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KR20190115079A - 암 요법 및 b 세포 장애에서의 항-bcma 항체 및 항체-커플링된 t 세포 수용체 (actr)의 공동-사용 - Google Patents

암 요법 및 b 세포 장애에서의 항-bcma 항체 및 항체-커플링된 t 세포 수용체 (actr)의 공동-사용 Download PDF

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KR20190115079A
KR20190115079A KR1020197026910A KR20197026910A KR20190115079A KR 20190115079 A KR20190115079 A KR 20190115079A KR 1020197026910 A KR1020197026910 A KR 1020197026910A KR 20197026910 A KR20197026910 A KR 20197026910A KR 20190115079 A KR20190115079 A KR 20190115079A
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cells
leu
antibody
actr
gly
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Application number
KR1020197026910A
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English (en)
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헤더 휴엣
세쓰 에텐버그
장고 서스먼
투바 치마
테일러 히크먼
케이티 오캘러헌
모린 라이언
Original Assignee
유넘 테라퓨틱스 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)의 증진을 필요로 하는 대상체에게 항-BCMA 항체의 치료 유효량, 및 이뮤노글로불린 분자 (Ig)의 Fc 부분에 대해 친화도를 갖고 그에 특이적인 세포외 도메인; 막횡단 도메인; 임의로 공동-자극 도메인 중 1개 이상, 및 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있는 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR) 구축물을 발현하는 T 림프구 및/또는 NK 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 증진시키는 방법이 본원에 개시된다.

Description

암 요법 및 B 세포 장애에서의 항-BCMA 항체 및 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR)의 공동-사용
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2017년 2월 17일에 출원된 미국 가출원 번호 62/460,669의 출원일의 이익을 주장하며, 그의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
세포-기반 요법, 항체 요법 및 시토카인 요법을 포함한 암 면역요법은, 정상 조직은 그대로 두면서 비정상 세포 (예컨대 종양 세포)를 공격하는 면역 반응을 촉발하는데 사용된다. 이는 약물 내성의 유전자 및 세포 메카니즘을 피하고, 정상 조직은 그대로 두면서 종양 세포를 표적화하는 그의 잠재력 때문에, 다양한 유형의 암을 치료하기 위한 유망한 옵션이다. T-림프구는 혈액 악성종양에 대한 동종 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)의 결과에 의해 입증된 바와 같이 주요 항-종양 효과를 발휘할 수 있으며, 여기서 T-세포-매개된 이식편-대-숙주 질환 (GvHD)은 질환 재발과 역으로 연관되고, 면역억제 철회 또는 공여자 림프구의 주입은 재발을 함유할 수 있다. 문헌 [Weiden et al., NEnglJ Med. 1979;300(19):1068-1073; Porter et al., NEnglJ Med. 1994;330(2):100-106; Kolb et al., Blood. 1995;86(5):2041-2050; Slavin et al., Blood. 1996;87(6):2195-2204; 및 Appelbaum, Nature. 2001;411(6835):385-389]. 이는 또한 B 세포 및 형질 세포 매개 질환 예컨대 자가면역 장애 및 염증성 장애의 유망한 치료이다.
세포-기반 요법은 암 세포, B 세포, 및 형질 세포에 대해 편향된 반응성을 갖는 세포독성 T 세포를 수반할 수 있다. 문헌 [Eshhar et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.; 1993;90(2):720-724; Geiger et al., J Immunol. 1999;162(10):5931-5939; Brentjens et al., Nat. Med. 2003;9(3):279-286; Cooper et al., Blood. 2003;101(4):1637-1644; 및 Imai et al., Leukemia. 2004;18:676-684]. 하나의 접근법은 1개 이상의 T 세포 활성화 신호전달 도메인에 융합된 항원-결합 도메인을 갖는 키메라 수용체를 발현하는 것이다. 항원-결합 도메인을 통해 암, B 세포, 및 형질 세포 항원에 결합하게 되면, T 세포는 활성화되고, 세포독성이 촉발된다. 키메라 수용체-발현 자가 T 림프구 주입을 사용한 임상 시험의 최근의 결과는 그들의 임상 잠재력의 유력한 증거를 제공하였다. 문헌 [Pule et al., Nat. Med. 2008;14(11):1264-1270; Porter et al., N Engl J Med; 2011; 25;365(8):725-733; Brentjens et al., Blood. 2011;118(18):4817-4828; Till et al., Blood. 2012;119(17):3940-3950; Kochenderfer et al., Blood. 2012;119(12):2709-2720; 및 Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013;5(177):177ra138].
또 다른 접근법은 면역 세포, 예컨대 NK 세포 또는 T 세포에서 항체-커플링된 T 세포 수용체 (ACTR) 단백질을 발현하는 것이다. ACTR 단백질은 세포외 Fc-결합 도메인을 함유한다. ACTR-발현 T 세포 ("ACTR T 세포"로도 불림)가 대상체에게 특정 유형의 세포, 예를 들어 암 세포를 표적화하는 항체와 함께 투여되는 경우에, 이들은 항체의 Fc 도메인에 대한 그의 결합을 통해 항체에 의해 표적화되는 표적화된 세포에 대한 독성을 증진시킬 수 있다. 문헌 [Kudo et al., Cancer Research (2014) 74:93-103].
항체-기반 면역요법, 예컨대, 모노클로날 항체, 항체-융합 단백질, 및 항체 약물 접합체 (ADC)는 많은 유형의 암, B 세포 매개 장애, 및 형질 세포 매개 장애를 포함한 매우 다양한 질환을 치료하는데 사용된다. 이러한 요법은 정상 세포 (예를 들어, 비-암 세포)에 비해, 제거하고자 하는 세포 (예를 들어, 표적 세포 예컨대 암 세포) 상에 차등 발현되는 세포 표면 분자의 인식에 따라 달라질 수 있다. 항체-기반 면역요법의 표적 세포에 대한 결합은 다양한 메카니즘, 예를 들어, 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC), 보체-의존성 세포독성 (CDC), 또는 항체-약물 접합체 (ADC)로부터의 페이로드의 직접적인 세포독성 활성을 통해 표적 세포 사멸을 일으킬 수 있다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR)를 발현하는 면역 세포 및 B-세포 성숙 항원 (BCMA)에 특이적인 항체의 공동-사용을 수반하는, 대상체에서 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 증진시키기 위한 방법의 개발에 기초한다. 항-BCMA 항체와 조합된, 본원에 기재된 개선된 ACTR 구축물을 발현하는 T 세포는 세포독성, 세포 증식 및 활성화 (예를 들어, IL-2 생산, CD25+ 및/또는 CD69+ 세포의 백분율)를 포함한 우수한 생체내 및 시험관내 생물활성, 및/또는 생체내 항암 활성 (예를 들어, 항-BCMA 양성 표적 세포, 예컨대 다발성 골수종 세포 활성)을 입증하였다.
따라서, 본 개시내용의 한 측면은 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)의 증진을 필요로 하는 대상체에게 항-BCMA 항체의 치료 유효량, 및 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR) 구축물을 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포일 수 있는 면역 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 증진시키는 방법을 제공한다.
ACTR 구축물은 (a) Fc 결합 도메인; (b) 막횡단 도메인; (c) 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 세포질 신호전달 도메인 및 임의로 (d) 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 세포질 신호전달 도메인 (c) 또는 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인 (d)은 ACTR 구축물의 C-말단에 위치할 수 있다. 일부 예에서, 세포질 신호전달 도메인은 ACTR 구축물의 C-말단에 위치할 수 있다.
일부 실시양태에서, ACTR 구축물은 (e) 힌지 도메인을 추가로 포함할 수 있고, 이는 (a)의 C-말단 및 (b)의 N-말단에 위치할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, ACTR 구축물은 그의 N-말단에 신호 펩티드를 추가로 포함할 수 있고, 이는 CD8α로부터 유래될 수 있다.
일부 실시양태에서, ACTR 구축물에서 Fc 결합 도메인 (a)은 (i) 임의로 Fc-감마 수용체, Fc-알파 수용체, 또는 Fc-엡실론 수용체인, Fc-수용체의 세포외 리간드-결합 도메인, (ii) 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 결합하는 항체 단편, (iii) 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 결합하는 자연 발생 단백질 또는 그의 Fc-결합 단편, 또는 (iv) 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 결합하는 합성 폴리펩티드일 수 있다. 일부 예에서, Fc 결합 도메인은 CD16A, CD32A 또는 CD64A 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 특정 실시양태에서, CD16A의 세포외 리간드-결합 도메인은 CD16A F158 (일명, F158 FCGR3A) 또는 CD16A V158 (일명, V158 FCGR3A)이다. 다른 예에서, Fc 결합 도메인은 (ii)이고, 이는 단일 쇄 가변 단편 (ScFv), 도메인 항체, 또는 나노바디이다. 다른 예에서, Fc 결합 도메인은 (iii)이고, 이는 단백질 A 또는 단백질 G이다. 대안적으로, Fc 결합 도메인은 (iv)이고, 이는 쿠니츠 펩티드, SMIP, 아비머, 아피바디, DARPin, 또는 안티칼린이다.
일부 실시양태에서, ACTR 구축물의 막횡단 도메인 (b)은 단일-통과 막 단백질의 것일 수 있다. 예를 들어, 막횡단 도메인은 CD8α, CD8β, 4-1BB, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16A, OX40, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, CD32, CD64, VEGFR2, FAS, PD1, 또는 FGFR2B의 것이다. 대안적으로, (b)의 막횡단 도메인은 비-자연 발생 소수성 단백질 절편일 수 있다.
일부 실시양태에서, ACTR의 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인 (d)은 4-1BB, CD28, CD28LL->GG 변이체, OX40, ICOS, CD27, GITR, HVEM, TIM1, LFA1, 또는 CD2의 것일 수 있다. 일부 예에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 단일 공동-자극 신호전달 도메인 (ACTR 구축물의 유일한 공동-자극 신호전달 도메인으로서) 또는 2개의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 예시적인 공동-자극 신호전달 도메인 조합은 (i) CD28 및 4-1BB; (ii) CD28LL->GG 변이체 및 4-1BB; (iii) CD28 및 CD27; 또는 (iv) CD28 및 OX40을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, ACTR 구축물의 세포질 신호전달 도메인 (c)은 CD3ζ 또는 FcεR1γ의 세포질 도메인일 수 있다.
일부 실시양태에서, 힌지 도메인 (e)은 CD8α, CD28, 또는 IgG의 것일 수 있다. 대안적으로, 힌지 도메인은 비-자연 발생 펩티드, 예를 들어, 연장된 재조합 폴리펩티드 (XTEN) 또는 (Gly4Ser)n 폴리펩티드일 수 있고, 여기서 n은 3-12의 정수이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 1 내지 60개의 아미노산 잔기 길이, 예를 들어 1 내지 30개의 아미노산 잔기 길이 또는 31 내지 60개의 아미노산 잔기 길이이다.
일부 실시양태에서, ACTR 구축물은 (i) 4-1BB 또는 CD28의 단일 공동-자극 도메인, 및 (ii) CD8 또는 CD28의 힌지 도메인, CD8 또는 CD28의 막횡단 도메인, 또는 그의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, ACTR 구축물은 (i) 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인, 및 (ii) CD8 힌지 도메인, CD8 막횡단 도메인, 또는 그의 조합을 포함한다. 특정 실시양태에서, ACTR 구축물은 (i) CD28 공동-자극 신호전달 도메인, 및 (ii) CD28 힌지 도메인, CD28 막횡단 도메인, 또는 그의 조합을 포함한다. 구체적 실시양태에서, ACTR 구축물에 임의의 비-CD16A 수용체로부터의 힌지 도메인이 부재한다. 일부 실시양태에서, ACTR 구축물에 임의의 힌지 도메인이 부재한다. 특정 실시양태에서, ACTR 구축물은 CD28 공동-자극 신호전달 도메인 및 임의로 CD8 막횡단 도메인을 포함한다.
일부 구체적 예에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 (a) F158 FCGR3A 또는 V158 FCGR3A의 세포외 리간드-결합 도메인, (b) CD8α의 힌지 및 막횡단 도메인, (c) CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인, 및 임의로 (d) 4-1BB의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하며, 여기서 (c) 또는 (d)는 ACTR 구축물의 C-말단에 위치한다. 예를 들어, ACTR 구축물은 서열식별번호(SEQ ID NO): 1의 잔기 22 내지 436, 또는 서열식별번호: 31의 잔기 22 내지 436의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 하나의 특정한 예에서, ACTR 구축물은 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 31의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구체적 예에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 (a) F158 FCGR3A 또는 V158 FCGR3A의 세포외 리간드-결합 도메인, (b) CD28의 힌지 및 막횡단 도메인, (c) CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인, 및 임의로 (d) CD28의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하며, 여기서 (c) 또는 (d)는 ACTR 구축물의 C-말단에 위치한다. 예를 들어, ACTR 구축물은 서열식별번호: 57의 잔기 22-432의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 하나의 특정한 예에서, ACTR 구축물은 서열식별번호: 57의 아미노산 서열을 포함한다.
추가의 구체적 예에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 (a) F158 FCGR3A 또는 V158 FCGR3A의 세포외 리간드-결합 도메인, (b) CD8α의 막횡단 도메인, (c) CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인, 및 임의로 (d) CD28의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하며, 여기서 (c) 또는 (d)는 ACTR 구축물의 C-말단에 위치한다. 예를 들어, ACTR 구축물은 서열식별번호: 58의 잔기 22-390의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 하나의 특정한 예에서, ACTR 구축물은 서열식별번호: 58의 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 치료될 대상체는 BCMA-양성 암을 갖는 인간 환자이다. 본원에 사용된 용어 "BCMA-양성 암"은 TNFRSF17로도 공지되어 있는 B-세포 성숙 항원 (BCMA)을 발현하는 암 세포를 갖는 암을 지칭한다. 일부 실시양태에서, BCMA-양성 암은 골수종, 백혈병 또는 림프종을 포함하나 이에 제한되지는 않는 혈액암이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 류마티스 관절염, 전신 루푸스 E (SLE), 제I형 당뇨병, 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 혈소판감소성 자반증, 다발성 경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 원발성 담즙성 간경변증, 육아종증 다발혈관염 (GPA), 결핵, 또는 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)을 포함하나 이에 제한되지는 않는, B 세포 매개 장애 또는 형질 세포 매개 장애를 갖는 인간 환자이다.
본원에 기재된 임의의 방법에 사용하기 위한 T 림프구 또는 NK 세포는 대상체로부터 단리된 자가 T 림프구 또는 자가 NK 세포일 수 있다. 대안적으로, 본원에 기재된 임의의 방법에 사용하기 위한 T 림프구 또는 NK 세포는 동종 T 림프구 또는 동종 NK 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, 자가 T 림프구, 자가 NK 세포, 동종 T 림프구, 또는 동종 NK 세포는 대상체에의 투여 전에 생체외 활성화 및/또는 확장될 수 있다. 특정 실시양태에서, 생체외 활성화 및/또는 확장은 면역조정제 (예를 들어, 레날리도미드)의 존재 하에 수행될 수 있다.
일부 예에서, 동종 T 림프구는 내인성 T 세포 수용체의 발현이 억제되거나 제거된 T 림프구이다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, ACTR 구축물은 레트로바이러스 형질도입, 렌티바이러스 형질도입, DNA 전기천공, 및 RNA 전기천공으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 T 림프구 또는 NK 세포 내로 도입될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, ACTR 구축물을 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포는 면역조정제 (예를 들어, 레날리도미드)와 공투여될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 방법에서, 항-BCMA 항체는 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함할 수 있는 인간 또는 인간화 항체일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 방법에서, 항-BCMA 항체는 키메라 항체일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 야생형 Fc 수용체에 대해 상승된 결합 친화도를 갖는 Fc 변이체 단편을 함유할 수 있다 (예를 들어, 리툭시맙 또는 트라스투주맙에서 확인되는 것과 같은, 야생형 IgG와 비교 시). 특정 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 항체의 힌지 및/또는 CH2 도메인에 1개 이상의 돌연변이를 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항-BCMA 항체는 당조작될 수 있다 (예를 들어, 비-푸코실화될 수 있다).
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 임의의 방법에 사용되는 항-BCMA 항체는 항체 hSG16.17 또는 hSG16.45와 BCMA 내의 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 항체 hSG16.17 또는 hSG16.45와 BCMA에의 결합에 대해 경쟁한다. 일부 예에서, 항-BCMA 항체는 항체 hSG16.17 또는 hSG16.45와 동일한 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 경쇄 CDR을 포함한다. 예를 들어, 항-BCMA 항체는 항체 hSG16.17 또는 hSG16.45와 동일한 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 동일한 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, (i) 본원에 정의된 바와 같은 항-BCMA 항체 중 임의의 것, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물; 및 (ii) 본원에 정의된 바와 같은 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR) 구축물을 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포 집단을 포함하는 면역요법을 위한 키트가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 키트는 면역조정제 (예를 들어, 레날리도미드)를 추가로 포함할 수 있다.
또한 ACTR 구축물을 발현하는 면역 세포 중 임의의 것과 공동으로 본원에 기재된 표적 질환 중 임의의 것을 치료하는데 사용하기 위한 항-BCMA 항체 중 임의의 것을 포함하는 제약 조성물; 및 표적 질환을 치료하는데 사용하기 위한 의약의 제조에서의 항-BCMA 항체 및 면역 세포의 용도가 본 개시내용의 범주 내에 있다.
개시내용의 하나 이상의 실시양태의 세부사항이 하기 설명에 제시된다. 본 개시내용의 다른 특색 또는 이점은 여러 실시양태의 상세한 설명으로부터, 및 첨부된 청구범위로부터 명백할 것이다.
하기 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고, 본 개시내용의 특정 측면을 추가로 입증하기 위해 포함되며, 이는 이들 도면 중 1개 이상을 본원에 제시된 구체적 실시양태의 상세한 설명과 함께 참조하여 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1은 SG16.17 항-BCMA 항체를 사용한 유동 세포측정법에 의해 결정된 바와 같은, 상이한 종양 세포 샘플 상에서의 BCMA의 양을 보여주는 그래프의 세트이다. 측정은 기하 평균 형광 강도 (gMFI)로서 제시된다. A: 다발성 골수종 세포주 (NCI-H929, U266B1, RPMI8226, MM1S, OPM2) 및 K562 대조군 세포. B: 세포주 KMS-20, NCI-H929 및 U266B1 세포, 및 다발성 골수종 (MM) 환자-유래 골수 단핵 세포 (BMMC)의 2개의 샘플.
도 2는 유동 세포측정법에 의한 ACTR 변이체 서열식별번호: 1 T 세포에 대한 항-BCMA SG16.17 및 SG16.17SEA (비-푸코실화) 항체의 키메라 (A) 및 인간화 (B) 버전의 결합 곡선을 보여주는 그래프의 세트이다. 항-Fc 검출 항체로부터의 PE 신호의 기하 평균 형광 강도 (gMFI)를 각각의 항-BCMA 항체의 증가하는 농도에 대해 제시한다.
도 3은 항-BCMA 키메라 SG16.17, 키메라 SG16.45, 키메라 SG16.17SEA (비-푸코실화), 및 키메라 SG16.45SEA (비-푸코실화) 항체와 조합된, ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포에 의해 유도된 BCMA-발현 NCI-H929 (A) 및 U266B1 (B) 표적 세포의 항체 특이적 세포독성을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 4는 BCMA-발현 NCI-H929 표적 세포 및 항-BCMA 키메라 SG16.17, 키메라 SG16.45, 키메라 SG16.17SEA (비-푸코실화), 및 키메라 SG16.45SEA (비-푸코실화) 항체와 함께 인큐베이션된, ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포에 의한 IFNγ (A) 및 IL-2 (B) 생산을 입증하는 그래프의 세트이다.
도 5는 항-BCMA 키메라 SG16.17, 인간화 SG16.17 #1, 인간화 SG16.17 #9, 인간화 SG16.17 #10, 키메라 SG16.45, 인간화 SG16.45 #1, 인간화 SG16.45 #3, 및 인간화 SG16.45 #18 항체와 조합되어 ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포와 함께 인큐베이션된 BCMA-발현 표적 세포 (NCI-H929 세포)의 항체 특이적 세포독성을 보여주는 그래프의 세트이다. A: 항-BCMA 키메라 SG16.17, 인간화 SG16.17 #1, 인간화 SG16.17 #9, 및 인간화 SG16.17 #10 항체를 사용한 결과. B: 항-BCMA 키메라 SG16.45, 인간화 SG16.45 #1, 인간화 SG16.45 #3, 및 인간화 SG16.45 #18 항체를 사용한 결과.
도 6은 항-BCMA 인간화 SG16.17 항체, 인간화 SG16.17SEA (비-푸코실화) 항체, 및 WO2010104949A2에 제시된 NCI-뮤린 BCMA CAR 서열로부터 유래된 항체와 조합되어 ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포와 함께 인큐베이션된 BCMA-발현 NCI-H929 (A) 및 U266B1 (B) 표적 세포의 항체 특이적 세포독성을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 7은 BCMA를 발현하는 세포주 (NCI-H929, U266B1, RPMI8226, OPM2, MM1s) 및 BCMA를 발현하지 않는 세포주 (K562)에 대한 다양한 농도의 비-푸코실화 인간화 항-BCMA 항체 (hSG16.17SEA)에 의한 Jurkat 세포 활성화를 평가하기 위한 실험의 결과를 입증하는 그래프의 세트이다. A: ACTR을 발현하는 레트로바이러스로 형질도입된, NFAT 리포터 시스템을 갖는 Jurkat 세포 (Jurkat-N) (Jurkat-N-ACTR)로부터의 결과. B: 음성 대조군으로서 사용된, NFAT 리포터 시스템을 갖지만 ACTR 발현은 결여된 Jurkat 세포 (Jurkat-N)로부터의 결과.
도 8은 비-푸코실화 인간화 항-BCMA 항체 (hSG16.17SEA)와 조합되어 ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포, 또는 모의 T 세포와 함께 인큐베이션된 BCMA-발현 NCI-H929 (A) 및 U266B1 (B) 표적 세포의 항체 특이적 세포독성을 보여주는 그래프의 세트이다.
도 9는 BCMA-발현 표적 세포 (NCI-H929 표적 세포) 및 비-푸코실화 인간화 항-BCMA 항체 (hSG16.17SEA)와 함께 인큐베이션된 ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포에 의한 IFNγ 및 IL2 생산을 입증하는 그래프이다.
도 10은 ACTR T 변이체 서열식별번호: 1 세포를 비-푸코실화 인간화 항-BCMA 항체 (hSG16.17SEA)의 존재 하에 BCMA 발현 MM 표적 세포주 NCI-H929 (A); U266B1 (C), 및 RPMI-8226 (D)과 공동-인큐베이션한 경우, 제1일 및 제7일에 CD3 양성 T 세포의 증식 수준을 입증하는 일련의 그래프를 포함한다. NCI-H929 표적 세포를 대조군 모의 T 세포와 공동-인큐베이션한 경우 CD3+ T 세포의 수준의 확장은 관찰되지 않았다 (B).
도 11은 비-푸코실화 인간화 항-BCMA 항체 (hSG16.17SEA)의 존재 하에 BCMA-양성 NCI-H929 표적 세포에 의한 반복 자극 (3-4일마다) 후 ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 사용한 CD3-양성 세포의 확장 수준을 입증하는 그래프이고; 동일한 조건 하에서 BCMA-음성 K562 세포의 존재 하에서는 T 세포 확장이 관찰되지 않았다. NCI-H929 또는 K562 표적 세포를 비-푸코실화 인간화 항-BCMA 항체 (hSG16.17SEA)의 존재 하에 대조군 모의 T 세포와 공동-인큐베이션한 경우, CD3+ T 세포의 확장은 관찰되지 않았다.
도 12는 NSG 마우스의 다발성 골수종의 피하 NCI-H929 모델에서 종양 성장 및 종양 부피 종점까지의 시간을 입증하는 그래프의 세트이다. 처리군은 다음과 같았다: 비히클 (PBS 단독), hSG16.17SEA 항체 단독, ACTR 변이체 서열식별번호: 1 T-세포 단독, 및 hSG16.17SEA 항체와 조합된 ACTR 변이체 서열식별번호: 1 T-세포. hSG16.17SEA 항체로 처리된 군에 4주 동안 1주 1회 마우스당 100 μg의 항체를 투여하였고 (QWx4, 점선 수직선으로 표시됨); ACTR T-세포로 처리된 군에는 2주 동안 1주 1회 마우스당 1 x 107개 세포를 투여하였다 (QWx2, 회색 화살표로 표시됨). A: 평균 종양 부피를 상이한 치료 부문의 마우스에 대한 시간의 함수로서 플롯팅하였다. B: 연구에 남아있는 마우스의 백분율을 상이한 치료 부문의 마우스의 사전 규정된 종양 부피 종점에 대한 시간의 함수로서 플롯팅하였다.
도 13은 ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포 또는 모의 T 세포와 다양한 이펙터 T 세포 대 표적 세포 (E:T) 비로 인큐베이션된 BCMA-발현 NCI-H929 (A) 및 U266B1 (B) 표적 세포의 세포독성을 보여주는 그래프의 세트이다. 이는 1 μg/mL의 다양한 키메라 항-BCMA 항체 또는 이소형 대조군 항체의 존재 하에 수행된다.
도 14는 BCMA-양성 표적 세포 (NCI-H929 및 U266B1)와 공동-배양한 후, 1 μg/mL의 다양한 키메라 항-BCMA 항체, 또는 이소형 대조군 항체의 존재 하에서의, ACTR 변이체 서열식별번호: 1의 CD3 양성 세포 상에서의 CD25 (A) 및 CD69 (B) 활성화 마커의 수준을 입증하는 그래프의 세트이다.
도 15는 (A) BCMA+ HER2- NCI-H929 또는 (B) BCMA- HER2+ SKBR3 표적 세포 및 증가하는 농도의 항-BCMA (hSG16.17 SEA) 또는 항-HER2 (트라스투주맙) 항체의 존재 하에서의, 모의 T 세포 및 ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T 세포에 의한 IFNγ 생산을 보여주는 그래프의 세트이다. 매칭된 항체/표적 쌍과 조합된 ACTR T-세포에 의해서만 오직 강건한 시토카인 생산이 관찰되었고; 미스매칭된 항체/표적 쌍의 존재 하에서는 모의 T 세포 또는 ACTR T 세포에 의해 낮거나 부재하는 시토카인 생산이 관찰되었다.
도 16은 (A) ACTR 변이체 서열식별번호: 57 또는 (B) ACTR 변이체 서열식별번호: 58을 발현하는 T-세포에 의해 유도된 BCMA-발현 NCI-H929 표적 세포의 세포독성을 보여주는 그래프의 세트이다. 모의 T 세포는 본 실험에서 대조군으로서 포함되었다. ACTR-T-세포-매개된 세포독성은 hSG16.17 SEA 항체의 존재 하에만 관찰되었고, 이펙터-대-표적 (E:T) 비 증가에 따라 증가하였다.
도 17은 hSG16.17 SEA 항체 및 NCI-H929 표적 세포의 부재 및 존재 하에 (A) ACTR 변이체 서열식별번호: 57 및 (B) ACTR 변이체 서열식별번호: 58을 발현하는 T-세포의, CD25 발현에 의해 측정된 바와 같은, 활성화를 보여주는 그래프의 세트이다. 모의 T 세포는 본 실험에서 대조군으로서 포함되었다. 활성화 마커인 CD25의 발현은 NCI-H929 표적 세포 및 hSG16.17 SEA 항체의 존재 하에 ACTR 변이체 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 58을 발현하는 T-세포의 표면 상에서 증가하였지만, 항체의 부재 하에는 그렇지 않았다. 모의 T 세포 상에서의 CD25의 증가는 항체의 존재 또는 부재 하에 관찰되지 않았다.
도 18은 ACTR 변이체 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 58을 발현하는 T-세포에 의해 유도된 BCMA-발현 NCI-H929 (A) 표적 세포 및 BCMA-음성 K562 (B) 표적 세포의 항체 특이적 세포독성을 보여주는 그래프의 세트이다. 모의 T 세포는 본 실험에서 음성 대조군으로서 포함되었다. ACTR T-세포에 의해 매개되는 세포독성은 hSG16.17 SEA 항체의 존재 하에 농도 의존성 방식으로 BCMA-발현 표적 세포에 의해서만 관찰되었다.
도 19는 BCMA-발현 표적 세포 (NCI-H929 표적 세포) 및 다양한 농도의 항-BCMA 항체 hSG16.17SEA 항체와 함께 인큐베이션된, ACTR 변이체 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 58을 발현하는 T-세포에 의한 IFNγ (A) 및 IL2 (B) 시토카인 생산을 입증하는 그래프의 세트이다. 모의 T 세포는 본 실험에서 음성 대조군으로서 포함되었다. ACTR 변이체 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 58을 발현하는 T 세포는 IFNγ 및 IL2 생산의 농도-의존성 증가를 나타내었고; 모의 T 세포는 검출가능한 시토카인 생산을 나타내지 않았다.
도 20은 모의 T 세포 또는 ACTR 변이체 서열식별번호: 57 세포를 다양한 농도의 항-BCMA 항체 hSG16.17SEA의 존재 하에 BCMA-발현 NCI-H929 세포와 공동-인큐베이션한 경우 제7일의 CD3 양성 T 세포의 증식 수준을 입증하는 그래프이다. ACTR T 세포의 증식은 항체의 존재 하에만 관찰되었고; NCI-H929 표적 세포를 대조군 모의 T 세포와 공동-인큐베이션한 경우에 CD3+ T 세포의 확장은 관찰되지 않았다.
도 21은 (A) NCI-H929 및 (B) RPMI-8226 표적 세포에 의한 레날리도미드의 존재 및 부재 하에서의 ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포의 증식을 보여주는 그래프의 세트이다. 모의 T-세포는 본 실험에서 대조군으로서 사용되었다. 증식은 ACTR T-세포를 hSG16.17 SEA 항체의 존재 하에 배양한 경우에만 관찰되었고, 이는 1 μM 레날리도미드의 존재 하에 증진되었다.
항체-기반 면역요법은 많은 유형의 암을 포함한 매우 다양한 질환을 치료하는데 사용된다. 이러한 요법은 종종 정상 세포 (예를 들어, 비-암 세포)에 비해 제거하고자 하는 세포 (예를 들어, 표적 세포 예컨대 암 세포) 상에 차등 발현되는 세포 표면 분자의 인식에 따라 달라진다 (Weiner et al. Cell (2012) 148(6): 1081-1084). 여러 항체-기반 면역요법은 시험관내에서 표적 세포 (예를 들어, 암 세포)의 항체 의존성 세포-매개 세포독성을 촉진시키는 것으로 밝혀졌으며, 일부의 경우, 일반적으로 이는 또한 생체내 작용 메카니즘인 것으로 여겨진다. ADCC는 면역계의 이펙터 세포, 예컨대, 자연 킬러 (NK) 세포, T 세포, 단핵구 세포, 대식세포, 또는 호산구가 특이적 항체에 의해 인식된 표적 세포 (예를 들어, 암 세포)를 활발하게 용해시키는 세포-매개 선천성 면역 메카니즘이다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로, 항-BCMA 항체 및 ACTR T 세포의 조합 사용이 BCMA-양성 암 세포에서 세포 사멸을 성공적으로 증진시켰다는 예상외의 발견에 기초한다. 이들 발견은 BCMA가 항체/ACTR-T 세포 조합 요법을 위한 적합한 표적이라는 것을 나타낸다.
