KR20200019882A - 세균 균주를 포함하는 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 중추신경계 장애 및 병태를 치료 및 예방하기 위해 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 포유동물 소화관으로부터 단리된 세균 균주를 포함하는 조성물 및 질환의 치료에서의 그와 같은 조성물의 용도의 분야이다.
인간 장은 자궁내에서 멸균인 것으로 생각되지만, 출생 직후 아주 다양한 모계 및 환경 미생물에 노출된다. 그 후에, 미생물 군집화 및 연속의 동적 기간이 발생하고, 이는 인자 예컨대 전달 방식, 환경, 다이어트 및 호스트 유전자형에 의해 영향받고, 이들 모두는, 특히 초기 생애 동안, 장내 미생물총의 조성에 영향을 미친다. 후속으로, 미생물총은 안정화하고 성인형이 된다 [1]. 인간 장내 미생물총은 2개의 주요한 박테리아 분할, 박테로이데테스 및 피르미쿠테스에 본질적으로 속하는 500 초과 내지 1000의 상이한 계통형을 함유한다 [2]. 인간 소화관의 박테리아 군집화에서 발생하는 성공적인 공생 관계는 다양한 대사, 구조, 보호성 및 다른 유익한 기능을 가져왔다. 군집화된 소화관의 향상된 대사 활동은 달리 소화불가능한 식이 성분이 숙주에 중요한 영양소 원천을 제공하는 부산물의 방출로 분해되는 것을 확신한다. 유사하게, 장내 미생물총의 면역학적 중요성은 널리 인식되고 공생 박테리아의 도입 이후 기능적으로 재구성되는 손상된 면역계를 갖는 무균 동물에서 예시된다 [3-5].
인간 미생물군집의 크기 및 복잡성의 발견은 건강 및 질환의 많은 개념의 온-곰그 (on-gomg) 평가를 초래하였다. 틀림없이, 미생물총 조성에서 극적인 변화는 위장 장애 예컨대 염증성 장 질환 (IBD)에서 문서로 기록되었고 [6-9], 더욱 최근에, 인간 뇌 질환에서 병리생리적 역할을 할 수 있는 소화관 미생물군집에서 교번에 관한 당업계에서 관심이 증가된다 [10]. 전임상 및 임상 증거는 뇌 발달과 미생물총 사이 관계를 강하게 시사하고 있다 [11].
전임상 문헌의 증가하는 증거물은, 다중 신경분비 및 내분비 신호전달 시스템을 포함하는, 뇌와 소화관 미생물군집 사이 양방향 신호전달을 실증하였다. 사실상, 미생물군집내 클로스트리듐 종의 증가된 수준은 뇌 장애에 연결되었고 [12], 박테로이데테스 및 피르미쿠테스 파일라의 불균형은 또한 뇌 발달 장애에 연루되었다 [13]. 비피도박테리아, 락토바실러스, 숫테렐라, 프레보텔라 및 루미노코쿠스 속 및 알칼리게나세아에 과의 것을 포함하는, 소화관 공생의 변경된 수준이 면역-매개된 중추신경계 (CNS) 장애에 관여된다는 제안은 환자와 건강한 대상체 사이 미생물총에서 변경의 부족을 시사하는 연구에 의해 의문이 든다 [14]. 이것은, 현재는, 미생물군집과 인간 뇌 질환 사이의 관계의 실제적인 효과가 저조하게 특성규명되는 것을 나타낸다. 따라서, 더욱 직접적인 분석적 연구는 CNS 장애에 관한 미생물군집 변경의 치료적 영향을 확인하도록 요구된다.
특정 세균 균주가 동물 소화관에서 가질 수 있는 잠재적인 긍정적인 효과의 인식에서, 다양한 균주는 다양한 질환의 치료에서 사용을 위하여 제안되어 왔다 (참고, 예를 들어, [14-17]). 또한, 대부분 락토바실러스 및 비피도박테리아 균주를 포함하는, 특정 균주는 장에 직접적으로 연결되지 않는 다양한 염증성 및 자가면역 질환에서 치료를 위하여 제안되어 왔다 (참조 [18] 및 [19] 검토용). 또한, 생균제의 범위는 정서 행동 조절에서 소화관 미생물군집의 역할을 결정하기 위해 동물 모델에서 조사되어 왔고, 비피도박테리아 및 락토바실러스는 유익한 효과를 나타내는, 불안 및 반복적인 행동을 감소시키는, 그리고 사회적 상호작용을 증가시키는 주요 속이다 [20-22]. 그러나, 상이한 질환과 상이한 세균 균주 사이의 관계, 그리고 소화관 및 전신 수준에서 그리고 질환의 임의의 특정 유형에서 특정 세균 균주의 정확한 효과는, 특히 중추신경계 질환에 대하여 저조하게 특성규명된다.
미생물총-소화관-뇌 축이 자폐 스펙트럼 장애 (ASD) 및 다른 신경발달 및 신경정신 장애에서 영향받는다는 것을 제안하기 위한 증가하는 증거물이 있다. 동물 모델은 미생물총이 ASD에서 관여될 수 있는 방법에 대한 상당한 통찰력을 제공하였다. 게다가, 전임상 연구는 유익한 살아있는 생물학적 치료제의 투여를 통해 장내 미생물총 표적화가, 모계 면역 활동화 (MIA) 마우스 모델 및 블랙 및 탄, 브라키우릭 (BTBR) 마우스를 포함하는, 동물 모델에서 자폐성-관련된 행동 개선에 효능을 나타내는 것을 실증하였다. BTBR 마우스는 ASD 예컨대 손상된 사회성, 반복적인 행동 및 증가된 불안과 연관된 수많은 행동을 나타내는 유전자 변형된, 근친교배한 마우스 균주이다. 나아가, 이들 마우스는 또한 장내 미생물총의 조성에 대한 변경과 함께 위장 기능이상을 나타낸다. 결과적으로, ASD에서 미생물총-소화관-뇌 축의 역할을 조사하기 위한 적절한 동물 모델을 나타낸다.
따라서, 중추신경계 장애의 신규한 치료 방법에 대한 요건이 당업계에 있다. 또한 소화관 박테리아를 사용하는 신규한 요법이 개발될 수 있도록 소화관 박테리아의 잠재적인 효과가 특성규명되기 위한 요건이 있다.
본 발명자들은 중추신경계 장애를 치료 및 예방하기 위해 신규한 요법을 개발했다. 특히, 본 발명자들은 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 및 예방하기 위해 신규한 요법을 개발했다. 특히, 본 발명자들은, 블라우티아 속의 세균 균주가 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 질환 및 병태를 치료 및 예방하는데 효과적일 수 있는 것을 확인했다. 실시예에서 기재된 바와 같이, 블라우티아 균주를 포함하는 조성물의 경구 투여는 자폐 스펙트럼 장애의 마우스 모델에서 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상과 연관된 증상을 감소시킬 수 있다. 또한, 실시예에서 기재된 바와 같이, 블라우티아 균주를 포함하는 조성물의 경구 투여는 미생물총-소화관-뇌 축의 기능, 및 신경발달 및 신경정신의학 장애와 연관된 신호전달 분자의 수준을 조절할 수 있다.
따라서, 제1 구현예에서, 본 발명은 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 스테르코리스를 사용하는 조성물은 중추신경계 장애 또는 병태를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 중추신경계 장애 또는 병태는 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된다. 추가 구현예에서, 본 발명은 신경발달 장애 또는 신경정신 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 신경발달 장애 또는 신경정신 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 스테르코리스를 사용하는 조성물은 신경발달 장애 또는 신경정신 병태를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 신경발달 장애 또는 신경정신 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명자들은, 이러한 속으로부터 세균 균주에 의한 치료가 중추신경계 장애, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 것들의 마우스 모델에서의 임상 이득을 제공할 수 있음을 확인했다. 본 발명자들은, 이러한 속으로부터 세균 균주에 의한 치료가 중추, 자율신경 및 장용 신경계에서 신호전달을 조절할 수 있고; 시상하부-뇌하수체-부신 (HPA) 축 경로의 활동을 조절할 수 있고; 신경내분비 및/또는 신경면역 경로를 조절할 수 있고/거나; 대상체의 공생 대사물, 염증성 마커 및/또는 위장 투과도의 수준을 조절할 수 있음을 확인했다. 블라우티아 스테르코리스를 사용하는 조성물은 중추, 자율신경 및 장용 신경계에서 신호전달을 조절하고; 시상하부-뇌하수체-부신 (HPA) 축 경로의 활동을 조절하고; 신경내분비 및/또는 신경면역 경로를 조절하고/거나; 대상체의 공생 대사물, 염증성 마커 및/또는 위장 투과도의 수준을 조절하는데 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서 블라우티아를 사용하는 조성물 훽슬레라에가 또한, 효과적일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 하기로 구성된 군으로부터 질환 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법에서 사용되는 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다: 자폐 스펙트럼 장애 (ASD); 아동 발달 장애; 강박 장애 (OCD); 주요 우울 장애; 우울증; 계절성 정서적 장애; 불안 장애; 만성 피로 증후군 (근육통성 뇌척수염); 스트레스 장애; 외상후 스트레스 장애; 정신분열증 스펙트럼 장애; 정신분열증; 양극성 장애; 정신병; 기분 장애; 치매; 알츠하이머; 파킨슨병; 및/또는 만성 통증. 추가 구현예에서, 본 발명의 조성물은 다발성 경화증; 운동 뉴런 질환; 헌팅턴병, 길랑-바레 증후군 및/또는 수막염을 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 미생물총-소화관-뇌 축에 대한 그리고 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 질환에 대한 블라우티아 속으로부터의 세균 균주에 대해 나타낸 효과는 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 다른 질환 및 병태, 예컨대 상기에 열거된 것들에 대한 치료적 이점을 제공할 수 있다. 다른 구현예에서, 본 발명은 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 질환 및 병태와 연관된 동반이환, 예컨대 상기에 열거된 것들을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 질환 및 병태, 예컨대 상기에 열거된 것들 와 연관된 위장 동반이환을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 자폐 스펙트럼 장애의 증상의 평가에 대한 본원에서 사용된 마우스 모델 실험은 상기에 열거된 것들을 포함하는 다른 중추신경계 장애의 증상의 평가에 대해 적용가능한 것으로 당해 기술에 공지되어 있다 [23-25].
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 자폐 스펙트럼 장애, 예컨대 자폐증을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명자들은, 블라우티아 균주에 의한 치료가 자폐 스펙트럼 장애의 마우스 모델에서 증상 중증도를 감소시킬 수 있고 정형, 반복적인, 강박성 및 불안해하는 행동을 예방 또는 감소시킬 수 있음을 확인했다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 자폐 스펙트럼 장애의 치료를 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아를 사용하는 조성물은 자폐 스펙트럼 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 특히 자폐 스펙트럼 장애의 치료에서 정형, 반복적인, 강박성 또는 불안해하는 행동을 감소시키는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 자폐 스펙트럼 장애의 행동 증상의 치료에서 사용하기 위한 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 자폐 스펙트럼 장애의 위장 증상의 치료에서 사용하기 위한 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 자폐 스펙트럼 장애의 행동 및 위장 증상의 치료에서 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 균주에 의한 치료는 중추, 자율신경 및 장용 신경계에서 신호전달을 조절할 수 있고; HPA 축 경로의 활동을 조절할 수 있고; 신경내분비 및/또는 신경면역 경로를 조절할 수 있고/거나; 대상체의 공생 대사물, 염증성 마커 및/또는 위장 투과도의 수준을 조절할 수 있고, 이들 모두는 자폐 스펙트럼 장애의 신경병리학과 연루된다. 특정 구현예에서, 블라우티아 균주에 의한 치료는 옥시토신 및/또는 바소프레신 호르몬의 수준을 조절할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 자폐 스펙트럼 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 스테르코리스를 사용하는 조성물은 자폐 스펙트럼 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 자폐 스펙트럼 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 강박 장애 (OCD)를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 OCD의 치료에서 정형, 반복적인, 강박성 또는 불안해하는 행동을 감소시키는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 블라우티아 균주에 의한 치료는 중추, 자율신경 및 장용 신경계에서 신호전달을 조절할 수 있고; HPA 축 경로의 활동을 조절할 수 있고; 신경내분비 및/또는 신경면역 경로를 조절할 수 있고/거나; 대상체의 공생 대사물 및/또는 위장 투과도의 수준을 조절할 수 있고, 이들 모두는 OCD의 신경병리학과 연루된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 OCD를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 스테르코리스를 사용하는 조성물은 OCD를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 OCD를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 주요 우울 장애 (MDD)을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 균주에 의한 치료는 우울증의 마우스 모델에서 임상 이득을 제공할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 우울증의 치료에 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 균주를 사용하는 조성물은 우울증를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 우울증의 치료에서 정형, 반복적인, 강박성 또는 불안해하는 행동을 감소시키는데 사용되는 조성물을 제공한다. 블라우티아 균주에 의한 치료는 중추, 자율신경 및 장용 신경계에서 신호전달을 조절할 수 있고; HPA 축 경로의 활동을 조절할 수 있고; 신경내분비 및/또는 신경면역 경로를 조절할 수 있고; 그리고 대상체의 공생 대사물, 염증성 마커 및/또는 위장 투과도의 수준을 조절할 수 있고, 이들 모두는에 연루된다 MDD의 신경병리학. 특정 구현예에서, 블라우티아 균주에 의한 치료는 옥시토신 및/또는 바소프레신 호르몬의 수준을 조절할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 MDD를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 스테르코리스를 사용하는 조성물은 MDD를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 MDD를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 불안 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 균주에 의한 치료는 본원의 실시예에서 불안의 마우스 모델 에서 질환 발병률 및 질환 중증도를 감소시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 불안 장애의 치료에 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 균주를 사용하는 조성물은 불안 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 불안의 치료에서 정형, 반복적인, 강박성 또는 불안해하는 행동를 감소시키는데 사용하기 위한 조성물을 제공한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 불안 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 스테르코리스를 사용하는 조성물은 불안 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 불안 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 스트레스 장애, 예컨대 외상후 스트레스 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용되는, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물은 스트레스 장애의 마우스 모델에서 스트레스를 감소시킬 수 있다. 블라우티아 균주에 의한 치료는 중추, 자율신경 및 장용 신경계에서 신호전달을 조절할 수 있고; HPA 축 경로의 활동을 조절할 수 있고; 신경내분비 및/또는 신경면역 경로를 조절할 수 있고; 그리고 대상체의 공생 대사물, 염증성 마커 및/또는 위장 투과도의 수준을 조절할 수 있고, 이들 모두는에 연루된다 스트레스 장애의 신경병리학. 특정 구현예에서, 블라우티아 균주에 의한 치료는 옥시토신 및/또는 바소프레신 호르몬의 수준을 조절할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 스트레스 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 스테르코리스를 사용하는 조성물은 스트레스 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 스트레스 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 정신분열증 스펙트럼 및 정신병적 장애, 예컨대 정신분열증을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용되는, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다을 제공한다. 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물은 정신분열증 스펙트럼 및 정신병적 장애의 마우스 모델에서 양성 및 음성 증상을 개선할 수 있다. 블라우티아 균주에 의한 치료는 중추, 자율신경 및 장용 신경계에서 신호전달을 조절할 수 있고; HPA 축 경로의 활동을 조절할 수 있고; 신경내분비 및/또는 신경면역 경로를 조절할 수 있고; 그리고 대상체의 공생 대사물 및/또는 위장 투과도의 수준을 조절할 수 있고, 이들 모두는 정신분열증 스펙트럼 및 정신병적 장애의 신경병리학에 연루된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 정신분열증 스펙트럼 및 정신병적 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 스테르코리스를 사용하는 조성물은 정신분열증 스펙트럼 및 정신병적 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 정신분열증 스펙트럼 및 정신병적 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 양극성 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물은 양극성 장애의 마우스 모델 에서 조병 및/또는 우울증의 발생을 감소시킬 수 있다. 블라우티아 균주에 의한 치료는 중추, 자율신경 및 장용 신경계에서 신호전달을 조절할 수 있고; HPA 축 경로의 활동을 조절할 수 있고; 신경내분비 및/또는 신경면역 경로를 조절할 수 있고; 그리고 대상체의 공생 대사물, 염증성 마커 및/또는 위장 투과도의 수준을 조절할 수 있고, 이들 모두는 양극성 장애의 신경병리학에 연루된다. 특정 구현예에서, 블라우티아 균주에 의한 치료는 옥시토신 및/또는 바소프레신 호르몬의 수준을 조절할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 양극성 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 스테르코리스를 사용하는 조성물은 양극성 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 양극성 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 신경인지 장애 예컨대 알츠하이머병를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물은 신경인지 장애의 마우스 모델에서 인지 및 행동 기능을 개선할 수 있다. 블라우티아 균주에 의한 치료는 중추, 자율신경 및 장용 신경계에서 신호전달을 조절할 수 있고; HPA 축 경로의 활동을 조절할 수 있고; 신경내분비 및/또는 신경면역 경로를 조절할 수 있고; 그리고 대상체의 공생 대사물 및/또는 위장 투과도의 수준을 조절할 수 있고, 이들 모두는 신경인지 장애의 신경병리학과 연루된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 신경인지 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 스테르코리스를 사용하는 조성물은 신경인지 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 신경인지 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명은 파킨슨병을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물은 파킨슨병의 마우스 모델에서 운동 및 인지 기능을 개선할 수 있다. 블라우티아 균주에 의한 치료는 중추, 자율신경 및 장용 신경계에서 신호전달을 조절할 수 있고; HPA 축 경로의 활동을 조절할 수 있고; 신경내분비 및/또는 신경면역 경로를 조절할 수 있고; 그리고 대상체의 공생 대사물, 염증성 마커 및/또는 위장 투과도의 수준을 조절할 수 있고, 이들 모두는 파킨슨병의 신경병리학과 연루된다. 특정 구현예에서, 블라우티아 균주에 의한 치료는 옥시토신 및/또는 바소프레신 호르몬의 수준을 조절할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명은 파킨슨병을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 스테르코리스를 사용하는 조성물은 파킨슨병을 치료하는데 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 파킨슨병을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 하이드로게노트로피카를 사용하는 조성물은 중추신경계 장애 또는 병태를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 신경발달 장애 또는 신경정신 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 하이드로게노트로피카를 사용하는 조성물은 신경발달 장애 또는 신경정신 병태를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다.
블라우티아 하이드로게노트로피카를 사용하는 조성물은 중추, 자율신경 및 장용 신경계에서 신호전달을 조절하고; 시상하부-뇌하수체-부신 (HPA) 축 경로의 활동을 조절하고; 신경내분비 및/또는 신경면역 경로를 조절하고/거나; 대상체의 공생 대사물, 염증성 마커 및/또는 위장 투과도의 수준을 조절하는데 특히 효과적일 수 있다. 특히 바람직한 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카는 부티레이트의 수준을 조절한다. 특정 구현예에서, 부티레이트의 수준의 조절은 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 자폐 스펙트럼 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 하이드로게노트로피카를 사용하는 조성물은 자폐 스펙트럼 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 OCD를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 하이드로게노트로피카를 사용하는 조성물은 OCD를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 MDD를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 하이드로게노트로피카를 사용하는 조성물은 MDD를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 불안 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 블라우티아 하이드로게노트로피카를 사용하는 조성물은 불안 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 스트레스 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다 for. 블라우티아 하이드로게노트로피카를 사용하는 조성물은 스트레스 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 정신분열증 스펙트럼 및 정신병적 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다 for. 블라우티아 하이드로게노트로피카를 사용하는 조성물은 정신분열증 스펙트럼 및 정신병적 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 양극성 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다 for. 블라우티아 하이드로게노트로피카를 사용하는 조성물은 양극성 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 신경인지 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다 for. 블라우티아 하이드로게노트로피카를 사용하는 조성물은 신경인지 장애를 치료하는데 특히 효과적일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 파킨슨병을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다 for. 블라우티아 하이드로게노트로피카를 사용하는 조성물은 파킨슨병을 치료하는데 특히 효과적일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개되는 질환 또는 병태의 치료 또는 예방에서 미생물총-소화관-뇌 축을 조절하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 특히, 본 발명의 조성물은 자폐 스펙트럼 장애; 강박 장애; 주요 우울 장애; 불안 장애; 스트레스 장애; 정신분열증 스펙트럼 장애; 양극성 장애; 신경인지 장애 및 파킨슨병의 치료 또는 예방에서 미생물총-소화관-뇌 축을 조절하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예들에서, 본 조성물 중 세균 균주는 블라우티아 스테르코리스의 것이다. 밀접하게 관련된 균주가 또한, 사용될 수 있고, 그와 같은 세균 균주는 블라우티아 스테르코리스의 세균 균주의 16s rRNA 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 세균 균주는 16s rRNA 서열을 갖되, 이 서열은 서열번호:1 또는 2에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일하다. 바람직하게는, 상기 서열 동일성은 서열번호:2에 대한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:2에 의해 제시된 16s rRNA 서열을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예들에서, 본 조성물 중 세균 균주는 블라우티아 훽슬레라에의 것이고. 밀접하게 관련된 균주가 또한, 사용될 수 있고, 그와 같은 세균 균주는 블라우티아 훽슬레라에의 세균 균주의 16s rRNA 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 세균 균주는 16s rRNA 서열을 갖되, 이 서열은 서열번호:3 또는 4에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일하다. 바람직하게는, 상기 서열 동일성은 서열번호:4에 대한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:4에 의해 제시된 16s rRNA 서열을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예들에서, 본 조성물 중 세균 균주는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 것이다. 밀접하게 관련된 균주가 또한, 사용될 수 있고, 그와 같은 세균 균주는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 세균 균주의 16s rRNA 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열. 바람직하게는, 세균 균주는 16s rRNA 서열을 갖되, 이 서열은 서열번호:7에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일하다. 가장 바람직하게는, 본 조성물 중 세균 균주는 기탁 번호 DSM 14294하에 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여를 위한 것이다. 본 발명의 균주의 경구 투여는 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 것들을 치료하는데 효과적일 수 있다. 또한, 경구 투여는 환자 및 종사자에게 편리하고 장으로 전달 및/또는 부분적인 또는 전체적인 군집화를 허용한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동결건조된 세균 균주 포함한다. 동결건조는 박테리아의 전달을 허용하는 안정한 조성물을 제조하기 위한 효과적인 및 편리한 기술 이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기에 기재된 바와 같은 조성물을 포함하는 식품을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기에 기재된 바와 같은 조성물을 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
추가로, 본 발명은 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상에 의해 매개된 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법을 제공하되, 상기 방법은 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
상기 발명의 개발에서, 본 발명자들은 요법에 특히 유용한 세균 균주를 확인하고 특성화했다. 본 발명의 블라우티아 스테르코리스 균주는 본 명세서에 기재된 질환, 예컨대 자폐 스펙트럼 장애를 치료하는데 효과적인 것으로 나타났다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 기탁 번호 NCIMB 42381 하에서 기탁된 블라우티아 스테르코리스 균주, 또는 이의 유도체의 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 그와 같은 세포, 또는 그와 같은 세포의 생물학적으로 순수한 배양물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 요법에서 사용하기 위해, 특히 본 명세서에 기재된 질환을 위해 기탁 번호 NCIMB 42381, 또는 이의 유도체 하에 기탁된 블라우티아 스테르코리스 균주의 세포를 제공한다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 기탁 번호 NCIMB 42381 하에서 기탁된 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 신경발달 장애 또는 신경정신 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 기탁 번호 NCIMB 42381 하에서 기탁된 균주를 포함하는 조성물을 제공한다, for. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 자폐 스펙트럼 장애, 또는 바람직하게는 자폐증을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 기탁 번호 NCIMB 42381 하에서 기탁된 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 정형, 반복적인, 강박성 또는 불안해하는 행동을 감소시키는 방법에서, 특히 자폐증의 치료에서 사용하기 위한, 기탁 번호 NCIMB 42381하에서 기탁된 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 발명의 개발에서, 본 발명자들은 요법에 특히 유용한 추가 세균 균주를 확인 및 특성화했다. 본 발명의 블라우티아 훽슬레라에 균주는 본 명세서에 기재된 질환, 예컨대 자폐 스펙트럼 장애를 치료하는데 효과적인 것으로 나타났다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 기탁 번호 NCIMB 42486 하에 기탁된 블라우티아 훽슬레라에 균주의 세포 또는 이의 유도체를 제공한다. 본 발명은 또한, 그와 같은 세포, 또는 그와 같은 세포의 생물학적으로 순수한 배양물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 요법에서 사용하기 위해, 특히 본 명세서에 기재된 질환을 위해 기탁 번호 NCIMB 42486 하에 기탁된 블라우티아 훽슬레라에 균주의 세포 또는 이의 유도체를 제공한다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 기탁 번호 NCTMB 42486 하에 기탁된 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 신경발달 장애 또는 신경정신 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 기탁 번호 NCIMB 42486 하에서 기탁된 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 자폐 스펙트럼 장애, 또는 바람직하게는 자폐증을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 기탁 번호 NCIMB 42486 하에서 기탁된 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 정형, 반복적인, 강박성 또는 불안해하는 행동을 감소시키는 방법에서, 특히 자폐증의 치료에서 사용하기 위한, 기탁 번호 NCIMB 42486 하에서 기탁된 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 발명의 개발에서, 본 발명자들은 요법에 특히 유용한 세균 균주를 확인하고 특성화했다. 본 발명의 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주는 본 명세서에 기재된 질환, 예컨대 자폐 스펙트럼 장애를 치료하는데 효과적인 것으로 나타났다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 기탁 번호 DSM 14294 하에서 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주, 또는 이의 유도체의 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 그와 같은 세포, 또는 그와 같은 세포의 생물학적으로 순수한 배양물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 요법에서 사용하기 위해, 특히 본 명세서에 기재된 질환을 위한, 기탁 번호 DSM 14294 하에서 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주, 또는 이의 유도체의 세포를 제공한다.
특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 기탁 번호 DSM 14294 하에서 기탁된 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 신경발달 장애 또는 신경정신 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 기탁 번호 DSM 14294 하에서 기탁된 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 자폐 스펙트럼 장애, 또는 바람직하게는 자폐증을 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 기탁 번호 DSM 14294 하에서 기탁된 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명은 정형, 반복적인, 강박성 또는 불안해하는 행동을 감소시키는 방법에서, 특히 자폐증의 치료에서 사용하기 위한, 기탁 번호 DSM 14294 하에서 기탁된 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
도 1: 3-챔버 테스트에서 C57B1/6 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. *p≤0.05 신규한 대 친숙한 (A) 및 **p<0.01 대상 대 동물 (B).
도 2: 강제 수영 테스트에서 C57B1/6 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. 비히클 그룹과 상당히 상이한 Mrx006 **p<0.01; 미접촉 그룹과 상당히 상이한 비히클 그룹 ##p<0.01.
도 3: 꼬리 현수 테스트에서 C57B1/6 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 4: 공포 조건화 테스트에서 C57B1/6 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. * 비히클 그룹과 상당히 상이한 MRX006; * 미접촉 그룹과 상당히 상이한 비히클; *p≤0.05, #p≤0.05, ##p<0.01, ###p<0.001.
도 5: 신규한 대상 인식 테스트에서 C57B1/6 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
# 그룹 내의 상당히 상이한 대상 친숙한 대상; #p≤0.05.
도 6: 구슬 감추기 테스트에서 C57B1/6 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 7: 상승된 플러스 미로 테스트에서 C57B1/6 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 8: C57B1/6 마우스에서 스트레스 유도된 이상고열에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. * 미접촉 그룹과 상당히 상이한 비히클, #p≤0.05.
도 9: C57B1/6 마우스에서 순환 옥시토신 수준에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. * 비히클 그룹과 상당히 상이한 Mrx006; *p≤0.05.
도 10: C57B1/6 마우스에서 코르티코스테론 혈장 수준에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. * 미접촉 (A) 또는 비히클 (B) 그룹과 상당히 상이함; *p≤0.05.
도 11: C57B1/6 마우스에서 소화관 투과도에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 12: C57B1/6 마우스에서 장기 중량 및 결장 길이에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 13: 3개의 챔버 사회적 상호작용 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. ## 그룹 내의 각각에 비해 p<0.01 그룹. ### 그룹 내의 각각에 비해 p<0.001 그룹. * 비히클 그룹에 비해 p<0.05.
도 14: 강제된 침입자 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 15: 구슬 감추기 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. * 사전 비교에 의한 결정된 바와 같이 비히클 그룹에 비해 p<0.05.
도 16: 털손질 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. 사전 비교에 의해 드러난 바와 같이, * 비히클 그룹에 비해 p≤0.05. ** 비히클 그룹에 비해 p<0.01.
도 17: 상승된 플러스 미로 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 18: 오픈 필드 아레나에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. * 비히클 그룹에 비해 p<0.05.
도 19: 강제 수영 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 20: 암컷 소변 스니핑 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. # 물 비히클 그룹에 비해 p<0.05. ** 비히클 그룹에 비해 p<0.01.
도 21: 신규한 대상 인식 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 22: BTBR 마우스에서 생체외 위장 투과도에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 23: BTBR 마우스에서 생체내 위장 투과도에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 24: BTBR 마우스에서 생체내 위장 운동성에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. * 사전 비교에 의해 드러난 바와 같이 비히클 그룹에 비해 p<0.05.
도 25: BTBR 마우스에서 스트레스-유도된 코르티코스테론 혈장 수준에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 26: BTBR 마우스에서 장기 중량 및 결장 길이에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 27: 경시적으로 BTBR 마우스의 체중에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 28: Mrx006에 의한 만성 치료는 MIA 마우스에서 모델에서 매장된 구슬의 수를 감소시켰다. #대조군 그룹에 비해 p<0.05; ** 비히클 MIA 그룹에 비해 p<0.01.
도 29: 음식 선호도 테스트의 사회적 전수에서 MIA 마우스에서의 사회성에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 30: MRX006에 의한 만성 치료는 MIA 마우스에서 오픈 필드 아레나에 대한 노출에 의해 야기된 스트레스-유도된 운동 활동을 약화시킨다. ## 대조군 그룹에 비해 p<0.01, * 비히클 MIA 그룹에 비해 p<0.05.
도 31: 암컷 소변 스니핑 테스트에서 MIA 마우스에서의 우울-유사 행동에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과. 각각의 물 그룹에 비해 p<0.05.
도 32: MIA 마우스에서 생체내 위장 운동성에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 33: MIA 마우스에서 장기 중량 및 결장 길이에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 34: BTBR 마우스에서 순환 사이토카인 집중력에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 35: 구슬 감추기 테스트에서 MIA 마우스에 대한 MRX008에 의한 치료의 효과. ## 대조군 그룹에 비해 p<0.01.
도 36: 음식 선호도 테스트의 사회적 전수에서 MIA 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 37: 강제 수영 테스트에서 MIA 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 38: 장내 투과도에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 39: 장내 운동성에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과. ## 대조군 그룹에 비해 p<0.01.
도 40: 음식 선호도 테스트의 사회적 전수에서 BTBR 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 41: 강제된 침입자 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 42: 구슬 감추기 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 43: 상승된 플러스 미로에서 BTBR 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 44: 오픈 필드 아레나에서 BTBR 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과. * 사전 쌍별 비교에 의해 드러난 바와 같이 비히클 그룹에 비해 p<0.05.
도 45: 강제 수영 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 46: 암컷 소변 스니핑 테스트에서 BTBR 마우스에서의 우울-유사 행동에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과. ## 물 비히클 그룹에 비해 p<0.01.
도 47: BTBR 마우스에서 생체내 장내 운동성에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 48: BTBR 마우스에서 선택적 해부상의 마커에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 49: BTBR 마우스의 시상하부에서 옥시톡신, 바소프레신 및 그것의 각각의 수용체의 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과. * 비히클 그룹에 비해 p<0.05.
도 50: BTBR 마우스의 편도에서 옥시톡신, 바소프레신 및 그것의 각각의 수용체의 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과. * 비히클 그룹에 비해 p<0.05.
도 51: 오픈 필드 아레나에서 BTBR 마우스에 대한 블라우티아 하이드로게노트로피카 및 부티레이트에 의한 만성 치료의 효과. 도 51B, 51D, 51F 및 51H에서의 데이터는 도 51A, 51C, 51E 및 51G, 각각에서의 것과 동일하고, 단, PBS 및 LYO 대조군 번호가 풀링되었다. p≤0.05: * 대 C57BL/6 (동일한 치료, 적용가능한 경우); # 대 PBS 동일한 유전자형; § BTBR: But 대 PBS 또는 Bact 대 Lyo. PBS는 부티레이트 투여에 대한 음성 대조군이고; LYO는 박테리아 (블라우티아 하이드로게노트로피카) 투여에 대한 음성 대조군이고; BUT는 부티레이트의 실험 투여이고; BACT는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 실험 투여이다.
도 52: 구슬 감추기 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 블라우티아 하이드로게노트로피카 및 부티레이트에 의한 만성 치료의 효과. 도 52B의 데이터는 도 52A의 것과 동일하지만, 단, PBS 및 LYO 대조군 번호가 풀링되었다. p≤0.05: * 대 C57BL/6 (동일한 치료, 적용가능한 경우); # 대 PBS 동일한 유전자형; § BTBR: But 대 PBS 또는 Bact 대 Lyo. PBS는 부티레이트 투여에 대한 음성 대조군이고; LYO는 박테리아 (블라우티아 하이드로게노트로피카) 투여에 대한 음성 대조군이고; BUT는 부티레이트의 실험 투여이고; BACT는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 실험 투여이다.
도 53: 땅파기 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 블라우티아 하이드로게노트로피카 및 부티레이트에 의한 만성 치료의 효과. 도 53A는 시간 소비된 땅파기를 도시하고, 한편, 도 53B는 땅파기 한바탕의 수를 도시한다. p≤0.05: * 대 C57BL/6 (동일한 치료, 적용가능한 경우); # 대 PBS 동일한 유전자형; § BTBR: But 대 PBS 또는 Bact 대 Lyo. PBS는 부티레이트 투여에 대한 음성 대조군이고; LYO는 박테리아 (블라우티아 하이드로게노트로피카) 투여에 대한 음성 대조군이고; BUT는 부티레이트의 실험 투여이고; BACT는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 실험 투여이다.
도 54: 자기-털손질 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 블라우티아 하이드로게노트로피카 및 부티레이트에 의한 만성 치료의 효과. 도 54A는 시간 소비된 털손질을 도시하고; 도 54C는 털손질 한바탕의 수를 도시하고, 그리고 도 54E는 한바탕에 대한 시간 소비된 털손질을 도시한다. 도 54B, 54D 및 54F에서의 테이타는 도 54A, 54C, 및 54E 각각과 동일하고, 단, PBS 및 LYO 대조군 번호가 풀링되었다. p≤0.05: * 대 C57BL/6 (동일한 치료, 적용가능한 경우); # 대 PBS 동일한 유전자형; § BTBR: But 대 PBS 또는 Bact 대 Lyo. PBS는 부티레이트 투여에 대한 음성 대조군이고; LYO는 박테리아 (블라우티아 하이드로게노트로피카) 투여에 대한 음성 대조군이고; BUT는 부티레이트의 실험 투여이고; BACT는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 실험 투여이다.
도 55: 건강한 HIM 랫트의 맹장 내용에서 단쇄 지방산 생산 (RMN 1H)에 대한 블라우티아 하이드로게노트로피카의 효과 (14일 동안 1010/일).
도 56: B. 28일 동안 B 하이드로게노트로피카 (BlautiX)를 포함하는 조성물로 치료되거나 치료되지 않는 IBS-HMA 랫트의 배설물 샘플에서 하이드로게노트로피카 모집단의 qPCR 평가.
도 57: 28일 동안 B. 하이드로게노트로피카 (Blautix)로 치료되거나 되지 않은 IBS-HMA 랫트의 맹장 샘플에서 단쇄 지방산 (SCFA) 농도. 도 57A는 총 SCFA의 농도를 도시한다. 도 57B는 아세트산, 프로피온산 및 부티르산의 농도를 도시한다.
도 58: 3개의 챔버 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 블라우티아 하이드로게노트로피카 및 부티레이트에 의한 만성 치료의 효과. 도 58A는 사회성 (대상 또는 또 다른 마우스의 스니핑에 대한 선호)에 대한 투여의 효과는 도시하고, 한편 도 58B는 사회적 참신성에 대한 선호 (즉 스니핑 신규한 마우스 대 친숙한 마우스)를 도시한다. p≤0.05: S 대 50%; * 대 C57BL/6 (동일한 치료, 적용가능한 경우); # 대 PBS 동일한 유전자형; § BTBR: But 대 PBS 또는 Bact 대 Lyo. PBS는 부티레이트 투여에 대한 음성 대조군이고; LYO는 박테리아 (블라우티아 하이드로게노트로피카) 투여에 대한 음성 대조군이고; BUT는 부티레이트의 실험 투여이고; BACT는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 실험 투여이다.
도 59: 시상하부 세포주에서 옥시톡신 및 옥시톡신 수용체의 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 60: BALBc 마우스 모델의 결정에서 생체외 위장 투과도 및 융합막 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 61: BALBc 마우스 모델의 회장에서 생체외 위장 투과도 및 융합막 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 62: BALBc 마우스 모델에서 맹장 단쇄 지방산 생산에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 63: BALBc 마우스 모델의 비장세포로부터 사이토카인 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 64: BALBc 마우스 모델에서 아미노산의 혈장 수준에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 65: BALBc 마우스 모델의 뇌간에서 신경전달물질 수준에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 66: BALBc 마우스 모델의 해마 신경전달물질 수용체의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 67: BALBc 마우스 모델의 편도체 신경전달물질 수용체의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 68: BALBc 마우스 모델에서 전전두엽 피질 신경전달물질 수용체의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 69: BALBc 마우스 모델의 해마에서 염증성 마커의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 70: BALBc 마우스 모델의 편도체에서 염증성 마커의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 71: BALBc 마우스 모델의 전전두엽 피질에서 염증성 마커의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 72: BALBc 마우스 모델의 해마 내분비 마커의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 73: BALBc 마우스 모델에서 편도체 내분비 마커의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 74: BALBc 마우스 모델의 전전두엽 피질 내분비 마커의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 75: MIA 마우스에서 모델의 결장 및 회장에서 생체내 위장 투과도에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 76: MIA 마우스의 3개의 챔버 사회적 상호작용 테스트에서 사회적 참신성에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 77: MIA 마우스의3개의 챔버 사회적 상호작용 테스트에서 사회적 선호에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 78: 털손질 테스트에서 MIA 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 79: 상승된 플러스 미로 테스트에서 MIA 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 80: 강제 수영 테스트에서 MIA 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 81: MIA 마우스에서 스트레스-유도된 코르티코스테론 혈장 수준에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 2: 강제 수영 테스트에서 C57B1/6 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. 비히클 그룹과 상당히 상이한 Mrx006 **p<0.01; 미접촉 그룹과 상당히 상이한 비히클 그룹 ##p<0.01.
도 3: 꼬리 현수 테스트에서 C57B1/6 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 4: 공포 조건화 테스트에서 C57B1/6 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. * 비히클 그룹과 상당히 상이한 MRX006; * 미접촉 그룹과 상당히 상이한 비히클; *p≤0.05, #p≤0.05, ##p<0.01, ###p<0.001.
도 5: 신규한 대상 인식 테스트에서 C57B1/6 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
# 그룹 내의 상당히 상이한 대상 친숙한 대상; #p≤0.05.
도 6: 구슬 감추기 테스트에서 C57B1/6 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 7: 상승된 플러스 미로 테스트에서 C57B1/6 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 8: C57B1/6 마우스에서 스트레스 유도된 이상고열에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. * 미접촉 그룹과 상당히 상이한 비히클, #p≤0.05.
도 9: C57B1/6 마우스에서 순환 옥시토신 수준에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. * 비히클 그룹과 상당히 상이한 Mrx006; *p≤0.05.
도 10: C57B1/6 마우스에서 코르티코스테론 혈장 수준에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. * 미접촉 (A) 또는 비히클 (B) 그룹과 상당히 상이함; *p≤0.05.
도 11: C57B1/6 마우스에서 소화관 투과도에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 12: C57B1/6 마우스에서 장기 중량 및 결장 길이에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 13: 3개의 챔버 사회적 상호작용 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. ## 그룹 내의 각각에 비해 p<0.01 그룹. ### 그룹 내의 각각에 비해 p<0.001 그룹. * 비히클 그룹에 비해 p<0.05.
도 14: 강제된 침입자 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 15: 구슬 감추기 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. * 사전 비교에 의한 결정된 바와 같이 비히클 그룹에 비해 p<0.05.
도 16: 털손질 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. 사전 비교에 의해 드러난 바와 같이, * 비히클 그룹에 비해 p≤0.05. ** 비히클 그룹에 비해 p<0.01.
도 17: 상승된 플러스 미로 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 18: 오픈 필드 아레나에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. * 비히클 그룹에 비해 p<0.05.
도 19: 강제 수영 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 20: 암컷 소변 스니핑 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. # 물 비히클 그룹에 비해 p<0.05. ** 비히클 그룹에 비해 p<0.01.
도 21: 신규한 대상 인식 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 22: BTBR 마우스에서 생체외 위장 투과도에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 23: BTBR 마우스에서 생체내 위장 투과도에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 24: BTBR 마우스에서 생체내 위장 운동성에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과. * 사전 비교에 의해 드러난 바와 같이 비히클 그룹에 비해 p<0.05.
도 25: BTBR 마우스에서 스트레스-유도된 코르티코스테론 혈장 수준에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 26: BTBR 마우스에서 장기 중량 및 결장 길이에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 27: 경시적으로 BTBR 마우스의 체중에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 28: Mrx006에 의한 만성 치료는 MIA 마우스에서 모델에서 매장된 구슬의 수를 감소시켰다. #대조군 그룹에 비해 p<0.05; ** 비히클 MIA 그룹에 비해 p<0.01.
도 29: 음식 선호도 테스트의 사회적 전수에서 MIA 마우스에서의 사회성에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 30: MRX006에 의한 만성 치료는 MIA 마우스에서 오픈 필드 아레나에 대한 노출에 의해 야기된 스트레스-유도된 운동 활동을 약화시킨다. ## 대조군 그룹에 비해 p<0.01, * 비히클 MIA 그룹에 비해 p<0.05.
도 31: 암컷 소변 스니핑 테스트에서 MIA 마우스에서의 우울-유사 행동에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과. 각각의 물 그룹에 비해 p<0.05.
도 32: MIA 마우스에서 생체내 위장 운동성에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 33: MIA 마우스에서 장기 중량 및 결장 길이에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 34: BTBR 마우스에서 순환 사이토카인 집중력에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 35: 구슬 감추기 테스트에서 MIA 마우스에 대한 MRX008에 의한 치료의 효과. ## 대조군 그룹에 비해 p<0.01.
도 36: 음식 선호도 테스트의 사회적 전수에서 MIA 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 37: 강제 수영 테스트에서 MIA 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 38: 장내 투과도에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 39: 장내 운동성에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과. ## 대조군 그룹에 비해 p<0.01.
도 40: 음식 선호도 테스트의 사회적 전수에서 BTBR 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 41: 강제된 침입자 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 42: 구슬 감추기 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 43: 상승된 플러스 미로에서 BTBR 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 44: 오픈 필드 아레나에서 BTBR 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과. * 사전 쌍별 비교에 의해 드러난 바와 같이 비히클 그룹에 비해 p<0.05.
도 45: 강제 수영 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 46: 암컷 소변 스니핑 테스트에서 BTBR 마우스에서의 우울-유사 행동에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과. ## 물 비히클 그룹에 비해 p<0.01.
도 47: BTBR 마우스에서 생체내 장내 운동성에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 48: BTBR 마우스에서 선택적 해부상의 마커에 대한 MRX008에 의한 만성 치료의 효과.
도 49: BTBR 마우스의 시상하부에서 옥시톡신, 바소프레신 및 그것의 각각의 수용체의 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과. * 비히클 그룹에 비해 p<0.05.
도 50: BTBR 마우스의 편도에서 옥시톡신, 바소프레신 및 그것의 각각의 수용체의 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과. * 비히클 그룹에 비해 p<0.05.
도 51: 오픈 필드 아레나에서 BTBR 마우스에 대한 블라우티아 하이드로게노트로피카 및 부티레이트에 의한 만성 치료의 효과. 도 51B, 51D, 51F 및 51H에서의 데이터는 도 51A, 51C, 51E 및 51G, 각각에서의 것과 동일하고, 단, PBS 및 LYO 대조군 번호가 풀링되었다. p≤0.05: * 대 C57BL/6 (동일한 치료, 적용가능한 경우); # 대 PBS 동일한 유전자형; § BTBR: But 대 PBS 또는 Bact 대 Lyo. PBS는 부티레이트 투여에 대한 음성 대조군이고; LYO는 박테리아 (블라우티아 하이드로게노트로피카) 투여에 대한 음성 대조군이고; BUT는 부티레이트의 실험 투여이고; BACT는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 실험 투여이다.
도 52: 구슬 감추기 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 블라우티아 하이드로게노트로피카 및 부티레이트에 의한 만성 치료의 효과. 도 52B의 데이터는 도 52A의 것과 동일하지만, 단, PBS 및 LYO 대조군 번호가 풀링되었다. p≤0.05: * 대 C57BL/6 (동일한 치료, 적용가능한 경우); # 대 PBS 동일한 유전자형; § BTBR: But 대 PBS 또는 Bact 대 Lyo. PBS는 부티레이트 투여에 대한 음성 대조군이고; LYO는 박테리아 (블라우티아 하이드로게노트로피카) 투여에 대한 음성 대조군이고; BUT는 부티레이트의 실험 투여이고; BACT는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 실험 투여이다.
도 53: 땅파기 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 블라우티아 하이드로게노트로피카 및 부티레이트에 의한 만성 치료의 효과. 도 53A는 시간 소비된 땅파기를 도시하고, 한편, 도 53B는 땅파기 한바탕의 수를 도시한다. p≤0.05: * 대 C57BL/6 (동일한 치료, 적용가능한 경우); # 대 PBS 동일한 유전자형; § BTBR: But 대 PBS 또는 Bact 대 Lyo. PBS는 부티레이트 투여에 대한 음성 대조군이고; LYO는 박테리아 (블라우티아 하이드로게노트로피카) 투여에 대한 음성 대조군이고; BUT는 부티레이트의 실험 투여이고; BACT는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 실험 투여이다.
도 54: 자기-털손질 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 블라우티아 하이드로게노트로피카 및 부티레이트에 의한 만성 치료의 효과. 도 54A는 시간 소비된 털손질을 도시하고; 도 54C는 털손질 한바탕의 수를 도시하고, 그리고 도 54E는 한바탕에 대한 시간 소비된 털손질을 도시한다. 도 54B, 54D 및 54F에서의 테이타는 도 54A, 54C, 및 54E 각각과 동일하고, 단, PBS 및 LYO 대조군 번호가 풀링되었다. p≤0.05: * 대 C57BL/6 (동일한 치료, 적용가능한 경우); # 대 PBS 동일한 유전자형; § BTBR: But 대 PBS 또는 Bact 대 Lyo. PBS는 부티레이트 투여에 대한 음성 대조군이고; LYO는 박테리아 (블라우티아 하이드로게노트로피카) 투여에 대한 음성 대조군이고; BUT는 부티레이트의 실험 투여이고; BACT는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 실험 투여이다.
도 55: 건강한 HIM 랫트의 맹장 내용에서 단쇄 지방산 생산 (RMN 1H)에 대한 블라우티아 하이드로게노트로피카의 효과 (14일 동안 1010/일).
도 56: B. 28일 동안 B 하이드로게노트로피카 (BlautiX)를 포함하는 조성물로 치료되거나 치료되지 않는 IBS-HMA 랫트의 배설물 샘플에서 하이드로게노트로피카 모집단의 qPCR 평가.
도 57: 28일 동안 B. 하이드로게노트로피카 (Blautix)로 치료되거나 되지 않은 IBS-HMA 랫트의 맹장 샘플에서 단쇄 지방산 (SCFA) 농도. 도 57A는 총 SCFA의 농도를 도시한다. 도 57B는 아세트산, 프로피온산 및 부티르산의 농도를 도시한다.
도 58: 3개의 챔버 테스트에서 BTBR 마우스에 대한 블라우티아 하이드로게노트로피카 및 부티레이트에 의한 만성 치료의 효과. 도 58A는 사회성 (대상 또는 또 다른 마우스의 스니핑에 대한 선호)에 대한 투여의 효과는 도시하고, 한편 도 58B는 사회적 참신성에 대한 선호 (즉 스니핑 신규한 마우스 대 친숙한 마우스)를 도시한다. p≤0.05: S 대 50%; * 대 C57BL/6 (동일한 치료, 적용가능한 경우); # 대 PBS 동일한 유전자형; § BTBR: But 대 PBS 또는 Bact 대 Lyo. PBS는 부티레이트 투여에 대한 음성 대조군이고; LYO는 박테리아 (블라우티아 하이드로게노트로피카) 투여에 대한 음성 대조군이고; BUT는 부티레이트의 실험 투여이고; BACT는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 실험 투여이다.
도 59: 시상하부 세포주에서 옥시톡신 및 옥시톡신 수용체의 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 60: BALBc 마우스 모델의 결정에서 생체외 위장 투과도 및 융합막 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 61: BALBc 마우스 모델의 회장에서 생체외 위장 투과도 및 융합막 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 62: BALBc 마우스 모델에서 맹장 단쇄 지방산 생산에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 63: BALBc 마우스 모델의 비장세포로부터 사이토카인 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 64: BALBc 마우스 모델에서 아미노산의 혈장 수준에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 65: BALBc 마우스 모델의 뇌간에서 신경전달물질 수준에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 66: BALBc 마우스 모델의 해마 신경전달물질 수용체의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 67: BALBc 마우스 모델의 편도체 신경전달물질 수용체의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 68: BALBc 마우스 모델에서 전전두엽 피질 신경전달물질 수용체의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 69: BALBc 마우스 모델의 해마에서 염증성 마커의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 70: BALBc 마우스 모델의 편도체에서 염증성 마커의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 71: BALBc 마우스 모델의 전전두엽 피질에서 염증성 마커의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 72: BALBc 마우스 모델의 해마 내분비 마커의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 73: BALBc 마우스 모델에서 편도체 내분비 마커의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 74: BALBc 마우스 모델의 전전두엽 피질 내분비 마커의 유전자 발현에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 75: MIA 마우스에서 모델의 결장 및 회장에서 생체내 위장 투과도에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과.
도 76: MIA 마우스의 3개의 챔버 사회적 상호작용 테스트에서 사회적 참신성에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 77: MIA 마우스의3개의 챔버 사회적 상호작용 테스트에서 사회적 선호에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 78: 털손질 테스트에서 MIA 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 79: 상승된 플러스 미로 테스트에서 MIA 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 80: 강제 수영 테스트에서 MIA 마우스에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
도 81: MIA 마우스에서 스트레스-유도된 코르티코스테론 혈장 수준에 대한 MRX006에 의한 치료의 효과.
세균 균주
본 발명의 조성물은 블라우티아의 세균 균주 속을 포함한다. 실시예는, 이러한 종의 박테리아는 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 자폐 스펙트럼 장애 및 중추신경계 장애를 치료 또는 예방하는데 유용하다는 것을 입증한다. 자폐 스펙트럼 장애의 증상의 평가에 대한 본원에서 사용된 마우스 모델 실험은 상기에 열거된 것들을 포함하는 다른 중추신경계 장애의 증상의 평가에 대해 적용가능한 것으로 당해 기술에 공지되어 있다.
본 발명은 요법에서 사용되는, 예를 들어, 중추신경계 장애 또는 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 사용되는 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 블라우티아 속의 균주를 포함하고 임의의 다른 박테리아 속을 함유하지 않는다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 블라우티아 속의 단일 균주를 포함하고, 임의의 다른 세균 균주, 속 또는 종을 함유하지 않는다.
본 발명에서 사용되는 블라우티아 균주의 예는 블라우티아 스테르코리스, B. 파에시스, B. 코코이데스, B. 글루세라세아, B. 한세니, B. 하이드로게노트로피카, B. 루티, B. 프로덕타, B. 쉰키이 및 B. 훽슬레라에를 포함한다. 바람직한 종은 블라우티아 스테르코리스, B. 훽슬레라에 및 B. 하이드로게노트로피카이다. 블라우티아 종은 구형 또는 타원형일 수 있는 그램-반응-양성, 비-운동성 박테리아이고 모두는 글루코스 발효의 주요 최종 생성물로서 아세트산을 생산하는 필수 산소성생물이다 [26]. B. 프로덕타가 패혈증 샘플로부터 단리되었어도, 블라우티아는 인간 소화관으로부터 단리될 수 있다. 블라우티아 스테르코리스 균주 GAM6-1T의16S rRNA 유전자 서열에 대한 유전자은행 기탁 번호는 (서열번호:1로서 본 명세서에서 개시된) HM626177이다. 예시적인 블라우티아 스테르코리스 균주는 [27]에서 기재된다. 블라우티아 훽슬레라에의 유형 균주는 WAL 14507 = ATCC BAA-1564 = DSM 19850이다 [28]. 블라우티아 훽슬레라에 균주 WAL 14507 T의 16S rRNA 유전자 서열에 대한 유전자은행 기탁 번호는 (서열번호:3으로서 본 명세서에서 개시된) EF036467이다. 이 예시적인 블라우티아 훽슬레라에 균주는 [28]에서 기재된다.
기탁 번호 NCIMB 42381 하에 기탁된 블라우티아 스테르코리스 박테리아는 실시예에서 시험되었고, 또한 본 명세서에서 일명 MRX006 (균주 830)이다. 용어들 "MRX006", "MRx0006" "Mrx006", "Mrx0006" 및 균주 830은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 시험된 MRX006 (830 균주)에 대한 16S rRNA 서열은 서열번호:2에서 제공된다. MRX006 (균주 830)은 "블라우티아 스테르코리스 830"으로서 2015년 3월 12일에 GT Biologics Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland)에 의해 국제 기탁기관 NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland)에 기탁되었고 기탁 번호 NCIMB 42381로 배정되었다. GT Biologics Ltd.는 후속으로 그것의 명칭을 4D Pharma Research Limited로 변경하였다.
MRX006 (균주 830)의 게놈은 염색체 및 플라스미드를 포함한다. MRX006 (균주 830)에 대한 염색체 서열은 서열번호:5에서 제공된다. MRX006 (균주 830)에 대한 플라스미드 서열은 서열번호:6에서 제공된다. 이들 서열은 PacBio RS II 플랫폼을 사용하여 생성되었다.
기탁 번호 NCIMB 42486 하에 기탁된 블라우티아 훽슬레라에 박테리아는 실시예에서 시험되었고, 또한 본 명세서에서 일명 균주 MRX008이다. 용어들 "MRX008", "MRx0008" "Mrx008" 및 "Mrx0008"은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다. 시험된 MRX008 균주에 대한 16S rRNA 서열은 서열번호:4에서 제공된다. 균주 MRX008은 "블라우티아/루미노코쿠스"로서 2015년 11월 16일에 4D Pharma Research Ltd. (Life Sciences Innovation Building, Aberdeen, AB25 2ZS, Scotland)에 의해 국제 기탁 기관 NCIMB, Ltd. (Ferguson Building, Aberdeen, AB21 9YA, Scotland)에 기탁되었고 기탁 번호 NCIMB 42486으로 배정되었다.
본 발명의 추가 바람직한 균주는 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 박테리아이다. 이 균주는 2001년 5월 10일에 "S5a33"으로서 기탁 번호 DSM 14294 하에 Deutsche Sammlung von Mikroorganismen [German Microorganism Collection] (Mascheroder Weg 1b, 38124 Braunschweig, Germany)에 기탁되었다. 기탁자는 INRA Laboratoire de Microbiologie CR de Clermont-Ferrand/Theix 63122 Saint Genes Champanelle, France이었다. 기탁의 소유권은 배정의 방식으로 4D Pharma Plc로 넘어갔다. 4D Pharma Plc는, 동의의 방식으로, 4D Pharma Research Limited가 출원에서 기탁된 생물학적 물질을 언급하도록 승인하였고 대중에 이용가능해지는 기탁된 물질에 그것의 전적인 변경할 수 없는 허락을 제공하였다. 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁은 2000년 5월 11일에 공개되었다.
기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 박테리아는 실시예에서 시험되었고, 그리고 본 발명의 바람직한 균주이다.
상기 예에서 시험된 균주와 밀접하게 관련된 세균 균주는 또한 자폐 스펙트럼 장애 및 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적일 것으로 기대된다. 특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 블라우티아 스테르코리스의 세균 균주의 16s rRNA 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:1 또는 2에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 상기 서열 동일성은 서열번호:2에 대한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:2에 의해 제시된 16s rRNA 서열을 갖는다. 특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 블라우티아 훽슬레라에의 세균 균주의 16s rRNA 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%) 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:3 또는 4에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 상기 서열 동일성은 서열번호:4에 대한 것이다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:4에 의해 제시된 16s rRNA 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:5에 대한 서열 동일성을 갖는 염색체를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:5의 적어도 60% (예를 들어 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)에 걸쳐 서열번호:5에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어 적어도 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성)를 갖는 염색체를 갖는다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:5의 70%에 걸쳐 서열번호:5에 대한 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열번호:5의 80%에 걸쳐 서열번호:5에 대한 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열번호:5의 90%에 걸쳐 서열번호:5에 대한 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열번호:5의 100%에 걸쳐 서열번호:5에 대한 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열번호:5의 70%에 걸쳐 서열번호:5에 대한 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열번호:5의 80%에 걸쳐 서열번호:5에 대한 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열번호:5의 90%에 걸쳐 서열번호:5에 대한 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열번호:5의 100%에 걸쳐 서열번호:5에 대한 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열번호:5의 70%에 걸쳐 서열번호:5에 대한 적어도 98% 서열 동일성, 또는 서열번호:5의 80%에 걸쳐 서열번호:5에 대한 적어도 98% 서열 동일성, 또는 서열번호:5의 90%에 걸쳐 서열번호:5에 대한 적어도 98% 서열 동일성, 또는 서열번호:5의 100%에 걸쳐 서열번호:5에 대한 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 염색체를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:6에 대한 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 갖는다. 바람직한 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:6의 적어도 60% (예를 들어 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%에 걸쳐) 서열번호:6에 대한 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어 적어도 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성)을 갖는 플라스미드를 갖는다. 예를 들어, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:6의 70%에 걸쳐 서열번호:6에 대한 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열번호:6의 80%에 걸쳐 서열번호:6에 대한 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열번호:6의 90%에 걸쳐 서열번호:6에 대한 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열번호:6의 100%에 걸쳐 서열번호:6에 대한 적어도 90% 서열 동일성, 또는 서열번호:6의 70%에 걸쳐 서열번호:6에 대해 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열번호:6의 80%에 걸쳐 서열번호:6에 대해 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열번호:6의 90%에 걸쳐 서열번호:6에 대한 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열번호:6의 100%에 걸쳐 서열번호:6에 대한 적어도 95% 서열 동일성, 또는 서열번호:6의 70%에 걸쳐 서열번호:6에 대한 적어도 98% 서열 동일성, 또는 서열번호:6의 80%에 걸쳐 서열번호:6에 대한 적어도 98% 서열 동일성, 또는 서열번호:6의 90%에 걸쳐 서열번호:6에 대한 적어도 98% 서열 동일성, 또는 서열번호:6의 100%에 걸쳐 서열번호:6에 대한 적어도 98% 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 가질 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:5에 대한 서열 동일성을 갖는 염색체 및 서열번호:6에 대한 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 갖는다.
기탁 번호 42381 하에 기탁된 박테리아의 생물형인 세균 균주는 또한 자폐 스펙트럼 장애 및 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적일 것으로 기대된다. 기탁 번호 42486 하에 기탁된 박테리아의 생물형인 세균 균주는 또한 자폐 스펙트럼 장애 및 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적일 것으로 기대된다. 생물형은 동일 또는 매우 유사한 생리적 및 생화학적 특성을 갖는 밀접하게 관련된 균주이다.
기탁 번호 NCIMB 42381 또는 42486 하에 기탁된 박테리아의 생물형이고 본 발명에서 사용하기에 적합한 균주는 기탁 번호 NCIMB 42381 또는 42486 하에 기탁된 박테리아에 대한 다른 뉴클레오타이드 서열을 서열분석함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 전체의 게놈은 서열분석될 수 있고 본 발명에서 사용하기 위한 생물형 균주는 그것의 전체의 게놈의 적어도 80%에 걸쳐 (예를 들어 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%에 걸쳐, 또는 그것의 전체의 게놈에 걸쳐)적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 생물형 균주는 그것의 게놈의 적어도 98%에 걸쳐 적어도 98% 서열 동일성 또는 그것의 게놈의 99%에 걸쳐 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 생물형 균주를 확인하는데 사용하기 위한 다른 적합한 서열은 hsp60 또는 반복 서열 예컨대 박스, ERIC, (GTG)s, 또는 REP 또는 [29]를 포함할 수 있다. 생물형 균주는 기탁 번호 NCIMB 42381 또는 42486 하에 기탁된 박테리아의 상응하는 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 생물형 균주는 NCIMB 42381로서 기탁된 균주 MRX006의 상응하는 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며 서열번호:2에 대해 적어도 99% 동일한 (예를 들어 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한) 16S rRNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물형 균주는 NCIMB 42381로서 기탁된 균주 MRX006의 상응하는 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며 서열번호:2의 16S rRNA 서열을 갖는다.
일부 구현예에서, 생물형 균주는 NCIMB 42486로서 기탁된 균주 MRX008의 상응하는 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며, 서열번호:4에 대해 적어도 99% 동일한 (예를 들어 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한) 16S rRNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물형 균주는 NCIMB 42486로서 기탁된 균주 MRX008의 상응하는 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며 서열번호:4의 16S rRNA 서열을 갖는다.
대안적으로, 기탁 번호 NCIMB 42381 또는 42486 하에 기탁된 박테리아의 생물형이고 본 발명에서 사용하기에 적합한 균주는 기탁 번호 NCIMB 42381 기탁물 또는 기탁 번호 NCIMB 42486 기탁, 및 제한 단편 분석 및/또는 PCR 분석을 사용하여, 예를 들어 형광 증폭된 단편 길이 다형성 (FAFLP) 및 반복적인 DNA 요소 (rep)-PCR 핑거프린팅, 또는 단백질 프로파일링, 또는 부분적인 16S 또는 23s rDNA 서열분석을 사용하여 분석될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 그와 같은 기술은 다른 블라우티아 스테르코리스 또는 블라우티아 훽슬레라에 균주를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 기탁 번호 NCIMB 42381 또는 42486 하에 기탁된 박테리아의 생물형이고 본 발명에서 사용하기에 적합한 균주는 증폭된 리보솜 DNA 제한 분석 (ARDRA)에 의해 분석될 때, 예를 들어 (예시적인 방법 및 안내 참고, 예를 들어, [30]에 대해) Sau3AI 제한 효소를 사용할 때 기탁 번호 NCIMB 42381 또는 42486 하에 기탁된 박테리아와 동일한 패턴을 제공하는 균주이다. 대안적으로, 생물형 균주는 기탁 번호 NCIMB 42381 또는 42486 하에 기탁된 박테리아와 동일한 탄수화물 발효 패턴을 갖는 균주로서 확인된다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 다른 블라우티아 스테르코리스 균주, 예컨대 기탁 번호 NCIMB 42381 또는 42486 하에 기탁된 박테리아의 생물형은, 실시예에 기재된 검정을 포함하는 임의의 적절한 방법 또는 전략을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용되는 균주는 혐기성 YCFA에서 배양하고/거나 상기 박테리아를 자폐 스펙트럼 장애 마우스 모델에게 투여하고, 그리고 그 다음 사이토카인 수준을 평가함으로써 확인될 수 있다. 특히, 기탁 번호 NCIMB 42381 또는 42486 하에 기탁된 박테리아와 유사한 성장 패턴, 대사 유형 및/또는 표면 항원을 갖는 세균 균주은 본 발명에서 유용할 수 있다. 유용한 균주는 NCIMB 42381 또는 42486 균주에 대해 비교할만한 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 생물형 균주는 실시예에서 기재된 배양 및 투여 프로토콜을 사용하여 확인될 수 있는 실시예에서 나타난 효과에 대해 자폐 스펙트럼 장애 모델에 대한 비교할만한 효과를 유도할 것이다.
