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KR20190118164A - 개선된 항체-커플링된 t 세포 수용체 구축물 및 그의 치료 용도 - Google Patents

개선된 항체-커플링된 t 세포 수용체 구축물 및 그의 치료 용도 Download PDF

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KR20190118164A
KR20190118164A KR1020197025077A KR20197025077A KR20190118164A KR 20190118164 A KR20190118164 A KR 20190118164A KR 1020197025077 A KR1020197025077 A KR 1020197025077A KR 20197025077 A KR20197025077 A KR 20197025077A KR 20190118164 A KR20190118164 A KR 20190118164A
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KR
South Korea
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cells
actr
domain
antibody
cell
Prior art date
Application number
KR1020197025077A
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English (en)
Inventor
캐슬린 맥기니스
그레고리 모츠
마이클 프레이
비르기트 슐츠
제임스 헴필
제임스 김
투바 치마
테일러 히크먼
Original Assignee
유넘 테라퓨틱스 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유넘 테라퓨틱스 인크. filed Critical 유넘 테라퓨틱스 인크.
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Abstract

CD16A 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인 (그 중 적어도 1개는 CD28 공동-자극 신호전달 도메인임), 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR) 폴리펩티드가 본원에 개시된다. 또한, 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR)인 제1 폴리펩티드; 및 공동-자극 신호를 도출하는 제2 폴리펩티드를 발현하는 유전자 조작된 면역 세포, 뿐만 아니라 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)의 증진을 필요로 하는 대상체에게 치료 유효량의 치료 항체 및 유효량의 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR) 폴리펩티드를 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 림프구 및/또는 NK 세포)를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 증진시키는 방법이 본원에 개시된다.

Description

개선된 항체-커플링된 T 세포 수용체 구축물 및 그의 치료 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 1월 30일에 출원된 미국 가출원 번호 62/451,992, 및 2017년 10월 28일에 출원된 미국 가출원 번호 62/578,429의 출원일의 이익을 주장한다. 이들 언급된 출원 각각의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
세포-기반 요법, 항체 요법 및 시토카인 요법을 포함한 암 면역요법은, 정상 조직은 그대로 두면서 종양 세포를 공격하는 면역 반응을 촉발하는 데 사용된다. 이는 약물 내성의 유전자 및 세포 메카니즘을 피하고, 정상 조직은 그대로 두면서 종양 세포를 표적화하는 그의 잠재력 때문에, 다양한 유형의 암을 치료하기 위한 유망한 옵션이다. T-림프구는 혈액 악성종양에 대한 동종 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)의 결과에 의해 입증된 바와 같이 주요 항-종양 효과를 발휘할 수 있으며, 여기서 T-세포-매개된 이식편-대-숙주 질환 (GvHD)은 질환 재발과 역으로 연관되고, 면역억제 철회 또는 공여자 림프구의 주입은 재발을 함유할 수 있다. Weiden et al., NEnglJ Med. 1979;300(19):1068-1073; Porter et al., NEnglJ Med. 1994;330(2):100-106; Kolb et al., Blood. 1995;86(5):2041-2050; Slavin et al., Blood. 1996;87(6):2195-2204; 및 Appelbaum, Nature. 2001;411(6835):385-389.
세포-기반 요법은 암 세포에 대해 편향된 반응성을 갖는 세포독성 T 세포를 수반할 수 있다. Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.; 1993;90(2):720-724; Geiger et al., J Immunol. 1999;162(10):5931-5939; Brentjens et al., Nat. Med. 2003;9(3):279-286; Cooper et al., Blood. 2003;101(4):1637-1644; 및 Imai et al., Leukemia. 2004;18:676-684. 한 접근법은 1개 이상의 T 세포 활성화 신호전달 도메인에 융합된 항원-결합 도메인을 갖는는 키메라 수용체를 발현하는 것이다. 항원-결합 도메인을 통해 암 항원에 결합하게 되면, T 세포는 활성화되고, 세포독성이 촉발된다. 키메라 수용체-발현 자가 T 림프구 주입을 사용한 임상 시험의 최근의 결과는 그들의 임상 잠재력의 유력한 증거를 제공하였다. Pule et al., Nat. Med. 2008;14(11):1264-1270; Porter et al., N Engl J Med; 2011; 25;365(8):725-733; Brentjens et al., Blood. 2011;118(18):4817-4828; Till et al., Blood. 2012;119(17):3940-3950; Kochenderfer et al., Blood. 2012;119(12):2709-2720; 및 Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013;5(177):177ra138.
또 다른 접근법은 면역 세포, 예컨대 NK 세포 또는 T 세포에서 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR) 단백질을 발현하는 것이며, ACTR 단백질은 세포외 Fc-결합 도메인을 함유한다. ACTR-발현 T 세포 ("ACTR T 세포"로도 불림)가 대상체에게 항암 항체와 함께 투여되는 경우에, 이들은 항체의 Fc 도메인에 대한 그의 결합을 통해 항체에 의해 표적화된 암 세포에 대한 독성을 증진시킬 수 있다. Kudo et al., Cancer Research (2014) 74:93-103.
항체-기반 면역요법, 예컨대, 모노클로날 항체, 항체-융합 단백질, 및 항체 약물 접합체 (ADC)는 많은 유형의 암을 포함한 매우 다양한 질환을 치료하는 데 사용된다. 이러한 요법은 정상 세포 (예를 들어, 비-암 세포)에 비해, 제거하고자 하는 세포 (예를 들어, 표적 세포 예컨대 암 세포) 상에 차등 발현되는 세포 표면 분자의 인식에 따라 달라질 수 있다. 항체-기반 면역요법의 암 세포에 대한 결합은 다양한 메카니즘, 예를 들어, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체-의존성 세포독성 (CDC), 또는 항체-약물 접합체 (ADC)로부터의 페이로드의 직접적인 세포독성 활성을 통해 암 세포 사멸을 일으킬 수 있다.
본 개시내용은 치료 활성을 포함한 우수한 시험관내 및/또는 생체내 생물활성을 나타내는 개선된 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR)의 개발에 기초한다. 이러한 개선된 ACTR 구축물은 CD28 공동-자극 도메인을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 기재된 개선된 ACTR 구축물은 힌지 도메인을 갖지 않거나 또는 단축된 힌지 도메인을 가질 수 있다. 단독으로, 또는 공동-자극 신호전달을 도출할 수 있는 별개의 폴리펩티드와 조합하여 취해진 본원에 기재된 개선된 ACTR 구축물을 발현하는 T 세포는, 세포독성, 세포 증식 및 활성화를 포함한 우수한 생체내 및 시험관내 생물활성 (예를 들어, IL-2 생산, CD3+ 세포의 백분율), 및/또는 생체내 항종양 활성을 나타내었다.
따라서, 1종 이상의 증진된 생물활성을 갖는 ACTR 폴리펩티드, 이러한 것을 코딩하는 핵산, ACTR 및 임의로 공동-자극 신호전달을 도출할 수 있는 별개의 폴리펩티드를 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 세포 또는 자연 살해 세포), 및 면역 요법에서의 치료 항체와 함께 이러한 것의 용도가 본원에 제공된다.
따라서, 본 개시내용의 한 측면은 (i) CD16A 세포외 도메인, (ii) 막횡단 도메인, (iii) 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인 (그 중 적어도 1개는 CD28 공동-자극 신호전달 도메인임), 및 (iv) CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR) 폴리펩티드를 특색으로 한다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 (i) CD16A 세포외 도메인, (ii) 막횡단 도메인, (iii) 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인 (그 중 적어도 1개는 CD28 공동-자극 신호전달 도메인임), 및 (iv) CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR) 폴리펩티드를 특색으로 한다. 막횡단 도메인이 (ii) CD8 막횡단 도메인인 경우, ACTR 폴리펩티드는 임의의 비-CD16A 수용체로부터의 힌지 도메인이 없거나, 또는 1개 초과의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 1 내지 60개 아미노산 잔기 길이 (예를 들어, 1 내지 30개 아미노산 잔기 길이 또는 31 내지 60개 아미노산 잔기 길이)일 수 있는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드는 비-CD16A 수용체로부터의 임의의 힌지 도메인이 없을 수 있다. 일부 예에서, ACTR 폴리펩티드는 임의의 힌지 도메인이 없을 수 있다.
일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD16A 힌지 도메인, 비-CD16A 수용체 힌지 도메인, 또는 그의 조합이다. 특정 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD28 힌지 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인 (ii)는 CD28 막횡단 도메인이다. 그러한 경우에, ACTR 폴리펩티드는 임의의 비-CD16A 수용체로부터의 임의의 힌지 도메인이 없을 수 있고/거나 1개 초과의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 (i) CD28 공동-자극 도메인; 및 (ii) CD28 막횡단 도메인, CD28 힌지 도메인, 또는 그의 조합을 포함한다.
일부 예에서, ACTR 폴리펩티드는 서열식별번호(SEQ ID NO): 9, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 2개의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하며, 하나는 CD28 공동-자극 신호전달 도메인이고 다른 것은 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인 또는 OX40 공동-자극 신호전달 도메인이다. 일부 실시양태에서, 다른 공동-자극 신호전달 도메인은 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인이다. 특정 실시양태에서, 4-1BB 신호전달 도메인은 CD28 공동-자극 신호전달 도메인에 대해 N-말단에 위치한다. 특정 실시양태에서, 4-1BB 신호전달 도메인은 CD28 공동-자극 신호전달 도메인에 대해 C-말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, 다른 공동-자극 신호전달 도메인은 OX40 공동-자극 신호전달 도메인이다. 특정 실시양태에서, OX40 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28 공동-자극 신호전달 도메인에 대해 C-말단에 위치한다. 특정 실시양태에서, OX40 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28 공동-자극 신호전달 도메인에 대해 N-말단에 위치한다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 (ii) CD8 막횡단 도메인이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것은 CD8 힌지 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 특정 예에서, ACTR 폴리펩티드는 서열식별번호: 7 또는 서열식별번호: 8의 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 (i) CD16A 세포외 도메인, (ii) 막횡단 도메인, 및 (iii) CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR) 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 ACTR 폴리펩티드는 임의의 비-CD16A 수용체로부터의 힌지 도메인이 없을 수 있다 (예를 들어, 임의의 힌지 도메인이 없음).
일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 추가로 포함한다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인은 CD27, CD28, 4-1BB, ICOS 및 OX40으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 2개의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개의 공동-자극 신호전달 도메인 중 하나는 CD28 공동-자극 신호전달 도메인이고 다른 하나는 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인, OX40 공동-자극 신호전달 도메인, CD27 공동-자극 신호전달 도메인 또는 ICOS 공동-자극 신호전달 도메인이다. 일부 실시양태에서, 다른 공동-자극 신호전달 도메인은 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인이다. 특정 실시양태에서, 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28 공동-자극 신호전달 도메인에 대해 N-말단에 위치한다. 특정 실시양태에서, 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28 공동-자극 신호전달 도메인에 대해 C-말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, 다른 공동-자극 신호전달 도메인은 OX40 공동-자극 신호전달 도메인이다. 특정 실시양태에서, OX40 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28 공동-자극 신호전달 도메인에 대해 C-말단에 위치한다. 특정 실시양태에서, OX40 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28 공동-자극 신호전달 도메인에 대해 N-말단에 위치한다.
일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 단일 (즉, 오직 1개의) 공동-자극 신호전달 도메인을 함유한다. 일부 실시양태에서, 단일 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인이다. 구체적 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 ACTR 폴리펩티드인 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하고 임의로 공동-자극 신호를 도출하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 공동-자극 신호전달 도메인, 공동-자극 수용체, 공동-자극 수용체에 대한 결합 모이어티, 또는 공동-자극 수용체의 리간드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 4-1BB, ICOS, OX40, CD27 또는 CD28에 대한 결합 모이어티 (예를 들어, 단일-쇄 항체 (scFv))를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 4-1BBL, CD80, CD86, OX40L, ICOSL, CD70, 또는 그의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 4-1BBL일 수 있다.
일부 예에서, 제1 폴리펩티드는 서열식별번호: 38의 아미노산 서열을 포함하고/거나, 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 39의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 예에서, 제1 폴리펩티드는 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하고/거나, 제2 폴리펩티드는 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 사이에 위치하는 제3 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 여기서 제3 뉴클레오티드 서열은 리보솜 스키핑 부위, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 또는 제2 프로모터를 코딩한다. 특정 실시양태에서, 리보솜 스키핑 부위는 P2A 펩티드이다.
일부 실시양태에서, 핵산은 벡터 내에 존재한다. 일부 실시양태에서, 벡터는 발현 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터이다. 특정 실시양태에서, 벡터는 레트로바이러스 벡터, 예를 들어, 감마 레트로바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 특정 실시양태에서, 숙주 세포는 면역 세포이다.
한 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR)인 제1 폴리펩티드를 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)를 제공한다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)는 공동-자극 도메인 또는 공동-자극 수용체의 리간드를 포함하는 제2 폴리펩티드를 추가로 발현한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 4-1BBL, CD80, CD86, OX40L, ICOSL, CD70, 또는 그의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, 제2 폴리펩티드는 4-1BBL을 포함한다.
한 측면에서, 본 개시내용은 항체-의존성 세포-매개 세포독성의 증진을 필요로 하는 대상체에게 유효량의 임의의 면역 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 또는 본원에 개시된 벡터 중 임의의 것, 및 유효량의 치료 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 증진시키는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 치료 항체는 TNF-알파, HER2, CD52, CD38, BCMA, GPC3, PDGF-R-알파, CD25, VEGF, BLyS, CD30, IL1-B, EGFR, RANK 리간드, GD2, C5, CD11a, CD22, CD123, CD33, CTLA4, CEACAM5, 알파-4 인테그린, CD20, CD19, IgE, RSV, VEGFR2, IL6R, IL12, IL-23, FOLR1 (폴레이트 수용체 알파), 루이스 Y, PD-1, B7-H1 (PD-L1, CD274), B7-H2 (PD-DC, CD273), B7-H3, B7-H4, CD138 (신데칸-1), 인테그린 알파4-베타7 또는 PSMA에 특이적이다.
일부 실시양태에서, 치료 항체는 아달리무맙, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 알렘투주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 바실릭시맙, 베바시주맙, 벨리무맙, 브렌툭시맙 베도틴, 카나키누맙, 세툭시맙, 다클리주맙, 다라투무맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 두르발루맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 겜투주맙, 골리무맙, 인플릭시맙, 이필리무맙, 라베투주맙, 나탈리주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 페르투주맙, 라무시루맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 우스테키누맙 및 베돌리주맙으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 면역 세포는 대상체로부터 단리된 자가 T 세포이다. 다른 실시양태에서, 면역 세포는 동종 T 세포이다. 특정 실시양태에서, 면역 세포는 내인성 T 세포 수용체가 억제되거나 제거된 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 면역 세포는 투여 전에 생체외에서 확장 및/또는 활성화된 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 암을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 인간 환자이다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 임의의 핵산을 면역 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 집단 내로 도입시키는 것을 포함하는, 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR)를 발현하는 면역 세포를 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 ACTR을 발현하는 면역 세포를 확인 또는 단리하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 핵산은 레트로바이러스 형질도입, 렌티바이러스 형질도입, DNA 전기천공 및 RNA 전기천공으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 면역 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포) 내로 도입된다.
한 측면에서, 본 개시내용은 (i) 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR) (예를 들어, CD28 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 ACTR)인 제1 폴리펩티드; 및 (ii) 공동-자극 신호를 도출하는 제2 폴리펩티드를 발현하는, 유전자 조작된 면역 세포를 제공한다. 일부 예에서, 제2 폴리펩티드는 공동-자극 수용체, 그의 리간드, 또는 공동-자극 수용체에 대한 결합 모이어티 (예를 들어, 단일-쇄 항체)를 포함할 수 있다. 예는 4-1BB, ICOS, OX40, CD27 또는 CD28, 그의 리간드, 또는 이러한 수용체에 대한 결합 모이어티를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, ACTR은 임의의 공동-자극 신호전달 도메인이 없다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 고형 종양 (예를 들어, 림프종)을 치료하기 위해 항-CD20 항체와 함께 ACTR-발현 면역 세포를 사용하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 방법은 (i) 그를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 1종 이상의 림프구고갈제 (예를 들어, 플루다라빈, 시클로포스파미드, 또는 그의 조합)를 투여하는 것; (ii) (i) 후에 대상체에게 항-CD20 항체 (예를 들어, 리툭시맙)를 투여하는 것; 및 (iii) (ii) 후에 대상체에게 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR)를 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 세포)를 투여하는 것을 포함한다. ACTR은 (a) CD16 (예를 들어, CD16V 이소형)의 Fc 결합 도메인; (b) CD28의 공동-자극 신호전달 도메인 및 (c) CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 임의로, ACTR은 (a)와 (b) 사이에 위치하는, CD28로부터의 힌지 도메인 및/또는 CD28로부터의 막횡단 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 한 예에서, ACTR은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함한다.
이 방법에 의해 치료될 대상체는 재발성 또는 불응성 CD20+ 림프종, 예를 들어, 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL), 외투 세포 림프종 (MCL), 원발성 종격 B 세포 림프종 (PMBCL), 등급 3b 여포성 림프종 (Gr3b-FL), 및 변형된 조직학 여포성 림프종 (TH-FL)을 갖는 인간 환자일 수 있다. 일부 예에서, 환자는 질환 제어를 위한 화학요법 하에 있었거나 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 대상체에게 40 x 106개 세포, 80 x 106개 세포, 150 x 106개 세포 또는 300 x 106개 세포의 용량으로 투여될 수 있는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 단계 (iii) 전 및 후에 항-CD20 항체를 투여받는다.
ACTR을 발현하는 면역 세포는 대상체로부터 면역 세포를 수집하고 ACTR을 코딩하는 핵산을 ACTR의 발현을 위한 면역 세포 내로 도입시킴으로써 제조될 수 있다. 일부 경우에, 수집 단계는 백혈구분리반출술을 포함한다.
추가로, 본 개시내용은 활성화된 T 세포 상에 또한 제시되는 표면 항원을 발현하는 세포를 수반하는 질환을 치료하기 위한 방법 및 키트를 제공한다. 예를 들어, 세포독성의 유도를 필요로 하는 대상체에게 (i) 활성화된 T 세포의 표면 상에 발현된 항원 (예를 들어, CD5, CD38, 또는 CD7)에 특이적인 항체; 및 (ii) 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR)를 발현하는 T 세포를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 세포독성을 유도하는 방법이 본원에 제공된다. ACTR은 (a) Fc 결합 도메인 (예를 들어, Fc 수용체 예컨대 CD16의 세포외 리간드 결합 도메인); (b) 막횡단 도메인 (예를 들어, CD28의 것); (c) 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인 (예를 들어, CD28 또는 4-1BB의 것); 및 (d) 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 세포질 신호전달 도메인 예컨대 CD3ζ의 것을 포함할 수 있다. (c) 또는 (d)는 키메라 수용체의 C-말단에 위치한다. 일부 예에서, ACTR은 (a)와 (b) 사이에 위치하는 힌지 도메인 (예를 들어, CD28로부터의 것)을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, ACTR은 (a) CD16의 Fc 결합 도메인; (b) CD28의 힌지 및 막횡단 도메인; (c) CD28의 공동-자극 신호전달 도메인 및 (d) CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 한 예에서, ACTR은 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, ACTR을 발현하는 T 세포는 시험관내에서 확장된다.
또한, 활성화된 T 세포 상에 발현된 항원 (예를 들어, CD5, CD38, 또는 CD7)에 특이적인 항체, 및 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR)를 발현하는 T 세포, 예를 들어, 본원에 기재된 것들을 포함하는 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, ACTR을 발현하는 T 세포는 시험관내에서 확장된다.
본 개시내용의 하나 이상의 실시양태에 대한 세부사항은 하기 설명에 제시된다. 본 개시내용의 다른 특색 또는 이점은 여러 실시양태의 상세한 설명으로부터, 및 또한 첨부된 청구범위로부터 명백해질 것이다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 개시내용의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함되며, 이는 이들 도면 중 하나 이상을 본원에 제시된 구체적 실시양태의 상세한 설명과 함께 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1은 CD20-특이적 항체 리툭시맙과 조합하여 ACTR 변이체를 발현하는 T-세포와 함께 인큐베이션된 CD20-발현 Raji 표적 세포의 세포독성을 보여주는 일련의 그래프를 포함한다. 세포독성의 용량-의존성 증가가 ACTR 변이체 (A) 서열식별번호: 7, (B) 서열식별번호: 8, (C) 서열식별번호: 9, (D) 서열식별번호: 13을 코딩하는 뉴클레오티드의 발현에서 관찰되었다.
도 2는 HER2-특이적 항체 트라스투주맙과 조합하여 ACTR 변이체를 발현하는 T-세포와 함께 인큐베이션된 HER2-발현 HCC1954 표적 세포의 세포독성을 보여주는 일련의 그래프를 포함한다. 세포독성의 용량-의존성 증가가 ACTR 변이체 (A) 서열식별번호: 7, (B) 서열식별번호: 8, (C) 서열식별번호: 9, (D) 서열식별번호: 13 및 (E) 서열식별번호: 38/서열식별번호: 39를 코딩하는 뉴클레오티드의 발현에서 관찰되었다.
도 3은 CD20-발현 Raji 표적 세포 및 CD20-특이적 항체 리툭시맙과 함께 인큐베이션된 ACTR 변이체를 발현하는 T-세포에 의한 IL-2 생산을 입증하는 일련의 그래프이다. IL-2 방출의 용량-의존성 증가가 ACTR 변이체 (A) 서열식별번호: 7, (B) 서열식별번호: 8, (C) 서열식별번호: 9, (D) 서열식별번호: 13 및 (E) 서열식별번호: 38/서열식별번호: 39를 코딩하는 뉴클레오티드의 발현에서 관찰되었다. 모의 세포는 IL-2의 증가를 보여주지 않았다 (D, E).
도 4는 HER2-발현 HCC1954 표적 세포 및 HER2-특이적 항체 트라스투주맙과 함께 인큐베이션된 ACTR 변이체를 발현하는 T-세포에 의한 IL-2 생산을 입증하는 일련의 그래프이다. IL-2 방출의 용량-의존성 증가가 ACTR 변이체 (A) 서열식별번호: 7, (B) 서열식별번호: 8, (C) 서열식별번호: 9, (D) 서열식별번호: 13 및 (E) 서열식별번호: 38/서열식별번호: 39를 코딩하는 뉴클레오티드의 발현에서 관찰되었다. 모의 세포는 IL-2의 증가를 보여주지 않았다 (D, E).
도 5는 ACTR 변이체를 발현하는 T-세포를 CD20-특이적 항체 리툭시맙의 존재 또는 부재 하에 CD20-발현 Raji 표적 세포와 함께 인큐베이션하고, 7일 동안 인큐베이션한 경우에, 출발 T 세포 카운트에 비한 CD3+ 세포의 수의 증가를 입증하는 일련의 그래프이다. 제0일의 세포 카운트에 비한 CD3+ 세포의 증가를 각각의 조건에 대해 플롯팅하였다. CD3+ 세포의 항체-의존성 증가가 ACTR 변이체 (A) 서열식별번호: 7, (B) 서열식별번호: 9, (C) 서열식별번호: 13 및 (D) 서열식별번호: 38/서열식별번호: 39를 코딩하는 뉴클레오티드의 발현에서 관찰되었다.
도 6은 ACTR 변이체 (서열식별번호: 7, 9, 13 및 38/서열식별번호: 39)를 발현하는 T 세포의 항종양 활성을 입증하는 일련의 그래프이다. 마우스에게 Raji 종양 세포를 접종하고, 5개의 처리군으로 분류하고, 비히클 대조군 (염수; 개방 원 및 흑색 실선), 리툭시맙 항-CD20 항체 단독 (100 μg/마우스 또는 5 mg/kg, IP, 제4, 11, 18, 25일; 폐쇄 사각형과 회색 실선), ACTR T 세포 변이체 단독 (1 x 107개 세포, IV, 제5, 12일; 개방 삼각형과 흑색 파선) 또는 단일 작용제와 동일한 용량 및 일수로의 리툭시맙 및 ACTR T 세포 변이체의 조합 (폐쇄 원과 흑색 실선), 또는 항-CD19 CAR 변이체를 발현하는 T 세포 (1 x 107개 세포, IV, 제5, 12일; 회색 다이아몬드와 회색 파선)로 처리하였다. 마우스를 후속적으로 IVIS 스펙트럼을 사용하여 종양 생물발광에 대해 매주 2회 영상화하였다. 종양 부담 (광자/초로 표시됨)이 시간 경과에 따라 플롯팅된다. ** p<0.01, **** p<0.0001 (리툭시맙 대조군과 비교, 2원 ANOVA + Sidac 다중 비교 시험)
도 7은 ACTR 변이체 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 13, 서열식별번호: 38/서열식별번호: 39 및 CD19 CAR을 코딩하는 핵산을 발현하는 T 세포와 함께 3-4일마다 리툭시맙-옵소닌화된 표적 세포를 사용한 반복 자극 후의 CD3-양성 T 세포의 증식을 입증하는 그래프이다.
도 8은 ACTR 변이체 서열식별번호: 7, 서열식별번호: 8, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 13 및 서열식별번호: 38/서열식별번호: 39, 및 CD19 CAR을 코딩하는 핵산을 발현하는 T 세포를 사용한 각각의 재자극 라운드 후의 리툭시맙 옵소닌화된 Raji 표적 세포에 대한 세포독성을 입증하는 일련의 그래프이다. 이전 시점에서의 표적 세포의 수에 비한 Raji 표적 세포 수의 배수 변화가 시간의 함수로서 플롯팅된다. 데이터는 선 그래프 (A) 및 막대 그래프 (B)로서 플롯팅된다. 1 미만의 값은 표적 세포 성장의 제어 및 세포독성을 나타낸다.
도 9는 ACTR 변이체 발현 T 세포가 3 - 4일마다 신선한 CD20+ Ramos 종양 세포 및 리툭시맙으로 챌린징된 반복 시뮬레이션 "스트레스 시험"에서 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 활성을 입증하는 그래프이다. 총 T 세포 및 표적 세포 카운트가 시간의 함수로서 플롯팅된다.
도 10은 복수의 세포주 및 적응증에 걸쳐 종양 표적 항체와 조합된 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포의 T 세포 활성 (IL-2 방출, 증식)을 입증하는 그래프이다.
도 11은 리툭시맙, CD20+ 종양 세포, 및 ACTR 변이체 서열식별번호: 9를 사용한 결합 검정의 결과를 입증하는 일련의 그래프이다. 도 11, 패널 A는 유동 세포측정법에 의해 결정시, CD20+ 림프종 종양 세포 Raji, Daudi, 및 RL에 대한 리툭시맙의 결합, 및 CD20-음성 세포주 K562에 대한 결합이 거의 내지 전혀 없는 것을 입증한다. 도 11, 패널 B는 유동 세포측정법에 의해 결정시, ACTR 변이체 서열식별번호: 9를 발현하는 T 세포에 대한 리툭시맙의 결합을 입증한다.
도 12는 ACTR 발현 T 세포 활성화에 대한 가설 모델을 도시하는 그래프이다. 저친화도 천연 T 세포 수용체 및 Fc 수용체와 유사하게, ACTR T 세포는 ACTR이 종양 세포의 표면에 결합된 다중 리툭시맙 분자와 결속되는 경우에 구조 결합력을 통해 활성화된다.
도 13은 (A, B) 증가하는 세포 용량의 모의 또는 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포 및 1 μg/mL 리툭시맙의 존재 하에 CD20+ 종양 세포를 사용한 세포독성 검정의 결과; 및 (C) 2:1 E:T (이펙터 대 표적 세포) 비에서 ACTR 발현 T 세포 및 증가하는 농도의 리툭시맙의 존재 하에 CD20+ 종양 세포를 사용한 세포독성의 결과를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 14는 (A, B) 2:1 E:T (이펙터 대 표적 세포) 비에서 CD20+ 종양 세포 및 증가하는 농도의 리툭시맙의 존재 하에 ACTR 변이체 서열식별번호: 9를 발현하는 T 세포에 대한 시토카인 방출 검정의 결과; 및 (C) 1:1 E:T (이펙터 대 표적 세포) 비에서 CD20+ 종양 세포 및 증가하는 농도의 리툭시맙의 존재 하에 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포의 증식 검정의 결과를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 15는 CD20+ Ramos 또는 CD20-음성 종양 세포 및 리툭시맙 또는 트라스투주맙 (항-HER2)의 존재 하에 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포의 (A) 세포독성, (B) IL-2 생산, 및 (C) T 세포 증식 검정의 결과를 입증하는 일련의 그래프이다. 항체는 4 μg/mL 최종 농도로 사용되었다. 이들 그래프는 강건한 ACTR T 세포 활성이 항체 (리툭시맙) 및 동족 항원을 발현하는 표적 (CD20-발현 Ramos 세포)의 존재 하에서만 관찰된다는 것을 입증한다.
도 16은 Raji 세포, 1 μg/mL 리툭시맙, 및 증가하는 농도 (0 mg/mL, 0.4 mg/mL, 1.2 mg/mL)의 인간 IgG (최대 3600배 리툭시맙)의 존재 하에 모의 T 세포 및 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포에 대한 시토카인 생산 검정의 결과를 입증하는 그래프이다.
도 17은 (A) 정상 면역 세포 및 다발성 골수종 세포주 NCI-H929에 대한 IL-6R의 유동 세포측정법 정량화; 및 (B) ACTR 변이체 서열식별번호: 9를 발현하는 T 세포 또는 모의 T 세포에 대한 토실리주맙 (항-IL-6R 항체)의 결합 검정의 결과를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 18은 IL-6R+ NCI-H929 세포 및 증가하는 농도의 토실리주맙 (0 - 25 μg/mL)과 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포 또는 모의 T 세포의 존재 하에 또는 T 세포의 부재 하에 (A) 세포독성 및 (B) 시토카인 방출 검정의 결과를 입증하는 일련의 그래프이다. NCI-H929 세포 및 항-CD38 양성 대조군 항체 (1.5 μg/mL)의 존재 하의 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포는 양성 대조군과 동일한 조건 하에 제시된다.
도 19는 상이한 용량의 리툭시맙과 조합된 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포, 항-CD19-CAR을 발현하는 T 세포, 리툭시맙 단독, ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포 단독, 또는 대조군 처리를 사용한 공격성 Raji 이종이식편을 갖는 마우스의 백분율 생존을 입증하는 그래프이다. 리툭시맙을 종양 접종 후 제4일 및 그후 매주, 총 4회 용량으로 투여하였다. 1 x 107개 용량의 T 세포 (ACTR 또는 CAR)를 종양 접종후 제5일에 투여하였다.
도 20은 1 또는 2회 용량의 리툭시맙과 조합된 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포, 리툭시맙 단독, ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포 단독, 또는 대조군 처리를 사용한 공격성 Raji 이종이식편을 갖는 마우스의 백분율 생존을 입증하는 그래프이다. 리툭시맙 (100 μg)을 종양 접종 후 제4일 및 그후 매주, 총 4회 용량으로 투여하였다. 1 또는 2회 용량의 1 x 107개 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포를 리툭시맙 투여 다음날인 제5일 또는 제5일 및 제12일에 제공하였다.
도 21은 ACTR 변이체 서열식별번호: 9를 발현하는 3명의 고유 비-호지킨 림프종 (NHL) 공여자 (NHL1, NHL2, 및 NHL3)로부터의 T 세포를 사용한 실험의 결과를 입증하는 일련의 그래프이다. 도 21, 패널 A는 3명의 고유 비-호지킨 림프종 (NHL) 공여자의 PBMC로부터 생성된 T 세포에서의 ACTR 변이체 서열식별번호: 9의 발현 수준을 입증한다. 1:1 E:T에서 CD20+ 종양 세포 및 증가하는 농도의 리툭시맙의 존재 하에 ACTR 변이체 서열식별번호: 9-발현 T 세포에 의한 시토카인 방출이 도 21, 패널 B에 제시된다. 1:1 E:T 비에서 CD20+ 종양 세포 및 증가하는 농도의 리툭시맙의 존재 하에 ACTR 변이체 서열식별번호: 9-발현 T 세포 증식은 도 21, 패널 C에 제시된다.
도 22는 예시적인 치료 항체로서의 리툭시맙과 조합된 ACTR 발현 T 세포를 사용한, 재발성 또는 불응성 CD20+ B 세포 림프종을 갖는 환자에 대한 예시적인 치료 스케줄을 도시하는 그래프이다.
도 23은 HER2-증폭된 세포주 (OE19, N87, 및 SKBR3) 및 비-HER2-증폭된 세포주 (MCF7 및 KATOIII) 상의 HER2 단백질 발현을 도시하는 그래프이다. HER2 발현 수준은 항-인간 HER2 항체로 염색한 후에 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 염색된 세포의 평균 형광 강도 (MFI)는 각각의 세포주에 대해 플롯팅된다.
도 24는 HER2-증폭된 및 비-HER2 증폭된 세포주 및 트라스투주맙 (항-HER2)의 존재 하에 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포에 대한 (A) 세포독성, (B) 시토카인 생산, 및 (C) T 세포 증식에 대한 검정의 결과를 입증하는 일련의 그래프이다. 항체는 5 μg/mL 최종 농도로 사용되었다.
도 25는 HER2-증폭된 및 비-HER2 증폭된 세포주의 존재 하에 트라스투주맙-기반 HER2-표적화 CAR-T 세포의 (A) 세포독성, (B) 시토카인 생산, 및 (C) T 세포 증식에 대한 검정의 결과를 입증하는 일련의 그래프이다.
도 26은 (A) 트라스투주맙 및 HER2-증폭된 및 비-HER2 증폭된 세포주의 존재 하의 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포의 증식; 및 (B) HER2-증폭된 및 비-HER2 증폭된 세포주의 존재 하에 HER2-표적화 CAR-T 세포의 증식에 대한 검정의 결과를 입증하는 일련의 그래프이다. 제0일의 총 T 세포 투입은 100,000개 세포였다. T 세포를 CD3에 대한 염색 후 유동 세포측정법에 의해 제6일에 정량화하였으며, 총 T 세포는 ACTR을 사용한 실험의 경우 각각의 표적 세포주에 대한 항체 농도의 함수로서 (A) 또는 CAR T 세포를 사용한 실험의 경우 표적 세포의 함수로서 (B) 플롯팅된다.