따라서, 본 개시내용은 항-BCMA 항체의 치료 유효량, 및 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 구축물을 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 림프구 또는 NK 림프구)의 치료 유효량을 포함하는 조합 요법을 사용하여 대상체에서 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 증진시키는 방법, 및 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA 항체 및 ACTR-발현 면역 세포를 포함하는 면역요법을 위한 키트를 제공한다. 방법 또는 키트의 T 림프구 및/또는 NK 세포는 공동-자극 도메인을 포함하는 외인성 폴리펩티드 또는 공동-자극 신호를 트랜스로 제공하는 공동-자극 인자의 리간드를 추가로 발현할 수 있다. 대안적으로, 외인성 폴리펩티드는 체크-포인트 수용체 또는 그의 기능적 도메인을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, ACTR 구축물은 숙주 세포의 표면 상에 발현될 수 있는 비-자연 발생 분자를 지칭하고, Fc 부분 및 ACTR 구축물을 발현하는 면역 세포의 이펙터 기능을 촉발하기 위한 1개 이상의 세포질 신호전달 도메인을 함유하는 표적 분자에 결합할 수 있는 세포외 도메인을 포함하며, 여기서 ACTR 구축물의 적어도 2개의 도메인은 상이한 분자로부터 유래될 수 있다.
B-세포 성숙 항원 (BCMA)은 B 세포, 특히 성숙 B 세포 상에서 발현되는 조직 괴사 인자 수용체 (TNFR) 슈퍼패밀리의 구성원이다. BCMA는 TNFR 슈퍼패밀리의 증식-유도 리간드에 결합하고, 이는 NFκB 및 MAPK8/JNK 신호전달 경로의 활성화로 이어진다. 이는 BCMA가 B 세포 발생 및 자가면역 반응에서 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 예로서, 인간 BCMA 단백질이 진뱅크(GenBank)에서 수탁 번호 BAB60895 하에 제공된다 (서열식별번호: 71로 하기 제시됨).
항-BCMA 항체는 표적 세포 (예를 들어, BCMA-양성 암 세포, B 세포, 및 형질 세포)의 표면 상에 발현된 BCMA 단백질에 결합할 수 있다. 이러한 Fc-함유 분자에 결합할 수 있는 수용체, 예를 들어, 본원에 기재된 ACTR 구축물 분자를 발현하는 면역 세포는 표적 세포-결합된 항-BCMA 항체를 인식하고, 이러한 수용체/항체 결속은 면역 세포가 이펙터 기능, 예컨대 세포독성 과립의 방출 또는 세포-사멸-유도 분자의 발현을 수행하도록 자극하여, BCMA-발현 표적 세포의 세포 독성을 증진시킨다.
본원에 기재된 방법은 다수의 이점을 부여할 것이다. 예를 들어, Fc에 결합하는 세포외 도메인을 통해, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 특이적 표적 항원 (예를 들어, 암 항원)에 직접적으로 결합하기 보다는 항-BCMA 항체의 Fc 부분에 결합할 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 ACTR 구축물을 발현하는 면역 세포는 항-BCMA 항체에 의해 결합된 임의의 유형의 BCMA-양성 세포의 세포 사멸을 유도/증진시킬 수 있을 것이다.
I. ACTR 구축물
본원에 기재된 ACTR 구축물은 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 대한 결합 친화도 및 특이성을 갖는 세포외 도메인 ("Fc 결합제" 또는 "Fc 결합 도메인"), 막횡단 도메인, 및 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인을 추가로 포함할 수 있다. ACTR 구축물은 숙주 세포 상에 발현된 경우에 세포외 리간드-결합 도메인이 표적 분자 (예를 들어, 항-BCMA 항체) 및 ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인에 대한 결합을 위해 세포외로 위치하도록 구성된다. 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인이 활성화 및/또는 이펙터 신호전달을 촉발하기 위해 세포질에 위치할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 구축물은 N-말단에서 C-말단으로, Fc 결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 구축물은 N-말단에서 C-말단으로, Fc 결합 도메인, 막횡단 도메인, 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인, 및 ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 다른 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 구축물은 N-말단에서 C-말단으로, Fc 결합 도메인, 막횡단 도메인, ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인, 및 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 ACTR 구축물 중 임의의 것은, Fc 결합 도메인의 C-말단 및 막횡단 도메인의 N-말단에 위치할 수 있는 힌지 도메인을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 기재된 ACTR 구축물은, 서로 연결되거나 또는 ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인에 의해 분리될 수 있는 2개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 함유할 수 있다. ACTR 구축물 내의 세포외 Fc 결합제, 막횡단 도메인, 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인(들), 및 ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인은 직접적으로, 또는 펩티드 링커를 통해 서로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물 중 임의의 것은 N-말단에서 신호 서열을 포함할 수 있다.
일부 예시적인 ACTR 구축물은 WO2016040441에 제공되며, 그 안의 관련 개시내용은 본원에 언급된 목적 및 대상을 위해 참조로 포함된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥이 달리 명백하게 지시하지 않는 한 복수 지시대상을 포함한다.
A. Fc 결합 도메인
본원에 기재된 ACTR 구축물은 Fc 결합 도메인인, 즉, 적합한 포유동물 (예를 들어, 인간, 마우스, 래트, 염소, 양, 또는 원숭이)의 이뮤노글로불린 (예를 들어 IgG, IgA, IgM, 또는 IgE)의 Fc 부분에 결합할 수 있는 세포외 도메인을 포함한다. 적합한 Fc 결합 도메인은 자연 발생 단백질 예컨대 포유동물 Fc 수용체 또는 특정 박테리아 단백질 (예를 들어, 단백질 A, 단백질 G)로부터 유래될 수 있다. 추가적으로, Fc 결합 도메인은 높은 친화도 및 특이성으로 본원에 기재된 항-BCMA 항체 중 임의의 것의 Fc 부분에 특이적으로 결합하도록 조작된 합성 폴리펩티드일 수 있다. 예를 들어, 이러한 Fc 결합 도메인은 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원-결합 단편일 수 있다. 예는 단일-쇄 가변 단편 (scFv), 도메인 항체, 또는 나노바디를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 대안적으로, Fc 결합 도메인은 Fc 부분에 특이적으로 결합하는 합성 펩티드, 예컨대, 쿠니츠 도메인, 소형 모듈 면역제약 (SMIP), 애드넥틴, 아비머, 아피바디, DARPin, 또는 안티칼린일 수 있고, 이는 Fc에 대한 결합 활성에 대해 펩티드 조합 라이브러리를 스크리닝함으로써 확인될 수 있다.
일부 실시양태에서, Fc 결합 도메인은 포유동물 Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 본원에 사용된 "Fc 수용체"는 많은 면역 세포 (B 세포, 수지상 세포, 자연 킬러 (NK) 세포, 대식세포, 호중구, 비만 세포, 및 호산구 포함)의 표면 상에 발현되고, 항체의 Fc 도메인에 대한 결합 특이성을 나타내는 세포 표면 결합된 수용체이다. Fc 수용체는 전형적으로 항체의 Fc (단편 결정화가능) 부분에 대해 결합 특이성을 갖는 적어도 2개의 이뮤노글로불린 (Ig)-유사 도메인으로 구성된다. 일부 경우에, 항체의 Fc 부분에 대한 Fc 수용체의 결합은 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 효과를 촉발시킬 수 있다. 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 구축물을 구축하는 데 사용되는 Fc 수용체는 자연-발생 다형성 변이체 (예를 들어, CD16 V158 변이체)일 수 있으며, 이는 야생형 대응물 (예를 들어, CD16 F158)과 비교하여 증가 또는 감소된, Fc에 대한 친화도를 가질 수 있다. 대안적으로, Fc 수용체는 Ig 분자의 Fc 부분에 대한 결합 친화도를 변경시키는 하나 이상의 돌연변이 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 돌연변이를 포함한 최대 10개의 아미노산 잔기 치환)를 보유하는, 야생형 대응물의 기능적 변이체일 수 있다. 일부 경우에, 돌연변이는 Fc 수용체의 글리코실화 패턴을 변경시키고 그에 따라 Fc에 대한 결합 친화도를 변경시킬 수 있다.
하기 표는 본원에 기재된 방법 또는 구축물 중 임의의 것에 사용될 수 있는 Fc 수용체 세포외 도메인에서의 다수의 예시적인 다형성을 열거한다 (예를 들어, 문헌 [Kim et al., J. Mol. Evol. 53:1-9, 2001] 참조):
표 1. Fc 수용체에서의 예시적인 다형성
Figure pct00001
Fc 수용체는 그가 결합할 수 있는 항체의 이소형에 기초하여 분류된다. 예를 들어, Fc-감마 수용체 (FcγR)는 일반적으로 IgG 항체, 예컨대, 그의 1종 이상의 하위유형 (즉, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4)에 결합하고; Fc-알파 수용체 (FcαR)는 일반적으로 IgA 항체에 결합하고; Fc-엡실론 수용체 (FcεR)는 일반적으로 IgE 항체에 결합한다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 Fc-감마 수용체, Fc-알파 수용체, 또는 Fc-엡실론 수용체이다. Fc-감마 수용체의 예는 비제한적으로, CD64A, CD64B, CD64C, CD32A, CD32B, CD16A, 및 CD16B를 포함한다. Fc-알파 수용체의 예는 FcαR1/CD89이다. Fc-엡실론 수용체의 예는 비제한적으로, FcεRI 및 FcεRII/CD23을 포함한다. 하기 표는 본원에 기재된 ACTR 구축물을 구축하는 데 사용하기 위한 예시적인 Fc 수용체, 및 상응하는 Fc 도메인에 대한 그의 결합 활성을 열거한다:
표 2. 예시적인 Fc 수용체
Figure pct00002
본원에 기재된 ACTR 구축물에 사용하기 위한 Fc 수용체의 리간드 결합 도메인의 선택은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 예를 들어, 이는 Fc 수용체의 결합이 요구되는 항-BCMA 항체의 이소형 및 결합 상호작용의 목적하는 친화도와 같은 인자에 따라 달라질 수 있다.
일부 예에서, (a)는 Fc에 대한 친화도를 조정할 수 있는 자연 발생 다형성을 혼입시킬 수 있는, CD16의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 일부 예에서, (a)는 위치 158에 다형성 (예를 들어, 발린 또는 페닐알라닌)을 혼입시키는 CD16의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 일부 실시양태에서, (a)는 그의 글리코실화 상태 및 Fc에 대한 그의 친화도를 변경시키는 조건 하에 제조된다.
일부 실시양태에서, (a)는 ACTR 구축물이 IgG 항체의 하위세트에 특이적이도록 하는 변형을 혼입시키는 CD16의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 예를 들어, IgG 하위유형 (예를 들어, IgG1)에 대한 친화도를 증가 또는 감소시키는 돌연변이가 혼입될 수 있다.
일부 예에서, (a)는 Fc에 대한 친화도를 조정할 수 있는 자연 발생 다형성을 혼입시킬 수 있는, CD32의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 일부 실시양태에서, (a)는 그의 글리코실화 상태 및 Fc에 대한 그의 친화도를 변경시키는 조건 하에 제조된다.
일부 실시양태에서, (a)는 ACTR 구축물이 IgG 항체의 하위세트에 특이적이도록 하는 변형을 혼입시키는 CD32의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 예를 들어, IgG 하위유형 (예를 들어, IgG1)에 대한 친화도를 증가 또는 감소시키는 돌연변이가 혼입될 수 있다.
일부 예에서, (a)는 Fc에 대한 친화도를 조정할 수 있는 자연 발생 다형성을 혼입시킬 수 있는, CD64의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 일부 실시양태에서, (a)는 그의 글리코실화 상태 및 Fc에 대한 그의 친화도를 변경시키는 조건 하에 제조된다.
일부 실시양태에서, (a)는 ACTR 구축물이 IgG 항체의 하위세트에 특이적이도록 하는 변형을 혼입시키는 CD64의 세포외 리간드-결합 도메인이다. 예를 들어, IgG 하위유형 (예를 들어, IgG1)에 대한 친화도를 증가 또는 감소시키는 돌연변이가 혼입될 수 있다.
다른 실시양태에서, Fc 결합 도메인은 IgG 분자의 Fc 부분에 결합할 수 있는 자연 발생 박테리아 단백질로부터 유래된다. 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 구축물을 구축하는 데 사용하기 위한 Fc 결합 도메인은 전장 단백질 또는 그의 기능적 단편일 수 있다. 단백질 A는 원래 박테리아 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)의 세포 벽에서 발견되는 42 kDa 표면 단백질이다. 이는 각각이 3-나선형 번들로 폴딩되어 있는 5개의 도메인으로 구성되어 있고, 이는 대부분의 항체의 Fc 영역뿐만 아니라, 인간 VH3 패밀리 항체의 Fab 영역과의 상호작용을 통해 IgG에 결합할 수 있다. 단백질 G는 포유동물 IgG의 Fab 및 Fc 영역 둘 다에 결합하는 C 및 G군 연쇄구균 박테리아에서 발현되는 대략 60-kDa 단백질이다. 천연 단백질 G가 또한 알부민에 결합하지만, 재조합 변이체는 알부민 결합을 제거하도록 조작된 것이다.
ACTR 구축물에 사용하기 위한 Fc 결합 도메인은 또한 조합 생물학 또는 직접 진화 방법을 사용하여 신생 생성될 수 있다. 단백질 스캐폴드 (예를 들어, IgG로부터 유래된 scFv, 쿠니츠-유형 프로테아제 억제제로부터 유래된 쿠니츠 도메인, 안키린 반복부, 단백질 A로부터의 Z 도메인, 리포칼린, 피브로넥틴 제III형 도메인, Fyn으로부터의 SH3 도메인 등)로부터 출발하여, 표면 상의 잔기 세트에 대한 아미노산 측쇄는 큰 변이체 스캐폴드 라이브러리 생성을 위해 무작위로 치환될 수 있다. 먼저 결합에 대해 선택하고, 이어서 파지, 리보솜 또는 세포 디스플레이에 의해 증폭시킴으로써 Fc 도메인과 같은 표적에 대해 친화도를 갖는 희귀 변이체를 큰 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 반복된 라운드의 선택 및 증폭을 사용하여 표적에 대해 가장 높은 친화도를 갖는 이들 단백질을 단리할 수 있다. Fc-결합 펩티드는 예를 들어, 문헌 [DeLano et al., Science, 287:5456 (2000); Jeong et al., Peptides, 31(2):202-206 (2009); 및 Krook et al., J. Immunological Methods, 221(1-2):151-157 (1998)]과 같이, 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예시적인 Fc-결합 펩티드는 ETQRCTWHMGELVWCEREHN (서열식별번호: 85), KEASCSYWLGELVWCVAGVE (서열식별번호: 86) 또는 DCAWHLGELVWCT (서열식별번호: 87)의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 Fc 결합 도메인 중 임의의 것은 치료 항체의 Fc 부분에 대해 적합한 결합 친화도를 가질 수 있다. 본원에 사용된 "결합 친화도"는 겉보기 회합 상수 또는 KA를 지칭한다. KA는 해리 상수인 KD의 역수이다. 본원에 기재된 ACTR 구축물의 Fc 수용체 도메인의 세포외 리간드-결합 도메인은 항체의 Fc 부분에 대해 적어도 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10M 또는 그 미만의 결합 친화도 KD를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 결합 도메인은 또 다른 항체, 항체의 이소형, 또는 그의 하위유형에 대한 Fc 결합 도메인의 결합 친화도와 비교하여, 항체, 항체의 이소형, 또는 그의 하위유형(들)에 대해 높은 결합 친화도를 갖는다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인은 또 다른 항체, 항체의 이소형, 또는 그의 하위유형에 대한 Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 결합과 비교하여, 항체, 항체의 이소형, 또는 그의 하위유형(들)에 대해 특이성을 갖는다. 높은 친화도로 결합하는 Fc-감마 수용체는 CD64A, CD64B, 및 CD64C를 포함한다. 낮은 친화도로 결합하는 Fc-감마 수용체는 CD32A, CD32B, CD16A, 및 CD16B를 포함한다. 높은 친화도로 결합하는 Fc-엡실론 수용체는 FcεRI이고, 낮은 친화도로 결합하는 Fc-엡실론 수용체는 FcεRII/CD23이다.
Fc 수용체, 또는 Fc 결합 도메인 (예를 들어, Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인)을 포함하는 ACTR 구축물에 대한 결합 친화도 또는 결합 특이성은 평형 투석, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라즈몬 공명, 또는 분광분석법을 포함한 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인은 자연-발생 Fc-감마 수용체, Fc-알파 수용체, 또는 Fc-엡실론 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 아미노산 서열과 적어도 90% (예를 들어, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%) 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 2개의 아미노산 서열의 "퍼센트 동일성"은 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993]에서와 같이 변형된, 문헌 [Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990]의 알고리즘을 사용하여 결정될 수 있다. 이러한 알고리즘은 문헌 [Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0) 내로 혼입된다. BLAST 단백질 검색은 XBLAST 프로그램, 스코어=50, 워드길이=3으로 수행되어 본 개시내용의 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 수득할 수 있다. 2개의 서열 사이에 갭이 존재하는 경우에, 갭드(Gapped) BLAST가 문헌 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997]에 기재된 바와 같이 이용될 수 있다. BLAST 및 갭드 BLAST 프로그램을 이용하는 경우에, 각각의 프로그램 (예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터가 사용될 수 있다.
Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 변이체, 예컨대 본원에 기재된 것이 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다. 일부 실시양태에서, 변이체 세포외 리간드-결합 도메인은 참조 세포외 리간드-결합 도메인의 아미노산 서열에 비해 최대 10개의 아미노산 잔기 변이 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개)를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 변이체는 하나 이상의 유전자 다형성으로 인한 자연-발생 변이체일 수 있다. 다른 실시양태에서, 변이체는 비-자연 발생 변형된 분자일 수 있다. 예를 들어, 돌연변이는 Fc 수용체의 글리코실화 패턴 및 그에 따른 상응하는 Fc 도메인에 대한 그의 결합 친화도를 변경시키기 위해 Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인 내로 도입될 수 있다.
일부 예에서, Fc 수용체는 본원에 기재된 바와 같은 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B, CD32C, CD64A, CD64B, CD64C, 또는 그의 변이체일 수 있다. Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인은 본원에 기재된 바와 같은 CD16A, CD16B, CD32A, CD32B, CD32C, CD64A, CD64B, CD64C의 세포외 리간드-결합 도메인의 아미노산 서열에 비해 최대 10개의 아미노산 잔기 변이 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 8, 9, 또는 10개)를 포함할 수 있다. 하나 이상의 아미노산 변이를 포함하는 이러한 Fc 도메인은 변이체로 지칭될 수 있다. Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 Fc 수용체 도메인에 비해 항체, 항체의 이소형, 또는 그의 하위유형(들)에 결합하는 Fc 수용체 도메인에 대한 결합 친화도를 증가시킬 수 있다. 예를 들어, Fc-감마 수용체 CD16A의 잔기 158의 돌연변이는 항체의 Fc 부분에 대한 Fc 수용체의 결합 친화도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 Fc-감마 수용체 CD16A의 잔기 158에서의 페닐알라닌에서 발린으로의 치환이며, 이는 CD16A V158 변이체로 지칭된다.
인간 CD16A F158 및 CD16A V158 변이체의 아미노산 서열이 하기에 제공되며, F158 및 V158 잔기는 볼드체 및 밑줄표시로 강조되어 있다 (신호 펩티드는 이탤릭체표시됨):
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Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인에서 이루어질 수 있는, 분자 예컨대 항체의 Fc 부분에 대한 결합 친화도를 증진 또는 감소시킬 수 있는 대안적 또는 추가의 돌연변이가 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체는 CD16A, CD16A V158 변이체, CD16A F158 변이체, CD16B, CD32A, CD32B, CD32C, CD64A, CD64B 또는 CD64C이다.
B. 막횡단 도메인
본원에 기재된 ACTR 구축물의 막횡단 도메인은 관련 기술분야에 공지된 임의의 형태일 수 있다. 본원에 사용된 "막횡단 도메인"은 세포 막, 바람직하게는 진핵 세포 막에서 열역학적으로 안정한 임의의 단백질 구조를 지칭한다. 본원에 사용된 ACTR 구축물에 사용하기에 상용성인 막횡단 도메인은 자연 발생 단백질로부터 수득될 수 있다. 대안적으로, 이는 합성 비-자연 발생 단백질 절편, 예를 들어, 세포 막에서 열역학적으로 안정한 소수성 단백질 절편일 수 있다.
막횡단 도메인은 막횡단 도메인의 3차원 구조에 기초하여 분류된다. 예를 들어, 막횡단 도메인은 알파 나선, 1개 초과의 알파 나선의 복합체, 베타-배럴, 또는 세포의 인지질 이중층을 관통할 수 있는 임의의 다른 안정한 구조를 형성할 수 있다. 게다가, 막횡단 도메인은 또한 또는 대안적으로 막횡단 도메인이 막을 가로질러 횡단하는 통과 횟수, 및 단백질의 배향을 포함한, 막횡단 도메인 위상에 기초하여 분류될 수 있다. 예를 들어, 단일-통과 막 단백질은 세포 막을 1회 가로질러 횡단하고, 다중-통과 막 단백질은 세포 막을 적어도 2회 (예컨대, 2, 3, 4, 5, 6, 7회 또는 그 초과) 가로질러 횡단한다.
막 단백질은 세포의 내부 및 외부에 대한 그의 말단 및 막-통과 절편(들)의 위상에 따라 제I형, 제II형 또는 제III형으로 정의될 수 있다. 제I형 막 단백질은 단일 막-관통 영역을 가지며, 단백질의 N-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측에 존재하고, 단백질의 C-말단이 세포질 측에 존재하도록 배향되어 있다. 제II형 막 단백질 또한 단일 막-관통 영역을 갖지만, 단백질의 C-말단이 세포의 지질 이중층의 세포외 측에 존재하고, 단백질의 N-말단이 세포질 측에 존재하도록 배향되어 있다. 제III형 막 단백질은 다중 막-관통 절편을 가지며, 이는 막횡단 절편의 수 및 N- 및 C-말단의 위치에 기초하여 추가로 세분될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물의 막횡단 도메인은 제I형 단일-통과 막 단백질로부터 유래된다. 단일-통과 막 단백질은 CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, TCRβ, TCRζ, CD32, CD64, CD64, CD45, CD5, CD9, CD22, CD37, CD80, CD86, CD40, CD40L/CD154, VEGFR2, FAS, PD1, 및 FGFR2B를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 하기로부터 선택되는 막 단백질로부터의 것이다: CD8α, CD8β, 4-1BB/CD137, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16, OX40/CD134, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, CD32, CD64, VEGFR2, FAS, PD1, 및 FGFR2B. 일부 예에서, 막횡단 도메인은 CD8α의 것이다. 일부 예에서, 막횡단 도메인은 4-1BB/CD137의 것이다. 다른 예에서, 막횡단 도메인은 CD28 또는 CD34의 것이다. 또 다른 예에서, 막횡단 도메인은 인간 CD8α로부터 유래되지 않는다. 일부 실시양태에서, ACTR 구축물의 막횡단 도메인은 단일-통과 알파 나선이다.
다중-통과 막 단백질로부터의 막횡단 도메인이 또한 본원에 기재된 ACTR 구축물에 사용하기에 상용성일 수 있다. 다중-통과 막 단백질은 복합 (적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7개 또는 그 초과) 알파 나선 또는 베타 시트 구조를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 다중-통과 막 단백질의 N-말단 및 C-말단은 지질 이중층의 반대측에 존재하고, 예를 들어, 단백질의 N-말단은 지질 이중층의 세포질 측에 존재하고, 단백질의 C-말단은 세포외 측에 존재한다. 다중-통과 막 단백질로부터의 1회 또는 다수회에 걸친 나선 통과가 본원에 기재된 ACTR 구축물을 구축하는 데 사용될 수 있다.
본원에 기재된 ACTR 구축물에 사용하기 위한 막횡단 도메인은 또한 합성, 비-자연 발생 단백질 절편의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 합성, 비-자연 발생 알파 나선 또는 베타 시트이다. 일부 실시양태에서, 단백질 절편은 적어도 대략 20개의 아미노산, 예를 들어, 적어도 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개, 또는 그 초과의 아미노산이다. 합성 막횡단 도메인의 예는 관련 기술분야에, 예를 들어, 미국 특허 번호 7,052,906 B1 및 PCT 공개 번호 WO 2000/032776 A2에 공지되어 있으며, 그의 관련 개시내용은 본원에 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 시스테인 잔기를 포함하지 않는다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 1개의 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 2개의 시스테인 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인의 아미노산 서열은 2개 초과의 시스테인 잔기 (예를 들어, 3, 4, 5개 또는 그 초과)를 포함한다.
막횡단 도메인은 막횡단 영역, 및 막횡단 도메인의 C-말단 측에 위치하는 세포질 영역을 포함할 수 있다. 막횡단 도메인의 세포질 영역은 3개 이상의 아미노산을 포함할 수 있고, 일부 실시양태에서, 이는 지질 이중층에 막횡단 도메인을 배향시키는 데 도움을 줄 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 시스테인 잔기는 막횡단 도메인의 막횡단 영역에 존재한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 시스테인 잔기는 막횡단 도메인의 세포질 영역에 존재한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인의 세포질 영역은 양으로 하전된 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인의 세포질 영역은 아미노산 아르기닌, 세린, 및 리신을 포함한다.
일부 실시양태에서, 막횡단 도메인의 막횡단 영역은 소수성 아미노산 잔기를 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 영역은 주로 소수성 아미노산 잔기, 예컨대, 알라닌, 류신, 이소류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트립토판, 또는 발린을 포함한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 영역은 소수성이다. 일부 실시양태에서, 막횡단 영역은 폴리-류신-알라닌 서열을 포함한다.
단백질 또는 단백질 절편의 소수친수성, 또는 소수성 또는 친수성 특징은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법, 예를 들어, 카이트(Kyte) 및 둘리틀(Doolittle) 소수친수성 분석에 의해 평가될 수 있다.
C. 공동-자극 신호전달 도메인
많은 면역 세포는 세포 증식, 분화 및 생존을 촉진시킬 뿐만 아니라 세포의 이펙터 기능을 활성화시키기 위해 항원-특이적 신호의 자극에 더하여 공동-자극을 필요로 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "공동-자극 신호전달 도메인"은 세포 내의 신호 전달을 매개하여 면역 반응 예컨대 이펙터 기능을 유도하는 공동-자극 신호전달 단백질의 적어도 단편을 지칭한다. 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 면역 세포 예컨대 T 세포의 활성화는 종종 2종의 신호를 필요로 한다: (1) T 세포 수용체 (TCR) 및 항원 제시 세포에 의해 제시된 항원 펩티드/MHC 복합체의 결속에 의해 촉발되는 항원 특이적 신호 (전형적으로 TCR 복합체의 성분으로서의 CD3ζ에 의해 유도됨); 및 (ii) 공동-자극 수용체와 그의 리간드 사이의 상호작용에 의해 촉발되는 공동-자극 신호. 공동-자극 수용체는 TCR-촉발된 신호전달에 더하여 공동-자극 신호를 전달하고, 면역 세포, 예컨대 T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구 또는 호산구에 의해 매개되는 반응을 조정한다. 공동-자극 신호전달 도메인을 함유하거나 또는 이러한 신호전달 도메인이 없는 본원에 기재된 ACTR 구축물 중 임의의 것은 공동-자극 신호를 트랜스로 제공하는 공동-자극 도메인 또는 공동-자극 인자의 리간드를 포함하는 1개 이상의 별개의 폴리펩티드와 함께 면역 세포 (예를 들어, NK 세포 또는 T 세포)에서 공동-발현될 수 있다. 대안적으로, ACTR은 면역 체크포인트 신호를 제공하는 별개의 폴리펩티드와 함께 면역 세포에서 공동-발현될 수 있다.
숙주 세포 (예를 들어, 면역 세포)에서의 공동-자극 신호전달 도메인의 활성화는 세포가 시토카인의 생산 및 분비, 식세포 특성, 증식, 분화, 생존 및/또는 세포독성을 증가 또는 감소시키도록 유도할 수 있다. 임의의 공동-자극 분자의 공동-자극 신호전달 도메인은 본원에 기재된 ACTR 구축물 또는 본원에 기재된 면역 세포에서의 공동-발현을 위한 1개 이상의 별개의 폴리펩티드에 사용하기에 상용성일 수 있다. 공동-자극 신호전달 도메인의 유형(들)은 ACTR 구축물이 발현될 면역 세포의 유형 (예를 들어, T 세포, NK 세포, 대식세포, 호중구, 또는 호산구) 및 목적하는 면역 이펙터 기능 (예를 들어, ADCC)과 같은 인자에 기초하여 선택된다. ACTR 구축물에 사용하기 위한 또는 면역 세포에서의 발현을 위한 공동-자극 신호전달 도메인의 예는 공동-자극 단백질의 세포질 신호전달 도메인일 수 있고, 이는 비제한적으로 B7/CD28 패밀리의 구성원 (예를 들어, B7-1/CD80, B7-2/CD86, B7-H1/PD-L1, B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-H6, B7-H7, BTLA/CD272, CD28, CTLA-4, Gi24/VISTA/B7-H5, ICOS/CD278, PD-1, PD-L2/B7-DC, 및 PDCD6); TNF 슈퍼패밀리의 구성원 (예를 들어, 4-1BB/TNFSF9/CD137, 4-1BB 리간드/TNFSF9, BAFF/BLyS/TNFSF13B, BAFF R/TNFRSF13C, CD27/TNFRSF7, CD27 리간드/TNFSF7, CD30/TNFRSF8, CD30 리간드/TNFSF8, CD40/TNFRSF5, CD40/TNFSF5, CD40 리간드/TNFSF5, DR3/TNFRSF25, GITR/TNFRSF18, GITR 리간드/TNFSF18, HVEM/TNFRSF14, LIGHT/TNFSF14, 림포톡신-알파/TNF-베타, OX40/TNFRSF4, OX40 리간드/TNFSF4, RELT/TNFRSF19L, TACI/TNFRSF13B, TL1A/TNFSF15, TNF-알파, 및 TNF RII/TNFRSF1B); SLAM 패밀리의 구성원 (예를 들어, 2B4/CD244/SLAMF4, BLAME/SLAMF8, CD2, CD2F-10/SLAMF9, CD48/SLAMF2, CD58/LFA-3, CD84/SLAMF5, CD229/SLAMF3, CRACC/SLAMF7, NTB-A/SLAMF6, 및 SLAM/CD150); 및 임의의 다른 공동-자극 분자, 예컨대, CD2, CD7, CD53, CD82/Kai-1, CD90/Thy1, CD96, CD160, CD200, CD300a/LMIR1, HLA 부류 I, HLA-DR, 이카로스(Ikaros), 인테그린 알파 4/CD49d, 인테그린 알파 4 베타 1, 인테그린 알파 4 베타 7/LPAM-1, LAG-3, TCL1A, TCL1B, CRTAM, DAP12, 덱틴(Dectin)-1/CLEC7A, DPPIV/CD26, EphB6, TIM-1/KIM-1/HAVCR, TIM-4, TSLP, TSLP R, 림프구 기능 연관 항원-1 (LFA-1), 및 NKG2C를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, ICOS, CD27, GITR, HVEM, TIM1, LFA1(CD11a) 또는 CD2, 또는 그의 임의의 변이체의 것이다.