본 발명의 특히 바람직한 균주는 기탁 번호 NCIMB 42381 하에 기탁된 블라우티아 스테르코리스 균주. 이것은 실시예에서 시험되고 질환을 치료하는데 효과적인 것으로 나타난 예시적인 MRX006 균주 이다. 따라서, 본 발명은 기탁 번호 NCIMB 42381 하에 기탁된 블라우티아 스테르코리스 균주, 또는 이의 유도체의 세포, 예컨대 단리된 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 기탁 번호 NCIMB 42381 하에 기탁된 블라우티아 스테르코리스 균주, 또는 이의 유도체의 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 기탁 번호 NCIMB 42381 하에 기탁된 블라우티아 스테르코리스 균주의 생물학적으로 순수한 배양물을 제공한다. 본 발명은 또한, 요법에서 사용하기 위해, 특히 본 명세서에 기재된 질환을 위해, 기탁 번호 NCIMB 42381, 또는 이의 유도체 하에 기탁된 블라우티아 스테르코리스 균주의 세포를 제공한다.
본 발명의 특히 바람직한 균주는 기탁 번호 NCIMB 42486 하에 기탁된 블라우티아 훽슬레라에 균주이다. 이것은 실시예에서 시험되고 질환을 치료하는데 효과적인 것으로 나타난 예시적인 MRX008 균주이다. 따라서, 본 발명은 기탁 번호 NCIMB 42486 하에 기탁된 블라우티아 훽슬레라에 균주, 또는 이의 유도체의 세포, 예컨대 단리된 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 기탁 번호 NCIMB 42486 하에 기탁된 블라우티아 훽슬레라에 균주의 세포 또는 이의 유도체를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 기탁 번호 NCIMB 42486 하에 기탁된 블라우티아 훽슬레라에 균주의 생물학적으로 순수한 배양물을 제공한다. 본 발명은 또한, 요법에서 사용하기 위해, 특히 본 명세서에 기재된 질환을 위해, 기탁 번호 NCIMB 42486 하에 기탁된 블라우티아 훽슬레라에 균주의 세포 또는 이의 유도체를 제공한다.
기탁 번호 NCIMB 42381 또는 42486 하에 기탁된 균주의 유도체는 최초의 것으로부터 배양된 (서브클로닝된)딸 균주 (자손) 또는 균주일 수 있다. 기탁 번호 NCIMB 42381 하에 기탁된 균주 또는 42486의 유도체는 최초의 것으로부터 배양된 (서브클로닝된) 딸 균주 (자손) 또는 균주일 수 있다. 본 발명의 균주의 유도체는 생물학적 활성을 없애지 않으면서 예를 들어 유전적 수준에서 변형될 수 있다. 특히, 본 발명의 유도체 균주는 치료적으로 활성이다. 유도체 균주는 최초 NCIMB 42381 또는 42486 균주에 대해 비교할만한 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 유도체 균주는 중추신경계 장애 또는 병태 모델에 대한 비교할만한 효과 및 실시예에서 기재된 배양 및 투여 프로토콜을 사용하여 확인될 수 있는 실시예에서 나타난 효과에 대한 사이토카인 수준에 대한 비교할만한 효과를 유도할 것이다. NCIMB 42381 균주의 유도체는 일반적으로 NCIMB 42381 균주의 생물형일 것이다. NCIMB 42486 균주의 유도체는 일반적으로 NCIMB 42486 균주의 생물형일 것이다.
기탁 번호 NCIMB 42381 하에 기탁된 블라우티아 스테르코리스 균주의 세포에 대한 언급은 기탁 번호 NCIMB 42381 하에 기탁된 균주와 동일한 안전성 및 치료적 효능 특성을 갖는 임의의 세포를 포괄하고, 그리고 그와 같은 세포는 본 발명에 의해 포괄된다. 따라서, 일부 구현예에서, 기탁 번호 NCIMB 42381 하에 기탁된 블라우티아 스테르코리스 균주의 세포에 대한 언급은 NCIMB 42381 하에 기탁된 MRX006 균주만을 지칭하고 NCIMB 42381 하에 기탁되지 않은 세균 균주를 지칭하지 않는다. 일부 구현예에서, 기탁 번호 NCIMB 42381 하에 기탁된 블라우티아 스테르코리스 균주의 세포에 대한 언급은 기탁 번호 NCIMB 42381 하에 기탁된 균주와 동일한 안전성 및 치료적 효능 특성을 갖지만, NCIMB 42381 하에 기탁된 균주가 아닌 세포를 지칭한다.
기탁 번호 NCIMB 42486 하에 기탁된 블라우티아 훽슬레라에 균주의 세포에 대한 언급은 기탁 번호 NCIMB 42486 하에 기탁된 균주와 동일한 안전성 및 치료적 효능 특성을 갖는 임의의 세포를 포괄하고, 그리고 그와 같은 세포는 본 발명에 의해 포괄된다. 따라서, 일부 구현예에서, 기탁 번호 NCIMB 42486 하에 기탁된 블라우티아 훽슬레라에 균주의 세포에 대한 언급은 NCIMB 42486 하에 기탁된 균주만을 지칭하고 NCIMB 42486하에 기탁되지 않은 세균 균주를 지칭하지 않는다. 일부 구현예에서, 기탁 번호 NCIMB 42486 하에 기탁된 블라우티아 훽슬레라에 균주의 세포에 대한 언급은 기탁 번호 NCIMB 42486 하에 기탁된 균주와 동일한 안전성 및 치료적 효능 특성을 갖지만, NCIMB 42486 하에 기탁된 균주가 아닌 세포를 지칭한다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:5에 대한 서열 동일성, 및 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:1, 2, 3 또는 4에 대한 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 서열, 바람직하게는 서열번호:2 또는 4에 대해 적어도 99% 동일한 16s rRNA 서열을 가지며, 더 바람직하게는 서열번호:2 또는 4의 16S rRNA 서열을 포함하는 염색체를 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:5에 대한 서열 동일성을 갖는 염색체를 가지며, 그리고 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:5에 대한 서열 동일성을 갖는 염색체, 및 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:1, 2, 3 또는 4에 대한 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 서열을 가지며, 그리고 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:2 또는 4에 의해 제시된 16s rRNA 서열에 대해 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 (예를 들어, 서열번호:2 또는 4의 16S rRNA 서열을 포함하는) 16s rRNA 서열 및 서열번호:5의 적어도 90%에 걸쳐 서열번호:5에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 염색체를 가지며, 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 블라우티아 스테르코리스이고, 그리고 서열번호:2 또는 4에 의해 제시된 16s rRNA 서열에 대해 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 (예를 들어, 서열번호:2 또는 4의 16S rRNA 서열을 포함하는) 16s rRNA 서열 및 서열번호:5의 적어도 98%에 걸쳐 (예를 들어 적어도 99% 또는 적어도 99.5%에 걸쳐) 서열번호:5에 대해 적어도 98% 서열 동일성 (예를 들어 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 서열 동일성)을 갖는 염색체를 가지며, 그리고 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:6에 대한 서열 동일성을 가지며, 그리고 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:1, 2, 3 또는 4에 대한 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 서열, 바람직하게는 서열번호:2 또는 4에 대해 적어도 99% 동일한 16s rRNA 서열를 가지며, 더 바람직하게는 서열번호:2 또는 4의 16S rRNA 서열을 포함하는 플라스미드를 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:6에 대한 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 가지며, 그리고 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:6에 대한 서열 동일성을 갖는 플라스미드, 및 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:1, 2, 3 또는 4에 대한 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 서열을 가지며, 그리고 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 은 서열번호:2 또는 4에 의해 제시된 16s rRNA 서열에 대해 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 (예를 들어, 서열번호:2 또는 4의 16S rRNA 서열을 포함하는) 16s rRNA 서열 및 서열번호:6의 적어도 90%에 걸쳐 서열번호:6에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 가지며, 그리고 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 블라우티아 스테르코리스이고, 그리고 서열번호:2 또는 4에 의해 제시된 16s rRNA 서열에 대해 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 (예를 들어, 서열번호:2 또는 4의 16S rRNA 서열을 포함하는) 16s rRNA 서열 및 서열번호:6의 적어도 98%에 걸쳐 (예를 들어 적어도 99% 또는 적어도 99.5%에 걸쳐) 서열번호:6에 대해 적어도 98% 서열 동일성 (예를 들어 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 서열 동일성)을 갖는 플라스미드를 가지며, 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:5에 대한 서열 동일성을 갖는 염색체, 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:6에 대한 서열 동일성을 갖는 플라스미드, 및 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:1, 2, 3 또는 4에 대한 서열 동일성을 가지며, 바람직하게는 서열번호:2 또는 4에 대해 적어도 99% 동일한 16s rRNA 서열을 가지며, 더 바람직하게는 서열번호:2 또는 4의 16S rRNA 서열을 포함하는 16S rRNA 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:5에 대한 서열 동일성을 갖는 염색체, 및 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:6에 대한 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 가지며, 그리고 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:5에 대한 서열 동일성을 갖는 염색체, 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:6에 대한 서열 동일성을 갖는 플라스미드, 및 예를 들어 상기에 기재된 바와 같은 서열번호:1, 2, 3 또는 4에 대한 서열 동일성을 갖는 16S rRNA 서열을 가지며, 그리고 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:2 또는 4에 의해 제시된 16s rRNA 서열에 대해 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 (예를 들어, 서열번호:2 또는 4의 16S rRNA 서열을 포함하는) 16s rRNA 서열, 서열번호:5의 적어도 90%에 걸쳐 서열번호:5에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 염색체, 및 서열번호:6의 적어도 90%에 걸쳐 서열번호:6에 대해 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 플라스미드를 가지며, 그리고 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적이다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 블라우티아 스테르코리스이고, 그리고 has 서열번호:2 또는 4에 의해 제시된 16s rRNA 서열과 적어도 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 (예를 들어, 서열번호:2 또는 4의 16S rRNA 서열을 포함하는) 16s rRNA 서열, 서열번호:5의 적어도 98%에 걸쳐 (예를 들어 적어도 99% 또는 적어도 99.5%에 걸쳐) 서열번호:5에 대해 적어도 98% 서열 동일성 (예를 들어 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 서열 동일성)을 갖는 염색체, 및 서열번호:6의 적어도 98%에 걸쳐 (예를 들어 적어도 99% 또는 적어도 99.5%에 걸쳐) 서열번호:6에 대해 적어도 98% 서열 동일성 (예를 들어 적어도 99% 또는 적어도 99.5% 서열 동일성)을 갖는 플라스미드를 가지며, 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 세균 균주는 생존가능하고 상기 장을 부분적으로 또는 전적으로 군집화할 수 있다.
블라우티아 하이드로게노트로피카 (이전에 루미노코쿠스 하이드로게노트로피쿠스로 알려짐)은 포유동물의 장으로부터 단리되었고, 엄격한 혐기성이며, 그리고 H2/CO2를 아세테이트로 대사하는데, 이는 인간 영양 및 건강에 중요할 수 있다. 블라우티아 하이드로게노트로피카의 균주의 유형은 S5a33 = JCM 14656이다. 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주 S5a36의 16S rRNA 유전자 서열에 대한 유전자은행 기탁 번호는 X95624.1이다 (서열번호:7로서 본 명세서에 개시됨). 이러한 예시적인 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주는 [28] 및 [31]에 기재되어 있다. S5a33 균주 및 S5a36 균주는 건강한 대상체의 배설물 샘플로부터 단리된 균주의 2개의 서브클론에 해당한다. 동일한 형태, 생물학 및 대사를 나타내고, 동일한 16S rRNA 서열을 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 블라우티아 하이드로게노트로피카는 서열번호:7의 16S rRNA 서열을 갖는다.
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 세균 균주의 16s rRNA 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:7에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한 16s rRNA 서열을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 서열번호:7에 의해 제시된 16s rRNA 서열을 갖는다.
기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 박테리아의 생물형인 세포 균주는 또한 자폐 스펙트럼 장애 및 중추신경계 장애 및 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 효과적일 것으로 기대된다.
기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 박테리아의 생물형이고 본 발명에서 사용하기에 적합한 균주는 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 박테리아에 대한 다른 뉴클레오타이드 서열을 서열분석함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 실질적으로 전체의 게놈은 서열분석될 수 있고 본 발명에서 사용하기 위한 생물형 균주는 그것의 전체의 게놈의 적어도 80%에 걸쳐 (예를 들어 적어도 85%, 90%, 95% 또는 99%에 걸쳐, 또는 그것의 전체의 게놈에 걸쳐) 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 가질 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 생물형 균주는 그것의 게놈의 적어도 98%에 걸쳐 적어도 98% 서열 동일성 또는 그것의 게놈의 99%에 걸쳐 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다. 생물형 균주를 확인하는데 사용하기 위한 다른 적합한 서열은 hsp60 또는 반복 서열 예컨대 박스, ERIC, (GTG)s, 또는 REP 또는 [29]를 포함할 수 있다. 생물형 균주는 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 박테리아의 상응하는 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 생물형 균주는 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 균주의 상응하는 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며 서열번호:7에 대해 적어도 99% 동일한 (예를 들어 적어도 99.5% 또는 적어도 99.9% 동일한) 16S rRNA 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 생물형 균주는 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 균주의 상응하는 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 서열 동일성을 갖는 서열을 가지며 서열번호:7의 16S rRNA 서열을 갖는다.
대안적으로, 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 박테리아의 생물형이고 본 발명에서 사용하기에 적합한 균주는 기탁 번호 DSM 14294 기탁, 및 제한 단편 분석 및/또는 PCR 분석을 사용하여, 예를 들어 형광 증폭된 단편 길이 다형성 (FAFLP) 및 반복적인 DNA 요소 (rep)-PCR 핑거프린팅, 또는 단백질 프로파일링, 또는 부분적인 16S 또는 23s rDNA 서열분석을 사용하여 확인될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 그와 같은 기술은 다른 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
특정 구현예에서, 기탁 번호 NCIMB 42381 또는 42486 하에 기탁된 박테리아의 생물형이고 본 발명에서 사용하기에 적합한 균주는 증폭된 리보솜 DNA 제한 분석 (ARDRA)에 의해, 예를 들어 Sau3AI 제한 효소를 사용하여 분석될 때 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 박테리아와 동일한 패턴을 제공하는 균주이다 (예시적인 방법 및 안내 참고, 예를 들어, [30]에 대해). 대안적으로, 생물형 균주는 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 박테리아와 동일한 탄수화물 발효 패턴을 갖는 균주로서 확인된다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 유용한 다른 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주, 예컨대 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 박테리아의 생물형은, 실시예에 기재된 검정을 포함하는 임의의 적절한 방법 또는 전략을 사용하여 확인될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용되는 균주는 혐기성 YCFA에서 배양하고/거나 상기 박테리아를 자폐 스펙트럼 장애 마우스 모델에게 투여하고, 그리고 그 다음 사이토카인 수준을 평가함으로써 확인될 수 있다. 특히, 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 박테리아에 대해 유사한 성장 패턴, 대사 유형 및/또는 표면 항원을 갖는 세균 균주은 본 발명에서 유용할 수 있다. 유용한 균주는 기탁 번호 DSM 14294 균주에 대한 비교할만한 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 생물형 균주는 실시예에서 기재된 배양 및 투여 프로토콜을 사용하여 확인될 수 있는 실시예에서 나타난 효과에 비해 자폐 스펙트럼 장애 모델에 대한 비교할만한 효과를 유도할 것이다.
본 발명의 특히 바람직한 균주는 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주이다. 이것은 실시예에서 시험되고 질환을 치료하는데 효과적인 것으로 나타난 예시적인 균주이다. 따라서, 본 발명은 세포, 예컨대 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주, 또는 이의 유도체의 단리된 세포를 제공한다. 본 발명은 또한, 기탁 번호 DSM 14294 하에서 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주, 또는 이의 유도체의 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 본 발명은 또한, 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주의 생물학적으로 순수한 배양물을 제공한다. 본 발명은 또한, 요법에서 사용하기 위해, 특히 본 명세서에 기재된 질환을 위해, 기탁 번호 DSM 14294 하에서 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주, 또는 이의 유도체의 세포를 제공한다.
기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 균주의 유도체 최초의 것으로부터의 배양된 (서브클로닝된) 딸 균주 (자손) 또는 균주일 수 있다. 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 균주의 유도체는 최초의 것으로부터 배양된 (서브클로닝된) 딸 균주 (자손) 또는 균주일 수 있다. 본 발명의 균주의 유도체는 생물학적 활성을 없애지 않으면서 예를 들어 유전적 수준에서 변형될 수 있다. 특히, 본 발명의 유도체 균주는 치료적으로 활성이다. 유도체 균주는 will 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 최초 균주에 대해 비교할만한 면역 조절 활성을 가질 것이다. 특히, 유도체 균주는 중추신경계 장애 또는 병태 모델에 대한 비교할만한 효과 및 실시예에서 기재된 배양 및 투여 프로토콜을 사용하여 확인될 수 있는 실시예에서 나타난 효과에 비해 사이토카인 수준에 대한 비교할만한 효과를 유도할 것이다. DSM 14294 균주의 유도체는 일반적으로 DSM 14294 균주의 생물형일 것이다.
기탁 번호 DSM 14294 하에서 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주의 세포에 대한 언급은 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 균주와 동일한 안전성 및 치료적 효능 특성을 갖는 임의의 세포를 포괄하고, 그리고 그와 같은 세포는 본 발명에 의해 포괄된다. 따라서, 일부 구현예에서, 기탁 번호 DSM 14294 하에서 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주의 세포에 대한 언급은 DSM 14294 하에 기탁된 균주만을 지칭하고, DSM 14294 하에 기탁되지 않은 세균 균주를 지칭하지 않는다. 일부 구현예에서, 기탁 번호 DSM 14294 하에서 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주의 세포에 대한 언급은 기탁 번호 DSM 14294 하에 기탁된 균주와 동일한 안전성 및 치료적 효능 특성을 갖지만 DSM 14294 하에 기탁된 균주가 아닌 세포를 지칭한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 세균 균주는 생존가능하고 상기 장을 부분적으로 또는 전적으로 군집화할 수 있다.
치료 용도
미생물총-소화관-뇌 축의 조절
소화관과 뇌 (미생물총-소화관-뇌 축) 사이의 소통은 양방향 신경체액 소통 시스템을 통해 일어난다. 최근 증거는, 소화관에 거주하는 미생물총이 뇌 발달을 감소시킬 수 있고 미생물총-소화관-뇌 축을 통한 행동 표현형을 생성할 수 있음을 나타낸다. 사실상, 수많은 검토는, 중추신경계 기능성을 유지하는데 미생물총-소화관-뇌 축의 역할을 시사하고 중추신경계 장애 및 병태의 발달에서 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상을 시사한다 [10], [13], [14], [32],
뇌과 소화관 (즉, 소화관-뇌 축) 사이의 양방향 소통은 중추신경계, 신경내분비 및 신경면역계를 포함하되, 이는 시상하부-뇌하수체-부신 (HPA) 축, 장용 신경계 (ENS) 및 미주신경을 포함하는 자율신경계 (ANS)의 교감성 및 부교감신경 아암, 및 장내 미생물총을 포함한다.
실시예에서 실증된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 미생물총-소화관-뇌 축을 조절할 수 있고 CNS 장애와 연관된 행동 증상을 감소시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 조성물은 중추신경계 (CNS)의 장애, 특히 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상와 연관된 장애 및 병태를 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한, 신경발달 장애 및/또는 신경정신 병태를 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 신경발달 질환 및 신경정신 병태는 미생물총-소화관-뇌 축과 종종 연관된다. 본 발명의 조성물은 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상에 의해 매개된 신경발달 질환 및/또는 신경정신 병태를 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다. 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 신경발달 장애 또는 신경정신 병태를 치료 또는 예방하는데 유용하다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 질환 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다: 자폐 스펙트럼 장애 (ASD); 아동 발달 장애; 강박 장애 (OCD); 주요 우울 장애; 우울증; 계절성 정서적 장애; 불안 장애; 정신분열증 스펙트럼 장애; 정신분열증; 양극성 장애; 정신병; 기분 장애; 만성 피로 증후군 (근육통성 뇌척수염); 스트레스 장애; 외상후 스트레스 장애; 치매; 알츠하이머; 파킨슨병; 및/또는 만성 통증. 추가 구현예에서, 본 발명의 조성물은 운동 뉴런 질환; 헌팅턴병; 길랑-바레 증후군 및/또는 수막염을 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 만성 질환을 치료 또는 예방하고, 다른 요법 (예컨대 항정신병약물 및/또는 항우울제에 의한 치료)에 반응하지 않느느 환자에서 질환을 치료 또는 예방하고/거나 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상와 연관된 조직 손상 및 증상을 치료 또는 예방하는데 특히 유용할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CNS를 조절한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 자율신경계 (ANS)를 조절한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 장용 신경계 (ENS)를 조절한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 시상하부, 뇌하수체, 부신 (HPA) 축을 조절한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 신경내분비 경로를 조절한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 신경면역 경로. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 CNS, ANS, ENS, HPA 축 및/또는 신경내분비 및 신경면역 경로를 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체의 공생 대사물 및/또는 위장 투과도의 수준을 조절한다.
미생물총-소화관-뇌 축의 신호전달은 신경계에 의해 조절된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 신경계에서 신호전달을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 중추신경계의 신호전달을 조절한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 감각 뉴런에서 신호전달을 조절한다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 운동 뉴런 에서 신호전달을 조절한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 ANS 에서 신호전달을 조절한다. 일부 구현예에서, ANS는 부교감신경계이다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 미주신경의 신호전달을 조절한다. 다른 구현예에서, ANS는 교감성 신경계이다. 다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 장용 신경계 에서 신호전달을 조절한다. 특정 구현예에서, ANS 및 ENS 뉴런의 신호전달은 위장관의 내강 내용에 직접적으로 반응한다. 다른 구현예에서, ANS 및 ENS 뉴런의 신호전달은 내강 박테리아에 의해 생산된 신경화학물질에 간접적으로 반응한다. 다른 구현예에서, ANS 및 ENS 뉴런의 신호전달은 내강 박테리아 또는 장내 분비 세포에 의해 생산된 신경화학물질에 반응한다. 특정 바람직한 구현예에서, ENS의 뉴런은 CNS의 기능에 영향을 미치는 미주신경 구심성을 활성화한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 장크롬친화성 세포의 활성을 조절한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동물 모델에서 공포 조건화를 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 공포 및/또는 불안의 발달를 조절하기 위해 사용될 수 있고/거나 대상체에서 사라지는 정도를 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동물 모델에서 스트레스-유도된 이상고열의 정도를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 스트레스 및/또는 불안의 수준을 조절한다.
자폐 스펙트럼 장애 (ASD)
자폐 스펙트럼 장애는, 사회적 상호작용, 소통 및 유래없이 제한된, 반복적인 행동 및 관심에서 초기-발병 어려움을 특징으로 하는, 이종성 신경발달 병태의 세트이다. 증상은 아주 어린 나이부터 인지될 수 있지만 ASD는 주류 교육을 시작하는 더욱 유능한 소아에서 종종 진단된다. 자폐증은 ASD의 일차 유형을 나타낸다.
역사상, 자폐증은 3개의 핵심 영역: 손상된 사회적 상호작용, 비정상 소통, 및 제한된 및 반복적인 행동 및 관심을 기반으로 하여 진단되어 왔다. 질환의 국제 분류 (ICD-10R, WHO 1993) 그리고 진단 및 통계 지침서 (DSM-IV, American Psychiatric Association, 2000)에서, 자폐증은, 4개의 가능한 진단 아형: 아스퍼거 증후군, 소아기 자폐증/자폐 장애, 비전형적 자폐증, 및 달리 분류되지 않는 PDD로, 전반적 발달 장애 (PDD)의 포괄적 용어에 포함된다. DMS-5에서, 이들 진단 아형은 자폐 스펙트럼 장애 (ASD)의 단일 카테고리로 조합되고 손상의 3개의 핵심 영역의 이전의 사용은, 감각 통합 기능이상을 포함하는, 2개의 주요 영역, 즉 사회적 의사소통 및 상호작용, 그리고 반복적인 행동으로 감소되어 왔다.
ASD는 다양한 상이한 방식으로 각각의 사람을 감염시키고 매우 경증부터 중증까지 다양할 수 있기 때문에 '스펙트럼 장애'이다. 감염된 개체의 기능은 실질적으로 언어 능력, 지능 수준, 동반이환, 증상의 조성 및 서비스에 접근에 따라 다양하다. 인지 기능, 학습, 주목 및 감각 처리는 일반적으로 손상된다.
DSM-IV는 자폐증의 진단이, 사회적 상호작용에서 정성적 손상의 최소 2개의 측정, 소통에서 정성적 손상의 1개의 증상, 그리고 제한된 및 반복적인 행동의 1개의 증상을 포함하는, 적어도 6개 증상의 존재를 요구한다는 것을 언급한다. DMS-5는 ASD의 진단을 2개의 증상 영역: (i) 사회적 상호작용 및 사회적 의사소통 결핍; 및 (ii) 행동, 관심 또는 활동의 제한된, 반복적인 패턴으로 재정립시킨다.
동반이환 의료 병태는 ASD에서 고도로 만연한다. 동반이환은 불안 및 우울증, 발작, 주의력 결핍, 공격적인 행동, 수면 문제, 위장 장애, 간질, 정신 지체, 지적 장애 및 섭식 곤란을 포함한다.
실시예는 본 발명의 조성물이 자폐 스펙트럼 장애의 동물 모델에서 질환 발병률 및 질환 중증도의 감소를 달성하고 그래서 이들이 자폐 스펙트럼 장애의 치료 또는 예방에서 유용할 수 있다는 것을 입증한다.
ASD는 환경 인자에 의해 부분적으로 유발된 중추신경계 장애이다. 따라서, 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상은 ASD의 발병 및 지속을 담당할 수 있다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 자폐 스펙트럼 장애를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 자폐증을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 일부 구현예에서, 자폐증은 전반적 발달 장애 (PDD)이다. 또 다른 구현예에서, PDD는 아스퍼거 증후군, 소아기 자폐증/자폐 장애, 비전형적 자폐증 및/또는 달리 분류되지 않는 PDD이다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 자폐 스펙트럼 장애, 자폐증, 전반적 발달 장애; 아스퍼거 증후군; 소아기 자폐증/자폐 장애, 비전형적 자폐증 및/또는 달리 분류되지 않는PDD를 치료 또는 예방하는데 유용하다.
본 발명의 조성물은 대상체의 미생물총-소화관-뇌 축 조절에 유용할 수 있다. 따라서, 바람직한 구현예에서 본 발명의 조성물은 ASD의 위험에 처한 것으로 확인된, 또는 태아기 또는 초기 발달 단계에; 소아기에 및/또는 성인기에 ASD로 진단된 환자에 있어서 ASD 예방에 유용하다. 본 발명의 조성물은 ASD의 발병을 예방하는데 유용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 ASD를 관리 또는 경감하는데 유용할 수 있다. ASD의 치료 또는 예방은, 예를 들어, 환자에 대하여 문제인 트리거의 범위 또는 악화의 빈도에서 감소 또는 증상의 중증도의 완화를 지칭할 수 있다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 ASD의 적어도 하나의 핵심 증상을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 DMS-5에서 분류된 ASD의 2개의 증상 도메인 중 적어도 하나를 예방, 감소 또는 경감시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 사회적 상호작용 및/또는 사회적 의사소통 결핍을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 행동, 관심 또는 활동의 제한적인, 반복적인 패턴을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 사회적 상호작용, 사회적 의사소통 결핍 및/또는 행동, 관심 또는 활동의 제한적인, 반복적인 패턴을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 반복적인 행동, 정형 행동, 강박성 행동, 일상적인 행동, 동일성 행동 및 제한된 행동을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 ASD를 가지고 있는 대상체에서 사회적 인식, 사회적 정보 처리, 사회적 의사소통에 대한 수용력, 사회적 불안 /회피, 및 자폐성 집착 및 특성을 개선한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 ASD의 핵심 증상과 연관된 추가 증상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 ASD를 가지고 있는 대상체에서 과민성 (공격, 고의적 자해 및 울화통 포함), 동요, 울음, 무기력, 사회적 위축, 정형 행동, 과잉행동, 비-준수, 부적절한 언어, 불안, 우울증, 및/또는 과도하게 또는 과소하게 통제된 행동을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 ASD를 가지고 있는 대상체에서 인지 기능, 학습, 주목 및/또는 감각 처리를 개선한다.
다른 구현예에서, 본 발명의 조성물은 ASD를 가지고 있는 대상체에서 이차 결과 측정을 개선한다. 일부 구현예에서, 이차 결과 측정은 관심의 추가의 증상 및/또는 기능적 평가 척도, 행동 척도 및 여러 종류 측정을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 ASD의 핵심 증상을 가지고 있는 대상체의 평가에 대한 진단 및/또는 증상 척도의 긍정적인 변화를 초래한다. 일부 구현예에서, 진단 및/또는 증상 척도는 자폐증 진단 면담 - 개정판 (ASI-R)이다. 일부 구현예에서, 진단 또는 증상 척도는 자폐증 진단 관찰 스케줄-일반적인 (ADOS-G), 이제 ADOS-2이다. 다른 구현예에서, 진단 또는 증상 척도는 자폐증 진단 면담 개정판 (ADI-R)이다. 다른 구현예에서, 진단 또는 증상 척도는 사회적 및 의사소통 장애 (DISCO)에 대한 진단 면담이다. 또 다른 구현예에서, 진단 또는 증상 척도는 소아기 자폐증 평정 척도 (CARS 및 CARS2)이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 ASD의 효능 종점의 일반적인 측정에서 긍정적인 변화를 야기한다. 특정 구현예에서, 일반적인 측정은, 비제한적으로 비정상적인 행동 체크리스트 (ABC), 아동 행동 체크리스트 (CBCL), 바이랜드-II 적응 행동 척도 (VABS), 사회적 반응성 척도 (SRS), 및/또는 반복적인 행동 척도- 개정판 (RBS-R)을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신과 및 신경적 장애를 평가하기 위한 임상 전반적 인상-전반적인 개선 (CGI-I) 척도를 개선한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 ASD를 가지고 있는 대상체의 전반적인 기능에 대한 긍정적인 효과를 나타낸다.
추가의 척도는 당해 분야의 숙련가에 알려져 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 당해 분야의 숙련가에게 알려진 진단 및/또는 증상 척도의 결과를 개선한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 ASD의 동반이환의 발병률을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 불안 및 우울증, 발작, 주의력 결핍, 공격적인 행동, 수면 문제, 위장 장애 (과민성 장 증후군 (IBS) 포함), 간질, 정신 지체, 지적 장애 및/또는 섭식 곤란의 발병률을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장 동반이환, 예컨대 복부 통증, 설사 및 고창을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 자폐증과 유사하게 임상적으로 나타나는 특정 정신과 및 행동 장애의 증상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 주의력 결핍 장애 (ADHD); 정서적/불안 장애; 부착 장애; 적대적 반항 장애 (ODD); 강박 장애 (OCD) 및/또는 정신분열증을 포함하는 정신병 (인지 손상)을 예방, 감소 또는 경감시키다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, ASD를 치료하기 위해 또 다른 요법과 함께 사용될 때 ASD를 예방, 감소, 또는 경감시키는데 특히 효과적이다. 그와 같은 요법은 항정신병약물, 항-불안 및 항우울제 약물을 포함한다. 그와 같은 약물은 리스페리돈 (Risperdal®); 올란자핀 (Zyprexa®); 플루옥세틴 (Prozac®); 세르트알린 (Zoloft®); 플루복스아민 (Luvox®); 클로미프라민 (Anafranil®); 할로페리돌 (Haldol®); 티오리다진; 플루펜아진; 클로르프로마진; 지프라시돈 (Geogon®); 카밤아제핀 (Tegretol®); 라모트리진 (Lamictal®); 토피라메이트 (Topomax®); 발프로산 (Depakote®); 메틸페니데이트 (Ritalin®); 디아제팜 (Valium®) 및 로라제팜 (Ativan®)을 포함한다.
자폐 스펙트럼 장애의 치료용 의약품의 임상 개발에서 EMA 지침은, 질환의 이종성으로 인해, 단일 화합물로 모든 핵심 증상에서 상당한 효과를 달성하는 것이 가능할 수 없고, 그래서 단기 효능이 적어도 하나의 핵심 증상에서 실증되어야 한다는 것을 언급한다. 실시예에서 사용된 살아있는 생물학적 치료 균주는 자폐 스펙트럼 장애의 적어도 하나의 핵심 증상의 효과적인 치료를 보여주었고, 그래서 이들 균주 및 관련된 블라우티아 균주는 인간 질환에 대해 효과적인 것으로 기대된다.
강박 장애 (OCD)
OCD는 불안 장애에 속하는 이종성, 만성 및 불구 장애이다. DSM-IV 정의에 따르면, OCD의 필수적인 특징은 중증이고 시간이 걸리는 (하루에 1 시간 초과) 또는 마킹된 고통을 야기히거나 대상체의 정상 일상적인, 직업적 기능화, 일반 사회적 활동 또는 관계 (기준 C)를 상당히 방해하는 재발성 강박상태 및/또는 충동 (기준 A)이다. 장애의 과정 동안 일부 지점으로서, 사람은 강박상태 또는 충동이 과도하거나 비합리적인 (기준 B) 것을 인식하였다.
강박상태는 강요적이고 부적절한 것으로 경험되는 그리고 현저한 불안 또는 고통을 야기하는 재발성 및 지속성 사고, 충동 또는 이미지로서 정의된다. 사고, 충동 또는 이미지는 실생활 문제에 대하여 단순히 과도한 걱정이 아니고, 이들은 그 자신의 마음의 산물 (예를 들어 오염에 대한 공포, 대칭 강박상태)로서 환자에 의해 인식된다. 사람은 일부 다른 사고 또는 행동으로 강박상태를 무시, 억압 또는 중화시키려 한다.
충동은 사람이 엄격하게 적용되어야 하는 규칙에 따라 또는 강박상태에 반응으로 수행하기 위해 유도되어 느끼는 반복적인 행동 (예를 들어 손 씻기, 주문, 비축, 점검) 또는 정신 작용 (예를 들어 기도, 계수하기, 조용한 말의 반복)으로서 정의된다.
OCD는 주요 우울 장애, 다른 불안 장애 (범불안 장애, 사회적 불안 장애, 공황 장애), 약물 남용 및 섭식 장애 (식욕부진 및 게걸증)을 포함하는 다른 정신과 질환의 동반이환 속도와 종종 연관된다.
OCD는 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상 로 인해을 발달시키거나 지속할 수 있는 정신과 장애이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 OCD를 치료 또는 예방하는데 유용하다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 OCD의 필수적인 증상 특징을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 재발성 강박상태 및/또는 충동을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 강박상태는 관입적이고 부적절한 것으로서 경험되고 현저한 불안 또는 고통을 야기하는 재발성 또는 지속적 사고, 충동 또는 이미지이다. 특정 구현예에서, 충동은, 대상체가 강박상태에 대한 반응으로 또는 엄격하게 적용되어야 하는 규칙에 따라 수행하기 위해 유도되도록 느끼는 반복적인 행동이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 Y-BOCS 및/또는 NIMH-OC 진단 및/또는 증상 척도에 따라 대상체에서 OCD의 증상을 개선한다. 일부 구현예에서, Y-BOCS 척도는 일차 종점의 개선를 모니터링하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, NIMH-OC 척도는 이차 파라미터의 개선를 모니터링하기 위해 사용된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신과 및 신경적 장애를 평가하기 위해 임상 전반적 인상-전반적인 개선 (CGI-I) 척도을 개선한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 ASD를 가지고 있는 대상체의 전반적인 사회적 기능 (관계, 일, 등)에 대한 긍정적인 효과를 나타낸다. 일부 구현예에서, 전반적인 척도는 쉬한 장애 척도이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 OCD의 적어도 하나의 동반이환을 예방, 감소 또는 경감시킨다. OCD의 동반이환은 주요 우울 장애, 다른 불안 장애 (범불안 장애, 사회적 불안 장애, 공황 장애), 약물 남용 및 섭식 장애 (식욕부진 및 게걸증) 질 드 라 투렛 증후군, ADHD (주의력 결핍 과잉행동 장애) 및 발달 장애를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, OCD를 치료하기 위해 또 다른 요법과 함께 사용될 때 OCD를 예방, 감소, 또는 경감시키는데 특히 효과적이다. 그와 같은 요법은 세로토닌 및 도파민 재흡수 억제제; 클로미프라민 및 항정신병약물을 포함한다.
주요 우울 장애 (MDD)
MDD는 실질적인 심리사회적 기능이상 및 높은 개별 정신적 긴장 뿐만 아니라 과잉 이환율 및 사망률 (자살의 위험은 상당하다)과 연관된다. 용어 주요 우울 장애는 임상 우울증, 주요 우울증, 단극성 우울증, 단극성 장애, 재발성 우울증 및 단순 우울증을 포괄한다. 용어 주요 우울 장애는 기분 장애; 기분저하증; 만성 우울증; 계절성 정서적 장애 및 경계선 인격 장애를 포함한다.
DMS-5 기준에 따르면, MDD 증상은 우울해진 기분, 또는 2주 초과 동안 일상 생활에서 관심 또는 즐거움의 상실; 및 손상된 사회적인, 직업적 및 교육적 기능을 포함한다. 특이적 증상, 하기 9개 중 적어도 5개의 특이적 증상이 거의 매일 나타난다: 하루 종일 우울해진 기분 또는 짜증남; 대부분의 활동에서 줄어든 관심 또는 즐거움, 대부분의 매일; 상당한 체중 변화 또는 식욕 변화; 수면 변화 (불면증 또는 과면증); 활동 변화 (전신운동 동요 또는 지연); 피로 또는 에너지 손실; 죄책감 또는 무가치함 (무가치함의 감정 또는 과도하거나 부적절한 죄책감); 감소된 집중력 (사고 또는 집중력에 대한 줄어든 능력, 또는 더 많은 우유부단함; 및 자살경향성 (죽음 또는 자살에 대한 생각, 또는 대상체는 자살 계획을 가지고 있다). 또한, MDD는 비이성적인 걱정을 포함하는 불안 증상; 불쾌한 걱정에 대한 선입감; 긴장해소 및/또는 긴장감 어려움과 연관된다. MDD 에피소드 경도, 중간 또는 중증일 수 있다.
MDD 에피소드는 다른 정신과 장애를 가지고 있거나 체세포 장애 예컨대 파킨슨병, 알츠하이머병, 뇌혈관 장애, 암 및 만성 통증 증후군을 가지고 있는 동반이환과 종종 연관된다. MDD는 범불안 장애; 불안 장애; 서브스턴스 사용 장애; 외상후 스트레스 장애 (PTSD); 인격 장애; 통증; 스트레스; 과민성 장 증후군; 불면증; 두통 및 대인관계 문제를 포함하는 동반이환으로서 넓은 스펙트럼의 다른 정신적 장애와 빈번하게 연관된다.
주요 우울 장애는 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상 로 인해을 발달시키거나 지속할 수 있는 정신과 장애이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 MDD를 치료 또는 예방하는데 유용하다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 급성 주요 우울 에피소드 및/또는 신규한 에피소드의 예방 (재발 예방)를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 경도, 중간 또는 중증 MDD 에피소드의 발생을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에서 열거된 DMS-5 기준에 의해 분류되는 바와 같은 MDD의 증상 중 하나 이상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 우울해진 기분을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 대부분의 활동에서 줄어든 관심 또는 즐거움을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 2-주 기간 내에 MDD의 증상의 발생을 감소시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 증상 또는 진단 척도에 따라 MDD의 증상을 개선한다. 그와 같은 증상 개선의 평가 척도는 우울증 (HAMD)의 해밀턴 평가 척도 및 몽고메리 아스버그 우울증 평가 척도를 포함한다. 또한, 정(Zung) 자가-평가 우울증 척도 (SDS) 및 정(Zung) 자가-평가 불안 척도 (SAS)는 또한 적합한 증상 개선 척도이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신과 및 신경적 장애를 평가하기 위해 임상 전반적 인상-전반적인 개선 (CGI-I) 척도을 개선한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 MDD를 가지고 있는 대상체의 전반적인 사회적 및 직업적 기능에 대한 긍정적인 효과를 나타낸다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 치료 내성 MDD를 치료 또는 예방하는데 유용하다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 MDD의 적어도 하나의 동반이환을 예방, 감소 또는 경감시킨다. MDD의 동반이환은 범불안 장애; 불안 장애; 서브스턴스 사용 장애; 외상후 스트레스 장애 (PTSD); 인격 장애; 통증; 스트레스; IBS; 불면증; 두통 및 대인관계 문제를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 MDD를 치료하기 위해 또 다른 요법과 함께 사용될 때, MDD를 예방, 감소, 또는 경감시키는데 특히 효과적이다. 그와 같은 요법은 항우울제, 확대 전략 (예를 들어 병용 요법, 리튬 및 다른 기분 안정화제, 갑상선 호르몬 및 비전형적 항정신병약물) 또는 심지어 제2 세대 항정신병약물을 포함한다.
불안 장애
불안 장애는 불안감 및 공포감을 특징으로 하는 정신적 장애의 그룹이다. 범불안 장애 (GAD); 특정 공포증; 사회적 불안 장애; 분리 불안 장애; 광장공포증; 공황 장애 및 선택적 무언증을 포함하는 수많은 불안 장애가 있다.
GAD는 6개의 기준에서 DMS-5에 따라 진단된다. 제1 기준은 불안 또는 걱정이 많은 활동에 관해서 대부분의 시간 동안 존재하는 6 개월 초과에 걸쳐 너무 많은 불안 또는 걱정이다. 제2 기준은 대상체가 제1 기준의 증상을 관리할 수 없다는 것이다. 제3 기준은 하기의 적어도 3개 (소아에서 1개)가 발생하는 것이다: 차분하지 못함; 쉽게 피곤함; 집중력 문제; 과민성; 근긴장 및 수면 문제. 최종 3개의 기준은 증상이 상당한 사회적인, 직업적 및 기능적 손상을 초래한다는 것; 증상이 약물, 약물, 또는 다른 신체적 건강 문제 때문이 아니라는 것; 그리고 증상이 또 다른 정신과 문제 예컨대 공황 장애와 더 양호하게 적합하지 않다는 것이다. 모든 다른 불안 장애는 GAD의 차별적인 진단으로서 고려될 수 있다.
GAD는 우울증; 서브스턴스 사용 장애; 스트레스; IBS; 불면증; 두통; 통증; 심장 사건; 대인관계 문제 및 ADHD를 포함하는 동반이환으로서 넓은 스펙트럼의 다른 정신적 장애와 빈번하게 연관된다.
불안 장애는 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상 로 인해을 발달시키거나 지속할 수 있는 정신과 장애 이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 불안 장애를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 특정 구현예에서, 불안 장애는 범불안 장애 (GAD); 특정 공포증; 사회적 불안 장애; 분리 불안 장애; 광장공포증; 공황 장애 및 선택적 무언증이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에서 열거된 DMS-5 기준에 의해 분류되는 바와 같이 대상체에서 GAD의 증상 중 하나 이상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. DMS-5에 따르면, 동일한 증상은 와 연관된다 다른 불안 장애. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 불안 장애의 증상 중 하나 이상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체의 불안 또는 걱정을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 6 개월 기간 내에 증상의 발생을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 차분하지 못함; 피로; 집중력 상실; 과민성; 근긴장성; 및/또는 수면 문제를 예방하고, 감소시키거나 완화시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 불안 장애와 연관된 사회적인, 직업적 및 기능적 손상을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 증상 또는 진단 척도에 따라 불안 장애의 증상을 개선한다. 특정 구현예에서, 증상 개선의 평가 척도는 해밀턴 불안 평가 척도 (HAM-A). 일부 구현예에서, HAM-A 총 척도는 일차 종점을 평가하기 위해 사용된다. 다른 구현예에서, HAM-A 정신적 불안 인자은 이차 종점으로서 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신과 및 신경적 장애를 평가하기 위해 임상 전반적 인상-전반적인 개선 (CGI-I) 척도을 개선한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 불안 장애를 가지고 있는 대상체의 전반적인 사회적인, 직업적 및 기능적 손상에 대한 긍정적인 효과를 나타낸다. 일부 구현예에서, 전반적인 척도는 쉬한 장애 척도이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 GAD의 동반이환 및 불안 장애을 예방, 감소 또는 경감시킨다. GAD의 동반이환은 우울증; 서브스턴스 사용 장애; 스트레스; IBS; 불면증; 두통; 통증; 심장 사건; 대인관계 문제 및 ADHD를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 불안 장애를 치료하기 위해 또 다른 요법과 함께 사용될 때, 불안 장애를 예방, 감소, 또는 경감시키는데 특히 효과적이다. 그와 같은 요법은 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 (벤라팍신, 둘록세틴, 에스시탈로프람 및 파록세틴); 벤조디아제핀 (알프라졸람, 로라제팜 및 클로나제팜); 프레가발린 (Lyrica®) 및 가바펜틴 (Neurontin®); 세로토닌 수용체 부분적인 효능제 (부스피론 및 탄도스피론); 비전형적 세로토닌성 항우울제 (예컨대 이미프라민 및 클로미프라민); 모노아민 옥시다제 억제제 (MAOI) (예컨대 모클로베마이드 및 페넬진); 하이드록시진; 프로프라놀롤; 클로니딘; 구안파신 및 프라조신을 포함한다.
외상후 스트레스 장애 (PTSD)
PTSD는 중증 및 불구 장애이고, 이의 필수적인 특징은 이 장애의 촉발 인자로서 외상적 사건을 포함하는 것이다.
PTSD의 증상은 DMS-V 기준에 따라 4개 주요 클러스터로 그룹화된다: (i) 침입: 그 예는 악몽, 외상성 사건의 원치않는 사고, 회상, 및 정서 고통 또는 생리적 반응성으로 외상적 알림에 반응을 포함함; (ii) 회피: 그 예는 장소, 대화, 또는 다른 추억을 포함하는 외상성 기억에 대한 트리거 회피를 포함함; (iii) 인지 및 기분의 음성 변경: 그 예는 외상적 사건에 대한 본인 또는 타인의 왜곡된 비난, 자신 또는 세상에 대한 부정적인 믿음, 지속적 부정적 감정 (예를 들어, 두려움, 죄책감, 수치심), 소외감, 및 억제된 감정 (예를 들어, 긍정적 감정을 경험하지 못함)을 포함함; (iv) 각성 및 반응성의 변경: 그 예는 분노한, 무모한, 또는 자기-파괴적 행동, 수면 문제, 집중력 문제, 증가된 깜짝놀람 반응, 및 과각성을 포함함.
외상적 사건의 4 주 이내 해결하는 증상은 급성 스트레스 장애에 대한 기준을 충족시킨다. DSM은 급성 (3 개월 미만 동안 증상의 기간)과 만성 PTSD (3 개월 초과 증상의 기간)을 구별한다. 증상이 스트레스요인 이후 6 개월 초과 동안 시작하면, 장애는 지연된 개시 PTSD로서 정의된다.
PTSD는 주요 우울 장애 및 서브스턴스 사용 장애와 높은 동반이환을 가져온다.
PTSD는 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상으로 인해 발달되거나 지속될 수 있는 정신과 장애이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 PTSD를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 유사한 발병에 따르면, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 스트레스 장애를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 급성 스트레스 장애를 치료한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 급성 및/또는 만성 PTSD를 치료한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 지연된 개시 PTSD를 치료한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에서 열거된 DMS-5 기준에 의해 분류되는 바와 같이 대상체에서 PTSD (또는 스트레스 장애)의 증상 중 하나 이상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 PTSD를 가지고 있는 대상체에서 침투적 사고을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 PTSD를 가지고 있는 대상체에서 회피 행동을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 PTSD를 가지고 있는 대상체에서 인지 및 기분의 음성 변경을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 PTSD를 가지고 있는 대상체에서 각성 및 반응성의 변경을 예방한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 증상 또는 진단 척도에 따라 PTSD 및 스트레스 장애의 증상을 개선한다. 특정 구현예에서, 증상 개선의 평가 척도는 임상- 투여된 PTSD (CAPS) 척도이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신과 및 신경적 장애를 평가하기 위해 임상 전반적 인상-전반적인 개선 (CGI-I) 척도를 개선한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 PTSD 및 스트레스 장애를 가지고 있는 대상체의 전반적인 사회적인, 직업적 및 기능적 손상에 대한 긍정적인 효과를 나타낸다. 일부 구현예에서, 전반적인 척도는 쉬한 장애 척도이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 PTSD 및 스트레스 장애의 동반이환을 예방, 감소 또는 경감시킨다. PTSD 및 스트레스 장애의 동반이환은 MDD, 서브스턴스 사용 장애; 스트레스 및 불안을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 PTSD 및 스트레스 장애를 치료하기 위해 또 다른 요법과 함께 사용될 때, PTSD 및 스트레스 장애를 예방, 감소, 또는 경감시키는데 특히 효과적이다. 그와 같은 요법은 세로토닌성 제제, 삼환형 항우울제, 기분 안정제, 아드레날린 억제제, 항정신병약물, 벤조디아제핀, 세르트알린 (Zoloft®), 플루옥세틴 (Prozac®) 및/또는 파록세틴 (Paxil®)을 포함한다.
정신분열증 스펙트럼 및 정신병적 장애
이들 질환은 분명히 생각하는, 양호한 판단을 하는, 정서적으로 반응하는, 효과적으로 의사소통하는, 현실을 이해하는, 그리고 적절하게 행동하는 대상체의 능력에 영향을 준다. 정신병적 질환은 정신분열증 (아래 열거된 증상); 분열정동성 장애 (상기 대상체는 정신분열증 및 기분 장애 둘 모두의 증상, 예컨대 우울증 또는 양극성 장애를 가짐); 정신분열형 장애 (정신분열증의 증상, 그러나 단시간: 1 내지 6 개월 동안 지속하는 증상을 나타냄); 단기 정신병적 장애 (대상체는, 종종 높은 스트레스성 사건, 예컨대 가족의 사망에 반응하여, 정신병적 행동의 갑작스러운, 짧은 기간을 나타냄 - 회복은 일반적으로 1 개월 미만임); 망상 장애 (적어도 1 개월 동안 지속하는 망상); 공유된 정신병적 장애; 서브스턴스-유도된 정신병적 장애; 또 다른 의료 병태로 인한 정신병적 장애; 망상분열증 (정신분열증과 유사한 증상을 나타내고, 사람이 나이든 경우, 삶에서 늦게 시작함)을 포함한다. 가장 널리-알려진 정신병적 장애는 정신분열증이고 다수의 정신병적 장애는 정신분열증과 유사한 증상을 나타낸다.
정신분열증은 이종성 과정 및 증상 프로파일을 가진 중증 정신과 질환이다. 정신분열증은 임상적으로 소위 양성 및 음성 증상으로 나타난다. 양성 증상은 망상, 환각, 무질서한 말하기, 및 무질서한 또는 긴장성 행동을 포함한다. 음성 증상은 정서적 둔마, 사고 및 말하기의 유창성 및 생산성에서 그리고 목표 지향된 행동의 개시에서 제한을 포함한다. 양성 증상은 정상 기능의 과잉 또는 왜곡을 반영하는 것처럼 보이고, 반면에 음성 증상은 정상 기능의 축소 또는 손실을 반영하는 것처럼 보인다. 또한, 인지 결핍 (작업 기억, 정보 처리, 주목/경계, 학습, 추리 및 사회적 인지의 결함)은 통상이다. 인지 결핍은 일반적으로 현행 항정신병약물 치료로 불량한 개선을 보여준다. 정신분열증 환자는 또한 기분 증상을 앓는다. 이들 우세한 증상 이외에, 정신분열증은 다른 정신과 증상 예컨대 조증 및 우울 증상, 불안 또는 강박 증상, 약물 남용 및 의존, 및 인격 장애를 가진 동반이환과 연관된다.
DMS-5에 따르면, 정신분열증의 진단을 위하여, 대상체는 하기 증상의 적어도 2종을 가져야 한다: 망상; 환각; 무질서한 말하기; 무질서한 또는 긴장성 행동 및 음성 증상. 증상 중 적어도 하나는 망상, 환각 또는 무질서한 말하기의 존재이어야 한다. 방해의 연속적 징후는 적어도 6 개월 동안 지속해야 하고, 그 동안 상기 대상체는, 상당한 시간에 걸쳐 발생하는 사회적 또는 직업적 악화 문제로, 적어도 1 개월의 활동 증상을 경험해야 한다.
정신분열증 스펙트럼 및 정신병적 장애는 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상 로 인해을 발달시키거나 지속할 수 있는 정신과 장애 이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 정신분열증 스펙트럼 및/또는 정신병적 장애를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 특정 구현예에서, 정신분열증 스펙트럼 및 정신병적 장애는 로부터 선택된다 정신분열증; 분열정동성 장애; 정신분열형 장애; 단기 정신병적 장애; 망상 장애; 공유된 정신병적 장애; 서브스턴스-유도된 정신병적 장애; 또 다른 의료 병태로 인한 정신병적 장애 및 망상분열증으로부터 선택된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신분열증를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 특정 구현예에서, 정신분열증은 하기로부터 선택된다: 편집성, 무질서한, 긴장성, 미분화된 및 잔존 정신분열증.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에서 열거된 DMS-5 기준에 의해 분류되는 바와 같이 대상체에서 정신분열증의 증상 중 하나 이상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 이들 구현예는 다른 정신분열증 스펙트럼 및 정신병적 장애의 증상의 예방, 감소 또는 완화에 적용된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신분열증의 음성 증상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신분열증의 양성 증상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신분열증의 음성 및 양성 증상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신분열증을 가지고 있는 대상체에서 망상, 환각, 무질서한 말하기, 및 무질서한 또는 긴장성 행동을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신분열증을 가지고 있는 대상체에서 정서적 둔마, 사고 및 말하기의 유창성 및 생산성의 제한 및 목표 지향된 행동의 개시을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신분열증을 가지고 있는 대상체에서 인지 결함 및/또는 기분 장애을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 6 개월 기간 내에 대상체에서 정신분열증의 양성 및/또는 음성 증상의 발생을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신분열증 스펙트럼 또는 정신병적 장애을 가지고 있는 대상체에서 사회적 및/또는 직업적 기능성을 개선한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 증상 또는 진단 척도에 따라 정신분열증의 증상 스펙트럼 또는 정신병적 장애을 개선한다. 특정 구현예에서, 증상 개선의 평가 척도는 양성 및 음성 증상 척도 (PANSS) 및 간단한 정신과 평가 척도 (BPRS)이다. 특정 구현예에서, 음성 증상 (SANS)의 평가 척도가 사용된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신과 및 신경적 장애를 평가하기 위해 임상 전반적 인상-전반적인 개선 (CGI-I) 척도을 개선한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신분열증 스펙트럼 또는 정신병적 장애를 가지고 있는 대상체의 전반적인 사회적 및 직업적 손상에 대한 긍정적인 효과를 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신분열증 스펙트럼 또는 정신병적 장애의 적어도 하나의 동반이환을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 동반이환은 조증 및 우울 증상, 불안 또는 강박 증상, 약물 남용 및 의존, 및 인격 장애이다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 치료 내성의 불응성 정신분열증을 치료 또는 예방하는데 유용하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 PTSD 및 스트레스 장애를 치료하기 위해 또 다른 요법과 함께 사용될 때, 정신분열증 스펙트럼 또는 정신병적 장애를 예방, 감소, 또는 경감시키는데 특히 효과적이다. 특정 구현예에서, 그와 같은 요법은 클로르프로마진, 플루펜아진, 할로페리돌 및/또는 퍼펜아진을 포함하는 제1 세대 항정신병약물을 포함한다. 특정 구현예에서, 그와 같은 요법은 아리피프라졸 (Abilify®); 아세나핀 (Saphris®); 브렉스피프라졸 (Rexulti®); 카프리프라진 (Vraylar®); 클로자핀 (Clozaril®); ilopendone (Fanapt®); 루라시돈 (Latuda®); 올란자핀 (Zyprexa®®); 팔리페리돈 (Invega); 쿠에티아핀 (Seroquel®); 리스페리돈 (Risperdal®); 지프라시돈 (Geodon®)을 포함하는 제2 세대 요법을 포함한다.
양극성 장애
양극성 장애는 일반적으로 만성 질환이다. 조병은 양극성 장애의 주 증상이다. 조증 및 우울증 에피소드의 특이적 기간 및 패턴을 기반으로 양극성 장애의 몇 개의 유형이 있다. DMS-5에서, 구별은 양극성 I 장애, 양극성 II 장애, 순환성 장애, 급속-순환 양극성 장애 및 양극성 장애 NOS 사이 실시된다.
DSM에 따르면, 조병은 비정상적으로 및 지속적으로 상승된, 과대망상된, 또는 짜증남 기분의 뚜렷한 기간이다. 에피소드는 1 주 지속해야 하고, 기분은 하기 증상의 적어도 3개를 가져야 한다: 높은 자부심; 감소된 수면 필요성; 말하기 속도 증가; 아이디어의 신속한 점프; 쉽게 산만해짐; 목표 또는 활동의 증가된 관심; 전신운동 동요; 고위험의 증가된 활동 추구.
양극성 I 장애는 하나 이상의 조증 또는 혼합된 (조병 및 우울증) 에피소드 및 적어도 하나의 주요 우울 에피소드를 포함한다 (MDD 에피소드의 증상에 대해 상기 참고). 양극성 II 장애는 적어도 하나의 경조증 에피소드에 의해 동반된 하나 이상의 주요 우울 에피소드를 갖는다. 조증 또는 혼합형 에피소드는 없다. 경조증은 조병의 덜 알려진 형태이다. 증상은 상당한 사회적인, 직업적 및 기능적 손상을 담당한다. 순환기질은 경조증의 기간과 함께 저-수준 우울증 변화를 특징으로 한다. 증상은 진단이 실시될 수 있기 전 소아에서 1년 또는 성인에서 적어도 2년 동안 존재해야 한다. 성인 및 소아에서 무증상 기간은, 각각 2 개월 또는 1 개월 이하 동안 지속한다. 신속한 순환 양극성 장애는 양극성 장애의 중증 형태이다. 사람이 1 년 이내 주요 우울증, 조병, 경조증, 또는 혼합된 상태의 적어도 4 에피소드를 갖는 경우 발생한다. 달리 분류되지 않는 (NOS) 양극성 장애는 다른 유형에 분명히 적합하지 않은 양극성 증상으로 분류하였다. NOS는 다중 양극성 증상이 존재하지만 임의의 다른 아형에 대한 라벨을 충족시키기에 충분하지 않은 경우 진단된다.
양극성 장애는 하기 동반이환과 연관된다: ADHD; 불안 장애; 서브스턴스 장애; 비만 및 대사 증후군.
양극성 장애는 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상으로 인해 발달되거나 지속될 수 있는 정신과 장애이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 양극성 장애를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 특정 구현예에서, 양극성 장애는 양극성 I 장애이다. 특정 구현예에서, 양극성 장애는 양극성 II 장애. 특정 구현예에서, 양극성 장애는 순환성 장애이다. 특정 구현예에서, 양극성 장애는 급속-순환 양극성 장애이다. 특정 구현예에서, 양극성 장애는 양극성 장애 NOS이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 양극성 장애의 증상 중 하나 이상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 조증 에피소드의 발생을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 비정상적으로 및 지속적으로 상승된, 팽창된, 또는 짜증남 기분의 발생을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기 증상 중 하나 이상을 예방, 감소 또는 경감시킨다: 높은 자부심; 감소된 수면 필요성; 말하기 속도 증가; 아이디어의 신속한 점프; 쉽게 산만해짐; 목표 또는 활동의 증가된 관심; 전신운동 동요; 고위험의 증가된 활동 추구. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 하나 이상의 조증 또는 혼합된 에피소드의 발생을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 적어도 하나의 주요 우울 에피소드의 발생을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 경조증 에피소드에 의해 동반된 적어도 하나의 주요 우울 에피소드의 발생을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 양극성 장애의 급성기를 치료하고/거나 추가의 에피소드의 발생을 예방한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 양극성 장애를 가지고 있는 대상체에서 조증/우울 에피소드의 급성기를 치료하고, 그리고 추가의 조증/우울 에피소드의 발생을 예방한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 증상 또는 진단 척도에 따라 양극성 장애의 증상을 개선한다. 특정 구현예에서, 조증 에피소드의 증상 개선의 평가 척도는 조증 상태 평가 척도 및 청수년 조병 평가 척도이다. 특정 구현예에서, 척도는 베흐-라파엘센 조병 척도 (BRMAS)이다. 특정 구현예에서, 조증에서 우울 에피소드로 스위칭되는 증상 개선의 평가 척도는 해밀턴 우울증 평가 척도, 몽고메리-아스버그 평가 척도, 및 베흐-라파엘센 우울증 척도를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신과 및 신경적 장애를 평가하기 위해 임상 전반적 인상-전반적인 개선 (CGI-I) 척도을 개선한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 양극성 장애를 가지고 있는 대상체의 전반적인 사회적인, 직업적 및 기능적 손상에 대한 긍정적인 효과를 나타낸다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 양극성 장애의 적어도 하나의 동반이환을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 동반이환은 하기로부터 선택된다: ADHD, 불안 장애, 서브스턴스 장애, 비만 및 대사 증후군.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 리튬 및 디발프로엑스에 반응하지 않는 조증-우울 병 및 양극성 장애를 치료 또는 예방하는데 유용하다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 양극성 장애를 치료하기 위해 또 다른 요법과 함께 사용될 때, 양극성 장애를 예방, 감소, 또는 경감시키는데 특히 효과적이다. 특정 구현예에서, 그와 같은 요법은 리튬 카보네이트, 항경련제 약물 (발프로에이트, 디발프로엑스, 카밤아제핀 및 라모트리진 포함) 및 항정신병 약물 (아리피프라졸, 올란자핀, 쿠에티아핀 및 리스페리돈 포함)을 포함한다.
신경인지 장애 및 알츠하이머병
DSM-5에서, 용어 치매는 용어들 주요 신경인지 장애 및 온건한 신경인지 장애로 대체되었다. 신경인지 장애는 불균질 부류의 정신과 질환이다. 가장 흔한 신경인지 장애는 알츠하이머병, 이어서 혈관 치매 또는 2개의 혼합된 형태이다. 다른 형태 of 신경퇴행성 장애 {예를 들어 루이체 질환, 전두측두 치매, 파킨슨 치매, 크로이펠츠-야콥병, 헌팅턴병, 및 베르니케-코르사코프 증후군)는 치매에 의해 동반된다.