도 27은 대략 80 mm3 출발 부피의 피하 N87 위 이종이식된 종양을 갖는 암컷 NOD.Cg-Prkdcscid IL-2rgtm1Wjl/SzJ 마우스에서의 트라스투주맙과 조합된 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포에 대한 생체내 투여 요법을 도시하는 그래프이다. 트라스투주맙 (100 μg/마우스, IP)을 종양 접종 7일 후에 출발하여 4주 동안 매주 1회 투여하였다. ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포 또는 트라스투주맙-기반 HER2-표적화 CAR-T 세포 (1.5 x 107개 총 T 세포)를 종양 세포 접종 후 제8일에 출발하여 2주 동안 매주 1회 투여하였다. 대조군 마우스에게 비히클 단독을 동일한 스케줄 상에서 투여하였다.
도 28은 도 27에 제시된 실험의 결과를 도시하는 그래프이다. 평균 종양 부피는 처리군: 비히클, 트라스투주맙 단독, ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포 단독, ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포와 트라스투주맙, 및 항-HER2 CAR T 세포에 대한 시간의 함수로서 플롯팅된다.
도 29는 HER2-증폭된 종양 세포주 (N87) 세포; 비-HER-증폭된 종양 세포주 (MCF7) 세포; HER-2 음성 세포주 (Daudi) 세포; 및 다양한 정상 세포주 (유방 상피, 폐동맥 평활근, 심근세포, 기관지 상피 또는 신장 상피) 상의 HER2 발현을 도시하는 그래프이다. HER2 수준을 항-인간 HER2 항체로 염색한 후 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 염색된 세포의 평균 형광 강도 (MFI)가 제시된다.
도 30은 (A) 트라스투주맙 (5 μg/mL)과 조합된 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포; 또는 (B) 트라스투주맙-기반 HER2-표적화 CAR-T 세포를 사용한 세포독성 검정의 결과를 도시하는 일련의 그래프이다. 표적 세포는 N87 (HER2 증폭됨), MCF7 (HER2 낮음), Daudi (HER2 음성), 및 정상 세포주 (유방 상피, 폐동맥 평활근, 심근세포, 기관지 상피 또는 신장 상피)이다.
도 31은 트라스투주맙 (A) 및 항-HER2 CAR T 세포 (B) 및 정상 1차 세포 (유방 상피, 폐동맥 평활근, 심근세포, 기관지 상피 또는 신장 상피)의 존재 하에 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포의 시토카인 방출 프로파일 (IL-2)을 도시하는 일련의 그래프이다. HER2-증폭된 종양 세포주 (N87) 세포; 비-HER-증폭된 종양 세포주 (MCF7) 세포; 및 HER-2 음성 세포주 (Daudi) 세포가 대조군으로서 제시된다.
도 32는 트라스투주맙 (A) 및 항-HER2 CAR T 세포 (B) 및 정상 1차 세포 (유방 상피, 폐동맥 평활근, 심근세포, 기관지 상피 또는 신장 상피)의 존재 하에 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포의 시토카인 방출 프로파일 (IFN-γ)을 도시하는 일련의 그래프이다. HER2-증폭된 종양 세포주 (N87) 세포; 비-HER-증폭된 종양 세포주 (MCF7) 세포; 및 HER-2 음성 세포주 (Daudi) 세포가 대조군으로서 제시된다.
도 33은 유동 세포측정법에 의해 결정시, (A) 다발성 골수종 및 림프종 세포주 (CD38-음성 대조군 세포주로서 U266B1을 사용함); (B) RPMI-8226, KMS-20, 및 NCI-H929 다발성 골수종 세포주와 비교하여 다발성 골수종 환자로부터의 형질 세포; (C) 2명의 건강한 공여자로부터의 PBMC 하위세트; 및 (D) 5명의 건강한 공여자로부터의 적혈구의 표면 상의 CD38 발현을 도시하는 일련의 그래프이다. 평균 형광 강도는 평가된 각각의 세포 유형에 대해 플롯팅된다.
도 34는 유동 세포측정법에 의해 측정시 활성화된 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포 또는 Daudi 세포의 표면 상의 CD38 발현을 도시하는 일련의 그래프이다. 결과는 Daudi 표적 세포 또는 리툭시맙 (1 μg/mL)으로 자극된 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포에 대해 제시된다. 평균 형광 강도는 총 T 세포 (A) 및 ACTR-양성 T 세포 (B)에 대한 시간의 함수로서 플롯팅되고 Daudi 표적 세포의 평균 형광 강도와 비교된다.
도 35는 항-인간 CD3 및 항-인간 CD28 활성화 항체로 활성화되고 100 U/mL IL-2의 존재 하에 10일 동안 확장된 T 세포의 배수 확장 (A), 생존율 (B), 세포 크기 (C), 및 CD38 발현 (D)을 도시하는 일련의 그래프이다. ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포, 및 CD38-표적화 THB7 CAR T 세포를 제3일에 ACTR 또는 CAR을 코딩하는 바이러스로 적절하게 형질도입하였고; 모의 T 세포는 형질도입하지 않았다.
도 36은 다라투무맙의 존재 하에 (A) NCI-H929, (B) MM.1S, (C) RPMI-8226, 또는 (D) Daudi 표적 세포와 함께 배양된 모의 또는 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포에 대해 관찰된 세포독성을 도시하는 일련의 그래프이다. 퍼센트 세포독성은 항체 농도의 함수로서 플롯팅된다.
도 37은 다라투무맙-옵소닌화된 NCI-H929, MM.1S, RPMI-8226, 및 Daudi 표적 세포의 존재 하에 인큐베이션된 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포로부터의 IL-2 (A) 및 IFN-γ (B) 생산을 도시하는 일련의 그래프이다. 모의 T 세포에서의 시토카인 생산 (플롯팅되지 않음)은 표준 곡선의 선형 범위 미만이었다.
도 38은 다라투무맙-옵소닌화된 NCI-H929, MM.1S, RPMI-8226, 및 Daudi 표적 세포의 존재 하에 모의 또는 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포에 대한 증식 검정의 결과를 도시하는 일련의 그래프이다. 총 T 세포 카운트는 패널 A 및 B에서 다라투무맙 항체 농도의 함수로서 플롯팅된다. 도 38, 패널 C에서, CD16+ 세포의 빈도 (%)는 총 CD3+ T 세포 게이트 내에서 계산되었고, 다라투무맙 항체 농도의 함수로서 플롯팅된다.
도 39는 공여자-매칭된 PBMC 및 RPMI-8226 다발성 골수종 세포 (MM 세포) 및 1 μg/mL 또는 10 μg/mL 다라투무맙과 함께 인큐베이션된 모의 (A) 또는 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 (B) T 세포에 대한 항체-특이적 세포독성 검정의 결과를 도시하는 일련의 그래프이다. 반응을 상이한 PBMC 하위유형에 대한 세포독성 효과를 단리하기 위해 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 퍼센트 세포독성은 세포 유형의 함수로서 플롯팅된다.
도 40은 자가 PBMC의 존재 하에 또는 자가 PBMC 및 RPMI-8226 표적 세포 및 증가하는 농도의 다라투무맙의 존재 하에 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포에 대한 IFN-γ (A) 및 IL-2 (B) 방출 검정의 결과를 도시하는 일련의 그래프이다.
도 41은 유동 세포측정법에 의한 적혈구 상의 CD38 발현의 평가 (A); 유동 세포측정법에 의한 적혈구에 대한 다라투무맙 결합의 평가 (B); 및 ACTR 및 적혈구 공동-배양 검정을 사용한 다양한 농도의 다라투무맙의 존재 하의 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포 매개 용혈의 평가를 도시하는 일련의 그래프이다.
도 42는 트라스투주맙 및 Her2-발현 HCC1954 또는 SKBR3 표적 세포의 존재 하에, ACTR 변이체 서열식별번호: 2, 9, 13, 19, 20, 21, 22 및 27을 발현하는 2명의 상이한 공여자로부터의 T 세포로부터의 ACTR 변이체 서열식별번호: 2에 의한 것에 비한 평균 IL-2 생산을 도시하는 그래프이다.
도 43은 증가하는 농도의 HER2-표적화 항체 트라스투주맙 및 HER2-발현 표적 BT20 및 SKBR3의 존재 하에 모의 T 세포 및 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 및 서열식별번호: 26을 발현하는 T 세포에 의한 IL-2 (A) 및 IFN-γ (B) 방출을 도시하는 일련의 그래프이다.
도 44는 항-인간 CD3 및 항-인간 CD28 활성화 항체로 활성화되고 100 U/mL IL-2의 존재 하에 10일 동안 확장된 T 세포에 대한 시간의 함수로서의 배수 확장 (A), 세포 크기 (B), 및 생존율 (C)을 도시하는 일련의 그래프이다. ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포, 및 CD38-표적화 THB7 CAR 및 056 CAR T 세포를 제3일에 ACTR 또는 CAR을 코딩하는 바이러스로 적절하게 형질도입하였고; 모의 T 세포는 형질도입하지 않았다.
도 45는 유동 세포측정법에 의해 측정시, 항-인간 CD3 및 항-인간 CD28 활성화 항체로 활성화되고 100 U/mL IL-2의 존재 하에 10일 동안 확장된 T 세포 상의 제6, 8, 및 10일의 CD38 발현을 도시하는 일련의 그래프이다. ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포, 및 CD38-표적화 THB7 CAR 및 056 CAR T 세포를 제3일에 ACTR 또는 CAR을 코딩하는 바이러스로 적절하게 형질도입하였고; 모의 T 세포는 형질도입하지 않았다.
도 46은 다라투무맙의 부재 또는 존재 하에 (A) Daudi 또는 (B) NCI-H929 표적 세포와 함께 배양된 모의 T 세포, ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포, THB7 CAR T 세포, 및 056 CAR T 세포에 대해 관찰된 세포독성을 도시하는 일련의 그래프이다. 퍼센트 세포독성은 이펙터:표적 (E:T) 비의 함수로서 플롯팅된다.
도 47은 NCI-H929, RPMI-8226, 또는 Daudi 표적 세포와 함께 배양된, 다라투무맙의 존재 하의 모의 T 세포, 다라투무맙의 존재 하의 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 발현 T 세포, THB7 CAR T 세포, 및 056 CAR T 세포에 대한 IFN-γ (A) 및 IL-2 (B) 생산을 도시하는 일련의 그래프이다.
항체-기반 면역요법은 많은 유형의 암을 포함한 매우 다양한 질환을 치료하는 데 사용된다. 이러한 요법은 종종 정상 세포 (예를 들어, 비-암 세포)에 비해 제거하고자 하는 세포 (예를 들어, 표적 세포 예컨대 암 세포) 상에 차등 발현되는 세포 표면 분자의 인식에 따라 달라진다 (Weiner et al. Cell (2012) 148(6): 1081-1084). 여러 항체-기반 면역요법은 시험관내에서 표적 세포 (예를 들어, 암 세포)의 항체 의존성 세포-매개 세포독성을 촉진시키는 것으로 밝혀졌으며, 일부의 경우, 일반적으로 이는 또한 생체내 작용 메카니즘인 것으로 여겨진다. ADCC는 면역계의 이펙터 세포, 예컨대, 자연 킬러 (NK) 세포, T 세포, 단핵구 세포, 대식세포, 또는 호산구가 특이적 항체에 의해 인식된 표적 세포 (예를 들어, 암 세포)를 활발하게 용해시키는 세포-매개 선천성 면역 메카니즘이다.
본 개시내용은 또한 적어도 부분적으로 CD16A 세포외 도메인 및 CD28 공동-자극 도메인을 포함하는 ACTR 폴리펩티드 또는 CD16A 세포외 도메인 및 단축된 힌지 도메인을 포함하거나 힌지 도메인을 포함하지 않는 ACTR 폴리펩티드가 우수한 생물활성을 나타내었다는 예상외의 발견에 기초한다. 추가로, 본 개시내용은 또한 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 기술이 동족살해 효과로 인해 활성화된 T 세포 상에 제시되는 항원을 표적화하는 통상적인 CAR-T 세포와 연관된 시험관내 확장/제조 문제를 극복하였다는 발견에 기초한다. 이러한 항원에 특이적인 항체와 조합하여, ACTR-T 세포는 활성화된 T 세포 상에 또한 제시되는 표면 항원, 예컨대 CD5, CD38, 또는 CD7을 발현하는 세포와 연관된 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 개선된 ACTR 폴리펩티드, 이러한 것을 발현하는 유전자 조작된 면역 세포, 및 치료 유효량의 치료 항체 및 치료 유효량의 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 폴리펩티드를 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 림프구 또는 NK 림프구)를 포함하는 조합 요법을 사용하여 대상체에서 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 증진시키는 방법을 제공한다. 본 개시내용은 또한 ACTR 폴리펩티드 및 공동-자극 신호를 도출할 수 있는 또 다른 외인성 폴리펩티드를 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 림프구 및/또는 NK 세포)를 제공한다.
본원에 사용된 바와 같이, ACTR 폴리펩티드 또는 구축물은 숙주 세포의 표면 상에 발현될 수 있는 비-자연 발생 분자를 지칭하고, Fc 부분 및 ACTR 폴리펩티드를 발현하는 면역 세포의 이펙터 기능을 촉발하기 위한 1개 이상의 세포질 신호전달 도메인을 함유하는 표적 분자에 결합할 수 있는 세포외 도메인 (예를 들어, CD16A 세포외 도메인)을 포함하며, 여기서 ACTR 폴리펩티드의 적어도 2개의 도메인은 상이한 분자로부터 유래될 수 있다. ACTR 폴리펩티드는 Fc 부분, 막횡단 도메인, 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 함유하는 표적 분자에 결합할 수 있는 CD16A 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 공동-자극 신호전달 도메인 중 적어도 1개는 CD28 공동-자극 도메인일 수 있다. ACTR 폴리펩티드는 임의의 비-CD16A 수용체로부터의 힌지 도메인이 없을 수 있거나 또는 막횡단 도메인이 CD8 막횡단 도메인인 경우에 1개 초과의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
기재된 방법에서 사용하기 위한 항체는 표적 세포 (예를 들어, 암 세포)의 표면 상의 단백질에 결합할 수 있다. 이러한 Fc-함유 분자에 결합할 수 있는 수용체, 예를 들어, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드 분자를 발현하는 면역 세포는 표적 세포-결합된 항체를 인식하고, 이러한 수용체/항체 결속은 면역 세포가 이펙터 기능, 예컨대 세포독성 과립의 방출 또는 세포-사멸-유도 분자의 발현을 수행하도록 자극하여, 표적 세포의 세포 독성을 증진시킨다.
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드, 세포 및 방법은 다수의 이점을 부여할 것이다. 예를 들어, Fc에 결합하는 CD16A 세포외 도메인을 통해, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드는 특이적 표적 항원 (예를 들어, 암 항원)에 직접적으로 결합하기 보다는 표적 세포에 결합된 항체의 Fc 부분에 결합할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드를 발현하는 면역 세포는 치료 항체에 의해 결합된 임의의 유형의 세포의 세포 사멸을 유도/증진시킬 수 있을 것이다. 추가로, 개선된 ACTR 구축물은 본원에 기재된 바와 같은 우수한 생물활성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이러한 개선된 ACTR 구축물을 발현하는 면역 세포 및 치료 항체를 수반하는 조합 요법은 표적 질환 세포, 예컨대 암 세포에 대해 우수한 치료 효과를 발휘할 것으로 예상될 것이다.
I. ACTR 구축물
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물 (ACTR 폴리펩티드로도 불림)은 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 대한 결합 친화도 및 특이성을 갖는 세포외 도메인 ("Fc 결합제" 또는 "Fc 결합 도메인"), 막횡단 도메인, 및 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드는 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다. ACTR 폴리펩티드는 숙주 세포 상에 발현된 경우에 세포외 리간드-결합 도메인이 표적 분자 및 ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인에 대한 결합을 위해 세포외로 위치하도록 구성된다. 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인이 활성화 및/또는 이펙터 신호전달을 촉발하기 위해 세포질에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, Fc 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, Fc 결합 도메인, 막횡단 도메인, 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인, 및 ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, Fc 결합 도메인, 막횡단 도메인, ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인, 및 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물과 함께 사용하기 위한 예시적인 ACTR 구축물은 예를 들어 본 발명의 설명 및 도면에서 찾아볼 수 있거나, 또는 이러한 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 PCT 특허 공개 번호 WO2016040441A1에서 찾아볼 수 있다.
본원에 기재된 개선된 ACTR 폴리펩티드는 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 대한 결합 친화도 및 특이성을 갖는 CD16A 세포외 도메인 ("Fc 결합제" 또는 "Fc 결합 도메인"), 막횡단 도메인, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인 (그 중 적어도 1개는 CD28 공동-자극 신호전달 도메인임)을 추가로 포함할 수 있다. ACTR 폴리펩티드는 숙주 세포 상에 발현된 경우에 세포외 리간드-결합 도메인이 표적 분자 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인에 대한 결합을 위해 세포외로 위치하도록 구성된다. 공동-자극 신호전달 도메인은 활성화 및/또는 이펙터 신호전달을 촉발하기 위해 세포질에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로, Fc 결합 도메인 예컨대 CD16A 세포외 도메인, 막횡단 도메인, 임의적인 1개 이상의 공동-자극 도메인 (예를 들어, CD28 공동-자극 도메인, 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인, OX40 공동-자극 신호전달 도메인, CD27 공동-자극 신호전달 도메인 또는 ICOS 공동-자극 신호전달 도메인), 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 어구 "단백질 X 막횡단 도메인" (예를 들어, CD8 막횡단 도메인)은 주어진 단백질, 즉 막에서 열역학적으로 안정한 막횡단-관통 단백질 X의 임의의 부분을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 어구 "단백질 X 세포질 신호전달 도메인", 예를 들어, CD3ζ 세포질 신호전달 도메인은 세포 또는 소기관의 내부와 상호작용하고 신호를 전달할 수 있는 단백질 (단백질 X)의 임의의 부분을 지칭한다.
본 명세서에 사용된 어구 "단백질 X 공동-자극 신호전달 도메인", 예를 들어, CD28 공동-자극 신호전달 도메인은 면역 세포 (예컨대 T 세포) 내로 공동-자극 신호를 전달할 수 있는 주어진 공동-자극 단백질 (단백질 X, 예컨대 CD28, 4-1BB, OX40, CD27, 또는 ICOS)의 부분을 지칭한다.
일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드의 막횡단 도메인이 CD8 막횡단 도메인인 경우에, ACTR 폴리펩티드는 임의의 비-CD16A 수용체로부터의 힌지 도메인이 없을 수 있거나 또는 단축된 힌지 도메인을 함유할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, ACTR 폴리펩티드는 1개 초과의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드는 Fc 결합 도메인의 C-말단 및 막횡단 도메인의 N-말단에 위치할 수 있는 힌지 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드는 비-CD16A 힌지 도메인을 갖지 않을 수 있거나, 또는 힌지 도메인을 전혀 함유하지 않을 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드는 단축된 힌지 도메인 (예를 들어, 최대 25개의 아미노산 잔기 포함)을 가질 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드는 서로 연결되거나 또는 ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인에 의해 분리될 수 있는, 2개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 함유할 수 있다. ACTR 폴리펩티드 내의 세포외 Fc 결합제, 막횡단 도메인, 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인(들), 및 ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인은 직접적으로, 또는 펩티드 링커를 통해 서로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것은 N-말단에서 신호 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.
A. Fc 결합 도메인
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드는 Fc 결합 도메인인, 즉, 적합한 포유동물 (예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 염소, 양, 또는 원숭이)의 이뮤노글로불린 (예를 들어 IgG, IgA, IgM, 또는 IgE)의 Fc 부분에 결합할 수 있는 세포외 도메인을 포함한다. 적합한 Fc 결합 도메인은 자연 발생 단백질 예컨대 포유동물 Fc 수용체 또는 특정 박테리아 단백질 (예를 들어, 단백질 A, 단백질 G)로부터 유래될 수 있다. 추가적으로, Fc 결합 도메인은 높은 친화도 및 특이성으로 본원에 기재된 항체 중 임의의 것의 Fc 부분에 특이적으로 결합하도록 조작된 합성 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 이러한 Fc 결합 도메인은 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 예는 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 도메인 항체, 또는 나노바디를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 대안적으로, Fc 결합 도메인은 Fc 부분에 특이적으로 결합하는 합성 펩티드, 예컨대, 쿠니츠 도메인, 소형 모듈 면역제약 (SMIP), 애드넥틴, 아비머, 아피바디, DARPin, 또는 안티칼린일 수 있고, 이는 Fc에 대한 결합 활성에 대해 펩티드 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, Fc 결합 도메인은 포유동물 Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 본원에 사용된 "Fc 수용체"는 많은 면역 세포 (B 세포, 수지상 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호중구, 비만 세포, 및 호산구 포함)의 표면 상에 발현되고, 항체의 Fc 도메인에 대한 결합 특이성을 나타내는 세포 표면 결합 수용체이다. Fc 수용체는 전형적으로 항체의 Fc (단편 결정화가능) 부분에 대해 결합 특이성을 갖는 적어도 2개의 이뮤노글로불린 (Ig)-유사 도메인으로 구성된다. 일부 경우에, 항체의 Fc 부분에 대한 Fc 수용체의 결합은 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 효과를 촉발시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 폴리펩티드를 구축하는 데 사용되는 Fc 수용체는 자연 발생 다형성 변이체 (예를 들어, CD16 V158 변이체)일 수 있으며, 이는 야생형 대응물과 비교하여 증가 또는 감소된, Fc에 대한 친화도를 가질 수 있다. 대안적으로, Fc 수용체는 Ig 분자의 Fc 부분에 대한 결합 친화도를 변경시키는 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 돌연변이를 포함한 최대 10개의 아미노산 잔기 치환)를 보유하는, 야생형 대응물의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 경우에, 돌연변이는 Fc 수용체의 글리코실화 패턴을 변경시키고 그에 따라 Fc에 대한 결합 친화도를 변경시킬 수 있다.
하기 표는 본원에 기재된 방법 또는 구축물 중 임의의 것에 사용될 수 있는 Fc 수용체 세포외 도메인에서의 다수의 예시적인 다형성을 열거한다 (예를 들어, 문헌 [Kim et al., J. Mol. Evol. 53:1-9, 2001] 참조):
표 1. Fc 수용체에서의 예시적인 다형성
Figure pct00001
Fc 수용체는 그가 결합할 수 있는 항체의 이소형에 기초하여 분류된다. 예를 들어, Fc-감마 수용체 (FcγR)는 일반적으로 IgG 항체, 예컨대, 그의 하나 이상의 하위유형 (즉, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)에 결합하고; Fc-알파 수용체 (FcαR)는 일반적으로 IgA 항체에 결합하고; Fc-엡실론 수용체 (FcεR)는 일반적으로 IgE 항체에 결합한다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 Fc-감마 수용체, Fc-알파 수용체, 또는 Fc-엡실론 수용체이다. Fc-감마 수용체의 예는 비제한적으로, CD64A, CD64B, CD64C, CD32A, CD32B, CD16A, 및 CD16B를 포함한다. Fc-알파 수용체의 예는 FcαR1/CD89이다. Fc-엡실론 수용체의 예는 비제한적으로, FcεRI 및 FcεRII/CD23을 포함한다. 하기 표는 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드를 구축하는 데 사용하기 위한 예시적인 Fc 수용체, 및 상응하는 Fc 도메인에 대한 그의 결합 활성이 열거된다:
표 2. 예시적인 Fc 수용체
Figure pct00002
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드에 사용하기 위한 Fc 수용체의 리간드 결합 도메인의 선택은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 이는 Fc 수용체의 결합이 요구되는 항체의 이소형 및 결합 상호작용의 목적하는 친화도와 같은 인자에 의존할 수 있다.
일부 예에서, Fc 결합 도메인은 Fc에 대한 친화도를 조정할 수 있는 자연 발생 다형성을 혼입시킬 수 있는, CD16의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 일부 예에서, Fc 결합 도메인은 위치 158에서 다형성 (예를 들어, 발린 또는 페닐알라닌)을 혼입시키는 CD16의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 일부 실시양태에서, Fc 결합 도메인은 그의 글리코실화 상태 및 Fc에 대한 그의 친화도를 변경시키는 조건 하에 제조된다.
인간 CD16A F158 및 CD16A V158 변이체의 아미노산 서열이 하기에 제공되며, F158 및 V158 잔기는 볼드체 및 밑줄표시로 강조되어 있다 (신호 펩티드는 이탤릭체표시됨):
Figure pct00003
일부 실시양태에서, Fc 결합 도메인은 ACTR 폴리펩티드가 IgG 항체의 하위세트에 특이적이도록 하는 변형을 혼입시키는 CD16의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 예를 들어, IgG 하위유형 (예를 들어, IgG1)에 대한 친화도를 증가 또는 감소시키는 돌연변이가 혼입될 수 있다.
본원에 기재된 Fc 결합 도메인 중 임의의 것은 치료 항체의 Fc 부분에 대한 적합한 결합 친화도를 가질 수 있다. 본원에 사용된 "결합 친화도"는 겉보기 회합 상수 또는 KA를 지칭한다. KA는 해리 상수인 KD의 역수이다. 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드의 Fc 수용체 도메인의 세포외 리간드-결합 도메인은 항체의 Fc 부분에 대해 적어도 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 M 또는 그 미만의 결합 친화도 Kd를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 결합 도메인은 또 다른 항체, 항체의 이소형(들), 또는 그의 하위유형(들)에 대한 Fc 결합 도메인의 결합 친화도와 비교하여 항체, 항체의 이소형(들), 또는 그의 하위유형(들)에 대해 높은 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인은 또 다른 항체, 항체의 이소형(들), 또는 그의 하위유형(들)에 대한 Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 결합과 비교하여 항체, 항체의 이소형(들), 또는 그의 하위유형(들)에 대해 특이성을 갖는다.
관련 기술분야에 공지된 바와 같은 다른 Fc 결합 도메인은 또한 예를 들어 WO2015058018A1에 기재된 것들을 포함한 본원에 기재된 ACTR 구축물에 사용될 수 있으며, 그의 관련 개시내용은 본원에 언급된 목적 및 대상을 위해 참조로 포함된다.
B. 막횡단 도메인
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드의 막횡단 도메인은 관련 기술분야에 공지된 임의의 형태일 수 있다. 본원에 사용된 "막횡단 도메인"은 세포 막, 바람직하게는 진핵 세포 막에서 열역학적으로 안정한 임의의 단백질 구조를 지칭한다. 본원에 사용된 ACTR 폴리펩티드에 사용하기에 상용성인 막횡단 도메인은 자연 발생 단백질로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 이는 합성 비-자연 발생 단백질 절편, 예를 들어, 세포 막에서 열역학적으로 안정한 소수성 단백질 절편일 수 있다.
막횡단 도메인은 막횡단 도메인의 3차원 구조에 기초하여 분류된다. 예를 들어, 막횡단 도메인은 알파 나선, 1개 초과의 알파 나선의 복합체, 베타-배럴, 또는 세포의 인지질 이중층을 관통할 수 있는 임의의 다른 안정한 구조를 형성할 수 있다. 게다가, 막횡단 도메인은 또한 또는 대안적으로 막횡단 도메인이 막을 가로질러 횡단하는 통과 횟수, 및 단백질의 배향을 포함한, 막횡단 도메인 위상에 기초하여 분류될 수 있다. 예를 들어, 단일-통과 막 단백질은 세포 막을 1회 가로질러 횡단하고, 다중-통과 막 단백질은 세포 막을 적어도 2회 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7회 또는 그 초과) 가로질러 횡단한다.
막 단백질은 세포의 내부 및 외부에 대해 상대적인 그의 말단 및 막-통과 절편(들)의 위상에 따라 제I형, 제II형 또는 제III형으로 정의될 수 있다. 제I형 막 단백질은 단일 막-관통 영역을 가지며, 단백질의 N-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측에 존재하고, 단백질의 C-말단이 세포질 측에 존재하도록 배향되어 있다. 제II형 막 단백질 또한 단일 막-관통 영역을 갖지만, 단백질의 C-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측에 존재하고, 단백질의 N-말단이 세포질 측에 존재하도록 배향되어 있다. 제III형 막 단백질은 다중 막-관통 절편을 가지며, 이는 막횡단 절편의 수 및 N- 및 C-말단의 위치에 기초하여 추가로 세분될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드의 막횡단 도메인은 제I형 단일-통과 막 단백질로부터 유래된다. 단일-통과 막 단백질은 CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD27, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD37, CD80, CD86, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS, 및 FGFR2B를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 하기로부터 선택되는 막 단백질로부터의 것이다: CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, CD32, CD64, VEGFR2, FAS, 및 FGFR2B. 일부 예에서, 막횡단 도메인은 CD8의 것이다 (예를 들어, 막횡단 도메인은 CD8α의 것임). 일부 예에서, 막횡단 도메인은 4-1BB/CD137의 것이다. 다른 예에서, 막횡단 도메인은 CD28의 것이다. 그러한 경우에, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드는 임의의 비-CD16A 수용체로부터의 힌지 도메인이 없을 수 있다. 일부 경우에, 이러한 ACTR 폴리펩티드는 임의의 힌지 도메인이 없을 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 이러한 ACTR 폴리펩티드는 본원에 기재된 바와 같은 2개 이상의 공동-자극 영역을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 막횡단 도메인은 CD34의 것이다. 또 다른 예에서, 막횡단 도메인은 인간 CD8α로부터 유래되지 않는다. 일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드의 막횡단 도메인은 단일-통과 알파 나선이다.
다중-통과 막 단백질로부터의 막횡단 도메인이 또한 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드에 사용하기에 상용성일 수 있다. 다중-통과 막 단백질은 복합 알파 나선 구조 (적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 초과의 알파 나선) 또는 베타 시트 구조를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 다중-통과 막 단백질의 N-말단 및 C-말단은 지질 이중층의 반대측에 존재하고, 예를 들어, 단백질의 N-말단은 지질 이중층의 세포질 측에 존재하고, 단백질의 C-말단은 세포외 측에 존재한다. 다중-통과 막 단백질로부터의 1회 또는 다수회에 걸친 나선 통과가 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드를 구축하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드에 사용하기 위한 막횡단 도메인은 또한 합성, 비-자연 발생 단백질 절편의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 합성, 비-자연 발생 알파 나선 또는 베타 시트이다. 일부 실시양태에서, 단백질 절편은 적어도 대략 20개의 아미노산, 예를 들어, 적어도 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개, 또는 그 초과의 아미노산이다. 합성 막횡단 도메인의 예는 관련 기술분야에, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,052,906 B1 및 PCT 공개 번호 WO 2000/032776 A2에 공지되어 있으며, 그의 관련 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 시스테인 잔기를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 1개의 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 2개의 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 2개 초과의 시스테인 잔기 (예를 들어, 3, 4, 5개 또는 그 초과)를 포함한다.
막횡단 도메인은 막횡단 영역, 및 막횡단 도메인의 C-말단 측에 위치하는 세포질 영역을 포함할 수 있다. 막횡단 도메인의 세포질 영역은 3개 이상의 아미노산을 포함할 수 있고, 일부 실시양태에서, 이는 지질 이중층에 막횡단 도메인을 배향시키는 데 도움을 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 시스테인 잔기는 막횡단 도메인의 막횡단 영역에 존재한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 시스테인 잔기는 막횡단 도메인의 세포질 영역에 존재한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인의 세포질 영역은 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인의 세포질 영역은 아미노산 아르기닌, 세린, 및 리신을 포함한다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인의 막횡단 영역은 소수성 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 영역은 주로 소수성 아미노산 잔기, 예컨대, 알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 또는 발린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 영역은 소수성이다. 일부 실시양태에서, 막횡단 영역은 폴리-류신-알라닌 서열을 포함한다.
단백질 또는 단백질 절편의 소수친수성, 또는 소수성 또는 친수성 특징은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 카이트(Kyte) 및 둘리틀(Doolittle) 소수친수성 분석에 의해 평가될 수 있다.
C. 공동-자극 신호전달 도메인
많은 면역 세포는 세포 증식, 분화 및 생존을 촉진시킬 뿐만 아니라 세포의 이펙터 기능을 활성화시키기 위해, 항원-특이적 신호의 자극에 더하여 공동-자극을 필요로 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드는 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 CD28 공동-자극 신호전달 도메인을 함유할 수 있다. 본원에 사용된 용어 "공동-자극 신호전달 도메인"은 세포 내의 신호 전달을 매개하여 면역 반응 예컨대 이펙터 기능을 유도하는 공동-자극 신호전달 단백질의 적어도 단편을 지칭한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 면역 세포 예컨대 T 세포의 활성화는 종종 2종의 신호를 필요로 한다: (1) T 세포 수용체 (TCR) 및 항원 제시 세포에 의해 제시된 항원 펩티드/MHC 복합체의 결속에 의해 촉발되는 항원 특이적 신호 (전형적으로 TCR 복합체의 성분으로서의 CD3ζ에 의해 유도됨); 및 (ii) 공동-자극 수용체와 그의 리간드 사이의 상호작용에 의해 촉발되는 공동-자극 신호. 공동-자극 수용체는 TCR-촉발된 신호전달에 더하여 공동-자극 신호를 전달하고, 면역 세포, 예컨대 T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구에 의해 매개되는 반응을 조정한다.