공동-자극 신호전달 도메인이 면역 세포의 면역 반응을 조정할 수 있도록 하는, 본원에 기재된 공동-자극 신호전달 도메인 중 임의의 것의 변이체가 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다. 일부 실시양태에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 야생형 대응물과 비교하여 최대 10개의 아미노산 잔기 변이 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5 또는 8개)를 포함한다. 1개 이상의 아미노산 변이를 포함하는 이러한 공동-자극 신호전달 도메인은 변이체로 지칭될 수 있다.
공동-자극 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공동-자극 신호전달 도메인에 비해 신호 전달을 증가시키고, 면역 반응의 자극을 증진시킬 수 있다. 공동-자극 신호전달 도메인의 아미노산 잔기의 돌연변이는 돌연변이를 포함하지 않는 공동-자극 신호전달 도메인에 비해 신호 전달을 감소시키고, 면역 반응의 자극을 감소시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 CD28 아미노산 서열의 잔기 186 및 187의 돌연변이는 ACTR 구축물의 공동-자극 도메인에 의한 공동-자극 활성, 및 면역 반응 유도를 증가시킬 수 있다. 일부 실시양태에서, 돌연변이는 CD28LL→GG 변이체로 지칭되는, CD28 공동-자극 도메인의 위치 186 및 187 각각에서의 리신의 글리신 잔기로의 치환이다. 공동-자극 신호전달 도메인의 공동-자극 활성을 증진 또는 감소시킬 수 있는, 상기 도메인에서 이루어질 수 있는 추가의 돌연변이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 공동-자극 신호전달 도메인은 4-1BB, CD28, OX40, 또는 CD28LL→GG 변이체의 것이다.
일부 실시양태에서, ACTR 구축물은 1개 초과의 공동-자극 신호전달 도메인 (예를 들어, 2, 3개 또는 그 초과)을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, ACTR 구축물은 동일한 공동-자극 신호전달 도메인 중 2개 이상, 예를 들어, CD28의 공동-자극 신호전달 도메인의 2개의 카피를 포함한다. 일부 실시양태에서, ACTR 구축물은 상이한 공동-자극 단백질로부터의 2개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인, 예컨대, 본원에 기재된 임의의 2개 이상의 공동-자극 단백질을 포함한다. 공동-자극 신호전달 도메인의 유형(들)의 선택은 ACTR 구축물과 함께 사용될 숙주 세포 (예를 들어, T 세포 또는 NK 세포)의 유형 및 목적하는 면역 이펙터 기능과 같은 인자에 기초할 수 있다. 일부 실시양태에서, ACTR 구축물은 2개의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 2개의 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28 및 4-1BB이다. 일부 실시양태에서, 2개의 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28LL→GG 변이체 및 4-1BB이다. 일부 실시양태에서, 2개의 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28 및 CD27이다. 일부 실시양태에서, 2개의 공동-자극 신호전달 도메인은 CD28 및 OX40이다. 공동-자극 도메인은 임의의 순서로 발생할 수 있다. 예를 들어, 2개의 공동-자극 도메인은 (5'에서 3'로) CD28 및 4-1BB; CD28LL→GG 변이체 및 4-1BB; CD28 및 CD27; 또는 CD28 및 OX-40의 순서로 발생할 수 있다. 또 다른 예로서, 2개의 공동-자극 도메인은 (5'에서 3'로) 4-1BB 및 CD28; 4-1BB 및 CD28LL→GG 변이체; CD27 및 CD28; 또는 OX-40 및 CD28의 순서로 발생할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 단일 공동-자극 신호전달 도메인 (ACTR 구축물 내의 유일한 공동-자극 신호전달 도메인), 예를 들어, 4-1BB 또는 CD28로부터의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 예에서, ACTR 구축물은 단일 공동-자극 신호전달 도메인의 오직 1개의 카피를 함유할 수 있다. 다른 예에서, ACTR 구축물은 동일한 공동-자극 신호전달 도메인의 2개의 카피, 예를 들어, CD28의 공동-자극 신호전달 도메인의 2개의 카피를 함유할 수 있다.
D. 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 세포질 신호전달 도메인
면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 임의의 세포질 신호전달 도메인은 본원에 기재된 ACTR 구축물을 생성하는 데 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "ITAM"은 일반적으로 많은 면역 세포에서 발현되는 신호전달 분자의 테일 부분에 존재하는 보존된 단백질 모티프이다. 모티프는 6-8개의 아미노산에 의해 분리된 아미노산 서열 YxxL/I의 2개의 반복부를 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 x는 독립적으로 보존된 모티프 YxxL/Ix(6-8)YxxL/I를 생산하는 임의의 아미노산이다. 신호전달 분자 내의 ITAM은 적어도 부분적으로 신호전달 분자의 활성화 후 ITAM에서의 티로신 잔기의 인산화에 의해 매개되는 세포 내 신호 전달에 중요하다. ITAM은 또한 신호전달 경로에 수반되는 다른 단백질에 대한 도킹 부위로서 기능할 수 있다. 일부 예에서, ITAM을 포함하는 세포질 신호전달 도메인은 CD3ζ 또는 FcεR1γ의 것이다. 다른 예에서, ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인은 인간 CD3ζ로부터 유래되지 않는다. 또 다른 예에서, 동일한 ACTR 구축물의 세포외 리간드-결합 도메인이 CD16A로부터 유래된 경우에, ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인은 Fc 수용체로부터 유래되지 않는다.
하나의 구체적 실시양태에서, 여러 신호전달 도메인이 상가적 또는 상승작용적 효과를 위해 함께 융합될 수 있다. 유용한 추가의 신호전달 도메인의 비제한적 예는 TCR 제타 쇄 및 FcεRIγ 중 1종 이상의 일부 또는 모두를 포함한다.
E. 힌지 도메인
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 세포외 리간드-결합 도메인과 막횡단 도메인 사이에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 힌지 도메인은 일반적으로 단백질의 두 도메인 사이에서 발견되며, 단백질의 가요성 및 도메인 중 하나 또는 둘 다의 서로에 대한 움직임을 허용할 수 있는 아미노산 절편이다. ACTR 구축물의 막횡단 도메인에 대해 상대적인 Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 이러한 가용성 및 움직임을 제공하는 임의의 아미노산 서열이 사용될 수 있다.
힌지 도메인은 약 10-100개 아미노산, 예를 들어, 15-75개 아미노산, 20-50개 아미노산 또는 30-60개 아미노산을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 또는 75개 아미노산 길이일 수 있다.
용어 "약" 또는 "대략"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 결정된 바와 같은 특정한 값에 대한 허용 오차 범위 내에 있음을 의미하고, 이는 부분적으로 값이 어떻게 측정 또는 결정되는지, 즉 측정 시스템의 한계에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, "약"은 관련 기술분야의 실시에 따라 허용되는 표준 편차 범위 내에 있음을 의미할 수 있다. 대안적으로, "약"은 주어진 값의 최대 ±20%, 바람직하게는 최대 ±10%, 보다 바람직하게는 최대 ±5%, 및 보다 바람직하게는 추가로 최대 ±1%의 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정과 관련하여, 용어는 값의 한 자릿수 범위 내에, 바람직하게는, 2-배 범위 내에 있음을 의미할 수 있다. 특정한 값이 본 출원 및 청구범위에 기재되는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 용어 "약"이 내포되며, 이러한 맥락에서 특정한 값에 대한 허용 오차 범위 내에 있음을 의미한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 자연 발생 단백질의 힌지 도메인이다. 힌지 도메인을 포함하는 것으로 관련 기술분야에 공지된 임의의 단백질의 힌지 도메인은 본원에 기재된 ACTR 구축물에 사용하기에 상용성이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 자연 발생 단백질의 힌지 도메인의 적어도 일부이며, ACTR 구축물에 가요성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD8α의 것이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD8α의 힌지 도메인의 부분, 예를 들어, CD8α의 힌지 도메인의 적어도 15개 (예를 들어, 20, 25, 30, 35, 또는 40개)의 연속적인 아미노산을 함유하는 단편이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD28의 것이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 CD28의 힌지 도메인의 부분, 예를 들어, CD28의 힌지 도메인의 적어도 15개 (예를 들어, 20, 25, 30, 35, 또는 40개)의 연속적인 아미노산을 함유하는 단편이다.
항체, 예컨대, IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 항체의 힌지 도메인은 또한 본원에 기재된 ACTR 구축물에 사용하기에 상용성이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 항체의 불변 도메인 CH1 및 CH2를 연결하는 힌지 도메인이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 항체의 것이고, 항체의 힌지 도메인 및 항체의 하나 이상의 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 항체의 힌지 도메인 및 항체의 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG, IgA, IgM, IgE, 또는 IgD 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체이다. 일부 실시양태에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH2 및 CH3 불변 영역을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 영역은 IgG1 항체의 힌지 영역 및 CH3 불변 영역을 포함한다.
비-자연 발생 펩티드는 또한 본원에 기재된 ACTR 구축물에 대한 힌지 도메인으로서 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인의 C-말단과 막횡단 도메인의 N-말단 사이의 힌지 도메인은 펩티드 링커, 예컨대 (GlyxSer)n 링커이며, 여기서 x 및 n은 독립적으로 3 내지 12의 정수 (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 또는 그 초과 포함)일 수 있다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)n (서열식별번호: 76)이며, 여기서 n은 3 내지 60의 정수 (3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60 포함)일 수 있다. 특정 실시양태에서, n은 60 초과의 정수일 수 있다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)3 (서열식별번호: 77)이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)6 (서열식별번호: 78)이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)9 (서열식별번호: 79)이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)12 (서열식별번호: 80)이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)15 (서열식별번호: 81)이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)30 (서열식별번호: 82)이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)45 (서열식별번호: 83)이다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 (Gly4Ser)60 (서열식별번호: 84)이다.
다른 실시양태에서, 힌지 도메인은 다양한 길이의 친수성 잔기 (예를 들어, 10-80개의 아미노산 잔기)로 이루어진 비구조적 폴리펩티드인, 연장된 재조합 폴리펩티드 (XTEN)이다. XTEN 펩티드의 아미노산 서열은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이고, 예를 들어 그의 관련 개시내용이 본원에 참조로 포함된 미국 특허 번호 8,673,860에서 찾아볼 수 있다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 XTEN 펩티드이고, 60개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 XTEN 펩티드이고, 30개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 XTEN 펩티드이고, 45개의 아미노산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 XTEN 펩티드이고, 15개의 아미노산을 포함한다.
F. 신호 펩티드
일부 실시양태에서, ACTR 구축물은 또한 폴리펩티드의 N-말단에 신호 펩티드 (신호 서열로도 알려짐)를 포함한다. 일반적으로, 신호 서열은 폴리펩티드를 세포 내 목적하는 부위로 표적화하는 펩티드 서열이다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 ACTR 구축물을 세포의 분비 경로로 표적화하고, ACTR 구축물이 지질 이중층에 통합 및 고정될 수 있게 할 것이다. 본원에 기재된 ACTR 구축물에 사용하기에 상용성인 자연 발생 단백질의 신호 서열, 또는 합성, 비-자연 발생 신호 서열을 포함한 신호 서열이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 CD8α로부터의 것이다. 일부 실시양태에서, 신호 서열은 CD28로부터의 것이다. 다른 실시양태에서, 신호 서열은 뮤린 카파 쇄로부터의 것이다. 또 다른 실시양태에서, 신호 서열은 CD16으로부터의 것이다.
G. ACTR 구축물의 예
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드의 특정 예는 예를 들어 CD16A Fc 결합 도메인 (예를 들어, CD16A F158 변이체 또는 CD16A V158 변이체), CD28 공동-자극 도메인 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 가질 수 있다. 이러한 ACTR 폴리펩티드는 CD28 힌지 도메인, CD28 막횡단 도메인, 또는 그의 조합을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, ACTR 폴리펩티드는 CD8α로부터의 것일 수 있는 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구체적 예에서, ACTR 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로 순서대로 CD8α의 신호 서열, CD16A Fc 결합 도메인, CD28 힌지 도메인, CD28 막횡단 도메인, CD28 공동-자극 도메인, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하며, 예를 들어, 서열식별번호: 57이다.
본원에 기재된 ACTR 폴리펩티드의 다른 예는 임의의 비-CD16A 수용체로부터의 힌지 도메인이 없을 수 있다 (예를 들어, 힌지 도메인을 갖지 않을 수 있음). 이러한 ACTR 폴리펩티드는 예를 들어 CD16A Fc 결합 도메인 (예를 들어, CD16A F158 변이체 또는 CD16A V158 변이체), CD28 공동-자극 도메인 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 가질 수 있으나, 힌지 도메인을 갖지 않을 수 있다. 일부 예에서, ACTR 폴리펩티드는 추가적으로 CD8 막횡단 도메인을 포함할 수 있다. 일부 예에서, ACTR 폴리펩티드는 CD8α로부터의 것일 수 있는 신호 서열을 추가로 포함할 수 있다. 하나의 구체적 예에서, ACTR 폴리펩티드는 N-말단에서 C-말단으로 순서대로 CD8α의 신호 서열, CD16A Fc 결합 도메인, CD8 막횡단 도메인, CD28 공동-자극 도메인, 및 CD3ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하며, 예를 들어, 서열식별번호: 58이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 CD16의 세포외 리간드-결합 도메인 (예를 들어, CD16A F158 변이체 또는 CD16A V158 변이체), CD8α의 힌지 및 막횡단 도메인, 4-1BB의 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인, 예를 들어, 본원에 개시된 CD16F-BB-ζ 및 CD16V-BB-ζ 중 1개 이상을 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 CD16의 세포외 리간드-결합 도메인 (CD16F 또는 CD16V, 또한 F158 FCGR3A 및 V158 FCGR3A 변이체로도 알려짐), CD8α의 힌지 및 막횡단 도메인, 4-1BB의 공동-자극 신호전달 도메인, 및 CD3ζ의 세포질 신호전달 도메인, 예를 들어, 본원에 개시된 CD16F-BB-ζ 및 CD16V-BB-ζ를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 서열식별번호: 1 또는 서열식별번호: 31이다.
표 3은 본원에 기재된 예시적인 ACTR 구축물을 제공한다. 이러한 예시적인 구축물은 N-말단에서 C-말단으로 순서대로 신호 서열, Fc 결합 도메인 (예를 들어, Fc 수용체의 세포외 도메인), 힌지 도메인, 및 막횡단을 가지며, 임의적인 공동-자극 도메인 및 세포질 신호전달 도메인의 위치는 바뀔 수 있다. 일부 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 서열식별번호: 1-63 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, ACTR 폴리펩티드는 서열식별번호: 1-63 중 어느 하나로 이루어질 수 있다. 또한 각각 본원에 언급된 목적 및 대상을 위해 참조로 포함된 WO2015058018A1, US20150139943A1, 및 PCT/US2018/015999를 참조한다.
표 3: 예시적인 ACTR 구축물.
Figure pct00004
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Figure pct00006
예시 ACTR 구축물의 아미노산 서열은 하기에 제공된다 (신호 서열은 이탤릭체표시됨).
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일부 예에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 하기 열거된 성분 중 1종 이상을 포함한다. 일부 예에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 하기 열거된 성분 모두를 포함하지 않는다. 예를 들어, 본원에 기재된 ACTR 구축물은 하기 표 4에 열거된 서열 중 하나 이상을 포함하지 않을 수 있다.
표 4: 예시적인 서열
Figure pct00018
본원에 개시된 다른 ACTR 구축물과 같이, 면역 세포 예컨대 T 세포 및 NK 세포에서의 이들 예시적인 ACTR 구축물의 발현은 이들 세포에 ADCC 능력을 부여할 것이고, 따라서, 항-BCMA 항체의 항종양 잠재력을 유의하게 증대시킬 것이다.
H. ACTR 구축물의 제조 및 그를 포함하는 제약 조성물
본원에 기재된 ACTR 구축물 중 임의의 것은 상용 방법, 예컨대, 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다. 본원의 ACTR 구축물을 제조하는 방법은 Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인, 막횡단 도메인, 및 ITAM을 포함하는 세포질 신호전달 도메인을 포함하여, ACTR 구축물의 각각의 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 생성하는 것을 수반한다. 핵산 구축물은 또한 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 또한 Fc 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인과 막횡단 도메인 사이의 힌지 도메인을 코딩한다. ACTR 구축물을 코딩하는 핵산은 또한 신호 서열을 코딩할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 서열은 서열식별번호: 1-63에 의해 제공된 예시적인 ACTR 구축물 중 어느 하나를 코딩한다.
ACTR 구축물의 각각의 성분의 서열은 상용 기술, 예를 들어, 관련 기술분야에 공지된 다양한 공급원들 중 어느 하나로부터의 PCR 증폭을 통해 수득될 수 있다. 일부 실시양태에서, ACTR 구축물의 성분 중 1종 이상의 서열은 인간 세포로부터 수득된다. 대안적으로, ACTR 구축물의 1종 이상의 성분의 서열은 합성될 수 있다. PCR 증폭 또는 라이게이션과 같은 방법을 사용하여, 각각의 성분 (예를 들어, 도메인)의 서열은 직접적으로, 또는 (예를 들어, 펩티드 링커를 코딩하는 핵선 서열을 사용하여) 간접적으로 연결되어, ACTR 구축물을 코딩하는 핵산 서열을 형성할 수 있다. 대안적으로, ACTR 구축물을 코딩하는 핵산을 합성할 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산은 DNA이다. 다른 실시양태에서, 핵산은 RNA이다.
II. ACTR 구축물을 발현하는 면역 세포
본원에 기재된 ACTR 구축물을 발현하는 숙주 세포 (ACTR-발현 세포, 예를 들어, ACTR T 세포)는 Fc-함유 항-BCMA 항체에 의해 결합된 BCMA-양성 표적 세포를 인식할 수 있는 특정 세포 집단을 제공한다. 한 실시양태에서, 이러한 숙주 세포 상에 발현된 ACTR 구축물의 세포외 리간드-결합 도메인과 항-BCMA 항체의 Fc 부분과의 결속으로 활성화 신호가 ACTR 구축물의 임의적인 공동-자극 신호전달 도메인(들) 및/또는 ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인에 전달되고, 이는 다시 숙주 세포의 세포 증식 및/또는 이펙터 기능, 예컨대, 숙주 세포에 의해 촉발되는 ADCC 효과를 활성화시킨다. 또 다른 실시양태에서, 이러한 숙주 세포 상에 발현된 ACTR 구축물의 세포외 Fc-결합 도메인과 항-BCMA 항체의 Fc 부분과의 결속으로 활성화 신호가 ACTR 구축물의 ITAM-함유 세포질 신호전달 도메인 및/또는 이러한 숙주 세포에서 공동-발현되는 1개 이상의 공동-자극 신호전달 도메인에 전달되고, 이는 다시 숙주 세포의 세포 증식 및/또는 이펙터 기능, 예컨대, 숙주 세포에 의해 촉발되는 ADCC 효과를 활성화시킨다. 공동-자극 신호전달 도메인(들) 및 ITAM을 포함하는 세포질 신호전달 도메인의 조합은 세포 내 다중 신호전달 경로의 강건한 활성화를 가능하게 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 면역 세포, 예컨대 T 세포 또는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 NK 세포이다. 다른 실시양태에서, 면역 세포는 확립된 세포주, 예를 들어, NK-92 세포일 수 있다.
본원에 기재된 ACTR 구축물 중 임의의 것은 공동-자극 신호를 트랜스로 제공하기 위한 본원에 기재된 1개 이상의 별개의 폴리펩티드와 함께 면역 세포에서 공동-발현될 수 있다.
면역 세포 집단은 임의의 공급원, 예컨대 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC), 골수, 또는 조직 예컨대 비장, 림프절, 흉선 또는 종양 조직으로부터 수득될 수 있다. 목적하는 유형의 숙주 세포를 수득하는 데 적합한 공급원은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 면역 세포 집단은 PBMC로부터 유래된다. 목적하는 유형의 숙주 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, 또는 T 세포 및 NK 세포)는 세포를 자극 분자와 공동-인큐베이션함으로써 수득된 세포 집단 내에서 확장될 수 있다. 비제한적 예로서, 항-CD3 및 항-CD28 항체는 T 세포의 확장에 사용될 수 있다.
본원에 기재된 ACTR 구축물 중 임의의 것을 발현하는 면역 세포를 구축하기 위해, ACTR 구축물의 안정한 또는 일시적인 발현을 위한 발현 벡터가 본원에 기재된 바와 같은 통상적인 방법을 통해 생성되고, 면역 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, ACTR 구축물을 코딩하는 핵산은 적합한 프로모터와 작동가능하게 연결되어 적합한 발현 벡터, 예컨대, 바이러스 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 핵산 및 벡터는 적합한 조건 하에 제한 효소와 접촉하여, 서로 쌍형성될 수 있고 리가제로 연결될 수 있는 상보적인 단부를 각각의 분자 상에서 생성할 수 있다. 대안적으로, 합성 핵산 링커는 ACTR 구축물을 코딩하는 핵산의 말단에 라이게이션될 수 있다. 합성 링커는 벡터 내 특정한 제한 부위에 상응하는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 발현 벡터/플라스미드/바이러스 벡터의 선택은 ACTR 구축물의 발현을 위한 숙주 세포의 유형에 따라 달라질 것이나, 진핵 세포에서의 통합 및 복제에 적합해야 한다.
본원에 기재된 ACTR 구축물의 발현에 다양한 프로모터가 사용될 수 있으며, 이는 비제한적으로, 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 프로모터, 바이러스 LTR, 예컨대, 라우스 육종 바이러스 LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 또는 헤르페스 단순 tk 바이러스 프로모터를 포함한다. ACTR 구축물의 발현을 위한 추가의 프로모터는 면역 세포에서의 임의의 구성적 활성 프로모터를 포함한다. 대안적으로, 임의의 조절가능한 프로모터가 사용될 수 있고, 이로써, 면역 세포 내에서의 그의 발현은 조정될 수 있다.
추가적으로, 벡터는 예를 들어, 하기 중 일부 또는 모두를 함유할 수 있다: 선택 마커 유전자, 예컨대, 숙주 세포에서 안정한 또는 일시적인 형질감염체의 선택을 위한 네오마이신 유전자; 높은 수준의 전사를 위한 인간 CMV의 극초기 유전자로부터의 인핸서/프로모터 서열; mRNA 안정성을 위한 SV40으로부터의 전사 종결 및 RNA 프로세싱 신호; 적절한 에피솜 복제를 위한 SV40 폴리오마바이러스 복제 기점 및 ColE1; 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), 다목적 다중 클로닝 부위; 센스 및 안티센스 RNA의 시험관내 전사를 위한 T7 및 SP6 RNA 프로모터; 촉발된 경우에 벡터를 보유하는 세포의 사멸을 유발하는 "자살 스위치" 또는 "자살 유전자" (예를 들어, HSV 티미딘 키나제 또는 유도성 카스파제, 예컨대, iCasp9), 및 ACTR 구축물의 발현을 평가하기 위한 리포터 유전자.
하나의 구체적 실시양태에서, 이러한 벡터는 또한 자살 유전자를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "자살 유전자"는 자살 유전자를 발현하는 세포의 사멸을 유발하는 유전자를 지칭한다. 자살 유전자는 작용제, 예를 들어, 약물에 대한 감수성을 유전자가 발현되는 세포에 부여하고, 세포가 작용제와 접촉하거나 또는 그에 노출된 경우에 세포의 사멸을 유발하는 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 관련 기술분야에 공지되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004] 참조), 이는 예를 들어, 헤르페스 단순 바이러스 (HSV) 티미딘 키나제 (TK) 유전자, 시토신 데아미나제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제, 니트로리덕타제 및 카스파제, 예컨대, 카스파제 8을 포함한다.
트랜스진을 함유하는 벡터를 생산하는 데 적합한 벡터 및 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 입수가능하다. ACTR 구축물의 발현을 위한 벡터의 제조에 관한 예는 예를 들어, 그 전문이 본원에 참조로 포함된 US2014/0106449에서 찾아볼 수 있다.
본원에 기재된 ACTR 구축물을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터 중 임의의 것은 또한 본 개시내용의 범주 내에 있다. 이러한 벡터, 또는 그 안에 함유되어 있는 ACTR 구축물을 코딩하는 서열은 임의의 적합한 방법에 의해 숙주 세포, 예컨대, 숙주 면역 세포 내로 전달될 수 있다. 벡터를 면역 세포로 전달하는 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, DNA 전기천공, RNA 전기천공, 시약, 예컨대, 리포솜을 사용하는 형질감염, 또는 바이러스 형질도입을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, ACTR 구축물의 발현을 위한 벡터는 바이러스 형질도입에 의해 숙주 세포에게 전달된다. 전달을 위한 예시적인 바이러스 방법은 재조합 레트로바이러스 (예를 들어 PCT 공개 번호 WO 90/07936; WO 94/03622; WO 93/25698; WO 93/25234; WO 93/11230; WO 93/10218; 및 WO 91/02805; 미국 특허 번호 5,219,740 및 4,777,127; GB 특허 번호 2,200,651; 및 EP 특허 번호 0 345 242 참조), 알파바이러스-기반 벡터, 및 아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터 (예를 들어 PCT 공개 번호 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984; 및 WO 95/00655 참조)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, ACTR 구축물의 발현을 위한 벡터는 레트로바이러스이다. 일부 실시양태에서, ACTR 구축물의 발현을 위한 벡터는 렌티바이러스이다.
레트로바이러스 형질도입을 기재하는 참고문헌의 예는 미국 특허 번호 5,399,346 (Anderson et al.); 문헌 [Mann et al., Cell 33:153 (1983)]; 미국 특허 번호 4,650,764 (Temin et al.); 미국 특허 번호 4,980,289 (Temin et al.); 문헌 [Markowitz et al., J. Virol. 62:1120 (1988)]; 미국 특허 번호 5,124,263 (Temin et al.); 국제 특허 공개 번호 WO 95/07358 (1995년 3월 16일 공개, Dougherty et al.); 및 문헌 [Kuo et al., Blood 82:845 (1993)]을 포함한다. 국제 특허 공개 번호 WO 95/07358은 1차 B 림프구의 높은 효율 형질도입을 기재한다. 본원에 언급된 목적 및 대상을 위해 본원에 참조로 포함된 WO2016040441A1을 또한 참조한다.
ACTR 구축물을 코딩하는 벡터를 바이러스 벡터를 사용하여 숙주 세포로 도입하는 예에서, 면역 세포를 감염시킬 수 있고, 벡터를 보유하는 바이러스 입자는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있고, 이는 예를 들어, PCT 출원 번호 WO 1991/002805A2, WO 1998/009271 A1, 및 미국 특허 6,194,191에서 찾아볼 수 있다. 바이러스 입자를 세포 배양물 상청액으로부터 수거하고, 바이러스 입자를 면역 세포와 접촉시키기 전에 단리 및/또는 정제할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 구축물 중 임의의 것을 코딩하는 RNA 분자는 통상적인 방법 (예를 들어, 시험관내 전사)에 의해 제조한 다음, 공지된 방법 (예를 들어, 문헌 [Rabinovich et al., Human Gene Therapy 17:1027-1035])을 통해 적합한 숙주 세포, 예를 들어, 본원에 기재된 것 내로 도입시킬 수 있다.
숙주 세포 내로 본원에 제공된 ACTR 구축물 중 임의의 것을 코딩하는 벡터, 또는 키메라 벡터를 코딩하는 핵산 (예를 들어, RNA 분자)을 도입한 후, ACTR 구축물의 발현을 허용하는 조건 하에 세포가 배양된다. ACTR 구축물을 코딩하는 핵산이 조절가능한 프로모터에 의해 조절되는 예에서, 숙주 세포는 조절가능한 프로모터가 활성화되는 조건에서 배양된다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 유도가능한 프로모터이고, 면역 세포는 유도 분자의 존재 하에, 또는 유도 분자가 제조되는 조건 하에 배양된다. ACTR 구축물 발현 여부를 결정하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 임의의 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 정량적 리버스 트랜스크립타제 PCR (qRT-PCR)에 의한 ACTR 구축물-코딩 mRNA의 검출에 의해, 또는 웨스턴 블롯팅, 형광 현미경검사, 및 유동 세포측정법을 포함한 방법에 의한 ACTR 구축물 단백질의 검출에 의해 평가될 수 있다. 대안적으로, ACTR 구축물의 발현은 면역 세포가 대상체에게 투여된 후에 생체내에서 발생할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "대상체"는 임의의 포유동물을 지칭한다. 예를 들어, 대상체는 영장류일 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
대안적으로, 본원에 개시된 면역 세포 중 임의의 것에서의 ACTR 구축물의 발현은 ACTR 구축물을 코딩하는 RNA 분자를 도입함으로써 달성될 수 있다. 이러한 RNA 분자는 시험관내 전사에 의해 또는 화학적 합성에 의해 제조될 수 있다. 이어서, RNA 분자는 예를 들어 전기천공에 의해, 적합한 숙주 세포 예컨대 면역 세포 (예를 들어, T 세포, NK 세포, 또는 T 세포 및 NK 세포 둘 다) 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Rabinovich et al., Human Gene Therapy, 17:1027-1035] 및 WO WO2013/040557에 기재된 방법에 따라, RNA 분자는 합성되고, 숙주 면역 세포 내로 도입될 수 있다.
