 재조합 VII 및 재조합 VIIa로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
5. 제1항에 있어서, 상기 포유류 세포가 CHO, BHK 및 포유류 세포로부터 선택되는, 방법.
6. 제5항에 있어서, 상기 세포 관류 배양과 함께 사용되는 막-기반의 외부 세포 체류 시스템이 B-도메인-제거된 재조합 Factor VIII을 발현시킬 수 있으며, B-도메인-제거된 재조합 Factor VIII의 생산을, 막 여과 시스템을 사용하지 않는 세포 체류 시스템으로 수득되는 생산과 비교해, 50% 이상 증가시키는, 방법.
7. 제1항에 있어서, 상기 세포 관류 배양이 일회용 생물반응기에서 수행되는, 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 막-기반의 세포 체류 시스템이 일회용인, 방법.
9. 제1항에 있어서, 관류 시스템을 수용하는 상기 생물반응기와 상기 막-기반의 외부 세포 체류 시스템이 일회용이므로, 상기 세포 배양 시스템은 일회용인, 방법.

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