숙주 세포 (예를 들어, 면역 세포)에서의 공동-자극 신호전달 도메인의 활성화는 세포가 시토카인의 생산 및 분비, 식세포 특성, 증식, 분화, 생존 및/또는 세포독성을 증가 또는 감소시키도록 유도할 수 있다. 임의의 공동-자극 분자의 공동-자극 신호전달 도메인은 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드에 사용하기에 상용성일 수 있다. 공동-자극 신호전달 도메인의 유형(들)은 ACTR 폴리펩티드가 발현될 면역 세포의 유형 (예를 들어, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구, 또는 호산구) 및 목적하는 면역 이펙터 기능 (예를 들어, ADCC)과 같은 인자에 기초하여 선택된다. ACTR 폴리펩티드에 사용하기 위한 공동-자극 신호전달 도메인의 예는 공동-자극 단백질의 세포질 신호전달 도메인일 수 있고, 이는 비제한적으로 B7/CD28 패밀리의 구성원 (예를 들어, B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD-1, PD-L2/B7-DC, 및 PDCD6); TNF 슈퍼패밀리의 구성원 (예를 들어, 4-1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB 리간드/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 리간드/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 리간드/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 리간드/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR 리간드/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, 림포톡신-알파/TNF-베타, OX40/TNFRSF4, OX40 리간드/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-알파, 및 TNF RII/TNFRSF1B); SLAM 패밀리의 구성원 (예를 들어, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6, 및 SLAM/CD150); 및 임의의 다른 공동-자극 분자, 예컨대, CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA 부류 I, HLA-DR, 이카로스(Ikaros), 인테그린 알파 4/CD49d, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, 덱틴(Dectin)-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, 림프구 기능 연관 항원-1 (LFA-1), 및 NKG2C를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, ICOS, CD27, GITR, HVEM, TIM1, LFA1(CD11a) 또는 CD2, 또는 그의 임의의 변이체의 것이다.
본원에 기재된 공동-자극 신호전달 도메인 중 임의의 것의 변이체가 또한 본 개시내용의 범주 내에 있고, 이로써, 공동-자극 신호전달 도메인은 면역 세포의 면역 반응을 조정할 수 있다. 일부 실시양태에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 야생형 대응물과 비교하여 최대 10개의 아미노산 잔기 돌연변이 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 8개) 예컨대 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 포함한다. 1개 이상의 아미노산 변이 (예를 들어, 아미노산 치환, 결실 또는 부가)를 포함하는 이러한 공동-자극 신호전달 도메인은 변이체로 지칭될 수 있다.
공동-자극 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공동-자극 신호전달 도메인에 비해 신호 전달을 증가시키고, 면역 반응의 자극을 증진시킬 수 있다. 공동-자극 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공동-자극 신호전달 도메인에 비해 신호 전달을 감소시키고, 면역 반응의 자극을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 CD28 아미노산 서열의 잔기 186 및 187의 돌연변이는 ACTR 폴리펩티드의 공동-자극 도메인에 의한 공동-자극 활성, 및 면역 반응 유도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 CD28LL→GG 변이체로 지칭되는, CD28 공동-자극 도메인의 위치 186 및 187 각각에서의 리신의 글리신 잔기로의 치환이다. 공동-자극 신호전달 도메인의 공동-자극 활성을 증진 또는 감소시킬 수 있는, 상기 도메인에서 이루어질 수 있는 추가의 돌연변이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, 또는 CD28LL→GG 변이체의 것이다.
일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 단일 공동-자극 도메인 예컨대, 예를 들어, CD27 공동-자극 도메인, CD28 공동-자극 도메인, 4-1BB 공동-자극 도메인, ICOS 공동-자극 도메인 또는 OX40 공동-자극 도메인을 함유할 수 있다.
일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 1개 초과의 공동-자극 신호전달 도메인 (예를 들어, 2, 3개 또는 그 초과)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 동일한 공동-자극 신호전달 도메인 중 2개 이상, 예를 들어, CD28의 공동-자극 신호전달 도메인의 2 카피를 포함한다. 일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 상이한 공동-자극 단백질로부터의 2개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인, 예컨대, 본원에 기재된 임의의 2개 이상의 공동-자극 단백질을 포함한다. 공동-자극 신호전달 도메인의 유형(들)의 선택은 ACTR 폴리펩티드와 함께 사용될 숙주 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 유형 및 목적하는 면역 이펙터 기능과 같은 인자에 기초할 수 있다. 일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 2개의 공동-자극 신호전달 도메인, 예를 들어, CD28의 공동-자극 신호전달 도메인의 2 카피를 포함한다. 일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 상이한 공동-자극 수용체로부터의 2개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인, 예컨대 본원에 기재된 임의의 2개 이상의 공동-자극 수용체, 예를 들어, CD28 및 4-1BB, CD28 및 CD27, CD28 및 ICOS, CD28LL→GG 변이체 및 4-1BB, CD28 및 OX40, 또는 CD28LL→GG 변이체 및 OX40을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28 및 4-1BB이다. 일부 실시양태에서, 2개의 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28LL→GG 변이체 및 4-1BB이다. 일부 실시양태에서, 2개의 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28 및 OX40이다. 일부 실시양태에서, 2개의 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28LL→GG 변이체 및 OX40이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 CD28 및 ICOSL의 조합을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 CD28 및 CD27의 조합을 함유할 수 있다. 특정 실시양태에서, 4-1BB 공동-자극 도메인은 CD28 또는 CD28LL→GG 변이체 공동-자극 신호전달 도메인에 대해 N-말단에 위치한다.
1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 함유하거나 또는 이러한 신호전달 도메인이 없는 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것은 면역 세포 (예를 들어, NK 세포 또는 T 세포)에서, 공동-자극 신호를 트랜스로 도출할 수 있는 1개 이상의 별개의 폴리펩티드, 예를 들어, 공동-자극 수용체, 그의 리간드, 또는 공동-자극 수용체에 대한 결합 모이어티 (예를 들어, 단일-쇄 항체)를 포함하는 폴리펩티드와 함께 공동-발현될 수 있다. 비제한적 예로서, 1개 이상의 별개의 폴리펩티드는 4-1BB 리간드 (4-1BBL), CD80, CD86, OX40 리간드 (OX40L), ICOS 리간드 (ICOSL), CD70, 그의 단편, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 별개의 폴리펩티드는 4-1BB, CD28, CD27, CD40L, OX40, ICOS, 그의 단편, 그의 조합을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 별개의 폴리펩티드는 본원에 기재된 공동-자극 수용체 또는 리간드 중 임의의 것에 특이적인 결합 모이어티 (예를 들어, scFv)를 포함할 수 있다. 비제한적 예로서, 1개 이상의 별개의 폴리펩티드는 4-1BB, ICOS, OX40, CD27 또는 CD28에 결합하는 scFv를 포함할 수 있다. 예를 들어, 1개 이상의 별개의 폴리펩티드는 효능작용 항-4-1BB mAb로부터의 scFv를 포함할 수 있다.
예로서, 4-1BBL의 아미노산이 하기에 제공된다:
Figure pct00004
D. 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 세포질 신호전달 도메인
면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 임의의 세포질 신호전달 도메인은 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드를 생성하는 데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "ITAM"은 일반적으로 많은 면역 세포에서 발현되는 신호전달 분자의 테일 부위에 존재하는 보존된 단백질 모티프이다. 모티프는 6-8개의 아미노산에 의해 분리된 아미노산 서열 YxxL/I의 2개의 반복부를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 x는 독립적으로 보존된 모티프 YxxL/Ix(6-8)YxxL/I를 생산하는 임의의 아미노산이다. 신호전달 분자 내의 ITAM은 적어도 부분적으로 신호전달 분자의 활성화 후 ITAM에서의 티로신 잔기의 인산화에 의해 매개되는 세포 내 신호 전달에 중요하다. ITAM은 또한 신호전달 경로에 수반되는 다른 단백질에 대한 도킹 부위로서 기능할 수 있다. 일부 예에서, ITAM을 포함하는 세포질 신호전달 도메인은 CD3ζ 또는 FcεR1γ의 것이다. 다른 예에서, ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인은 인간 CD3ζ로부터 유래된 것이 아니다. 또 다른 예에서, 동일한 ACTR 폴리펩티드의 세포외 리간드-결합 도메인이 CD16A로부터 유래된 경우에, ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인은 Fc 수용체로부터 유래되지 않는다.
하나의 구체적 실시양태에서, 여러 신호전달 도메인이 상가적 또는 상승작용적 효과를 위해 함께 융합될 수 있다. 유용한 추가의 신호전달 도메인의 비제한적인 예는 TCR 제타 쇄, CD28, OX40/CD134, 4-1BB/CD137, FcεRIy, ICOS/CD278, ILRB/CD122, IL-2RG/CD132, 및 CD40 중 1종 이상의 일부 또는 모두를 포함한다.
E. 힌지 도메인
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드는 세포외 리간드-결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 힌지 도메인은 일반적으로 단백질의 두 도메인 사이에서 발견되며, 단백질의 가요성 및 도메인 중 하나 또는 그 둘 모두의 서로에 대해 상대적인 운동을 허용할 수 있는 아미노산 절편이다. ACTR 폴리펩티드의 막횡단 도메인에 대해 상대적인 Fc 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인의 이러한 가용성 및 운동을 제공하는 임의의 아미노산 서열이 사용될 수 있다.
힌지 도메인은 약 1-100개 아미노산, 예를 들어, 약 1-60개 아미노산 (1-30개 아미노산 또는 31-60개 아미노산 포함) 또는 약 50-100개 아미노산 (51-75개 아미노산 또는 76-100개 아미노산 포함)을 함유할 수 있다. 비제한적 예로서, 힌지는 1-15개 아미노산, 15-75개 아미노산, 20-50개 아미노산 또는 30-60개 아미노산일 수 있다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70 또는 75개 아미노산 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 힌지 도메인을 함유하지 않는다.
용어 "약" 또는 "대략"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값에 대한 허용 오차 범위 내를 의미하고, 이는 부분적으로 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지, 즉 측정 시스템의 한계에 의존할 것이다. 예를 들어, "약"은 관련 기술분야의 실시에 따라 허용되는 표준 편차 범위 내에 있다는 것을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 ±20%, 바람직하게는 최대 ±10%, 보다 바람직하게는 최대 ±5%, 및 보다 바람직하게는 추가로 최대 ±1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 프로세스와 관련하여, 용어는 값의 한 자릿수 범위 내에, 바람직하게는, 2배 범위 내에 있음을 의미할 수 있다. 특정한 값이 본 출원 및 청구범위에 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"이 내포되며, 이러한 맥락에서 특정한 값에 대한 허용 오차 범위 내에 있음을 의미한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 자연 발생 단백질의 힌지 도메인이다.
힌지 도메인을 포함하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 임의의 단백질의 힌지 도메인은 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드에 사용하기에 상용성이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 자연 발생 단백질의 힌지 도메인의 적어도 일부이며, ACTR 폴리펩티드에 가요성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD8의 것이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD8의 힌지 도메인의 부분, 예를 들어, CD8의 힌지 도메인의 적어도 15개 (예컨대, 20, 25, 30, 35, 또는 40개)의 연속적인 아미노산을 함유하는 단편이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD28의 것이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD28의 힌지 도메인의 부분, 예를 들어, CD28의 힌지 도메인의 적어도 15개 (예컨대, 20, 25, 30, 35, 또는 40개)의 연속적인 아미노산을 함유하는 단편이다.
일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD16A 수용체의 것, 예를 들어, CD16A 수용체 또는 그의 부분의 전체 힌지 도메인이며, 이는 CD16A 수용체의 최대 40개의 연속적인 아미노산 잔기 (예를 들어, 20, 25, 30, 35, 또는 40개)로 이루어질 수 있다. 이러한 ACTR 구축물은 상이한 수용체 (비-CD16A 수용체)로부터의 힌지 도메인을 함유하지 않을 수 있다.
항체, 예컨대, IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 항체의 힌지 도메인은 또한 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드에 사용하기에 상용성이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 항체의 불변 도메인 CH1 및 CH2를 연결하는 힌지 도메인이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 항체의 것이고, 항체의 힌지 도메인 및 항체의 하나 이상의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 일부 실시양태에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH3 불변 영역을 포함한다.
비-자연 발생 펩티드는 또한 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드에 대한 힌지 도메인으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 C-말단과 막횡단 도메인의 N-말단 사이의 힌지 도메인은 펩티드 링커, 예컨대 (GlyxSer)n 링커이며, 여기서 x 및 n은 독립적으로 3 내지 12의 정수 (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 그 초과 포함)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)n (서열식별번호: 25)이며, 여기서 n은 3 내지 60의 정수 (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 포함)일 수 있다. 특정 실시양태에서, n은 60 초과의 정수일 수 있다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)3 (서열식별번호: 28)이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)6 (서열식별번호: 29)이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)9 (서열식별번호: 30)이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)12 (서열식별번호: 31)이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)15 (서열식별번호: 32)이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)30 (서열식별번호: 33)이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)45 (서열식별번호: 34)이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)60 (서열식별번호: 35)이다.
다른 실시양태에서, 힌지 도메인은 다양한 길이의 친수성 잔기 (예컨대, 10-80개의 아미노산 잔기)로 이루어진 비구조적 폴리펩티드인, 연장된 재조합 폴리펩티드 (XTEN)이다. XTEN 펩티드의 아미노산 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 예를 들어 그의 관련 개시내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 8,673,860에서 찾아볼 수 있다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 XTEN 펩티드이고, 60개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 XTEN 펩티드이고, 30개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 XTEN 펩티드이고, 45개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 XTEN 펩티드이고, 15개의 아미노산을 포함한다.
F. 신호 펩티드
일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 또한 폴리펩티드의 N-말단에 신호 펩티드 (신호 서열로도 알려짐)를 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 폴리펩티드를 세포 내 목적하는 부위로 표적화하는 펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 ACTR 폴리펩티드를 세포의 분비 경로로 표적화하고, ACTR 폴리펩티드가 지질 이중층에 통합 및 고정될 수 있게 할 것이다. 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드에 사용하기에 상용성인 자연 발생 단백질의 신호 서열, 또는 합성, 비-자연 발생 신호 서열을 포함한 신호 서열이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 CD8α로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 CD28로부터의 것이다. 다른 실시양태에서, 신호 서열은 뮤린 카파 쇄로부터의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 신호 서열은 CD16으로부터의 것이다.
G. ACTR 폴리펩티드의 예
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드의 특정 예는 예를 들어 CD16A Fc 결합 도메인, CD28 공동-자극 도메인 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 가질 수 있다. 이러한 ACTR 폴리펩티드는 CD28 힌지 도메인, CD28 막횡단 도메인, 또는 그의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, ACTR 폴리펩티드는 CD8α로부터의 것일 수 있는 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구체적 예에서, ACTR 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로 순서대로 CD8α의 신호 서열, CD16A Fc 결합 도메인, CD28 힌지 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD28 공동-자극 도메인, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하며, 예를 들어, 서열식별번호: 9이다. 일부 실시양태에서, 상기 기재된 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것 (예를 들어, 서열식별번호: 9)은 예를 들어 4-1BBL 도메인 (예를 들어, 서열식별번호: 39)을 포함하는, 본원에 기재된 바와 같은 공동-자극 신호전달을 제공하는 별개의 폴리펩티드와 조합될 수 있다.
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드의 다른 예는 임의의 비-CD16A 수용체로부터의 힌지 도메인이 없을 수 있다 (예를 들어, 힌지 도메인을 갖지 않을 수 있음). 이러한 ACTR 폴리펩티드는 예를 들어 CD16A Fc 결합 도메인, CD28 공동-자극 도메인 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 가질 수 있으나, 힌지 도메인을 갖지 않을 수 있다. 일부 예에서, ACTR 폴리펩티드는 추가적으로 CD8 막횡단 도메인을 포함할 수 있다. 일부 예에서, ACTR 폴리펩티드는 CD8α로부터의 것일 수 있는 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구체적 예에서, ACTR 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로 순서대로 CD8α의 신호 서열, CD16A Fc 결합 도메인, CD8 막횡단 도메인, CD28 공동-자극 도메인, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하며, 예를 들어, 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 38이다. 특정 경우에, ACTR 폴리펩티드는 제2 폴리펩티드 예컨대 공동-자극 신호를 도출할 수 있는 폴리펩티드와 함께 발현될 수 있다. 이러한 제2 폴리펩티드와 ACTR 폴리펩티드의 발현을 위한 구축물은 본원에 기재된다.
표 3은 본원에 기재된 예시적인 ACTR 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 예시적인 구축물은 N-말단에서 C-말단으로 순서대로 신호 서열, Fc 결합 도메인 (예를 들어, Fc 수용체의 세포외 도메인), 힌지 도메인, 및 막횡단을 가지며, 임의적인 공동-자극 도메인 및 세포질 신호전달 도메인의 위치는 바뀔 수 있다. 일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 서열식별번호: 1-22, 26, 27, 38 및 40 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 서열식별번호: 1-22, 26, 27, 38 및 40 중 어느 하나로 이루어질 수 있다.
표 3: 예시적인 ACTR 폴리펩티드.
Figure pct00005
예시 ACTR 폴리펩티드의 아미노산 서열은 하기에 제공된다 (신호 서열은 이탤릭체표시됨).
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
트랜스 형태의 예시적인 ACTR 구축물 (ACTR 폴리펩티드 및 트랜스로 공동-자극 신호전달을 제공하는 별개의 폴리펩티드 함유)이 하기에 추가로 제공된다.
Figure pct00012
Figure pct00013
트랜스 공동-자극인자 폴리펩티드는 서열식별번호: 39이며 상기에 제공된다.
서열식별번호: 38, 39 및 40에서의 이탤릭체표시된 도메인 및 밑줄표시된 도메인의 설명은 서열식별번호: 18 및 서열식별번호: 10과 관련하여 하기에 제공된다.
H. ACTR 구축물을 코딩하는 핵산
본 개시내용은 또한 본원에 개시된 ACTR 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 폴리뉴클레오티드와 관련하여, 본 개시내용은 또한, 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 (이러한 폴리뉴클레오티드가 키메라 수용체의 발현을 위한 적어도 1개의 조절 요소에 작동가능하게 연결되는 벡터 포함)를 제공한다. 본 개시내용의 유용한 벡터의 비제한적 예는 바이러스 벡터 예컨대, 예를 들어, 감마 레트로바이러스 벡터를 포함한 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 (AAV 벡터) 및 렌티바이러스 벡터를 포함한다.
일부 경우에, 본원에 기재된 핵산은 2개의 코딩 서열을 포함할 수 있으며, 하나는 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 폴리펩티드를 코딩하고, 다른 것은 공동-자극 신호를 도출할 수 있는 폴리펩티드를 코딩한다. 이러한 폴리펩티드는 공동-자극 수용체 예컨대 4-1BB, CD28, OX40, CD27, ICOS, 또는 그의 조합으로부터의 공동-자극 도메인을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 폴리펩티드는 공동-자극 수용체의 리간드, 예를 들어, 4-1BB 리간드 (4-1BBL), CD80, CD86, OX40 리간드 (OX40L), ICOS 리간드 (ICOSL), CD70, 그의 기능적 단편, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 2개의 코딩 서열을 포함하는 핵산은 2개의 코딩 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드가 독립적 (및 물리적으로 별개의) 폴리펩티드로서 발현될 수 있도록 구성될 수 있다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 본원에 기재된 핵산은 제1과 제2 코딩 서열 사이에 위치하는 제3 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 이 제3 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 리보솜 스키핑 부위를 코딩할 수 있다. 리보솜 스키핑 부위는 정상 펩티드 결합 형성을 손상시키는 서열이다. 이러한 메카니즘은 1개의 메신저 RNA로부터의 추가의 오픈 리딩 프레임의 번역을 발생시킨다. 이 제3 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 P2A, T2A 또는 F2A 펩티드를 코딩할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Kim et al., PLoS One. 2011;6(4):e18556] 참조). 비제한적 예로서, 예시적인 P2A 펩티드는 ATNFSLLKQAGDVEENPGP 서열식별번호: 23의 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 제3 뉴클레오티드 서열은 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)를 코딩할 수 있다. IRES는 말단-비의존성 방식으로 번역 개시를 가능하게 하여 또한 1개의 메신저 RNA로부터의 추가의 오픈 리딩 프레임의 번역을 허용하는 RNA 요소이다.
또 다른 실시양태에서, 제3 뉴클레오티드 서열은 제2 폴리펩티드의 발현을 제어하는 제2 프로모터를 코딩할 수 있다.
제3 뉴클레오티드 서열은 또한 1개 초과의 리보솜 스키핑 서열, IRES 서열, 추가의 프로모터 서열, 또는 그의 조합을 코딩할 수 있다.
핵산은 또한 추가의 코딩 서열 (제4 및 제5 코딩 서열을 포함하나 이에 제한되지는 않음)을 포함할 수 있고, 추가의 코딩 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드가 추가로 독립적이고 물리적으로 별개인 폴리펩티드로서 발현되도록 구성될 수 있다. 이를 위해, 추가의 코딩 서열은 1개 이상의 리보솜 스키핑 서열, IRES 서열 또는 추가의 프로모터 서열을 코딩하는 1개 이상의 뉴클레오티드 서열에 의해 다른 코딩 서열로부터 분리될 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기재된 핵산은 ACTR 폴리펩티드, 및 공동-자극 신호를 도출할 수 있는 제2 폴리펩티드를 코딩할 수 있으며, 이들은 P2A 펩티드에 의해 연결된다. 발현 동안, ACTR 및 제2 폴리펩티드는 P2A 부위의 존재로 인해 독립적이고 물리적으로 별개인 폴리펩티드로서 생산될 것이다. 일련의 비제한적 예로서, 둘 다 P2A 리보솜 스키핑 부위를 보유하는 서열식별번호: 10 및 서열식별번호: 18을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현은 2종의 물리적으로 별개인 단백질을 생산할 것이다: 하나는 ACTR 단백질 (각각 서열식별번호: 40 및 서열식별번호: 38)을 포함하고 다른 것은 4-1BB 리간드 (4-1BBL) 단백질 (서열식별번호: 39)을 포함한다. 한 실시양태에서, 서열식별번호: 18을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 생산된 2종의 단백질은 서열식별번호: 38 및 서열식별번호: 39로서 제시된다. 또 다른 실시양태에서, 서열식별번호: 10을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현에 의해 생산된 2종의 단백질은 서열식별번호: 40 및 서열식별번호: 39로서 제시된다.
Figure pct00014
상기 서열식별번호: 10 및 18에서, N-말단 이탤릭체 단편은 신호 펩티드이고, 그에 따른 도메인은 ACTR 폴리펩티드 영역이고, 이탤릭체표시된 GSG 펩티드는 링커이고, 밑줄표시된 펩티드는 P2A 리보솜 스키핑 부위이고, 볼드체의 C-말단 도메인은 4-1BBL 도메인이다. 리보솜 스키핑 시에, 4-1BBL 도메인을 함유하는 폴리펩티드는 ACTR 폴리펩티드의 N-말단에서 여분의 "P" 잔기를 포함하고, 나머지 링커 및 P2A 서열은 ACTR 폴리펩티드의 C-말단에 부착된다.
I. ACTR 폴리펩티드의 제조 및 그를 포함하는 제약 조성물
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것은 상용 방법, 예컨대, 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 본원의 ACTR 폴리펩티드를 제조하는 방법은 Fc 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 ITAM을 포함하는 세포질 신호전달 도메인을 포함하여, ACTR 폴리펩티드의 각각의 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 생성하는 것을 수반한다. 핵산 구축물은 또한 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 또한 Fc 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인과 막횡단 도메인 사이의 힌지 도메인을 코딩한다. ACTR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 또한 신호 서열을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열식별번호: 1-22, 26, 27, 38 또는 40에 의해 제공된 예시적인 ACTR 폴리펩티드 중 어느 하나를 코딩한다.
ACTR 폴리펩티드의 각각의 성분의 서열은 상용 기술, 예를 들어, 관련 기술분야에 공지된 다양한 공급원들 중 어느 하나로부터의 PCR 증폭을 통해 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드의 성분 중 1종 이상의 서열은 인간 세포로부터 수득된다. 대안적으로, ACTR 폴리펩티드의 1종 이상의 성분의 서열은 합성될 수 있다. PCR 증폭 또는 라이게이션과 같은 방법을 사용하여, 각각의 성분 (예를 들어, 도메인)의 서열은 직접적으로, 또는 (예를 들어, 펩티드 링커를 코딩하는 핵선 서열을 사용하여) 간접적으로 연결되어, ACTR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 형성할 수 있다. 대안적으로, ACTR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 합성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA이다. 다른 실시양태에서, 핵산은 RNA이다.
CAR-T 세포의 알려져 있는 제한은 표적 항원 제한이다. CAR-T 세포가 T 세포 항원에 특이적인 경우에, 이러한 CAR-T 세포의 시험관내 확장은 실질적으로 동족살해로 인해 손상되어 이러한 CAR-T 세포를 시험관내에서 제조하는 것을 어렵게 할 것이다. 예를 들어, 문헌 [Dusseaux et al.]은 "정상 활성화된 T-세포 상의 CD38의 발현은 이 단백질에 대한 CAR T-세포의 발생에 대한 유의한 허들이다"라고 보고하였다. Dusseaux et al. European Hemalogical Association; June 2016, Poster 365. 추가로, 문헌 [Gomes-Silva et al.]은 또한 "CD7-특이적 CAR의 발현은 잔류 CD7 발현 및 뒤이은 동족살해 때문에 형질도입된 T 세포의 확장을 손상시켰다"라고 보고하였다. Gomes-Silva et al., Blood, 2017, 130: 285-296. 유사하게, CD5에 대해서는 또한 문헌 [Mamonkin et al., Cancer Immunol Res., 2018, 6:47-58]을 참조한다. 대조적으로, 본 발명의 ACTR T 세포는 세포 표면 항원을 직접적으로 표적화하지 않고, 따라서 시험관내에서 확장된 경우에 동족살해 효과를 갖지 않는다.
II. ACTR 폴리펩티드를 발현하는 면역 세포
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드를 발현하는 유전자 조작된 숙주 세포 (예를 들어, 면역 세포 예컨대 T 세포 또는 NK 세포) (ACTR-발현 세포, 예를 들어, ACTR T 세포)는 Fc-함유 항종양 항체에 의해 결합된 표적 세포를 인식할 수 있는 특정 세포 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 숙주 세포 상에 발현된 ACTR 폴리펩티드의 세포외 리간드-결합 도메인과 항종양 항체의 Fc 부분과의 결속으로 활성화 신호가 ACTR 폴리펩티드의 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인(들) 및/또는 ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인에 전달되고, 이는 다시 숙주 세포의 세포 증식 및/또는 이펙터 기능, 예컨대, 숙주 세포에 의해 촉발되는 ADCC 효과를 활성화시킨다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 숙주 세포 상에 발현된 ACTR 폴리펩티드의 세포외 Fc-결합 도메인과 항체의 Fc 부분과의 결속으로 활성화 신호가 ACTR 폴리펩티드의 ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인 및/또는 이러한 숙주 세포에서 공동-발현되는 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인에 전달되고, 이는 다시 숙주 세포의 세포 증식 및/또는 이펙터 기능, 예컨대, 숙주 세포에 의해 촉발되는 ADCC 효과를 활성화시킨다. 공동-자극 신호전달 도메인(들) 및 ITAM을 포함하는 세포질 신호전달 도메인의 조합은 세포내 다중 신호전달 경로의 강건한 활성화를 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 면역 세포, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 NK 세포이다. 다른 실시양태에서, 면역 세포는 확립된 세포주, 예를 들어, NK-92 세포일 수 있다.
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것은 면역 세포 (예를 들어, NK 세포 또는 T 세포)에서, 트랜스로 공동-자극 신호를 제공하기 위한 본원에 기재된 1개 이상의 별개의 폴리펩티드, 예를 들어, 1개 이상의 신호전달 도메인 (예를 들어, 공동-자극 도메인 또는 공동-자극 인자의 리간드)을 포함하는 폴리펩티드와 함께 공동-발현될 수 있다. 비제한적 예로서, 1개 이상의 별개의 폴리펩티드는 4-1BB 리간드 (4-1BBL), CD80, CD86, OX40 리간드 (OX40L), ICOS 리간드 (ICOSL), CD70, 그의 단편, 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 한 예에서, 1개 이상의 별개의 폴리펩티드는 4-1BBL을 코딩할 수 있다.
면역 세포 집단은 임의의 공급원, 예컨대 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수, 또는 조직 예컨대 비장, 림프절, 흉선, 줄기 세포 또는 종양 조직으로부터 수득될 수 있다. 목적하는 유형의 숙주 세포를 수득하는 데 적합한 공급원은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 집단은 PBMC로부터 유래된다. 목적하는 유형의 숙주 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, 또는 T 세포 및 NK 세포)는 세포를 자극 분자와 공동-인큐베이션함으로써 수득된 세포 집단 내에서 확장될 수 있다. 비제한적 예로서, 항-CD3 및 항-CD28 항체는 T 세포의 확장에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것을 발현하는 면역 세포를 구축하기 위해, ACTR 폴리펩티드의 안정한 또는 일시적인 발현을 위한 발현 벡터를 본원에 기재된 바와 같은 통상적인 방법을 통해 생성할 수 있고, 면역 숙주 세포 내로 도입할 수 있다. 예를 들어, ACTR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 적합한 프로모터와 작동가능하게 연결된 적합한 발현 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 적합한 조건 하에 핵산 및 벡터를 제한 효소와 접촉시켜, 서로 쌍을 형성할 수 있고, 리가제로 연결될 수 있는 상보적인 단부를 각 분자 상에 생성할 수 있다. 대안적으로, ACTR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 말단에 합성 핵산 링커를 라이게이션시킬 수 있다. 합성 링커는 벡터 내 특정한 제한 부위에 상응하는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 발현 벡터/플라스미드/바이러스 벡터의 선택은 ACTR 폴리펩티드의 발현을 위한 숙주 세포의 유형에 의존하지만, 진핵 세포에서의 통합 및 복제에 적합한 것이어야 한다.
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드의 발현에 다양한 프로모터가 사용될 수 있으며, 이는 비제한적으로, 시토메갈로바이러스 (CMV) 중간 초기 프로모터, 바이러스 LTR, 예컨대, 라우스 육종 바이러스 LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 헤르페스 단순 tk 바이러스 프로모터를 포함한다. ACTR 폴리펩티드의 발현을 위한 추가의 프로모터는 면역 세포에서의 임의의 구성적 활성 프로모터를 포함한다. 대안적으로, 임의의 조절가능한 프로모터가 사용될 수 있고, 이로써, 면역 세포 내에서의 그의 발현은 조정될 수 있다.
추가적으로, 벡터는 예를 들어, 하기 중 일부 또는 모두를 함유할 수 있다: 선택가능한 마커 유전자, 예컨대, 숙주 세포에서 안정한 또는 일시적인 형질감염체의 선택을 위한 네오마이신 유전자 또는 카나마이신 유전자; 고수준의 전사를 위한 인간 CMV의 중간 초기 유전자로부터의 인핸서/프로모터 서열; mRNA 안정성을 위한 SV40으로부터의 전사 종결 및 RNA 프로세싱 신호; SV40 폴리오마 복제 기점 및 적절한 에피솜 복제를 위한 ColE1; 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), 다목적 다중 클로닝 부위; 센스 및 안티센스 RNA의 시험관내 전사를 위한 T7 및 SP6 RNA 프로모터; 촉발된 경우에 벡터를 보유하는 세포의 사멸을 유발하는 "자살 스위치" 또는 "자살 유전자" (예를 들어, HSV 티미딘 키나제 또는 유도성 카스파제, 예컨대, iCasp9), 및 ACTR 폴리펩티드의 발현을 평가하기 위한 리포터 유전자.
하나의 구체적 실시양태에서, 이러한 벡터는 또한 자살 유전자를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "자살 유전자"는 자살 유전자를 발현하는 세포의 사멸을 유발하는 유전자를 의미한다. 자살 유전자는 작용제, 예를 들어, 약물에 대한 감수성을 유전자가 발현되는 세포에 부여하고, 세포가 작용제와 접촉하거나 또는 그에 노출된 경우에 세포의 사멸을 유발하는 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004] 참조), 이는 예를 들어, 헤르페스 단순 바이러스 (HSV) 티미딘 키나제 (TK) 유전자, 시토신 데아미나제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 니트로리덕타제 및 카스파제, 예컨대, 카스파제 8을 포함한다.
트랜스진을 함유하는 벡터를 생산하는 데 적합한 벡터 및 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 입수가능하다. ACTR 폴리펩티드의 발현을 위한 벡터의 제조에 관한 예는 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함된 US2014/0106449에서 찾아볼 수 있다.
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드 구축물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 중 임의의 것은 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다. 이러한 벡터, 또는 그 안에 함유되어 있는 ACTR 폴리펩티드를 코딩하는 서열은 임의의 적합한 방법에 의해 숙주 세포, 예컨대, 숙주 면역 세포 내로 전달될 수 있다. 벡터를 면역 세포로 전달하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, DNA 전기천공, RNA 전기천공, 시약, 예컨대, 리포솜을 사용하는 형질감염, 또는 바이러스 형질도입 (예를 들어, 레트로바이러스 형질도입 예컨대 렌티바이러스 형질도입)을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드의 발현을 위한 벡터는 바이러스 형질도입 (예를 들어, 레트로바이러스 형질도입 예컨대 렌티바이러스 형질도입)에 의해 숙주 세포에게 전달된다. 전달을 위한 예시적인 바이러스 방법은 재조합 레트로바이러스 (예를 들어 PCT 공개 번호 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; 및 WO 91/02805; 미국 특허 번호 5,219,740 및 4,777,127; GB 특허 번호 2,200,651; 및 EP 특허 번호 0 345 242 참조), 알파바이러스-기반 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어 PCT 공개 번호 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984; 및 WO 95/00655 참조)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드의 발현을 위한 벡터는 레트로바이러스이다. 일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드의 발현을 위한 벡터는 렌티바이러스이다.
레트로바이러스 형질도입을 기재하는 참고문헌의 예는 문헌 [Anderson et al., 미국 특허 번호 5,399,346; Mann et al., Cell 33:153 (1983); Temin et al., 미국 특허 번호 4,650,764; Temin et al., 미국 특허 번호 4,980,289; Markowitz et al., J. Virol. 62:1120 (1988); Temin et al., 미국 특허 번호 5,124,263; 국제 특허 공개 번호 WO 95/07358, 공개 Mar. 16, 1995, Dougherty et al.; 및 Kuo et al., Blood 82:845 (1993)]을 포함한다. 국제 특허 공개 번호 WO 95/07358은 1차 B 림프구의 높은 효율 형질도입을 기재한다. 본원에 언급된 목적 및 대상을 위해 본원에 참조로 포함된 WO2016040441A1을 또한 참조한다.