본원에 기재된 ACTR 구축물 중 임의의 것을 발현하는 숙주 세포를 제조하는 방법은 또한 생체외에서 숙주 세포를 활성화시키는 것을 포함할 수 있다. 숙주 세포를 활성화시키는 것은 세포가 이펙터 기능 (예를 들어, ADCC)을 수행할 수 있을 수 있는 활성화 상태로 숙주 세포를 자극하는 것을 의미한다. 숙주 세포를 활성화시키는 방법은 ACTR 구축물의 발현에 사용되는 숙주 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 예를 들어, T 세포는 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, IL-2 및/또는 피토헤모아글루티닌을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1종 이상의 분자의 존재 하에 생체외에서 활성화될 수 있다. 다른 예에서, NK 세포는 1종 이상의 분자 예컨대 4-1BB 리간드, 항-4-1BB 항체, IL-15, 항-IL-15 수용체 항체, IL-2, IL12, IL-21, 및 K562 세포의 존재 하에 생체외에서 활성화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물 중 임의의 것을 발현하는 숙주 세포 (ACTR-발현 세포)는 대상체에의 투여 전에 생체외에서 활성화된다. 숙주 세포 활성화 여부를 결정하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이며, 세포 활성화와 연관된 1종 이상의 세포 표면 마커의 발현, 시토카인의 발현 또는 분비, 및 세포 형태를 평가하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 ACTR 구축물 중 임의의 것을 발현하는 숙주 세포를 제조하는 방법은 생체외에서 숙주 세포를 확장시키는 것을 포함할 수 있다. 숙주 세포를 확장시키는 것은 ACTR 구축물을 발현하는 세포의 수를 증가시키는 임의의 방법, 예를 들어, 숙주 세포가 증식하도록 하거나, 또는 숙주 세포가 증식하도록 자극하는 것을 수반할 수 있다. 숙주 세포의 확장을 자극하는 방법은 ACTR 구축물의 발현을 위해 사용되는 숙주 세포의 유형에 따라 달라질 것이며, 이는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 ACTR 구축물 중 임의의 것을 발현하는 숙주 세포는 대상체에의 투여 전에 생체외에서 확장된다.
일부 실시양태에서, ACTR 구축물을 발현하는 숙주 세포는 대상체에게 세포를 투여하기 전에 생체외에서 확장되고, 활성화된다. 숙주 세포 활성화 및 확장을 사용하여 바이러스 벡터를 게놈 내로 통합시킬 수 있고, 본원에 기재된 바와 같은 ACTR 구축물을 코딩하는 유전자를 발현시킬 수 있다. mRNA 전기천공을 사용할 경우, 비록 전기천공이 활성화된 세포에서 수행될 때에 보다 효과적일 수 있지만, 활성화 및/또는 확장이 필요하지 않을 수도 있다. 일부 경우에, ACTR 구축물은 적합한 숙주 세포에서 (예를 들어, 3-5일 동안) 일시적으로 발현된다. 일시적인 발현은, 잠재적인 독성이 있는 경우 유리할 수 있으며, 가능한 부작용에 대한 임상 시험의 초기 단계에서 도움이 되어야 한다.
ACTR 구축물을 발현하는 숙주 세포 중 임의의 것은 또한 본 개시내용의 범주 내에 있는 제약 조성물을 형성하기 위해 제약상 허용되는 담체와 혼합될 수 있다.
본 개시내용의 조성물과 관련하여 사용된 어구 "제약상 허용되는"은 분자 엔티티 및 이러한 조성물의 다른 성분이 생리학상 허용되고, 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 투여된 경우에 전형적으로 부작용 반응을 일으키지 않는 것을 지칭한다. 바람직하게는, 본원에 사용된 용어 "제약상 허용되는"은 포유동물, 및 보다 특히 인간에서 사용하기 위한, 연방 정부 또는 주 정부의 관리 당국에 의해 승인되거나, 또는 미국 약전, 또는 다른 일반적으로 인정된 약전에 열거된 것을 의미한다. "허용되는"은 담체가 조성물의 활성 성분 (예를 들어, 핵산, 벡터, 세포, 또는 치료 항체)과 상용성이고, 조성물(들)을 투여받은 대상체에게 부정적인 영향을 미치지 않는다는 것을 의미한다. 본 발명의 방법에서 사용하고자 하는 제약 조성물 중 임의의 것은 동결건조된 제제 또는 수용액 형태로 제약상 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제를 포함할 수 있다.
완충제를 포함한 제약상 허용되는 담체는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제; 저분자량 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 이뮤노글로불린; 아미노산; 소수성 중합체; 단당류; 이당류; 및 다른 탄수화물; 금속 착물; 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]을 참조한다.
본 개시내용의 제약 조성물은 또한 치료하고자 하는 특정한 적응증 및/또는 ADCC의 증진을 위해 필요한 1종 이상의 추가의 활성 화합물, 바람직하게는, 서로 유해한 영향을 미지치 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 가능한 추가의 활성 화합물의 비제한적 예는 예를 들어, IL2 뿐만 아니라, 관련 분야에 공지되고 하기 조합 치료에 관한 논의에서 열거되는 다양한 작용제를 포함한다.
본 개시내용이 본원에 언급된 질환 상태들 중 임의의 것에 관한 것인 한, 본 개시내용과 관련하여 용어 "치료하다," "치료" 및 유사 용어는 이러한 상태와 연관된 적어도 1종의 증상을 경감 또는 완화시키거나, 이러한 상태의 진행을 저속화 또는 역전시키는 것을 의미한다. 본 개시내용의 의미 내에서, 용어 "치료하다"는 또한 발병을 정지시키고/거나, 발병을 (즉, 질환의 임상 징후 전 기간을) 지연시키고/거나, 질환의 발생 또는 악화 위험을 감소시키는 것을 의미한다. 예를 들어, 암과 관련하여 용어 "치료하다"는 환자의 종양 부담을 제거 또는 감소시키거나, 또는 전이를 예방, 지연, 또는 억제하는 것 등을 의미할 수 있다.
III. 항-BCMA 항체
B-세포 성숙 항원 (BCMA)은 TNF 수용체 슈퍼패밀리의 세포 표면 수용체이다. 이는 B 세포 (성숙 B 림프구에서 고도로 발현됨) 및 형질 세포에서 발현되고, BAFF (B-세포 활성화 인자)에 특이적으로 결합하여 NF-카파B 및 MAPK8/JNK를 활성화시키는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 문헌 [Bayles and Milcarek, Crit Rev Immunol. 2014;34(6):481-99; Coquery and Erickson, Crit Rev Immunol. 2012;32(4):287-305; 및 Rickert et al., Immunol Rev. 2011 Nov;244(1):115-33]을 참조한다.
예시적인 야생형 인간 BCMA의 서열 (또한 수탁 번호 BAB60895 하에 진뱅크에 의해 제공됨)이 하기에 제공된다:
Figure pct00019
(i) 항-BCMA 항체
본 개시내용은 면역요법 (예를 들어, 암 면역요법)에서의 ACTR T 세포 및 항-BCMA 항체의 공동-사용에 관한 것이다. 항-BCMA 항체는 BCMA 단백질, 예를 들어, 세포 표면 상에 발현된 BCMA 단백질에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다.
항체 (복수 형태가 상호교환가능하게 사용됨)는 이뮤노글로불린 분자의 가변 영역 내에 위치하는 적어도 하나의 항원 인식 부위를 통해 표적, 예컨대 탄수화물, 폴리뉴클레오티드, 지질, 폴리펩티드 등에 특이적으로 결합할 수 있는 이뮤노글로불린 분자이다. 본원에 사용된 용어 "항체"는 무손상 (즉, 전장) 폴리클로날 또는 모노클로날 항체뿐만 아니라, Fc 영역을 포함하는 그의 항원-결합 단편, 그의 돌연변이체, 항체 부분을 포함하는 융합 단백질, 인간화 항체, 키메라 항체, 디아바디, 나노바디, 선형 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체) 및 요구되는 특이성의 항원 인식 부위 및 Fc 영역을 포함하는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 다른 변형된 형태 (항체의 당화 변이체, 항체의 아미노산 서열 변이체, 및 공유적으로 변형된 항체 포함)를 포괄한다. 항체는 임의의 부류의 항체 예컨대 IgD, IgE, IgG, IgA, 또는 IgM (또는 그의 하위부류)을 포함하고, 항체는 임의의 특정한 부류일 필요가 없다. 그의 중쇄의 불변 도메인의 항체 아미노산 서열에 따라, 이뮤노글로불린은 상이한 부류로 배정될 수 있다. 이뮤노글로불린의 5종의 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 알파, 델타, 엡실론, 감마 및 뮤로 불린다. 이뮤노글로불린의 상이한 부류의 서브유닛 구조 및 3차원 형태는 널리 공지되어 있다. 본 개시내용에 사용하기 위한 항-BCMA 항체는 공동-사용된 ACTR T 세포에 의해 인식가능한 Fc 영역을 함유한다. Fc 영역은 인간 또는 인간화 Fc 영역일 수 있다.
본원에 기재된 항체 중 임의의 것은 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있다. "모노클로날 항체"는 균질한 항체 집단을 지칭하며, "폴리클로날 항체"는 비균질한 항체 집단을 지칭한다. 이러한 두 가지 용어가 항체의 공급원, 또는 그것이 제조되는 방식을 제한하는 것은 아니다.
한 예에서, 본원에 기재된 방법에 사용된 항체는 인간화 항체이다. 인간화 항체는 특정 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린 쇄, 또는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 그의 항원-결합 단편인 비-인간 (예를 들어 뮤린) 항체의 형태를 지칭한다. 대부분, 인간화 항체는, 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)으로부터의 잔기가 목적하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비-인간 종 (공여자 항체)의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기는 상응하는 비-인간 잔기로 대체된다. 게다가, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 도입된 CDR 또는 프레임워크 서열 어느 것에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있지만, 이것은 항체 성능이 추가로 정밀화되고 최적화되도록 포함된다. 일반적으로, 인간화 항체는 적어도 1개, 및 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 최적으로는 이뮤노글로불린 불변 영역 또는 도메인 (Fc)의 적어도 부분, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 것을 포함할 것이다. 항체는 WO 99/58572에 기재된 바와 같이 변형된 Fc 영역을 가질 수 있다. 다른 형태의 인간화 항체는 원래 항체와 관련하여 변경된 1개 이상 (1, 2, 3, 4, 5 또는 6개)의 CDR을 가지며, 이는 또한 원래 항체로부터의 1개 이상의 CDR"로부터 유래된" 1개 이상의 CDR로 지칭된다. 인간화 항체는 또한 친화도 성숙을 수반할 수 있다.
또 다른 예에서, 본원에 기재된 항체는 인간 항체로부터의 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있는 키메라 항체이다. 키메라 항체는 제1 종으로부터의 가변 영역 또는 그의 일부 및 제2 종으로부터의 불변 영역을 갖는 항체를 지칭한다. 전형적으로, 이들 키메라 항체에서, 경쇄 및 중쇄 둘 다의 가변 영역은 포유동물의 한 종 (예를 들어, 비-인간 포유동물 예컨대 마우스, 토끼 및 래트)으로부터 유래된 항체의 가변 영역을 모방하고, 반면에 불변 부분은 또 다른 포유동물 예컨대 인간으로부터 유래된 항체에서의 서열과 상동이다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변형은 가변 영역 및/또는 불변 영역에서 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-BCMA 항체는 상응하는 표적 항원 또는 그의 에피토프에 특이적으로 결합한다. 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 관련 기술분야에서 널리 이해되는 용어이다. 분자는 그것이 대안적인 표적과 하는 것에 비해 더 긴 지속기간 및/또는 더 큰 친화도로 특정한 표적 항원과 더 빈번하고 더 빠르게 반응하는 경우, "특이적 결합"을 나타내는 것으로 지칭된다. 항체는 그것이 다른 물질에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 더 용이하게, 및/또는 더 큰 지속기간으로 결합하는 경우, 표적 항원 또는 에피토프에 "특이적으로 결합한다". 예를 들어, 항원 (BCMA) 또는 그 안의 항원 에피토프에 특이적으로 (또는 우선적으로) 결합하는 항체는 그것이 다른 항원 또는 동일한 항원 내 다른 에피토프에 결합하는 것보다 더 큰 친화도, 결합력으로, 더 용이하게, 및/또는 더 큰 지속기간으로 이 표적 항원에 결합하는 항체이다. 또한 예를 들어 제1 표적 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 제2 표적 항원에 특이적으로 또는 우선적으로 결합할 수 있거나 또는 결합하지 않을 수 있다는 것이 이러한 정의에서 이해된다. 이에 따라, "특이적 결합" 또는 "우선적 결합"은 배타적 결합을 (포함할 수 있지만) 반드시 요구하지는 않는다. 일부 예에서, 표적 항원 또는 그의 에피토프에 "특이적으로 결합하는" 항체는 다른 항원 또는 동일한 항원 내 다른 에피토프에 결합하지 않을 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체는 BCMA에 특이적으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA 항체는 표적 항원 (예를 들어, BCMA) 또는 그의 항원 에피토프에 대해 적합한 결합 친화도를 갖는다. 본원에 사용된 "결합 친화도"는 겉보기 회합 상수 또는 KA를 지칭한다. KA는 해리 상수 (KD)의 역수이다. 본원에 기재된 항-BCMA 항체는 표적 항원 또는 항원 에피토프에 대해 적어도 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, 10-10 M, 또는 그 미만의 결합 친화도 (KD)를 가질 수 있다. 증가된 결합 친화도는 감소된 KD에 상응한다. 제2 항원 대비 제1 항원에 대한 항체의 더 높은 친화도 결합은 제2 항원에의 결합에 대한 KA (또는 수치값 KD)보다 제1 항원에의 결합에 대한 더 높은 KA (또는 더 작은 수치값 KD)에 의해 나타내어질 수 있다. 이러한 경우에, 항체는 제2 항원 (예를 들어, 제2 입체형태의 동일한 제1 단백질 또는 그의 모방체; 또는 제2 단백질) 대비 제1 항원 (예를 들어, 제1 입체형태의 제1 단백질 또는 그의 모방체)에 대해 특이성을 갖는다. 결합 친화도에서의 차이 (예를 들어, 특이성 또는 다른 비교에 있어서)는 적어도 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 37.5, 50, 70, 80, 91, 100, 500, 1000, 10,000 또는 105배일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA 항체 중 임의의 것은 표적 항원 또는 그의 항원 에피토프에 대한 항체의 결합 친화도를 증가시키기 위해 추가로 친화도 성숙될 수 있다.
결합 친화도 (또는 결합 특이성)는 평형 투석, 평형 결합, 겔 여과, ELISA, 표면 플라즈몬 공명, 또는 분광분석법 (예를 들어, 형광 검정을 사용함)을 포함한 다양한 방법에 의해 결정될 수 있다. 결합 친화도를 평가하기 위한 예시적인 조건은 HBS-P 완충제 (10 mM HEPES pH7.4, 150 mM NaCl, 0.005% (v/v) 계면활성제 P20)일 수 있다. 이들 기술은 표적 단백질 농도의 함수로서 결합된 결합 단백질의 농도를 측정하는 데 사용될 수 있다. 결합된 결합 단백질 ([Bound])의 농도는 일반적으로 하기 방정식에 의해 유리 표적 단백질 ([Free])의 농도와 관련된다:
[Bound] = [Free]/(Kd+[Free])
KA를 항상 정확하게 결정할 필요는 없는데, 이는 그것이 때때로 예를 들어 ELISA 또는 FACS 분석과 같은 방법을 사용하여 결정되고, KA에 비례하고, 따라서 더 높은 친화도가 예를 들어 2배 더 높은지 결정하는 것과 같은 비교에 사용할 수 있는 친화도의 정량적 측정을 수득하기에 충분하거나, 친화도의 질적 측정을 수득하기에 충분하거나, 또는 예를 들어 기능적 검정, 예를 들어, 시험관내 또는 생체내 검정에서의 활성에 의해 친화도의 추론을 수득하기에 충분하기 때문이다.
본원에 기재된 면역 요법 방법에 사용하기 위한 항-BCMA 항체는 특정 영역 또는 그 안의 항원 에피토프에 결합 (예를 들어, 특이적으로 결합)할 수 있다.
본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 예시적인 항-BCMA 항체는 본원에 기재된 항체 뿐만 아니라 다른 알려진 항체를 포함한다. 특정의 예시적인 항-BCMA 항체의 서열은 하기 표 5에 제공된다 (카바트 CDR 서열은 VH 및 VL 서열에서 밑줄표시됨).
표 5: 예시적인 BCMA 항체 서열 (VH 및 VL CDR은 밑줄표시됨).
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
본원에 기재된 항-BCMA 항체는 래트 SG16.17 또는 래트 SG16.45 항체의 인간화 또는 키메라 항체일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-BCMA 항체는 hSG16.17 경쇄 (예를 들어, VL 또는 VK2-VK5 중 임의의 것)와 쌍형성된 hSG16.17 VH (예를 들어, VH1-VH6 중 임의의 것)를 포함할 수 있다. 이러한 조합 중 임의의 것은 hSG16.17 항체이다. 다른 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 hSG16.45 경쇄 (예를 들어, VK1-VK5 중 임의의 것)와 쌍형성된 hSG16.45 중쇄 (예를 들어, VH1-VH6 중 임의의 것)를 포함할 수 있다. 이러한 조합 중 임의의 것은 hSG16.45 항체이다. 일부 예에서, 항-BCMA 항체는 hSG16.45 VH5와 동일한 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.45 VK2 및 동일한 성숙 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-BCMA 항체는 hSG16.45 VH1과 동일한 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.45 VK1과 동일한 성숙 경쇄 가변 영역을 포함한다. 또 다른 예에서, 항-BCMA 항체는 hSG16.45 VH1과 동일한 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.45 VK3과 동일한 성숙 경쇄 가변 영역을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-BCMA 항체는 본원에 기재된 예시적인 항체 중 임의의 것, 예를 들어, hSG16.17 또는 hSG16.45와 동일한 BCMA 내 에피토프에 결합하거나, 또는 BCMA에 결합하는 것에 대해 예시적인 항체와 경쟁한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-BCMA 항체는 DYY(I/M)H (서열식별번호: 107) 또는 DHWMT (서열식별번호: 108)의 중쇄 CDR1, (Y/R/I)INPNSGYT(K/N/S)Y(N/A)(Q/E)(K/N)F(Q/K)(T/G) (서열식별번호: 109) 또는 (S/A/G)ITNTGGATYY(L/A)DSVKG (서열식별번호: 110)의 중쇄 CDR2, 및/또는 YMWERVTGFFDF (서열식별번호: 111) 또는 PGLYFDY (서열식별번호: 112)의 중쇄 CDR3을 함유한다. 대안적으로 또는 추가로, 본원에 기재된 항-BCMA 항체는 (L/R)ASEDISDDLA (서열식별번호: 113) 또는 (R/L)A(S/T)SSVSVMY (서열식별번호: 114)의 경쇄 CDR1, (서열식별번호: 115) TTS(S/R)LQ(D/S) 또는 STSSLAS (서열식별번호: 116)의 경쇄 CDR2, 및/또는 QQTYKFPPT (서열식별번호: 117) 또는 HQWSSDPPT (서열식별번호: 118)의 경쇄 CDR3을 함유한다.
일부 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 상기 표 5에 열거된 예시적인 중쇄 중 임의의 것과 동일한 중쇄 CDR 및/또는 표 5에 열거된 예시적인 경쇄 중 임의의 것과 동일한 경쇄 CDR을 포함한다.
대안적으로 또는 추가로, 항체는 hSG16.17 VH3에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 성숙 중쇄 가변 영역 및 hSG16.17 VK2에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
대안적으로 또는 추가로, 항체는 hSG16.45 VH5에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 중쇄 성숙한 가변 영역 및 hSG16.45 VK2에 대해 적어도 90% 서열 동일성 (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성)을 갖는 성숙 경쇄 가변 영역을 포함할 수 있다.
본원에 기재된 항-BCMA 항체 중 임의의 것에서, 위치 H58은 N 또는 K에 의해 점유될 수 있고, 위치 H60은 A 또는 N에 의해 점유될 수 있고, 위치 H61은 Q 또는 E에 의해 점유될 수 있고, 위치 H62는 K 또는 N에 의해 점유될 수 있고, 위치 H64는 Q 또는 K에 의해 점유될 수 있고, 위치 H65는 G 또는 T에 의해 점유될 수 있고, 위치 L24는 R 또는 L에 의해 점유될 수 있고, 위치 L53은 S 또는 R에 의해 점유될 수 있다. 일부 예에서, 위치 H58, H60, H61, H62, H64 및 H65는 각각 N, A, Q, K, Q 및 G에 의해 점유될 수 있고/거나 L24 및 L53은 각각 R 및 S에 의해 점유될 수 있다. 다른 예에서, 위치 H20, H48, H69, H71, H73, H76, H80, H88, H91 및 H93은 각각 L, I, M, A, K, N, V, A, F 및 T에 의해 점유될 수 있고/거나 위치 L46, L48 및 L87은 각각 V, V 및 F에 의해 점유될 수 있다. 본원에 사용된 넘버링 시스템은 카바트 넘버링 시스템이다.
본원에 기재된 항-BCMA 항체 임의의 것에서, 위치 H50은 A 또는 S에 의해 점유될 수 있고/거나, 위치 L24는 R 또는 L에 의해 점유될 수 있고/거나, 위치 L26은 S 또는 T에 의해 점유될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 위치 H30, H93 및 H94는 각각 N, T 및 S에 의해 점유될 수 있다.
본원에 기재된 항체 중 임의의 것에서, 성숙 중쇄 가변 영역은 중쇄 불변 영역에 융합될 수 있고, 성숙 경쇄 가변 영역은 경쇄 불변 영역에 융합될 수 있다. 임의로, 중쇄 불변 영역은 천연 인간 불변 영역에 비해 Fcγ 수용체에 대한 감소된 결합을 갖는 천연 인간 불변 영역의 돌연변이체 형태이다. 임의로, 중쇄 불변 영역은 lgG1 이소형의 것이다. 임의로, 중쇄 불변 영역 및 경쇄 불변 영역은 표 5에 개시된 서열을 갖는다. 임의로, 중쇄 불변 영역은 S239C 돌연변이를 포함하는 아미노산 서열을 갖는다. 임의로, 항체는 네이키드 항체이다. 임의로, 항체는 세포독성제 또는 세포증식억제제에 접합된다. 임의로, 항체는 세포독성제에 접합된다. 임의로, 세포독성제는 효소 절단가능한 링커를 통해 접합된다. 임의로, 세포독성제는 DNA 작은 홈 결합제이다.
인간화 항체가 예시된 hSG16.17 VH3 VK2 인간화 항체로부터의 임의의 변이를 나타내는 경우, 이러한 추가의 변이에 대한 하나의 가능성은 가변 영역 프레임워크에서의 추가의 복귀돌연변이이다. 다른 예시된 인간화 중쇄 또는 경쇄 성숙 가변 영역에서 복귀돌연변이된 임의의 또는 모든 위치는 또한 R에 의해 점유된 H8, A에 의해 점유된 H67 및 A에 의해 점유된 H78, S에 의해 점유된 L40, M에 의해 점유된 L78 및 D에 의해 점유된 L85 중 (즉, 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 모두로), 또는 중쇄에서 N에 의해 점유된 H38, R에 의해 점유된 H40, K에 의해 점유된 H73, S에 의해 점유된 H82A, 및 T에 의해 점유된 H83 중 5개 모두 및 경쇄에서 K에 의해 점유된 L3, 및 I에 의해 점유된 L20 중 1개 또는 둘 다로 이루어질 수 있다.
인간화 항체가 예시된 hSG16.45 VHS VK2 인간화 항체로부터의 임의의 변이를 나타내는 경우, 이러한 추가의 변이에 대한 하나의 가능성은 가변 영역 프레임워크에서의 추가의 복귀돌연변이이다. 다른 예시된 인간화 중쇄 또는 경쇄 성숙 가변 영역에서 복귀돌연변이된 임의의 또는 모든 위치는 또한 각각 I, I, N, 및 V에 의해 점유된 H37, H48, H76, H107 중 (즉, 1, 2, 3, 또는 4개로) 및/또는 각각 A, V, I, H, V, Y, 및 M에 의해 점유된 L14, L19, L21, L38, L58, L71 및 L78 중 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7개로 이루어질 수 있다.
일부 실시양태에서, 항체는 야생형 Fc 수용체, 예를 들어, 야생형 IgG 분자의 Fc 영역 (예를 들어, 리툭시맙 또는 트라스투주맙의 Fc)에 대한 상승된 결합 친화도를 갖는 Fc 변이체 단편을 함유할 수 있다.
Fc 변이체 단편은 야생형 IgG의 Fc에 대해 하나 이상의 돌연변이를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, Fc에서의 하나 이상의 돌연변이는 힌지 및/또는 CH2 도메인에 위치한다. 항체 내 돌연변이의 예는 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 미국 특허 7,601,335, 8,188,231, 및 9,120,856에서 찾아볼 수 있고, 아미노산 잔기 S239, F243, R292, S298, Y300, V305, A330, I332, E333, K334, 또는 P396 (문헌 [Kabat et al., (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.]에 기재된 바와 같은 EU 인덱스 넘버링을 사용함)의 치환 돌연변이를 포함한다. 일부 실시양태에서, Fc 단편에서의 하나 이상의 돌연변이는 S239D, F243L, R292P, S298A, Y300L, V305I, A330L, I332E, I332D, E333A, K334A, 및/또는 P396L일 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Shields et al. J. Biol. Chem. (2001) 276(9):6591-6604; Lazar et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2006) 103(11): 4005-4010; Stavenhagen et al. Cancer Res. (2007) 67(18): 8882-8890; Isoda et al. PLoS One (2015) 10(10): e0140120; Lu et al. J. Immunol. Met. (2011) 365:132-141; Liu et al. J. Biol. Chem. (2014) 289(6): 3571-3590; 및 Smith et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2012) 109(16):6181-6186]을 참조한다. 또한 미국 특허 번호 6,737,056, 7,662,925, 7,317,091, 및 8,217,147을 참조한다. 언급된 공개의 관련 개시내용은 본원에 언급된 목적 또는 대상을 위해 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, Fc 영역은 당조작될 수 있다 (즉, 변경된 글리코실화를 가질 수 있음). 특정 실시양태에서, Fc 영역은 비푸코실화 (즉, 비-푸코실화)될 수 있다.
항체는 그의 불변 영역에서의 보존된 위치를 포함한 위치에서 글리코실화되어 항체의 기능 및 구조에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Boyd et al., (1996) Mal. lmmunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, (1990) Biochem. 29:4175-4180; 및 Hefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, (1996) Current Opin. Biotech. 7:409-416]을 참조한다. 글리코실화의 변경 (즉, "당조작")은 예를 들어 항체 상에 발견되는 하나 이상의 탄수화물 모이어티를 첨가, 이동 또는 결실시킴으로써, 또는 글리코실화의 조성을 변화시킴으로써 (글리코실화 패턴을 변화시킴으로써) 이루어진다. 항체의 글리코실화의 변경은 항체의 서열 내 적어도 1개의 아미노산 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6개 또는 그 초과의 아미노산)의 첨가 또는 치환을 통해 달성될 수 있다. 대안적으로, 항체의 글리코실화는 또한 항체의 서열을 변경시키지 않고 달성될 수 있다. 예를 들어, 항체는 항체의 글리코실화 패턴을 변경시키는 세포, 예컨대, 예를 들어, 글리코실화 패턴을 변경시키도록 유전자 조작된 세포에 의해 발현될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Hse et al., (1997) J. Biol. Chem. 272:9062-9070 및 Yang et al. (2015) Nature Biotechnology 33, 842-844]을 참조한다. 비제한적 예로서, 조작된 세포주는 FUT8 유전자에서 기능 상실 돌연변이를 가질 수 있다. 세포에 의한 발현 동안 글리코실화 패턴에 영향을 미치는 다른 인자는 배지 제제, 배양 밀도, 산소화, pH, 정제 계획 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,047,335, 5,510,261, 및 5,278,299를 참조한다. 항체는 또한 예를 들어 효소적 과정 예컨대 엔도글리코시다제 예컨대 엔도글리코시다제 H의 사용을 사용하여 발현 후에 프로세싱될 수 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법에서 사용하기 위한 항체는 야생형 항체와 비교하여 더 낮은 양의 푸코스를 갖는 글리코실화 패턴을 가질 수 있다. 예를 들어, 다양한 실시양태에서, 항체의 분자 중 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 15% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만 또는 약 3% 미만이 야생형 푸코스 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항체의 분자 중 약 2%가 야생형 푸코스 수준을 갖는다. 한 실시양태에서, 항체는 푸코스 대신에 푸코스 유사체를 포함한다. 항체-생산 세포를 푸코스 유사체와 함께 인큐베이션하여 비-푸코실화 항체를 제조하는 방법, 푸코스 유사체를 사용하는 방법, 및 푸코스 유사체 그 자체가 예를 들어 WO2009135181 및 WO2009135181에 기재되어 있다. 그 안의 관련 개시내용은 언급된 목적 및 대상을 위해 참조로 포함된다.
(ii) 항-BCMA 항체의 제조
본원에 기재된 바와 같은 BCMA에 결합할 수 있는 항체는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Harlow and Lane, (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]을 참조한다.
일부 실시양태에서, 표적 항원 (예를 들어, BCMA 또는 그의 촉매 도메인)에 특이적인 항체는 통상적인 하이브리도마 기술에 의해 제조될 수 있다. 임의로 담체 단백질 예컨대 KLH에 커플링된 전장 표적 항원 또는 그의 단편이 그 항원에 결합하는 항체를 생성하기 위한 숙주 동물을 면역화시키는 데 사용될 수 있다. 본원에 추가로 기재된 바와 같이, 숙주 동물 면역화의 경로 및 스케줄은 일반적으로 항체 자극 및 생산에 대해 확립된 통상적인 기술을 따른다. 마우스, 인간화, 및 인간 항체의 생산을 위한 일반적 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있다. 인간을 포함한 임의의 포유동물 대상체 또는 그로부터의 항체 생산 세포는 인간을 포함한 포유동물의 하이브리도마 세포주의 생산을 위한 기초로서의 역할을 하도록 조작될 수 있는 것으로 고려된다. 전형적으로, 숙주 동물에게 본원에 기재된 바와 같은 것을 포함한 면역원의 양이 복강내로, 근육내로, 경구로, 피하로, 족저내, 및/또는 피내로 접종된다.
하이브리도마는 문헌 [Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497]의 일반적인 체세포 혼성화 기술을 사용하여, 또는 문헌 [Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982)]에 의해 변형된 바과 같이 림프구 및 불멸화된 골수종 세포로부터 제조될 수 있다. X63-Ag8.653, 및 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재의 솔크 인스티튜트, 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute, Cell Distribution Center)로부터의 것을 포함하나 이에 제한되지는 않는 입수가능한 골수종 세포주가 혼성화에 사용될 수 있다. 일반적으로, 기술은 폴리에틸렌 글리콜과 같은 융합생성제를 사용하거나 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 전기적 수단에 의해 골수종 세포 및 림프성 세포를 융합시키는 것을 수반한다. 융합 후, 세포는 융합 배지로부터 분리되고, 선택적 성장 배지, 예컨대 하이포크산틴-아미노프테린-티미딘 (HAT) 배지에서 성장되며 비혼성화된 모 세포는 제거된다. 혈청으로 보충되거나 보충되지 않은 본원에 기재된 배지 중 임의의 것이 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 배양하는 데 사용될 수 있다. 세포 융합 기술에 대한 또 다른 대안으로서, EBV 불멸화 B 세포를 사용하여 본원에 기재된 항-BCMA 모노클로날 항체를 생산할 수 있다. 원하는 경우에 하이브리도마는 확장 및 서브클로닝되고, 상청액은 통상적인 면역검정 절차 (예를 들어, 방사성면역검정, 효소 면역검정, 또는 형광 면역검정)에 의해 항-면역원 활성에 대해 검정된다.