DSM-5 하의 치매의 증상 기준은 하기로부터 선택된 하나 이상의 인지 영역에서 성능의 이전의 수준으로부터 상당한 인지력 감퇴의 증거이다: 학습 및 기억; 언어; 실행 기능; 복잡한 주의; 지각-운동 및 사회적 인지. 인지 결핍은 일상 활동에서의 독립을 방해해야 한다. 또한, 인지 결핍은 섬망의 맥락에서 독점적으로 일어나지 않고 또 다른 정신 장애 (예를 들어 MDD 또는 정신분열증)에 의해 더 잘 설명되지 않는다.
일차 증상에 추가하여, 신경인지 장애를 가지고 있는 대상체는 동요, 공격, 우울증, 불안, 무관심, 정신병 및 수면-각성 사이클 방해를 포함하는 행동 및 정신과 증상을 나타낸다.
신경인지 장애는 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상으로 인해 발달되거나 지속될 수 있는 정신과 장애이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 신경인지 장애를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 바람직한 구현예에서, 신경인지 장애는 알츠하이머병. 다른 구현예에서, 신경인지 장애는 혈관 치매; 혼합된 형태 알츠하이머병 및 혈관 치매; 루이체 질환; 전두측두 치매; 파킨슨 치매; 크로이펠츠- 야콥병; 헌팅턴병; 및 베르니케-코르사코프 증후군 로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 신경인지 장애의 증상 중 하나 이상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 인지력 감퇴의 발생을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기로부터 선택된 하나 이상의 인지 영역에서 신경인지 장애를 가지고 있는 대상체의 성능의 수준을 개선한다: 학습 및 기억; 언어; 실행 기능; 복잡한 주의; 지각-운동 및 사회적 인지. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동요, 공격, 우울증, 불안, 무관심, 정신병 및 수면-각성 사이클 방해로부터 선택된 신경인지 장애와 연관된 하나 이상의 행동 및 정신과 증상의 발생을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 전임상 단계에서 의심되는 병원성 기전에서의 개입에 의한 증상 질환을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 증상 진행의 둔화 또는 정지로, 질환 변형을 개선한다. 일부 구현예에서, 증상 진행의 둔화 또는 정지는 기저의 신경병리 과정 지연에서 증거와 상관관계가 있다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 향상된 인지 및 기능적 개선을 포함하는 신경인지 장애의 증상을 개선한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 치매의 행동 및 정신과 증상 (BPSD)를 개선한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 일상 활동을 착수하기 위해 신경인지 장애를 가진 대상체의 능력을 개선한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 알츠하이머병을 가지고 있는 대상체에서 인지 및 기능 둘 모두를 개선한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 알츠하이머병을 가지고 있는 대상체에서 인지 종점을 개선한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 알츠하이머병을 가지고 있는 대상체에서 기능적 종점을 개선한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 알츠하이머병을 가지고 있는 대상체에서 인지 및 기능적 종점을 개선한다. 또 추가의 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 알츠하이머병을 가지고 있는 대상체에서 전체적인 임상 반응 (전반적인 종점)을 개선한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 증상 또는 진단 시험에 따른 신경인지 장애의 증상을 개선한다. 특정 구현예에서, 알츠하이머병 (및 다른 신경인지 장애)의 증상 개선 평가용 테스트는 객관적인 인지, 일상 생활 활동, 변화의 전반적인 평가, 건강 관련된 삶의 질 테스트 그리고 신경인지 장애의 행동 및 정신과 증상을 평가하는 테스트로부터 선택된다.
특정 구현예에서, 증상 개선의 평가용 객관적인 인지 테스트는 알츠하이머병 평가 척도 인지 하위척도 (ADAS-cog) 및 고전적 ADAS 척도를 사용한다. 특정 구현예에서, 인지의 증상 개선은 알츠하이머병에서 사용을 위한 신경생리적 테스트 배터리 (NTB)를 사용하여 평가된다.
일부 구현예에서, 변화 테스트의 전반적인 평가는 정신과 및 신경적 장애를 평가하기 위한 임상 전반적 인상-전반적인 개선 (CGI-I) 척도를 사용한다. 일부 구현예에서, 전반적인 척도는 임상의의 인터뷰 기반 인상 변화 플러스 (CIBIC-플러스)이다. 일부 구현예에서, 전반적인 척도는 알츠하이머병 협력 연구 유닛 임상의의 전반적인 인상 변화 (ADCS-CGIC)이다.
특정 구현예에서, 건강 관련된 삶의 질 평가는 알츠하이머병-관련된 QOL (ADRQL) 및 QOL-알츠하이머병 (QOL-AD)이다.
특정 구현예에서, 신경인지 장애의 행동 및 정신과 증상을 평가하는 테스트는 알츠하이머병 평가 척도의 행동 병리학 (BEHAVE-AD); 치매용 행동 평가 척도 (BRSD); 신경정신행동검사 (NPI); 및 코헨-만스필드 동요 목록 (CMAI)로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 신경인지 장애를 치료하기 위해 또 다른 요법과 함께 사용될 때 신경인지 장애를 예방, 감소, 또는 경감시키는데 특히 효과적이다. 특정 구현예에서, 그와 같은 요법은 도네페질 (Aricept®), 갈란타민 (Razadyne®) 및 리바스티그민 (Exelon ®), 및 메만틴을 포함하는 아세틸콜린에스테라제 억제제를 포함한다.
파킨슨병
파킨슨병은 신경 세포 (도파민-생산 세포)의 이종성 모집단의 퇴행을 특징으로 하는 신경병리적으로 흔한 신경퇴행성 질환이다. 파킨슨병의 임상 진단은 운동완서 및 하기 핵심 증상 중 적어도 하나를 필요로 한다: 휴지성 떨림; 근육 강성/경직성 및 체위성 반사운동 손상. 질환의 진행 동안 존재 또는 발달할 수 있는 다른 징후 및 증상은 자율신경 방해 (타액분비과다증, 지루, 변비, 배뇨 방해, 성적 기능, 기립성 저혈압, 다한증), 수면 방해 및 냄새 감각 또는 온도 감각의 방해이다. 우울 증상 및 인지 기능이상 동반이환은 많은 파킨슨병 환자, 뿐만 아니라 루이스체에 관련된 신경인지 장애에서 발달한다.
파킨슨병는 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상으로 인해 발달되거나 지속될 수 있는 정신과 장애이다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 파킨슨병를 치료 또는 예방하는데 유용하다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 파킨슨병의 증상 중 하나 이상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 파킨슨병의 하나 이상의 핵심 증상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 운동완서을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 휴지성 떨림; 근육 강성/경직성 및/또는 체위성 반사운동 손상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 자율신경 방해 (타액분비과다증, 지루, 변비, 배뇨 방해, 성적 기능, 기립성 저혈압, 다한증), 수면 방해 및 냄새 감각 또는 온도 감각의 방해로부터 선택된 파킨슨병 진행과 연관된 하나 이상의 증상을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 파킨슨병을 가지고 있는 우울 증상 동반이환을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 구두 기억 및/또는 실행 기능을 개선한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 주목, 작업 기억, 언어 유창성 및/또는 불안을 개선한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 파킨슨병을 가지고 있는 인지 기능이상 동반이환을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 파킨슨병 진행을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 늦은 운동 합병증을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 늦은 운동 변동을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 신경 손실을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 파킨슨병 치매 (PDD)의 증상을 개선한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 실행 기능, 주목 및/또는 작업 기억의 손상을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 도파민작용성 신경전달을 개선한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 손상된 도파민작용성 신경전달을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 증상 또는 진단 척도에 따라 파킨슨병의 증상을 개선한다. 특정 구현예에서, 파킨슨병에서 운동 기능의 증상 개선을 평가하는 시험은 통일된 파킨슨병 평가 척도이다. 특히, UPDRS II는 일상 생활의 활동을 고려하고, 그리고 UPDRS III은 운동-시험을 고려한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 증상 또는 진단 시험 및/또는 척도에 따라 PDD와 연관된 증상을 개선한다. 특정 구현예에서, 테스트 또는 척도는 하기로부터 선택된다: the 홉킨스 언어 학습 테스트 - 개정판 (HVLT-R); 델리스-카플란 실행 기능 시스템 (D-KEFS) 색상-단어 간섭 테스트; 해밀턴 우울증 평가 척도 (HAM-D 17; 우울증); 해밀턴 불안 평가 척도 (HAM-A; 불안) 및 통일된 파킨슨병 평가 척도 (UPDRS; PD 증상 중증도).
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 정신과 및 신경적 장애를 평가하기 위해 임상 전반적 인상-전반적인 개선 (CGI-I) 척도을 개선한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 파킨슨병을 가지고 있는 대상체의 전반적인 사회적 및 직업적 손상에 대한 긍정적인 효과를 나타낸다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 신경인지 장애를 치료하기 위해 또 다른 요법과 함께 사용될 때 신경인지 장애를 예방, 감소, 또는 경감시키는데 특히 효과적이다. 특정 구현예에서, 그와 같은 요법은 도파민 효능제 (L-Dopa+ 포함); 모노아민 옥시다제 억제제, 카테콜아민-O-메틸 전달효소 억제제; 항콜린제 및 글루타메이트 조절제를 포함한다.
다른 중추신경계 장애
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 미생물총-소화관-뇌 축의 기능이상과 연관된 중추신경계 장애를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 상기 구현예에 추가하여, 본 발명의 조성물은 정신병; 만성 피로 증후군 (근육통성 뇌척수염) 및/또는 만성 통증를 치료 또는 예방하는데 유용하다. 추가 구현예에서, 본 발명의 조성물은 운동 뉴런 질환; 헌팅턴병; 길랑-바레 증후군 및/또는 수막염을 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다.
헌팅턴 질환
헌팅턴 질환은, 뇌에서 특정 신경 세포를 손상시키는, 선천적 결함있는 유전자에 의해 야기된, 선천적 뇌 병태이다. 이 뇌 손상은 경시적으로 점진적으로 악화되고 운동, 인지 (지각, 인식, 생각, 판단) 및 행동에 영향을 줄 수 있다. 질환의 초기 특징은 성격 변화, 기분 기복, 꼼지락거리는 운동, 과민성 및 변경된 행동을 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 헌팅턴병을 치료 또는 예방하는데 유용하다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 헌팅턴병의 증상, 예컨대 과민성 또는 과도한 운동을 관리한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 헌팅턴병과 연관된 우울증을 치료하고/하거나 증상 예컨대 사회적 위축, 부족 또는 관심 및 수면 방해를 개선한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 과제에 집중하는 능력 및 기억을 개선한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 불구 비정상 운동을 치료한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 행동 문제, 반사회적 행동, 과민성 및 헌팅턴병과 연관된 정신병을 치료한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 신경보호를 유도하고 신경 손상을 예방한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 도파민의 수준 및/또는 도파민-함유 세포의 수준을 증가시킨다.
신경화학 인자, 뉴로펩타이드 및 신경전달물질 및 미생물총-소화관-뇌 축
상기 설명된 바와 같이, 미생물총-소화관-뇌 축은 수많은 상이한 생리 시스템에 의해 조절된다. 미생물총-소화관-뇌 축은 수많은 신호전달 분자에 의해 조절된다. 이들 신호전달 분자의 수준에서 변경은 중추신경계 발달 및/또는 기능성에서 결함을 초래한다. 사실상, 이 섹션에서 개시된 많은 분자는 중추신경계 장애 또는 병태의 발병 및 미생물총-소화관-뇌 축의 기능성에서 연루되었다 ([14], [32], [10], [33]). 발명자들에 의해 수행된 실험은 행동 변화가 블라우티아 균주의 투여에 의해 유발될 수 있다는 것을 나타낸다. 이 효과는 신호전달 분자, 특히 이 섹션에서 열거된 것의 수준에서 효과에 의해 매개될 수 있다. 이들 변경은 블라우티아 균주와 연관된 치료적 이점을 담당할 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 개시된 중추신경계 장애 및 병태가 (즉 미생물총-소화관-뇌 축을 통해) 유사한 근본적인 생화학적 및 생리적 발병을 나타낸다는 사실로 인해, 블라우티아 균주의 유사한 치료적 이점은 이들 장애 및 병태에 대하여 또한 달성될 수 있다. 블라우티아 스테르코리스의 투여는 중추신경계 장애 또는 병태와 연관된 행동 변화를 유발하는데 특히 효과적일 수 있다. 특정 구현예에서, 블라우티아 훽슬레라에의 투여는 중추신경계 장애 또는 병태와 연관된 행동 변화를 유발하는데 특히 효과적일 수 있다.
미생물총-소화관-뇌 축의 신호전달은 신경화학 인자, 뉴로펩타이드 및 신경전달물질의 수준에 의해 조절된다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 신경화학 인자, 뉴로펩타이드 및 신경전달물질의 수준을 조절한다. 따라서, 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 직접적으로 CNS 생화학을 변경시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 뇌-유래된 신경친화성 인자 (BDNF)의 수준을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 모노아민을 조절한다. 특정 구현예에서, 모노아민은 세로토닌 (5-하이드록시트립트아민 (5-HT)), 도파민, 노르에피네프린 및/또는 에피네프린. 특정 구현예에서, 모노아민은 카테콜아민. 특정 구현예에서, 카테콜아민은 도파민, 노르에피네프린 및 에피네프린. 특정 구현예에서, 모노아민은 트립타민의 수준을 조절한다. 특정 구현예에서, 트립타민은 세로토닌 및 멜라토닌. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 아세틸콜린의 수준을 조절한다.
특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 옥시톡신의 수준을 조절한다. 옥시토신는 정서, 사회적인, 인지 및 신경내분비 생리 뿐만 아니라 자가조절과 연관된다. 특히, 옥시토신 방출은 불안해소; 양성 기분; 모계 행동, 암수 한쌍의 결합; 성적 행동; 사회적 기억; 후각 기억; 식욕감퇴 효과; 스트레스에 반응하는 HPA 축의 감쇠; 출생 및 젖먹이 동안 자동흥분 뿐만 아니라 다른 생리적 및 심리적 과정에 관여된다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 옥시토신의 수준을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은의 수준을 감소시킨다 옥시토신. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 옥시토신 신호전달을 증가 또는 감소시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 옥시토신 수용체의 수준을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 뉴런, 근육 및 위장 세포 내외로 칼슘 이온의 흐름을 조절한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 옥시토신의 수준을 조절함으로써 미생물총-소화관-뇌 축과 연관된 신경발달 및 신경정신 장애 및 질환을 치료 및 예방한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 뇌 모노아민 및 이의 대사물의 수준을 조절한다. 바람직한 구현예에서, 모노아민은 세로토닌. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 트립토판 대사의 세로토닌성 및/또는 카이뉴레닌 경로를 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세로토닌 대사물, 예컨대 5-하이드록시인돌아세트산 (5-HIAA)의 수준을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 도파민 대사물, 예컨대 호모바닐산 (HVA)의 수준을 조절한다. 이들 신경전달물질 및 신경화학 인자의 조절은 스트레스, 우울증 및 불안-관련된 장애를 치료하는데 유용하다.
미생물총-소화관-뇌 축의 신호전달은 γ-아미노부티르산 (GABA)의 수준에 의해 조절된다. 따라서, 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 GABA의 수준을 조절한다. GABA는 뉴런 흥분성을 감소시키는 억제성 신경전달물질 이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 GABA의 수준을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 GABA의 수준을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 GABAergic 신경전달을 변경시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 중추신경계의 상이한 영역에서 GABA 전사의 수준을 조절한다. 특정 구현예에서, 공생 유래된 GABA는 혈액-뇌 장벽을 가로지르고 신경전달에 직접적으로 영향을 준다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 해마, 편도 및/또는 청색 반점에서 GABA의 감소 로 이어진다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 피질 영역에서 GABA의 증가 로 이어진다.
신경활동 분자, 예컨대 세로토닌, 멜라토닌, GABA, 히스타민 및 아세틸콜린의 수준은 중추신경계 질환 예컨대 치매, 알츠하이머병 및 헌팅턴병의 병리생리와 연결된다.
미생물총-소화관-뇌 축의 신호전달은 히스타민의 수준에 의해 조절된다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 히스타민의 수준을 조절한다. 특정 구현예에서, 히스타민은 면역조절 효과를 갖는다. 특정 구현예에서, 히스타민 수준은 내강으로부터 체순환계로 박테리아의 전좌를 가능하게 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장관 투과도 및/또는 장벽 기능을 변경시킨다. 특정 다른 구현예에서, 히스타민은 중심 과정에 연결된 신경전달물질로서 작용한다.
미생물총-소화관-뇌 축의 신호전달은 HPA 축에 의해 조절된다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 HPA 활동을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 HPA 스트레스 반응을 약화시킨다. 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 HPA 활동과 연관된 염증 반응을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 글루코코르티코이드의 수준을 조절한다. 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 코르티코스테론 및 아드레날린의 수준을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 코르티코트로핀-방출 인자 및/또는 바소프레신의 수준을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 바소프레신 및/또는 다른 신경뇌하수체 또는 항이뇨 호르몬의 수준을 조절한다. HPA 축 활동의 변경은 불안 및 스트레스 장애 와 연관된다.
미생물총-소화관-뇌 축의 신호전달은 면역 반응 및 염증성 인자 및 마커의 변경에 의해 조절된다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 면역 반응을 조절할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 순환 신경면역 신호전달 분자의 전신 수준을 조절한다. 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 전-염증 사이토카인 생산 및 염증을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 염증성 상태를 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 비장세포 증식성 반응을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 C-반응 단백질; IL-1 계열 사이토카인; IL-1β; IL-2; IL-4; IL-6; IL-8; IL-10; IL-12p40; IL-17; IL-17A; IL-21; IL-23; TNF-α 및 IFN-γ의 전신 및/또는 혈장 수준을 조절한다. 일부 구현예에서 본 발명의 조성물은 항-염증성 사이토카인, 예를 들어 IL-10의 수준을 조절한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IL-10의 수준을 증가시킨다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 TNF-α의 수준을 조절한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IFN-γ의 수준을 조절한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IFN-γ:IL-10 비를 조절한다. 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 IFN-γ:lL-10 비를 감소시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 전-염증 사이토카인 TNF-α 및 IFN-γ의 수준을 감소시킨다. 증가된 순환 수준의 사이토카인는 우울증, 불안, 정신분열증 및 ASD를 포함하는 다양한 신경정신 장애 와 밀접하게 연관된다. 염증성 상태 변경의 증거는 장애 예컨대 정신분열증, 주요 우울 장애 및 양극성 장애에서 강조된다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 내성-매개 수지상 세포의 수준을 조절하고, 그리고 전 및 항-염증성 사이토카인 반응을 상호간에 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 마이엘로페록시다제 (염증 및 산화에 대한 마커)의 전신수준을 감소시킨다. 면역계 및 염증 반응의 치료적 조절제는 자폐 스펙트럼 장애 및 기분 장애를 치료하는데 유용하다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 감염 또는 백신접종에 대한 면역 반응을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 감염 또는 백신접종에 반응하는 염증의 수준을 조절한다. 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 임신 동안 감염 또는 백신접종에 반응하는 모계 면역 활동화를 조절한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 자손의 중추신경계 장애를 치료 또는 예방하기 위해 임신 동안 투여될 수 있다.
미생물총-소화관-뇌 축의 신호전달은 수준 공생 대사물에 의해 조절된다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 미생물총 대사물의 전신 수준을 조절한다. 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 단쇄 지방산 (SCFA)의 수준을 조절한다. 특정 구현예에서 SCFA의 수준은 증가되거나 줄어든다. 일부 구현예에서, SCFA는 부티르산 (BA) (또는 부티레이트)이다. 일부 구현예에서, SCFA는 프로피온산 (PPA)이다. 일부 구현예에서, SCFA는 아세트산이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 혈액-뇌 장벽를 가로지르기 위해 SCFA의 능력을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 다당류 A (PSA)의 수준을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 강력한 전-염증 내독소 리포폴리사카라이드 (LPS)의 수준을 조절한다. LPS는 생리적 뇌 활동을 변경시키고 뉴로펩타이드 합성을 조절하는 염증성 사이토카인의 생산을 유발시킨다. LPS는 CNS의 조절에 중요한 영향을 미치며, 감정의 조절에 헌신하는 영역 (예를 들어 편도)의 활동을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 트립토판 및/또는 그것의 대사물의 수준을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 4-에틸페닐설페이트 (4EPS; ASD-관련된 행동 비정상과 연관된 요독성 독성)의 수준을 조절한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 4-에틸페닐설페이트의 수준을 감소시킨다. 관강내 소화관 자극에 의해 야기된 뉴런 신호전달 경로의 자극에 의해 생성된 신호는 통증 지각, 면역-반응 조절, 감정 조절 및 다른 항상성 기능을 포함하는 뇌 활동을 강하게 조절한다. 따라서, 조 이들 인자의 수준을 조절할 수 있는 조성물은 CNS 장애를 치료 또는 예방하기 위해 넓은 치료적 적용를 갖는다.
미생물총-소화관-뇌 축의 신호전달은 수준 위장 투과도에 의해 조절된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장관 상피의 완전성을 변경시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장관의 투과도를 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 장벽 기능 및 위장관의 완전성을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장관 운동성을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장관 내강으로부터 공생 대사물 및 염증성 신호전달 분자의 혈류로의 전좌를 조절한다.
미생물총-소화관-뇌 축의 신호전달은 위장관의 미생물군집 조성물에 의해 조절된다. 따라서, 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장관의 미생물군집 조성물을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 미생물군집 장내세균총불균형 및 독성 대사물 (예를 들어 LPS)의 연관된 증가를 예방한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장관에서 클로스트리듐의 수준을 조절한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장관에서 클로스트리듐의 수준을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 캄필로박터 제주니의 수준을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 유해한 혐기성 박테리아의 증식 및 이들 박테리아에 의해 생산된 신경독소의 생산을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 미생물군집 락토바실러스의 수준 및/또는 비피도박테리아를 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 숫테렐라, 프레보텔라, 루미노코코스 속 및/또는 알칼리게나세아에 과의 미생물군집 수준을 조절한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 락토바실러스 플란타룸 및/또는 사카로마이세스 보울라디의 수준을 증가시킨다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 광범위한 항생제 사용에 의한 미생물군집의 조성물의 조절장애를 예방한다. 특정 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 임신 동안 항생제의 투여시 기능적 모계 미생물군집 조성물을 유지한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 자손의 중추신경계 장애를 치료 또는 예방하기 위해 임신 동안 투여될 수 있다.
미생물군집의 조절은 불안, 우울증, 자폐 스펙트럼 장애, 강박 장애 및 기억 능력 (공간적 및 비-공간적 기억 포함), 뿐만 아니라 파킨슨병을 포함하는 다른 CNS-관련된 장애를 포함하는 정신과 장애-관련된 행동을 개선하는데 효과적인 것으로 밝혔다. 특정 연구는, 생균제가 심리적 스트레스, 신체화, 우울증 및 분노-적대감을 감소시킬 수 있음을 제안했다. 락토바실러스의 수준은 우울증과 연관되고 위장 불편과 연관된 통증 신호전달과 연루되었다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에 기재된 중추신경계 장애와 연관된 행동 증상 중 적어도 하나를 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 전체적인 임상 반응을 개선한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 정형, 반복적인 행동을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 유래없이 제한적인 행동 및/또는 관심의 발생을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 재발성 강박상태 및/또는 충동을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 사회적 행동의 결핍을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 회피 행동을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 소통 행동의 결핍을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 인지 및 기분의 음성 변경을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 불안-관련된 행동을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 스트레스-관련된 행동을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 우울증-관련된 행동을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 공격적인 행동을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 비정상적으로 및 지속적으로 상승된, 팽창된, 또는 짜증남 기분의 발생을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 침투적 사고을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 각성 및 반응성의 변경을 예방한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 망상, 환각, 무질서한 말하기, 및 무질서한 또는 긴장성 행동을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 정서적 둔마, 사고 및 말하기의 유창성 및 생산성 및 목표 지향된 행동의 개시의 제한을 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하기 증상 중 하나 이상을 예방, 감소 또는 경감시킨다: 높은 자부심; 감소된 수면 필요성; 말하기 속도 증가; 아이디어의 신속한 점프; 쉽게 산만해짐; 목표 또는 활동의 증가된 관심; 전신운동 동요; 고위험의 증가된 활동 추구.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 공간적 및/또는 비-공간적 기억 결핍을 개선한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 인지 및 기능 모두를 개선한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 운동 활동을 개선한다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 운동완서를 예방, 감소 또는 경감시킨다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에서 휴지성 떨림; 근육 강성/경직성 및/또는 체위성 반사운동 손상을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에 개시된 CNS 장애와 연관된 적어도 하나의 동반이환을 예방, 감소 또는 경감시킨다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에 기재된 CNS 장애에 대하여 증상 및/또는 진단 척도 중 적어도 하나에서 대상체의 점수를 개선한다. 특정 다른 구현예에서, 증상 및/또는 진단 척도는 하기로부터 선택된다: 일반적인 건강 설문지 (GHQ); 우울증 불안 및 스트레스 척도 (DASS); 우울증 감수성의 레이덴 지수-개정 (LEIDS-r); 양성 및 음성 증상 척도 (PANSS); 상태-특성 불안 목록 (STAI); 발달 행동 체크리스트 (DBC); 벡 우울증 목록 (BDI); 벡 불안 목록 (BAI); 홉킨스 증상 체크리스트 (HSCL-90); 병원 불안 및 우울증 척도 (HADS); 감지된 스트레스 척도 (PSS); 대처 체크리스트 (CCL) (일상 생활의 스트레스를 계수하기 위해 또한 사용됨); 및 기분 상태의 설문지-기반 프로파일 (POMS).
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 당해 분야의 숙련가에 알려진 CNS 장애의 다른 동물 모델에서 치료적 효능을 평가하는 경우 증상 및/또는 진단 척도를 개선할 수 있다. 실시예에서 개시된 행동 검정에 더하여, 본 발명의 조성물은 상호 사회적 상호작용; 후각 소통; 초음파 발성; 운동 정형 (예컨대 돌기 및 수직 점핑), 반복적인 행동 예컨대 자기-털손질 및 디핑; 그리고 공간 작업의 인내를 개선할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 CNS 장애의 다른 동물 모델에서 CNS 장애를 치료 및/또는 예방하는데 유용할 것이다. 다른 마우스 모델은 근친교배한 마우스 균주 (BALB/cJ 및 C58/J 포함) 및 또한 유전자 변형된 마우스 균주 (NEUREXIN1, NEUROLIGIN3, NEUROLIGIN4, SHANK2, SHANK3, CNTNAP2, Tsc1/2 및 Fmr1 유전자 돌연변이체 마우스 균주 포함)를 포함한다.
부티레이트는 히스톤 탈아세틸화효소 억제제로서 작용하는 단쇄 지방산이고, G-단백질 커플링된 수용체를 통해 신호전달할 수 있고 대사 경로의 조절에 연루된다.
실시예는 경구 조성물에서 투여된 경우 블라우티아 하이드로게노트로피카가 부티레이트의 장내 수준을 증가시킨다는 것을 입증한다. 실시예는 블라우티아 하이드로게노트로피카가 중추신경계 장애 및 병태를 치료하는데 유용하다는 것을 또한 입증한다. 블라우티아 하이드로게노트로피카의 이러한 효과는 부티레이트에 의해 매개될 수 있다.
부티레이트는 뇌의 해마 및 정면 피질에서 히스톤 탈아세틸화에 연결되었고 [34] 헌팅턴병, 파킨슨병, 알츠하이머병 및 자폐증에서 연루되었다 [35].
특정 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주는 부티레이트 생산자이다. 특정 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주는 아세틸-CoA, 글루타레이트, 4-아미노부티레이트 및/또는 라이신 경로에 의해 부티레이트를 합성한다. 특정 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주는 부티레이트를 합성하기 위해 후속으로 사용될 수 있는 아세틸-CoA 생성하기 위해 복합 다당류 (예를 들어 전분 및 자일란)를 대사한다. 특정 구현예에서, 본 발명에서 사용되는 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주는 결장에서 박테리아 발효에 의해 부티레이트를 생성한다.
특정 바람직한 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 부티레이트의 수준을 조절한다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 부티레이트의 수준을 증가시킨다.
특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 히스톤 탈아세틸화효소 (HDAC) 억제제이다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 뇌의 해마 및 정면 피질에서 히스톤 탈아세틸화를 억제한다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 히스톤 아세틸화를 증가시키고 예비-생존, 프로 -재생 및 프로-가소성 유전자의 발현을 촉진한다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 히스톤 아세틸화를 구조하고, 뉴런 세포사를 예방하고, 그리고 수명 (예를 들어 헌팅턴병에서) 수명을 연장시킨다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 (예를 들어 파킨슨병에서) 세포사로부터 뉴런을 보호한다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 히스톤 아세틸화를 회복시키고 (예를 들어 알츠하이머병를 치료 또는 예방하기 위해) 학습 연관된 유전자의 발현을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 이들 후생유전자 변형은 잠재적인 정신과 치료일 수 있다.
특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물의 HDAC 억제 활성은 뉴런 생존, 가소성 및 재생에 관여된 수많은 유전자의 전사에 영향을 미친다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 신경친화성 인자의 프로모터 주위의 아세틸화를 증가시킨다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 BDNF, GDNF 및 NGF의 프로모터 주위의 아세틸화를 증가시킨다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 BDNF, GDNF 및 NGF의 발현을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 c-Fos 및 호멜라를 포함하는 가소성에 관여된 전초기 유전자의 발현을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 이들 인자의 발현은 뇌에서 변경된다.
특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물의 탈아세틸화효소 억제 활동은 비-히스톤 단백질의 아세틸화를 유지한다. 특정 구현예에서, 아세틸화는 많은 단백질의 효소적 및 대사 활동에 영향을 미친다. 예를 들어, HDAC 억제제는 산화적 스트레스 동안 전사 인자 Sp1의 아세틸화 및 활동화를 유지함으로써, 세포 생존을 촉진하기 위해 보호성 적응성 반응을 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 생체내 산화적 스트레스를 예방한다.
특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 정면 피질, 해마 및 선조체에서 혈액-뇌 장벽 (BBB) 완전성 및/또는 융합막 단백질 발현 {예를 들어 크라우딘 5 및/또는 폐색)을 회복시킨다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 BBB 완전성을 회복 및/또는 유지시킨다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 융합막 발현을 촉진 및/또는 유지한다. 따라서, 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 중추신경계 장애, 특히 신경발달 장애 및/또는 신경정신 병태와 연관된 염증성 매개체, 신경화학 인자, 뉴로펩타이드 신경전달물질에 대한 방역을 확립 및/또는 유지할 수 있다.
특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 신경-염증을 억제한다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 IL-1RA (전-염증 IL-1β의 억제제)의 수준을 증가시킨다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 전-염증 IL-1β 및/또는 TNFα의 수준을 감소시킨다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 IL-1RA의 수준을 증가시키는 IL-4 발현을 증가시킨다.
특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 항-염증제이다. 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 핵 인자 κB (NF-κB) 활동화를 억제한다. 따라서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 IL-1B, TNFα, IL-2, IL-6, IL-8, IL-12, 유도성 질산 합성효소, 사이클로옥시게나제-2, 세포간 접착 분자-1, T 세포 수용체-α 및 MHC 부류 II 분자를 포함하는 초기 면역 염증 반응 유전자의 발현을 조절할 수 있다.
특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 미토콘드리아 활동에 영향을 준다. 따라서, 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 미토콘드리아 뇌병증 및/또는 부신백질이상증을 치료 및/또는 예방한다.
특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 GPCR를 통한 신호전달에 영향을 준다. 따라서, 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 파킨슨병을 치료 및/또는 예방한다.
특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 히스톤 아세틸화에 영향을 준다. 따라서, 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 알츠하이머병, 파킨슨병, 및/또는 헌팅턴병을 치료 및/또는 예방한다.
특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 미생물군집 항상성에 영향을 준다. 따라서, 특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 중추신경계 장애 및 병태를 치료 및/또는 예방한다.
특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 포함하는 본 발명의 조성물은 중추신경계 장애 또는 병태와 연관된 행동 변화의 개선을 유발할 수 있다.
특정 구현예에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카의 효과는 부티레이트와 독립적일 수 있다. 예를 들어, 실시예는, 부티레이트 단독이 아닌, 블라우티아 하이드로게노트로피카의 투여가 마우스의 수평 및 수직 활동 그리고 불안 감소에서 역할을 시사하는 오픈 필드 모델의 센터에서 소비된 시간을 상당히 증가시킨다는 것을 입증한다. 구체적으로, 블라우티아 하이드로게노트로피카는 불안-유사 및 정형 행동 감소에서 효능을 나타내고, 반면에 부티레이트의 효능은 정형 행동의 감소로 제한된다.
투여 방식
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 본 발명의 세균 균주로 장의 부분적인 또는 전체적인 군집화 및/또는 전달을 가능하게 하기 위해 위장관에 투여되어야 한다. 일반적으로, 본 발명의 조성물은 경구로 투여되지만, 이들은 직장으로, 비강내로, 또는 구강으로 또는 설하 경로로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 포움, 스프레이 또는 겔로서 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 좌약, 예컨대 직장 좌약으로서, 예를 들어 테오브로마 오일 (코코아 버터), 합성 경질 지방 (예를 들어 수포사이어, 위텝솔), 글리세로-젤라틴, 폴리에틸렌 글리콜, 또는 비누 글리세린 조성물의 형태로 투여될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 위장관에 튜브, 예컨대 경비위관, 입위관, 위 튜브, 공장조루술 튜브 (J 튜브), 경피 내시경 위루술 (PEG), 또는 포트, 예컨대 위에 접근을 제공하는 가슴 벽 포트, 공장 및 다른 적합한 접근 포트를 통해 투여된다.
본 발명의 조성물은 1회 투여될 수 있거나, 이들은 치료 레지멘의 일부로서 순차적으로 투여될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 매일 투여되어야 한다.
본 발명의 특정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료는 환자의 장내 미생물총의 평가가 동반된다. 치료는 본 발명의 균주로 부분적인 또는 전체적인 군집화 및/또는 상기의 전달이 달성되지 않아 이로써 효능이 관측되지 않으면 반복될 수 있거나, 또는 치료는 전달 및/또는 부분적인 또는 전체적인 군집화가 성공적이고 효능이 관측되면 중단될 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 자궁내 및/또는 출생 후 그 소아에서 염증성 또는 자가면역 질환을 예방하기 위해 임신한 동물, 예를 들어 포유동물 예컨대 인간에 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 중추신경계 장애 또는 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 또는 병태로 진단된, 또는 중추신경계 장애 또는 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 또는 병태의 위험에 처한 것으로 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 조성물은 또한 건강한 환자에서 중추신경계 장애 또는 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 또는 병태의 발달을 예방하기 위한 예방적 조치로서 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 비정상 장내 미생물총을 갖는 것으로서 확인된 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 환자는 블라우티아, 특히 블라우티아 스테르코리스 또는 블라우티아 훽슬레라에에 의해 감소된 또는 부재의 군집화를 가질 수 있다. 예를 들어, 환자는 블라우티아, 특히 블라우티아 스테르코리스, 블라우티아 훽슬레라에 또는 블라우티아 하이드로게노트로피카에 의해 감소된 또는 부재의 군집화를 가질 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품, 예컨대 영양 보충물로서 투여될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 조성물은 인간의 치료를 위한 것이지만, 단위 포유동물 예컨대 가금, 돼지, 고양이, 개, 말 또는 토끼를 포함하는 동물 치료하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 동물의 성장 및 성능을 향상시키는데 유용할 수 있다. 동물에게 투여되면, 경구 위관영양법이 사용될 수 있다.
조성물
일반적으로, 본 발명의 조성물은 박테리아를 포함한다. 본 발명의 바람직한 구현예들에서, 본 조성물은 냉동건조된 형태로 제형화된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 본 발명의 세균 균주를 포함하는 과립 또는 젤라틴 캡슐, 예를 들어 경질 젤라틴 캡슐을 포함할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 조성물은 동결건조된 박테리아를 포함한다. 박테리아의 동결건조는 잘 확립된 절차이고 관련된 안내는, 예를 들어, 참조 [36], [], 및 [38]에서 이용가능하다.
대안적으로, 본 발명의 조성물은 살아있는, 활동 박테리아 배양물을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 세균 균주는 불활동화되지 않았고, 예를 들어, 열-불활동화되지 않았다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 세균 균주는 사멸되지 않았고, 예를 들어, 열-사멸되지 않았다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 세균 균주는 약화되지 않았고, 예를 들어, 열-약화되지 않았다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 세균 균주는 사멸, 불활동화 및/또는 약화되지 않았다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 세균 균주는 살아있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 세균 균주는 생존가능하다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 세균 균주는 장을 부분적으로 또는 전적으로 군집화할 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 중 세균 균주는 생존가능하고 상기 장을 부분적으로 또는 전적으로 군집화할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 살아있는 세균 균주 및 사멸된 세균 균주의 혼합물을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 세균 균주의 장으로의 전달을 가능하게 하기 위해 캡슐화된다. 캡슐화는, pH의 변화에 의해 유발될 수 있는, 예를 들어, 화학적 또는 물리적 자극 예컨대 압력, 효소적 활동, 또는 물리적 붕해로 파열을 통해 상기 표적 위치에서 전달까지 열화로부터 조성물을 보호한다. 임의의 적절한 캡슐화 방법은 사용될 수 있다. 예시적인 캡슐화 기술은 다공성 매트릭스 이내 포획, 고체 담체 표면상의 부착 또는 흡착, 응집에 의한 또는 교차-임크밍(lmkmg) 제제로 자기-응집, 및 미세다공성 막 또는 마이크로캡슐 뒤의 기계적 격납을 포함한다. 본 발명의 조성물 제조에 유용할 수 있는 캡슐화에서 안내는, 예를 들어, 참조 [39] 및 [40]에서 이용가능하다.
본 조성물은 경구로 투여될 수 있고 정제, 캡슐 또는 분말의 형태일 수 있다. 캡슐화된 생성물이 바람직한 것은, 블라우티아가 산소성생물이기 때문이다. 다른 성분 (예컨대 비타민 C, 예를 들어)은 전달 및/또는 부분적인 또는 전체적인 군집화 및 생체내 생존을 개선하기 위해 산소 포착제 및 프리바이오틱 기질로서 포함될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 생균제 조성물은 음식 또는 영양 생성물, 예컨대 우유 또는 유장 기초 발효된 유제품으로서, 또는 의약품으로서 경구로 투여될 수 있다.
본 조성물은 생균제로서 제형화될 수 있다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 세균 균주의 치료 유효량을 포함한다. 세균 균주의 치료 유효량은 환자에게 유익한 효과를 발휘하기에 충분하다. 세균 균주의 치료 유효량은 환자의 장의 부분적인 또는 전체적인 군집화 및/또는 상기에 전달을 초래하기에 충분할 수 있다.
예를 들어 성인 인간을 위한, 박테리아의 적합한 일일 용량은 약 1 x 103 내지 약 1 x 1011 콜로니 형성 단위 (CFU); 예를 들어, 약 1 x 107 내지 약 1 x 1010 CFU; 또 다른 예에서 약 1 x 106 내지 약 1 x 1010 CFU일 수 있다.
특정 구현예에서, 본 조성물은, 조성물의 중량에 대해, 약 1 x 106 내지 약 1 x 1011 CFU/g; 예를 들어, 약 1 x 105 내지 약 1 x 1010 CFU/g의 양으로 세균 균주를 함유한다. 용량은, 예를 들어, 1 g, 3g, 5g, 및 10g일 수 있다.
전형적으로, 생균제, 예컨대 본 발명의 조성물은 적어도 하나의 적합한 프리바이오틱 화합물과 선택적으로 조합된다. 프리바이오틱 화합물은 일반적으로 소화불가능한 탄수화물 예컨대 올리고- 또는 다당류, 또는 당 알코올이고, 이는 상부 소화관에서 분해 또는 흡수되지 않는다. 알려진 프리바이오틱스는 상품 예컨대 이눌린 및 트랜스갈락토-올리고당을 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 생균제 조성물은, 총 중량 조성물에 대해, 약 1 내지 약 30중량 % (예를 들어 5 내지 20중량 %)의 양으로 프리바이오틱 화합물을 포함한다. 탄수화물은 하기로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다: 프룩토- 올리고당 (또는 FOS), 단쇄 프룩토-올리고당, 이눌린, 아이소말트-올리고당, 펙틴, 자일로-올리고당 (또는 XOS), 키토산-올리고당 (또는 COS), 베타-글루칸, 아라비아검 변형된 및 저항성 전분, 폴리덱스트로스, D-타가토스, 아카시아 섬유, 캐럽, 귀리, 및 사이트루스 섬유. 일 양태에서, 프리바이오틱스는 단쇄 프룩토-올리고당 (FOSs-c.c로서 아래 본 명세서에서 간단히 나타냄)이고; 상기 FOSs-c.c.는, 사탕무의 전환에 의해 일반적으로 수득된 그리고 3개의 글루코스 분자가 결합되는 당류 분자를 포함하는, 소화가능한 탄수화물이 아니다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 중추신경계 장애를 치료 또는 예방하기 위해또 다른 치료적 화합물과 함께 사용된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 중추 신경전달물질 및 뉴로펩타이드를 조절하는 영양 보충물과 함께 투여된다. 바람직한 구현예에서, 영양 보충물은 영양 비타민을 포함하거나 그것으로 구성된다. 특정 구현예에서, 비타민은 비타민 B6, 마그네슘, 디메틸글리신 (비타민 B16) 및 비타민 C이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 또 다른 생균제와 함께 투여된다. 특정 바람직한 구현예에서, 생균제는 트리추리스 수이스 란을 포함하거나 그것으로 구성된다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함할 수 있다. 그와 같은 적합한 부형제의 예는 참조 [41]에 발견될 수 있다. 치료용 허용가능한 담체 또는 희석제는 약제학적 기술에서 잘 알려져 있고 기재된, 예를 들어, 참조 [42]에 기재되어 있다. 적합한 담체의 예는 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 스테아르산마그네슘, 만니톨, 소르비톨 및 기타 동종의 것을 포함한다. 적합한 희석제의 예는 에탄올, 글리세롤 및 물을 포함한다. 약제학적 담체, 부형제 또는 희석제는 의도된 투여 경로 및 표준 약제학적 실시와 관련하여 선택될 수 있다. 약제학적 조성물은, 담체, 부형제 또는 희석제로서 또는 그것 외에, 임의의 적합한 결합제(들), 윤활제(들), 현탁화제(들), 코팅제(들), 가용화제(들)을 포함할 수 있다. 적합한 결합제의 예는 전분, 젤라틴, 천연 당류 예컨대 글루코스, 무수 락토스, 유동 없는 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미제, 천연 및 합성 검, 예컨대 아카시아, 트라가칸쓰 또는 나트륨 알기네이트, 카복시메틸 셀룰로스 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적합한 윤활제의 예는 나트륨 올레에이트, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 나트륨 벤조에이트, 아세트산나트륨, 염화나트륨 및 기타 동종의 것을 포함한다. 보존제, 안정화제, 염료 및 심지어 향료 제제는 약제학적 조성물 내에 제공될 수 있다. 보존제의 예는 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 산화방지제 및 현탁화제가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 식품으로서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 식품은 본 발명의 치료 효과에 추가하여, 예컨대 영양 보충물에서 영양 이점을 제공할 수 있다. 유사하게, 식품은 본 발명의 조성물의 맛을 향상시키거나 또는 약제학적 조성물보다 통상적인 음식 품목에 더 유사함으로써 소비자에게 조성물을 더 매력적으로 만들기 위해 제형화될 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 우유-기반 제품으로서 제형화된다. 용어 "우유-기반 제품"은 가변 지방 함량을 가지고 있는 임의의 액체 또는 반-고체 우유- 또는 유장-기초 제품을 의미한다. 우유-기반 제품은 be, 예를 들어, 소의 우유, 염소의 우유, 양의 우유, 탈지유, 전유, 임의의 가공 없는 분말화된 우유 및 유장으로부터 재조합된 우유, 또는 가공 제품, 예컨대 요거트, 엉긴 우유, 응유, 신맛 우유, 신맛 전유, 버터 우유 및 다른 신맛 우유 제품일 수 있다. 또 다른 중요한 그룹은 우유 음료, 예컨대 유장 음료, 발효된 우유, 연유, 영아 또는 베이비 우유; 풍미 우유, 아이스크림; 우유-함유 음식 예컨대 사탕을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하고, 그리고 임의의 다른 속으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나, 또 다른 속으로부터의 박테리아의 최소한 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 요법에서 사용하기 위해, 임의의 다른 속으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나 또 다른 속으로부터의 박테리아의 최소한 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함하는 블라우티아 속의 하나 이상의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주 또는 블라우티아 훽슬레라에를 포함하고, 그리고 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나, 또 다른 종으로부터의 박테리아의 최소한 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 요법에서 사용하기 위해 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나 또는 또 다른 종으로부터의 박테리아의 최소한 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함하는 하나 이상의 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주 또는 블라우티아 훽슬레라에를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나, 또는 또 다른 종으로부터의 박테리아의 최소한 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함하는 하나 이상의 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 요법에서 사용하기 위해 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나 다른 종으로부터의 박테리아의 최소한 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함하는 하나 이상의 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주 또는 블라우티아 훽슬레라에를 포함하고, 그리고 임의의 다른 블라우티아 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나, 또는 또 다른 블라우티아 종으로부터의 박테리아의 최소한 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 요법에서 사용하기 위해 임의의 다른 블라우티아 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나, 또는 또 다른 블라우티아 종으로부터의 박테리아의 최소한 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함하는 하나 이상의 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주 또는 블라우티아 훽슬레라에를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하고 임의의 다른 블라우티아 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나 또 다른 블라우티아 종으로부터의 박테리아의 최소한 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함한다. 따라서, 일부 구현예에서, 본 발명은 요법에서 사용하기 위해, 임의의 다른 블라우티아 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않거나, 또는 또 다른 블라우티아 종으로부터의 박테리아의 최소한 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함하는 하나 이상의 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 구현예에서, 본 발명의 조성물은 contain 단일 세균 균주 또는 종을 함유하고 임의의 다른 세균 균주 또는 종을 함유하지 않는다. 그와 같은 조성물은 다른 세균 균주 또는 종의 최소한 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함할 수 있다. 그와 같은 조성물은 유기체의 다른 종이 실질적으로 없는 배양물일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 요법에서 사용하기 위해, 또 다른 균주로부터의 박테리아의 최소한 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함하는 블라우티아 속의 단일 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다 임의의 다른 균주로부터의 박테리아를 함유하지 않거나.
일부 구현예에서, 본 발명은 요법에서 사용하기 위해, 임의의 다른 균주로부터의 박테리아를 함유하지 않거나 또 다른 균주로부터의 박테리아의 최소한 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함하는 블라우티아 스테르코리스 또는 블라우티아 훽슬라에 종의 단일 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 요법에서 사용하기 위해, 임의의 다른 균주로부터의 박테리아를 함유하지 않거나 또 다른 균주로부터의 박테리아의 최소한 또는 생물학적으로 무관한 양만을 포함하는 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 단일 세균 균주를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 1 초과 개의 세균 균주를 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 종 내의 것으로부터의 1 초과 개의 균주 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 또는 45개 초과의 균주)를 포함하고, 그리고 선택적으로, 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 종 내의 것으로부터의 50개 미만의 균주 (예를 들어 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 12, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4 또는 3개 미만의 균주)를 포함하고, 그리고선택적으로, do not contain 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 동일한 종 내의 것으로부터의 1-40, 1-30, 1- 20, 1-19, 1-18, 1-15, 1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1-3, 1-2, 2-50, 2-40, 2-30, 2-20, 2-15, 2-10, 2-5, 6-30, 6-15, 16-25, 또는 31-50개의 균주를 포함하고, 그리고 선택적으로, 임의의 다른 종으로부터의 박테리아를 함유하지 않는다. 본 발명은 전술한 것의 임의의 조합을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 조성물은 미생물 컨소시엄을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 조성물은 블라우티아 세균 균주를 미생물 컨소시엄의 일부로서 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 블라우티아 세균 균주는 장에서 생체 내에서 공생하여 살 수 있는 다른 속으로부터 하나 이상 (예를 들어 적어도 2, 3, 4, 5, 10, 15 또는 20개의) 다른 세균 균주와 함께 존재한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본 조성물은 상이한 속으로부터의 세균 균주와 함께 블라우티아의 세균 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 미생물 컨소시엄은 단일 유기체, 예를 들어 인간의 대변 샘플로부터 수득된 2개 이상의 세균 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 미생물 컨소시엄는 자연에서 함께 발견되지 않는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 미생물 컨소시엄은 적어도 2종의 상이한 유기체의 대변 샘플로부터 수득된 세균 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 2종의 상이한 유기체는 동일한 종, 예를 들어 2종의 상이한 인간으로부터 유래한다. 일부 구현예에서, 2종의 상이한 유기체는 영아 인간 및 성인 인간이다. 일부 구현예에서, 2종의 상이한 유기체는 인간 및 비-인간 포유동물이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 추가로, 균주 MRX006와 동일한 안전성 및 치료적 효능 특성을 갖지만, NCIMB 42381로서 기탁된 MRX006가 아니거나, 또는 블라우티아 스테르코리스가 아닌 세균 균주를 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 추가로, 균주 MRX008 과 동일한 안전성 및 치료적 효능 특성을 갖지만, NCIMB 42486로서 기탁된 MRX008가 아니거나, 또는 블라우티아 훽슬레라에가 아닌 세균 균주를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 추가로, DSM 14294로서 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주와 동일한 안전성 및 치료적 효능 특성을 갖지만, DSM 14294로서 기탁된 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주가 아니거나, 또는 블라우티아 하이드로게노트로피카가 아닌 세균 균주를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 바실러스 속의 세균 균주를 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 바실러스 서브틸리스를 포함하지 않고/거나 바실러스 코아굴란스을 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물에 의해 치료될 CNS 장애는 양극성 장애가 아니다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물에 의해 치료될 환자는 진균 감염을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물에 의해 치료될 환자는 캔디다증을 앓고 있지 않다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물에 의해 치료될 환자는 진균 감염을 갖는 것으로 진단되지 않았고/거나 캔디다증을 앓고 있는 것으로 진단되지 않았다. 바람직한 그와 같은 구현예에서, 본 발명의 조성물에 의해 치료될 환자는 진균 감염을 갖는 것으로 결코 진단되지 않았고/거나 캔디다증을 앓고 있는 것으로 결코 진단되지 않았다.
본 발명의 조성물이 1 초과 개의 세균 균주, 종 또는 속, 개별 세균 균주를 포함하는 일부 구현예에서, 종 또는 속은 별도, 동시 또는 순차적인 투여를 위한 것일 수 있다. 예를 들어, 본 조성물은 모든 1 초과 개의 세균 균주, 종 또는 속을 포함할 수 있거나, 또는 세균 균주, 종 또는 속은 별도로 저장되고 별도로, 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 1 초과 개의 세균 균주, 종 또는 속은 별도로 저장되지만, 사용 전에 함께 혼합된다.
일부 구현예에서, 본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 성인 대변으로부터 수득된다. 본 발명의 조성물이 1 초과 개의 세균 균주를 포함하는 일부 구현예에서, 모든 세균 균주는 성인 대변으로부터 수득되거나 또는 다른 세균 균주가 존재하면, 단지 최소량으로 존재한다. 박테리아는 성인 대변으로부터 수득되고 본 발명의 조성물에서 사용된 후에 배양될 수 있었다.
상기에서 언급된 바와 같이, 일부 구현예에서, 하나 이상의 블라우티아 세균 균주는 본 발명의 조성물에서 단지 치료적으로 활성제(들) 이다. 일부 구현예에서, 본 조성물은 중 세균 균주(들)은 본 발명의 조성물에서 단지 치료적으로 활성제(들)이다.
본 발명에 따라 사용되는 조성물은 마케팅 승인을 요구하거나 그렇지 않을 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 상기 세균 균주는 동결건조된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 상기 세균 균주는 분무 건조된다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 세균 균주는 동결건조되거나 분무 건조되되, 살아 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 세균 균주는 동결건조되거나 분무 건조되되, 생존가능하다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 세균 균주는 동결건조되거나 분무 건조되되, 장을 부분적으로 또는 전적으로 군집화할 수 있다. 특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 세균 균주는 동결건조되거나 분무 건조되되, 생존가능하고 상기 장을 부분적으로 또는 전적으로 군집화할 수 있다.
일부 경우에, 동결건조되거나 분무 건조된 세균 균주는 투여 전에 재구성된다. 일부 경우에, 재구성는 본 명세서에 기재된 희석제의 사용에 의한다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제 또는 담체를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에서 사용된 세균 균주; 및 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하되; 세균 균주는 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여될 때, 장애를 치료하는데 충분한 양이고; 그리고 상기 장애는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 자폐 스펙트럼 장애 (ASD); 아동 발달 장애; 강박 장애 (OCD); 주요 우울 장애; 우울증; 계절성 정서적 장애; 불안 장애; 정신분열증 스펙트럼 장애; 정신분열증; 양극성 장애; 정신병; 기분 장애; 만성 피로 증후군 (근육통성 뇌척수염); 스트레스 장애; 외상후 스트레스 장애; 치매; 알츠하이머; 파킨슨병; 및/또는 만성 통증; 운동 뉴런 질환; 헌팅턴병; 길랑-바레 증후군 및/또는 수막염.
특정 구현예에서, 본 발명은 본 발명에서 사용된 세균 균주; 및 약제학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하되; 세균 균주는 중추신경계 장애 또는 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 충분한 양이다. 바람직한 구현예에서, 상기 질환 또는 병태는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다: 자폐 스펙트럼 장애 (ASD), 아동 발달 장애; 강박 장애 (OCD); 주요 우울 장애; 우울증; 계절성 정서적 장애; 불안 장애; 정신분열증 스펙트럼 장애; 정신분열증; 양극성 장애; 정신병; 기분 장애; 만성 피로 증후군 (근육통성 뇌척수염); 스트레스 장애; 외상후 스트레스 장애; 치매; 알츠하이머; 파킨슨병; 및/또는 만성 통증. 추가 구현예에서, 본 발명의 조성물은 운동 뉴런 질환; 헌팅턴병; 길랑-바레 증후군 및/또는 수막염을 치료 또는 예방하는데 유용할 수 있다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 세균 균주의 양은 조성물의 중량에 대해 그램당 약 1 χ 103 내지 약 1 χ 1011 콜로니 형성 단위이다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 상기 조성물은 1 g, 3 g, 5 g 또는 10 g의 용량으로 투여된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 상기 조성물은 경구, 직장, 피하, 비강, 볼, 및 설하 로 구성된 군으로부터 선택된 방법에 의해 투여된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 이 조성물은 락토스, 전분, 글루코스, 메틸 셀룰로스, 스테아르산마그네슘, 만니톨 및 소르비톨 로 구성된 군으로부터 선택된 담체를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 이 조성물은 에탄올, 글리세롤 및 물 로 구성된 군으로부터 선택된 희석제를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 이 조성물은 전분, 젤라틴, 글루코스, 무수 락토스, 자유-유동 락토스, 베타-락토스, 옥수수 감미제, 아카시아, 트라가칸쓰, 나트륨 알기네이트, 카복시메틸 셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 올레에이트, 스테아르산나트륨, 스테아르산마그네슘, 나트륨 벤조에이트, 아세트산나트륨 및 염화나트륨으 로 구성된 군으로부터 선택된 부형제를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 이 조성물은 보존제, 산화방지제 및 안정화제 중 적어도 하나를 추가로 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 이 조성물은 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르 로 구성된 군으로부터 선택된 보존제를 포함한다.
특정 구현예에서, 본 발명은 상기 약제학적 조성물을 제공하되, 본 조성물이 약 4°C 또는 약 25 °C에서 밀봉 용기에서 보관되고 용기가 50% 상대 습도를 갖는 분위기에서 배치될 때, 콜로니 형성 단위로 측정된 세균 균주의 적어도 80%는, 적어도 약: 1 개월, 3 개월, 6 개월, 1 년, 1.5 년, 2 년, 2.5 년 또는 3 년의 기간 후에 남아 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 조성물을 포함하는 밀봉된 용기에서 제공된다. 일부 구현예에서, 밀봉된 용기는 샤세트 또는 병. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 본 명세서에서 기재된 바와 같은 조성물을 포함하는 주사기에서 제공된다.
본 발명의 조성물은 일부 구현예에서, 약제학적 제형으로서 제공될수 있다. 예를 들어, 본 조성물은 정제 또는 캡슐로서 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 캡슐는 젤라틴 캡슐 ("겔-캡")이다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 경구로 투여된다. 경구 투여는, 본 화합물이 입으로부터 직접 혈류로 들어가는 위장관, 및/또는 볼, 혀, 또는 설하 투여에 들어가도록 삼키는 것을 수반할 수 있다.
경구 투여에 적합한 약제학적 제형은 고체 플러그, 고체 미세미립자, 반-고체 및 액체 (다중상 또는 분산된 시스템 포함) 예컨대 정제; 다중- 또는 나노-미립자를 함유하는 연질 또는 경질 캡슐, 액체 (예를 들어 수용액), 에멀션 또는 분말; 로젠지 (액체-채워진 것 포함); 츄(chews); 겔; 빠른 분산 투약 형태; 필름; 오불레스; 스프레이; 및 볼/점막접착성 패치를 포함한다.
일부 구현예에서 약제학적 제형은 경구 투여에 의해 본 발명의 조성물의 장에의 전달에 적합한 장용 제형, 즉 위-저항성 제형 (예를 들어, 위 pH에 대한 저항성)이다. 장용 제형은, 본 조성물의 박테리아 또는 또 다른 성분이 산-민감성이고, 예를 들어 위 조건 하에서 열화되기 쉬울 때 특히 유용할 수 있다.
일부 구현예에서, 장용 제형은 장 코팅을 포함한다. 일부 구현예에서, 제형은 장용 코팅된 투약 형태이다. 예를 들어, 제형은 장의-코팅 정제 또는 장용 코팅된 캡슐, 등일 수 있다. 장 코팅은 경구 전달을 위한 종래의 장 코팅, 예를 들어, 정제, 캡슐, 등용 종래의 코팅일 수 있다. 제형은 필름 코팅, 예를 들어, 장용성 중합체, 예를 들어 산-불용성 폴리머의 박막 증을 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 장용 제형은 본질적으로, 장 코팅이 필요없는 장, 예를 들어, 위-저항성이 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 제형은 장 코팅을 포함하지 않는 장용 제형이다. 일부 구현예에서, 제형은 열겔화 물질로 만들어진 캡슐이다. 일부 구현예에서, 열겔화 물질은 셀룰로스 물질, 예컨대 메틸셀룰로스, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로스 (UPMC)이다. 일부 구현예에서, 캡슐은 임의의 막 형성 폴리머를 함유하지 않는 쉘이다. 일부 구현예에서, 캡슐은 쉘을 포함하고, 상기 쉘은 하이드록시프로필메틸셀룰로스를 포함하고 임의의 막 형성 폴리머를 포함하지 않는다 (예를 들어 참고 [43]). 일부 구현예에서, 제형은 본질적으로 장용성 캡슐 (예를 들어, Vcaps® (Capsugel))이다.
일부 구현예에서, 제형은 연질 캡슐이다. 연질 캡슐은 캡슐 외피에 존재하는 연화제, 예컨대, 예를 들어, 글리세롤, 소르비톨, 말티톨 및 폴리에틸렌 글리콜의 첨가로 인해, 특정 탄력성 및 유연도를 가질 수 있는 캡슐이다. 연질 캡슐은 예를 들어, 젤라틴 또는 전분의 기반으로 생산될 수 있다. 젤라틴-기반 연질 캡슐은 다양한 공급자로부터 상업적으로 입수가능하다. 투여 방법, 예컨대, 예를 들어, 경구 또는 직장에 따라, 연질 캡슐은 have 다양한 형상을 가질 수 있고, 예를 들어, 둥근형, 타원형, 장방형 또는 어뢰-형상일 수 있다. 연질 캡슐은 종래의 공정에 의해, 예컨대, 예를 들어, 셰러 공정, 아코겔 공정 또는 액적 또는 블로잉 공정에 의해 생산될 수 있다.
배양 방법
본 발명에서 사용하기 위한 세균 균주는 예를 들어, 참조 [44], [] 및 [46]에서 상술된 표준 미생물학 기술을 사용하여 배양될 수 있다.
배양에 사용된 고체 또는 액체 배지는 YCFA 한천 또는 YCFA 배지일 수 있다. YCFA 배지는 (100ml당, 근사치 값): 카시톤 (1.0 g), 효모 추출물 (0.25 g), NaHCO3 (0.4 g), 시스테인 (0.1 g), K2HPO4 (0.045 g), KH2PO4 (0.045 g), NaCl (0.09 g), (NH4)2SO4 (0.09 g), MgSO4·7H2O (0.009 g), CaCl2 (0.009 g), 레사주린 (0.1 mg), 헤민 (1 mg), 바이오틴 (1 μg), 코발라민 (1 μg), p-아미노벤조산 (3 g), 엽산 (5 μg), 및 피리독사민 (15 μg)을 포함할 수 있다.
백신 조성물에서 사용되는 세균 균주
본 발명자들은, 본 발명의 세균 균주가 중추신경계 장애 또는 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 유용하다는 것을 확인했다. 이것은, 본 발명의 세균 균주가 호스트 중추, 자율신경 및/또는 장용 신경계; HPA 경로의 활성; 신경면역 및 신경내분비 경로; 및 호스트 위장관 및/또는 위장 투과도에서 공생 대사물의 수준에 대해 갖는 효과의 결과인 것 같다. 따라서, 본 발명의 조성물은 또한, 백신 조성물로서 투여될 때, 중추신경계 장애 또는 병태, 특히 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개된 중추신경계 장애 또는 병태를 예방하는데 유용할 수 있다. 특정 그와 같은 구현예에서, 본 발명의 세균 균주는 생존가능하다. 특정 그와 같은 구현예에서, 본 발명의 세균 균주는 장을 부분적으로 또는 전적으로 군집화할 수 있다. 특정 그와 같은 구현예에서, 본 발명의 세균 균주는 생존가능하고 상기 장을 부분적으로 또는 전적으로 군집화할 수 있다. 다른 특정 그와 같은 구현예에서, 본 발명의 세균 균주는 사멸, 불활성화 또는 약화될 수 있다. 특정 그와 같은 구현예에서, 조성물은 백신 아쥬반트를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 조성물은 주사를 통해, 예컨대 피하 주사를 통해 투여하기 위한 것이다.
일반사항
본 발명의 수행은 달리 지적되지 않는 경우 당업계 기술 범위 내에서 화학, 생화학, 분자 생물학, 면역학 및 약리학의 통상적인 방법을 사용한다. 상기 기술은 문헌에서 완전하게 설명된다. 예를 들어, 문헌 [47] 및 [48]-[54] 등을 참조한다. 용어 "포함하는 (comprising)"은 "이루어진" 뿐만 아니라 "포함하는 (including)"을 포괄하고, 예를 들어, X를 "포함하는" 조성물은 전적으로 X로 이루어질 수 있거나, 추가적인 것, 예를 들어 X+Y를 포함할 수 있다.
수치 x와 관련하여 용어 "약"은 선택적이며 예를 들어, x±10%를 의미한다.