ACTR 폴리펩티드를 코딩하는 벡터를 바이러스 벡터를 사용하여 숙주 세포로 도입하는 예에서, 면역 세포를 감염시킬 수 있고, 벡터를 보유하는 바이러스 입자는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있고, 이는 예를 들어, PCT 출원 번호 WO 1991/002805A2, WO 1998/009271 A1, 및 미국 특허 6,194,191에서 찾아볼 수 있다. 바이러스 입자를 세포 배양물 상청액으로부터 수거하고, 바이러스 입자를 면역 세포와 접촉시키기 전에 단리 및/또는 정제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 RNA 분자를 통상적인 방법 (예를 들어, 시험관내 전사)에 의해 제조한 다음, 공지된 방법 (예를 들어, 문헌 [Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17:1027-1035])을 통해 적합한 숙주 세포, 예를 들어, 본원에 기재된 것 내로 도입시킬 수 있다.
숙주 세포 내로 본원에서 제공하는 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 벡터, 또는 키메라 벡터를 코딩하는 핵산 (예를 들어, RNA 분자)을 도입한 후, ACTR 폴리펩티드의 발현을 허용하는 조건 하에 세포를 배양할 수 있다. ACTR 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 조절가능한 프로모터에 의해 조절되는 예에서, 숙주 세포를 조절가능한 프로모터가 활성화되는 조건에서 배양할 수 있다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 유도가능한 프로모터이고, 면역 세포는 유도 분자의 존재 하에, 또는 유도 분자가 제조되는 조건 하에 배양된다. ACTR 폴리펩티드 발현 여부를 결정하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 임의의 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 정량적 리버스 트랜스크립타제 PCR (qRT-PCR)에 의한 ACTR 폴리펩티드 코딩 mRNA의 검출에 의해, 또는 웨스턴 블롯팅, 형광 현미경검사, 및 유동 세포측정법을 포함한 방법에 의한 ACTR 폴리펩티드 단백질의 검출에 의해 평가될 수 있다. 대안적으로, ACTR 폴리펩티드의 발현은 면역 세포가 대상체에게 투여된 후에 생체내에서 발생할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 포유동물 예컨대 인간, 원숭이, 마우스, 토끼 또는 가축 포유동물을 지칭한다. 예를 들어, 대상체는 영장류일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
대안적으로, 본원에 개시된 면역 세포 중 임의의 것의 ACTR 폴리펩티드의 발현은 ACTR 폴리펩티드를 코딩하는 RNA 분자를 도입함으로써 달성될 수 있다. 이러한 RNA 분자는 시험관내 전사에 의해 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 이어서, RNA 분자는 예를 들어 전기천공에 의해, 적합한 숙주 세포 예컨대 면역 세포 (예컨대, T 세포, NK 세포, 또는 T 세포 및 NK 세포 둘 다) 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Rabinovich et al., Human Gene Therapy, 17:1027-1035] 및 WO WO2013/040557에 기재된 방법에 따라, RNA 분자는 합성될 수 있고, 숙주 면역 세포 내로 도입될 수 있다.
특정 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드를 포함하는 벡터 또는 RNA 분자는 생체내에서 숙주 세포 또는 면역 세포에 도입될 수 있다. 비제한적 예로서, 이것은 (예를 들어 정맥내 투여를 통해) 대상체에게 직접적으로 본원에 기재된 1개 이상의 ACTR 폴리펩티드를 코딩하는 벡터 또는 RNA 분자를 투여하여 생체내에서 ACTR 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포를 생산함으로써 달성될 수 있다.
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것을 발현하는 숙주 세포를 제조하는 방법은 또한 생체외에서 숙주 세포를 활성화시키는 것을 포함할 수 있다. 숙주 세포를 활성화시키는 것은 세포가 이펙터 기능 (예를 들어, ADCC)을 수행할 수 있을 수 있는 활성화된 상태로 숙주 세포를 자극하는 것을 의미한다. 숙주 세포를 활성화시키는 방법은 ACTR 폴리펩티드의 발현에 사용되는 숙주 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, T 세포는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, IL-2 및/또는 피토헤모아글루티닌을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 분자의 존재 하에 생체외에서 활성화될 수 있다. 다른 예에서, NK 세포는 1종 이상의 분자 예컨대 4-1BB 리간드, 항-4-1BB 항체, IL-15, 항-IL-15 수용체 항체, IL-2, IL12, IL-21, 및 K562 세포의 존재 하에 생체외에서 활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것을 발현하는 숙주 세포 (ACTR-발현 세포)는 대상체에의 투여 전에 생체외에서 활성화된다. 숙주 세포가 활성화되는지 결정하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 세포 활성화와 연관된 1종 이상의 세포 표면 마커의 발현, 시토카인의 발현 또는 분비, 및 세포 형태를 평가하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것을 발현하는 숙주 세포를 제조하는 방법은 생체외에서 숙주 세포를 확장시키는 것을 포함할 수 있다. 숙주 세포를 확장시키는 것은 ACTR 폴리펩티드를 발현하는 세포의 수를 증가시키는 임의의 방법, 예를 들어, 숙주 세포가 증식하도록 허용하거나, 또는 숙주 세포가 증식하도록 자극하는 것을 수반할 수 있다. 숙주 세포의 확장을 자극하는 방법은 ACTR 폴리펩티드의 발현을 위해 사용되는 숙주 세포의 유형에 따라 달라질 것이며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것을 발현하는 숙주 세포는 대상체에의 투여 전에 생체외에서 확장된다.
일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포는 대상체에게 세포를 투여하기 이전에 생체외에서 확장되고, 활성화된다. 숙주 세포 활성화 및 확장을 사용하여 바이러스 벡터를 게놈 내로 통합시킬 수 있고, 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있다. mRNA 전기천공을 사용할 경우, 비록 전기천공이 활성화된 세포에서 수행될 때에 보다 효과적일 수 있지만, 활성화 및/또는 확장이 필요하지 않을 수도 있다. 일부 경우에, ACTR 폴리펩티드는 적합한 숙주 세포 (예를 들어, 3-5일 동안)에서 일시적으로 발현된다. 일시적인 발현은, 잠재적인 독성이 있는 경우 유리할 수 있으며, 가능한 부작용에 대한 임상 시험의 초기 단계에서 도움이 되어야 한다.
ACTR 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포 중 임의의 것은 또한 본 개시내용이 범주 내에 있는 제약 조성물을 형성하기 위해 제약상 허용되는 담체와 혼합될 수 있다.
본 개시내용의 조성물과 관련하여 사용된 어구 "제약상 허용되는"은 분자 엔티티 및 이러한 조성물의 다른 성분이 생리학상 허용되고, 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 투여된 경우에 전형적으로는 부작용 반응을 일으키지 않는 것을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는"은 포유동물, 및 보다 특히 인간에서 사용하기 위한, 연방 정부 또는 주 정부의 관리 당국에 의해 승인되거나, 또는 미국 약전, 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 열거된 것을 의미한다. "허용되는"은 담체가 조성물의 활성 성분 (예를 들어, 핵산, 벡터, 세포, 또는 치료 항체)과 상용성이고, 조성물(들)을 투여받은 대상체에게 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명의 방법에서 사용하고자 하는 제약 조성물 중 임의의 것은 동결건조된 제제 또는 수용액 형태로 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함할 수 있다.
완충제를 포함한 제약상 허용되는 담체는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한, 항산화제; 보존제; 저분자량 폴리펩티드; 단백질, 예컨대, 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 아미노산; 소수성 중합체; 단당류; 이당류; 및 다른 탄수화물; 금속 복합체; 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]을 참조한다.
본 개시내용의 제약 조성물은 또한 치료하고자 하는 특정한 적응증 및/또는 ADCC의 증진을 위해 필요한 1종 이상의 추가의 활성 화합물, 바람직하게는, 서로 유해한 영향을 미지치 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 가능한 추가의 활성 화합물의 비제한적인 예는 예를 들어, IL-2 뿐만 아니라, 관련 분야에 공지되고 하기 조합 치료에 관한 논의에서 열거되는 다양한 작용제를 포함한다.
본 개시내용이 본원에서 언급된 질환 상태들 중 임의의 것에 관한 것인 한, 본 개시내용과 관련하여, 용어 "치료하다," "치료" 및 유사 용어는 이러한 상태와 연관된 적어도 하나의 증상을 경감, 또는 완화시키거나, 이러한 상태의 진행을 저속화 또는 역전시키는 것을 의미한다. 본 개시내용의 의미 내에서, 용어 "치료하다"는 또한 발병을 정지시키고/거나, 발병 (즉, 질환의 임상 징후 전 기간)을 지연시키고/거나, 질환의 발생 또는 악화 위험을 감소시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 암과 관련하여, 용어 "치료하다"는 환자의 종양 부담을 제거 또는 감소시키거나, 또는 전이를 예방, 지연, 또는 억제하는 것 등을 의미할 수 있다.
III. ACTR 폴리펩티드를 발현하는 면역 세포 및 치료 항체의 조합 면역요법
본 개시내용의 예시적인 ACTR 폴리펩티드는 T 림프구에 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 능력을 부여하고, NK 세포에서 ADCC를 증진시킨다. 수용체가 세포에 결합된 항체에 의해 결속된 경우에, 이는 T-세포 활성화, 지속적인 증식 및 결합된 세포에 대한 특이적 세포독성을 촉발한다.
Ig의 Fc 부분에 대한 CD16의 친화도 정도가 ADCC의 중요한 결정인자이며, 따라서, 항체 면역요법에 대한 임상 반응에 대해 중요한 결정인자가 된다. Ig에 대한 결합 친화도가 높고, 우수한 ADCC를 매개하는 V158 다형성을 갖는 CD16이 예로서 선택되었다. T 세포 증식 및 ADCC 유도에서 F158 수용체가 V158 수용체보다 효능이 더 낮지만, F158 수용체가 V158 수용체보다 생체내 독성이 더 낮을 수 있어 일부 임상적 환경에서는 유용할 수 있다.
본 개시내용의 ACTR 폴리펩티드 및 방법은 암 항원에 특이적으로 결합하는 항체와 조합된 경우에 1종의 단일 수용체가 모든 암에 사용되도록 함으로써 T-세포 요법을 용이하게 한다. 항체-지정 세포독성은, 항체 투여의 간단한 중단에 의해 요구될 경우에는 언제나, 중단되어야 한다. 임의의 잠재적인 자가면역 반응성을 제한하기 위해 mRNA 전기천공을 사용하여 ACTR 폴리펩티드를 일시적으로 발현시킴으로써 임상적 안전성을 추가로 증진시킬 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용은 암의 항체-기반 면역요법의 효능 증진을 필요로 하는 대상체 내로 치료 유효량의 항체 및 치료 유효량의 T 림프구 또는 NK 세포를 도입하는 단계를 포함하고, 상기 T 림프구 또는 NK 세포는 본 개시내용의 ACTR 폴리펩티드를 포함하며, 상기 대상체는 항원-발현 세포에 결합할 수 있고, 인간 CD16에 결합할 수 있는 인간화 Fc 부분을 갖는 항체로 치료받고 있는 대상체인, 암의 항체-기반 면역요법의 효능 증진을 필요로 하는 대상체에서 암의 항체-기반 면역요법의 효능을 증진시키는 방법을 제공한다.
용량 또는 양에 적용되는 본원에 사용된 용어 "치료적으로 유효한"은 그를 필요로 하는 대상체에의 투여시 목적하는 활성을 일으키기에 충분한 화합물 또는 제약 조성물의 양을 지칭한다. 활성 성분의 조합물 (예를 들어, 항체를 포함하는 제1 제약 조성물, 및 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR) 구축물을 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포의 집단을 포함하는 제2 제약 조성물)이 투여되는 경우에, 조합물의 유효량은 개별적으로 투여되는 경우에 효과적이었을 각각의 성분의 양을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 본 개시내용과 관련하여, 용어 "치료상 효과적인"은 본 개시내용의 방법에 의해 치료되는 장애의 징후를 지연시키거나, 그의 진행을 정지시키거나, 그의 적어도 1종의 증상을 경감 또는 완화시키기에 충분한 화합물 또는 제약 조성물의 양을 지칭한다.
A. 면역 요법 효능 증진
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드를 발현하는 숙주 세포 (예를 들어, 면역 세포)는 대상체에서 ADCC를 증진시키고/거나 항체-기반 면역요법의 효능을 증진시키는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예컨대, 인간, 원숭이, 마우스, 토끼, 또는 가축 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 암 환자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 본원에 기재된 치료 항체 중 임의의 것으로 치료받은 적이 있거나, 또는 치료받고 있는 대상체이다.
본원에 기재된 방법을 실시하기 위해, 유효량의 본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것을 발현하는 면역 세포 (NK 세포 및/또는 T 림프구) 및 유효량의 항체, 또는 그의 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체에게 적합한 경로, 예컨대 정맥내 투여를 통해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 유효량은 투여 시에 대상체에게 치료 효과를 부여하는 각각의 작용제 (예를 들어, ACTR 폴리펩티드를 발현하는 NK 세포 및/또는 T 림프구, 항체, 또는 그의 조성물)의 양을 지칭한다. 본원에 기재된 세포 또는 조성물의 양이 치료 효과를 달성하였는지 결정하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인식할 바와 같이, 유효량은 치료될 특정 상태, 상태의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기, 성별 및 체중을 포함한 개별적 환자 파라미터, 치료 지속기간, (존재하는 경우) 공동 요법의 성질, 특정 투여 경로, 및 건강 진료의의 지식 및 전문기술 내에 속하는 기타 인자에 따라 달라진다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에서 임의의 질환 또는 장애를 완화시키거나, 경감시키거나, 호전시키거나, 개선시키거나, 증상을 감소시키거나, 또는 그의 진행을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 인간 암 환자이다.
본 개시내용의 방법은 임의의 암의 치료에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 방법으로 치료될 수 있는 암의 특정 비제한적 예는 예를 들어 림프종, 유방암, 위암, 신경모세포종, 골육종, 폐암, 피부암, 전립선암, 결장직장암, 신세포 암종, 난소암, 횡문근육종, 백혈병, 중피종, 췌장암, 두경부암, 망막모세포종, 신경교종, 교모세포종, 갑상선암, 간세포성암, 식도암, 자궁경부암 및 신경모세포종을 포함한다. 특정 실시양태에서, 암은 고형 종양일 수 있다.
일부 실시양태에서, 면역 세포는 ADCC 활성을 적어도 20%만큼 및/또는 적어도 2배만큼 증진시키는 데, 예를 들어, ADCC를 50%, 80%, 100%, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 또는 그 초과만큼 증진시키는 데 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다.
면역 세포는 항체가 결합하는 항원을 발현하는 세포를 표적화하기 위해 치료 항체와 공-투여된다. 항체-기반 면역요법은 면역요법이 대상체에서 유용한 것으로 간주되는 임의의 질환 또는 장애의 증상을 치료, 완화, 또는 감소시키는 데 사용될 수 있다.
항체 (상호교환가능하게 복수 형태로 사용됨)는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역 내에 위치하는 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 무손상 (즉, 전장) 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, Fc 영역을 포함하는 그의 항원-결합 단편, 그의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 디아바디, 나노바디, 선형 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 요구되는 특이성의 항원 인식 부위 및 Fc 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형태 (항체의 당화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유적으로 변형된 항체 포함)를 포괄한다. 항체는 임의의 부류의 항체 예컨대 IgD, IgE, IgG, IgA, 또는 IgM (또는 그의 하위부류)을 포함하고, 항체는 임의의 특정 부류일 필요가 없다. 그의 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM인, 이뮤노글로불린의 5종의 주요 부류가 있고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 형태는 널리 공지되어 있다. 본 개시내용에 사용하기 위한 항체는 공동-사용된 ACTR T 세포에 의해 인식가능한 Fc 영역을 함유한다. Fc 영역은 인간 또는 인간화 Fc 영역일 수 있다.
본원에 기재된 항체 중 임의의 것은 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. "모노클로날 항체"는 균질한 항체 집단을 지칭하며, "폴리클로날 항체"는 비균질한 항체 집단을 지칭한다. 이러한 두 가지 용어가 항체의 공급원, 또는 그것이 제조되는 방식을 제한하는 것은 아니다.
한 예에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 특정 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄, 또는 비-인간 이뮤노글로불린에서 유래된 최소 서열을 함유하는 그의 항원-결합 단편인 비-인간 (예를 들어 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 대부분, 인간화 항체는, 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 대체된다. 게다가, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열 어느 것에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있지만, 이것은 항체 성능이 추가로 정밀화되고 최적화되도록 포함된다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 최적으로는 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 부분, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 항체는 WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 가질 수 있다. 다른 형태의 인간화 항체는 원래 항체와 관련하여 변경된 1개 이상의 CDR (1, 2, 3, 4, 5, 6개)을 가지며, 이는 또한 원래 항체로부터의 1개 이상의 CDR"로부터 유래된" 1개 이상의 CDR로 지칭된다. 인간화 항체는 또한 친화도 성숙을 수반할 수 있다.
또 다른 예에서, 본원에 기재된 항체는 인간 항체로부터의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있는 키메라 항체이다. 키메라 항체는 제1 종으로부터의 가변 영역 또는 그의 일부 및 제2 종으로부터의 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 이들 키메라 항체에서, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은 포유동물의 한 종 (예를 들어, 비-인간 포유동물 예컨대 마우스, 토끼 및 래트)으로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하고, 반면에 불변 부분은 또 다른 포유동물 예컨대 인간으로부터 유래된 항체에서의 서열과 상동이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변형은 가변 영역 및/또는 불변 영역에서 이루어질 수 있다.
본원에 개시된 ACTR 폴리펩티드 중 임의의 것을 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 림프구 및/또는 NK 세포)는 Fc-함유 항체로 치료되었거나 치료되고 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 면역 세포는 항체와 동시에 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 대안적으로, 면역 세포는 항체-기반 면역요법의 과정 동안 인간 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 예에서, 면역 세포 및 항체는 인간 대상체에게 적어도 4시간 이격되어, 예를 들어, 적어도 12시간 이격되어, 적어도 1일 이격되어, 적어도 3일 이격되어, 적어도 1주 이격되어, 적어도 2주 이격되어 또는 적어도 1개월 이격되어 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 상응하는 표적 항원 또는 그의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 관련 기술분야에서 널리 이해되는 용어이다. 분자는 그것이 대안적인 표적과 하는 것에 비해 더 긴 지속기간 및/또는 더 큰 친화도로 특정한 표적 항원과 더 빈번하고 더 빠르게 반응하는 경우, "특이적 결합"을 나타내는 것으로 지칭된다. 항체는 그것이 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 더 용이하게, 및/또는 더 큰 지속기간으로 결합하는 경우, 표적 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합한다". 예를 들어, 항원 또는 그 안의 항원 에피토프에 특이적으로 (또는 우선적으로) 결합하는 항체는 그것이 다른 항원 또는 동일 항원 내 다른 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 더 용이하게, 및/또는 더 큰 지속기간으로 이 표적 항원에 결합하는 항체이다. 또한 예를 들어 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 제2 표적 항원에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 또는 결합하지 않을 수 있다는 것이 이러한 정의에서 이해된다. 이에 따라, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 (포함할 수 있지만) 반드시 요구하지는 않는다. 일부 예에서, 표적 항원 또는 그의 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 다른 항원 또는 동일한 항원 내 다른 에피토프에 결합하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 TNF-알파, HER2, CD52, CD38, BCMA, GPC3, PDGF-R-알파, CD25, VEGF, BLyS, CD30, IL1-B, EGFR, RANK 리간드, GD2, C5, CD11a, CD22, CD33, CTLA4, CEACAM5, 알파-4 인테그린, CD20, CD19, IgE, RSV, VEGFR2, IL6R, IL12, IL23, 인테그린 알파4-베타7 또는 PSMA에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항체는 표적 항원 (예를 들어, TNF-알파, HER2, CD52, CD38, BCMA, GPC3, PDGF-R-알파, CD25, VEGF, BLyS, CD30, IL1-B, EGFR, RANK 리간드, GD2, C5, CD11a, CD22, CD33, CTLA4, CEACAM5, 알파-4 인테그린, CD20, CD19, IgE, RSV, VEGFR2, IL6R, IL12, IL23, 인테그린 알파4-베타7 또는 PSMA) 또는 그의 항원 에피토프에 대해 적합한 결합 친화도를 갖는다. 본원에 사용된 "결합 친화도"는 겉보기 회합 상수 또는 KA를 지칭한다. KA는 해리 상수 (KD)의 역수이다. 본원에 기재된 방법에 사용하기 위한 항체는 표적 항원 또는 항원 에피토프에 대해 적어도 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 M, 또는 그 미만의 결합 친화도 (KD)를 가질 수 있다. 증가된 결합 친화도는 감소된 KD에 상응한다. 제2 항원 대비 제1 항원에 대한 항체의 더 높은 친화도 결합은 제2 항원에의 결합에 대한 KA (또는 수치값 KD)보다 제1 항원에의 결합에 대한 더 높은 KA (또는 더 작은 수치값 KD)에 의해 나타내어질 수 있다. 이러한 경우에, 항체는 제2 항원 (예를 들어, 제2 입체형태의 동일한 제1 단백질 또는 그의 모방체; 또는 제2 단백질) 대비 제1 항원 (예를 들어, 제1 입체형태의 제1 단백질 또는 그의 모방체)에 대해 특이성을 갖는다. 결합 친화도에서의 차이 (예를 들어, 특이성 또는 다른 비교에 있어서)는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37.5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10,000 또는 105배일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체 중 임의의 것은 표적 항원 또는 그의 항원 에피토프에 대한 항체의 결합 친화도를 증가시키기 위해 추가로 친화도 성숙될 수 있다.
결합 친화도 (또는 결합 특이성)는 평형 투석, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라즈몬 공명, 또는 분광분석법 (예를 들어, 형광 검정을 사용함)을 포함한 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 결합 친화도를 평가하기 위한 예시적인 조건은 HBS-P 완충제 (10 mM HEPES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.005% (v/v) 계면활성제 P20)일 수 있다. 이들 기술은 표적 단백질 농도의 함수로서 결합된 결합 단백질의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 결합된 결합 단백질 ([Bound])의 농도는 일반적으로 하기 방적식에 의해 유리 표적 단백질 ([Free])의 농도와 관련된다:
[Bound] = [Free]/(Kd+[Free])
KA를 항상 정확하게 결정할 필요는 없는데, 이는 그것이 때때로 예를 들어 ELISA 또는 FACS 분석과 같은 방법을 사용하여 결정되고, KA에 비례하고, 따라서 더 높은 친화도가 예를 들어 2배 더 높은지 결정하는 것과 같은 비교에 사용할 수 있는 친화도의 정량적 측정을 수득하기에 충분하거나, 친화도의 질적 측정을 수득하기에 충분하거나, 또는 예를 들어 기능적 검정, 예를 들어, 시험관내 또는 생체내 검정에서의 활성에 의해 친화도의 추론을 수득하기에 충분하기 때문이다.
본원에 기재된 면역 요법 방법에 사용하기 위한 항체는 특정 영역 또는 그 안의 항원 에피토프에 결합 (예를 들어, 특이적으로 결합)할 수 있다.
본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 예시적인 항체는 TNF-알파, HER2, CD52, CD38, BCMA, GPC3, PDGF-R-알파, CD25, VEGF, BLyS, CD30, IL1-B, EGFR, RANK 리간드, GD2, C5, CD11a, CD22, CD33, CTLA4, CEACAM5, 알파-4 인테그린, CD20, CD19, IgE, RSV, VEGFR2, IL6R, IL12, IL23, 인테그린 알파4-베타7 또는 PSMA에 특이적인 항체, 뿐만 아니라 다른 알려져 있는 항체를 포함한다. 비제한적 예로서, 본원에 기재된 조성물 및 방법에서 사용하기 위한 항체는 하기 중 1종 이상일 수 있다: 아달리무맙, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 알렘투주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 바실릭시맙, 베바시주맙, 벨리무맙, 브렌툭시맙 베도틴, 카나키누맙, 세툭시맙, 다클리주맙, 다라투무맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 두르발루맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 겜투주맙, 골리무맙, 인플릭시맙, 이필리무맙, 라베투주맙, 나탈리주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 페르투주맙, 라무시루맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 우스테키누맙, 및 베돌리주맙.
항체-기반 면역요법의 효능은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있고, 이는 숙련된 의료 전문가에게 명백할 것이다. 예를 들어, 항체-기반 면역요법의 효능은 대상체의 생존 또는 대상체 또는 그의 조직 또는 샘플 중의 종양 또는 암 부담에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 ACTR 폴리펩티드를 발현하는 면역 세포 및/또는 항체의 부재 하의 효능과 비교하여 항체-기반 면역요법의 효능을 적어도 20%만큼 및/또는 적어도 2배 만큼 증진시키는 데, 예를 들어, 항체-기반 면역요법의 효능을 50%, 80%, 100%, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 또는 그 초과만큼 증진시키는 데 효과적인 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
본원에 기재된 조성물 또는 방법 중 임의의 것에서, 면역 세포 (예를 들어, NK 및/또는 T 세포)는 대상체에 대해 자가일 수 있고, 즉, 면역 세포는 치료를 필요로 하는 대상체로부터 수득되고, ACTR 폴리펩티드의 발현을 위해 유전자 조작되고, 이어서 동일한 대상체에게 투여될 수 있다. 하나의 구체적 실시양태에서, 대상체 내로의 재도입 전에, 자가 면역 세포 (예컨대, T 림프구 또는 NK 세포)는 생체외에서 활성화되고/거나, 확장된다. 자가 세포를 대상체에게 투여하면, 비-자가 세포를 투여한 경우와 비교하여 숙주 세포의 거부가 감소될 수 있다.
대안적으로, 숙주 세포는 동종 세포이고, 즉, 세포는 제1 대상체로부터 수득되고, ACTR 폴리펩티드의 발현을 위해 유전자 조작되고, 제1 대상체와는 상이하지만 동일한 종인 제2 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 동종 면역 세포는 인간 공여자로부터 유래될 수 있고, 공여자와 상이한 인간 수용자에게 투여될 수 있다. 하나의 구체적 실시양태에서, T 림프구는, 내인성 T 세포 수용체의 발현이 억제 또는 제거되는 동종 T 림프구이다. 하나의 구체적 실시양태에서, 대상체 내로의 도입 전에, 동종 T 림프구는 생체외에서 활성화되고/거나, 확장된다. T 림프구는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 항-CD3/CD28, IL-2, 및/또는 피토헤모아글루티닌의 존재 하에 활성화될 수 있다.
NK 세포는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, CD137 리간드 단백질, CD137 항체, IL-15 단백질, IL-15 수용체 항체, IL-2 단백질, IL-12 단백질, IL-21 단백질, 및 K562 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 작용제의 존재 하에 활성화될 수 있다. 예를 들어, NK 세포를 확장시키는 데 유용한 방법에 관한 설명에 대해 미국 특허 번호 7,435,596 및 8,026,097을 참조한다. 예를 들어, 본 개시내용의 조성물 또는 방법에서 사용되는 NK 세포는 주요 조직적합성 복합체 I 및/또는 II 분자가 결여되거나, 또는 그를 불충분하게 발현하고, 막 결합 IL-15 및 4-1BB 리간드 (CDI37L)를 발현하도록 유전자 변형된 세포에의 노출에 의해 우선적으로 확장될 수 있다. 이러한 세포주는 K562 (ATCC, CCL 243; 문헌 [Lozzio et al., Blood 45(3):321-334 (1975)]; [Klein et al., Int. J. Cancer 18:421-431 (1976)]), 및 빌름스(Wilms) 종양 세포주 HFWT (문헌 [Fehniger et al., Int Rev Immunol 20(3-4):503-534 (2001)]; [Harada H, et al., Exp Hematol 32(7):614-621 (2004)]), 자궁 내막 종양 세포주 HHUA, 흑색종 세포주 HMV-II, 간모세포종 세포주 HuH-6, 폐 소 세포 암종 세포주 Lu-130 및 Lu-134-A, 신경모세포종 세포주 NB 19 및 N1369, 고환 NEC 14로부터의 배아 암종 세포주, 자궁경부 암종 세포주 TCO-2, 및 골수-전이된 신경모세포종 세포주 TNB 1 (문헌 [Harada, et al., Jpn. J. Cancer Res 93: 313-319 (2002)])을 포함하나 이에 반드시 제한되지 않는다. 바람직하게는, 사용되는 세포주, 예컨대, K562 및 HFWT 세포주는 MHC I 및 II 분자, 둘 모두가 결여되거나, 또는 그를 불충분하게 발현한다. 세포주 대신 고형 지지체가 사용될 수 있다. 이러한 지지체는 바람직하게는 그의 표면 상에 NK 세포에 결합하고 1차 활성화 사건 및/또는 증식성 반응을 유도할 수 있거나 또는 이러한 효과를 갖는 분자에 결합하여 스캐폴드로서 작용할 수 있는 적어도 하나의 분자에서 부착되어 있어야 한다. 지지체는 그의 표면에 CD137 리간드 단백질, CD137 항체, IL-15 단백질 또는 IL-15 수용체 항체를 부착시킬 수 있다. 바람직하게는, 지지체는 그의 표면에 결합된 IL-15 수용체 항체 및 CD137 항체를 가질 것이다.
기재된 조성물 또는 방법의 한 실시양태에서, T 림프구, NK 세포, 또는 T 림프구 및 NK 세포를 대상체에게 도입 (또는 재-도입)한 후, 대상체에게 치료 유효량의 IL-2를 투여한다.
본 개시내용에 따라, 환자는 체중 1 kg당 약 105 내지 1010개 또는 그 초과의 세포 (세포/kg)의 범위로, 본 개시내용의 ACTR 폴리펩티드를 포함하는 면역 세포, 예컨대, T 림프구 또는 NK 세포를 치료 유효 용량으로 주입함으로써 치료될 수 있다. 주입은 목적하는 반응을 달성할 때까지 환자가 견딜 수 있을 만큼 자주 및 다수회에 걸쳐 반복될 수 있다. 적절한 주입 용량 및 스케줄은 환자마다 달라지겠지만, 이는 특정한 환자에 대해 치료 의사에 의해 결정될 수 있다. 전형적으로, 대략 106개의 세포/Kg인 초기 용량으로 주입되고, 108개 이상의 세포/Kg으로 단계적으로 증량될 것이다. 주입된 세포를 확장시키기 위해 IL-2가 공-투여될 수 있다. IL-2의 양은 체표면적 1 m2당 약 1-5 x 106 국제 단위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 약 100-500 mg, 500-1000 mg, 1000-1500 mg 또는 1500-2000 mg 중 하나 이상의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체는 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg 또는 약 900 mg 중 하나 이상의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체는 약 1000 mg, 약 1100 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg 또는 약 1800 mg 중 하나 이상의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체는 약 1600 mg 중 하나 이상의 용량으로 대상체에게 투여된다.
본원에 기재된 방법에서 사용된 특정한 투여 요법, 즉, 용량, 시기 및 반복은 특정한 대상체 및 이러한 대상체의 의료 병력에 따라 달라질 것이다. 사용된 항체의 적절한 투여량은 치료될 암의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체는 1회 또는 일련의 치료로 환자에게 투여될 수 있다. 본 개시내용의 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링될 수 있다.
항체의 투여는 전신 투여 뿐만 아니라 질환 부위 (예를 들어, 종양)에 직접적으로 투여하는 것을 포함한, 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 항체를 대상체에게 1회 용량으로 투여하는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항체를 대상체에게 다수회 용량 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8회 용량)으로 투여하는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 항체는 대상체에게 다수회 용량으로 투여되며, 항체의 제1 용량은 ACTR을 발현하는 면역 세포의 투여 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 전에 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체의 제1 용량은 ACTR을 발현하는 면역 세포의 투여 약 24-48시간 전에 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 항체는 ACTR을 발현하는 면역 세포의 투여 전에 및 이어서 후속적으로 약 2주마다 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항체의 제1 2회 용량은 약 1주 (예를 들어, 약 6, 7, 8, 또는 9일) 이격되어 투여된다. 특정 실시양태에서, 제3 및 그 이후의 용량은 약 2주마다 투여된다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 항체의 투여 시기는 대략적이고, 지시된 날짜의 3일 전 및 3일 후를 포함한다 (예를 들어, 3주마다의 투여는 제18일, 제19일, 제20일, 제21일, 제22일, 제23일 또는 제24일의 투여를 포괄함).
본원에 기재된 조성물 또는 방법의 효능은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있고, 숙련된 의료 전문가에게 명백할 것이다. 예를 들어, 항체-기반 면역요법의 효능은 대상체의 생존 또는 대상체 또는 그의 조직 또는 샘플에서의 암 부담에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체-기반 면역요법은 대상체에서의 요법 (예를 들어, 항체 및 ACTR 폴리펩티드를 발현하는 면역 세포의 투여)의 안전성 또는 독성에 기초하여, 예를 들어 대상체의 전반적 건강 및/또는 유해 사건 또는 심각한 유해 사건의 존재에 의해 평가된다.
B. 조합 치료
본 개시내용에 기재된 조성물 및 방법은 다른 유형의 암 요법, 예컨대, 화학요법, 수술, 방사선 조사, 유전자 요법 등과 함께 이용될 수 있다. 이러한 요법은 본 개시내용에 따른 면역요법과 동시에 또는 순차적으로 (임의의 순서로) 투여될 수 있다.
추가의 치료제와 함께 공-투여되는 경우에, 각 작용제에 대해 적합한 치료 유효 투여량은 상가 작용 또는 상승작용으로 인해 감량될 수 있다.
본 개시내용의 치료는 다른 면역조정 치료, 예컨대, 예를 들어, 치료 백신 (GVAX, DC-기반 백신 등을 포함하나 이에 제한되지는 않음), 체크포인트 억제제 (CTLA4, PD1, LAG3, TIM3 등을 차단하는 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 또는 활성화제 (41BB, OX40 등을 증진시키는 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)와 조합될 수 있다.