항체의 공급원으로서 사용될 수 있는 하이브리도마는 BCMA 활성을 방해할 수 있는 모노클로날 항체를 생산하는 모 하이브리도마의 모든 유도체, 자손 세포를 포괄한다. 이러한 항체를 생산하는 하이브리도마는 공지된 절차를 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 성장될 수 있다. 모노클로날 항체는 원하는 경우에, 통상적인 이뮤노글로불린 정제 절차, 예컨대 황산암모늄 침전, 겔 전기영동, 투석, 크로마토그래피, 및 한외여과에 의해 배양 배지 또는 체액으로부터 단리될 수 있다. 예를 들어, 고체 상에 부착된 면역원으로 이루어진 흡착제 상에 제제를 전개시키고, 목적하는 항체를 면역원으로부터 용리 또는 방출시킴으로써, 목적하지 않은 활성 (존재하는 경우)을 제거할 수 있다. 이관능성 또는 유도체화제, 예를 들어 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙신이미드 (리신 잔기를 통함), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl, 또는 R1N=C=NR (여기서, R 및 R1은 상이한 알킬 기임)을 사용하여, 면역화시키고자 하는 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린, 또는 대두 트립신 억제제와 접합된 표적 아미노산 서열을 함유하는 표적 항원 또는 그의 단편으로 숙주 동물을 면역화시키면, 항체 (예를 들어, 모노클로날 항체) 집단이 생성될 수 있다.
원하는 경우에, 관심 항체 (모노클로날 또는 폴리클로날) (예를 들어, 하이브리도마에 의해 생산됨)를 서열분석할 수 있고, 이어서 폴리뉴클레오티드 서열을 발현 또는 증식을 위해 벡터 내로 클로닝할 수 있다. 관심 항체를 코딩하는 서열은 숙주 세포에서 벡터 내에 유지될 수 있고, 이어서 숙주 세포는 향후 사용을 위해 확장 및 동결될 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오티드 서열은 항체를 "인간화"시키거나 항체의 친화도 또는 다른 특징을 개선시키기 위해 유전자 조작에 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체가 인간에서 임상 시험 및 치료에 사용되는 경우에 면역 반응을 피하기 위해 불변 영역이 인간 불변 영역과 더 유사하도록 조작할 수 있다. 표적 항원에 대한 보다 큰 친화도 및 BCMA의 활성을 억제하는 데 있어서 보다 큰 효능을 수득하기 위해 항체 서열을 유전자 조작하는 것이 바람직할 수 있다. 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 변화가 항체에 대해 이루어질 수 있고, 표적 항원에 대한 그의 결합 특이성이 여전히 유지된다는 것이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
다른 실시양태에서, 완전 인간 항체는 특이적 인간 이뮤노글로불린 단백질을 발현하도록 조작된 상업적으로 입수가능한 마우스를 사용하여 수득될 수 있다. 보다 바람직한 (예를 들어, 완전 인간 항체) 또는 보다 강건한 면역 반응을 생성하도록 설계된 트랜스제닉 동물이 또한 인간화 또는 인간 항체의 생성을 위해 사용될 수 있다. 이러한 기술의 예는 암젠, 인크.(Amgen, Inc.) (캘리포니아주 프리몬트)로부터의 제노마우스(Xenomouse)R™ 및 메다렉스, 인크.(Medarex, Inc.) (뉴저지주 프린스턴)로부터의 HuMAb-마우스R™ 및 TC 마우스™이다. 또 다른 대안에서, 파지 디스플레이 또는 효모 기술에 의해 항체를 재조합적으로 제조할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; 및 6,265,150; 및 문헌 [Winter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455]를 참조한다. 대안적으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553)을 사용하여, 비면역화된 공여자로부터의 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레퍼토리로부터 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 생산할 수 있다.
유전자 조작된 항체, 예컨대 인간화 항체, 키메라 항체, 단일-쇄 항체 및 이중-특이적 항체를 예를 들어 통상적인 재조합 기술을 통해 생산할 수 있다. 한 예에서, 표적 항원에 특이적인 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 용이하게 단리되고, 통상적인 절차를 사용하여 (예를 들어 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 서열분석될 수 있다. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 한다. 단리되면, DNA를 1개 이상의 발현 벡터 내로 배치할 수 있고, 이어서 이를 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 숙주 세포, 예컨대 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. 예를 들어, PCT 공개 번호 WO 87/04462를 참조한다. 이어서, 예를 들어, 상동 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써 (Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851), 또는 이뮤노글로불린 코딩 서열에 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 전부 또는 일부 코딩 서열을 공유 연결함으로써 DNA가 변형될 수 있다. 그러한 방식으로, 표적 항원의 결합 특이성을 갖는 유전자 조작된 항체, 예컨대 "키메라" 또는 "하이브리드" 항체를 제조할 수 있다.
"키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어 문헌 [Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851; Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; 및 Takeda et al. (1984) Nature 314:452]을 참조한다.
인간화 항체를 구축하는 방법이 또한 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)]을 참조한다. 한 예에서, 모 비-인간 항체의 VH 및 VL의 가변 영역은 관련 기술분야에 공지된 방법에 따라 3차원 분자 모델링 분석에 적용된다. 이후에, 정확한 CDR 구조의 형성에 있어서 중요한 것으로 예측되는 프레임워크 아미노산 잔기는 동일한 분자 모델링 분석을 사용하여 확인된다. 병행하여, 모 비-인간 항체의 것과 상동인 아미노산 서열을 갖는 인간 VH 및 VL은 검색 질의로서 모 VH 및 VL 서열을 사용하여 임의의 항체 유전자 데이터베이스로부터 확인된다. 이어서, 인간 VH 및 VL 수용자 유전자가 선택된다.
선택된 인간 수용자 유전자 내의 CDR 영역은 모 비-인간 항체 또는 그의 기능적 변이체로부터의 CDR 영역으로 대체될 수 있다. 필요한 경우, CDR 영역과 상호작용하는 데 있어서 중요한 것으로 예측되는 모 쇄의 프레임워크 영역 내의 잔기 (상기 설명 참조)는 인간 수용자 유전자에서 상응하는 잔기를 치환하는 데 사용될 수 있다.
관련 기술분야에 공지되고 본원에 기재된 방법에 따라 수득된 항체는 관련 기술분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 특징화될 수 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 항원이 결합하는 에피토프를 확인하는 것, 또는 "에피토프 맵핑"이다. 예를 들어, 문헌 [Chapter 11 of Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999]에 기재된 바와 같이, 항체-항원 복합체의 결정 구조 해석, 경쟁 검정, 유전자 단편 발현 검정, 및 합성 펩티드-기반 검정을 포함하여 단백질 상에서 에피토프의 위치를 맵핑하고 특징화하는 관련 기술분야에 공지된 많은 방법이 존재한다. 추가의 예에서, 에피토프 맵핑을 사용하여 항체가 결합하는 서열을 결정할 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프일 수 있고, 즉 아미노산의 단일 스트레치 내에 함유될 수 있거나, 또는 반드시 단일 스트레치 (1차 구조 선형 서열) 내에 함유될 필요는 없을 수 있는 아미노산의 3차원 상호작용에 의해 형성된 입체형상 에피토프일 수 있다. 다양한 길이 (예를 들어, 적어도 4-6개의 아미노산 길이)의 펩티드는 단리 또는 합성되고 (예를 들어, 재조합적으로), 항체와의 결합 검정에 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 항체가 결합하는 에피토프를 표적 항원 서열로부터 유래된 중첩 펩티드를 사용하여 항체에 의한 결합을 결정함으로써 체계적인 스크리닝에서 결정할 수 있다. 유전자 단편 발현 검정에 따르면, 표적 항원을 코딩하는 오픈 리딩 프레임은 무작위로 또는 특정 유전자 구축물에 의해 단편화되고, 발현된 항원 단편의 시험될 항체와의 반응성이 결정된다. 유전자 단편은, 예를 들어 PCR에 의해 생산된 다음, 방사성 아미노산의 존재 하에 시험관내에서 단백질로 전사 및 번역될 수 있다. 이어서, 방사성 표지된 항원 단편에 대한 항체의 결합은 면역침전 및 겔 전기영동에 의해 결정된다. 특정 에피토프는 또한 파지 입자의 표면 상에 디스플레이된 무작위 펩티드 서열의 대형 라이브러리 (파지 라이브러리)를 사용함으로써 확인될 수 있다. 대안적으로, 중첩 펩티드 단편의 규정된 라이브러리는 간단한 결합 검정에서 시험 항체에 대한 결합에 대해 시험될 수 있다. 추가의 예에서, 항원 결합 도메인의 돌연변이유발, 도메인 스와핑 실험 및 알라닌 스캐닝 돌연변이유발이 에피토프 결합에 요구되고/되거나, 충분하고/하거나, 필요한 잔기를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, BCMA 폴리펩티드의 다양한 단편이 밀접하게 관련되었지만 항원성이 다른 단백질 (예컨대 뉴로트로핀 단백질 패밀리의 또 다른 구성원)로부터의 서열로 대체 (스와핑)된 표적 항원의 돌연변이를 사용하여 도메인 스와핑 실험이 수행될 수 있다. 돌연변이체 BCMA에 대한 항체의 결합을 평가함으로써, 항체 결합에 대한 특정한 항원 단편의 중요성을 평가할 수 있다.
대안적으로, 경쟁 검정은 항체가 다른 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지 결정하기 위해 동일한 항원에 결합하는 것으로 알려져 있는 다른 항체를 사용하여 수행될 수 있다. 경쟁 검정은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
일부 예에서, 항-BCMA 항체는 하기 예시된 바와 같은 재조합 기술에 의해 제조된다.
본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산은, 각각의 뉴클레오티드 서열이 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결되어, 하나의 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 한 예에서, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 각각은 별개의 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 대안적으로, 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 중쇄 및 경쇄 둘 다가 동일한 프로모터로부터 발현되도록 단일 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 필요한 경우, 내부 리보솜 진입 부위 (IRES)는 중쇄와 경쇄 코딩 서열 사이에 삽입될 수 있다.
일부 예에서, 항체의 2개의 쇄를 코딩하는 뉴클레오티드 서열은 동일하거나 또는 상이한 세포 내로 도입될 수 있는 2개의 벡터 내로 클로닝된다. 2개의 쇄가 상이한 세포에서 발현되는 경우, 이들 각각은 그를 발현하는 숙주 세포로부터 단리될 수 있고, 단리된 중쇄 및 경쇄는 항체의 형성을 가능하게 하는 적합한 조건 하에 혼합 및 인큐베이션될 수 있다.
일반적으로, 항체의 하나 또는 모든 쇄를 코딩하는 핵산 서열은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결되어 적합한 발현 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 및 벡터는 적합한 조건 하에 제한 효소와 접촉하여, 서로 쌍형성될 수 있고 리가제로 연결될 수 있는 상보적인 단부를 각각의 분자 상에서 생성할 수 있다. 대안적으로, 합성 핵산 링커는 유전자 말단에 라이게이션될 수 있다. 이들 합성 링커는 벡터 내 특정한 제한 부위에 상응하는 핵산 서열을 함유한다. 발현 벡터/프로모터의 선택은 항체를 생산하는 데 사용하기 위한 숙주 세포의 유형에 따라 달라질 것이다.
시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기 프로모터, 바이러스 LTR 예컨대 라우스 육종 바이러스 LTR, HIV-LTR, HTLV-1 LTR, 원숭이 바이러스 40 (SV40) 초기 프로모터, 이. 콜라이 lac UV5 프로모터, 및 단순 포진 tk 바이러스 프로모터를 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 프로모터가 본원에 기재된 항체의 발현을 위해 사용될 수 있다.
조절성 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 이러한 조절성 프로모터는 lac 오퍼레이터-보유 포유동물 세포 프로모터로부터의 전사를 조절하는 전사 조정인자로서 이. 콜라이로부터의 lac 리프레서를 사용하는 것 [Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)], 테트라시클린 리프레서 (tetR)를 사용하는 것 [Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992); Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998); Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)]을 포함한다. 다른 시스템은 아스트라디올, RU486, 디페놀 무리슬레론, 또는 라파마이신을 사용하는 FK506 이량체, VP16 또는 p65를 포함한다. 유도성 시스템은 인비트로젠(Invitrogen), 클론테크(Clontech) 및 아리아드(Ariad)로부터 입수가능하다.
오페론을 갖는 리프레서를 포함하는 조절성 프로모터가 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 이. 콜라이로부터의 lac 리프레서는 lac 오퍼레이터-보유 포유동물 세포 프로모터로부터의 전사를 조절하는 전사 조정인자로서 기능할 수 있는데 [M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987)]; Gossen and Bujard (1992); [M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)], 이는 테트라시클린 리프레서 (tetR)가 전사 활성인자 (VP 16)와 조합되어 tetR-포유동물 세포 전사 활성인자 융합 단백질, tTa (tetR-VP 16)를 생성하고, 인간 시토메갈로바이러스 (hCMV) 주요 극초기 프로모터로부터 유래된 tetO-보유 최소 프로모터와 조합되어 포유동물 세포에서 유전자 발현을 제어하는 tetR-tet 오퍼레이터 시스템을 생성한다. 한 실시양태에서, 테트라시클린 유도성 스위치가 사용된다. 테트라시클린 리프레서 (tetR) 단독은, 오히려 tetR-포유동물 세포 전사 인자 융합 유도체보다, 테트라시클린 오퍼레이터가 CMVIE 프로모터의 TATA 요소의 하류에 적절히 배치된 경우에 포유동물 세포에서 유전자 발현을 조절하기 위한 강력한 트랜스-조정제로서 기능할 수 있다 (Yao et al., Human Gene Therapy). 이 테트라시클린 유도성 스위치의 하나의 특정한 이점은 그것이 그의 조절가능한 효과를 달성하기 위해 테트라시클린 리프레서-포유동물 세포 전사활성인자 또는 리프레서 융합 단백질의 사용을 필요로 하지 않는다는 것인데, 이는 일부 경우에 세포에 독성일 수 있다 (Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)).
추가적으로, 벡터는 예를 들어 하기 중 일부 또는 모두를 함유할 수 있다: 선택 마커 유전자, 예컨대 포유동물 세포에서의 안정한 또는 일시적 형질감염체의 선택을 위한 네오마이신 유전자; 높은 수준의 전사를 위한 인간 CMV의 극초기 유전자로부터의 인핸서/프로모터 서열; mRNA 안정성을 위한 SV40으로부터의 전사 종결 및 RNA 프로세싱 신호; 적절한 에피솜 복제를 위한 SV40 폴리오마 복제 기점 및 ColE1; 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), 다기능 다중 클로닝 부위; 및 센스 및 안티센스 RNA의 시험관내 전사를 위한 T7 및 SP6 RNA 프로모터. 트랜스진을 함유하는 벡터를 생산하는 데 적합한 벡터 및 방법은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 입수가능하다.
본원에 기재된 방법을 실시하기에 유용한 폴리아데닐화 신호의 예는 인간 콜라겐 I 폴리아데닐화 신호, 인간 콜라겐 II 폴리아데닐화 신호, 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
항체 중 임의의 것을 코딩하는 핵산을 포함하는 1개 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)는 항체를 생산하기에 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 숙주 세포는 항체 또는 그의 임의의 폴리펩티드 쇄의 발현에 적합한 조건 하에 배양될 수 있다. 이러한 항체 또는 그의 폴리펩티드 쇄는 통상적인 방법, 예를 들어, 친화도 정제를 통해 배양된 세포에 의해 (예를 들어, 세포 또는 배양물 상청액으로부터) 회수될 수 있다. 필요한 경우, 항체의 폴리펩티드 쇄는 항체의 생산을 가능하게 하는 적합한 시간 기간 동안 적합한 조건 하에 인큐베이션될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항체를 제조하는 방법은 또한 본원에 기재된 바와 같이, 항-BCMA 항체의 중쇄 및 경쇄 둘 다를 코딩하는 재조합 발현 벡터를 수반한다. 재조합 발현 벡터는 통상적인 방법, 예를 들어, 칼슘 포스페이트-매개 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포 (예를 들어, dhfr- CHO 세포) 내로 도입될 수 있다. 양성 형질전환체 숙주 세포는 세포로부터 또는 배양물 배지로부터 회수될 수 있는 항체를 형성하는 2개의 폴리펩티드 쇄의 발현을 가능하게 하는 적합한 조건 하에 선택 및 배양될 수 있다. 필요한 경우, 숙주 세포로부터 회수된 2개의 쇄는 항체의 형성을 가능하게 하는 적합한 조건 하에 인큐베이션될 수 있다.
한 예에서, 2개의 재조합 발현 벡터가 제공되며, 하나는 항-BCMA 항체의 중쇄를 코딩하고, 다른 것은 항-BCMA 항체의 경쇄를 코딩한다. 2개의 재조합 발현 벡터 둘 다는 통상적인 방법, 예를 들어, 칼슘 포스페이트-매개 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포 (예를 들어, dhfr- CHO 세포) 내로 도입될 수 있다. 대안적으로, 발현 벡터 각각은 적합한 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 양성 형질전환체는 항체의 폴리펩티드 쇄의 발현을 가능하게 하는 적합한 조건 하에 선택 및 배양될 수 있다. 2개의 발현 벡터가 동일한 숙주 세포 내로 도입되는 경우에, 그 안에 생산된 항체는 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 필요한 경우, 폴리펩티드 쇄는 숙주 세포로부터 또는 배양 배지로부터 회수될 수 있고, 이어서 항체의 형성을 가능하게 하는 적합한 조건 하에 인큐베이션될 수 있다. 2개의 발현 벡터가 상이한 숙주 세포 내로 도입되는 경우에, 이들 각각은 상응하는 숙주 세포로부터 또는 상응하는 배양 배지로부터 회수될 수 있다. 이어서, 2개의 폴리펩티드 쇄는 항체의 형성에 적합한 조건 하에 인큐베이션될 수 있다.
표준 분자 생물학 기술이 재조합 발현 벡터를 제조하고, 숙주 세포를 형질감염시키고, 형질전환체에 대해 선택하고, 숙주 세포를 배양하고, 배양 배지로부터 항체를 회수하는 데 사용된다. 예를 들어, 일부 항체는 단백질 A 또는 단백질 G 커플링된 매트릭스를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA 항체의 중쇄, 경쇄, 또는 둘 다를 코딩하는 핵산, 그를 함유하는 벡터 (예를 들어, 발현 벡터); 및 벡터를 포함하는 숙주 세포 중 임의의 것이 본 개시내용의 범주 내에 있다.
(iii) 항-BCMA 항체의 제약 조성물
본원에 기재된 바와 같은, 항체, 뿐만 아니라 코딩 핵산 또는 핵산 세트, 그를 함유하는 벡터, 또는 벡터를 포함하는 숙주 세포는 표적 질환을 치료하는 데 사용하기 위한 제약 조성물을 형성하기 위해 제약상 허용되는 담체 (부형제)와 혼합될 수 있다. 완충제를 포함한 제약상 허용되는 부형제 (담체)가 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]을 참조한다.
본 발명의 방법에 사용될 제약 조성물은 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다. (Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover). 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용된 투여량 및 농도에서 수용자에게 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 다른 유기 산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 또는 덱스트란을 포함한 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대-이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 트윈(TWEEN)™, 플루로닉스(PLURONICS)™ 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 항체 (또는 코딩 핵산)를 함유하는 리포솜을 포함하고, 이는 관련 기술분야에 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)]; 및 미국 특허 번호 4,485,045 및 4,544,545에 기재된 것에 의해 제조될 수 있다. 순환 시간이 증진된 리포솜이 미국 특허 번호 5,013,556에 개시되어 있다. 특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발 방법에 의해 생성될 수 있다. 리포솜은 규정된 세공 크기의 필터를 통해 압출되어 바람직한 직경을 갖는 리포솜을 생성한다.
항체 또는 코딩 핵산(들)은 또한 각각 예를 들어 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들어, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐)에 또는 마크로에멀젼에 포획될 수 있다. 이러한 기술은 관련 기술분야에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 [Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)]을 참조한다.
다른 예에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 지속-방출 포맷으로 제제화될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하며, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 지속-방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 번호 3,773,919), L-글루탐산 및 7 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예컨대 루프론 데포(LUPRON DEPOT)™ (락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤리드 아세테이트로 구성된 주사가능한 마이크로구체), 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산을 포함한다.
생체내 투여에 사용될 제약 조성물은 멸균되어야 한다. 이는 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다. 치료 항체 조성물은 일반적으로 멸균 접근 포트를 갖는 용기, 예를 들어, 피하 주사 바늘에 의해 관통될 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알 내에 놓인다.
본원에 기재된 제약 조성물은 경구, 비경구 또는 직장 투여, 또는 흡입 또는 취입에 의한 투여를 위한 단위 투여 형태 예컨대 정제, 환제, 캡슐, 분말, 과립, 용액 또는 현탁액, 또는 좌제로 존재할 수 있다.
고체 조성물 예컨대 정제의 제조를 위해, 주요 활성 성분을 제약 담체, 예를 들어 통상적인 정제화 성분, 예컨대 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 소르비톨, 활석, 스테아르산, 스테아르산마그네슘, 인산이칼슘 또는 검, 및 다른 제약 희석제, 예를 들어, 물과 혼합하여, 본 발명의 화합물 또는 그의 비독성 제약상 허용되는 염의 균질 혼합물을 함유하는 고체 예비제제 조성물을 형성할 수 있다. 이들 예비제제 조성물을 균질한 것으로서 언급하는 경우에, 이는 조성물이 동등하게 효과적인 단위 투여 형태 예컨대 정제, 환제 및 캡슐로 용이하게 세분될 수 있도록 활성 성분이 조성물 전반에 걸쳐 균일하게 분산되는 것을 의미한다. 이어서, 이러한 고체 예비제제 조성물은 본 발명의 활성 성분을 0.1 내지 약 500 mg 함유하는 상기 기재된 유형의 단위 투여 형태로 세분된다. 신규 조성물의 정제 또는 환제를 코팅하거나 또는 달리 배합하여 장기 작용의 이점을 제공하는 투여 형태를 제공할 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제가 내부 투여 및 외부 투여 성분을 포함할 수 있으며, 후자는 전자의 외피 형태이다. 2종의 성분은 위에서의 붕해에 저항하는 역할을 하고 내부 성분이 무손상 상태로 십이지장 내로 통과하도록 또는 방출이 지연되도록 허용하는 장용 층에 의해 분리될 수 있다. 다양한 물질이 이러한 장용 층 또는 코팅에 사용될 수 있으며, 이러한 물질은 다수의 중합체 산, 및 중합체 산과 쉘락, 세틸 알콜 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 물질의 혼합물을 포함한다.
적합한 표면-활성제는, 특히 비-이온성 작용제, 예컨대 폴리옥시에틸렌소르비탄 (예를 들어, 트윈™ 20, 40, 60, 80 또는 85) 및 다른 소르비탄 (예를 들어, 스판(Span)™ 20, 40, 60, 80 또는 85)을 포함한다. 표면-활성제를 갖는 조성물은 편리하게는 0.05 내지 5%의 표면-활성제를 포함할 것이고, 0.1 내지 2.5%일 수 있다. 필요한 경우, 다른 성분, 예를 들어 만니톨 또는 다른 제약상 허용되는 비히클이 첨가될 수 있다는 것이 인지될 것이다.
적합한 에멀젼은 상업적으로 입수가능한 지방 에멀젼, 예컨대 인트라리피드(Intralipid)™, 리포신(Liposyn)™, 인포누트롤(Infonutrol)™, 리포푼딘(Lipofundin)™ 및 리피피산(Lipiphysan)™을 사용하여 제조될 수 있다. 활성 성분은 사전-혼합된 에멀젼 조성물 중에 용해될 수 있거나 또는 대안적으로 오일 (예를 들어, 대두 오일, 홍화 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 옥수수 오일 또는 아몬드 오일) 중에 용해될 수 있고, 인지질 (예를 들어, 난 인지질, 대두 인지질 또는 대두 레시틴) 및 물과의 혼합시 에멀젼이 형성된다. 에멀젼의 긴장성을 조정하기 위해 다른 성분, 예를 들어 글리세롤 또는 글루코스가 첨가될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 적합한 에멀젼은 전형적으로 최대 20%의 오일, 예를 들어, 5 내지 20%를 함유할 것이다. 지방 에멀젼은 0.1 내지 1.0 μm, 특히 0.1 내지 0.5 μm의 지방 액적을 포함할 수 있고, 5.5 내지 8.0 범위의 pH를 갖는다.
에멀젼 조성물은 항체를 인트라리피드™ 또는 그의 성분 (대두 오일, 난 인지질, 글리세롤 및 물)과 혼합함으로써 제조된 것일 수 있다.
흡입 또는 취입을 위한 제약 조성물은 제약상 허용되는 수성 또는 유기 용매 또는 그의 혼합물 중의 용액 및 현탁액, 및 분말을 포함한다. 액체 또는 고체 조성물은 상기 제시된 바와 같은 적합한 제약상 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조성물은 국부 또는 전신 효과를 위해 경구 또는 비강 호흡 경로에 의해 투여된다.
바람직하게는 멸균 제약상 허용되는 용매 중의 조성물은 기체 사용에 의해 연무화될 수 있다. 연무화된 용액은 연무화 장치로부터 직접적으로 호흡될 수 있거나, 또는 연무화 장치가 페이스 마스크, 텐트 또는 간헐성 양압 호흡 기계에 부착될 수 있다. 제제를 적절한 방식으로 전달하는 장치로부터, 바람직하게는 경구로 또는 비강으로, 용액, 현탁액 또는 분말 조성물이 투여될 수 있다.
IV. ACTR 구축물을 발현하는 면역 세포 및 항-BCMA 항체의 조합 면역요법
본 개시내용의 예시적인 ACTR 구축물은 T 림프구에 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC) 능력을 부여하고, NK 세포에서 ADCC를 증진시킨다. 수용체가 BCMA-발현 세포에 결합된 항-BCMA 항체에 의해 결속된 경우에, 이는 T-세포 활성화, 지속적인 증식 및 BCMA를 발현하는 세포에 대한 특이적 세포독성을 촉발한다. 예를 들어, 이 요법은 BCMA-양성 암 세포, B 세포 또는 형질 세포에 대해 효과적일 것이다. 비제한적 세트의 예로서, BCMA-양성 암 세포는 혈액암 세포 (예를 들어, 골수종, 다발성 골수종, 백혈병, 림프종 또는 형질세포종 세포 포함)를 포함한다. 이 요법의 효과는 적어도 도 1 (BCMA-양성 (NCI-H929, U266B1, RPMI8226, MM1S, OPM2)과 BCMA-음성 (K562) 세포를 비교함); 및 도 7 (본 개시내용의 ACTR 구축물의 존재 및 부재 모두 하에 항-BCMA 항체에 의한 BCMA-양성 및 음성 세포에서의 효과를 비교함)에 제시된 바와 같이 BCMA를 발현하는 세포에 특이적이다.
Ig의 Fc 부분에 대한 CD16의 친화도 정도가 ADCC의 중요한 결정인자이며, 따라서, 항체 면역요법에 대한 임상 반응에 대해 중요한 결정인자가 된다. Ig에 대한 결합 친화도가 높고, 우수한 ADCC를 매개하는 V158 다형성을 갖는 CD16이 예로서 선택되었다. T 세포 증식 및 ADCC 유도에서 F158 수용체가 V158 수용체보다 효능이 더 낮지만, F158 수용체가 일부 임상적 환경에서 V158 수용체에 비해 이점을 가질 수 있다.
본 개시내용의 ACTR 구축물 및 방법은 항-BCMA 항체와 조합된 경우에 1종의 단일 수용체가 모든 BCMA-양성 암에 사용되도록 함으로써 T-세포 요법을 용이하게 한다. 항체-지정 세포독성은, 항체 투여의 간단한 중단에 의해 요구될 경우에는 언제나, 중단되어야 한다. 임의의 잠재적인 자가면역 반응성을 제한하기 위해 mRNA 전기천공을 사용하여 ACTR 구축물을 일시적으로 발현시킴으로써 임상적 안전성을 추가로 증진시킬 수 있다.
따라서, 한 실시양태에서, 본 개시내용은 암의 항체-기반 면역요법의 효능 증진을 필요로 하는 대상체 내로 치료 유효량의 항-BCMA 항체 및 치료 유효량의 T 림프구 또는 NK 세포를 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 T 림프구 또는 NK 세포는 본 개시내용의 ACTR 구축물을 포함하고, 대상체는 BCMA-발현 세포에 결합할 수 있고 인간 CD16에 결합할 수 있는 인간화 Fc 부분을 갖는 항-BCMA 항체로 치료받고 있는 것인, 상기 대상체에서 암의 항체-기반 면역요법의 효능을 증진시키는 방법을 제공한다.
용량 또는 양에 적용되는 본원에 사용된 용어 "치료상 효과적인"은 그를 필요로 하는 대상체에의 투여시 목적하는 활성을 일으키기에 충분한 화합물 또는 제약 조성물의 양을 지칭한다. 활성 성분의 조합물 (예를 들어, 항-BCMA 항체를 포함하는 제1 제약 조성물, 및 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR) 구축물을 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포의 집단을 포함하는 제2 제약 조성물)이 투여되는 경우에, 조합물의 유효량은 개별적으로 투여되는 경우에 효과적이었을 각각의 성분의 양을 포함할 수 있거나 또는 포함하지 않을 수 있다. 본 개시내용과 관련하여, 용어 "치료상 효과적인"은 본 개시내용의 방법에 의해 치료되는 장애의 징후를 지연시키거나, 그의 진행을 정지시키거나, 그의 적어도 1종의 증상을 경감 또는 완화시키기에 충분한 화합물 또는 제약 조성물의 양을 지칭한다.
A. 면역 요법 효능 증진
본원에 기재된 ACTR 구축물을 발현하는 숙주 세포 (예를 들어, 면역 세포)는 대상체에서 ADCC를 증진시키고/거나 항체-기반 면역요법의 효능을 증진시키는 데 유용하다. 일부 실시양태에서, 대상체는 포유동물, 예컨대, 인간, 원숭이, 마우스, 토끼, 또는 가축 포유동물이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 암 환자이다. 일부 실시양태에서, 대상체는 본원에 기재된 치료 항체 중 임의의 것으로 치료받은 적이 있거나 또는 치료받고 있는 대상체이다.