특정 구현예에서, 용어 "조절한다"는 증가시킨다 또는 활성화시킨다를 의미한다. 대안적 구현예에서, 용어 "조절한다"는 감소시킨다 또는 억제한다를 의미한다.
용어 "실질적으로"는 "완전하게"를 배제하지 않고, 예를 들어, Y가 "실질적으로 부재"인 조성물은 Y가 완전하게 부재일 수 있다. 경우에 따라, 용어 "실질적으로"는 본 발명의 정의로부터 생략될 수 있다.
2개의 뉴클레오타이드 서열 간의 퍼센트 서열 동일성에 대한 언급은 정렬된 경우, 뉴클레오타이드의 퍼센트는 2개의 서열의 비교시 동일함을 의미한다. 상기 정렬 및 퍼센트 상동성 또는 서열 동일성은 당업계에 공지된 소프트웨어 프로그램, 예를 들어, 참조문헌 [55]의 섹션 7.7.18에 기재된 것들을 사용하여 결정될 수 있다. 바람직한 정렬은 갭 개방 페널티가 12이고 갭 연장 페널티가 2이며 BLOSUM 매트릭스가 62인 갭 검색을 사용하는 스미쓰-워터맨 (Smith-Waterman) 상동성 검색 알고리듬에 의해 결정한다. 상기 스미쓰-워터맨 상동성 검색 알고리듬은 참조문헌 [56]에 기재되어 있다.
달리 구체적으로 기재되지 않는 경우, 다수의 단계를 포함하는 공정 또는 방법은 상기 방법의 개시 또는 종료 시점에 추가의 단계를 포함할 수 있거나, 추가의 중재 단계를 포함할 수 있다. 또한, 단계들은 적당한 경우 대안적 순서로 조합되거나, 생략되거나 수행될 수 있다.
본 발명의 다양한 구현예는 본원에 기재되어 있다. 각각의 구현예에 특정된 특성들은 다른 특정된 특성과 조합하여 추가의 구현예를 제공할 수 있는 것으로 인지된다. 특히, 본원에서 적합하거나, 전형적이거나 바람직한 것으로 강조된 구현예는 서로 조합될 수 있다 (이들이 상호 배타적인 경우를 제외하고).
발명을 수행하기 위한 양태
본 연구의 목적은 신경발달 및 정신의학 장애와 연관된 행동 특징을 나타내는 2개의 상이한 마우스내 정신의학 및 신경학적 장애의 치료에 대한 생 바이오치료제의 효과를 평가하는 것이다. 특히, 상기 연구는 (i) C57BL/6 wt 마우스 모델, (ii) BTBR 근친교배된, 유전학적으로 변형된 마우스 모델 및 (iii) 모계 면역 활성화 (MIA) 마우스 모델에서 자폐증-관련된 거동에 집중한다. 3개 마우스 모델에서 불안증, 우울증 및 거동의 인지 및 사회적 도메인에 걸친 비히클 처리와 비교하여 만성 MRX006의 효과를 조사하였다. 추가로, 생리학적 및 해부학적 분석, 및 순환 사이토킨 및 옥시토신 수준의 검출을 수행하였다.
자폐증 스펙트럼 장애의 치료를 위한 의학 제품의 임상적 개발에 대한 EMA 가이드라인은, 질환의 이종성으로 인해, 단일 화합물을 사용한 모든 핵심 증상들에 대한 유의적 효과를 성취할 수 없고 따라서 단기 효능은 적어도 하나의 핵심 증상에 대해 입증되어야만 함을 기재하고 있다. 실시예에서 시험된 생 바이오치료제는 자폐증 스펙트럼 장애의 적어도 하나의 핵심 증상의 효과적인 치료를 보여주었고 따라서 이들 균주 (strain) 및 관련 블라우티아 균주는 인간 질환에 대해 효과적인 것으로 예상된다. 유사하게, 다른 중추 신경계 장애 또는 병태는 다수의 상이한 증상과 함께 복합 병리를 나타내고 거의 승인된 치료법이 없다. 따라서, 효과적인 치료는 중추 신경계 장애 또는 병태의 모든 증상을 치료할 필요가 없는 것으로 이해된다. 치료는 이것이 중추 신경계 장애 또는 병태와 연관된 증상들 중 하나를 치료하는 경우 치료학적으로 유용한 것으로 고려된다.
실시예
1 -
C57BL
/6 마우스에서 불안증, 우울증, 거동의 인지 및 사회적 도메인의 평가
실시예 1a - C57BL/6 마우스 실험을 위한 재료 및 방법
마우스
수컷 C57BL/6 마우스는 제조사 (Harlan UK)로부터 구입하였다. 동물을 12시간 암주기상에서 온도- 및 습도- 제어실 (7:00부터 19:00까지 점등)에 거주시켰다. 모든 실험은 유럽 지침 2010/63 EEC, 2012년 S.I. No. 543의 요건에 따라 수행되었으며 대학 (University College Cork)의 동물 실험 윤리위원회의 승인되었다.
종 (Strain)
MRX006: 블라우티아 스테르코리스 (Blautia stercoris) 세균은 수탁 번호 NCIMB 42381로 기탁되었다.
바이오치료제는 글리세롤 스톡으로 제공되었다. 생 바이오치료제는 혐기적 조건하의 설비에서 성장시켰다.
생 바이오칠제 투여
마우스가 7주령이 된 경우 MRX006 또는 비히클 (대조군)을 사용한 투여를 개시하였다. 이들 마우스는 거동 배터리의 개시 전에 4주 동안 MRX006 또는 포스페이트 완충 용액 (PBS)으로 하루 1회 치료하였다. 마우스는 거동 배터리 동안에 하루 1회 추가로 치료하였다. MRX006 (1x109 CFU 경구 투여)은 투여 전 PBS 중에 용해시켰다.
투여 스케줄
상기 연구를 위한 치료 그룹은 하기에 나타낸다. 경구 투여용 비히클은 PBS이다. 하루 경구 투여는 경구 위관영양법을 통해 수행한다.
순수 (Naive) 그룹은 거동 배터리의 개시 때까지 취급하지 않았다.
배설물 수거
새로운 배설물 샘플을 연구 종료 때까지 매주 개별 마우스로부터 수거하였다. 적어도 20 mg의 새로운 배설물은 소형원심분리기 튜브에 넣고 즉시 빙상에 위치시킴에 이어서 -80℃에서 보관하였다.
실험 디자인 및 방법
상기 명시된 바와 같이, MRX006을 사용한 투여는 마우스가 7주령이 된 경우 개시하였다. 초기 투여는 거동 실험 전에 4주 동안 수행하였다. 거동 배터리는 하기의 순서로 일어났다: 5주차에 구슬 매장 및 3개 챔버 시험; 6주차에 상승된 십자형 미로 및 꼬리 매달기 시험; 8주차에 개방 필드 및 신규 대상 인지 시험; 9주차에 스트레스-유도된 고체온 시험; 10주차에 두려움 조건화 시험; 및 11주차에 강제 수영 시험. 플루오레세인 소화관 투과성 검정은 9주차에 수행하였다. 최종적으로, 12주에, 마우스를 도태시키고 혈장 샘플과 함께 뇌, 근위 및 원위 결장, 부신 및 비장 영역에 대해 해부하였다.
그래프 디자인 및 통계학적 분석
모든 그래프는 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (버젼 5) 상에서 생성하였다. 데이터는 IBM SPSS 통계 22.0 (EEUU)을 사용하여 분석하였다. 데이터 분포는 콜모고로브-스미르노브 (Kolmogorov-Smirnov) 정규성 시험을 사용하여 분석하였다. 비히클 그룹 대 MRX006 그룹을 비교하는 데이터는 투-웨이 (two-way) ANOVA 및 피셔 최소 유의성 차이 (LSD) 사후 (post hoc) 시험을 사용하여 분석하였다. 비히클 그룹 대 순수 마우스를 비교하는 데이터는 쌍을 이루지 않은 스튜던트 t 시험에 의해 분석하였다. 비-정상적으로 분포된 데이터는 크루스칼-왈리스 (Kruskal-Wallis) 및 비-파라미터 만-휘트니 U 시험 (Mann-Whitney U test)에 의해 분석하였다. P < 0.05는 통계학적 유의성에 대한 기준이었다.
실시예 1b - 사회적 상호작용 거동의 평가 - 3개의 챔버 시험
합리성
3-챔버 사회적 상호작용 시험 (3-CSIT)은 잘 확증된 윤리적으로 적절한 모델이고 이는 마우스에서 성별 일치하는 동종 간의 사회적 상호작용을 평가하고 사회적 신규성 및 사회적 선호도의 판독을 가능하게 한다. 상기 시험을 사용하여 상기 거동 판독에서 변화를 특징 분석하고 입증한다. 상기 시험은 마우스가 무생물 물체 또는 성별 일치 동종 마우스 간을 자유롭게 탐색할 수 있게 한다.
추가로, 3-챔버 시험 (3-CHT)은 설치류 모델에서 일반 사회성 형태의 인지 및 사회적 신규성에서 관심을 평가하기 위해 사용되는 시험이다. 설치류는 정상적으로 물체 보다는 또 다른 설치류와 보다 시간을 보내는 (사회성) 것을 선호한다. 더욱이, 설치류는 친숙한 마우스 보다 신규 마우스 (사회적 신규성)를 조사하는 것을 선호한다. 이들 경향을 기준으로, 3-CHT는 사회성 및/또는 사회적 신규성이 결핍된 설치류의 동정을 도와줄 수 있다.
방법
동물은 모든 격실로의 용이한 접근을 가능하게 하는 작은 원형 개구부와 함께 분할에 의해 3개의 챔버 (좌측 및 우측 및 보다 작은 중심 챔버)로 분할된 사각형 장치에 위치시킨다. 시험은 3회 순차적 10분 시험으로 구성된다: (1) 습관화 (시험 동물은 3개의 빈 챔버를 탐색하도록 허용된다); (2) 사회성 (익숙하지 않은 동물은 좌측 또는 우측 챔버의 내부 메쉬 와이어 케이지에 위치시킨다); (3) 사회적 신규성 선호도 (새로운 동물은 현재 친숙한 동물의 반대쪽에 있는 챔버의 이전에 빈 내부 케이지에 위치시킨다). 순수 동물은 습관화 단계에서 챔버에 대한 선호도, 사회성 단계에서 마우스에 대한 선호도, 및 사회적 신규성 단계에서 신규한 마우스에 대한 선호도를 갖지 말아야 한다. 식별 비율에서의 증가는 사회적 거동에서의 증가를 시사한다. 모든 동물은 연령-및 성별-일치하고, 각각의 챔버는 각각 30분 시험 후 세정하고 새로운 베딩으로 정렬한다. 3단계 각각에 대해, 거동은 장치 상에 탑재된 비디오 카메라에 의해 기록한다.
결과
그룹 내 스튜던트 t 시험은 모든 그룹이 물체에 비해 마우스를 조사하는데 보다 많은 시간을 소요함을 밝혔고 (**p<0.01) 이는 사회성에서의 결핍을 시사하지 않는다(도 1). 매일 위관영양법은 사회성에 영향을 주지 않는다. 흥미롭게도, MRX006은 친숙한 마우스에 비해 새로운 마우스를 조사하는데 소요되는 시간을 증진시키고, 이는 증가된 사회적 신규성을 시사한다(p<0.05; 도 1).
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 3개 챔버 시험에서 C57BL/6 마우스에서 사회적 신규성에 대한 선호도를 증진시켰다.
실시예 1c - 우울증-유사 거동의 평가-강제된 수영 시험(FST)
합리적
강제된 수영 시험 (FST)은 항우울증 활성을 평가하기 위해 가장 광범위하게 사용되는 실험 패러다임이다. 순수 동물은 부동 부유 자세에 적응하기 전에 수영, 기어오르기 및 다이빙 형태로 이탈 거동을 나타낼 것이다. 부동의 지속 기간은 거동 절망을 나타낸다. 항우울증 약물은 상기 시험에서 부동 자세에 소요되는 시간을 감소시킨다.
방법
마우스는 23-25℃ 수돗물로 채워진 유리 실린더 (24 x 21 cm)에서 17 cm 깊이까지 6분 동안 수영하도록 강제한다. FST는 천장 카메라로부터 비디오 촬영하였다. 스코어링된 거동 파라미터는 6분 시험의 마지막 4분 동안에 부동능이다.
결과
하루 위관영양법은 부동 시간을 증가시켰고, 이는 순수 마우스와 비교하여 우울증 유사 거동을 시사한다 (t 스튜던트 시험, t (190=4.565; p<0.01; 도 2). MRX006을 사용한 만성 치료는 부동능을 유의적으로 감소시켰고, 이는 비히클 그룹과 비교하여 항우울증 유사 효과를 시사한다 (F(2.29) = 14.992; **p<0.01).
결론
MXR006을 사용한 만성 치료는 강제된 수영 시험에서 항우울증 유사 거동을 유도하였다.
실시예 1d - 우울증-유사 거동의 평가-꼬리 매달기 시험
합리성
꼬리 매달기 시험은 항우울증 유사 거동을 평가하기 위해 사용되는 잘 특징 분석된 시험이다. 부동에 소요되는 시간은 우울증 유사 거동의 지수이다. 항우울증 약물을 사용한 치료는 부동에 소요되는 시간을 감소시킨다.
방법
마우스는 꼬리 끝 1 cm 앞에 6분의 기간 동안 부착 된 접착 테이프 조각으로 상승 막대 (60 cm)에 매단다. 마우스는 근처 표면에서 탈출하거나 붙잡을 수 없는 방식으로 매단다. 상기 시험 동안에, 6분의 지속기간에, 수득한 탈출을 향한 거동을 정량한다. 스코어링된 거동 파라미터는 부동 자세로 소요된 시간이다. 시험은 삼각대 카메라에 의해 비디오-기록하고, 부동 시간은 연구자 블라인드에 의해 실험 조건으로 수동으로 스코어링하였다.
결과
위관영양법에 대한 하루 취급 (스튜던트 t 시험, t (20) = 0.9405; p=0.3582) 및 MRX006을 사용한 만성 치료 (원-웨이 ANOVA, F (2.30) =2.014; p=0.152)는 꼬리 매달기 시험에서 어떠한 유의적 효과를 유도하지 않았다(도 3).
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 꼬리 매달기 시험에서 C57BL/6 마우스에서 임의의 관찰가능한 항우울증 유사 거동을 유도하지 않았다.
실시예 1e - 인지 평가- 공포 조건화 시험
합리성
상황에 따른 공포 조건화는 해마 의존적 기억의 척도로 사용된다. 공포 조건화는 비조건화된 자극 (US), 예를 들어, 조건화된 자극 (CS), 특정 톤 또는 빛 또는 냄새를 사용한 쇼크에 대해 동물에 의해 나타난 동결 반응을 측정하는 연관 학습 형태이다. 동결 수준의 측정을 사용하여 US 및 CS 자극에 대해 동물 반응을 평가하였다. 이러한 시험은 마우스가 획득 당일에 획득한 것을 얼마나 효율적으로 망각하는지를 측정한다. 시험은 무조건 자극과 연관된 조건화된 자극에 대한 마우스의 불안 및 쌍으로 비조건화된 자극의 반복 부재에서 조건화된 자극의 존재하에 마우스가 감소 된 불안 및/또는 스트레스 (동결 수준)를 나타내는 속도를 평가한다.
방법
상기 시험을 위한 장치는 위의 빛을 가진 챔버로 이루어져 있다. 각각의 챔버는 더 큰 챔버 내부에 위치하여 외부 빛 및 소음으로부터 보호한다. 제1 일째 (훈련 또는 획득 단계)에, 마우스를 챔버에 위치시키고 이들의 동결 거동은 3분 (기준선) 동안 기록하였고 이어서 6회 이하 빛/톤 [조건화된 자극 (CS - 30 s)] 및 발쇼크 [비조건화된 자극 (US - 2 s)]를 수행하고, 최대 2분 이하의 간격으로 페어링한다. 페어링은 큐 (cue)의 마지막 20s 동안의 큐 [예를 들어, 조합된 빛 (~260 lx) 및 톤 노출 (80 dB)] 및 큐의 마지막 2s 동안에 전기 발쇼크로 이루어진다. 발 쇼크는 동결 거동을 증가시킨다. 전류 강도는 0.6 mA이다. 동결 반응을 유도하는 최소 전류를 사용하였다. 마지막 페어링 2분 후, 마우스는 이들의 정규 거주 조건으로 복귀시켰다. 조건화 24 h 및 48 h 후 (각각 2일 (복구 단계) 및 3일 (소멸 단계)), 동일한 실험 과정을 발쇼크 부재하에 조건화된 공포 기억 (소멸 단계)의 기억 보유 및 소멸을 시험하기 위해 반복하였다. 상황 기억 보유는 발쇼크가 없는 상황에서 동물이 상황 (즉, 발쇼크 챔버)에 놓일 때 동결 거동을 특징으로 한다.
결과
동결 수준은 획득 단계 (함께 커플링된 CS 및 US 둘 다로의 노출), 복구 및 소멸 단계 (CS는 US와 커플링되지 않음)에서 측정하였다(도 4 참조). 상기 연구에서, 하루 위관영양법은 순수 동물과 비교하여 획득 단계에서의 동결 수준 (단계 1 #p<0.05; 단계 2 ###p<0.001; 단계 3-4 ##p<0.01)에서 유의적 증가를 유도하였다. MRX006 만성 치료는 획득 단계 동안에 비히클 그룹과 비교하는 경우 동결 수준을 변화시키지 않았다. 상기 획득 단계에 이어서 훈련 세션 24시한 후 수행되는 복구 단계가 수행된다 (CS에 이어서 US가 수행되지 않는다). 상기 데이터는 순수 그룹과 비교하여 비히클 그룹에서 단계 1 (제1 톤으로의 노출)에서 동결 수준에서의 유의적 증가를 보여주었다(p<0.05). 흥미롭게도, 동결 수준에서 유의적 감소는 비히클 그룹과 비교하는 경우 MRX006-치료된 마우스에서 단계 1에서 관찰되었다 (*p<0.05). 총체적으로, 복구 단계에서, MRX006-치료된 것은 비히클 그룹과 비교하는 경우 감소된 동결 수준에 대한 경향을 나타냈고, 이는 MRX006을 사용한 치료가 학습을 증진시킬 수 있음을 시사한다. 복구 단계에 이어서 소멸 단계를 수행한다 (24시간 후, CS, 및 US 부재). 이러한 시험은 마우스가 획득 당일에 획득 한 것을 얼마나 효율적으로 망각하는지를 측정한다. 소멸 단계의 단계 3에서, 비히클 그룹은 순수 그룹과 비교하는 경우 증가된 동결 수준을 나타냈다(p<0.05). MRX006을 사용한 만성 치료는 소멸 단계에서 임의의 유의적 변화를 유도하지 않았다.
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 복구 단계에서 동결 수준을 감소시키고, 이는 MRX006이 학습을 증진시킬 수 있음을 시사한다. 전체적으로, MRX006을 사용한 만성 치료는 공포 조건화된 거동을 관찰가능하게 변화시키지 않았다.
실시예 1f -인지 평가 - 신규 물체 인식 (NOR) 시험
합리성
사용되는 프로토콜은 문헌(참조: Bevins 및 Besheer (2006))으로부터 채택하였고, 인지, 특히 인식 기억을 시험하기 위해 사용되었다. 상기 시험은 친숙한 것 보다 신규 물체를 탐색하는데 보다 많은 시간을 소요하는 설치류의 자발적 경향을 기초로 한다. 신규 물체를 탐색하는 선택은 학습 및 인식 기억의 사용을 반영한다. 추가로, 개선된 기억은 감소된 우울증 유사 거동의 반영이다.
방법
사용되는 프로토콜은 문헌(참조: Bevins and Besheer (2006))으로부터 채택하였다. 이것은 3일에 걸쳐 수행하였다. 1일 째에, 동물을 오버 헤드 카메라가 장착된 대형 용기인 시험 환경에 10분 동안 적응시켰다. 어떠한 베딩 (bedding)도 사용하지 않았고 용기는 각각의 동물 사이에서 70% 에탄올로 닦았다. 2일 째에 동물은 10분 동안 시험 장치에 적응시켰다. 이 기간 후에, 동물을 용기에서 꺼내고 동일한 2개의 동일한 물체를 환경에 도입하였다. 동물을 용기로 복귀시키고 추가로 10분 동안 탐색하도록 하였다. 물체를 각각의 시험 전에 70% 에탄올로 세정하였다. 훈련 기간 후, 설치류를 24시간 지연 기간 동안 환경으로부터 제거하였다. 3일 째에, 이번에는 이전 날로부터 1개의 친숙한 물체와 1개의 새로운 물체를 포함하는 용기에 복귀시켰다. 2개의 물체와 함께 동물의 활동은 5분 동안 기록하였다. 설치류가 각각의 물체에 대해 탐색하는데 소요되는 시간의 양을 수동 관찰에 의해 기록하였고 총 상호작용 시간에 걸쳐 신규 물체와 상호작용하는에 소요되는 시간에 상응하는 식별 지수 (DI) 값을 생성하였다. 대조군 래트와 비교하여 DI에서의 감소는 상기 유형의 기억 결핍을 지적한다.
결과
위관영양법을 위한 매일 취급은 C57B1/6 마우스에서 인식 기억에 영향을 주지 않았다(도 5). 실제로, 그룹 둘 다는 친숙한 물체 보다 더 신규한 물체를 탐색하는 선호도에 대한 패턴을 보여준다 (통계학적으로 유의성에 도달하지 않았지만). MRX006으로 만성적으로 치료받은 마우스에는 친숙한 것 보다 신규 물체를 탐색하는 선호도가 유의적으로 증가하였다(p<0.05) (도 5).
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 친숙한 물체 보다 신규한 물체에를 조사하는데 유의적으로 보다 많은 시간을 소요하는 C57B1/6 마우스를 유도하였고, 이는 증진된 인식 기억을 시사한다.
실시예 1g - 불안증-유사 거동의 평가- 구슬 매장 시험
합리성
구슬 매장 시험은 네오포비아, 불안증 및 충동적 강박 거동의 유용한 모델이다. 이는 또한 신규 항우울증제, 불안 완화제 및 항정신병제를 시험하기 위해 사용된다. 불안 완화제와 같은 약리학적 제제로 전처리된 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 감소된 구슬 매장 거동을 보여준다.
방법
마우스는 신규 폴리프로필렌 케이지 (35 x 28 x 18.5 cm, L x W x H)에 넣고, 상기 케이지는 표준 설치류 (단단한 목재) 베딩 (5 cm) 및 이의 위에 20개 구슬 (5개 열의 구슬이 규칙적으로 벽으로 부터 2 cm 이격된 공간에 위치하고 2 cm 격리되어 있다)을 함유한다. 실험은 1000 lux의 빛 강도하에 수행하였다. 30분 후, 마우스를 이들 케이지로부터 꺼내고 이들의 표면의 2/3 rds 초과에 대해 매장된 구슬의 수를 스코어링하였다.
결과
스튜던트 시험 (비히클 대 순수 (naive); t (20) = 0.1308; p = 0.8973) 및 원 웨이 ANOVA 분석 (F (2.38) =0.992; p=0.384)은 MRX006을 사용한 만성 치료 또는 매일 위관영양법이 매장된 구슬의 수를 변화시키지 않음을 밝혔고 이는 불안증 유사 기준선에 어떠한 변화가 없음을 시사한다(도 6).
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 구슬 매장 시험에서 C57B1/6 마우스에서 관찰가능하게 불안증 유사 거동을 변화시키지 않았다.
실시예 1h - 불안증-유7사 거동의 평가 - 상승된 십자형 미로 시험
합리성
상승된 십자형 미로 (EPM)는 설치류에서 불안증-유사 거동을 평가하기 위해 광범위하게 사용되는 시험이다. EPM은 덜 불안한 마우스가 미로의 개방 아암에서 더 많은 시간을 소요하면서 일반적인 불안 거동을 평가한다. 개방 아암 활동에서의 증가 (지속 기간)는 항-불안증 거동을 반영한다.
방법
상기 셋업은 2개의 개방 (회피) 및 2개의 폐쇄 (안전) 아암 (50 x 5 x 15 cm 벽)을 포함하는, 바닥으로부터 1 미터 상승된 회색 플라스틱 십자형 미로로 이루어진다. 적색광 하에 실험을 수행하였다 (7 lux). 마우스를 개방 아암에 직명한 미로의 중앙에 넣고 (폐쇄된 아암으로의 직접 진입을 회피하기 위해) 6분의 지속 기간 동안 탐색하도록 하였다. 실험은 천장 카메라를 사용한 비디오 촬영으로 여러 거동 파라미터를 측정하였다. 장치는 이전 마우스로부터 후각 신호를 방지하기 위해 각각의 대상체 후에 70% (vol/vol) 에탄올로 세정하였다. 개방/폐쇄 아암에서 소요되는 시간, 중앙에서 소요되는 시간 및 이동 수를 수동으로 분석하였다. 각각의 아암에서 소요되는 시간 및 진입 수의 퍼센트는 각각 불안증-유사 거동 및 운동 활동에 대해 측정되었다. 아암으로의 진입은 아암 내부에 모든 4개의 발로서 정의되었다. 개방 아암 활동에서의 증가 (지속 기간)는 항-불안증 거동을 반영한다.
결과
스튜던트 t 시험 분석은 매일 위관영양법이 개방 아암에서 소요되는 시간에 영향을 미치지 않음을 밝혔다(도 7). 원-웨이 ANOVA 분석은 MRX006을 사용한 만성 치료가 대조군 그룹과 비교하는 경우 상승된 십자형 미로에서의 거동을 변화시키지 않음을 밝혔다(도 7). 구체적으로, Mrx006을 사용한 만성 치료는 개방 아암에서 및 폐쇄 아암에서 소요되는 시간을 변화시키지 않았다.
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 상승된 십자형 미로에서 C57B1/6 마우스의 거동을 관찰가능하게 변화시키지 않았다.
실시예 1i - 스트레스 유도된 발열요법 (SIH) 시험에서 불안증 수준의 평가
합리성
SIH 패러다임은 불안증의 널리-특징 분석된 지수이다. 상기 시험에서, 스트레스는 직장 온도의 측정에 의해 단순하게 유발된다.
방법
간략하게, 동물은 시험 1일 전에 단독으로 거주시켰다. 직장 온도는 윤활 온도-민감성 프로브를 사용하여 15분 간격으로 측정하였다. 제1 온도 측정 동안에 경험한 스트레스로 인해, 제2 측정의 온도 (T2)는 먼저 것 (T1) 보다 높았다. 온도에서의 상기 차이 (ΔΤ = T2 - T1)는 SIH 반응으로서 정의된다. 상기 SIH 반응은 상이한 부류의 불안증 완화제에 의해 기록한다.
결과
위관영양법의 매일 처리량은 ΔΤ를 증가시켰고 이는 불안증-유사 거동을 시사한다 (스튜던트 t 시험, t (19) = 2.121, p=0.047). MRX006을 사용한 만성 치료는 비히클 그룹과 비교할 때 ΔΤ의 변화를 유도하지 않았다 (원-웨이 ANOVA, F (2.29) = 1.215; p = 0.312) (도 8).
결론
MRX006을 이용한 만성 치료는 C57B1/6 마우스에서 스트레스 유발 고온 시험에서 온도에서 스트레스 유도 변화를 관찰가능하게 변화시키지 않았다.
실시예 1j - 생리학적 분석-혈장 옥시토신 수준
방법 및 결과
옥시토신 수준은 순수, 비히클 및 MRX006 처리된 마우스에서 측정하였다(도 9). 수컷과 암컷의 중추 신경계에서 작용하는 옥시토신 펩타이드는 소속, 성적 행동, 사회적 인식, 공격성 및 신뢰를 포함한 다양한 복잡한 사회적 거동에 중요하다. 방사선 면역 검정 (RIA)은 혈액에서 매우 소량의 펩타이드 및 대사물을 측정하는 민감한 방법이다. RIA를 위해 샘플을 제조하고 RIA 기술 (RIAgnosis, Sinzing, Germany)을 통한 옥시토신 측정을 위해 전달되었다. C57B1/6 마우스에서 MRX006을 사용한 만성 치료는 옥시토신 수준의 감소를 보여주었다 (p <0.05).
실시예 1k - 생리학적 분석 - 스트레스-유도된 코르티코스테론 혈장 수준
방법 및 결과
코르티코스테론은 스트레스에 응답하여 방출되는 주요 설치류 호르몬이다. 상기 연구에서, 코르티코스테론 수준 변화는 기준선에서 및 순수, 비히클 및 MRX006-처리된 마우스에서 강제된 수영 시험 (급성 스트레스 노출) 후 측정하였다(도 10). 코르티코스테론 측정은 상이한 시점에서, 즉 TO (강제 수영 시험 전), 및 강제 수영 시험에 노출 후 30분 (T30), 90분 (T90) 및 120분 (T120)에서 수행되었다. 데이터는 T30에서 순수 그룹과 비교하여 비히클 그룹에서 스트레스-유도 코르티코스테론 수준의 유의적인 증가를 보여주었다 (p <0.05). 흥미롭게도, 스트레스 유도된 코르티코스테론 수준의 유의 한 증가는 대조군과 비교할 때 MRX006-처리된 마우스에서 T30에서 관찰되었다. 다른 시점에서는 큰 변화가 관찰되지 않았다. 이들 결과는 비히클 및 MRX006 처리된 그룹 둘 다에서 스트레스에 대해 증가된 민감성을 시사할 수 있다.
실시예 11 - 생리학적 분석 - 생체내 위장관 투과 검정
합리성
이러한 절차는 생체내 장 운동성을 평가하기 위해 사용된다. 소화관 투과성은 플루오레세인 유도체의 경구 투여 후 혈액에서 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)의 정량화를 통해 상이한 만성 치료들 사이에서 정량하였다. 이것은 경구로 투여된 플루오레세인 유도체가 소화관을 통해 말초 시스템으로 누출되는 원리에 기초하여 소화관 투과성을 정량화하는 확립된 방법이다.
방법
시험 마우스는 단독으로 거주시키고 밤새 단식시켰다. 다음날 아침에 (~9 am), 마우스는 경구 위관영양법에 의해 FITC 덱스트란((600 mg/kg)을 투여받았다. 2시간 후, 혈액 샘플의 100 μl를 헤파린-처리된 모세관 튜브에 수거하고 어둡게한 에펜도르프에 전달하고 빙상에 위치시켰다. 샘플은 15분 동안 3500 x g에서 원심분리하고, 혈장을 흡인 제거하고 샘플을 장기 보관을 위해 -80℃에 보관하였다.
희석되지 않은 샘플을 사용하여 FITC 농도를 정량하였다. 25 μl의 FITC는 384 웰 플레이트 (Greiner bio one)에서 이중으로 피펫팅하였다. FITC는 490 nm 내지 520 nm의 범위에서 빅터 (Victor) 분광측정기를 사용하여 측정하였다. 표준 곡선을 위해, FITC의 일련의 희석물은 PBS (pH 7.4)에서 제조하였다. 흡광도에서의 증가는 장벽 온전함의 감소를 지적한다.
결과
상기 데이터는 매일 위관영양법(p = 0.051)으로 장 투과성의 증가 경향을 보였지만 유의성에 도달하지 못하였다(도 11). MRX006 그룹 간의 총체적 장 투과성은 변화되지 않은 상태로 남아있다.
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 소화관 투과성에 대해 어떠한 관찰가능한 효과를 나타내지 않았다.
실시예 1m - 생리학적 분석 - 기관 중량 및 결장 길이
위관영양법에 대한 매일 취급 및 MRX006을 사용한 만성 치료는 맹장 중량, 비장 중량 및 부신 중량에서의 변화를 유도하지 않았다(도 12).
C57B1/6 마우스 모델로부터의 결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 항우울증 유사 활동을 스크리닝하기 위해 광범위하게 사용되는 시험인 강제 수용 시험에서 항우울증 유사 효과를 유도하였다. 추가로, MRX006을 사용한 만성 치료는 3-챔버 시험에서 친숙한 마우스에 비해 신규 마우스와 보다 많은 시간을 소요하는 C57B1/6 마우스에서 사회적 거동을 증진시켰고, 이는 MRX006가 자폐증 스펙트럼 장애의 핵심 증상인 사회적 장애를 역전시킴을 시사한다. 추가로, MRX006을 사용한 만성 치료는 공포 조건화 시험에서 동결 수준을 감소시키는 경향이 있고 이는 상기 종류의 투여가 기억의 인지 기능을 개선시키고 C57B1/6 마우스에서 불안증을 감소시킴을 지적한다.
추가의 연구는 급성으로 또는 준-임상적으로 투여되는 경우 옥시토신 수준 및 코르티코스테론 수준에 대한 MRX006의 효과를 특징 분석하기 위해 요구된다. 상기 증거는 MRX006이 시상하부 뇌하수체 축 (HPA)의 신호전달을 조절함을 지적한다.
따라서, MRX006의 투여는 항우울증 효과를 유발하고, 사회적 신규성 및 인지 촉진 효과를 증진시킨다.
실시예 2 - BTBR 마우스 모델
BTBR 마우스 모델은 강한 자폐증 유사 표현형을 나타내는 근친교배한 유전학적으로 변형된 마우스를 사용한다. 사회적 거동에서 결핍, 증가된 반복적 거동 및 증가된 불안증 관련 거동은 상기 균주에서 보고되었다(참조: Meyza and Blanchard, 2017). 상기 강한 거동 표현형으로 인해, BTBR 마우스는 자폐증 관련 거동의 치료를 위한 신규 치료학적 제제의 효능을 평가하기 위한 이상적인 동물 모델이다. 생 바이오치료제에 의한 상기 증상의 완화는 또한 다른 정신학적 또는 신경학적 질환의 치료에서 바이오치료제의 효능을 지적할 수 있다.
실시예 2a - BTBR 마우스 모델을 위한 재료 및 방법
마우스
수컷 BTBR 마우스는 하우스에서 사육하였다. 동물을 12시간 암주기상에서 온도- 및 습도- 제어실 (7:00부터 19:00까지 점등)에 거주시켰다. 모든 실험은 유럽 지침 2010/63/EEC, 2012년 S.I. No. 543의 요건에 따라 수행되었으며 대학 (University College Cork)의 동물 실험 윤리위원회의 승인되었다.
종 (Strain)
MRX006: 블라우티아 스테르코리스 (Blautia stercoris) 세균은 수탁 번호 NCIMB 42381로 기탁되었다.
바이오치료제는 글리세롤 스톡으로 제공되었다. 생 바이오치료제는 혐기적 조건하의 설비에서 성장시켰다.
생 바이오칠제 투여
마우스가 8주령인 경우 MRX006 또는 비히클을 사용한 투여를 개시하였다. 이들 마우스는 거동 배터리의 개시 전에 3주 동안 MRX006 또는 포스페이트 완충 용액 (PBS)으로 하루 1회 치료하였다. 마우스는 거동 배터리 동안에 하루 1회 추가로 치료하였다. MRX006 (l x 107 내지 1 x 109 CFU 경구 투여)은 투여 전 PBS 중에 용해시켰다.
투여 스케줄
상기 연구를 위한 치료 그룹은 하기에 나타낸다. 경구 투여용 비히클은 PBS이다. 하루 경구 투여는 경구 위관영양법을 통해 수행한다.
배설물 수거
새로운 배설물 샘플을 종료 때까지 매주 개별 마우스로부터 수거하였다. 적어도 20 mg의 새로운 배설물은 소형원심분리기 튜브에 넣고 즉시 빙상에 위치시킴에 이어서 -80℃에서 보관하였다.
실험 디자인 및 방법
상기 명시된 바와 같이, MRX006을 사용한 투여는 마우스가 8주령이 된 경우 개시하였다. 초기 투여는 거동 실험 전에 3주 동안 수행하였다. 거동 배터리는 하기의 순서로 일어났다: 4주 째에 구슬 매장 시험; 5주 째에 상승된 십자형 미로; 개방 필드 및 신규 물체 인식 시험, 및 6주째 음식 선호도 시험의 사회적 전파; 암컷 뇨 스니핑 및 7주 째에 사회적 상호작용 시험, 및 9주째 강제 수영 시험. 카민 레드 위장 운동 검정 및 위장 침투성 검정 꼬리 출혈은 각각 8 및 9주째 동안에 일어났다. 최종적으로, 10주 내지 11주에, 마우스는 바징세포 자극을 위해 죽이고 회장 및 결장에서 FITC의 생체외 측정을 하였다.
위장 파라미터 (투과성 및 운동성)와 함께 고정 관념의 사회적 및 우울증 유사 거동에 대한 BTBR 모델에서 생 바이오치료제 치료의 효과는 하기의 실시예에서 개요를 기재한다.
상기 표에 열거된 그룹 1은 대조군 BTBR 마우스를 나타내고, 이는 자폐증 스펙트럼 장애와 연관된 표현형을 보여주는 것으로 예상된다. 자폐증 스펙트럼 장애의 거동 증상에 대한 임의의 치료 효과는 그룹 1과 그룹 2 간의 차이에 의해 확인된다.
그래프 디자인 및 통계학적 분석
모든 그래프는 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (버젼 5) 상에서 생성하였다. 데이터는 IBM SPSS 통계 22.0 (EEUU)을 사용하여 분석하였다. 데이터 분포는 콜모고로브-스미르노브 (Kolmogorov-Smirnov) 정규성 시험을 사용하여 분석하였다. 비히클 그룹 대 MRX006 그룹을 비교하는 데이터는 원-웨이 ANOVA 및 피셔 최소 유의성 차이 (LSD) 사후 (post hoc) 시험을 사용하여 분석하였다. ANOVA가 유의적인 치료 효과를 나타내지 않으면, 대조군에 대한 선행 쌍별 비교 시험을 수행하였다. 비-정상적으로 분포된 데이터는 크루스칼-왈리스 (Kruskal-Wallis) 및 비-파라미터 만-휘트니 U 시험 (Mann-Whitney U test)에 의해 분석하였다. P < 0.05는 통계학적 유의성에 대한 기준이었다.
실시예 2b - 사회적 거동의 평가 - 3개 챔버 사회적 상호작용 시험
합리성
3-챔버 사회적 상호작용 시험 (3-CSIT)은 잘 확증된 윤리적으로 적절한 모델이고 이는 마우스에서 성별 일치하는 동종 간의 사회적 상호작용을 평가하고 사회적 신규성 및 사회적 선호도의 판독을 가능하게 한다. 상기 시험은 마우스가 무생물 물체 또는 성별 일치 동종 마우스 간을 자유롭게 탐색할 수 있게 한다.
방법
동물은 모든 격실로의 용이한 접근을 가능하게 하는 작은 원형 개구부와 함께 분할에 의해 3개의 챔버 (좌측 및 우측 및 보다 작은 중심 챔버)로 분할된 사각형 장치에 위치시킨다. 시험은 3회 순차적 10분 시험으로 구성된다: (1) 습관화 (시험 동물은 3 개의 빈 챔버를 탐색하도록 허용된다); (2) 사회성 (익숙하지 않은 동물은 좌측 또는 우측 챔버의 내부 메쉬 와이어 케이지에 위치시킨다); (3) 사회적 신규성 선호도 (새로운 동물은 현재 친숙한 동물의 반대쪽에 있는 챔버의 이전에 빈 내부 케이지에 위치시킨다). 순수 동물은 습관화 단계에서 챔버에 대한 선호도, 사회성 단계에서 마우스에 대한 선호도, 및 사회적 신규성 단계에서 신규한 마우스에 대한 선호도를 갖지 말아야 한다. 식별 비율에서의 증가는 사회적 거동에서의 증가를 시사한다. 모든 동물은 연령-및 성별-일치하고, 각각의 챔버는 각각 30분 시험 후 세정하고 새로운 베딩으로 정렬한다. 3단계 각각에 대해, 거동은 장치 상에 탑재된 비디오 카메라에 의해 기록한다.
결과
사회성을 평가하기 위해, 그룹 내 스튜던트 t-시험은 MRX006 그룹에 대한 물체에 비해 신규 동종 (CS) 마우스에 대해 증가된 선호도를 밝혔다 [t(22)= 5.281; P<0.0001] (도 13a). 사회적 신규성을 평가하기 위해, 그룹 내 스튜던트 t-시험은 비히클 그룹에서만 동종의 신규물에 대해 증가된 선호도를 밝혔다 [t(22)= 3.452; P<0.001]. 동종의 신규물과의 상호작용 시간의 ANOVA는 치료 효과를 밝히지 못했다 [F(3,47)=2.492; P=0.43; 도 13b]. 그러나, 선행 쌍별 비교 시험은 MRX006을 사용한 치료 (t(22)=0.7497; P=0.4614)가 비히클 그룹과 비교하는 경우 동종의 신규물과의 상호작용 시간을 감소시킴을 밝혔다. 동종의 신규물을 조사하는데 소요되는 퍼센트 시간의 ANOVA는 치료 효과를 밝혔다 [F(3,47)= 2.942; P= 0.0433; 도 13c]. 사후 비교는 MRX006을 사용한 치료가 동종의 신규물을 조사하는 퍼센트 시간을 감소시킴을 밝혔다(p<0.05).
투 웨이 ANOVA 분석 [물체/동종 (CS): [F(1,47)= 21.164; PO.0001; 치료: F(1,47)= 0.56; P=0.815; 물체/CS x 치료: F(1,47)=5.414; P= 0.025] 이어서 사후 분석은 MRX006 치료된 마우스가 물체에 비해 동종물을 조사하는데 보다 많은 시간을 소요하였다 (p<O.01; 도 13d). 투-웨이 ANOVA 분석 [친숙한 대 신규한: F(1,47)= 3.454; P=0.070; 치료: F(1,47)= 0.360; P=0.552; F/N x 치료: F(1,47)= 8.627; P=0.005]에 이어서 사후 비교는 MRX006을 치료받은 마우스가 친숙한 마우스에 비해 신규한 것을 조사하는데 시간을 덜 소요함을 밝혔다(p<0.05; 도 13e). 대조적으로, 동종의 친숙한 것에 비해 신규물을 조사하는데 보다 많은 시간을 소요하였다(p<0.05; 도 13e). 퍼센트 분석은 MRX006 처리된 마우스가 비히클 그룹과 비교하는 경우 동종의 신규물과 상호작용하는데 시간을 덜 소요함을 밝혔다 (t=2.480 df=22; P= 0.0213; 도 13f).
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 3개 챔버 시험에서 사회적 신규성을 감소시키고 BTBR 마우스의 사회적 인지를 감소시킨다.
실시예 2c - 사회적 거동의 평가 - 강제 침입 시험
합리적
이러한 절차는 설치류 간의 사회적 상호작용 거동을 평가한다. 침입 마우스를 거주 마우스 홈-케이지에 위치시킴에 의해, 당업자는 사회적 상호작용 및 공격성 거동을 평가할 수 있다.
방법
각각의 세션은 10분의 기간 동안 침입 마우스를 거주 마우스 홈-케이지에 위치는 것으로 이루어져 있다. 실험은 천장 카메라를 사용한 비디오 촬영으로 여러 거동 파라미터를 측정하였다. 동물이 상호작용에 소요하는 시간의 양을 기록하였다.
결과
상호작용 시간의 ANOVA는 치료의 효과를 밝히지 못했다 [F(3,45)= 2.327; P=0.088; 도 14]. 유사하게, 선행 쌍별 비교 시험은 MRX006을 사용한 치료 (t=1.425 df=22; P=0.1682)가 비히클 그룹과 비교하는 경우 사회적 상호작용 거동에 영향을 미치지 않음을 밝혔다.
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 사회적 상호작용 시험에서 BTBR 마우스의 사회적 거동에 영향을 미치지 않는다.
실시예 2d - 고정관념의 거동의 평가 - 구슬 매장 시험
합리성
상기 시험은 반복적이고, 강박 및 불안 거동에 대해 평가한다. 매장된 보다 높은 수의 구슬은 보다 높은 불안 또는 고정관념 거동을 지적한다. 불안 완화제와 같은 약리학적 제제로 치료받은 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 감소된 구슬 매장 거동을 보여준다.
방법
마우스는 신규 폴리프로필렌 케이지 (35 x 28 x 18.5 cm, L x W x H)에 넣고, 상기 케이지는 표준 설치류 (단단한 목재) 베딩 (5 cm) 및 이의 위에 20개 구슬 (5개 열의 구슬이 규칙적으로 벽으로 부터 2 cm 이격된 공간에 위치하고 2 cm 격리되어 있다)을 함유한다. 실험은 1000 lux의 빛 강도하에 수행하였다. 30분 후, 마우스를 이들 케이지로부터 꺼내고 이들의 표면의 2/3 rds 초과에 대해 매장된 구슬의 수를 스코어링하였다.
결과
매장된 구슬의 수에 대해 ANOVA에 의해 결정된 바와 같은 치료의 어떠한 효과도 없었다 [F(3,45)= 1.64; P = 0.193]. 그러나, 선행 쌍별 비교 시험은 MRX006 (t=2.276 df=21, p<0.05)이 매장된 구슬의 수를 감소시킴을 밝혔다(도 15).
결론
MRX006을 사용한 치료는 구슬 매장 시험에서 BTBR 마우스에서의 반복적 거동을 감소시킨다.
실시예 2e - 고정관념의 거동의 평가 - 털 손질 (grooming) 시험
합리성
상기 시험은 고정관념 및 반복적 거동에 대한 지수로서 사용한다. 털 손질에 소요되는 시간에서의 증가는 증가된 고정관념 또는 반복적 거동을 지적한다.
방법
마우스는 개별적으로 플렉시글라스 (Plexiglas) 탑으로 덮여진 신규 유리 비이커 (500 mL)에 위치시켰다. 실험은 60 lux의 빛 강도하에 수행하였다. 삼각대 스탠드에 부착된 휴대용 카메라를 사용하여 실험을 비디오 촬영하였다. 털 손질 거동은 20분 동안 기록하였다.
결과
ANOVA [F(3,47)= 4.174; P=0.011]에 의해 결정된 바와 같은 생 바이오치료제의 털 손질 활동에 대해 유의적 효과가 있다. 사후 비교는 MRX006을 사용한 치료가 비히클 그룹에 비해 털 손질에 소요되는 시간의 양을 유의적으로 감소시킴을 밝혔다(p<0.05)(도 16). 유사하게, 선행 쌍별 비교 시험은 MRX006 (t=2.895 df=22, p<0.01)이 비히클 그룹과 비교하여 털 손질에 소요되는 시간을 감소시킴을 밝혔다.
결론
MRX006을 사용한 치료는 털 손질 시험에서 BTBR 마우스에서의 반복적 거동을 감소시킨다.
실시예 2f - 불안증-유사 거동의 평가 - 상승된 십자형 미로
합리성
상승된 십자형 미로 (EPM)는 설치류에서 불안증-유사 거동을 평가하기 위해 광범위하게 사용되는 시험이다. EPM은 덜 불안한 마우스가 미로의 개방 아암에서 더 많은 시간을 소요하면서 일반적인 불안 거동을 평가한다. 개방 아암 활동에서의 증가 (지속 기간)는 항-불안증 거동을 반영한다.
방법
상기 셋업은 2개의 개방 (회피) 및 2개의 폐쇄 (안전) 아암 (50 x 5 x 15 cm 벽)을 포함하는, 바닥으로부터 1 미터 상승된 회색 플라스틱 십자형 미로로 이루어진다. 적색광 하에 실험을 수행하였다 (7 lux). 마우스를 개방 아암에 직명한 미로의 중앙에 넣고 (폐쇄된 아암으로의 직접 진입을 회피하기 위해) 5분의 지속 기간 동안 탐색하도록 하였다. 실험은 천장 카메라를 사용한 비디오 촬영으로 여러 거동 파라미터를 측정하였다. 각각의 아암에서 소요되는 시간 및 진입 수의 퍼센트는 각각 불안증-유사 거동 및 운동 활동에 대해 측정되었다. 아암으로의 진입은 아암 내부에 모든 4개의 발로서 정의되었다.
결과
ANOVA 분석은 폐쇄된 아암에서 소요되는 시간의 퍼센트에 대한 생 바이오치료학적 치료의 효과가 없음을 밝혔다 [F(3.47)= 0.885; P=0.457; 도 17a]. 개방형 아암에 소요된 퍼센트 시간의 크루스칼 왈리스 (Kruskal Wallis) 비-파라미터 분석은 치료 효과가 없음을 밝혔다 [카이-제곱 = 1.220; df = 3; P = 0.748; 도 17b]. 폐쇄된 아암으로의 진입 수의 ANOVA 어떠한 치료 효과를 밝히지 못했고 [F(3,44)= 1.82; P=0.159; 도 17c], 개방 아암으로의 진입 수의 크루스칼 왈리스 (Kruskal Wallis) 비-파라미터 분석은 어떠한 치료 효과를 밝히지 못했다 [카이-제곱= 2.045; df= 3; P = 0.563; 도 17d].
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 상승된 십자형 미로에서 BTBR 마우스 내 불안증 유사 거동에 대해 어떠한 효과를 갖지 않는다.
실시예 2g - 불안증 유사 거동의 평가 - 개방 필드 무대
합리성
개방 필드 무대를 사용하여 신규 스트레스 환경 및 운동 활동으로의 노출 반응을 평가하기 위해 사용된다. 순수 마우스는 무대의 중앙보다 노출이 적기 때문에 대부분의 시간을 무대의 벽과 함께 자연스럽게 소요한다. 상기 중앙에서 소요되는 지속 시간의 증가는 불안증 유사 거동의 감소를 나타낸다.
방법
마우스는 개별적으로 개방 필드 무대에 위치시키고 (43 x 35 x 25, L x w x h) 10분 동안 탐사하도록 방치한다. 실험은 60 lux의 빛 강도하에 일어났다. 실험은 천장 카메라를 사용하여 비디오 촬영하여 에토비젼 소프트웨어 (Ethovision software)를 사용하는 여러 거동 파라미터를 측정할 수 있다. 이동 거리는 운동 활동에 대해 스코어링하였다.
결과
이동된 거리의 ANOVA는 개방 필드 무대에서 운동 활동에 대한 치료 효과를 밝히지 못했다 [F(3,47)= 0.317; P=0.813; 도 18a 및 도 18d]. 외곽 구역에서 소요되는 시간의 ANOVA는 치료 효과를 밝히지 못했다 [F(3,46)= 2.217; P=0.100; 도 18b]. 그러나, 선행 쌍별 비교 시험은 MRX006 치료 (t=2.791 df=21, p<0.05; 도 18e)가 개방 필드 무대의 외곽 구역에서 소요되는 시간을 감소시킴을 밝혔다. 내곽 구역에서 소용되는 시간의 ANOVA는 치료 효과를 밝히지 못했다 [F(3,46)= 2.217; P=0.100; 도 18c]. 그러나, 선행 쌍별 비교 시험은 MRX006 치료 (t=2.791 df=21; p<0.05; 도 18f)가 개방 필드 무대의 내곽 구역에서 소요되는 시간을 증가시킴을 밝혔다.
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 개방 필드 무대 시험에서 BTBR 마우스에서 불안증 유사 거동을 감소시킨다.
실시예 2h - 우울증 유사 거동의 평가 - 강제 수영 시험
합리성
강제된 수영 시험 (FST)은 항우울증 활성을 평가하기 위해 가장 광범위하게 사용되는 실험 패러다임이다. 순수 동물은 부동 부유 자세에 적응하기 전에 수영, 기어오르기 및 다이빙 형태로 이탈 거동을 나타낼 것이다. 부동의 지속 기간은 거동 절망을 나타낸다. 항우울증 약물은 상기 시험에서 부동 자세에 소요되는 시간을 감소시킨다.
방법
마우스는 23-25℃ 수돗물로 채워진 유리 실린더 (24 x 21 cm)에서 17 cm 깊이까지 6분 동안 수영하도록 강제한다. FST는 천장 카메라로부터 비디오 촬영하였다. 스코어링된 거동 파라미터는 6분 시험의 마지막 4분 동안에 부동능이다.
결과
부동 시간의 ANOVA는 치료의 효과를 밝히지 못했다 [F(3,46)= 1.309; P= 0.284; 도 19].
결론
MXR006을 사용한 만성 치료는 강제 수영 시험에서 BTBR 마우스의 부동 시간에 영향을 미치지 않는다.
실시예 2i - 우울증 유사 거동의 평가 - 암컷 뇨 스니핑 시험
합리성
암컷 뇨 스니핑 시험 (FUST)을 사용하여 설치류에서 무쾌감성 유사 거동을 평가하였다. 스니핑 시간에서의 감소는 사회적 회피/무쾌감성을 시사하고 증가는 사회적 거동/쾌감성 거동에서의 증가를 나타낸다.
방법
실험적 마우스는 시험 1주 전에 단독으로 거주시킨다. 상기 시험 동안에, 멸균수에 침지된 면화 팁 어플리케이터를 홈 케이지에 위치시키고 마우스는 3분 동안 스니프/조사하도록 한다. 3분 시험 후, 면화 팁 어플리케이터를 제거한다. 45분 후, 새로운 면화 팁 어플리케이터는 암컷 뇨 (이들의 주기의 발정기에 있는 동일한 균주의 암컷 마우스로부터 수거된)에 침지시키고, 상기 케이지에 위치시켰다. 마우스는 추가로 3분 동안 이를 스니프/조사하도록 하였다. 물 및 뇨를 스니핑하는데 소요되는 시간의 양을 기록한다.
결과
비히클 그룹에 대해, 스튜던트 t-시험은 물을 스니핑하는데 소요되는 시간에 상대적으로 뇨를 스니핑하는데 소요되는 시간에서 유의적 증가를 밝혔다 [t( 16)=2.611; P=0.0189; 도 2Oa]. 물로의 노출에 대해, 스니핑에 소요되는 시간의 ANOVA는 물 그룹에서 치료 효과를 밝히지 못했다 [F(3,35)= 0.875; P=0.464]. 뇨로의 노출에 대해, 스니핑에 소요되는 시간의 ANOVA는 치료 효과를 밝히지 못했다 [F(3,34)= 2.153; P=0.114]. 그러나, 선행 비교는 MRX006을 사용한 만성 치료(t=3.602 df=16; P= 0.0024)가 비히클 그룹과 비교하는 경우 뇨를 스니핑하는데 소요되는 시간을 증가시킴을 밝혔다.
투 웨이 ANOVA 분석 [뇨: [F(1,36)= 44.118; PO.0001]; 치료: [F(1,36)= 12.335; P=0.001]; 뇨 x 치료: [F(1,36)= 9.236; P=0.005]에 이어서 사후 시험은 MRX006으로 치료받은 마우스가 비히클 그룹과 비교하여 뇨를 스니핑하는데 더 시간을 소요함을 밝혔다 (*p<0.01; 도 20b). 중요하게, 비히클 마우스는 예상된 바와 같이 물 보다 뇨를 스니핑하는데 시간을 보다 소요한다 (#p<0.05).
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 암컷 스니핑 뇨 시험에서 BTBR 마우스에서 암컷 뇨를 스니핑하는데 소요되는 시감을 증가시킨다.
실시예 2j - 우울증 유사 거동의 평가 - 신규 물체 인식 시험
합리성
사용되는 프로토콜은 문헌(참조: Bevins and Besheer (2006))으로부터 채택하였고, 인식 기억을 시험하기 위해 사용되었다. 개선된 기억은 감소된 우울증 유사 거동의 반영이다.
방법
사용되는 프로토콜은 문헌(참조: Bevins and Besheer (2006))으로부터 채택하였다. 이것은 3일에 걸쳐 수행하였다. 1일 째에, 동물을 오버 헤드 카메라가 장착된 대형 용기인 시험 환경에 10분 동안 적응시켰다. 어떠한 베딩 (bedding)도 사용하지 않았고 용기는 각각의 동물 사이에서 70% 에탄올로 닦았다. 2일 째에 동물은 10분 동안 시험 장치에 적응시켰다. 이 기간 후에, 동물을 용기에서 꺼내고 동일한 2개의 동일한 물체를 환경에 도입하였다. 동물을 용기로 복귀시키고 추가로 10 분 동안 탐색하도록 하였다. 물체를 각각의 시험 전에 70% 에탄올로 세정하였다. 훈련 기간 후, 설치류를 24시간 지연 기간 동안 환경으로부터 제거하였다. 3일 째에, 이번에는 이전 날로부터 1개의 친숙한 물체와 1개의 새로운 물체를 포함하는 용기에 복귀시켰다. 2개의 물체와 함께 동물의 활동은 5분 동안 기록하였다. 설치류가 각각의 물체에 대해 탐색하는데 소요되는 시간의 양을 수동 관찰에 의해 기록하였고 총 상호작용 시간에 걸쳐 신규 물체와 상호작용하는에 소요되는 시간에 상응하는 식별 지수 (DI) 값을 생성하였다. 대조군 래트와 비교하여 DI에서의 감소는 상기 유형의 기억 결핍을 지적한다.
결과
그룹 내 스튜던트 t-시험은 신규 물체 인식 시험의 1일 째에 물체 A 또는 B에 대한 사이드-선호도를 밝히지 못했다(도 21 a). 그룹 내 스튜던트 t-시험은 친숙한 물체와 비교하여 신규 물체에 대해 선호도를 밝히지 못했다. 신규 물체에 대해, 상호작용 시간의 ANOVA는 치료 효과를 밝히지 못했다 [F(3,46)= 0.122; P= 0.946; 도 21b]. 추가로, 식별 지수에 대한 치료의 어떠한 효과도 ANOVA 분석에 의해 밝혀지지 않았다 [F(3,47)= 0.535; P =0.661; 도 21c].
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 신규 물체 인식 시험에서 BTBR 마우스 내 인지 거동에 대해 어떠한 효과를 갖지 않는다.
실시예 2k - 생체내 위장관 투과성 검정
합리성
이러한 절차는 생체내 장 운동성을 평가하기 위해 사용된다.
방법
시험 마우스는 단독으로 거주시키고 밤새 단식시켰다. 다음날 아침에 (~9 am), 마우스는 경구 위관영양법에 의해 FITC 덱스트란 (600 mg/kg)을 투여받았다. 2시간 후, 혈액 샘플의 100 μl를 헤파린-처리된 모세관 튜브에 수거하고 어둡게한 에펜도르프에 전달하고 빙상에 위치시켰다. 샘플은 15분 동안 3500 x g에서 원심분리하고, 혈장을 흡인 제거하고 샘플을 장기 보관을 위해 -80℃에 보관하였다.
희석되지 않은 샘플을 사용하여 FITC 농도를 정량하였다. 25 μl의 FITC는 384 웰 플레이트 (Greiner bio one)에서 이중으로 피펫팅하였다. FITC는 490 nm 내지 520 nm의 범위에서 빅터 (Victor) 분광측정기를 사용하여 측정하였다. 표준 곡선을 위해, FITC의 일련의 희석물은 PBS (pH 7.4)에서 제조하였다. 흡광도에서의 증가는 장벽 온전함의 감소를 지적한다.
결과
장 장벽 기능은 형광성 화합물, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC)의 경구 투여를 통해 평가함에 이어서 순차적 꼬리 채혈하여 혈장에서 FITC의 수준을 평가하였다. FITC 농도의 ANOVA는 치료의 유의적 효과를 밝히지 못했다 [F(3,47)= 1.366; P=0.266; 도 23].
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 BTBR 마우스에서 장 투과성에 영향을 미치지 않았다.
실시예 2l - 생체외 위장 투과성 검정
합리성 및 방법
회장 및 결장의 투과성은 어싱 (Ussing) 챔버를 사용하여 생체외 평가하였다. 결장 및 회장은 마우스로부터 절개 제거하고 크렙 완충액을 함유하는 5 mL 튜브에 수거하였다. 결장 및 회장 둘 다는 장간막 라인을 따라 절단되고 어싱 챔버 장치상에 탑재하였다. 결장에 대해, D-글루코스를 함유하는 4 mL의 크렙 용액은 어싱 챔버 장치의 양 측면으로 첨가하였다.
회장에 대해, D-만니톨을 함유하는 4 mL의 크렙 용액은 점막 측면으로 첨가하였고, D-글루코스를 갖는 동일한 용적의 크렙은 장막 측면에 첨가하였다. 챔버를 카보겐 가스 (95% O2 및 5% CO2)로 산소화시키고 37℃에서 유지하여 조직 통합성을 유지한다. 2.5 mg/mL FITC-덱스트린은 점막 챔버에 첨가하였다. 샘플은 0분 시점 (기준선), 60분, 90분 및 120분 시점에서 장막 챔버로부터 취하였다. 25 μl의 FITC는 384 웰 플레이트 (Greiner bio one)에서 이중으로 피펫팅하였다. FITC는 490 nm 내지 520 nm의 범위에서 빅터 (Victor) 분광측정기를 사용하여 측정하였다. 표준 곡선을 위해, FITC의 일련의 희석물은 PBS (pH 7.4)에서 제조하였다.
결과
생체외 장 투과성 검정에서, 반복된 측정 ANOVA는 결장 [F(3,87)= 64.197; PO.0001] 및 회장 [F(3,87)= 34.572; PO.0001] 둘 다에 대한 시간 효과를 밝혔고, 반복된 측정 ANOVA는 결장 [F(9,87)= 1.184; P=0.316; 도 23a] 또는 회장 [F(9,87)= 0.810; P=0.609; 도 22b]에 대한 시간과 관련하여 치료 효과를 밝히지 못했다.
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 결장 또는 회장의 투과성을 영향을 미치지 않는다.
실시예 2m - 생체내 위장 운동 검정
합리성
이러한 절차는 생체내 장 운동성을 평가하기 위해 사용된다.
방법
마우스는 시험 개시 전에 단독으로 거주시킨다. 마우스는 비-흡수성 착색된 염료 (카민 레드 (Carmine Red))를 경구 위관영양법으로 주입하였다. 제1 착색된 배설물 볼러스의 분비에 대한 시간을 기록하고 전체 장의 연동 운동의 지수로서 사용한다.
결과
위관 영양법에 의해 마우스에 비-흡수성 착색된 염료 (카민 레드)를 투여하였다. 제1 착색된 배설물 볼러스의 분비에 대한 시간을 기록하고 전체 장의 연동 운동의 지수로서 사용한다. 운동 시간의 ANOVA는 어떠한 치료 효과를 나타내지 않았고 [F(3,47)= 2.097; P=0.114], 그러나, 선행 쌍별 비교 시험은 MRX006으로 치료된 마우스 (t=2.270 df=22, p<0.05; 도 24)가 비히클 그룹과 비교하는 경우 변화된 장 운동을 나타냄을 밝혔다.
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 BTBR 마우스에서 감소된 장 운동을 보여주었다.
실시예 2n - 스트레스-유도된 순환 코르티코스테론 결정
합리성
FST로의 노출은 HPA 축의 강한 활성화를 유도하고 스트레스 호르몬인 코르티코스테로이드의 수준이 증가한다. FST로의 노출 전 및 후에 취해진 혈장 코르티코스테론 농도는 시상하부 뇌하수체 부신 (HPA) 축의 스트레스 유도된 활성화의 지수로서 사용하였다.
방법
FST의 날에, 마우스는 이들의 홈-케이지로부터 꺼내고 기저 혈액 샘플이 채취된 수술방으로 이동시켰다. 메스 블레이드 (scalpel blade)를 사용하여 꼬리의 맨 끝 (1 mm)을 제거하였다. 혈액은 헤파린화된 모세관 튜브를 사용하여 수거하고 이어서 미세원심분리 튜브에 전달하였다. 혈액 샘플은 또한 FST로의 노출 후 30, 60, 90 및 120분에 취하여 피크 및 회수 코르티코스테로이드 수준에 대해 평가하였다. 혈액은 빙상에서 유지시키고 이어서 4℃에서 15분 동안 2,500 x g에서 원심분리하였다. 혈장 농도는 판매 지침 (ENZO Corticosterone ELISA, ADI-900-097, Enzo Life Sciences)에 따라 ELISA에 의해 평가하였다.