본 개시내용의 면역요법과 조합하는 데 유용한 다른 치료제의 비제한적인 예는 (i) 항혈관신생제 (예를 들어, TNP-470, 혈소판 인자 4, 트롬보스폰딘-1, 메탈로프로테아제의 조직 억제제 (TIMP1 및 TIMP2), 프로락틴 (16-Kd 단편), 안지오스타틴 (플라스미노겐의 38-Kd 단편), 엔도스타틴, bFGF 가용성 수용체, 형질전환 성장 인자 베타, 인터페론 알파, 가용성 KDR 및 FLT-1 수용체, 태반 프로리페린-관련 단백질 뿐만 아니라, 문헌 [Carmeliet and Jain (2000)]에 열거되어 있는 것; (ii) VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제, 예컨대, 항-VEGF 항체, VEGF 변이체, 가용성 VEGF 수용체 단편, VEGF 또는 VEGFR을 차단할 수 있는 압타머, 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제의 억제제 및 그의 임의의 조합; 및 (iii) 화학요법 화합물, 예컨대, 예를 들어, 피리미딘 유사체 (5-플루오로우라실, 플록수리딘, 카페시타빈, 겜시타빈 및 시타라빈), 퓨린 유사체, 폴레이트 길항제 및 관련 억제제 (메르캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 2-클로로데옥시아데노신 (클라드리빈)); 항증식제/항유사분열제, 예컨대, 천연 생성물, 예컨대, 빈카 알칼로이드 (빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 비노렐빈), 미세관 파괴제, 예컨대, 탁산 (파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론 및 나벨빈, 에피디포도필로톡신 (에토포시드, 테니포시드), DNA 손상제 (악티노마이신, 암사크린, 안트라시클린, 블레오마이신, 부술판, 캄포테신, 카르보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 시톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸렌다이아민 옥살리플라틴, 이포스파미드, 멜팔란, 메클로레타민, 미토마이신, 미토크산트론, 니트로소우레아, 플리카마이신, 프로카르바진, 탁솔, 탁소테레, 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 에토포시드 (VP16)); 항생제, 예컨대, 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신 (아드리아마이신),이다루비신, 안트라시클린, 미토크산트론, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신) 및 미토마이신; 효소 (L-아스파라긴을 전신 대사시키고, 그 자신의 아스파라긴을 합성하는 능력이 없는 세포를 제거하는 L-아스파라기나제); 항혈소판제; 항증식성/항유사분열 알킬화제, 예컨대, 질소 머스타드 (메클로레타민, 시클로포스파미드 및 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민 및 메틸멜라민 (헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬 술포네이트-부술판, 니트로소우레아 (카르무스틴 (BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-다카르바지닌 (DTIC); 항증식성/항유사분열 항대사물, 예컨대, 폴산 유사체 (메토트렉세이트); 백금 배위 착물 (시스플라틴, 카르보플라틴), 프로카르바진, 히드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체 (에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타미드, 닐루타미드) 및 아로마타제 억제제 (레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제 (헤파린, 합성 헤파린 염, 및 트롬빈의 다른 억제제); 섬유소용해물질 (예컨대, 조직 플라스미노겐 활성제, 스트렙토키나제 및 유로키나제), 아스피린, 디피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압시시맙; 항이동제; 항분비제 (브레펠딘); 면역억제제 (시클로스포린, 타크롤리무스 (FK-506), 시로리무스 (라파마이신), 아자티오프린, 미코페놀레이트 모페틸); 항혈관신생 화합물 (예를 들어, TNP-470, 게니스테인, 베바시주맙) 및 성장 인자 억제제 (예를 들어, 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 억제제); 안지오텐신 수용체 차단제; 산화질소 공여자; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 항체 (트라스투주맙); 세포 주기 억제제 및 분화 유도제 (트레티노인); AKT 억제제 (예컨대 MK-2206 2HCl, 페리포신 (KRX-0401), GSK690693, 이파타세르팁 (GDC-0068), AZD5363, 우프로세르팁, 아푸레세르팁, 또는 트리시리빈); mTOR 억제제, 토포이소머라제 억제제 (독소루비신 (아드리아마이신), 암사크린, 캄포테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신, 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코르티코스테로이드제 (코르티손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 및 프레드니솔론); 성장 인자 신호 전달 키나제 억제제; 미토콘드리아 기능이상 유도제 및 카스파제 활성화제; 및 크로마틴 파괴제를 포함한다.
추가의 유용한 작용제에 관한 예에 대해서는 또한 문헌 [Physician's Desk Reference, 59.sup.th edition, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.]; [Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.]; [Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill, NY]; [Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J.]을 참조한다.
C. 항종양 항체와 조합된 ACTR-T 세포를 사용한 고형 종양의 치료 요법
본원에 기재된 방법은 또한 적어도 부분적으로 ACTR (예를 들어, 서열식별번호: 9의 ACTR)을 발현하는 면역 세포 및 항종양 항체 (예를 들어, 리툭시맙 또는 트라스투주맙)의 조합이 종양 항원 예컨대 CD20 또는 HER2를 발현하는 표적 암 세포에 결합하는 항체에 반응하여 면역 세포의 증식 및 활성화를 발생시키고, 증식 및 활성화가 항체-의존성이고 자기-제한적이라는 발견에 기초한다. 항종양 항체 (예를 들어, 리툭시맙 또는 트라스투주맙)에 대한 적절한 노출에 대한 의존성은 ACTR을 발현하는 면역 세포의 활성이 항체 용량 및 투여 스케줄에 의해 조정되어 이전에 사용된 CAR T 세포에 비해 본원에 기재된 방법의 이점을 제공할 수 있다.
따라서, 본 개시내용은 또한 고형 종양 (예를 들어, 림프종, 특히, 재발성 및/또는 불응성 림프종, 또는 HER2+ 암 예컨대 HER2+ 유방암, 위암, 및 식도암)을 치료하기 위해 ACTR-T 세포 및 항종양 (예를 들어, 항-CD20 또는 항-HER2) 항체의 조합을 사용하는 치료 요법을 제공한다. 이 치료에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 조건화 요법 (예를 들어, 림프구고갈 요법)에 이어서, 항종양 항체 (예를 들어, 항-CD20 항체 예컨대 리툭시맙 또는 항-HER2 항체 예컨대 트라스투주맙)의 투여 및 ACTR을 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 세포)의 주입을 포함하는 조합 항종양 항체 (예를 들어, 항-CD20 항체 또는 항-HER2 항체)/ACTR-T 세포 요법에 적용될 수 있다. 하기는 CD28 공동-자극 도메인을 갖는 ACTR 폴리펩티드 (예를 들어, 서열식별번호: 9)를 발현하는 T 세포 및 항-CD20 항체 (예를 들어, 리툭시맙)를 사용하는 예시적 및 비제한적 예이다.
치료에 적합한 대상체는 상용 의료 실시에 의해 확인될 수 있다. 이러한 대상체는 CD20+ 림프종, 특히, 재발성 또는 불응성 CD20+ 림프종을 갖는 인간 환자일 수 있다. 림프종은 림프 세포로부터 발생한 혈액 세포 종양의 군을 지칭한다. 호지킨 림프종 및 비-호지킨 림프종은 2가지 주요 유형의 림프종이다. 림프종은 림프종에 대한 치료를 받은 후에 림프종 세포가 대상체의 골수에 존재하는 경우에 "불응성"인 것으로 간주될 수 있다. 대안적으로, 림프종은 림프종 세포의 복귀가 골수에서 검출되고 림프종의 완화 후 정상 혈액 세포의 수가 감소된 경우에 "재발성"인 것으로 간주된다. 일부 실시양태에서, 재발성 또는 불응성 CD20+ 림프종은 비-호지킨 림프종이다. 일부 실시양태에서, CD20+ B-세포 림프종은 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL), 외투 세포 림프종 (MCL), 원발성 종격 B 세포 림프종 (PMBCL), 등급 3b 여포성 림프종 (Gr3b-FL) 또는 변형된 조직학 여포성 림프종 (TH-FL)이다.
항-CD20/ACTR 치료 전에, 대상체 예컨대 인간 고형 종양 (예를 들어, 림프종) 환자는 조건화 요법, 예컨대 대상체의 내인성 림프구를 감소 또는 고갈시키기 위한 림프구고갈 요법에 적용될 수 있다.
림프구고갈은 통상적으로 면역이식 및 면역요법 전에 사용되는, 내인성 림프구 및/또는 T 세포의 파괴를 지칭한다. 림프구고갈은 조사 및/또는 화학요법에 의해 달성될 수 있다. "림프구고갈제"는 대상체에게 투여되는 경우에 내인성 림프구 및/또는 T 세포를 감소시키거나, 고갈시키거나 또는 제거할 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 림프구고갈제는 작용제의 투여 전의 림프구의 수와 비교하여 림프구의 수를 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 96%, 97%, 98%, 또는 적어도 99%만큼 감소시키는 데 효과적인 양으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 림프구고갈제는 대상체에서의 림프구의 수가 검출 한계 미만이도록 림프구의 수를 감소시키는 데 효과적인 양으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 적어도 1종 (예를 들어, 2, 3, 4, 5종 또는 그 초과)의 림프구고갈제를 투여받는다. 일부 실시양태에서, 림프구고갈제는 림프구를 특이적으로 사멸시키는 세포독성제이다. 림프구고갈제의 예는 비제한적으로 플루다라빈, 시클로포스파미드, 벤다무스틴, 5-플루오로우라실, 겜시타빈, 메토트렉세이트, 다카르바진, 멜팔란, 독소루비신, 빈블라스틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 도세탁셀, 이리노테칸, 에톱시드 포스페이트, 미톡산트론, 클라드리빈, 데니류킨 디프티톡스, 또는 DAB-IL-2를 포함한다. 일부 경우에, 림프구고갈제는 저용량 조사와 동반될 수 있다. 조건화 요법의 림프구고갈 효과는 상용 실시를 통해 모니터링될 수 있다.
일부 실시양태에서, 림프구고갈 요법은 1종 이상의 림프구고갈제, 예를 들어, 플루다라빈 및 시클로포스파미드를 포함한다. 본원에 기재된 방법에 의해 치료될 대상체는 조건화 단계에서 적합한 기간 (예를 들어, 2-5 일) 동안 1종 이상의 림프구고갈제의 다수회 용량을 받을 수 있다.
조건화 요법 (림프구고갈 요법) 후, 대상체는 항-CD20 항체 예컨대 리툭시맙의 투여 및 ACTR을 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 세포)의 주입을 포함하는 항-CD20/ACTR 치료 요법에 적용된다.
항-CD20 치료는 ACTR-발현 면역 세포의 치료 전에 본원에 기재된 바와 같이 대상체에 대해 수행될 수 있다. CD-20은 모든 단계의 B 세포의 표면 상에 발현된 B 림프구 항원이다. CD20 양성 세포는 호지킨병, 골수종 및 흉선종의 사례에서 발견된다. 인간 CD20은 MS4A1 유전자에 의해 코딩된다. 관련 기술분야에 공지된 임의의 항-CD20 항체는 본원에 제공된 방법에 사용될 수 있다. 항-CD20 항체는 CD20 분자, 예를 들어, B 세포의 표면 상에 발현된 CD20 분자에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 한 예에서, 항-CD20 항체는 리툭시맙이다. 의약 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 통상적인 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 항-CD20 항체-함유 제약 조성물을 투여하는 데 사용될 수 있다. 이 조성물은 또한 다른 통상적인 경로를 통해, 예를 들어, 비경구로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 용어 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 동맥내, 활막내, 흉골내, 척수강내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기술을 포함한다.
항-CD20 치료 후, 대상체는 예를 들어 주입을 통해, ACTR-발현 면역 세포 예컨대 T 세포를 제공받는다. ACTR을 발현하는 T 세포는 임의의 치료 유효 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. 일련의 비-제한적 예로서, ACTR을 발현하는 T 세포는 40 x 106개 세포, 80 x 106개 세포, 150 x 106개 세포, 또는 300 x 106개 세포의 용량으로 대상체에게 투여될 수 있다. ACTR을 발현하는 T 세포의 1회 또는 1회 초과 용량 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7회 용량)이 동일한 대상체에게 투여될 수 있다.
본원에 기재된 ACTR 구축물 중 임의의 것이 이 방법에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 이 치료에 사용된 ACTR 구축물은 Fc 수용체 예컨대 CD16 (예를 들어, CD16V 이소형)의 세포외 리간드 결합 도메인, CD28의 힌지 도메인, CD28의 막횡단 도메인, CD28의 공동-자극 도메인, 및 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 특정한 예에서, ACTR 구축물은 서열식별번호: 9일 수 있다.
ACTR-T 세포 치료 후, 항-CD20 치료의 1회 이상의 사이클이 필요한 경우 수행될 수 있고, 이는 의사에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 항-CD20 항체 치료의 1회의 추가의 사이클은 ACTR-T 세포 치료 후에 수행될 수 있다. 용량-제한 독성 (DLT) 평가는 대상체에 대해 수행될 수 있다. 이어서, 대상체는 또 다른 사이클의 항-CD20 항체 치료에 이어서 반응 평가에 적용될 수 있다. 항-CD20 항체 치료는 질환 진행이 관찰될 때까지 추가의 21일 동안 계속될 수 있다.
도 22는 리툭시맙과 조합된 ACTR T 세포를 사용하여 재발성 또는 불응성 CD20+ B 세포 림프종을 갖는 환자를 치료하기 위한 예시적인 치료 스케줄을 도시하는 그래프이다. 하기 조직학적 하위유형 중 1종의 조직학적으로 확인된 재발성 또는 불응성 CD20+ B 세포 림프종을 갖는 대상체가 적격일 수 있다: DLBCL, MCL, PMBCL, Gr3b-FL, TH-FL.
본원에 기재된 방법의 효능은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있고, 숙련된 의료 전문가에게 명백할 것이다. 예를 들어, 항체-기반 면역요법의 효능은 대상체의 생존 또는 대상체 또는 그의 조직 또는 샘플에서의 암 부담에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체-기반 면역요법은 대상체에서의 요법 (예를 들어, 항-CD20 항체 및 ACTR을 발현하는 면역 세포의 투여)의 안전성 또는 독성에 기초하여, 예를 들어 대상체의 전반적 건강 및/또는 유해 사건 또는 심각한 유해 사건의 존재에 의해 평가된다.
D. 활성화된 T 세포의 항원을 수반하는 질환의 치료
전통적인 CAR-T 요법은 세포 표면 항원에 특이적인 CAR 구축물을 사용함으로써 이러한 항원을 발현하는 병리학적 세포를 제거하는 것을 수반한다. CAR-T 세포가 활성화된 T 세포에 또한 제시되는 표면 항원, 예를 들어, CD5, CD38, 또는 CD7을 표적화하는 경우에, 이러한 CAR-T 세포의 시험관내 확장은 활성화된 CAR-T 세포가 또한 이러한 표면 항원을 발현하고 다른 CAR-T 세포에 의해 사멸될 것이기 때문에 (동족살해 효과) 손상될 것이다. 따라서, CAR-T 요법의 개발은 그것이 표적화하는 세포 항원에 의해 제한된다.
ACTR-T 요법은 이러한 항원 제한을 갖지 않는다. ACTR-T 세포는 병리학적 세포를 직접적으로 표적화하지 않고, 항체를 중간체로서 사용한다. 따라서, ACTR-T 세포의 시험관내 확장은 ACTR-T 세포가 표적화하는 항원의 유형에 제한되지 않는다.
따라서, 본 개시내용은 또한 활성화된 T 세포의 표면 상에 발현된 항원에 특이적인 항체; 및 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR)를 발현하는 T 세포의 조합 사용을 수반하는, 대상체에서 세포독성을 유도하는 방법을 제공한다. 이 방법은 활성화된 T 세포에 또한 제시되는 표면 항원을 발현하는 세포를 수반하는 질환의 치료에서 유익할 것이다.
임의의 ACTR 구축물, 예를 들어, 관련 기술분야에 공지되거나 또는 본원에 개시된 것들이 이 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어, 이 방법에 사용하기 위한 ACTR 구축물은 (a) Fc 결합 도메인; (b) 막횡단 도메인; (c) 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인; 및 (d) 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있으며, 여기서 (c) 또는 (d)는 키메라 수용체의 C-말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, ACTR은 (a)와 (b) 사이에 위치할 수 있는 힌지 도메인을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 기재된 Fc-결합 도메인, 막횡단 도메인, 세포질 신호전달 도메인 및/또는 힌지 도메인 중 임의의 것은 이 방법에 사용하기 위한 ACTR을 구축하는 데 사용될 수 있다.
상기 기재된 CD28의 공동-자극 도메인에 더하여, 다른 공동-자극 도메인이 또한 이 방법에 사용하기 위한 ACTR 구축물을 제조하는 데 사용될 수 있다. 예는 비제한적으로 B7/CD28 패밀리의 구성원 (예를 들어, B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD-1, PD-L2/B7-DC, 및 PDCD6); TNF 슈퍼패밀리의 구성원 (예를 들어, 4-1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB 리간드/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 리간드/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 리간드/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 리간드/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR 리간드/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, 림포톡신-알파/TNF-베타, OX40/TNFRSF4, OX40 리간드/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-알파, 및 TNF RII/TNFRSF1B); SLAM 패밀리의 구성원 (예를 들어, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6, 및 SLAM/CD150); 및 임의의 다른 공동-자극 분자, 예컨대, CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA 부류 I, HLA-DR, 이카로스, 인테그린 알파 4/CD49d, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, 덱틴-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, 림프구 기능 연관 항원-1 (LFA-1), 및 NKG2C를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, ICOS, CD27, GITR, HVEM, TIM1, LFA1(CD11a) 또는 CD2, 또는 그의 임의의 변이체의 것이다.
대상체에서 세포독성을 유도하는 방법에서 사용하기 위한 예시적인 ACTR 구축물은 예를 들어 본 발명의 설명 및 도면 (예를 들어, 서열식별번호: 9)에서 찾아볼 수 있거나 또는 이러한 목적을 위해 본원에 참조로 포함된 국제 특허 출원 번호 PCT/US2015/049126에서 찾아볼 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포독성을 유도하는 방법에 사용된 ACTR-T 세포는 예를 들어 본원에 기재된 방법을 따라 시험관내에서 확장된다.
T 세포의 표면 상에 발현된 항원에 특이적인 항체는 T 세포의 표면 상에 발현된 임의의 항원에 대한 항체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 CD38 또는 CD7에 결합할 수 있다. 또 다른 일련의 비제한적 예로서, 항체는 CD2, CD3, 또는 CD5에 결합할 수 있다. T 세포의 표면 상에 발현된 항원에 결합하는 항체는 다라투무맙, SAR650984, 시플리주맙, BTI-322, 오텔릭시주맙, 테플리주맙, 비실리주맙, 졸리모맙 아리톡스, 텔리모맙 아리톡스를 포함할 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.
IV. 치료 용도를 위한 키트
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 조성물의 사용을 위한 키트를 제공한다. 예를 들어, 본 개시내용은 또한 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 증진시키고 항체-기반 면역요법을 증진시키는 데 있어서 항체, 및 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR) 구축물을 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 림프구 또는 NK 세포)의 집단의 사용을 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제1 제약 조성물, 및 본원에 기재된 것과 같은 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR) 구축물 예컨대 발현하는 T 림프구 및/또는 NK 세포의 집단을 포함하는 제2 제약 조성물을 포함하는 1개 이상의 용기를 포함할 수 있다. T 림프구 및/또는 NK 세포의 집단은 공동-자극 도메인 또는 공동-자극 도메인의 리간드를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 추가로 발현할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 키트는 시험관내에서 확장된 ACTR-T 세포, 및 활성화된 T 세포 상에 제시되는 세포 표면 항원에 특이적인 항체, 예를 들어, 항-CD5 항체, 항-CD38 항체 또는 항-CD7 항체를 포함한다. ACTR-T 세포는 관련 기술분야에 공지되거나 본원에 개시된 ACTR 구축물 중 임의의 것을 발현할 수 있다. 한 예에서, ACTR-T 세포는 ACTR 변이체 서열식별번호: 9를 발현한다.
일부 실시양태에서, 키트는 추가적으로 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 사용하기 위한 지침서를 포함할 수 있다. 포함된 지침서는 대상체에서 의도하는 활성, 예를 들어, ADCC 활성 증진 및/또는 항체-기반 면역요법의 효능 증진을 달성하기 위해 제1 및 제2 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것에 관한 설명을 포함할 수 있다. 키트는 대상체가 치료를 필요로 하는지 여부를 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 대상체를 선택하는 것에 관한 설명을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 지침서는 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1 및 제2 제약 조성물을 투여하는 것에 관한 설명을 포함한다.
본원에 기재된 제1 및 제2 제약 조성물의 용도에 관한 지침서는 일반적으로 의도하는 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄, 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에서 제공되는 지침서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 상의 서면 지침서이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 제약 조성물이 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데, 발병을 지연시키는 데, 및/또는 완화시키는 데 사용된다는 것을 나타낸다.
본원에 제공된 키트는 적합한 포장 내에 있다. 적합한 포장은 바이알, 보틀, 자, 가요성 포장 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치, 또는 주입 장치와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 제1 제약 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 본원에 기재된 바와 같은 항체이다. 제2 제약 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 본원에 기재된 바와 같은 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR) 구축물을 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 림프구 또는 NK 세포)의 집단이다.
키트는 임의로 추가의 성분 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 그와 회합된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
일반적 기술
달리 나타내지 않는 한, 본 개시내용의 실시는, 관련 기술분야의 기술 내에 있는 분자생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌 예컨대 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985≫; Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984≫; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986≫; Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986≫; and B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)]에 충분히 설명되어 있다.
추가의 상세설명 없이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명에 기초하여 본 개시내용을 최대한 이용할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 구체적 실시양태는 단지 예시적인 것이고, 어떠한 방식으로든 나머지 개시내용을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 인용된 모든 공개는 본원에 언급된 목적 또는 대상을 위해 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 표적 세포에 대한 ACTR-T 세포의 세포독성 검정.
표 3에서의 ACTR 변이체를 코딩하는 감마-레트로바이러스를 생성하였다. 이들 바이러스를 사용하여 1차 인간 T-세포를 감염시켜, 감염된 세포의 표면 상에 이들 ACTR 변이체를 발현하는 세포를 생성하였다. 세포를 후속적으로 반딧불이 루시페라제 및 CD20-표적화 리툭시맙을 구성적으로 발현하는 CD20-양성 Raji 표적 세포 또는 반딧불이 루시페라제 및 HER2-표적화 트라스투주맙을 구성적으로 발현하는 HER2-양성 HCC1954 세포와 함께 세포독성 검정에 사용하였다.
T-세포 (이펙터; E) 및 Raji 표적 세포 (표적; T)를 10% 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 200-μL 반응 부피로 상이한 농도의 리툭시맙 (0 - 10 μg/mL)의 존재 하에 4:1 이펙터-대-표적 비 (120,000개 이펙터 세포; 30,000개 표적 세포)로 인큐베이션하였다. 모든 반응은 이중으로 수행하였다. 반응물을 CO2 (5%) 인큐베이터에서 37℃에서 40 - 48시간 동안 인큐베이션하였다. 100-μL 부피의 상청액을 각각의 반응물로부터 제거하였다. 100-μL 부피의 브라이트-글로(Bright-Glo) 루시페라제 검정 시약 (프로메가(Promega); 위스콘신주 매디슨)을 나머지 시약에 첨가하고, 실온에서 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 발광을 엔비전(Envision) 다중표지 판독기 (퍼킨엘머(PerkinElmer), 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 측정하였다. 살아있는 세포의 백분율은 주어진 샘플의 발광 신호를 각각의 T-세포 유형에 대한 항체의 부재 하의 발광 신호로 나누고 100을 곱함으로써 결정하였다. 퍼센트 세포독성은 100에서 퍼센트 살아있는 세포를 감산함으로써 결정하였다.
별개의 실험에서, T-세포 (이펙터; E) 및 HCC1954 표적 세포 (표적; T)를 10% 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 200-μL 반응 부피로 상이한 농도의 트라스투주맙 (0 - 1 μg/mL)의 존재 하에 1:4 이펙터-대-표적 비 (30,000개 이펙터 세포; 30,000개 표적 세포)로 인큐베이션하였다. 모든 반응은 이중으로 수행하였다. 반응물을 CO2 (5%) 인큐베이터에서 37℃에서 20 - 24시간 동안 인큐베이션하였다. 루시페라제 검정을 수행하고, 발광을 측정하고, 퍼센트 세포독성을 상기와 같이 결정하였다.
표적 Raji 세포를 서열식별번호: 7, 8, 9 및 13의 변이체를 발현하는 ACTR T-세포, 및 증가하는 농도의 리툭시맙과 함께 인큐베이션한 경우에, 세포독성의 농도-의존성 증가가 관찰되었다 (도 1). 표적 HCC1954 세포를 서열식별번호: 7, 8, 9, 13 및 서열식별번호: 38/서열식별번호: 39의 변이체를 코딩하는 핵산을 발현하는 ACTR T-세포 및 증가하는 농도의 트라스투주맙과 함께 인큐베이션한 경우에, 세포독성의 농도-의존성 증가가 또한 관찰되었다 (도 2).
유사한 실험에서, 세포독성이 또한 세포주 둘 다에서 추가의 ACTR 변이체에서 관찰되었다. 퍼센트 세포독성을 항체 농도의 함수로서 플롯팅하고, 비선형 회귀 분석을 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism)으로 생성하고, EC50 값을 결정하는 데 사용하였다. 이들 실험에 대한 퍼센트 최대 세포독성 및 EC50은 하기 표 4에서 찾아볼 수 있다. CD28 공동자극 도메인을 포함하는 추가의 ACTR 변이체를 또한 평가하였다. C28 공동자극 도메인을 함유하는 ACTR 변이체는 Raji 표적 세포 및 리툭시맙에서의 EC50의 범위 (0.02 - 0.38 μg/mL) 및 HCC1954 표적 세포 및 트라스투주맙에서의 EC50의 범위 (0.003 - 0.09 μg/mL)를 입증한다. 이들 실험은 ACTR 변이체가 항체에 대한 동족 표적을 발현하는 세포주에 대해 항체-의존성 세포독성을 나타낸다는 것을 입증한다.
표 4: 상이한 ACTR 변이체에서의 세포독성
Figure pct00015
*n.d. = 결정되지 않음
**ACTR 구축물 서열식별번호: 38과 서열식별번호: 39는 트랜스로 발현됨
실시예 2: 표적 세포의 존재 하에 ACTR-T 세포에 의한 IL-2 시토카인 방출.
표 3에서의 ACTR 변이체를 코딩하는 감마-레트로바이러스를 생성하였다. 이들 바이러스를 사용하여 1차 인간 T-세포를 감염시켜, 감염된 세포의 표면 상에 이들 ACTR 변이체를 발현하는 세포를 생성하였다. 이들 세포를 후속적으로 CD20-양성 Raji 표적 세포 및 CD20-표적화 리툭시맙과 HER2-양성 HCC1954 표적 세포 및 HER2-표적화 트라스투주맙을 사용한 IL-2 방출 검정에 사용하였다. 모의 T-세포 (ACTR 변이체를 발현하지 않는 T-세포)를 이 실험에서 대조군으로서 사용하였다.
T-세포 (이펙터; E) 및 Raji 표적 세포 (표적; T)를 10% 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 100-μL 반응 부피로 상이한 농도의 리툭시맙 (0 - 10 μg/mL)의 존재 하에 4:1 이펙터-대-표적 비 (120,000개 이펙터 세포; 30,000개 표적 세포)로 인큐베이션하였다. 모든 반응은 이중으로 수행하였다. 반응물을 CO2 (5%) 인큐베이터에서 37℃에서 20 - 24시간 동안 인큐베이션하였다.
별개의 실험에서, T-세포 (이펙터; E) 및 HCC1954 표적 세포 (표적; T)를 10% 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 100-μL 반응 부피로 상이한 농도의 트라스투주맙 (0 - 1 μg/mL)의 존재 하에 1:4 이펙터-대-표적 비 (30,000개 이펙터 세포; 120,000개 표적 세포)로 인큐베이션하였다. 모든 반응은 이중으로 수행하였다. 반응물을 CO2 (5%) 인큐베이터에서 37℃에서 20 - 24시간 동안 인큐베이션하였다.
각각의 실험에 대해, 방출된 시토카인 IL-2의 양을 제조업체의 프로토콜에 따라 메소 스케일 디스커버리 V-플렉스(Meso Scale Discovery V-Plex) 인간 IL-2 키트를 사용하여 상청액으로부터 측정하였다. 간략하게, 염증유발 패널 1 캘리브레이터 블렌드, 술포-태그 검출 항체, 및 판독 완충제를 제조업체의 프로토콜에 따라 제조하였다. 공동-배양 상청액을 얼음 상에서 해동시키고, RP10 (10% 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640) 배지에서 희석시켜 검정의 선형 범위 내의 값을 달성하였다. 이어서, 염증유발 캘리브레이터 블렌드 또는 샘플 (50 μL)을 MSD 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 후속적으로 밀봉하고, 호일로 덮고, 실온 진탕기에서 2시간 동안 600 x g로 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 0.05% 트윈(Tween)-20을 함유하는 포스페이트 완충 염수 (PBST) 150 μL로 3회 세척한 후, 인간 IL-2 술포-태그 검출 항체 (25 μL)를 플레이트에 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 밀봉하고, 호일로 덮고, 실온 진탕기에서 2시간 동안 600 x g로 인큐베이션하였다. 플레이트를 150 μL PBST로 3회 세척하였다. 판독 완충제 (150 μL)를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 MSD 퀵플렉스(Quickplex) SQ 120 상에서 실행하였다.
미가공 데이터를 싱글 플렉스 IL-2 MSD 키트를 위해 생성된 플레이트 레이아웃을 사용하여 MSD 워크벤치에서 분석하였다. 표준 곡선을 분석된 각각의 플레이트에 대한 키트 로트와 매칭되도록 조정하였다. 광 유닛의 미가공 데이터를 염증유발 캘리브레이터 표준 곡선을 사용하여 시토카인 농도 (pg/mL)에 외삽하였다. 시토카인 데이터를 항체 농도의 함수로서 플롯팅하였다.
표적 Raji 세포를 서열식별번호: 7, 8, 9, 13 및 서열식별번호: 38/서열식별번호: 39의 변이체를 코딩하는 핵산을 발현하는 ACTR T-세포, 및 증가하는 농도의 리툭시맙과 함께 인큐베이션한 경우에, IL-2 방출의 항체-의존성 및 농도-의존성 증가가 관찰되었다 (도 3). 유사하게, 표적 HCC1954 세포를 서열식별번호: 7, 8, 9, 13 및 서열식별번호: 38/서열식별번호: 39의 변이체를 코딩하는 핵산을 발현하는 ACTR T-세포 및 증가하는 농도의 트라스투주맙과 함께 인큐베이션한 경우에, IL-2 방출의 농도-의존성 증가가 또한 관찰되었다 (도 4). 모의 T 세포는 IL-2 방출을 거의 또는 전혀 보여주지 않았다. 유사한 실험에서, IL-2 방출이 또한 세포주/항체 쌍 둘 다에서 추가의 ACTR 변이체에 대해 관찰되었으며, 이들 실험으로부터의 최대 IL-2 방출은 표 5에서 찾아볼 수 있다. C28 공동자극 도메인을 함유하는 ACTR 변이체는 Raji 표적 세포 및 리툭시맙 (280 - 3600 pg/mL)의 존재 하에 및 HCC1954 표적 세포 및 트라스투주맙 (50 - 700 pg/mL)의 존재 하에 최대 IL-2 방출의 범위를 입증한다. 이들 실험은 ACTR 변이체가 항체에 대한 동족 표적을 발현하는 세포주의 존재 하에 항체-의존성 시토카인 방출을 보여준다는 것을 입증한다.
표 5: ACTR 변이체를 발현하는 T 세포의 IL-2 방출
Figure pct00016
* ACTR 구축물 서열식별번호: 40과 서열식별번호: 39는 트랜스로 발현됨
**ACTR 구축물 서열식별번호: 38과 서열식별번호: 39는 트랜스로 발현됨
실시예 3: ACTR-T 세포의 증식.
표 3에서의 ACTR 변이체를 코딩하는 감마-레트로바이러스를 생성하였다. 이들 바이러스를 사용하여 1차 인간 T-세포를 감염시켜, 감염된 세포의 표면 상에 이들 ACTR 변이체를 발현하는 세포를 생성하였다. 이들 세포를 후속적으로 CD20-양성 Raji 표적 세포 및 CD20-표적화 리툭시맙과 함께 증식 검정에 사용하였다.
T-세포 및 표적 세포를 배양 배지 (10% 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지)에서 200-μL 반응 부피로 4 μg/mL 리툭시맙의 존재 하에 또는 첨가된 항체 없이 1:1 비 (각각 30,000개 세포)로 혼합하였다. 반응물을 CO2 (5%) 인큐베이터에서 37℃에서 7일 동안 인큐베이션하고; 70 μL의 배양 배지를 제4일에 각각의 반응물에 첨가하였다. 세포를 원심분리에 의해 펠릿화하고, 포스페이트-완충 염수 (PBS)로 세척하고, 픽서블 바이어빌리티 다이 이플루오르450(Fixable Viability Dye eFluor450) (이바이오사이언스(eBioscience))으로 염색하였다. 세포를 소 혈청 알부민 및 아지드화나트륨을 함유하는 세포 염색 완충제로 2회 세척하였다 (바이오레전드(Biolegend)). 이어서, 세포를 항-CD16-알렉사-플루오르-647 (클론 3G8, 바이오레전드) 및 항-CD3-알렉사-플루오르-488 (클론 OKT3, 바이오레전드) 항체로 염색하였다. 이어서, 세포를 세포 염색 완충제에서 2회 세척한 후, 200 μL의 염색 완충제 중에 재현탁시켰다.
염색된 세포를 애튠(Attune)™ NxT 음향 포커싱 세포측정기를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 단일, 살아있는, CD3-양성 T-세포를 사용하여 증식을 평가하였다. 제0일 대비 제7일의 세포 카운트의 배수 증가를 조건의 함수로서 플롯팅하였다 (도 5). 표적 Raji 세포를 서열식별번호: 7, 8, 9, 13 및 서열식별번호: 38/서열식별번호: 39의 변이체를 코딩하는 핵산을 발현하는 ACTR T-세포 및 리툭시맙과 함께 인큐베이션한 경우에, 항체-의존성 T-세포 증식을 나타내는 CD3+ 세포의 수의 항체-의존성 증가가 관찰되었다 (도 5). 추가의 실험에서, T-세포 증식을 다수의 상이한 ACTR 변이체를 발현하는 T-세포와 함께 상기 기재된 것들과 유사한 조건 하에 5 μg/mL 리툭시맙의 존재 하에 평가하였다. 항체가 없는 반응물 대비 CD3+ 세포의 수의 증가를 결정하였다. 이들 ACTR 변이체는 항체-의존성 증식을 보여주었다 (표 6). CD28 공동자극 도메인을 코딩하는 추가의 ACTR 변이체를 또한 평가하였다. C28 공동자극 도메인을 함유하는 ACTR 변이체는 항체가 없는 반응물 대비 CD3+ 세포의 수의 범위 증가를 입증한다 (2.5 - 15배). 이들 실험은 ACTR 변이체가 항체에 대한 동족 표적을 발현하는 세포주의 존재 하에 항체-의존성 증식을 보여준다는 것을 입증한다.