본원에 기재된 방법을 실시하기 위해, 유효량의 본원에 기재된 ACTR 구축물 중 임의의 것을 발현하는 면역 세포 (NK 세포 및/또는 T 림프구) 및 유효량의 항-BCMA 항체, 또는 그의 조성물은 치료를 필요로 하는 대상체에게 적합한 경로, 예컨대 정맥내 투여를 통해 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 유효량은 투여 시에 대상체에게 치료 효과를 부여하는 각각의 작용제 (예를 들어, ACTR 구축물을 발현하는 NK 세포 및/또는 T 림프구, 항-BCMA 항체, 또는 그의 조성물)의 양을 지칭한다. 본원에 기재된 세포 또는 조성물의 양이 치료 효과를 달성하였는지 결정하는 것은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 관련 기술분야의 통상의 기술자가 인식할 바와 같이, 유효량은 치료될 특정 상태, 상태의 중증도, 연령, 신체 상태, 크기, 성별 및 체중을 포함한 개별적 환자 파라미터, 치료 지속기간, (존재하는 경우) 공동 요법의 성질, 특정 투여 경로, 및 건강 진료의의 지식 및 전문기술 내에 속하는 기타 인자에 따라 달라진다. 일부 실시양태에서, 유효량은 대상체에서 임의의 질환 또는 장애를 완화시키거나, 경감시키거나, 호전시키거나, 개선시키거나, 증상을 감소시키거나, 또는 그의 진행을 지연시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 인간 암 환자이다. 다른 실시양태에서, 치료를 필요로 하는 대상체는 B 세포 매개 장애 또는 형질 세포 매개 장애를 갖는 인간이다.
본 개시내용의 방법은 임의의 BCMA-양성 암의 치료에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 방법에 의해 치료될 수 있는 암의 구체적 비제한적 예는, 예를 들어 혈액암 예컨대 골수종 (예를 들어, 다발성 골수종 또는 형질세포종), 무증상 다발성 골수종 (SMM), 및 의미 불명의 모노클로날 감마글로불린병증 (MGUS)), 백혈병, 및 림프종 (예를 들어, 비-호지킨 림프종 (NHL, 이는 발렌스트롬 마크로글로불린혈증 (WM) 및 버킷 림프종을 포함함) 또는 호지킨 림프종)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 암은 재발성 다발성 골수종 또는 불응성 다발성 골수종일 수 있다. 다른 BCMA-양성 암은 골수이형성 증후군 (MDS) 또는 골수증식성 증후군 (MPS)을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 방법은 임의의 B 세포 매개 장애 또는 형질 세포 매개 장애의 치료에 사용될 수 있다. 본원에 사용된 "B 세포"는 그의 세포 막 상에 B 세포 수용체를 발현하는 림프구 하위유형의 백혈구 유형을 지칭한다. 예시적인 B 세포는 형질 세포, 기억 B 세포, 여포성 B 세포, 변연부 B 세포, B-1 세포 및 조절 B 세포를 포함한다. B 세포 매개 장애 (예를 들어, 형질 세포 매개 장애)는 예를 들어 류마티스 관절염, 전신 루푸스 E (SLE), 제I형 당뇨병, 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 혈소판감소성 자반증, 다발성 경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 원발성 담즙성 간경변증, 다발혈관염을 동반한 육아종증 (GPA; 이전에 베게너 육아종증 또는 WG로 알려짐), 결핵, 및 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 면역 세포는 ADCC 활성을 적어도 20%만큼 및/또는 적어도 2배만큼 증진시키는 데, 예를 들어, ADCC를 50%, 80%, 100%, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배, 또는 그 초과만큼 증진시키는 데 효과적인 양으로 대상체에게 투여된다.
면역 세포는 BCMA-발현 세포를 표적화하기 위해 항-BCMA 항체와 공-투여된다. 항-BCMA 항체-기반 면역요법은 면역요법이 대상체에서 유용한 것으로 간주되는 임의의 질환 또는 장애의 증상을 치료, 완화, 또는 감소시키는 데 사용될 수 있다.
항체-기반 면역요법의 효능은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있고, 이는 숙련된 의료 전문가에게 명백할 것이다. 예를 들어, 항체-기반 면역요법의 효능은 대상체의 생존 또는 대상체 또는 그의 조직 또는 샘플 중의 종양 또는 암 부담에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 면역 세포는 ACTR 구축물을 발현하는 면역 세포 및/또는 항-BCMA 항체의 부재 하의 효능과 비교하여 항체-기반 면역요법의 효능을 적어도 20%만큼 및/또는 적어도 2배 만큼 증진시키는 데, 예를 들어, 항체-기반 면역요법의 효능을 50%, 80%, 100%, 2배, 5배, 10배, 20배, 50배, 100배 또는 그 초과만큼 증진시키는 데 효과적인 양으로 치료를 필요로 하는 대상체에게 투여된다.
본원에 기재된 방법 중 임의의 것에서, 면역 세포 (예를 들어, NK 및/또는 T 세포)는 대상체에 대해 자가일 수 있고, 즉, 면역 세포는 치료를 필요로 하는 대상체로부터 수득되고, ACTR 구축물의 발현을 위해 유전자 조작되고, 이어서 동일한 대상체에게 투여될 수 있다. 하나의 구체적 실시양태에서, 대상체 내로의 재도입 전에, 자가 면역 세포 (예컨대, T 림프구 또는 NK 세포)는 생체외에서 활성화되고/거나, 확장된다. 자가 세포를 대상체에게 투여하면, 비-자가 세포를 투여한 경우와 비교하여 숙주 세포의 거부가 감소될 수 있다.
대안적으로, 숙주 세포는 동종 세포이고, 즉, 세포는 제1 대상체로부터 수득되고, ACTR 구축물의 발현을 위해 유전자 조작되고, 제1 대상체와는 상이하지만 동일한 종인 제2 대상체에게 투여된다. 예를 들어, 동종 면역 세포는 인간 공여자로부터 유래될 수 있고, 공여자와 상이한 인간 수용자에게 투여될 수 있다. 구체적 실시양태에서, T 림프구는, 내인성 T 세포 수용체의 발현이 억제 또는 제거되는 동종 T 림프구이다. 하나의 구체적 실시양태에서, 대상체 내로의 도입 전에, 동종 면역 세포 (예를 들어, T 림프구 또는 NK 세포)는 생체외에서 활성화되고/거나, 확장된다. T 림프구 또는 NK 세포는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, 항-CD3/CD28, IL-2, 및/또는 피토헤모아글루티닌의 존재 하에 활성화될 수 있다. 특정 실시양태에서, 생체외 활성화 및/또는 확장은 면역조정제 (예를 들어, 레날리도미드)의 존재 하에 수행될 수 있다.
NK 세포는 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해, 예를 들어, CD137 리간드 단백질, CD137 항체, IL-15 단백질, IL-15 수용체 항체, IL-2 단백질, IL-12 단백질, IL-21 단백질, 및 K562 세포주로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 작용제의 존재 하에 활성화될 수 있다. 예를 들어, NK 세포를 확장시키는 데 유용한 방법에 관한 설명에 대해 미국 특허 번호 7,435,596 및 8,026,097을 참조한다. 예를 들어, 본 개시내용의 방법에서 사용되는 NK 세포는 주요 조직적합성 복합체 I 및/또는 II 분자가 결여되거나, 또는 그를 불충분하게 발현하고, 막 결합 IL-15 및 4-1BB 리간드 (CDI37L)를 발현하도록 유전자 변형된 세포에의 노출에 의해 우선적으로 확장될 수 있다. 이러한 세포주는 K562 [ATCC, CCL 243; Lozzio et al., Blood 45(3): 321-334 (1975); Klein et al., Int. J. Cancer 18: 421-431 (1976)], 및 빌름스 종양 세포주 HFWT (Fehniger et al., Int Rev Immunol 20(3-4):503-534 (2001); Harada H, et al., Exp Hematol 32(7):614-621 (2004)), 자궁 내막 종양 세포주 HHUA, 흑색종 세포주 HMV-II, 간모세포종 세포주 HuH-6, 폐 소 세포 암종 세포주 Lu-130 및 Lu-134-A, 신경모세포종 세포주 NB 19 및 N1369, 고환 NEC 14로부터의 배아 암종 세포주, 자궁경부 암종 세포주 TCO-2, 및 골수-전이된 신경모세포종 세포주 TNB 1 [Harada, et al., Jpn. J. Cancer Res 93: 313-319 (2002)]을 포함하나 이에 반드시 제한되지 않는다. 바람직하게는, 사용되는 세포주, 예컨대, K562 및 HFWT 세포주는 MHC I 및 II 분자, 둘 다가 결여되거나, 또는 그를 불충분하게 발현한다. 세포주 대신 고형 지지체가 사용될 수 있다. 이러한 지지체는 바람직하게는 그의 표면 상에 NK 세포에 결합하고 1차 활성화 사건 및/또는 증식성 반응을 유도할 수 있거나 또는 이러한 효과를 갖는 분자에 결합하여 스캐폴드로서 작용할 수 있는 적어도 하나의 분자에서 부착되어 있어야 한다. 지지체는 그의 표면에 CD137 리간드 단백질, CD137 항체, IL-15 단백질 또는 IL-15 수용체 항체를 부착시킬 수 있다. 바람직하게는, 지지체는 그의 표면에 결합된 IL-15 수용체 항체 및 CD137 항체를 가질 것이다.
상기 방법의 한 실시양태에서, T 림프구, NK 세포, 또는 T 림프구 및 NK 세포를 대상체에게 도입 (또는 재-도입)한 후, 대상체에게 치료 유효량의 IL-2를 투여한다.
본원에 개시된 ACTR 구축물 중 임의의 것을 발현하는 면역 세포 (예를 들어, T 림프구 및/또는 NK 세포)는 Fc-함유 항-BCMA 항체로 치료받은 적이 있거나 또는 치료받고 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 면역 세포는 인간 대상체에게 항-BCMA 항체와 동시에 투여될 수 있다. 대안적으로, 면역 세포는 인간 대상체에게 항-BCMA 항체-기반 면역요법의 과정 동안 투여될 수 있다. 일부 예에서, 면역 세포 및 항-BCMA 항체는 인간 대상체에게 적어도 4시간 이격되어, 예를 들어, 적어도 12시간 이격되어, 적어도 1일 이격되어, 적어도 3일 이격되어, 적어도 1주 이격되어, 적어도 2주 이격되어 또는 적어도 1개월 이격되어 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간 대상체는 성인 (즉, ≥18세)이다. 인간 대상체는 측정가능한 질환과 함께 조직학적으로- 또는 세포학적으로-확인된 재발성 또는 불응성 다발성 골수종 (MM)을 가질 수 있다. 일부 경우에, 인간 대상체는 둘 다에 이중-불응성이 아닌 한, 프로테아솜 억제제 (예를 들어, 보르테조밉, 카르필조밉, 또는 익사조밉) 및 면역조정제 (예를 들어, 레날리도미드 또는 포말리도미드)로의 치료를 포함하여 적어도 3 선행 차수의 사전 요법; 및 HSCT-적격으로 고려되는 대상체의 경우 조혈 줄기 세포 이식 (HSCT)을 받을 수 있다. 특정 실시양태에서, IgG MM을 갖는 대상체를 위한 정량적 혈청 IgG 수준은 임상시험 정상 상한치 (ULN)를 초과하지 않을 수 있다. 일부 예에서, 인간 대상체는 0 (즉, 인간 대상체가 완전히 활동적이고, 제한 없이 모든 질환전 성능을 수행할 수 있음) 또는 1 (즉, 인간 대상체가 격렬한 신체 활동에서 제한되지만, 보행가능하고 가볍거나 정적인 성질의 작업, 예를 들어, 가벼운 집안일 또는 사무 업무를 수행할 수 있음)의 ECOG (동부 협동 종양학 그룹) 성능 상태를 가질 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 인간 대상체는 적어도 6개월의 기대 수명을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 인간 대상체는 1000개/μL 초과의 절대 호중구 (ANC) 계수, 50,000개/μL 초과의 혈소판 계수, 30 mL/분/1.73m2 초과의 추정 사구체 여과율 (GFR), 또는 그의 조합을 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 인간 대상체는 (i) 알려져 있는 활성 중추 신경계 (CNS) 침범 (예를 들어, 다발성 골수종에 의함)을 갖지 않을 수 있거나; (ii) 전신 류마티스성 또는 자가면역 질환 또는 급성 또는 만성 감염을 갖지 않을 수 있거나; (iii) 비제어된 혈전색전성 사건 또는 최근의 중증 출혈을 갖지 않을 수 있거나; (iv) 현재 5 mg/일 초과의 프레드니손 (또는 생리학적 대체 수준을 초과하는 등가의 글루코코르티코이드)을 사용하지 않을 수 있거나; (v) 하기 선행 치료: 6개월 내 T 세포-지정 항체 요법 (예를 들어, 알렘투주맙 또는 항흉선세포 글로불린); 2주 내 세포독성 화학요법, 생물학적 요법 또는 방사선요법을 포함한 임의의 선행 골수종-지정 요법; 4주 내 Fc-도메인을 함유하는 임의의 모노클로날 항체 또는 다른 단백질 치료제; 요법에 대해 진전이 기록되지 않는 한 3 반감기 내 실험 작용제; 임의의 시간에 선행 BCMA-지정 조사 작용제; 임의의 시간에, 유전자 비변형된 자가 세포의 전달 (예를 들어, 조혈 줄기 세포 이식)을 제외한 선행 세포 또는 유전자 요법; 및/또는 임의의 시간에 선행 동종 HSCT 중 임의의 것을 투여받지 않았을 수 있거나; (vi) 임신 또는 모유수유 중이 아닐 수 있거나; 또는 (i)-(vi) 중 어느 하나의 조합일 수 있다.
본 개시내용에 따라, 환자는 체중 1 kg당 약 105 내지 1010개 또는 그 초과의 세포 (세포/kg)의 범위로, 본 개시내용의 ACTR 구축물을 포함하는 면역 세포 예컨대 T 림프구 또는 NK 세포를 치료 유효 용량으로 주입함으로써 치료될 수 있다. 주입은 목적하는 반응을 달성할 때까지 환자가 견딜 수 있을 만큼 자주 및 다수회에 걸쳐 반복될 수 있다. 적절한 주입 용량 및 스케줄은 환자마다 달라지겠지만, 이는 특정한 환자에 대해 치료 의사에 의해 결정될 수 있다. 전형적으로, 대략 106개의 세포/Kg인 초기 용량으로 주입되고, 108개 이상의 세포/Kg으로 단계적으로 증량될 것이다. 주입된 세포를 확장시키기 위해 IL-2가 공-투여될 수 있다. IL-2의 양은 체표면적 제곱 미터당 약 1-5 x 106 국제 단위일 수 있다.
일부 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 약 100-500 mg, 500-1000 mg, 1000-1500 mg 또는 1500-2000 mg 중 하나 이상의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 약 500 mg, 약 600 mg, 약 700 mg, 약 800 mg 또는 약 900 mg 중 하나 이상의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 약 1000 mg, 약 1100 mg, 약 1200 mg, 약 1300 mg, 약 1400 mg, 약 1500 mg, 약 1600 mg, 약 1700 mg 또는 약 1800 mg 중 하나 이상의 용량으로 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 약 1600 mg 중 하나 이상의 용량으로 대상체에게 투여된다.
본원에 기재된 방법에서 사용된 특정한 투여 요법, 즉, 용량, 시기 및 반복은 특정한 대상체 및 이러한 대상체의 의료 병력에 따라 달라질 것이다. 사용된 항-BCMA 항체의 적절한 투여량은 치료될 암의 유형, 질환의 중증도 및 과정, 이전 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당 의사의 재량에 따라 달라질 것이다. 항체는 1회 또는 일련의 치료로 환자에게 투여될 수 있다. 본 개시내용의 요법의 진행은 통상적인 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 요법의 진행은 전체 반응률 (예를 들어, 다발성 골수종에 대한 국제 골수종 연구 그룹 (IMEG) 반응 기준 포함), 반응 지속기간, 무진행 생존의 기간, 또는 전체 생존에 의해 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 요법의 지속은 유동 세포측정법 및/또는 정량적 폴리머라제 연쇄 반응 (qPCR)에 의해 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 염증 마커, 시토카인, 및/또는 케모카인은 본 개시내용의 요법의 투여 후에 측정될 수 있다. 특정 실시양태에서, 항-BCMA 항체의 혈장 농도는 확인될 수 있다.
항-BCMA 항체의 투여는 전신 투여 뿐만 아니라 질환 부위 (예를 들어, 종양)에 직접적으로 투여하는 것을 포함한, 임의의 적합한 경로에 의해 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 항-BCMA 항체 (예를 들어, 본원에 개시된 임의의 항-BCMA 항체)를 대상체에게 1회 용량으로 투여하는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 방법은 항-BCMA 항체를 대상체에게 다수회 용량 (예를 들어, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8회 용량)으로 투여하는 것을 수반한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 대상체에게 다수회 용량으로 투여되며, 항-BCMA 항체의 제1 용량은 ACTR을 발현하는 면역 세포의 투여 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 전에 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA 항체의 제1 용량은 ACTR을 발현하는 면역 세포의 투여 약 24-48시간 전에 대상체에게 투여된다.
일부 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 ACTR을 발현하는 면역 세포의 투여 전에 및 이어서 후속적으로 약 2주마다 대상체에게 투여된다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA 항체의 처음 2회 용량은 약 1주 (예를 들어, 약 6, 7, 8, 또는 9일) 이격되어 투여된다. 특정 실시양태에서, 제3 및 그 이후의 용량은 약 2주마다 투여된다.
본원에 기재된 임의의 실시양태에서, 항-BCMA 항체의 투여 시기는 대략적이고, 지시된 날짜의 3일 전 및 3일 후를 포함한다 (예를 들어, 3주마다의 투여는 제18일, 제19일, 제20일, 제21일, 제22일, 제23일 또는 제24일의 투여를 포괄함).
본원에 기재된 방법의 효능은 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 평가될 수 있고, 숙련된 의료 전문가에게 명백할 것이다. 예를 들어, 항체-기반 면역요법의 효능은 대상체의 생존 또는 대상체 또는 그의 조직 또는 샘플에서의 암 부담에 의해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항체-기반 면역요법은 대상체에서의 요법 (예를 들어, 항-BCMA 항체 및 ACTR 구축물을 발현하는 면역 세포의 투여)의 안전성 또는 독성에 기초하여, 예를 들어 대상체의 전반적 건강 및/또는 유해 사건 또는 심각한 유해 사건의 존재에 의해 평가된다.
B. 조합 치료
본 개시내용에 기재된 조성물 및 방법은 다른 유형의 암 요법, 예컨대, 화학요법, 수술, 방사선 조사, 유전자 요법 등과 함께 이용될 수 있다. 이러한 요법은 본 개시내용에 따른 면역요법과 동시에 또는 순차적으로 (임의의 순서로) 투여될 수 있다.
추가의 치료제와 함께 공-투여되는 경우에, 각 작용제에 대해 적합한 치료 유효 투여량은 상가 작용 또는 상승작용으로 인해 감량될 수 있다.
본 개시내용의 치료는 다른 면역조정 치료, 예컨대, 예를 들어, 치료 백신 (GVAX, DC-기반 백신 등을 포함하나 이에 제한되지는 않음), 체크포인트 억제제 (CTLA4, PD1, LAG3, TIM3 등을 차단하는 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음) 또는 활성화제 (41BB, OX40 등을 증진시키는 작용제를 포함하나 이에 제한되지는 않음)와 조합될 수 있다. 본 개시내용의 치료는 또한 1종 이상의 추가의 작용제, 예컨대 비제한적으로: 탈리도미드 (탈로미드(Thalomid)®), 탈리도미드의 유도체 또는 유사체 예컨대 레날리도미드 (레블리미드(Revlimid)®) 또는 포말리도미드 (포말리스트(Pomalyst)®/임노비드(Imnovid)®), 보르테조밉 (벨케이드(Velcade)®), HDAC 억제제 예컨대 파노비노스타트 (페리닥(Farydak)®), 익사조밉 (닌라로(Ninlaro)®), 다라투무맙 (다르잘렉스(Darzalex)®), 엘로투주맙 (엠플리시티(Empliciti)™), 독소루비신 HCl (독실(Doxil)®), 카르필조밉 (키프롤리스(Kyprolis)®), 또는 스테로이드 또는 코르티코스테로이드 예컨대 덱사메타손 및 프레드니손과 조합될 수 있다.
본 개시내용의 면역요법과 조합하는 데 유용한 다른 치료제의 비제한적 예는 (i) 항혈관신생제 (예를 들어, TNP-470, 혈소판 인자 4, 트롬보스폰딘-1, 메탈로프로테아제의 조직 억제제 (TIMP1 및 TIMP2), 프로락틴 (16-Kd 단편), 안지오스타틴 (플라스미노겐의 38-Kd 단편), 엔도스타틴, bFGF 가용성 수용체, 형질전환 성장 인자 베타, 인터페론 알파, 가용성 KDR 및 FLT-1 수용체, 태반 프로리페린-관련 단백질 뿐만 아니라, 문헌 [Carmeliet and Jain (2000)]에 열거되어 있는 것; (ii) VEGF 길항제 또는 VEGF 수용체 길항제, 예컨대, 항-VEGF 항체, VEGF 변이체, 가용성 VEGF 수용체 단편, VEGF 또는 VEGFR을 차단할 수 있는 압타머, 중화 항-VEGFR 항체, VEGFR 티로신 키나제의 억제제 및 그의 임의의 조합; 및 (iii) 화학요법 화합물, 예컨대, 예를 들어, 피리미딘 유사체 (5-플루오로우라실, 플록수리딘, 카페시타빈, 겜시타빈 및 시타라빈), 퓨린 유사체, 폴레이트 길항제 및 관련 억제제 (메르캅토퓨린, 티오구아닌, 펜토스타틴 및 2-클로로데옥시아데노신 (클라드리빈)); 항증식제/항유사분열제, 예컨대, 천연 생성물, 예컨대, 빈카 알칼로이드 (빈블라스틴, 빈크리스틴, 및 비노렐빈), 미세관 파괴제, 예컨대, 탁산 (파클리탁셀, 도세탁셀), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 노코다졸, 에포틸론 및 나벨빈, 에피디포도필로톡신 (에토포시드, 테니포시드), DNA 손상제 (악티노마이신, 암사크린, 안트라시클린, 블레오마이신, 부술판, 캄포테신, 카르보플라틴, 클로람부실, 시스플라틴, 시클로포스파미드, 시톡산, 닥티노마이신, 다우노루비신, 독소루비신, 에피루비신, 헥사메틸렌다이아민옥살리플라틴, 이포스파미드, 멜팔란, 메클로레타민, 미토마이신, 미토크산트론, 니트로소우레아, 플리카마이신, 프로카르바진, 탁솔, 탁소테레, 테니포시드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 에토포시드 (VP16)); 항생제, 예컨대, 닥티노마이신 (악티노마이신 D), 다우노루비신, 독소루비신 (아드리아마이신),이다루비신, 안트라시클린, 미토크산트론, 블레오마이신, 플리카마이신 (미트라마이신) 및 미토마이신; 효소 (L-아스파라긴을 전신 대사시키고, 그 자신의 아스파라긴을 합성하는 능력이 없는 세포를 제거하는 L-아스파라기나제); 항혈소판제; 항증식성/항유사분열 알킬화제, 예컨대, 질소 머스타드 (메클로레타민, 시클로포스파미드 및 유사체, 멜팔란, 클로람부실), 에틸렌이민 및 메틸멜라민 (헥사메틸멜라민 및 티오테파), 알킬 술포네이트-부술판, 니트로소우레아 (카르무스틴 (BCNU) 및 유사체, 스트렙토조신), 트라젠-다카르바지닌 (DTIC); 항증식성/항유사분열 항대사물, 예컨대, 폴산 유사체 (메토트렉세이트); 백금 배위 착물 (시스플라틴, 카르보플라틴), 프로카르바진, 히드록시우레아, 미토탄, 아미노글루테티미드; 호르몬, 호르몬 유사체 (에스트로겐, 타목시펜, 고세렐린, 비칼루타미드, 닐루타미드) 및 아로마타제 억제제 (레트로졸, 아나스트로졸); 항응고제 (헤파린, 합성 헤파린 염, 및 트롬빈의 다른 억제제); 섬유소용해물질 (예컨대, 조직 플라스미노겐 활성제, 스트렙토키나제 및 유로키나제), 아스피린, 디피리다몰, 티클로피딘, 클로피도그렐, 압시시맙; 항이동제; 항분비제 (브레벨딘); 면역억제제 (시클로스포린, 타크롤리무스 (FK-506), 시로리무스 (라파마이신), 아자티오프린, 미코페놀레이트 모페틸); 항혈관신생 화합물 (예를 들어, TNP-470, 게니스테인, 베바시주맙) 및 성장 인자 억제제 (예를 들어, 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 억제제); 안지오텐신 수용체 차단제; 산화질소 공여자; 안티센스 올리고뉴클레오티드; 항체 (트라스투주맙); 세포 주기 억제제 및 분화 유도제 (트레티노인); mTOR 억제제, 토포이소머라제 억제제 (독소루비신 (아드리아마이신), 암사크린, 캄포테신, 다우노루비신, 닥티노마이신, 에니포시드, 에피루비신, 에토포시드, 이다루비신, 미톡산트론, 토포테칸, 이리노테칸), 코르티코스테로이드제 (코르티손, 덱사메타손, 히드로코르티손, 메틸프레드니솔론, 프레드니손, 및 프레드니솔론); 성장 인자 신호 전달 키나제 억제제; 미토콘드리아 기능이상 유도제 및 카스파제 활성화제; 및 크로마틴 파괴제를 포함한다.
추가의 유용한 작용제에 관한 예에 대해서는 또한 문헌 [Physician's Desk Reference, 59.sup.th edition, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.; Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.; Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill, NY; Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J]을 참조한다.
V. 치료 용도를 위한 키트
본 개시내용은 또한 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 증진시키고 항체-기반 면역요법을 증진시키는 데 있어서 항-BCMA 항체, 및 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR) 구축물을 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포의 집단의 사용을 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 항-BCMA 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제1 제약 조성물, 및 본원에 기재된 것과 같은 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR) 구축물을 발현하는 T 림프구 및/또는 NK 세포의 집단을 포함하는 제2 제약 조성물을 포함하는 1개 이상의 용기를 포함할 수 있다. T 림프구 및/또는 NK 세포의 집단은 공동-자극 도메인 또는 공동-자극 인자의 리간드를 포함하는 외인성 폴리펩티드를 추가로 발현할 수 있다.
일부 실시양태에서, 키트는 추가적으로 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 사용하기 위한 지침서를 포함할 수 있다. 포함된 지침서는 대상체에서 의도하는 활성, 예를 들어, ADCC 활성 증진 및/또는 항체-기반 면역요법의 효능 증진을 달성하기 위해 제1 및 제2 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것에 관한 설명을 포함할 수 있다. 키트는 대상체가 치료를 필요로 하는지 여부를 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 대상체를 선택하는 것에 관한 설명을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 지침서는 치료를 필요로 하는 대상체에게 제1 및 제2 제약 조성물을 투여하는 것에 관한 설명을 포함한다.
본원에 기재된 제1 및 제2 제약 조성물의 용도에 관한 지침서는 일반적으로 의도하는 치료를 위한 투여량, 투여 스케줄, 및 투여 경로에 관한 정보를 포함한다. 용기는 단위 용량, 벌크 패키지 (예를 들어, 다중-용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 개시내용의 키트에서 제공되는 지침서는 전형적으로 라벨 또는 패키지 삽입물 상의 서면 지침서이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 제약 조성물이 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 데, 발병을 지연시키는 데, 및/또는 완화시키는 데 사용된다는 것을 나타낸다.
본원에 제공된 키트는 적합한 포장 내에 있다. 적합한 포장은 바이알, 보틀, 자, 가요성 포장 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비강 투여 장치, 또는 주입 장치와 조합하여 사용하기 위한 패키지가 또한 고려된다. 키트는 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있음). 용기는 또한 멸균 접근 포트를 가질 수 있다. 제1 제약 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 본원에 기재된 바와 같은 항-BCMA 항체이다. 제2 제약 조성물 중 적어도 1종의 활성제는 본원에 기재된 바와 같은 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR) 구축물을 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포의 집단이다.
키트는 임의로 추가의 성분 예컨대 완충제 및 해석 정보를 제공할 수 있다. 통상적으로, 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 그와 연합된 라벨 또는 패키지 삽입물(들)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본 개시내용은 상기 기재된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
일반적 기술
달리 나타내지 않는 한, 본 개시내용의 실시는, 관련 기술분야의 기술 내에 있는 분자생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 문헌 예컨대 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985≫; Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984≫; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986≫; Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986≫; 및 B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)]에 충분히 설명되어 있다.
추가의 상세설명 없이, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 상기 설명에 기초하여 본 개시내용을 최대한 이용할 수 있는 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 구체적 실시양태는 단지 예시적인 것이고, 어떠한 방식으로든 나머지 개시내용을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본원에 인용된 모든 공개는 본원에 언급된 목적 또는 대상을 위해 참조로 포함된다.
실시예
실시예 1: 다발성 골수종 세포주 및 환자 샘플의 표면 상에서의 BCMA 발현
5종의 상이한 다발성 골수종 세포주의 표면 상에서의 BCMA의 발현을 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 도 1, 파트 A에서, 다발성 골수종 (MM) 세포주를 BSA (염색 완충제)를 함유하는 포스페이트 완충 염수 (PBS)로 2회 세척한 후, 10 μg/mL의 SG16.17과 함께 30분 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 염색 완충제 중에서 2회 세척하고, PE-접합된 염소 항-인간 IgG (Fab')2 2차 항체와 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 염색 완충제 중에서 2회 세척한 후, 유동 세포측정법을 통해 PE 검출을 수행하였다. 각 세포주에 대한 PE 신호의 기하 평균 형광 강도 (gMFI)를 그래프로 나타낸다. 도 1, 파트 B에서, BCMA의 표면 발현 염색을 유동 세포측정법을 통해 MM 환자-유래 골수 단핵 세포 (BMMC)와 함께 KMS-20, NCI-H929 및 U266B1 세포에 대해 재실행하였다. 본 실험에서, MM 형질 세포 집단 내의 BCMA의 기하 평균 형광 강도 (gMFI)를 3종의 다발성 골수종 세포주 및 2종의 환자 BMMC 샘플 사이에서 비교하였다. 환자 유래 BMMC (MM#1 및 MM#2)를 해동시키고, 염색 완충제 중에서 2회 세척한 후, 라이브/데드 이플루오르-780(Live/Dead eFluor-780) 염료로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 살아있는 세포/사멸 세포 염색 후, 세포를 2회 세척하고, AF488-접합된 항-인간 CD38 항체, 항-인간 CD138 V450, 항-인간 CD45 브릴리언트 바이올렛 605, 항-인간 IgG 브릴리언트 바이올렛 711, 항-CD19-PE, 항-CD56 PerCP-Cy5.5, 항-CD27-BV510, 및 AF647 접합된 SG16.17 항-BCMA 항체로 이루어진 항체 칵테일 100 μL와 함께 인큐베이션하였다. 염색 후에, 세포를 염색 완충제로 다시 2회 세척하고, 염색을 유동 세포측정법을 통해 검출하였다. 다발성 골수종 세포주 및 MM 환자 유래 BMMC에 대한 유동 세포측정법 게이팅을 이중선 배제 및 사멸 세포 배제 후에 수행하였다.