결과
반복적인 측정 ANOVA는 시간의 유의적인 효과를 밝혔다 [F(4,164)= 127.127; PO.0001; 도 25]. 사후 비교는 모든 그룹에 대해 30분 시점에서 순환 농도에서 유의적인 증가를 밝혔다. 반복되는 측정 ANOVA는 시간과 관련하여 치료의 유의적 효과를 밝히지 못했다 [F(12,164)= 0.561; P=0.871].
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 강제 수영 시험에 노출된 BTBR 마우스에서 스트레스 유도된 코르티코스테론 수준에 영향을 미치지 않는다.
실시예 2o - 기관 중량 및 결장 길이
체중의 퍼센트로서 기관 체중의 ANOVA는 부신 [F(3,44)= 1.480; P=0.234; 도 26a], 비장 [F(3,43)= 0.779; P=0.513; 도 26b] 또는 맹장 [F(3,44)= 0.441; P=0.725; 도 26c]에 대한 치료 효과를 밝히지 못했고, 결장 길이의 ANOVA는 치료의 효과를 밝히지 못했다 [F(3,46)= 0.826; P=0.487; 도 26d].
결론
MRX006을 사용한 치료는 선택적 해부학적 마커에 영향을 미치지 않는다.
실시예 2p - 중량 모니터링
동물 체중은 어느 세균 균주가 상기 특정 파라미터에 영향을 미치는지를 결정하기 위해 실험 지속 기간 동안 주당 1회 평가하였다. 반복적인 측정 ANOVA는 시간의 유의적인 효과를 밝혔다 [F(11,484)= 111.217; P< 0.0001; 도 27]. 반복적인 측정 ANOVA는 시간과 관련하여 치료 효과를 밝히지 못했다 [F(33,484)= 0.581; P=0.971],
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 BTBR 마우스에서 체중에 영향을 미치지 않는다.
BTBR 마우스 모델로부터의 결론
연구의 주요 발견은 MRX006을 사용한 치료가 고정관념 및 불안증-관련된 거동을 약화시킴을 밝혔다. 구체적으로, MRX006은 동물이 털 손질에 소비하는 시간의 양을 감소시킬 뿐만 아니라 구슬 매장 시험에 매장된 구슬의 수를 감소시켰다. 더욱이, 이러한 생 바이오치료제를 사용한 치료는 개방 필드의 중앙에서 소요되는 시간의 양을 증가시켰고 이는 주변에서 소요하는 시간 양의 감소에 상응하고 이는 불안 완화 유사 효과를 지적한다. 그러나, 불안증 유사 거동에 대한 효과는 상승되는 십자형 미로 시험에 서 관찰되지 않았다. BTBR 마우스에서 고정관념 및 불안증 관련 거동을 개선시키는 MRX006의 능력은 전망이 있고 이것이 효과적인 치료제일 수 있음을 지적한다.
MRX006은 또한 암컷 마우스로부터 뇨를 스니핑하는데 소요되는 시간을 증가시켰다. 암컷 뇨 스니핑 시험은 설치류에서 본래에 쾌감성 유사 거동을 평가하기 위해 디자인되었고 뇨의 스니핑에 소요되는 시간의 증가는 보상 탐색 거동의 증가로서 해석된다(참조: Malkesman et al, 2010). BTBR 마우스가 우울증 유사 표현형을 나타내는 것으로 보고되지 않는다면, MRX006으로 치료 후 현재 실험에서 뇨를 스니핑하는데 소요되는 시간에서의 관찰된 증가가 쾌감성 거동에서의 개선을 반영하는 것 같지 않다. 차라리 이것은 이들 마우스가 MRX006이 사회적 정보 (즉 암컷 페로몬)을 인지하고 가공하는 능력을 증가시킨다는 것일 수 있다. 그러나, 그룹 중에서 사회적 거동에서의 어떠한 차이가 3 챔버 시스템 및 사회적 상호작용 시험에서 관찰되지 않았다. MRX006을 사용한 치료는 동종의 친숙한 것에 상대적으로 동종의 신규 마우스를 조사하는데 소요하는 시간의 양을 감소시켰다.
장 운동을 제외하고는, 현재 연구에서 평가된 생 바이오치료제는 측정된 여러 생리학적 파라미터에 영향을 주지 않았다. 예를 들어, 생 바이오치료제의 어떠한 효과도 스트레스 유도된 코르티코스테론 분비, 해부학적 중량, 장 투과성 또는 총 체중에서 관찰되지 않았다. 장 운동 검정에서, MRX006을 사용한 치료는 제1의 적색 펠렛이 카민 적색 염료를 사용한 경구 위관영양법 후 나타나도록 하는데 소요되는 시간을 연장시켰다. 상기 결과는 MRX006이 장 운동을 연장시킴을 시사한다.
실시예 3 - 모계 면역 활성화 (MIA) 마우스 모델
MIA 마우스 모델은 자손의 자폐 스펙트럼 장애의 핵심 증상을 유발하기 위해 임신 마우스에서 환경 면역 챌린지를 사용한다. MIA 마우스는 전형적으로 (털 손질 및 구슬 매장 테스트에 의해 나타난 바와 같이) 고정관념 거동 및 사회적 의사 소통의 결핍 (사회적 놀이, 3-챔버 사회적 상호작용 및 음식 선호도 시험의 사회적 전달에 의해 나타나는 바와 같이)을 나타낸다. 자손은 자폐증의 3가지 핵심 증상 (소통 감소; 사회성 감소; 반복 또는 고정 관념 거동 증가)을 나타내므로 치료제의 투여가 자폐 스펙트럼 장애와 관련디고 다수의 많은 신경학적 장애에서 거동 표현형을 완화할 수 있는지의 여부를 결정하는데 적합한 모델을 제공한다. 동물 모델에서 거동 표현형의 변화는 근본적인 생물학적 또는 생리학적 기전에 대한 이해와 상관없이 잠재적으로 임상적으로 관련된 중재를 나타낸다는 것이 잘 확립되어있다 (참조: Crawley 2012).
실시예 3a - MIA 마우스 모델을 위한 재료 및 방법
마우스
모계 면역 활성화 (환경적 ASD 마우스 모델) 프로토콜은 이전에 기재된 바와 같이 수행되었다(참조: Hsiao, McBride 등 2013). 간단하게, 임신한 C57BL/6N 마우스(ENVIGO, UK)에 문헌(참조: Hsiao, McBride 등 2013)에 기재된 방법에 따라 식염수 또는 20 mg/kg 폴리(I:C)로 E12.5 상에서 i.p. 주사하였다. 이들 마우스는 MIA 마우스로서 하기 실험에 열거되어 있다. 수컷 마우스는 8주령에서 거동을 개시하였다. 동물을 12시간 암주기상에서 온도- 및 습도- 제어실 (7:00부터 19:00까지 점등)에 거주시켰다. 모든 실험은 유럽 지침 2010/63/EEC, 2012년 S.I. No. 543의 요건에 따라 수행되었으며 대학 (University College Cork)의 동물 실험 윤리위원회의 승인되었다.
종 (Strain)
MRX006: 블라우티아 스테르코리스 (Blautia stercoris) 세균은 수탁 번호 NCIMB 42381로 기탁되었다.
생 바이오치료제는 혐기적 조건하의 설비에서 성장시켰다.
생 바이오칠제 투여
마우스가 8주령인 경우 MRX006 또는 비히클을 사용한 투여를 개시하였다. 이들 마우스는 거동 배터리의 개시 전에 3주 동안 MRX006 또는 포스페이트 완충 용액 (PBS)으로 하루 1회 치료하였다. 마우스는 거동 배터리 동안에 5주 동안 하루 1회 추가로 치료하였다. MRX006 (1 x 107 내지 1 x 109 CFU 경구 투여)은 투여 전 PBS 중에 용해시켰다.
투여 스케줄
상기 연구를 위한 치료 그룹은 하기에 나타낸다. 경구 투여용 비히클은 PBS이고 하루 경구 투여는 경구 위관영양법을 통해 일어난다.
배설물 수거
새로운 배설물 샘플을 종료 때까지 매주 개별 마우스로부터 수거하였다. 적어도 20 mg의 새로운 배설물은 소형 원심분리기 튜브에 넣고 즉시 빙상에 위치시킴에 이어서 -80℃에서 보관하였다.
실험 디자인 및 방법
상기 명시된 바와 같이, MRX006 또는 비히클을 사용한 투여는 마우스가 8주령이 된 경우 개시하였다. 거동 배터리는 다음 순서로 수행하였다: 4 주차 개방 필드 무대, 5 주차 구슬 매장 시험; 6 주차에 음식 선호도 시험의 사회적 전달, 7 주차에 암컷 뇨 스니핑 시험. 카민 레드 위장 운동 검정 및 위장 침투성 검정 꼬리 출혈은 각각 7 및 8주째 동안에 일어났다. 최종적으로, 9주에, 마우스는 비장 세포 자극을 위해 죽이고 회장 및 결장에서 FITC의 생체외 측정을 하였다.
위장 파라미터 (투과성 및 운동성)와 함께 고정 관념의 사회적 및 우울증 유사 거동에 대한 MIA 모델에서 생 바이오치료제 치료의 효과는 하기의 실시예에서 개요를 기재한다.
상기 표에 나열된 그룹 2는 모계 면역 활성화 마우스를 나타내며, 모체는 임신 중에 폴리 (I:C)로 처리하였다. 이들 마우스는 대조군 마우스 (그룹 1)와 비교하여 자폐 스펙트럼 장애와 관련된 표현형을 보여줄 것으로 예상된다-상기 대조군은 폴리 (I:C) 투여가 모계 마우스 자손에서 예상되는 거동 증상을 유발하도록 한다. 자폐증 스펙트럼 장애의 거동 증상에 대한 임의의 치료 효과는 그룹 2와 그룹 3 간의 차이에 의해 확인된다.
그래프 디자인 및 통계학적 분석
모든 그래프는 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (버젼 5) 상에서 생성하였다. 데이터는 IBM SPSS 통계 22.0 (EEUU)을 사용하여 분석하였다. 데이터 분포는 콜모고로브-스미르노브 (Kolmogorov-Smirnov) 정규성 시험을 사용하여 분석하였다. 비히클 그룹 대 MRX006 그룹을 비교하는 데이터는 원-웨이 ANOVA 및 피셔 최소 유의성 차이 (LSD) 사후 (post hoc) 시험을 사용하여 분석하였다. ANOVA가 유의적인 치료 효과를 나타내지 않으면, 대조군에 대한 선행 쌍별 비교 시험을 수행하였다. 비-정상적으로 분포된 데이터는 크루스칼-왈리스 (Kruskal-Wallis) 및 비-파라미터 만-휘트니 U 시험 (Mann-Whitney U test)에 의해 분석하였다. P < 0.05는 통계학적 유의성에 대한 기준이었다.
실시예 3b - 고정관념의 거동의 평가 - 구슬 매장 시험
합리성
상기 시험은 반복적이고, 강박 및 불안 거동에 대해 평가한다. 매장된 보다 높은 수의 구슬은 보다 높은 불안 또는 고정관념 거동을 지적한다. 불안 완화제와 같은 약리학적 제제로 치료받은 마우스는 대조군 마우스와 비교하여 감소된 구슬 매장 거동을 보여준다.
방법
마우스는 신규 폴리프로필렌 케이지 (35 x 28 x 18.5 cm, L x W x H)에 넣고, 상기 케이지는 표준 설치류 (단단한 목재) 베딩 (5 cm) 및 이의 위에 20개 구슬 (5개 열의 구슬이 규칙적으로 벽으로 부터 2 cm 이격된 공간에 위치하고 2 cm 격리되어 있다)을 함유한다. 실험은 1000 lux의 빛 강도하에 수행하였다. 30분 후, 마우스를 이들 케이지로부터 꺼내고 이들의 표면의 2/3 rds 초과에 대해 매장된 구슬의 수를 스코어링하였다.
결과
대조군 그룹과 비히클 MIA 그룹 사이의 스튜던트 t-시험 분석은 비히클 MIA 마우스가 대조군 그룹과 비교하여 더 많은 구슬을 매장함을 밝혔다 (t(21) = 2.751, P = 0.011; 도 28). 매장된 구슬의 수의 ANOVA는 치료의 중요한 효과를 밝혔고 [F(3,48) = 18.39; P <0.001], 사후 비교는 MRX006으로의 만성 치료가 매장된 구슬의 수를 감소 시켰음을 밝혔다(p <0.01;도 28).
결론
비히클 MIA 그룹은 대조군 그룹보다 유의적으로 구슬이 매장되고, 이는 MIA 모델이 마우스에서 자폐 스펙트럼 장애-유사 증상을 성공적으로 유발했음을 나타낸다. MRX006을 사용한 만성 치료는 MIA 마우스에서 반복적이고 강박적이며 불안한 거동을 감소시킨다.
실시예 3c - 사회적 거동의 평가 - 음식 선호도의 사회적 전달
합리성
사회적 전달 음식 선호도는 마우스에서 사회적 거동을 평가하는데 사용되는 후각 기억의 관련 시험이다. 상기 시험에서 관찰자 마우스는 최근에 새로운 음식을 섭취한 입증자 마우스와 상호작용한다. 관찰자 마우스가 입증자가 섭취한 음식과 일부 다른 신규 음식 사이간의 선택이 제공되는 경우, 관찰자 마우스는 입증자가 먹는 음식을 선호해야한다. 감소된 음식 선호도는 감소된 사회성을 지적한다.
방법
본 시험은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(참조: Desbonnet, Clarke 등 2015). 간략하게, 시험 18시간 전에, 마우스에서 음식을 제거하는 반면, 물은 임의로 이용할 수 있다. 음식 선택은 분쇄된 마우스 저작물로 만들어진 1% 분쇄된 계피 또는 2% 분쇄된 코코아로 로 구성되었다. 각각의 케이지로부터 입증자 마우스를 무작위로 선택하였고, 이후 사회적 상호 작용 동안 동정을 가능하게하기 위해 꼬리를 파란색 마커로 표시하였다. 입증자 음식 컨테이너는 1시간 샘플링 탐색 전 및 후에 입증자 음식 컨테이너를 1시간 샘플링 후에 칭량하였다. 최소 0.2 g의 소비된 음식은 시험에 포함시키기 위해 요구되었다. 입증자 마우스를 케이지-메이트와 30분의 상호작용 기간 동안 각각의 홈 케이지에 다시 복귀시켰다. 후속적으로, 케이지-메이트를 신호 음식 또는 신규 음식의 선호도에 대해 개별적으로 시험하였다. 컨테이너는 각각의 선택 세션 직전 및 직후에 칭량하였다. 이어서 관찰된 마우스를 각각의 홈 케이지에 다시 복귀시키고 선택 세션을 24시간 후에 반복하였다. 시험 마우스는 입증자 마우스에서 계피 또는 코코아 냄새를 사회성 신호로 사용하고 두 가지 중에서 선택하는 경우 우선적으로 동일한 음식을 선택해야한다.
결과
퍼센트 음식 선호도의 스튜던트 t-시험은 0 시간 (t(22) = 0.3325, P = 0.7427) 또는 24시간 (t(21) = 0.2878, P = 0.7763) 평가에서 대조군과 비히클 MIA 그룹 간에 차이가 없음을 밝혔다. 입증자 신호 음식 선호도의 ANOVA는 관찰자가 0 시간에 음식 선택에 노출되었을 때 유의적인 차이를 나타내지 않았다 [F(3,48) = 1.49, P = 0.228; 도 29a] 또는 24시간 평가 [F(3,47) = 2.66, P = 0.059; 도 29b]. MRX006을 사용한 치료는 음식 선호도 시험의 사회성 전달에서 신호 음식에 대한 선호도를 변화시키지 않았다.
결론
비히클 MIA 그룹은 감소된 사회성 전달 음식 선호도를 나타내지 않았고 (MIA 비히클은 대조군과 비교하여 음식 선호도에 변화가 없음을 나타냄), 이는 MIA 모델이 감소된 사회성 표현형을 유발하지 않았음을 시사한다. MRX006을 사용한 만성 치료는 음식 선호도에 효과를 갖지 않았다. 그러나, MIA 모델이 본 시험에서 감소된 사회성 표현형을 야기하지 않은 것으로 보이므로, 음식 선호도 시험의 사회적 전달에서 사회성에 대한 MRX006으로의 만성 치료의 효과를 결정할 수는 없다.
실시예 3d - 불안증 유사 거동의 평가 - 개방 필드 무대
합리성
개방 필드 무대를 사용하여 신규 스트레스 환경 및 운동 활동으로의 노출 반응을 평가하기 위해 사용된다. 순수 마우스는 무대의 중앙보다 노출이 적기 때문에 대부분의 시간을 무대의 벽과 함께 자연스럽게 소요한다. 상기 중앙에서 소요되는 지속 시간의 증가는 불안증 유사 거동의 감소를 나타낸다.
방법
마우스는 개별적으로 개방 필드 무대에 위치시키고(43 x 35 x 25, L x w x h) 10분 동안 탐사하도록 방치한다. 실험은 60 lux의 빛 강도하에 일어났다. 실험은 천장 카메라를 사용하여 비디오 촬영하여 에토비젼 소프트웨어 (Ethovision software)를 사용하는 여러 거동 파라미터를 측정할 수 있다. 이동 거리는 운동 활동에 대해 스코어링하였다.
결과
스튜던트 t-시험은 대조군과 비히클 MIA 그룹 사이에서 이동 한 총 거리에서 유의적인 차이를 나타내지 않았다 (t(22) = 0.9357, P = 0.3596). 이동한 총 거리의 ANOVA는 치료의 유의적인 효과를 밝혔다 [F(3,47) = 4.36, P = 0.003, 도 30a]. 사후 비교는 MRX006으로의 처리가 비히클 처리된 동물에 비해 이동한 총 거리를 감소시켰을 밝혔다(p <0.05). 스튜던트 t-검정은 대조군과 비교하여 비히클 MIA 그룹에 의해 개방 필드의 외곽 구역에서 소요된 시간의 현저한 증가를 밝혔다 (t(21) = 3.337, P = 0.003). 개방 필드의 외곽 구역에서 소요된 시간의 ANOVA는 치료 효과가 없음을 밝혔다 [F(3,47) = 0.093, 도 30b]. 스튜던트 t-검정은 대조군 마우스와 비교하여 비히클 MIA 그룹에 의해 내곽 구역에서 소요된 시간의 상당한 감소를 밝혔다 (t(21) = 3.337, P = 0.003). 내곽 구역에서 소요된 시간의 ANOVA는 치료 효과가 없음을 밝혔다 [F(3,47) = 0.93, P = 0.96, 도 30c].
결론
MRX006을 사용한 치료는 개방 필드 무대에서 MIA 마우스가 이동하는 거리를 감소시킨다. 따라서, MRX006은 개방 필드 무대에 노출되어 유발되는 스트레스 유도된 운동 활동을 약화시킬 수 있다.
실시예 3e - 우울증 유사 거동의 평가 - 암컷 뇨 스니핑 시험
합리성
암컷 뇨 스니핑 시험 (FUST)을 사용하여 설치류에서 무쾌감성 유사 거동을 평가하였다. 스니핑 시간에서의 감소는 사회적 회피/무쾌감성을 시사하고 증가는 사회적 거동 쾌감성 거동에서의 증가를 나타낸다.
방법
실험적 마우스는 시험 1주 전에 단독으로 거주시킨다. 상기 시험 동안에, 멸균수에 침지된 면화 팁 어플리케이터를 홈 케이지에 위치시키고 마우스는 3분 동안 스니프/조사하도록 한다. 3분 시험 후, 면화 팁 어플리케이터를 제거한다. 45분 후, 새로운 면화 팁 어플리케이터는 암컷 뇨 (이들의 주기의 발정기에 있는 동일한 종의 암컷 마우스로부터 수거된)에 침지시키고, 상기 케이지에 위치시켰다. 마우스는 추가로 3분 동안 이를 스니프/조사하도록 하였다. 물 및 뇨를 스니핑하는데 소요되는 시간의 양을 기록한다.
결과
맨-휘트니 U-시험 (Mann-Whitney U-test)은 대조군 [맨-휘트니 U 값 = 7, P = 0.0123]과 비히클 MIA [맨 휘트니 U 값 = 57; P = 0 0201] 그룹은 물보다 뇨를 스니핑하는데 더 많은 시간을 소요하였다(도 31). 뇨를 스니핑하는데 소요된 시간 동안, 크루스칼-왈리스 (Kruskal-Walli) 비-파라미터 분석은 치료 효과를 나타내지 않았다 [df = 4, P = 0.3293].
결론
MRX006을 사용한 만성 치료는 암컷 스니핑 뇨 시험에서 MIA 마우스의 우울증 유사 거동에 영향을 미치지 않는다.
실시예 3f - 생체내 장 운동 검정
합리성
MIA 모델은 소화관 장벽 기능을 변화시키는 것으로 보고되었다. 따라서, 바이오치료제를 사용한 만성 치료가 장 운동성을 변화시키는지 확인하는 것이 중요하였다.
방법
마우스는 시험 개시 전에 단독으로 거주시킨다. 마우스는 비-흡수성 착색된 염료 (카민 레드(Carmine Red))를 경구 위관영양법으로 주입하였다. 제1 착색된 배설물 볼러스의 분비에 대한 시간을 기록하고 전체 장의 연동 운동의 지수로서 사용한다.
결과
스튜던트 t-시험 분석은 비히클 MIA 그룹이 대조군 그룹과 비교할 때 변화된 장 운동 (적색 펠렛이 더 적은 시간 내에 검출 됨)을 나타내지 않음을 밝혔다 (t(22) = 0.006, P = 0.9950). 이동 시간의 ANOVA는 치료의 효과를 밝히지 못했다 [F(3,50)= 0.99; P= 0.404; 도 32].
결론
본 실험에서, 비히클 MIA 그룹은 대조군과 비교하여 변화된 장 운동성을 나타내지 않았다. MRX006을 사용한 만성 치료는 대조군 또는 비히클 MIA 그룹과 비교하여 장 운동성에 영향을 미치지 않았다.
실시예 3g - 기관 중량 및 결장 길이
결장 길이에 대해, 스튜던트 t-시험은 비히클 MIA와 대조군 그룹 간에 유의적인 차이를 나타내지 않았다 (t(21) = 1.26, P = 0.26). 길이의 결장의 ANOVA는 치료의 효과를 밝히지 못했다 [F(3,49)= 0.69; P=0.57; 도 33a]. 체중의 퍼센트로서 맹장 중량에 대하여, 스튜던트 t-시험은 비히클 MIA와 대조군 간의 유의적인 차이를 밝히지 못했다 (t(22) = 0.56, P = 0.58). ANOVA는 맹장 중량에 대한 치료의 유의적 효과를 나타내지 않았다 [F(3,48)=0.84, P=0.48, 도 33b]. 체중의 퍼센트로서 비장 중량에 대하여, 스튜던트 t-시험은 비히클 MIA와 대조군 간의 유의적인 차이를 밝히지 못했다 (t(22) = 0.64, P = 0.53). ANOVA는 비장 중량에 대한 치료의 유의적인 효과를 밝히지 못했다 [F(3,48) = 2.25, P = 0.09, 도 33c).
결론
MRX006을 사용한 치료는 자폐증의 MIA 마우스 모델에서 결장 길이 또는 기관 중량에 영향을 주지 않는다.
MIA 마우스 모델로부터의 결과 논의
MRX006을 이용한 만성 치료는 MIA 마우스에서 구슬 매장 시험에서 관찰된 표현형을 역전시킬 수 있었다. MRX006을 사용한 만성 치료는 매장된 구슬의 수를 감소시킬 수 있었고, 이는 고정관념 유사 거동에서의 감소를 시사한다. 또한, MRX006을 사용한 만성 치료는 개방 필드 무대의 내곽 및 외곽 구역에서 소요된 시간에 어떠한 영향을 미치는 것 없이 이동 거리를 감소시켰다. 결과적으로, MRX006을 사용한 치료는 개방 필드 무대에 노출됨으로써 유발되는 스트레스 유도된 운동 활동을 약화시킬 수 있다. 사회적 전달 음식 및 암컷 뇨 스니핑 시험에서 어떠한 유의적인 치료 효과는 관찰되지 않았고, 이는 MIA 마우스 모델에서 사회적 및 우울증 유사 거동에 직접적인 관찰 가능한 효과가 없음을 시사한다. 시험된 생 바이오치료제는 장 운동성 또는 투과성에 영향을 주지 않았다. 따라서 MIA 모델은 고정 관념 유사, 반복 및 불안 거동을 평가하는데 유용한 것으로 입증되었지만 자폐 스펙트럼 장애와 관련된 다수의 다른 증상을 재현하지는 못했다. 그럼에도 불구하고, 상기 결과는 MRX006을 사용한 만성 치료가 자폐증 스펙트럼 장애의 증상에 대해 양성 영향을 가질 수 있음을 나타낸다.
자폐증 스펙트럼 장애의 치료에서 MRX006에 관한 전체 결론
MRX006은 BTBR 및 MIA 마우스 모델 둘 다에서 고정 관념 및 불안증 유사 거동의 치료에 효과적인 것으로 나타났다. 자폐증의 마우스 모델에서 거동 및 생물학적 표현형을 역전시키는 치료요법은 인간 질병에 대해 효과적일 것으로 예상된다.
자폐증 스펙트럼 장애의 치료를 위한 의학 제품의 임상적 개발에 대한 EMA 가이드라인은 질환의 이종성으로 인해, 단일 화합물을 사용한 모든 핵심 증상들에 대한 유의적 효과를 성취할 수 없고 따라서 단기 효능은 적어도 하나의 핵심 증상에 대해 입증되어야만 함을 기재하고 있다. MRX006 생 바이오치료제는 자폐 스펙트럼 장애의 적어도 하나의 핵심 증상의 효과적인 치료를 보여주었고, 따라서 이에 관련된 블라우티아 (Blautia) 및 비. 스테르코리스 (B. stercoris) 균주는 인간 질병에 효과적일 것으로 예상된다. 유사하게, 다른 중추 신경계 장애 또는 병태는 다수의 상이한 증상과 함께 복합 병리를 나타내고 거의 거의 승인된 치료법이 없다. 따라서, 효과적인 치료는 중추 신경계 장애 또는 병태의 모든 증상을 치료할 필요가 없는 것으로 이해된다. 치료는 이것이 중추 신경계 장애 또는 병태와 연관된 증상들 중 하나를 치료하는 경우 치료학적으로 유용한 것으로 고려된다.
실시예 4 - BTBR 마우스에서 순환 사이토킨의 측정
방법 및 결과
혈장은 실험 종료시 각각의 동물로부터 쿨링 (cull) 당일 트렁크 혈액으로부터 수거하였다. 순환 사이토킨은 시판되는 전기 화학 발광 멀티플렉스 시스템 (MSD, Galthersberg, MSD, USA)을 사용하여 비히클 및 MRX006 그룹의 혈장 샘플에서 평가하였다. 하기의 사이토킨은 하기에 대해 검정하였다: IL-1β, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, IL-21, IL-23, TNF-α 및 IFN-γ. 멀티플렉스 분석은 IL-1β, IL-4, IL-17A, IL-21 및 IL-23의 수준이 비히클 및 MRX006 처리된 동물 둘 다에서 검출 한계 미만임을 밝혔다. 순환 TNF-α에 대해, 스튜던트 t-검정은 MRX006을 사용한 치료의 유의적인 효과를 밝히지 못했다 (t(21) = 0.4264, P = 0.6742, 도 34a). 순환 IFN-에 대해, 스튜던트 시험은 Mrx006을 사용한 치료의 유의적인 효과를 밝히지 못했다 (t(17) = 0.4103, P = 0.6867,도 34b). 순환 IL-6에 대해, 스튜던트 t-시험은 MRX006을 사용한 치료의 유의적인 효과를 밝히지 못했다 (t(11) = 0.020, P = 0.98, 도 34c). 순환 IL-10에 대해, MRX006을 사용한 만성 치료는 IL-10 수준에서 비-유의적인 증가를 유발한다 (t (13) = 1.396, P = 0.1861, 도 34d).
결론
순환 사이토킨 농도의 조절에 있어서 MRX006의 유의적인 효과는 없었지만, 생 바이오치료제를 사용한 치료 후 순환 IL-10의 증가에 대한 명백한 비유의적인 경향이 있었다. 이러한 결과는 MRX006이 면역 조절 성질을 갖고 항-염증성 사이토킨의 생성을 증가시킬 수 있음을 시사한다. 멀티플렉스 검정은 기저의 자극되지 않은 사이토킨 농도를 함유한 혈장 샘플에 대해 수행되었지만, MRX006이 자극된 조건 하에서 IL-10 및 다른 사이토킨을 조절할 수 있는지의 여부를 평가하는 것은 흥미로울 것이다.
실시예
5 -
C57BL
/6 마우스에서 중추 및 말초 옥시토신 수준에 대한
MRX006을
사용한 준임상 치료 효과의 평가
세균 균주를 제조하고 상기 실시 예에 명시된 바와 같이 투여 하였다. C57BL/6 마우스를 각각 10-12마리 마우스로 7개의 실험 치료 그룹에서 6일 동안 생 바이오치료제로 치료하였다. 후속적으로, 시상 하부를 마우스로부터 절개하고 시상 하부의 옥시토신 수준을 방사선 면역검정 (RIA)에 의해 검출하고, 또한 혈장 중의 옥시토신의 수준을 RIA에 의해 검출하였다. 또한, 옥시토신 수용체, 인터루킨 및 기타 염증성 마커 및 바소프레신 호르몬의 수준은 RIA 및 다른 분석학적 방법에 의해 검출되었다.
실시예 6 - 안정성 시험
본원에 기재된 적어도 하나의 세균 균주를 함유하는 본원에 기재된 조성물은 25℃ 또는 4℃에서 밀봉된 컨테이너에 저장하고, 컨테이너는 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90% 또는 95% 상대 습도를 갖는 대기에 위치시킨다. 1개월, 2개월, 3개월, 6개월, 1년, 1.5년, 2년, 2.5년 또는 3년 후에도 세균 균주의 최소 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%가 표준 프로토콜에 의해 결정된 콜로니 형성 단위로 측정된 바와 같이 남아있다.
실시예 7 - MIA 마우스 모델에서 또 다른 생 바이오치료제의 투여
실시예 7a - MIA 마우스 모델을 위한 재료 및 방법
본 실시예에서 사용된 마우스, 생 바이오치료제 투여 및 배성물 수거는 상기 실시예 3에서 사용된 것들과 동일하다.
균주 (Strain)
MRX008: 블라우티아 웩슬레라 (Blautia wexierae) 세균은 수탁 번호 NCIMB 42486으로 기탁되었다.
투여 스케줄
상기 연구를 위한 치료 그룹은 하기에 나타낸다. 경구 투여용 비히클은 PBS이다. 하루 경구 투여는 경구 위관영양법을 통해 수행한다.
실험 디자인 및 방법
마우스가 8주령인 경우 MRX008 또는 비히클을 사용한 투여를 개시하였다. 거동 배터리는 다음 순서로 수행하였다: 5주차에 구슬 매장 시험; 6주차에 음식 선호도의 사회적 전달 및 8주차에 강제 수영 시험. 카민 레드 위장 운동 검정 및 위장 침투성 검정 꼬리 출혈은 각각 7 및 8주째 동안에 일어났다. 최종적으로, 9주 째에, 마우스는 비장 세포 자극을 위해 죽이고 회장 및 결장에서 FITC의 생체외 측정을 하였다.
위장 파라미터 (투과성 및 운동성)와 함께 고정 관념의 사회적 및 우울증 유사 거동에 대한 MIA 모델에서 생 바이오치료제 치료의 효과는 하기의 실시예에서 개요를 기재한다.
상기 표에 나열된 그룹 2는 모계 면역 활성화 마우스를 나타내며, 모체는 임신 중에 폴리 (I:C)로 처리하였다. 이들 마우스는 대조군 마우스 (그룹 1)와 비교하여 자폐 스펙트럼 장애와 관련된 표현형을 보여줄 것으로 예상된다-상기 대조군은 폴리 (I:C) 투여가 모계 마우스 자손에서 예상되는 거동 증상을 유발하도록 한다. 자폐증 스펙트럼 장애의 거동 증상에 대한 임의의 치료 효과는 그룹 2와 그룹 3 간의 차이에 의해 확인된다.
그래프 디자인 및 통계학적 분석
모든 그래프는 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (버젼 5) 상에서 생성하였다. 데이터는 IBM SPSS 통계 22.0 (EEUU)을 사용하여 분석하였다. 데이터 분포는 콜모고로브-스미르노브 (Kolmogorov-Smirnov) 정규성 시험을 사용하여 분석하였다. 비히클 그룹 대 MRX008 그룹을 비교하는 데이터는 원-웨이 ANOVA 및 피셔 최소 유의성 차이 (LSD) 사후 (post hoc) 시험을 사용하여 분석하였다. ANOVA가 유의적인 치료 효과를 나타내지 않으면, 대조군에 대한 프리온 쌍별 비교 시험을 수행하였다. 비-정상적으로 분포된 데이터는 크루스칼-왈리스 (Kruskal-Wallis) 및 비-파라미터 만-휘트니 U 시험 (Mann-Whitney U test)에 의해 분석하였다. P < 0.05는 통계학적 유의성에 대한 기준이었다.
실시예 7b - 고정관념의 거동의 평가 - 구슬 매장 시험
합리성 및 방법
상기 실시예 3b를 참조한다.
결과
대조군 그룹과 비히클 MIA 그룹 사이의 스튜던트 t-시험 분석은 비히클 MIA 마우스가 대조군 그룹과 비교하여 더 많은 구슬을 매장함을 밝혔다 (t(19) = 3.00, P = 0.007; 도 35). 매장된 구슬의 수의 ANOVA는 치료 효과를 밝혔고 [F(3,42) = 6.37, P = 0.001], MRX008을 사용한 만성 치료는 비히클 MIA 그룹에 비해 매장된 구슬의 수가 감소함을 보여주었다.
결론
비히클 MIA 그룹은 대조군 그룹보다 유의적으로 구슬이 매장되고, 이는 MIA 모델이 마우스에서 자폐 스펙트럼 장애-유사 증상을 성공적으로 유발했음을 지적한다. MRX008을 사용한 만성 치료시 MIA 마우스에서 반복적이고 강박적이며 불안한 거동이 감소하는 경향이 있다.
실시예 7c - 사회적 거동의 평가 - 음식 선호도의 사회적 전달
합리성 및 방법
상기 실시예 3c를 참조한다.
결과
입증자 신호 음식 선호도의 ANOVA는 비히클 또는 MRX008 투여에 상관 없이, 관찰자가 입증자 상호 작용 (T0) 직후에 (F(3,34) = 0.38, P = 0.77; 도 36a) 또는 24 시간 후에 (F(3,34)=0.85, P=0.48; 도 36b) 음식 선택에 노출된 경우 어떠한 유의적 차이를 밝히지 못했다.
결론
비히클 MIA 그룹은 감소된 사회성 전달 음식 선호도를 나타내지 않았고 (MIA 비히클은 대조군과 비교하여 음식 선호도에 변화가 없음을 나타냄), 이는 MIA 모델이 감소된 사회성 표현형을 유발하지 않았음을 시사한다. 따라서, MIA 마우스 모델을 사용한, MRX008에 의한 만성 치료가 사회성에 미치는 효과를 결정할 수 없다.
실시예 7d - 우울증 유사 거동의 평가 - 강제 수영 시험
합리성
강제 수영 시험 (FST)은 항우울제 활동을 평가하기 위해 가장 널리 사용되는 실험 패러다임이다([57]). 상기 시험에서, 마우스는 6분 동안 수영을 하도록 강제하고, 스코오된 거동 파라미터는 6분 시험의 마지막 4분 동안 부동이다. 순수 동물은 부동 부유 자세에 적응하기 전에 수영, 기어오르기 및 다이빙 형태로 이탈 거동을 나타낼 것이다. 부동의 지속 기간은 거동 절망을 나타낸다. 항우울증 약물은 상기 시험에서 부동 자세에 소요되는 시간을 감소시킨다.
방법
마우스는 23-25℃ 수돗물로 채워진 유리 실린더 (24 x 21 cm)에서 17 cm 깊이까지 6분 동안 수영하도록 강제한다. FST는 천장 카메라로부터 비디오 촬영하였다. 스코어링된 거동 파라미터는 6분 시험의 마지막 4분 동안에 부동능이다.
결과
스튜던트 t 시험 분석은 대조군 그룹과 비히클 MIA 그룹 사이의 부동 시간에 대해 유의적인 차이가 없음을 밝혔다 (t = 0.8968 df = 20; 0.3805). 부동 시간의 ANOVA는 MRX008을 사용한 치료의 효과를 밝히지 못했지만, MRX008의 투여 후 부동 소요 시간을 감소시키는 약간의 경향이 있다 [F(3,42) = 1.803; P = 0.1625; 도 37].
결론
비히클 MIA 그룹은 강제된 수영 시험에서 증가된 부동 시간을 나타내지 않았고 (MIA 비히클은 대조군과 비교하여 부동 시간에서 어떠한 변화를 나타내지 않았다), 이는 MIA 모델이 우울증 유사 증상을 증가시키지 않고 MIA 마우스 모델을 사용한 우울증-유사 거동에 대한 MRX008을 사용한 만성 치료 효과를 결정할 수 없음을 시사한다.
실시예 7e - 생체내 장 투과성 검정
합리성
MIA 모델은 소화관 장벽 기능을 변화시키는 것으로 보고되었다. 따라서, 바이오치료제를 사용한 만성 치료가 장 투과성을 변화시키는지를 확인하는 것이 중요하였다.
방법
시험 마우스는 단일 케이지에 넣고 음식은 밤새 제거하였다. 다음 날 (약 9 am에) 마우스에는 FITC 덱스트란 (플루로스셈-이소티오시네이트; MW: 4kDa, Sigma; 농도: PBS (pH7.4) 중에서 80mg/ml FITC을 동물당 600 mg/kg)을 위관영양법에 의해 투여하였다. FITC 투여 2시간 후, 혈액 꼬리 채혈로부터의 100 μl의 샘플을 헤파린-코팅된 모세관 튜브에 수거하고 앰버 에펜도르프에 전달하고 빙상에 위치시켰다. 샘플은 15분 동안 3500 x g에서 원심분리하고, 혈장을 흡인 제거하고 샘플을 장기 보관을 위해 -80℃에 보관하였다.
희석되지 않은 샘플을 사용하여 FITC 농도를 정량하였다. 25 μl의 FITC는 384 웰 플레이트 (Greiner bio one)에서 이중으로 피펫팅하였다. FITC는 490 nm 내지 520 nm의 범위에서 빅터 (Victor) 분광측정기를 사용하여 측정하였다. 표준 곡선을 위해, FITC의 일련의 희석물은 PBS (pH 7.4)에서 제조하였다.
추가로, 9주에 마우스의 쿨링 후, 회장 및 결장에서 FITC의 생체외 측정을 수행한다.
결과
스튜던트 t 시험 분석은 대조군 그룹과 비히클 MIA 그룹 간에 어떠한 유의적인 차이가 없음을 밝혔다 (t(20)=0.56, P=0.58; 도 38). FITC 농도의 ANOVA는 치료의 유의적 효과를 밝히지 못했다 [F(3,39)= 2.23; P=0.08].
결론
본 실험에서, 비히클 MIA 그룹은 변화된 장 투과성을 나타내지 않았다 (MIA 비히클은 대조군과 비교하여 투과성에서 어떠한 변화를 나타내지 않았다). 추가로, MRX008을 사용한 만성 치료는 MIA 마우스에서 장 투과성에 영향을 미치지 않았다.
실시예 7f - 생체내 장 운동 검정
합리성 및 방법
상기 실시예 3f를 참조한다.
결과
스튜던트 t-시험 분석은 비히클 MIA 그룹이 대조군 그룹과 비교할 때 증가된 장 운동 (적색 펠렛이 더 적은 시간 내에 검출 됨)을 나타냄을 밝혔다 (t(19) = 3.00, P = 0.007). 이동 시간의 ANOVA는 치료의 효과를 밝히지 못했다 [F(3,38)= 0.74; P= 0.54; 도 39].
결론
본 실험에서, 비히클 MIA 그룹은 대조군과 비교하여 증가된 장 운동을 나타냈다. MRX008을 사용한 만성 치료는 대조군과 비교하여 장 운동에 영향을 미치지 않았다.
실시예 8 - BTBR 마우스 모델에서 또 다른 생 바이오치료제의 투여
실시예 8a - BTBR 마우스 모델을 위한 재료 및 방법
본 실시예에서 사용된 마우스, 생 바이오치료제 투여 및 배성물 수거는 상기 실시예 2에서 사용된 것들과 동일하다.
균주 (Strain)
MRX008: 블라우티아 웩슬레라(Blautia wexlerae) 세균은 수탁 번호 NCIMB 42486로 기탁되었다.
투여 스케줄
상기 연구를 위한 치료 그룹은 하기에 나타낸다. 경구 투여용 비히클은 PBS이다. 하루 경구 투여는 경구 위관영양법을 통해 수행한다.
실험 디자인 및 방법
상기 명시된 바와 같이, MRX008을 사용한 투여는 마우스가 8주령이 된 경우 개시하였다. 초기 투여는 사회성, 불안증, 고정관념 및 인지 시험을 포괄하는 거동 실험 전 3주 동안 수행한다. 거동 배터리는 하기의 순서로 일어났다: 4주 째에 구슬 매장 시험; 5주 째에 상승된 십자형 미로; 개방 필드 및 신규 물체 인식 시험, 및 6주째 음식 선호도 시험의 사회적 전파; 암컷 뇨 스니핑 및 7주 째에 사회적 상호작용 시험, 및 9주째 강제 수영 시험. 카민 레드 위장 운동 검정 및 위장 침투성 검정 꼬리 출혈은 각각 8 및 9주째 동안에 일어났다. 최종적으로, 10주 내지 11주에, 마우스는 바징세포 자극을 위해 죽이고 회장 및 결장에서 FITC의 생체외 측정을 하였다.
위장 파라미터 (투과성 및 운동성)와 함께 고정 관념의 사회적 및 우울증 유사 거동에 대한 BTBR 모델에서 생 바이오치료제 치료의 효과는 하기의 실시예에서 개요를 기재한다.
상기 표에 열거된 그룹 1은 대조군 BTBR 마우스를 나타내고, 이는 자폐증 스펙트럼 장애와 연관된 표현형을 보여주는 것으로 예상된다. 자폐증 스펙트럼 장애의 거동 증상에 대한 임의의 치료 효과는 그룹 1과 그룹 2 간의 차이에 의해 확인된다.
그래프 디자인 및 통계학적 분석
모든 그래프는 그래프패드 프리즘 소프트웨어 (버젼 5) 상에서 생성하였다. 데이터는 IBM SPSS 통계 22.0 (EEUU)을 사용하여 분석하였다. 데이터 분포는 콜모고로브-스미르노브(Kolmogorov-Smirnov) 정규성 시험을 사용하여 분석하였다. 비히클 그룹 대 MRX008 그룹을 비교하는 데이터는 원-웨이 ANOVA 및 피셔 최소 유의성 차이 (LSD) 사후 (post hoc) 시험을 사용하여 분석하였다. ANOVA가 유의적인 치료 효과를 나타내지 않으면, 대조군에 대한 선행 쌍별 비교 시험을 수행하였다. 비-정상적으로 분포된 데이터는 크루스칼-왈리스 (Kruskal-Wallis) 및 비-파라미터 만-휘트니 U 시험 (Mann-Whitney U test)에 의해 분석하였다. P < 0.05는 통계학적 유의성에 대한 기준이었다.
실시예 8b - 사회적 거동의 평가 - 음식 선호도의 사회적 전달
합리성
사회적 전달 음식 선호도는 마우스에서 사회적 거동을 평가하는데 사용되는 후각 기억의 관련 시험이다. 상기 시험에서 관찰자 마우스는 최근에 새로운 음식을 섭취한 입증자 마우스와 상호작용한다. 관찰자 마우스가 입증자가 섭취한 음식과 일부 다른 신규 음식 사이간의 선택이 제공되는 경우, 관찰자 마우스는 입증자가 먹는 음식을 선호해야한다. 감소된 음식 선호도는 감소된 사회성을 지적한다.
방법
본 시험은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(참조: Desbonnet, Clarke 등 2015). 간략하게, 시험 18시간 전에, 마우스에서 음식을 제거하는 반면, 물은 임의로 이용할 수 있다. 음식 선택은 분쇄된 마우스 저작물로 만들어진 1% 분쇄된 계피 또는 2% 분쇄된 코코아로 구성되었다. 각각의 케이지로부터 입증자 마우스를 무작위로 선택하였고, 이후 사회적 상호 작용 동안 동정을 가능하게 하기 위해 꼬리를 파란색 마커로 표시하였다. 입증자 음식 컨테이너는 1시간 샘플링 탐색 전 및 후에 입증자 음식 컨테이너를 1시간 샘플링 후에 칭량하였다. 최소 0.2 g의 소비된 음식은 시험에 포함시키기 위해 요구되었다. 입증자 마우스를 케이지-메이트와 30분의 상호작용 기간 동안 각각의 홈 케이지에 다시 복귀시켰다. 후속적으로, 케이지-메이트를 신호 음식 또는 신규 음식의 선호도에 대해 개별적으로 시험하였다. 컨테이너는 각각의 선택 세션 직전 및 직후에 칭량하였다. 이어서 관찰된 마우스를 각각의 홈 케이지에 다시 복귀시키고 선택 세션을 24시간 후에 반복하였다. 시험 마우스는 입증자 마우스에서 계피 또는 코코아 냄새를 사회성 신호로 사용하고 두 가지 중에서 선택하는 경우 우선적으로 동일한 음식을 선택해야한다.
결과
입증자 신호 음식 선호도의 ANOVA는 관찰자가 입증자 상호 작용 (T0) 직후에 (F(3,36) =1.123, P = 0.354; 도 40a) 또는 24시간 후에 (F(3,38)=0.138, P=0.936; 도 40b) 음식 선택에 노출된 경우 어떠한 유의적 차이를 밝히지 못했다.
결론
MRX008을 사용한 치료는 음식 선호도 시험의 사회성 전달에서 BTBR 마우스의 사회성에 영향을 미치지 않았다.
실시예 8c - 사회적 거동의 평가 - 강제 침입 시험
합리성 및 방법
상기 실시예 2c를 참조한다.
결과
상호작용 시간의 ANOVA는 치료의 효과를 밝히지 못했다 [F(3,36)= 1.905; P=0.1462; 도 41].
결론
MRX008을 사용한 치료는 사회적 상호작용 시험에서 BTBR 마우스의 사회적 거동에 영향을 미치지 않았다.
실시예 8d - 고정관념의 거동의 평가 - 구슬 매장 시험
합리성 및 방법
상기 실시예 2d를 참조한다.
결과
매장된 구슬 수의 ANOVA는 치료의 유의적인 효과를 밝히지 못했지만 [F(3,39)= 0.835; P= 0.483; 도 42], MRX008을 사용한 만성 치료는 BTBR 마우스에 의해 매장된 구슬의 수에서 감소하는 경향을 나타낸다.
결론
MRX008을 사용한 만성 치료는 BTBR 마우스에서 반복적, 강박적 및 불안 거동에 유의적으로 영향을 미치지 않았지만, 이것은 상기 거동의 감소된 수준으로의 경향을 나타낸다.
실시예 8e - 불안증 유사 거동의 평가 - 상승된 십자형 미로
합리성 및 방법
상기 실시예 2f를 참조한다.
결과
폐쇄된 아암에서 소비된 퍼센트 시간의 ANOVA는 치료의 효과를 밝히지 못했다 [F(3,39)= 0.556; P= 0.647; 도 43a]. MRX008으로 치료받은 마우스는 비히클 그룹과 비교하여 개방 아암에서 더 많은 시간을 소요하는 것으로 나타난다(도 43b). 이와 일치하여, MRX008을 사용한 만성 치료는 비히클 그룹과 비교하여 개방 아암으로의 진입 수를 증가시키는 것으로 나타난다(도 43d). 폐쇄된 아암으로의 진입 수의 ANOVA는 치료의 효과를 밝히지 못했다 [F(3,39)= 0.556; P= 0.647; 도 43c].
결론
MRX008을 사용한 만성 치료는 상승된 십자형 미로에서 BTBR 마우스 내 항-불안증 거동에 대해 비-유의적 경향을 보여준다.
실시예 8f - 불안증 유사 거동의 평가 - 개방 필드 무대
합리성 및 방법
상기 실시예 2g를 참조한다.
결과
이동한 거리의 ANOVA는 개방 필드 무대에서 운동 활동에 대한 치료의 유의적 효과를 밝히지 못했지만 [F(3,37)=1.325; P=0.282, 도 44a], MRX008은 이동한 거리를 감소시키는 것으로 나타났고 이는 스트레스 유도된 운동 활성에서의 감소를 시사한다. 외곽 구역에서 소요되는 시간의 ANOVA는 치료 효과를 밝히지 못했다 [F(3,37)= 1.598; P=0.208; 도 44b]. 선행 쌍별 비교는 Mrx008을 사용한 치료가 내곽 구역에서 소요되는 시간을 감소시킴을 밝혔다 [t=2.388 df=17; P=0.0288; 도 44c].
결론
MRX008을 사용한 만성 치료는 스트레스 유도된 운동 활동에서 감소로의 경향을 보여주지만, 불안증 유사 거동과 연루된 내곽 구역에서 시간의 감소를 보여주었다.
실시예 8g - 우울증 유사 거동의 평가 - 강제 수영 시험
합리성 및 방법
상기 실시예 2h를 참조한다.
결과
부동 시간의 ANOVA는 FST에서 BTBR 마우스의 부동 시간에 대해 치료 효과를 밝히지 못했지만 [F(3,38)= 1.879; P=0.151; 도 45], MRX008을 사용한 만성 치료는 부동 소요 시간에서 감소로의 경향을 유발하였고 이는 항-우울증 거동을 시사한다.
결론
MRX008을 사용한 치료는 치료의 항-우울증 효과와 연루된 강제된 수영 시험에서 BTBR 마우스의 부동 시간을 비유의적으로 감소시킨다.
실시예 8h - 우울증 유사 거동의 평가 - 암컷 뇨 스니핑 시험
합리성 및 방법
상기 실시예 2i를 참조한다.
결과
비히클 그룹에 대해, 맨-휘트니 U 시험은 물을 스니핑하는데 소요되는 시간에 상대적으로 뇨를 스니핑하는데 소요되는 시간에서 유의적 증가를 밝혔다 [t=2.976 df=18; P=0.0081]. 물로의 노출에 대해, 스니핑에 소요되는 시간의 크루스칼 왈리스 비-파라미터 분석은 물 그룹에서 치료 효과를 밝히지 못했다 [카이 제곱: 6.352; df=3; P=0.096]. 뇨로의 노출에 대해, 스니핑에 소요되는 시간의 크루스칼 왈리스 비-파라미터 분석은 치료의 효과를 밝히지 못했다 [카이 제곱: 3.639; df=3; P=0.303, 도 46].
결론
MRX008을 사용한 치료는 BTBR 마우스에서 뇨를 스니핑하는데 소요되는 시간에 대한 효과를 갖지 않았다.
실시예 8i - 생체내 위장 운동 검정
합리성 및 방법
상기 실시예 2m을 참조한다.
결과
이동 시간의 ANOVA는 치료의 효과를 밝히지 못했다 [F(3,39)= 2.072; P= 0.121; 도 47].
결론
MRX008을 사용한 치료는 장 운동에 영향을 미치지 않았다.
실시예 8j - 기관 중량 및 결장 길이
체중의 퍼센트로서 기관 체중의 ANOVA는 부신 [F(3,37)= 0.208; P=0.890; 도 48a], 비장 [F(3,35)= 0.629; P=0.601; 도 48b] 또는 맹장 [F(3,37)= 0.883; P=0.460; 도 48c]에 대한 치료 효과를 밝히지 못했다. 결장 길이의 ANOVA는 치료의 효과를 밝히지 못했다 [F(3,37)= 5.635; P=0.003; 도 48d].
자폐증 스펙트럼 장애의 치료에서 MRX008에 관한 전체 결론
본원에 기재된 실험은 또 다른 블라우티아 종 (즉, 블라우티아 웩슬레라 MRX008)의 투여가 마우스 모델에서 신경발육 및 신경정신 장애의 치료를 위해 적용될 수 있다는 증거를 나타낸다. 특히, MRX008을 사용한 치료는 BTBR 마우스 모델에서 각각 상승된 십자형 미로 및 강제 수영 시험에서 항-우울증 효과 뿐만 아니라 잠재적 항-불안 완화 효과로의 경향을 나타내었지만, 개방 필드 무대 검정은 MBX008이 불안증 유사 거동에 영향을 미치지 않음을 시사하였다. 추가로, MRX008은 고정관념, 반복적 및 불안 거동을 MIA 및 BTBR 마우스 모델 둘 다에서 구슬 매장 시험에 의해 나타난 바와 같이 감소시킬 수 있다. MRX008 바이오치료제를 사용한 치료는 이들 연구에서 측정된 여러 생리학적 파라미터를 변화시키지 않았다.
자폐증 스펙트럼 장애의 치료를 위한 의학 제품의 임상적 개발에 대한 EMA 가이드라인은 질환의 이종성으로 인해, 단일 화합물을 사용한 모든 핵심 증상들에 대한 유의적 효과를 성취할 수 없고 따라서 단기 효능은 적어도 하나의 핵심 증상에 대해 입증되어야만 함을 기재하고 있다. MRX008 생 바이오치료제는 자폐 스펙트럼 장애의 적어도 하나의 핵심 증상의 효과적인 치료를 보여주었고, 따라서 이에 관련된 블라우티아 (Blautia) 및 비. 웩슬레라 (B. wexlerae) 균주는 인간 질병에 효과적일 것으로 예상된다. 유사하게, 다른 중추 신경계 장애 또는 병태는 다수의 상이한 증상과 함께 복합 병리를 나타내고 거의 거의 승인된 치료법이 없다. 따라서, 효과적인 치료는 중추 신경계 장애 또는 병태의 모든 증상을 치료할 필요가 없는 것으로 이해된다. 치료는 이것이 중추 신경계 장애 또는 병태와 연관된 증상들 중 하나를 치료하는 경우 치료학적으로 유용한 것으로 고려된다.
실시예
9 -
C57BL
/6 마우스에서 중추 및 말초 옥시토신 수준에 대한
MRX008을
사용한 준임상 치료 효과의 평가
세균 균주를 제조하고 상기 실시 예에 명시된 바와 같이 투여 하였다. C57BL/6 마우스를 각각 10-12마리 마우스로 7개의 실험 치료 그룹에서 6일 동안 생 바이오치료제로 치료하였다. 후속적으로, 시상 하부를 마우스로부터 절개하고 시상 하부의 옥시토신 수준을 방사선 면역검정 (RIA)에 의해 검출하고, 또한 혈장 중의 옥시토신의 수준을 RIA에 의해 검출하였다. 또한, 옥시토신 수용체, 인터루킨 및 기타 염증성 마커 및 바소프레신 호르몬의 수준은 RIA 및 다른 분석학적 방법에 의해 검출되었다.
실시예
10 -
BTBR
마우스의 시상하부 및 편도체에서 옥시토신, 바소프레신 및 이들 각각의 수용체의 발현 수준에 대한
MRX006을
사용한 만성 치료 효과의 평가
MRX006에 의한 만성 치료는 BTBR 마우스의 시상 하부에서 옥시토신 및 바소프레신의 유전자 발현 수준을 증가시킨다(도 49c 및 49d 참조). 이 조직에서 옥시토신 및 바소프레신 수용체의 수준에 대한 효과는 도 49a 및 49b에 나타낸다.
BTBR 마우스의 편도체에서 옥시토신, 바소프레신 또는 이들 각각의 수용체의 유전자 발현 수준에 대한 MRX006에 의한 만성 치료의 효과는 또한 도 50에 나타낸다.
따라서, MRX006을 사용한 만성 치료는 BTBR 마우스의 시상하부에서 바소프레신 및 옥시토신의 발현을 증가시킨다. 이러한 현저한 결과는 생 바이오치료제의 투여시 뇌에서 화학적 변화와 거동 변화 사이의 상관 관계를 제공한다. 이러한 연구는 생 바이오치료제가 위장 기능 개선과 함께 사회적, 불안 유사 및 고정 관념의 거동에서 동시의 변화로 중앙 옥시토신/바소프레신 시스템을 변화시킬 수 있다는 것을 최초로 보고한 것이다.
실시예
11 -
C57BL
/6 및
BTBR
마우스 모델에서
블라이티아
하이드로게노트로피카의
투여
자폐증 스펙트럼 장애 및 다른 신경학적 장애에 대한 모델로서 BTBR 마우스를 사용한 거동 실험에서, PBS 및 LYO 둘 다를 투여받은 C57BL/6 마우스는 BTBR 마우스 모델이 증가된 불안증, 감소된 사회적 혐오감 및 증가된 고정관념 거동을 효과적으로 입증함을 확인하기 위한 대조군으로서 사용되었다. 이것은 이들 ASD 관련 거동 결함에 대한 세균 치료 효과의 평가를 가능하게 하였다.
실시예 11a - 불안증 유사 거동의 평가 - 개방 필드 무대
합리성 및 방법
상기 실시예 2g를 참조한다. 수평적 활동은 개방 필드 무대에서 마우스가 이동한 거리이다. 수직적 활동은 마우스가 뒷다리로 서는 사건의 횟수이다. 이러한 거동의 빈도가 높을수록 운동 및 탐색이 증가하고 불안이 더 낮은 수준임을 지적한다. 무대의 중앙 영역에서 이러한 행동의 빈도가 증가하면 탐색적 행동이 높고 불안 수준이 낮음을 지적한다.
PBS는 부티레이트가 PBS 중에서 투여됨으로서 부티레이트 투여에 대한 음성 대조군이다. LYO는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 투여에 대한 음성 대조군이다. 처음 분석 (도 51a, 51c 및 51e) 후, C57BL/6 및 BTBR 모델 둘 다에서 PBS 및 LYO의 음성 대조군에 대한 값을 조합하고 평균화하여 제2 분석에서 단순화된 비교를 제공한다(도 51b, 51d 및 51f).
결과
수평적 활동
불안증 및/또는 자폐증 관련 모델로부터 예상되는 바와 같이, BTBR 마우스는 C57BL/6 마우스와 비교하여 상당히 감소된 수평적 활성을 나타낸다. LYO 음성 대조군은 PBS 대조군과 비교하여 C57BL/6 마우스에서 수평적 활동에 대해 어떠한 효과를 보여주지 않았다. 처음 30분 내의 PBS 대조군과 비교하여, LYO 대조군 또는 부티레이트 단독으로 처리된 BTBR 마우스는 이동된 거리에서 유의적인 차이를 보이지 않았지만, 두 번째 30분에서 LYO 대조군은 BTBR 마우스가 이동한 거리를 감소시켰다. 그러나, 세균 균주로 치료받은 마우스는 BTBR 대조군 마우스와 비교하여 이동한 거리에서 유의적인 증가를 보여주었다(도 51a).
상기 명시된 바와 같이, 대조군과 실험 값 간의 추가의 비교를 제공하기 위해, PBS 및 LYO 대조군에 대한 값은 2차 분석에서 조합하였다. 제1 분석과 유사하게, 부티레이트의 투여는 수평적 활동에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 세균 균주의 투여는 BTBR 모델 대조군과 비교하여 수평적 활동을 유의적으로 증가시켰다(도 51b).
수직적 활동
BTBR 마우스는 C57BL/6 마우스와 비교하여 유의적으로 감소된 수직적 활동 (뒷발 서기)을 나타낸다. LYO 음성 대조군은 PBS 대조군과 비교하여 C57BL/6 마우스에서 수직적 활동에 대해 어떠한 효과를 보여주지 않았다. BTBR PBS 대조군 마우스와 비교하여, 부티레이트 단독으로 치료받은 BTBR 마우스는 뒷발 서기에서 어떠한 차이를 나타내지 않았지만 LYO 대조군은 BTBR 마우스의 수직적 활동을 감소시켰다. 그러나, 세균 균주로 치료받은 마우스는 BTBR LYO 대조군 마우스와 비교하여 수직적 활동에서 유의적인 증가를 보여주었다(도 51c).
상기 명시된 바와 같이, 대조군과 실험 값 간의 추가의 비교를 제공하기 위해, PBS 및 LYO 대조군에 대한 값은 2차 분석에서 조합하였다. 제1 분석과 유사하게, 부티레이트의 투여는 BTBR 마우스의 수평적 활동에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 세균 균주의 투여는 BTBR 대조군과 비교하여 수직적 활동을 유의적으로 증가시켰다(도 51d).
처음 5분에 개방 필드의 중앙에서 이동한 % 거리
예상된 바와 같이, 분석의 처음 5분에서, BTBR 마우스는 C57BL/6 마우스와 비교하여 개방 필드 무대의 중앙에서 이동한 이들 거리의 증가된 퍼센트를 나타냈다. 이것은 증가된 불안 거동을 나타내는 BTBR 마우스가 이동한 전체 거리의 감소를 반영하고 검정의 처음 5분 내에 보다 불안한 BTBR 마우스가 탐색 단계에 진입하기 보다는 초기 환경에 그들 자체가 친숙할 가능성이 높다는 사실을 반영한다(도 51e).
상기 명시된 바와 같이, 대조군과 실험 값 간의 추가의 비교를 제공하기 위해, PBS 및 LYO 대조군에 대한 값은 2차 분석에서 조합하였다(도 51f).
개방 필드 무대의 중앙에서 소요된 % 시간
분석의 전체 시간을 고려하는 경우, BTBR 마우스는 C57BL/6 마우스와 비교하여 무대의 중앙에서 소요하는 퍼센트 시간이 감소함을 보여준다. 이것은 BTBR 마우스의 증가된 불안증 및 감소된 수평적 활동을 반영한다. LYO 대조군 또는 부티레이트 단독은 무대의 중앙에서 소요하는 시간에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 세균 균주의 투여는 BTBR 마우스에서 LYO 대조군과 비교하여 무대의 중앙에서 소요되는 시간의 양을 유의적으로 증가시켰다(도 51g).
상기 명시된 바와 같이, 대조군과 실험 값 간의 추가의 비교를 제공하기 위해, PBS 및 LYO 대조군에 대한 값은 2차 분석에서 조합하였다. 첫번째와 유사하게, 부티레이트의 투여는 BTBR 대조군과 비교하여 필드의 중앙에서 소요되는 시간에 영향을 미치지 않았다. 세균 균주의 투여는 개방 필드의 중앙에서 소요되는 시간의 양을 증가시켰다.