표 6: 상이한 ACTR 변이체를 발현하는 T 세포의 항체-의존성 증식
Figure pct00017
* ACTR 구축물 서열식별번호: 40과 서열식별번호: 39는 트랜스로 발현됨
**ACTR 구축물 서열식별번호: 38과 서열식별번호: 39는 트랜스로 발현됨
실시예 4: Raji 종양 동물 모델에서의 ACTR-T 세포의 항종양 효과.
Raji 모델
Raji 세포주 (ATCC, 카탈로그 번호 CCL-86)는 정맥내, 복강내 또는 피하 이식 시에 면역 손상된 마우스에서 종양을 형성하는 인간 버킷 림프종 세포주이다. 이 실시예에서의 실험을 위해, Raji 세포를 레디펙트(RediFect) FFLuc-퓨로마이신 (퍼킨 엘머) 렌티바이러스 입자를 사용하여 반딧불이 루시페라제로 형질도입하고, 37℃, 5% CO2-가습 챔버에서 10% 열-불활성화된 소 태아 혈청 및 1 μg/mL 퓨로마이신으로 보충된 RPMI-1640 배지에서 유지하였다. 종양 세포 생존율은 접종을 위한 수거 시에 98%였다.
6주령의 암컷 NSG™ (NOD scid 감마, NOD.Cg-Prkdcscid IL-2rgtm1Wjl/SzJ, 계통 005557) 마우스를 더 잭슨 래보러토리(The Jackson Laboratory) (메인주 바 하버)로부터 수득하였다. 기능적 T, B 및 NK 세포가 결여된 이들 마우스는 특히 인간 종양의 생착에 매우 적합하고, 인간 T 세포 예컨대 ACTR T 세포로 효율적으로 재구성된다. 수용 시에, 마우스를 연구 개시 전 8일 동안 순응시켰다. 마우스는 도착 시에 또는 연구 개시 전에 질환 또는 질병의 징후를 나타내지 않았다. 동물을 자기-충족되는 마이크로-아이솔레이터 랙에서의 개별 환기 이노비브 케이지에서 케이지당 5마리로 수용하였다.
정맥내 Raji 이종이식편 모델을 암컷 NSG™ 마우스 내로 루시페라제-발현 Raji 세포의 현탁액을 접종함으로써 발생시켰다. 0.1 mL DPBS 중에 현탁된 Raji 세포 (마우스당 1 x 105개 세포)를 외측 꼬리 정맥으로 정맥내로 주사하였다. 마우스는 주로 골수 (척주, 두개골, 장골)에 위치하는 검출가능한 종양을 6일 내에 발생시켰다.
마우스에게 100 μg의 리툭시맙 (100 μL 부피)을 제4, 11, 18 및 25일에 복강내로 투여하였다. 제5 및 12일에, 마우스에게 100 μL의 1 x 107개의 T 세포 (ACTR 변이체 서열식별번호: 7, 9, 13 및 서열식별번호: 38/서열식별번호: 39를 코딩하는 핵산을 발현하는 T-세포)를 정맥내로 투여하였다. 마우스의 한 군에게 CD19-표적화 CAR (항-CD19 scFv, CD8 힌지 및 막횡단 도메인, 4-1BB 공동자극 도메인, CD3-제타 신호전달 도메인)을 발현하는 T 세포를 투여하였고; 이들 마우스에게 리툭시맙을 투여하지는 않았다. 세포 접종후 제6일에 시작하여, 종양 부담을 IVIS 스펙트럼 영상화 시스템 (퍼킨 엘머)을 사용하여 매주 2회 생물발광 영상화에 의해 모니터링하였다. 마우스를 그의 건강을 모니터링하기 위해 매주 2회 칭량하였다. 평균 광자/초를 시간에 대해 플롯팅하였다 (도 6). 안락사 기준은 체중 감소 또는 증가 및 임상 증상, 특히 뒷다리 마비에 기초하였다. 마우스를 연구 종결 시 (제55일)까지 생존에 대해 추적하였다.
처리군은 비히클 대조군, 리툭시맙 항-CD20 항체 단독 (로슈, 100 μg/마우스 또는 5 mg/kg), ACTR 변이체 단독, CD19 CAR, 또는 리툭시맙 및 ACTR 변이체 T 세포의 조합으로 처리된 마우스를 포함하였다.
대조군 마우스는 제18 또는 19일에 질환 부담으로 사망하였다. 리툭시맙 처리 단독은 종양 부담의 감소를 유도하고, 24일까지 마우스의 생존을 연장시켰다. ACTR T 세포 단독으로의 처리는 시험된 ACTR 변이체와 관계없이 종양 부담 또는 생존의 유의한 감소를 제공하지 않았다. CD19 CAR로의 처리는 리툭시맙 단독에서 관찰된 것과 유사한 종양 부담의 감소를 발생시켰다.
리툭시맙과 조합된 ACTR 변이체로의 처리는 비히클 대조군, ACTR 변이체 단독, 또는 리툭시맙 단독보다 더 큰 종양 성장 억제를 발생시켰다. 리툭시맙 단독에 비한 차이는 모든 ACTR 변이체에 대해 통계적 유의성 (2원 ANOVA와 Sidak 다중 비교 시험)에 도달하였다 (7, p<0.0001; 9, p<0.01; 13, p<0.0001; 및 18, p<0.0001) (도 6).
실시예 5: 반복 자극 증식 검정
ACTR-T 세포 또는 CD19 CAR T 세포를 검정을 위해 1 x 106개 세포/mL로 RPMI-10 배지 (RPMI1640 + 10% FBS)에서 생성 및 제조하였다. ACTR 및 CAR 발현을 유동 세포측정법 (하기 참조)에 의해 결정하고, 모든 변이체에 대해 ACTR/CAR 발현을 정규화하기 위해 공여자-매칭된 모의 T-세포에 의해 30% ACTR/CAR 양성 세포로 조정하였다.
Raji 종양 세포를 수거하고, 카운팅하고, RPMI-10 배지에 의해 2 x 106개 세포/mL로 조정하였다. 리툭시맙 항체를 4 μg/mL로 희석하여 최종 검정 내 항체 농도가 1 μg/mL가 되게 하였다. T-세포 (550 μL)를 24 웰 플레이트에 첨가하고, 이어서 1:1의 이펙터:표적 (E:T) 비를 위해 275 μL의 Raji 세포, 및 275 μL의 리툭시맙 또는 배지 대조군을 첨가하였다. 세포를 잘 혼합하고, 70 μL 분취물을 유동 세포측정 분석을 위해 취하였다 (기준선 카운트). 플레이트를 37℃에서 3-4일 동안 인큐베이션하여 ACTR 변이체 T 세포 또는 CAR-T 세포에 의한 표적 세포 사멸 및 T 세포 증식을 가능하게 하였다.
제3일 또는 제4일에, 각각의 배양물의 분취물 (70 μL)을 분리하고, T 세포 및 종양 세포 카운트에 대해 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 나머지 배양물을 원심분리 (500 x g, 5분 동안)에 의해 펠릿화하고, 미리 한정된 부피의 신선한 배지 중에 재현탁시켰다. 3-4일 인큐베이션 기간 동안 확장된 T 세포를 함유하는 배양물을 대략 1 x 106개 세포/mL로 재조정하고, 12-웰 플레이트로 옮겼다. 비-증식 배양물을 1-1.25 mL의 신선한 배지 중에 재현탁시키고, 24-웰 플레이트에서 유지하였다. 신선한 Raji 세포를 4 x 106개 세포/mL로 제조하고, 필요한 경우에 적절한 부피를 혼합된 T 세포/종양 세포 배양물에 첨가하여 E:T 세포 비를 다시 1:1로 만들었다. 리툭시맙을 자극된 웰에 1 μg/mL의 최종 농도로 첨가하였으며, 배지 단독은 대조군 웰에 첨가하였다. 배양물을 다시 3 - 4일 동안 인큐베이션하였다. 이러한 재자극 과정을 총 4회의 자극 라운드 동안 3-4일마다 반복하였다.
제14일에, 모든 배양물을 수거하고, T 세포 (CD3+) 및 종양 세포 (CD3-) 카운트에 대해 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 누적 T 세포 확장 및 종양 사멸을 시간 경과에 따라 분석하였다.
유동 세포측정 분석을 위해, 각각의 배양물을 철저히 혼합하고, 70 μL를 분리하고 96-웰 둥근-바닥 폴리프로필렌 플레이트로 옮겼다. 25 μL의 2개의 분취물을 각각 150 μL의 MACS 완충제 (밀테니(Miltenyi)) 중에서 항-인간 CD3-알렉사플루오르(AlexaFluor)488 (T 세포 마커; 바이오레전드) 및 항-인간-CD16-알렉사플루오르647 (ACTR 마커; 클론 3G8, 바이오레전드) 항체로 염색하였다. 샘플을 혼합하고, 4℃에서, 암실에서, 15분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 샘플을 25 μL의 MACS 완충제 중에서 아이오딘화프로피듐 (PI) 용액과 함께 인큐베이션하고, 유동 세포측정기 (애튠 NxT) 상에서 분석하였다. 각각의 샘플에 대해 100-μL 부피를 획득하였다. 유동 세포측정 데이터 분석을 플로우조(FlowJo) (트리스타(TreeStar))를 사용하여 수행하였다. 살아있는, 단일 세포 집단을 사용하여 살아있는 CD3+ T 세포 및 CD3-음성 Raji 세포의 절대 카운트를 추가로 결정하였다.
T 세포의 출발 수 대비 T 세포 수의 배수 변화를 시간의 함수로서 플롯팅하였다 (도 7). 모든 시험된 ACTR 변이체는 표적 세포 및 리툭시맙의 존재 하에 증식되었다. 모든 ACTR T 세포 변이체는 CD19 CAR-T 세포와 대등한 ACTR 변이체 서열식별번호: 8을 제외하고 CD19 CAR-T 세포보다 더 증식되었다. ACTR T 세포 변이체는 항체-옵소닌화된 표적 세포로의 급속 재자극 하에 14일 검정 기간에 걸쳐 3 - 8배 확장되었으며, ACTR 변이체 서열식별번호: 9는 가장 큰 증식을 보여주었다. 항체의 부재 하에 표적 세포로 자극된 ACTR T 세포는 확장되지 않았으며, 표적 세포에 의해 과다성장되었다 (데이터는 제시되지 않음).
이전 시점에서의 표적 세포의 수 대비 Raji 표적 세포 수의 배수 변화를 시간의 함수로서 플롯팅하였다 (도 8, 패널 A 및 B). Raji 표적 세포는 제1 자극 후에 계속해서 성장하였다. ACTR 변이체 및 CD19 CAR T 세포는 제2 라운드의 자극 후에 출발하여 다양한 정도로 Raji 표적 세포를 제어하고 사멸시켰다. Raji 표적 세포는 ACTR 변이체의 존재 하에 리툭시맙 항체의 부재 하에 계속해서 성장하였다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 6: 시험관내 및 생체내에서 리툭시맙과 조합된 ACTR 변이체 서열식별번호: 9를 발현하는 T 세포와 CD20-발현 종양 세포주의 사용
본 실시예는 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 (본 실시예 전반에 걸쳐 ACTR로 지칭됨)를 발현하는 T 세포가 리툭시맙과 조합된 경우에 시험관내 항종양 세포 활성 및 생체내 공격성 CD20+ 림프종의 종양 퇴행을 성공적으로 매개하였다는 것을 입증한다. 이 구축물을 사용한 실험의 세부사항 및 결과는 하기에 제시된다.
ACTR의 초기 시험
ACTR을 발현하는 T 세포의 활성을 반복 자극 "스트레스 시험"에서 분석하였으며, 여기서 ACTR 변이체 발현 T 세포를 실시예 5에 기재된 것과 유사한 절차를 사용하여 3일마다 신선한 CD20+ Ramos 종양 세포 및 리툭시맙으로 챌린징하였다. ACTR T 세포는 계속해서 증식하였고 3회의 반복 자극 후에 표적 Ramos 세포에 대해 세포독성이었으며, 제4 자극 후에 증식성 및 세포독성 능력을 잃기 시작하였다 (도 9).
시토카인 방출 (IL-2) 및 증식 검정을 혈액 및 고형 종양 질환 환경에서 발현되는 6종의 상이한 표적에 특이적인 항체 및 동족 표적을 발현하는 세포주를 사용하여 실시예 2 및 3에 기재된 것과 유사한 방식으로 수행하였다. T 세포 활성은, IL-2 방출 및 증식 둘 다에 의해 측정시, 상이한 적응증을 나타내는 복수의 세포주에 걸쳐 입증되었다 (도 10).
리툭시맙은 CD20+ 종양 세포 및 ACTR T 세포에 결합한다
Raji, Daudi, 및 RL CD20+ 림프종 종양 세포에 대한 리툭시맙 결합을 세포를 리툭시맙 및 형광색소-표지된 항-인간 Fc 검출 항체로 염색함으로써 유동 세포측정법에 의해 분석하였다 (도 11, 패널 A). CD20-음성 세포주 K562에 대해 특이적 결합이 관찰되지 않았다. ACTR T 세포에 결합하는 리툭시맙의 능력을 또한 상이한 농도의 리툭시맙을 ACTR-발현 T 세포와 함께 인큐베이션함으로써 평가하였다. 결합된 리툭시맙을 형광색소-표지된 항-인간 Fc 항체로 검출하고 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 리툭시맙은 농도-의존성 방식으로 ACTR-발현 T 세포에 결합한다 (도 11, 패널 B). ACTR T 세포에 대한 리툭시맙의 겉보기 친화도는 689 ±82 nM이다.
이론에 얽매이지는 않지만, ACTR-T 세포 활성화의 제안된 작용 메카니즘에 대한 가설 모델이 도 12에 제시된다. 저친화도 천연 T 세포 수용체 및 Fc 수용체와 유사하게, ACTR T 세포는 ACTR이 종양 세포의 표면에 결합된 다중 리툭시맙 분자와 결속되는 경우에 구조적 결합력을 통해 활성화될 수 있다.
세포독성 검정을 1μg/mL 리툭시맙의 존재 하에 모의 (ACTR 없음) 및 ACTR-발현 T 세포 및 CD20+ 종양 세포를 사용하여 수행하였다. T 세포 및 표적 세포를 상이한 이펙터 (E) 대 표적 (T) 비로 혼합하고, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 반응을 세포 생존율 염료, 항-인간 CD3, 및 항-인간 CD19 항체로 염색하고, 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 퍼센트 세포독성은 T 세포, 표적 세포, 및 리툭시맙과의 반응물에서 살아있는 CD19+ 세포의 수를 T 세포가 없는 반응물 대조군에서의 살아있는 CD19+ 세포의 수로 나누고, 생성된 값을 1에서 감산한 다음, 100을 곱합으로써 결정하였다. 퍼센트 세포독성은 모의 세포 (도 13, 패널 A) 및 ACTR-발현 T 세포 (도 13, 패널 B)에서 상이한 E:T 비에 대해 표적 세포의 함수로서 플롯팅된다. 이들 실험의 결과는 모의 세포에서 세포독성이 거의 또는 전혀 관찰되지 않으므로 강건한 세포독성이 ACTR-의존성이고, 세포독성은 ACTR T 세포 용량에 의존성이라는 것을 입증하였다 (도 13, 패널 A 및 B). 유사한 실험을 다양한 농도의 리툭시맙에서 2:1 E:T 비로 ACTR T 세포 및 CD20+ 표적 세포를 사용하여 수행하였다. 상청액을 시토카인 분석을 위해 이들 반응물에서 분리하였다. ACTR T 세포는 CD20+ 종양 세포의 리툭시맙-용량-의존성 세포독성을 매개한다 (도 13, 패널 C).
상청액을 제조업체의 프로토콜에 따라 메소 스케일 디스커버리 V-플렉스 인간 IFN-γ 및 V-플렉스 인간 IL-2 키트를 사용하여 IFN-γ 및 IL-2에 대해 분석하였다. 간략하게, 염증유발 패널 1 캘리브레이터 블렌드, 술포-태그 검출 항체 및 판독 완충제를 제조업체의 프로토콜에 따라 제조하였다. 공동-배양 상청액을 얼음 상에서 해동시키고, RP10 (10% 소 태아 혈청을 갖는 RPMI 1640) 배지 중에서 희석시켜 검정의 선형 범위 내의 값을 달성하였다. 염증유발 캘리브레이터 블렌드 또는 샘플 (50 μL)을 MSD 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 호일로 덮고, 실온 진탕기 상에서 2시간 동안 600 x g로 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 150 μL 포스페이트 완충 염수로 3회 세척하였다. 인간 IFN-γ 또는 인간 IL-2 술포-태그 검출 항체 (25 μL)를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고, 호일로 덮고, 실온 진탕기 상에서 2시간 동안 600 x g로 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 150 μL 포스페이트 완충 염수로 3회 세척하였다. 판독 완충제 (150 μL)를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 MSD 퀵플렉스 SQ 120 상에서 실행하였다.
미가공 데이터를 단일 플렉스 IFN-γ 및 단일 플렉스 IL-2 MSD 키트에 대해 생성된 플레이트 레이아웃을 사용하여 MSD 워크벤치에서 분석하였다. 표준 곡선을 분석된 각각의 플레이트에 대해 키트 로트와 매칭되도록 조정하였다. 광 유닛의 미가공 데이터를 염증유발 캘리브레이터 표준 곡선을 사용하여 시토카인 농도 (pg/mL)에 외삽하였다. 시토카인 데이터를 항체 농도의 함수로서 플롯팅하였다 (도 14, 패널 A 및 B). 리툭시맙-농도 의존성 IL-2 및 IFN-γ 시토카인 방출이 ACTR-발현 T 세포에서 관찰되었다.
증식 검정을 증가하는 농도의 리툭시맙의 존재 하에 7일 동안 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 1:1 E:T 비로 ACTR-발현 T 세포 및 CD20+ 표적 세포 (Raji, Ramos, Daudi, RL)를 인큐베이션함으로써 수행하였다. 세포를 생존율 염료 및 항-CD3 항체로 염색하고 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 살아있는 CD3+ 세포는 리툭시맙 농도의 함수로서 플롯팅된다 (도 14, 패널 C). ACTR 발현 T 세포는 리툭시맙-의존성 및 항체-농도-의존성 방식으로 증식하는 것으로 밝혀졌다.
ACTR 활성의 특이성
세포독성, IL-2 생산, 및 T 세포 증식 검정을 CD20+ Ramos 세포 또는 CD20-음성 K562 세포 및 CD20-표적화 리툭시맙 또는 HER2-표적화 트라스투주맙의 존재 하에 모의 또는 ACTR T 세포를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 수행하였고; Ramos 및 K562 세포 둘 다는 HER2에 대해 음성이었다. 세포독성 및 IL-2 방출 실험을 2:1 E:T 비로 수행하고, 증식 실험을 1:1 E:T 비로 수행하였다. 항체를 4 μg/mL 최종 농도로 사용하였다. 이들 실험의 결과는 도 15 패널 A-C에 제시된다. 세포독성, IL-2 방출, 및 증식이 ACTR-발현 T 세포, 리툭시맙, 및 CD20+ 세포의 존재 하에 관찰되었고; 시험된 다른 반응 조건 중 임의의 것 하에 T 세포 활성이 거의 내지 전혀 관찰되지 않았다. 이들 실험은 ACTR T 세포 활성이 ACTR 발현 및 표적-결합된 항체에 의존성이라는 것을 입증한다.
ACTR 활성을 또한 비-표적화 IgG의 존재 하에 평가하였다. 이들 실험에서 모의 또는 ACTR-발현 T 세포를 CD20-발현 Raji 세포와 4:1 E:T 비로 혼합하였다. 세포를 1 μg/mL 리툭시맙 및 증가하는 농도의 혈청 중 비-표적화 인간 IgG (0 - 3.6 mg/mL)와 함께 인큐베이션하였다. IgG를 풀링된 인간 AB 혈청 및 IgG-고갈된 혈청을 혼합함으로써 적정하여 반응물 중 상이한 최종 IgG 농도를 달성하였다. 반응물을 24시간 동안 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. IFN-γ 방출을 상기 기재된 바와 같이 검정하였다. 모의 T 세포는 IL-2 방출을 거의 또는 전혀 보여주지 않았고; ACTR T 세포는 강건한 IL-2 방출을 보여주었으며, 이는 시험된 모든 비-표적화 IgG 농도에 걸쳐 유사하였다 (도 16). 이들 실험은 비-표적화 IgG가 항체-표적화된 ACTR 활성에 거의 내지 전혀 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다.
다양한 항체의 존재 하의 ACTR-T 세포의 활성화
토실리주맙은 시토카인 방출 증후군 (CRS)의 효과를 완화시키기 위해 T 세포 요법 치료 요법에 사용되는 항-IL6 수용체 (IL-6R) 항체이다. IL-6R-발현 세포의 존재 하의 토실리주맙의 ACTR 결속은 CRS와 연관된 독성을 악화시킬 수 있다. 이들 실험은 ACTR-발현 T 세포가 IL-6R-발현 세포의 존재 하에 토실리주맙과 생산적으로 결속되지 않는다는 것을 입증한다.
정상 면역 세포 및 다발성 골수종 세포주 NCI-H929 상의 IL-6R의 수용체 정량화를 유동 세포측정법에 의해 결정하였다 (도 17, 패널 A). 이들 실험은 NCI-H929 세포가 정상 면역 세포 대비 대등하거나 더 큰 수의 세포당 IL-6R을 발현한다는 것을 입증한다. 토실리주맙을 사용한 결합 검정을 ACTR-발현 T 세포에 대한 리툭시맙 결합에 대해 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 수행하였다. 토실리주맙은 용량-의존성 방식으로 ACTR-발현 T 세포에 결합하며, ACTR을 발현하지 않는 모의 T 세포는 토실리주맙에 대한 결합을 나타내지 않는다 (도 17, 패널 B).
세포독성 및 IL-2 방출 검정을 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 이들 실험을 위해 모의 또는 ACTR-발현 T 세포를 증가하는 농도의 토실리주맙 (0 - 25 μg/μL)의 존재 하에 4:1 E:T 비로 NCI-H929 세포와 함께 인큐베이션하였다. NCI-H929 세포를 또한 T 세포의 부재 하에 증가하는 농도의 토실리주맙과 함께 인큐베이션하였다. 대조군 실험을 ACTR T 세포, NCI-H929 표적 세포, 및 항-CD38 항체 다라투무맙 (0.5 μg/mL)을 사용하여 수행하였으며; NCI-H929 세포는 CD38을 발현한다. 이들 실험의 결과는 ACTR T 세포가 모의 T 세포에서 관찰된 것 또는 T 세포의 부재 하에서보다 IL-6R+ NCI-H929 세포 및 증가하는 농도의 토실리주맙의 존재 하에 세포독성을 매개하지 않았다는 것을 입증하였다 (도 18, 패널 A). 이들 실험의 결과는 또한 ACTR T 세포가 모의 T 세포에서 또는 T 세포의 부재 하에 관찰된 것과 유사하게 IL-6R+ NCI-H929 세포 및 증가하는 농도의 토실리주맙의 존재 하에 IL-2 방출을 매개하지 않았다는 것을 입증하였다 (도 18, 패널 B).
ACTR T 세포는 동일한 조건 하에 대조군 실험에서 NCI-H929 세포 및 항-CD38 항체 다라투무맙의 존재 하에 세포독성 및 시토카인 방출을 매개하는 것으로 밝혀졌다.
생체내 ACTR 활성
또 다른 실험에서, ACTR T 세포의 항종양 효능을 NSG™ (NOD scid 감마, NOD.Cg-Prkdcscid IL-2rgtm1Wjl/SzJ, 계통 005557) 마우스에서 공격성 Raji 이종이식편에서 검정하였다. Raji-luc 세포를 연구를 위해 해동시키고, 제한된 횟수의 계대배양 동안 배지에서 성장시켰다. Raji-luc 세포 (0.1 mL 무혈청 배지 중 마우스당 1 x 105개 세포)를 암컷 NSG 마우스의 외측 꼬리 정맥에 정맥내로 주사하였다. 세포 접종후 제4일에, 마우스를 처리군 (n=5)으로 무작위화하였다. 각 군에서의 개별 마우스를 귀 천자에 의해 식별하였다. 세포 접종후 제6일에 시작하여, 종양 부담을 IVIS 스펙트럼 (퍼킨 엘머)을 사용하여 생물발광 영상화에 의해 모니터링하였다. 마우스의 체중은 17.1 내지 23.5 (20.5 +/- 1.3, 평균 +/- SD) 그램 범위였다. 평균 종양 방사휘도 (광자/초) 및 체중 (그램)을 시간 경과에 따라 측정하고, 안락사 기준은 체중 감소 및 임상 증상에 기초하고 생물발광 컷-오프에 기초하지 않았다. 모든 동물 실험을 우눔 동물 실험 윤리 위원회 (IACUC)에 의해 승인받은 프로토콜에 따라 수행하였다. 모든 절차를 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 지침 (국립 연구 협의회)에 따라 수행하였다.
실험군은 비처리 (대조군), ACTR 단독, 용량당 20 μg, 50 μg, 또는 100 μg의 리툭시맙 단독, 및 ACTR + 용량당 20 μg, 50 μg, 또는 100 μg 리툭시맙의 리툭시맙이었다. CD19 CAR (4-1BB 공동자극 도메인 및 CD3-제타 신호전달 도메인에 연결된 항-CD19 scFv)을 발현하는 T 세포를 또한 이 실험에서 평가하였다. 리툭시맙을 받은 군에서, 항체를 먼저 종양 세포 접종 4일 후에 투여하고, 매주 총 4회 용량으로 투여하였다. ACTR T 세포를 받은 군에서, 1 x 107개 ACTR T 세포의 단일 용량을 제1 리툭시맙 투여 다음날인 제5일에 제공하였다. 처리된 마우스의 퍼센트 생존을 처리군 모두에 대한 시간의 함수로서 플롯팅하였다 (도 19). 항종양 효능은 강력하고 리툭시맙 용량-의존성이었다 (도 19).
유사한 실험은 ACTR + 리툭시맙 항종양 효능이 ACTR T 세포 용량-의존성이었음을 입증하였다. 실험군은 비처리 (대조군), 리툭시맙 단독, ACTR 단독 (2회 용량), ACTR (1회 용량) + 리툭시맙, 및 ACTR (2회 용량) + 리툭시맙이었다. 리툭시맙을 받은 군에서, 항체를 먼저 종양 세포 접종 4일 후에 투여하고, 매주 총 4회 용량으로 투여하였다. ACTR T 세포를 받은 군에서, 1 x 107개 ACTR T 세포의 단일 용량을 제1 리툭시맙 투여 다음날인 제5일에 제공하고; ACTR T 세포의 2회 용량을 받은 군을 1 x 107개 ACTR T 세포로 제12일에 다시 처리하였다. 퍼센트 생존을 시간의 함수로서 플롯팅하였다 (도 20). ACTR 및 리툭시맙 둘 다로 처리된 군은 증진된 생존에 의해 입증된 바와 같이 강건한 항종양 활성을 보여주었다. 생존은 1회 용량의 ACTR로 처리된 군 대비 2회 용량의 ACTR로 처리된 군의 경우에 더 컸으며, 이는 ACTR 활성이 용량-의존성이라는 것을 나타낸다.
비-호지킨 림프종 (NHL) 공여자로부터 제조된 T 세포에서의 ACTR 활성
ACTR을 코딩하는 감마 레트로바이러스를 3명의 고유 비-호지킨 림프종 (NHL) 공여자의 PBMC로부터 생성된 T 세포 내로 형질도입하고, T 세포 상의 ACTR의 표면 발현을 항-CD16 검출 항체를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 확인하였다 (도 21, 패널 A). IL-2 방출 및 증식 실험을 증가하는 농도의 리툭시맙의 존재 하에 1:1 E:T 비로 Raji 표적 세포를 사용하여 상기 기재된 것과 유사한 방식으로 수행하였다. NHL 공여자로부터 생성된 ACTR T 세포는 리툭시맙 농도-의존성 IL-2 방출 (도 21, 패널 B) 및 증식 (도 21, 패널 C)을 매개하는 것으로 밝혀졌다.
결과의 요약
리툭시맙과 조합된 경우에, ACTR 발현 T 세포는 CD20+ 림프종 세포주의 존재 하에 강력한 활성화, 증식, 시토카인 생산, 및 종양-지정 세포독성을 나타내었다. ACTR 발현 T 세포 시험관내 활성은 리툭시맙에 의존성이었고 용량-적정가능하였다. ACTR 발현 T 세포는 NSG 마우스에서의 공격성 Raji 림프종 이종이식편 모델에서 생체내에서 강력한 항종양 효능을 가졌다. 이러한 항종양 활성은 ACTR T 세포 및 리툭시맙 용량-의존성이었으며, 더 높은 T 세포 수 및 항체 농도가 개선된 반응을 매개하였다. 종합하면, 이들 데이터는 다양한 암 항원을 표적화하기 위한 ACTR 발현 T 세포 치료 접근법의 특이성 및 다목적성을 입증한다.
실시예 7: ACTR 변이체 서열식별번호: 9를 발현하는 T 세포와 조합된 트라스투주맙을 사용한 HER2-증폭된 암의 효과적인 표적화
시험된 세포주 상의 HER2 발현
HER2-증폭된 세포주 (OE19, N87, 및 SKBR3) 및 비-HER2-증폭된 세포주 (MCF7 및 KATOIII) 상의 HER2 단백질 발현을 항-인간 HER2 항체로의 염색 후에 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 염색된 세포의 평균 형광 강도 (MFI)는 평가된 각각의 세포주에 대해 플롯팅된다 (도 23). HER2-증폭된 세포주는 항-HER2 항체로의 강건한 염색을 보여준 반면, 비-HER2-증폭된 세포에서는 최소 염색이 관찰되었다. 이들 결과는 이들 세포주에 대해 보고된 카피수 데이터와 일치한다 (하기 참조).
다양한 세포주뿐만 아니라 그의 조직 기원의 HER2 카피수 (log2)가 표 7에 제시된다. HER2 유전자는 OE19, N87 및 SKBR3 세포주에서 증폭되고, MCF7 및 KatoIII 세포주에서는 증폭되지 않는다. HER2 카피수는 그의 이러한 세포주에 대한 설명에 대해 참조로 포함된 암 세포주 백과사전 (CCLE)에 기재되어 있다.
표 7: 증폭된 및 비-증폭된 세포주 상의 HER2 유전자 발현
Figure pct00018
트라스투주맙과 조합된 ACTR은 HER2-증폭된 종양 세포주에 대해 선택적 시험관내 활성을 갖는다.
세포독성, IL-2 방출, 및 IFN-γ 방출을 ACTR T 세포 및 HER2-증폭된 세포주 (OE19, N87, 및 SKBR3) 및 비-HER2-증폭된 세포주 (MCF7 및 KATOIII)에서 평가하였다. 반응을 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 200-μL 반응 부피로 5 μg/mL 항-HER2 항체 트라스투주맙의 존재 하에 2:1 E:T 비로 수행하였다. 상청액을 24시간 후에 분리하고, 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정 (시스바이오(Cisbio))을 사용하여 IL-2 및 IFN-γ에 대해 분석하였다. 간략하게, 시토카인 표준 및 접합체를 제조업체의 프로토콜에 따라 제조하였다. 저부피 384-웰 플레이트에서, 10-μL 부피의 접합체 및 10-μL 부피의 세포 상청액 (IL-2의 경우 1:4 희석됨, IFN-γ의 경우 1:16 희석됨)을 24시간 동안 공동-인큐베이션하였다. 형광 신호를 엔비전 다중-표지 플레이트 판독기를 사용하여 측정하고, 데이터를 제조업체의 권장사항에 따라 분석하였다. 48시간 후, 세포독성을 살아있는 표적 세포의 척도로서 ATP라이트 원 스텝(ATPlite one step) (퍼킨 엘머)을 사용하여 평가하였다. 이전 실험은 ATP라이트 신호에 대한 T 세포의 최소 기여를 입증하였다. 퍼센트 세포독성은 ACTR 및 항체를 갖는 웰에서의 ATP라이트 신호를 항체의 부재 하의 대조군 웰과 비교함으로써 결정하였다. 이들 실험은 ACTR T 세포 + 트라스투주맙이 HER2-증폭된 세포주 OE19, N87, 및 SKBR3의 존재 하에 강건한 세포독성, IL-2 방출, 및 IFN-γ 방출을 보여주지만 비-증폭된 세포주 MCF7 및 KatoIII의 존재 하에는 그렇지 않다는 것을 입증한다 (도 24).
유사한 실험을 항-HER2 CAR을 발현하는 T 세포를 사용하여 수행하였다. 이 CAR 변이체는 트라스투주맙 서열로부터 유래된 scFv (4D5), CD8 힌지 및 막횡단 도메인, CD28 공동자극 도메인, 및 CD3-제타 신호전달 도메인으로 구성되었다. 세포독성 및 시토카인 방출 실험을 트라스투주맙의 부재 하에 2:1 E:T 비로 상기 기재된 바와 같이 수행하였다. 이들 실험은 항-HER2 CAR T 세포가 HER2-증폭된 세포주 OE19, N87, 및 SKBR3의 존재 하에 및 비-증폭된 세포주 MCF7 및 KatoIII의 존재 하에 강건한 세포독성, IL-2 방출, 및 IFN-γ 방출을 매개한다는 것을 입증한다 (도 25).
이들 실험은 표적 세포 상의 HER2 발현의 함수로서 ACTR T 세포 + 트라스투주맙이 HER2-증폭된 세포주에 대해 선택적 활성을 나타내지만 항-HER2 CAR T 세포는 선택적 활성을 나타내지 않는다는 것을 입증한다.