실시예 2: SG16.17 및 비-푸코실화 (SEA) SG16.17 항체에 대한 ACTR T-세포의 결합
ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 구축물을 코딩하는 감마-레트로바이러스를 생성하였다. 이 바이러스를 사용하여 1차 인간 T-세포를 감염시켜, 감염된 세포의 표면 상에서 상기 ACTR 변이체를 발현하는 세포를 생성하였다.
이들 ACTR T 세포에 결합하는 항체의 능력을 유동 세포측정법을 통해 평가하였다. ACTR-형질도입된 T 세포를 엑스 비보-15(X VIVO-15) 배지에서 다양한 농도의 키메라 (도 2, 파트 A) 및 인간화 (도 2, 파트 B) 버전의 SG16.17 및 SG16.17SEA (비-푸코실화) 항체와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 얼음 상에 놓고, 세포 염색 완충제로 2회 세척한 후, PE-접합된 염소 항-인간 IgG (Fab')2 항체 및 항-인간 CD16-APC로 이루어진 항체 칵테일로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 염색 완충제 중에서 2회 세척한 후, 유동 세포측정법을 통해 검출을 수행하였다. CD16+ ACTR T 세포 내의 PE 신호의 기하 평균 형광 강도 (gMFI)를 도 2에 제시한다. 이들 결과는 비-푸코실화 (SEA) 버전의 SG16.17 항체가 키메라 및 인간화 버전 둘 다의 경우 푸코실화 항체와 비교하여 증가된 결합 또는 겉보기 친화도를 갖는다는 것을 입증한다.
실시예 3: ACTR T-세포에 커플링된 다양한 BCMA 항체의 존재 하에서의 다발성 골수종 세포주의 세포독성
ACTR T-세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성하였다. CD16 발현에 대한 항체 염색 후의 유동 세포측정법은 T 세포의 46-56%가 ACTR을 발현한다는 것을 입증하였다. 이들 세포를 반딧불이 루시페라제를 구성적으로 발현하는 NCI-H929 및 U266B1 표적 세포를 사용하는 세포독성 검정에 사용하였다.
ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 4:1, 이펙터-대-표적 비 (120,000개 T 세포; 30,000개 표적 세포)로, 증가하는 농도의 다양한 키메라 항-BCMA 항체 (도 3, 파트 A 및 B), 인간화 항-BCMA 항체 클론 (도 5, 파트 A 및 B), 또는 WO2010104949A2에 제시된 NCI-뮤린 BCMA CAR 서열로부터 유래된 항-BCMA 항체 (도 6, 파트 A 및 B)와 함께, 10 % 태아 소 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지를 사용하여 200-μL 반응 부피로 인큐베이션하였다. 분석된 키메라 및 인간화 항체는 SG16.17 및 SG16.45 항-BCMA 항체의 푸코실화 및 비-푸코실화 ("SEA"로 라벨링됨) 버전을 포함하였다. 반응물을 37℃에서 24 또는 48시간 동안 CO2 (5 %) 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 동등 부피의 브라이트-글로(Bright-Glo) 루시페라제 검정 시약 (프로메가(Promega); 위스콘신주 매디슨)을 첨가한 후, 실온에서 10분 인큐베이션하였다. 엔비전(EnVision) 다중-표지 플레이트 판독기 (퍼킨엘머(PerkinElmer); 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 발광을 측정하였다. 살아있는 세포의 백분율은 주어진 샘플의 발광 신호를 항체 부재 하의 발광 신호로 나누고 100을 곱하여 결정하였다. 퍼센트 세포독성은 100에서 살아있는 세포의 백분율을 감산하여 결정하였다. 이어서 항체 특이적 세포독성의 백분율 (%)을 항체 농도의 함수로서 플롯팅하였다.
도 3에서, 결과는 24 및 48시간의 공동-배양 후의, 증가하는 농도의 4종의 키메라 항-BCMA 항체 중 1종의 존재 하에 ACTR T-세포와의 공동-배양 후 (A) NCI-H929 및 (B) U266B1 표적 세포 세포독성의 용량-의존성 증가를 입증하였다. 추가로, 키메라 항체 (cSG16.17SEA 및 cSG16.45SEA)의 비-푸코실화 (SEA) 버전은 푸코실화 항체와 비교할 경우 증가된 세포독성을 입증하였다. 도 5, 파트 A에서, 결과는 SG16.17의 모든 3종의 제시된 인간화 클론이 키메라 SG16.17 항체보다 더 우수하지 않다면 (클론 #9 및 #10), 유사하게 수행한다는 것을 입증하였다. 도 5, 파트 B에서, 결과는 SG16.45의 모든 3종의 인간화 클론이 NCI-H929 세포와, 키메라 SG16.45 항체와 유사하게 수행한다는 것을 입증하였다. 도 6에서, 결과는 인간화 비-푸코실화 BCMA 항체인 SG16.17SEA가 NCI-H929 (도 6, 파트 A) 및 U266B1 (도 6, B) 다발성 골수종 세포주 둘 다에 대해, WO2010104949 A2에 제시된 NCI-뮤린 BCMA 서열로부터 유래된 항-BCMA 항체와 비교하여 증가된 세포독성을 입증하였음을 입증하였다. RPMI-8226 다발성 골수종 세포에 의해 유사한 결과가 수득되었다.
실시예 4: BCMA 발현 NCI-H929 및 U266B1 표적 세포를 옵소닌화하는 다양한 BCMA 항체의 존재 하에서의 ACTR T-세포 시토카인 방출
ACTR T-세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성하였다. CD16 발현에 대한 항체 염색 후의 유동 세포측정법은 T 세포의 46-49 %가 ACTR을 발현한다는 것을 입증하였다. 이들 세포를 NCI-H929 및 U266B1 표적 세포와의 공동-배양 검정에 사용하여 시토카인 분석을 위한 상청액을 수집하였다.
ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 4:1, 이펙터-대-표적 비 (120,000개 T 세포; 30,000개 표적 세포)로, 증가하는 농도의 다양한 키메라 항체와 함께, 10 % 태아 소 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 중 200-μL 반응 부피로 인큐베이션하였다. 도 4에서, 키메라 항체는 SG16.17 및 SG16.45 항-BCMA 항체의 푸코실화 및 비-푸코실화 (SEA) 버전을 100 - 0.0005 μg/mL의 농도 범위로 포함하였다. 도 9에서, 인간화 비-푸코실화 (SEA) SG16.17 항체를 3.8 - 0.002 μg/mL의 농도 범위로 사용하였다. 24시간 후, 반응 부피의 절반 (100 μL)을 수집하고, -20℃에서 동결시켰다. 후속해서 메소 스케일 디스커버리 V-플렉스 인간 IFN-γ 키트 (K151QOD-4) 및 V-플렉스 인간 IL-2 키트 (K151QQD-4)를 사용하여 상청액을 IFNγ 및 IL2에 대해 분석하였다. 간략하게, 제조업체의 프로토콜에 따라 염증유발 보정인자 블렌드, 검출 항체 용액, 및 판독 완충제를 제조하였다. 공동-배양 상청액을 얼음 상에서 해동시키고, 10% 태아 소 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 적절하게 희석하였다. 50 μL의 희석된 샘플 또는 보정인자를 MSD 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 암실에서 2시간 동안 600 x g의 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 150 μL PBS로 3회 세척하였다. 검출 항체 용액 25 μL를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 암실에서 2시간 동안 600 x g의 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05 % 트윈-20을 함유하는 150 μL 포스페이트 완충 염수로 3회 세척하였다. 판독 완충제 (150 μL)를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 MSD 퀵플렉스 SQ 120 상에서 실행시켰다.
NCI-H929 세포를 옵소닌화하는 모든 키메라 및 인간화 항체는 증가하는 항체 농도에 의해 증가하는 ACTR T-세포 IFNγ (도 4, 파트 A; 도 9) 및 IL2 (도 4, 파트 B; 도 9) 방출을 유도하였다. NCI-H929 표적 세포를 모의 T-세포와 함께 인큐베이션한 경우, 최소 세포독성, IFNγ 및 IL2 방출이 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음). 이들 결과는 ACTR T-세포가 옵소닌화된 표적 세포에 의해 항-BCMA 항체 농도-의존성 방식으로 시토카인을 분비할 수 있다는 것을 입증한다. 항체의 비-푸코실화 (SEA) 버전 (SG16.17SEA 및 SG16.45SEA)은 그의 푸코실화 대응물과 비교하여 시토카인 방출에서 증가된 효력을 입증하였다.
실시예 5: BCMA-발현 골수종 세포주 및 증가하는 농도의 hSG16.17SEA의 존재 하에서의 Jurkat 리포터 세포주 활성화
항-BCMA 항체 옵소닌화된 표적 세포가 Jurkat 세포를 활성화하는 능력을, T 세포 활성화를 반영하는 Jurkat 세포 리포터 검정에서 분석하였다. Jurkat 세포를 활성화된 T-세포의 핵 인자 (NFAT) 컨센서스 결합 부위의 최소 CMV 프로모터 요소 및 직렬 반복부 하류의 반딧불이 루시페라제를 코딩하는 렌티바이러스로 형질도입하였다. 이러한 세포주에서, 세포 활성화의 마커인 NFAT 전사 인자의 상향조절은 전사 반응 요소에의 결합 및 루시페라제의 후속 발현을 발생시켰고, 이는 루시페린 기질의 루시페라제 절단 후 발광을 측정함으로써 모니터링되었다. 따라서, 루시페라제 발현은 세포 활성화를 반영한다. 이러한 세포주는 Jurkat-N으로 지정된다.
Jurkat-N 세포를 10% 태아 소 혈청이 보충된 RPMI-1640 배지 중에서 100-μL 반응 부피로 BCMA 양성 표적 MM 세포, 예컨대 NCI-H929, U266B1, RPMI-8226, OPM-2 및 MM1 세포와 1:1 비로 혼합하였다. 표면 BCMA-음성 백혈병 세포주인 K562를 대조군으로서 사용하였다. 반응물을 3 - 0.004 μg/mL의 인간화 hSG16.17SEA 항체의 존재 하에 5시간 동안 37℃에서 CO2 (5 %) 인큐베이터 내에서 인큐베이션하였다. 5시간 인큐베이션 후에 브라이트라이트 플러스 시약 (100 μL, 퍼킨 엘머)을 첨가하여 세포를 용해시키고 루시페린 기질을 첨가하였다. 이어서, 반응물을 암실에서 10분 동안 인큐베이션하고, 발광을 엔비전 멀티-라벨 플레이트 판독기 (퍼킨-엘머; 매사추세츠주 월섬)를 사용하여 측정하였다.
ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 레트로바이러스로 형질도입된 Jurkat-N 세포 (Jurkat-N-ACTR)로부터의 결과를 도 7, 파트 A에 제시한다. ACTR 발현이 결여된 Jurkat-N 세포로부터의 결과를 음성 대조군으로서 사용하였고, 이를 도 7, 파트 B에 제시한다.
Jurkat-N ACTR 세포의 강건한 활성화는, 증가된 발광 신호에 의해 입증된 바와 같이, hSG16.17SEA 항체 및 BCMA-발현 다발성 골수종 세포주의 존재 하에 관찰되었고; 발광의 증가는 표면 BCMA 발현이 결여된 백혈병 세포주인 K562 세포에 의해서는 관찰되지 않았다 (도 7, 파트 A). 추가로, ACTR이 결여된 Jurkat-N 세포는 hSG16.17SEA 항체 및 표적 세포의 존재 하에 발광의 증가를 입증하지 않았다 (도 7, 파트 B). 이들 결과는 표면 BCMA를 발현하는 표적 세포만이 BCMA 표적화 항체의 존재 하에 ACTR을 발현하는 Jurkat-N 세포의 활성화를 촉진한다는 것을 입증하였다. 또한, 표적화 항체의 부재 하에 (기저 신호; 점선) Jurkat-N-ACTR 세포의 활성화는 관찰되지 않았다 (도 7, 파트 A).
실시예 6: ACTR T-세포에 커플링된 인간화 비-푸코실화 (SEA) BCMA 항체의 존재 하에서의 NCI-H929 및 U266B1 다발성 골수종 세포주의 세포독성.
ACTR T-세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성하였다. CD16 발현에 대한 항체 염색 후의 유동 세포측정법은 T 세포의 46%가 ACTR을 발현한다는 것을 입증하였다. 모의 T-세포 (ACTR 변이체를 발현하지 않는 T-세포)를 ACTR T 세포와 유사한 방식으로 확장시켰다. 모의 T 세포 및 ACTR T 세포 둘 다를 반딧불이 루시페라제를 구성적으로 발현하는 NCI-H929 및 U266B1 표적 세포와의 세포독성 검정에 사용하였다.
도 8에서, ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 4:1, 이펙터-대-표적 비 (120,000개 T 세포; 30,000개 표적 세포)로, 증가하는 농도의 인간화 비-푸코실화 (SEA) 항-BCMA 항체 SG16.17과 함께, 10 % 태아 소 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 200-μL 반응 부피로 인큐베이션하였다. 표적-세포 발광을 측정하고, 퍼센트 세포독성을 실시예 3에서와 같이 결정하였다.
NCI-H929 및 U266B1 표적 세포 세포독성의 증가는, 세포를 ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포 및 증가하는 농도의 hSG16.17SEA와 함께 24 및 48시간 동안 공동-배양한 경우에 관찰되었다 (도 8). 기저 세포독성이 항체의 부재 하에 및 모의 T-세포에 의해 낮았기 때문에, 세포독성의 이러한 증가는 항체 의존성이고 ACTR T-세포 특이적이었다.
실시예 7: 인간화 비-푸코실화 (SEA) 항-BCMA 항체 및 BCMA 발현 다발성 골수종 세포주의 존재 하에서의 ACTR T-세포 증식
ACTR T-세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성하였다. CD16 발현에 대한 항체 염색 후의 유동 세포측정법은 T 세포의 33%가 ACTR을 발현한다는 것을 입증하였다. 모의 T-세포 (ACTR 변이체를 발현하지 않는 T-세포)를 ACTR T 세포와 유사한 방식으로 확장시켰다. ACTR T-세포 (도 10, 파트 A, C, 및 D) 및 모의 T-세포 (도 10, 파트 B) 둘 다를 BCMA 발현 MM 표적 세포주 NCI-H929 (도 10, 파트 A 및 B); U266B1 (도 10, 파트 C), 및 RPMI-8226 (도 10, 파트 D)과의 증식 검정에 사용하였다.
ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 1:1, 이펙터-대-표적 비 (30,000개 T 세포; 30,000개 표적 세포)로, 증가하는 농도의 인간화 비-푸코실화 (SEA) BCMA 항체와 함께, 10 % 태아 소 혈청 및 25 U/mL IL2가 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 200-μL 반응 부피로 인큐베이션하였다. 반응물을 7일 동안 37℃에서 CO2 (5 %) 인큐베이터 내에서 인큐베이션하였다. 살아있는 CD3+ T-세포의 수를 제1일 및 제7일에 결정하고, 투입한 T-세포의 수 (점선)와 비교하였다. 간략하게, 제1일 및 제7일에, 세포를 염색 완충제 중에서 2회 세척한 후, 라이브/데드 이플루오르-780 염료로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 살아있는 세포/사멸 세포 염색 중에서 인큐베이션 후, 세포를 2회 세척하고, 후속해서 AF488-접합된 항-인간 CD3 항체 및 AF647-접합된 항-인간 CD16 항체로 이루어진 항체 칵테일 100 μL와 함께 인큐베이션하였다. 염색 후에, 세포를 염색 완충제로 다시 2회 세척하고, 후속해서 염색을 유동 세포측정법을 통해 검출하였다. CD3+ T 림프구에 대한 유동 세포측정법 게이팅을 이중선 배제 및 사멸 세포 배제 후에 수행하였다.
도 10에서, 결과는 증가하는 농도의 인간화 hSG16.17SEA의 존재 하에 BCMA 양성 표적 세포와의 공동-배양 7일 후 ACTR 변이체 서열식별번호: 1의 CD3+ T 세포의 증식의 증가를 입증한다. 기저 증식이 항체의 부재 하에 및 모의 T-세포에 의해 낮았기 때문에, T-세포 증식의 증가는 항체 의존성이고 ACTR T-세포 특이적이었다. 일부 기저 증식 (항체 부재)이 U266B1 세포에 의해, 아마도 동종 자극으로 인해 관찰되었다. ACTR+ T-세포 증식은 CD3+ T 세포와 동일한 경향을 따랐다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 8: 인간화 비-푸코실화 (SEA) 항-BCMA 항체 및 BCMA-발현 다발성 골수종 세포주의 존재 하에서의 ACTR T-세포 확장
ACTR T-세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성하였다. CD16 발현에 대한 항체 염색 후의 유동 세포측정법은 T 세포의 63%가 ACTR을 발현한다는 것을 입증하였다. 모의 T-세포 (ACTR 변이체를 발현하지 않는 T-세포)를 ACTR T 세포와 유사한 방식으로 확장시켰다. ACTR T 세포 및 모의 T 세포 둘 다를 표적 세포 예컨대 BCMA 발현 NCI-H929 세포주 및 BCMA 음성 K562 세포를 사용하는 재자극 또는 T 세포 확장 검정에 사용하였다.
T-세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 1:1, 이펙터-대-표적 비 (30,000개 T 세포; 30,000개 표적 세포)로, 0.1 μg/mL의 인간화 hSG16.17SEA와 함께, 10 % 태아 소 혈청 및 25 U/mL IL2가 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 200-μL 반응 부피로 인큐베이션하였다. 반응물을 37℃에서 CO2 (5 %) 인큐베이터 내에서 인큐베이션하였다. 3 - 4일마다, 살아있는 CD3+ T 세포 카운트를 실시예 7에 기재된 것과 유사한 방식으로 라이브/데드 염색 및 항-CD3 항체에 의해 염색함으로써 유동 세포측정법에 의해 측정하였고; 세포를 또한 항-CD16 항체에 의해 염색하여 ACTR+ 세포를 측정하였다. CD3+ T 세포 카운트에 기초하여 T 세포를 3-4일마다 표적 세포로 1:2 비로 재자극하였고; 0.1 μg/mL의 인간화 hSG16.17SEA를 또한 각각의 재자극 시 첨가하였다.
ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포에 의한 결과를 도 11에 제시하였고, 이는 0.1 μg/mL 인간화 hSG16.17SEA의 존재 하에 BCMA-양성 NCI-H929 표적 세포로 재자극되었을 때 CD3+ T-세포의 28-일 확장을 입증하였지만 BCMA-음성 K562 세포에 의해서는 그렇지 않았다. T-세포 증식의 증가는 모의 T-세포에 의해서는 관찰되지 않았기 때문에 ACTR T-세포 특이적이었다. ACTR+ T-세포 증식은 CD3+ T-세포와 동일한 경향을 따랐다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 9: NSG 마우스의 다발성 골수종의 피하 NCI-H929 모델에서의 hSG16.17SEA 항체와 조합된 ACTR T-세포.
1:1 매트리겔:무혈청 배지 중의 NCI-H929 세포 현탁액 (마우스당 1 x 105개 세포)을 암컷 NSG 마우스의 옆구리 내로 접종함으로써 피하 NCI-H929 MM 이종이식편 모델을 확립하였다. 평균 종양 부피가 80 - 100 mm3에 도달하면, 마우스를 처리군으로 무작위화하였다. 각각의 처리군은 5 또는 10 마리의 마우스를 가졌고, 처리군은 다음과 같았다: 비히클 (PBS 단독), hSG16.17SEA 항체 단독, ACTR 변이체 서열식별번호: 1 T-세포 단독, 및 hSG16.17SEA 항체와 조합된 ACTR 변이체 서열식별번호: 1 T-세포. hSG16.17SEA 항체로 처리된 군에게 마우스 당 100 μg의 항체를 4주 동안 1주 1회 투여하였고 (QWx4, 도 12의 그래프 상의 점선 수직선으로 표시됨); ACTR T-세포로 처리된 군에게 2주 동안 1주 1회 마우스 당 1 x 107개 세포를 투여되었다 (QWx2, 도 12의 그래프에 회색 화살표로 표시됨).
마우스를 매일 모니터링하고, 체중 및 종양 부피 측정을 연구 기간 동안 매주 2회 행하였다. 종양 부피가 1000 mm3을 초과하였을 때 마우스를 안락사시켰다. 도 12, 파트 A에서, 평균 종양 부피를 상이한 치료 부문의 마우스에 대해 시간의 함수로서 플롯팅하였다. 데이터는 hSG16.17SEA와 조합된 ACTR T-세포가 어느 하나의 단일 작용제 단독보다 더 큰 종양 성장 억제를 유도하였음을 입증하였다. 연구에 남아있는 마우스의 백분율을 상이한 치료 부문의 마우스의 사전 규정된 종양 부피 종점에 대한 시간의 함수로서 플롯팅하였다 (도 12, 파트 B). hSG16.17SEA 항체 단독과 비교할 경우 hSG16.17SEA 항체와 조합된 ACTR T-세포에 의한 처리는 시간을 사전 규정된 종양 부피 종점까지 연장시켰다.
실시예 10: ACTR T 세포 및 항-BCMA 항체의 증가된 E:T 비에 의한 NCI-H929 및 U266B1 다발성 골수종 세포주의 세포독성.
ACTR T-세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성하였다. CD16 발현에 대한 항체 염색 후의 유동 세포측정법은 T 세포의 49%가 ACTR을 발현한다는 것을 입증하였다. 이들 세포를 반딧불이 루시페라제를 구성적으로 발현하는 NCI-H929 및 U266B1 표적 세포를 사용하는 세포독성 검정에 사용하였다.
T-세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 다양한 이펙터-대-표적 (E:T) 세포 비로 10 μg/mL 항-BCMA 항체의 존재 하에 (도 13), 10 % 태아 소 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 200-μL 반응 부피로 인큐베이션하였다. 항체는 2종의 항-BCMA 항체 (SG16.17 및 SG16.45)의 푸코실화 및 비-푸코실화 (SEA) 버전을 포함하였다. 반응물을 NCI-H929 세포의 경우 24시간 동안 (도 13, 파트 A) 또는 U266B1 세포의 경우 48시간 동안 (도 13, 파트 B) 37℃에서 CO2 (5 %) 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 표적 세포 발광을 측정하고, 퍼센트 세포독성을 실시예 3에서와 같이 결정하였다.
ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포에 의한 결과를 도 13에 제시하며, 이는 고정 농도의 4종의 항-BCMA 항체의 존재 하에 증가하는 수의 ACTR T-세포에 의한 NCI-H929 및 U266B1 표적 세포 세포독성의 증가를 입증하였다. 비-푸코실화 (SEA) 버전의 키메라 항체 (cSG16.17SEA 및 cSG16.45SEA)는 푸코실화 항체와 비교하여 증가된 효력을 입증하였다. 이소형 항체의 존재 하에서의 및 모의 T-세포에 의한 기저 세포독성은 둘 다의 표적 세포주에서 매우 낮은 것으로 관찰되었다.
실시예 11: 항-BCMA 항체 옵소닌화된 NCI-H929 및 U266B1 다발성 골수종 세포주의 존재 하에서의 ACTR T-세포의 활성화.
ACTR T-세포를 실시예 2에 기재된 바와 같이 생성하였다. CD16 발현에 대한 항체 염색 후의 유동 세포측정법은 T 세포의 46%가 ACTR을 발현한다는 것을 입증하였다.
T-세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 1:1, 이펙터-대-표적 비 (30,000개 T 세포; 30,000개 표적 세포)로, 1 μg/mL의 항-BCMA 항체와 함께, 10 % 태아 소 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 200-μL 반응 부피로 인큐베이션하였다. 반응물을 24시간 동안 37℃에서 CO2 (5 %) 인큐베이터 내에서 인큐베이션하였다. 2개의 활성화 마커, CD25 및 CD69의 기하 평균 형광 강도 (gMFI)를 유동 세포측정법을 통해 총 CD3+ CD16+ ACTR T-세포 게이트에서 결정하였다. 간략하게, 세포를 염색 완충제 중에서 2회 세척한 후, 라이브/데드 이플루오르-450 염료로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 살아있는 세포/사멸 세포 염색 중에서 인큐베이션 후, 세포를 2회 세척하고, AF488-접합된 항-인간 CD3 항체, APC-접합된 항-인간 CD16 항체, PerCP-Cy5.5-접합된 항-인간 CD25 항체, 및 BV510-접합된 항-인간 CD69 항체로 이루어진 항체 칵테일 100 μL와 함께 인큐베이션하였다. 후속해서, 세포를 2회 세척하고, 고정시키고, 투과화하고, 세포내 분자에 대해 염색한 후, 유동 세포측정법을 통해 검출하였다. CD3+ CD16+ ACTR T-세포에 대한 유동 세포측정법 게이팅을 이중선 및 사멸 세포 배제 후에 수행하였다.
ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포에 의한 결과를 도 14에 제시하고, 이는 항-BCMA 항체의 존재 하에 BCMA 양성 표적 세포, NCI-H929 및 U266B1과 함께 공동 배양할 경우 24시간 내에 ACTR T-세포 상에서의 활성화 마커 CD25 (도 14, 파트 A) 및 CD69 (도 14, 파트 B)의 수준의 유의한 증가를 입증하였다. 비-푸코실화 (SEA) 버전의 항체 (cSG16.17SEA 및 cSG16.45SEA)와 함께 인큐베이션된 ACTR T 세포는 그의 푸코실화 대응물과의 인큐베이션과 비교했을 때 CD25 및 CD69의 증진된 발현을 입증하였다. 이소형-대조군 항체는 NCI-H929 및 U266B1 표적 세포의 존재 하에 ACTR T-세포의 활성화를 최소로 유도하거나 어떠한 활성화도 유도하지 않았다.
실시예 12: BCMA-양성 및 BCMA-음성 표적 세포의 존재 하에서의 hSG16.17 SEA 커플링된 ACTR T-세포 시토카인 생산의 특이성
ACTR 또는 모의 T-세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 4:1 E:T 비로, 증가하는 농도의 항-BCMA (hSG16.17 SEA) 또는 항-HER2 (트라스투주맙) 표적화 항체의 존재 하에 인큐베이션하였다. 이들 실험을 위해, BCMA+ HER2- NCI-H929 및 BCMA- HER2+ SKBR3 표적 세포를 사용하였다. 세포 상청액을 37℃/ 5 % CO2 인큐베이터에서 24-시간 인큐베이션 후에 수집하였다. 후속해서, 메소 스케일 디스커버리 V-플렉스 인간 IFN-γ 키트 (K151QOD-4)를 사용하여 상청액을 IFNγ에 대해 분석하였다. 간략하게, 제조업체의 프로토콜에 따라 염증유발 보정인자 블렌드, 검출 항체 용액, 및 판독 완충제를 제조하였다. 공동-배양 상청액을 얼음 상에서 해동시키고, 10% 태아 소 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 적절하게 희석하였다. 50 μL의 희석된 샘플 또는 보정인자를 MSD 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 암실에서 2시간 동안 600 x g의 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 150μL PBS로 3회 세척하였다. 검출 항체 용액 25 μL를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 암실에서 2시간 동안 600 x g의 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 150 μL 포스페이트 완충 염수로 3회 세척하였다. 판독 완충제 (150 μL)를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 MSD 퀵플렉스 SQ 120 상에서 실행시켰다.
ACTR 서열식별번호: 1을 발현하는 T-세포를 증가하는 농도의 hSG16.17 SEA 항체 및 BCMA+ HER2- NCI-H929 표적 세포와 함께 인큐베이션하였을 때, IFNγ 생산에서 농도-의존성 증가가 관찰되었고 (도 15, 패널 A); ACTR 서열식별번호: 1을 발현하는 T 세포를 증가하는 농도의 HER2-표적화 트라스투주맙 항체 및 BCMA- HER2+ SKBR3 표적 세포와 함께 인큐베이션한 경우에 유사한 결과가 관찰되었다 (도 15, 패널 B). ACTR T-세포는 hSG16.17 SEA 항체 및 BCMA- HER2+ SKBR3 세포의 존재 하에 최소 IFNγ를 생산하였고 (도 15, 패널 B), 이는 관찰된 시토카인 생산이 표적 특이적이라는 것을 입증한다. ACTR T-세포는 또한 트라스투주맙 및 BCMA-양성 NCI-H929 세포의 존재 하에 최소 IFNγ를 생산하였고 (도 15, 패널 A), 이는 관찰된 이펙터 기능이 항-BCMA hSG16.17 SEA 항체에 특이적이라는 것을 입증한다. 이들 실험은 ACTR-발현 T 세포에 의한 IFNγ 생산이 매칭된 항체-표적 쌍에 의존한다는 것을 입증한다.
실시예 13: 증가하는 이펙터 대 표적 세포 비의 존재 하에서의 NCI-H929 표적 세포의 세포독성
ACTR 변이체 서열식별번호: 57 또는 서열식별번호: 58을 코딩하는 감마-레트로바이러스를 생성하였다. 이들 바이러스를 사용하여 1차 인간 T-세포를 감염시켜, 감염된 세포의 표면 상에서 이들 ACTR 변이체를 발현하는 세포를 생성하였다. 후속해서, 이들 세포를 BCMA-양성 NCI-H929 표적 세포 및 BCMA-표적화 hSG16.17 SEA 항체를 사용하는 세포독성 검정에 사용하였다.
모의 T-세포 (ACTR 변이체를 발현하지 않는 T-세포)를 ACTR T 세포와 유사한 방식으로 확장시키고, 본 실험에서 대조군으로서 사용하였다.
T-세포 (이펙터; E) 및 NCI-H929 표적 세포 (표적; T)를 다양한 이펙터-대-표적 비로 1μg/mL hSG16.17 SEA 항체의 존재 하에 인큐베이션하였다. 반응물을 44시간 동안 37℃에서 CO2 (5 %) 인큐베이터에서 인큐베이션한 다음, 후속해서 유동 세포측정 염색을 수행하였다. 간략하게, 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 고정가능한 생존율 염료로 염색하였다. 세포를 다시 PBS로 세척하고, 이어서 알렉사플루오르488-접합된 항-인간 CD3, 알렉사플루오르 647-접합된 항-인간 CD16, 및 PerCP-Cy5.5-접합된 항-인간 CD25 항체를 함유하는 100 μL의 항체 칵테일과 함께 인큐베이션하였다. 30-분 인큐베이션 후, 세포를 2회 세척하고 유동 세포측정기 상에서 데이터를 획득하였다. 살아있는 표적 세포 카운트는 생존율 염료 음성, CD3- CD16- 세포에 대해 게이팅함으로써 결정하였다. 살아있는 표적 세포의 백분율은 주어진 샘플로부터의 살아있는 표적 세포 카운트를 표적 세포 단독 웰에서의 살아있는 표적 세포 카운트로 나누어 결정하였다. 퍼센트 세포독성은 100에서 퍼센트 살아있는 세포를 감산하여 결정하였다. 퍼센트 세포독성을 E:T 비의 함수로서 플롯팅하였다 (도 16).