결론
블라우티아 하이드로게노트로피카의 조성물을 사용한 만성 치료는 탐색 활동을 증가시키고 개방 필드 무대 시험에서 BTBR 마우스 모델에서 불안증 유사 거동을 감소시킨다. 중요하게, 세균 균주의 BTBR 마우스 모델로의 투여는 BTBR 대조군과 비교하여 수평적 및 수직적 활동을 증가시키고 무대의 중앙에서 소요되는 시간의 총양을 증가시켰다. 따라서, 상기 세균 균주는 불안증 완화 효과를 갖고 중추 신경계 장애 (예를 들어, 자폐증 스펙트럼 장애)를 나타내는 마우스 모델에서 탐색 거동을 개선시킨다.
실시예 11b - 고정관념의 거동의 평가 - 구슬 매장 시험
합리성 및 방법
상기 실시예 2d를 참조한다. PBS는 부티레이트의 투여를 위한 음성 대조군이다. LYO는 블라우티아 하이드로게노트로피카 균주의 투여에 대한 음성 대조군이다. 처음 분석(도 52a) 후, C57BL/6 및 BTBR 모델 둘 다에서 PBS 및 LYO의 음성 대조군에 대한 값을 조합하고 평균화하여 제2 분석에서 단순화된 비교를 제공한다(도 52b).
결과
예상된 바와 같이, BTBR 모델 마우스는 C57BL/6 모델 대조군과 비교하여 구슬을 보다 유의적으로 매장시킴을 보여주는 반복적 거동에서의 증가를 나타냈다(도 52b). 부티레이트 및 세균 균주의 투여는 매장된 구슬의 수를 감소시켰다(도 52a 및 52b).
결론
부티레이트 및/또는 세균 균주의 투여는 구슬의 매장 수를 감소시키고 이는 불안증 또는 고정관념 거동에서의 감소를 지적한다.
실시예 11c - 고정관념의 거동의 평가 - 파기 (digging) 시험
합리성 및 방법
구슬 매장 시험의 합리성과 유사하게, 증가된 파기 거동은 반복적이고 고정관념의 거동에서의 증가에 상응한다.
결과
예상된 바와 같이, C57BL/6 대조군 균주와 비교하여 BTBR 모델에서 파기에 소요되는 시간이 유의적으로 증가하였다(도 53a). 그러나, 파기 행동의 수는 C57BL/6와 BTBR 균주 간에 유의적으로 상이하지 않았다(도 53b). 따라서, 상기 분석에서 반복적 거동을 예방하는데 있어서 세균 균주 또는 부티레이트의 역할을 평가할 수 없다.
실시예
11d - 고정관념의 거동의 평가 - 자기-털 손질 (self-grooming) 시험
합리성 및 방법
상기 실시예 2e를 참조한다. PBS는 부티레이트의 투여를 위한 음성 대조군이다. LYO는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 투여에 대한 음성 대조군이다. 제1 분석(도 54a, 54c 및 54e) 후, C57BL/6 및 BTBR 모델 둘 다에서 PBS 및 LYO의 음성 대조군에 대한 값을 조합하고 평균화하여 제2 분석에서 단순화된 비교를 제공한다(도 54b, 54d 및 54f).
결과
고정관념 거동에 대한 BTBR 모델과 일치하여, BTBR 마우스는 PBS 및 LYO 대조군 둘 다에서 C57BL/6 마우스 모델과 비교하여 털 손질 행동의 증가된 수 뿐만 아니라 털 손질에 소요되는 증가된 시간을 보여주었다. 단독의 부티레이트의 투여는 PBS 대조군과 비교하여, 털 손질에 소요되는 시간, 털 손질 행동 수, 및 행동 당 털 손질에 소요되는 시간의 감소를 보여주었다. 세균 균주의 투여는 털 손질 행동 당 털 손질에 소요되는 시간을 감소시켰다(도 54a, 54c 및 54e).
상기 명시된 바와 같이, 대조군과 실험 값 간의 추가의 비교를 제공하기 위해, PBS 및 LYO 대조군에 대한 값은 2차 분석에서 조합하였다. 상기 제2 분석은 제1 분석의 것과 유사한 결과를 제공하였다(도 54b, 54d 및 54f).
결론
부티레이트 또는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 투여는 털 손질의 행동 당 털 손질에 소요되는 시간의 양을 감소시킨다.
실시예 11e - 블라우티아 하이드로게노트로피카 실험의 전체 결론
개방 필드 무대 시험에서, 블라우티아 하이드로게노트로피카는 BTBR 마우스의 탐색 거동을 유의적으로 개선시켰다. 추가로, 세균 균주는 이들 마우스의 불안증 유사 거동을 감소시켰다. 따라서, 세균의 투여는 자폐증 유사 특징을 나타내는 BTBR 마우스의 거동을 조절함이 명백하다. 따라서, 당업자는 이들 세균이 신경발육 및/또는 신경정신 장애 또는 병태를 포함하는, 중추신경계 장애 또는 병태의 치료 및/또는 예방에 유용할 것으로 예상한다.
상기 세균 균주의 투여는 또한 자가-털 손질 시험에서 털 손질 행동 당 고정관념 거동을 수행하는 시간의 양을 감소시키는 것으로 나타난다.
실시예 11f - 부티레이트 실험의 전체 결론
고정 관념 거동 분석으로부터의 데이터는 중추 신경계 장애에서 부티레이트에 대한 치료학적 역할을 지시한다.
부티레이트의 투여는 BTBR 대조군과 비교하여 매장된 구슬의 수를 감소시키고 평균 수를 C57BL/6 야생형 대조군 마우스에서 관찰 된 것과 유사한 수준으로 복귀시켰다. 추가로, 단독의 부티레이트의 투여는 BTBR 대조군과 비교하여, 털 손질에 소요되는 전체 시간 및 털 손질 행동의 수를 감소시켰다.
이들 결과는 동물 모델에서 반복 및 고정관념 거동을 감소시키는데 부티레이트의 역할에 관한 구두 지시를 제공한다.
실시예 12 - SCFA 생산 건강한 래트에 대한 세균 리오필리세이트의 효과
블라우티아 하이드로게노트로피카 균주 DSM 14294의 만성 투여의 건강한 ΗHIM 래트에서 SCFA 생산에 대한 효과를 연구하였고 상기 결과는 도 55에 보고한다. 실험에 관한 추가의 세부 사항은 상기 도면의 기재에서 제공된다. 도 55는, BT의 투여가 부티레이트 생산에서 뿐만 아니라 아세테이트에서 유의적 증가를 유도한다는 것을 도시한다..
실시예
13 - 인간
마이크로바이오타
연관된
래트
(
HMA
래트
) 모델에서 연구된 B. 하이드로게노트로피카의 효과
요약
무균성 래트 16마리 (대조군 그룹에서 8 마리의 래트 및 치료 그룹에서 8 마리의 래트를 포함하는) 그룹에 인간 IBS 대상체 (IBS-HMA 래트) 기원의 배설물 마이크로바이오타를 접종하였다. 3개의 연속 실험은 3개의 상이한 IBS 환자 기원의 배설물 샘플을 사용하여 수행하였다. 래트의 2개의 다른 그룹 (n = 10)에 본능적 민감성 대조군으로서 건강한 대상체 (n=2 대상체, 건강한-HMA 래트의 2 그룹)의 배설물 샘플을 접종하였다. 따라서, 24마리의 IBS-마이크로바이오타 연관된 래트 (대조군), 블라우틱스로 치료받은 24마리의 IBS 마이크로바이오타 연합된 래트 및 20마리의 건강한-마이크로바이오타 연합된 래트가 있다. 이어서 IBS-HMA 래트의 절반에 본 발명에 따른 B. 하이드로게노트로피카의 세균 균주를 포함하는 조성물을 투여하였고, 다른 절반의 동물에는 대조군 용액을 투여하였다.
균주 (Strain)
블라우티아 하이드로게노트로피카 (Blautia hydrogenotrophica) (BH) 균주 DSM 14294.
조성물 및 투여
BH 리오필리세이트는 멸균 미네랄 용액 중에 ml 당 1010 세균의 농도로 현탁시켰다. 2 ml의 상기 현탁액을 경구 위관영양법에 의해 28일의 기간 동안 IBS-HMA 래트 당 매일 투여하였다.
대조군 용액은 경구 위관영양법에 의해 매일 (래트 당 2 ml) IBS-HMA 래트의 대조군 그룹에 투여되는 멸균 미네랄 용액이다.
래트
무균 수컷 피셔 래트 (10주령)에는 IBS 대상체 (IBS-HMA 래트)로부터 인간 배설물 마이크로바이오타를 접종하였다. 16마리의 래트에는 동일한 인간 배성물 접종물을 접종하였다. 3개의 연속 실험은 3마리의 상이한 IBS 대상체로부터의 배설물 샘플과 함께 수행하였다. 10마리 래트의 2개의 다른 그룹에 2마리의 건강한 대상체 (노르모 (normo)-민감성 대조군 그룹) 기원의 배설물 샘플을 접종하였다.
연구 디자인
14일 - 인간 배설물 마이크로바이오타를 사용한 무균 래트의 접종.
0 내지 28일 -경구 위관영양법에 의한 BH 리오피세이트 (검정 그룹) 또는 대조군 용액 (대조군 그룹)의 하루 용량
14일 내지 22일 - 전극을 복부 (팽창 검정을 위해)에 이식하기 위한 수술
22일 내지 28일 - 팽창 시험과 연관된 스트레스를 피하기 위해 래트의 적응.
28일 - 설피드 및 단쇄 지방산 (SCFA) 분석을 위해 배설물 샘플을 수거하기 위한 동물의 팽창 검정 및 안락사.
0일, 14일 및 28일 - 미생물 분석을 위한 배설물 샘플의 수거: BH 집단 및 미생물의 다른 공생 그룹을 평가하기 위한 qPCR 및 선택 배지 및 엄격한 혐기성 방법을 사용한 미생물의 기능성 그룹의 열거.
결과
도 56은 대조군 용액 또는 BH 리오피세이트를 투여 받은 IBS-HMA 래트 기원의 배설물 샘플 중에 B. 하이드로게노트로피카 집단의 qPCR 분석 결과를 제공한다. BH 집단에서 유의적인 증가는 결장에서 BH의 성공적인 전달을 확인시켜 주는, BH 리오피세이트를 투여 받은 래트에서 투여 기간 말기 (28일)에 관찰되었다.
도 57은 IBS-HMA 래트의 맹장 샘플에서 주 발효 대사물인, 단쇄 지방산에 대한 BH 투여 영향에 대해 보고한다. BH의 투여는-부티레이트 농도에서 유의적인 증가 뿐만 아니라 아세테이트 농도의 유의적인 증가를 유도하였다(도 57b).
실시예 14 - 3개의 챔버 시험에서 사회적 상호작용 거동의 평가
합리성 및 방법
상기 실시예 1b를 참조한다. 본 실험에서, 기록된 데이터는 탐색 시간이고, 이는 처음 5분의 기간 동안 및 10분의 세션 동안에 실린더 (동종의 물체를 함유하는)의 스니핑 시간에 의해 정의된다.
판독:
ㆍ 시험 1, 사회성 (동종 대 물체):
o 사회성 지수: 동종의 스니핑 시간 % (>50%인 경우: 사회성, 즉, 동종 대 물체에 대한 선호도)
o 다른 판독, 탐색 거동의 지수: 동종, 물체, 전체의 탐색 시간
ㆍ 시험 2, 사회적 신규성 선호도 (새로운 동종 대 친숙한 동종):
o 사회적 신규성 선호도 (또는 혐오감)의 지수: 새로운 동종의 스니핑 시간 %
o 다른 판독, 탐색 거동의 지수: 새로운 및 친숙한 동종 전체의 탐색 시간
결과
시험 1: 사회성 (도 58a):
C57BL/6 마우스에서, 사회성은 PBS에서 및 LYO 치료된 마우스에서 상이하지 않다. 예상된 바와 같이, BTBR 마우스는 PBS 대조군에서 감소된 사회성을 보여주었다. 예상치 않게, BTBR 마우스는 LYO로 치료받는 경우 개선된 사회성을 나타냈다. 그러나, BTBR-PBS 대 C57-PBS, BTBR-LY0 대 C57-LYO 및 BTBR-PBS 대 BTBR-LYO 간의 차이는 유의적이지 않다. 흥미롭게도, 부티레이트의 투여는 BTBR 마우스에서 사회성을 개선시켰다 (BTBR-PBS 대 BTBR-BUT 간에 유의적으로 상이함). 블라우티아 하이드로게노트로피카의 투여는 세균 PBS 대조군과 비교하여 사회성을 증가시켰다.
시험 2: 사회적 신규성 (도 58b):
PBS로 치료받은 C57BL/6 마우스에서 사회적 신규성 선호도가 있지만 이러한 선호도는 LYO를 투여받은 C57BL/6 마우스에서 감소한다 (이들 차이는 유의적이지 않다). 10분 세션에서, BTBR 마우스는 PBS 또는 LYO로 치료받는 경우 C57BL/6 마우스와 비교하여 감소된 사회적 신규성 선호도를 보여주었다. BTBR-PBS 대 C57-PBS, BTBR-LYO 대 C57 LYO 및 BTBR-PBS 대 BTBR-LYO의 차이 간의 차이는 유의적이지 않다. 따라서 도 58b에 나타낸 결과는 해석하기가 어렵다.
자폐증 스펙트럼 장애의 치료에서
블라우티아
하이드로게노트로피카에
관한 전체 결론
본원에 기재된 실험은 또 다른 블라우티아 종 (즉 블라우티아 하이드로게노트로피카)의 투여가 마우스 모델에서 신경발육 및 신경정신 장애의 치료를 위해 적용될 수 있다는 증거를 나타낸다. 특히, 블라우티아 하이드로게노트로피카를 사용한 치료는 불안증 유사, 고정 관념 및 반복적 거동을 감소시키고 마우스에서 사회성을 증가시켰다.
자폐증 스펙트럼 장애의 치료를 위한 의학 제품의 임상적 개발에 대한 EMA 가이드라인은 질환의 이종성으로 인해, 단일 화합물을 사용한 모든 핵심 증상들에 대한 유의적 효과를 성취할 수 없고 따라서 단기 효능은 적어도 하나의 핵심 증상에 대해 입증되어야만 함을 기재하고 있다. 블라우티아 하이드로게노트로피카 생 바이오치료제는 자폐 스펙트럼 장애의 적어도 하나의 핵심 증상의 효과적인 치료를 보여주었고, 따라서 이에 관련된 블라우티아 (Blautia) 및 B. 하이드로게노트로피카 (B. hydrogenotrophica) 균주는 인간 질병에 효과적일 것으로 예상된다. 유사하게, 다른 중추 신경계 장애 또는 병태는 다수의 상이한 증상과 함께 복합 병리를 나타내고 거의 거의 승인된 치료법이 없다. 따라서, 효과적인 치료는 중추 신경계 장애 또는 병태의 모든 증상을 치료할 필요가 없는 것으로 이해된다. 치료는 이것이 중추 신경계 장애 또는 병태와 연관된 증상들 중 하나를 치료하는 경우 치료학적으로 유용한 것으로 고려된다.
실시예
15 - 시상하부 세포주에서 옥시토신 및 이의 각각의 수용체의 유전자 발현 수준에 대한 MRX006을 사용한 만성 치료 효과의 평가
MRX006을 사용한 만성 치료는 시상하부 세포주에서 옥시토신 및 이의 수용체의 mRNA의 발현 수준을 유의적으로 증가시킨다(도 59a 및 59b).
이러한 현저한 결과는 MRX006의 투여시 뇌에서의 화학적 변화와 거동 변화 사이의 상관 관계를 제공한다. 이러한 연구는 생 바이오치료제가 위장 기능 개선과 함께 사회적, 불안 유사 및 고정 관념의 거동에서 동시의 변화로 중앙 옥시토신 시스템을 변화시킬 수 있다는 것을 최초로 보고한 것이다.
실시예 16 - BALBc 마우스 모델
실시예 16a - BALBc마우스 모델을 위한 재료 및 방법
마우스
BALBc (Envigo, UK) 성숙 수컷 마우스는 12 h 광암 주기 (7:00 내지 19:00 hr에서 점등)하에 그룹 거주시키고; 표준 설치류 음식 및 물이 자유롭게 이용가능하게 하였다. 모든 실험은 유럽 지침 2010/63/EEC, 2012년 S.I. No. 543의 요건에 따라 수행되었으며 대학 (University College Cork)의 동물 실험 윤리위원회의 승인되었다. 동물은 실험 개시에 8주령이다.
균주 (Strain)
MRX006: 블라우티아 스테르코리스 (Blautia stercoris) 세균은 수탁 번호 NCIMB 42381로 기탁되었다.
세균은 글리세롤 스톡으로 제공되고 혐기적 조건하의 설비에서 성장시킨다.
MRX006 투여
동물들은 동물 유닛으로 도착 후 1주 동안 이들의 유지 방에 습관화되도록 하였다. 마우스가 8주령인 경우 MRX006 또는 비히클을 사용한 투여를 개시하였다. MRX006 (1 x 107 내지 1 x 109 CFU)을 투여 전 PBS 중에 용해시켰다. 마우스에 경구 위관영양법 (200 ㎕ 용량)으로 MRX006을 15:00 내지 17:00에 연속 6일 동안 1 x 109 CFU로 투여하였다. 7일 째에, 동물들을 참수시키고 조직을 실험을 위해 수거하였다.
조직 수거
동물은 치료 및 시험 조건에 관한 무작위 양상으로 희생시키고; 샘플링은 9.00 a m. 내지 2:30 p.m에서 수행하였다. 트렁크 혈액을 칼륨 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 튜브에 수거하고 4000 g에서 15분 동안 회전시켰다. 혈장을 단리하고 추가의 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다. 뇌는 신속히 절제하고, 해부하고 각각의 뇌 영역은 빙상에서 순간 냉동시키고 추가의 분석을 위해 - 80℃에서 보관하였다. 비장을 제거하고, 5 mL RPMI 배지 (L-글루타민 및 중탄산나트륨, R8758 Sigma + 10% FBS (F7524, Sigma) + 1% Pen/Strep (P4333, Sigma)을 갖는)에서 수거하고 생체외 면역 자극을 위해 쿨링 직후 가공하였다. 장 조직 (맹장에 가장 가까운 회장 및 결장의 2 cm 분절을 절제하고, 맹장에서 조직의 가장 먼 1 cm를 사용함)을 장 투과성 분석을 위해 어싱 (Ussing) 챔버에 탑재하였다. 추가로 회장 및 결장 조직의 1cm를 단단한 접합 유전자 발현 분석을 위해 취하였다. 맹장을 제거하고, 칭량하고 SCFA 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다.
통계 분석
정규 분포 데이터는 평균 ± SEM으로 제공되고; 비-파라미터 데이터 세트는 사분위 간 범위의 중앙값으로 나타낸다. 쌍을 형성하지 않는 2개-테일-t 시험을 파라미터 데이터를 분석하기 위해 적용하였고 맨-휘트니 (Mann-Whitney) 시험은 비-파라미터를 위해 사용하였다. 스피어맨 (Spearman)의 순위 상관 관계 계수는 풀링된 데이터세트 내 상관 관계 분석을 위해 사용되었다. < 0.05의 p 값은 모든 경우에 유의적인 것으로 간주되었다.
실시예
16b-
생체외
위장 투과성 및 단단한 접합부 발현에 대한
MRX006에
의한 만성 치료의 효과 평가
방법
경추 탈골에 의해 마우스를 안락사시키고, 원위 회장 및 결장을 제거하고, 냉각 된 크렙스 용액에 위치시키고, 장간막 라인을 따라 개방하고 조심스럽게 세정하였다. 제제를 이어서 37℃에서 유지된 산소화된 (95% O2, 5% CO2) 크렙스 완충액과 함께 이전에 기재된 바와 같이(Hyland and Cox, 2005 [58]) 어싱 챔버 (Harvard Apparatus, Kent, UK, 0.12 cm2의 노출된 영역)에 위치시켰다. 4 kDa FITC-덱스트란을 2.5 mg/mL의 최종 농도로 점막 챔버에 첨가하고; 200 μL의 샘플을 다음 3 시간 동안 30분마다 혈청 챔버로부터 수거하였다.
결과
소화관 투과성 지수 (실시예 21에 기재된 바와 같이)로서 관강내로부터 어싱 챔버의 장막 측면으로의 FITC의 통과를 사용하여, MRX006이 회장 또는 결장 조직 투과성에 대해 효과를 미치지 않는 것으로 결정되었다. 도 60a 및 61a는 MRX006에 의한 만성 치료가 결장 또는 회장의 투과성에 영향을 미치지 않음을 입증한다.
MRX006은 회장 또는 결장 조직에서 단단한 접합 단백질 (소화관 장벽의 통합성을 유지하는데 관여하는) 오크루딘, 효소 IDO-1 (트립토판/키누레닌 경로에서 인돌아민-피롤 2,3-디옥시게나제-1 제1 및 율속 효소) 또는 TPH1 (세로토닌의 합성에 관여하는, 트립토판 하이드록실라제 1, 효소 트립토판 하이드록실라제의 이소형)의 mRNA 에 대해 어떠한 효과를 갖지 않았다(도 60 및 61b, 61c 및 61e). 그러나, MRX006은 회장에서 TJP-1 (단단한 접합 단백질 1, 단단한 접합 단백질) mRNA 발현을 증가 시켰지만, 결장은 아니었다 (도 60d 및 61d).
논의
MRX006은 회장 또는 결장 투과성에 대해 어떠한 효과를 갖지 않았지만 TJP1 발현을 증가시켰다. TJP1은 소화돤 통합성을 유지하는 것과 연관된 다수의 단단한 접합 단백질 중 하나이며, 본원 발명자는 mRNA 발현에서 상기 증가를 알았지만, 이것은 이러한 단단한 접합의 단백질 발현 또는 내피로의 혼입을 반드시 반영하는 것은 아닐 수 있다. MRX006을 사용한 6일의 치료가 투과성을 변화시키지 않는다는 발견은 소화관 투과성과 통합성에 부정적인 영향을 미치지 않음을 시사한다. MRX006은 또한 IDO-1 또는 TPH1을 변화시키지 않았으며, 이는 소화관에서 세로토닌 생산 또는 트립토판/키누레닌 경로를 변화시키지 않음을 시사한다.
이들 데이터는 MRX006으로의 만성 치료가 소화관 투과성을 변화시키지 않으며 소화관 장벽의 통합성에 영향을 미치지 않음을 입증한다. 이것은 MRX006의 능력이 고정 관념 및 불안증 관련 거동을 약화시켜 소화관 장벽 통합성의 결핍을 유도하지 않음을 보여준다.
실시예
16c-맹장
단쇄
지방산 생산에 대한
MRX006에
의한 만성 치료 효과의 평가
방법
맹장 내용물을 혼합하고 MilliQ 물과 함께 와동시키고 10분 동안 실온에서 항온처리하였다. 상등액은 원심분리(10000 g, 5분, 4℃)에 의해 수득하여 세균 및 다른 고체 및 0.2 μm에 의한 여과물을 펠렛화하였다. 이를 투명한 GC 바이엘에 전달하고 2-에틸부티르산 (Sigma)을 내부 표준물로서 사용하였다. SCFA의 농도는 ZB-FFAP 컬럼 (30 m x 0.32 mm x 0.25 mm; Phenomenex)이 장착된 Varian 3500 GC 불꽃 이온화 시스템을 사용하여 분석하였다. 아세테이트, 프로피오네이트, 이소-부티레이트, n-부티레이트, 이소발레레이트 및 발레레이트 (Sigma)를 함유하는 상이한 농도의 표준 혼합물로 표준 곡선을 작성 하였다. 베리안 스타 크로마토그래피 워크스테이션 (Varian Star Chromatography Workstation) 버전 6.0 소프트웨어를 사용하여 피크를 적분하였다. 모든 SCFA 데이터는 μmol/g으로서 표현하였다.
결과
단쇄 지방산 (SCFA)은 식이물로부터 비-분해성 섬유가 소화관에서 세균에 의해 발효되는 경우 생성된다. MRX006 투여 6일 째에 비히클 PBS 투여와 비교하는 경우 아세테이트 (t12 = 0.959, p = 0.357), 프로피오네이트 (t12 = 1.033, p = 0.322), 이소부티레이트 (t12 = 1.859, p = 0. 090), 부티레이트 (t12 = 0.857, p = 0.408), 이소발레아레이트 (t12 = 1.757, p = 0.107) 또는 발레아레이트 (t12 = 0.434, p = 0.672)에 대해 어떠한 효과를 갖지 않았다(도 62).
논의
MRX006의 투여는 맹장 SCFA 생산에 어떠한 효과를 갖지 않았다. 이것은 MRX006의 6일 용법이 발효, 또는 식이물로부터 비-분해성 섬유의 발효에 관여하는 세균을 변화시키지 않았음을 시사한다.
실시예
16d - 비장 세포로부터
사이토킨
발현에 대한
MEX006에
의한 만성 치료 효과의 평가
합리성/방법
생체외 비장 세포 검정은 세균 또는 바이러스 모사체 챌린지와 함께 비장 세포 (비장으로부터 분리된 세포-면역 방어에 관여하는 주요 기관)에 챌린징하는 것을 포함한다.
희생시킨 후 비장을 5 mL RPMI 배지에 즉시 수거하고 즉시 배양하였다. 비장 세포는 먼저 RPMI 배지에서 파쇄시켰다. 파쇄 단계에 이어서 RBC 용해 단계를 수행하고, 여기서, 상기 세포는 1 ml의 RBC 용해 완충액 (11814389001 ROCHE, Sigma)에서 5분 동안 항온처리하였다. 10 ml의 배지를 첨가하여 용해를 중단시킴에 이어서 5분 동안 200 g 원심분리하였다. 이어서 세포가 40 um 스트레이너에 통과되는 최종 단계를 수행하였다. 이어서 파쇄물을 40 um 스트레이너 상에서 여과하고, 200g에서 5분 동안 원심분리하고 배지에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고 씨딩하였다 (4,000,000/mL 배지). 2.5시간 적응 후, 세포는 리포폴리사카라이드 (LPS-2 μg/ml) 또는 콘카나발린 A (ConA-2.5 μg/ml)로 24시간 동안 자극하였다. 자극 후, 상등액을 수거하여 TNFα, IL-10, IL-1β, 인터페론 γ, CXCL2 및 IL6에 대한 염증 촉진 패널 1 (마우스) V-PLEX 키트 (Meso Scale Discovery, Maryland, USA)를 사용하여 사이토킨 방출을 평가하였다. 분석은 MESO QuickPlex SQ 120, SECTOR 이미저 2400, SECTOR 이미저 6000, SECTOR S 600을 사용하여 수행하였다.
결과
MRX006은 LPS (세균 감염을 모방하는) 또는 콘카발린 A (바이러스 감염을 모방하는) 자극에 반응하는 염증 촉진 (IFNγ, TNFα, IL-1β) 또는 항염증 (IL-10, IL-6) 또는 CXCL1 (면역 반응 활성화의 마커)의 비장세포 방출에 대한 효과를 갖지 않았다(도 63).
논의
MRX006은 또한 LPS 또는 콘카발린 A를 사용한 챌린지 후 비장세포로부터의 사이토킨 발현에 대해 어떠한 효과를 갖지 않았다. 이것은 6일 MRX006 투여가 선천적 말초 면역 반응에 부정적인 영향을 미치지 않았음을 입증한다. 이것은 MRX006 치료가 전신 면역 활성화를 활성화시키지 않음을 보여준다.
실시예
16e - 아미노산의 혈장 수준에 대한
MRX006을
사용한 만성 치료 효과의 평가
합리성 및 방법
실험 말기에 트렁크 혈액을 혈장 중 아미노산 분석을 위해 수거하였다. 이것은 마이크로바이오타에서 변화에 의한 필수 아미노산의 생합성 및 이화작용의 지수를 제공한다.
동물은 치료 및 시험 조건에 관한 무작위 양상으로 희생시키고; 샘플링은 9.00 a m. 내지 2:30 p.m에서 수행하였다. 트렁크 혈액을 칼륨 EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산) 튜브에 수거하고 4000 g에서 15분 동안 회전시켰다. 혈장을 단리하고 추가의 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다. 혈장은 0.2 mol/L 나트륨 시트레이트 완충액, pH 2.2로 희석하여 250 nmol의 각각의 아미노산 잔기를 수득하였다. 샘플은 내부 표준 노르류신으로 희석하여 최종 농도 125 nm/mL를 수득하였다. 아미노산은 Jeol Na+ 고성능 양이온 교환 컬럼이 장착된 Jeol JLC-500/V 아미노산 분석기 (Jeol Ltd, Garden City, Herts, UK)를 사용하여 정량하였다.
결과
MRX006은 혈장 내 프롤린 및 페닐알라닌 수준을 감소시켰다.
논의
아미노산의 혈장 수준은 MRX006의 6일 투여 후 크게 변동되지 않는다. 드 노보 (de novo)로 합성될 수 없는 9개의 필수 아미노산이 있고 이는 직접 식이물에 공급되거나 식이물의 분해에 의해 공급되어야만 한다. 이들은 발린, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 메티오닌, 류신, 이소류신, 라이신 및 히스티딘을 포함한다. 6개 다른 아미노산은 인간 식이물에서 조건적으로 필수인 것으로 고려되고, 이것은 이들의 합성이 특별한 병리학적 조건, 예를 들어, 영아 또는 중증 대사 장애에 있는 개체에서 미성숙 하에 제한될 수 있음을 의미한다. 이들 6개의 아미노산은 아르기닌, 시스테인, 글라이신, 글루타민, 프롤린 및 티로신을 포함한다. 5개의 아미노산은 인간에서 불필요하고 이는 이들이 신체에서 충분한 양으로 합성될 수 있음을 의미한다. 이들 5개는 알라닌, 아스파르트산, 아스파라긴, 글루탐산 및 세린이다.
상기 연구에서, 필수 아미노산 페닐알라닌, 및 또 다른 중요한 아미노산인 프롤린은 MRX006 투여 후 감소하고 이는 상기 프로바이오틱이 식이물로부터의 주요 아미노산의 대사에 역할을 수행할 수 있음을 시사한다.
실시예
16f-뇌간에서 신경 전달 물질 수준에 대한
MRX006에
의한 만성 치료효과의 평가
방법
신경 전달 물질 농도는 뇌간 기원의 샘플에 대해 HPLC로 분석하였다. 간략하게, 뇌간 조직은 내부 표준물로서 4 ng/40 μl의 N-메틸 5-HT (Sigma Chemical Co., UK)로 스파이킹된 500 μl의 냉각된 이동상 중에서 초음파 처리하였다. 이동상은 0.1 M 시트르산, 5.6 mM 옥탄-1-설폰산 (Sigma), 0.1 M 인산이수소나트륨, 0.01 mM EDTA (Alkem/Reagecon, Cork) 및 9% (v/v) 메탄올 (Alkem Reagecon)을 함유하고, 4 N 수산화나트륨 (Alkem/Reagecon)을 사용하여 pH 2.8로 조정하였다. 이어서 파쇄물을 4℃에서 22,000 x g에서 15분 동안 원심분리하고 40 μl의 상등액을 SCL 10-Avp 시스템 제어기, LECD 6A 전기화학 검출기 (Shimadzu), LC-10AS 펌프, CTO-10A 오븐, SIL-10A 자동주사기 (40℃에서 유지되는 샘플 냉각기를 갖는) 및 온라인 가스토르 탈기기 (online Gastorr Degasser) (ISS, UK)로 이루어진 HPLC 시스템 상에 주사하였다. 30℃에서 유지된 역상 컬럼 (Kinetex 2.6 u C18 100 x 4.6 mm, Phenomenex)은 분리에 사용하였다 (유속 0.9 ml/min). Ag/AgCl 참조 전극 (Shimdazu)과 조합된 유리질 탄소 작동 전극은 +0.8 V에서 작동시키고 생성된 크로마토그램은 클래스-VP 5 소프트웨어 (Shimadzu)를 사용하여 분석하였다. 신경 전달 물질은 샘플 분석 동안에 일정 간격으로 전개되는 표준 주사에 의해 결정된 바와 같이 이들의 특징적인 체류 시간에 의해 동정하였다. 분석물 대 내부 표준물의 피크 높이의 비율을 측정하고 표준 주사물과 비교하였다. 결과는 조직의 새로운 중량 g 당 신경 전달 물질의 ng으로서 나타낸다.
결과
MRX006의 6일 투여는 노르아드레날린, 도파민, 세로토닌, 5-HIAA (5-하이드록시-인돌-아세트산; 5-HT (5-하이드록시-트립타민의 대사물 (세로토닌))의 수준, 또는 쌍을 이루지 않은 2-테일 t-시험에 의해 결정된 세로토닌 턴오버 (5-HIAA:5-HT의 비율)에 대해 어떠한 효과를 갖지 않았다(도 65). 노르아드레날린 (t12 = 0.307, p = 0.764), 도파민 (t12 = 0.957, p = 0.357), 세로토닌 (t12 = 0.745, p = 0. 074), 5-HIAA (t12 = 0.379, p = 0.711) 수준 또는 뇌간에서 세로토닌 턴오버 (t12 = 0.683, p = 0.507).
논의
뇌간 내에 신경 전달 물질 수준은 6-일 MRX006 투여 후 변동되지 않았다. 이들 데이터는 MRX006이 뇌간의 수준에서 모노아민 수준에 의해 지배되는 거동에 대해 음성적 영향을 주지 않음을 시사한다.
실시예
16g - 중앙 및 위장 유전자 발현에 대한
MRX006에
의한 만성 치료 효과의 평가
합리성
신경 전달 물질 수용체 [세로토닌 수용체 1a(5-HT1a), 도파민 D1 수용체, GABAB 수용체 서브유닛 B1, GABAA 수용체, NMDA2A 및 NMDA2B 수용체], 염증 마커 [IL-1β, IL6, CD11b, TNFα 및 TLR4], 및 내분비 마커 [코르티코스테론 방출 인자 (CRF), 코르티코스테론 방출 인자 수용체 1 및 2 (CRFR1, CRFR2), 뇌-유래된 뉴로트로핀 인자 (BDNF), 바소프레신 수용체, 옥시토신 수용체, 글루코코르티코이드 수용체 및 미네랄로코르티코이드 수용체]에 대한 유전자의 발현은 편도체, 전두엽 피질 및 해마로부터의 뇌 조직에서 분석하였다.
방법
전체 RNA는 제조업자의 추천에 따라 mirVana™ miRNA 단리 키트 (Ambion/Llife technologies, Paisley, UK) 및 DNase 처리 (터보 DNA-부재, Ambion/life technologies)를 사용하여 추출하였다. RNA는 제조업자의 지시에 따라 NanoDrop™ 분광측정기 (Thermo Fisher Scientific Inc., Wilmington, Delaware, USA)를 사용하여 정량하였다. RNA 양은 제조업자의 절차에 따라 Agilent 생분석기 (Agilent, Stockport, UK)를 사용하여 평가하고 RNA 통합 수 (RIN)를 계산하였다. RIN 값이 >7인 RNA는 후속 실험을 위해 사용하였다. RNA는 제조업자의 지시에 따라 어플라이드 바이오시스템 (Applied Biosystems) 고능력 cDNA 키트 (Applied Biosystems, Warrington, UK)를 사용하여 cDNA로 역전사시켰다. 간략하게, 멀티스크라이브 (Multiscribe) 역전사효소 (50 U/μL) (1)(2)(1)(10)는 RT 마스터 혼합물의 일부로서 첨가하고, 10분 동안 25℃, 2시간 동안 37℃에서, 5분 동안 85℃에서 항온처리하고 4℃에서 보관하였다. 정량적 PCR은 마우스 특이적 표적화된 유전자에 대해 어플라이드 바이오시스템에 의해 디자인된 프로브 ((6 카복시 플루오레세인 - FAM)를 사용하여 수행하였고, β-액틴은 내인성 대조군으로서 사용한다.
증폭 반응물은 1 μl cDNA, 5 μl의 2X PCR 마스터 혼합물 (Roche), 900 nM의 각각의 프라이머를 함유하였고 RNase-부재 물을 첨가하여 총 10 μl가 되게 한다. 모든 반응은 LightCycler®480 시스템상에서 96웰 플레이트를 사용하여 3회 수행하였다. 열 순환 조건은 55 사이클 동안 제조업자 (Roche)에 의해 추천된 바와 같다. 앰플리콘 오염을 억제하기 위해, 각각의 전개물은 사용되는 각각의 프로브에 대해 3회 어떠한 주형 대조군을 함유하지 않았다. 사이클 임계 (Ct) 값을 기록하였다. 데이터는 β-액틴을 사용하여 정규화하고 2-AACT 방법을 사용하여 전환시키고 대조군 그룹에 대한 배수 변화로서 제공하였다.
결과
도 66은 MRX006이 신경 전달 물질 수용체 세로토닌 la (5-HT1a) (t11 = 0.742, p = 0.474), 도파민 D1 수용체 (t10 = 1.426, p = 0.184), GABAB 수용체 B1 서브유닛 (t12 = 1.871, p = 0. 086), GABAA 수용체 (t12 = 0.017, p = 0.987), NMDA 수용체 서브유닛 2A (t11 = 1.275, p = 0. 229), NMDA 수용체 서브유닛 2B (t11 = 1.39, p = 0.192)의 해마 유전자 발현에 대해 어떠한 효과를 갖지 않음을 보여준다.
도 67은 MRX006이 신경 전달 물질 수용체 도파민 D1 수용체 (t11 = 0.429, p = 0.677), GABAB 수용체 B1 서브유닛 (t11 = 0.998, p = 0. 344), GABAA 수용체 (t11 = 1.145, p = 0.277), NMDA 수용체 서브유닛 2A (t12 = 0.852, p = 0.411), NMDA 수용체 서브유닛 2B (t12 = 0.395, p = 0. 707)의 편도체 유전자 발현에 대해 어떠한 효과를 갖지 않음을 보여준다.
도 68은 MRX006이 신경 전달 물질 수용체 도파민 D1 수용체 (t11 = 0.583, p = 0.571), GABAB 수용체 B1 서브유닛 (t12 = 1.304, p = 0.217), GABAA 수용체 (t10 = 2.043, p = 0.068), NMDA 수용체 서브유닛 2A (t11 = 0.177, p = 0.104), NMDA 수용체 서브유닛 2B (t11 = 1.235, p = 0.243)의 전두엽 피질 발현에 대해 어떠한 효과를 갖지 않음을 보여준다.
조사된 임의의 뇌 영역에서 신경 전달 물질의 mRNA 발현에 대해 MRX006은 어떠한 효과를 나타내지 않았다(도 66-68).
해마 및 편도체 (도 69 및 70[A1])에서, 다양한 염증 마커의 mRNA 발현에 대해 어떠한 효과가 없었다. MRX006은 염증 마커 IL-1β (t10 = 1.346, p = 0.208), IL-6 (t12 = 1.041, p = 0.308), CD11b (t12 = 1.195, p = 0.255), TNFα (t11 = 0.816, p = 0.342), TLR4 (t12 = 0.521, p = 0. 612)의 해마 유전자 발현에 대해 어떠한 효과를 갖지 않았다. MRX006은 염증 마커 IL-1β (t11 = 1.53, p = 0.988), IL-6 (t11 = 1.145, p = 0.217), CD11b (t11 = 1.143, p = 0.275), TLR4 (t11 = 0.971, p = 0.532)의 편도체 유전자 발현에 대해 어떠한 효과를 갖지 않았다.
전두엽 피질에서, MRX006은 다른 염증 마커에서의 임의의 변화 없이 TLR4에 대한 mRNA 발현을 감소시켰다(도 71). MRX006은 전두엽 피질에서 TLR4 (t12 = 2.639, p = 0.0216)의 mRNA 발현을 유의적으로 감소시켰지만 IL-6 (t11 = 1.145, p = 0.217) 또는 CD11b (t11 = 2.175, p = 0.523)에 대한 전두엽 피질 유전자 발현에 대해 어떠한 추가의 효과를 갖지 않았다.
MRX006은 해마 (t12 = 2.389, p = 0.0342)에서 바소프레신 수용체 mRNA 발현을 감소시켰지만, 내분비 마커 CRF (t12 = 0.767, p = 0.458), CRFR1 (t12 = 0.174, p = 0.865), CRFR2 (t11 = 0.238, p = 0.816), BDNF (t12 = 1.548, p = 0.148), 옥시토신 수용체 (t12 = 0.762, p = 0.461), 글루코코르티코이드 수용체 (t12 = 0.607, p = 0.556), 미네랄로코르티코이드 수용체 (t12 = 0.67, p = 0.516)에 대한 mRNA 발현에 대해 어떠한 추가의 효과를 갖지 않았다(도 72).
MRX006은 편도체 내분비 마커 CRFR1 (t12 = 0.226, p = 0.825), CRFR2 (t11 = 0.78, p = 0.451), BDNF (t12 = 0.201, p = 0.844), 바소프레신 수용체 (t12 = 0.756, p = 0.465), 옥시토신 수용체 (t11 = 0.167, p = 0.87), 글루코코르티코이드 수용체 (t11 = 1.027, p = 0.327), 미네랄로코르티코이드 수용체 (t11 = 1.448, p = 0.175)의 mRNA 발현에 대해 어떠한 효과를 갖지 않았다(도 73[A2]).
MRX006은 전두엽 피질 내분비 마커 CRFR1 (t12 = 1.666, p = 0.122), CRFR2 (t11 = 1.179, p = 0.261), BDNF (t11 = 1.065, p = 0.310), 옥시토신 수용체 (t11 = 1.037, p = 0.322), 글루코코르티코이드 수용체 (t12 = 1.185, p = 0.259), 미네랄로코르티코이드 수용체 (t11 = 1.910, p = 0.083)의 mRNA 발현에 대해 어떠한 효과를 갖지 않았다(도 74).
편도체 및 전두엽 피질에서(도 73 및 74), 임의의 내분비 마커의 mRNA 발현에서 어떠한 변화가 없었지만, 해마에서(도 72)는 분석된 다른 내분비 마커에 대한 임의의 효과 없이 바소프레신 수용체의 mRNA 발현이 감소하였다.
논의
염증성, 내분비 및 신경 전달 물질 수용체에 대한 중앙 유전자 발현은 6-일 MRX006 투여 후 대부분 변동되지 않았다.
생리학적 파라미터에 대한 MRX006 투여에 관한 전체 결론
전체 이들 데이터는 MRX006 투여가 전신 및 중앙 생리학적 이벤트에 음성적 영향을 미치지 않음을 확인시켜 준다. 이들 데이터는 MRX006이 최소의 바람직하지 않을 수 있는 부작용과 함께 높은 관용성 프로필을 가질 수 있음을 시사한다.
실시예 17 - 모계 면역 활성화 (MIA) 마우스 모델
사용되는 MIA 마우스는 실시예 3a에 기재된 바와 동일하다.
실시예
17a - MIA 모델에서
생체내
위장 투과성에 대한
MRX006에
의한 만성 치료 효과의 평가
회장 및 결장의 투과성은 실시예 2k에 기재된 바와 같이 어싱 (Ussing) 챔버를 사용하여 생체내 평가하였다. 도 75는 MRX006에 의한 만성 치료가 MIA 모델에서 결장 또는 회장의 투과성에 영향을 미치지 않음을 입증한다.
이것은 MRX006에 의한 만성 치료가 소화관 투과성을 변경하지 않음을 확인시켜주고, 이는 이로운 사회적 거동, 감소된 불안증 유사 거동 및 MRX006의 고정 관념 거동 효과가 소화관의 통합성에 결함을 초래하지 않음을 보여준다.
실시예 17b - 사회적 거동의 평가 - 3개 챔버 사회적 상호작용 시험
3-챔버 사회적 상호작용 시험 (3-CSIT)은 실시예 1a에 기재된 바와 같이 수행하였지만, 상기 데이터는 치료에 맹검인 연구자가 수동으로 스코어링하였다. 실시예 1a에서의 데이터는 컴퓨터 트랙킹 소프트웨어에 의해 자동으로 생성되었고 이는 마우스와의 상호작용과 마우스와 동일한 챔버에 단지 존재하는 것을 구분할 수 없다 [A3].
사회적 신규성 시험에서(도 76[A4]), 사회적 차별에서 MIA-유도 결함이 없었으며 MRX006은 사회적 신규성에 추가의 영향을 미치지 않았다.
도 77 [A5]은 사회성 시험에서, MRX006이 사회성 거동에서 MIA-유도된 결핍을 역전시킬 수 있음을 보여준다. 이것은 MRX006이 사회성 결함을 역전시킬 수 있는 BTBR 모델에서 나타난 데이터와 유사하다 [A6].
실시예 17c - 시회적 거동의 평가 - 털 손질 (grooming) 시험
털 손질 시험은 실시예 2e에 기재된 바와 같이 수행하였다. MRX006을 사용한 만성 치료는 털 손질 시험에서 MIA 마우스에서의 반복적인 거동 변화를 유도하지 않았다(도 78).
실시예 17d - 사회적 거동의 평가 - 상승된 십자형 미로
상승된 십자형 미로 시험은 실시예 2f에 기재된 바와 같이 수행하였다. MRX006을 사용한 치료는 상승된 십자형 미로에서 MIA 마우스 내 불안증 유사 거동에 대해 어떠한 효과를 갖지 않는다(도 79).
실시예 17e
-
사회적 거동의 평가 - 강제 수영 시험
강제 수영 시험은 실시예 2h에 기재된 바와 같이 수행하였다. MRX006을 사용한 만성 치료는 강제 수영 시험에서 MIA 마우스의 부동 시간을 감소시켰다(도 80).
실시예 17f - 스트레스-유도된 순환 코르티코스테론 결정
코르티코스테론의 수준은 실시예 2n에 기재된 바와 같이 측정하였다. MRX006을 사용한 만성 치료는 강제 수영 시험에 노출된 MIA 마우스에서 스트레스 유도된 코르티코스테론 수준에 영향을 미치지 않는다(도 81).
결론
MRX006을 사용한 치료는 사회적 거동에서 MIA 유도 결핍을 역전시키고 강제 수영 테스트에서 부동 시간을 감소시켰다. 이것은 사회성과 항우울 활동을 개선시키는 MRX006의 능력을 입증한다.
실시예 3에서 상기된 결과에 추가로, MRX006은 자폐증 스펙트럼 장애의 증상에 대해 양성의 영향을 갖는 것으로 입증되었다.
서열
서열번호:1 (블라우티아 스테르코리스 균주 GAM6-1 16S 리보솜 RNA 유전자, 부분 서열 HM626177)
서열번호:2 (블라우티아 스테르코리스 MRX006 (균주 830)에 대한 공통 16S rRNA 서열)
서열번호:3 (블라우티아 훽슬레라에 균주 WAL 14507 16S 리보솜 RNA 유전자, 부분 서열 EF036467)
서열번호:4 (블라우티아 훽슬레라에 균주 MRX008에 대한 공통 16S rRNA 서열)
서열번호:5 (MRX006 (균주 830) 염색체 서열) - 전자적 서열목록 참고.
서열번호:6 (MRX006 (균주 830) 플라스미드 서열) - 전자적 서열목록 참고.
서열번호:7 (블라우티아 하이드로게노트로피카 균주 S5a36 16S 리보솜 RNA 유전자, 부분 서열 X95624.1)
참조문헌
SEQUENCE LISTING
<110> 4D PHARMA RESEARCH LIMITED
<120> COMPOSITIONS COMPRISING BACTERIAL STRAINS
<130> P071054
<141> 2018-05-22
<150> GB 1708176.1
<151> 2017-05-22
<150> GB 1714305.8
<151> 2017-09-06
<150> GB 1714309.0
<151> 2017-09-06
<150> GB 1714298.5
<151> 2017-09-06
<150> GB 1716493.0 ?
<151> 2017-10-09
<150> GB 1718551.3 ?