ACTR T 세포 및 HER2-표적화 CAR-T 세포는 HER2-증폭된 종양 세포주 상에서 증식한다
증식 검정을 웰당 100,000개 T 세포에서 출발하여 6일 동안 2:1 E:T 비로 실시예 6에 기재된 것과 유사한 방식으로 수행하였다. ACTR T 세포를 사용한 실험을 증가하는 농도의 트라스투주맙 (0 - 5 μg/mL)을 사용하여 수행하고; 항-HER2 CAR T 세포를 사용한 실험을 트라스투주맙의 부재 하에 수행하였다. T 세포 증식을 HER2-증폭된 세포주 (OE19, N87, 및 SKBR3) 및 비-HER2-증폭된 세포주 (MCF7 및 KATOIII)의 존재 하에 평가하였다. 이들 실험의 결과는 ACTR T 세포가 HER2-증폭된 세포주, N87 및 OE19의 존재 하에 트라스투주맙 용량-의존성 증식을 갖는다는 것을 입증하고 (도 26, 패널 A); HER2-표적화 CAR-T 세포가 N87 및 OE19 표적 세포 상에서 대등한 증식을 갖는다는 것 (도 26, 패널 B)을 입증하였다. SKBR3, MCF7, 및 KatoIII 표적 세포에서는 증식이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았다.
트라스투주맙과 조합된 ACTR T 세포가 N87 위암 이종이식편 모델에서 강건한 항종양 활성을 매개한다
실험을 대략 80 mm3 출발 부피의 피하 N87 (인간 위암 세포주) 종양을 갖는 암컷 NSG (NOD.Cg-Prkdcscid IL-2rgtm1Wjl/SzJ) 마우스에서 트라스투주맙과 조합된 ACTR 발현 T 세포에 대한 생체내 투여 요법을 사용하여 수행하였다. 모든 생체내 절차는 실시예 6에 기재된 바와 같이, IACUC 승인된 프로토콜 및 표준에 따라 수행하였다. 투여 요법은 도 27에 상술된다. 이 연구에서의 실험군은 비히클 (대조군; 비처리), 트라스투주맙 단독, ACTR T 세포 단독, ACTR T 세포 + 트라스투주맙, 및 항-HER2 CAR T 세포였다.
항-HER2 CAR에서의 scFv는 트라스투주맙으로부터 유래되었고, 따라서 트라스투주맙과 동일한 HER2 상 에피토프에 결합한다. 따라서, 항-HER2 CAR T 세포 및 트라스투주맙의 공동-사용은 이들이 HER2+ 종양 세포에 대한 결합에 대해 서로 경쟁할 수 있기 때문에 생체내 항종양 활성을 증진시킬 것으로 예상되지 않을 것이다.
트라스투주맙을 받은 군에게 종양 접종 7일 후에 시작하여 4주 동안 매주 1회 100 μg 항체를 복강내로 투여하였다. ACTR T 세포 (1.5 x 107개의 총 T 세포) 또는 항-HER2 CAR T 세포 (1 x 107개의 총 T 세포)를 받는 군에게 종양 접종후 제8일 및 제15일에 투여하였다. 대조군 마우스에게 항체 (비히클은 PBS임) 및 T 세포 (비히클은 무혈청 배지임) 둘 다와 동일한 스케줄 상에서 비히클 단독을 투여하였다. 평균 종양 부피를 실험 전반에 걸쳐 측정하고 시간의 함수로서 플롯팅하였다 (도 28).
트라스투주맙과 조합된 ACTR T 세포는 트라스투주맙 또는 ACTR T 세포 단독 대비 강건한 항종양 활성을 보여주었고, 항-HER2 CAR T 세포에서 관찰된 것보다 더 빠른 항종양 동역학을 보여주었다.
종양 세포주와 비교한 정상 세포 상의 HER2 발현
HER2-증폭된 종양 세포 (N87), 비-HER-증폭된 종양 세포 (MCF7), HER-2 음성 세포 (Daudi), 및 다양한 정상 세포 (유방 상피, 폐동맥 평활근, 심근세포, 기관지 상피 또는 신장 상피) 상의 HER2 발현은 항-인간 HER2 항체로 염색한 후 유동 세포측정법에 의해 측정하였다. 평균 형광 강도 (MFI)를 각각의 세포 유형에 대해 플롯팅하였다 (도 29). 예상한 대로, N87 세포는 높은 수준의 HER2 발현을 보여주었고, MCF7 세포는 낮은 수준의 HER2 발현을 보여주었고, Daudi 세포는 HER2 발현을 거의 보여주지 않았다. 정상 세포주 중에서, 유방 상피 세포는 중간 수준의 HER2 발현을 보여주었으며 모든 다른 것들은 낮은 수준의 HER2 발현을 보여주었다.
정상 세포 상의 항-HER2 CAR T 세포와 비교한 ACTR과 트라스투주맙의 차등 시험관내 활성은 ACTR + 트라스투주맙에 대한 유리한 치료 지수를 시사한다
세포독성 검정을 48시간 동안 2:1 E:T로 ACTR T 세포 또는 항-HER2 CAR T 세포 및 표적 세포를 사용하여 상기 기재된 바와 같이 수행하였고; ACTR T 세포를 사용한 실험은 또한 트라스투주맙 (0 - 5 μg/mL)을 함유하였다. 이 실험에서 평가된 표적 세포는 N87 (HER2-증폭됨), MCF7 (HER2 비-증폭됨), Daudi (HER2 음성), 및 정상 세포주 (유방 상피, 폐동맥 평활근, 심근세포, 기관지 상피 및 신장 상피)였다. ACTR T 세포 플러스 트라스투주맙은 HER2-증폭된 N87 세포에 대한 강건한 세포독성을 매개하였고, 비-증폭된 또는 음성 표적 세포주 및 정상 세포주에 대해서는 활성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다 (5 μg/mL 트라스투주맙과 조합된 ACTR에 대한 데이터가 도 30, 패널 A에 플롯팅됨). 대조적으로, 항-HER2 CAR T 세포는 HER2-증폭된 N87 세포, HER2-비-증폭된 MCF7 세포, 및 여러 정상 세포주에 대해 강건한 세포독성을 나타내었다 (도 30, 패널 B). 결과는 트라스투주맙과 조합된 ACTR T 세포가 항-HER2 CAR T 세포와 비교할 때 높은 종양 선택성을 갖는다는 것을 나타낸다.
상청액을 상기 기재된 바와 같이 세포독성 반응물에서 분리하고 IL-2 및 IFNγ 방출에 대해 분석하였다. ACTR T 세포는 HER2-증폭된 N87 세포의 존재 하에 트라스투주맙 농도-의존성 IL-2 방출을 보여주었고 정상 세포주를 포함한 시험된 다른 표적 세포의 존재 하에 IL-2 방출을 거의 내지 전혀 보여주지 않았다 (도 31, 패널 A). 대조적으로, 항-HER2 CAR T 세포는 HER2-증폭된 N87 세포 및 HER2-비-증폭된 MCF7 세포의 존재 하에 강건한 IL-2 방출 및 정상 폐동맥 평활근 세포 및 심근세포의 존재 하에 IL-2 방출을 나타내었다 (도 31, 패널 B). ACTR T 세포는 HER2-증폭된 N87 세포의 존재 하에 트라스투주맙 농도-의존성 IFNγ 방출을 보여주었고 정상 세포주를 포함한 시험된 다른 표적 세포의 존재 하에 IFNγ 방출을 거의 내지 전혀 보여주지 않았다 (도 32, 패널 A). 대조적으로, 항-HER2 CAR T 세포는 HER2-증폭된 N87 세포 및 HER2-비-증폭된 MCF7 세포의 존재 하에 강건한 IFNγ 방출 및 정상 폐동맥 평활근 세포 및 심근세포의 존재 하에 IFNγ 방출을 보여주었다 (도 32, 패널 B). 이들 결과는 ACTR-발현 T 세포가 트라스투주맙 및 정상 1차 세포 (유방 상피, 폐동맥 평활근, 심근세포, 기관지 상피 또는 신장 상피)의 존재 하에 시토카인을 방출하지 않으며, 시토카인 방출은 항-HER2 CAR T 세포의 존재 하에 이들 정상 세포에서 관찰된다는 것을 입증한다.
결과의 요약
상기 제시된 바와 같이, 트라스투주맙과 조합된 경우에, ACTR T 세포는 HER2-증폭된 표적 세포주에 대해서는 강력한 증식, 시토카인 생산 및 종양-지정 세포독성을 갖지만, 비-증폭된 MCF7 및 KATOIII 세포주에 대해서는 감소된 활성을 갖는다. 트라스투주맙-기반 (4D5 scFv) HER2-표적화 CAR-T 세포는 HER2-증폭된 및 비-증폭된 세포주 둘 다에 대한 세포독성 및 시토카인 방출을 입증하였으며, 이는 HER2 발현의 차등 역치가 HER2 CAR-T 세포와 비교하여 ACTR T 세포의 활성화에 요구된다는 것을 시사한다. ACTR T 세포는 NSG 마우스에서의 피하 N87 위암 이종이식 모델에서 강력한 항종양 효능을 갖고, 이러한 활성은 HER2 CAR-T 세포와 대등하였다. 트라스투주맙의 존재 하에 정상 세포와 함께 인큐베이션한 경우에, ACTR T 세포는 유의한 세포독성 또는 시토카인 방출을 입증하지 않았다. 대조적으로, HER2 CAR-T 세포는 시토카인을 방출하고 이들 정상 세포에 대해 세포독성을 매개하였다. 종합하면, 이들 데이터는 HER2-증폭된 세포에 대한 ACTR T 세포 + 트라스투주맙의 효능을 지지하고, 트라스투주맙-기반 HER2-표적화 CAR T 세포와 비교하여 이러한 조합에 의한 '온 타켓/오프 종양' 독성의 감소된 위험을 시사한다.
실시예 8: ACTR 변이체 서열식별번호: 9를 발현하는 T 세포와 조합된 다라투무맙을 사용한 CD38-양성 암의 효과적인 표적화
다발성 골수종 및 림프종 세포주, 다발성 골수종 형질 세포, 면역 세포, 및 적혈구의 표면 상의 CD38 발현
CD38 발현을 유동 세포측정법에 의해 암 세포주, 환자-유래 세포, 및 정상 세포의 표면 상에서 평가하였다.
CD38 발현을 림프종 세포주 Daudi, Raji, Ramos 및 RL, 및 다발성 골수종 세포주 NCI-H929, MM.1S, OPM2, RPMI 8226 및 U266B1 상에서 평가하였다. 세포주를 BSA를 갖는 PBS (염색 완충제) 중에서 2회 세척하고, 이어서 인간 Fc 차단으로 10분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 실온에서 20분 동안 10 μg/mL 다라투무맙과 함께 인큐베이션하였다. 이어서 염색 완충제 중에서 2회 세척하고, 4℃에서 30분 동안 PE-접합된 염소 항-인간 IgG (Fab')2 2차 항체와 인큐베이션하였다. 염색 완충제 중에서 2회 세척한 후, 염색된 세포를 유동 세포측정법에 의해 분석하였다. 기하 평균 형광 강도 (gMFI)를 각각의 세포주에 대해 플롯팅하였다 (도 33, 패널 A). 모든 세포주는 CD38 발현에 대해 음성인 U266B1을 제외하고 다양한 정도로 CD38 발현을 나타낸다.
CD38 발현을 또한 유동 세포측정법을 통해 1차 MM 환자-유래 골수 단핵 세포 (BMMC) 샘플과 함께 NCI-H929, KMS-20, 및 RPMI-8226 다발성 골수종 (MM) 세포주 상에서 평가하였다. 환자 유래 BMMC 및 MM 세포주를 PBS 중에서 1회 세척한 다음, 4℃에서 30분 동안 라이브/데드 이플루오르-780 염료로 염색하였다. 생존율 염색 후, 세포를 1회 세척하고, 실온에서 10분 동안 인간 Fc 차단 (50 μL)과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 AF488-접합된 항-인간 CD38 항체 및 브릴리언트 바이올렛 510-접합된 항-인간 CD27 항체로 이루어진 항체 칵테일 100 μL로 염색하였다. 30분 염색 인큐베이션 후, 세포를 염색 완충제로 2회 세척하고, 유동 세포측정법 의해 평가하였다. 다발성 골수종 세포주 및 MM 환자 유래 BMMC 상에 게이팅하는 유동 세포측정법을 중복 제외 및 사멸 세포 제외 후에 수행하였다. CD38 발현을 모든 세포에 대해 검출하였으며, 환자-유래 BMMC 세포에서 가장 높은 발현이 관찰되었다 (도 33, 패널 B).
CD38 발현을 또한 유동 세포측정법을 통해 NCI-H929 다발성 골수종, Daudi 림프종, 및 2명의 공여자로부터의 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 하위세트 상에서 평가하였다. PBMC를 해동시키고, 염색 완충제로 1회 세척하였다. 세포를 알렉사플루오르488-접합된 항-인간 CD3, APC-접합된 항-인간 CD19, PE-Cy7 접합된 항-인간 CD14, 브릴리언트 바이올렛 421-접합된 항-인간 CD56, 및 PE-접합된 항-인간 CD38 항체로 이루어진 항체 칵테일 100 μL로 염색하였다. 4℃에서 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 염색 완충제로 2회 세척하고, 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 중복 제외 후, CD38의 gMFI를 CD3+ (T 세포), CD19+ (B 세포), CD3- CD56+ (자연 킬러 (NK) 세포), 및 CD3- CD14+ (단핵구) 집단 내에서 계산하였다. PBMC 하위세트에 대한 CD38 발현 수준을 Daudi 및 NCI-H929 세포의 CD38 발현 (gMFI) 수준과 비교하였다. 공여자 둘 다에서, NK 세포는 면역 세포 하위세트의 가장 높은 CD38 발현을 입증하였으나, CD38 발현의 수준은 NCI-H929 다발성 골수종 및 Daudi 림프종 세포에서 관찰된 것보다 유의하게 더 낮았다 (도 33, 패널 C).
CD38 발현을 또한 5명의 상이한 건강한 공여자로부터의 적혈구 (적혈구)의 표면 상에서 평가하였다. 5명의 건강한 공여자로부터의 신선한 전혈을 아지드화나트륨을 함유하는 세포 염색 완충제 중에서 1:10000으로 희석하였다. 세포를 1회 세척하고, 이어서 APC-접합된 항-인간 CD235a, 브릴리언트 바이올렛 605-접합된 항-인간 CD45, 및 PE-접합된 항-인간 CD38 항체로 이루어진 항체 칵테일 100 μL과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 세포 염색 완충제로 2회 세척하고, 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 낮은 CD38 발현 (gMFI)이 CD235a+ 적혈구의 표면 상에서 관찰되었다 (도 33, 패널 D).
활성화된 ACTR T 세포의 표면 상의 CD38 발현
ACTR-발현 T 세포 (이펙터; E) 및 Daudi 표적 세포 (표적; T)를 1 μg/mL의 CD20-표적화 항체 리툭시맙의 존재 하에 1:1 이펙터-대-표적 비 (30,000개 표적 세포)로 인큐베이션하였다. 반응물을 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 1, 2 또는 3일 동안 인큐베이션하고, 이어서 유동 세포측정 분석을 위해 염색하였다. 간략하게, 세포를 PBS로 1회 세척하고 이어서 고정가능한 생존율 염료 이플루오르450으로 염색하였다. 세포를 PBS로 다시 세척하고, 이어서 알렉사플루오르488-접합된 항-인간 CD3, APC-접합된 항-인간 CD16, 및 PE-접합된 항-인간 CD38 항체를 함유하는 항체 칵테일 100 μL와 함께 인큐베이션하였다. 20분 인큐베이션한 후, 세포를 2회 세척하고, 데이터를 유동 세포측정기 상에서 획득하였다. CD38의 gMFI를 CD3+ 총 T 세포 및 CD3+ CD16+ ACTR+ T 세포, 및 Daudi 표적 세포에 대해 결정하였다. CD38의 gMFI를 자극 후 시간의 함수로서 플롯팅하였다 (도 34). CD38의 gMFI는 리툭시맙의 부재 하에 인큐베이션된 세포 대비 리툭시맙 및 Daudi 세포의 존재 하에 활성화시킨 후의 총 T 세포 (모든 CD3+ 세포)에 대해 시간의 함수로서 증가하였으나, CD38 발현은 Daudi 표적 세포에 대한 것보다 유의하게 더 낮았다 (도 34, 패널 A). CD38의 gMFI는 리툭시맙의 존재 하에 ACTR T 세포 (CD3+ CD16+ 세포)에 대해 유의하게 상향조절되었으며, 자극 24시간 후의 피크 발현은 Daudi 표적 세포에서 관찰된 것과 유사하였다 (도 34, 패널 B). 이들 실험은 CD38이 표적화-항체 및 항체에 대한 동족 항원을 발현하는 표적 세포를 사용한 활성화 시에 ACTR T 세포에 대해 상향조절된다는 것을 입증한다.
모의, ACTR, T 세포, 및 CD38-표적화 CAR-T 세포의 생산
T 세포를 항-CD3 및 항-CD28 항체로 활성화된 PBMC로부터 생성하였다. 세포를 4-1BB 공동자극 도메인에 연결된 THB7 단일 쇄 가변 단편, 및 T 세포 수용체 CD3제타 세포내 도메인 (THB7-41BB-CD3제타)으로 구성된 ACTR 또는 CD38-표적화 CAR 서열을 코딩하는 감마-레트로바이러스로 활성화 3일 후에 형질도입하고 (Mihara et al. 2009. J Immunother. 32(7):737-43.); 모의 T 세포는 바이러스로 형질도입하지 않았다. 배수 확장 (도 35, 패널 A), 생존율 (도 35, 패널 B), 및 세포 크기 (도 35, 패널 C)를 뉴클레오카운터(Nucleocounter) NC-200 세포 계수기를 사용하여 확장 과정 전체에 걸쳐 모니터링하였다. CD38 발현을 또한 확장 제5, 7 및 10일에 유동 세포측정법에 의해 평가하였다 (도 35, 패널 D). 간략하게, 세포를 BSA를 갖는 PBS (염색 완충제) 중에서 1회 세척하고 이어서 APC-Cy7-접합된 항-인간 CD3, 브릴리언트 바이올렛 421-접합된 항-인간 CD4, PE-접합된 항-인간 CD8, APC-접합된 항-인간 CD16, 및 FITC-접합된 항-인간 CD38을 함유하는 항체 칵테일 100 μL와 함께 20분 동안 인큐베이션하였다. 염색 완충제 중에서 2회 세척한 후, 검출을 유동 세포측정법을 통해 수행하였다. ACTR T 세포는 항-CD38 CAR T 세포 대비 증진된 확장 (도 35, 패널 A), 생존율 (도 35, 패널 B), 세포 직경 (도 35, 패널 C), 및 CD38 발현 (도 35, 패널 D)을 나타낸다.
유사한 실험에서, 추가의 항-CD38 CAR을 평가하였다. 056 CAR은 4-1BB 공동자극 도메인에 연결된 056 단일 쇄 가변 단편, 및 T-세포 수용체 CD3제타 세포내 도메인 (056-41BB-CD3제타)으로 구성된다 (Drent et al. 2016. Haematologica. 101(5):616-25). T 세포를 ACTR, THB7 CAR 또는 056 CAR을 코딩하는 감마-레트로바이러스로 형질도입하고; 모의 T 세포는 바이러스로 형질도입하지 않았다. 배수 확장 (도 44, 패널 A), 세포 크기 (도 44, 패널 B), 및 세포 생존율 (도 44, 패널 C)을 뉴클레오카운터 NC-200 세포 계수기를 사용하여 확장 과정 전체에 걸쳐 모니터링하였다. ACTR T 세포는 둘 다의 항-CD38 CAR 변이체를 발현하는 T 세포 대비 증진된 확장 (도 44, 패널 A), 세포 직경 (도 44, 패널 B), 및 세포 생존율 (도 44, 패널 C)을 나타내었다.
CD38 발현을 또한 확장 제 6, 8 및 10일에 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 간략하게, 세포를 BSA를 갖는 PBS (염색 완충제) 중에서 1회 세척하고 이어서 PE-접합된 항-인간 CD38 항체와 함께 20분 동안 인큐베이션하였다. 염색 완충제 중에서 2회 세척한 후, 검출을 유동 세포측정법을 통해 수행하였다. 각각의 T 세포 확장에 대한 CD38 발현을 나타내는 히스토그램이 도 45에 제시된다. 모의 및 ACTR T 세포 둘 다에 대한 히스토그램은 확장 과정에 걸쳐 더 낮은 CD38 발현으로의 이동을 입증하나, 실험 전체에 걸쳐 강건한 CD38 발현을 유지한다. THB7 CAR 및 056 CAR T 세포 둘 다에 대한 히스토그램은 실험 과정에 걸쳐 CD38 발현의 현저한 감소를 나타내고, CAR 변이체 둘 다에 대해 제8일 및 제10일에 CD38 발현이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았으며, 이는 CD38-양성 T 세포의 CAR-매개 고갈 및/또는 CAR+ 세포에서의 CD38 발현의 하향조절을 나타낸다.
이들 실험은 항-CD38 CAR T 세포 생산이 CD38-표적-매개 자가용해에 의해 억제되고 ACTR T 세포 생산은 그렇지 않다는 것을 입증한다.
ACTR T 세포는 항-CD38 CAR T 세포와 비교하여 개선된 세포독성 및 시토카인 생산을 증명한다
상기 기재된 실험에서 생성된 T 세포를 CD38-발현 표적 세포를 사용한 활성 실험에서 평가하였다. ACTR- 및 CAR-발현 세포를 모의 T 세포와 매칭되는 형질도입 효율에 대해 정규화시켰다. 이들 실험을 위해, 모의 T 세포, ACTR T 세포, THB7 CAR T 세포, 및 056 CAR T 세포를 CD38-발현 Daudi, NCI-H929, 또는 RPMI-8226 표적 세포와 함께 상이한 E:T 비 (1:4, 1:2, 1:1, 2:1, 및 4:1)로 인큐베이션하였다. 모의 및 ACTR T 세포를 사용한 실험을 다라투무맙 (1 μg/mL)의 부재 및 존재 하에 수행하였다. 반응물을 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 상청액 (100 μL)을 시토카인 분석을 위해 분리하였다.
세포독성을 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 간략하게, 세포를 PBS로 1회 세척하고 이어서 고정가능한 생존율 염료로 염색하였다. 세포를 PBS로 다시 세척하고, 이어서 100 μL 알렉사플루오르488-접합된 항-인간 CD3 항체와 함께 인큐베이션하였다. 20분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 2회 세척하고, 데이터를 유동 세포측정기 상에서 획득하였다. 살아있는 표적 세포 카운트는 생존율 염료 음성, CD3- 세포에 대해 게이팅함으로써 결정하였다. 살아있는 표적 세포의 백분율은 주어진 샘플로부터의 살아있는 표적 세포 카운트를 표적 세포 단독 웰에서의 살아있는 표적 세포 카운트로 나눔으로써 결정하였다. 퍼센트 세포독성은 퍼센트 살아있는 세포를 100에서 감산함으로써 결정하였다. 퍼센트 세포독성을 E:T 비의 함수로서 플롯팅하였다 (도 46).
세포독성의 이펙터 세포 용량-의존성 증가가 Daudi (도 46, 패널 A) 및 NCI-H929 (도 46, 패널 B) 세포와 함께 배양된 ACTR과 다라투무맙, THB7 CAR, 및 056 CAR T 세포에 대해 관찰되었다. 모의 T 세포 단독 및 ACTR T 세포 단독은 어느 한 표적 세포주에 대해 세포독성을 거의 또는 전혀 나타내지 않았다. 다라투무맙의 존재 하의 모의 T 세포는 Daudi 세포에 대해 일부 세포독성을 나타내었으며, 이는 다라투무맙 단독이 이들 표적 세포에 대해 세포독성 효과를 가질 수 있다는 것을 나타낸다 (도 46, 패널 A). 다라투무맙의 존재 하의 ACTR T 세포는 Daudi 및 NCI-H929 표적 세포 (도 46, 각각 패널 A 및 B) 둘 다에서 더 낮은 E:T 비에서 THB7 및 056 CAR T 세포 둘 다보다 우수한 세포독성을 입증하였다.
이들 실험으로부터의 상청액을 시스바이오 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정을 사용하여 IFNγ 및 IL-2에 대해 분석하였다. 간략하게, 시토카인 표준 및 접합체를 제조업체 프로토콜에 따라 제조하였다. 저부피 384-웰 플레이트에서, 10 μL 부피의 접합체 및 10 μL 부피의 세포 상청액을 2시간 (IL-2) 또는 24시간 (IFNγ) 동안 공동-인큐베이션하였다. 플레이트를 엔비전 다중-표지 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 1:1 E:T 비로 수행된 반응으로부터의 세포 상청액에서 측정된 IFNγ 또는 IL-2의 농도는 표적 세포의 함수로서 플롯팅된다 (도 47).
강건한 IFNγ 생산이 NCI-H929, RPMI-8226, 및 Daudi 표적 세포의 존재 하에, 다라투무맙의 존재 하의 ACTR T 세포, THB7 CAR T세포, 및 056 CAR T 세포에 대해 관찰되었다 (도 47, 패널 A). 다라투무맙의 존재 하의 모의 T 세포를 사용한 IFNγ 생산은 매우 낮거나 또는 검정에 대한 정량화 한계 미만이었다. 강건한 IL-2 생산이 NCI-H929, RPMI-8226, 및 Daudi 표적 세포의 존재 하에, 다라투무맙의 존재 하의 ACTR T 세포에 대해 관찰되었다 (도 47, 패널 B). 낮은 수준의 IL-2 생산이 NCI-H929, RPMI-8226, 및 Daudi 표적 세포의 존재 하에, THB7 CAR, 056 CAR, 및 모의 (다라투무맙의 존재 하) T 세포에 대해 관찰되었다 (도 47, 패널 B).
이들 실험은 다라투무맙의 존재 하의 ACTR T 세포가 항-CD38 CAR T 세포 대비 우수한 세포독성 및 시토카인 생산을 갖는다는 것을 입증한다.
NCI-H929, MM.1S, RPMI-8226, 및 Daudi 세포에 대해 매개된 ACTR T 세포 세포독성은 다라투무맙의 존재 하에 용량-의존성이고 ACTR-특이적이다
ACTR 또는 모의 T 세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 증가하는 농도의 CD38-표적화 항체, 다라투무맙의 존재 하에 2:1 E:T 비로 인큐베이션하였다. 이들 실험을 위해, NCI-H929, MM.1S, RPMI-8226, 및 Daudi 표적 세포를 사용하였다. 반응물을 CO2 (5%) 인큐베이터에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하고, 이어서 유동 세포측정 염색하였다. 간략하게, 세포를 PBS로 1회 세척하고 이어서 고정가능한 생존율 염료로 염색하였다. 세포를 PBS로 다시 세척하고, 이어서 알렉사플루오르488-접합된 항-인간 CD3 및 알렉사플루오르 647-접합된 항-인간 CD16 항체를 함유하는 항체 칵테일 100 μL와 함께 인큐베이션하였다. 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 2회 세척하고, 데이터를 유동 세포측정기 상에서 획득하였다. 살아있는 표적 세포 카운트는 생존율 염료 음성, CD3- CD16- 세포에 대해 게이팅함으로써 결정하였다. 살아있는 표적 세포의 백분율은 주어진 샘플로부터의 살아있는 표적 세포 카운트를 표적 세포 단독 웰에서의 살아있는 표적 세포 카운트로 나눔으로써 결정하였다. 퍼센트 세포독성은 퍼센트 살아있는 세포를 100에서 감산함으로써 결정하였다. 퍼센트 세포독성을 항체 농도의 함수로서 플롯팅하였다 (도 36).
세포독성의 항체 용량 의존성 증가가 다라투무맙의 존재 하에 NCI-H929 (도 36, 패널 A), MM.1S (도 36, 패널 B), RPMI-8226 (도 36, 패널 C), 및 Daudi (도 36, 패널 D) 표적 세포와 함께 배양된 ACTR T 세포에 대해 관찰되었다. 모의 T 세포가 증가하는 농도의 다라투무맙의 존재 하에 배양된 경우에는 세포독성의 증가가 관찰되지 않았다.
NCI-H929, MM.1S, RPMI-8226 및 Daudi 세포, 및 다라투무맙의 존재 하의 ACTR T 세포 시토카인 방출은 항체-용량-의존성이다
ACTR 또는 모의 T 세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 증가하는 농도의 CD38-표적화 항체 다라투무맙의 존재 하에 1:1 E:T 비로 인큐베이션하였다. 세포 상청액을 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 24시간 인큐베이션한 후에 수집하였다. 상청액을 시스바이오 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정을 사용하여 IFNγ 및 IL-2에 대해 분석하였다. 간략하게, 시토카인 표준 및 접합체를 제조업체 프로토콜에 따라 제조하였다. 저부피 384-웰 플레이트에서, 10 μL 부피의 접합체 및 10 μL 부피의 세포 상청액을 2시간 (IL-2) 또는 24시간 (IFNγ) 동안 공동-인큐베이션하였다. 플레이트를 엔비전 다중-표지 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 세포 상청액에서 측정된 IFN감마 또는 IL-2의 농도는 다라투무맙 농도의 함수로서 플롯팅된다.
강건한 ACTR T 세포 (도 37, 패널 A) IL-2 및 (도 37, 패널 B) IFNγ 생산이 다라투무맙-옵소닌화된 NCI-H929, MM.1S, RPMI-8226, 및 Daudi 표적 세포의 존재 하에 관찰되었다. 모의 T 세포에 의한 시토카인 생산 (플롯팅되지 않음)은 표준 곡선의 선형 범위 미만이었다.
다라투무맙-옵소닌화된 NCI-H929, MM.1S, RPMI-8226, 및 Daudi 표적 세포의 존재 하의 ACTR T 세포 특이적 증식
T 세포를 ACTR을 코딩하는 감마 레트로바이러스로 형질도입하였고; 유동 세포측정법 실험은 이들 세포 중 24 - 32%가 ACTR에 대해 양성인 것을 입증하였다. ACTR 또는 모의 T 세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 증가하는 농도의 CD38-표적화 항체 다라투무맙의 존재 하에 1:1 이펙터-대-표적 비로 인큐베이션하였다. 반응물을 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 7일 동안 인큐베이션하고, 이어서 유동 세포측정 염색하였다. 간략하게, 세포를 PBS로 1회 세척하고 이어서 고정가능한 생존율 염료 이플루오르450으로 염색하였다. 세포를 PBS로 다시 세척하고, 이어서 알렉사플루오르488-접합된 항-인간 CD3 및 알렉사플루오르647-접합된 항-인간 CD16 항체를 함유하는 항체 칵테일 100 μL와 함께 인큐베이션하였다. 30분 동안 인큐베이션한 후, 세포를 2회 세척하고, 데이터를 유동 세포측정기 상에서 획득하였다. 살아있는 T 세포 카운트는 생존율 염료 음성, CD3+ 세포에 대해 게이팅함으로써 결정하였다. 도 38, 패널 A 및 B에서, 총 T 세포 카운트는 다라투무맙 항체 농도의 함수로서 플롯팅된다. 모의 T 세포는 다라투무맙 및 NCI-H929, MM.1S, RPMI-8226 및 Daudi 표적 세포의 부재 또는 존재 하에 증식하지 않았다 (도 38, 패널 A). ACTR T 세포는 NCI-H929, MM.1S, RPMI-8226, 및 Daudi 표적 세포의 존재 하에, 다라투무맙의 존재 하에는 강건한 증식을 입증하나 다라투무맙의 부재 하에는 그렇지 않았다 (도 38, 패널 B). 도 38, 패널 C에서, CD16+ 세포의 백분율을 총 CD3+ T 세포 게이트 내에서 계산하고, 다라투무맙 항체 농도의 함수로서 플롯팅하였다. ACTR+ T 세포의 백분율은 항체 용량 의존성 방식으로 증가하였으며, 이는 ACTR+ T 세포가 증식 동안 형질도입되지 않은 세포보다 우선적으로 풍부화된다는 것을 입증한다.
ACTR T 세포 세포독성 및 시토카인 방출은 자가 PBMC 하위세트에 대해 최소이지만 CD38 발현 표적 세포주에 특이적이다
ACTR T 세포를 ACTR T 세포, 자가 PBMC, 및 CD38-발현 다발성 골수종 표적 세포주를 함유하는 공동-배양 검정에서 CD38-표적화 다라투무맙의 존재 하의 PBMC 및 PBMC 하위세트의 잠재적 표적화에 대해 평가하였다. 상기 기재된 바와 같이, CD38의 낮은 발현이 일부 PBMC 하위세트에 대해 관찰된다 (도 33, 패널 C).
ACTR 또는 모의 T 세포를 4:1 E:T 비로의 RPMI-8226 다발성 골수종 표적 세포 (25,000개 세포)의 존재 또는 부재 하에, 1:1 E:T 비로의 자가 PBMC (각각 100,000개 세포)의 존재 하에 인큐베이션하였다. 반응물을 다라투무맙의 존재 또는 부재 하에, 37℃/5% CO2에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 24시간 후, 세포 상청액의 절반을 시토카인 분석을 위해 수집하고, 세포를 유동 세포측정 분석을 위해 수거하였다.
간략하게, 세포를 PBS로 1회 세척하고 이어서 고정가능한 생존율 염료 디플루오르780으로 염색하였다. 생존율 염색 후, 세포를 PBS로 1회 세척하고, 알렉사플루오르488-접합된 항-인간 CD3, APC-접합된 항-인간 CD19, PE-Cy7 접합된 항-인간 CD14, 브릴리언트 바이올렛 421-접합된 항-인간 CD56, 및 브릴리언트 바이올렛 510-접합된 항-인간 CD138로 이루어진 항체 칵테일 100 μL와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 염색 완충제로 2회 세척하고, 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 중복 제외 및 사멸 세포 제외 후, CD3+ T 세포, CD19+ B 세포, CD3- CD56+ 자연 킬러 세포, CD3- CD14+ 단핵구, 및 CD3- CD138+ MM 표적 세포 카운트를 결정하였다. 살아있는 표적 세포의 백분율은 주어진 샘플에서의 살아있는 표적 세포 카운트를 항체의 부재 하의 살아있는 표적 세포 카운트로 나눔으로써 각각의 명시된 세포 하위세트에 대해 계산하였다. 항체 특이적 세포독성은 퍼센트 살아있는 세포를 100에서 감산함으로써 결정하였다. 항체 특이적 세포독성 (%)은 1 또는 10 μg/mL 다라투무맙의 존재 하에 모의 T 세포 (도 39, 패널 A) 및 ACTR T 세포 (도 39, 패널 B)를 사용한 반응물에 대한 다양한 세포 하위세트에 대해 항체 농도의 함수로서 플롯팅된다. 데이터는 3명의 공여자를 나타낸다. 모의 T 세포에서 세포독성이 거의 또는 전혀 관찰되지 않았고; ACTR T 세포는 RPMI-8226 세포 (MM 세포)에 대한 강건한 세포독성을 나타내었으나 자가 PBMC 하위세트에 대해서는 세포독성을 거의 내지 전혀 나타내지 않았다.