NCI-H929 표적 세포 및 hSG16.17 SEA 항체의 존재 하에 배양된 경우, ACTR 변이체 서열식별번호: 57 (도 16, 패널 A) 및 ACTR 변이체 서열식별번호: 58 (도 16, 패널 B)을 발현하는 ACTR T-세포에 대해 세포독성에서 T-세포 용량 의존성 증가가 관찰되었다. 항체의 부재 하에서의 ACTR T-세포 및 항체의 부재 및 존재 하에서의 모의 T-세포는 최소 세포독성을 입증하였다 (도 16, 패널 A 및 B).
실시예 14: 증가하는 이펙터 대 표적 세포 비의 존재 하에서의 ACTR T 세포 상에서의 CD25 활성화 마커의 상향조절
ACTR 변이체 서열식별번호: 57 또는 서열식별번호: 58을 코딩하는 감마-레트로바이러스를 생성하였다. 이들 바이러스를 사용하여 1차 인간 T-세포를 감염시켜, 감염된 세포의 표면 상에서 이들 ACTR 변이체를 발현하는 세포를 생성하였다. 후속해서, 이들 세포를 BCMA-양성 NCI-H929 표적 세포 및 BCMA-표적화 hSG16.17 SEA 항체를 사용하는 활성화 검정에 사용하였다. 모의 T-세포 (ACTR 변이체를 발현하지 않는 T-세포)를 ACTR T 세포와 유사한 방식으로 확장시키고, 본 실험에서 대조군으로서 사용하였다.
T-세포 (이펙터; E) 및 NCI-H929 표적 세포 (표적; T)를 다양한 이펙터-대-표적 비로 1μg/mL hSG16.17 SEA 항체의 존재 하에 인큐베이션하였다. 반응물을 44시간 동안 37℃에서 CO2 (5 %) 인큐베이터에서 인큐베이션한 다음, 후속해서 유동 세포측정 염색을 수행하였다. 간략하게, 세포를 PBS로 2회 세척한 후, 고정가능한 생존율 염료로 염색하였다. 세포를 다시 PBS로 세척하고, 이어서 알렉사플루오르488-접합된 항-인간 CD3, 알렉사플루오르 647-접합된 항-인간 CD16, 및 PerCP-Cy5.5-접합된 항-인간 CD25 항체를 함유하는 100 μL의 항체 칵테일과 함께 인큐베이션하였다. 30-분 인큐베이션 후, 세포를 2회 세척하고 유동 세포측정기 상에서 데이터를 획득하였다. CD25의 기하 평균 형광 강도를 CD3+ T-세포 게이트 내에서 계산하였고, E:T 비의 함수로서 플롯팅하였다 (도 17).
ACTR 변이체 서열식별번호: 57 (도 17, 패널 A) 및 ACTR 변이체 서열식별번호: 58 (도 17, 패널 B)을 발현하는 T-세포는 항체의 부재 하에 ACTR T 세포에 비해 CD25 발현에서 증가를 나타내었다. 유사하게, 항체의 부재 하에서의 ACTR T 세포 및 항체의 부재 및 존재 하에서의 모의 T 세포 상에서 낮은 수준의 CD25가 관찰되었다.
실시예 15: hSG16.17 SEA 커플링된 ACTR T-세포 세포독성은 BCMA-양성 표적 세포의 존재 하에 농도-의존성이고, BCMA-음성 표적 세포의 존재 하에서는 그렇지 않다.
ACTR 변이체 서열식별번호: 57 또는 서열식별번호: 58을 코딩하는 감마-레트로바이러스를 생성하였다. 이들 바이러스를 사용하여 1차 인간 T-세포를 감염시켜, 감염된 세포의 표면 상에서 이들 ACTR 변이체를 발현하는 세포를 생성하였다. 모의 T-세포 (ACTR 변이체를 발현하지 않는 T-세포)를 ACTR T 세포와 유사한 방식으로 확장시켰다. 모의 T-세포 및 ACTR 변이체 T-세포 둘 다를 반딧불이 루시페라제를 구성적으로 발현하는 NCI-H929 및 K562 표적 세포와의 세포독성 검정에 사용하였다.
도 18에서, T-세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 4:1, 이펙터-대-표적 비 (30,000개 표적 세포)로, 증가하는 농도의 인간화 비-푸코실화 항-BCMA 항체 hSG16.17SEA와 함께, 10 % 태아 소 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 200-μL 반응 부피로 인큐베이션하였다. 반응물을 48시간 동안 5 % CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 표적 세포 발광을 측정하고, 퍼센트 세포독성을 실시예 3에 기재된 바와 같이 결정하였다.
BCMA-발현 NCI-H929 세포 및 증가하는 농도의 hSG16.17SEA의 존재 하에 ACTR 변이체 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 58을 발현하는 T 세포에 의해 표적 세포 세포독성의 증가가 관찰되었다 (도 18, 패널 A). BCMA-음성 K562 세포 및 증가하는 농도의 hSG16.17SEA의 존재 하에 ACTR 변이체 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 58을 발현하는 T 세포에 의해서는 세포독성의 증가가 관찰되지 않았다 (도 18, 패널 B). 모의 T-세포의 존재 하에 최소 세포독성이 관찰되었기 때문에, 이러한 NCI-H929 세포독성은 항체 의존성이고 ACTR T-세포 특이적이었다. BCMA-발현 U266B1 세포에 의해 유사한 결과가 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음).
실시예 16: BCMA 발현 NCI-H929 표적 세포를 옵소닌화하는 hSG16.17SEA의 존재 하에서의 ACTR T-세포 시토카인 방출.
ACTR 변이체 서열식별번호: 57 또는 서열식별번호: 58을 코딩하는 감마-레트로바이러스를 생성하였다. 이들 바이러스를 사용하여 1차 인간 T-세포를 감염시켜, 감염된 세포의 표면 상에서 이들 ACTR 변이체를 발현하는 세포를 생성하였다. 모의 T-세포 (ACTR 변이체를 발현하지 않는 T-세포)를 ACTR T 세포와 유사한 방식으로 확장시켰다. 이들 이펙터 세포를 BCMA-양성, NCI-H929 및 U266B1 표적 세포와의 공동-배양 검정에 사용하여 도 19의 시토카인 분석을 위한 상청액을 수집하였다.
모의 또는 ACTR T-세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 4:1, 이펙터-대-표적 비 (120,000개 T 세포; 30,000개 표적 세포)로, 증가하는 농도의 hSG16.17SEA 항체 (0 - 3 μg/mL)와 함께, 10 % 태아 소 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 중 200-μL 반응 부피로 인큐베이션하였다. 반응물을 48시간 동안 5 % CO2 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 반응 부피의 절반 (100 μL)을 수집하고 -20℃에서 동결시켰다. 후속해서 메소 스케일 디스커버리 V-플렉스 인간 IFN-γ 키트 (K151QOD-4) 및 V-플렉스 인간 IL-2 키트 (K151QQD-4)를 사용하여 상청액을 IFNγ 및 IL2에 대해 분석하였다. 간략하게, 제조업체의 프로토콜에 따라 염증유발 보정인자 블렌드, 검출 항체 용액, 및 판독 완충제를 제조하였다. 공동-배양 상청액을 얼음 상에서 해동시키고, 10% 태아 소 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지에서 적절하게 희석하였다. 50 μL의 희석된 샘플 또는 보정인자를 MSD 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 암실에서 2시간 동안 600 x g의 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 150 μL PBS로 3회 세척하였다. 검출 항체 용액 25μL를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 밀봉하고, 암실에서 2시간 동안 600 x g의 진탕기 상에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% 트윈-20을 함유하는 150μL 포스페이트 완충 염수로 3회 세척하였다. 판독 완충제 (150 μL)를 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 MSD 퀵플렉스 SQ 120 상에서 실행시켰다.
ACTR 변이체 서열식별번호: 57 및 서열식별번호: 58을 발현하는 T 세포는 hSG16.17SEA 및 NCI-H929의 존재 하에 항체-의존성 및 항체-농도-의존성 IFNγ (도 19, 패널 A) 및 IL2 (도 19, 패널 B) 방출을 나타내었다. 모의 T 세포에 의해서는 낮거나 부재하는 시토카인 방출이 관찰되었다. 이들 결과는 ACTR T-세포가 BCMA-양성 표적 세포에 의해 ACTR-특이적, 항체-의존성 및 hSG16.17SEA 농도-의존성 방식으로 시토카인을 분비할 수 있었음을 입증하였다. 유사한 결과가 BCMA-발현 U266B1 세포의 존재 하에서 관찰되었다 (데이터는 제시되지 않음).
유사한 실험에서, IFNγ 및 IL-2 방출이 또한 추가의 ACTR 변이체에 의해 NCI-H929 및 U266B1 BCMA-양성 표적 세포주 둘 다에 의해 관찰되었다. 이들 실험으로부터 1 μg/mL hSG16.17SEA 항체에 의해 관찰된 IFNγ 및 IL-2 방출은 표 6 및 7에서 확인할 수 있다. 이들 실험은 다수의 ACTR 변이체가 BCMA-양성 표적 세포주의 존재 하에 hSG16.17SEA-의존성 시토카인 방출을 나타낸다는 것을 입증한다.
표 6. ACTR 변이체를 발현하는 T 세포로부터의 IL2 시토카인 방출
Figure pct00023
표 7. ACTR 변이체를 발현하는 T 세포로부터의 IFNγ 시토카인 방출
Figure pct00024
실시예 17: BCMA 양성 다발성 골수종 세포주의 존재 하에서의 hSG16.17 SEA-커플링된 ACTR T 세포 증식.
ACTR 변이체 서열식별번호: 57을 코딩하는 감마-레트로바이러스를 생성하였다. 이들 바이러스를 사용하여 1차 인간 T-세포를 감염시켜, 감염된 세포의 표면 상에서 이들 ACTR 변이체를 발현하는 세포를 생성하였다. 모의 T-세포 (ACTR 변이체를 발현하지 않는 T-세포)를 ACTR T 세포와 유사한 방식으로 확장시켰다. ACTR T 세포 및 모의 T 세포 둘 다를 BCMA 발현 MM 표적 세포주 예컨대 도 20의 NCI-H929와의 증식 검정에 사용하였다.
모의 T 세포 또는 ACTR T 세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 1:1, 이펙터-대-표적 비 (30,000개 표적 세포)로, 증가하는 농도의 인간화 비-푸코실화 항-BCMA 항체 (hSG16.17SEA)와 함께, 10 % 태아 소 혈청이 보충된 RPMI 1640 배지 중에서 200-μL 반응 부피로 인큐베이션하였다. 반응물을 7일 동안 37℃에서 CO2 (5 %) 인큐베이터 내에서 인큐베이션하였다. 살아있는 CD3+ T 세포의 카운트를 제7일에 결정하였다. 간략하게, 제7일에, 세포를 염색 완충제 중에서 2회 세척한 후, 라이브/데드 이플루오르-780 염료로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 살아있는 세포/사멸 세포 염색 중에서 인큐베이션 후, 세포를 2회 세척하고, 후속해서 AF488-접합된 항-인간 CD3 항체 및 AF647-접합된 항-인간 CD16 항체로 이루어진 항체 칵테일 100 μL와 함께 인큐베이션하였다. 염색 후에, 세포를 염색 완충제로 다시 2회 세척하고, 후속해서 염색을 유동 세포측정법을 통해 검출하였다. CD3+ T 림프구에 대한 유동 세포측정법 게이팅을 이중선 배제 및 사멸 세포 배제 후에 수행하였다.
도 20에서, 결과는 ACTR T 세포 변이체 서열식별번호: 57, BCMA-양성 NCI-H929 표적 세포 및 증가하는 농도의 hSG16.17SEA와의 공동-배양 7일 후 CD3+ T 세포의 증식의 증가를 입증한다. 증식이 항체의 부재 하에 및 모의 T-세포에 의해 최소였기 때문에, T 세포 증식의 이러한 증가는 항체 의존성이고 ACTR T-세포 특이적이다.
추가의 실험에서, T-세포 증식을, 다수의 상이한 ACTR 변이체를 발현하는 T-세포를 사용하여 상기 기재된 것과 유사한 조건 하에 1 μg/mL hSG16.17SEA의 존재 하에 평가하였다. 항체가 부재하는 반응에 비해 CD3+ 세포 수의 증가가 결정되었다. 이들 ACTR 변이체는 항체-의존성 증식을 나타내었다 (표 8). 이들 실험은 hSG16.17SEA와 조합된 다수의 ACTR 변이체가 BCMA-양성 표적 세포주의 존재 하에 항체-의존성 T 세포 증식을 나타낸다는 것을 입증한다.
표 8. 상이한 ACTR 변이체를 발현하는 T 세포의 항체-의존성 증식
Figure pct00025
실시예 18: BCMA+ 다발성 골수종 표적 세포, hSG16.17 SEA 항체, 및 면역조정 약물인 레날리도미드의 존재 하에서의 ACTR T 세포 증식.
모의 또는 ACTR T 세포 (이펙터; E) 및 표적 세포 (표적; T)를 1:1, 이펙터-대-표적 세포 비로 항-BCMA 항체, hSG16.17 SEA (1 μg/mL)의 존재 및 부재 하에 인큐베이션하였다. 레날리도미드 (1 μM)의 부재 또는 존재 하에 NCI-H929 및 RPMI-8226 표적 세포를 사용하여 증식 검정을 수행하였다. 총 CD3+ T 세포 카운트는 CO2 (5 %) 인큐베이터에서의 7일 인큐베이션 후 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 간략하게, 세포를 PBS 중에서 1회 세척한 후, 고정가능한 생존율 염료로 염색하였다. 생존율 염료와 인큐베이션 후, 세포를 세포 염색 완충제로 세척하고, 후속해서 AF488-접합된 항-인간 CD3 항체 및 AF647-접합된 항-인간 CD16 항체로 이루어진 100 μL의 항체 칵테일로 염색하였다. 염색 후, 세포를 염색 완충제로 2회 세척하고, 유동 세포측정법을 통해 검출하였다. CD3+ T 림프구에 대한 유동 세포측정법 게이팅을 사멸 세포 배제 후에 수행하였다. 총 CD3+ T 세포 카운트를 레날리도미드 농도의 함수로서 플롯팅하였다.
ACTR 변이체 서열식별번호: 1을 발현하는 T 세포를 BCMA+ 표적 세포 및 hSG16.17 SEA 항체의 존재 하에 배양한 경우 CD3+ T 세포 카운트의 증가가 관찰되었다. 레날리도미드는 NCI-H929 (도 21, 패널 A) 및 RPMI-8226 (도 21, 패널 B) 다발성 골수종 표적 세포의 존재 하에 hSG16.17 SEA 커플링된 ACTR T 세포의 증식을 추가로 증진시켰다. 항체의 부재 하에 및 모의 T-세포에 의해 최소 증식이 관찰되었기 때문에 이러한 T 세포 증식의 증가는 항체 의존성이고 ACTR T 세포 특이적이었다.
다른 실시양태
명세서에 개시된 모든 특색은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각각의 특색은 동일한, 동등한 또는 유사한 목적을 제공하는 대안적인 특색으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명백하게 언급되지 않는 한, 개시된 각각의 특색은 단지 일반적인 일련의 동등한 또는 유사한 특색의 예이다.
상기 설명으로부터, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용의 본질적인 특징을 용이하게 확인할 수 있고, 그의 취지 및 범주로부터 벗어나지 않으면서, 본 개시내용을 다양하게 변화 및 변형시킴으로써 다양한 용법 및 조건에 맞게 적합화할 수 있다. 따라서, 다른 실시양태도 또한 청구범위 내에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> Unum Therapeutics Inc. <120> CO-USE OF ANTI-BCMA ANTIBODY AND ANTIBODY-COUPLED T CELL RECEPTOR (ACTR) IN CANCER THERAPY AND B CELL DISORDERS <130> U1199.70006WO00 <140> PCT/US2018/000028 <141> 2018-02-16 <150> US 62/460,669 <151> 2017-02-17 <160> 118 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 1 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val 20 25 30 Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val 35 40 45 Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln 50 55 60 Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe 65 70 75 80 Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr 85 90 95 Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly 100 105 110 Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro 115 120 125 Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val 130 135 140 Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser 145 150 155 160 Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe 165 170 175 Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn 180 185 190 Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe 195 200 205 Pro Pro Gly Tyr Gln Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 210 215 220 Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 225 230 235 240 Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala 245 250 255 Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu 260 265 270 Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys 275 280 285 Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr 290 295 300 Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly 305 310 315 320 Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala 325 330 335 Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg 340 345 350 Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu 355 360 365 Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn 370 375 380 Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met 385 390 395 400 Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly 405 410 415 Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala 420 425 430 Leu Pro Pro Arg 435 <210> 2 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 2 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val 20 25 30 Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val 35 40 45 Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln 50 55 60 Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe 65 70 75 80 Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr 85 90 95 Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly 100 105 110 Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro 115 120 125 Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val 130 135 140 Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser 145 150 155 160 Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe 165 170 175 Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn 180 185 190 Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe 195 200 205 Pro Pro Gly Tyr Gln Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 210 215 220 Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 225 230 235 240 Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala 245 250 255 Cys Asp Ile Ile Ser Phe Phe Leu Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu 260 265 270 Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly 275 280 285 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 290 295 300 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 305 310 315 320 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 325 330 335 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 340 345 350 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 355 360 365 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 370 375 380 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 385 390 395 400 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 405 410 415 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 420 425 430 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 435 440 <210> 3 <211> 442 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 3 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gly Met Arg Thr Glu Asp Leu Pro Lys Ala Val 20 25 30 Val Phe Leu Glu Pro Gln Trp Tyr Arg Val Leu Glu Lys Asp Ser Val 35 40 45 Thr Leu Lys Cys Gln Gly Ala Tyr Ser Pro Glu Asp Asn Ser Thr Gln 50 55 60 Trp Phe His Asn Glu Ser Leu Ile Ser Ser Gln Ala Ser Ser Tyr Phe 65 70 75 80 Ile Asp Ala Ala Thr Val Asp Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Thr 85 90 95 Asn Leu Ser Thr Leu Ser Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Ile Gly 100 105 110 Trp Leu Leu Leu Gln Ala Pro Arg Trp Val Phe Lys Glu Glu Asp Pro 115 120 125 Ile His Leu Arg Cys His Ser Trp Lys Asn Thr Ala Leu His Lys Val 130 135 140 Thr Tyr Leu Gln Asn Gly Lys Gly Arg Lys Tyr Phe His His Asn Ser 145 150 155 160 Asp Phe Tyr Ile Pro Lys Ala Thr Leu Lys Asp Ser Gly Ser Tyr Phe 165 170 175 Cys Arg Gly Leu Val Gly Ser Lys Asn Val Ser Ser Glu Thr Val Asn 180 185 190 Ile Thr Ile Thr Gln Gly Leu Ala Val Ser Thr Ile Ser Ser Phe Phe 195 200 205 Pro Pro Gly Tyr Gln Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro 210 215 220 Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys 225 230 235 240 Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala 245 250 255 Cys Asp Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr 260 265 270 Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys 275 280 285 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 290 295 300 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 305 310 315 320 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 325 330 335 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 340 345 350 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 355 360 365 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 370 375 380 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 385 390 395 400 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 405 410 415 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 420 425 430 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 435 440 <210> 4 <211> 436 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 4 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu 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Thr Asn Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ser Pro Gly Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 100 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 100 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp His 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Val Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Asn Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ser Pro Gly Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 101 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 101 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp His 20 25 30 Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Thr Asn Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Ser Pro Gly Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 102 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 102 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Thr Thr Thr Ala Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Thr Ser Ser Val Ser Val Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln His Lys Ser Gly Ala Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Asn Thr Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 103 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 103 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Val Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 104 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 104 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Val Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 105 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 105 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Val Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 106 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 106 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Leu Ala Thr Ser Ser Val Ser Val Met 20 25 30 Tyr Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 107 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Ile or Met <400> 107 Asp Tyr Tyr Xaa His 1 5 <210> 108 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 108 Asp His Trp Met Thr 1 5 <210> 109 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Tyr, Arg, or Ile <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> Xaa is Lys, Asn, or Ser <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Asn or Ala <220> <221> misc_feature <222> (13)..(13) <223> Xaa is Gln or Glu <220> <221> misc_feature <222> (14)..(14) <223> Xaa is Lys or Asn <220> <221> misc_feature <222> (16)..(16) <223> Xaa is Gln or Lys <220> <221> misc_feature <222> (17)..(17) <223> Xaa is Thr or Gly <400> 109 Xaa Ile Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Thr Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Phe Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 110 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Ser, Ala, or Gly <220> <221> misc_feature <222> (12)..(12) <223> Xaa is Leu or Ala <400> 110 Xaa Ile Thr Asn Thr Gly Gly Ala Thr Tyr Tyr Xaa Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 111 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 111 Tyr Met Trp Glu Arg Val Thr Gly Phe Phe Asp Phe 1 5 10 <210> 112 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 112 Pro Gly Leu Tyr Phe Asp Tyr 1 5 <210> 113 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Leu or Arg <400> 113 Xaa Ala Ser Glu Asp Ile Ser Asp Asp Leu Ala 1 5 10 <210> 114 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> Xaa is Arg or Leu <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> Xaa is Ser or Thr <400> 114 Xaa Ala Xaa Ser Ser Val Ser Val Met Tyr 1 5 10 <210> 115 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> Xaa is Ser or Arg <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> Xaa is Asp or Ser <400> 115 Thr Thr Ser Xaa Leu Gln Xaa 1 5 <210> 116 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 116 Ser Thr Ser Ser Leu Ala Ser 1 5 <210> 117 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 117 Gln Gln Thr Tyr Lys Phe Pro Pro Thr 1 5 <210> 118 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic Polypeptide <400> 118 His Gln Trp Ser Ser Asp Pro Pro Thr 1 5

Claims (45)

  1. 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)의 증진을 필요로 하는 대상체에게 항-BCMA 항체의 치료 유효량 및 면역 세포의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 증진시키는 방법이며, 여기서 면역 세포는
    (a) Fc 결합 도메인;
    (b) 막횡단 도메인; 및
    (c) 면역수용체 티로신-기반 활성화 모티프 (ITAM)를 포함하는 세포질 신호전달 도메인
    을 포함하는 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR) 구축물을 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포인 방법.
  2. 제1항에 있어서, ACTR 구축물이
    (d) 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인
    을 추가로 포함하며;
    여기서 (c) 또는 (d)는 ACTR 구축물의 C-말단에 위치하고; 임의로 여기서 (c)는 ACTR 구축물의 C-말단에 위치하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, ACTR이 (e) (a)의 C-말단 및 (b)의 N-말단에 위치하는 힌지 도메인을 추가로 포함하는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, (a)의 Fc 결합 도메인이
    (i) 임의로 Fc-감마 수용체, Fc-알파 수용체, 또는 Fc-엡실론 수용체인, Fc-수용체의 세포외 리간드-결합 도메인,
    (ii) 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 결합하는 항체 단편,
    (iii) 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 결합하는 자연 발생 단백질, 또는 그의 Fc-결합 단편, 및
    (iv) 이뮤노글로불린의 Fc 부분에 결합하는 합성 폴리펩티드
    로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, Fc 결합 도메인이 (i)이고, 이는 CD16A, CD32A 또는 CD64A 수용체의 세포외 리간드-결합 도메인이며, 여기서 임의로 CD16A의 세포외 리간드-결합 도메인은 CD16A F158 또는 CD16A V158인 방법.
  6. 제4항에 있어서, Fc 결합 도메인이 (ii)이고, 이는 단일 쇄 가변 단편 (ScFv), 도메인 항체 또는 나노바디인 방법.
  7. 제4항에 있어서, Fc 결합 도메인이 (iii)이고, 이는 단백질 A 또는 단백질 G인 방법.
  8. 제4항에 있어서, Fc 결합 도메인이 (iv)이고, 이는 쿠니츠 펩티드, SMIP, 아비머, 아피바디, DARPin, 또는 안티칼린인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, (b)의 막횡단 도메인이 단일-통과 막 단백질의 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 막횡단 도메인이 CD8α, CD8β, 4-1BB, CD28, CD34, CD4, FcεRIγ, CD16A, OX40, CD3ζ, CD3ε, CD3γ, CD3δ, TCRα, CD32, CD64, VEGFR2, FAS, PD1, 및 FGFR2B로 이루어진 군으로부터 선택된 막 단백질의 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, (b)의 막횡단 도메인이 비-자연 발생 소수성 단백질 절편인 방법.
  12. 제2항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, (d)의 적어도 1개의 공동-자극 신호전달 도메인이 4-1BB, CD28, CD28LL->GG 변이체, OX40, ICOS, CD27, GITR, HVEM, TIM1, LFA1, 및 CD2로 이루어진 군으로부터 선택된 공동-자극 분자의 것인 방법.
  13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, ACTR 구축물이 단일 공동-자극 신호전달 도메인 또는 2개의 공동-자극 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
  14. 제13항에 있어서, ACTR 구축물이
    (i) CD28 및 4-1BB;
    (ii) CD28LL->GG 변이체 및 4-1BB;
    (iii) CD28 및 CD27;
    (iv) CD28 및 OX40
    으로부터의 2개의 공동-자극 도메인을 포함하는 것인 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, (c)의 세포질 신호전달 도메인이 CD3ζ 또는 FcεR1γ의 세포질 도메인인 방법.
  16. 제3항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, (e)의 힌지 도메인이 CD8α, CD28, 또는 IgG의 것인 방법.
  17. 제3항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, (e)의 힌지 도메인이 비-자연 발생 펩티드인 방법.
  18. 제17항에 있어서, (e)의 힌지 도메인이 연장된 재조합 폴리펩티드 (XTEN) 또는 (Gly4Ser)n 폴리펩티드이며, 여기서 n은 3-12의 정수인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, ACTR 구축물이 그의 N-말단에 신호 펩티드를 추가로 포함하는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 신호 펩티드가 CD8α의 것인 방법.
  21. 제3항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 힌지 도메인이 1 내지 60개의 아미노산 잔기 길이이고, 임의로 힌지 도메인이 1 내지 30개의 아미노산 잔기 길이 또는 31 내지 60개의 아미노산 잔기 길이인 방법.
  22. 제3항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, ACTR 구축물이 (i) 4-1BB 또는 CD28의 단일 공동-자극 도메인, 및 (ii) CD8 또는 CD28의 힌지 도메인, CD8 또는 CD28의 막횡단 도메인, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  23. 제22항에 있어서, ACTR 구축물이 (i) 4-1BB 공동-자극 신호전달 도메인, 및 (ii) CD8 힌지 도메인, CD8 막횡단 도메인, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  24. 제22항에 있어서, ACTR 구축물이 (i) CD28 공동-자극 신호전달 도메인, 및 (ii) CD28 힌지 도메인, CD28 막횡단 도메인, 또는 그의 조합을 포함하는 것인 방법.
  25. 제1항, 제2항 및 제4항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, ACTR 구축물에 임의의 비-CD16A 수용체로부터의 힌지 도메인이 부재하고, 임의로 ACTR 구축물에 임의의 힌지 도메인이 부재하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, ACTR 구축물이 CD28 공동-자극 신호전달 도메인 및 임의로 CD8 막횡단 도메인을 포함하는 것인 방법.
  27. 제1항에 있어서, ACTR 구축물이 서열식별번호: 1-63으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 BCMA-양성 암을 갖는 인간 환자인 방법.
  29. 제28항에 있어서, BCMA-양성 암이 혈액암이고, 이는 임의로 골수종, 백혈병 또는 림프종인 방법.
  30. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 류마티스 관절염, 전신 루푸스 E (SLE), 제I형 당뇨병, 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 혈소판감소성 자반증, 다발성 경화증, 건선, 쇼그렌 증후군, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 원발성 담즙성 간경변증, 육아종증 다발혈관염 (GPA), 결핵, 및 이식편-대-숙주 질환 (GVHD)으로 이루어진 군으로부터 임의로 선택된 B 세포 매개 장애를 갖는 인간 환자인 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, T 림프구 또는 NK 세포가 대상체로부터 단리된 자가 T 림프구 또는 자가 NK 세포인 방법.
  32. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, T 림프구 또는 NK 세포가 동종 T 림프구 또는 동종 NK 세포인 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 대상체에의 투여 전에, T 림프구 또는 NK 세포가 생체외 활성화되고/거나 확장되고, 임의로 생체외 활성화 및/또는 확장이 바람직하게는 레날리도미드인 면역조정제의 존재 하에 수행되는 것인 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, T 림프구가 내인성 T 세포 수용체의 발현이 억제되거나 제거된 T 림프구인 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, ACTR 구축물이 레트로바이러스 형질도입, 렌티바이러스 형질도입, DNA 전기천공, 및 RNA 전기천공으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의해 T 림프구 또는 NK 세포 내로 도입된 것인 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, ACTR 구축물을 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포가 바람직하게는 레날리도미드인 면역조정제와 공투여되는 것인 방법.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 항-BCMA 항체가 인간 또는 인간화 항체인 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 항-BCMA 항체가 야생형 Fc 수용체에 대해 상승된 결합 친화도를 갖는 Fc 변이체 단편을 함유하는 것인 방법.
  39. 제38항에 있어서, Fc 변이체 단편이 비-푸코실화되고/거나 Fc 단편의 힌지 및/또는 CH2 도메인에 1개 이상의 돌연변이를 함유하는 것인 방법.
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 항-BCMA 항체가 항체 hSG16.17 또는 hSG16.45와 BCMA 내의 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 항체 hSG16.17 또는 hSG16.45와 BCMA에의 결합에 대해 경쟁하는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 항-BCMA 항체가 항체 hSG16.17 또는 hSG16.45와 동일한 중쇄 상보성 결정 영역 (CDR) 및 경쇄 CDR을 포함하는 것인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 항-BCMA 항체가 항체 hSG16.17 또는 hSG16.45와 동일한 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 동일한 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 것인 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 항-BCMA 항체가 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하는 것인 방법.
  44. (i) 제37항 내지 제43항 중 어느 한 항의 항-BCMA 항체, 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물; 및
    (ii) 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 항체-커플링된 T-세포 수용체 (ACTR) 구축물을 발현하는 T 림프구 또는 NK 세포 집단
    을 포함하는 면역요법을 위한 키트.
  45. 제44항에 있어서, 바람직하게는 레날리도미드인 면역조정제를 추가로 포함하는 키트.
KR1020197026910A 2017-02-17 2018-02-16 암 요법 및 b 세포 장애에서의 항-bcma 항체 및 항체-커플링된 t 세포 수용체 (actr)의 공동-사용 KR20190115079A (ko)

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