<151> 2017-11-09
<160> 7
<170> SeqWin2010, version 1.0
<210> 1
<211> 1372
<212> DNA
<213> Blautia stercoris
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gtaagcggaa ttcctagtgt agcggtgaaa tgcgtagata ttaggaggaa caccagtggc 660
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<212> DNA
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<221> n
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gacgggtgag taacgcgtgg gtaacctgcc ttatacaggg ggataacagt cagaaatggc 120
tgctaatacc gcataagcgc acagagctgc atggctcagt gtgaaaaact ccggtggtat 180
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cggaacaagg aaagtcaaga ttcctaaaaa tttccatttt ttacgcattg actcataagc 2520
gtaaatcgca ctttttccgg tttttcgtcc gattgcaata tctgtagtca gtaaagtaaa 2580
accaaaagtc aaaaccaata caagatagat aatcagaaaa agtccccctc catctttcgc 2640
agccaggtaa ggaaacctcc ataaattgcc gactcccacg gcacttccag cggcagcaaa 2700
tacgaatcct atctgaccgc tgaatccact tttttgtttc attctctttc acctcatctt 2760
ttttatttaa catttagata tcatgccatt aaaacaatcc agacctcatc agtcagtgtg 2820
ttgatttgct acgccaaaca gcgtctgcta ctccttcacc ggaattttca ttggtacatt 2880
ttatcattaa acactcttta ttgtcaattt ctttatttca aaaaatcctg tacattatct 2940
ttcgtcactt tttcataagg caaatagata tatctttgat tttcaaattc cacttttttc 3000
attttttctc cggtaacaag ctgacgtgca agctgtgcca ttgcatttgc ctgtgcctct 3060
ttatcattat ataccgtagc ggccatcttt tcttctaaaa cagcttctaa accttcatct 3120
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attcgattga caagcactaa catcattgcc attaacagca tcaacatcac aataaaacat 5880
tgcaaattcg tcaactgatc tgtgaaaatc gaatacggta tcacaccaac taatttccag 5940
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atctgcatct gtctcggatg ataaatgatt ttgccattac tatcacataa ataaaaatac 6120
tgcccatttt ctaaggtgtt aatctgatcc atcatacgtg agatttcaga ataatccata 6180
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gaagaaataa cccaataata gcgaaacgtt ccatcatcaa ataaattctg gatatgtgga 6300
atcgaaaaat gtatattttc catttcatcc atcgcatgga taaaccaatc ctgctttgtc 6360
acatttggat cctctttttg agatacgacc ggctctgctg caatcagact tccaaaatta 6420
ttataaattg cgatacttct taatctactt ttatttgctt catataataa ctgcattcct 6480
ttttgaattt cttctgactc cgtagaaaaa tcgctttctt ttatcacact ataataagct 6540
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atcttttaaa tattgttcta actgttcttc ataaatgcgt ccttcaatta aagtcgaata 7920
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tgcatattca aattcatcaa agccggtaaa taacaaaatt tttgttgtcg gatatcggct 8160
tttgatttcg ccacaaagct gcatcccgtc catataaggc attcgaatat ctgtcattac 8220
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aattacgcaa aatccaagct tgtcccaatc tatttttctt tcaatcactt gtgttacttc 8340
ttcttcatca tccaccaaaa gcaagctata tgtattcatc cgcttttctc cattttttta 8400
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ttaccgctac aagaataatg atacctgaga atacgaactg aaggtttgta tcaataccaa 8580
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ttttaccaat accaccggta aaggatacac cacctacaac acaggctgcg atggcatcca 8700
tttcccatcc ctgtccatat gctgcggaac cggaaccaac cattcttgca cattccagcc 8760
aggcaccaaa tccataaaga atacctgcca tgatgaatgc accaagcata actccaaata 8820
ctgagatacc agaaactgct gcggcttccg gatttccacc tactgcgaaa agattttttc 8880
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caccaaagga tacacctttt gttgaataag taactaaacc aaagattaca agcatatttg 9060
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cggtaagcaa gatcaaacct gcaacaccaa gtgctaagaa cattctagga gatgcctgct 9360
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ccatcgcaat tccattttca agagcatctt tcggtccgga aaagcttact tcttttccat 11460
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gcacgttctg ccgggagcgc atctcctttt tttaatctgc ctgctctgat attttcgata 16440
atctgattta aaatttcatc aaacgcattt tctttactaa tctgcctgaa catatttctt 16500
tccttcctaa aaaataatgc ttttcttttt catccttttt ttattatacg tcttttcatt 16560
ttaagtaaca agctgaattt tatagcaaaa agaaaagcct acgaagaaaa tttctcccct 16620
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tgttttcttc tgattacttc aagaatcaca agtgtaacaa tgacaccaaa tgccagtgat 16800
atccatgcat tttgtgtgaa tcctgctacc acataggtta cacagctgat tgccgcaacg 16860
gtaagagcat atggcagctg agtagaaaca tgattcacat ggtcacactg tgccccggca 16920
gatgccataa ttgttgtatc tgaaatcgga gagcaatggt ctccacaaac tgctcctgcc 16980
atacatgctg aaatggaaat aatcataagc tgtggatttg aattctcaaa tacatgtaca 17040
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gctcctacta aaaagatgat tgccggtaaa aatttcataa aacttccggc acagccctgc 17160
atcacagtat ccacaaactc cgctgcacca agactgtctg tcattgcttt taaagtccag 17220
gcaaatgata aaatcataat tgccggtacc atcgctttaa atccttccgg aatacatccc 17280
atacattcac ggaatggaag aattcgacgt gccacataaa agataatagt aattaaaata 17340
ccaaacatac ttccgattac cagcccgaca gaagcatcac tctgtgaaaa ggcagttaca 17400
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tcatgtgttc tcattgaacc aaattcagct tttaataaaa ccattccaac catcataacc 17640
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aatccttcct gaatcatatg gacaacggtt ccttcaaaac taaagttcga ataaaacaat 18120
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acaatcgcta caatcggagg caccagtgcc caaaaagtag catacatttt cggcacgtat 18240
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attaaaatat aactctgttt tcctccaaga taataccatg ctgccgcacc tccggctact 21540
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attccggatg atacactttt gaagcacaaa tcctgtccat caccatctcc gctatataat 22020
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attaatatca gaaaaaaata atttactctg tgaaagccat ttatctttta ccaaaacttc 23340
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ttcttcctgg ttttggagaa tacaaagtcg tcggatgaat ctgaacataa tccggatgtt 141600
ccagttcaat tccatgtttt aaggcaattg ccaatgcatc tccggttaaa tgtgggaagt 141660
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gaaatcaaaa gcatcatagc tgtagtactg cagattaaaa gtgtatcaat gaaaacagaa 155160
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tttcttgttc ttcttccaaa ctttatataa agcgttcaag ataggaagta aaacgcatat 166560
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tgtatcatat ccagcatttt ttgctccaca agccgtcgtt ttgaatcacg gagcaaatca 168660
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ttcatccggc agcatctggt tgacgattct ctggtccagg cccagcttac ggccatccga 182460
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gggacgctgc ttgggacgga tcacagctac tttgagaatg ttgcccacga tcttttccag 201660
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gtcggcattt ttagagctga tatgtttgaa tgttgccaac agcatcaccc actttctgca 208560
agacttcaaa ctttagggca gcaaggtcgg aaaccgccgc ccgtacttcc ccggcaagct 208620
gcgggtaggg actgtgccac tcgttcagcg tccgggctat ctggtttaag ttgccgccga 208680
tcctgccgta ttcggcggtc agcttcccga cagcggcaag cagctcgtca ttgacggggg 208740
aaacggttat gatggggcgt atggctgccc cggttatggc ttgccggata aactcggctt 208800
ggctcatgtt gcaggcagaa agcctttccg caaactcggc gtattcttcc tcggtcatgc 208860
gtgtcttgac tacccggctg cggtgcggcg tgttgtatcg ttttcgcatg gtaaaaacct 208920
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gtagcccata cctaaaacgg tttttatgta aatgggcttg cggctgtccg gctctatttt 209340
tttccgcagg ttgtaaatca catttgcaac gcttgactgg cagctttcac tttccatgtt 209400
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tacaagggta ctgtattcaa ggcgggtaag gcttacttcc tccccgtctt gaaatacccg 209520
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ttaattttat taaatagata ggttgaattt ttttcggttt tacaaattaa gcatatcgac 210180
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aatacatttg aaatatattg ctcaaatata gaatttgggg aaataatcat aatgttattt 211260
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tattattata gtgggaagaa gtatgttaga tatttgattt ctgcaagcat atcaattcta 212220
atacggacgt gtaatttaag caataaacaa attgggacaa agcagttata ccgctatgtc 212280
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accagcgtca aagttctgtt ttccacttct tcctgcattt tctcgcctcc tttccacgaa 218700
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atcgtttcac ggctcatggc gtttaccaga gaaacctcca taccggaaag ctgaatatcc 222000
gcaggcatca ggtcaacgcc ttctgcatga tgcagaatac cttctccggg gcgtataggc 222060
tgatccatca gaattttgcc cattgcatcc gacagtgtaa ctggcagctt gtccggttgc 222120
ggatttccca agctgattgt caggcttcct tgtgggtccc cgtcgatcag aagcactttc 222180
tttccggcct gtgccaaacc tattcccaag ttcgcacagg ttgttgtttt gccaacgccg 222240
cctttctggt ttgcgatggc gatgatttgt gtgttcatga cttcacctca tttctgattg 222300
ttgctgttgt ttctggaaat agaaaaagcc gccacttcaa aatcataaag tgacggccct 222360
ttctaatgcc ggaatctctg aaacaaaaaa agcacccagt tatttgttac tgagtgcctg 222420
cattagaatc gtatttaatt gttcagattt ggtcagatta tgccaaaccc tccagcgaaa 222480
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atttttcaat taatttcgtt cccgcccttt tattataaag ctttgtgagt ggatctctct 227820
gcgcttcttc ctgcagttgc tcttcccttc ttctctctat cgtaacatct ctgatacttc 227880
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acaaaatatt ttcggtcatc aaaaagcgta attccaatcc agattgtaac cggaattaaa 249240
attaaaatca aaaacataga tgcaatcgta cgttttgaca gctttccctt gtgttttggc 249300
gctgtcagta catcctgcgc ttcccagaaa tcgttttttt ccggttctga tttctcatcc 249360
cagaaatcca ggtctgtttc ctgtgccggt ttcttcccat ctaaaaaggc atccagaaag 249420
acatctaatt tttcttcttt cagcacgaca ccgcctcctc ttctgtctga ttgattgctt 249480
ttaccacatc ctctactgtt accgcatttg gaaaataatt tcttgccata cggtttgcag 249540
cagtggtata aaagttattt ccggcaaaaa attttttcga ttcttcactg gttaccacat 249600
ttccctgaaa gaacagtccg gtacgatccg catactgcgc acaaaattct acatcatgag 249660
aaatcatcaa aatcgttaca ccatgttcac ttaattttct taatatctct ccgagttctt 249720
ttttataatg attatcgatt cctttggtcg gctcatccat caaaagaatt ttcgggcgaa 249780
gcagaagtac ttttgcaagt gccagtctct gctgctctcc accacttaaa tcatagggat 249840
gccggtctaa aagcccttct aatcttgtta acgagacaat tccctcaact gcatcttttt 249900
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cggttccgtt tcctcctacc actgcaaaga tttctccttt tttgatgtcc aggcttaacc 250200
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attctgcatc aattcgatac cggtctgcat gcgctctcaa atagcgaatt gccgctttta 257700
catcctgaat ctgcattgga tactctccct cattggaggt tcgatactct acacttgcca 257760
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taataaatgc tgccaggaaa atagttgttc ccataattaa cggatagtca cgattctgaa 276540
ttgcctgtac aaaatatctt cccagtcccg gaatagagaa tacggtctct acaaccaaac 276600
cgccgcaaag tgtaaatgcg atctgtggtc ccaaataagt aataaccgga attaatgcat 276660
tacgtaatgc atgtttgaaa ataattttac tattcttcaa accttttgct cttgctgttt 276720
taatatactc ctgattgatt gcatccagca tagatgttct ggtctgtctg gacaaatagc 276780
acatcggata aaaaccaagg gctacacacg gcaacacata actttgcgga gtaccatcaa 276840
acaacgccgg gaaaactttg attccctcaa caccaccaca gaatgtatgt aataataaag 276900
ttgcaactac aaaccccggc atggaaatac cgatagtaca cagcactcgc agaaaactgt 276960
caatccaggt tcctctctta aatgctgcaa gacatcccag cggaatgcct aaaagcactg 277020
cccataaaag agcaaggcta cctacttttg cagataccgg gaacatttct ttgataattc 277080
ccagaaccgg acggttcttc tgcatcttga tggaagttcc aaaatctccc tgtgccaagt 277140
ttttcagata cttgcccagc tgaacataca taggctgatc cagtccgtat tttgcattca 277200
atgcctggat tgtcgcctca gacggtgttt tttctgataa ccatggatta cccggaatcg 277260
cattcatcaa aaagaacgta atacaagcaa caagcagcaa tgtaacaaat gccatacaga 277320
ttcttcgtat tgtgtatttt gtcatcttct atacctttcc tctctttctc atctctcctg 277380
tcgatgtaaa gcggacattc gcaatccgct ttgctacttg ctcatgaacg cagataagca 277440
ttcccccact tcaagtgcgc agagcactaa gcggcgggta agggggatgc ttatctgcgt 277500
tcaaattgta aattgtcgac aatatgacaa tattataccc attttaacgc attaatgtca 277560
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ttacgtttta taatctcata cggctcgcta taccagattt ttggctcatc tgcttcattt 277680
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gaagatgtac ccaactgatg gaattcgccc agccattttt tccagccaaa aatttcattt 278880
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catcccttcg tcttttttat atttttttat tgtaacatag tttttgtgct gtcagcacag 279000
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tccattcttc gcagcgaatc ctcaacatct tttttcacag ctgctgctcg ggtgtcatta 280020
tttacggtat aaccgtctcg ttcgtaatgg aaattaccac cctcatctct ccaattcaat 280080
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cactgtttct actttagccc cattttccgt cagcataaat tctgctattt ccacattcag 282060
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aaatggagta aacaattcat tttttataaa ttcttctgac attccaattc cagtatcttt 282360
tattttaaat tcacatgtca tatgatcttc tgatctttca atcgttctca tactcatgta 282420
aataaaacca ttcaccttat tgtacttcat actgtttgta aacagattca tcaatatttt 282480
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ttcttaaaat catgcaactg gtttatttcc acattccgta tcgtctccat aaaatcgcct 289740
ttctcgaata catcgaattc atctattctg aaatccatct gatacgatga ctttcagata 289800
caaagaaaga ccgctcactt tcaatttttc ttgaaaatga acggtctttc acgcttctgt 289860
tatttagttg aatgataaat gtattacttt ctctttgatg tgtttctgaa gccgcaatcc 289920
aataccacag acacgtttac tccatcagaa atagcctttt tatacgtttt tcggtcactc 289980
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caagcatacc cttcatcata ctcttaattc tcataatcgt ttctcctctc tgaaacatgt 290280
tttgtttttc ctctgcttca ctatacaata ccgttgtaaa aaccaatgtc caaagtagga 290340
aaaatttgag taaattccga cacttatttt atgcagttct atctttatga gatttcatca 290400
acatcataat acttaaaatc ccggaagcag gcacttcctc ctgtttcctc tgccgcataa 290460
cagaacagac caaaccggca accagtaaaa tgatccagtt tgaagtacag cttatgcacg 290520
gttccgatgg gtagccagtc tcccttattt acccggtaat agcagcgtgc ttcatccttc 290580
atgttacaga aatctgcttc aagacgaaaa tctatctggt gtgattcaac aacagttcct 290640
tccgtcatat ccaatatacc atcttctttt ttatccagca taaggacttc atattttcca 290700
tgatgttttg taatgccaac tgcagcataa cagctctgca acgcacacaa acctgcgata 290760
tcgccctctt tcaatgcaga agcatcaaca gtaacctcag ctgcgcagga cggataactc 290820
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ccggaatcct gaaacagcat tgcataccac tttccatccg gcgtatccac tattcctccc 291180
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gaatgaacca gaaaaatata ataatagccg tttatttttt gaatatgaga accctcatag 291360
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ttttccgtct tcaatctgta aaatcctgtc agccatctgg gcaatctcct cattgtgagt 304020
aatcattaca atcgtttgat gaaaacgctt actggtgact tttaaaagtc ccaatacatc 304080
ctgactcgtt ttggagtcca gattgcctgt cggttcatct gccagcaaaa tagcaggttt 304140
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tcaggcacgc catagaatca ttattgtcgg catccgcaat gacattaatg taacctatca 317700
cgttccttct cctgaaccat atagcgagat agacaacacc tgcagaaatg ctattgaaaa 317760
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tgaacgtctc agacatattc gtcctggtga aaatgcattt acagcggatc ttccgcctga 317880
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tcttttgacg taccatccgg tgtatcattc cggaaacata ttccatttct tctttgggat 399660
tggcacattc caaaaccctt atcgaatcct gtctttcggt ataacagttt cttttagaac 399720
gaaataaatt ctgctctaaa aatgccagtg ccggctgatg gaaaaacctt gcgtttccct 399780
taattttcac atcgtccacc ggacagccga ctcttgacgc tgtctggcac aatctactca 399840
ccgtctgctt acttaaataa aacagattcg tcgcatcact ctgcacataa ggacgttccc 399900
cttccccgat tgtaaccgtc acatacattt cttcgcagag gggcagaatc ttctccagta 399960
cattttgctg aatcggtgta aatccggtat agccatccag aaccagtatg ctctctttta 400020
attttttcga ctttccggct acacttccaa gcacttcaag cacttcttct cttgtgattg 400080
cttttccttc cagatactca aaaaagccgt cataaagcac tgcaatatcc tttaatttat 400140
agtaaagttc cggcttatcc tttgcacact ccagcatttt ttccatgtct tcttttgaga 400200
cttcatactg ccgaagctca gataccatgg atttcatttc agagatataa ccctgtcgtt 400260
tcattttttc gccaagcaca cttaattcct tcttatgatt ttgtgccact tttcggataa 400320
ccagactctt tccggtctct tctaacacat cctcacacag ataacctgtt tcttctaata 400380
ctcgaaaagc aagacgttca aaacttaaga catcaatatt taaaattcct tttcttggat 400440
gcatccggac cagttctttc tgtgtctgca tcgtaaactg ctctggtact aataccagat 400500
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gaaataatag aatccccctc ataagtcata agacccgttc cataatgcat ggcatcgtca 401160
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gaatttgtca ctgttccatc aatatccaat actaataatt tataactcat ttttaaaaaa 401460
tcctcctcaa tttctcagat gtttaaccaa atcaagtaag tcccctgctt caattgcgaa 401520
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gctgcgtagc agctatttgg ttatgagcaa gtagcgaagc ggattgcgaa tatccacttg 401640
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tctttttctc ctaataaact atgatgtgag tgtcaaaaat aaattttgcc actcgctgat 401760
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acgaaagaag tgatttatac cgtgcttttt gttgtactcg ccattgtgct tgcagtcctt 402060
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acccagtcca caaaagacct tacttatgcc gaagaaaata aatatacttc gatgctgttg 402360
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gctgatgaca atacttgcac tatcctttgc agagttgatt ataaccagta agaatggagc 403260
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cttcatactg ttttgcaaaa tcttttaagg ccgagtcaat ttcaattttt gtatttacaa 405600
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atatttggtg tatagtcata tttttttaaa attttctgaa ttcgttcgat attagccagt 407040
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tacttcacgg atatcagctt cattcatata accccagcga ctctgctgat agccaaatgc 408780
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tgtgcatcaa aatggcattt atcatcttgg agttggcggt ggaattaccg ctgaatccga 427020
attggaattt gaatatgacg aaacctggca gaaagccaaa gccgttgtcg cagccatcgc 427080
aggaggtgac gtgcatgagt aatcttactc ttacatcatt aactccagat gatggttact 427140
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acgaacactt aaaccgttta aaaaaatccg ctctttttct tggatttctg ccggataaaa 427260
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acattttaga aaaacgtctg gcaaaacagc gaggatacga cgaacccatt ttcttaaata 427560
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ataatttcaa gacctttgta gtctttggat ttgtagattt caccatcagc ccagcaaatt 437220
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tcttttaagt tttcgtcgtt tccttcgatt tcgaaaccaa ggcaagctgt gaagtcttct 437400
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gcaatcccct ccagttcttc tgcgcttacc cttccagcat caaacatctg atattttttc 454260
tgttttaaat aacggacaat cagttctgtc ttaccaatac cgctcactcc gtaaatataa 454320
gcagttatat tttcttcttc ggcagccttc aaacgcctga gtgcccgttt tggccggata 454380
taacatattt tgtccttttc tgtcaatgat acacccctct tcctttttcc tttctataca 454440
tagaattata acaattttcg acatctttgt atactaacca aacggctagt attttcaaaa 454500
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tattcggttg cctctgtaag tccggttaag tcatactctg taacagttac cggagaagca 466020
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ttgattgccg gagagttttc tgcaagtttg tatccatcaa atacggtctt tgcatttgga 467940
tcttcatgtg ttcttgcttt tttatttgct gctacagaat ccggaccgga acctgcatca 468000
accagtactt ttgtaccttc atttactttt acagcagctg catcgtttgg ataagtactt 468060
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taaagtactt gggctcgagc ttggggcaga tgactatatg attaagccgt ttgattccaa 481440
agaacttgtt gcaagagtaa aagctgtcct gcgccgttat cagccaacgg tcgctcctgc 481500
cggacagcct gccggaaaat acgtagaata tccagacctt gctatcaatc tggcaaatta 481560
ttccgttgtc tattttggaa ggcagattga tatgcctcca aaggaactcg aacttttgta 481620
tttccttgct tcctctccca atcaggtctt taccagagaa caactcttag accatatctg 481680
ggggtatgaa tatatcggag atacccgtac agttgacgtg catatcaaac gtttaagaga 481740
aaaaatcaaa gaccatccat cctggtctat cagcactgta tggggaatcg gttataaatt 481800
cgaggttaaa aatacatgag aaaatctctc tatataaaat ttgtaatttc ctacctgatt 481860
cttgctttca ttggattttt tgcagtctcc atgtttggtt cctctatggt acacaatcat 481920
ctggactctg tttacagcac ttccttatat caggaagcca caaatattgc ccaaaaccag 481980
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ttgtcaaaat atcagaatgt ggaaatctgg ctgattagca aaaaaggaga aattctttta 482100
aatactgcat cggattcgga tgataataaa cttactgtca tcgaagattt taatcccggt 482160
cattcaaatg gaacttacta ccagaccgga actttcttta acatgttctc taccgaacat 482220
ttaagcgtaa tggttccagt cacttcccag ttaaatatac aaggatatgt tgccatccat 482280
ctgccggaaa gtgtgatttt gaaccagcag aatcagatta tgaatatcat ttattcttta 482340
attttaatta ttcttctgat tatgctctgt atcctgcttg ttttctcttt tatggtctat 482400
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tcagacgaac ttgataaagt caacgaatat cagagaaaat ttgtcgccaa tgtctcacat 482580
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aatgccgata tgggtaaaat ccagcaggta ctttataatt tgattgacaa tgcaatcaaa 482940
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cgtttttata agattgattc ttcccgtgga aaagaccgaa aaggtacagg acttggactt 483120
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agattccttt taaaatctgg tctttttgct ggttaattgt aaattccaat aactccggtt 487380
catatccaaa ggttcttgca taagaacgca gactgtaaac cgccagattg gaatgaatat 487440
attttgcatt aattgcaact aatactgttt tcataagttt ctgttcctct ttttattttt 487500
caatcgatac aatgttgatt atacacatcc tattttattt tttaaagacc aaaaaagaaa 487560
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tttaacaaat cgagtttcat ctgccggaga atgatctgcc ataacttttg tatactcatt 487680
ttccacgtaa tctgcttttt catttccttt tgaagcaaaa gtcatcttta agaagattgg 487740
tgaaatgatg gttgtaataa caaccacgat aacaaccggt ccaagtaagg aagatggcat 487800
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tggaataaat gcggtaacac ctttatttaa catgtttacc attgtttcaa cagtttctaa 495000
acgaataccg gagaatcctt ttactaagtt gttgatacga agtaacataa caccccttgc 495060
cacatcaatt gggaatgggt caccggcacc aactgcatga gtaataatta agtttctctg 495120
aagttcttta cactgttcct gagaaattac aacgtcactg aatttaccaa aaccagttgt 495180
gataccgtaa acaactttct cctccgctac taagtcgtct accacttttc tggaatcaat 495240
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agcggacatc attctttatg atgcggacat ttgtatcagt acgttatcat ggtaaaactg 495540
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atatatttga atatgaaaat ggagaaactt tcctcactac agcgaaagaa tgccctttca 508680
ctgtagtgtt tctggatatt tatatgaatg gatccaatgg aattgataca gcaaaagaac 508740
ttcgcagatc agacactaac tgtctgctga tctttacaac aagttcaact gaccatgctc 508800
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tgtcctttac tgtaattgcc atacgttttc ctcctaaaca agatttttgt tttcactgtt 522360
tgctctcgta tcttactttc tattttaacc ttttacagct ccatttgcta ccccatttaa 522420
gatttgtttc tgacataata agtagaaaat cagaatcgga attaatgcaa gaatgtagga 522480
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tccaagtgcc gttaaaatcg caacggtcgc atgcattgga gacatcattg ggaatataat 522660
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actgttgatt gctcctgcat ctacaatgac tacttttgta tcttctttga tgctgctttc 536040
aatatcggac tggaaaatct taatgtttgc aaaaaacaga ttttcgctga atcgataaat 536100
aattgtattt ttaatcggat aagcattgcg gtttcgtttt aaatcataat aggcttcctt 536160
gcctggaatc ataccataaa aagcacgagg cggattggtt gctcgtaaca caactgctat 536220
aaaagaaagt aacaatccga ttacaacacc ataaatggtt cccaaaaaca aaacactgat 536280
gcacgctgct acaaatatat aaaattcatt ccgacttact ttaaataagc gaattgccag 536340
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ctttgtattt cttttcaagt actgaaataa tactttatga gcgtccaaaa tcgagaaacg 549660
taccccttca cggctgattg caaatccatt attttccgtg ccaatcaatg atttcataga 549720
taaaacaacc ggctcaagca tggctctttc cttggcactg cgtcccacat ctgaaaattc 549780
taatggttct cttaagagaa cagcagaagg ggtgctgttc actccctctt cattttcaat 549840
tactaaaggt ttttcaattt tcgtgttata gactcctact acgctgttat tcgtaccaaa 549900
gtcaattcct atcgttttcg ctgcgtattc ttcaaacatc gtcagtctcc tcctgtatat 549960
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attgattttg caattctggc atgtttctct tcttcctctg tctccacaat atcaattact 550080
tcatgaattt ttgaatcaaa agcagaattt tcctttgttg tatgaatttt aacccccatc 550140
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tctcataata taaaaatacg gtcttttttt ctctggattt ttcggtgctt ttggaccttg 577080
catctttctt tctccccagt ctcattctta atttcattta ttataacaga ctacactctt 577140
tagaacaccg ggagaaatta tagaaaaaac tccgacaaaa tattacgttt tattcgaatc 577200
ctaattatta ataaattcga tagtttccag acaaagcaag cattgaaaac atataaagga 577260
aattatcata atatcttctg tctcctgtgc gaagcggtgt attccagaat ttctctacac 577320
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ccaccggatg caatgctttc tcttctagtc ttgttccatc tgttaaaaat actccatccc 577440
aatgtagctt ctggtcctca cagtaaaatt tctgaagatg attcgcattt tctacctgcc 577500
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cactataata ccaatcatga cgtccaaaaa tctcctgatg ccctttatga ggagttccat 577620
cataatccgc atattccgcc gataaacctg tttttgggtg acatgcttta tgaagatagt 577680
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taaatttaat caaatggttt ttcgcatccc acatagaatc acccggttgc cccggttcgc 577860
ctttatgtac acattctttt aagattgccc ttgcctcttt actatactca aaaattcctt 577920
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ccggagccgg tccatctgaa ttccaagttc catcagtgcc acacgaccat gcaaaataat 578040
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acataacttt tatcatgata cctttttata taaaagaatc attccatttt taaaagaaaa 583020
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gcatacttca tatcttctac tgtgattttt gtaatacctt ctgtgtaaat ctcttcataa 629040
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tttaagatac cggaaatctc atcgatctca tctgctgtta aagaagagtg aagtggacgg 629280
ataatcggaa taccaccgcc acagcttgct tcaaacatat agttaatatt tttctcttct 629340
gcaattttaa gcagttccaa accatgtctt gcaactaatt ctttattgga tgtgcagaca 629400
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tcatttctaa aacctctgct ctgtctttct cctgcatgga acgaattata acctctccct 699780
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gccggatttt cttcttttcc aagattaaaa taatctacct gtttatctgc cccaatatca 713280
agggtacgga taatgacctt ttttcctgcc atcagctgca atgcctgctt ataggcatta 713340
aactgttctt cttctgttgg aaaatctgtt tttccaagat ataagaactc gcttctgaat 713400
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aatcatcatc agaagataca atctgcaagt ttaaagaaga aagatccacg tttaatgtgc 726960
tataatcatc tatctttgtt ttttctaatc cataagttga atcttctttt gttgccgaac 727020
ctttccattg gtttaaatca gcggcaagca cataattttt tcctccgttc aaaaatccaa 727080
ctgcaaagag aagtgctcct gccacaacgc atcccgcacc tgctgcaaga caatttttaa 727140
tccatctttt catgaatcct tcctcctttt ctaaatctct ttgaacgtcc tgaaacccat 727200
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tgcgaatacg caagccagat tccaagcaac agtactgcaa caatcaatct cgaagccaca 740640
attgtggtgt tattcatatc tccgctcaat ttgcgcacaa aaattccggc agaaccaaaa 740700
ccgattccgg taataatcgg cataaaacca tataattttt tcatcttttt accaacttta 740760
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gacttttctt cacctgtaag aatctgatta taatcaagag taaaatactt cttatacaga 781500
tctgcctgaa aaaaaggact atcttgagcc aactgacgca tagcccagtc cagttccgtc 781560
ttgacatcgc tgcgctcttt gttcattaca aaatatatac ctgatttacc aatattggta 781620
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taataaattt catctccatc tgtcttgtat gccgggagtt cctttatcac ctcctgccat 795120
ttagatttat cgatggaacc ttctattttg taactctcgt aacgtggaac tgtttctgtc 795180
ttttcatttc ctgtcttatc tttccaggta cgtgatattg ttaccgtaat actgtttggt 795240
cttgaatgat caaaattgtt taaatccttc caaactttat tgatcgtcag cttgatgttc 795300
tcatcacatg gatcctgtga ctcggatggt tccggtgtat cactatctcc cgtgttcaat 795360
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acaaatatcc aaccttctgc tacttggtta ttatggcaat aggaaagaag tttcctttgc 808860
aataccttag gcaaaaaaat ccttctatac tttcctttat tataaatctc tatctttcca 808920
gattttacac gctccactgt aaaatatttt atttcactga tccggattcc tgtacatgct 808980
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catcaatatt tacttttcca gcaacaagaa tatcgctgta ttcttcactt attttttcat 835680
aagctgctcc aattctacgg caataaccac accaatgtgc ccagaaatca accaaaaccg 835740
gtttttcctt atgaattaat tgtccaaact tttctttatt tatatttata gatgtcatat 835800
ttttcaactc cttctcctat ttgaacttaa tataccccaa ataagtgctt gcttccgtga 835860
tgatatcaca gaaaagataa tttactttat tacacttctt tttatttcta tttatggcat 835920
atgccagtta tataattgac gcatctaaaa aaagcaagta tactatgttc gtaaaggaga 835980
taacggttat gaacttcgaa aattgttttc cactatggaa tgacttaaat acagcacaga 836040
aaaaactaat ttcagacaat ttaatcacac gggatgtaaa aaaaggaacg atcattcaca 836100
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tttaataatt tctttatctg tctgatgcat tccgactttt ccgatgtatc ccacacagct 877140
gattgtttct tctgtatcct ctttaacaat tccggtatat gctttatacg ccttatgatt 877200
cattgcaaga taatgtgcca tcattcccgc gtctatactg gatgcaattt ttgctgcaca 877260
ggagatcttt gcaccatcac agataattcc cggaatattt gccaatgtat tgtcaatcgt 877320
tgctttaatc tgtgcaacac ttcctccaca taaataagtg attgcggcag ccgatgcaca 877380
agaagcagaa accgcaccac aaaatgcaga cagttttcca ataaacattt tttggtacgt 877440
ggtcaaaaga cctgaaaaaa ccagtgcccg atacaattca tcatttctgt aatttttttc 877500
tcttgcatac acgattacgg gaacagagga tgcaattccc tgatttccac ttcctgaatt 877560
aataataacc ggcatatcac agccactcat ccttgcctct gaagcggctg ctgcataggc 877620
tttcatacga gtcactactc cgtctgcata actctcacgc agcactcttc caattccaag 877680
accataatct ccggaaatcc cctcataagc aatatccata ttatatcgaa tctgtcgttc 877740
aatcatcgga cgtactaaat tcaatggcac ttcatctgca aactgtttga tattctccaa 877800
agtaagcacg gaacggtctg tcagaccacc tccggttgct tcgttctcat caccgataaa 877860
aatcgtttct ccattttttt ctatttttgc aatattcgta tgtgaataac ggatttcaac 877920
cattgctgaa tctgctcctg ctgacacttc aaccataaaa tgcaatggaa tatccgaatc 877980
cagaaattca acttcacaac gtttttgttc cagcaatttt ttcgtctgcg ctctctgttc 878040
ctccgttacc ttttctaaaa cttccatttt attttctgag tgacctgcaa tagctcctaa 878100
aatacaggct gtttcgattc ctgtcattcc tcctgaattt ggaatcgtta cacaacgcac 878160
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ttctcttgct tttgcagaag cataagccag tgcaattggc tctgtacatc ccatcgccgg 878280
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catgatgggg ataaaccacc ttttgacttt ggtatcttaa gtaaagcgga tattcgcctg 878460
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atacattaaa taatgttttc atcggctgtc tgccttcaaa gtaatttaaa aattctgaag 879060
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tcgacacaag tgccatcacc tcatactctt tcgtaaaccc attttctcca gtcaacgtga 879180
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ttttcttcca atccttccag attctctctt ccaatcgttc tttttcccag tctgataact 879480
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gcatggtaag cttatgagtt cttctctttt tcccttttac ctttgcattt acagagcttt 879840
cggtcagctt cacagcttcg attggggaaa tctttgctac gatacggcac ggcttaatac 879900
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ttttcatgat ttccataata tttctttaag ttctcgcatt ttaatacttc catctctcat 881760
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atttttcttg taaaactgcg gtaaagcgga cattcgcaat ccgcttcgct acttgctcat 883500
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tgtaaaaccg attaaaaatg accacgaaga tgttgctctg atgaaaaaag agcttccgac 999060
aaacaaatct ttattctgct tatatgaagt gaaacttctg aagaacggaa aagagattcg 999120
tctcccgaag aaagcaacac tttctgtttc ggtcggaaaa gaatatgaag gaaaagaaat 999180
gaccctttta cattgtgtaa acgaaaaagt agagtcttta aaaggcacag taaaagataa 999240
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aacacaaaac ggaaacaata aaactaccag tggaaacaat aaaactaccg ttggaaacgg 999360
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caaatccgtt aagaccggag atgagttacc acttggcgtt acgcttttga tgcttttggt 999480
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caaaatctat atccagactt gcttctacta tttgcgttgt aatccagaca cctgttttat 1011420
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ttgaatgaag aagccataca ttttcacttt ttaattcctt ataatgtcgt tgtgcttcta 1011540
aaacagtatt gcaaatgact aatacttttt tatgttttcc ctgttccaag atttcattat 1011600
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aatgctgaag aactggtgaa aatgtagctg tgataatggc aaattttcca cccatttttt 1011780
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aactactacg ttctgaattc caagacgttc catctcagct tctgagagag caaccggctt 1052220
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atcattcatt accatgtgaa ttaaaacgta tccagggaac atttttttct gaacaattct 1052340
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gtatctactc ttttttgttc tgcaaagaaa tgcagggcac gcattactgc acgatcaccg 1105380
gcttcttctc ttactttatt aagatttgcc ataaattctt tttcgtccac atccgcaagc 1105440
acttcttttc caaatacctt tgcggcacgt ttcatttcaa ccggcactgc ggaatattct 1105500
tcacttaagt ctgcatgacc ttttcctgta tttacaataa ttaagtcata tcctaactta 1105560
tcataaccga attccacttt ttctactttt ggcatttcct ctttgaaatc aatcgcaatg 1105620
actccgccta ctgcacatgc catctggtct aacagtccgg actgttttaa ccaatattca 1105680
tgttctgcat actgtccgat tttcgcatat tcaacataat caatttttcc ttcattgctg 1105740
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atcgcataca tcaactcata tccattaaaa gaacctaatg attcacattt tgtaaacttt 1131900
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caatagaacc gtattttttt tgtgcttcaa ccgcaccaat atcatgtagt atagcaataa 1198200
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gattagctgt cagctaacaa aaatcggatt gcgttagctg gaaattgatc attttgaatg 1211280
gaattttgtg tcacgaacgt gattagaaaa taacaaaagc gttcgctgtc agctaatcca 1211340
gctaacattt tcgaacgctt tgaagcccgt cgccaagagg atttgaacct ccgacccctc 1211400
gcttaggagt tcatcctggt acagaaaaca gcttgcattc tatgtcaatc aaagtcattc 1211460
aaagccttga ttttactgct ttttctgtca atttcagaaa agataagaaa acctgttttc 1211520
atctgaggaa ttacagtttg ggtggaaaaa tggtggattt tccaccatta gggtaaagcc 1211580
aacctgttcc ttccaattat aaatgatgac taccattacc tgacatttta cagtaatgat 1211640
tatttggttt tcttattaga tctatgtcta ttataccgtg cttgcggtca actgtcgata 1211700
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tacacttcaa atactcggaa gtgtttctga gcagattcat atttccctgt ttcgtaattt 1211820
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tccagccatg caaaaattat ctgttctgat tctatccagg ttaagttttt atccttcttt 1211940
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gtctctccct taagagtcct ggtattctgg ataatataca gagcgaccga tatgaccatc 1212060
attatagcgc acaaaccaat caacagatct gataccatcg gtgtaatgtg gaaccatata 1212120
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aggcagtgaa aaacatgata aaagtatttc aggcaacaaa gcagcagatt ttacagatat 1343520
attcggaaaa agaatatgag caggctgtga aagaactcga agaggaagaa actaaataaa 1343580
aaaataagag acaaataaaa taagtgataa agaaactaaa aggagttaga aatgggagaa 1343640
aagcaagaac ttacgttaga ggaaaaaaaa gaaaaagttc gagattttcg tccgatagat 1343700
gatgcttttt ttgaaacgct ggcagatgat agagcatttt gccaagagat actacgagtt 1343760
atattaagtg ataaaaaatt agtcgtagaa gatgtaattg tacagaacag taaaagaaat 1343820
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caggaaacac tgcttacaga cagatccact ctgaaattat cagatgaaga atttgaattt 1356480
catttatcat agttgctaaa tgattaagaa cagtgtaggt gaaaaagatg ggatttttaa 1356540
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caagaggtac agacaaagac aaggaaaata aaactctgga ttcggctttc gagccgaatc 1396680
tggactccaa cgcaagcgag actgcctcaa atgacgggaa caatgaagaa gctgataaac 1396740
cggaaggaat ccggattccg ggatatccat caattacagt tccggcagat acaacagaca 1396800
tagaaatgaa tctggaaaat ccggccggaa atccatgcta ctttacattt gaactggtgt 1396860
taaaagatac aaatgaaact ctgtatacct cgaaaatggt agaaccgggg aaagcaatta 1396920
cgaacgtaac actgtcgcat ggacttgaaa aaggggaata tccggctgtg ataaagattt 1396980
cgacagcatc acttgaggat ggctctgcaa tgaacggagc aaatgtagaa actaccttga 1397040
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ataaccaatg gactgtaatg cttttacagt agtatatttg gatttttcac agcgcatctt 1423080
aaagtctgtg atttctccat tttctgcgac aacgagagag ttacagaaga tggtcggata 1423140
gccgagtttt ttcattaaag gtccggcaaa ctgggagaag gtatcactga taatgataac 1423200
ctgagtcatt tctcttaact tgtccaaaaa ttcctttgca ccgggaatcg ggtcaatctt 1423260
tgcgatggtt tcctgaatct cttttaatcc aaggttgtgt tcttttaaaa tgtttaagcg 1423320
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gtttgtagct ccagtagaag tatccgcttc cggcatccca tgcatctaac atggcttttg 1423860
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tattgatgga gcaactgaat acggaatctt cttccgtctg attgtaccga ttttgaaacc 1476120
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attactggtt gtgcgttctt ccagcaaata tacgttaaca atcggtttga acacactgat 1476240
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taagagaata tggacagact tacgcaaaat atccatttat gatttatcag ttccagacaa 1502520
aattccgtga tgaagcacgt ccaagagccg gtctgatccg tgtacgtgaa tttactatga 1502580
aagatgcgta ttctttccac acatctcagg aagatttgga agaatattat gacaaatgtt 1502640
atcatgctta tgaaagaatt tttgcaagag ccggaattcc ggaaacaatc gcagttgcat 1502700
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gaaatccttt tcggaaaagg tcatgagctg acagtgaaaa aaatgctgag ccagccggga 1542180
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attaagctta gaatgaaaac atcggatgaa gaggaaagaa aaaatgaaat atacagaaaa 1607760
tgaaacaata tcgcaaaaac agcttttttc tcaggcaagt gtttccatgc tgggcttaag 1607820
cctgatggca gttccggaat ttatgagatt ttcgttgaag acgatgatat ttggactggt 1607880
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gtgcttatgg tgatggaacc tcttgaaaaa gaagaggctt tttatcgtta tgaagagggg 1647300
aaacttacca ggcaggaagg cttttatgtt tattatgaaa aaaatgagcc aatgcaaaat 1647360
tttttaattg agcaaaataa atatgcaaga gaaagaagcg aaaaggtagc ggatgaagca 1647420
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aaaaaatcgg agtaccgtgt ccaatctgtg gaaaagaagt agtaatgcgc agaagtaaaa 1699860
aaggacgccg ttattatggc tgtgaaaaca atccggaatg tgaatttatg tcctggcaga 1699920
agccatccaa agaaaaatgt ccaaactgcg gtggatatat ggtagaaaaa ggaaacaaac 1699980
tggtctgtgc aaatgaacag tgtggatttg taaaaataca gccgaaagac aaaggcgaag 1700040
aggcttaaat aaaaatccaa gtaaagtgga catttgtgga ataaaaacaa tgaaaataaa 1700100
tggttaattt agggcgattg caggaaaagt cttgtagtcg ctctttttgg tgaaagaaac 1700160
gaaattgtta gaaaaaaatg aatagacaga aaatagctat attatccatt gatttcagaa 1700220
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aaactcttaa aggcaaacca taccagtcag atttaccgtc tggaatccga tattgcaaag 1857840
aatttcccgg tacagatcag tgcattgaaa gagcggattg ccgggatgca gatagattcc 1857900
caggtagtaa aaagcgtgga tttacaggat aatgacacgt ttgccatgac agtaggaaat 1857960
gtcctttatg aagataagaa agaagcaggc gaggcattga tcgctgcctg tgcaggacta 1858020
aaaaccgtta gcaccggtgg aaaggtcggg gaatatcatg ggtttacgtt atctgcttcc 1858080
tacaatatgt tctccaatgc atttgaactg acggtcaaag ggaaatgttc ttataagctg 1858140
gagatcggaa aagacccggt aggaaatatg cagcgtatcc ataacaccct tttttccatt 1858200
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atagaagggg aagcaaaggg gtattatcat cagacagaaa agtatatcgc aattcaggaa 1859220
gatatgagta atcttcagac catgaaaacc ggagtacacg aagtaagcca tgcattgctg 1859280
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tggagaaatt gacaatttcc gaatagacaa aataacaaag gccatcaaaa aagcatacga 2161320
tgcaaccaat aaacaattca gtgacgatat gctagacatg ctggcacttc atgtgacatc 2161380
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agacgagtaa aagatgtaaa agtagattat gtatgtttca atattccgga tgaatttgta 2187840
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aaccggttgt agaagcaaac gaagaaaaat atcgtaaaga agctttatta gagcgtcttg 2240640
tagaaccgga acgtgttatt atgttccgtg taccgtgggt tgatgacaaa ggtaatgtac 2240700
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tgagattcca tccatccgta tatcttggaa tcattaaatt ccttggattt gaacagattt 2240820
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atatgaaacg gatatctgga gacggcgcat cttgccgtct cttttttagt taatcattca 2280300
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ggaaggttcc catattcaga tcggtgctga cttatgtaga aaatataaag agtcccagat 2332920
tgtaattaat gcggttgagt cccaccacgg tgacgtagag ccgaattctc tggtggcttg 2332980
tcttgtacag gcggcagatg cgatttcagc tgcaagacca ggtgcaagaa gagaaactgt 2333040
agaaacatat accaacaggt taaaacaatt agaagacata acaaactcct tcaagggagt 2333100
agaaaaatct tttgctattc aggcaggtag agaaatccgt gtaatggtac ttccggaaca 2333160
tgtaagtgat acggatatgg tattgttagc acgagatatt tccaaacaaa ttgaagctga 2333220
actggagtat ccaggacaga ttaaagttag tgtaattcgt gaaagccgcg tagtcgatta 2333280
cgcaaaataa gaaacagatg cagagtcaaa gaaaaaattc tttggctctg ttttttaacc 2333340
aaatcaagta agtcccctgc ttcaattgcg aaaagcaata agcaggggac ttgcttgtat 2333400
caggaggggg caagcccctt ctgataagct gcgtagcagc tatttggtta tgagcaagta 2333460
gcgaagcgga ttgcgaatat ccacttgact ttgcaggaaa ttgcttttct gtaaaaaatt 2333520
ttttgtgtta agtataataa ataaggcata ccttgtatag ggggaaaaaa tgaaaaaaag 2333580
gctttctatt tttttgattc tatattttgt aggctttaca attggaattc tttgtacgag 2333640
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aaatacagaa tctgttttaa atgttcaggt atttggtcac ttattaaaac tgagggggaa 2333760
atggtttctg ttttatttta taggtggaat gacgcctgca ggaattgtaa tggtattggc 2333820
aggatgtctg tggctcggac ttttagcagg ctgtctggtt actttatttt tgatggagta 2333880
tggggtcatt ggaatttttt tctgcatagg atgtgggatt cctcagagtt tcttttatct 2333940
tccctctgtt ttagctctgt tttttttatg cagtgagatg agtcttaaat tctggaggaa 2334000
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tatatttttg cttgggattt ttttggaaag ttatgtgagt cccaatttat taagagtatt 2334120
atttcattaa aaaattcata aaaagttaac aatttaaaat ttaccatata tggtggatga 2334180
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tatattcttg aagtttttgt ggttttgacg ttgcagaaag actttgagag tgtctagaaa 2334360
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atccggcaga tactttaaaa gctccaaaag tagaaaaaaa gataccggag attctttctg 2334720
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tttaacaaac tattgctttt taaatttaat cttgatagaa taagtacgaa ttaagaaatc 2398920
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gtaaaagaat taaaagagca gatttttcat cggattgaga taaaaaaagg acagaaagga 2571120
agtcagattt taacagtggt ctgaaccttt aaaaaaacat aagaattgct tgataaaacg 2571180
gcaaaaaaca tgtataataa tggtattgat aaattattgt catttactgc gcccaattaa 2571240
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gcggatttcc agaaaggaaa catgcggtta ggtcttgcac tgacacttgt gaaagaacat 2571600
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gatgatttag aaacaagtct ggatggagca gcacagaaaa aagtaagtga agaattaaat 2702940
gcctctaatt gtcgtgcgtt agaaggcggt tacatgaata cacagggaac aacttatgta 2703000
agaaaaagct ctttttattt gacagatgca gttgcagcag agcattttgt aaatgaaact 2703060
cgttttcata ataatttata cttagcaacg aattatgcaa aagaacaggg gatttccgta 2703120
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tgaaaatgtt agatgagccg gagtgcatag aagatcgatg gcttgatgac gaagcaaaag 2756160
gagaaaagtg gttgttagaa tttcaggaat tagcattaac ggaagaatac agggaatgga 2756220
ttcgagatta tatcgataaa aaatatgaag aaaaaggatt accatatccg acaggagcag 2756280
acttcgatta aggggtctgt ttttttctgg tcttttggga ggtgataaga ggtggaagta 2756340
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gacagcattt tatgtgcgaa aagattttat ccagattccc attacatggt agaaatagag 2756460
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ttacaccagc cgcagagccg gggcatattc gcagaaaggt aaggtcagca acctaaagga 2782320
gatgaacgag actttcaatt atctccgggc aaacggcatt tactcccttg aagatttgga 2782380
aagccgtgtc agcgaacaca gtgctgccac agagagcttg aagaaaacgc tggacgaaca 2782440
gactgcccga atgaaagcaa ttaagcagct ctatgacagc tccgctgctt tccagagctt 2782500
gaagcctgtc tatgacggct tgcagaaaat caagtttgag aagcccagag ccaagtacaa 2782560
ggcagagcat gaagcggaac tgaaacagtt ctacgccgcc agacgtaagc tgaccggaga 2782620
gttcccggac ggcaaggtgg atatgaaaaa gctgaccgaa gagtatgacg agctggaaca 2782680
ggcgcacaac accacctatg gcgagtttaa gaccgtcaga gacgatttac accgtctttg 2782740
gaaggtcaag tcatgtgtag atactgccgc ccgatttaac gagcgtacag aggaacaact 2782800
gcaccaaaat cgaccccaaa cacgacacaa aaaggaggat atatcccgat gaattacacc 2782860
caagcacaga ttgaccgggc aaacgccgtc agtctggaag attttctccg cacacaggga 2782920
gagacgctta tcaaaagcgg acgggaatac cgctggaaag aacatgacag cctgaccgtc 2782980
cggggaaaca agtggtttcg ccacagccag agcaagggcg gctatcccat tgattttgtc 2783040
atggagtttt acggcaagtc ctttcccgaa gctgtccagc tcctgaccgg cgaaagcggc 2783100
gaggggcaga ccgaagccag cacagcaccg cccacagcgt tccacttgcc cttgcacaac 2783160
aggacagccg acagagcaat tcaatatctc acagaaagcc gaggtctcaa caaaacgctt 2783220
gttgaggctt ttcttctttc cggggatatt tacgaggacg caaagcggca caatgttgtg 2783280
tttgtcggca gagaccgaag cggtacgccg agatacgccc atgtgcgagg aacggcagac 2783340
ccattcagac aggacattgt cgggtctgac aaatcctatc cgttccgaca cgagggtaat 2783400
ggcaatcagc tctttgtctt tgaagcgccg attgacctgt tatcgtttat ctgcctttat 2783460
ccgcaggact ggcagacaag gagctacctt gccctgggcg gcgtttcggg caaagccctt 2783520
gaccgttttc tttctgaacg caaggacacc cgaaaagtgt tcctctgcct tgacagcgac 2783580
accgcaggaa gtgaagcctg cacccggctg gcacaggaca ttcccggcga gatcgccgtc 2783640
attcgccttg tcccggcaag gaaagactgg aacgatgttc tccgtcagca aggggacatt 2783700
cccagccgca aattcatagc cgagacaatc acgctgcgag agctgcccac cgcccagcct 2783760
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tatatcccct ttggaaagct gacgattata cagggcaacc ccggcgaggg caagacctac 2783880
tttgccatgc gtcttgcggc ggcttgcacc aaccgaaagc ccttacccgg tatggagacc 2783940
cttgagcctt tcaacatcat ctaccagacc gcagaggacg gtctgggcga taccgtcaag 2784000
ccccgactga tggaagcgga agcagacctt gaaagagtgc ttgtcattga cgatagggac 2784060
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ctggttatca ttgacccggt acaggcgttt ctgggcgcag atgtggacat gaacagagca 2784180
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cttgcctttt ctctgggaga cgagaaaggc tttgagtgga taggggctta tgacattacc 2784480
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aaagcggtca atgacagggg catatcctca cgcacgatga ggacagctaa aagccgtatt 2784660
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cgccttgcct tgttccctca taccgacacc gcccgatgat gaacagtcac cgggcatttt 2784840
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gtcagaaagc agatcggcaa gacaacctat atcgtccgtg tccatttcag ccagaccgcc 2784960
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cttctttgtg aatttgatga aaaagtcctt gacttttcgt ctctggaaag actgcaaagt 2785080
cgattttaat ctcggttggt gtccgtctgg cagcttttaa cctgaaacag atcgccaacc 2785140
tgacctgtac agacgaactg gacttataca gcatcgggga gaagaaagta gcactgtttt 2785200
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tgtttcagac actgtattat gtggcagacc ggaagtacgg aggaaggctt ccaattccgg 2785320
tacactgcat tatggatgag tggccaaacg tagccttgcc ggatgatttt gacaagattc 2785380
tggcaaccat gcgttccagg gggatttcct gcagtatcat catccagaac atcgcacaga 2785440
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atctgggtgg aaatgaaaaa gaaggacata agtatgtctc ggaattattg ggaaaagaga 2785560
cattggatac caatacctac ggacagacaa aagggcgtag cggcagctat tcggtgaatt 2785620
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agcatgtgaa tttcagatac acagaggacg gtggtgcatc gccttatgat tatgcgaaaa 2785800
caccactggc tcacgacgac ctaaagattg acattaacag attagacgac tacgaactgc 2785860
tgtctaccga ggacatcctt ggtgaatagc agttttttga tggattggag tgatgtgtat 2785920
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tcaataacct gtctaccttt attttttctc tgattcgtgc gatcggtttg attttgcttg 2786160
gatttggtgt tgtgcaggtt ggtctgtctt taaaaagcca tgatccaagc cagagggcaa 2786220
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tgattatggc gtaagcctct ttgaaaaaat atatcaggaa acagcaggag tgccggaagg 2786340
tactcctgta ttcaaaaata tgtttaagga ggtgagagtt tttgagtgat aactggattg 2786400
tacagaatct aaactcagca ctatccacat ggagtgaaaa gatggcagaa ctgtggactc 2786460
tgctgactga aaatccggca acttttaagg gcggcggcat ctggcggatt atggtaaata 2786520
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ttatccggtt tgcacttgct cagggagcaa ttacatacgg gatggaactt atgcaggcac 2786700
tgttttccat tgtgcaggga atcgtgacaa ccgtaatgag tggctccagt atggcaggaa 2786760
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gttcttatat aggcgtgtgt ctggaagggg caattattgc actggcatgc attatctttt 2787060
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catctgaccg tattgtcaga gaaatgatgg gacttggagg ttaaaaatat ggatacaaag 2787240
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tatcggaaca atggaaattt atatgtagga ctctgccata aggaagggag agaatgggaa 2787360
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gtgttgaatg aaacaggaag atcaggatat acaacctatc agaaggtagc gtttgatcta 2787540
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gaagtaccga aagaaaaacc acagaaaacg aagaaacaaa acaggggaga ggaacgataa 2787660
tttatggaag taaagatgaa caaagaaatc agggactatc aggaatccat gtttatggga 2787720
ctggacctga gacaatgtgt gtgttctgtt cttgcgattc ttacagcaat cggaatttac 2787780
tttggaatgc gtgatattac tggacaggaa ataaccggat ggctgtgtgt gcttggtgct 2787840
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tattgcgagt aaggacaata agacagaaat gtttctggat tattccgaac tcttaaatgc 2788320
actggattcc ggcatttctg ccaaaattac catcaataac cggagaatca ataaagaaga 2788380
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gtcggcaaaa gaaaagtcga ttctggaccg ctgtgctgca gatgtgtacc gggattatat 2789760
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acagccggaa gaagaggcaa gaggactggc attatcatct gaacttttta tcaatggaag 2789880
cctgaacacc tttgcacagc cgaccaatgt gaataagaag aacaggatca tggattatga 2789940
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gttctatctg ttattccgct atgaatacag tgcaaatttc ttctaccgac tttataagag 2790120
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aagttttcgg attgcatccg atgaaggggt atcccttccg gcatagatgc ctaacccata 2821980
aaaagaaaac atgaaaatag aaataaaagg aggaagttga ttatggcaaa aaaagaaaat 2822040
tttcaggaat atgtagtacg tacacaaaat gaaatcgcag ggactggatt tttaaagatc 2822100
agcagaggcg tgaacgtctg gtaaaggtgt acaatgaacg atttaacagc atccgtcccc 2822160
gtgaatacga tggcagtcat ttgacttttc caggaatgaa tccggaaata gaacttcgcc 2822220
cacatcagaa aaacgctgcc gcacaccagc tttatggtga caatgtactt ctggcacacg 2822280
tagtaggagc tgggaatacc tatgaaatgg tagcggcggc aatggaaagt aaaagactgg 2822340
gattatcaca gaagaatctc tttgtcgtgc caaaccattt gacggagcag tggggagctg 2822400
agttcctgca gctatatccg ggtgccaata ttctggttgc aaccaagaaa gattttgaac 2822460
cagcaaaccg aaaaaaattc tgtgctagaa ttgctatggg caactatgat gctattatca 2822520
tcggtcattc ccagtttgag cgtatcccaa tctctgatga gcggcaggaa gatatgctgc 2822580
ggaagcagat tgatgatctg gaaatggcaa tccagagtgc aaggtatgaa caggacggtg 2822640
gacgttatac tgtcaaacag attgaaaaga ccagaaaaac actgcagaca agactggaaa 2822700
aactgaatca gaaagagaaa aaagatcagg tagttacgtt tgaagaactg ggcgtggatc 2822760
atttgtatgt agatgaagca cacagctata aaaatgcgtt tctctacaca aaaatgagaa 2822820
atgtagccgg gattgcacag aacgaagcac agaagtcagc agatatgttc aataaatgtc 2822880
agtatctgga tgagattacc tgagggaaag gcattacctt tgctacaggc acaccaatca 2822940
gcaacagcat gacggaatta tatgttatgc agcggtatct gcagaacagc aaactgcaga 2823000
atatgggact tggattgttt gattcctggg cttccacttt tggagaagtt gtcacgagca 2823060
tcgaacttgc accggagggc tatgctttaa taggacgata aagttaactg tcctaaattg 2823120
aaaatacata aggaaggagg ttaagagaat gtcaaggact tcaaagatta cagcacttta 2823180
tgagagatta tcaagagatg atgacctgaa tggcgagagt aattccatta ccaatcagaa 2823240
aaaatacctc gaagattatg cccgtaggaa tggttttgag aatatccgcc attttactga 2823300
cgatggtttt tcgggtgtaa atttcaatcg ccccggcttt caagcgttga ttaaggaaat 2823360
tgaagcaggc aatgtcggaa cattctaagc agacgcttgt tgttgaccct gtggcttctg 2823420
aggtggtaaa gcgtatcttt ctgcttgcaa atgagggcaa aagtccacga gccatagcgg 2823480
aaatactgac cgaagaaaag gttttaattc ctgccgcata tgcaaaggaa tatcacccag 2823540
aacagtacaa tgggattaag tttgcagacc cttatatttg gggcatatct gccattagaa 2823600
cgattttaag cagacaagaa tatcttggac atactgtttt gagaaagtcg gtcagcacca 2823660
attttaaatt gcataagaga aagactaccg atgaagatga gcagtatgtg ttttataaca 2823720
cccacgagcc tatcatatcg caggaacttt gggacagcgt tcagaagcga aagaaacgag 2823780
tgaacagagc tgcggcaaga ggtacacata ccaaccgatt aagcggttat ctgtactgtg 2823840
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agtattcgta ccgttgcggt ggttatgcga gcagggtaaa ttcctgtact gctcattcaa 2823960
taagtgctga taatgttgaa gccttgatat tatcggcagt taaacgcttt tcaaaattcg 2824020
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aggaaaagcc gaagcacaat caatcggagt tgaaacgctg tcagaaacgc tatgacgaac 2824140
tctctacgct cattcgtggc ttgtatgaaa atcttatatc gggattgtta cccgaaagac 2824200
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tcattgacaa gattgtggtg tatgaatacg agggtgtagg taaagcaaga acgcaaaagg 2824440
ttgacattta tttcaattat gtcggacaag tcgatattgc ctacaccgag gaaaaacttg 2824500
ccgagataaa agagcaggaa gaacaggaag aaaagaagcg attggagaaa cagcgtcagc 2824560
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gagaagcgga aaaaggcgat cactattacc gtcagcgtgt atgtgctgtg tgtggtagta 2824800
cctactggcc tacacacagt cagcagaaat tctgctccga ggaatgtaaa aaggtaaacc 2824860
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tttgggggaa cataagcgtg tgctatattt taatctgctg acaagcagaa agttatatga 2825100
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ctaacggata ccaaccgaag aagaactgct gtcaaaccaa tggcagtttt tctttttcgg 2825340
caagtattca agaagtcatt aagtcgtgag tataatcgaa gtggtagaaa agttacctat 2825400
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ccggaagtca cgcaagcaga gttggtgctt tagtgtgttg tttgctttcg ctgttatctt 2825640
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tgttttttgt gttttccatt ttggcatttg ttggatttgt tagccacctt ttagaggtga 2825820
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tctttctcaa gctcagcttg cagaaatggt aggagtatca agaaatacca ttagttctat 2825940
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caaaaaattt gaggaactat tctattttta ggaggtcatt atggaaaata ttataatgtt 2826060
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tatattgtat ggacagttca aatacaataa aggaattttt tgagaatcag ggaggtataa 2826360
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tgctgcatgt tcttgtcatt cagttctgcg gactgaacgc acagagcagg ccatggcttt 2826600
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tgctgatgat caacagcgga gccatgcaga atacgctggc ggcacttcct gctgagtctg 2826840
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ggattcattt tatcgtggac ttctttgccg tggcaggtcc ggcgcttctt cccatctatg 2827080
tgattgaaat tggtgtcttt gtgatggcag ccggaactct tgttatggcg ctgaagatgg 2827140
gaaggatgga agaactgtga attccagttt tctgctatca taaaacagaa tatatctgac 2827200
agaacgcacc gtagaaatac ggtgtttttt gttaccccaa acccacaatt tcatacacaa 2827260
ccacaggtta gtacaaatac cttatgtgcg tttttgaaag gcttagaaag ggatatttac 2827320
cccgattttc gccccgagaa atgacacaaa taaggctgaa tgtatcttct ctgtggtttt 2827380
tatattttcg gcaggaaagg aggattgctt gctatgccga gaatgagcaa gaagcggaaa 2827440
caagagtggg cgttgtttct gaatgatcga aaccgcatta cctacaacga actttgcaga 2827500
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ttatcgaaaa ggagaacaaa gaaaaatgat tgaaaatgaa atgactgtca gcgtgcctct 2827620
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aaaactttta attcttgacc cgatgagttc ctatatcgga gaaagttgtt cgatgaacaa 2828040
tgccaacgaa acacgagccg agtttaatca tctgatagcg gttgcgaaag atacaggctg 2828100
tgcgattgtg attattgctc atatgaacaa gatgagagat accaatcccc tttaccgtac 2828160
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ggaagtcaag gcgaaagcat ttctgattga aatgctgaaa gacggagaaa tgctttcttc 2828460
gaattgtgaa gaaaaacttg aagccgcagg gttcaggaaa tcgaccatta aaaaggcaaa 2828520
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tgatgaaatc aatatagcgg caaccgagga acttgggaaa aaggtgtacc actatcatct 2829240
tcatgctatg gttctgcctg tggtggagaa agaaatccta tggagcaagc gttgcaaaga 2829300
tgaaaaactg cgaggaacgg ttaaggaagt agtcaatcag attagccatt caaagaaatg 2829360
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ccccgaagtt gctaaacttt ttaccgaaaa agtgaagcaa cttttttctt ttaaggaagc 2829960
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catttaattt agaaaatcca caaaaagtat cttgacaaac tcgaccccga aggaacagga 2830380
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gaaaaaagta cagatgttaa tcagatagct gcagtctata aaaaatatag ggagaatcca 2831940
gaaactgcgt atctgggatg ctcgatggga attatctatc gtgatccgga agaccgttac 2832000
tacgatgatg ctgaatttgc aatcgtaaaa ggaaatacag tacttggaaa tctgatggat 2832060
gatgttcggt tttatggaga acttgcactg gtacgggaag ggattgagaa aattcatgaa 2832120
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aatgcagtaa aaaaattaca gaagatatga aactgtccgc agaggattgt gagctcgctc 2835000
agattattgg attgttacat gatattggaa gatttgaaca attgaaatgt tacaacagtt 2835060
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tgattcggcg ttttgtcgaa gaaaataagt gggatgaaat tataaaaaca gcaataggac 2835180
atcatagtga ttactgctta aaaggaatta cgaatgagcg agaattgatg catgctcaaa 2835240
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agacaagtac attatggcat tgtatacgca ttgtctggtg acgaggaaag cagttgctac 2848260
acaaggagta cagatcaagg gttttacaga aaaagagtat ggaatggtaa gactggagaa 2848320
tgtgggggat gttttgtttc aggcgttgct atgggataga acgaaaagag aagggcaaat 2848380
tctttgcaca gatttttgta gtatctttat tttgtaatat ttttttagtg aaatggaggg 2848440
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aatggaagat attacaagat atattaatga taataagaaa aacataccca tagcattatc 2861460
agaagacata tgcacaattg aaaatgatat agataatatt tctgagttta tttcgggtgc 2861520
atttgattca gattataata aaaatatgga gtattttgca gattattatg aaaatgagca 2861580
tatggataac aaaggagttt tttcaagtga tgcgtggatt gatgaagaaa caccttatgt 2861640
catgctgagc gaggagacgg aacaggaata ttatatttca gaatattgga ctcaagaaat 2861700
aacggaaaag tcagtggtaa aagaaacttt agatttacta aatgctatag taaaaacagc 2861760
taaggtgtgg ttatataaga aaccttatga tatgtttaaa gcacagttgg ttcagattgg 2861820
aactgatgaa aatgtactaa aataataaga gaatagtatt tgtatcttaa aaaaggtgta 2861880
taaaaatgga ttaaaaaatg caggtgctga tgagaaaaat acatcagcat ctgtaaatat 2861940
atttgttgtt gctgattagt ttttataatt atccatgagg aacactttaa aatgaaacat 2862000
tgatttctca ttgtgaaatt gaggagtact aggtttaatt ctaaggtctc tagcaatctg 2862060
acgttttaaa tgacccgtca taatcatttt ttttggttcc caagtttttc tatctaattc 2862120
accaatcata gcgtaggagg atatattaaa cgggagcatt taagaaagaa cggatgatga 2862180
aggcatatgc acagttggaa tatcattaca aggatacagc caccatcata ttaaaagagg 2862240
catggcttga aacactaggg tttgagccgg ggacacccat aaatgtcgag tgtgacggag 2862300
gaaggtgtta caagggaagc agtcacaaaa gaccagatgc gaaggttctt gaaatttata 2862360
catgatgatg tggtttattg taaatattat gaagtgattt atattctttt tcacactggt 2862420