상청액으로부터의 시토카인을 상기 기재된 바와 같이 분석하였다. 간략하게, 세포 상청액의 절반 (100 μL)을 시스바이오 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정을 사용하는 IFNγ 및 IL-2 시토카인 분석을 위해 수집하였다. 시토카인 표준 및 접합체를 제조업체의 프로토콜에 따라 제조하였다. 저부피 384-웰 플레이트에서, 10 μL 부피의 접합체 및 10 μL 부피의 세포 상청액을 2시간 (IL-2) 또는 24시간 (IFNγ) 동안 공동-인큐베이션하였다. 플레이트를 엔비전 다중-표지 플레이트 판독기 상에서 판독하였다. 세포 상청액에서 측정된 시토카인의 농도는 RPMI-8226 세포의 존재 또는 부재 하에, ACTR T 세포 및 PBMC를 사용한 반응물에 대한 다라투무맙 항체 농도의 함수로서 플롯팅된다 (도 40). ACTR T 세포가 다라투무맙과 함께 RPMI-8226 다발성 골수종 세포의 존재 하에 배양된 경우에는 IFNγ (도 40, 패널 A) 및 IL-2 (도 40, 패널 B) 생산의 증가가 관찰되었으나, RPMI-8226 다발성 골수종 세포의 부재 하에는 그렇지 않았다.
다라투무맙과 조합된 ACTR T 세포는 용혈을 매개하지 않는다.
CD38 발현을 유동 세포측정법에 의해 적혈구 상에서 평가하였다. 5명의 건강한 공여자로부터의 신선한 전혈을 아지드화나트륨을 함유하는 세포 염색 완충제 (세포 염색 완충제) 중에서 1:10000으로 희석하였다. 세포를 세포 염색 완충제로 1회 세척하고, 이어서 APC-접합된 항-인간 CD235a, 브릴리언트 바이올렛 605-접합된 항-인간 CD45, 및 PE-접합된 항-인간 CD38 또는 이소형 대조군 항체로 이루어진 항체 칵테일 100 μL와 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 세포 염색 완충제로 2회 세척하고, 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. CD38 발현을 CD235a+ 적혈구의 표면 상에서 평가하고, 도 41, 패널 A에 플롯팅하였다. 생성된 항-CD38 항체로 염색된 적혈구의 히스토그램은 이소형 대조군으로 염색한 것 대비 약간의 이동을 보여주었으며, 이는 적혈구 상의 소량의 CD38 발현을 나타낸다.
적혈구에 대한 다라투무맙의 결합을 또한 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 5명의 건강한 공여자로부터의 신선한 전혈을 세포 염색 완충제 중에서 1:1000으로 희석하였다. 희석된 전혈 (100 μL)을 96 웰 둥근 바닥 플레이트에서 플레이팅하고, 원심분리에 의해 200 x g에서 5분 동안 펠릿화하였다. 세포를 8 μg/mL의 최종 농도로 제조된 다라투무맙을 함유하는 세포 염색 완충제 중에서 37℃/5% CO2에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 세포 염색 완충제로 2회 세척하고, 실온에서 20분 동안 PE-접합된 염소 항-인간 IgG (Fab')2 2차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 염색 완충제 중에서 2회 세척한 후, PE 검출을 유동 세포측정법을 통해 수행하였다. 최대 다라투무맙 결합이 시험된 5명의 공여자 중 하나에서 나타났으며, 이를 2차 항체 단독과 비교하였다 (도 41, 패널 B). 생성된 히스토그램에서의 작은 이동이 2차 항체 단독 대비 다라투무맙의 존재 하에 관찰되었으며, 이는 적혈구에 대한 약간의 다라투무맙 결합을 나타낸다.
ACTR T 세포 매개 용혈을 ACTR 및 적혈구 공동배양 검정을 사용하여 평가하였다. ACTR T 세포를 5명의 건강한 공여자로부터의 적혈구의 존재 하에 인큐베이션하여 대략 1:200 ACTR+ T 세포:적혈구 비를 달성하였다. 형질도입되지 않은 모의 T 세포 및 다라투무맙을 사용한 반응물 및 T 세포의 부재 하의 다라투무맙 단독을 사용한 반응물을 이 실험에서 대조군으로서 사용하였다. 반응물을 37℃/5% CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 600 μg/mL, 200 μg/mL, 66.7 μg/mL, 22.2 μg/mL, 7.4 μg/mL 또는 0 μg/mL의 다라투무맙의 존재 하에 인큐베이션하였다. 24시간 공동-배양 후, 생존 적혈구를 원심분리에 의해 500 x g에서 10분 동안 펠릿화하였다. 상청액 (60 μL)을 헤모글로빈 ELISA에서의 분석을 위해 수집하였으며, 여기서 세포 상청액에서 측정된 헤모글로빈은 적혈구 용해를 나타낸다. 간략하게, 세척 완충제, 희석제 용액, 효소-항체 접합체, 및 헤모글로빈 표준을 제조업체의 지침에 따라 제조하였다. 샘플 및 표준 (100 μL)을 ELISA 플레이트에 첨가하고, 실온에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 300 μL의 세척 완충제로 4회 세척하고, 이어서 100 μL 효소-항체 접합체와 함께 20분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 다시 300 μL의 세척 완충제로 4회 세척하고, 이어서 100 μL TMB 발색원 기질 용액과 함께 10분 동안 인큐베이션하였다. 정지 용액 (100 μL)을 각각의 웰에 첨가하고, 450 nm에서의 흡광도를 스펙트라맥스(SpectraMax) I3X를 사용하여 결정하였다. 각각의 샘플 웰에서 측정된 헤모글로빈 농도를 전체 용해로 이어지는 2% 트리톤(Triton)-X 첨가 (대조군 점선)와 비교하였다. 헤모글로빈 농도를 다라투무맙 농도의 함수로서 플롯팅하였다 (도 41, 패널 C). 반응물로부터의 상청액에서 헤모글로빈이 거의 내지 전혀 검출되지 않았고, ACTR T 세포, 모의 T 세포, 또는 다라투무맙 단독을 사용한 반응물 중에서 차이가 존재하지 않았다.
실시예 9: CD28 공동자극 도메인을 갖는 ACTR 변이체를 발현하는 T 세포로부터의 IL-2 생산
서열식별번호: 2, 9, 13, 19, 20, 21, 22, 및 27을 갖는 ACTR 변이체를 코딩하는 감마-레트로바이러스를 생성하였다. 이들 바이러스를 사용하여 2명의 상이한 공여자로부터의 1차 인간 T-세포를 감염시켜, 감염된 세포의 표면 상에 이들 ACTR 변이체를 발현하는 세포를 생성하였다. 이들 세포를 후속적으로 Her2-양성 HCC1954 또는 SKBR3 표적 세포 및 Her2-표적화 트라스투주맙을 사용하는 IL2 방출 검정에 사용하였다.
T-세포 (이펙터; E) 및 HCC1954 표적 세포 (표적; T)를 10% 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 200-μL 반응 부피로 1 μg/mL 트라스투주맙의 존재 하에 1:1 이펙터-대-표적 비 (120,000개 이펙터 세포; 120,000개 표적 세포)로 인큐베이션하였다. T-세포 (이펙터; E) 및 SKBR3 표적 세포 (표적; T)를 10% 소 태아 혈청으로 보충된 RPMI 1640 배지에서 100-μL 반응 부피로 1 μg/mL 트라스투주맙의 존재 하에 1:1 이펙터-대-표적 비 (30,000개 이펙터 세포; 30,000개 표적 세포)로 인큐베이션하였다. 반응물을 CO2 (5%) 인큐베이터에서 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다.
상청액을 균질 시간 분해 형광 (HTRF) 검정 (시스바이오)을 사용하여 IL-2에 대해 분석하였다. 간략하게, 시토카인 표준 및 접합체를 제조업체의 프로토콜에 따라 제조하였다. 저부피 384-웰 플레이트에서, 10-μL 부피의 접합체 및 10-μL 부피의 세포 상청액을 24시간 동안 공동-인큐베이션하였다. 형광 신호를 엔비전 다중-표지 플레이트 판독기를 사용하여 측정하고, 데이터를 제조업체의 권장사항에 따라 분석하였다.
각각의 표적/공여자 쌍에 대해, 방출된 IL-2의 양을 ACTR 변이체 서열식별번호: 2에 의해 방출된 것에 대해 정규화시켰다. 평균 상대 IL-2는 도 42에서 ACTR 변이체의 함수로서 플롯팅된다. 시험된 모든 ACTR 변이체를 발현하는 T 세포는 T 세포 활성의 지시자인 IL-2의 생산을 보여주었다. ACTR 변이체 서열식별번호: 9는 다른 ACTR 변이체 대비 우수한 IL-2 생산을 보여주었다.
실시예 10: ACTR 변이체 서열식별번호: 9 및 서열식별번호: 26에 의한 시토카인 생산
시토카인을 생성하는 ACTR 변이체 서열식별번호: 9 및 26의 능력을 다수의 상이한 항체-표적 쌍의 존재 하에 평가하였다. 이들 실험을 위해, 서열식별번호: 9 또는 서열식별번호: 26을 발현하는 ACTR T 세포를 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 24시간 동안 표적 세포 및 다양한 농도의 표적화 항체와 함께 1:1 E:T 비로 인큐베이션하였다. ACTR을 발현하지 않은 모의 T 세포를 대조군으로서 포함시켰다. 실시예 6에 기재된 바와 같이, 상청액을 분리하고 메소 스케일 디스커버리 V-플렉스 인간 IFN-γ 및 V-플렉스 인간 IL-2 키트를 사용하여 시토카인 IL-2 및 IFN-γ에 대해 분석하였다. HER2-발현 BT20 및 SKBR3 표적 세포를 사용한 실험의 경우, 트라스투주맙을 0 - 0.5 μg/mL로 적정하고, CD20-발현 Daudi, Raji, 및 RL 표적 세포를 사용한 실험의 경우, 리툭시맙을 0 - 10 μg/mL로 적정하고, B7H3-발현 BT474 표적 세포를 사용한 실험의 경우, 항-B7H3 항체 hu8H9-6m을 적정하였다 (Ahmed et al. 2015. J. Biol. Chem., 290, pp.30018-30029). 리툭시맙 및 트라스투주맙을 상업적 공급원으로부터 수득하였다. 항-B7H3 항체 hu8H9-6m은 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 플라스미드를 프리스타일 293F 세포 (써모 사이언티픽) 내로 형질감염시키고 단백질 A 친화도를 사용하여 세포 배양 상청액으로부터 항체를 정제함으로써 생성하였다.
HER2-발현 세포주를 사용한 실험에 대해, IL-2 (도 43, 패널 A) 및 IFN-γ (도 43, 패널 B) 값을 상이한 트라스투주맙 농도에 대해 시험된 T 세포 및 표적 세포주의 함수로서 플롯팅하였다. ACTR 변이체 서열식별번호: 9 및 ACTR 변이체 서열식별번호: 26 둘 다는 항체-의존성 방식으로 IL-2 및 IFN-γ를 생산하였다. IL-2 및 IFN-γ 방출 둘 다는 트라스투주맙 및 HER2-발현 표적 세포에서 ACTR 변이체 서열식별번호: 26에 대해서보다 ACTR 변이체 서열식별번호: 9에 대해 더 높았다. 유사한 결과가 리툭시맙 및 CD20-발현 표적 세포 및 항-B7H3 항체 및 B7H3-발현 표적 세포에서 수득되었다. ACTR 변이체 서열식별번호: 9 및 ACTR 변이체 서열식별번호: 26으로 시험된 가장 높은 항체에서의 각각의 표적-항체 쌍에 대해 생산된 상대 IL-2 및 IFN-γ가 표 8에 제시된다. 유사한 실험을 추가의 표적-항체 쌍으로 수행하고, 또한 ACTR 변이체 서열식별번호: 26 대비 ACTR 변이체 서열식별번호: 9에서 증가된 시토카인 방출을 보여주었다.
표 8: ACTR 변이체 서열식별번호: 9 및 26에 의한 상대 시토카인 방출
Figure pct00019
본 연구의 결과는 CD28 공동-자극 도메인 (및 임의로 CD28 막횡단 도메인 및/또는 CD28 힌지 도메인)을 함유하는 ACTR 구축물을 발현하는 T 세포가 특정 우수한 효과 예컨대 시토카인 방출 프로파일을 보여주었음을 나타내며, 이는 이러한 ACTR 구축물이 (예를 들어, 공동-자극 분자의 발현이 결여된 암 (조혈 또는 비-조혈)의 치료를 위한) 특정 우수한 치료 측면을 가질 수 있다는 것을 나타낸다.
다른 실시양태
본 명세서에 개시된 모든 특색은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특색은 동일한, 동등한 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특색으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특색은 단지 일반적인 일련의 동등한 또는 유사한 특색의 예이다.
상기 설명으로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있고, 그의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서, 본 개시내용을 다양하게 변화 및 변형시킴으로써 다양한 용법 및 조건에 맞게 적합화할 수 있다. 따라서, 다른 실시양태도 또한 청구범위 내에 포함된다.
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 20 25 30 <210> 30 <211> 45 <212> PRT <213> Synthetic polypeptide <400> 30 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 35 40 45 <210> 31 <211> 60 <212> PRT <213> Synthetic polypeptide <400> 31 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 50 55 60 <210> 32 <211> 75 <212> PRT <213> Synthetic polypeptide <400> 32 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 <210> 33 <211> 150 <212> PRT <213> Synthetic polypeptide <400> 33 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 <210> 34 <211> 225 <212> PRT <213> Synthetic polypeptide <400> 34 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 165 170 175 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser 225 <210> 35 <211> 300 <212> PRT <213> Synthetic polypeptide <400> 35 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 35 40 45 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 65 70 75 80 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 85 90 95 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 130 135 140 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 145 150 155 160 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 165 170 175 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 180 185 190 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 195 200 205 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 210 215 220 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 225 230 235 240 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 245 250 255 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 260 265 270 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 275 280 285 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 290 295 300 <210> 36 <211> 208 <212> PRT <213> Synthetic polypeptide <400> 36 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Phe 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 <210> 37 <211> 254 <212> PRT <213> Synthetic polypeptide <400> 37 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala 1 5 10 15 Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val Val Phe Leu Glu Pro 20 25 30 Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val Thr Leu Lys Cys Gln 35 40 45 Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Glu 50 55 60 Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe Ile Asp Ala Ala Thr 65 70 75 80 Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr Asn Leu Ser Thr Leu 85 90 95 Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly Trp Leu Leu Leu Gln 100 105 110 Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro Ile His Leu Arg Cys 115 120 125 His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn 130 135 140 Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser Asp Phe Tyr Ile Pro 145 150 155 160 Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Val 165 170 175 Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn Ile Thr Ile Thr Gln 180 185 190 Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe Pro Pro Gly Tyr Gln 195 200 205 Val Ser Phe Cys Leu Val Met Val Leu Leu Phe Ala Val Asp Thr Gly 210 215 220 Leu Tyr Phe Ser Val Lys Thr Asn Ile Arg Ser Ser Thr Arg Asp Trp 225 230 235 240 Lys Asp His Lys Phe Lys Trp Arg Lys Asp Pro Gln Asp Lys 245 250 <210> 38 <211> 411 <212> PRT <213> Synthetic polypeptide <400> 38 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val 20 25 30 Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val 35 40 45 Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln 50 55 60 Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe 65 70 75 80 Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr 85 90 95 Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly 100 105 110 Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro 115 120 125 Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val 130 135 140 Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser 145 150 155 160 Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe 165 170 175 Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn 180 185 190 Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe 195 200 205 Pro Pro Gly Tyr Gln Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 210 215 220 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys 225 230 235 240 Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg 245 250 255 Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp 260 265 270 Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala 275 280 285 Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu 290 295 300 Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp 305 310 315 320 Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu 325 330 335 Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile 340 345 350 Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr 355 360 365 Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met 370 375 380 Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu 385 390 395 400 Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly 405 410 <210> 39 <211> 255 <212> PRT <213> Synthetic polypeptide <400> 39 Pro Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp 1 5 10 15 Pro Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu 20 25 30 Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val 35 40 45 Phe Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly 50 55 60 Ser Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp 65 70 75 80 Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu 85 90 95 Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser 100 105 110 Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys 115 120 125 Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val 130 135 140 Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly 145 150 155 160 Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly 165 170 175 Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu 180 185 190 Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser 195 200 205 Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg 210 215 220 His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg 225 230 235 240 Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu 245 250 255 <210> 40 <211> 456 <212> PRT <213> Synthetic polypeptide <400> 40 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val 20 25 30 Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val 35 40 45 Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln 50 55 60 Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe 65 70 75 80 Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr 85 90 95 Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly 100 105 110 Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro 115 120 125 Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val 130 135 140 Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser 145 150 155 160 Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe 165 170 175 Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn 180 185 190 Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe 195 200 205 Pro Pro Gly Tyr Gln Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 210 215 220 Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 225 230 235 240 Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala 245 250 255 Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu 260 265 270 Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Ser Lys Arg Ser Arg 275 280 285 Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro 290 295 300 Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala 305 310 315 320 Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr 325 330 335 Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg 340 345 350 Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met 355 360 365 Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu 370 375 380 Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys 385 390 395 400 Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu 405 410 415 Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu 420 425 430 Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala 435 440 445 Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly 450 455

Claims (97)

  1. (i) CD16A 세포외 도메인,
    (ii) 막횡단 도메인,
    (iii) 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인 (그 중 적어도 1개는 CD28 공동-자극 신호전달 도메인임), 및
    (iv) CD3ζ 세포질 신호전달 도메인
    을 포함하는 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR) 폴리펩티드이며;
    여기서 막횡단 도메인 (ii)이 CD8 막횡단 도메인인 경우에, ACTR 폴리펩티드는 임의의 비-CD16A 수용체로부터의 힌지 도메인이 없거나 또는 1개 초과의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 것인
    ACTR 폴리펩티드.
  2. 제1항에 있어서, 힌지 도메인을 추가로 포함하며, 여기서 힌지 도메인은 1 내지 60개 아미노산 잔기 길이인 ACTR 폴리펩티드.
  3. 제2항에 있어서, 힌지 도메인이 1 내지 30개 아미노산 잔기 길이인 ACTR 폴리펩티드.
  4. 제2항에 있어서, 힌지 도메인이 31 내지 60개 아미노산 잔기 길이인 ACTR 폴리펩티드.
  5. 제2항에 있어서, 힌지 도메인이 CD16A 힌지 도메인, 비-CD16A 수용체 힌지 도메인, 또는 그의 조합인 ACTR 폴리펩티드.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 도메인이 CD28 힌지 도메인을 포함하는 것인 ACTR 폴리펩티드.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 막횡단 도메인 (ii)이 CD28 막횡단 도메인인 ACTR 폴리펩티드.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, (i) CD28 공동-자극 도메인; 및 (ii) CD28 막횡단 도메인, CD28 힌지 도메인, 또는 그의 조합을 포함하는 ACTR 폴리펩티드.
  9. 제8항에 있어서, 서열식별번호: 9, 서열식별번호: 19, 서열식별번호: 20, 서열식별번호: 21, 서열식별번호: 22 또는 서열식별번호: 27의 아미노산 서열을 포함하는 ACTR 폴리펩티드.
  10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 2개의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하며, 하나는 CD28 공동-자극 신호전달 도메인이고 다른 것은 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인 또는 OX40 공동-자극 신호전달 도메인인 ACTR 폴리펩티드.
  11. 제10항에 있어서, 막횡단 도메인 (ii)이 CD8 막횡단 도메인인 ACTR 폴리펩티드.
  12. 제11항에 있어서, CD8 힌지 도메인을 추가로 포함하는 ACTR 폴리펩티드.
  13. 제1항에 있어서, 임의의 비-CD16A 수용체로부터의 힌지 도메인이 없는 ACTR 폴리펩티드.
  14. (i) CD16A 세포외 도메인,
    (ii) 막횡단 도메인, 및
    (iii) CD3ζ 세포질 신호전달 도메인
    을 포함하는 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR) 폴리펩티드이며;
    여기서 ACTR 폴리펩티드는 임의의 비-CD16A 수용체로부터의 힌지 도메인이 없는 것인
    ACTR 폴리펩티드.
  15. 제14항에 있어서, 임의의 힌지 도메인이 없는 ACTR 폴리펩티드.
  16. 제13항 또는 제14항에 있어서, 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 추가로 포함하는 ACTR 폴리펩티드.
  17. 제16항에 있어서, 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인이 CD27, CD28, 4-1BB, ICOS 및 OX40으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 ACTR 폴리펩티드.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 2개의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 ACTR 폴리펩티드.
  19. 제18항에 있어서, 2개의 공동-자극 신호전달 도메인 중 하나가 CD28 공동-자극 신호전달 도메인이고 다른 하나가 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인, OX40 공동-자극 신호전달 도메인, CD27 공동-자극 신호전달 도메인 또는 ICOS 공동-자극 신호전달 도메인인 ACTR 폴리펩티드.
  20. 제19항에 있어서, 다른 공동-자극 신호전달 도메인이 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인인 ACTR 폴리펩티드.
  21. 제20항에 있어서, 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인이 CD28 공동-자극 신호전달 도메인에 대해 N-말단에 위치하는 것인 ACTR 폴리펩티드.
  22. 제19항에 있어서, 다른 공동-자극 신호전달 도메인이 OX40 공동-자극 신호전달 도메인인 ACTR 폴리펩티드.
  23. 제22항에 있어서, OX40 공동-자극 신호전달 도메인이 CD28 공동-자극 신호전달 도메인에 대해 C-말단에 위치하는 것인 ACTR 폴리펩티드.
  24. 제16항에 있어서, 단일 공동-자극 신호전달 도메인을 함유하며, 여기서 단일 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28로부터의 것인 ACTR 폴리펩티드.
  25. 제24항에 있어서, 막횡단 도메인이 CD8 막횡단 도메인인 ACTR 폴리펩티드.
  26. 제25항에 있어서, 서열식별번호: 2, 서열식별번호: 13 또는 서열식별번호: 17의 아미노산 서열을 포함하는 ACTR 폴리펩티드.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 ACTR 폴리펩티드인 제1 폴리펩티드를 코딩하는 제1 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산.
  28. 제27항에 있어서, 공동-자극 신호를 도출하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 제2 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 핵산.
  29. 제28항에 있어서, 제2 폴리펩티드가 공동-자극 수용체, 그의 리간드, 또는 공동-자극 수용체에 대한 결합 모이어티를 포함하는 것인 핵산.
  30. 제28항에 있어서, 제2 폴리펩티드가 4-1BB, ICOS, OX40, CD27 또는 CD28에 대한 결합 모이어티를 포함하는 것인 핵산.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 결합 모이어티가 단일-쇄 항체 (scFv)인 핵산.
  32. 제28항에 있어서, 제2 폴리펩티드가 4-1BBL, CD80, CD86, OX40L, ICOSL, CD70, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 핵산.
  33. 제32항에 있어서, 제2 폴리펩티드가 4-1BBL을 포함하는 것인 핵산.
  34. 제33항에 있어서, 제1 폴리펩티드가 서열식별번호: 13의 아미노산 서열을 포함하고/거나 제2 폴리펩티드가 서열식별번호: 24의 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산.
  35. 제27항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 뉴클레오티드 서열과 제2 뉴클레오티드 서열 사이에 위치하는 제3 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하며, 여기서 제3 뉴클레오티드 서열은 리보솜 스키핑 부위, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) 또는 제2 프로모터를 코딩하는 것인 핵산.
  36. 제35항에 있어서, 리보솜 스키핑 부위가 P2A 펩티드인 핵산.
  37. 제27항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 벡터 내에 존재하는 핵산.
  38. 제37항에 있어서, 벡터가 발현 벡터인 핵산.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 벡터가 아데노-연관 바이러스 (AAV)인 핵산.
  40. 제37항 또는 제38항에 있어서, 벡터가 레트로바이러스 벡터인 핵산.
  41. 제40항에 있어서, 레트로바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터 또는 감마 레트로바이러스 벡터인 핵산.
  42. 제27항 내지 제41항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  43. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항의 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR) 폴리펩티드인 제1 폴리펩티드를 발현하는 면역 세포.
  44. 제43항에 있어서, T 세포 또는 자연 킬러 (NK) 세포인 면역 세포.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서, 공동-자극 도메인 또는 공동-자극 수용체의 리간드를 포함하는 제2 폴리펩티드를 추가로 발현하는 면역 세포.
  46. 제45항에 있어서, 제2 폴리펩티드가 4-1BBL, CD80, CD86, OX40L, ICOSL, CD70, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 면역 세포.
  47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 폴리펩티드가 4-1BBL을 포함하는 것인 면역 세포.
  48. 항체-의존성 세포-매개 세포독성의 증진을 필요로 하는 대상체에게 (i) 유효량의 제43항 내지 제47항 중 어느 한 항의 면역 세포 또는 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항의 벡터, 및 (ii) 유효량의 치료 항체를 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 증진시키는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 치료 항체가 TNF-알파, HER2, CD52, CD38, BCMA, GPC3, PDGF-R-알파, CD25, VEGF, BLyS, CD30, IL1-B, EGFR, RANK 리간드, GD2, C5, CD11a, CD22, CD33, CTLA4, CEACAM5, 알파-4 인테그린, CD20, CD19, IgE, RSV, VEGFR2, IL6R, IL12, IL23, 인테그린 알파4-베타7 또는 PSMA에 특이적인 것인 방법.
  50. 제48항 또는 제49항에 있어서, 치료 항체가 아달리무맙, 아도-트라스투주맙 엠탄신, 알렘투주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 바실릭시맙, 베바시주맙, 벨리무맙, 브렌툭시맙 베도틴, 카나키누맙, 세툭시맙, 다라투무맙, 다클리주맙, 데노수맙, 디누툭시맙, 두르발루맙, 에쿨리주맙, 에팔리주맙, 에프라투주맙, 겜투주맙, 골리무맙, 인플릭시맙, 이필리무맙, 라베투주맙, 나탈리주맙, 오비누투주맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 오말리주맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 페르투주맙, 라무시루맙, 리툭시맙, 토실리주맙, 트라스투주맙, 우스테키누맙 및 베돌리주맙으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 대상체로부터 단리된 자가 T 세포인 방법.
  52. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 T 세포이고 T 세포는 동종인 방법.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 T 세포이고 T 세포는 내인성 T 세포 수용체가 억제되거나 제거된 것인 방법.
  54. 제48항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 T 세포이고 T 세포는 투여 전에 생체외에서 확장 및/또는 활성화된 것인 방법.
  55. 제48항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 암을 갖거나 또는 갖는 것으로 의심되는 인간 환자인 방법.
  56. 제27항 내지 제41항 중 어느 한 항의 핵산을 면역 세포의 집단 내로 도입시키는 것을 포함하는, 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR)를 발현하는 면역 세포를 제조하는 방법.
  57. 제56항에 있어서, ACTR을 발현하는 면역 세포를 확인 또는 단리하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 핵산이 레트로바이러스 형질도입, 렌티바이러스 형질도입, DNA 전기천공 및 RNA 전기천공으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의해 면역 세포 내로 도입되는 것인 방법.
  59. (i) CD28 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR)인 제1 폴리펩티드; 및
    (ii) 공동-자극 신호를 도출하는 제2 폴리펩티드
    를 발현하는 유전자 조작된 면역 세포.
  60. 제59항에 있어서, ACTR이 임의의 공동-자극 신호전달 도메인이 없는 것인 유전자 조작된 면역 세포.
  61. 제59항 또는 제60항에 있어서, 제2 폴리펩티드가 공동-자극 수용체, 그의 리간드, 또는 공동-자극 수용체에 대한 결합 모이어티를 포함하는 것인 유전자 조작된 면역 세포.
  62. 제61항에 있어서, 결합 모이어티가 단일-쇄 항체 (scFv)인 유전자 조작된 면역 세포.
  63. (i) 고형 종양의 치료를 필요로 하는 대상체에게 유효량의 1종 이상의 림프구고갈제를 투여하는 것;
    (ii) (i) 후에 대상체에게 항-CD20 항체를 투여하는 것; 및
    (iii) (ii) 후에 대상체에게
    (a) CD16의 Fc 결합 도메인;
    (b) CD28의 공동-자극 신호전달 도메인, 및
    (c) CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인
    을 포함하는 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR)를 발현하는 면역 세포를 투여하는 것
    을 포함하는, 고형 종양을 치료하는 방법.
  64. 제63항에 있어서, ACTR이 (a)와 (b) 사이에 위치하는, CD28로부터의 힌지 도메인 및/또는 CD28로부터의 막횡단 도메인을 추가로 포함하는 것인 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, CD16이 CD16V 이소형인 방법.
  66. 제63항에 있어서, ACTR이 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  67. 제63항에 있어서, 고형 종양이 림프종인 방법
  68. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 재발성 또는 불응성 CD20+ B 세포 림프종을 갖는 인간 환자인 방법.
  69. 제68항에 있어서, 재발성 또는 불응성 CD20+ B 세포 림프종이 미만성 대 B-세포 림프종 (DLBCL), 외투 세포 림프종 (MCL), 원발성 종격 B 세포 림프종 (PMBCL), 등급 3b 여포성 림프종 (Gr3b-FL), 및 변형된 조직학 여포성 림프종 (TH-FL)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  70. 제63항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 림프구고갈제가 플루다라빈 및 시클로포스파미드인 방법.
  71. 제63항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CD20 항체가 리툭시맙인 방법.
  72. 제63항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 세포가 T 세포인 방법.
  73. 제72항에 있어서, ACTR을 발현하는 T 세포가 대상체에게 40 x 106개 세포, 80 x 106개 세포, 150 x 106개 세포 또는 300 x 106개 세포의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  74. 제63항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 단계 (iii) 전 및 후에 항-CD20 항체를 투여받는 것인 방법.
  75. 제63항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, ACTR을 발현하는 면역 세포가 대상체로부터 면역 세포를 수집하고 ACTR의 발현을 위해 ACTR을 코딩하는 핵산을 면역 세포 내로 도입시킴으로써 제조되는 것인 방법.
  76. 제75항에 있어서, 수집 단계가 백혈구분리반출술을 포함하는 것인 방법.
  77. 제63항 내지 제76항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 질환 제어를 위한 화학요법 하에 있었거나 있는 것인 방법.
  78. 세포독성의 유도를 필요로 하는 대상체에게
    (i) 활성화된 T 세포의 표면 상에 발현된 항원에 특이적인 항체; 및
    (ii) (a) Fc 결합 도메인;
    (b) 막횡단 도메인;
    (c) 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인; 및
    (d) 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 세포질 신호전달 도메인
    을 포함하는 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR)를 발현하는 T 세포
    를 투여하는 것을 포함하며,
    여기서 (c) 또는 (d)는 키메라 수용체의 C-말단에 위치하는 것인,
    대상체에서 세포독성을 유도하는 방법.
  79. 제78항에 있어서, Fc 결합 도메인이 Fc 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인인 방법.
  80. 제79항에 있어서, Fc 수용체가 CD16인 방법.
  81. 제78항 내지 제80항 중 어느 한 항에 있어서, 공동-자극 신호전달 도메인이 4-1BB 또는 CD28의 것인 방법.
  82. 제78항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, ACTR이 (a)와 (b) 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함하는 것인 방법.
  83. 제78항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 세포질 신호전달 도메인이 CD3ζ의 것인 방법.
  84. 제78항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, ACTR이
    (a) CD16의 Fc 결합 도메인;
    (b) CD28의 힌지 도메인, CD28의 막횡단 도메인, 또는 그의 조합;
    (c) CD28의 공동-자극 신호전달 도메인, 및
    (d) CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인
    을 포함하는 것인 방법.
  85. 제84항에 있어서, ACTR이 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  86. 제78항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 CD38, CD7 또는 CD5에 특이적인 것인 방법.
  87. 제78항 내지 제86항 중 어느 한 항에 있어서, ACTR을 발현하는 T 세포가 시험관내에서 확장된 것인 방법.
  88. (i) 활성화된 T 세포 상에서 발현된 항원에 특이적인 항체, 및
    (ii) (a) Fc 결합 도메인;
    (b) 막횡단 도메인;
    (c) 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인; 및
    (d) 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 세포질 신호전달 도메인
    을 포함하는 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR)를 발현하는 T 세포
    를 포함하며;
    여기서 (c) 또는 (d)는 키메라 수용체의 C-말단에 위치하는 것인
    키트.
  89. 제88항에 있어서, Fc 결합 도메인이 Fc 수용체의 세포외 리간드 결합 도메인인 키트.
  90. 제89항에 있어서, Fc 수용체가 CD16인 키트.
  91. 제88항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 공동-자극 신호전달 도메인이 4-1BB 또는 CD28의 것인 키트.
  92. 제88항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, ACTR이 (a)와 (b) 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함하는 것인 키트.
  93. 제88항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 세포질 신호전달 도메인이 CD3ζ의 것인 키트.
  94. 제88항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, ACTR이
    (a) CD16의 Fc 결합 도메인;
    (b) CD28의 힌지 및 막횡단 도메인;
    (c) CD28의 공동-자극 신호전달 도메인, 및
    (d) CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인
    을 포함하는 것인 키트.
  95. 제94항에 있어서, ACTR이 서열식별번호: 9의 아미노산 서열을 포함하는 것인 키트.
  96. 제88항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 CD38, CD7 또는 CD5에 특이적인 것인 키트.
  97. 제88항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, ACTR을 발현하는 T 세포가 시험관내에서 확장된 것인 키트.
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