atgagaattt cggaattttg tggacttacg atgagggata ttgatttaga gaaaagaacc 2862480
atcaatattg atcatcagct gcaaagaact tccaaaagag agtatgtaat tgagccaaca 2862540
aaaacaaatg ccggaacaat ggttattcca atgacaaatg aagtgacaga gatgtttcga 2862600
gcaattattg aggatagacc agattataag gttgaaaaag tggtagacgg ttacacggga 2862660
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tgatatacag gaaaatgaca ggattgaaga ttatcggaaa atgcctgtaa acagcgtaaa 2863140
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cattgataca cacgaaccta agtatgaact catctgttct atcaggtttg aggaatcaac 2874720
cgtctatggg gcgaagcaca gaacttactg acagcaggat ttcactattc tcggctcaac 2874780
gtggaaaatg tgcgctaagt ggggaactct ttgaaaatgc ggctgacata gtatgctggc 2874840
tgaaaacacc ggcagaattg ggcggcaagg aacgctatcg aaatatgatt ttgttccata 2874900
atagatttct tccactcctg caagagtgtc ctaagaatga gctaaaagag atagccgaca 2874960
cgctcaaggc aacaaaggaa ctgatgttaa aagtgaacag tctgcgccag caggctggtt 2875020
tgtccgcaat agaaaactaa catttcattt ggtgattgat taaatgcttg tgaaaacaac 2875080
cgatggaacg ccggatgcgg tgaaagtcgc acgtccggtg tggagtgggg gaaaatccgg 2875140
cgataacttc aaaggattac ctatcactat aggctgaaaa gctctattat acggcactca 2875200
tcgcttatat ctggtatgaa gctccggagg aggagcagaa tttcgccatg ctgattgatc 2875260
tgattgatgc cagcgaagcc agagaggatg atgagaattt caaaaatgcc gttgatttgc 2875320
tttttgagga gctggaggca gagaacccga accattttgc agtaagacag tataagaagt 2875380
acaaacttgc tgcgggtgat atatgctcta agtgacttct taatcatgat tttgtcgtgg 2875440
ttagtgaagc aatcacttag agcattttta tttcaggagg tacagccatg agaaatgaaa 2875500
aaattacccc actgtacgag cgcctgagcc gggatgatga gttacagggc gagagcaact 2875560
ccatatccaa ccaaaagcaa atgttagagg attttgcccg ccggaatgga ctgccaaacc 2875620
ctacgcactt taccgatgat ggtatctcag gcacccgttt tgaccgcccc ggatttttgg 2875680
cgatgatgga ggaagtggag gcagggcgtg tagaggcaat cgtcatcaag gacatgagcc 2875740
ggttggggcg cgactatcta aaggtcggtc aggtcatgga ggttttgcgg cagcgaggcg 2875800
ttcgtctgat tgccatcaac gacggtgtgg acagtctgaa aggcgatgac gattttaccc 2875860
cgttccgcaa catcatgaat gaattttacg cccgtgatac cagccggaaa attcgctctg 2875920
tgtttaagtc aaaaggcatg agcggcaagc acctgaccgg cactgtgatt tacggctact 2875980
tatgggacga aaaacgggag cattggctgg tagatgagga agctgccgaa gtggtgcgcc 2876040
gtatcttcgc cctcacgctg gagggatatg ggccttatca gatcgcctgc aaattatccg 2876100
cagaccggat tgaaattcct gtcgtacacc ttgcccgctt caacgagggt gtgaaccgtt 2876160
caaagccggt caaagacccc tatggatggg ggtcatctac catcgtgaac attttgaaaa 2876220
aacgagagta tttggggcac accatcaatt tcaagacccg caagcacttt aaggacaaga 2876280
aaagccacta tgtttctgag gacgagtgga cgatctttga gaatacccat gaagccatta 2876340
tcgaccagca gacctttgat ctggtgcaga aaatccgcag caatgtacgg cgttatccaa 2876400
acggctgggg cgaagcagct cccctcacag gcttgctcta ttgtgcagat tgtggcggca 2876460
agatgtatgt ccaccgcacc aacaatggca ggcggatttc tcaatatacc tgttccaatt 2876520
ataccaaagt tccgtgtggg acactatgcc ctacacaaca ccgtatcaat gagagtgctg 2876580
ttctgacatt ggtttctgac acgctccggg ctatcgctga atattccaga aatgaccgga 2876640
cggaatttat tcacaccgtt caggaaacgc aggttgctca acagagtgcc gatatatcga 2876700
aaaagcgcag gcgtctggcc gctgctcaaa agagagccgg agaactggaa aaactgattt 2876760
gcaaaatcta tgaggacaat gccctcggca agctgccgga tgcacgatat agggcgcttg 2876820
atgcacagta tgccaaagag caggatgcac ttgagattga aattgcagag ctggaaaagg 2876880
ctgttaccgg ctatgagcag agccagaaat cagcggagaa atttatagcc ctgattgata 2876940
agtacgagaa ttttgacacg ctgacaaaca ccatgctcaa cgagtttgta gagaaaatcc 2877000
ttgtccacga acgcgtccga aaaggcagtc aggacaccac gcaggaaatt gaaatctact 2877060
tcaatttttt aggacgctat atcccaccat ccttgcaacc ggttccttta accccggagg 2877120
aacaggaaga actgcggaaa aaagaagaac gcaaggacag gcttcatcag aactatttga 2877180
agcggaaagc cagcggcgca caaaaacggt atgaggacaa aatcaaggcg aagaaaaaag 2877240
cggaaatgga cgctaagaaa gccttgatcc gggctgagga tatgaaaaaa ggtatttttt 2877300
ctactgtcgg acagctaccg aaagaagaac cgcgcaaagg cagcatagca gccaacgcag 2877360
cagtctaatc atcatggagc aaaggagaat gaatatgagt aagttgactt acattcgttg 2877420
tggagattat gatataccca acctaaaact ttctgtgcag ccggaaactt ctatcggcaa 2877480
gtacggcagg atgcgaaaat cctacctgaa ggaacatcgt cctattctct acaaccaact 2877540
gctgatgagc gagaagctgt atccgcacct gatagagatt gaccggacaa cgcaggagcg 2877600
tatggacacc atgttacctc acatgatgga ggctgcgggt gtcactgagg gactaaaagc 2877660
ctgtgaccct atgcgttggg tggggctgat gaacacatta acggcacaga ttgaggaaat 2877720
tttaatcagg gaactgattt gcagctgaat gggaggtgcg ggaaatgctg acctttgaaa 2877780
aggttttgaa agtgtttcag gcatatctgg atgatgaccc tttgtatgag gtggttcaga 2877840
ccagccacgg ttatacattg atggcatggg aaccccaccg gaatgactgg tacagcgcag 2877900
aaatacagaa aactccggag gatttacgga acgctttgtt gggtacatac gccaactttc 2877960
tggaagataa gattaccgga aatgaccgcg agctgactgt gacagaaacc ggagaaatcc 2878020
agcagaggtg ccgggaactt tgggaaaagt gccgggaaac ttgatataga aatgccagaa 2878080
ggaggccgcg attatgcgtc ctccttctgc ttcgcagtct gttccatttt gagcgccccg 2878140
tctatggcac cttcgataat cggcaggtat tcttcagggc agagtttcag cttgtggctg 2878200
acccgttgcc gctgtgcgct ttcttcccgc atgatctccg ggttaaaata ccgttccacg 2878260
ggaagtccgc agaccttaat caactggatc atcacaggca ggctcggaat cgcaccttga 2878320
ttctcaatgt tggcaaggta ccgccattca atcccaacca tttctgccaa tgtttttcgt 2878380
gccagacgct ttgcctctcg tgcagctttg acatctgcgc cgaaggtttc aaaaccggga 2878440
caatcttcaa ctttcgccat ataacatcac ccagttacat tgtataattc atactttgcc 2878500
cgtggaatgt cgctatatgc aggttggttg aagtttataa ttcatatatt acatcttata 2878560
tttttcaaga acaggaatta caatagaagg gaaatgaaaa aagtaaaaga aaaatttcta 2878620
aagttaaatc cttttgggtt actcagttgt atattaagtg taaggcgttt tacacatgga 2878680
aggcggtgac acggtatcga agatttcata ctaattaaaa aaatccagtc gggtgacaca 2878740
gatgcatttg agataattgt ccgaaaatat tatcagtcaa tttatctatt ttgttgtcgg 2878800
cgattgaacg gcaatccaga taccgccgca gatattacac aagatgtttt cttgaaattg 2878860
ttggagaata ttcaatcagt acgaaagatc gggaaatttc aaaactacct gctaacgatt 2878920
gctgttaata cctgtaacaa ttatactaag aaagcaaaac ccctgtatat ggatttagaa 2878980
actcttgaag atatagaaga tactgataat gcctttgaaa aaattgagct taacgaactt 2879040
aaagcgcaaa ttcaatatgc aatcaacaca ttaccggact atcaaaaaga ggtcatcatt 2879100
ttacgatttt attatgattt gaaaatccga gagattgcaa ccattacaaa agctagtgtt 2879160
tctactgtaa aatctaggct ccaacagggg attaaaaaac tggaacgata tttggctgat 2879220
tttagaggag gcgataatgt atgacccaaa aacaaaatgg tgtattagaa tggttgcaga 2879280
gttgtgaaac gcctgctcca tctgaaccta aaattaaagc agtaatcgta gctggaaaaa 2879340
gttacatgaa tagttctgaa ttcaataaaa attcaatgcg agatattata ttgaaccaac 2879400
ttcaatttct gccgctttct ttctggattg ttcaaataat actcactata tgtgcagtat 2879460
tattagcatg tatcctgggc caatggaggg ttccatttta ttatccattg acaatccttg 2879520
cagttatggt tccattcctt gcgttattag gtgcaataga aatatctaaa agcaacatct 2879580
atggtatgtg ggaaattgaa cagtctagta gaacaacgct ggtaaaaatt gtagcaggtc 2879640
gtatgctgat tattggagta atcaaccttt tcctaataac agtcatttta atttcaatgg 2879700
catatattta ccagaaatca atgattgaaa tggtgttgta tggtttgatt ccatttaata 2879760
tttcttgcac ttgttatctt tttatatgcg cgaaaagcag gacaaacgat agcttgtatc 2879820
atttaatcgc ttgtatgatt tttctttctg gaacattttc tcttgtactc catcagcgat 2879880
ttatatttga agcgtctatg ttctggggat ggattggatt ttatgtgtta tctattatcc 2879940
tattagggaa aacacttcaa ctgtacttga aaaaagaaaa aatgattgga gaattgatat 2880000
ggaacttaca ataaatgatc tttcaaaaga atatggaaga aaaaaagctg taaatcattt 2880060
cagcgcaaaa ttaacaaatg gtgtttatgg tctactcggg gcaaatggtg cgggcaagac 2880120
aactttgatg cgaatgattt gcgatgtcca aactgaaacg aaaggagcca ttttttttaa 2880180
cgggaaaaac attcatgatt tgggcgagaa atatcgtaat atcttaggct acctgccaca 2880240
aaattttggc tattatccta actttacagc gtataaattt ttgatgtata tctctgcaat 2880300
aaaggggctg ccgcctaaaa aagcccataa tcgcacaatg gagctgttgc aggttgttga 2880360
tctgctcaca cagaaaaacg aaaaaatcaa aactttttcc ggcggtatga aacaacgctt 2880420
gggaattgct caagcattac taaacgatcc ccgtattttg attttggatg aacctacagc 2880480
tggacttgac ccgaaagagc gggtgcggtt taggaatctg attagttctt tggcagaaaa 2880540
tagaattgta attttgtcca ctcacattgt ttctgatgtt gaatatatcg caaatgagat 2880600
tctgattatg aaaaatggcg agttaattca acatggttct ccagaagaaa ttttgaagcc 2880660
gattgaaaaa tgtgtttggg aatgtgatgt atctcgaaaa gaggccgaag aattagaatt 2880720
gaactatgta acagcaaatc tgaaacataa taatggtgca gaacggctga ggattatttc 2880780
tcaagaagca ccatgcagaa ccgcttggaa tgttgatcca acattggaag atttgtattt 2880840
atactatttt gcggaggtat ccgagcatga atgaaatgat aaaagcagaa cgaaataaaa 2880900
tatgttcgag aaagcaaaca cgaatgttgt ttttagctgg tatggttctt atcgttgcct 2880960
attttttctt ttttcaattt aattatcaaa atgttttcta tgattatgac cttgaaaaaa 2881020
tggcattagc aagcggtttt acagccattg aacaacggaa ggaagtagca gaaatatttg 2881080
aaggaaaact ctctcaaaat acattactta ctatgcaaga aaaaatcgac caagcaaaac 2881140
aagcaactgt tggacaagat gaaaattctg ctttttctgc tgttcatgtt tatcgtgacc 2881200
aagcggcgat tctggaatat ttgacaaatt ctgatggtag ttttaagtca ctcgaaacag 2881260
catatccaaa tagtccaact gtgactttag gatattgcga tggctgggat aagctattat 2881320
ctggaatggg gagcatcttg tccataatga tatgtttaat tgttgtaatc actctatctc 2881380
ctgttttctc agaagagtat gcacttcata cagatagcat tatttattcg gctcggtatg 2881440
gccgaaccaa actcacaact tcaaaaatta tagcggcctt ggaagttgta attggcacat 2881500
acctcttgta tttactgcta aatttagttc tgtatggctg tacctatggg ttacaggggt 2881560
ggaatgtaag cattcaatct tcattacatt atgcttcttc aatatataat ttgacctttt 2881620
tgcaaatgtt ctttatctct gtaatattga atatttttgg gattgtagcc ttgacaacta 2881680
ttacattgtt tttaagtgct caaatgagtt ctcctgttac agcgcttatt acttcttgcg 2881740
tcatctgctt cttgccagtt gtgtttgatt ttaatgatag ccttcctgtt ttacaaaaaa 2881800
tgcaggaaat ttgcccgatt tttatgcttc atacaaacgg tatattttct gatatgaaaa 2881860
catatttcgg tatgagccag ccggtcttta tgatcatcct taatgttgga ttgatattcg 2881920
tattttatag actaacaaaa aatatatcaa agaaacatca agttacgggg taattttgat 2881980
gaaagagaca agttgggtta gttgtcctat atgccataat aaaacccgaa taaaaatacg 2882040
aattgacacg gaattaagga atttcccctt gttctgtcca aaatgtaaac aggaaacgct 2882100
cattcatgta aagcaactga atatatccgt tattagagag ccagacgcat agacgcagag 2882160
ccgataacac gcaggctaac atgactgctg ttatcggctt ttcatattct tttaaacctg 2882220
ccccgcctaa tggggaaaga aaaaaaccgt agctgggcag gttgattttg tgcgcttact 2882280
ctagataccc tggcggcggt tttgagaaat cagagccgcc gtttcttttc gtctacccta 2882340
aaccaacgac gacccaacac cgtgtaaatc cacggcggca tataggagga tgccgccgtg 2882400
tctatgtttg cgtcttttca cagtatccat gatctgcacc acttaaaaaa agcctgttcc 2882460
cagcagcgga gcaatgcggt cagaagtatg cactatacca tgtaactaaa cagcaaaata 2882520
tactctatta cgctcgtatg gctttatgcc gtccgggcgc ttttttgtcc ctatggagcc 2882580
ggaacatcgg gtcagcatgg cccgaacttt atccccggtg ccgctccccg ccgcctcatt 2882640
cagatttacc aaaaaatctg aatggaggaa aggcagatgg aagttaccat caattataac 2882700
ggacaagctg tgaccgtgga ggtcacgctg gaagtctatg aatttcttga ccgcgccgat 2882760
cacaagacgg aaaaccttgc ccatgaacag cggcggcatt gggacgggcg ggagtttgac 2882820
gagtacatag cttttaccga gggcgtgggc gtttacagcg aaacgccgga ggaatacctt 2882880
tgccgcatgg aaacgctgca tgatctgatg gctgttctgg acacctgtac cgaggcccag 2882940
cgccgccggt tcctgctcta tgcgcttgac gggctgagcc ttgcggagat cggtgtgctg 2883000
tgcggctgct ccaaagtagc tgtttatcaa agtgtggagg cggtcagaaa aaaatttata 2883060
aatttctttg agaacaggct taacgaatga cctgttttct ggctaccaag tgaaagggat 2883120
catttccctt atctcagcga ggggcggaca gcggacgagc tgtccgcctc tccgattttc 2883180
aggaggtaag cctatgaaaa caatcaatct gcggtggatg tatccccact accggcatga 2883240
cgagtttgtg gatgttacgg acgaggtatg ggcagcgatg tatcaggccc agcgggagat 2883300
ggagaactat gagcgtcgga aagtctacca ccgcgcctac tactctctgg acgcatacag 2883360
ctggctggaa aattacgcac tggaacacag cagatcgccg gaagatattt tgctggaacg 2883420
agaagaaatg accacccgcc tgcacctgat tgcagctctg cctgcggctc tggctcatgc 2883480
cactccgaca caggcccgcc gtgttcacgc ctactacatt gccggtatca agcagccgga 2883540
aatcgcccgg agagagggta tccatagcag taaggtcagc gttgccatcc accgggggct 2883600
gcggaatatg cgccgctgct atgatgacct ttttcaaaca gagtgagggc gtgcctatgc 2883660
agaccatcaa tctcaaacaa tattatccat tttgcaaaga ggacattttt gtggaggtgt 2883720
ccgatgagat cgtcgaagcg tttcttctgg acaagagagc cgaggccgcc agagatcgca 2883780
agatgttccg gtataaggcg ttttattccc tcgattgtaa cgatggaatc gaaaatgccg 2883840
ccatcggctg ggcgcagcca tctccggagg actacctgat agaaaaagaa gaattagccg 2883900
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agggtatcac gccatcacag gcgggaaaat ccatccacgc tacactgcga aggctgcgcc 2884080
ggtactttgc gcgtcagaaa tggacggtca atctatgagt atttccaaag aaaagaggtg 2884140
catgacatga acgaaaaaaa tacagcccac ccccaaaaag aagaacggga gaaagtcctg 2884200
aaggagatcc ggcagcttga aaaccgaaag aagattttgg agaacaagca gcggaacgaa 2884260
gaacgcaggg ttcgcacccg ccgtctgatt gagcgcggag ccattttgga ggggattttt 2884320
ccgctggctc ccaacctttc cagcgcagag gtcaaagcat ttctgattgc cctgtcccat 2884380
cttccggggg ctgcggaatt gactgcaaac ctgccaaaat ccggggacac gccataagtc 2884440
ccttgtttac aagggcgcac ttatacaccg ttgccggtgc tgtgcgccct gccgggggcg 2884500
ttgcgtactt cgtccgcgat gggaagctac gctccccaaa ccccttgtgc gctctgcgca 2884560
gccaaacacc cgctttgcgt ttgtccggct ccacagagcc tgttatcccc tcactgaaag 2884620
gaggtgttcc ccatagattt ctgtcatatc cccgtcagta tcatcaagcg cagcgcgggc 2884680
cgttccgctg ttgcctcagc tgcttaccgc agcggaacca agctgacaaa tgaatgggac 2884740
ggcatgaccc acgactacac ccggaaaggc ggcattgttc atgcggagat catgctgcct 2884800
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ggaatgtgcg ccgactttgc catccatgac aagggaaccg gcaaccctca tgtccatatc 2885040
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gcagcctaca ccaaccgggc gctggaatct gccggtagac cggagcgcat tgaccaccgc 2885280
agctacaagc ggcagggcat tgataaaatc ccctctgtcc atctgggacc agccgccagc 2885340
caaatggaaa agcgcggtat ctgcaccgac aagggagaag taaaccggca gatcgccgcc 2885400
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cgcaaaaccg ccgagcagct gtcccgacag gaaagggaca agcctcacga ccgtgggccg 2886060
gagcggtaaa ggctaccgcg ttttggcgta cccctgtcaa gtgcgtcgca tttcacgaca 2886120
tacttttgca cacagaaaaa ccgccgtaca ggtttcccca tacggcggca gactgtttat 2886180
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cttccagcat ggcagcaacc gtttctttgt tcggctgttc cagccttact tcaaagggaa 2886600
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aacatcgaac ttttaatagg ccagtcctct accgaggccg agcgaaagcg ggctgcaagg 2887740
cttcaaaata aggctctttc tgcgccccgg acaaacggcg gacatttgtc cgacattcgt 2887800
ccaccagaga tagagataga gttagagaaa gagatagata taaagagaga gatagagaag 2887860
ggacgctccg cccgcgccta tggccgttac cagaatgttt tcctgacgga cgaggaactg 2887920
gcagacttgc aggccagttt tcctgttgta tgggaacagt acattgaaaa gctgtccgag 2887980
tacatggctt ctaccggcaa gcgttatcag agccatgcag caaccatccg gcgctgggcc 2888040
ggtgaggacg ctaaaaaaac tgtcacaccc tcacgcaacc gggattacag cgtaaaggag 2888100
gatgaaactg tatgattgag attaccgcag aaatccgggc gttcatcgac aaggcagctg 2888160
ccggtgtgga attggctgag gacgagtata tagacccgtc agatgggctc attcactgta 2888220
agaaatgcgg cggccagagg cagaccgttg tgccatgctt tgggaaatct ggctacttta 2888280
tgccgcgctg catctgccag tgccagcggg aggctgagga gcagcgcaag gctgctgaag 2888340
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atctctatga ctacacattt tccaatgata acgggcaaaa cccattgatg gacaaggctc 2888460
acgcctatgt tgagaactgg aaggaggcat ataaaaacaa caccggcctg ctgttgttcg 2888520
gggatgtggg aaccggcaag tcctttttcg ccggttgtat tgccaacgcc ctgcttgacc 2888580
gggatgtgcc ggtgctgatg acgaacttcc ccaccatcct gaaccgcctg acggggatgt 2888640
tttccgagga cagggccgac tttatcgcca gctttgatga gtacgaccta cttatcattg 2888700
acgatctggg tgtagagcgc agtaccgaat atgctatgga gcagatgttt ttcgtcatcg 2888760
acagccgcta tcgcagccgc aggcccatga ttatcacaac aaacttgaaa ctgtccgagc 2888820
tgaaaaaccc gcctgatctg gcccacgccc gtatctatga ccgtattttg gaacggtgtg 2888880
cgccgattct ttttgacggg aagaatttca gggaagaaaa tgccggtgct acccgacagg 2888940
cagcaaaaga cattgtaagc agtaagcacg actgattttt taccgggcgg cacagacccg 2889000
ttcggagaaa ggagcgccat gaacagagaa ccccgtacta tgcaggtggc agacgccgct 2889060
actgcgtcca gagcgccgga aaacacgcca gcgatggtaa agaaaatcgg taagacaacc 2889120
tacaaggttc atgtccattt cagcaatacc agcacagaaa ccatgagcga taaaatcaag 2889180
cgtatgctca aaaatgaaat tcagcagatg tgatagactg ataaacgaag ccaccttgtg 2889240
ctaaactgat gatggtacgc accaaaattt ttgtcaagga ggacacgaaa atgctttaca 2889300
cagaaaaaga gaagcatgaa attgaacgag taaaggaggt ctttgcggaa catctgcggc 2889360
aaagccctga ttttgaactg ctctggtcgg acaaggtagg ctatgtttgg ctggcgattg 2889420
gcgtaaatcc gctttatgtg gataccggta tcaggataga atcagctgcc gatctctgcg 2889480
gcaggtgttt ggacgatgtt gctacggatg ttttgtatat gacgggcaac gatcatgcac 2889540
tggaagtagc tgacccgctg gaattagccg aaatcaagcg gcgctgggag ccatatatca 2889600
accagctgcc agactatgcg tatctctgca aagacctgct gaacggaaaa atgtaatcta 2889660
tcaaacgagg tgtcaggagc catacggtgc ttctggcacc ttttttgtgg atttttgtga 2889720
atttgatgaa aaagtccttg acaattcgtc tctggaaaga cagcaaaatc catattgatt 2889780
agctgtggtg caagactggc accttttgac attaaagagc tgcgtgacct gatggaatat 2889840
gacgagctgg agcttgatac gattggtgag aaaaagacag cgttattcgt cattatttcc 2889900
gatacggatg ccacatttaa tttcgtggtg tcgattatgt attcccaact ctttaacctg 2889960
ctttgtgaca aggcagatga tgtatataac gggagactcc cggttcatgt gcgtatgctc 2890020
cttgatgagt ttgcgaacat cgggcagatt ccacagtttg agaagctgat tgctacaatc 2890080
cgtagccgtg aaatatcagc ttctattatt ttgcagtcaa agtcccagct caaggcgatt 2890140
tataaggaca acgctgacac gattgaaggc aactgtgata ccacactatt cctcggtggg 2890200
aaggaaaaga ctacgctcaa agaactggca gaagttctgg ggaaggaaac gattgacctt 2890260
tacaatacct cggatacaag aggtacaagc cagtcctacg gtctgaatta ccagaaaacc 2890320
ggaaaagagc ttatgagtca ggatgagatt gcggtcatgg acggcggaaa atgtatcatg 2890380
cagcttaggg gcgtgagacc atttttctca gacaaatttg atataacgaa gcacaaaaga 2890440
tacagggagc tgttcgatta tgaccctcaa aatgcctttg acattgagaa atatgtgaag 2890500
catctgcatc acatgaaagt cactccaaat acacaggtgg atgaaacctt tgactgtggg 2890560
gaggtaaacg ggcaggagga gcattcctca aatacaactg aataaagaac catgaacctt 2890620
tggacacaat gtccagaagc aaaaataatt taagaaaaga aagaggtaaa ttgaatggca 2890680
ttttttacaa cagcagtaac aggacttaaa acagtagtaa ccgcaatcgg tgcaggtgtg 2890740
gcagtatggg gtgtgatcaa tcttctggaa ggttacggaa acgataatcc gggcgcaaag 2890800
agccaaggag tcaagcagct tatggcaggc ggcggtattg ttattgtggc tcagacggtg 2890860
attccacagc ttacaagtct gttctcataa ttcatgggaa caatcattga caaaatcact 2890920
gaatttataa aggaaatgct gcaggggtgg gtgcttgaca atcttgaaac gatgtttacc 2890980
gacgtaaata cgaaggtagg ctctattgca ggggaagtcg ggcagacacc cagctcatgg 2891040
aacgcaggca ttttttccat gatccggaat ctttcagata atgtcatgat tcccatagca 2891100
ggaatgatta tcagcgccat actctgctat gagctgatta cgatggtaat ggataaaaac 2891160
aacatgcacg agatggggag cgagttcttc tttcgctacc tcatcaaagc atgtgttgcg 2891220
gtaatgttgc tcagtaagac gtttgacatt acaatggcaa tctttgatgt gggaaaccat 2891280
atcgtgacca atgcatcggg tgccattacc ggctccacga gccttgatgt gtcatccacg 2891340
ttgcagacca tgtttaatga tcagctttcc actatgggaa taggcgaact gatagggctt 2891400
ggaattgaaa ccatgattgt cagcttatgt atgaaaatca tgtccgtttt aatcaccgtc 2891460
gttttgtacg gacgaatgat agagatatac ctttatattt cagtggctcc ggttccgttt 2891520
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gctctggcat ttcagggatt tttcatcatg gtgtgcgtag gcatttactc tgtactggtg 2891640
tcgagtgtgg cggttgtatc caatcttcat acggcattat ggtcagtggc agcctacacc 2891700
gtcattttat gcttcagctt atttaagaca ggctcccttg caaaatcaat acttaatgca 2891760
cattagtagg aaaggaaaat gcttatggca atatcagtag cagtgccaaa agatttaagc 2891820
ggcatcaaga caaaggtggc gatgaatttg acaaaacgtc agttaatctg ctttggtggt 2891880
gcgggtgctg tgggtatccc cttttatatt tttacaaaag gggcaatcgg cacacaggca 2891940
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gacggctttc cggctgagaa gattctgtac tttatgatac ggcagaaaat actgacaccg 2892060
ggaatacgtc cctataaatc cgaaaacatt tacaggcagt tggaggaacg ggagaaaata 2892120
gagaaggagg tgcgttatct tgaagaaaaa gccgcaggca aaacaacagg gtaaacctgt 2892180
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gatgttccgt gacggcatct gtcaggtgac ttccacctat tacacgaaaa tgttggagtt 2892360
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cagtaaattt atcaattatt ttgacccgtc tattaagttc cagttatttc tgtttaacag 2892480
acaggtaaac gaacagactt taatagacca gtttgacatt cctttgcagg gagatgattt 2892540
tgatgatatc cgggaggaat attcggagat gttaaagaag caggctgcaa agggcaacaa 2892600
cggcatcatt aaatcaaagt accttatttt tggtacggag tgcaagggct ttaaagaagc 2892660
aaaatcaaag ctgaataata ttgaagctga tgtgattaaa aattttttga atcttggcac 2892720
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ggatacaatg gaacctttcc gtttttcatt tcaggaactg tcagagtctg gaaagagtgt 2892840
aaaggattat attgcaccgc cgggctttga tttccgttat ccgagccgtt ttaagacagg 2892900
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ggacccggta aaggcaatca agatgttaaa agcagctctg accaatatcc agaaaatgaa 2893080
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gaagattatc aagatgacct ttcttattac ctgttacggc agaaacaaga gggagcttga 2893260
aaatctgatt cagagagtat ccggcattat ccagcaggca aactgcaatt tgagatgtat 2893320
gcagtatttg caggagcagg gccttatggc atctgcaccg attggctgta atgatacggg 2893380
tattgagagg gtgcttacca caaagagtac tgctattctg gtgccgttct gtacgcagga 2893440
gttattcatg cctgccccgg caatttatta tggactgaat gccttgtcaa acaacatgat 2893500
tatggcagac agaaaaaggc ttcgtacacc gaatggagtc atacttggta cacccggttc 2893560
gggtaaatcg ttcagtgcaa agcgtgagat tttatcctgc tttttaatga caagggatga 2893620
tgtgattatc tgtgatccgg agggagagta ttttgctctt gtgggagcct tgcatggaca 2893680
ggtggtacga cttgccacca attccaaaga ttacttaaac ccgatggata tccagttaag 2893740
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tctgatcgcc ggaggaaagg atggtctgga aaatgatgaa aagggtatta ttgacgagtg 2893860
tatccgtcat atctacgatg cttattttga aaatccggtg ccggagaaca tgccaatcct 2893920
tgaagatttg tataatgccc ttctggaaca taagaacagc aaggcagaac gtattgccaa 2893980
tagccttgtg ctgtatgtgc atggttctca aaattatttt aaccaccgta ccaatgtaga 2894040
tagtaagaac cgcattatgt gttttgacat cagggacttg ggaaaccagt taaaagagct 2894100
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cgattttgta tacctgttaa accagaacgc aaaggatcag acaatccttg tagataagct 2894400
ggggttgtcg gaaaagcagc ttgcccatgt gactaattca gagccgggtt ccggtcttat 2894460
cctgtttgac aatgtggtaa ttccattcgt ggataaatat ccgacagata ccaagaccta 2894520
tgcgattatg aataccaaac cggaggaaag tgtaaggcag gaggaaaata attagtggca 2894580
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gcttttggac acgatgtcca gaggtcggaa cagaaacaaa agtccggaaa aaataagcga 2894700
aagacaggtc agtaccggaa agaggatacc tttggacaga gagaccagaa gtctggaaat 2894760
acggatacca gtaagaatca gaaaagtgat ttttcacagg aaaataatgc ttttactgag 2894820
gagaatgttt ccgagcagga gaaaagccag ccacaggatg attaccaccg cagggatact 2894880
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gaaaggacag agtttgaagg aagtaaaaag ttagacaggc ttcagaaaaa ggcagaaaaa 2895060
gccgggagaa aaacagaagc ggcaagaaag aagattccga agaaaacaga atattccctt 2895120
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gctatcggac atgacccgtt tgctctgatt agttatttgt cggcagttca tacggaattt 2895960
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ttaacgccaa caacggaaac aaggactcgg acagtgacaa agacaggaac caggactgtg 2896080
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gtttaatcac ttgatatcag tcgcaaagaa tactggctgt gccattgtga ttatcgctca 2927160
tatgaacaag atgagagata ccaaccctct ttatcgtacc aacggttcta ttgatattgc 2927220
gggtgctgca agaagtattc ttgcgatcac tcgcacaccg aacaaagaag caccagcaga 2927280
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gcagggaagc tgacaggaaa cggaaatgga atgcagtatt tcggagcaat tctaattcga 2953380
agtgacttgt ctttggaaga attggatgct tactattcaa ggtacagaag taatgagtgg 2953440
gaatgtttgg tgaaaattca ggaagggcag tccattgagg ggattgatca cgggacacta 2953500
caatttgcgg aagaaataaa ggacaggggt tattacattg tatattcttg gggaagtgga 2953560
aattctctat tggatgaatt ggatatacgt ggacactaaa aaggagcaag atgaattatg 2953620
aaatatattt ccaaaatcag taaaatcagt agcttcatat tttacatatt tctattgtgc 2953680
caattatggc atttatgcca atatggaatc attagaagtc attttttcgg agtagttatt 2953740
tgtacagtag gttttacagc ggcagttatt gtttggttgg tttcaagaag gaagaagtta 2953800
gaagaggata cggagaggat aattaacgat tgggggattc ctttttgaat aggaatctct 2953860
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gatagaaaag cattagagta tatgctttcg ttagaatatg ctatgccata tcaattactt 2953980
aagacaaaaa ataatagaag gaaaattatt tatataatga caccagtatt atttttgtta 2954040
tcaatcggtt gctattttgt aaagagttat ccgatgtttt atgtgggaat ggggatttct 2954100
attattgcat tgatttggat tatttggttt caatctaagg gaaaaaaatt tgaaaataat 2954160
gtccatgaat ttgtatggaa taaatcaaga tataacaaag tggaaattga tgttcaggga 2954220
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aaaagacaat ggaaattttg tacaaaagca caaggggaac aggagaatgt gtaacagctt 2979780
ctcaggcaat tttaaaagga ttatcagatg atggtggatt atttgttcct acacagattc 2979840
cggttttgga tattcctgta gagaaacttg catccatgac ttatcaggaa atcgcttatg 2979900
aggttatgag tcgtttcctt acagatttta cagaagacga attaaaagca tgtattgaaa 2979960
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tttcctctaa ggaataataa cagataattc cattttcaat ttcaataaaa gccgcacgaa 3072660
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ttttatgttc ttttccctta cagacatggc atctttctaa cattgcactc tgataagtac 3125820
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atacatctcg tcccatttta tccgttccaa agatatgtgc cttactcggt gcaagcagag 3138960
catcatttaa atctcccttt aatgggtcta taccaccact tacaatcggt gcaaaaatcg 3139020
caaccagaat aatcagaacc gccagaatca gaaaaaaagt aaactgctta ttctgcgcaa 3139080
aaaaattttt cttcttcatt ttttcttact cctttaatct cattctcggg tcaatataaa 3139140
tataagaagc atctacaatc agattgatta ccatataaat caacgcaagc cagagtacat 3139200
acccctgaat caggttatag tcacttgagg taattgcaga tactgcaagg tttccaagtc 3139260
ctggatagga gaaaataact tctacaactg cagttcctcc aagcaaagaa ccaatcgaca 3139320
aaccaaacat tgtaattagc ggaagtaaag aatttggaaa tacattacac cagataatac 3139380
gggaacgttt tacgcctcgt gcctctgccc caattacata atcctgactc agttcatcta 3139440
acactgcggt acgaacctgt ctggtatact ttgaaaacat tgcaattgcc aaagttaatg 3139500
ctggaagaaa caggctctta aaatcccctg cggaactgat aaccggaaat atcttaatat 3139560
aaacgcaaaa tgccatcata aggagcagtc ccacccagaa gtttggcatg gcacagccga 3139620
caaaagtaat tcccctgact aaataatcaa tccacgtgtc tttttttaat gccgatatca 3139680
ttccgagcgg tacagataaa atcagcataa tcagcataga cattaaggtt aattttaaag 3139740
tcggccaaag tctcacactt aacagttctg taaccggctt atttaacgaa taagaggttc 3139800
caaaatcacc atgcaggcag tttccaagcc atctgccata ctgcacaaca aacgggtcat 3139860
ttaatcccat ctcttctctt gtctgttcta ccatttcttc tgtcggcatc acaccatttg 3139920
cggaatacat atttcgtacc gggtcaccag gtgacatgta agtcagccca aatgtaataa 3139980
aactgatacc aaataatacg attatgattt gtaataatcg catgataacc tgtttcttac 3140040
tcaaaaattt tcacaccttt cataagtctt taatcaaacc actatctcta tccatataca 3140100
atgcccagtc caaaataaga ctgggcataa tcttaaataa aacgctttct tattctgcgt 3140160
ctgccggaac aatttctgtc gtcagccagt agtaatctgc tgtatgaatc ttagcatatc 3140220
ctacattttt agaataaatc atactggagt tataatatcc gtcaattaaa actgctgcat 3140280
catcaatcag aatctgctgc atctggaaga ttaaatcttc acgtttatcc ggatccattt 3140340
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tttcagttgc ccagtttgcc atataggcat aaggatctcc agtacctact gtaatccagt 3140460
tattgttatt aaagtcataa tctaaggctg ccagtttact ccactggtca tcagagcttc 3140520
catattcagc agtcacacca attccgattt cttttaagta ctgagtatgt gcatcagaaa 3140580
attcatttaa cagacggttt tcataagaaa tataacgcag gttaatattt tttccatcaa 3140640
gctcacggat tccatcacca tcggtatcta caattcctgc atcatccaat aatttctttg 3140700
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caaagttcat ccaggagaat ccacaacgta cacctggtgc aatatctact gtatagtcat 3140940
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gaccactctc cagagccatt gcctttgcag agttatctcc catatacatc agatttactt 3141060
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tggtatgttc tacatccaca atgcccatag tcgggtgact gagctgtccc atcaagtttg 3141240
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cttcaaattc cagatatttt tccggttttg cagaaccaga tggtccaact tcttttaagt 3141360
gttcgtaaca ttcctttact ttacttgctg tcagatcaca tccatctgag aattttaatc 3141420
cttttttcaa agtaatgacc cattccgtat gatcatcatt taccgtataa ctgtctgcca 3141480
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gcattgcatt ccagccaccg ttctcatccc ctgcggtatt tacacttccg tctgtgtaca 3141600
tggcacaacc gaaatttaaa accttttcat cactgttact tgatgatttt gcagcctttc 3141660
ctgaggaaga agaacttcca catcctccaa gtacacttac tgccatcaca gttgccatca 3141720
tcagcgctac tacatgtttc tttctcattt gcttcatcct tcctatactg gttcttcttc 3141780
ataaattaca tttgcctttt atagacgggg acaaaagtct gcttcttttt acgctttttt 3141840
ctgtttttaa gcgcaaaaaa accggatacc aaagcatccg actgttaaag attcttaatt 3141900
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caggtttcct gacttaagca tacacatcaa aagcaccttc ccagaataaa ctatctttcc 3142080
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gttctctttt aatcagacga ctgtctgaac ttatctctgt ggcatattcg ccaacattct 3142200
ataaataatt ttatttaaca ccattaatat acaagataaa tcatcttttt gtcaataaaa 3142260
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gtcatttctt aatttatctc tctgatttaa atcagccagt gtcattccat cataatattc 3144360
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agaaaacatc agaccttcta cacgcagtcc ggatttccaa tgaccatatt caatggcgtc 3145140
acccggaaga gaatactgta ccccataaaa cggtgcaatt ccgaaccctc tcataataca 3145200
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tccaagtgca catcctgcac aaatcagatt tctttttccg tatttcggta aaattttcgg 3145320
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atatgcggta tagaaaacca tcaatcccaa tgcaatcaga aaataacggt ttgtaactgt 3145500
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cgtctcataa atccaagctg aattaaatgt tttccagatt ccacttctgc atttactact 3147960
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attgttgctg ctgtaccggt atctgcctgt gcattatcta agatgacatc taaattcaca 3152280
ccttcttcga ttccagcttc ctttaaacct tctaaaaatc cttcacggca gttatccaga 3152340
gaaccatgct ctgcaaactg ggaaattcca actgtatagg ttgcttcttt actatctgta 3152400
ccttttgtat ctgcagtgtt ttcccctgct gaactgtttc cgcatcctgc aagtactcct 3152460
gctgtcatta ctgcgcttaa taccattgct aatacttttc ttctcatctt tttttctcct 3152520
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caattttcaa aagattttca tgcagctcac aggattcgca aacttcttct gatttttctg 3165540
tcataaaaca aatgctatcc tttctcttat tgatttttag cttttttatt ctataaattt 3165600
tttacaaaca aggttctgat tgcatttaat acggcaatta ccataacccc tacatcagca 3165660
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ataccaattg caaagtaaat attttcatat acaatgcgga tacatttttt tgcaatctta 3165780
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aaaatagaag caagtgcgtg gaacacttct gcacaccatc ttaaacattc tttaaaggac 3178860
ggagcaccaa ccggcataat cataaattcc tgtacatcca gtccggaaga taatgcatgg 3178920
catccaccgt taataatatt catcattggt accggcagac gatttccgga aattccgcca 3178980
aggaaacgat acagaggaat atccagtgca tttgcagctg ctcttgcact tgcgattgat 3179040
acagcaagaa ttgcatttgc acctaacttg gatttgtctt ttgttccgtc tgctgcaatc 3179100
atagctccat ctacagcata gatgtcagaa gcatccagtc catgtaaggt ctcattaatt 3179160
gttgtattaa tattttcaac tgccttttcg acaccttttc caaggtatct ttcttttaca 3179220
ttatctctaa gctccagtgc ttcaaattct cctgtagatg ctccacttgg tgccattcct 3179280
cttccgatag ttccatcttt taagatgacc tctgcctcta cagttggatt tcctctggag 3179340
tccaaaattt ctcttccgat tactttttcg attgttaaat gactcattgc catgtctcct 3179400
ctctgtttgt tttcctctca ttttacaact cctttaccgg aagcttggta tcttccggtg 3179460
aagaaagact caggtaatct tccttcaaag gagttctaaa atgattcagt cacacgaagt 3179520
tagttttaac taactatttg tattatacaa aaagaagaat aaaaatgcaa tcccctgaaa 3179580
gtgatagttt ttatcagtaa atttctgatt ctcttctttt aacagtcatt gaacttttac 3179640
aaagccatct tatcgaataa tgaaattcaa tggctgttct tctaaagaaa cttctactac 3179700
cttttttact cctgcgtttt ccccgtctgt atgaatcgga acagcctctt ccattgtcag 3179760
tactgccttt ttacatcttt caatatgtac cattttttta aatatcacat gctttccgaa 3179820
aaatgccgtt ggcagtacac atagaatcat taactttgga agtttttcta ccagacaaat 3179880
atccaaaaaa tcatcacagg gttctgcctc tggacaaaac aaaaatccac caccctcata 3179940
acgagtattc ataaatacag aaaataaaat tcctctctga tattcctttc tattctgatt 3180000
atctaacacc agttctgcct ttgtataggg atatttcatc aacaatttta atgccgtaaa 3180060
taagtaggtt aatttcccaa aatgtaaaaa gtttaacatg tttttgattt tcgactgaat 3180120
cgaatgatgg cagactgctg catcaaatcc tgctccgctg ctgattataa accttctttt 3180180
ttctccctct tcttcctcat tatctttagt tacaattttt ccaattctta ccgctttttt 3180240
ctcttttgga tgaagaataa aggctaaagc ttcaagtggc tcttttgaaa gtccaagtcc 3180300
ccttgcaagg tcatttcctg aaccggttgg aatataacca aaacttaaaa atggagataa 3180360
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tttctttgta gcagcaattt tatagttaat ctcttctttc tctaactgtt cctttatctc 3180540
tctccaaagc gttttatgtt ttcctgaact tgaagaagga tttatgataa aatagtaaaa 3180600
catggtatta ttccttttcc tttgtttttt cttttaactt taatcagaat tgagagattt 3180660
ttcaatagaa agtttatgta aaagtttatg gatttggaaa attaaatttg ggtaaaataa 3180720
aaagagagcg gaacaaaaag aatctcatct tttcatttcc gctcttcttt atttttctta 3180780
ttctacttct tccggttcca tgcttcgcag atgttctttg atttctccga tatcatattt 3180840
ctgactatat tcggttaaat aagaataata ctccgtatta tctgccggat aaatctttga 3180900
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ttccagacca cattcaccct tgcttaaacg ttctgcatgg tgcattttca attcgtcaca 3181080
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cttgtacaga aaagcttcta acttgtttcc tgcaaccatt ttcagaccgt ctcccattaa 3182520
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gttgtcattc catctggata aatccctttt ggcatcgcat ctttatccac aaacttttga 3185880
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tatgatcggc tttccatcac agtcatactg atatacctgg tcatcatgtg gtacaacccc 3205560
taacagttcc agtccctgat ttcggatttc ttccagagtt ccggcatcca gttttccatc 3205620
tggaacacga ttcacgatca atcctgtttt ctgtggttta aaattcaatt ccttcatcag 3205680
ctttgcaata cgtccggctg cctgaacacc tcttctggaa cagtcactca caagaatcgc 3205740
aacttccatc attggcagga tgcctctgct gatgtgttcc atacctgctt cgttatcaac 3205800
cacaatatat ggataatggc tttgcagttt ctgaacctgg gtctgtacaa gaccatttac 3205860
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ttctgcaatt gcatcggaaa gacgcatttc cagatatgcc tgttttgtca taccggacgg 3205980
gatctgatat cgtgggtcga cacctgcccg ctcaatttct tctctcaatt ctccaagttt 3206040
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taataaaaac ttccgctctt cctattgtaa taattgtctc tataatctgc tcataataag 3218940
cctctttatc cgttagatct gatttttccg taatcagttc ctcaatcaca taagcaaagt 3219000
caggtggtaa cgcttttcgt acttttgacc gcgtatattt cgatgcggcc tccttacaga 3219060
cttcaatcaa acgatacaat gtaattttat accagtccat aatatcttct tcggtctttt 3219120
tgattaattc cattttttct tttggataat aaatcaaagt agcaagggag cgcttgtcct 3219180
gttcatttaa tgtatgcccg aacacgtcat taatttttct tcgtaccgaa cccgaaccat 3219240
tttttaatac atgcgaaaat gcctcatact ccccatgtat atcggtaaga aaatgttccg 3219300
ttccttttgg gagatttaaa atcgcctgca gattaataat ctccgtggat gcctttgcaa 3219360
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ggcggtataa ataatatgga cccatgccac actctctggc acaattcatt gccatatcca 3232200
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cgttaccgtt gcactgagtg ttgcttctct cattaatccg ggacttggcg tcaaagtaga 3258660
caacatctct acttctgaag tttccctttc cgaaagtaaa ccactgacag agattctttt 3258720
aaatattatt ccaaaaaatc caattgaatc cttagcaact gccgatatgc ttccaattat 3258780
cgtctttgct ttatttgtcg gtatcatgtt agcaaaactt ggttctaaaa catctaccat 3258840
agccaatttt ttcagccagt tcaatgacat tatgatggaa atgactatgg ttgttatgag 3258900
tgttgctcct atcggtgttt tctgcctgat tgcacgtacg tttgcaaata tcggattcag 3258960
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ccgattgaag gttttccatc tgtgcattta actgttctaa ctgagcagtc agctgctctt 3271920
tttgtgcctg tgcggtttct aagccattct gcacggtttc aatagacttc ttccactgtt 3271980
cttcggtcat gccatccggc tttttttcta gtgcatctaa ctgcccctgc agattttcta 3272040
tctgcgcatc aatctttgaa atcgcatctt ctaactgtga ctgaccactt tctgcttctg 3272100
aaagctgtcc ctttgcctct gtcaactgct caatcgtctg atttaataac gcttctgtct 3272160
tttctaataa ctgtttctgt gtatcaagct ctgcctgctt actttccaga ttttgaagct 3272220
ggacatccac ttcagcagca ttttttgtca attcactttg cgcttcattt aattttgcgc 3272280
ttccctctcc aatttgagaa gctgcctcgt tttgccctgc ttctaattcc tgctttccat 3272340
cctcaagctt tgctttatta ctgttcaatt cttcctgtgc atccgctaaa tcctgttctt 3272400
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ctccgtcaat actttctaac tctgactgaa cattgttttc gatataatct gttacctctg 3272580
cggcagacat tccgtccaca tcagctgctg caactaatac cggcatcata tccggattta 3272640
atttcatgat aatcggattt cctacggaat cgtcccaata tccttttatc tggtctaaat 3272700
tttcccgcat ctccaatgtc acggaatcca tattggtgga ctccccaaat tccagaatta 3272760
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tactctgttc aatcggtttg gtaacggtct gttctacggt ttcaggactt gcccctgggt 3272880
aggtagtcat aacaattgca taaggcagat ccatacttgg cagtaagtcc gtactcatct 3272940
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gtcaataaaa gaacttgctt cgtaaaataa aaggcagcag gaaattcgac tgttctctca 3273180
tttcctgctg ctctcattat cctattttca gtaaagctgt ggaatgctta tctgaattca 3273240
gattttctta cttctgtgct tctattttct ccgctaaatc atttaaatac acccagcgat 3273300
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ccactacatt atccaaaaaa taacggtcat gggacaccgt aattacaatc ccagaaaaag 3273720
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ccaaaaccag gcagtttgga gcagaaatca atacacttaa caagtacagc cttttttgct 3273840
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ctaacatctg tgacgctgta atccttccat cacgggtcgg aacatactct gcaatatctt 3273960
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tcatttttaa aatggttgat tttccgcagc catttggtcc gacaaatgca agtctttgat 3274140
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cctgttcctg aaccggtgct tttccatttt ttaatgcttc cagacgctct aatcttgctc 3274320
tctgctttgt acttctggca cgacaaccac gttttgccca ttccagttcc attcgaagca 3274380
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tattcgtcac tttatctaag aaataacggt catgcgttac cataattact acacctttat 3274560
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gcatcgttgt tttccccgtt ccatttaaac caacgattcc aatcttatcc ccttcctgta 3274980
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ttctacgtga cgttctactc taagagataa tgtttcaagt ccctgaagga aaataaatga 3276600
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gaagaaattc ctactaaaac tccttctttc ttagcaagca gttttcctgt cttaaatgca 3277680
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taatttcttc cccaattcca actaacaagt ctgcatttct gtgaagcaaa ggataaatca 3285120
aatcaaaatg ctccacaatc accatttttc cattgtttgc tgcctctaaa attgcctctg 3285180
ccagttcatg catctgggta aatgcagatt caaaccgaat gtccagatga taagtgtgcg 3285240
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atgctcaaga atactttcgt gctcagtatc catgaacaaa tcccgtctac ccaacggctt 3298320
tcacttttta cgaataatgg aatattcgta tctttactgt gactataccc taacataaga 3298380
gtagtcaaaa aaacgcaaaa aattcatata ttttttaaat tttttctaat tcatatacac 3298440
tttttaatgg ttttaaataa tattctgctt cttttcgata gtcctctgct tcttttgtca 3298500
aaagtttttt gaatttttct gaatatttct tttttaattc ccattcatgc aaggcgaaaa 3298560
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gaactggtcg gaaaaatttt gattgccttt ttacttgcac cagtacttgg atatatggga 3311700
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cggctacctt gttacgactt caccccagtt atcaatcccg ccttcggcag ctccctccct 3324960
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ttggaggaat tggataactg tctttttcaa tcactgcaca tacatcatct tttaacattc 3338040
tcggtacgtt ttcatagaaa ccaccgcctg tgatatgact acatgctttt acacgcactc 3338100
ctgcttcttt cacgcttctg agcgctttta catagatttt tgtcggtgca attaatgctt 3338160
ctccaagtgt ttttccaagt tcatcataat aagtatccaa tgattctttt gtcatatcaa 3338220
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aactatcttg taaaggtttc cctcttcatt attagccaaa tctgaatata ttttttcttc 3351240
aatgctatat atcggatacc cctgttctat caaaccttgt acataattag ctcttcctgg 3351300
agcatcattt atttccatta atacccactg tggaattaaa atcaaatcat agacttttag 3351360
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atccagaagc gcaatatgtt ttttattatc aatttttgta atcttaacta tctcgatcat 3351480
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tccttatgat aattcagttc tggatttgca acttttattt tctttattct ttcctgtaag 3351600
gaagatgtat tgataacata agaaggcatt actaagctat catctaatcc taacattcta 3351660
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ctctgataca taaactttat tttctttatc atataaaatc atatcaaatt catcactgtg 3377700
tgctctccaa tactcaattg ccttatcttt tcccataata aacagagaag tggacaacgc 3377760
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atatccggta gtcgggtcaa taatgtgatg ataagtaacc ccgtcctgtt caaaataacg 3377880
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gtaagattat cacatttggt attacgaatc aggatgctgt attatatccc gcagatcatg 3404160
gtgttaattt aaaactcccg ggtagaaagg aacgccttta tctttcaaat gtagaagcgg 3404220
attccgtcct caaagaggtt aaaattaagc cttattatgg aagatatatc ctgtgcctta 3404280
ccctcgaaag tgaaaatttt gccgcagata atacagacat gcccaacata tgcgccatag 3404340
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aatcgcaccc attac 3415035
<210> 6
<211> 6524
<212> DNA
<213> Blautia stercoris strain 830 plasmid
<400> 6
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catcagcgag ctgaagcaga gcgtagagct actgaagaac agcaacgaat tgcttcaaga 1920
cgctatatcg ggcgagattg ggagcttgaa agatgaggtt aaggaaaata ccgtccaaga 1980
ggttagaaag gcgttacagg cgaatataga ggctatacag agggcgacaa agcttcttga 2040
gaagcagtct gatacactta cgagcgtgat gaagcagaaa ctccgggagc tggaggaaag 2100
taagaacagc tttttcagat atgagggctt gaaactgtac ctgttttggg gtggcatggt 2160
ctgtaatatt ttagtatttc ttatgctagc gtctagcatg tttggtaggt gaaaatatat 2220
ctagttagat taaaaaggtg caaaaaccta ttgataagat tagcggtcaa ggcgagaggg 2280
agtgaggtgt aggtattgac accccaaagg cactccctta tacttgagag aaaagggtgc 2340
aaaaacctat tgataagatt agcggtcaag gcgagaggga gtgaggtgta aaagactatg 2400
gcaaaataca ccaaaaggag agataaaaga gggtatgagt ggaagtctgc ttatcgggag 2460
aaagaagccc ttatgctgga gaggggatac ccggaagtaa gtcctcatga tttctatcgg 2520
gagttgtttc cggctggcag tctccagcaa gagccggagg acggaaaagg caatattata 2580
gcgacacaga ttagaccgtc cggcaaagga agaacccggc agtgggtaat tgatgatagt 2640
ctgaaaatgt tggataaggt cgtaggggat aggtttgggc tgataccgcc tattagtttt 2700
tacggaaagt cacacacgaa agagaacgct catgagctgt ttgcggtggt ggtggacgtg 2760
gactatgtag gcaaacagca gttaaagaac ctgttgaagc agtttgggaa tggtgtgcag 2820
ctttgtccga cttatcttgt cagctccggc aagggggtac atctttacta tttcttgcag 2880
gagccggttc agttgtatcg aaacagggaa gaagtgcttg cggagctaaa agaagccctt 2940
atccggcggc tatggaatga taccagctct atccgtccgg acagcccgga tataaccgga 3000
atttatcagg ggtttcggtg tgtagggagt cagtcgaagc tgggtgcaga tttcccagta 3060
aaagcctata agctgtcaga gaaccgttac acgctggagg acataaaagc cagcataccg 3120
agctgtaagg tagaccttgc tccgttgtat gagaagccga gaagaagaag taccgttacg 3180
ctggaagaag caaaggaact gtacccggaa tggtatgaga agcggatcgt gcagggagag 3240
ccgaagcagc aaagtaagaa gcagggcggt acgtgggtat gtaacgaagc tttatatgaa 3300
tggtggaaac ggaaaataac cgaggaagtg aaagctggag ggcgttactt ttccattatg 3360
gcgttatgct cttatggctt gaagtgtggc atatctgagc agaagatacg gagagacgcc 3420
tatgcgttcc tggaccattt agagagcctt accgaggacg aggacaacca tttcagccgg 3480
gcagatgtaa aagacgctct ccgggcattg aaaggggaca gaaaaaggct gtcaacgata 3540
gcaagccggg aatggataga ggacaacaca aaggttacga taccagcaaa taagcgaaat 3600
tacagaaaac aagaggctca tttatatctt gcaaggcgaa aaaaagagga tatgaaagtt 3660
ataggcgaag tagtaaaaga gggcagacca acagcagagc ggacagtcag agaatggcag 3720
gagagccacc cgacaggaaa gaaagcggac tgcatccgag agacaggact tgcaaagcat 3780
accgtttata agtggtggaa agatataaac aatgaaaata tatagggaaa aaggagttat 3840
ttaataactc ctttttccct attgtctatt gctgaagatt tgaggaaaaa tgaaggaatt 3900
ttgataaaaa aagataattt atcaaatata ttaaagccaa ggttattatt ccaataatga 3960
tgctaatagg caatattttt tttataaata gtgttgcaag agacgttcct aaaagaaacg 4020
cagatccata tggaataaca atattcaaca taaaaatttt attatgtttt tttcgtaagg 4080
ttgattgatt atggattaaa aaacagaggc gttgaggata tcctgattgc atgcgttgat 4140
ggtttaaatg gatttccaca ggcaatcgag gctgtttatc caaaaacaga gattcagcag 4200
tgtatcatcc atcagatccg taattcaacg aagtttgttt catacaaaga catcaaaaaa 4260
ctgatggctg atctgaagct tgtatatgca gctccgacgg aagaaaccgc tttaaatgaa 4320
ctggaactgt tcaaggataa atgggattcc aagtacccaa aaatctataa atcctggcat 4380
gataattggg caaccctgtc cacttatttc aaatatccgg aggcagtaag acggctgatt 4440
tataccacaa atgccattga aggattcaac cgccagctcc ggaaagtgac taaaagcaag 4500
gcggtatttc cgtcggatga cagccttttg aaaatgctgt atctggcaac catggatatc 4560
acgaaaaaat ggaccggaca caggcaggac tggggacaga tccattccca gcttgaaatt 4620
tattttgaag aacgtctggc agggcggaac ctgtaaagca gtcaatttta ggcaggtttt 4680
attgacatgc ctaaaaacta ctgtataatg cagatatggg cagaatccgg aaaatcggct 4740
ctgcccattg taactattca caaatcttat atcagttttt aacgtttaca caaaacttga 4800
aacggtctct aaaattttgt ataataggaa ttgaagttaa attagatgct aaaaatttgt 4860
aattaagaag gagggattcg tcatgttggt attccaaatg cgtaatgtag ataaaacatc 4920
tactgttttg aaacagacta aaaacagtga ttacgcagat aaataaatac gttagattaa 4980
ttcctaccag tgactaatct tatgactttt taaacagata actaaaatta caaacaaatc 5040
gtttaacttc tgtatttatt tacagatgta atcacttcag gagtgattac atgaacaaaa 5100
atataaaata ttctcaaaac tttttaacga gtgaaaaagt actcaaccaa ataataaaac 5160
aattgaattt aaaagaaacc gataccgttt acgaaattgg aacaggtaaa gggcatttaa 5220
cgacgaaact ggctaaaata agtaaacagg taacgtctat tgaattagac agtcatctat 5280
tcaacttatc gtcagaaaaa ttaaaactga atactcgtgt cactttaatt caccaagata 5340
ttctacagtt tcaattccct aacaaacaga ggtataaaat tgttgggaat attccttacc 5400
atttaagcac acaaattatt aaaaaagtgg tttttgaaag ccgtgcgtct gacatctatc 5460
tgattgttga agaaggattc tacaagcgta ccttggatat tcaccgaaca ctagggttgc 5520
tcttgcacac tcaagtctcg attcagcaat tgcttaagct gccagcggaa tgctttcatc 5580
ctaaaccaaa agtaaacagt gtcttaataa aacttacccg ccataccaca gatgttccag 5640
ataaatattg gaagctatat acgtactttg tttcaaaatg ggtcaatcga gaatatcgtc 5700
aactgtttac taaaaatcat tttcatcaag caatgaaaca cgccaaagta aacaatttaa 5760
gtaccattac ttatgagcaa gtattgtcta tttttaatag ttatctatta tttaacggga 5820
ggaaataatt ctatgagtcg cttttgtaaa tttggaaagt tacacgttac taaagggaat 5880
ggagataaat tattagatat aacagcgaca actaacctaa cggaggctca accgtaaaat 5940
gagaagaacc cccagtagtg gctgctactg ggggttcgtt ttgtgtctac gtgacacatt 6000
atatcttttc ttagctattg ccattatagc atatgctctc aggcaaatca agtttacgca 6060
attattatat tttttatacg tatcactcta ttttctccgc aatttttatt tttgtgtatt 6120
ttatacattt tttttttttt taattattta ttcagcatat tgatatttat atgtttccta 6180
tctccgtcta accatttgca aatatagtag ccaactacac ttgccagtac ggaaacaaga 6240
aaagatataa tttctgacac gtagacacac cccctttctg ttgccagaat gggcgcgaca 6300
acgctagata ttatatcaca ggggcagaaa tgccacaaga agccatttcc ccttgtttat 6360
catcaaagcc ataaggaaaa gagtgtcaag ggcggtcata gaccgcagcg tttacccttg 6420
atactctttt ttgttggcaa tcatgctgga ggggaaaacg gctgtccgtc cgttccgtta 6480
cttccccctg tgcttcattg tccgttccgg cggaagaaag taaa 6524
<210> 7
<211> 1458
<212> DNA
<213> Blautia hydrogenotrophica strain S5a36
<220>
<221> n
<222> 1416
<223> a, t, c or g
<400> 7
gatgaacgct ggcggcgtgc ttaacacatg caagtcgaac gaagcgatag agaacggaga 60
tttcggttga agttttctat tgactgagtg gcggacgggt gagtaacgcg tgggtaacct 120
gccctataca gggggataac agttagaaat gactgctaat accgcataag cgcacagctt 180
cgcatgaagc ggtgtgaaaa actgaggtgg tataggatgg acccgcgttg gattagctag 240
ttggtgaggt aacggcccac caaggcgacg atccatagcc ggcctgagag ggtgaacggc 300
cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgca 360
caatggggga aaccctgatg cagcgacgcc gcgtgaagga agaagtatct cggtatgtaa 420
acttctatca gcagggaaga aagtgacggt acctgactaa gaagccccgg ctaattacgt 480
gccagcagcc gcggtaatac gtaaggggca agcgttatcc ggatttactg ggtgtaaagg 540
gagcgtagac ggtttggcaa gtctgatgtg aaaggcatgg gctcaacctg tggactgcat 600
tggaaactgt cagacttgag tgccggagag gcaagcggaa ttcctagtgt agcggtgaaa 660
tgcgtagata ttaggaggaa caccagtggc gaaggcggcc tgctggacgg taactgacgt 720
tgaggctcga aagcgtgggg agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acgctgtaaa 780
cgatgaatac taggtgtcgg gtggcaaagc cattcggtgc cgcagcaaac gcaataagta 840
ttcccacctg gggagtacgt tcgcaagaat gaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca 900
caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aaatcttgac 960
atccctctga ccgggaagta atgttccctt ttcttcggaa cagaggagac aggtggtgca 1020
tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct 1080
tattcttagt agccagcagg tagagctggg cactctaggg agactgccag ggataacctg 1140
gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gatttgggct acacacgtgc 1200
tacaatggcg taaacaaagg gaagcgaagg ggtgacctgg agcaaatctc aaaaataacg 1260
tctcagttcg gattgtagtc tgcaactcga ctacatgaag ctggaatcgc tagtaatcgc 1320
gaatcagaat gtcgcggtga atacgttccc gggtcttgta cacaccgccc gtcacaccat 1380
gggagtcagt aacgcccgaa gtcagtgacc caaccnaaag gagggagctg ccgaaggtgg 1440
gactgataac tggggtga 1458
Claims (81)
- 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한, 블라우티아 속의 세균 균주를 포함하는 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 중추신경계 장애 또는 병태는 미생물총-소화관-뇌 축에 의해 매개되는, 조성물.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서, 상기 조성물은 신경발달 장애 또는 신경정신 병태를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것인, 조성물.
- 청구항 1 또는 2에 있어서, 상기 조성물은 하기로 구성된 군으로부터 선택된 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는데 사용하기 위한 것인, 조성물: 자폐 스펙트럼 장애 (ASD); 아동 발달 장애; 강박 장애 (OCD); 주요 우울 장애; 우울증; 계절성 정서적 장애; 불안 장애; 만성 피로 증후군 (근육통성 뇌척수염); 스트레스 장애; 외상후 스트레스 장애; 정신분열증 스펙트럼 장애; 정신분열증; 양극성 장애; 정신병; 기분 장애; 치매; 알츠하이머; 파킨슨병; 만성 통증; 운동 뉴런 질환; 헌팅턴병; 길랑-바레 증후군 및 수막염.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 자폐 스펙트럼 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것인, 조성물.
- 청구항 5에 있어서, 상기 조성물은 자폐증을 감소시키거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것인, 조성물.
- 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 정형, 반복적인, 강박성 및/또는 불안해하는 행동을 예방하고, 감소시키거나 완화시키는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 강박 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것인, 조성물.
- 청구항 8에 있어서, 상기 조성물은 반복적인, 강박성 및/또는 불안해하는 행동을 예방하고, 감소시키거나 완화시키는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 주요 우울 장애를 치료하거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것인, 조성물.
- 청구항 10에 있어서, 상기 조성물은 급성 주요 우울 에피소드을 치료 또는 예방하고/거나 신규한 에피소드의 예방 (재발 예방)을 위한 것인, 조성물.
- 청구항 10 또는 11에 있어서, 상기 조성물은 경도, 중간 또는 중증 MDD 에피소드의 발생을 예방하고, 감소시키거나 완화시키는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 불안 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것인, 조성물.
- 청구항 13에 있어서, 상기 불안 장애는 범불안 장애 (GAD); 특정 공포증; 사회적 불안 장애; 분리 불안 장애; 광장공포증; 공황 장애 및/또는 선택적 무언증인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 신경인지 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것인, 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 상기 신경인지 장애는 혈관 치매; 혼합된 형태 알츠하이머병 및 혈관 치매; 루이체 질환; 전두측두 치매; 파킨슨 치매; 크로이펠츠- 야콥병; 헌팅턴병; 및 베르니케-코르사코프 증후군인, 조성물.
- 청구항 1 내지 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 미생물총-소화관-뇌 축을 조절하는 방법에서 사용하기 위한 것인, 조성물.
- 청구항 1 내지 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균 균주는 블라우티아 스테르코리스의 것인, 조성물.
- 청구항 1 내지 17에 있어서, 상기 세균 균주는 블라우티아 훽슬레라에의 것인, 조성물.
- 청구항 1 내지 17에 있어서, 상기 세균 균주는 블라우티아 하이드로게노트로피카의 것인, 조성물.
- 청구항 1 내지 18에 있어서, 상기 세균 균주는 16s rRNA 서열을 갖되, 이 서열은 블라우티아 스테르코리스의 세균 균주의 16s rRNA 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한, 조성물.
- 청구항 1 내지 18에 있어서, 상기 세균 균주는 16s rRNA 서열을 갖되, 이 서열은 서열번호:1 또는 2에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한, 조성물.
- 청구항 22에 있어서, 상기 세균 균주는 16s rRNA 서열을 갖되, 이 서열은 서열번호:2에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일하거나, 또는 상기 세균 균주는 서열번호:2에 의해 제시된 16s rRNA 서열을 갖는, 조성물.
- 청구항 1 내지 17 또는 19에 있어서, 상기 세균 균주는 16s rRNA 서열을 갖되, 이 서열은 블라우티아 훽슬레라에의 세균 균주의 16s rRNA 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한, 조성물.
- 청구항 1 내지 17 또는 19에 있어서, 상기 세균 균주는 16s rRNA 서열을 갖되, 이 서열은 서열번호:3 또는 4에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한, 조성물.
- 청구항 25에 있어서, 상기 세균 균주는 16s rRNA 서열을 갖되, 이 서열은 서열번호:4에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일하거나, 상기 세균 균주는 서열번호:4에 의해 제시된 16s rRNA 서열을 갖는, 조성물.
- 청구항 1 내지 17 또는 20에 있어서, 상기 세균 균주는 16s rRNA 서열을 갖되, 이 서열은 블라우티아 하이드로게노트로피카의 세균 균주의 16s rRNA 서열에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한, 조성물.
- 청구항 1 내지 17 또는 20에 있어서, 상기 세균 균주는 16s rRNA 서열을 갖되, 이 서열은 서열번호:7에 대해 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 99.9% 동일한, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 자폐 스펙트럼 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 29에 있어서, 상기 조성물은 자폐증을 감소시키거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것인, 조성물.
- 청구항 29 또는 30에 있어서, 상기 조성물은 정형, 반복적인, 강박성 및/또는 불안해하는 행동을 예방시키고, 감소시키거나 완화시키는 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 강박 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 32에 있어서, 상기 조성물은 반복적인, 강박성 및/또는 불안해하는 행동을 예방시키고, 감소시키거나 완화시키는 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 주요 우울 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 34에 있어서, 상기 조성물은 급성 주요 우울 에피소드를 치료 또는 예방하고/거나 신규한 에피소드의 예방 (재발 예방)을 위한 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 34 또는 35에 있어서, 상기 조성물은 경도, 중간 또는 중증 MDD 에피소드의 발생을 예방하고, 감소시키거나 완화시키는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 불안 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 37에 있어서, 상기 불안 장애는 범불안 장애 (GAD); 특정 공포증; 사회적 불안 장애; 분리 불안 장애; 광장공포증; 공황 장애 및/또는 선택적 무언증인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 신경인지 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 39에 있어서, 상기 신경인지 장애는 혈관 치매; 혼합된 형태 알츠하이머병 및 혈관 치매; 루이체 질환; 전두측두 치매; 파킨슨 치매; 크로이펠츠- 야콥병; 헌팅턴병; 및 베르니케-코르사코프 증후군인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은자폐 스펙트럼 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 41에 있어서, 상기 조성물은 자폐증을 감소시키거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것인, 조성물.
- 청구항 41 또는 42에 있어서, 상기 조성물은 정형, 반복적인, 강박성 및/또는 불안해하는 행동을 예방하고, 감소시키거나 완화시키는 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 강박 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 44에 있어서, 상기 조성물은 반복적인, 강박성 및/또는 불안해하는 행동을 예방하고, 감소시키거나 완화시키는 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 주요 우울 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 46에 있어서, 상기 조성물은 that 급성 주요 우울 에피소드를 치료 또는 예방하고/거나 신규한 에피소드의 예방 (재발 예방)을 위한 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 46 또는 47에 있어서, 상기 조성물은 경도, 중간 또는 중증 MDD 에피소드의 발생을 예방하고, 감소시키거나 완화시키는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 불안 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 49에 있어서, 상기 불안 장애는 범불안 장애 (GAD); 특정 공포증; 사회적 불안 장애; 분리 불안 장애; 광장공포증; 공황 장애 및/또는 선택적 무언증인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 신경인지 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 훽슬레라에 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 51에 있어서, 상기 신경인지 장애는 혈관 치매; 혼합된 형태 알츠하이머병 및 혈관 치매; 루이체 질환; 전두측두 치매; 파킨슨 치매; 크로이펠츠- 야콥병; 헌팅턴병; 및 베르니케-코르사코프 증후군인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 자폐 스펙트럼 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 53에 있어서, 상기 조성물은 자폐증을 감소시키거나 예방하는 방법에서 사용하기 위한 것인, 조성물.
- 청구항 53 또는 54에 있어서, 상기 조성물은 정형, 반복적인, 강박성 및/또는 불안해하는 행동을 예방하고, 감소시키거나 완화시키는 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 강박 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 56에 있어서, 상기 조성물은 반복적인, 강박성 및/또는 불안해하는 행동을 예방하고, 감소시키거나 완화시키는 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 주요 우울 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 58에 있어서, 상기 조성물은 급성 주요 우울 에피소드를 치료 또는 예방하고/거나 신규한 에피소드의 예방 (재발 예방)을 위한 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 58 또는 59에 있어서, 상기 조성물은 경도, 중간 또는 중증 MDD 에피소드의 발생을 예방하고, 감소시키거나 완화시키는, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 불안 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 61에 있어서, 상기 불안 장애는 범불안 장애 (GAD); 특정 공포증; 사회적 불안 장애; 분리 불안 장애; 광장공포증; 공황 장애 및/또는 선택적 무언증인, 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 신경인지 장애를 치료 또는 예방하는 방법에서 사용하기 위한 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 63에 있어서, 상기 신경인지 장애는 혈관 치매; 혼합된 형태 알츠하이머병 및 혈관 치매; 루이체 질환; 전두측두 치매; 파킨슨 치매; 크로이펠츠- 야콥병; 헌팅턴병; 및 베르니케-코르사코프 증후군인, 조성물.
- 청구항 20, 27 및 28 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균 균주는 부티레이트의 수준을 증가시키는, 조성물.
- 청구항 1 내지 65 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 경구 투여를 위한 것인, 조성물.
- 청구항 1 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균 균주는 동결건조되는, 조성물.
- 청구항 1 내지 68 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세균 균주는 생존가능하고 상기 장을 부분적으로 또는 전적으로 군집화할 수 있는, 조성물.
- 청구항 1 내지 69 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 블라우티아의 단일 균주를 포함하는, 조성물.
- 청구항 1 내지 70 중 어느 한 항에 있어서, 블라우티아 세균 균주를 미생물 컨소시엄의 일부로서 포함하는, 조성물.
- 청구항 1 내지 71 중 어느 한 항의 사용을 위한, 청구항 1 내지 71 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 식품.
- 청구항 1 내지 72 중 어느 한 항의 사용을 위한, 청구항 1 내지 72 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 백신 조성물.
- 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 블라우티아 스테르코리스 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 그것이 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
- 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 블라우티아 훽슬라에 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 그것이 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
- 중추신경계 장애 또는 병태를 치료 또는 예방하는 방법으로서, 블라우티아 하이드로게노트로피카 종의 세균 균주를 포함하는 조성물을 그것이 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 방법.
- 청구항 1 내지 18, 20 내지 22, 26-37 및 50 내지 55 중 어느 한 항의 사용을 위한, 기탁 번호 NCIMB 42381 하에 기탁된 블라우티아 스테르코리스 균주, 또는 이의 유도체의 세포.
- 청구항 1 내지 17, 19, 23내지 25, 및 38 내지 55 중 어느 어느 한 항의 사용을 위한, 기탁 번호 NCIMB 42486 하에 기탁된 블라우티아 훽슬레라에 균주의 세포 또는 이의 유도체.
- 청구항 1 내지 18, 20 내지 22, 26 내지 37 및 50 내지 55 중 어느 어느 한 항의 사용을 위한 청구항 77의 세포를 포함하는 조성물.
- 청구항 1 내지 17, 19, 23 내지 25, 및 38 내지 55 중 어느 어느 한 항의 사용을 위한, 청구항 78의 세포를 포함하는 조성물.
- 청구항 79 또는 80에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하는, 조성물.
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